UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANA

BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
LABORATORIO DE GENÉTICA MOLECULAR
GRUPO: 1602 SEMESTRE: 2017-I

EQUIPO 3: LUNA BENÍTEZ MAX; ROSALES BOLAÑOS FRANCISCO ENRIQUE

PROFESORAS: BQD LARISSA ANDREA GONZÁLEZ SALCEDO; BQD ÁNGELES LÓPEZ CABRERA
ENTREGA 7-OCTUBRE-2016

INFORME DE LA PRÁCTICA
EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ELECTROFORESIS DE DNA

RESUMEN
Uno de los más importantes aportes a la biología ha sido el reconocimiento del DNA como “la molécula de la vida”. Para
su estudio y la aplicación de técnicas moleculares es necesario la extracción de DNA íntegro y puro. La extracción consiste
en el aislamiento y purificación de moléculas de DNA y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. Una
vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometría, ya que una
característica del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm, lo que permite estimar su concentración. Además
de conocer la cantidad y calidad del DNA por espectrofotometría, es importante conocer si el DNA obtenido está integro,
lo cual se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa, debido a las bandas que se forman. Los objetivos de
la práctica son cuantificar DNA extraído por 2 diferentes métodos (por perclorato de sodio y por fenol-cloroformo) mediante
espectrofotometría, así como evaluar la pureza e integridad del DNA por electroforesis, para comparar los resultados
obtenidos por ambos métodos. Los resultados obtenidos por el método de perclorato de sodio fueron: relación 260/280 =
1.577, concentración = 22.371 ng/µL, bandas difusas; mientras que por el método de fenol-cloroformo fueron: relación
260/280 = 1.92, concentración = 1342.28 ng/µL, bandas muy difusas. Como conclusiones, se logró extraer DNA humano
por los métodos de perclorato de sodio y de fenol-cloroformo, siendo que por el método de perclorato de sodio se obtuvo
menor cantidad de DNA y contaminado, en contraste al método de fenol-cloroformo, con el cual se obtuvo mayor cantidad
de DNA y alta pureza; y al no evaluarse la integridad de ambas muestras por fallas en la electroforesis, se concluye que el
método más eficaz es el de fenol-cloroformo.
Palabras clave: Nucleótidos, espectrofotometría, absorbancia, densidad óptica, electroforesis.

SUMMARY
One of the most important contributions to biology has been the recognition of DNA as "the molecule of life". For their study
and application of molecular techniques is necessary the extraction of DNA full and pure. The extraction involves the
isolation and purification of DNA molecules and is based on the physicochemical characteristics of the molecule. After
obtaining the genetic material, it is important to determine the performance by spectrophotometry, as a feature of DNA is
that it absorbs ultraviolet (UV) at 260 nm, which allows estimation of their concentration. Besides knowing the quantity and
quality of DNA by spectrophotometry, it is important to know if the DNA obtained is integral, which can be observed by
agarose gel electrophoresis, because the bands are formed. The objectives of the practice are quantified DNA extracted by
2 different methods (sodium perchlorate and phenol-chloroform) by spectrophotometry, and to assess the purity and the
integrity of the DNA by electrophoresis, to compare the results obtained by both methods. The results obtained by the
method of perchlorate were: ratio 260/280 = 1.577, concentration = 22.371 ng/µL, diffuse bands; while by the phenol-
chloroform method they were: 260/280 ratio = 1.92, concentration = 1342.28 ng/µL, very diffuse bands. In conclusion, it
was possible to extract human DNA by the methods of sodium perchlorate and phenol-chloroform, being that by the method
of sodium perchlorate less DNA and contaminated was obtained, in contrast to the method of phenol-chloroform, the which
greater amount of DNA and high purity was obtained; because the integrity of both samples evaluated by electrophoresis
failures, it is concluded that the most effective method is phenol-chloroform.
Keywords: Nucleotides, spectrophotometry, absorbance, optical density, electrophoresis.

