Laboratorio Caseína
Laboratorio Caseína
Laboratorio Caseína
OBJETIVOS
Determinar experimentalmente el punto isoeléctrico de la caseína.
Observar el perfil de proteínas de las diferentes fracciones obtenidas durante un procedimiento para la purificación de
caseína en geles de electroforesis SDS-PAGE y determinar la concentración de proteína en la leche.
Cuantificar el nitrógeno total presente en la caseína purificada.
Método de determinación de nitrógeno mediante el Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar el
método kjeldhal potenciómetro
Potenciómetro
Espectrofotómetro Lavar el precipitado con 20mL de etanol y centrifugar
3 Leches de diversas marcas (1 litro) nuevamente.
Cámara de electroforesis
Fuente de poder Retirar el sobrenadante (guardar una parte de este
Reactivo de Biuret sobrenadante como solución B) y a continuación adicionar
Patrón de albúmina de huevo 0.02 mg/ml 10 mL de éter etílico y centrifugar.
Un juego de micropipetas
Equipo Kjeldahl Al finalizar queda un precipitado blanco de fácil
Manto calefactor manipulación, el cual es la caseína.
Reactivo de
Albumina en
leche (ml)
Biuret (ml)
Agua (ml)
problema
1mg/ml (ml)
solución
de manera que aquellas proteínas retardadas puedan
solución
Tubo
(ml)
alcanzar al resto y todas inicien la separación desde el
mismo punto, mejorando así la calidad de la corrida. El gel
concentrador se prepara siempre a una concentración de
B 1,8 - - - 1,2 acrilamida 4%, mientras que el gel de separación o gel de
1 1,6 0,2 - - 1,2 corrida se prepara según el rango óptimo de resolución:
2 1,4 0,4 - - 1,2
3 1,2 0,6 - - 1,2 Gel de corrida
4 1,0 0,8 - - 1,2 Ensamblar, según instrucciones, el cassette que consta de
5 0,8 1,0 - - 1,2 soportes, vidrios y separadores. Preparar el gel de corrida.
Leche 1,6 - 0,01 - 1,2 El volumen del gel de corrida deberá calcularse
Sln A - - - 1,8 1,2 dependiendo del grosor del gel. Por lo general se preparan
Sln C - - - 1,8 1,2 10ml de acrilamida 10% así:
Tabla 2: Volúmenes a utilizar de cada una de las soluciones en la
cuantificación de proteínas
Solución Volumen
Agua destilada 4mL
Agitar suavemente y esperar 15min a que se desarrolle el
Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.3mL
color en la oscuridad y medir la absorbancia de cada tubo
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
a 550nm.
SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 100µL
TEMED 4µL
Tabla 3: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del
gel de corrida
Electroforesis de las proteínas de la leche Verter cuidadosamente la solución de acrilamida con una
Geles de corrida y concentración pipeta Pasteur en el contenedor representado por 2 vidrios
La técnica de separación comúnmente utilizada se sujetos al cassette y distanciados por unos separadores.
denomina electroforesis discontinua. En esta se preparan Dejar aproximadamente 1,5cm de distancia entre la
2 geles, el de corrida, donde se separan las proteína y el solución de acrilamida y el vidrio frontal.
de apilamiento o concentrado, que como su nombre lo
indica, concentra la mezcla. Luego de añadido el gel de corrida y previo a la
polimerización, añadir suavemente agua destilada para
El gel de corrida que separará las muestras debe tener evitar que el borde del gel polimerice de manera irregular.
mayor concentración de Acrilamida (10%) y pH más Esperar unos 15min para una polimerización total del gel.
básico (8.3) de manera que ofrezca mayor resistencia en
la corrida a los polipéptidos. Gel concentrador o de apilamiento
Luego de polimerizado el gel de corrida, descargar el agua
El gel de apilamiento posee baja concentración de de la superficie del mismo y preparar 4ml del gel de
acrilamida (4%) en tampón ligeramente ácido (Tris/HCl 1M apilamiento (4%) según se muestra a continuación:
pH 6.8), de forma que ofrezca poca resistencia a la mezcla
Solución Volumen en una solución colorante (1g de azul de Coomassie,
Agua destilada 2.7mL 459ml de metanol, 450ml de agua destilada y 100ml de
Acrilamida-bisacrilamida 30% 0.67mL ácido acético glacial) por 3 horas. Transcurrido el tiempo,
Tris/HCl 1M pH 6.8 0.5mL sumergir el gel en una solución decolorante (100ml
SDS 10% 40µL metanol, 100ml de ácido acético glacial, 800ml de agua
Persulfato de amonio 10% 40µL destilada) o en agua en ebullición durante 10 minutos para
TEMED 4µL eliminar las asociaciones inespecíficas del gel al colorante.
Tabla 4: Volúmenes a utilizar de los reactivos para la preparación del Observar las bandas proteicas.
gel de apilamiento
Análisis del gel de electroforesis (se realiza en la
Verter suavemente el contenido del gel de apilamiento tercera sesión).
sobre el gel de corrida polimerizado y colocar el peine
cuidadosamente para que no se formen burbujas. Esperar Ya desteñido el gel realizar la gráfica log PM vs distancia
unos 10min hasta que polimerice la acrilamida. recorrida del marcador de peso molecular para determinar
el peso molecular de las bandas de las muestras
Colocación de las muestras problema.
