Publicacion Tirbas 2013 PDF

RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y
AGRICULTURA SUSTENTABLE
Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez

Claudio Penna & Fabricio Cassn
EDITORES
ISBN 978-987-26716-1-7
Asociacin Argentina de Microbiologa

Repblica Argentina
2013

EDITORES
3
4

EDITORES
Publicacin Electrnica del Taller Internacional sobre

Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable 2010
Desarrollado el 21 y 22 de Octubre de 2010.
Ciudad Autnoma de Buenos Aires. Buenos Aires. Argentina
ISBN 978-987-26716-1-7

Repblica Argentina
2013
5
Rizosfera, biodiversidad y agricultura sustentable / Ins Garca de Salamone
... [et.al.]; edicin literaria a cargo de Ins Garca de Salamone.
1a ed.Buenos Aires: Asoc. Argentina de Microbiologa; Ins Eugenia Garca
de Salamone, Susana Vzquez, Claudio Penna, Fabricio Daro Cassn, 2012.
E-Book.
ISBN 978-987-26716-1-7
1. Biologa de Suelos. I. Garca de Salamone, Ins II. Garca de Salamone,

Ins, ed. lit.
CDD 631.46
Fecha de catalogacin: 21/11/2012
RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y AGRICULTURA SUSTENTABLE

EDITORES
Queda hecho el depsito que marca la ley 11.723.

Impreso en Argentina Printed in Argentina.
Queda prohibida la reproduccin total o parcial del texto de la presente obra en cualquiera
de sus formas, electrnica o mecnica, sin el consentimiento previo y escrito de la Editorial.

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6
http://www.aam.org.ar/
Comit Organizador TIRBAS 2010

Ins Eugenia Garca de Salamone
Fabricio Cassn
Claudio Penna
Susana Vzquez
Diego Sauka
Comisin Directiva AAM 2010-2011

Presidente Manuel Gmez Carrillo
Vicepresidente Marta Rocci
Secretaria Mara Cecilia Freire
Secretaria de actas Mara I. G. Fernndez
Prosecretaria Alejandra Picconi
Tesorera Adriana De Pasulis
Protesorero Claudio Penna
Vocal Titular 1 Jorge Santoianni
Vocal Titular 2 Mara Jos Gallego
Vocal Titular 3 Marta Rivas
Vocal Titular 4 Mara Soledad Ramirez
Vocal Suplente 1 Adriana Sucari
Vocal Suplente 2 Diego Sauka
Vocal Suplente 3 Manuel Boutureira
Vocal Suplente 4 Gustavo Giusiano
Comisin Directiva DIMAYA/AAM 2010-2011

Presidente Fabricio Cassn
Vicepresidente Claudio Penna
Secretario Diego Sauka
Tesorera Ins Garca de Salamone
Secretaria de actas Susana Vzquez
Vocal Titular 1 Lucas Ruberto
Vocal Titular 2 Rosana Massa
Vocal Suplente 1 Mnica Baldini
Vocal Suplente 2 Diego Libkind
7
8
ndice de Contenidos
Prlogo............................................................................................ 13
Captulo 1
Efecto de las prcticas agronmicas sobre las bacterias deletreas
rizosfricas y endoftas ................................................................... 15
Effect of agronomic practices on deleterious rhizosphere and endophytic bacteria
Marleny Burkett-Cadena, Camilo A. Ramirez, Mark R. Liles, Joseph W. Kloepper
Captulo 2
Interacciones entre fitopatgenos y microorganismos benficos
en la rizosfera ................................................................................. 33
Interactions among plant pathogens and beneficial rhizosphere microorganisms
Marta C. Rivera, Eduardo R. Wright
Captulo 3
Hongos formadores de micorrizas arbusculares: Influencia de las prcticas
agronmicas sobre su diversidad y dinmica de colonizacin ....... 47
Arbuscular mycorrhizal fungi: Influence of agronomic practices on diversity
and dynamics of colonization
Santiago Schalamuk, Magdalena Druille, Marta N. Cabello
Captulo 4
Huellas de la simbiosis pasto-endofito en el agroecosistema ....... 73
Footprints of grass-endophyte symbiosis in agroecosystems
Marina Omacini, Pedro E. Gundel, Mara Semmartin
Captulo 5
Bacillus thuringiensis y su utilidad en el control de insectos
asociados a la rizosfera ................................................................... 89
Bacillus thuringiensis and their utility in the control of insects associated
to the rhizosphere
Diego H. Sauka; Rodrigo H. Monella, Graciela B. Benintende
Captulo 6
Nematodos como indicadores de la calidad del suelo:
Efectos de la fertilizacin nitrogenada ......................................... 109
Nematodes as indicadors of soil quality:Effects of nitrogen fertilization
Claudia Viviana Azpilicueta, Mara Cristina Aruani
9
Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez, Claudio Penna, Fabricio Cassn
Captulo 7
Perfil Fisiolgico de Comunidades de Suelo Basado en el Consumo
de Oxgeno .............................................................................................. 123
Community-Level Physiological Profiling of Soil Communities Based on
Oxygen Consumption
Jay L. Garland, M. Celina Zabaloy
Captulo 8
Bacterias solubilizadoras de fsforo como biofertilizantes:
aislamiento, caracterizacin, diversidad y promocin del crecimiento vegetal .... 137
Phosphate solubilizing bacteria as biofertilizers: isolation, characterization,
diversity and growth vegetable promotion
Leticia A. Fernndez, Marcelo A. Sagardoy
Captulo 9
Investigacin aplicada en Azotobacter sp. dirigida a la promocin de
crecimiento en cultivos de inters econmico en Colombia .................... 151
Azotobacter sp. applied research aimed to growth promotion of crops with
economics interest in Colombia
Ruth Rebeca Bonilla, Ren Novo, Belisario Roncallo, Mauricio Camelo,
Paola Criollo, Germn Andrs Estrada, Mara Fernanda Garrido, Mnica Lpez,
Andrs Eduardo Moreno, Melissa Obando, Lorena Parra, Diego Mauricio Rivera,
Daniel Fernando Rojas, Mario Van Strahlen, Corina Zambrano
Captulo 10
El gnero Pseudomonas en suelos agrcolas y en rizosfera. De molculas
a comunidades ......................................................................................... 173
Pseudomonads in agricultural soils and rhizosphere. From molecules to
communities
Betina Agaras, Claudio Valverde
Captulo 11
Asociacin entre Azospirillum brasilense y plantas de frutilla
(Fragaria ananassa): quimiotxis y colonizacin radicular ............................... 195
Association between Azospirillum brasilense and strawberry plants
(Fragaria ananassa): chemotaxis and root colonization
Ral O. Pedraza, Mara F. Guerrero-Molina, Beatriz C. Winik,
Mara L. Tortora, Alicia L. Ragout, Katia R. Teixeira, Beatriz E. Baca
Captulo 12
Etileno como mediador de los mecanismos directos e indirectos de la
promocin del crecimiento vegetal ejercido por rizobacterias ................... 215
Ethylene as a mediator of direct and indirect mechanisms carried out by
plant growth promoting rhizobacteria
Claudia M. Ribaudo, Daniela S. Riva, Jos A. Cur, Clara Ponds,
Antonio Granell-Richart, Mara L. Cantore
10
ndice de Contenidos
Captulo 13
Ms all del tratamiento a las semillas: Evolucin de productos basados
en PGPRs que contienen complejas comunidades microbianas ............................. 241
Beyond seed treatments: evolution of PGPR products containing complex
microbial communities
Joseph W. Kloepper, Juan David Castillo, Marleny Burkett-Cadena, Katheryn S. Lawrence
Captulo 14
Bacterias promotoras de crecimiento vegetal como componentes
en el mejoramiento ambiental .......................................................................... 261
Plant growth-promoting bacteria as a component for environmental improvement
Luz E. de-Bashan, M.C. Juan-Pablo Hernndez, Yoav Bashan
Captulo 15
Diversidad funcional de comunidades microbianas rizosfricas
en suelos expuestos a sustancias contaminantes ............................................... 287
Functional diversity of rhizosphere microbial communities in soils
exposed to contaminants
Jhovana S. Escobar Ortega, Agr. Luciana P. Di Salvo, Florencia DAuria,
Sebastian M. Gatica, Ins E. Garca de Salamone
Captulo 16
Acumulacin y tolerancia al metal pesado cadmio en rizobios de
vida libre y en simbiosis con leguminosas ........................................................... 307
Accumulation and tolerance to heavy metal cadmium in free-living rhizobia
and in symbiosis with legumes
Stella Castro, Eliana Bianucci, Jsica Rivadeneira, Mara del Carmen Tordable,
Adriana Fabra, Juan Sobrino-Plata, Luis Hernndez, Ramn Carpena-Ruiz
Captulo 17
Micorrizorremediacin como alternativa para la recuperacin de
suelos contaminados por actividades mineras ............................................................ 325
Myco-rhizoremediation as alternative for recovering soils polluted
by mining activities
Pablo Cornejo, Sebastin Meier, Csar Arriagada, Fernando Borie
11
12
Prlogo
Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable son temas muy amplios

y mutlidisciplinarios por naturaleza. Numerosos cientficos de reas tales como
ciencias del suelo, produccin y proteccin de cultivos han centrado sus
investigaciones en los mismos y la informacin disponible actualmente puede
abordarse desde un punto de vista holstico. Durante las ltimas dcadas, ha
habido avances significativos y se han hecho evidentes las conexiones entre la
sustentabilidad de los agroecosistemas y el mantenimiento de la biodiversidad.
Por su parte, las races aun siguen siendo un desafo de investigacin pero se
ha esclarecido su influencia sobre los ciclos biogeoqumicos y se ha avanzado
significativamente en el conocimiento de las asociaciones entre organismos
en el ambiente de la rizosfera.
Este libro tiene diecisiete captulos y brinda tanto informacin balanceada
como conocimiento integral de la rizosfera. El mismo pretende colaborar con
la comprensin sobre varios aspectos que son la base para lograr
sustentabilidad agrcola y ambiental. Los captulos 1, 2 y 3 analizan diversos
aspectos de los efectos de las prcticas agronmicas sobre las comunidades
de hongos formadores de micorrizas arbusculares, bacterias benficas y
deletreas de la rizosfera. Los cambios que se producen por el manejo
inadecuado de los sistemas agrcolas pueden conducir a cambios en las
comunidades microbianas que puede provocar la produccin exagerada de
metabolitos nocivos para las plantas. En el captulo 4 se describen los aspectos
biolgicos, ecolgicos y agronmicos mas relevantes de la simbiosis entre
pastos y hongos endfitos asexuales y se resumen los conocimientos actuales
acerca de las vas por las cuales pueden modificar las relaciones que establecen
las plantas hospedantes con la biota del suelo, a corto y a largo plazo y as
modular la estructura y el funcionamiento de las comunidades. Tambin se
identifican los vacos de conocimiento acerca de las implicancias de esta
simbiosis en el manejo del agroecosistema y en qu medida existen alternativas
para manipularla de manera tal que favorezca una menor utilizacin de
insumos. Los captulos 5 y 6 analizan las comunidades de nematodos e insectos
asociados a la rizosfera. Por su parte, el captulo 7 analiza los perfiles fisiolgicos
de las comunidades microbianas edficas utilizando una metodologa basada
en la evaluacin del consumo de oxgeno frente a la utilizacin de distintas
fuentes de carbono. En este libro se pueden encontrar varios captulos que
analizan las comunidades de distintas bacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPB) tales como bacterias solubilizadoras de fsforo del suelo
13
(captulo 8), como la aplicacin del gnero Azotobacter (captulo 9),

Pseudomonas (Captulo 10), Azospirillum brasilense (capitulo 11). Los captulos
12 y 13 incluyen un anlisis detallado de mecanismos directos e indirectos
sobre el crecimiento vegetal de varias rizobacterias. Los dos captulos siguientes
estn dedicados a algunos modelos de utilizacin de PGPB como herramienta
del mejoramiento ambiental (Capitulo 14) y a la caracterizacin de la diversidad
funcional observada en las comunidades microbianas rizosfricas en suelos
expuestos a sustancias contaminantes (Captulo 15). Los dos ltimos captulos
analizan el efecto de la contaminacin con el metal pesado cadmio sobre las
comunidades de rizobios tanto libres como en asociacin con plantas
leguminosas (Captulo 16) y la micorrizacin como una alternativa para
recuperar suelos contaminados por actividades mineras (Capitulo 17).
Este libro no es una revisin enciclopedista. Sin embargo, un nfasis
internacional ha sido dedicado a las tendencias y probables futuros
desarrollos. Los captulos incluyen tanto aspectos tericos como prcticos y
seguramente podrn servir de base para el diseo de futuros trabajos de
investigacin a travs de los cuales nuevos y significativos desarrollos pueden
ser esperados. Esta obra ser probablemente til para asesores agronmicos,
estudiantes, docentes, e investigadores tanto de universidades e institutos
de investigacin trabajando en reas vinculadas a la microbiologa agrcola y
ambiental, salud y calidad del suelo como pilar de la agricultura sustentable.
En base a lo expresado hasta aqu, con gran placer y satisfaccin quisiera
expresar mi inmensa gratitud a todos los autores por sus contribuciones y
por su paciencia sin lmites, as como, tambin por su apoyo y comprensin
constante durante el proceso de generacin de este libro. Adems, quisiera
agradecer el apoyo de la Asociacin Argentina de Microbiologa (AAM) y a los
miembros del comit editor de la Divisin de Microbiologa Agrcola y
Ambiental (DIMAYA-AAM) por facilitar y gestionar los medios econmicos y
administrativos para la concrecin de este libro que ha sido titulado: Rizosfera,
Biodiversidad y Agricultura Sustentable.

Ing. Agr., M.Sc., Ph.D.
Responsable del Comit Editor
14
Captulo 1
Efecto de las prcticas agronmicas sobre
las bacterias deletreas rizosfricas y
endoftas
Effect of agronomic practices on deleterious rhizosphere
and endophytic bacteria
Marleny Burkett-Cadena a,1, Camilo A. Ramirez b, Mark R. Lilesc, Joseph W. Kloeppera
a
Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, Auburn, AL 36849 USA.
b
Instituto de Biologa, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia. c Department of
Biological Sciences, Auburn University, Auburn, AL 36849 USA. 1Corresponding author.
E-mail: [email protected]
Introduction
Agronomic practices are well known to affect soil microorganisms (Lupwayi et al.
1998). The effects of tillage (Ceja-Navaro et al. 2010), cover crops (Carrera et al. 2007),
crop rotation (Buyer et al. 2010), and applications of pesticides (Allison et al. 2007),
fertilizers (Jangid et al. 2008), and soil disinfectants (Roux-Michollet et al. 2008) on
soil microorganisms have been documented on many crops. For example, positive
effects have been shown in agricultural systems with reduced tillage, cover crops or
crop rotation, indicating that these practices increased soil microbial diversity and
activity (Ceja-Navarro et al. 2010; Yin et al. 2010; Lupwayi et al. 1998). Likewise, green
manures and crop rotations can enhance soil bacterial population density and reduce
plant disease incidence through stimulation of antagonists (Wiggins, Kinkel, 2005).
Soil amended with poultry litter has higher bacterial diversity than inorganically
fertilized soils (Carrera et al. 2007). The effect of some agronomic practices on soil
microorganisms can also have negative consequences for plant growth. Deleterious
rhizobacteria (DRB), for instance, have been linked with reduced plant growth in
systems with continuous pesticide use and for monoculture crops (Schippers et al.
1987; Stroo et al. 1988). Rhizosphere and root-colonizing microorganisms represent
a highly diverse microbial assemblage that metabolizes the nutrients exuded by roots
and interacts closely with plants (Kluepfel, 1993). Only a minority of rhizosphere
microbes have been examined thoroughly for their relative importance in mediating
beneficial plant-microbial interactions (Compant et al. 2010). Several rhizobacterial
isolates are used as biological control agents or plant growth promoters (Raaijmakers
et al. 2009). However, the plant-rhizobacteria interaction does not always result in
enhanced plant growth or health, as some rhizobacteria cause deleterious effects on
plant growth (Kremer, 2007).
15
Marleny Burkett-Cadena , Camilo A. Ramirez, Mark R. Liles, Joseph W. Kloepper
Given the importance of soil microorganisms for soil health, quality, and
nutrient cycling, it is important to determine the effect of agronomic practices
on soil microbial ecology. This manuscript reviews literature and presents new
data on the response of the rhizosphere and endophytic bacteria to two
common agronomic practices used to manage pathogens: the application of
systemic fungicides and soil steaming.
Rhizosphere bacteria: deleterious and beneficial

The concept of deleterious rhizobacteria (DRB) initially emerged as a way
to explain possible mechanisms of growth promotion by plant growth
promoting rhizobacteria (PGPR). The original concept was that plant growth
is promoted by PGPR and reduced by DRB, and it is the balance between the
two that affects the overall plant growth. PGPR and DRB are both described as
non-infective rhizobacteria, because they do not parasitize plants nor colonize
vascular tissues at high populations, but are aggressive root colonizers able
to antagonize other rhizosphere microorganisms (Kremer, 2007).
DRB have been isolated from a variety of crops such chrysanthemum (Burkett-
Cadena et al. unpublished data), potatoes (Sturz et al. 2000), carrots (Surette et
al. 2003), citrus (Gardner et al. 1985), peas (Berggren et al. 2001), and peach
(Benizri et al. 2005). These crops exhibited detrimental responses associated
with the presence of specific bacterial strains, while no other explanation such
as disease symptoms, presence of pathogens, or nutritional deficiency could
be identified. Several bacterial groups have the potential to induce deleterious
plant effects, and among soil bacteria the fluorescent pseudomonads are the
most commonly reported DRB in the literature (Kremer, 2007).
The positive effects of PGPR on plants occur through multiple mechanisms
(Bottini et al. 2004; Compant et al. 2010; Patten, Glick, 2002; Rodrguez, Fraga,
1999). Similarly, multiple mechanisms are involved in the inhibition of plant
growth by DRB. Production of cyanide, plant growth regulators (auxins),
antibiotics, and/or phytotoxic metabolites by DRB can induce detrimental
effects in plants (Bakker, Schippers, 1987; Boel et al. 1993; Kremer, Souissi,
2001). For example, indole acetic acid (IAA) is a metabolite involved in
mediating the deleterious effect(s) of DRB. IAA is a phytohormone that can be
synthesized by different bacterial groups, including plant pathogenic and
beneficial bacteria (Omer et al. 2004). The effect of IAA on root growth is
highly dependent on the concentration to which roots are exposed. Promotion
of root growth occurred at low IAA levels (i.e., 5 g/ml), whereas inhibition of
root growth occurred when IAA levels were high (i.e., 72 g/ml) (Barazani,
Friedman, 1999). In another study, inhibition of sugar beet root growth was
correlated with IAA concentrations produced by P. fluorescens and P. putida
rhizobacteria (Loper and Schroth, 1986). Similarly, studies by Sarwar and
Kremer (1995) and Xie et al. (1996) found a correlation between concentration
of IAA produced by rhizobacteria and root growth in different plant models,
with high levels resulting in deleterious effects on plant growth.
16
Efecto de las prcticas agronmicas sobre las bacterias deletreas rizosfricas y endftas
Soil steaming and its effects on soil and rhizosphere bacteria

Soil steaming is a disinfestation method to reduce soil-borne pathogens
and weeds in open fields and greenhouses. Steaming was developed in
Germany in the early 1800s and in 1890s it was first commercially used in the
United States. Baker and Olsen (1960) conducted some of the first research on
pasteurization via soil steaming for the elimination of soil-borne plant
pathogens (Baker, 1962). Their studies included using steamed soil in
combination with a retarding organism (antagonist) to prevent damping
off of bedding plants caused by Rhizoctonia solani.
The temporal dynamics of soil microbial communities following steam
disinfestation have been studied. Roux-Michollet et al. (2008) showed that
over a 60-day period steaming caused significant decreases in the activity and
culturable counts of the bulk soil microbial community, and induced changes
in its composition with nitrifying bacteria being the most negatively affected
(Roux-Michollet et al. 2008). A study of DRB in a commercial flower
monoculture in Colombia found that the primary bacterial groups associated
with a reduction in chrysanthemum growth in a steamed soil were the
fluorescent pseudomonads. Steaming was used to disinfest the soil prior to
cultivation and, therefore, to manage soil-borne pathogen populations. In
addition, tests in a greenhouse pot assay revealed that consecutive steaming
reduces the microbial populations post-steaming, and that after planting the
populations of fluorescent pseudomonads increase rapidly in the
chrysanthemum rhizosphere (Burkett-Cadena et al. unpublished data).
Effects of fungicide application on rhizosphere and endophytic

bacteria- A field study case
Leatherleaf fern (Rumohra adiantiformis) is an important commodity used
in flower arrangements because fronds are highly symmetrical and have a long
shelf-life after harvest. Distortions in frond shapes were reported in Florida
during the 1980s, coinciding with widespread use of the systemic fungicide
Benlate DF (Mills et al. 1996). Benlate was also reported to increase populations
of phytotoxic fluorescent pseudomonads in the leatherleaf fern rhizosphere
(Kremer et al. 1996). The name fern distortion syndrome (FDS) was proposed
in 2010 for the problem of distorted fronds (Kloepper et al. 2010).
FDS was found to be present in farms where leatherleaf fern was successively
cultivated in the same field, which is in agreement with Schippers et al. (1987)
who pointed out that allelopathic bacteria may arise in areas where one crop is
grown successively. In addition, the incidence and severity of FDS in Costa Rica
were found to relate to endophytic populations of fluorescent pseudomonads
inside fern rhizomes (Kloepper et al. 2010). These results and observations
made in Costa Rica suggested a model of latent infections of allelopathic or
deleterious bacteria that induce damage when a threshold population is
reached (Kloepper et al. 2010). Those deleterious or allelopathic bacteria
17
could reduce or alter normal plant growth via production of allelochemicals

such as IAA, which was reported by Barazani and Friedman, (1999) to be related
to allelopathic effects of some rhizosphere bacteria. The strong association
between FDS and fluorescent pseudomonads observed in Costa Rican ferns
suggested that future work should characterize these fluorescent pseudomonads
for production of IAA and other allelopathic effects in a plant bioassay.
The overall aim of the current study was to examine the relationship of
Benlate to FDS and to its effect on pseudomonad populations. The objectives
of the study were 1) to determine if leatherleaf fern grown in Florida with a
history of Benlate use had greater populations of fluorescent pseudomonads
than ferns grown without Benlate use; 2) if Benlate treatment of rhizomes
affects fluorescent pseudomonad populations; and 3) if the fluorescent
pseudomonads associated with FDS produce IAA and exhibit allelopathic
effects in a cucumber seed bioassay.
Ratings of FDS, and sampling for fluorescent pseudomonads

Two ferneries were selected for the study, KHD with a history of Benlate use
and Floricrops without Benlate use (Mills et al. 1996). Both ferneries were near
Deland, Florida and were less than 500 m apart. In October of 2005 each fernery
was rated to determine the incidence and severity of FDS using the 4-point rating
system developed in Costa Rica (Kloepper et al. 2010). The results of FDS ratings
(Table 1) indicated that all four quadrants at Floricrops had significantly lower
fern deformation incidence and severity than all four blocks of KHD. The average
incidence at Floricrops was 11%, while it was 90.25% at KHD.
Table 1.
Incidence and severity of fern deformation at KHD and Floricrops.
Fernery History of Benlate Quadrant Location Incidence Mean Severity*

use
Floricrops No Southeast 21% 0.21c
Northeast 7% 0.07c
Northwest 9% 0.10c
Southwest 7% 0.07c
KHD Yes Northwest 86% 1.34b
Southwest 92% 1.58a
Southeast 90% 1.79a
Northeast 93% 1.40b
LSD0.01 0.22
*Means followed by different letters are significantly different at P = 0.01.
18
Bacterial populations were determined in the rhizosphere, rhizomes, and

petioles from asymptomatic plants at Floricrops and from asymptomatic and
damaged plants at KHD. Results from these isolations in 2005 during the months
of September (Table 2) and October (Table 3) generally indicated higher
populations of total bacteria and fluorescent pseudomonads (FPs) from ferns with
damage in the Benlate-treated fernery (KHD) than from healthy ferns in the control
fernery (Floricrops). Total culturable bacteria counts (on 10% TSA) from the
rhizosphere of plants from Floricrops were significantly lower than those from
plants from KHD. Similarly, total bacteria within the rhizomes or petioles of plants
at Floricrops were significantly lower than those from at least one of the treatments
from KHD. Populations of fluorescent pseudomonads (on Kings B) followed the
same trend as the total bacterial populations. At the 95% probability level, the
population in the rhizosphere was highest in deformed plants from KHD, next
highest in normal-appearing plants at KHD, and lowest with plants from Floricrops.
Within rhizomes and petioles the population of fluorescent pseudomonads was
significantly lower (99% probability) in plants from Floricrops than from KHD.
Table 2.
Bacterial populations from Floricrops and KHD ferneries, September, 2005*.
Rhizosphere Intra-rhizome Intra-petiole
Sample no. Total Fl. Total Fl. Total Fl.
bacteria Pseudo. bacteria Pseudo. bacteria Pseudo.
(log cfu/g) (log cfu/g) (log cfu/g) (logcfu/g) (logcfu/g) (log cfu/g)
1. Floricrops 6.16 B 5.25 B,c 4.15 b 0.14 B 4.58 b 0.00 b
asymptomatic
2. KHD 6.66 A 5.75 A,b 4.50 a 2.25 A 5.45 a 0.91 a
asymptomatic
3. KHD 6.93 A 6.03 A,a 4.27 ab 2.02 A 4.43 b 1.32 a
deformed
LSD0.01 0.45 0.32 0.31 0.37 1.06 0.93
LSD0.05 0.33 0.24 0.23 0.27 0.79 0.69
* Means followed by different letters are significantly different. Capital letters

indicate significance at P < 0.01; lower case letters indicate significance at P < 0.05.
Table 3.
Bacterial populations from Floricrops and KHD ferneries, October, 2005*.
Rhizosphere Surface of rhizomes
Sample no. Total bacteria Fl. Pseudo. Totalbacteria Fl. Pseudo.
(log cfu/g) (log cfu/g) (log cfu/g) (log cfu/g)
1. Floricrops asymptomatic 6.31 B* 5.12 B 2.81 B 1.35 B
2. KHD asymptomatic 6.64 A 6.08 A 3.33 A 2.33 A
3. KHD deformed 6.72 A 6.19 A 3.36 A 2.53 A
LSD0.01 0.45 0.32 0.31 0.37
* Means followed by different letters are significantly different at P < 0.01.
19
In addition to culturable bacterial counts, culture-independent PCR-DGGE

analysis was conducted using DNA extracted from rhizosphere samples and
from the surface of the rhizomes. Total community DNA was extracted using
the UltracleanTM Soil DNA isolation kit (MoBio Laboratories,USA). Bacterial
16S rRNA gene amplicons were amplified using the primers 968-GC and 1401
R (Smalla et al. 2001). For amplification of Pseudomonas spp. the primer
system 311Ps and R1459Ps described by Milling et al. (2004) was used. For
amplification of Bacillus spp. and related taxa the primer BacF described by
Garbeva et al. (2003) was used in combination with the universal bacterial
primer 1401R. In all cases the recommended thermalcycling conditions for
the respective primer sets was used, and equal amounts of genomic DNA
template (50 ng) were added to each reaction. The presence of amplicons
was verified by agarose gel electrophoresis prior to resolution on a DGGE gel.
A 45% to 60% denaturing gradient within an 8% polyacrylamide gel was
prepared. The DGGE was performed in 1X TAE at 60 C and a constant voltage
of 100 V for 16 h. Individual DGGE bands were quantified and compared by
densitometry using SigmaStat program. The DGGE analyses generally supported
the enumeration results, with no significant changes observed using bacteria
domain-level or Bacillus genus-level primer sets (data not shown). In contrast,
Pseudomonas-specific amplicons from KHD were increased 132% compared
to samples from Floricrops (Figure 1), but there were no differences observed
in Pseudomonas taxa composition based on DGGE (data not shown). This
supports the conclusion that overall numbers of FPs were greater at KHD, but
the relative abundance of different Pseudomonas spp. was not significantly
altered.
Figure 1: Intensity of Pseudomonas 16S rRNA amplicons in 8 replicate

samples of rhizospheres from healthy plants at Floricrops (left) and
from damaged plants at KHD (right).
Rhizome diameter, root weight, and microscopy of rhizomes

checking for natural openings
It was previously reported that ferns with symptoms of FDS in Costa Rica had
smaller rhizome diameters and reduced root weight (Kloepper et al. 2010). Results
from sampling in Florida revealed the same trend (Table 4). The largest rhizome
20
diameters were observed in asymptomatic plants from Floricrops, with a mean

rhizome diameter significantly greater than that of rhizomes from asymptomatic
or deformed plants from KHD. Deformed plants at KHD had a significantly smaller
rhizome diameter than asymptomatic plants at KHD (Figure 2). Asymptomatic
plants at Floricrops had a much greater root weight compared to plants at KHD,
especially deformed KHD plants that had rhizomes with irregularly shaped growing
tips compared to rhizomes from asymptomatic plants (Figure 2).
Table 4.
Rhizome and Root effects in Florida Ferns sampled October, 2005.
Treatment Rhizome diameter (mm)a Root weight from a5-cm

section of rhizome
1. Floricrops asymptomatic 10.8 A* 10.39 A
2. KHD asymptomatic 9.5 B 4.54 B
3. KHD deformed 8.55 C 2.89 BC
LSD0.01 0.75 1.81
*Means followed by different letters are significantly different at P < 0.01.

a
Diameter was measured 3 cm from the growing tip of 20 samples from each treatment.
Figure 2: Rhizome diameter of asymptomatic plants from Floricrops

(left) and deformed plants at KHD (right). Note the irregularly-shaped
growing tips of rhizomes from KHD.
Microscopic analysis of rhizomes revealed the presence of natural openings

in all rhizome tips. The growing tip of the rhizome was not observed to have
the scales that cover mature parts of the rhizome (Figure 3). A series of
photographs with increasing magnification of the rhizome tip is shown in
Figure 3. Here, one can clearly see the presence of uncovered regions of the
rhizome that would allow bacteria in the root zone to enter and establish
endophytically during normal rhizome development (Figure 3).
21
Figure 3: Photomicrograph of a growing tip of a typical rhizome of an

asymptomatic fern plant. Lowest magnification (10x) is in the upper left
panel and the highest magnification (63x) is in the lower right panel.
Note the presence of unprotected cells (not covered by scales) at the
rhizome tip that allows bacterial access to the inside of the growing
rhizome.
Effects of fungicide application on rhizosphere pseudomonads:

A greenhouse study
Greenhouse experiments were designed to determine the effect of Benlate on
populations of fluorescent pseudomonads. Rhizomes, collected from
asymptomatic plants at Floricrops fernery, were dipped into water (control),
Benlate DF, or Benlate WP at the label rate of 1 lb/100 gal (1.2 g/L) and were then
planted in field soil in a greenhouse. Ferns were grown at 23C and artificially
shaded with polypropylene shade fabric. Ferns were watered daily and fertilized
with 20-10-20 twice per week. Eight replicate pots (plants) were used for each
treatment. Genomic DNA extraction and PCR-DGGE analyses were conducted from
rhizosphere soil at 6 weeks after treatment, as described above. Based on the
previous results with PCR-DGGE from field samples, the analysis was performed
using primers for total bacteria, Bacillus spp., and Pseudomonas spp.
PCR-DGGE analyses indicated that Benlate altered the composition of the
rhizosphere community, including the pseudomonads. With the bacterial domain-
level primer set, 5 ribotypes (bands) were significantly more abundant (greater
gel densitometry reading) with Benlate treatment (Figure 4). An analysis of the
Bacillus community indicated that one ribotype significantly increased with Benlate
treatment (Figure 5). Using a Pseudomonas-specific primer set, three ribotypes
exhibited a significant increase with Benlate treatment (Figure 6).
22
Figure 4: PCR-DGGE analysis of the rhizosphere total bacteria community 6

weeks after dipping rhizomes in Benlate DF (left), Benlate WP (center), or
water (right). Arrows indicate bands present in the Benlate treatment but
not in control samples.
Figure 5: CR-DGGE analysis of Bacillus spp. from rhizosphere samples 6

weeks after dipping rhizomes in Benlate DF (left), Benlate WP (center),
or water (right). The arrow indicates a band not present (or abundant)
in the control samples.
Figure 6: PCR-DGGE analysis of Pseudomonas spp. from rhizosphere

samples 6 weeks after dipping rhizomes in Benlate DF (center), Benlate
WP (right), or water (left). Note the increased number of bands with
both formulations of Benlate.
23
Production of IAA by fluorescent pseudomonads isolated from

ferns rhizosphere and from Benlate-treated ferns
A collection of 100 strains of fluorescent pseudomonads isolated in September
of 2005 from the rhizosphere of asymptomatic ferns at Floricrops and 100 strains
from the rhizosphere of deformed ferns at KHD were examined for IAA production.
Development of a red color within 5 min after adding Reagent A was scored as ++
(and equated to an IAA standard of 20-40 g/ml), while development of a pink
color by 30 min was scored as + (and equated to an IAA standard of 10-20 g/ml).
Two experiments were conducted to determine if Benlate treatment affects
IAA production by fluorescent pseudomonads colonizing leatherleaf fern.
Rhizomes containing fronds were collected from asymptomatic plants at
Floricrops fernery and were then planted in field soil in the greenhouse. In the
first experiment, Benlate was applied as a foliar spray while the second
experiment used rhizome dips. Treatments in both experiments included
Benlate DF and Benlate WP at the label rate of 1 lb/100 gal (1.2 g/L) and a
water control. Eight replicate pots (plants) were used for each treatment. In
the foliar spray experiment, at four weeks after treatment endophytic
fluorescent pseudomonads were isolated and 50 strains per treatment were
tested for IAA. In the rhizome dip experiment, rhizosphere pseudomonads
were isolated at four weeks after treatment and 50 strains per treatment were
examined for IAA production.
A marked difference in the frequency of IAA production by fluorescent
pseudomonad strains from the rhizosphere of deformed plants at KHD and
asymptomatic plants at Floricrops was observed (Table 6). There were 6-
fold more isolates from deformed plants at KHD that were capable of
producing IAA compared to the isolates from asymptomatic plants. The IAA
reaction developed rapidly for strains isolated from KHD, with 30% having a
red color within 5 min. Based on IAA standards, this rapid color change
indicates a high IAA concentration of >20 g/ml. Hence, while 30% of the
KHD strains were high producers of IAA, none of the strains from Floricrops
were observed to have high IAA producers.
Table 6.
IAA production frequency of Pseudomonas isolates from rhizospheres of
deformed ferns at KHD and asymptomatic ferns at Floricrops*.
Fernery and appearance of ferns % of % of % of strains %ofstrains

strains ++ strains + + or ++ for negative
for IAAa for IAAb IAA for IAA
Floricrops, asymptomatic 0 8 8 92
KHD, deformed 30 19 49 51
* 100 isolates from each fernery were tested.

