BALOTARIO DE FISIOLOGIA MICROBIANA

1. E
xplique Ud. Cuál sería el uso en fisiología microbiana de la Microscopia de contraste de fases, de campo
oscuro, de luz fluorescente y microscopia de contraste de interferencia diferencial, microscopia de fuerza
atómica y microscopia con focal de barrido con laser. Explique el fundamento de cada una de ellas.

Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al
corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosas: esto
se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera
directamente del colorante .

Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras
y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El microscopio
de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin
embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo,
que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase
de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de
refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora
de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina

El microscopio en campo oscuro Utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre
el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la
luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y
los objeto minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma
de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminación normal.

El microscopio de interferencia involucra la participación de las mediciones de las diferencias en la

trayectoria entre dos haces de luz divididos.1 Con este instrumento es posible determinar las diferencias
ópticas de fase para las diversas estructuras celulares y en consecuencia medir su peso seco.
2. En la síntesis de una célula bacteriana ordinaria y en base a su función primaria en el
crecimiento explique qué significa reacciones de ensamblaje, reacciones de polimerización, reacciones
biosintéticas y reacciones energéticas.

Reacciones de ensamblaje:
Las reacciones de ensamblaje involucran la modificación química de las macromoléculas, su transporte
a sitios específicos en la célula y su asociación para formar estructuras celulares (envoltura, apéndices,
nucleoide, polisomas, inclusiones, y complejo de enzimas). Puede ocurrir espontáneamente (auto
ensamblaje) o en forma dirigida por otras macromoléculas ( ensamblaje dirigido)

Reacciones de biosintesis
Las reacciones de biosíntesis producen los componentes base de las reacciones de polimerización.
También producen cofactores y productos relacionados, así como moléculas de señalización
(alarmonas=comunicación intracelular: peptidos y proteínas, aminoácidos derivados, AMPc, etc).
Las reacciones están agrupadas en Vías Biosintéticas que producen uno o más bloques de construcción.

Las reacciones de polimerización

Consisten en la unión dirigida (enzimas) y secuencial de moléculas activadas en cadenas largas. El

resultado de este proceso es la formación de macromoléculas

Las reacciones energéticas

Incluyen todas las vías energéticas conocidas como CATABOLISMO (degradan y oxidan sustratos) y
Reacciones Amfibólicas (reacciones que producen energía y precursores metabólicos)
3. Detalle cual es la diferencia estructural de de la membrana bacterias Gram positivas, bacterias
Gram negativas, arqueobacterias, levaduras, hongos filamentosos y microalgas.
Microoganismos Composicion de Menbrana
Gram positivos
Gram negativos Bicapa lipídica ASIMETRICA
Lado externo: LPS (posee actividad de
endotoxina)
• Lado interno: Lipoproteína de Braun (une
membrana externa con pared celular).
• Presenta porinas (nutrición y ATB) [ej:
OmpC y OmpF de la E.coli
Hongos filamentosos
Microalgas
Levaduras
Arqueobacterias La membrana celular de la Archaea presenta
características particulares, respecto al
componente lipídico.
A diferencia de la Bacteria y Eukarya, carecen
de ácidos grasos y en su lugar tienen cadenas
laterales compuestas de unidades repetitivas
de isopreno (fentanilo o bifentanilo) unidas
por enlaces éter al glicerol que constituyen el
gliceroldiéter, cuando se distribuyen a
manera de bicapa y el gliceroltetraéter,
cuando es a manera de monocapa (en estos
casos los lípidos constan de dos cabezas
polares "glicerina" que estan unidas
covalentemente entre sí a través de los ácidos
grasos).
4. Detalle cual es la diferencia estructural de la pared citoplasmática de… bacterias Gram
positivas, bacterias Gram negativas, arqueobacterias, levaduras, hongos filamentosos y microalgas.

Gram-positivas

La pared celular contiene una capa gruesa de peptidoglicano además de ácidos teicoicos, que son
polímeros de glicerol o ribitol fosfato. Los ácidos teicoicos se unen al peptidoglicano o a la membrana
citoplasmática.

Gram-negativas

La capa de peptidoglicano es relativamente fina y se encuentra rodeada por una segunda membrana
lípida exterior que contiene lipopolisacáridos y lipoproteínas. La capa de peptidoglicano se une a la
membrana externa por medio de lipoproteínas.

Pared celular de microalgas

Al igual que las paredes celulares de las plantas superiores, la pared celular de las algas está compuesta
por carbohidratos como la celulosa y glicoproteínas.3 La presencia de algunos polisacáridos en las
paredes de las algas, es usada como carácter diagnóstico en la taxonomía de las algas.
•Polisacáridos sulfonados como la agarosa, se presentan en las paredes de algas rojas.

•Manosyl: Forma microfiblillas en la pared celular de algunas algas verdes de los géneros Codium,
Dasycladus, Acetabularia, Porphyra y Bangia entre otros.

•Ácido alginílico: es un polisacárido común en la pared celular de las algas pardas.

El grupo de algas diatomeas sintetiza sus paredes celulares (también conocidas como frústulas o valvas)
usando ácido silícico (específicamente ácido ortosilícico, H4SiO4). El ácido se polimeriza
intracelularmente, y después la pared sale al exterior para proteger a la célula. Comparadas con las
membranas celulares orgánicas producidas por otros grupos, requieren menos energía
(aproximadamente el 8 %) para su síntesis, lo que constituye un ahorro para la célula,4 y posiblemente
explique las tasas de crecimiento más altas en las diatomeas
 5. Explique cuál es la composición y función de la membrana externa de las bacterias Gram
negativas. Además, detalle la biosíntesis de la composición de cada uno de los elementos de la
membrana externa.

La composición química y la disposición de los elementos de esta membrana externa son muy distintos
a los de una membrana típica:

Parece ser que la membrana externa está en contacto directo con la plasmática en numerosos puntos,
denominados zonas de adhesión. Puede que se trate de regiones en las que produzca una auténtica
fusión entre estos dos tipos de membrana, facilitando quizá el transporte de ciertas sustancias desde el
exterior al interior celular.

Estudiaremos a continuación los componentes de la membrana externa, aludiendo a su composición

química, estructura y funciones.
  Fosfolípidos (FL)

Se localizan en la lámina interna de la m. ext. La composición en fosfolípidos es similar a la de la

membrana citoplásmica, con un ligero enriquecimiento en fosfatidil-etanolamina.

 Lipopolisacárido (LPS)

Se trata de una macromolécula exclusiva de la lámina externa de la membrana externa de bacterias

Gram-negativas, responsable de muchas de las propiedades biológicas de estas bacterias. Se le conoce
también con el nombre de endotoxina . Se trata de un glucolípido complejo, que podemos considerar
compuesto de tres regiones o dominios:

 El lípido A: esta región es prácticamente idéntica en todas las bacterias Gram-negativas.

Consiste en un disacárido formado por dos unidades de glucosamina unidas por enlace ß(1à6),
pero donde todos los grupos -OH (menos uno) y -NH2 están sustituidos (unidos a otras
moléculas): Obsérvese que

existen 5 (a veces 6) ácidos grasos, todos ellos saturados, con predominio de ß-hidroximirístico
(un ácido graso C14).
El -OH original en 4´ está sustituido por arabinosamina-fosfato.
El -OH en 1 está sustituido por fosforil-etanolamina (a veces pirofosforil-etanolamina)

 El oligosacárido medular (también llamado corazón o núcleo): se une al lípido A a través del -
OH en 3´. Se pueden considerar dos fracciones:

la fracción del núcleo interno, a base de dos tipos de azúcares exclusivos de Gram-negativas: 2-ceto-3-
desoxioctónico (KDO) y L-glicero-D-manoheptosa (Hep). Alguna de las Hep y alguno de los KDO pueden
a su vez estar unidos a fosforil-etanolamina (o pirofosforil-etanolamina). Esta región es muy rica en
grupos cargados, especialmente con carga negativa (de los fosfatos y KDO).
La fracción del núcleo externo está constituida a base de hexosas (glucosa, galactosa, NAG, y a veces
algunas hexosas más raras).

 Cadena lateral específica: polisacárido repetitivo, que se proyecta hacia el exterior celular, y
que constituye el Ag somático O de bacterias Gram-negativas. Consiste en la repetición (hasta
40 veces) de unidades tri-, tetra- o pentasacarídicas (en estos dos últimos casos uno de los
azúcares de cada repetición queda lateral respecto del esqueleto lineal que forman los demás).

De todas estas regiones del LPS la única indispensable para la viabilidad es el lípido A. Los mutantes
incapaces de sintetizar las cadenas laterales o el oligosacárido medular dan colonias rugosas y están
afectados en distintas propiedades biológicas, pero pueden sobrevivir.
El conjunto es un mosaico fluido que permite el desplazamiento lateral de los fosfolípidos, del LPS, y
de las proteínas, pero no de las lipoproteínas unidas covalentemente al peptidoglucano. Sin embargo,
esta fluidez es menor que la de la membrana citoplásmica

FUNCIONES DE LA MEMBRANA EXTERNA

A) Actúa como tamiz molecular, que permite la difusión únicamente de moléculas relativamente
pequeñas. Esto supone una protección frente a muchos agentes antibacterianos:colorantes, ácidos
biliares, antibióticos, enzimas (p. ej., la lisozima, que podría alcanzar y atacar al PG). Recuérdese que
las porinas sólo permiten el paso de sustancias hidrofílicas por debajo del tamaño especificado por
el diámetro de los canales.

B) Condiciona propiedades de superficie:

a) grado de humedad (humectabilidad)

b) adhesividad
 c) carga eléctrica.

C) Es la estructura donde se fijan los componentes del complemento (sistema defensivo de los
animales superiores que conduce a la inserción, en la membrana externa, de una serie de proteínas
llamadas complejo de ataque a la membrana, que agujerea dicha membrana y ocasiona la lisis de la
bacteria).

D) Ciertas proteínas y cadenas laterales del LPS pueden ser lugares de adsorción (receptores
específicos) de fagos y bacteriocinas.

E) Punto de anclaje del anillo externo (“L”) del corpúsculo basal de los flagelos.

6. Explique qué significa espacio periplasmático en bacterias, que proteínas se presentan y cuáles
son sus funciones.
Entre la membrana externa y la membrana citoplásmica existe un compartimento acuoso bañando al
peptidoglucano, denominado periplasma o espacio periplásmico. El volumen de este compartimento
puede llegar a representar un 20-40% del volumen celular total. El contenido del periplasma (el “gel
periplásmico”) incluye:

El periplasma cumple una función de osmorregulación: El periplasma es una solución densa, con alta
concentración de macromoléculas, y que participa en la regulación de la osmolaridad celular frente a la
tonicidad del medio exterior. Para ello, existe en este espacio periplásmico un oligosacárido derivado
de la membrana citoplásmica (ODM, o según sus iniciales inglesas, MDO), a base de 10 unidades de ß-
D-glucosa (unidas entre sí por enlaces 1à2) con sustituyentes ácidos.