1
INTRODUCCIÓN precipita con isopropanol y se lava con etanol para
finalmente ser resuspendido en un tampón estabilizante
Uno de los más importantes aportes a la biología ha sido para DNA. El segundo método (fenol-cloroformo)permite
el reconocimiento del DNA como “la molécula de la vida”. la purificación de DNA mediante la adición de fenol y
Para el estudio de DNA existen diferentes muestras que cloroformo lo que da lugar a la aparición de 2 fases: una
pueden ser obtenidas y analizadas de un paciente; fase acuosa superior que contiene los ácidos nucleicos y
sangre, semen, saliva, cabello, hueso, diente o tejido, la una fase orgánica que contiene las proteínas disueltas en
forma más rápida y fácil de obtener es la sangre. La el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo, 2)
sangre está compuesta por células y restos celulares en posteriormente se precipita el DNA de la fase acuosa con
una solución acuosa: el plasma. Dentro de las células, isopropanol o etanol absoluto y se lava con etanol al 70%
están los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, de las cuales, para eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas que
los leucocitos son las únicas células nucleadas que se podrían aún estar presentes en la muestra, 3) se emplea
presentan como granulocitos, monocitos y linfocitos, y, alcohol isoamílico para cambiar la constante dieléctrica
por lo tanto, las únicas de las que se puede obtener DNA del medio, 3) por último el DNA se resuspende en un
por la presencia de este núcleo. (Koolman y Röhm, 2005) tampón apropiado.
···········································································
Debido a que en el DNA se encuentran cifradas las Una vez obtenido el material genético, es importante
instrucciones que definen las características propias de determinar el rendimiento mediante espectrofotometría.
cada organismo, diversas tecnologías y sistemas de La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de
análisis se han desarrollado para la caracterización de una molécula en solución depende de la cantidad de luz
esta molécula. La aplicación de técnicas moleculares absorbida de las moléculas disueltas. Una característica
inicia con la extracción de DNA y la obtención exitosa de del DNA es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm,
datos confiables y reproducibles depende, en gran con lo cual se puede estimar su concentración. Cuando
medida, de la extracción de DNA íntegro y puro (Rocha, la longitud de la celda en que se disuelve el DNA, es de
2009). 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO).
En el caso de DNA genómico o de doble cadena, una
El DNA está constituido por dos cadenas de nucleótidos densidad óptica equivale a 50 µg/ml (Alejos, 2014).
unidas entre sí formando una doble hélice. Los
nucleótidos están integrados por un azúcar Además de conocer la cantidad y calidad del DNA por
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada espectrofotometría, es importante conocer si el
(adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los DNA obtenido está integro. La integridad del DNA
nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, se puede observar mediante electroforesis en gel
mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de agarosa. Si el DNA está integro, se debe
de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen observar una banda estrecha cercana al pozo en
mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la que se colocó la mezcla de DNA. Si está
estructura helicoidal. Los grupos fosfato están cargados fragmentado, se observará una banda de más de
negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA 1 cm de ancho o un sendero luminoso en el carril
una carga neta negativa y lo hace altamente polar de la muestra. El DNA fragmentado dificulta y
(Rocha, 2009). afecta la reproducibilidad de las técnicas
moleculares (Alejos, 2014).
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de
moléculas de DNA y se basa en las características
fisicoquímicas de la molécula. Los métodos tradicionales METODOLOGÍA
de extracción utilizan solventes orgánicos para separar a
las proteínas del DNA y, una vez suspendido en la fase Se siguieron las metodologías para las prácticas 2, 3, 4 y
acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. En general, 5 del manual de prácticas de genética molecular de la
la extracción consiste de cinco etapas principales: FES Cuautitlán, páginas 23-24, 29-30, 35, 41-42.
homogeneización del tejido, lisis celular, separación de
proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del DNA
(Alejos, 2014). RESULTADOS

Los métodos de extracción del DNA más utilizados son Tabla 1. Resultados de las determinaciones
por perclorato (Salting Out) y por fenol-cloroformo. El espectrofotométricas.
método por perclorato de amonio o sodio a altas
concentraciones se fundamenta en el cambio de
Método de Lectura Lectura Relación Concentración
solubilidad que experimentan las proteínas cuando son extracción 260 nm 280 nm 260/280 DNA (ng/µL)
sometidas a modificaciones en la concentración salina,
1) inicia con una lisis celular con un detergente aniónico Perclorato 0.022 0.014 1.577 22.371 ng/µL
que solubiliza los componentes celulares e inhibe la
acción de las nucleasas intracelulares, 2) a continuación Fenol- 1.342 0.699 1.92 1342.28 ng/µL
se desnaturalizan y se eliminan las proteínas por Cloroformo
precipitación salina, 3) por último el DNA en solución se
2
 DNA como de proteínas), lo que reduce las interacciones
polares del DNA con el disolvente y favorece las
interacciones hidrofóbicas entre las proteínas y el DNA,
causando finalmente su precipitación, permite cuantificar
mayor cantidad de DNA, y favorece que el DNA obtenido
no se encuentre contaminado por la utilización de otros
solventes orgánicos, pero si por proteínas que le restaría
pureza, como en este caso. Mientras que por el método
de fenol-cloroformo es mejor en base a la calidad que se
obtiene, pero no así en la concentración, ya que como el
fenol elimina las proteínas asociadas al DNA, y la mayor
parte del DNA genómico se encuentra unido a histonas
(proteínas) se puede “arrastrar” algo de este al momento
Gráfica 1. Se muestra una gráfica de barras comparativa de las de realizar la extracción con este método, aunque en este
concentraciones de DNA obtenidas por espectrofotometría Epoch de los caso no existió ni contaminación por fenol o por
métodos de extracción por Perclorato de sodio y por Fenol-Cloroformo.
Se puede observar que por el método de Fenol-Cloroformo se obtuvo
cloroformo, y la cantidad extraída de DNA fue bastante
una mayor cantidad de DNA con respecto al método de Perclorato de (Sepp, 2004).
sodio.
Con la finalidad de verificar la integridad del DNA
Imagen 1. Electroforesis de DNA extraído por perclorato extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de
de sodio y por fenol-cloroformo. DNA, se realizó electroforesis en gel de agarosa. La
electroforesis consiste en la separación de moléculas
(proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una
matriz tamponada, agarosa en este caso, la cual funciona
como un filtro separando las moléculas en un campo
eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que
poseen. Las bandas se logran observar gracias a la
tinción con GelRed, colorante fluorescente no tóxico, que
actúa mediante inserción entre las pares de bases que
conforman el ácido nucleico, permitiendo la fluorescencia
bajo luz UV (Fierro, 2014).