a
Development of red or pink color within 5 min on nitrocellulose membrane (Bric et al., 1991).
b
Development of red or pink color by 30 min on nitrocellulose membrane.
24
These results indicated a functional change within the population of

rhizosphere fluorescent pseudomonads that is related to the use of Benlate,
and this change persists long after Benlate applications have ceased.
Results of Benlate applications to fern on the frequency of IAA production
by fluorescent pseudomonads indicated a profound shift in the percentage
of endophytic bacteria inside the rhizomes capable of producing IAA (Table
7). The frequency of strains that strongly produced IAA (red color in 5 min)
after spray with Benlate DF was 70% compared to 6% from the control.
Benlate WP did not change the frequency of IAA production, relative to the
control. An increase in the frequency of IAA production by rhizosphere
fluorescent pseudomonads was observed in the rhizome-dip test (Table 8).
The percentage of strains producing high levels of IAA increased 4- to 6-
fold, with both formulations of Benlate stimulating this trait.
Table 7.
Effect of foliar sprays of Benlate on the frequency of IAA production by
endophytic fluorescent pseudomonads within rhizomes.
Treatment % of strains % of strains + % of strains + % of strains

(Foliar spray) ++ for IAA for IAA or ++ for IAA negative for IAA
Benlate DF 70 10 80 20
Benlate WP 6 18 24 76
Water control 6 19 25 75

a
Development of red or pink color within 5 min on nitrocellulose membrane (Bric et
al. 1991).
b
Table 8.
Effect of rhizome dips in Benlate on the frequency of IAA production by
fluorescent pseudomonads in the rhizosphere.
Treatment % of strains % of strains + % of strains + % of strains

(Rhizome dip) ++ for IAA for IAA or ++ for IAA negative for IAA
Benlate DF 43 22 65 35
Benlate WP 32 26 58 42
Water control 7 17 24 76

a
Development of red or pink color within 5 min on nitrocellulose membrane (Bric et
al. 1991).
b
25
Marleny Burkett-Cadena , Camilo A. Ramirez, Mark R. Lile, Joseph W. Kloepper
Allelopathic effects in cucumber seed bioassays

Two cucumber seed bioassays were developed to evaluate allelopathic or
deleterious potential of fluorescent pseudomonads isolated from fern
rhizospheres. The assays were modifications of a lettuce seed bioassay that
was used in previous studies of deleterious rhizobacteria (Alstrm et al. 1989;
Barazani, Friedman 1999; Kremer, 2007; Kremer et al. 1996).
The first bioassay was a whole-cell assay in which bacterial isolates
were plated onto 50% Kings B agar and incubated at 28C for 24 hr. One
small loopful of each strain was agitated in 9 ml sterile water, and two 10-
fold serial dilutions were prepared. Three replicate cucumber seeds were
placed onto a water agar plate, and 50 l of a 10-2 dilution for each tested
strain was applied to each cucumber seed, resulting in an average inoculum
density of log 4.3 cfu/seed. We estimated that since populations enumerated
from damaged ferns in the field were observed as high as log 5.5 cfu/g in the
rhizosphere, the inoculum density used in the cucumber assay would be
conservative. After inoculation, seeds were placed at room temperature in
the light for 4 days. Plates with bacterial inoculations were compared
visually to control plates and rated as + (better root growth than the control),
- (less root growth than the control), or 0 (no change from the control). In
addition, the length of each radical was measured, and the mean length for
each bacterial treatment was calculated and compared to the mean length
of the controls.
The second bioassay was a cell-free metabolite assay in which bacterial
isolates were grown 48 hr in 9 ml tryptic soy broth. The resulting suspension
was filter-sterilized through a 0.45 m filter, and 50 l of the sterile filtrate
containing bacterial metabolites was inoculated onto each of 3 cucumber seeds
per plate. Controls were inoculated with 50 l of sterile tryptic soy broth.
After inoculation, seeds were grown and roots were measured as in the first
bioassay.
A collection of 100 fluorescent pseudomonad strains was isolated in
September of 2005 from the rhizosphere of asymptomatic ferns at Floricrops
and an additional 100 strains were isolated from the rhizosphere of deformed
ferns at KHD. All isolates were tested in both bioassays.
Visual differences in the root systems of inoculated and control cucumber
were apparent with some bacteria and some metabolites in all tests. A higher
percentage of fluorescent pseudomonads from deformed ferns at KHD induced
damage in both bioassays than did strains from asymptomatic ferns at
Floricrops (Table 9). Hence, more pseudomonad isolates from deformed ferns
at KHD with a history of Benlate use demonstrated allelopathic potential than
did pseudomonads from ferns at Floricrops without a history of Benlate use.
Some representative examples of reduced cucumber root growth in response
to pseudomonad metabolites is presented in Figure 7.
26
Table 9.
Phytotoxic potential of fluorescent pseudomonads from rhizospheres of
ferns at KHD and Floricrops.*
% of strains exhibiting indicated effect
Effect in cucumber bioassay Fernery and Whole-cell Cell-free
appearance of ferns bioassay metabolite
bioassay
Reduced overall growth of KHD, deformed 44 22
cucumber roots compared
to controla Floricrops, 7 7
asymptomatic
Increased overall growth of KHD, deformed 0 0

cucumber roots compared
Floricrops, 5 16
to controla
asymptomatic
Decreased average root KHD, deformed 13 3
length by over 50%
Floricrops, 0 0
compared to control
asymptomatic
* A collection of 100 strains from normal-appearing ferns at Floricrops and 100

strains from damaged plants at KHD was tested in two separate bioassays on
cucumber.
a
Based on visual comparison of cucumber seeds inoculated with cells or supernatants
compared to controls treated with water.
Figure 7: Representative negative visual ratings (reduced growth of cucumber

root systems) with inoculation with fluorescent pseudomonads in whole cell
bioassay. Upper left = control; other three images are different strains from the
rhizosphere of deformed ferns at KHD nursery with a history of Benlate use.
27
In this study we determined the effect of Benlate application on

populations of fluorescent pseudomonads in ferns. Previously a strong
correlation was observed between fern distortion and fungicide application.
Areas with a history of routine Benlate application had a higher incidence and
severity of frond growth distortion. The results of this study indicated that
bacterial population densities in different fern microhabitats were increased
due to Benlate application. Greater total bacterial populations and especially
fluorescent pseudomonads associated with Leatherleaf fern increased
following Benlate application. Increases in pseudomonads were observed by
culture-based and DNA-based methods, and were still detected in soils years
after the last Benlate application. The finding that higher endophytic
populations of fluorescent pseudomonads are associated with symptomatic
plants in the Benlate-treated fernery suggests that fluorescent pseudomonads
contribute to fern deformation following a shift in the endophytic micro flora
caused by the systemic fungicide. Additionally, Benlate application is not
only related to changes in bacterial populations but also with functional
traits. Isolation and characterization of fluorescent pseudomonad strains
from symptomatic ferns indicated that Benlate application resulted in a higher
frequency of IAA producing strains and deleterious effects in cucumber
seedlings. These findings are relevant because they show that agronomic
practices can adversely change the dynamics of the bacterial populations inside
and outside the plant host. Those changes are associated with alteration in
the production of bacterial metabolites and ultimately those metabolites can
be deleterious for the plant.
Conclusions and remarks

In this manuscript the effects of agronomic practices on plant-bacterial
interactions were investigated. We show that fern growth distortion is correlated
with changes in bacterial populations, specifically with increased populations of
fluorescent pseudomonads. The alteration of the bacterial community structure
in relation to agronomic practices can be of particular interest in perennial crops
like fern and vegetatively propagated crops like chrysanthemum. To maintain
the commercial value and productivity ferns and chrysanthemums are cultivated
in high density and continuously in the same field. Thus residues from the
previous crops provide resources for the survival of DRB, which will persist as a
consequence of little modifications in their habitat. The application of products
such as Benlate, which can cause changes in bacterial populations and their
associated functional traits, can have profound effects on plant health, through
a cascade of ecological interactions in the rhizosphere. Changes in the microbial
community lead to the over-production of bacterial metabolites, which are
ultimately deleterious for the plant.
It is important to consider that common mechanisms can be shared by
beneficial and deleterious microorganisms, for example in the plant-microbe
28
interactions that exist in rhizobia-legume and plant-pathogens. In the same

way, similar strategies may be used by plant growth promoting rhizobacteria
and by allelopathic bacteria. Consequently, agricultural practices may
fundamentally alter soil microbial communities, leading to increases in
populations of certain functional bacterial groups. Those bacterial groups such
as the fluorescent pseudomonads and their metabolites are integral to the
processes that result in detrimental effects in cultivated plants. The role of
microorganisms in the soil agro ecosystem has been very well documented.
Now the tripartite interaction, including the plant host, should be further
addressed.
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32
Captulo 2
Interacciones entre fitopatgenos y
microorganismos benficos en la rizosfera
Interactions among plant pathogens and beneficial
rhizosphere microorganisms
Marta C. Rivera1, Eduardo R. Wright2
1,2
Facultad de Agronoma. UBA. Av. San Martn 4453 (1417). Ciudad de Buenos Aires. Argentina.
Introduccin
El trmino rizosfera fue introducido por Hiltner en 1904 (Hartman 2005),
quien lo defini como la parte del suelo que es influenciada por el sistema
radical. Es un sitio de interacciones nicas entre microorganismos benficos
y patgenos, que son atrados por los exudados de las races, que pueden
tener un altsimo impacto sobre la nutricin y salud de las plantas. Constituye
un nicho rico en nutrientes como resultado de tales secreciones orgnicas
constituidos por monmeros como glucosa y aminocidos, polmeros como
polisacridos y protenas, y restos de races (Hawes et al. 2003) y excreciones
(Uren 2007). Como consecuencia, se pueden detectar niveles elevados de
poblaciones de caros, nematodes y microorganismos (Bazin et al. 1990).
Protozoos (Darbyshire Greaves 1973; Griffiths et al. 2007) y algas (Shran
Nehra, 2011) tambin forman parte de la biota de la rizosfera, que presenta
actividad muy variada. El acceso continuo de la poblacin microbiana de la
rizosfera al flujo de sustratos de alto y bajo peso molecular derivados de las
races, junto con factores fsicos, qumicos y biolgicos especficos, pueden
afectar en forma marcada la actividad y estructura de la comunidad
microbiana (Srensen 1997; Brimecombe et al. 2001). Esta puede resultar
perjudicial o mortal para la vida vegetal debido a la manifestacin de diversas
patologas, as como beneficiosa, mediante actividades de promocin del
crecimiento de las plantas y prevencin de las enfermedades parasitarias o
no parasitarias que las afectan. Desde que se acu el trmino rizosfera, se
han logrando importantsimos avances que permiten una mejor comprensin
de los numerosos procesos biticos y abiticos que ocurren all. El estudio
de las interacciones raz-suelo-microorganismo se considera actualmente
central en numerosas ciencias relacionadas con la nutricin y salud vegetal
(Hinsinger Marshner 2006). En este captulo se describen aspectos generales
de microorganismos benficos y patgenos que pueden estar presentes en
33
ese hbitat y de algunas interacciones entre sus poblaciones, con efectos

directos o indirectos sobre la sanidad vegetal.
Desarrollo
La rizosfera como nicho microbiano
Se conoce que el suelo, y en especial la rizosfera, son los ambientes donde
existe la mayor biodiversidad, debido a que es una regin altamente favorable
para la proliferacin y actividad metablica de numerosos microorganismos
(Nannipieri et al. 2003). Alrededor del 15% del rea de las races se considera
cubierta por microorganismos especficos (Sylvia et al. 2005). La composicin
y los roles de las comunidades microbianas rizosfricas no estn totalmente
comprendidos an. El estudio de componentes individuales ha dado lugar a
la identificacin de numerosos organismos, que presentan un rango de
interacciones desde simbiticas hasta patognicas. En la biota benfica se
encuentran microorganismos que solubilizan y fijan nutrientes, producen
sustancias promotoras del crecimiento vegetal, inducen la resistencia de las
plantas a enfermedades o se comportan como antagnicos de agentes
fitopatgenos. En un sentido amplio, los micorganismos benficos de la
rizosfera incluyen simbiontes (ciertos Actinomycetes y hongos micorrticos)
y saprfitos de vida libre (Schippers et al. 1987).
Las bacterias constituyen el grupo microbiano ms numeroso, con un
promedio de 106 a 109 unidades formadoras de colonias por gramo de suelo
rizosfrico (Jurkevitch et al. 1992). Sin embargo, participan de una pequea
proporcin de la biomasa del suelo debido a su tamao. Bacilos no
esporulantes, Pseudomonas y Actinomycetes son las bacterias ms frecuentes.
Tambin se encuentran hongos patgenos y simbiticos asociados a la
rizosfera, en concentraciones de alrededor de105 a 106 unidades formadoras
de colonias por gramo de suelo rizosfrico. Especies de Zygomycetes e
Hyphomycetes son las que se establecen con mayor facilidad, dada su
capacidad de metabolizar azcares simples (Sylvia et al. 2005). Los hongos
juegan un papel importante en la rizosfera. Intervienen en numerosos
procesos ecolgicos, el crecimiento y la sanidad vegetal (Hawksworth
Rosmann 1997). La diversidad y la composicin de las comunidades fngicas
permanecen relativamente desconocidas en muchos ecosistemas (Becklin et
al. 2012).
La poblacin microbiana de la rizosfera puede ser estudiada a travs de
tcnicas culturales y bioqumicas. Entre las primeras, las ms utilizadas son
la dilucin seriada y recuento en placas o el anlisis del nmero ms probable;
se pueden utilizar medios selectivos para cuantificar ciertos grupos. Sin
embargo, estas tcnicas pueden llegar a subestimar la poblacin microbiana
hasta un 90% (Bakken 1997). Las bioqumicas pueden ser de utilidad para
detectar y cuantificar alteraciones causadas por las plantas o la microflora.
Diferentes tcnicas como PFLA (phospholipid fatty-acid analysis) (Lynch et al.
34
Interacciones entre fitopatgenos y microorganismos benficos en la rizosfera
2004) y la extraccin de cidos nucleicos del suelo han permitido estudiar la

estructura de las comunidades. Mediante el uso de tcnicas moleculares se
ha podido determinar microorganismos no cultivables (Nannipieri et al. 2003).
La microflora de la rizosfera es dinmica, y presenta variacin temporal y
espacial (Shivanna Vasanthakumari 2011). Su estructura puede variar segn
las caractersticas del suelo, el tipo de fertilizacin, la especie vegetal y el rea
de la raz considerada (Marschner et al. 2004, Berg et al. 2005). Es creciente el
desarrollo de tcnicas moleculares tiles para analizar la estructura de las
comunidades asociadas a la rizosfera en distintas especies silvestres y cultivadas
tales como trigo (Triticum aestivum L.) (Smit et al. 1999), maz (Zea mays L.)
(Gomes et al. 2003), falsa avena (Arrhenatherum elatius L.) (P.Beauv. ex J.Presl
& C.Presl) (Vandenkoornhuyse et al. 2002), Senecio jacobaea (Kowalchuk et al.
2006), Taraxacum ceratophorum, Taraxacum officinale and Polemonium
viscosum (Becklin et al. 2012), etc. La diversidad qumica de los exudados de
la races no ha sido suficientemente explorada an (Walker et al. 2003).
Microorganismos patgenos de plantas

Entre los fitopatgenos, se encuentran numerosas especies de protozoos,
cromistas, hongos y bacterias. Se destacan los gneros Plasmodiophora
(Cercozoa, Protozoa); Pythium y Phytophthora (Oomycota, Chromista);
Sclerotinia y Gaeumannomyces (Ascomycota, Fungi); Sclerotium (Incertae sedis,
Fungi); Fusarium, Verticillium, Cylindrocladium y Cylindrocarpon
(Hyphomycetes, Fungi); Armillaria (Basidiomycota, Fungi); Agrobacterium,
Ralstonia, Clavibacter y Streptomyces (Protista). Otros gneros de mucha
menor prevalencia como fitopatgenos son Labyrinthula (Labyrinthista,
Chromista), Chytridium (Chytridiomycota, Fungi) y Botrytis (Ascomycota, Fungi)
(Agrios 2005, ISF 2011). En todos los casos en los cuales causan enfermedades,
las plantas manifiestan una sintomatologa secundaria (clorosis, muerte de
hojas y ramas, prdida de turgencia) asociada a sntomas primarios causados
en el lugar de infeccin de los patgenos, tales como necrosis del xilema, agallas
o pudricin basal) (Rivera Wright 2008).
Si bien no diferenci entre suelo y rizosfera, Lockwood (1988) trabaj sobre 4
conceptos: (i) existen 2 grupos ecolgicos diferentes (habitantes del suelo e
invasores del suelo) que pueden infectar a las plantas, (ii) el potencial de inculo,
que incluye como componente la estimulacin de los patgenos por medio de
exudados de las races, (iii) el hospedante, que puede volverse ms susceptible
debido a stress ambiental, (iv) los microorganismos del suelo, que pueden
influenciar la sobrevivencia y desarrollo de los patgenos. Describi la secuencia
evolutiva de dos tipos contrastantes de comportamiento de los microorganismos
de suelo, en base a las interpretaciones de Garret (1956). Los parsitos habitantes
del suelo son primitivos, no especializados, y pueden infectar plntulas y tejidos
juveniles. Residen en el suelo y presentan comportamiento saprfito, dado que
se alimentan de materia orgnica (White 2003). Poseen un rango amplio de
35
hospedantes y una gran distribucin en los suelos (Blair 1943). Rhizoctonia solani
es un ejemplo tpico de habitante del suelo (Koike et al 2007). Por el contrario, los
parsitos habitantes de la raz son ms especializados, a menudo especficos
y de una existencia ms transitoria en el suelo, por ello se los considera invasores
del suelo. Sus esporas son normalmente depositadas en el suelo, pero slo
germinan y crecen ante la presencia de alguna planta hospedante cercana. Muchos
son patgenos, dado que son capaces de crecer en forma parastica sobre de la
planta hospedante (White 2003). No pueden sobrevivir en el suelo en forma
saproftica, pero s formar estructuras de resistencia que permanecen all.
Verticillium dahliae es un ejemplo tpico de invasor de suelo (Ogawa English 1991).
Su presencia en ese hbitat es muy dependiente de los tejidos de plantas
hospedantes (Blair 1943). Los parsitos obligados se encuentran ltimos en la
secuencia evolutiva (Lockwood, 1988).
Los fitopatgenos se pueden encontrar en los suelos en general, y en la
rizosfera en particular, en forma latente (clamidosporas, esclerocios,
estructuras de origen sexual, esporas de reposo). En forma activa, se nutren
de la materia orgnica en descomposicin o de las plantas. En general se
comportan ocasionando enfermedades de tipo monocclico, es decir, siguen
un ciclo patognico (sobrevivencia-infeccin-sobrevivencia) por ciclo de cultivo.
Penetran los tejidos vegetales en forma directa mediante accin mecnica y
enzimtica, o a travs de heridas ocasionadas por laboreos o plagas animales
(Agrios 2005). La adhesin a las plantas hospedantes implica la atraccin
especfica de propgulos por las superficies vegetales, y un encaje perfecto
entre los ligantes (adhesinas) y los receptores. El producto de esta interaccin
activa una cascada compleja de transduccin de seales que es movilizada en
el proceso de reconocimiento patgeno-hospedante. La infeccin contina
con la colonizacin de los tejidos vegetales.
Microorganismos benficos y su efecto sobre las enfermedades de las plantas

Entre las numerosas interacciones entre organismos benficos y
fitopatgenos en la rizosfera, se encuentran las que se establecen entre stos
ltimos y sus antagonistas, fenmeno enmarcado en lo que se denomina
control biolgico, que segn la definicin clsica enunciada por Cook y Baker
(1983) es la reduccin de la cantidad de inculo o de la actividad del patgeno
capaz de producir enfermedad, obtenida por accin de uno o ms organismos,
distintos del hombre.
Los microorganismos constituyen un enorme reservorio natural an no
totalmente explotado para el control de enfermedades de las plantas. Aunque
la exploracin inicial en el rea del control biolgico se inici a comienzos del
siglo XX, la investigacin tecnolgica comenz a desarrollarse ms intensivamente
recin en los ltimos 30 a 40 aos. Diferentes hongos filamentosos, levaduras
y bacterias han sido citados y utilizados como antagonistas. Los mecanismos
de antagonismo primeramente detectados en la rizosfera son antibiosis,
36
hiperparasitismo y competencia (Cook Baker 1983). Son altamente dependientes

de los organismos involucrados y del medio abitico. En muchos casos, los
organismos presentan ms de un tipo de interaccin.
El trmino antibiosis (antibitico; del gr. : opuesto, : vida, TIK:
relativo a) (Real Academia Espaola, 2012) describe situaciones en que un
microorganismo produce una sustancia qumica que tiene la capacidad de
inhibir el crecimiento o de destruir bacterias u otros organismos. Los
antibiticos son productos del metabolismo secundario, con bajo peso
molecular, voltiles o solubles, activos a bajas concentraciones. Un ejemplo
tpico de antibiosis es la inhibicin de cepas de Agrobacterium tumefaciens
por el antibitico Agrocin 84 producido por A. radiobacter (Zoina et al.
2001). Antibiticos producidos por ejemplo por cepas de los gneros
bacterianos Pseudomonas (Howell Stipanovic 1980, James-Jr Gutterson,
1986, Thomashow Meller 1988, Maurhofer et al. 1992, Paulsen et al 2005)
o Bacillus (Silo-Suh et al. 1994, Bernal et al. 2002, Arajo et al. 2005,
Athukorala Fernando, 2009) y el gnero fngico Trichoderma (Dennis Webster
1971; Faramak-Almassi et al. 1991; Degenkolb et al. 2006; Eziashi et al.
2006) han sido caracterizados y ampliamente estudiados. En general, la
produccin de antibiticos se detecta in vitro con facilidad, mediante la
visualizacin de reas de inhibicin del crecimiento de los patgenos en
cultivos duales con antagonistas.
Los hiperparsitos (del gr. TT, superioridad o exceso; del lat. parastus,
y este del gr. , comensal) son parsitos de parsitos (Real Academia
Espaola, 2012). Numerosas especies del gnero Trichoderma (T. viride, T.
harzianum, T. koningii, T. asperellum, etc.) han sido citadas como hiperparsitos
muy activos. Son capaces de parasitar micelio de fitopatgenos a travs de
crecimiento alrededor de las hifas y formacin de haustorios (Thornton
Gilligan 1999) o esclerocios (Ferguson 1953). Estas interacciones son
fcilmente visibles al microscopio ptico y tambin han sido caracterizadas
mediante microscopa electrnica (Elad et al. 2009). Numerosos
microorganismos (hongos y bacterias) producen quitinasas (Ihrmark et al.
2010), glucanasas (Lisboa-de-Marco Felix 2007) y proteasas (Kedrics et al.
2005) capaces de hidrolizar los constituyentes de las paredes celulares de
hongos fitopatgenos, desintegrando as sus hifas.
La competencia (del lat. competent-a; cf. competir) (Real Academia Espaola,
2012) por nutrientes, espacio, etc. resulta de una interaccin sin accin directa
del antagonista sobre el patgeno. La capacidad de utilizacin de exudados
radicales y de colonizacin de races otorga una ventaja adaptativa a
numerosos microorganismos, entre ellos las rizobacterias. Cepas del gnero
Trichoderma presentan ventajas adaptativas por su velocidad de colonizacin
de sustratos. Aquellos aislamientos que son altamente competentes en la
rizosfera pueden colonizar la totalidad de la superficie de las races (Harman
2000). La produccin de siderforos (molculas de bajo peso molecular
capaces de quelar iones frricos y transportarlos al interior de las clulas)
37
es un ejemplo tpico de competencia por nutrientes en sustratos con baja

disponibilidad. Algunas especies, por ejemplo Pseudomonas fluorescentes,
presentan la capacidad de producir estos compuestos de gran afinidad con
el hierro (Rachid Ahmed 2005), que como consecuencia queda poco disponible
para otros microorganismos. Los beneficios de la interaccin planta-
microorganismo benfico pueden depender de una poblacin importante del
biocontrolador (Bull et al. 1991) y de una competencia y colonizacin de las
races (Schippers et al. 1987).
Cepas hipovirulentas o no virulentas, por su capacidad de ocupar el mismo
nicho ecolgico que las patgenas, pueden ser consideradas potenciales
antagonistas para proteger a las plantas hospedantes (Brandy Tavantzis 1999).
As tambin, la gran variabilidad existente en las poblaciones de especies
benficas determina que su eficiencia en el control dependa de la cepa
presente. Por otra parte, las interacciones entre microorganismos pueden ser
especficas de los hospedantes (Kloepper, 1996).
Numerosos microorganismos asociados a las plantas, que han resultado
ser eficientes antagonistas para el control de patgenos, han demostrado
estimular el crecimiento de una gran variedad de hospedantes. Tal es el caso
de cepas de los gneros Trichoderma (hongos promotores del crecimiento
vegetal; en ingles: PGPF). Entre las bacterias promotoras del crecimiento
vegetal (en ingles: PGPR) los gneros Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter,
Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus y Serratia
han sido reportados (Saharan Nehra 2011). A modo de ejemplo, se puede
citar el trabajo de Campbell y Greaves (1990), quienes obtuvieron 150
aislamientos de Pseudomonas fluorescentes de suelos cultivados con trigo,
inocularon semillas de esa especie y comprobaron que el 40% de los
aislamientos estimulaban el crecimiento de la races. Las rizobacterias han
sido muy estudiadas. Colonizan fuertemente las races y promocionan el
crecimiento vegetal, aumentando la biomasa subterrnea y area (Kloepper
et al. 1980, Saharan Nehra 2011). Sintetizan factores de crecimiento y
aumentan la disponibilidad de minerales en el suelo. Se ha detectado efecto
de bacterias fijadoras de nitrgeno sobre la nodulacin (Polenko et al. 1987).
Mediante el mejoramiento del estado nutricional de las plantas, podran
ejercer un efecto indirecto en la sanidad.
Si bien se encuentra entre los ltimos mecanismos relacionados con el control
biolgico descubiertos, la resistencia sistmica inducida es estudiada hace
dcadas (Kloepper et al.1980; Hammerschmidt et al. 1982; Loon et al. 1998). La
invasin de clulas externas de las races por micelio de distintas cepas de
Trichoderma puede desencadenar mecanismos de resistencia sistmica inducida
(Yedidia et al. 2003). Las PGPR activan sistemas de defensa de las plantas a
patgenos foliares o sistmicos (van Peer R et al. 1991; Wei et al. 1991).
Las micorrizas confieren una ventaja adaptativa sobre su hospedante
haciendo disponibles algunos nutrientes, representando un desafo para
varios organismos patgenos e influenciando en la composicin de la
38
microflora de la rizosfera (Kothamashi et al. 2001).

Cul es el rol de cada microorganismo en la rizosfera? Tanto los
micoorganismos promotores del crecimiento vegetal como los agentes de
control biolgico presentan efectos benficos adicionales, adems de sus
funciones primarias. Rhizobium y Glomus spp. son promotores del crecimiento
y productividad vegetal (efecto primario) y juegan un rol en la reduccin de
enfermedades (efecto secundario). Por otra parte, biocontroladores tales como
Trichoderma spp. y Pseudomonas spp. pueden controlar enfermedades (efecto
primario) y, como se ha demostrado, pueden estimular el crecimiento de las
plantas (Avis et al. 2008).
Un suelo puede ser categorizado como supresor de enfermedades, cuando
el dao producido por algunos organismos perjudiciales es reducido por la
actividad de otros benficos, o sea aquel donde ciertos microorganismos
patgenos no crecen o no se desarrollan lo suficiente (Hornby 1983). Hiltner
destac el papel de la microflora de la rizosfera en el fenmeno de la supresin
inducida en el suelo, luego de varios aos de monocultivo (Hinsinger Marshner
2006). La supresin puede estar basada en la presencia y actividades de
bacterias, hongos, o bien en una estimulacin general de las actividades
microbianas del suelo. La investigacin sobre suelos supresivos de
enfermedades ha dado lugar a la identificacin de numerosos microorganismos
que han sido utilizados en el control biolgico inundativo de fitopatgenos,
con mayor o menor xito, atribuible a la extrema variabilidad de
comportamiento de los sistemas biolgicos complejos, altamente dependiente
de las condiciones ambientales.
En general, se observa en ecosistemas naturales una importante biomasa
microbiana total que decrece a medida que los sistemas se utilizan en
agricultura tradicional. Como consecuencia, en ecosistemas inalterados existe
una mayor probabilidad de ocurrencia de interacciones conocidas o no- que
permitan el control biolgico de fitopatgenos. Es por ello que existen
corrientes de investigacin que priorizan la capacidad supresora general en
los ecosistemas, a travs del manejo de comunidades microbianas completas
o fracciones especficas de las mismas. Es lo que se lleva a cabo en forma ms
o menos emprica con la incorporacin de algunos sustratos orgnicos, como
por ejemplo los composts termoflicos o composts de lombriz (McKellar Nelson
2003; Asciutto et al. 2006; Rivera Wright 2009) ampliamente utilizados en
ciertos planteos agrcolas, como por ejemplo la produccin orgnica o
agroecolgica. Metodologas de reciente desarrollo para la deteccin de
comunidades rizosfricas complejas permitirn aprovechar la capacidad
buffer de estas comunidades para el manejo de la salud vegetal.
Los patlogos vegetales han estudiado la dinmica de la coevolucin
hospedante-patgeno. El concepto de coevolucin ofrece un marco similar
para el estudio de interacciones microbianas y su relacin con la supresin
de enfermedades en el suelo (Kinkel et al. 2011). All, los cambios evolutivos
dentro de las comunidades microbianas ocurren en escalas de tiempo
39
relativamente cortas y en respuesta a prcticas de manejo de los cultivos