 En medios de alta osmolaridad (por ejemplo, en los fluidos corporales), disminuye la

concentración del oligosacárido.

 En ambientes de baja osmolaridad (p. ej., aguas fecales), aumenta mucho la concentración de dicha
molécula. De este modo, la presión de turgor del protoplasto se transmite contra el peptidoglucano,
que como sabemos ya, es la estructura de la pared celular. que aguanta las variaciones de presión
osmótica.
 7. Explique cómo se produce el ensamblaje del nucleoide en Eubacterias.

La información hereditaria de las bacterias se encuentra fundamentalmente en un único cromosoma

consistente en una molécula de ADN doble hélice circular. El tamaño de esta molécula varia según la
especie bacteriana de 0,1 x 109 a 8 x 109 dalton.

Una de las bacterias más estudiadas desde el punto de vista genético es Escherichia coli cuyo ADN mide
1.100 m de longitud y tiene 3.200.000 pares de nucleótidos. La circularidad del cromosoma de E. coli se
demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas de tiempo mediante la técnica de la
conjugación interrumpida (Jacob y Wollman, 1958). Sin embargo, la primera evidencia citológica de la
circularidad del cromosoma de E. coli se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando radiactivamente el
ADN, realizando una autorradiografía y analizando los resultados al microscopio óptico. F. Jacob E. L.
Wollman J. Cairns

La deshidratación requerida por las técnicas citológicas necesarias para la observación al microscopio
electrónico de la organización cromosómica de las bacterias produce un desplegado o disgregación del
nucleoide bacteriano que dificulta los análisis. Por esta causa, no ha sido posible determinar mediante
microscopía electrónica la estructura del nucleoide bacteriano.

El 60 % del nucleoide es ADN, un 30 % es ARN (incluido el ARN producto de la transcripción), del 5 al 10

% es proteína (un 90% de la proteína corresponde a polipéptidos de la ARN polimerasa) y 1% son lípidos
(probablemente contaminaciones de membrana). El estado más o menos relajado, desplegado o
disgregado del nucleoide bacteriano puede deducirse de su comportamiento después de ciertos
tratamientos y posterior centrifugación en gradiente de sucrosa. Cuanto más compactado está el
nucleoide menos viscoso es, menos rozamiento ofrece cuando migra en el tubo de centrifuga a través
de la solución saturada de sucrosa y, por tanto, presenta una mayor velocidad de sedimentación. Cuanto
más relajado o disgregado está el nucleoide más viscoso es, ofrece un mayor rozamiento en su migración
y disminuye su velocidad de sedimentación.

Cuando el nucleoide se trata con ARNasa, enzima que digiere específicamente ARN, la velocidad de
sedimentación disminuye de 1.600 S a 160 S en una relación directa al tiempo de tratamiento con
ARNasa. El tratamiento con reactivos que disocian o degradan proteínas también produce un
desplegado o relajamiento del ADN del nucleoide que se traduce también en una disminución de la
velocidad de sedimentación. Este dato indicaría que también las proteínas podrían jugar un papel en el
enrollamiento o plegamiento del nucleoide. El tratamiento del nucleoide con bromuro de etidio produce
también una disminución de la velocidad de sedimentación. Este cambio en la velocidad de
sedimentación es típico de ADN superenrollado.

8. Detalle cuál es la composición de un flagelo bacteriano y como se produce su ensamblaje.

 1-filamento,

2-espacio periplásmico,

3-codo,

4-juntura,

5-anillo L,

6-eje,

7-anillo P,

8-pared celular,

9-estátor,

10-anillo MS,

El flagelo bacteriano es una estructura filamentosa que sirve para impulsar la célula bacteriana. Tiene
una estructura única, completamente diferente de los demás sistemas presentes en otros organismos,
como los cilios y flagelos eucariotas, y los flagelos de las arqueas. Presenta una similitud notable con los
sistemas mecánicos artificiales, pues es una compleja estructura compuesta de varios elementos
(piezas) y que rota como una hélice. Composición y estructura

Los flagelos están compuestos por cerca de 20 proteínas, con aproximadamente otras 30 proteínas para
su regulación y coordinación.1 El filamento es un tubo hueco helicoidal de 20 nm de espesor. El
filamento tiene una fuerte curva justo a la salida de la membrana externa; este "codo" permite convertir
el movimiento giratorio del eje en helicoidal.

Un eje se extiende entre el codo y el cuerpo basal, pasando por varios anillos de proteínas en la
membrana de la célula que actúan como cojinetes. Las bacterias Gram-negativas tienen cuatro de estos
anillos: el anillo L que se asocia con la membrana externa (lipopolisacáridos), el anillo P que se asocia
con la pared celular (capa de peptidoglicano), el anillo MS que se inserta directamente en la membrana
plasmática, y el anillo C que se une a la membrana plasmática. Las bacterias Gram-positivas sólo tienen
dos anillos: MS y C.

El filamento termina en una punta de proteínas. El flagelo bacteriano está impulsado por un motor
rotativo compuesto por proteínas (estátor, complejo Mot), situado en el punto de anclaje del flagelo en
la membrana plasmática. El motor está impulsado por la fuerza motriz de una bomba de protones, es
decir, por el flujo de protones (iones de hidrógeno) a través de la membrana plasmática bacteriana. Este
bombeo se produce debido al gradiente de concentración creado por el metabolismo de la célula. (En
Vibrio hay dos tipos de flagelos, laterales y polares, y algunos son impulsados por una bomba de iones
de sodio en lugar de la bomba de protones4 ). El rotor puede girar a 6.000-17.000 rpm, pero el filamento
por lo general sólo alcanza 200-1000 rpm. Los flagelos no giran a una velocidad constante, sino que
aumentan o disminuyen su velocidad de rotación en relación con la fuerza motriz de protones.
 Las bacterias pueden alcanzar a través del medio líquido una velocidad de hasta 60 longitudes de
célula/segundo. Aunque esto representa sólo 0,00017 km/h, al comparar esta velocidad con la de
organismos superiores en términos de número de longitudes del cuerpo por segundo, es
extremadamente rápido. El más rápido de los animales terrestres, el guepardo, corre a una velocidad
máxima de alrededor de 110 km/h, pero esto representa sólo alrededor de 25 longitudes de
cuerpo/segundo. Por tanto, cuando el tamaño se tiene en cuenta, las células procarióticas que nadan
velocidades de 50-60 longitudes de cuerpo/segundo son en realidad mucho más rápidas que los
organismos más grandes. Los componentes del flagelo bacteriano son capaces de auto ensamblaje sin
ayuda de enzimas o de otros factores. Tanto el cuerpo basal como el filamento tienen un hueco central,
a través del cual las proteínas del flagelo son capaces de moverse a sus respectivas posiciones. Durante
el montaje, las proteínas que forman el filamento se añaden a la punta en lugar de en la base. El flagelo
bacteriano está relacionado con el complejo de poro y con el sistema de secreción de tipo III, una jeringa
molecular que las bacterias utilizan para inyectar toxinas en otras células. Dadas las similaridades, se
piensa que tanto el flagelo como el sistema de secreción se han originado a partir del complejo de poro.
Además, el sistema de secreción de tipo III parece ser una simplificación del flagelo, pues está formado
por subconjunto de componentes del flagelo.

9. Explique cuál es la composición de una cápsula bacteriana y como se produce su ensamblaje.

Funciones:
- Contribuye a la invasividad o virulencia de la bacteria, porque las células encapsuladas están
protegidas contra la fagocitosis y los virus.
- Adherencia de las bacterias a las superficies de su medio.
- Son capaces de inducir la formación de anticuerpos específicos.

Composición química: formada por polisacáridos simples (excepto en Bacillus anthracis que es
polipeptídica). Se denomina cápsula cuando es condensada y rodea estrechamente a la célula. Se
denomina glucocáliz cuando forma una maraña alrededor de la célula.
Se relaciona con el tipo de colonia que las bacterias forman.
Se sintetiza por enzimas localizadas en la superficie externa de la célula.

Condiciones para la síntesis: depende de las condiciones ambientales y de cultivo, es decir, que disponga
de los sustratos necesarios para sintetizarla.

10. Explique en mayor detalle las diferencias que existen entre las paredes y membranas
citop0lasmáticas de las arqueobacterias
Algunas especies de Arqueas carecen de pseudopéptidoglicano y están cubiertas por polisacáridos,
glicoproteínas ó proteínas. La forma más común de pared de las Arqueas es la capa S paracristalina,
que está compuesta de proteínas o lipoproteínas dispuestas en simetría hexagonal. Esta estructura
se encuentra en Arqueas como los halófilos extremos, metanógenos y los hipertermófilos. Sus
funciones son idénticas a las de Eubacterias y son resistentes a penicilina y lisozima

 N- acetilglucosamina y ácido
 N-acetiltalosaminurónico.
 Enlaces β1-3.
 Resistente a la lisozima y a la
 penicilina.
 Descrita en los Methanobacteriales y en el género Methanopyrus
Las membranas celulares de Archaea son químicamente diferentes al resto de las cosas vivas, ya que
incluyen derivados de una molécula de glicerol e isopreno en lugar de los ácidos grasos. Las diferencias
químicas entre Archaea y otros organismos, se presentan en la membrana celular, entre las cuales
resaltaremos las más importantes:

 Quiralidad del glicerol: La unidad básica de la cual se construyen las membranas celulares es
el fosfolípido. El glicerol de los fosfolípidos de Archaea son esteroisómeros del glicerol usado
por Bacterias y Eukaryas para construir sus membranas. Dos moléculas que son esteroisómeros
son imágenes espejo una de otra. Mientras que las Bacterias y Eukaryas tienen D-glicerol en sus
membranas, las Archaeas tienen L-glicerol en el suyo. Éste es más que una diferencia
geométrica. Los componentes químicos de la célula tienen que ser construidos por las enzimas,
de este modo la quiralidad de la molécula es determinado por la forma de esas enzimas. Una
célula que construye una forma no podrá construir la otra forma.

 Acoplamiento de éter: Cuando las cadenas laterales se agregan al glicerol, la mayoría de los
organismos las unen con un acoplamiento de éster. La cadena lateral agregada tiene dos átomos
de oxígeno unidos a un extremo. Uno de estos átomos de oxígeno se utiliza para formar el
acoplamiento con el glicerol, y el otro sobresale al lado cuando se hace la vinculación. Por el
contrario, las cadenas laterales de Archaea son limitadas usando un acoplamiento de éter, que
carece de ese átomo de oxígeno. Esto da origen a un fosfolípido que varía en sus propiedades
químicas de los lípidos de la membrana de otros organismos.
 Cadenas de Isopreno: Las cadenas laterales en los fosfolípidos de Bacterias y de Eukaryas son
los ácidos grasos, cadenas de generalmente 16 a 18 átomos de carbono. Archaea no utiliza los
ácidos grasos para construir sus fosfolípidos membranales. En su lugar, tienen cadenas laterales
de 20 átomos de carbono construidos de isopreno.