Cuando el gel concentrador o de apilamiento haya
polimerizado, colocar el cassette en el tanque de Determinación de nitrógeno total
electroforésis con aproximadamente 500mL del buffer de
corrida en el cual se encuentran los electrodos Digestión (se realiza uno o dos días antes de la
sumergidos. Quitar cuidadosamente el peine para que titulación junto con la destilación y absorción)
quedaran libres los pozos del gel. Se colocaron En un balón de digestión coloque en su orden lo siguiente:
cuidadosamente las muestras con una micropipeta.
Muestra exactamente 0.5 g de caseína
Muestras: pesada: seca
Leche diluída 2µL (De una dilución previamente Mezcla catalizadora: 0.15 g de dióxido de
realizada de 10 µL de leche y 90 µL de agua). titanio, 0.15 g de
Buffer de carga de muestra 18µL sulfato de cobre y
Solución A 10µL 5.2 g de sulfato de
Buffer de carga 10µL potasio.
Solución B 10µL H2SO4 Concentrado:
Buffer de carga 10µL
Lleve los balones al digestor.
Solución C 10µL
Caliente al principio suavemente aproximadamente
Buffer de carga 10µL durante unos 10 minutos con el fin de eliminar por
. evaporación la mayor parte de la humedad que acompaña
la muestra. Suba gradualmente el calor hasta una
Someterlas a ebullición (92°C) por 3 minutos e temperatura tal que los vapores de SO3 (vapores irritantes
inmediatamente sacarlas a hielo, luego sembrar 20µL de producidos por descomposición del H2SO4) no alcancen
las muestra en los pozos de los geles de la electroforesis. sino la mitad del cuello del balón de digestión.
Incluir un estándar de peso molecular en uno de los pozos Mantenga estas condiciones, hasta obtener una solución
(5µL). de color verde esmeralda.
Deje enfriar los balones.
Someter las muestras a electroforesis aplicando una
corriente de 30mA por gel y observar la corrida por 40 Destilación y Absorción
minutos. Colocar en el equipo de destilación el tubo de digestión
con la muestra. Programe el equipo para realizar una
Finalizada la corrida extraer los vidrios del cassette destilación con los siguientes parámetros:
cuidadosamente y separarlos de manera tal que el gel
quedara posado sobre uno de los vidrios. Sumergir el gel Agua: 50 ml
Ácido bórico: 75 ml al 2%
NaOH: 80 ml al 32% o una densidad de 1.34 Cooper T. (1.984) “Instrumentos y Técnicas Bioquímicas”.
Tiempo de destilación: 5 min Editorial Reverté. España. 442p
Titulación (se realiza en la tercera sesión) FAO Food and Nutrition Paper 14/7 Roma, 1986
Titule con HCl de concentración conocida (depende de la
muestra cuando con 0.1 N se consumen más de 10 ml en Bernal de Ramírez,I. 1993. Análisis de alimentos,
la titulación, este se puede remplazar por una solución de Academia Colombiana de ciencias exactas, físicas y
titulación de 0.5 a 1 N), con indicador de Taschiro hasta naturales Colección Julio Carrizosa Valenzuela, No 2.
que produzca un viraje de color o hasta obtener Bogotá
nuevamente el valor inicial del pH del ácido bórico (pH: 4.3
a 4.5).
ANEXO
Registrar el volumen y concentración de ácido gastado en 1. Tris/HCl 1,5M pH 8.8, 100 ml:
la valoración para cada una de las muestras trabajadas. Pesar 18,15 g de Tris, disolver el Tris en 50ml de agua
destilada, añadir gota a gota HCl concentrado hasta que
Resultado a reportar y analizar: contenido de nitrógeno por el pH baje a 8.8, completar con agua destilada hasta el
gramo de composición de caseína. volumen final (100ml)
CUESTIONARIO (para incluir como resultados y/o 3. SDS 10% (p/v), 100ml:
discusión de resultados en el informe) Pesar 10 g de SDS, añadir agua destilada hasta completar
1. ¿Qué sucedería si se representa la transmitancia para el volumen de 100ml, información de seguridad: El SDS
la determinación del punto isoeléctrico de la caseína? es un polvo fino neurotóxico, por lo tanto se debe usar
2. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? máscara, guantes y lentes de protección para su
Determínelo con los datos de su experimento y manipulación.
compárelo con el obtenido por bioinformática.
3. ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el 4. Glicerol 50% (v/v), 100 ml:
pI? Tomar un volumen de 50ml de glicerol al 100%, añadir
4. ¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de la 50ml de agua destilada
caseína?
5. ¿Cuál es la concentración de la solución de caseína? 5. Azul de Bromofenol 1% (p/v), 10ml:
6. ¿A qué se debe la diferencia del pH teórico de las Pesar 100mg de azul de bromofenol, completar con agua
soluciones preparadas para la determinación del destilada hasta 10ml y mezclar hasta disolver, filtrar la
punto isoeléctrico y el pH medido experimentalmente? solución en papel Whatman No 1 (o cualquier papel de
filtro) para eliminar el colorante no disuelto
NOTA:
Las soluciones 1, 2 y 6 son estables por meses a 4°C. Las
soluciones 7 y 9 deben ser almacenadas a –20°C. El resto
a temperatura ambiente.