(Bakker et al. 2010).
Conclusiones
Es muy importante el avance logrado en el conocimiento de algunos
patosistemas, entendiendo como tales a la interaccin entre un
fitopatgeno y su hospedante sumada a las interacciones que ocurren
entre ambos con el ambiente bitico y abitico de suelo y rizosfera. Sin
embargo, mucho queda por entender. Es de esperar que el desarrollo y
aplicacin de nuevas tecnologas permitan ampliar la comprensin de
estos sistemas tan complejos, con el objetivo ltimo de mejorar la sanidad
de los cultivos.
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45
46
Captulo 3
Hongos formadores de micorrizas
arbusculares: Influencia de las prcticas
agronmicas sobre su diversidad y
dinmica de colonizacin
Arbuscular mycorrhizal fungi: Influence of agronomic
practices on diversity and dynamics of colonization
Santiago Schalamuk1, Magdalena Druille2, Marta N. Cabello3,4*
1
Centro de Investigaciones Fitopatolgicas (CIDEFI), (Facultad de Ciencias Agrarias y
Forestales. UNLP) 60 y 119, (CP 1900) La Plata. 2Ctedra de Forrajicultura, (Facultad de
Agronoma; UBA) Av. San Martn 4453 (CP 1417), Capital Federal; 1Instituto Spegazzini, (FCNyM,
UNLP) Av. 53 N 477, (CP1900) La Plata;4CICPBA. E-mail: [email protected]
Introduccin
El suelo es un sistema vivo, dinmico, que constituye un recurso esencial
para la produccin de alimento y fibra y para el balance global y el
funcionamiento de los ecosistemas (Doran et al. 1996). Un vasto nmero de
microorganismos residen en el suelo y llevan a cabo un amplio rango de
funciones. Entre estos microorganismos se encuentran los hongos formadores
de micorrizas arbusculares (HFMA), los cuales forman simbiosis mutualistas
con las races de la mayora de las especies vegetales (Smith, Read 2008). En
estas asociaciones simbiticas se genera un movimiento bidireccional de
nutrientes donde el carbono fluye hacia el hongo y los nutrientes inorgnicos
se mueven hacia la planta. Los hongos que forman estas asociaciones son
bitrofos obligados y se encuentran ubicados dentro del phylum
Glomeromycota (Schbler et al. 2001). Las micorrizas son las asociaciones
ms frecuentes en la naturaleza debido a su rango de hospedantes y su
distribucin cosmopolita (Harley, Smith 1983), y por ello los Glomeromycota
son usualmente considerados generalistas dada su baja especificidad
(Smith, Read 2008). Tambin es importante destacar que los HFMA colonizan
la mayora de las plantas cultivables y presentan un impacto sustancial en la
productividad de muchos cultivos (Johnson 1993).
El efecto positivo ms significativo de las micorrizas arbusculares
consiste en el mejoramiento de la nutricin de las plantas, ya que las hifas de
estos hongos se extienden en el suelo y pueden absorber y transferir macro y
47
micronutrientes hacia las races. En ese sentido, la mayor captacin de

nutrientes, particularmente los poco mviles como el P, se logra ampliando el
volumen de suelo explorado y alcanzando zonas donde los nutrientes se
encuentran disponibles, es la caracterstica ms conocida de estas
asociaciones (Sieverding 1991). Desde el punto de vista nutricional es
pertinente aclarar que, teniendo en cuenta que los HFMA consumen C de los
hospedantes, el efecto de la micorrizacin sobre las plantas depende de la
relacin costo-beneficio de la simbiosis (Johnson et al. 1997; Grimoldi et al.
2005). Por lo tanto, si bien se asume que las micorrizas arbusculares
constituyen asociaciones mutualistas, el rango de respuesta es afectado por
numerosos factores, entre ellos el estado y especie de planta hospedante, la
especie de Glomeromycota y las condiciones del ambiente rizosfrico.
Los hongos micorrcico-arbusculares poseen mltiples roles en los
ecosistemas naturales y agroecosistemas. Entre otros beneficios de estas
asociaciones micorrcicas se pueden mencionar los incrementos en la
resistencia a parsitos de races (Borowicz 2001), los aumentos en la tolerancia
a la sequa (Aug 2001) y las reducciones del impacto de estreses ambientales
como por ejemplo la salinidad (Ruiz-Lozano et al. 1996). Los HFMA tambin
tienen una funcin importante en el mantenimiento de la fertilidad fsica del
suelo, al producir una glicoprotena especfica recalcitrante, denominada
glomalina (Wright et al. 1996) que aumenta la agregacin (Wright, Upadhyaya
1998; Wright et al. 1999; Rillig et al. 2001) y promueve disminuciones de la
erodabilidad los suelos (Rillig et al. 2002). Por otra parte, tambin se ha
demostrado que estos hongos simbiontes pueden redistribuir los recursos
energticos en las comunidades vegetales a travs de redes fngicas que se
extienden tridimensionalmente en el suelo y conectan diferentes plantas entre
s (Read 1997). El mecanismo de formacin de esas redes est relacionado
con capacidad de las hifas de Glomeromycota para generar anastomosis con
otras hifas de individuos fngicos compatibles, creando as redes de longitud
indefinida (Giovannetti et al. 2004).
Los HFMA se encuentran agrupados en 14 gneros que incluyen ms de
210 especies descriptas hasta la fecha, y los efectos que tiene sobre los
hospedantes, o eficiencia, difieren ampliamente entre especies y cepas
(Miller et al. 1985; Modjo, Hendrix 1986).
Teniendo en cuenta los cambios favorables que promueven las micorrizas
arbusculares en agroecosistemas, los hongos que constituyen este tipo de
simbiosis poseen gran importancia econmica potencial dentro de la
agricultura, y su estudio es relevante tanto para posibilitar el manejo de HFMA
indgenas a campo a travs de prcticas agrcolas apropiadas como para el
logro de inoculaciones exitosas.
El presente captulo tiene como objetivos sealar los principales efectos
de prcticas agrcolas habituales en los cultivos extensivos de Argentina, tales
como las rotaciones, las labranzas, la fertilizacin y las aplicaciones de
plaguicidas sobre las asociaciones micorrcicas arbusculares, y mencionar los
48
Hongos formadores de micorrizas arbusculares:
Influencia de las prcticas agronmicas sobre su diversidad y dinmica de colonizacin
resultados de algunas investigaciones efectuadas en agroecosistemas de

nuestro pas.
Prcticas agrcolas y micorrizas

La agricultura argentina ha sobrellevado grandes procesos de
transformacin. El cambio ms importante en los ltimos 20 aos ha consistido
en el predominio de la soja como el principal cultivo de la regin pampeana
(Solbrig 2005), en la cual actualmente este cultivo, junto con el maz, el trigo y
el girasol ocupa la mayor superficie. El rea sembrada con soja ha crecido
junto con un paquete tecnolgico que incluye la siembra directa o labranza
cero y material genticamente modificado que facilita el control de malezas
con herbicidas totales. La soja transgnica resistente al glifosato facilit
enormemente la siembra directa, permitiendo simplificar el control qumico
de malezas durante el ciclo del cultivo. Por otra parte, se introdujo el barbecho
qumico, es decir el control de las malezas previo a la siembra exclusivamente
a travs de herbicidas. La siembra directa ha sido incorporada como una
herramienta que, mediante el mantenimiento de los residuos de cultivo,
permite la disminucin de la erosin del suelo, la reduccin en las prdidas de
materia orgnica, y tambin una mejor economa del agua (Satorre 2005).
Estos aspectos han posibilitado la expansin de la frontera agrcola hacia zonas
que eran mayormente destinadas a la ganadera, como tambin la
intensificacin de la agricultura mediante el doble cultivo trigo-soja en un
mismo ao.
El cambio tecnolgico mencionado afecta profundamente a las
comunidades de Glomeromycota. Las asociaciones micorrzicas, debido
fundamentalmente a su carcter de simbiontes obligados, reflejan
interacciones entre la planta hospedante, los hongos y el ambiente (Brundrett
et al. 1996). Por este motivo, los efectos de cada prctica agronmica son
complejos, ya que pueden afectar directamente a los HFMA como
indirectamente a travs de los hospedantes de los que obtienen sus recursos
o en el ambiente suelo donde se propagan. Por lo tanto, las prcticas agrcolas
constituyen disturbios que afectan tanto la dinmica como la diversidad de
estos hongos. Mientras que en ecosistemas naturales existen plantas de
diversas especies en diferentes estados fenolgicos y estacionalidad
hospedando los Glomeromycota, en sistemas agrcolas con cultivos anuales,
se presentan dos periodos con diferencias muy marcadas: una parte del ao
donde se registra una gran densidad de plantas hospedantes coetneas y
pertenecientes a la misma especie, es decir el cultivo, y luego de la cosecha
un periodo de barbecho con ausencia de hospedantes o en algunos casos con
presencia escasa de vegetacin espontnea de distintas especies. Las
tecnologas que se aplican en los principales cultivos de Argentina difieren
notablemente de las utilizadas en otras regiones agrcolas, donde la siembra
directa se encuentra menos difundida. La ausencia de labranza a travs de
49
sta tcnica conservacionista permite que el grado de disturbio en los suelos

se reduzca, sin embargo es importante destacar que la mayor utilizacin de
elementos externos como herbicidas y otros plaguicidas, fertilizantes, as como
intensificacin de las rotaciones generan disturbios de diferente naturaleza
que impactan de diversas maneras a las comunidades de Glomeromycota. El
manejo adecuado de los HFMA, teniendo en cuenta los beneficios que
promueven en los cultivos y en el suelo, debe ser considerado para mejorar la
eficiencia, productividad y sostenibilidad de los sistemas agrcolas.
Cultivos y rotaciones
Las especies y la secuencia de cultivos que se desarrollan en un lote
pueden alterar significativamente la estructura de las comunidades de
Glomeromycota. Como hemos sealado, en Argentina los principales cultivos
que se desarrollan son soja, trigo, maz y girasol. Todas estas especies
cultivables poseen la capacidad de formar asociaciones micorricicas, aunque
difieren en su grado de dependencia. El trigo y la soja son consideradas
medianamente dependientes mientras que maz y girasol son escasamente
dependientes (Jeffries, Dodd 1991). Entre los cultivos extensivos en la regin
pampeana se est difundiendo la colza o canola (Brassica napus L.), con gran
potencialidad de desarrollo para el ambiente edafoclimtico de la zona. Esta
especie pertenece a la familia Brassicaceae y por lo tanto no se asocia a los
Glomeromycota. Gavito, Miller (1998) han hallado retrasos en la colonizacin
de maz sembrado despus de colza, cuando se comparaba con plantas de
maz que se cultivaban en lotes con especies antecesoras micotrficas.
Teniendo en cuenta la significancia de la colonizacin temprana para la
absorcin de P, dicho retraso puede tener consecuencias negativas. Por ello,
en situaciones donde la disponibilidad de P es limitante, las caractersticas
relacionadas con las asociaciones micorrcicas del cultivo antecesor pueden
tener importantes efectos sobre el crecimiento y la absorcin de P del cultivo
siguiente a travs de cambios en el potencial inoculo del suelo y la
consecuente colonizacin (Gavito, Miller 1998; Karasawa et al. 2001). A pesar
de esto, existe la posibilidad de que las comunidades de HFMA puedan
reestablecer del efecto inhibitorio de un cultivo no hospedante a travs de la
inclusin de especies micotrficas (Gavito, Miller 1998).
Asimismo, la secuencia de cultivos que se desarrollan dentro de una
rotacin parece cambiar la composicin de especies de las comunidades
fngicas e impactar en su diversidad, aunque los impactos de esos cambios
no han sido evaluados extensamente (Hendrix et al. 1995). Es importante
destacar que, a pesar de la ausencia de especificidad en las asociaciones
micorrcicas, dado que los principales cultivos en Argentina se desarrollan
en distintas pocas del ao, y que adems poseen diferente estructura, cada
cultivo genera diferentes condiciones en el ambiente suelo que modifican las
comunidades de Glomeromycota.
50
Sistemas de labranza: Siembra directa

En Argentina, los sistemas de labranza reducida, especialmente la siembra
directa, se han difundido ampliamente en los ltimos aos, ocupando
actualmente alrededor del 70 % de la superficie dedicada a cultivos anuales
(Fertilizar 2010). Estos sistemas han sido incorporados con el fin de mantener
los suelos cubiertos con residuos vegetales durante la siembra y crecimiento
de los cultivos, y as reducir la erosin hdrica y elica (Satorre 2005).
En suelos de la regin pampeana numerosos trabajos han hallado que los
sistemas de labranza generan diversos cambios de naturaleza fsica, qumica y
biolgica en los suelos de Argentina, (i.e. Alvarez, Steinbach 2009; Diosma et
al. 2006; Ferreras et al. 2000; Aon et al 2001), y es de esperar que dichas
transformaciones influyan en las comunidades de Glomeromycota a travs
de modificaciones en el ambiente suelo y el estado fisiolgico de los
hospedantes. Sin embargo, es importante aclarar que la accin mecnica sobre
el suelo genera cambios cuali y cuantitativos que impactan en forma directa a
los propgulos de Glomeromycota (McGonigle, Miller 1996a). La colonizacin
de races por HFMA puede generarse a partir de tres fuentes distintas de
inculo: esporas, hifas pertenecientes a la red de micelio externo y fragmentos
de races colonizadas. Estas estructuras, que forman el denominado banco
de propgulos de Glomeromycota capaz de germinar, crecer y colonizar races
cuando se dan las condiciones adecuadas (pik 2004; Schalamuk, Cabello
2010a), sufren alteraciones directas por el laboreo del suelo. Se ha propuesto
que todos los tipos de propgulos de HFMA son afectados, en mayor o menor
medida, a travs de diversos mecanismos que actan en forma conjunta: i) la
disrupcin de la red hifal por los implementos de labranza ii) la dilucin
del suelo derivada de la mezcla de porciones superiores de suelo con mayor
infectividad micorrcica con otras mas pobres en propgulos iii) la
descomposicin acelerada de las races colonizadas (Schalamuk, Cabello
2010a). En consecuencia, las labranzas reducen la actividad de todos los
propgulos y esto se refleja en disminuciones en la capacidad de los suelos
para inducir colonizacin, es decir lo que denomina infectividad micorrzica
del suelo. En ese sentido, Schalamuk et al. (2004) hallaron mayores niveles
de infectividad micorrcica en el suelo en siembra directa que en sistemas
laboreados.
Diversos trabajos han registrado mayor presencia o actividad de
Glomeromycota en suelos bajo siembra directa que en otros previamente
labrados (Douds et al. 1995; McGonigle, Miller 1996a; Mozafar et al. 2000,
Schalamuk et al. 2004). Es de esperar que en un suelo bajo siembra directa se
encuentre una red de micelio externo desarrollada, teniendo en cuenta que
las hifas extraradicales pueden ser severamente afectadas por la labranza
(McGonigle, Miller 1996b; Wright, Upadhyaya 1998). Estudios realizados en
Argentina han hallado valores superiores de colonizacin micorrzica y
porcentajes de arbsculos en siembra directa con respecto a sistemas bajo
labranza convencional en los estados iniciales de los cultivos (Schalamuk et
51
al. 2003, 2004). El hecho que los eventos y procesos necesarios para iniciar
la colonizacin hayan sido ms rpidos en sistemas de siembra directa se
relacion con los mayores niveles registrados de infectividad del suelo. La
expresin grfica de la colonizacin micorrcica en races a travs del tiempo
presenta una curva de tipo sigmoidea, en la cual se reconocen tres etapas:
fase de latencia, fase exponencial y fase de plateau (Sieverding 1991). Una
mayor infectividad micorrcica del suelo debera reducir la longitud de la fase
de latencia, y as por lo tanto acelerar el proceso de colonizacin micorrcica
(Smith, Read 2008).
Mientras que en los primeros estados fenolgicos de los cultivos existe
una gran influencia de la infectividad micorrcica de los suelos, en los estados
fenolgicos ms avanzados, otros factores adquieren mayor importancia.
Luego de la colonizacin primaria, la longitud de raz colonizada se incrementa
durante el crecimiento y desarrollo de los cultivos (Land et al. 1993, Mozafar
et al. 2000), y en momentos cercanos a la madurez se determina el valor
mximo, fase de estabilizacin o plateau, que es resultado de la colonizacin
secundaria, es decir la expansin de las hifas desde los puntos de entrada
primarios hacia otras porciones de la raz. El nivel de plateau es muy variable,
y varios factores que afectan las tasas de crecimiento relativo del hongo y el
hospedante pueden cambiar esta situacin de equilibrio (Sieverding 1991).
Wilson, Tommerup (1992) afirman que la colonizacin secundaria est en gran
medida regulada por el flujo de carbohidratos desde la raz hacia el componente
fngico de la simbiosis. Por todo esto, es posible que en los estados avanzados
del cultivo variaciones en el ambiente fsico-qumico del suelo, el estado
nutricional y crecimiento de las plantas hospedantes, que pueden determinarse
por distintos sistemas de labranza, tengan incidencia en los porcentajes de
colonizacin, arbsculos y vesculas relacionados con la colonizacin
secundaria. Por otra parte, Schalamuk et al. (2003, 2004) en un cultivo de
trigo observaron que las diferencias entre los porcentajes de colonizacin entre
siembra directa y labranza convencional tienden a reducirse a medida que
avanza el desarrollo del cultivo, y se hacen mnimas en las ltimas etapas donde
se determinan los niveles de plateau (i.e. llenado de granos).
Es importante aclarar que, tal como ocurre con la colonizacin, las
diferencias en la abundancia de esporas dependen del momento donde se
efectan los muestreos. En agroecosistemas con cultivos anuales, el nmero
de esporas generalmente se incrementa a lo largo del ciclo del cultivo (Cabello
1987) y por lo tanto la esporulacin est frecuentemente ligada a la fenologa
del hospedante en el campo (i.e. la produccin mxima de esporas ocurre a
mediados o finales del ciclo de cultivo) (Morton et al. 2004). Varios estudios
han hallado mayores densidades de esporas en siembra directa que en labranza
convencional. (Crovetto 1985; Jansa et al. 2002; Schalamuk et al. 2003). Sin
embargo, mientras que en los estados tempranos de los cultivos, generalmente
se encuentran mayores densidades de esporas en los suelos no labrados, en
estados fenolgicos ms avanzados las diferencias entre sistemas de labranza
52
se reducen (Schalamuk et al. 2003). Es bien conocido que las esporas pueden
sobrevivir varios aos en el suelo (Sieverding 1991). Por lo tanto, el nmero
de esporas refleja tanto la esporulacin como la accin de diferentes factores
que afectan su supervivencia y acumulacin. Consecuentemente, la densidad
de esporas es el resultado de un complejo balance, y mientras la esporulacin
est relacionada con la actividad reciente de los HFMA, el nmero de esporas
incluye estructuras formadas en momentos anteriores. Por otra parte, mientras
que en sistemas naturales el banco de esporas en los suelos puede decrecer
por causas tan variadas como predatorismo, parasitismo, germinacin, entre
otros factores, (ver Schalamuk, Cabello 2008), en sistemas agrcolas otro efecto
que reduce directamente el nmero de esporas en el suelo es la dilucin del
suelo rico en esporas con las partes subsuperficiales ms pobres en estas
estructuras, ocasionada por la accin mecnica de las labranzas. Por estas
razones, la supervivencia y acumulacin tienen una gran influencia en el
nmero de esporas, y las mayores densidades de estas estructuras halladas
en siembra directa en los estados ms tempranos del cultivo pueden ser el
resultado tanto de una mayor o ms rpida esporulacin como de la presencia
de esporas residuales producidas durante el barbecho o el cultivo antecesor.
Teniendo en cuenta que la presencia de esporas no siempre implica la actividad
reciente de los HFMA, y que los disturbios mecnicos pueden cambiar su
distribucin espacial en el perfil del suelo, el nmero de esporas puede ser
considerado como un valioso indicador de utilidad de la presencia de HFMA
in situ, sin embargo debido a que no refleja la actividad reciente de estos
hongos, esta informacin debe ser tenida en cuenta con cautela.
En relacin a la diversidad de Glomeromycota, la cantidad de estudios
realizados sobre la temtica en agroecosistemas de argentina son escasos. En
un ensayo de siembra directa y labranza convencional en la provincia de Buenos
Aires se hallaron 24 taxa de ese phylum, lo que representa un nmero de especies
alto en comparacin con los registrados en otros sistemas agrcolas (Schalamuk
et al. 2006). Asimismo, se observ que los cambios en la composicin del banco
de propgulos de Glomeromycota pueden influir en su diversidad. Como se ha
sealado, los disturbios relacionados con el laboreo pueden afectar a cada uno
de los tipos de propgulos de distinta manera, y por otra parte, se conoce que
las esporas e hifas externas e internas poseen distinta capacidad para producir
nuevas unidades de infeccin (Klironomos, Hart 2002). Se considera que en
muchos hbitats, fundamentalmente los no disturbados, las redes de hifas en el
suelo junto con fragmentos de races son el principal medio por los cuales las
plantas se colonizan, incluso en las situaciones donde existen poblaciones altas
de esporas (Hepper 1981; Tommerup, Abbott 1981; Jasper et al. 1992). En los
experimentos a campo mencionados se registraron contribuciones mayores de
especies pertenecientes a la familia Glomeraceae sobre otras familias de
Glomeromycota (Acaulosporaceae y Gigasporaceae) en suelos manejados con
siembra directa con respecto a otros previamente laboreados (Schalamuk et al.
2006). A partir de material proveniente de esos experimentos, se efectuaron
plantas trampa utilizando diferentes tipos de propgulos para observar las
53
especies y gneros de esporas que se formaban utilizando las distintas fuentes

de inculo (Schalamuk, Cabello, 2010b). Mientras que en los suelos de siembra
directa y labranza convencional se registraban proporciones de esporas
pertenecientes a la familia Glomeraceae de 69.9% y 54.4% respectivamente, los
porcentajes de Glomeraceae encontrados en las plantas trampa que contenan
propgulos compuestos de micelio intra o extra radical provenientes de ambos
sistemas de labranza resultaron mayores al 90 %. Dichos resultados indican que
los miembros de la familia Glomeraceae presentan ventajas en el uso de ese
tipo de propgulos (hifas intra y extraradicales) sobre las especies pertenecientes
a Acaulosporaceae y Gigasporaceae. Por lo tanto, se ha sugerido que la mayores
contribuciones de Glomeraceae halladas en sistemas de siembra directa podran
ser explicadas, al menos en parte, por la falta de disrupcin de la red de hifas en
ese sistema y una diferente composicin del banco de propgulos en los suelos
que favorecen a especies pertenecientes a Glomus spp.
Fertilidad y Fertilizacin
En la agricultura argentina, el uso de fertilizantes se ha incrementado
notablemente en los ltimos aos, aunque sigue siendo relativamente bajo
cuando se la compara con el de los pases europeos. Los productos ms
empleados son los que proveen nitrgeno (57%) y fsforo (36%) y se aplican
fundamentalmente en cultivos de trigo y maz (Satorre 2005).
Es ampliamente conocido que en suelos pobres en nutrientes los valores de
colonizacin micorrcica suelen ser altos (Vivekanandan, Fixen 1991; Hayman 1975).
Una de las hiptesis ms aceptadas para explicar este hecho es la que seala que
las plantas invierten y transfieren ms C a los hongos micorrcicos en los suelos
donde nutrientes, como el N o el P, son limitantes (Mosse, Phillips 1971).
Consecuentemente, cuando la disponibilidad de estos nutrientes aumenta, se
esperaran disminuciones en la abundancia de micorrizas relacionadas con la
particin de carbohidratos hacia otros destinos de las plantas que no son las races
y subsiguientes limitaciones en el crecimiento del componente fngico de la
simbiosis, relacionadas con el menor suministro de C (Read 1991). Este
comportamiento ha sido denominado autorregulacin de la colonizacin
(Vierheilig et al. 2000; Vierheilig, Pich 2002; Vierheilig 2004a, b), debido a que
muestra similitud con la autorregulacin de la nodulacin en las interacciones
riozobios-leguminosas. El mecanismo de autorregulacin propone que una vez
que la colonizacin llega a cierto nivel, se suprimen posteriores aumentos en este
parmetro (Vierheilig, Pich 2002; Vierheilig 2004a, b). Si bien los mecanismos de
autorregulacin no han sido completamente dilucidados, se cree que las
strigolactonas, un grupo de apocarotenoides exudados por las races en la rizsfera,
cumplen un rol fundamental en esta regulacin actuando como factores de
ramificacin en las etapas de pre-simbiosis (Garca Garrido et al. 2009).
Diversos estudios en condiciones controladas, con sustratos estriles,
elementos marcados, inhibidores de la nitrificacin, entre otros, han
54
confirmado los efectos negativos del agregado de P o N sobre los porcentajes

de colonizacin y otros parmetros relacionados con la actividad de las
micorrizas (Hawkins, George 2001), En ensayos a campo, los efectos de las
adiciones de fertilizantes suelen ser ms complejos, teniendo en cuenta que
las respuestas en el crecimiento y el rendimiento de los cultivos y en la eficiencia
de aplicacin y absorcin por la planta estn influenciadas por numerosas
variables, entre ellas la disponibilidad inicial del nutriente y de otros elementos
que puedan interactuar en el suelo y en la nutricin de las plantas, las dosis de
fertilizante aplicadas, las caractersticas edafoclimticas de la zona que
determinan el grado de mineralizacin de los nutrientes y sus prdidas hacia
zonas que estn fuera del alcance de las races, el tipo de labranza, las fuentes
de fertilizante utilizadas, su tecnologa de aplicacin, etc.
En la regin pampeana argentina, la produccin agrcola se encuentra
limitada por una deficiencia generalizada de P, por lo tanto la fertilizacin con
este nutriente constituye una prctica comn (Echeverra, Garca 1998). Es
ampliamente conocido que la formacin de micorrizas se reduce en suelos con
altas concentraciones de P (Jensen, Jakobsen 1980; Hicks, Loynachan 1987),
por lo tanto varios mecanismos han sido propuestos con el objeto de explicar la
modulacin de la colonizacin micorrzica por el P del suelo, entre ellos: i)
disminuciones en los exudados de la raz (Kurle, Pfleger 1994) que afectan el
desarrollo de la simbiosis entre los cuales se limitan los exudados de
strigolactonas (Garcia Garrido et al. 2009) y ii) efectos directos de altas
concentraciones de P sobre el desarrollo de hifas externas de Glomeromycota
(Miranda, Harris 1994). En Argentina, en ensayos a campo efectuados en la
localidad de Balcarce, se registraron reducciones en la colonizacin micorrzica
espontnea en cultivos de trigo en respuesta al agregado de fsforo, y se hall
que aplicacin de dosis crecientes de P en lnea afectaron negativamente la
micorrizacin en mayor medida que la aplicacin de P al voleo en cultivos de
trigo tanto bajo labranza convencional (Covacevich et al. 2005) como en siembra
directa (Covacevich et al. 2008). Por otra parte, se encontr que la fuente de
fertilizante fosfatada influye notablemente en la reduccin de la colonizacin,
ya que la colonizacin micorrcica de HFMA indgenas disminuy con la aplicacin
de superfosfato soluble, mientras que cuando se utilizaba roca fosfrica como
fertilizante la colonizacin no se reduca (Covacevich et al. 2006).
El incremento en la utilizacin de fertilizantes nitrogenados en Argentina
est relacionado con la adopcin generalizada de la siembra directa, que
requiere de la adicin de N para sostener los rendimientos de los cultivos,
fundamentalmente de gramneas (Alvarez, Steinbach 2009). Diversos estudios
han hallado reducciones en la colonizacin micorrzica arbuscular con
aplicaciones de nitrgeno (Hayman 1970; Kruckelmann, 1975; Jensen, Jacobsen
1980; Land et al. 1993). Treseder (2004), utilizando la metodologa de meta-
anlisis, compar los efectos de la adicin de N y P sobre la colonizacin
micorrzica obtenidos en estudios a campo y hall que las reducciones en la
colonizacin relacionadas con la aplicacin de N son menos consistentes que
55
las relacionadas con la fertilizacin con P. Numerosos factores pueden

explicar la variabilidad de los efectos del N en comparacin con los del P. Se
conoce que el nitrato es ms mvil en el suelo que el fosfato, por lo tanto
cuando el N se encuentra en esta forma, la difusin o flujo masal suele
abastecer a las plantas de N en tasas adecuadas y entonces en esos casos la
inversin de la planta en la simbiosis micorrcica puede reducirse. Por otra
parte, si bien existe abundante informacin que confirma que las asociaciones
micorrcicas contribuyen a la captacin de N, es posible que stas no sean
tan efectivas en facilitar la absorcin de N inorgnico en comparacin con el
P inorgnico (Mosse, Phillips 1971; Smith, Read 2008). Es importante
considerar que, ante la presencia de N en forma amoniacal, los resultados
suelen presentar diferencias. Chambers et al. (1980) sostienen que el in
NH4+ tiene un efecto ms deletreo sobre la colonizacin micorrzica que el
N03. El mecanismo no es conocido completamente, pero Hawkins, George
(2001) afirman que el NH4+ afecta el crecimiento de las hifas en forma directa.
En suelos de la regin pampeana, en un ensayo a campo (Schalamuk et al.
2004) y en un bioensayo en macetas (Schalamuk et al. 2011) observaron que
la fertilizacin nitrogenada gener efectos negativos sobre los porcentajes de
colonizacin, arbsculos y vesculas en suelos provenientes de siembra directa.
Las reducciones en sistemas de labranza convencional fueron mnimas,
atribuyndose este hecho a los escasos valores de potencial inculo micorrcico
en los sistemas laboreados. Por otra parte, la variabilidad de los efectos del
nitrgeno sobre la colonizacin mencionada por Treseder (2004) ha sido
tambin registrada en nuestro pas, teniendo en cuenta que en un mismo
ensayo, ante aos con condiciones hdricas muy diferentes, los niveles de
colonizacin se redujeron en menor medida en un ao que present
precipitaciones excesivas que favorecieron las prdidas de nitrgeno
(Schalamuk et al. 2003) que en otro ao en el que se registraron normales
para la zona (Schalamuk et al. 2004).
Barbecho qumico, malezas y herbicidas

El sistema de siembra directa, ampliamente difundido en Argentina, implica
la imposibilidad de controlar mecnicamente a las malezas, y por lo tanto se
requiere la realizacin de un barbecho qumico. Para el barbecho qumico se
utilizan herbicidas totales que afectan las malezas del lote. Cuando se utiliza
la labranza convencional, En otros sistemas agrcolas se deja el suelo desnudo
y disturbado. En siembra directa se eliminan las malezas, que son hospedantes
de HFMA, pero el suelo no es disturbado fsicamente. La presencia o ausencia
de vegetacin impacta fuertemente en las comunidades de Glomeromycota,
debido fundamentalmente a sus caractersticas de simbiontes obligados. Las
comunidades de malezas, a pesar de presentar diversas interacciones negativas
con los cultivos, son tambin capaces de actuar como hospedantes de
Glomeromycota. En efecto, existe evidencia que sugiere que la presencia de
56
malezas hospedantes en agroecosistemas puede mantener comunidades

diversas de Glomeromycota, promover simbiosis efectivas con los cultivos y
as compensar los efectos de la competencia (Feldman, Boyle 1998). Por lo
tanto, las malezas hospedantes pueden constituir un puente efectivo para los
HFMA entre distintas estaciones de cultivo (Gosling et al. 2006). En ese sentido,
Kabir, Koide (2000) compararon los efectos de la utilizacin de un cultivo de
cobertura de trigo y los relacionados con la presencia de Taraxacum officinale
previo a un cultivo de maz, y encontraron que los lotes enmalezados con esta
especie generaban mayores porcentajes de colonizacin, absorcin de fsforo
y rendimiento en el maz que los no enmalezados. En nuestro pas, la mayora
de las especies que se presentan como malezas son hospedantes de
Glomeromycota, a excepcin de algunas pocas pertenecientes a las familias
Brassicaceae (Diplotaxis tenuifolia, Raphanus sativus, Brassica campestris,
Rapistrum rugosum), Chenopodiaceae (Chenopodium spp., Kochia scoparia),
Caryophyllaceae (Stellaria media) Amarantaceae (Amaranthus spp.) y
Polygonaceae (Polygonum convolvulus). Por lo tanto, teniendo en cuenta que
la mayora de las especies de malezas son micotrficas, la utilizacin de
herbicidas puede afectar negativamente las comunidades de HFMA. De hecho,
Kurle, Pfleger (1994) hallaron un menor nmero de esporas en reas de
rotacin maz-soja donde el manejo pasado haba reducido las poblaciones
de malezas, y parte de la disminucin en el nmero de esporas fue atribuida a
la reduccin de malezas hospedantes causada por los herbicidas.
Adems de la eliminacin de plantas hospedantes, los herbicidas pueden
tener efectos directos sobre las estructuras externas de los HFMA o indirectos
relacionados con cambios en la fisiologa del hospedante. Estos aspectos, junto
con otros como la diversidad de principios activos de herbicidas que se utilizan,
formulaciones, dosis y momentos de aplicacin, generan dificultades para
sealar tendencias relacionadas con sus efectos sobre las asociaciones
micorrcicas. Entre los distintos herbicidas que se utilizan en Argentina, el
glifosato es en la actualidad el ms difundido. Existen resultados dispares en
cuanto a sus efectos sobre la colonizacin micorrzica. Varios estudios han
hallado que el glifosato no afecta la colonizacin (Powell et al. 2009, Mujica
et al. 1999, dos Santos Malty et al. 2006, Savin et al. 2009), mientras que
otros sealan que la reduce (Ronco et al. 2008) o la incrementa (Morandi
1989). En medio agarizado, tambin se han encontrado diferencias entre los
resultados de distintos estudios: mientras que dos Santos Malty et al. (2006)
hallaron que el glifosato redujo el porcentaje de germinacin de esporas y el
tamao de los tubos germinativos, Giovannetti et al. (2006) encontraron que
este compuesto no afect este parmetro, incluso cuando se lo aplic a altas
dosis. Sin embargo, ambos trabajos citados registraron inhibiciones
relacionadas con el glifosato en el crecimiento de tubos germinativos. Por
otra parte, Ronco et al. (2008) no han hallado efectos negativos del glifosato
sobre la viabilidad de hifas de Glomus mosseae.
En cuanto a otros herbicidas, por ejemplo la atrazina, producto
ampliamente utilizado para control de latifoliadas en presiembra y
57
preemergencia en maz, los estudios reportan que la aplicacin de este

compuesto no posee efecto sobre la simbiosis micorrcica o incluso puede
favorecerla (Trappe et al. 1984). Los herbicidas del grupo de las amidas,
como el alaclor y acetoclor, que se encuentran muy difundidos para el control
de gramneas en presiembra y preemergencia en maz, como tambin los
pertenecientes al grupo de los hormonales, como el 2.4D o MCPA, que son
utilizados para el control de malezas latifoliadas en trigo, pueden inducir a
reducciones significativas en la colonizacin cuando se aplican dosis altas
(Trappe et al. 1984; Ocampo, Barea 1985). Sin embargo, no se han hallado
efectos negativos de herbicidas hormonales, como MCPA, sobre la germinacin
de esporas in vitro, inclusive a altas dosis (Giovannetti et al. 2006). Los estudios
relacionados con el efecto del herbicida diclofop metil, utilizado en trigo para
el control de gramneas anuales, no han mostrado concordancia. Mientras
que Rejon et al. (1997) hall reducciones en el porcentaje de colonizacin
relacionadas con dosis muy bajas de diclofop metil, Ryan et al. (1994) no
encontr diferencias en este parmetro utilizando este compuesto. Los efectos
sobre las asociaciones micorrcicas de los herbicidas de contacto, como el
paraquat, el bromoxinil y el bentazon, presentan tambin resultados dispares.
Existen estudios que reportan reducciones en el porcentaje de colonizacin
relacionadas con aplicaciones de paraquat en dosis recomendadas a campo
(Abd-Alla et al. 2000), mientras que otros no encontraron efectos negativos
luego de la aplicacin del producto de contacto bentazon (Bethlenfalvay et al.
1996). En relacin al nmero de esporas, se registraron disminuciones luego
de la aplicacin de bromoxinil y paraquat (Abd-Alla et al. 2000).
Enfermedades y fungicidas
Las enfermedades de los cultivos y su control mediante la utilizacin de
agroqumicos pueden generar mltiples efectos sobre las comunidades de
Glomeromycota. Gran diversidad de organismos patgenos afectan las races
de los cultivos, alteran el transporte, interfieren en los procesos fotosintticos,
producen un uso anormal de carbohidratos, entre otros efectos. Por lo tanto,
reducciones en los niveles de enfermedad a travs de la utilizacin de fungicidas
provocan cambios en la fisiologa de los hospedantes que impactan en su
capacidad para asociarse con HFMA, principalmente teniendo en cuenta que la
colonizacin es dependiente del flujo de carbohidratos desde la raz hacia el
componente fngico de la simbiosis (Wilson, Tommerup 1992). Entre los
plaguicidas que se utilizan para el control de adversidades biticas, los fungicidas
son lgicamente los que deberan presentar mayor efecto directo sobre los
hongos pertenecientes a Glomeromycota. Sin embargo, diversos estudios han
mostrado que los fungicidas pueden afectar a las asociaciones micorrcicas de
manera negativa, neutral o incluso positiva (Samarbakhsh et al. 2009). Los
fungicidas incluyen una enorme variedad de compuestos que difieren en su
efecto sobre la fisiologa de los hospedantes, modo de accin, espectro de
control, mecanismo de accin, mtodos de aplicacin y formulacin.
58
Consecuentemente, es difcil de generalizar sobre un grupo de compuestos,