 Ramificación de cadenas laterales: Las cadenas laterales de membranas de Archaeas se

construyen de diversos componentes y tienen una variada estructura física. Las cadenas
laterales constituidas por isopreno presentan ramificaciones desde la cadena principal, lo que
atribuye características interesantes a las Archaeas.
 11. Explique detalladamente como se produce la síntesis de la pared celular de una bacteria Gram
positiva, Bacteria Gram negativa y comente como mínimo la acción de 5 antibióticos que pueden
afectar su biosíntesis.

BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA

Consta de 4 etapas:

1. Síntesis de precursores solubles en el citoplasma.

2. Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana

citoplásmica (un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las
unidades disacarídicas con el pentapéptido.

3. Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero aún
unidas al undecaprenil-fosfato de la membrana.

4. Unión del polímero lineal así formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por
entrecruzamiento de (al menos) parte de sus péptidos respectivos.

A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración del transportador lipídico, una vez
que ha cumplido su misión, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis.

Veamos, pues, en más detalle, cómo ocurre este interesante proceso:

Fase 1:. Los monosacáridos que luego van a constituir la unidad disacarídica repetitiva del esqueleto
del peptidoglucano (NAM y NAG) se activan al unirse a uridín difosfato (UDP). (En general, los
monosacáridos que han de incorporarse a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante
su unión con nucleósidos-fosfato.)

Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado:

NAG-UDP
NAM-UDP

Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los distintos aminoácidos al NAM (en
reacciones que requieren energía e iones Mn++):

1. L-ala

2. D-glu

3. m-DAP (u otro diaminoácido; p. ej. L-lys en Staphylococcus aureus)

4. D-ala-D-ala

Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapétido. El último paso de adición de

aminoácidos es la unión del dipéptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:

una racemasa convierte la L-ala a D-ala;

creación de enlace peptídico entre dos D-ala.
Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un transportador de membrana,
llamado undecaprenil-fosfato (que abreviaremos como Lip-P), en una reacción catalizada por
una translocasa específica.

El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C55, derivado de la repetición 11 veces

de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal). Se le conoce también con el nombre de bactoprenol,
pero hoy se sabe que no es exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de
sustancias que, como los azúcares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera
hidrofóbica de la membrana.

Una vez que el NAM-pentapétido está unido al undecaprenil (por medio de pirofosfato),
una transferasa transfiere a éste la NAG desde el UDP-NAG. Se genera pues el enlace ß(1 4) entre NAG
y NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG.

En esta situación es cuando se producen la modificaciones que ya estudiamos en la estructura básica

del PG. Por ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutámico en posición (2) es
amidado (pasa a --CO-NH2. Por otro lado, se introducen los puentes peptídicos, que en el caso de esta
bacteria consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal de la L-Lys en posición (3).

Tanto la traslocasa como la transferasa está localizadas en el lado citoplásmico de la membrana, de

modo que el precursor Lip-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG, en este momento está “colgando” hacia el
citoplasma, anclado a la lámina interna de la membrana a través de bactoprenol.

Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: Ahora el bactoprenol “se da la vuelta” en la

membrana (una especie de flip-flop desde la capa interna hasta la externa), de modo que logra que el
precursor resultante de la fase 2 quede expuesto hacia el medio acuoso exterior a la membrana.
Entonces tiene lugar la polimerización de varias unidades disacarídicas: ello se logra en una reacción
de transglucosidación. Consiste en la unión de cada unidad disacarídica (con su pentapéptido) unida a
su respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez está unida
a otra molécula de Lip-P-P.

En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre
este Lip-P-P actúa una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el
undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito.

Fase 4: El polímero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y unido aún
al transportador lipídico de membrana. Ahora este polímero naciente (con sus pentapéptidos)
reacciona, por transpeptidación, con un PG aceptor preexistente. En esta reacción se ven implicados el
grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH2 libre del diaminoácido (3) del PG aceptor (o
del último aminoácido del puente peptídico).

Esto es lo mismo que decir que el enlace peptídico entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve
sustituido por otro enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido del PG naciente.
 La energía para esta reacción la suministra la hidrólisis concomitante del enlace peptídico entre las
dos D-ala terminales. Es decir, en cada reacción de transpeptidación se libera una D-ala,
correspondiente a la que ocupaba la posición (5).

Ya dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrapéptidos participan en entrecruzamientos. Las
D-ala terminales (en 5) de los péptidos no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por
una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no sólo que en el PG maduro existan
tetrapéptidos (y no los pentapéptidos originales), sino también la existencia de tripéptidos.

Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su PG maduro. Incluso algunas pueden

eliminar totalmente muchos de los péptidos originalmente unidos al NAM, mediante enzimas conocidas
genéricamente con el nombre de autolisinas. Así por ejemplo, Micrococcus luteus -un coco Gram-
positivo- merced a su actividad NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no está entrecruzado en un 50-
70%.

Antibióticos que actúan a nivel de la biosíntesis de peptidoglucano:

Estos antibióticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al
inhibir determinados pasos del ciclo de síntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulación de
precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la activación de las autolisinas de la bacteria,
que degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotónicos), por entrada
masiva de agua a la célula.

1. Fosfomicina: actúa inhibiendo la formación del 3-O-D-lactil-éter de la NAG (o sea, del NAM).
Parece ser que la base molecular estriba en la semejanza estructural entre el este antibiótico y el
 PEP (es decir, la fosfomicina es análogo estructural del PEP, lo que lleva a la inactivación de la
enzima correspondiente a esta reacción).

2. Cicloserina: Se comporta como análogo estructural de la D-alanina, por lo que inhibe la actuación
de la racemasa que convierte la L-ala a D-ala, así como de la reacción de unión de dos D-ala.

3. Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido hasta entonces al UDP y lo pasa al
bactoprenol (fase 2ª).

4. Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidación (fase 3ª), es decir, la unión de

diversas unidades disacarídicas.

5. Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo

por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana.

6. Antibióticos ß-lactámicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reacción de

entrecruzamiento por transpeptidación. (Estudiaremos su mecanismo de acción en más detalle en
el capítulo 20 sobre Quimioterápicos y Antibióticos).

12. Explique qué significa tasa de crecimiento poblacional (µ) y tiempo de generación (tg)

Que significa la constante µ?

Es la velocidad específica de crecimiento en un sustrato dado, y significa la afinidad del microorganismo

por el sustrato

Explica la velocidad de crecimiento en función del sustrato limitante

Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se
duplique.

G = t/n

Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en
cada generación.

Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica:

1 generación -------------> 2 células

2 generaciones -------------> 4 células

3 generaciones -------------> 8 células

4 generaciones -------------> 16 células

13. Detalladamente explique cómo se llega a la siguiente fórmula: µ = ln2/tg = 0.693/tg

14. Detalle experimentalmente como se construye una curva de crecimiento en bacterias y explique
para que puede servir una curva de calibración.

Realización de la curva de crecimiento de P. fluorescens

Se emplea un frasco erlenmeyer conteniendo 200 ml de caldo nutritivo estéril que se inoculó
con una suspensión bacteriana en fase exponencial de crecimiento con una concentración
suficiente para que la densidad óptica inicial a 600 nm corresponda a 0,10 (4,9 x 106 UFC/ml).
Posteriormente, los frascos se someten a agitación durante 3 h (agitación a 120 ciclos por min)
a una temperatura de 28°C.
Seguidamente, se analiza la evolución del crecimiento bacteriano tomando muestras de 2,5 ml
de la suspensión de P. fluorescens a distintos tiempos y midiendo su densidad óptica con un
Espectrofotómetro SHIMADZU UV-1800.
Al finalizar la experiencia cinética, el cultivo de P. fluorescens se inocula sobre un medio sólido
para asegurar la ausencia de contaminación.

Los ensayos para la determinación de las curvas de crecimiento se realizaron por duplicado y
tres veces en forma independiente. Con dichos datos se obtuvieron las desviaciones estándar
para cada uno de los puntos de la curva de crecimiento.
 Cultivo de P. fluorescens en medio líquido: Curva de calibración

Para realizar ensayos microbiológicos bajo condiciones equivalentes es necesario trabajar con
la misma cantidad de biomasa en una fase de crecimiento similar. Una de las formas de medir
la biomasa y determinar las fases de crecimiento de la misma es utilizando un método que
relacione dicha biomasa con una magnitud física tal como la absorbancia de luz. Para estas
determinaciones se utiliza un espectrofotómetro, en el cual la luz atraviesa un tubo conteniendo
el cultivo bacteriano. El cambio entre la intensidad de luz que incide en el cultivo (Io) y la
transmitida (I) se registra en el espectrofotómetro como absorbancia (A) o densidad óptica
(D.O.), valor derivado del log del cociente entre Io y la de la luz transmitida por la suspensión, A
= log Io/I. A medida que la concentración celular aumenta, el cultivo se hace más turbio y se
reduce la cantidad de luz transmitida que alcanza la célula fotoeléctrica (dicha intensidad se
detecta como corriente en un galvanómetro).
Esta reducción de la intensidad de luz transmitida es consecuencia de la difracción de la luz por
parte de las células. Sin embargo, la absorbancia no es una medida directa del número de
células, por lo cual es necesario realizar una curva de calibración para obtener la
correspondencia entre las medidas de la biomasa en el cultivo y las de Absorbancia (medidas a
600 nm de longitud de onda

15. Explique detalladamente los métodos directos e indirectos que existen para estudiar las curvas
de crecimiento bacteriano.

MÉTODOS DIRECTOS

En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1) Determinación del peso húmedo:
se tara un tubo de centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
se determina el peso del sedimento.
2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser
pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen
representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil
pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco
equivale a unas 5x109bacterias.
3) Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.
4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP,
clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.
 Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores
debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en
determinaciones de crecimientos en ambientes naturales

16. Explique experimentalmente como haría para estudiar el CRECIMIENTO DIAUXICO en E. coli.
Para comenzar, veamos el comportamiento de una población de esta bacteria cuando en su medio de
cultivo existen dos fuentes de carbono: glucosa y lactosa: se da un crecimiento en dos fases llamado
crecimiento diáuxico: durante una primera fase,
las bacterias aprovechan solamente la fuente
más rica de carbono (la glucosa), creciendo de
modo exponencial durante unas cuantas
generaciones, hasta que agotan esta glucosa. A
continuación se entra en una corta fase de tipo
estacionario, que conduce a una nueva fase de
crecimiento exponencial (aunque con un
coeficiente m menor que el de la fase
exponencial anterior) debido a que en ésta las
bacterias han pasado a metabolizar la lactosa.
Mientras exista glucosa en el medio de cultivo,
no se degrada la lactosa, debido al fenómeno
conocido como represión catabólica o “efecto
glucosa”: el catabolismo de la glucosa “impide”
de alguna manera que se expresen los genes del
operón de la lactosa. Pero una vez que la glucosa
se agota, el operón lac se activa y se expresa: se
sintetizan las enzimas que permiten metabolizar
la lactosa. La corta fase estacionaria representa
entre las dos exponenciales representa el tiempo
que tardan las bacterias en “conectar” y expresar los genes del catabolismo de la lactosa una vez agotada
la glucosa.
 17. Explique ud. Experimentalmente cómo haría para estudiar el efecto de la salinidad, presión y
fuerza magnética en el crecimiento de Bacillus subtilis.