La resolución y velocidad de separación de fragmentos

DISCUSIÓN DE RESULTADOS de DNA por electroforesis son reguladas a través de la
concentración de agarosa en el gel y el voltaje aplicado
La pureza de la muestra está relacionada con el valor de durante la electroforesis (Fierro, 2014). En esta práctica
máxima absorbancia de los ácidos nucleicos detectada a se utilizó agarosa al 0.8% y la electroforesis fue a 100
una longitud de onda de 260 nm, la relación de volts durante 30 minutos. Se puede observar que para el
absorbancia a 260 nm y 280 nm se utiliza para evaluar la caso del método…. Sin embargo, debido a la
pureza de ADN, una proporción de 1.7-1.9 es contaminación y a la perforación del gel de agarosa
generalmente aceptada como DNA puro (Alejos, 2014). (respectivamente), las bandas resultantes no tenían
resolución, por lo cual la electroforesis falló y no se puede
En el caso de la extracción por perclorato se obtuvo una evaluar la integridad del DNA obtenido.
proporción de 1.577 mientras que en la extracción por
fenol-cloroformo se obtuvo 1.92. Estas relaciones indican Hay que considerar que al aumentar la concentración de
que por el método de perclorato se obtuvo un DNA impuro agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo
lo cual se puede deber a la presencia de proteína, fenol u largo del gel, permitiendo una mayor resolución en los
otros contaminantes que absorben fuertemente en o fragmentos de menor longitud. Por otro lado, el
cerca de 280 nm. Mientras que por el método de fenol- incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la
cloroformo el DNA obtenido fue casi puro, con alguna leve velocidad de migración de los fragmentos en el gel
presencia de contaminantes, pero en muy poca cantidad. (Fierro, 2014).
También es necesario considerar que ambas muestras
de sangre se encontraban lipémicas, por lo cual los La técnica para la cuantificación de ADN en la
lípidos pudieron participar en la contaminación por el electroforesis consiste simplemente en la utilización de
método de perclorato, mientras que esto no ocurre en el una secuencia de concentraciones de solución patrón de
método de fenol-cloroformo ya que el cloroformo se ADN (marcador de peso molecular) con la que se
encarga de disolver a los lípidos (Riera, 2010). comparan muestras de ADN de concentración
desconocida (Fierro, 2014). Sin embargo, como las
Por lo que la extracción de DNA por el método de bandas por ambos métodos no estaban bien definidas, o
perclorato de sodio al basarse en la reducción de nada definidas, no se pudo realizar la comparación con el
solubilidad del DNA por efecto de las sales y aumento de marcador de peso molecular.
las interacciones hidrofóbicas (cargas negativas tanto de
3
CONCLUSIONES

Se logró extraer DNA de dos muestras de sangre humana

por los métodos de perclorato y de fenol-cloroformo. En
cuanto a la cuantificación del DNA por
espectrofotometría, el método de fenol-cloroformo obtuvo
una mayor concentración de DNA, así como también una
mejor calidad del mismo en base a la relación 260/280,
esto en comparación con el método de perclorato de
sodio.

Por lo que, comparando los resultados obtenidos se

observó que por el método por perclorato es sencillo
trabajar y extraer el DNA, sólo que en ocasiones se puede
extraer una menor cantidad de DNA o estar contaminado
por proteínas si no se agregan las sales como es debido.
Mientras que por el método de cloroformo es posible
extraer mayor cantidad de DNA, pero el riesgo de
contaminación por fenol o por cloroformo aumenta si no
se realiza correctamente la extracción. Una mejor técnica
en la electroforesis hubiera ayudado a corroborar la
integridad del DNA por ambos métodos, pero al no
tomarse en cuenta, se concluye que el método más eficaz
es el de fenol-cloroformo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alejos, L. (2014). Extracción y purificación de DNA.

Herramientas moleculares aplicadas en ecología:
aspectos teóricos y prácticos (Compilado). México:
SEMARNAT. Págs. 1-3.

Fierro, F. (2014). Electroforesis de DNA. Herramientas

moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y
prácticos (Compilado). México: SEMARNAT. Págs. 27-
29.

Koolman, J. & Röhm, K. (2005). Bioquímica: texto y atlas.

(3 ed.). España: Médica Panamericana. Pág. 274.

Riera, M. (2010). Protocolo de extracción de DNA por

salting-out para pequeños volúmenes de sangre. Revista
de Ciencia y Tecnología; 12(14): 4-7 pp.

Rocha, P. (2009). Teoría y práctica para la extracción y

purificación del ADN de palma de aceite. Palmas; 23(3):
9-17 pp.

Sepp, R. (2004). Rapid techniques for DNA extraction

from routinely processed archival tissue for use in PCR. J
Clin Pathol; 47(4): 318-323 pp.