incluso sobre la aplicacin de un compuesto en particular. En lo que respecta
a la utilizacin de fungicida, es importante diferenciar fundamentalmente las
aplicaciones al follaje, las que se destinan al suelo, o la que realizan sobre las
semillas. En los cultivos extensivos de la regin pampeana no es una prctica
usual la aplicacin de fungicidas al suelo. Sin embargo los productos en los
denominados curasemillas toman contacto con ese medio. Del contacto con
el suelo cabra esperar, adems de efectos sobre aspectos fisiolgicos y sanitarios
en la planta hospedante, efectos directos sobre las hifas externas y/o esporas,
que impactarn tanto en la funcionalidad de las asociaciones para explorar los
recursos del suelo como tambin sobre el desarrollo de las fases presimbiticas
que posibilitan la colonizacin de las races.
Entre los fungicidas clsicos que se utilizan como curasemillas se encuentra
el thiram, perteneciente al grupo de los dithiocarbamatos, de accin preventiva
y de contacto. Efectos inhibitorios sobre la colonizacin de las races y la
produccin de esporas de dithiocarbamatos aplicados el suelo o como
curasemillas han sido ampliamente reportados en la literatura (Vijayalakshimi
1993; Sreenivasa, Bagyaraj 1989, Giovannetti et al. 2006, Hernndez-Dorrego,
Mestre Pars 2010).
Los triazoles constituyen un grupo ms moderno de fungicidas sistmicos.
Dentro de este grupo se encuentra el triadimenol, ampliamente utilizado como
curasemillas en trigo. Los triazoles, como el triadimenol, actan como
inhibidores de la biosntesis de ergosterol, un importante componente de las
membranas fngicas. Las cantidades relativas de ergosterol en los
Glomeromycota son escasas en comparacin con otros grupos de hongos,
por lo tanto su efecto negativo sobre la micorrizacin es generalmente bajo o
nulo (Schmitz et al. 1992, Frey et al. 1994). El metalaxyl es un principio activo
sistmico ampliamente utilizado en curasemillas para soja. Se ha hallado que
aplicaciones de metalaxyl incrementaron la colonizacin micorrcica y el
crecimiento de las plantas (Groth, Martinson 1983, Sukarno et al. 1996). Este
fungicida es especfico en su control de fitopatgenos oomycetes, y no posee
efectos sobre otros grupos de hongos. Por lo tanto, se ha sugerido que su
efecto favorable para la colonizacin micorrcica es bsicamente indirecto, a
travs de reducciones en las poblaciones de organismos antagnicos a los
HFMA (Hetrick Wilson 1991) e incrementos en la disponibilidad de azucares
solubles en los hospedantes. Sin embargo, Giovannetti et al. (2006)
documentaron efectos directos de este fungicida, ya que la aplicacin de
metalaxyl estimul la germinacin de esporas de Glomeromycota y el
crecimiento hifal en la fase presimbitica in vitro. Si bien estos estudios
muestran tendencias interesantes, las condiciones de los medios de cultivos
estriles son marcadamente diferentes a las que ocurren en suelos con races
de plantas, a causa de una gran cantidad de factores, entre ellos la absorcin
de fungicidas por el suelo. Por otra parte, el fungicida fludioxonil, que es
aplicado en curasemillas para soja en combinacin con metalaxyl, parece
promover la colonizacin a travs la reduccin de patgenos agresivos como
59
Rhizoctonia spp., organismos que son controlados por este fungicida (Murillo-
Williams, Pedersen 2008).
Dentro de los fungicidas que se utilizan en aplicaciones foliares, tienen
actualmente gran importancia los pertenecientes a los grupos de los triazoles
y las estrubirulinas. Los triazoles y otros inhibidores de la biosntesis del
ergosterol constituyen un grupo de fungicidas que ha adquirido gran difusin
en los cultivos de grano debido a su eficacia frente a patgenos foliares, y su
efecto sistmico y persistente dentro de la planta. A pesar de su mecanismo
de accin, a menudo se han encontrado efectos negativos de fungicidas
triazoles a altas dosis o en aplicaciones repetidas (West et al. 1993; Kling,
Jakobsen 1997; Schweiger, Jakobsen 1998). Sin embargo, en Argentina se ha
hallado que la aplicacin de triazoles a un cultivo de trigo no afect
negativamente los porcentajes de colonizacin micorrcica (Schalamuk et al.
indito). En la evaluacin de los efectos de los fungicidas foliares sobre los
HFMA debera tenerse en cuenta no slo el efecto del compuesto per se, sino
tambin la reduccin en las enfermedades que genera, incrementando el rea
foliar verde y aumentando el suministro de fotoasimilados hacia las races.
Otro grupo de fungicidas que est difundiendose rpidamente en la regin
agrcola argentina es el de las estrobilurinas, de accin translaminar o
mesostmica. Los fungicidas de este grupo poseen un amplio espectro de
accin al inhibir la respiracin mitocondrial. Diedhiou et al. (2004) hallaron
que las strobilurinas, a pesar de su amplio espectro, no afectan negativamente
la micorrizacin de los cultivos cuando se aplican para el control de patgenos
foliares a las dosis recomendadas. Schalamuk et al. (indito), hallaron
resultados similares en cultivos de trigo. Teniendo en cuenta que los fungicidas
de este grupo se aplican en pulverizacin foliar y no son completamente
sistmicos, es cuestionable que las aplicaciones de este grupo presenten algn
efecto detrimental sobre los HFMA. Dentro de los fungicidas clsicos, que se
reemplazan paulatinamente por los ms modernos, se encuentran los
pertenecientes al grupo de los benzimidazoles, como los fungicidas sistmicos
benomyl y carbendazim. Los benzimidazoles son eficaces en el control de
numerosas enfermedades causadas por una amplia variedad de hongos. El
benomyl y otros benzimidazoles se descomponen a metil benzimidazol
carbamato (carbendazim), y este ltimo compuesto interfiere en la divisin
de los ncleos de los hongos sensibles. El efecto deletereo del benomyl y su
producto de descomposicin, carbendazim, sobre los HFMA es ampliamente
conocido; se sabe que se une especficamente a las beta-tubulinas, inhibiendo
la funcin de las tubulinas, que son cruciales para el crecimiento fngico
(Boatman et al. 1978; Hale, Sanders 1982; Thingstrup, Rosendahl 1994;
Schweiger, Jakobsen 1998; Kjller, Rosendahl 2000). Venedikian et al. (1999)
observaron que la colonizacin puede resultar menos inhibida por aplicaciones
de carbendazim que la germinacin de las esporas y el crecimiento de hifas en
medio agarizado. Esto sugiere que las distintas fases de crecimiento de estos
hongos pueden tolerar diferentes concentraciones de fungicidas (Dodds,
Jeffries 1989; Ocampo 1993; Schreiner, Bethlenfalvay 1997).
60
En cuanto al efecto de la aplicacin de fungicidas sobre la diversidad de

Glomeromycota, la informacin sobre este tema es escasa, aunque se reconoce
que existen diferencias en la sensibilidad a distintos grupos de fungicidas entre
taxas o aislamientos de Glomeromycota (Dodd, Jeffries 1989; Schreiner,
Bethlenfalvay 1996).
Insecticidas
Al igual que lo ocurrido con otros pesticidas, el efecto de los insecticidas
sobre los HFMA vara en funcin del principio activo, las dosis utilizadas y las
especies involucradas en la simbiosis.
Menendez et al. (1999) estudiaron el efecto de dimetoato, un insecticida
organofosforado de accin sistmica, sobre el porcentaje de colonizacin
radical en soja. Estos autores hallaron que la colonizacin no se vio afectada
en ninguna de las dosis utilizadas, cuando la planta creci en un suelo inoculado
con Glomus mosseae. Sin embargo, al utilizar la comunidad nativa de HFMA el
porcentaje de colonizacin radical se redujo al aplicarse la dosis recomendada
a campo. Con respecto al porcentaje de germinacin de las esporas, el
dimetoato disminuy este porcentaje en Racocetra castaneae en dosis de 5
ml/L, lo aument en Gigaspora roseae en la dosis de 0,5 ml/L y no lo afect en
G. mosseae. Menendez et al. (1999) atribuyen esta respuesta diferencial a
que algunos cidos orgnicos y azcares inhiben la germinacin de esporas
de algunas especies pero estimula el crecimiento hifal de otras.
La mayor tolerancia de G. mosseae a la aplicacin de un insecticida
organofosforado coincide con los resultados de Burpee, Cole (1978). Pavarthi
et al. (1985) encontraron efectos negativos sobre esta especie fngica al aplicar
un insecticida organoclorado (Endosulfan) sobre la misma leguminosa. El uso
de Carbaryl, correspondiente al grupo de los carbamatos, no afect a la
colonizacin por G. mosseae. Martnez et al. (1998) demostr que la aplicacin
de triflumurn, un insecticida del grupo de las benzoilfenilureas, tuvo un efecto
nulo en la germinacin de esporas de G. mosseae, R. castanea y Gigaspora
rosea en las dos dosis evaluadas. Con respecto al porcentaje de colonizacin
radical, estos autores encontraron una disminucin de este parmetro con
suelo no tindalizado, ya sea que estuvieran o no inoculadas con G. mosseae.
Sin embargo, en suelo tindalizado e inoculado con G. mosseae, no se observ
ningn efecto del Triflumurn sobre la micorrizacin, en ninguna de las
concentraciones ensayadas.
Conclusin
Bajo condiciones naturales la mayora de los cultivos agronmicos estn
colonizados con hongos micorrcico-arbusculares. Sin embargo es difcil
demostrar sus funciones a campo. Las prcticas agronmicas implican cambios
61
complejos en los cuales no se conoce en que medida afectan las poblaciones

de HFMA y su simbiosis. Son necesarios ms estudios a campo para evaluar
su efecto sobre la composicin cuali-cuantitativa de HFMA en los diferentes
agrosistemas. Comprender los diferentes factores que influencian la biologa
de las poblaciones de Glomeromycota es esencial para cualquier intento de
conservacin del ambiente, usos biotecnolgicos o agricultura sustentable.
Para ello: i) es necesario conocer las especies fngicas nativas del sitio
especfico a cultivar; ii) establecer mtodos rpidos y precisos para evaluar la
densidad de propgulos del rea y la efectividad de las poblaciones de HFMA
nativas; iii) disear modelos que predigan el efecto de las practicas
agronmicas a implementar sobre las poblaciones de HFMA nativas.
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71
72
Captulo 4
Huellas de la simbiosis pasto-endofito
en el agroecosistema
Footprints of grass-endophyte symbiosis in agroecosystems
Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Buenos Aires, Departamento de Recursos
Naturales. Av San Martn 4453 (C1417DSE), Buenos Aires, Argentina.
Introduccin
La mayora de las especies vegetales establecen relaciones simbiticas
con una gran variedad de microorganismos y, si bien estos simbiontes
frecuentemente son inadvertidos, al alojarse en sus tejidos modifican a su
hospedante y su interaccin con el ambiente (Rodrguez et al. 2008, Hartley,
Gange 2009, Douglas 2010). Estos efectos pueden tener un gran impacto en la
estructura y el funcionamiento de las comunidades vegetales y de sus
organismos asociados (Clay, Holah 1999, Omacini et al. 2001, Clay, Schardl
2002). Las interacciones simbiticas ms estudiadas, particularmente en
contextos productivos, son las asociaciones de plantas con microorganismos
edficos que confieren ventajas a la planta hospedante frente a una baja
disponibilidad de nutrientes (van der Heijden, Sanders 2002, Douglas 2010).
Por ejemplo, una recopilacin basada en la base Scopus, de los trabajos
publicados desde la primera descripcin del fenmeno de simbiosis como
dos organismos que viven juntos (De Bary 1879) demuestra que las tres cuartas
partes de los trabajos realizados con plantas que incluyen el trmino
simbiosis en su ttulo, resumen o palabras clave, consideran la asociacin
de plantas con bacterias fijadoras de nitrgeno, principalmente del gnero
Rizobium, o con distintas especies de hongos formadores de micorrizas.
Otros simbiontes que han sido notablemente menos estudiados son
los hongos endofitos asexuales del gnero Neotyphodium (Clavicipitaceae:
Balansieae) (Figura 1). El inters por estos organismos comenz alrededor
de la dcada de los ochenta, cuando se descubri que su presencia en los
pastos estaba asociada a intoxicaciones en el ganado con sntomas
similares a los del ergotismo, ocasionando grandes prdidas econmicas
en los Estados Unidos y Nueva Zelanda (Bove 1970, Bacon, Hill 1997,
Fletcher, Easton 1997, Fletcher 2005). Recin durante los ltimos 10 aos
se gener un volumen de informacin equivalente al que se tena para
73
Rizobium en la dcada del sesenta (Figura 1). Estos hongos se encuentran

en los tejidos areos vegetativos y en las semillas de un gran nmero de
gramneas (Clay, Schardl 2002, Iannone et al. 2010). Adems de los
fenmenos de toxicidad inicialmente investigados, se identificaron otros
efectos importantes de los endofitos tales como otorgarles a sus
hospedantes resistencia a diversos factores de estrs (Malinowski, Belesky
2000, Rodrguez et al. 2008, Hartley, Gange 2009). De esta manera, la
comprensin del impacto de la interaccin entre pastos y hongos
endofitos sobre procesos fundamentales del ecosistema se transform en
una meta relevante de la investigacin ecolgica y agronmica en los
ltimos aos ya que las plantas conforman la base de la pirmide trfica
en la mayora de los agroecosistemas (es decir que representan la fuente
de energa y nutrientes disponibles para el resto de los organismos).
Recientemente se ha considerado que los endfitos as como otros
organismos hetertrofos (herbvoros domsticos y los patgenos foliares),
tienen la capacidad de afectar no slo la magnitud de la fijacin de
carbono por las plantas (McNaughton 1983) sino tambin de modificar la
tasa a la cual se mineralizan el carbono y los nutrientes depositados en el
suelo en forma de residuos (Omacini et al. 2004). Estos efectos
involucraran modificaciones en la estructura y el funcionamiento de las
comunidades biticas del suelo mediadas por la respuesta de las plantas
al simbionte, lo que a su vez repercutira en la composicin, diversidad y
dinmica de la vegetacin (Bever 1994, Omacini et al. 2005).
En este captulo, en primer lugar describiremos los aspectos biolgicos,
ecolgicos y agronmicos ms salientes de la simbiosis entre pastos y hongos
endofitos asexuales. En segundo lugar sintetizaremos el conocimiento actual
acerca de las vas por las cuales estos endofitos pueden modificar las relaciones
que establecen las plantas hospedantes con la biota del suelo, a corto plazo,
es decir sin que medie un cambio en la composicin de la comunidad vegetal,
y a largo plazo, una vez que se modul la estructura y el funcionamiento de
las comunidades. A lo largo del trabajo, identificaremos los vacos de
conocimiento acerca de las implicancias de esta simbiosis para el manejo del
agroecosistema y en qu medida existen alternativas para manipularla de
manera tal que redunden en una menor utilizacin de insumos (Tikhonovich,
Provorov 2007).
Desarrollo
La simbiosis pasto-endofito
Muchas especies de pastos de estacin templado-fra forman simbiosis
con hongos asexuales de la familia Clavicipitaceae (Ascomycota) del gnero
Neotyphodium (antes conocido como Acremonium sect. Albolanosa Morgan-
Jones; Glenn et al. 1996). De acuerdo con estudios filogenticos, las
diferentes especies de Neotyphodium surgieron de forma independiente a
74
Huellas de la simbiosis pasto-endofito en el agroecosistema
partir de ancestros sexuales del gnero Epichlo y, en general, a partir de

hibridaciones inter-especficas (Cabral et al. 1999, Moon et al. 2000, Clay,
Schardl 2002, Iannone et al. 2009). Las hifas de estos hongos crecen de
forma sistmica entre las clulas de las hojas, los tallos y los rganos
reproductivos del hospedante sin causar ningn sntoma de enfermedad
(Rodrguez et al. 2009) (ver Fotos en Figura 2). A diferencia de sus ancestros
patgenos, los endofitos Neotyphodium carecen de reproduccin sexual y
transmisin horizontal, lo que significa que se reproducen exclusivamente
de forma asexual y vertical a travs de las semillas de los pastos (estrategia
Tipo III, sensu, White 1987 o clase I sensu, Rodrguez et al. 2009) (Figura 2).
De esta manera, la simbiosis pasto-endofito es obligada para los hongos,
mientras que para las plantas es facultativa ya que pueden vivir sin ellos.
La teora evolutiva predice que una interaccin con tales caractersticas
debera resultar en mutualista: mientras que la planta le proporciona al
endofito nutricin, proteccin y medio de multiplicacin y dispersin, el
endofito confiere a la planta resistencia a la herbivora (mediada por
alcaloides) y tolerancia al estrs oxidativo (Malinowski, Belesky 2000, Clay,
Schardl 2002, Rodrguez et al. 2009, White, Torres 2010). No obstante, las
poblaciones en la naturaleza presentan una frecuencia de infeccin variable,
lo que indica que tambin existira variabilidad en la efectividad del
mutualismo y/o en la eficiencia de transmisin del endofito (Clay, Schardl
2002, Saikkonen et al. 2004, Gundel et al. 2008a)
La adecuada comprensin del proceso de transmisin del endofito y los
factores que lo controlan resulta clave para poder predecir y, eventualmente,
manejar la frecuencia de infeccin en las poblaciones de pastos nativos o
introducidos en pasturas. Si bien este proceso ha sido percibido como
altamente eficiente (Clay, Schardl 2002), en los ltimos tiempos esta
percepcin comenz a ser cuestionada (Gundel et al. 2008b). As, se encontr
que la eficiencia de transmisin vertical del endofito puede ser variable, en
especial cuando se consideran los distintos estadios del ciclo de vida del
pasto hospedante en un contexto poblacional (Gundel et al. 2008b). Cuando
una semilla infectada germina, las hifas ubicadas en los espacios
intercelulares del embrin pueden luego ser observadas en los meristemas
y en la base de las hojas de la plntula emergida (Figura 2). Dado que las
hifas se asocian de manera muy estrecha a los meristemas, el endofito
alcanza los macollos, las hojas o las flores muy tempranamente en la
diferenciacin (Clay, Schardl 2002, Saikkonen et al. 2004). Por lo tanto, en
las especies perennes el endofito puede mantenerse a travs de la
reproduccin vegetativa (Ejemplo, macollaje), pero en las especies anuales
la semilla es la nica unidad de multiplicacin y de dispersin de los dos
socios de la simbiosis. La transmisin puede presentar ineficiencias
parciales a causa de la muerte anticipada del endofito en las semillas, y
por la produccin de macollos, espigas y semillas no infectadas (Figura 2).
Estas variaciones en las tasas parciales de transmisin, que han sido
detectadas en poblaciones tanto de especies nativas como de introducidas
75
(Afkhami, Rudgers 2008; Gundel et al. 2009), parecen depender de factores

abiticos como biticos. Sin embargo, hasta el presente prcticamente no
existe informacin acerca de cmo operan los distintos factores ecolgicos
(Ejemplo; disponibilidad de agua y nutrientes, herbivora, etc.) sobre el
proceso de transmisin, un conocimiento ineludible para posibilitar el
manejo de la simbiosis en contextos productivos.
Los pastos hospedantes suelen experimentar cambios qumicos,
fisiolgicos y morfolgicos importantes a causa de los endofitos (Clay,
Schardl 2002). Aunque la presencia del endofito puede cambiar el perfil
metablico completo del pasto (Malinowski, Belesky 2000; Rasmussen et
al. 2008), se supone que los principales beneficios que el pasto obtiene se
deben a los alcaloides txicos que se acumulan en sus tejidos (Bush et al.
1997, White, Torres 2010). Si bien el micelio del endofito est restringido a
la parte area de la planta, la accin de los alcaloides puede alcanzar
incluso la parte subterrnea (Bush et al. 1993, Malinowski, Beleski 2000).
Existen cuatro grupos de alcaloides, lolinas, peraminas, ergopeptnicos y
lolitrenos, a los que se le conoce la funcin que desempea en cuanto a la
proteccin de los hospedantes contra herbvoros vertebrados e
invertebrados (Siegel et al. 1990; Bush et al. 1993; 1997; Popay, Bonos 2005).
Las concentraciones de los diversos alcaloides varan entre genotipos de
hongos y pastos (Faeth et al. 2002) y, tambin, entre ambientes (Bultman,
Bell 2003; Rasmussen et al. 2008). En particular, las lolinas slo estn
presentes en los pastos infectados con este tipo de endofitos; poseen una
actividad insecticida de amplio espectro y, en general, no son txicas para
los mamferos (Bush et al. 1997; Wilkinson et al. 2000). Tambin se ha
observado que otros metabolitos secundarios (e.g., compuestos fenlicos)
pueden aumentar su concentracin en los tejidos de los pastos infectados.
Estos metabolitos secundarios se exudan por las races de las plantas
infectadas (Malinowski et al. 1998), por lo que podran ejercer efectos
importantes sobre las condiciones qumicas y la disponibilidad de nutrientes
en la rizsfera tanto de la planta infectada como de sus vecinas (Omacini et
al. 2005).
Si bien la mayor parte del conocimiento de la simbiosis pasto-endofito
ha surgido de estudios en F. arundinacea y L. perenne (Saikonnen et al. 2006,
Rudgers, Clay 2007), algunos autores sugieren que entre un 20 y un 30% de
las gramneas pueden estar infectadas con endofitos sistmicos (Leuchtmann
1992; Clay, Schardl 2002). Constantemente se describen nuevas asociaciones
en diversas regiones del mundo (White et al. 2001; Cabral et al. 1999; Moon
et al. 2000; Rolston et al. 2002; Iannone et al. 2010). En nuestro pas, estos
hongos endofitos se asocian con varias especies de pastos de regiones
ridas y semiridas, templadas (Cabral et al. 1999; White et al. 2001; Torres
et al. 2004). Una revisin reciente permiti establecer que de un total de 80
especies coleccionadas, 34 estaban asociadas a endofitos, en un total 205
sitios del territorio argentino (Iannone et al. 2010). De todas estas especies,
76
cuatro resultan txicas para el ganado: Poa huecu, Festuca argentina, F.

hieronymi y F. dissitiflora. Ya en 1950, Parodi haba sealado que las tres
primeras eran muy txicas para los herbvoros. Recin 49 aos despus de
tal observacin, Cabral y colaboradores (1999) determinaron que esa
toxicidad se deba a la infeccin con hongos endofitos de la especie N.
tembladerae. En el caso de Festuca arundinacea y Lolium perenne, estas
especies estn ampliamente difundidas en las regiones templado-hmedas
de la Argentina y su asociacin con los endofitos N. coenophialum y N. lolii,
respectivamente, tambin tiene consecuencias negativas sobre el ganado,
si bien su incidencia es menor que la documentada en otros pases (de
Battista 2005; Gundel et al. 2009).
El significado ecolgico de la simbiosis en el suelo

El impacto de la presencia de los hongos endofitos se puede estudiar en una
jerarqua de dominios ecolgicos que van desde la planta hospedante hasta la
comunidad biolgica que la circunda, y de la que forma parte, tanto area como
subterrnea (Wardle et al. 2004; Omacini et al. 2005; van der Putten et al. 2009)
(Figura 3). De esta manera, los cambios inducidos en la morfologa, fisiologa o
qumica del hospedante se pueden propagar hacia los organismos y procesos
que determinan atributos de las comunidades tales como la diversidad, la
estructura de la cadena trfica o la resistencia a la invasin por nuevas especies.
Estos cambios, adems de guardar una relacin entre la porcin area y la
subterrnea, pueden ocurrir en tiempos cortos, y fundamentalmente ligados a
respuestas ecofisiolgicas de los individuos infectados, o bien en tiempos ms
prolongados, en los que medien cambios en la composicin de la vegetacin
debido a sus efectos indirectos en las interacciones entre las especies presentes
en el ecosistema (Figura 3). En definitiva, el resultado de lo que ocurre en el
tiempo ecolgico y en el evolutivo determina el xito tanto de la simbiosis como
del pasto hospedante en la comunidad (Figura 3) (Gundel et al. 2010).
Los cambios en la actividad de la microbiota del suelo debidos a la simbiosis
pasto-endofito se pueden observar en tiempos cortos, antes de que se detecten
modificaciones en la composicin y en la diversidad de la vegetacin (Clay,
Holah 1999). Un ejemplo de esto es la estimulacin de la respiracin microbiana
del suelo frente al agregado de rizodeposiciones de plantas de Festuca arundinacea
infectadas con Neotyphodium coenophialum, con respecto a sus equivalentes no
infectadas (Van Hecke et al. 2005). Otro ejemplo similar lo constituye la mayor
capacidad de reducir el Fe3+ en el ambiente rizosfrico de plantas infectadas de
la misma especie (Malinowski et al. 1998). Recientemente, en un ensayo bajo
condiciones controladas encontramos que la presencia de N. occultans en el
pasto anual Lolium multiflorum, alter la capacidad funcional de los
microorganismos del suelo con respecto a sus congneres sin endofito, luego de
una estacin de crecimiento del pasto (Casas et al. 2010). Ese lapso de 26 semanas
result suficiente para apreciar un cambio en la respuesta del suelo al agregado
77
de diferentes fuentes carbonadas de distinta complejidad (perfil catablico), y

un aumento en la contribucin relativa de los hongos a la actividad del suelo
(Casas et al. 2010). En ese mismo estudio, tambin se observaron cambios
pequeos en la estructura de la comunidad bacteriana, pero no se detectaron
modificaciones en su actividad. Si bien la medicin de las rizodeposiciones en el
suelo enfrenta serias restricciones metodolgicas, en plantas de L. multiflorum
creciendo en medio de cultivo se observ que la presencia del endofito les confera
una mayor capacidad de acidificar el medio externo (Vila Aiub et al. 2003).
No todos los hongos del suelo responden de la misma manera a la
presencia del endofito, e incluso existen algunas evidencias que sugieren
que una misma asociacin pasto-endofito puede comportarse de diferentes
maneras segn si el hongo es de vida libre o si coloniza un tejido del pasto
hospedante. Se ha demostrado que la presencia del endofito en los tejidos
areos de ciertas forrajeras como F. arundinacea, L. perenne y L. multiflorum,
puede disminuir la colonizacin de hongos formadores de micorrizas (Guo et
al. 1992; Mller 2003; Omacini et al. 2006; Mack, Rudgers 2008). En el caso
particular de L. multiflorum, las races de las plantas infectadas con endofitos
presentaron entre 10 y 16% de colonizacin, lo que representa un tercio del
nivel de colonizacin alcanzado por las plantas no infectadas (36-47%)
(Omacini et al. 2006). Sin embargo, en experimentos realizados a campo con
pastos nativos de la Argentina (Poa bonariensis y Bromus setifolius) se ha
observado una mayor colonizacin de hongos micorrticos en las races de
plantas infectadas con respecto a sus congneres no infectadas (Novas et al.
2009). Si bien estos estudios no incluyeron el estudio de los mecanismos que
regulan el nivel de colonizacin micorrtica entre plantas infectadas y no
infectadas con endofitos, existen evidencias de que pueden mediar complejas
interacciones con otros niveles trficos. Por ejemplo, Vicari et al. (2002)
detectaron que el endofito puede reducir el crecimiento de las larvas de
lepidpteros en ausencia de micorrizas, pero no cuando ambos simbiontes
estn presentes en el mismo hospedante. Por lo tanto, ignorar la presencia
del endofito como componente del ecosistema puede llevar a interpretaciones
errneas, ya que estos hongos modifican el funcionamiento de las micorrizas
y tambin a otras interacciones.
Existen relativamente pocos estudios en los que se haya evaluado el
impacto de los endofitos sobre otros organismos del suelo en el corto plazo,
y sus resultados tambin son muy variables. Por un lado, se ha detectado que
la infeccin puede reducir el dao por herbvoros de raz (Popay, Bonos 2005).
Pedersen y colaboradores et al.(1988), trabajando con F. arundinacea,
encontraron que la densidad de nemtodes fitfagos puede ser ms alta en
las races y en la rizsfera de las plantas con bajo nivel de infeccin endoftica
que en la rizsfera de las plantas con alto nivel de infeccin. Por su parte,
Chu-chou y colaboradores et al. (1992) observaron que la abundancia de los
nemtodes parsitos Helcotylencus spp. y Tylenchus spp. disminuy en parcelas
experimentales sembradas con plantas de F. arundinacea infectadas con
78
endofito, mientras que los nemtodes no parasticos no fueron afectados. En

el pasto Festuca pratensis, Popay y colaboradores (2003) observaron que la
presencia del endofito promova tanto una disminucin en la densidad de
larvas de Costelytra zealandica como un menor nivel de dao en las races.
Por otro lado, existen algunas evidencias de que la presencia de plantas
infectadas con endofito podra reducir la capacidad de fijar nitrgeno en
pasturas. Esto sucedera a travs de la reduccin del xito de las leguminosas
en las pasturas sembradas con la simbiosis L. perenne-N. lolii (Sutherland,
Hoglund 1989) y F. arundinacea-N. coenophialum (Clay, Holah 1999). En
experimentos realizados en invernculo tambin se observ que la supresin
de la leguminosa Trifolium repens depende del cultivar de pasto sembrado
dado que estos efectos negativos aumentan con en aquellos cultivares en los
que la produccin de alcaloides es mayor. Por esta razn, algunos
investigadores sugieren que la alelopata es uno de los mecanismos
involucrados en ese efecto (Malinowski et al. 1999, Sutherland et al. 1999).
An son necesarios estudios en los que se evale en qu medida la supresin
de las leguminosas frente a la presencia del endofito se debe un aumento en
la habilidad competitiva del pasto hospedante y/o a un efecto indirecto sobre
la capacidad de nodular y la actividad de las bacterias fijadoras de nitrgeno
(Ejemplo Rhizobium).
Tambin en el corto plazo, una vez finalizado el ciclo de crecimiento del
pasto hospedante, el endofito que queda en sus tejidos puede alterar procesos
clave del suelo a travs de varios caminos (Omacini et al. 2004) (Figura 4). En
primer lugar, las plantas infectadas que son naturalmente poco palatables
para muchos herbvoros (Clay 1990; Bush et al. 1997) pueden constituir un
sustrato de baja calidad para los organismos detritvoros y por lo tanto
descomponerse ms lentamente que las los materiales depositados por as
plantas no infectadas. Los cambios en la qumica de la planta hospedante,
algunos de ellos desconocidos, podran persistir en las hojas senescentes y
determinar cambios en la tasa de descomposicin (Bush et al. 1997; Siegrist
et al. 2010).En segundo lugar, la presencia de Neotyphodium puede alterar el
microambiente edfico y la descomposicin de otros sustratos al cambiar la
cantidad y calidad de la broza sobre la superficie del suelo, o la broza
subterrnea producida por la muerte de races. En este sentido, evidencias
empricas mostraron menores tasas de descomposicin del mantillo producido
por plantas de L. multiflorum y de F. arundinacea infectadas con respecto a
sus congneres no infectadas (Omacini et al. 2004; Lemons et al. 2005; Siegrist
et al. 2010) y una menor tasa de descomposicin de la broza de pastos no
infectados depositados en ambientes donde antes crecieron plantas con alto
nivel de infeccin (Omacini et al. 2004). Sin duda, los efectos del endofito en
la calidad de la broza y en su persistencia podran, a su vez, alterar la
disponibilidad de nutrientes para las especies presentes en el sitio
(Franzluebbers et al. 1999) y la condiciones biticas y abiticas para la
germinacin y el establecimiento de la prxima generacin de plantas (Antunes
et al. 2008, Omacini et al. 2009).
79
Figura 1: Dinmica temporal de la cantidad de artculos recopilados por la

base de datos Scopus que incluyen en su ttulo, resumen y/o palabras
clave, cada uno de los tres tipos de simbiontes. Lacantidad de artculos
est agrupada por dcada, desde 1961 hasta 2010. Ntese que durante las
dcadas de los sesenta y setenta, no se registran artculos con el trmino
Neotyphodium (o Acremonium coenophialum o A. lolii, como se lo denomin al
endofito de Festuca arundinaceae y Lolium perenne inicialmente).
Figura 2: Ciclo de vida del hongo endfito Neotyphodium en relacin al

ciclo de vida del pasto hospedante. Se indican las tasas vitales en cada
estadio del ciclo junto con las eficiencias parciales de transmisin del
endofito (llaves de flojo): (i) de semilla a plntula, (ii) de plntula a
macollo vegetativo, (iii) de macollo vegetativo a macollo reproductivo y
(iv) de macollo vegetativo a las semillas. Las fotos fueron tomadas por
Cecilia Casas y Lus Prez muestran las hifas del endofito (teidas con
rosa de bengala) en distintos rganos de la planta (200x).
80
Figura 3: Esquema de los efectos que puede tener la infeccin con hongos
endofitos sobre la estructura y el funcionamiento de los agroecosistemas.
Las flechas en ambas direcciones indican que los efectos tanto en
componentes areos como subterrneos de los ecosistemas pueden
modificar, a su vez, el xito tanto del pasto como del hongo simbionte.
Una cantidad de estudios de ms largo plazo, realizados en pastizales han

encontrado que la abundancia de individuos infectados aumenta con el paso
del tiempo (Clay, Schardl 2002). Esto sugiere que los cambios en la dominancia
de la simbiosis deberan ser acompaados por cambios en la estructura y la
dinmica del resto de la comunidad pero son muy pocos los trabajos publicados
en los que se compara la composicin y la diversidad de especies entre sitios
similares que slo difieren en el nivel de infeccin por endofitos (Omacini et al.
2005). En particular, un experimento a campo realizado por Clay and Holah
(1999) se destaca por haber demostrado que la presencia de N. coenophialum
en F. arundinacea limita drsticamente tanto el nmero de especies vegetales
como la tasa de entrada de especies arbreas durante la sucesin (Clay, Schardl
2002). Recientemente, Rudgers and Orr (2009) realizaron un experimento en el
que sembraron 9 especies arbreas en los suelos de esas mismas parcelas
experimentales; sus resultados mostraron que en el suelo condicionado por F.
arundinacea infectada se redujo la biomasa de al menos tres especies y la
superviencia de una de ellas, en comparacin con el suelo condicionado por F.
arundinacea no infectada. Adems, algunos de estos efectos de la presencia
previa de la simbiosis pasto-endofito se borraban cuando el suelo haba sido
esterilizado. Estos resultados sugieren que en las primeras etapas de la sucesin,
los efectos del endofito (tanto en el suelo como en la vegetacin) pueden generar
cambios en la direccin futura de la comunidad vegetal. Es evidente que solo
estamos comenzando a entender en qu medida los efectos en el hospedante y
luego en la comunidad vegetal pueden repercutir en el suelo y controlar la
dinmica y el funcionamiento del ecosistema. Se necesitan experimentos
manipulativos de largo plazo para saber si los efectos a nivel de la comunidad
81
estn asociados a un cambio en el vigor y la tolerancia al estrs de las plantas

infectadas, as como a mecanismos indirectos que involucran efectos del
endofito sobre las condiciones ambientales y las comunidades del suelo
(Matthews, Clay 2001).
Conclusiones
Las evidencias presentadas en este captulo muestran que, si bien ciertas
asociaciones de pastos con hongos endofitos afectan negativamente la
produccin pecuaria, esta simbiosis est ampliamente difundida en otras
especies e impactan de maneras muy diversas, y muchas veces ignoradas,
otros componentes del agroecosistema. En el componente subterrneo del
ecosistema, durante los ltimos aos, se ha identificado la huella del endofito
sobre la composicin y el funcionamiento de la biota edfica, en general, y de
ciertos grupos, en particular, tales como los hongos formadores de micorrizas,
las bacterias fijadoras de nitrgeno y los nematodos herbvoros. Sin embargo,
resulta llamativo que hasta el presente los endofitos hayan sido prcticamente
ignorados por los investigadores en esta red de conexiones entre los
componentes areos y subterrneos de los ecosistemas (Wardle 2002).
El uso creciente de agroqumicos en los planteos productivos y el impacto
ambiental y sobre la salud humana que acarrean, ha estimulado a los
cientficos para encontrar alternativas ms sustentables en el manejo de los
agroecosistemas (Tikhonovich, Provorov 2007). As, se ha generado
conocimiento que permiti el desarrollo de herramientas de control biolgico
de plagas, de fijacin simbitica de nutrientes, de promotores del crecimiento
y otros. En este sentido, la posibilidad de aprovechar los beneficios naturales
de la presencia de los endofitos Neotyphodium parece ser una opcin atractiva
y posible en este mismo camino. En este momento, se estn realizando grandes
esfuerzos por encontrar genotipos, o modificar los preexistentes, para lograr,
mediante el uso de endofitos no txicos, variedades forrajeras ms
persistentes y productivas (Panaccione et al. 2001; Colabelli et al. 2007) De
manera similar, la existencia de variabilidad natural en el perfil de alcaloides
producido por los endofitos segn su genotipo, el del pasto hospedante y/o el
ambiente, ha llevado a considerar la inclusin de este simbionte en los planes
de mejoramiento de gramneas ornamentales y para csped (Easton 2007). Si
duda, se requiere mayor conocimiento de los factores que controlan los
efectos deseables e indeseables de los endofitos y de aquellos que controlan
la persistencia y abundancia de la simbiosis en el sistema.
Agradecimientos
Las ideas presentadas en este trabajo fueron desarrolladas gracias a
nuestra interaccin cotidiana con Claudio Ghersa y con los estudiantes del
82
grupo de investigacin, en particular Cecilia Casas, Luis Prez y Pablo Garca

Parisi. Agradecemos tambin a Pablo Roset por revisar versiones previas de
este manuscrito. El presente trabajo forma parte del proyecto de investigacin
financiado por la Universidad de Buenos Aires (UBA), el Consejo Nacional de
Investigaciones Cientficas (CONICET) y la Agencia Nacional de Promocin
Cientfica y Tecnolgica (FONCYT).
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88
Captulo 5
Bacillus thuringiensis y su utilidad en el
control de insectos asociados a la rizosfera
Bacillus thuringiensis and their utility in the control of
insects associated to the rhizosphere
Diego H. Sauka; Rodrigo H. Monella, Graciela B. Benintende
Insumos Bacterianos, Instituto de Microbiologa y Zoologa Agrcola (IMYZA), Instituto
Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA). De los Reseros y Las Cabaas s/nro. C.C. 25. C.P.
1712. Castelar, Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected]
Introduccin
Las races de plantas de inters agroalimentario pueden ser vulnerables a la
actividad de una gran variedad de plagas de artrpodos, nemtodos y hongos.
Estas plagas producen prdidas sustanciales en los rendimientos, disminucin
de la longevidad de las plantas y de la calidad de los productos obtenidos. Todas
estas plagas demuestran interactuar en la rizosfera y de esta manera generar
un incremento en el dao a las races. Para poder controlarlas existen medidas
que pueden agruparse formando parte de programas de manejo que mejoran
la salud de las plantas. En gran medida, el control de plagas depende de la
aplicacin de productos qumicos. Su empleo indiscriminado produce problemas
de contaminacin ambiental, efectos no deseados sobre especies benficas y
tambin generando la seleccin de organismos resistentes. Debido a ello, hoy
en da existe una necesidad crtica de contar con herramientas seguras y efectivas.
Un ejemplo que se erige como una importante alternativa, lo constituye la
utilizacin de bacterias dentro del control microbiano de plagas, debido a su
toxicidad selectiva alta e impacto ambiental bajo a nulo. La especie Bacillus
thuringiensis es particularmente un exponente exitoso y el que mantiene un
nivel vigente de desarrollo, que se puede emplear para el control de insectos
plaga que afectan especficamente las races de plantas.
En este captulo se integran conocimientos de la biologa, la gentica y los
bioinsecticidas disponibles que contienen a esta bacteria entomopatgena
como ingrediente activo dentro de un contexto del control microbiano de
insectos que afectan las races de cultivos de inters agronmico.
Quin es Bacillus thuringiensis?