El crecimiento bacteriano puede ser afectado grandemente por las cantidades de agua que entran o
que salen a la célula. Cuando el medio que rodea a un organismo es hipotónico (contiene pocos solutos)
resulta una presión osmótica mayor dentro de la célula, excepto para algunas especies marinas que no
son afectadas. La pared celular de la mayoría de las bacterias es tan fuerte y rígida, que un hinchamiento
celular ligero generalmente es inaparente.

Sin embargo, cuando las bacterias son colocadas en una solución hipertónica (contiene más cantidad de
solutos) su crecimiento puede ser inhibido considerablemente. El grado de inhibición dependerá del tipo
de soluto y de la naturaleza del organismo; el citoplasma se deshidrata y el agua sale de la célula
causando una plasmolisis. En estos casos la célula es inhibida en ausencia de agua celular suficiente. En
casos extremos hay una inactivación enzimática permanente y las células no se recuperan en soluciones
isotónicas.

1. Prepare series de tubos de caldo nutritivo adicionado de NaCl en diferentes concentraciones, al

0.85%, 3.5%, 7 %, 10% y 15% y un tubo control con el medio sin NaCl y márquelos.

2. Prepare otra series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de sacarosa al 3.0%, 7.5%, 15%,30% y un
tubo control con el medio sin sacarosa y márquelos.

3. Inocule una serie de tubos de las diferentes concentraciones de NaCl con 0.1 ml (por tubo) deBacillus
subtilis .Homogenice cada tubo. Deje una serie como controles sin sembrar. Conserve también el control
sin NaCl y sin sembrar.

4. Inocule una serie de tubos de las concentraciones de sacarosa con 0.1 ml (por tubo) . Homogenice
cada tubo. Deje una serie como testigos sin sembrar. Conserve el testigo sin sacarosa y sin sembrar.

5. Incube los medios sembrados a 37°C por 28 horas. Conserve en el refrigerador los medios testigos.

6. Haga lecturas de los cultivos en espectrofotómetro , ajustando el aparato con el testigo del medio

sin sales y sin sembrar.

En las últimas décadas, se ha presentado mucho interés en estudiar los posibles efectos de los campos
electromagnéticos en sistemas biológicos complejos y sus aplicaciones en tratamientos, diagnósticos,
monitoreo y control. Los campos magnéticos de bajas intensidades muestran diferencias significativas
entre las muestras tratadas y el testigo, cuando la energía inducida por los magnetos es mayor que la
energía térmica producida en el sistema durante el tratamiento (Recalde, 2013).

El campo magnético puede aplicarse en la estimulación de microorganismos de interés (Figura 4 y 5). A

diferencia de otros métodos es posible utilizarlo sin grandes variaciones en las líneas tecnológicas,
disminuyendo así notoriamente los costos en la producción de la industria alimentaria (Barbosa et al.
2000). En diferentes lugares del mundo se ha venido estudiando la estimulación magnética de
microorganismos para aumentar la fuente de biomasa, al igual que la producción de metabolitos de
interés químico, farmacéutico e industrial, 23 identificando factores que estimulen su producción a gran
escala (Luna et al. 2011)..
.

18. En un cuadro resuma como afecta cada uno de los determinantes ambientales en el crecimiento
de los microorganismos.

19. Qué significa la Ley de mínimo de Liebig y la Ley de tolerancia de Shelford en el crecimiento de
S. cerevisiae en un cultivo líquido estático y a temperatura ambiente.
La Ley del Mínimo de Liebig, a menudo llamada simplemente Ley de Liebig o Ley del Mínimo, es un
principio desarrollado en la ciencia agricola por Carl Sprengel (1828) y más tarde popularizado
por Justus von Liebig. Afirma que el crecimiento no es controlado por el monto total de los recursos
disponibles, sino por el recurso más escaso

La ley de Liebig fue ampliada en 1913 por el écologo estadounidenseVictor E. Shelford(1877-1968), al

agregar que cuando la planta recibe un elemtento nutricional de manera excesiva o de mala calidad,
también pueden representar un factor limitante para su desarrollo, al igual que su escasez. Esta
amplicación de Shelford se conoce como la ley de las tolerancias.

20. De manera detallada explique qué significa Aw en los microorganismos y físicamente como se
entiende que la miel tenga una actividad de agua de 0.4

Como los microorganismos dependen del agua para la síntesis de sus componentes celulares, es
necesario que ésta se encuentre disponible en el medio de cultivo para que los microorganismos la
puedan utilizar para su crecimiento. La cantidad disponible de agua para los microorganismos en un
medio de cultivo, no depende sólo de la cantidad que se ha añadido, ya que en estos medios se pueden
encontrar sustancias sólidas disueltas que disminuyen su disponibilidad.

La actividad del agua (aw) es una expresión para la cantidad de agua disponible en un sustrato dado y
se define como “la centésima parte de la humedad relativa del aire que está en equilibrio con ese
sustrato”. Este valor nos indica la cantidad de agua disponible para ser utilizada por los microorganismos

El aw mínimo en que las bacterias crecen varía ampliamente pero los valores óptimos para la mayoría
de las especies son mayores de 0,99.

Existen ciertos microorganismos que pueden crecer en medios con elevadas concentraciones de solutos
y se conocen como osmotolerantes. Otros microorganismos necesitan para crecer elevadas
concentraciones de solutos, a éstos se les denomina osmofílicos. Hay otros microorganismos que se han
llamado halofílicos o halófilos estrictos, éstos requieren iones Na+ para crecer y lo hacen óptimamente
en medios a los que se les ha añadido NaCl para obtener valores de aw menores de 0,80 y los halófilos
facultativos que crecen a concentraciones de sales capaces de inhibir a la mayoría de las bacterias. En la
siguiente tabla se presentan como ejemplo algunos microorganismos y el valor de aw en el que se
produce su crecimiento.
 21. En los mecanismos de control genético de genes individuales explique cómo funciona la
atenuación de triptófano y de histidina.

La atenuación se da sobre todo en operones de biosíntesis de aminoácidos, por ejemplo, el operón del
triptófano, que está formado por una serie de genes estructurales que codifican por enzimas implicados
en la ruta de biosíntesis del triptófano. En el operón lac, la expresión de β-galactosidasa en el nivel
inducido con respecto al basal era de 103 veces. En el operón del triptófano, cuando hay triptófano en el
medio la expresión del operón se reprime 700 veces. ¿Cómo se explica esto si se tiene en cuenta que el
represor solo reprime 70 veces? Ha de haber algún mecanismo adicional que multiplica por 10 los niveles
de represión. La explicación está en que la transcripción de estos genes está sujeta a dos controles:
represión y atenuación. La atenuación es un mecanismo que controla la habilidad de la RNA polimersa
para leer, a través de un atenuador. El atenuador es un terminador intrínseco, localizado al comienzo
de la unidad de transcripción. La característica que tiene es que algunos eventos externos (presencia de
un metabolito, como Trp para operon trp; o un evento como la traducción) controlan la formación de la
horquilla necesaria para la terminación intrínseca En la atenuación al aumentar los niveles de triptófano,
la transcripción se para antes: mRNA atenuado; al disminuir los niveles de triptófano, la transcripción no
se para sino que continúa.

La región leader (trpL), región anterior a los genes estructurales juega un papel fundamental en la
atenuación:
La RNA polimerasa comienza la transcripción, el represor reprime poco y la RNA polimerasa transcribe
un RNA correspondiente a la secuencia leader. Dependiendo de la estructura secundaria adoptada por
este RNA se forma o no una señal de terminación. La secuencia leader tiene un AUG iniciador de
traducción con una fase de lectura abierta hasta un UGA, señal de terminación de traducción, que da
lugar a un péptido de 14 aminoácidos que no sirve para nada. A mediada que se va sintetizando el
RNA leader, va adoptando una determinada estructura secundaria.

La región del RNA inmediatamente antes del sitio de terminación de la traducción (región 1), es
complementaria a la región contigua (región 2) y al aparear se forma la horquilla 1-2; continúa la
transcripción y se transcriben las regiones 3 y 4, que también son complementarias y forman la horquilla
3-4. Como la región 4 va seguida de una serie de Us, esto constituye una señal de terminación por lo
que la transcripción cesa. Además, la región 2 puede también hibridar con la región 3. Curiosamente, en
el péptido leader, de los 14 aminoácidos dos son triptófano, siendo el triptófano el aminoácido menos
frecuente en las proteínas. Otra cosa a tener en cuenta es que en bacterias, a diferencia de eucarióticos,
la transcripción está acoplada a traducción. Los ribosomas están traduciendo el RNA que se está
transcribiendo.

Teniendo esto en cuenta:

» En ausencia de triptófano en el medio: la RNA polimerasa va transcribiendo. Los ribosomas reconocen

el AUG y comienzan a sintetizar el péptido hasta que llegan a lostripletes del triptófano en los que se
detienen, debido a que no hay triptofanil tRNA en el medio.Como los ribosomas quedan detenidos en el
codon del triptófano, la región 1 del RNA leader queda "bloqueada"y no puede hibridar con la región 2 y
se impide la formación del híbrido 1-2. Al sintetizarse la región 3, la 2 hibrida con la 3, con lo que no
puede formarse el híbrido 3-4 y no se da la señal de terminación. La RNA polimerasa continúa la
transcripción del operón.

» Cuando hay triptófano en el medio, los ribosomas continuamente traducen la región correspondiente
al péptido leader de 14 aminoácidos. En este caso los ribosomas quedan parados en la señal de
terminación de traducción (UGA) impidiendo la hibridación de la región 2 con la 3, con lo que al
transcribirse la región 4 se forma el híbrido 3-4. Aparece la señal de terminación de transcripción y no se
transcribe el operón.

Generalidad del mecanismo de atenuación. ¿Es un mecanismo general de control de transcripción? ¿Es
sólo una peculiaridad del operón del triptófano? Si observamos diferentes péptidos leader de distintos
operones de biosíntesis de aminoácidos

22. Explique en el control de los siguientes operones: Operon Lac, operon Ara y Operon Gal si
estos son de regulación positiva o de regulación negativa.

OPERÓN LACTOSA: CONTROL NEGATIVO

El Operón lactosa, que abreviadamente se denomina Operón lac, es un sistema inducible que está bajo
control negativo, de manera que la proteína reguladora, producto del gen regulador i, es un represor
que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es
la lactosa. Como veremos más adelante, el operón lactambién está bajo control positivo, ya que existe
otra proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales.

Los genes estructurales del operón lactosa son los siguientes:

 El gen z+: codifica para la b-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa más
galactosa.
 El gen y+: codifica para la galactósido permeasa que transporta b-galactósidos al interior de la
célula bacteriana.
 El gen a+: codifica para la tiogalactósido transacetilasa que cataliza la transferencia del grupo
acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalatósido. Este gen no está relacionado
con el metabolismo de la lactosa.

El verdadero inductor del sistema es la Alolactosa y no la lactosa de manera que la β-

galactosidasa transforma la lactosa en Alolactosa. En los estudios del operón lactosa se utiliza como
inductor un análogo sintético de la lactosa que es el Isopropil tiogalactósido (IPTG). El IPTG no
necesita ser transportado por la galactósido permeasa para entrar en la bacteria.

Las cepas normales de E. coli son inducibles, de manera que en ausencia del inductor (la lactosa), la
proteína represora producto del gen i se encuentra unida a la región operadora e impide la unión de la
ARN-polimerasa a la región promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes
estructurales.

Sin embargo, en presencia del inductor (la lactosa), este se une a la proteína reguladora que cambia su
conformación y se suelta de la región operadora dejando acceso libre a la ARN-polimerasa para que se
una a la región promotora y se transcriban los genes estructurales. Por consiguiente, la presencia del
inductor hace que se expresen los genes estructurales del operón, necesarios para metabolizar la
lactosa.

Operón lactosa en presencia de lactosa

También es conveniente recordar que los tres genes estructurales del operón lactosa se transcriben
juntos en un mismo ARNm, es decir que los ARN mensajeros de bacterias suelen ser policistrónicos,
poligénicos o multigénicos. Sin embargo, en eucariontes los mensajreos suelen sen monocistrónicos o
monogénicos, es decir, corresponden a la transcripción de un

OPERON ARABINOSA
El operón arabinosa (ara) de Escherichi coli es un sistema más complejo que el descrito de la lactosa. La
arabinosa, una pentosa, puede ser usada como sustrato metabólico a través de la vía de las pentosas-
fosfato; las enzimas necesarias para su metabolización son: arabinosa isomerasa, ribulosa quinasa y
ribulosa-5-fosfato epimerasa que están codificadas por los genes estructurales araA, araB y araD. El
operón ara incluye además de los tres genes estructurales:
a) una región reguladora que a su vez tiene dos operadores araO1 y araO2

b) un sitio de unión para la proteína reguladora (araC) denominado araI (I=inductor),}

c) un promotor adyacente a araI y en la proximidad del promotor se encuentra,

d) un sitio de unión para la CAP-AMPc. La proteína araC está codificada por un gen araC próximo que
se transcribe desde su propio promotor (próximo a araO1) en dirección opuesta a los genes
estructurales.

El papel de la proteína es complejo, ya que es capaz de regular su propia síntesis uniéndose a araO1 y
cuando su concentración supera las cuarenta copias por célula reprime su síntesis. Respecto a los genes
estructurales, actúa también como un regulador positivo y negativo, uniéndose a araO2 y a araI, lo cual
permite una acción distinta dependiendo de las siguientes condiciones metabólicas:

a) Si la glucosa es abundante y la arabinosa es escasa: la proteína reguladora araC se une en dos

puntos, a araO2 y araI formándose un lazo de ADN que no permite la transcripción de los genes
estructurales.

b) Si la glucosa es escasa y la arabinosa es abundante: el complejo CAP-AMPc es abundante y se une a

su sitio del ADN, adyacente a araI. La arabinosa funciona como un activador, al unirse a la proteína araC
altera su conformación, y al unirse ésta a araI se combina con CAP-AMPc y aumenta la transcripción.
c) Si ambos son escasos o ambos son abundantes, el sistema de regulación no está claro aunque se sabe
que hay represión.

OPERON GALACTOSA
El modelo del operón gal de E.coli, el cual está involucrado en la utilización del azúcar galactosa, es
otro ejemplo de regulación negativa. La figura muestra la organización de este operón. La trascripción
inicia de dos promotores galpG1 y galpG2. Los productos de tres genes estructurales galE, galT y galK,
son requeridos para la conversión de galactosa a glucosa, la cual puede entrar en la ruta de la
glucolisis.
El producto del gen galK es una quinasa que se encarga de fosforilar la galactosa a galactosa-1-fosfato.
El producto del gen galT es una transferasa que transfiere la galactosa-1-fosfato a UDP-glucosa
desplazando la glucosa a UDP-glucosa.
La glucosa liberada puede entonces ser usada como fuente de carbón y energía. El producto del gen galE
es una epimerasa que convierte UDP-galactosa a UDP-glucosa para continuar con el ciclo.

OPERON ALG

El operón glnALG es un operón que regula el contenido de nitrógeno de una célula. Codifica para el gen
estructural glnA los dos genes reguladores glnL y glnG. glnA codifica glutamina sintetasa, una enzima
que cataliza la conversión de glutamato y amoníaco en glutamina, controlando así el nivel de nitrógeno
en la célula. glnG codifica NRI que regula la expresión del operón glnALG en tres promotores, que son
glnAp1, glnAp2 situado aguas arriba de glnA) y glnLp (región glnA-glnL intercistrónica). glnL codifica NRII
que regula la actividad de NRI.

El glnALG tiene tres genes estructurales:

glnA: codifica la glutamina sintetasa, una enzima que cataliza la conversión de glutamato y amoníaco
en glutamina.

glnL: codifica NRII, que regula la actividad de NRI. [2]

glnG: codifica NRI, que regula la expresión del operón glnALG en tres promotores, que son glnAp1,
glnAp2 y glnLp.

Bajo un exceso de Amonio, el operon gln ALG es transcrito a un bajo nivel desde los promotores gln Ap1
y gln Lp mediante una RNA polimerasa σ70. Esto garantiza un mínimo de glutamina sintetasa.

Estas condiciones causan altos niveles de PII, debido a que la glutamina sintetasa estimula la remosion
del UMP de la forma PII-UMP, catalizada por la enzima bifuncional uridil transferasa/uridil removedora
(UT/UR). Estos altos niveles de PII, conducen a la actividad fosfatasa de NRII, lo que causa la
defosforilacion de NRI-P, esta defosforilacion causa la baja transcripción de glnALG. Por lo tanto PII
inhibe la transcripción del operon.

*El sistema de dos componentes es una forma de regulación a través de una interacción proteína-
proteína e iniciada por una señal de transducción.

23. Cuál es la diferencia entre control estricto y control global y grafique las condiciones que
deben darse para que se puedan desarrollar estos tipos de control.

REGULADORES GLOBALES

RESPUESTA “SOS” ANTE GRANDES DAÑOS EN EL ADN

Cuando el ADN de la bacteria está seriamente dañado, existen zonas de ADN de cadena sencilla sin
reparar. Esto constituye una señal por la que la proteína RecA (que está en este momento a una
concentración basal relativamente baja) se modifica y se convierte en una proteasa muy específica
(RecA*): la RecA* rompe a la proteína LexA, que estaba reprimiendo una serie de operones, incluyendo
a recA, uvrABC, umuDC, etc. Por lo tanto, estos genes se expresan ahora a alto nivel:

la expresión de uvrABC induce una mejora de la reparación por escisión resíntesis;

la expresión de recA mejora la reparación por recombinación;

la expresión de umuDC favorece una síntesis “de emergencia” de ADN, por la que se introducen
frecuentes errores: hay aumento de la mutagénesis;
se altera la regulación del crecimiento y división celular: las células se hacen filamentosas, muy largas,
con formas anómalas.

Todos estos cambios, a pesar de las alteraciones que provocan en las células, suponen la salvaguardia,
en última instancia de su viabilidad. Cuando las circunstancias agresivas (UV) desaparezcan, el mismo
circuito regulador se encarga de que las células vuelvan rápidamente a su metabolismo normal.

RESPUESTA AL CHOQUE TÉRMICO

La llamada respuesta al choque térmico es un mecanismo adaptativo compartido por prácticamente

todos los seres vivos, consistente en el aumento rápido de la síntesis de una serie de proteínas
(denonimadas proteínas Hsp, iniciales del inglés heat shock proteins) ante la elevación brusca de la
temperatura por encima de la óptima, con un ulterior descenso lento a sus niveles basales. A pesar de
que esta respuesta se descubrió precisamente ante aumentos de temperatura, se sabe ahora que en
realidad se induce ante otros tipos de agresiones o estrés ambientales (como por ejemplo, presencia de
etanol u otros solventes orgánicos en el medio, o daño al ADN). Las proteínas Hsp protegen a las células
del daño que les causaría una posterior elevación adicional de la temperatura. Obviamente, este sistema
parece que constituye un mecanismo adaptativo de protección que, una vez que detecta incrementos
anómalos de temperatura, prepara a la bacteria para soportar períodos relativamente largos a
temperaturas por encima de la óptima de crecimiento.

“QUORUM SENSING”

El mecanismo general consiste en lo siguiente: Mientras las bacterias están creciendo, van sintetizando
una pequeña molécula sensora (autoinductora), que difunde al medio exterior, de modo que cuando
llega a tener una determinada concentración, indica a la población de esa bacteria que ha alcanzado un
cierto nivel crítico o umbral (quórum), con lo que pone en marcha la respuesta adaptativa. Esto garantiza
que la respuesta de la población se produzca en el momento adecuado, y no antes, ya que la eficiencia
de la respuesta depende de la población como tal y no de las células aisladas o en pequeños grupos. Por
ejemplo, la eficacia de la respuesta adaptativa de ciertas bacterias puede depender de la secreción de
ciertas enzimas a cierto nivel alto; tal nivel se garantiza una vez que la población bacteriana llega a una
concentración alta, y para ello las bacterias necesitan “saber” que han alcanzado dicha concentración,
precisamente debido a que detectan un nivel alto de la propia molécula sensora que han estado
produciendo y secretando.

CONTROL ESTRICTO

En la naturaleza, las bacterias pasan a menudo períodos de hambre, especialmente por carencia de
aminoácidos, de modo que este suministro de aminoácidos sería insuficiente para mantener la síntesis
proteica. La respuesta estricta es un mecanismo de adaptación rápida de las actividades celulares al
pasar la bacteria bruscamente de un medio rico a otro pobre en aminoácidos, o cuando se agota la
fuente de C. Consiste en un mecanismo de ahorro para aguantar y sobrevivir a "los malos tiempos": la
bacteria ahorra sus recursos y se implica en el menor número de actividades, hasta que no mejoren las
condiciones.
Como veremos, el ajuste se realiza por medio de una rápida respuesta al nivel general de aa-ARNt (ARN
transferentes aminoacilados).