Bacillus thuringiensis es un bacilo gram positivo, anaerobio facultativo,
89
Diego H. Sauka, Rodrigo H. Monella, Graciela B. Benintende
de flagelacin pertrica, que posee la particularidad de desarrollar esporas

de resistencia elipsoidales que no provocan el hinchamiento del perfil bacilar
(Figura 1) (Sauka, Benintende 2008). No obstante, la caracterstica principal
de esta bacteria entomopatgena es que durante el proceso de esporulacin
produce una inclusin parasporal formada por uno o ms cuerpos cristalinos
de naturaleza proteica con toxicidad para distintos invertebrados,
especialmente larvas de insectos lepidpteros, dpteros y colepteros (Figura
1) (Sauka, Benintende 2008). El cristal parasporal se ubica en el interior del
esporangio y, por lo general, fuera del exosporio de la espora, siendo ambos
liberados tras la lisis celular.
Las protenas que forman los cristales, denominadas Cry, son muy diversas
e incluyen un conjunto de 68 grupos principales divididos en diferentes clases
y subclases juzgadas en base a un anlisis de similitud de sus secuencias de
aminocidos e informacin estructural derivada a partir de cristalografa de
rayos X (B. thuringiensis toxin nomenclature website en http://
www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/) (Crickmore et al. 1998). Las
diferencias aminoacdicas que presentan se traducen comnmente en las
variaciones a nivel de toxicidad y especificidad (Tounsi et al. 1999). Las protenas
Cry muestran en general espectros de actividad reducida y muchas veces
acotados a unas cuantas especies de insectos pertenecientes a un mismo
orden. Los genes que codifican estas protenas (genes cry), siguen la
clasificacin de sus protenas.
Figura 1: Imagen de B. thuringiensis en estado de esporangio obtenida a

travs de microscopa electrnica de transmisin. C: cristal parasporal;
E: espora. Barra, 200 nm.
B. thuringiensis puede llegar a producir la muerte del insecto por un mecanismo

no mediado por protenas Cry. Puede producir factores de virulencia como
fosfolipasas C, hemolisinas, enterotoxinas, a y b-exotoxinas, metaloproteasas,
quitinasas, protenas Vip (del ingls Vegetative insecticidal protein) y protenas
Sip (del ingls Secreted insecticidal protein) que le permitiran sobrevivir y
90
Bacillus thuringiensis y su utilidad en el control de insectos asociados a la rizosfera
multiplicarse dentro del husped, evadir su sistema inmune y producir septicemia

(Fedhila et al. 2004, Donovan et al. 2006). En varios estudios se prob que tanto
las quitinasas como las Vips aumentan la eficiencia y potencia de las toxinas Cry
en el control de insectos plaga. Por un lado, se sugiri la posible inclusin de algunos
de estos factores de virulencia a formulaciones de bioinsecticidas, y por otro, se
logr la incorporacin de sus genes a cepas de B. thuringiensis que no los posean
con el objeto de mejorar su actividad insecticida (Liu et al. 2002, Arora et al. 2003).
Las quitinasas son enzimas que tienen la capacidad de degradar quitina, un
componente principal de la cutcula y membrana peritrfica de insectos. Esta ltima
se encuentra recubriendo internamente el intestino y funciona como barrera fsica
contra infecciones bacterianas y virales, pero permite el flujo de nutrientes,
minerales y agua hacia el epitelio del intestino medio (Patil et al. 2000). Los
patgenos que infectan a travs del intestino deben penetrar esta barrera rica en
quitina, por lo que, la degradacin de membrana peritrfica es un blanco a vencer
para poder mejorar la accesibilidad de las protenas Cry a la membrana epitelial
(Regev et al. 1996).
Las Vips son protenas insecticidas no relacionadas estructuralmente con las
Cry, que no forman inclusiones cristalinas y que se secretan al medio durante la
etapa de crecimiento vegetativo de la bacteria (Estruch et al. 1996). Incluyen una
toxina binaria Vip1 y Vip2 con especificidad para colepteros, y Vip3 con
especificidad para lepidpteros (Estruch et al. 1996, Warren 1997 y 1998). Las
protenas Sip fueron recientemente descritas y muy poco se conoce de ellas. Slo
se conoce un miembro de este grupo, la protena Sip1A (Donovan et al. 2006).
Esta posee propiedades insecticidas para colepteros. Es producida y tambin
secretada por B. thuringiensis durante su etapa de crecimiento vegetativo.
El material gentico de B. thuringiensis consta de un cromosoma que
est representado por 5,3 millones de bases y de elementos
extracromosomales (plsmidos) cuyo tamao y nmero es variable entre las
distintas cepas de esta especie bacteriana (Schnepf et al. 1998, Han et al. 2006,
Challacombe et al. 2007, He et al. 2010). La comparacin de genomas de B.
thuringiensis con los de Bacillus cereus demostraron que ambas especies
comparten una organizacin genmica muy similar en la regin cercana al
origen de replicacin, mientras que el resto presenta una mayor variabilidad.
Actualmente se conoce la secuencia completa del genoma de tres cepas de B.
thuringiensis que brindan informacin nueva de secuencias de nucletidos
que es utilizada para poder entender mejor su gentica (Challacombe et al.
2007, Han et al. 2006, He et al. 2010). La gran mayora de las cepas de B.
thuringiensis poseen varios elementos extracromosomales, pudiendo ser
circulares y/o lineales (Carlson et al. 1994).
B. thuringiensis tambin se caracteriza por la presencia de plsmidos que
pueden variar en nmero de 1 a 17 por bacteria (Baum y Gonzlez 1992), y
cuyos tamaos oscilan entre 2 y cientos de kilobases (Gonzlez y Carlton 1980).
Estas cualidades de los plsmidos de B. thuringiensis son muy valiosas para la
caracterizacin de cepas, ya que junto al perfil proteico de los cristales, el
91
contenido de genes cry y la identificacin serolgica, permite hacer una

descripcin diferenciada de los diversos B. thuringiensis (Lopez-Meza e Ibarra
1996, Benintende et al. 1999, Sauka 2007, Sauka et al. 2010). De acuerdo al
mecanismo de replicacin que utilizan los plsmidos pueden clasificarse en dos
grupos que aparentemente no estaran relacionados (Porcar y Caballero, 2001):
plsmidos menores de 15 kb, sin funcin conocida que se replicaran

mediante un mecanismo de crculo rodante;
plsmidos de peso molecular elevado, mayores a 45 kb que se
replicaran mediante un mecanismo de tipo theta. Los plsmidos de
elevado peso molecular de B. thuringiensis poseen una estabilidad
estructuralmente alta permitiendo que la mayora de las cepas los
mantengan sin perderlos.
La mayora de los plsmidos de B. thuringiensis se han considerado

crpticos, debido a que no se les conoce una funcin determinada, con la
excepcin de poseer los genes cry responsables de codificar toxinas
insecticidas. La primera evidencia que ayuda al establecimiento de una
correlacin entre sntesis de protenas del cristal y la presencia de un plsmido,
se estableci por experimentos de curado de plsmidos, realizada por
Gonzlez y col. (1981). Posteriormente, se prob la transferencia de estos
plsmidos y otros entre distintos B. thuringiensis utilizando un proceso similar
a la conjugacin comnmente conocida en bacterias gram negativas (Gonzlez
et al. 1982). Mediante la reintroduccin de los plsmidos apropiados, fue
posible restablecer la capacidad de sntesis del cristal en las bacterias a las
cuales se les haba eliminado esta funcin mediante el curado. La evidencia
directa del rol que juegan estos plsmidos se obtuvo al clonar los primeros
genes cry, que se utilizaron como sondas para determinar su localizacin en
muchas de las cepas conocidas (Hfte, Whiteley 1989). De estas observaciones
se concluye, que los genes cry se encuentran localizados en plsmidos de peso
molecular elevado y que se replican mediante un mecanismo de tipo theta.
A pesar de dicha generalizacin, existe un reporte reciente en el que se
detect un gen cry en un plsmido de peso molecular bajo que se replica
mediante un mecanismo de crculo rodante (Loeza-Lara et al. 2005). Tambin
se report la existencia de genes cry insertados en el cromosoma de B.
thuringiensis (Klier et al. 1982, Klier, Rapoport 1984, Sanchis et al. 1988). En
algunas cepas pertenecientes a los serovares aizawai, thuringiensis,
dendrolimus, entomocidus y wuhanensis se detect la localizaron de genes
cry en el DNA cromosmico mediante experimentos de hibridacin Southern
blot. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que dichos genes
se encuentren en realidad presentes en un plsmido de peso molecular
elevado, el cual, dada su fragilidad, se rompa durante las etapas de extraccin
y/o anlisis. De esta forma, dichos plsmidos co-migraran con el DNA
92
cromosomal durante su anlisis electrofortico, lo cual explicara su presencia

en la banda del DNA cromosomal (Jurez-Prez 2004).
Otra caracterstica importante de los plsmidos de B. thuringiensis es que
son conjugativos. Cuando dos B. thuringiensis son cultivados juntos pueden
intercambiar plsmidos con una frecuencia elevada. Existen varios reportes
en relacin al estudio de este mecanismo entre cepas de B. thuringiensis bajo
distintas condiciones en laboratorio. Vilas-Bas y et al. (1998) evaluaron la
frecuencia de conjugacin entre una cepa de B. thuringiensis serovar
thuringiensis y una del serovar kurstaki en medios de cultivo, en distintos tipos
de suelo y en larvas vivas de insectos lepidpteros. Los transconjugantes
aparecieron luego de dos horas de incubacin en el medio de cultivo y de
cuatro horas en el caso de los suelos. Encontraron que la frecuencia ms alta
de transferencia se dio en las larvas infectadas y la ms baja en suelo. Otros
estudios, en los que se utilizaron cepas de B. thuringiensis serovar kurstaki,
thuringiensis e israelensis, se comprob que la conjugacin tambin es posible
en medios acuticos (Furlaneto et al. 2000, Thomas et al. 2001).
Mecanismo de accin general de las protenas Cry

Desde un punto de vista generalista, se pudo determinar que las protenas
Cry producen el dao celular en el intestino de las larvas de insectos
susceptibles siguiendo un proceso de varias etapas (Figura 2). Los cristales de
B. thuringiensis, y en algunos casos tambin las esporas, son ingeridos por la
larva del insecto como parte de su dieta habitual (en algunos casos puede ser
una planta BT ver ms adelante). Los cristales son posteriormente
solubilizados en el intestino medio del insecto liberando las protenas cristalinas
en forma de protoxinas. Estas son procesadas por proteasas para generar las
toxinas activas que se conocen como d-endotoxinas. As, atraviesan la
membrana peritrfica y se unen a receptores especficos de la membrana
epitelial, para insertarse en la misma y producir poros que finalmente conducen
a un desequilibrio osmtico y a una lisis celular consecuente. El tejido intestinal
es daado severamente durante este proceso, impidiendo la asimilacin y
retencin de compuestos vitales para la larva, lo que lleva a la muerte del
insecto por desnutricin. La muerte puede verse acelerada, ya que la
desorganizacin del epitelio producida por la lisis celular favorece el acceso
de las esporas a la hemolinfa donde encuentran un mbito propicio germinar
y para que las clulas vegetativas de la bacteria proliferen (Vachon et al. 2004).
Broderick y et al. (2006 y 2009) sugirieron que la mortalidad sera slo
inducida por B. thuringiensis y que dependera esencialmente de bacterias que
forman parte de la microbiota del intestino medio del insecto husped como
responsables reales. No obstante, est posibilidad fue descartada recientemente
por otro grupo de investigacin que confirma que la presencia de B. thuringiensis
es suficiente para producir la muerte de la larva y que lo puede lograr en ausencia
de su microbiota intestinal (van Frankenhuyzen et al. 2010).
93
Figura 2: Esquema del mecanismo de accin general de las protenas Cry

(Tomado de Sauka 2007).
Cules son las formas en que se puede presentar B.

thuringiensis para ser utilizado en control de plagas?
B. thuringiensis se puede presentar bajo una serie de formas conocidas
como bioinsecticidas de primera, segunda y tercera generacin (Tabla 1), as
como de las llamadas plantas transgnicas BT que se emplean en el control de
plagas insectiles.
Tabla 1.
Caractersticas principales de los bioinsecticidas que poseen B. thuringiensis
como ingrediente activo.
Bioinsecticidas Caractersticas principales de las formulaciones

Primera generacin Mezcla de cristales y esporas de B. thuringiensis como
ingrediente activo.- Especificidad restringida a ciertos
rdenes de insectos, potencia relativamente baja y
toxicidad residual corta.- Constituyen la mayor proporcin
de los productos comerciales disponibles mundialmente.
Segunda generacin Mezcla de cristales y esporas de B. thuringiensis a la
cual se le introdujo genes que codifican d-endotoxinas
presentes en otros B. thuringiensis- Espectro de actividad
ampliado o toxicidad incrementada mediante un efecto
sinrgico o aditivo.
Tercera generacin Contiene bacterias recombinantes que fueron
modificadas genticamente con genes cry de B.huringiensis,
o esta misma bacteria modificada con otros genes que
codifiquen para otros factores de virulencia distintos a las
d-endotoxinas.- Toxicidad residual aumentada o espectro
de actividad ampliado.
94
Un nmero elevado de formulaciones a base de B. thuringiensis se

encuentran registradas en todo el mundo. En nuestro pas, algunas empresas
privadas locales registraron productos de origen nacional destinados al control
de orugas defoliadoras y tambin mosquitos, los que se suman a productos
de importacin (Sauka, Benintende 2008). Tambin se encuentran registradas
un gran nmero de plantas transgnicas BT, plantas que expresan genes cry,
restringindose para su comercializacin en nuestro pas slo plantas de maz
y algodn (CERA 2011). En comparacin con los bioinsecticidas dispersables
que poseen cristales y esporas de B. thuringiensis como ingrediente activo,
este tipo de plantas transgnicas tienen la ventaja de que brindan una mayor
y ms efectiva proteccin a lo largo de toda la estacin de su crecimiento.
Control microbiano de insectos plaga asociados a la rizosfera

empleando B. thuringiensis
Las estrategias de Manejo Integrado de Plagas (MIP) tienen base en
principios ecolgicos, teniendo en consideracin todo el ecosistema y no solo
a una especie afectada (Lecuona 1996). As, distintas tcticas de control se
amalgaman para conseguir la reduccin poblacional esperada de la plaga, como
para impedir el avance a regiones no deseadas. Dentro de ellas, el control
microbiano (rama del control biolgico), estudia el uso de organismos
microscpicos (bacterias, hongos, virus, protozoarios y nematodos) en el
control de plagas para reducir sus poblaciones y los efectos dainos que ellos
causan (Lecuona 1996). En particular, el control microbiano de plagas insectiles
que atacan el sistema radicular de plantas que poseen valor econmico con
B.thuringiensis o plantas transgnicas productoras de sus toxinas es de gran
inters, ya que se disminuye la aplicacin de pesticidas que pueden causar
importantes daos y contaminacin medioambiental. Por otro lado, a pesar
de este gran inters existente en el control de plagas asociadas a la rizosfera,
su aplicacin exitosa se restringe, como se ver a continuacin, a un nmero
limitado y determinado de especies del orden Coleoptera. Lamentablemente
no se dispone hasta ahora de ningn bioinsecticida comercial de primera
generacin que se haya registrado para el control de este tipo de plagas, si
bien se dispone en el presente de cepas ampliamente promisorias (Tabla 2).
Tabla 2.
Susceptibilidad de plagas rizfagas a B.thuringiensis.
Bacillus Familia Gnero y Planta L/Ca Referencias

thuringiensis especie afectada
serovar/cepa
Bt185 Scarabaeidae Holotrichia Csped L Yu et al. 2006
parallela
95
PS80JJ1, Chrysomelidae Diabrotica Maz L Ellis et al. 2002

PS149B1 y virgifera
PS167H2 virgifera
galleriae Scarabaeidae Popillia Csped L Sharpe 1976
japonica
japonensis Scarabaeidae Anomala Csped L Susuki et al. 1992
Buibui albopilosa
Anomala Csped, L Ohba et al. 1992,
cuprea caa de Susuki et al. 1992 y
azcar 1993
Anomala Csped L Susuki et al. 1992
daimiana
Anomala Csped, C Koppenhofer et al.
orientalis anan, 1999, Mashtoly et
maz, al. 2009
caa de
azcar
Anomala Csped L Ohba et al. 1992,
rufocuprea Susuki et al. 1992,
Hori et al. 1994
Anomala Csped L Susuki et al. 1992
schonfeldti
Cyclocephala Csped L Mashtoly et al.
borealis 2009
Cyclocephala L/C Koppenhofer et al.
Csped
hirta 1997,
Koppenhofer
et al. 1999
Cyclocephala Csped L/C Koppenhofer et al.
1997,
pasadenae
Koppenhofer et al.
1999
Exomala Csped L/C Ohba et al. 1992,
orientalis Alm et al. 1997
Popillia Csped C Alm et al. 1997
japonica
kumamotoensis Chrysomelidae Diabrotica Maz L Johnson et al. 1993
undecin
punctata
howardi
a
Ensayo realizado en Laboratorio (L) y/o a Campo (C).
96
B. thuringiensis se la puede encontrar comnmente en muestras de suelo,

si bien su rol en el mismo no se comprende en su totalidad. La mayora de los
estudios disponibles describen la presencia y/o persistencia de sus esporas
en el mismo alejado de las races (Petras, Casida 1985), pero poco se conoce
sobre la persistencia de sus clulas vegetativas en la rizosfera de plantas. Lo
que s se sabe es que B. thuringiensis no es una rizobacteria verdadera como
lo constituye Rhizobium, que en general crece al colonizar las races de las
plantas con las que se asocian, y que no preferiran la rizosfera para su
desarrollo. No obstante, con la disponibilidad de esta escasa informacin y
sabiendo que existen especies bacterianas que en la rizosfera de plantas hallan
un ambiente apropiado para su crecimiento y supervivencia protegindose
de diversos factores biticos y abiticos, se opt por la introduccin de genes
cry de B. thuringiensis en Rhizobium mediante ingeniera gentica. El objetivo
fue transformar a Rhizobium para que junto a la nodulacin, tambin se exprese
las protenas insecticidas en ndulos y en la raz. Esta estrategia brind
resultados prometedores en el control de plagas que afectan la raz (Nambiar
et al 1990, Skot et al 1990, Bezdicek et al 1991).
El caso del control de los gusanos que afectan las races del
maz
El maz posee a nivel mundial una importancia relevante en aspectos que
conciernen tanto a lo econmico como a lo social, y es afectado por diversas
plagas (enfermedades, malezas, artrpodos). De ellas, unas diez especies o
subespecies del gnero Diabrotica (Coleoptera) son reconocidas como plagas
(Krysan, Miller 1986). Las larvas de estos insectos tienen en comn que
presentan hbito subterrneo y se alimentan de las races del maz (Krysan,
Miller 1986, Saini 2005). Aunque no inciden directamente en los rendimientos
en s, causan un impedimento en el crecimiento de la planta (PRMIP 1990).
Diabrotica virgifera, D. barberi y D. undecimpunctata howardi son plagas
principales en Norteamrica que afectan la raz del maz (Krysan, Miller 1986).
D. virgifera no se haba detectado nunca en Europa hasta que fue observada
cerca de Belgrado en 1992, para luego dispersarse por el continente y generar
gran preocupacin entre los productores. Por otro lado, D. speciosa es la
prima Sudamericana de las anteriores. Comnmente se la conoce en nuestro
pas como vaquita de San Antonio. Se distribuye a lo largo de toda el rea
maicera de Argentina, llegando a lograr por ao hasta tres generaciones en el
norte (Defag de Pecchioni et al. 2000, OEPP/EPPO 2005).
El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) estima que
los daos causados por especies de Diabrotica de esa rea, generan prdidas
de 1 billn de dlares anuales a la renta pblica, los cuales incluyen 800
millones en prdidas por menor rendimiento y 200 millones en tratamiento
por parte de los agricultores (http://www.usda.gov/wps/portal/usdahome).
Si bien en nuestro pas no disponemos de este tipo de estimaciones por ahora,
97
es factible creer que los perjuicios econmicos que producen, son en

proporcin al menos similares a los mencionados, teniendo en cuenta que
nuestra vaquita causa daos ms severos que las especies
norteamericanas.
Existen dos tipos de manejos principales que se emplean para el control
de estos colepteros: la rotacin de cultivos, en particular con soja o alfalfa, y
principalmente la aplicacin de insecticidas qumicos con todos los riesgos
ambientales que ello acarrea (Arruda et al. 2005). Entre ellos se destaca la
disminucin de organismos benficos que contribuyen al mantenimiento de
las plagas en niveles lo suficientemente bajos como para que no causen
dao. Esto originara que al desembolso requerido para el control de estas
especies, se le debera agregar los costos de control adicional de otras plagas
desprovistas de sus enemigos naturales.
Por lo hasta aqu argumentado, y teniendo en cuenta los hbitos alimenticios
de las larvas de Diabrotica, la mejor opcin alternativa es la implementacin de
una estrategia que involucre la utilizacin de plantas transgnicas productoras
de toxinas de B. thuringiensis a nivel de la raz para el control del dao producido
por larvas de esta plaga. El primer paso para lograr el desarrollo de una de estas
plantas transgnicas BT fue el descubrimiento de protenas de B. thuringiensis
con niveles efectivos de toxicidad para los gusanos de la raz del maz. Estas
incluyen las protenas cristalinas Cry3 y Cry6Aa1, y las solubles que constituyen
la protena binaria Vip1/Vip2 (Gaertner et al. 1990, Donovan et al. 1991 y 1992,
Carozzi et al. 1993, Narva et al. 1993, Thompson et al. 1999). Tambin se
reportaron derivados de Cry3Bb1 modificados genticamente que poseen una
toxicidad mejorada para larvas de Diabrotica (English et al. 2000). Las ltimas
en ser descritas fueron las protenas binaria Cry34/Cry35 (Baum et al. 2004) y
Sip1A (Donovan et al. 2006).
Algunos genes que codifican estas protenas fueron introducidos para su
expresin en hbridos de maz comerciales. La compaa Monsanto a travs
del uso de tcnicas de DNA recombinante, desarroll plantas de maz que son
protegidas del dao debido a gusanos del orden Coleoptera que afectan su
raz. Esta planta fue registrada en los Estados Unidos en 2003 (United States
Environmental Protection Agency Fact Sheet, 2005a). Los tejidos de estas
plantas expresan la protena Cry3Bb1 obtenida originalmente de B.
thuringiensis serovar kumamotoensis que es toxica selectivamente para larvas
de este tipo de gusanos. El nombre comercial de este producto es el YieldGard
Rootworm corn, planta transgnica BT que brinda a los que la cultivan una
serie de beneficios principales que se pueden resumir a continuacin:
Efectividad: prob ser una alternativa efectiva al tratamiento con ciertos

pesticidas tradicionales. Provee un control ms consistente debido a
que no se ven comprometidas por factores climticos que afectan a los
insecticidas aplicados.
98
Reduccin en la exposicin a insecticidas: con la proteccin frente al

dao transportado en las semillas los agricultores no necesitan
manipularlas como si estuvieran tratadas con insecticidas
convencionales.
Simplicidad: los agricultores no deben gastar tiempo en aplicacin de
insecticidas, pudiendo disponerlo para un sembrado ms dedicado.
La seguridad ambiental de esta planta de maz BT se estableci mediante

el ensayo en laboratorio y a campo de sus tejidos vegetales o de la protena
Cry3Bb1 frente a una amplia variedad de especies que no se espera que sean
blancos de accin (Grant et al. 2003, Taylor et al. 2003, Hyun et al. 2005,
Scheideler et al. 2008). No se observaron efectos adversos frente a esas
especies, an empleando las concentraciones de Cry3Bb1 mximas esperadas
en el ambiente. Adems, otros estudios demostraron que esta protena se
degrada rpidamente en diversos tipos de suelos (Icoz et al. 2008). Otras
observaciones obtenidas de estudios agronmicos realizados a lo largo de
toda la regin maicera de los Estados Unidos confirman que estas plantas son
fenotpicamente equivalentes al maz convencional (George et al. 2004), con
la obvia excepcin de su capacidad insecticida, por lo que son seguras e igual
de nutritivas para su consumo.
Herculex RW Rootworm Protection es otra planta de maz transgnico BT
que fue desarrollado en colaboracin entre Dow AgroSciences y Pioneer Hi-
Bred International, y registrado en los Estados Unidos en 2005 (United States
Environmental Protection Agency Fact Sheet, 2005b). Los tejidos de estas
plantas expresan una protena binaria (Cry34Ab1 y Cry35Ab1) obtenida de la
cepa PS149B1de B. thuringiensis que es toxica selectivamente para larvas de
este tipo de gusanos. Esta planta de maz brinda a los agricultores que la
cultivan los mismos beneficios principales que se describieron para el
YieldGard Rootworm corn.
El ltimo maz BT desarrollado especficamente para el control de gusanos
de las races fue el Agrisure RW por Syngenta Seeds Inc. Este producto fue
registrado en 2006, tambin en los Estados Unidos (United States
Environmental Protection Agency Fact Sheet, 2006). Estas plantas expresan
una protena Cry3A modificada que originalmente posee un nivel reducido de
toxicidad para Diabrotica spp. El gen cry3A de B. thuringiensis serovar
tenebrionis, primer B. thuringiensis descubierto con toxicidad para colepteros,
especficamente para el escarabajo de la papa (Leptinotarsa decemlineata),
se recre sintticamente para optimizar su expresin en maz y mejorar su
actividad txica para larvas de D. virgifera virgifera y D. barberi.
Hasta la fecha ninguna variedad transgnica de maz BT destinada al control
de gusanos de la raz est disponible en Argentina para su cultivo. Nuestro grupo
de trabajo est trabajando actualmente en el marco de dos proyectos financiados
por el Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria y la Agencia Nacional de
99
Promocin Cientfica y Tecnolgica, que tienen como base el posible desarrollo

de tcticas de control menos contaminantes que puedan ser empleadas
especficamente en estrategias de manejo integrado de D. speciosa para reducir
los daos y/o prdidas que esta plaga ocasiona. Esos proyectos estn generando
bases cientficas y tecnolgicas destinadas al desarrollo de futuros insumos
para el control de este coleptero en nuestra regin. Se est llevando a cabo la
seleccin de B. thuringiensis con alta toxicidad para D. speciosa que puedan ser
utilizadas en el desarrollo de bioinsecticidas bacterianos destinados para su
integracin en sistemas de produccin vegetal sustentable. Adems, se proyecta
disponer de genes que codifiquen reconocida capacidad insecticida que puedan
ser empleados para la futura transformacin de organismos (planta, bacteria,
etc.) que expresen algunas de estas caractersticas.
Consideraciones finales
Se apuesta por un esfuerzo mayor en la investigacin y desarrollo de
herramientas de uso agrcola para el control de insectos plaga asociados a
la rizosfera, con el fin de obtener formulaciones que incluyan B. thuringiensis
como agentes de control microbiano y/o plantas transgnicas que rechacen
los embates de este tipo de plagas que son tan difciles de controlar debido a
los hbitos subterrneos de las larvas. Todo esto es necesario para la
reduccin de la contaminacin debida a una carga excesiva de pesticidas
qumicos que se vierten al ambiente, objetivo ste de gran trascendencia
mundial. Parte de estos objetivos se cumplieron en ciertos pases, en los que
estn disponibles plantas modificadas genticamente que expresan protenas
Cry especficas para el control de diversas especies de Diabrotica.
Un desafo sera llegar a lograr el desarrollo de un bioinsecticida exitoso
para controlar larvas que se alimentan de races de plantas de inters
econmico, que se pueda dispersar en el suelo y que posea a B. thuringiensis
como ingrediente activo. Esto es algo, que a pesar de disponer de cepas con
toxicidad para este tipo de insectos, no se ha logrado hasta hoy.
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107
108
Captulo 6
Nematodos como indicadores de la
calidad del suelo: Efectos de la fertilizacin
nitrogenada
Nematodes as indicadors of soil quality:
Effects of nitrogen fertilization
Claudia Viviana Azpilicueta1, Mara Cristina Aruani2
1
Laboratorio de Servicios Agrarios y Forestales. Ministerio de Desarrollo Territorial. Santiago
del Estero 426. (8300) Neuqun. 2Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional del
Comahue. Cinco Saltos. Ro Negro.
Introduccin
Nematodos como componentes del sistema suelo
El suelo es un sistema integrado por organismos en estrecha relacin e
interaccin con el medio fsico - qumico que sirve de soporte y medio de vida
y es un componente crtico en la estructura y funcin de los agrosistemas.
Los organismos del suelo aportan una serie de servicios fundamentales para
el sustento de todos los ecosistemas ya que son los principales agentes del
reciclado de nutrientes, regulan la dinmica de la materia orgnica del suelo
y la retencin de carbono, modifican la estructura y el contenido de agua del
suelo, mejoran la cantidad y eficacia de captacin de nutrientes de las plantas
(Ferris et al. 2001). Estos servicios no slo son decisivos para el
funcionamiento de los ecosistemas naturales, sino que constituyen un
importante recurso para la gestin sostenible de los sistemas agrcolas
Entre los organismos del suelo podemos citar a los nematodos que son
gusanos cilndricos, aunque en algunos gneros las hembras pierden el aspecto
vermiforme y se vuelven globosas. Son animales pequeos, las especies de la
familia Tylenchidae miden entre 0,2 y 1 mm de longitud, ocasionalmente mayores
de 3 mm, (Luc et al. 1990) y las especies del orden Dorylaimida promedian el
mm, pero hay organismos que pueden medir 0,3 - 0,4 mm o tan largos como 12
mm (Jairajpuri, Ahmad 1992). El cuerpo est revestido por una cutcula de
naturaleza proteica, flexible que permite los movimientos del animal. Esta
cutcula reviste los orificios de la boca, recto, ano, fasmidios, anfidios, vagina
y poro excretor. El ciclo biolgico de los nematodos del suelo se desarrolla
dentro de este o de las plantas, segn la modalidad de alimentacin. Se
diferencian tres estados: huevo, juvenil y adulto (Dropkin, 1989).
109
Grupos trficos
La morfologa de la cavidad bucal (Fig. 1) y esfago de los nematodos
tiene una estrecha relacin con el hbito trfico. Yeates et al. (1993)
realizaron una revisin bibliogrfica donde resumieron informacin de
los hbitos alimenticios de los nematodos, agrupndolos en ocho grupos
trficos, aunque generalmente son reconocidos cinco: fitfagos,
bacterifagos, fungvoros, omnvoros y depredadores (Yeates 1971) que se
detallan a continuacin.
1. Fitfagos: Esta categora agrupa especies que se alimentan de plantas

vasculares. Su alimento consiste en el contenido celular y jugos obtenidos
a travs de un estomaestilete tylenchoideo o de un odontoestilete
dorylaimoideo. Con el estilete atraviesa las paredes celulares de las races
de las plantas y por contracciones de la zona muscular del esfago absorbe
el contenido citoplasmtico de las clulas vegetales. Esta categora
comprende especies del Orden Dorylaimida y Tylenchida. Hay una extensa
bibliografa sobre el manejo de este grupo trfico en sistemas agrcolas
sustentables y de subsistencia (Bridge 1996) y de distintas estrategias de
manejo en agricultura intensiva (Barker, Koenning 1998). Algunos gneros
estn relacionados con prdidas econmicas de los cultivos, como
Globodera, Heterodera, Meloidogyne, Pratylenchus, Xiphinema, entre los
ms importantes (Yeates 1998).
2. Bacterifagos: Se alimentan a travs de un estoma de diferente tamao
y forma. Estos organismos afectan la descomposicin de la materia
orgnica de distinta manera ya que se alimentan de microbios y regulan
la velocidad de descomposicin, dispersan microbios a travs del suelo
y agua, se alimentan de bacterias saprfitas o fitopatgenas e influyen
en la composicin de la comunidad microbiana, adems sirven como
fuente de alimento para la fauna del suelo y afectan la distribucin y
funcin de los simbiontes de las plantas (Freckman 1988).
3. Fungvoros: Se alimentan de hifas al introducir el estomaestilete o un
odontoestilete. Incluye tambin a los nematodos que se alimentan de
levaduras o esporas de hongos que son perforadas pero no ingeridas
en su totalidad. Comprende especies del orden Aphelenchida,
Dorylaimida y Tylenchida.
4. Carnvoros: Ejemplares de Monochidae poseen una cavidad bucal
fuertemente esclerozada, armada a veces con uno o numerosos dientes,
esta familia se alimenta de una variedad de animales del suelo como
de nematodos Tylenchida, Dorylaimida, Mononchidos y rotferos
(Bilgrami et al. 1986). Los ejemplares del orden Dorylaimida presentan
un estilete para alimentarse.
5. Omnvoros: Estos nematodos combinan distintas fuentes de alimentos
incluyendo bacterias, algas, hongos, protozoos y rotferos.
110
Nematodos como indicadores de la calidad del suelo: efectos de la fertilizacin nitrogenada
Figura 1: Cavidad bucal de distintos grupos trficos de nematodos: (A)