Descripción de la respuesta estricta desde un punto de vista fisiológico:

En esta situación se puede observar una variedad de cambios metabólicos:

Reducción masiva en la síntesis de ARN estable (o sea, de ARNr y ARNt); esto hace que el nivel
de ARN total baje a un 5-10% del normal.

Al bajar el nivel de ARNr, se produce un descenso en la traducción de los ARNm

correspondientes a las proteínas ribosómicas (por el mecanismo estudiado en 3.1). Por lo tanto,
baja la síntesis de proteínas ribosómicas, y disminuye la concentración de ribosomas.

Se produce un descenso de una 3 veces en la síntesis de ARNm total. Algunos mensajeros son
muy "vulnerables" y prácticamente desaparecen.

Aumenta la tasa de degradación de proteínas, por protesas especiales.

Se dan grandes ajustes metabólicos: baja la síntesis de hidratos de C, de lípidos, de nucleótidos

y el transporte de nutrientes, pero proporcionalmente aumenta la síntesis de aminoácidos.

Como resumen de todo lo anterior, se puede concluir que esta respuesta va encaminada a: impedir por
un lado acumulación de la maquinaria de traducción (ribosomas, ARNt) que no sería útil en ausencia de
un aporte exógeno de aminoácidos; aumentar la producción de aminoácidos, tanto por degradación de
proteínas como por nueva síntesis.

Pero una vez que la célula produce los suficientes aminoácidos para las nuevas condiciones, finaliza la
respuesta estricta y la célula vuelve a sus patrones habituales de expresión genética, aunque por
supuesto adaptados al nuevo medio (aquí entrarían en operación algunos de los sistemas habituales de
regulación de la transcripción ya estudiados).

Base molecular de la respuesta estricta:

Cuando la bacteria queda deprivada en su medio de algún aminoácido (supongamos ahora que
se trata del triptófano) va a haber poco ARNt cargado con ese aminoácido (en el ejemplo, poco
ARNtTrp). Por lo tanto (y recordando algo del mecanismo de síntesis de proteínas), ese ARNt
descargado no podrá unirse al factor de elongación EF-Tu, y no podrá entrar al sitio A del
ribosoma.

Por consiguiente, cuando el ribosoma llegue a un codón para ese aminoácido (en nuestro
ejemplo del triptófano podría ser el codón UUU), al no encontrar el ARNt cargado
correspondiente, el ribosoma se detendrá.

Si la detención del ribosoma se prolonga, un ARNt descargado termina por acceder al sitio A,
aun cuando lo haga en ausencia del factor EF-Tu.

Esta entrada "ilegítima" del ARNt descargado estimula la actuación de una proteína
llamada RelA que se asocia al ribosoma. La proteína Rel A cataliza la producción de un extraño
nucleósido de guanosina provisto de 4 fosfatos, a partir del GDP:
(5') ppG + ATP --------------------> (5') ppGpp (3') + AMP

Por lo tanto, la célula va acumulando ppGpp, que es el que va a regular los operones de los ARNr
y ARNt. El mecanismo exacto de la regulación aún no se conoce en detalle, pero parece que
incluye la acción directa sobre los promotores de esos operones así como sobre la ARN-
polimerasa, bloqueando el inicio de transcripción. Igualmente parece que inhibe la tasa de
elongación de otros operones.
24.Cómo funciona el Operon gln ALG en E. coli en un medio con abundante amonio. Detalle todo el
mecanismo de regulación.

OPERON ALG

El operón glnALG es un operón que regula el contenido de nitrógeno de una célula. Codifica para el gen
estructural glnA los dos genes reguladores glnL y glnG. glnA codifica glutamina sintetasa, una enzima
que cataliza la conversión de glutamato y amoníaco en glutamina, controlando así el nivel de nitrógeno
en la célula. glnG codifica NRI que regula la expresión del operón glnALG en tres promotores, que son
glnAp1, glnAp2 situado aguas arriba de glnA) y glnLp (región glnA-glnL intercistrónica). glnL codifica NRII
que regula la actividad de NRI.

El glnALG tiene tres genes estructurales:

glnA: codifica la glutamina sintetasa, una enzima que cataliza la conversión de glutamato y amoníaco
en glutamina.

glnL: codifica NRII, que regula la actividad de NRI.

glnG: codifica NRI, que regula la expresión del operón glnALG en tres promotores, que son glnAp1,
glnAp2 y glnLp.
 Bajo un exceso de Amonio, el operon gln ALG es transcrito a un bajo nivel desde los promotores gln Ap1
y gln Lp mediante una RNA polimerasa σ70. Esto garantiza un mínimo de glutamina sintetasa.

Estas condiciones causan altos niveles de PII, debido a que la glutamina sintetasa estimula la remosion
del UMP de la forma PII-UMP, catalizada por la enzima bifuncional uridil transferasa/uridil removedora
(UT/UR). Estos altos niveles de PII, conducen a la actividad fosfatasa de NRII, lo que causa la
defosforilacion de NRI-P, esta defosforilacion causa la baja transcripción de glnALG. Por lo tanto PII
inhibe la transcripción del operon.

*El sistema de dos componentes es una forma de regulación a través de una interacción proteína-
proteína e iniciada por una señal de transducción.

25.Explique detalladamente cómo funciona el sistema de dos componentes en el Regulón PHO y

condiciones de estrés de osmolaridad.

En el centro de esta cuestión está un sistema de transducción de señal de dos componentes que detecta
fosfato ambiental y controla la expresión de muchos genes para la adquisición de alta afinidad de fosfato y
la utilización de fuentes alternativas de fósforo.

Nuestro modelo actual para la regulación de esta respuesta es que el transportador PstSCAB (un
transportador ABC de alta afinidad de fosfato) detecta los niveles de fosfato y se comunica a través de la
proteína PhoU con la histidina quinasa bifuncional PhoR, que interactúa y controla el nivel de fosforilación
en estado estacionario del regulador de respuesta, PhoB. Phospho-PhoB se une a secuencias de ADN
específicas aguas arriba de los genes del regulón Pho, interactúa con la subunidad sigma70 de la ARN
polimerasa y estimula la transcripción. La suficiencia de fosfato genera una señal que cierra el regulón de
Pho activando la actividad de la fosfatasa fosfo-PhoB de PhoR. Sin embargo, cuando el fosfato es limitante
o cuando las mutaciones eliminan cualquier componente del transportador PstSCAB o PhoU, el regulón Pho
se enciende. Esta señal de bajo fosfato estimula la actividad quinasa de PhoR permitiéndole servir como un
eficiente fosforo-donante a PhoB

La inanición de fosfato también desencadena la respuesta general al estrés en la que las células se vuelven
cada vez más resistentes a muchas tensiones ambientales. El regulador maestro de esta respuesta es sigmaS
(RpoS), un factor sigma alternativo que compite con sigma70 para dirigir la transcripción de genes bajo su
control. La regulación de sigmaS es muy compleja y tiene numerosas entradas. Sus niveles celulares están
controlados a los niveles de transcripción, traducción, rotación de proteínas y actividad.

CONDICIONES DE ESTRÉS POR OSMOLARIDAD

Componentes: Env Z (es una proteína kinasa que actúa como un sensor osmótico transmembrana), Omp
R (es la proteína reguladora), Omp C (porina presente cuando la osmolaridad interna es alta), Omp F
(porina presente en baja osmolaridad).
El modelo propone que al incrementarse la osmolaridad externa, se activa Env Z, de tal manera que
fosforila Omp R.
Los altos niveles de Omp R-P reprime la síntesis de la porina Omp F y estimula la síntesis de Omp C
mediante el enlace a regiones de baja afinidad cercana a los promotores.
Los niveles bajos de Omp R-P estimulan la transcripción de omp F mediante el enlace a sitios de alta
afinidad cercanos al promotor de Omp F.

Otro gen regulador es mic F RNA, que también es estimulado en alta concentración de Omp R-P y
produce una molécula de RNA que inhibe la traducción de RNA mensajero de la porina Omp F.

26. Explique detalladamente porque E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo. Que

regulación genética le permite estar en un medio anaeróbico, anóxico y aeróbico.
 27. Explique los eventos que suceden en un ciclo celular de Pseudomonas sp., Candida utilis y
Penicillium sp.

28. Explique porque es posible que un microorganismo tenga un tiempo total de ciclo celular de 20
minutos y que la fase C sea de 30 minutos y de división de 25 minutos.

29. Explique qué eventos se deben coordinar para que se pueda dar la división celular en Bacillus
cereus.

30. Explique qué condiciones pueden generar que los microorganismos cambien en su
conformación estructural y/o función. Detalle esto con un ejemplo.

Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus,

Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia
adaptativa cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente: si los
niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la
célula de que se avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se
implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos, estructurales, etc. (proceso
de esporulación o esporogénesis), que conducen a la diferenciación, en el interior de la célula
vegetativa original, de una célula durmiente (la endospora). La célula-madre (o sea, la célula
vegetativa original que generó la endospora) finalmente se autolisa, liberando la espora, que es
capaz de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, -incluso siglos. Las
esporas son fácilmente diseminadas por el aire; cuando caen en medios ricos en nutrientes, se
desencadena su germinación, se reinicia la actividad metabólica, de modo que cada espora
genera una nueva célula vegetativa, capaz de divisón binaria, etc.

O sea, la esporulación se puede considerar como un proceso de supervivencia “en última instancia”, la
“última carta” que se juegan ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas
de hambre de nutrientes.
Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres (suelos, hierba seca, etc.). La
esporulación es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una línea filogenética de
bacterias Gram-positivas, y que les permite sobrevivir largos períodos de carencia nutricional. (Atención:
NO son estrictamente formas de resistencia).

Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas), que representan una etapa del ciclo
de vida de ciertas bacterias, y que se caracterizan por una estructura peculiar, diferenciada respecto de
las células vegetativas, por un estado metabólico prácticamente detenido, y por una elevada resistencia
a agentes agresivos ambientales.

31. Explique detalladamente el mecanismo de diferenciación individual que sucede en Clostridium

botulinum.

Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram positivos del Género Clostridium) poseen la capacidad de
esporular, esto es, producir esporos. Se trata de estructuras biológicas genéticamente iguales a su
antecesor vegetativo, metabólicamente inactivos y altamente resistentes a condiciones
medioambientales adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV, agentes químicos).

La germinación de los esporos conduce a la forma vegetativa de la bacteria y puede suceder, en algunos
casos luego de varios años. La resistencia de los esporos a altas temperaturas -120ºC hasta 15 minutos
desecación, falta de nutrientes, presencia de sustancias químicas antisépticas, radiaciones. La
resistencia al calor se explica por los escasos porcentajes de H2O en su constitución (proceso de
desecación paulatino del esporo en la maduración) y la presencia de Calcio y ácido dipicolínico como
agentes quelantes, mientras que la resistencia a los otros agentes físico/químicos estaría dada por lo
menos en parte por la presencia de proteínas

de superficie ricas en cisteína. Esta propiedad de esporular le confiere a las especies que la poseen una
singular resistencia frente los agentes físicos y químicos habitualmente usados para la desinfección y
una permanencia prolongada en el medio ambiente. Sin duda la ubicuidad y la peligrosidad de estos
gérmenes son resaltables y su permanencia en la ecología microbiana está por demás asegurada.

El proceso de esporulación comienza durante la fase de desarrollo estacionario luego de la falta de

ciertos nutrientes, una vez que se inicia el proceso este es irreversible y una enorme cantidad de cambios
metabólicos comienzan dentro de la célula con la producción y almacenamiento de enzimas y proteínas
distintas a las de la forma vegetativa, que luego formarán parte del esporo. El factor desencadenante
está constituido por la carencia de fuentes de Carbono y Nitrógeno, concretamente la falta de
concentraciones adecuadas de trifosfato de guanosina (GPT) intracelulares inicia la esporulación y se
sabe que todas las deficiencias nutricionales que conducen a una disminución del pool 4 de GPT
desencadenan la esporulación. Dos tipos de carencias son conocidas como responsables de la
disminución del GPT:

1. Disminución del precursor purínico Pribosil-PP, que ocurre cuando hay carencias de Carbono.

2. La carencia de aminoácidos la cual se relaciona con el aumento de nucleótidos fosforilados de

guanina, ppGpp y pppGpp. La germinación de los esporos comprende

3 etapas:
 a. ACTIVACIÓN: La activación es esencial para el proceso de la germinación y un esporo activado germina
en forma irreversible. Activan los esporos el calor y algunos estímulos químicos.

b. GERMINACION: Esta etapa comienza cuando los esporos activados son estimulados por variados
elementos nutritivos y no nutritivos (l-alanina, el más común,) glucosa, otros aminoácidos. Cambios
morfológicos y fisiológicos muy interesantes se producen cuando finaliza el estado latente; el esporo se
hincha, pierde su refringencia, pierde su resistencia a los agentes físico-químicos y comienza a
observarse actividad metabólica.

c. CRECIMIENTO: En esta etapa se produce la síntesis proteica y de los componentes estructurales de la

futura forma vegetativa. La membrana del 'core' del esporo se irá convirtiendo en pared celular y la
actividad proteica se irá intensificando. En este momento toda esta actividad puede anularse o
interferirse por Antibióticos, o carencias de nutrientes. Por su especial constitución los esporos no se
tiñen con el Gram aunque existen técnicas especiales que permiten ponerlos en evidencia. Si se tiñe una
bacteria esporulando mostrará el esporo en su interior (debemos recordar que cuando el esporo finaliza
su maduración la forma vegetativa se desintegra) como una imagen en negativo -ausencia de colorante

32. Porque se dice que en las mixobacterias existe un proceso de “pluricelularidad” y que se podría
hablar de “tejidos procariotas”. Explique detalladamente. Por otra parte, indique si es lo mismo decir
mixomicetos o mixobacterias

Las mixobacterias pertenecen al Dominio Bacteria y se describen en el Manual de Bergey’s para la

Determinación Bacteriológica (Holt et al., 1994) dentro del grupo 16, como bacterias fructificantes y
deslizantes; en la segunda edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2001-2004) son
ubicados en un único Orden dentro de las Delta Proteobacterias. Es importante diferenciar este grupo de
microorganismos de los Myxomicetes, organismos eucariónticos mucilaginosos no endoparásitos que han
sido ubicados recientemente dentro del Reino Protoctista (Spiegel et al., 2004).

Estas bacterias presentan un movimiento deslizante a lo largo de interfases tales como el agar o
superficies de vidrio, es así que pueden penetrar el sustrato y moverse a través de él, por ejemplo a través
de un gel de agar al 1,2 – 1,5%. 9

Presentan 3 capacidades que los distingue dentro de los procariontes: (Wireman & Dworkin, 1979). 1.
Movimiento deslizante en la fase vegetativa, en la cual forman una delgada capa que sirve de rastro para
otras células, luego de lo cual cubren gradualmente la placa.

2. Tiene un sofisticado sistema de comunicación celular.

3. Muestran un notable potencial morfogenético, el cual es expresado en 2 niveles:

 - En un primer nivel, bajo condiciones adversas inducido por condiciones de inanición, producen un
cuerpo fructificante en cooperación mediante una morfogénesis de 105 – 106 células; precisamente es
esta característica la que los distingue de los demás procariontes;

- Dentro del cuerpo fructificante, en un segundo nivel de morfogénesis celular, las restantes células
vegetativas se transforman en estructuras denominadas

MIXOSPORAS: una mixospora se define como una célula mixobacteriana en reposo, contenida en un
cuerpo fructificante. Una mixospora contenida dentro de una cápsula dura, se denomina microquiste. -
Podemos entonces decir que las mixobacterias presentan un ciclo de vida complejo (Reichenbach, 1999),
pues presentan una fase vegetativa con presencia de nutrientes en el medio y un ciclo de desarrollo celular
que se desencadena ante la carencia de nutrientes siendo denominado fase quística (Figura 1).

33. Cómo se produce la diferenciación celular en actinomicetos y porque son importantes estos
microorganismos.

Los actinomicetos son bacterias filamentosas, Gram positivas, que se encuentran ampliamente distribuidas
en el medio ambiente, son microorganismos con propiedades quitinolíticas, alto contenido de guanina y
citosina en su DNA, característica que los hace morfológicamente diversos entre sí y ayuda a diferenciarlos
de otras bacterias Gram positivas (El-Tarabily & Sivasithamparam, 2006; Franco-Correa et al., 2008;
Sastoque et al., 2007; Macagnan et al., 2008).

Debido a su amplia distribución, se pueden encontrar en superficies rocosas y en suelo rizosférico, ricos en
humus, hojarasca y estiércol, sedimentos marinos. La mayoría de las especies son heterótrofas, aerobios,
mesófilas, crecen en un rango de temperatura entre 25°C y 30°C y son poco tolerantes a la acidez, razón
por la cual requieren pH neutro para su óptimo crecimiento, aunque crecen en un rango de pH entre 5.0 y
9.0 (El-Tarabily & Sivasithamparam, 2006; Franco-Correa, 2008; Jayasinghe & Parkinson, 2008).

En consecuencia, en suelos con un pH inferior a 5.0, pueden encontrarse en raras ocasiones, al igual que
en suelos con una alta humedad entre el 85-100% de capacidad de campo, en comparación con suelos que
presentan condiciones semiáridas, con una humedad baja, como los suelos franco arenosos, son ideales
para el desarrollo de estos microorganismos debido a la aireación y poca capacidad para retener agua (El-
Tarabily & Sivasithamparam, 2006). Diversos estudios afirman que factores importantes para estimular el
crecimiento de estos microorganismos, como la humedad relativa, pH, disponibilidad de nutrientes en el
suelo, abundancia de materia orgánica, mesofauna, y temperatura, son aspectos que controlan la densidad
de estos microorganismos, que se han encontrado de manera abundante (alrededor de 11 104 -106
esporas/gramo) y más de veinte géneros han sido aislados bajo las condiciones mencionadas
anteriormente (Shrivastava et al., 2008; Jayasinghe & Parkinson, 2008; Ventura et al., 2007).

34. Explique las diferencias de pasteurización, UHT, tindalización Esterilizacion humeda y

esterrilizacion seca. Indique sus parámetros de operación y en qué casos se deben usar.

PASTEURIZACIÓN.

La pasteurización es un proceso térmico realizado a los alimentos: los procesos térmicos se pueden
realizar con la intención de disminuir las poblaciones patógenas de microorganismos o para desactivar
las enzimas que modifican los sabores de ciertos alimentos. No obstante, en la pasteurización se
emplean generalmente temperaturas por debajo del punto de ebullición (en cualquier tipo de alimento),
ya que en la mayoría de los casos las temperaturas superiores a este valor afectan irreversiblemente
ciertas características físicas y químicas del producto alimenticio; así, por ejemplo, si en la leche se
sobrepasa el punto de ebullición, las micelas de la caseína se “coagulan” irreversiblemente (o dicho de
otra forma, se “cuajan”). El proceso de calentamiento de la pasteurización, si se hace a bajas
temperaturas, tiene además la función de detener los procesos enzimáticos. Hoy en día, la
pasteurización realizada a los alimentos es un proceso industrial continuo aplicado a alimentos viscosos,
con la intención de ahorrar energía y costes de producción. Existen tres tipos de procesos bien
diferenciados:

a) Pasteurización VAT o lenta.

b) Pasteurización a altas temperaturas durante un breve periodo de tiempo(HTST - High

Temperature/Short Time).

c) El proceso a ultra-altas temperaturas (UHT - Ultra-High Temperature)

Proceso UHT.

El proceso UHT es de flujo continuo y mantiene la leche a una temperatura superior más alta que la
empleada en el proceso HTST, y puede rondar los 138 °C durante un período de al menos dos segundos.
Debido a este periodo de exposición, aunque breve, se produce una mínima degradación del alimento.
La leche cuando se etiqueta como “pasteurizada” generalmente se ha tratado con el proceso HTST,
mientras que para la leche etiquetada como “ultrapasteurizada” o simplemente “UHT”, se debe
entender que ha sido tratada por el método UHT

El reto tecnológico del siglo XXI es poder disminuir lo más posible el período de exposición a altas
temperaturas de los alimentos, haciendo la transición de altas a bajas temperaturas lo más rápida
posible, disminuyendo el impacto en la degradación de las propiedades organolépticas de los alimentos;
por esta razón, se está investigando la tecnología basada en microondas, que permite este tipo de
efectos (es empleado incluso en carnes). Este método es muy adecuado para los alimentos líquidos
ligeramente ácidos, tal como los zumos de frutas y los zumos de verduras (como el gazpacho), ya que
permite períodos de conservación de 10 a 45 días si se almacenan refrigerados a 10 °C

LA TINDALIZACIÓN

es un método de esterilización fraccionada con calor que se aplica para esterilizar materiales y medios
de cultivo termosensibles, que no pueden someterse a temperaturas superiores a los 100ºC. La
denominación de este proceso es un homenaje al físico John Tyndall que describió formas bacterianas
con una elevada resistencia al calor, diseñando esta metodología para su eliminación. Actualmente el
proceso de tindalización se lleva a cabo en autoclave con la válvula abierta de modo que no se produzca
sobrepresión y por lo tanto, no se alcanzan temperaturas superiores a las de ebullición (100ºC). El
procedimiento consiste en aplicar tratamientos térmicos de 30 minutos a 100ºC durante tres días
consecutivos, dejando el material a temperatura ambiente o a 37ºC en intervalos de 24 horas. Las
temperaturas cercanas a los 100ºC destruyen las formas vegetativas pero no las endosporas bacterianas,
por eso se requiere la realización de tres periodos de tratamientos consecutivos con el fin de permitir el
desarrollo de las formas esporuladas en los intervalos a temperatura ambiente. Este procedimiento se
puede utilizar en medios de cultivo con azúcares, gelatina, sueros o huevo que se descomponen a
temperaturas elevadas. También se suele utilizar de forma aplicada en el control de microorganismos
en alimentos.