Bacterifago, (B) Fitfago, (C) Depredador Dorylaimida, (D) Depredador
Mononchidae. (Fotografa Claudia Azpilicueta).
Nematodos como bioindicadores

En los ltimos aos, se ha demostrado un inters creciente en el estudio de
la nematofauna del suelo ya que poseen atributos que los hacen tiles como
indicadores ecolgicos de la calidad y salud del suelo (Bongers, 1990,
Wasilewska, 1997). Los nematodos son frecuentemente los ms numerosos de
los Metazoa, se encuentran en cualquier ambiente que provea una fuente de
carbono, en cualquier tipo de suelo y bajo todas las condiciones climticas,
viven en el agua capilar y estn en contacto directo con el microambiente
debido a que tienen una cutcula permeable (Bongers, Ferris 1999). Ocupan
posiciones claves en la red trfica del suelo, interactan con otros organismos
del suelo, es decir consumen y son alimento de otros (Snchez-Moreno, Ferris
2007). Son identificados en base a su morfologa debido a que se pueden observar
sus caractersticas por ser transparentes. Presentan una estrecha relacin
entre estructura y funcin, su hbito trfico puede ser estimado desde la
estructura bucal y esfago (Ritz, Trudgill 1999). La estructura de la comunidad
de nematodos ofrece un instrumento para evaluar cambios en la condicin del
111
suelo debido a que estos organismos responden rpidamente a nuevos recursos

y pueden ser analizados eficientemente (Bongers, Bongers 1998).
Existe una gran necesidad de asegurar que las prcticas de manejo del
suelo utilizadas, mejoren la calidad del suelo y mantengan un suelo saludable,
es decir un sistema estable con resiliencia al estrs, una alta diversidad biolgica
(Van Bruggen, Semenov 2000), una alta poblacin de organismos benficos y
una poblacin baja de plagas de los cultivos (Abawi, Widmer 2000).
La extensa literatura que existe sobre el estudio de los nematodos utilizados
como bioindicadores de las condiciones del suelo bajo diferentes cultivos (Power,
McSorley 1994), distintas prcticas agrcolas (Freckman, Ettema 1993, Porazinska
et al. 1999) aplicacin de plaguicidas (Pen-Mouratov, Steinberger 2005) y
herbicidas (Neher, Olson 1999), para distinguir los efectos de disturbios fsico y
qumicos de los suelos cultivados (Fiscus, Neher 2002) resalta el potencial que
tienen estos animales para reflejar distintas situaciones en un agrosistema.
Indices de la comunidad de nematodos

Los ndices ecolgicos son herramientas tiles que no solo proveen medidas
cuantitativas para caracterizar un ecosistema sino tambin para comparar diferentes
sistemas ecolgicos. En los ltimos aos hubo un desarrollo desde los ndices
biolgicos tradicionales a los ndices de madurez de nematodos y sus derivaciones.
Bongers (1990) propuso una escala c-p (colonizadores a persistentes) para todas las
familias de nematodos, resultando 5 grupos. El grupo c-p 1 conformado por familias
con ciclos de vida corto, alta fecundidad, tolerantes al disturbio como Rhabditidae,
Panagrolaimidae y Diplogasteridae y en el otro extremo el grupo c-p 5 que incluye
familias como Aporcelaimidae, Actinolaimidae, entre otras, que son ms sensibles
al disturbio, se caracterizan por ciclos de vida largos, baja fecundidad y generalmente
aparecen ms tarde en la sucesin (Bongers, Bongers 1998, Bongers, Ferris 1999). Los
taxa en el mismo grupo c-p responden de la misma manera al disturbio. Esta escala
se utiliza para el clculo del ndice de madurez (MI) que se basa en el principio de que
distintos taxa de nematodos (sin incluir a los nematodos fitfagos) presentan diferente
sensibilidad al estrs e indica la interrupcin de la secuencia de la sucesin a causa
de las diferencias en sus ciclos de vida (Bongers 1990). La sucesin puede ser
interrumpida por el agregado de fertilizantes, plaguicidas, la labranza (Wasilewska
1979, Neher, Olson 1999). El ndice de madurez se correlaciona negativamente con la
disponibilidad de nitrgeno y positivamente con la tasa de descomposicin de la
materia orgnica y adems refleja funciones importantes del ecosistema que
contribuyen a la sustentabilidad del mismo (Neher 1999, 2001).
El ndice de madurez MI puede disminuir por un aumento de nutrientes o por
contaminacin del suelo. Para diferenciar estas dos situaciones, es que se propuso
otro ndice (MI25) que no incluye a los nematodos con valor de c-p 1, que son los
que responden rpidamente al agregado de nutrientes al suelo. Este ndice MI25
registra cambios a largo plazo ya que los taxa que incluye (con valores de c-p de 2
112
a 5) son ms estables temporalmente y pueden proveer informacin a largo plazo

de las condiciones ambientales (Neher, Campbell 1994, Korthals et al. 1996).
El ndice de madurez PPI es comparable al ndice MI pero se calcula en
base a los nematodos fitfagos, el valor del ndice puede aumentar cuando se
produce un incremento en la produccin primaria, particularmente de races
(Bongers 1990). El ndice PPI puede o no correlacionarse positivamente con
el ndice de madurez de nematodos de vida libre (Bongers 1990, Freckman,
Ettema 1993, Neher, Campbell 1994). En condiciones de alta disponibilidad
de nutrientes, PPI tiende a ser ms alto y el ndice MI tiende a ser ms bajo,
de esta manera la relacin PPI/MI tiende a aumentar (Bongers et al. 1997).
Ferris et al. (2001) propusieron los ndices de enriquecimiento (EI) y de estructura
(SI) que proveen informacin adicional ya que reflejan la contribucin de
determinadas grupos funcionales de nematodos al enriquecimiento y estructura
de la red trfica del suelo. El ndice EI mide la abundancia de nematodos oportunistas
de enriquecimiento que resulta de la entrada de materia orgnica, labranza y otros
factores ambientales y el ndice SI sugiere la relacin trfica en una red indicada
por la presencia de nematodos de nivel trfico alto como son los depredadores y
omnvoros. La representacin grfica del perfil de la nematofauna que resulta de la
ubicacin de los valores de EI e SI provee un modelo de las condiciones de la red
trfica del suelo. Las redes trficas mas estructuradas y/o ms diversas, es decir
con valores de SI altos, se espera que sean ms estables y que contengan
probablemente organismos que pueden regular poblaciones de patgenos o
parsitos de plantas (Sanchez-Moreno, Ferris, 2007), debido a que habra ms
uniones en la red trfica, mas interacciones entre organismos, mayor redundancia
funcional y potencialmente mayor estabilidad funcional (Ferris et al. 2004). El
desarrollo de estos ndices represent un avance en la interpretacin de la relacin
entre la ecologa de la comunidad de nematodos y la funcin del suelo.
La interpretacin de los ndices requiere una referencia de una comunidad
relativamente no disturbada (Neher 1999) como son los sistemas de cultivos
perennes a medio y largo plazo (Neher, Campbell 1994). Adems, se debe tener
en cuenta las condiciones del ambiente ya que son importantes a la hora de
evaluar los ensambles de nematodos, como ser el tipo del suelo que se
correlaciona con distintas familias de nematodos (Yeates et al. 1997, Neher 1999).
Fertilizacin nitrogenada y su efecto sobre la comunidad de nematodos

Los fertilizantes orgnicos e inorgnicos son agregados al suelo para
aumentar la disponibilidad de nutrientes y la productividad del cultivo. En
un sistema sustentable, una mayor diversidad de la biota del suelo es
requerida para que los nutrientes sean captados en la biomasa y de esta
manera prevenir el lixiviado (Bongers, Bongers 1998).
La dinmica trfica y la estructura de la comunidad de nematodos han
sido estudiadas en distintos sistemas de manejo con fertilizantes sintticos
113
Tabla I.
114
Efecto de la fertilizacin nitrogenada sobre la comunidad de nematodos.
*Las comparaciones son realizadas con el tratamiento control excepto en ** la comparacin fue con tratamiento estircol
AT=Abundancia Total; B =Bacterifagos; F=Fungvoros; Fi=Fitfagos; O-P=Omnvoros-depredadores; IM=ndice de madurez calculado
con todas las familias de la comunidad de nematodos, MI = ndice de madurez de nematodos de vida libre, PPI = ndice de madurez
de nematodos fitoparsitos.
(Tabla I) y orgnicos (Porazinska, Coleman 1995, Neher 1999, Forge et al.

2003, Koenning, Barker 2004). Esta prctica agrcola conduce a cambios en
la estructura trfica y en la riqueza de especies de nematodos (Sarathchandra
et al. 2001, Bulluck et al. 2002), puede indirectamente y positivamente afectar
a los microorganismos y animales del suelo al aumentar el crecimiento vegetal
y estimular la exudacin radical que conduce a aumentar la entrada de
sustrato orgnico al suelo (Eo, Nakamoto 2007).
La fertilizacin tambin puede tener efectos adversos sobre la calidad del
suelo, se sabe que algunos taxa de nematodos se pierden con la fertilizacin
(Li et al. 2010), si bien la abundancia total permanece inalterada en un amplio
rango de usos del suelo, una fuerte presin ambiental selectiva acta sobre
varios taxa, indicando disminucin de la estabilidad del sistema como
resultado del manejo intensivo (Mulder et al. 2005).
Los cambios en la composicin de especies, estructura trfica y nmero
de nematodos de distintos gneros depende del tipo de fertilizante aplicado
(Ferris, Bongers 2006, Gruzdeva et al. 2007). Todd (1996) encontr que los
nematodos microbvoros (que se alimentan de bacterias y organismos
unicelulares eucariotas) aumentaron un 31% con la aplicacin de nitrato de
amonio. En otros estudios, los bacterifagos se incrementaron en respuesta
a un aumento en la dosis de fertilizante mineral en forma de NPK (60, 120 y
180 kg N ha-1 anual) y respondiendo de la misma manera con otros fertilizantes
que contenan nitrgeno (N, NK, NP y NK + NK) (Gruzdeva et al. 2007). Ferris et
al. (1998) encontr que la mineralizacin de nitrgeno en el suelo se
increment por la actividad de los nematodos bacterifagos y Wasilewska
(1998) al analizar las estrategias de vida de los taxa que componen esta
categora trfica observ que los bacterifagos c-p 1 declinaron con el
desarrollo del ecosistema mientras que la proporcin de grupos con valores
mayores de c-p aumentaron. Esta autora concluy que los nematodos
bacterifagos pueden ser empleados en la evolucin de las velocidades de
los procesos de descomposicin.
La respuesta de los nematodos bacterifagos fue mayor en sistemas de
manejo orgnico respecto a un sistema de manejo convencional (Ferris et al.
1996, Hu, Qi 2010). El aumento de los nematodos bacterifagos oportunistas
(c-p 1) est asociado con situaciones de enriquecimiento orgnico y
velocidades de descomposicin mayores que cuando se dan condiciones de
degradacin ambiental por lluvia cida donde disminuyen o desaparecen
los nematodos c-p 1 y 2, consecuencia de la tasa ms lenta de descomposicin
(Wasilewska, 1997). El grupo bacterifago c-p 2, considerados oportunistas
generalistas, se caracteriza por tener tasas menores de reproduccin que los
del grupo c-p 1 e incluye especies de la familia Cephalobidae, que se pueden
encontrar tanto en ambientes enriquecidos o en condiciones pobres de
alimento y adems son tolerantes a disturbios (Bongers, Bongers, 1998,
Bongers, 1999, Ferris et al. 2001). La recuperacin de un disturbio moderado,
115
como sera la fertilizacin, ya que no elimina la fauna del suelo, resulta en un

aumento de los nematodos bacterifagos oportunistas de enriquecimiento,
indicadores de la fertilidad del suelo (Ferris et al. 2001), de esta manera se
concluye que la dominancia de bacterifagos del los grupos c-p 1 o 2 depende
del estado nutricional y de la actividad microbiana en el sistema disturbado
(Bongers, Bongers 1998).
Respecto al comportamiento de la abundancia de los nematodos
fungvoros a la fertilizacin nitrogenada, Li et al. (2007) observaron un
aumento en este grupo con un incremento de fertilizacin en niveles de 112,5
a 225 kg N ha-1, aplicado durante la estacin de cultivo de trigo y en dosis
mayores (300 kg N ha-1) la poblacin tambin aument, en un sistema de
rotacin de soja, trigo y maz (Pan et al. 2010).
La abundancia de nematodos bacterifagos y fungvoros refleja la
disponibilidad actual o reciente de su alimento (Ferris, Matute 2003). Estos
nematodos al alimentarse de los descomponedores primarios de la materia
orgnica, aceleran la descomposicin y adems liberan nutrientes para el
crecimiento de las plantas (Freckman 1988, Ferris et al. 1996, Neher 2001).
Segn qu tipo de descomponedor predomine, las rutas de descomposicin
de la materia orgnica son descriptas como bacterianas o fngicas. La
fertilizacin con nitrgeno influye en las cadenas trficas basadas en los
detritos y puede inducir un ajuste desde los canales de energa basados en
hongos a bacterias (Bardgett, McAlister 1999). La relacin que se establece
entre la abundancia de nematodos fungvoros y bacterifagos indica qu
descomponedor se asocia con la ruta de descomposicin. Las cadenas trficas
en suelos agrcolas estn basadas ms en bacterias que en los hongos (Hendrix
et al. 1986), como lo indican varias experiencias (Freckman, Ettema 1993,
Neher, Campbell 1994).
La abundancia de nematodos fitfagos fue mayor en respuesta a la
fertilizacin con nitrato de amonio (Todd 1986) probablemente a una mayor
produccin de biomasa radical (Wang et al. 2006) y tambin aument en
respuesta a fertilizantes con K (Gruzdeva et al. 2007). Observaciones
realizadas por Rodriguez-Kabana (1986) sobre las propiedades nematicidas
del nitrgeno inorgnico indican que para ser efectivo debe ser aplicado a
tasas superiores a aquellas requeridas como fertilizantes y que las dosis
difieren de acuerdo a la especie de nematodo presente.
Los nematodos depredadores generalistas y especialistas son sensibles
al disturbio y a agregados qumicos (Korthals et al. 1996, Berkelmans et al.
2003, Tenuta, Ferris 2004), particularmente con la aplicacin de una dosis
alta de urea de 600 kg ha-1 (324 kg N ha-1), la poblacin de omnvoros
depredadores fue eliminada (Li et al. 2010) mientras que la fertilizacin
con nitrato de amonio, a una tasa de 100 kg ha-1 (33,5 kg N ha-1), disminuy
el porcentaje y abundancia de omnvoros (Wang et al. 2006). Tenuta, Ferris
(2004) encontraron que los nematodos del grupo c-p 4 y 5, donde estaran
116
incluidas las especies de estas categoras trficas, son ms sensibles a

soluciones con nitrgeno, por efectos osmticos y de cada in, que los
grupos con valores de c-p ms bajos, lo que sugiere que la aplicacin de
fertilizantes puede contribuir a la baja abundancia de estos nematodos en
sistemas de cultivo anual. Estos grupos funcionales, deberan ser
conservados ya que pueden tener un efecto regulatorio sobre los niveles
trficos ms bajo, incluyendo a los fitfagos y afectan la dinmica de
nutrientes al modificar la abundancia de los consumidores intermediarios
(Snchez-Moreno, Ferris 2007).
Experiencias en Argentina
En Balcarce, en un ensayo realizado en pasturas, Mondino (2001) report
que la fertilizacin con urea no afect al nmero total de nematodos ni la
abundancia de los distintos grupos trficos.
En el Alto Valle de Ro Negro, con historia frutcola de 70 aos y sustentada
en suelos con bajo contenido de materia orgnica, la fertilizacin nitrogenada
ha sido empleada con variada intensidad dependiendo de las condiciones
econmicas del sector. Anualmente se aplican entre 100 a 200 kg ha-1 de
nitrgeno, cifras consideradas elevadas para frutales de pepita que tienen
menores requerimientos (Weinbaum et al. 1992). En un ensayo en la zona, en
Malus domestica, con sistema de riego mecanizado con microaspersores y
malezas controladas con glifosato, la fertilizacin nitrogenada ocasion
cambios en algunos grupos trficos (bacterifagos y fungvoros), familias
(Rhabditidae) y gneros de nematodos. La abundancia de nematodos
bacterifagos aument con la aplicacin de nitrato de amonio en dosis de
150 y 75 kg N ha-1, y con la ltima dosis el aumento fue temporal. El ndice de
madurez MI se correlacion negativamente con el contenido de nitrato en el
suelo y la relacin PPI/MI fue afectada con la mayor dosis de nitrgeno
(Azpilicueta et al. 2008).
En otra experiencia, en la misma zona, en dos huertos comerciales de
Pyrus communis (H1 y H2), con agregado de guano y fertilizantes
inorgnicos, los resultados obtenidos del grfico que surge de la relacin
entre los ndices EI y SI (Fig. 2), la mayora de los valores se ubicaron en el
cuadrante B y revelaron que las redes trficas estaban moderadamente
enriquecidas, relativamente estructuradas y estables (Azpilicueta et al.
2010). En el huerto H1, el ndice de estructura SI fue consistentemente ms
alto que en el huerto H2 indicando que las redes trficas ms complejas
pueden coexistir con los nematodos oportunistas de enriquecimiento y
que la presencia de nematodos de niveles trficos ms altos, como
omnvoros y carnvoros, pueden sobrevivir en suelos enriquecidos
(Snchez-Moreno et al. 2006).
117
Figura 2: Relacin entre los ndices de enriquecimiento (EI) y estructura

(SI) en los huertos H1 y H2 en la temporada 2008-2009.
Conclusiones
La mayora de los nematodos del suelo aportan una serie de servicios
fundamentales para el sustento de los sistemas agrcolas que contribuyen a
mejorar la productividad del cultivo. En los agrosistemas se utilizan
fertilizantes nitrogenados en cantidades muchas veces excesivas y se ha
demostrado que los fertilizantes impactan en mayor o menor medida en la
diversidad y en la estructura de la comunidad de nematodos en el suelo,
dependiendo de la dosis y tipo de fertilizante. Es preciso que la informacin
generada por las investigaciones sobre los patrones de comportamiento de
la abundancia de los nematodos en repuesta a los fertilizantes, sea
incorporada e implementada en futuros programas de manejo de suelo. Con
esta informacin disponible se debera optimizar el uso de los fertilizantes
tratando de agregar la cantidad necesaria para el cultivo en el momento que
la planta realmente lo necesite, con el fin de evitar prdidas del mismo y
ocasionar efectos negativos en la comunidad de nematodos.
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122
Captulo 7
Perfil Fisiolgico de Comunidades de
Suelo Basado en el Consumo de Oxgeno
Community-Level Physiological Profiling of Soil
Communities Based on Oxygen Consumption
Jay L. Garland1, M. Celina Zabaloy2
1
Dynamac Corporation, Mail Code DYN-3 Kennedy Space Center, Fla. 32899, USA. 2Center of
Renewable Resources of Semiarid Region, National Council for Scientific and Technological
Research (CERZOS-CONICET), San Andrs 800, Baha Blanca (8000), Argentina.
Introduction
Characterization and classification of heterotrophic microbial communities
based on rapid assessment of multiple sole carbon sources use, an approach
termed community-level physiological profiling (CLPP) by Lehman et al. (1995),
was developed over 10 years ago (Garland, Mills 1991). The approach commonly
utilizes microtiter plates from Biolog, Inc. in which respiration of 95 separate
sole carbon sources is detected by the reduction of a redox sensitive dye (Bochner,
Savageau 1977, Bochner 1989). The multivariate profile of carbon source use is
a proven tool for rapid assessment of community dynamics in response to
spatial, temporal, or experimental gradients (Garland 1997, Mills, Garland
2001). More recent work has employed the rate of extinction in community
phenotypic characters with dilution as an estimate of relative structural diversity
(Garland, Lehman 1999). While a valuable method for assessing relative change
in microbial communities when properly applied, significant limitations of the
approach are well known (Konopka et al. 1998). In particular, the kinetics of
dye reduction is not a clear indicator of in situ carbon source utilization. The
discrepancy between CLPP response and function may result from the selective
enrichment of the community at the high substrate concentration (i.e., > 100
mM) necessary to achieve tetrazolium reduction in the Biolog plates during the
typical 1-4 day incubation (Smalla et al. 1998; Winding, Hendrickson 1997).
Development of a more functionally relevant CLPP will depend on the
application of new technologies for detection of physiological processes. An
improved detection system would involve lower substrate concentrations and
shorter incubations to minimize bias due to growth and selective enrichment.
In addition, the use of undefined, proprietary reagents should be minimized so
that incubation conditions can be defined and manipulated. The significant
123
effect that changes in the media formulation between GN2 and GN plates from
Biolog Inc. had on CLPP illustrates the need for a defined chemical environment
(OConnell, Garland 2002). Assessment of respiration should involve direct
measurement of substrates (i.e., O2) or products (CO2) rather than indirect
indicators such as tetrazolium dye. A multivariate approach to carbon source
use based on CO2 monitoring has been developed (Degens et al. 2001). While
this approach limits incubation time and the use of unknown reagents, substrate
concentrations are relatively high (i.e, 10-100 mM). 14C-respirometric
approaches allow for testing of environmentally relevant substrate
concentrations, but even simplified assay systems (Reid et al. 2001) still have
the expense associated with disposal of radioactive wastes.
Since the CLPP approach typically involves uniform mixing of various
substrates with the sample, aqueous suspensions (either direct samples of
liquid environments or slurries of solid samples) are tested. Detection of
dissolved O2 (DO) in the test medium may allow for improved sensitivity (i.e.,
testing of lower substrate concentrations) given the low solubility of O2 in
water. Recently, a fluorescence-based, microplate platform has been
developed for assessing DO (Wodnicka et al. 2000), and the objective of the
current work is to review the work completed to date with this approach, with
specific emphasis on soil analyses.
General methodology
BD Microplates
The BD Oxygen Biosensor System (BD Biosciences, Bedford. MA) used in
these studies consists of a 96 well (300 l volume) microtiter plate containing
an O2-sensitive fluorophore, 4,7-diphenyl-1,10-phenathroline ruthenium (II)
chloride, adsorbed onto an O2 permeable silicone matrix in the bottom of
each well. The fluorescence of the ruthenium dye is quenched by the presence
of O2, so the signal from the fluorophore-gel complex loaded on the bottom
of the microplate wells increases in response to respiration in the overlying
sample.
Plates are read continuously (every 15 to 30 min) on a microplate
flourometer at 485 nm excitation and 604 nm emission using the bottom
reading mode, with controlled incubation temperature, given that the
fluorescence is affected by temperature.
Plate inoculation
Previous work (Zabaloy et al. 2008) has shown that the sensitivity of the
assay to detect a response to low levels of substrate can be greatly increased
by increasing the volume of liquid loaded in the wells from 150 to 240 l.
Subsequent experimental work has been conducted using the optimized
124
Perfil Fisiolgico de Comunidades de Suelo Basado en el Consumo de Oxgeno
protocol published by Zabaloy et al. (2008) (Figure 1). Briefly, the 96-well
plate is loaded with the assay substrates to give a final concentration of 50
mg l-1 , taking into account the volume of soil slurry and any other reagent
solution to be loaded in the well (e.g., N, P, or antibiotic), and a final volume
of 240 l. Nitrogen at a rate of 10 mg l-1 has been shown to give an optimum
response. To achieve the desired final concentrations, appropriate stock
solutions must be prepared and filter-sterilized (< 0.2 m). For example, if the
desired final concentration of C source is 50 mg l-1 and that for N is 10 mg l-1
, and the soil slurry will be added in 80 l, then one could prepare stocks of
150 mg l-1 C source and 30 mg l-1 N, loading 80 l of each one. A thick soil
slurry that still allows pipetting is prepared. As a rule of thumb, mineral soils
can be suspended in less water (thicker slurries) than organic soils. In general,
10 g mineral soil (or 5 g of organic soil) is suspended in 25 ml of filter-
sterilized distilled water in a 50 ml centrifuge tube containing glass beads (2
mm ) and shaken for 1 min by hand to disrupt soil aggregates and homogenize
the slurry. The soil slurry is inoculated in the plate (typically, 80 to 160 l)
immediately prior to plate incubation and reading.
Figure 1: Overview of the BDOBS approach for soil community level

physiological profiling.
125
Data analysis
Fluorescence increases following a lag period ranging from a few minutes
to many hours as the inoculated community consumes O2 (Figure 1). To simplify
interpretation, fluorescent data are converted to normalized relative
fluorescent units (NRFU) by dividing each time reading by the time=1 h
response (to account for temperature stabilization in the platform).
Fluorescence reaches a peak at low substrate concentrations (<100 ppm), but
may be maintained at saturating levels (typically 8-9 NRFU) when high substrate
levels (e.g., 500 ppm) are used. Since low substrates amendments minimize
enrichment effects (see below), a peak in fluorescence is the preferred
response profile. Given the reversible nature of the quenching reaction,
fluorescence begins to decline when O2 diffusion into the gel layer equals the
diminishing rate of respiration rate as substrate is depleted. The rate of O2
diffusion into the gel layer appears to be strongly influenced by settling of the
soil suspension on top of the gel layer. Shaking the plates, even when sealed
with gas impermeable film to prevent O2 diffusion from the atmosphere air,
greatly reduces the fluorescent response (Garland and Zabaloy, unpublished
data). These result suggests that O2 dissolved in the overlying sample can not
readily diffuse into the gel under static conditions, most likely due to the settled
soil layer.
Various parameters may be used to characterize and compare the
response profiles, but the 3 most commonly used to date have been minimum
response time, peak height, and the integrated response, or area. The
minimum response time is defined as the amount of time necessary for a
10% increase in NRFU (i.e., threshold response of 1.1 NRFU) given that
formalin killed control never exceed 1.1 NRFU. The lag in response should
be related to the amount of active biomass able to utilize a given substrate
(see below for further detail). The peak in response corresponds to the
minimal level of O2 in the gel layer during incubation, and should reflect the
rate at which the O2 is consumed. The rate of O2 consumption can be affected
by the same factors affecting lag (i.e., the number and activity of organisms
present in the sample that can utilize the substrate). In addition, the peak
will be influenced by the degree of selected enrichment during the lag phase.
Finally, the degree to which the substrate is respired versus assimilated will
affect the peak response since samples with more cell growth should have
lower O2 consumption. Further work is needed to evaluate the influence of
these various factors on the peak height. The area under the curve can
provide an integrated measure of both the lag and the peak height, but
effective comparison amongst samples requires selection of an appropriate
incubation time. For example, sufficient time is needed to ensure that
responses are observable, but long incubation time will minimize differences
if responses have peak and declined to baseline level. Ideally, area values
should be compared when the fastest responding wells have just reached
their peak.
126
Functional relevance of the assay

The first published work that used BDOBS microplates for microbial
community analysis was by Garland et al. (2003), who reported that CLPP could
be performed with the O2-based system using substrate concentrations as low
as 50100 mg l -1 ,which represent 10100 times less than used in CLPP
approaches based on either Biolog or CO2 monitoring. Quantifiable responses
were obtained in as little as several hours when samples of relatively low cell
densities (i.e., 105-106 ml-1) were exposed to substrate concentrations as low as
50 ppm (Figure 2). The rate of fluorescent response was correlated with
independent measures of in situ rates of substrate use, indicating that, unlike
the Biolog-CLPP, the BDOBS-CLPP approach produced functionally relevant
proles. Specifically, rhizosphere samples from a hydroponic plant system
exposed to known concentrations of either of two different types of surfactants,
sodium laureth sulfate or cocoamidopropyl betaine, showed a faster response
in the BDOBS. The inverse relationship between the lag in response and
independent measures of the rate of substrate surfactant utilization by the intact
rhizosphere communities suggest that this is a viable approach for rapid
assessment of relative rates of substrate utilization among microbial
communities. The reduced incubation times and lower substrate concentrations
appear to result in a CLPP more indicative of the physiological activity, rather
than phenotypic potential, of the community. Recent work (Garland, Zabaloy,
unpublished data) found that the amount of cell growth in wells is minimal,
particularly for samples showing peak responses within 6-10 h, further
demonstrating that selective enrichment is minimal. Phenotypic and genotypic
characterization of the overall community, and its active fraction, is necessary
to address fundamental questions in microbial ecology related to the relationship
between community structure and function. Linking BDOBS with community-
level genotypic analysis targeting both the total (Amann et al. 1995, Pace 1997,
Smalla et al. 2001) and active (Borneman 1999, Yin et al. 2000) cells may help
provide fundamental insight into structural/functional dynamics.
Figure 2: Response of
rhizosphere communities in
the BDOBS plates containing
50 ppm of either A) sodium
laureth sulfate, SLESA, or B)
cocoamidopropyl betaine,
CAPD. Samples obtained from
hydroponic systems exposed to
neither substrate (control
system) or each individually
(SLES or CAPB systems).
127
This work also demonstrated that inoculum density consistently affected

the rate of response (i.e., minimum response time, lag, time to peak), and also
affected the degree of response in some cases, indicating that it can be a
confounding factor when comparing substrate utilization among samples.
This effect may be of limited concern in studies interested in comparing
responses per unit habitat (i.e., ml-1, g dry wt-1, etc.), but will need to be
addressed when density-independent changes in community response are
sought.
Review of work with soils

The suitability of the BDOBS approach for soil microbial physiological
profiling was first addressed by Visnen et al. (2005). Different size classes of
water stable aggregates were amended with low levels of C sources (100 mg l-1;
chitin, xylan, -cellulose, potato starch, L-asparagine, D(+) mannose, casamino
acid, sucrose, D-(+) xylose, sodium acetate and tryptic soya broth) in the wells.
All substrates induced detectable O2 consumption (peak in fluorescence) within
24 h. The communities associated with macroaggregates exhibited faster
response (time to peak) to C sources such as asparagine, cellulose, chitin,
mannose, sucrose, xylan and xylose compared to microaggregates. This work
verified that fungi responded in the assay, since addition of cycloheximide
reduced the rate of respiration of cellulose, chitin, mannose, xylan and xylose.
Response to asparagine and sucrose were less effected by cycloheximide
addition, suggesting that these substrates were preferentially used by bacteria.
Several methodological issues with the assay for soil testing were
investigated and optimized by Zabaloy et al. (2008), including the minimal
level of C supplementation that yielded a detectable response, the effect of
soil aggregate disruption, storage, N availability on C use, and selective
inhibition of fungi were explored in that work. Results showed that although
levels of substrates as low as 10 mg l-1 gave a fluorescent signal, 50 mg l-1 was
recommendable to distinguish the substrate-induced respiration from the
endogenous C response. Soil incubated in the field within micro-bags and
stored at 4 C for 0, 11 and 33 days, were either disrupted prior to plate
inoculation or incubated intact within the bags. The maximum fluorescent
response was not significantly changed by soil:water mixing and storage
(<33 days), thus indicating that creating the soil slurry has minimal impact
on the response. The addition of the fungal inhibitor cycloheximide in the
plate increased the lag in response (time to minimum response) of several
substrates (casein, asparagine, coumaric acid, acetate), but the extent of
inhibition was not related to the fungal to bacterial biomass ratios in the
soils. Still, the use of BDOBS coupled to the selective-inhibition method may
allow for discrimination of relative utilization of substrates by the fungal
communities, although it is not recommended for the estimation of overall
fungal activity/biomass in the samples.
128
Figure 3: Correlation of N diff (see explanation in the text) to extractable

soil NH 4+-N in field samples from a rye-corn rotation. Responses
presented for different (50 mg l -1 ) carbon amendments to the wells
(Panels A-E) and no carbon addition (Panel F).
Garland et al. (2002) was the first to demonstrate that N addition to the
wells could increase community response, suggesting that the assay could be
used to assess N limitation of microbial activity. Zabaloy et al. (2008) showed
that fertilization of soil microcosms altered the impact of N addition to the
wells. Unfertilized microcosms showed higher fluorescent peaks with N
addition (compared to without N) at all sampling times while soils from the
fertilized microcosms did not respond to N at the early time point (1 day) but
appeared N limited 5 days after fertilization.
Nutrient limitation of microbial activity in soil has practical consequences
on soil fertility and crop yields, for N is most likely immobilized in the microbial
biomass with amendments with high C:N contents. Garland et al. (2010)
compared the microbial activity between corn (Zea mays L.) and rye (Secale
cereale L.) rotations receiving no organic amendment (all fertilizer from
inorganic sources) versus additions of biosolids or dairy waste solid organic
amendments. They studied microbial respiration with a range of substrates
with and without N addition in the plate, along the crops cycle, in relation
with fertilization timing. This work further showed that Ndiff (i.e., the difference
129
in peak height for a given C source with 10 mg l-1 N source and without N) is an
indication of N limitation on microbial respiration. Ndiff was considerably higher
in all treatments during the rye crop when soil inorganic N was very low (< 10
mg l-1), with the dairy solid treatment showing the highest N limitation. In
contrast, N diff was low along all treatments during the corn crop when
extractable inorganic N was high (Figure 3). The crop yield results showed
good agreement with the N limitation estimate through Ndiff , with lower mid-
season biomass production for rye with dairy solids fertilization and no effect
of organic amendments on corn production. Work is being conducted to
understand the extent and duration of N limitation in soils following different
levels of N fertilization in the field, and the relationship between N limitation
and growth under the assay conditions (Garland et al., in preparation).
Brown et al. (2009) used the BDOBS approach to analyze physiological
responses of bulk soil, rhizosphere and litter microbial communities in a
nutrient-limited scrub-oak forest soil, exposed to varied experimental
conditions (N and/or P additions vs. no nutrients; complex, natural substrates
and glucose, vs. no C). All the communities appeared mainly N-limited with a
secondary P limitation, as observed by the complete lack of response to glucose
in the absence of these nutrients. That effect was greater in bulk and
rhizosphere soils, while the litter community might have less of a P limitation
given that the background C+ N and glucose+N showed significant respiration.
The litter community also showed substrate-specific adaptation, with greater
use of litter extracts as C source. This is a clear demonstration of the ecological
relevance of the assay, which reflects in situ use of substrates by microbial
communities. Moreover, this study showed that factors limiting microbial
respiration in the field can be assessed with this approach, given the flexibility
to add macro and micronutrients in the incubation media.
Overall, the above results showed that the BDOBS approach allows for
rapid and multivariate physiological profiling of soil microbial communities,
as well as the evaluation of their integrated use of C, N and P.
Effects of pesticides and other potential toxicants

Monitoring the fate and effects of pesticides and other xenobiotics in
environmental samples for ecotoxicological risk assessment is often time-
consuming and labor intensive, involving techniques ranging from analytical
chemistry to physiological studies with single species or communities. BDOBS-
CLPP has been used a rapid means of both defining biodegradation pathways
and assessing the potential impacts of toxicants on whole communities.
Sharvelle et al. (2008) used the BDOBS approach to elucidate the dominant
biodegradation pathway of an anionic surfactant used in detergents,
polyalcohol ethoxylate (PAE). They observed that PAE-adapted microbial
consortium, present in a sludge taken from municipal wastewater treatment
130
plant, showed a faster O2 uptake and greater response to the surfactant and
its metabolites as compared to an unexposed, control consortium. The BDOBS
results suggested that the hydrophobe-hydrophile pathway was the prevalent
metabolic route in this microbial community. At the same time, it allowed the
identification of several metabolites, such as ethylene glycol and diethylene
glycol, that were relatively recalcitrant and may be of environmental concern.
More recent work by Zabaloy et al. (2010) used the BDOBS to examine
aerobic degradation of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)
in soil microcosms treated with an environmentally-relevant level (ERL, 5 mg
kg-1 soil) and high level (HL, 50 mg kg-1 soil) of 2,4-D after 3 and 14 days of
incubation. Use of 2,4-D as a sole source of C and energy (50 mg l-1) was initially
retarded (> 40 h at day 3) and was maximal 2 weeks after treatment (Figure
4). They argued that a shift in the dominant degrader populations may have
occurred between days 3 and 14 in the HL, as opposed to the ERL microcosms,
and the increase in use of 2,4-D reflected the activity of specific degraders
that were favored by the high dose.
Figure 4: Time course of the fluorescent response of soils in the BDOBS

to 2,4-D as sole source of C. Plots represents data for microcosms
exposed to 5 or 50 mg 2,-4-D kg-1 soil for 14 days.
It has been postulated that long-term exposure of a community to a given

toxicant will lead to a higher tolerance for this pollutant, a concept known as
pollution-induced community tolerance (PICT) (Blanck 2002). Increased
community tolerance resulting from the elimination of sensitive species and
addition of tolerant species is considered strong evidence that changes were
caused by the pollutant. A fundamental step in the PICT measurements is the
selection of an ecologically relevant parameter as endpoint that reflects the
toxic effects at the community level (Blanck 2002). Zabaloy et al. (2010) adapted
131
the BDOBS as a means of assessing PICT of the soil microbial community to

2,4D. Coumaric acid mineralization by an agricultural soil and a pristine forest
soil were assessed in the BDOBS plate with increasing concentrations of
herbicide (0,5, 50, 125 and 250mg l 1) in the wells (Figure 4). Coumaric acid is
a lignin-derived phenolic compound, and its metabolism by soil microbes may
have important implications in soil C cycling (Yanni et al. 2010). Coumaric acid
use by the agricultural soil remained constant across all of the herbicide levels,
indicating the 2,4-D tolerant community existed even though 2,4-D exposures
had ceased 2 years before sampling. In contrast, increasing concentrations of
2,4-D in the plate significantly decreased coumaric acid use in the forest soil
that had never been directly exposed to 2,4-D. The BDOBS PICT approach
proved to be a useful tool to distinguish an herbicide-exposed soil from an
unpolluted one.
Figure 5: Pollution induced community tolerance (PICT) response (see

text for details) of agricultural soils exposed to 0 or 5 mg kg -1 2,4-D and
a pristine forest soil to 2,4-D. Graph shows the integrated response to
50 mg l-1 coumaric acid within wells of the BDOBS containing increasing
concentrations of 2,4-D.
Glyphosate is a non-selective herbicide that blocks the synthesis of aromatic

amino acids in plants and non-target sensitive microbes. Zabaloy et al. (in
preparation) used BDOBS as a CLPP tool to examine herbicide-derived shifts in
functional diversity and to assess potential mineralization of glyphosate in soil.
Soils from the Pampa region in Argentina (DOR and ZAV11) were collected from
fields with long-term use of the herbicide (> 11 year), and a natural site [ZAV0].
Microcosms were treated with glyphosate at rates of 15 and 150 mg kg-1 soil,
incubated for 1 week, and then sampled for carbon sources utilization using the
BDOBS plates. In the DOR microcosms, coumaric acid utilization showed a reduction
in peak height with the high dose of glyphosate. ZAV0 and ZAV11 differed in their
132
carbon utilization pattern, probably reflecting differences in long-term land

management, such as glyphosate use, vegetation cover, and tillage. Interestingly,
ZAV0 exhibited greater use of N-containing substrates (phenylalanine, sarcosine,
and glyphosate) which suggests larger N limitation as compared to the agricultural
site (ZAV11). Acute effects of the herbicide were not noticeable in the ZAV11
microcosms, probably because only the low rate was tested. Comparison of the
fluorescence response curve between wells without C amendment other than
glyphosate as a C+N source showed no adaptation for glyphosate use as was
detected in soils with previous history of herbicide use (DOR, ZAV11). However,
the unexposed (ZAV0) soil showed a relatively high respiratory response with
glyphosate as substrate which was probably related to N limitation in this soil (see
above), and not to higher general microbial activity (as background C was used to
the same extent than in the ZAV11 soil).
Conclusions
The BDOBS offers many advantages for physiological testing of microbial
communities. The location of the gel layer on the bottom of the wells allows
for visibly turbid (e.g. heavy soil suspensions) materials to be assayed with
bottom-reading plate readers, eliminating the need for cell extraction steps.
Detection of dissolved O2 (DO) rather than redox dye reduction improves the
sensitivity of CLPP, allowing for more rapid assessment (i.e., several hours
versus 1-4 days) of community respiration either without amendment or with
addition of low levels of substrates (i.e., 1 mM g-1 soil vs. 10-100 mM typically
used in substrate-induced respiration assays). Finally, conditions can be fully
defined and readily manipulated within the assay due to lack of ancillary
proprietary ingredients or physicochemical restrictions on the fluorophore
response. This flexibility allows for testing of the factors which may be limiting
microbial activity, such as the availability of nutrients or the presence of
potential toxicants. The ability to rapidly assess the physiological profile of a
soil microbial community was one of the original intents of the CLPP approach,
but the selective enrichment bias of the original plates severely limited the
ability to interpret such responses. Results to date suggests that the new
platform for the assay may allow for greater realization of the original intent,
providing ecological insight into how soil microbial communities are poised to
process various forms of carbon.
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Captulo 8
Bacterias solubilizadoras de fsforo
como biofertilizantes: aislamiento,
caracterizacin, diversidad y promocin
del crecimiento vegetal
Phosphate solubilizing bacteria as biofertilizers: isolation,
characterization, diversity and growth vegetable
promotion
Leticia A. Fernndez1, Marcelo A. Sagardoy2
1
Departamento de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur, San Andrs 800 Altos del
Palihue (8000) Baha Blanca. 2 Departamento de Agronoma de la Universidad Nacional del
Sur, San Andrs 800 Altos del Palihue (8000) Baha Blanca.
Introduccin
La rizosfera provee un microambiente complejo y dinmico, donde los
organismos forman una comunidad nica y de considerable potencial para
su estudio y aplicacin tecnolgica. El conocimiento integral de la misma,
es fundamental para la comprensin de distintos aspectos que se consideran
pilares de la sustentabilidad agrcola y ambiental (Garca de Salamone,
Cassn 2010). El proceso de solubilizacin de fsforo se presenta como
uno de esos aspectos relevantes.
La habilidad de algunos microorganismos para convertir formas de fsforo
insolubles de tal manera que se vuelvan accesibles por las races de las plantas
y/o cultivos, es una propiedad importante del suelo y de la rizosfera. Esta
capacidad es conocida como solubilizacin de fsforo y el nmero de bacterias
con este potencial es mayor en la rizosfera que en el suelo propiamente dicho
(Nobandegani 2008). Numerosos estudios han demostrado que este proceso
aumenta la fertilidad del suelo proveyendo de fsforo disponible extra para
las plantas y/o cultivos de inters agronmico, adems de que tiene efectos
importantes sobre otros nutrientes en el suelo, como por ejemplo el nitrgeno
en la fijacin biolgica de nitrgeno (Rodrguez, Fraga 1999).
El objetivo de este captulo es hacer una revisin que abarque los trabajos
ms actuales de una temtica tan relevante como es el proceso de solubilizacin
de fsforo inorgnico. De manera tal que, se comenzar con el ciclo de este
137
nutriente en el suelo, seguido de una profunda descripcin de las bacterias

solubilizadoras, su aislamiento, caracterizacin y una consideracin de los
mecanismos que les permiten la solubilizacin. Posteriormente, se explicarn
las actividades de las PGPRs en el suelo y su potencial utilizacin como
biofertilizantes para una agricultura sustentable. Cabe destacar, que en el captulo
se incluirn referencias sobre las distintas presentaciones realizadas durante
el Taller Internacional de Rizosfera Biodiversidad y Agricultura Sustentable.
Disponibilidad de fsforo en el suelo

El fsforo (P) es uno de los elementos ms importantes en la produccin
agrcola, ya que despus del nitrgeno, es el nutriente inorgnico ms
requerido por plantas y microorganismos y adems, es el factor limitante del
desarrollo vegetal a pesar de ser abundante en el suelo tanto en formas
inorgnicas como orgnicas (Alexander 1980).
El ciclo del P en los suelos representa slo una parte del que cumple en la
naturaleza (Figura 1). Las formas de P, con sus estados de oxidacin de -3 a +5,
son P soluble e insoluble. El P inorgnico soluble es la forma disponible para
los vegetales, ya que estos absorben los aniones ortofosfato
(predominantemente las formas inicas, H2PO4- y HPO4-2) desde la solucin del
suelo donde se encuentran a razn de 0,03 ppm y cuando un suelo es fertilizado
esta concentracin puede ascender a 3 ppm. Los aniones ortofosfato son
rpidamente consumidos en las inmediaciones de las races, lo que generara
gradientes de concentracin entre el suelo, la rizosfera y las superficies de las
races. Sin embargo, para la mayora de los suelos la tasa de difusin de estos
aniones es insuficiente para generar gradientes localizados, lo cual limita la
absorcin de este nutriente (Richardson et al. 2009).
Figura 1: Ciclo del fsforo en la naturaleza (Atlas, Bartha 2002)
138
Bacterias solubilizadoras de fsforo como biofertilizantes: aislamiento, caracterizacin, diversidad y promocin
El P insoluble se divide en la fraccin orgnica (Po) e inorgnica (Nahas

1991). Esta ltima, es la fraccin involucrada en el proceso de solubilizacin,
donde el fsforo insoluble inorgnico (Pi) se encuentra en el suelo como
aniones de fosfato que son adsorbidos a los constituyentes del suelo. Las
mayores reservas de Pi son las rocas y otros depsitos minerales, tales como
apatita, hidroxiapatita y oxiapatita. Gran parte de los suelos agrcolas contienen
importantes reservas de Pi, que se han ido incrementando debido a la
aplicacin de fertilizantes qumicos (Rodrguez, Fraga 1999).
Los microorganismos y la disponibilidad de fsforo

Como habitantes de la rizosfera y del suelo, las bacterias y los hongos participan
de una manera fundamental en la disponibilidad de P a las plantas. En la mayor
parte de las transformaciones que ocurren en el ciclo del P, los microorganismos
median las reacciones de transferencia de Po a Pi y de formas fosfatadas insolubles
e inmovilizadas a formas solubles o compuestos mviles (Figura 2) (Richardson
2001, Richardson et al. 2009). Una de las principales transformaciones que
producen es la inmovilizacin de P. Este proceso ocurre cuando los
microorganismos hacen inaccesible el P para el resto de la comunidad biolgica
ya que lo asimilan para integrarlo a su biomasa. Las otras dos transformaciones
son la mineralizacin de Po y la solubilizacin de Pi (Nahas 1991).
Los microorganismos solubilizadores de fsforo (PSM), son aquellos capaces
de transformar P inorgnico insoluble en ortofosfato soluble, en una manera
que contribuye significativamente al estado nutricional de una planta especfica
(Golstein, Krihnaraj 2007). Segn Illmer y Schinner (1992), la solubilizacin
por los microorganismos del suelo, objeto de esta revisin, es una alternativa
fundamental para incrementar la cantidad de P disponible para las plantas.
Figura 2: Representacin esquemtica de los procesos fisiolgicos y

qumicos que influencian la disponibilidad de P en el suelo y en la
rizosfera (Richardson 2001)
139
Solubilizacin de fsforo inorgnico: aislamiento y caracterizacin

de bacterias solubilizadoras
En el laboratorio, las bacterias solubilizadoras, crecen en medios con
fosfato triclcico, apatita o materiales insolubles similares como nica fuente
de fosfato y no solo asimilan el elemento sino que solubilizan una gran
proporcin del mismo, liberndolo en cantidades superiores a sus demandas
nutricionales (Alexander 1980).
El nmero de microorganismos solubilizadores puede constituir hasta un
40% de la poblacin cultivable (Richardson 2001). Si bien parecera que la
capacidad de solubilizacin est ampliamente extendida entre las bacterias,
la descripcin de organismos con esta capacidad se restringe a unos pocos
gneros (Kmpfer 2007). Entre ellos se han aislado de distintos suelos bacterias
solubilizadoras de fosfato (BSP) pertenecientes a los gneros Pseudomonas,
Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Burkholderia, Achromobacter, Microccocus,
Aerobacter, Flavobacterium y Erwinia (Nahas 1996; Kumar et al. 2001).
Existen diferentes mtodos para aislar del suelo microorganismos
solubilizadores de Pi, que presentan sus ventajas y desventajas. Si bien se ha
demostrado que la seleccin a partir de la formacin del halo de solubilizacin
no es una tcnica infalible (Nautiyal 1999), tampoco la concentracin de P
detectada en cultivo lquido lo es (Rodrguez, Fraga, 1999). Gyaneshwar et al.
(1998) demostraron que algunos microorganismos que solubilizan P en
condiciones de laboratorio no son capaces de hacerlo en suelos vertisoles
alcalinos. Esta incapacidad se debe posiblemente al alto poder de resistencia
a los cambios de pH de los suelos alcalinos junto con la baja secrecin de
cidos orgnicos que producen los microorganismos en esos ambientes.
Gyaneshwar et al. (2002) determinaron que es mejor adoptar tcnicas de
seleccin de cepas a partir de ensayos que reflejen la capacidad
amortiguadora de pH del suelo y por lo tanto seran vlidos slo aquellos
mtodos que incorporen soluciones tamponadas a los medios de cultivo. De
todas maneras, slo los ensayos de campo, establecern si la capacidad
solubilizadora de Pi de los organismos seleccionados in vitro realmente tiene
efecto sobre plantas de inters comercial.
Son numerosos los grupos de investigadores y los trabajos que describen
y resaltan la importancia de la solubilizacin de P, dedicndose
principalmente al aislamiento, caracterizacin y estudio de las capacidades
de solubilizacin en bacterias. Por ejemplo, en las proximidades de Aligarh
(India) fueron identificadas a nivel de gnero, 72 bacterias aisladas de suelos
rizosfricos y de ndulos radiculares. Los aislamientos fueron investigados
en su capacidad para promover el desarrollo de plantas a travs de la
produccin de IAA, amoniaco, HCN, siderforos, solubilizacin de fosfatos y
de su actividad antifngica. Entre las bacterias identificadas, el 80% perteneca
al gnero Bacillus y tena capacidad para solubilizar fosfato, seguido por
Azotobacter (74,47%), Pseudomonas (55,56%) y Mesorhizobium (16,67%) (Farah
140
et al. 2008). Por su parte, Taurian et al. (2009) seleccionaron 37 aislamientos

epifticos y 73 endofticos de plantas de man (Arachis hypogea L) por su
capacidad de solubilizar P en placa utilizando el medio NBRIP. Adems,
estudiaron la produccin de siderforos, de IAA, la inhibicin de dos
patgenos fngicos de man, Sclerotinia minor y S. sclerotiorum y la promocin
del crecimiento en man trabajando con condiciones controladas. Los
resultados demostraron que 85 de los 110 aislamientos formaban un halo
naranja, indicativo de la produccin de siderforos. Asimismo, nueve
bacterias mostraron produccin de IAA y otros 11 aislamientos posean
propiedades antibiticas contra los patgenos previamente mencionados.
Estos investigadores identificaron el mejor aislamiento como Pantoea
agglomerans. Por su parte, el trabajo de Malboobi et al. (2009) identific los
mejores aislamientos obtenidos de suelos alcalinos cultivados y no cultivados
de Irn trabajando con la cuantificacin de P soluble en el medio de Sperber.
Pantoea agglomerans, Microbacterium laevaniformans y Pseudomonas putida
solubilizaron entre 120 y 150 g-1mL-1 de P soluble. Los resultados previamente
descriptos son comparables a los obtenidos por Fernndez et al. (2005)
trabajando con las cepas Per2F del gnero Burkholderia y la Per3G de
Enterobacter aisladas de suelos cultivados con soja de Argentina. Estos autores
cuantificaron entre 112 y 206 g-1mL-1 de P soluble, trabajando con soluciones
tamponadas. Finalmente, Deepa et al. (2010) estudiaron la eficacia de
solubilizacin de P por aislamientos del gnero Enterobacter: E. aerogenes, E.
cloacae y E. asburiae, obtenidos de suelos no rizosfricos de India. Realizaron
ensayos de cuantificacin de P soluble y de IAA en medio lquido as como
estimaciones cualitativas de produccin de siderforos y de HCN. Los
resultados demostraron que estas cepas solubilizaron entre 58,5 y 79,5 g-
1
mL-1 da-1 de P soluble.
Se ha demostrado que el prolongado repique de BSP puede producir en
las mismas una rpida e irreversible prdida de la habilidad para disolver
fosfatos y que esa prdida es ms evidente en los aislamientos realizados desde
el suelo que a partir de la rizosfera de plantas, principalmente si se trabaja
con leguminosas (Paul, Sundara Rao 1971). En este sentido, Taurian et al.
(2009), evaluaron la capacidad de solubilizar P luego de 8 repiques y observaron
que el 93% de sus aislamientos mantenan esta capacidad.
Mecanismos y bases moleculares involucradas en el proceso

de solubilizacin
El principal mecanismo microbiolgico por el cual los compuestos
fosfatados son movilizados es la disminucin del pH del medio por la liberacin
de cidos orgnicos (Alexander 1980). La secrecin de los cidos puede disolver
directamente los fosfatos de origen mineral como resultado de un intercambio
del anin ortofosfato por el anin del cido. Sin embargo, tambin es posible
que los cidos se unan a los iones de hierro y aluminio que se encontraban
141
asociados a los fosfatos. Se han descripto distintos cidos orgnicos

producidos por los organismos solubilizadores de fosfato. Algunos de ellos
son glucnico, acetato, lactato, oxalato, succinato, citrato, glicolato y
gluconato, entre otros (Gyaneshwar et al. 2002). Golsdtein (1999) trabaj en
varias cepas de bacterias Gram negativas y demostr que el mecanismo
implica la oxidacin directa de la glucosa a cido glucnico y luego a 2-
ketoglucnico va la enzima glucosa deshidrogenada que requiere el cofactor
redox: pyrroloquinolina quinona. Como estas reacciones ocurren en el espacio
periplsmico de la clula, por lo tanto el espacio extracelular se vuelve cido.
Asimismo, Chen et al. (2006) aislaron 36 bacterias solubilizadoras de fosfato
de calcio de suelos de Taiwan, que pertenecan predominantemente a los
gneros bacterianos Bacillus, Rhodococcus, Arthrobacter y Serratia. Estos
autores mostraron que la propiedad de solubilizacin estaba asociada con
la produccin de cidos orgnicos y con una disminucin del pH del medio
de cultivo utilizado en el estudio. El anlisis de los cidos orgnicos
producidos por las bacterias estudiadas mediante la tcnica de HPLC, detect
ocho cidos orgnicos diferentes: ctrico, glucnico, lctico, succnico,
propinico y tres cidos orgnicos no identificados. Por su parte, De Werra
et al. (2009) trabajaron con Pseudomonas fluorescens CHA0 y demostraron,
trabajando con mutantes, que la capacidad de esta cepa de acidificar el
medio y de solubilizar P mineral, dependa exclusivamente de la produccin
de cido glucnico.
Se han observado otros posibles mecanismos que explicaran la
solubilizacin de Pi. Estos incluyen la liberacin de protones afuera de la clula
y su intercambio con cationes que estn unidos al P. Otros implican la
produccin de cidos inorgnicos como el cido sulfhdrico, el cido ntrico o
el cido carbnico. De todas formas, estos ltimos han sido ms cuestionados
(Rodrguez, Fraga 1999; Nahas 1991).
Las bases genticas de este proceso de solubilizacin an no son claras.
Como la produccin de distintos cidos estara involucrada en la solubilizacin,
cualquier gen que est relacionado con la elaboracin de cidos podra tener
que ver con el fenotipo solubilizador (Rodrquez, Fraga, 1999). Las
investigaciones en este tema se han orientado al aislamiento de los genes de
solubilizacin de Pi (mps) y a la manipulacin de los mismos, mediante la
introduccin y la sobreexpresin en bacterias que no posean esta capacidad
(Rodrguez et al. 2007). Liu et al. (1992) clonaron un gen de Erwinia hervicola
necesario para la produccin de cido glucnico en una cepa de Escherichia
coli HB101. Como resultado de la incorporacin de un plsmido con el gen de
inters, aument la produccin del cido y como consecuencia, la solubilizacin
de hidroxiapatita por la bacteria en cuestin. Babu-Khan et al. (1995) clonaron
el mismo gen en la misma cepa, pero el gen de inters era procedente de
Pseudomonas cepacia E-37. Por otro lado, Buch et al. (2009) estudiaron el
mecanismo de solubilizacin mediante la transformacin de Pseudomonas
fluorescens ATCC 13525. Estos investigadores insertaron en la cepa mencionada
142
el plsmido pAB3 conteniendo el gen para la enzima fosfoenolpiruvato

carboxilasa que incrementa la cantidad de oxalacetato, un intermediario en la
biosntesis de cidos orgnicos implicados en la solubilizacin de Pi. Los
resultados demostraron que bajo condiciones de insuficiencia de P, la actividad
enzimtica se sobreexpresaba y aumentaba el catabolismo de la glucosa,
aumentando las capacidades de solubilizacin de P.
El gnero Bradyrhizobium y la solubilizacin

Numerosos gneros bacterianos presentan capacidad para solubilizar y
mineralizar P, pero es de particular inters detectar esta habilidad en grupos que
adems realicen otras actividades, como por ejemplo fijar nitrgeno. La obtencin
de cepas de bradyrhizobios con doble funcin, permitira la produccin de
biofertilizantes fosforados para las futuras generaciones que tendrn un doble
compromiso: proteger el ambiente y alimentar a la poblacin humana.
Los bradyrhizobios pueden mineralizar Po (Abd-Alla 1994) y poseen
capacidad de solubilizacin de Pi (Halder, Chakrabartty 1993). Sin embargo,
son pocos los trabajos que han estudiado este grupo bacteriano y su relacin
con la disponibilidad de P en el suelo (Abd-Alla 1994). En la bibliografa se
describen experimentos en invernculo con cepas de Rhizobium y
Bradyrhizobium como promotoras del crecimiento en plantas no leguminosas
como por ejemplo en maz y en lechuga (Chabot et al. 1996 a; b; Chabot et al.,
1998) y en rabanito (Antoun et al. 1998). Existen algunos trabajos en
leguminosas como la soja (Mikanov, Kubt 1997) y ensayos de inoculacin
de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium con cepas solubilizadoras de Pi de
otros gneros bacterianos (Rudresh et al. 2005; Gull et al. 2004). En la mayora
de estos trabajos, se observa una estimulacin en el crecimiento y una mayor
absorcin de nutrientes por los cultivos as como en el nmero y en el peso de
los ndulos y en la actividad de la enzima nitrogenasa responsable de la
fijacin de nitrgeno. Asimismo, existen trabajos que han demostrado una
interaccin sinrgica positiva entre la MA Glomus mosseae, la BSP Enterobacter
sp. y Rhizobium meliloti (Barea et al. 2002). Por su parte, como se mencion en
un prrafo previo, Fernndez et al. (2007) estudiaron la inoculacin de BSP
sobre el cultivo de soja trabajando en el invernculo. Entre las bacterias se
incluy un aislamiento de Bradyrhizobium que present buenas capacidades
de solubilizacin in vitro con respecto a otros aislamientos. Sin embargo, los
resultados en planta no mostraron diferencias estadsticamente significativas
en comparacin a un testigo sin inocular.
Las bacterias solubilizadoras y la promocin del crecimiento

vegetal
Las asociaciones entre los microorganismos y las races en el suelo son muy
complejas y pueden mejorar la adquisicin de nutrientes por las plantas mediante
143
distintos mecanismos. Entre ellos se incluyen: i) un incremento en la superficie y

longitud radicular, ii) una contribucin directa mediante la disponibilidad de
nutrientes, ya sea por fijacin de nitrgeno o por estimulacin y/o contribucin
con los procesos metablicos que movilizan nutrientes desde fuentes inaccesibles
y iii) a travs de la biomasa microbiana (Figura 3) (Richardson et al. 2009).
Figura 3: Mecanismos promotores del crecimiento y desarrollo vegetal

(efectos directos e indirectos) asociados con el suelo y los microor-
ganismos de la rizosfera (Richardson et al. 2009). Las PGPRs biofer-
tilizantes y las micorrizas arbuscularers (AM) estimulan la nutricin
vegetal directamente incrementando el suministro de nutrientes a las
plantas (por ejemplo mediante fijacin biolgica de N, solubilizacin
de Pi, mineralizacin de Po y la produccin de vitaminas y de siderforos;
mejorando el acceso de las plantas a los nutrientes por incrementar la
superficie y longitud radicular. Las PGPRs con funciones de biocontrol
mejoran la salud de las plantas mediante la inhibicin del crecimiento
de organismos patgenos.
En este sentido, entre las bacterias que habitan en la rizosfera hay un

grupo de particular importancia, ya que causa impactos benficos en las
plantas y son conocidas como PGPRs (rizobacterias promotoras del
crecimiento vegetal). Las PGPRs colonizan las races y estimulan el crecimiento
vegetal mediante el biocontrol (efecto indirecto) y la biofertilizacin (efecto
144
directo) (Richardson et al. 2007). Como parte de la biofertilizacin, se incluye

el proceso de solubilizacin de Pi.
Los efectos benficos de la inoculacin con BSP sobre numerosos cultivos
son bien conocidos y han sido descriptos por numerosos autores (Igual,
Rodrguez-Barrueco 2007). Sin embargo, los resultados no siempre son
consistentes, a veces resultan contradictorios, observndose diferencias entre
investigadores y entre los ensayos realizados en el laboratorio y los
resultados obtenidos en el campo y/o invernculo. Fernndez et al. (2007)
estudiaron la inoculacin de BSP sobre el cultivo de soja trabajando en el
invernculo. Las plantas que se haban inoculado con la cepa Per2F del gnero
Burkholderia presentaron mayor altura y una mejor relacin N/P. Sin embargo,
ninguna de las cepas estudiadas, solubilizadoras de P in vitro, incrementaron
el P absorbido por el cultivo, lo cual estara indicando que la inoculacin de
BSP no necesariamente promueve y/o mejora la nutricin fosforada. Por su
parte, Afzal y Asghari (2008) estudiando en Pakistn la combinacin que
poda existir entre un fertilizante fosforado y bacterias aisladas del suelo,
demostraron que la inoculacin de trigo (Triticum aestivum L.) fertilizado con
P ms el agregado de Rhizobium y una bacteria solubilizadora de P poda
incrementar la produccin del cereal en un 29% respecto al control no
inoculado. Los autores concluyen que cuando se aplica esa tcnica dual es
necesario el agregado de fertilizaciones reducidas de P para lograr
incrementos significativos en la produccin de granos de trigo. Adems,
proponen que los rhizobios agregados a no leguminosas podran actuar
tambin como organismos solubilizadores de fosfatos y productores de
hormonas vegetales. En China, Chen et al. (2008) trabajando con una
fosfobacteria Gram positiva esporulada, observaron bajo condiciones
controladas que la liberacin de fsforo soluble que produca esa bacteria,
se incrementaba con el aumento de fosfatos al medio de cultivo, entre un
rango de 0,12-4% (p/v), y que los valores mximos se lograban a los 7 das de
incubacin. Adems, los autores detectaron una correlacin positiva (r= 0,93)
entre el nivel de fsforo soluble obtenido en el medio y la concentracin de
clulas vivas de la fosfobacteria investigada. Resultados por dems
interesantes cuando se piensa que esa bacteria podra ser utilizada para
producir un inoculante que ayude a movilizar P de un suelo.
PGPRS en agricultura sostenible: los biofertilizantes