Esterilización seca

En este caso se realiza en una estufa denominada horno Pasteur , en cuyo interior se disponen los
materiales que van a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado, o en contenedores
especiales para evitar la contaminación ambiental una vez finalizado el proceso y hasta su utilización. La
destrucción microbiana se produce por oxidación de los componentes celulares y desnaturalización de
proteínas. Este es un proceso menos eficaz por la ausencia de agua y por lo tanto deben incrementarse
tanto las temperaturas como los tiempos de exposición
Autoclave (calor húmedo)

El calor húmedo por medio de utilización de vapor de agua es el agente esterilizante más
frecuentemente utilizado. Este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por
desnaturalización de proteínas y enzimas, y desestabilización de membranas. La esterilización con calor
húmedo, se utiliza principalmente con el autoclave. El autoclave, desarrollado por CHAMBERLAND en
1884, es un aparato (constituido por una caldera, que se puede cerrar herméticamente con una tapa
metálica y que presenta una resistencia eléctrica en su interior (antiguamente por gas) que calienta el
agua. Este aparato permite que en el interior de la caldera se desplace el aire por una válvula de purga,
dejando que se acumule posteriormente vapor saturado a presión, que alcanza temperaturas superiores
a los 100ºC sin que se produzca ebullición.

Figura 1. Autoclaves: actual

(izquierda) y antiguo (derecha).

El material a esterilizar se introduce en el interior de la cámara, se somete al vapor de agua con

sobrepresión (lo más común: 1,1 atmósferas), hasta alcanzar temperaturas adecuadas para la
eliminación de los microorganismos y todas las formas de resistencia, sin que se produzca ebullición de
los medios líquidos. Las temperaturas y los tiempos de exposición pueden variar dependiendo del
material a esterilizar (LEWIS, 2002).
 35. Cómo funciona la esterilización por filtración, que elementos se requieren para su uso, que se
puede esterilizar con estos equipos y cuánto cuesta esterilizar una solución.

La filtración es un procedimiento físico de esterilización de fluidos en el cual los microorganismos no son

destruidos, sino simplemente retenidos por un material filtrante.

La filtración sólo puede ser utilizada con fluidos, sean líquidos o gaseosos. Se suele utilizar con soluciones
cuyos componentes sean termolábiles y por lo tanto no pueden ser esterilizadas en el autoclave, por
ejemplo, soluciones concentradas de azúcares, de urea, vitaminas, factores de crecimiento, etc.La
filtración tiene la desventaja de que es ineficaz con determinados microorganismos, como los virus o los
micoplasmas. Los primeros son mucho más pequeños que el tamaño del poro, por lo que no son
retenidos. Los segundos son pleomórficos ya que carecen de una pared de peptidoglicano y pueden
adaptarse al tamaño de poro, por lo que tampoco son retenidos.

El material filtrante debe de ser inerte para no reaccionar con los componentes de la solución, presentar
resistencia mecánica y tener un tamaño de poro menor que los microorganismos que deben ser
retenidos. Tradicionalmente se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamaño de poro de 0,45 o
de 0,22 micras. El fluido es impulsado mediante la presión ejercida por el embolo de una jeringuilla, o
bien mediante el uso de un quitasato y un sistema de vacío.

36. Explique ud que significa dimorfismo celular en hongos.

Es un importante factor de patogenicidad de determinados hongos .Se denominan hongos dimórficos

a aquellos que tienen la capacidad de adoptar la forma de levadura o producir la forma micelial o
filamentosa, según ciertas condiciones ambientales o de nutrientes .Uno de los factores ambientales
más importantes para el crecimiento de una u otra forma es la temperatura, a 25-28 °C crecen en
forma de hongos filamentosos (mohos) y a 35-37°C crecen en forma de levaduras. Entre los patógenos
humanos más estudiados que presentan dimorfismo podemos mencionar a Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Sporotrix schenkii y Penicillium marneffei.
Estos son capaces de desarrollarse en forma levaduriforme en los tejidos del hospedador (37°C)
(forma parasitaria) y en forma filamentosa (forma saprofítica) en cultivos a 28°C. Coccidioides sp. es
un hongo dimórfico dependiente de los nutrientes no de la temperatura, tanto a 37ºC como a 28ºC
desarrolla la forma filamentosa o saprofítica.
 37. Cómo se puede hacer crecer bacterias anaerobias estrictas. Explique detalladamente que
elementos se requieren y cuánto cuesta hacer crecer microorganismos en estos sistemas.

Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden
cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para
añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A
veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las
cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas (Algunos laboratorios tienen
habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno.

Figura .Cámara líbre de oxígeno. Los microorganismos anaeróbiros estrictos mueren cuando se exponen
al oxígeno, incluso cuando la exposición es breve. Normalmente son suficientes procedimientos menos
complejos
38. En un cuadro presente lo siguiente:
Microorganismo
T˚ óptima pH óptimo Aw Oxígeno Medio de cultivo y
su composición
05 bacterias
Gram negativas
05 bacterias
Gram positivas
05
Arqueobacterias
05 Levaduras
05 hongos
filamentosos
39. Explique a que se denominan medios de cultivos comunes, selectivos, diferenciales, medios de
almacenamiento, medios de propagación, medios de producción, medio minimo de sales, medio basal,
medio basal de glucosa y agente de disolución. Con un ejemplo explique para Bacillus subtilis cuales serían
esos medios.

a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos

poco existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por
ejemlo: agar común o caldo común.

b)SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas
delmedio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el
crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el
crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar
microorganismos na partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite
el crecimiento de ciertos estafilococos)

c) DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios géneros y especies de
microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria
que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el
consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya
única fuente de carbono es el citrato sódico, entonces en él solo crecerán las bacterias capaces de
desarrollarse utilizando como única fuente de carbono ese componente. A menudo la separación se basa
en la diferencia de color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que permite
diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metálico) de Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de
centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo producen colonias de color gris
blancuzco

d)MEDIO DE PROPAGACIÓN : Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria.
Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón
(BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
e) MEDIOS DE ALMACENAMIENTO: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos
interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos
utilizados en el Laboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres
formas:

a) haciendo pases periódicos de placa a placa,

b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y

c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

MEDIO MÍNIMO: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una
especie;

40. Desarrolle el protocolo de aislamiento de Bacillus sp., pseudomonas sp., E. coli y S. cerevisiae

Aislamiento deE. coli.

Para el aislamiento de E. coli, se trabajó con la metodología de Hitchins y col., la cual involucra un
enriquecimiento previo en caldo triptófano fosfato de doble concentración a44°C, durante un período
de 2 horas. Al cabo de las 2 horas ,se procedió al aislamiento deE. Coli a partir de siembras pore strías
en superficies con réplica de placas con agar Levine (Merck) a una temperatura de 37°C, durante 24
horas. La identificación se realizó a través de pruebas bioquímicas convencionales y confirmándose la
especie mediante el empleo de galerías ID 32E (BioMeriuex- Zuoz Pharma).
S

Para el aislamiento de P. aeruginosa

Las muestras fueron sembradas en agar selectivo cetrimide e incubadas a 35 ºC por 18 a 24 horas. En
el proceso de identificación se evaluó con coloración Gram (-), producción de pigmentos ferrociánicos
(+), crecimiento a 42 ºC en caldo peptonado (+), prueba de oxidasa (+) y citrato (+). Para la detección de
aislamientos productores de betal actamasa clásica se empleó el método yodométrico cualitativo de
acuerdo al esquema seguido por Livermore & Brown . Para la detección de betalactamasa de espectro
extendido se empleó el método de doble difusión con discos para bacterias gramnegativas de acuerdo
al esquema seguido por Weldhagen et al.

Aislamiento de Saccharomice cerevisae

Fermentar dentro de bolsas plásticas estériles (300 mL de mosto) a 25 °C por 8 d. Cada 2 d se tomaron
alícuotas de 1 mL, realizar tres diluciones decimales consecutivas y sembrar mediante extensión en
superficie sobre agar papa dextrosa (APD) adicionado de rosa de Bengala (60 mg L-1) y ampicilina (100
mg L-1), incubándose 5 d a 25 °C. Las colonias que desarrollaron y presentaron la morfología típica de
levaduras se sembraron mediante un asa estéril en medio Agar Nutritivo-Dextrosa para levaduras
(NYDA), donde se incubaron 3 d a 25 °C.

Para diferenciar las cepas del género Saccharomyices, las levaduras aisladas sembrar en dos pases
consecutivos en medio agar Lisina (Oxoid, Hampshire, UK), selectivo para no-Saccharomyces (Medina et
al., 2007), incubándose 4 d a 25 °C.

Aislamiento en Bacillus spp.

Las cepas bacterianas se identifican como "típicas de Bacillus" cuando poseen bordes irregulares,
aplanados, de color blanco mate, brilloso, aspecto harinoso, ceroso, seco o cremoso. Simultáneamente
se aíslan en una nueva caja Petri con PDA para su purificación, además fueron debidamente etiquetadas
con números y códigos PSL, incubar 28°C y observar a diario durante un periodo de cinco días
Posteriormente se realiza tinción de Gram para determinar bacterias Gram+ utilizando la metodología
de Carrea (2009) y 4 pruebas bioquímicas:
1. Prueba de la catalasa, adaptado de Zapata (2012)

 Cada cepa fue sembrada por estría cruzada en medio de cultivo Agar Nutritivo, se incubó a
28°C por 24 horas.Por cada cepa se colocó en un portaobjetos codificado tres gotas de agua
oxigenada (H2O2).

 Con un palillo se tomó un poco de la colonia y se colocó en la primera goa, lo mismo se realizó
para las dos gotas restantes con diferentes palillos, teniendo así tres repeticiones para
comprobar la reacción.

 La prueba es positiva una vez que se obsera la formación de burbujas debido a la producción
de O2 por la actividad enzimática.

2. Prueba en Agar Hierro Triple Azucar (Cuervo, 2010)

3. Voges Proskauer (Aquiahuatl et al., 2012)
4. Prueba de la hidrólisis del almidón (Carrera, 2009)