Si bien la utilizacin de fertilizantes fosforados es obviamente el mejor
mtodo para cubrir el dficit de P en la produccin sustentable, su uso est
siempre limitado por la espiral de los costos. En la actualidad, un alto inters
se ha generado en la bsqueda de tecnologas que podran proveer de suficiente
P a las plantas y as poder reducir la costosa dependencia que tienen los
productores agrcolas en buena parte del mundo (Zaidi et al. 2009). Como
consecuencia, surgen las PGPRs como una alternativa fundamental para la
agricultura sostenible. Las PGPRs son aplicadas como tratamiento a la semilla,
145
e inmediatamente despus de sembrar se multiplican y colonizan el sistema

radicular. Las industrias emergentes que elaboran productos basados en PGPRs
pertenecen a la categora de biofertilizantes (Kloepper 2010).
Entre las bacterias ms empleadas en los biofertilizantes se encuentran
las BSP que son considerados los inoculantes ms prometedores. Si bien
numerosos autores reportan una promocin del crecimiento vegetal gracias
a los microorganismos solubilizadores de P, un incremento en la produccin
no siempre est asociado a un aumento en la absorcin de P. Numerosos son
los motivos. Algunas de las razones podran ser: supervivencia y colonizacin
por parte de las cepas inoculadas, competencia con microorganismos nativos,
naturaleza y propiedades del suelo y de los cultivos, falta de nutrientes en la
rizosfera que permitan la produccin de cidos orgnicos y posiblemente la
falta de una asociacin simbitica que le provee suficientes compuestos
carbonados para permitir la movilizacin (Deubel, Merbach 2005). Penna
(2010) plantea acertadamente, que la mayor parte de los trabajos publicados
basan su anlisis en microorganismos cultivados en laboratorio y cosechados
en fase exponencial para ser aplicados en plntulas que crecen en medios
sintticos en condiciones controladas. Sin embargo, las formulaciones
corrientemente conocidas como inoculantes se aplican luego de meses de ser
producidos tras un largo perodo de almacenamiento con los microorganismos
en una larga fase estacionaria o en una fase de muerte.
Existen en el pas distintas redes aplicadas al estudio de la rizosfera que
han surgido ante la creciente demanda de nuevas tecnologas para mejorar la
productividad reduciendo los riesgos ambientales (Toresani et al. 2010). Por
ejemplo, la REDCAI (Red de Control de Calidad de Inoculantes), tiene como
misin la creacin de un espacio nacional de participacin de profesionales
que se desempeen en el rea de evaluacin inoculantes. En el ao 2003 se
cre la red de biofertilizacin iberoamericana denominada BIOFAG
(Fertilizantes Biolgicos para la Agricultura y el Medio Ambiente). Esta es una
red cuyo objetivo central ha sido la promocin de la investigacin, desarrollo
y aplicacin de fertilizantes biolgicos de mxima calidad (Lagares 2010).
DIMAGRI es otra red compuesta por investigadores de la Argentina, Brasil,
Colombia, Espaa, Guatemala, Mxico y Uruguay. Los investigadores que
componen esta red proponen el estudio de diferentes aspectos relacionados
con los microorganismos asociados a las races de cultivos de inters
agronmico y del suelo circundante (Teixeira 2010).
Conclusiones
La adquisicin de nutrientes como el P desde el suelo, es un proceso
gobernado por el desarrollo de las races y su interaccin con los componentes
abiticos y biticos (Richardson et al. 2009). Dentro de estos ltimos, los
microorganismos y ms precisamente, las bacterias solubilizadoras de P, objeto
de esta revisin, son un componente fundamental de la agricultura sostenible.
146
El entendimiento ms claro y preciso de la diversidad, estructura y

funcionamiento de estas bacterias, permitir mejorar el desarrollo de
tecnologas que posibiliten la aplicacin de las mismas como biofertilizantes.
En la actualidad, son necesarios los resultados consistentes por parte de
toda la comunidad cientfica y los trabajos interdisciplinarios, donde bilogos,
microbilogos, biotecnlogos y agrnomos, sean capaces de explicar el
fenmeno complejo de la solubilizacin de Pi por las bacterias asociadas a las
races de las plantas.
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150
Captulo 9
Investigacin aplicada en Azotobacter sp.
dirigida a la promocin de crecimiento en
cultivos de inters econmico en Colombia
Azotobacter sp. applied research aimed to growth
promotion of crops with economics interest in
Colombia
Ruth Rebeca Bonilla1, Ren Novo2, Belisario Roncallo3, Mauricio Camelo1, Paola
Criollo1, Germn Andrs Estrada4, Mara Fernanda Garrido1, Mnica Lpez1, Andrs
Eduardo Moreno1, Melissa Obando1, Lorena Parra1, Diego Mauricio Rivera1, Daniel
Fernando Rojas1, Mario Van Strahlen5, Corina Zambrano6
1
Laboratorio de Microbiologa de Suelos, Corpoica. 2Universidad de la Habana, Cuba.
3
Estacin Experimental Motilonia, Corpoica. 4Embrapa Agrobiologa, Brasil. 5 Instituto
Colombiano Agropecuario, ICA. 6 Instituto Interamericano de Cooperacin para la
Agricultura, IICA. E-mail: [email protected]
Introduccin
El uso excesivo de fertilizantes de sntesis qumica se hace insostenible para
cualquier prctica agrcola tanto a nivel econmico como ecolgico. An as, el uso
de fuentes qumicas ha incrementado la produccin agrcola (Johnson et al. 2001),
pero con costos irrecuperables (Garcia-Agustin et al. 2004). Su aplicacin ha provocado
numerosos efectos negativos sobre el medio ambiente, tales como acumulacin de
nitratos en aguas subterrneas (Johnson, Kross 1990; Smith et al. 1994; Halwani et al.
1999; Suthar et al. 2009), toxicidad en plantas por altos niveles de nitritos (Bancroft
et al. 1979) y en general, alteracin de las interacciones biolgicas y qumicas del
suelo (Mirlean et al. 2008). Por estas razones se considera que la incorporacin de
prcticas sostenibles en la agricultura moderna puede generar beneficios ambientales
importantes y su aplicacin cada vez es ms necesaria.
Diversas estrategias se han planteado como alternativa de enmienda,
dentro de las cuales reviste gran importancia el uso de microorganismos
eficientes en la promocin del crecimiento vegetal como herramienta de
biofertilizacin (Raupach, Kloepper 1998; Adesemoye et al. 2008, 2009). Estos,
son un componente natural del suelo y debido a su rol en el ciclaje de nutrientes
y en la sntesis de ciertos metabolitos, pueden incrementar su fertilidad y
productividad (Adesemoye et al. 2009).
151
Ruth Rebeca Bonilla, Ren Novo, Belisario Roncallo, Mauricio Camelo, Paola Criollo, Germn Andrs Estrada, Mara Fernanda
Garrido, Mnica Lpez, Andrs Eduardo Moreno, Melissa Obando, Lorena Parra, Diego Mauricio Rivera, Daniel Fernando
Rojas, Mario Van Strahlen, Corina Zambrano
La presencia de microorganismos benficos asociados a cultivos de inters

econmico es determinante, debido a que contribuyen con el crecimiento y desarrollo
de las plantas mediante la produccin y solubilizacin de sustancias fisiolgicamente
activas, el establecimiento y la aceleracin de procesos bioqumicos, lo cual esta
asociado con un incremento en la productividad de los cultivos (Yan et al. 2002;
Kloepper et al. 2004; Ryu et al. 2007; Dutta, Podile 2010).
El gnero Azotobacter sp. es uno de los gneros bacterianos que ha sido utilizado
y estudiado en la agricultura, especialmente la especie A. vinelandii (Katznelson,
Strzelczyk 1961; Bishop et al. 1980, 1982; Chisnell et al. 1988; Premakumar et al.
1998); aunque es cosmopolita, est ampliamente distribuido y ha sido encontrado
predominantemente en algunos suelos tropicales que se caracterizan por poseer
contenidos medios de materia orgnica, fosfatos y valores de pH cercanos a la
neutralidad (Novo, Bonilla 1998; Kumar et al. 2007; Bhatia et al. 2008). Las bacterias
de este gnero tienen varias actividades metablicas de inters como: fijacin de
nitrgeno de vida libre (Benemann et al. 1972; Eady, 1995; Fisher et al. 2000b, a;
Kizilkaya, 2009), solubilizacin de fsforo (Garg et al. 2001), produccin de
sustancias promotoras de crecimiento vegetal (Tserkovniak et al. 2009) y degradacin
de hidrocarburos (Saha et al. 2007; Juarez et al. 2008).
Basados en estas consideraciones, la Corporacin Colombiana de
Investigacin Agropecuaria (CORPOICA), ha focalizado parte de sus trabajos
en la investigacin bsica y aplicada de este microorganismo, en particular,
con la especie Azotobacter chroococcum. En este sentido, se han adelantado
procesos de evaluacin dirigidos a determinar su potencial como herramienta
biotecnolgica para incorporarla en sistemas de agricultura sostenible en
Colombia. Aspectos relevantes relacionados con diversas experiencias de
campo con Azotobacter chroococcum y el desarrollo de un bioferilizante basado
en este microorganismo sern descritos y discutidos en el presente documento.
Monibac: Un biofertilizante con base en una cepa nativa de

Azotobacter chroococcum para incrementar la productividad
y sostenibilidad de los cultivos de algodn, pastos, aj y tomate
La utilizacin de microorganismos capaces de intervenir directamente
sobre los ciclos biogeoqumicos, se ha propuesto como una alternativa para
reducir el impacto generado por los problemas actuales de contaminacin
derivados de la fertilizacin qumica (Kang et al. 2010). Utilizar biofertilizantes
en los sistemas productivos se convierte en una opcin sostenible viable
para incorporar en sistemas agrcolas de produccin.
Desarrollo del producto Monibac

1. Aislamiento, caracterizacin y seleccin de cepas
El proceso de aislamiento de Azotobacter sp. se desarroll en el laboratorio
de la Estacin Experimental Motilonia de Corpoica, localizada en Agustn Codazzi,
<
152
Investigacin aplicada en Azotobacter sp. dirigida a la promocin de crecimiento
en cultivos de inters econmico en Colombia
Cesar, Colombia. Las muestras de suelo rizosfrico fueron obtenidas de cultivos

de algodn, ubicados en tres localidades de la Regin Caribe Colombiana:
Agustn Codazzi (Cesar), Riohacha (La Guajira) y Montera (Crdoba). Estos
suelos presentaron un pH entre 6,0 y 7,3, bajos contenidos de materia orgnica
(entre 1,0 y 1,5%) y textura franco arcillosa (Novo, Bonilla 1998).
El aislamiento se llev a cabo mediante la tcnica de grnulos de suelo en
medio de cultivo Ashby (Beliakov 1957), modificada por Novo y Bonilla (1998) y
fueron analizadas cinco placas por muestra, colocando 20 granos de suelo en
cada una; la temperatura de incubacin fue de 30 C hasta la aparicin de colonias
tpicas de Azotobacter. Se realizaron pases sucesivos en medio de cultivo Ashby
hasta obtener un cultivo puro con presencia de pigmentos caractersticos de cada
una de las especies; estos cultivos se observaron mediante la coloracin de Gram,
identificando las caractersticas propias para la familia Azotobacteraceae (Dworkin
et al. 2006), correspondiente a bacilos pleomrficos Gram negativos que a las 72
horas de incubacin, presentan la formacin de quistes (Bonilla, Morales 2006).
La purificacin bioqumica se realiz mediante el empleo de medio de cultivo
Ashby y benzoato de sodio como fuente de carbono (Dworkin et al. 2006).
2. Seleccin de cepas eficientes

El proceso de seleccin de cepas eficiente se centr en el desarrollo de un
inoculante biolgico que permitiera aumentar la productividad del cultivo del algodn,
disminuir el impacto de la fertilizacin qumica y reducir los costos de produccin. Se
evalu la capacidad de las cepas AC1, AC2 y AC3 de A. chroococcum para promover el
crecimiento de cuatro especies vegetales: algodn (Gossypium hirsutum), sorgo
(Sorghum vulgare), maz (Zea mays) y frijol caup o capezuna (Vigna unguiculata). Se
emplearon como criterios de seleccin la disminucin de los tiempos de germinacin
y la productividad de las plantas. Los resultados obtenidos evidenciaron que todas
las cepas evaluadas fueron capaces de reducir los tiempos de germinacin sobre
todas las especies vegetales (Figura 1), en particular, la cepa AC1 redujo los tiempos
de germinacin con respecto al control sin inocular en 45, 23, 43 y 44% para algodn,
sorgo, maz y frijol caup, respectivamente. Las cepas AC2 y AC3 tambin mostraron
un efecto significativo positivo sobre los tiempos de germinacin, no obstante, ste
no se reflej sobre todas las especies vegetales de estudio.
A continuacin, se evalu el efecto de la inoculacin con las cepas de
estudio sobre la productividad de las especies vegetales seleccionadas. Todas
las cepas fueron capaces de aumentar el contenido de materia seca (Figura 2)
en algodn (Gossypium hiristium), sorgo (Sorghum vulgare), maz (Zea mays) y
< Caup (Vigna unguiculata). En particular, las cepas presentaron una tasa de
incremento ms amplia sobre el maz donde los incrementos fueron frente al
control de 100, 197 y 202% para AC1, AC2 y AC3, respectivamente, que sobre las
otras especies vegetales donde los incrementos fueron de 113, 55 y 107% para
capezuna o frijol caup, 45, 63 y 46% para algodn, y 43, 0 y 50% para sorgo,
respectivamente. Este efecto suele estar asociado a las capacidades de
promocin vegetal propias del gnero en estudio (Kizilkaya, 2008; Kizilkaya,
153
Figura 1: Efecto de A. chroococcum, sobre la germinacin de cuatro

especies vegetales.
Figura 2: Efecto de la inoculacin de A. chroococcum sobre el contenido

de materia seca.
2009). Se afirma que la capacidad de ciertos gneros bacterianos como

Azotobacter sp., Azospirillum sp. o Burkholderia sp. para aumentar la
disponibilidad de elementos como nitrgeno y fsforo pueden repercutir de
forma directa y significativa sobre el crecimiento y desarrollo de ciertas especies
vegetales. Adicionalmente, la sntesis bacteriana de compuestos reguladores
del crecimiento vegetal tambin pueden influir sobre el desarrollo de las
plantas, incrementando su crecimiento y en consecuencia su productividad. La
cepa AC1 mostr ser la mejor sobre el desarrollo del cultivo de algodn ya que
no slo redujo los tiempos de germinacin, sino que adems, dio lugar a un
aumento en el contenido de materia seca de la planta lo cual se refleja en un
mayor tamao de la misma y en un mayor ndice de ingresos econmicos para
los pequeos productores, de modo que el proceso de desarrollo del inoculante
154
se continuara empleando la cepa AC1, pero en primer lugar sera necesario

definir como se realizara el proceso de inoculacin para estudiar su eficiencia
como posible bioinoculante (Bonilla, Morales 2006).
Las cuatro especies evaluadas en este experimento representan especies
agrcolas de importancia econmica de la regin Caribe colombiana. Los logros
obtenidos en la biofertilizacin abre las puertas a la utilizacin de estrategias
de fertilizacin amigables con el medio ambiente y que pueden generar un
impacto directo sobre la productividad de los cultivos y a su vez, sobre la calidad
de vida de los agricultores. Despus de seleccionado el microorganismo, las
actividades de investigacin giraron en torno de la bsqueda de un soporte
que permitiera la aplicacin fcil del producto y su comercializacin.
1.2. Formulacin y pruebas de eficiencia en el cultivo de algodn

Se evaluaron dos soportes slidos: la turba y la cachaza suplementada.
Despus, se verific el crecimiento del microorganismo y se realiz la
incubacin de los productos para la obtencin de las concentraciones
adecuadas (1X108 UFC g-1). A travs del tiempo se realizaron anlisis de
control de calidad cada 15 das, durante 3 meses. Se verific la viabilidad del
microorganismo durante los 90 das mediante la tcnica de dilucin decimal
y recuento en placa. Los resultados evidenciaron que ambos sustratos
preservaron la viabilidad celular en condiciones de refrigeracin,
demostrando que los dos soportes resultaban adecuados para el
mantenimiento del inoculante biolgico basado en la cepa AC1 de A.
chroococcum. El efecto de sta cepa sobre la productividad del cultivo del
algodonero en las dos formulaciones previamente descritas, con adicin de
25 kg de nitrgeno, se corrobora al comparar los rendimientos en las pruebas
de eficiencia de Monibac en condiciones de campo (Figura 3).
Figura 3: Pruebas de eficiencia de Monibac sobre el cultivo del

algodonero. Rendimiento de algodn semilla y porcentaje de fibra
obtenidos.
155
Los resultados revelan que en los tratamientos en donde se realiz

inoculacin con el biofertilizante se obtuvieron mayores producciones de
algodn semilla, siendo superiores en un 18,8% respecto al testigo. El efecto
de la inoculacin del microorganismo sobre el crecimiento de la planta no se
vio afectado por el tipo de soporte empleado. Las diferencias entre los
tratamientos no fueron significativas (P>0,05), sin embargo, se observ una
tendencia de incremento en la produccin de algodn semilla en las plantas
inoculadas con soportes slidos y lquidos con respecto al testigo. No obstante,
debido a la mayor disponibilidad de la turba en el mercado y a que no hubo
diferencias significativas sobre la eficiencia del cultivo del algodn cuando se
emplearon los dos soportes, esta fue seleccionada para estudios posteriores.
El empleo del biofertilizante no incidi en la calidad de la semilla (Bonilla,
Morales 2006).
3. Evaluacin de la capacidad promotora de crecimiento vegetal

La especie Azotobacter chroococcum posee una amplia diversidad
metablica (Chakraborty et al. 2002; Bonartseva et al. 2003; Gradova et al.
2003; Saha and Paul, 2005; Saha et al. 2007; Juarez et al. 2008). Dentro de las
caractersticas ms relevantes est su capacidad para promover el crecimiento
vegetal (Katznelson, Strzelczyk 1961; Azcn, Barea 1975). Esto, debido a que
cuenta con ciertas habilidades para mejorar la disponibilidad de nutrientes
en suelo o a la produccin de ciertos metabolitos que pueden influir
directamente sobre el desarrollo de ciertas especies vegetales (Azcn, Barea
1975). Algunos de estos mecanismos de accin son: la solubilizacin de
fsforo, la fijacin biolgica de nitrgeno o la produccin de compuestos
tipo indoles, entre otros. Con el objetivo de caracterizar estas capacidades
microbianas, se llevaron a cabo diversos experimentos en condiciones de
laboratorio.
3.1. Solubilizacin de fsforo

En la evaluacin de la capacidad solubilizadora de fosfato de la cepa AC1
de Azotobacter chroococcum, se emple el medio de cultivo lquido SRSM
suplementado con fosfato tri-clcico. El medio de cultivo fue inoculado con
una suspensin celular de AC1 ajustada a una OD600= 0,5. El cultivo se incub
durante doce das a 28 C y 150 rpm., de acuerdo a la metodologa desarrollada
por (Caballero et al. 2007) para la cuantificacin del fsforo disponible con
la tcnica de azul de fosfomolibdeno. En los resultados se observa que en el
medio de cultivo lquido SRSM, la cepa AC1 liber 212 ppm de PO43- con un pH
final de 4,48. Rajkumar et al. (2006), reportaron una solubilizacin de fsforo
de 380 y 300 ppm para las cepas Pseudomonas sp. PsA4 y Bacillus sp. Ba32,
respectivamente, bajo las mismas condiciones. Mientras que Ma et al. (2008)
reportaron datos de solubilizacin de tan solo 90 ppm despus de 7 das de
incubacin, lo que es significativamente menor a lo obtenido por la cepa
156
AC1, mientras que el valor de AC1 es menor a lo reportado para las cepas
PsA4 y Ba32. A pesar que el gnero Azotobacter no ha sido ampliamente
reportado como solubilizador de fosfatos, los valores obtenidos estuvieron
acorde con lo reportado por varios autores (Chen et al. 2005; Rajkumar et al.
2006). Tambin se aplic el mtodo del p-nitrofenilfosfato (Caballero et al.
2007) con el fin de determinar la presencia de la enzima fosfatasa en la cepa
AC1 de A. chroococcum; sin embargo, no hubo evidencia de la presencia de
esta enzima encargada de la mineralizacin de fsforo orgnico.
3.2. Determinacin de compuestos indlicos totales

Con el objetivo de cuantificar la produccin de compuestos indlicos de
la cepa AC1 se emple la tcnica de Salkowsky modificada (Glickmann,
Dessaux 1995) en el medio de cultivo K-lactato suplementado con 100 ppm
de triptfano (Carreno-Lopez et al. 2000). La cepa AC1 produjo 18,23 g ml-1
de ndoles totales despus de seis das de incubacin, lo cual evidencia que
la produccin de ndoles suele estar asociada con la fase estacionaria del
microorganismo. La curva de calibracin fue realizada empleando cido
indol-3-actico (AIA) (Glickmann, Dessaux 1995). Estos resultados pueden
ser comparados con varios autores quienes reportan cantidades comparables
de indoles totales (Rajkumar, Freitas 2008; Ma et al. 2009) Rajkumar et al.
(2006) report produccin de indoles sobre medio de cultivo LB suplementado
con 500 ppm de triptfano en medio de 6,6 g ml-1 luego de 36 horas de
incubacin, lo que result ser bajo comparado con lo obtenido para la cepa
AC1 puesto que el medio empleado solo contena 100 ppm de triptfano.
3.3. Fijacin biolgica nitrgeno

Para la cuantificacin de la fijacin biolgica de nitrgeno, se aplic la
tcnica de reduccin de acetileno (ARA) mediante cromatografa de gases
(Caballero-Mellado et al. 2007), determinada en un cromatgrafo de gases
Perkin-Elmer 3920B con detector de ionizacin de llama y una columna Poropak
N 200/300 Mesh de 6 pies y 3 mm de dimetro. La cepa AC1 fue capaz de
reducir acetileno a etileno, produciendo 736 nmol C2H4 mL-1 h-1, lo cual confirm
la capacidad de la cepa de reducir nitrgeno molecular a amonio. De acuerdo
a los resultados obtenidos, existieron diferencias significativas (P<0,05) entre
AC1 y las dems cepas analizadas (datos no mostrados).
4. Pruebas de eficiencia sobre otros cultivos de inters econmico

4.1 Prueba de eficacia de Monibac en aj (Capsicum sp.)
El cultivo de hortalizas en ciertas reas de la regin Caribe representa una
importante fuente de ingreso para el pequeo productor. En consecuencia, la
disminucin en los costos de produccin provenientes de la aplicacin de
157
fertilizantes qumicos resulta una necesidad prioritaria para el mejoramiento de

sus ingresos. El experimento consisti en evaluar el efecto de la aplicacin del
bioinoculante Monibac sobre las variedades de aj chino y topito (Capsicum sp.).
Le evaluacin se realiz en la Estacin Experimental Caribia (Sevilla,
Magdalena) y en la finca Buenavista (Santa Marta, Magdalena). Se utiliz un
diseo experimental de bloques completos al azar con cuatro tratamientos y
tres replicas, distribuidos de la siguiente manera: T1) testigo absoluto (sin
fertilizacin), T2) Monibac, T3) Monibac + 1/3 de la fertilizacin qumica y
T4) testigo completo (fertilizacin qumica completa: 75 kg N/ha), tomando
como referente para la fertilizacin qumica los anlisis qumicos del suelo. Los
resultados fueron similares en ambas variedades. La calidad del fruto fue similar
entre tratamientos, mientras que el rendimiento en kg de fruto/ha disminuy
para T1, y no hubo diferencias significativas (P>0,05) entre los tratamientos T2,
T3 y T4. La aplicacin de Monibac permiti reducir la fertilizacin qumica.
Los resultados mostraron una disminucin de 13% y 15% en el rendimiento
cuando la fertilizacin biolgica no se complement con la qumica, por lo
tanto, no se puede suplir completamente la aplicacin de fertilizantes de sntesis
y se recomienda la aplicacin de 50% de la fertilizacin qumica y Monibac.
Figura 4: Producto de PCR con primers especficos para el gen nifH. 1)

Marcador de peso molecular de 100 pb a 1000 pb. 2) A. chroococcum AC1.
3) A. vinelandii AV5.
4.2 Prueba de eficacia de Monibac en lechuga (Lactuca sativa L.)

Al igual que en la costa Atlntica colombiana, la sabana de Bogot, D.C.,
tambin representa un gran potencial para la produccin masiva de hortalizas,
donde reviste gran inters la lechuga en la canasta familiar. La investigacin
158
se realiz en el Centro de Investigacin Tibaitat de Corpoica (Mosquera,

Cundinamarca) con el propsito de evaluar el efecto de la aplicacin de
Monibacen la reduccin de la fertilizacin qumica nitrogenada. Los
tratamientos evaluados fueron los siguientes: T1) sin fertilizacin, T2) aplicacin
de Monibac y re-inoculacin a los 20 das, T3) aplicacin de Monibac + 1/
3 de la fertilizacin nitrogenada y T4) fertilizacin qumica completa. Se
evaluaron las siguientes variables: Rendimiento en kg ha-1, peso seco total-
PST (g), peso de cabeza-PC (g), altura AL (cm), longitud de raz-LR (cm) y dimetro
de la cabeza- DC (cm).
El experimento se estableci en reas de 17,0 m2 por parcela, utilizando
un diseo de bloques al azar con cuatro tratamientos y tres repeticiones y la
fertilizacin qumica se realiz de acuerdo a previos anlisis de suelo. En la
variable rendimiento, los resultados revelaron diferencias significativas
(P<0,05) entre los tratamientos que recibieron fertilizacin (T2, T3 y T4) y el
testigo (T1); con la aplicacin de Monibac solo (T2), el rendimiento (14,803
kg ha-1) se redujo 6% en relacin con la fertilizacin qumica completa (T4),
mientras que la fertilizacin con Monibac ms el 33% de fertilizacin qumica
(T3) (15,416 kg/ha) produjo una reduccin del rendimiento del 2% (15,416 kg
ha-1), no existiendo diferencias significativas entre los tratamientos.
En la variable PST se presentaron diferencias significativas (P<0,05) entre
los tratamientos T2, T3 y T4 en relacin con el testigo (T1); no obstante, entre
los tratamientos T1, T2 y T3 las diferencias observadas no fueron significativas.
La variable PC present igual comportamiento que el peso seco total. Las
variables AL, LR y DC no presentaron diferencias significativas entre los
tratamientos. En conclusin, la aplicacin de Monibac representa una
alternativa importante para la disminucin de los costos de produccin
generados por la aplicacin de fertilizantes qumicos y en consecuencia un
impacto importante sobre la calidad de vida del pequeo productor y el
consumidor con productos ms limpios.
4.3 Prueba de eficacia de Monibac en pastos

Se realizaron dos experimentos en sitios diferentes en la Estacin
Experimental Motilonia (Agustn Codazzi, Cesar), utilizando el pasto Guinea
(Panicum maximum cv Tanzania). En la variable produccin de materia seca/
ha, los resultados revelaron diferencias significativas (P<0,05) entre los
tratamientos que recibieron fertilizacin en relacin con el testigo. Los
tratamientos consistentes en la aplicacin del Monibac (9,553 kg/ha) y
Monibac con 23,3 kg de Nitrgeno en forma de urea (12,048 kg/ha), presentaron
mayores producciones de forraje con respecto al testigo (4,085 kg/ha). No
fueron observadas diferencias estadsticas significativas (P>0,05) entre los
tratamientos que recibieron fertilizacin qumica, Monibac con fertilizacin
qumica y aplicacin de Monibac. En la variable produccin de forraje (materia
seca /ha) no fueron encontradas diferencias estadsticas significativas (P>0,05)
159
entre los tratamientos donde se aplic Monibac y Monibac con fertilizacin

qumica en relacin con el testigo; sin embargo, se presentaron incrementos de
produccin de forrajes de 86,3 y 125,9% con la aplicacin de Monibac y
Monibac con fertilizacin qumica, respectivamente en relacin con el testigo.
5. Identificacin molecular
Inicialmente se aislaron 42 cepas y se identificaron preliminarmente como
del gnero Azotobacter sp. por pruebas fenotpicas (microscpicas,
macroscpicas y bioqumicas) y posteriormente se seleccionaron 8. Los
resultados obtenidos en diferentes especies vegetales permitieron seleccionar
la cepa AC1 por tener un mayor efecto sobre la germinacin de algodn,
sorgo, maz y caup, en relacin con los otros aislamientos obtenidos; en
condiciones de invernadero aument la altura de la planta, la longitud
radicular, el peso seco de la raz y la parte area, con respecto a los testigos.
Dado que la cepa presentaba actividades metablicas de inters, se
caracteriz filogenticamente mediante la amplificacin del gen nifH en el
laboratorio de Microbiologa Molecular del Centro de Biotecnologa y
Bioindustria CORPOICA. Este gen (nifH) codifica para una subunidad de la
enzima dinitrogenasa reductasa y se ha demostrado que contiene informacin
filogentica suficiente para la identificacin de microorganismos diaztrofos
(Hill 1992). Se obtuvo una banda de 370 pb aproximadamente (Figura 4). La
purificacin se llev a cabo mediante una columna de purificacin Microcon
siguiendo la metodologa descrita por la casa comercial. El producto obtenido
de PCR se secuenci, la informacin obtenida fue comparada con la base de
datos curada del GenBank y se confirm el gnero y la especie del
microorganismo con un 99% de similitud.
6. Estandarizacin del proceso tecnolgico para la produccin

de Monibac
6.1. Diseo de un medio de cultivo econmico alternativo
El uso secuencial de diseos estadsticos experimentales (Plackett-Burman,
factorial fraccionado, paso ascendente y Box-Behnken) ha sido empleado para
la optimizacin y diseo de medios de cultivo alternativos (Ren et al. 2008;
Rojas-Tapias et al. 2009). Se enfocaron esfuerzos para generar un efecto positivo
sobre la multiplicacin de la cepa AC1 de Azotobacter chroococcum mediante el
diseo de un medio de cultivo alternativo, aplicando como criterio principal de
evaluacin la produccin de biomasa viable (UFC.ml-1); se tuvo en consideracin
el costo de produccin y la disponibilidad de las fuentes nutricionales.
Mediante el diseo de screening primario (Plackett-Burman) se evaluaron
once fuentes nutricionales (glucosa, glicerol, almidn, levadura entera,
levadura hidrolizada, glutamato, fosfato dibsico de potasio, cloruro de
160
sodio, cloruro de calcio, molibdato de sodio y solucin de sales menores).

Seis fuentes fueron seleccionadas y evaluadas mediante un diseo factorial
fraccionado seguido del modelo de paso ascendente. Se escogieron finalmente
tres fuentes (glucosa, levadura y glutamato) que demostraron tener el mayor
efecto (P<0,05) sobre el crecimiento del microorganismo.
Las tres fuentes nutricionales seleccionadas se llevaron a un diseo de
optimizacin de variables (Box-Behnken) y mediante el anlisis de una serie
de superficies de respuesta de correlacin entre los factores, se gener la
prediccin de la concentracin de los factores nutricionales y el
comportamiento esperado de la biomasa viable (UFC.ml-1) (Figura 5).
El anlisis estadstico demostr que dentro de las tres fuentes
nutricionales evaluadas en la fase final del estudio, el glutamato
suplementado present un efecto positivo significativo (P<0,05) con mayor
influencia sobre la produccin de biomasa viable. Con base en esta fuente
nutricional, se gener la composicin optimizada del medio alternativo a
partir de la cual se obtuvo una produccin de 9x109 UFC.ml-1 con una reduccin
de costos de produccin de 96.7% (Moreno et al. 2009).
6.2 Estandarizacin de condiciones fisicoqumicas en biorreactor

Para definir y optimizar las condiciones fisicoqumicas relacionadas con
la multiplicacin de la cepa AC1 en un biorreactor de 5L (Minifors 5L. VET
3.7L) se aplic un diseo estadstico factorial completo, partiendo de tres
Figura 5: Superficies de Respuesta:

factores nutricionales
relacionados con el aumento de
biomasa viable.
161
condiciones que desempean un papel crucial sobre el crecimiento del

microorganismo en un biorreactor: aireacin, velocidad de agitacin y pH
(Pea et al. 2000; Pea et al. 2008). Con este propsito, se gener una matriz
de 8 tratamientos con 24 ejecuciones donde se tom como variable nica de
respuesta la produccin de biomasa viable (UFC.ml-1). Se evaluaron las tres
condiciones fisicoqumicas limitantes a dos niveles: aireacin (0,2 0,4 v.v.m),
velocidad de agitacin (300 500 rpm) y pH (ajustado a 7,2 no controlado).
De las variables evaluadas se analizaron las superficies de respuesta
generadas con el fin de observar el rea de distribucin de la combinacin de
factores (Figura 6) que incrementan la produccin de biomasa viable (Moreno
et al. 2009)
Figura 6: Superficie de Respuesta:

condiciones fisicoqumicas
relacionadas con el aumento de
biomasa viable en biorreactor.
Las condiciones fisicoqumicas asociadas al aumento de biomasa viable

de A. chroococcum en biorreactor fueron: 0,4 v.v.m, 500 rpm y pH no controlado,
generando un recuento de 2,7x1013 UFC mL-1. Relacionado a esto, el crecimiento
del microorganismo se vio favorecido por el incremento del pH en el medio,
ya que este al no ser regulado, alcanz valores de 8,2 +/- 0,10, lo cual ha sido
relacionado con un mejor crecimiento del microorganismo (Gauri et al. 2009;
Thavasi et al. 2009). De igual forma, el aumento de la relacin entre la aireacin
y la velocidad de agitacin, demostr influenciar de manera significativa
(P<0,05) el desarrollo del microorganismo debido a que esta relacin regula
la disponibilidad de oxgeno, el tamao de partcula de la burbuja y la
disponibilidad de nutrientes dentro del medio de cultivo.
162
7. Efecto de diferentes plaguicidas sobre el crecimiento de Monibac

La utilizacin de agroqumicos en los sistemas de produccin intensivos
tiene una clara accin sobre la microbiota del suelo, lo cual afecta directamente
la riqueza y abundancia de las poblaciones microbianas nativas expuestas a
este tipo de sustancias. Como consecuencia de la retencin de ciertos
plaguicidas en las partculas del suelo, los microorganismos benficos, como
muchas bacterias presentes en la mayora de los sistemas agrcolas, pueden
sufrir alteraciones bioqumicas, disminuyendo su actividad biolgica y su efecto
promotor (Paoletti 1999; Rivera et al. 2010).
Dentro de las bacterias diazotrficas, el gnero Azotobacter es uno de los
ms estudiados en la agricultura por su alta capacidad de biodegradacin,
especialmente para la oxidacin de compuestos fenlicos sustituidos. Este
hecho resulta de especial inters debido a que estas bacterias aumentan su
actividad biolgica en suelos agrcolas con residuos de tipo fenlico, lo que
sugiere que estos microorganismos pueden contribuir a la biotransformacin
de estos residuos. En este contexto, estos diaztrofos son considerados como
bacterias ciertamente ideales para los procesos de remediacin de suelos
agrcolas contaminados con sustancias xenobiticas (Chakraborty et al. 2002;
Gradova et al. 2003; Caballero-Mellado et al. 2007; Rivera et al. 2010).
El uso intensivo de plaguicidas en el cultivo de algodn (Gossypium
hirsutum) se ha convertido en una problemtica insostenible ocasionando
daos drsticos al medio ambiente y la salud humana (FAO, 2008, 2009).
Esta situacin ha obligado a establecer planes de mejoramiento de la fertilidad
del suelo permitiendo la reduccin en el uso de fertilizantes de sntesis qumica
mediante el empleo de tecnologas limpias (Acua et al. 2006). Los datos de
campo e in vitro sobre los efectos de los fertilizantes nitrogenados, fungicidas,
insecticidas y herbicidas sobre las bacterias fijadoras de nitrgeno asociadas
a los cultivos de inters agrcola son escasos, motivo por el cual se evalu el
efecto de agroqumicos cuyos principios activos se basan en Carboxin: 5,6-
dihydro-2-methyl-N-phenyl-1,4-oxathiin-3-carboxamide; Tiram: tetra-
methylthioperoxydicarbonic diamide; Imidacloprid: (1-(6-cloro 6-4- piridinil-
metil)-N-nitroimidazolidin -2- ilideneamina); Cipermetrina:(1RS)-cis,trans-3-
(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano carboxilato de (RS)-ciano-3-
Fenoxibencilo; S-metolachloro: (S)-2-cloro-N-(2-etil-6-metil-fenil)-N-(2-metoxi-
1-metil-etil)-acetamida; Fluometuron: 1,1-dimetil-3(alfa, alfa, alfa-trifluoro-
m-tolil) urea y Glifosato: (N-(fosfonometil) glicina) sobre la viabilidad del
inoculante biolgico Monibac. Los resultados demostraron la
susceptibilidad del microorganismo frente al insecticida Cipermetrina al
50% y al ser mezclado con los dems plaguicidas en la dosis utilizada
regularmente en campo. Se encontr que no hubo efectos significativos
(P>0,05) en la aplicacin de los plaguicidas Carboxin, Thiram, Imidacloprid,
S-metolachloro, Fluometuron y Glifosato) sobre la cepa AC1, las diferentes
dosis evaluadas infiriendo que sta bacteria en condiciones de laboratorio
163
es capaz de tolerar estas sustancias qumicas mediante diferentes mecanismos

fisiolgicos sin afectar su crecimiento (Figura 7) (Rivera et al. 2010).
Figura 7. Efecto de los agroqumicos sobre la viabilidad de A. chroococcum

AC1, en dos tiempos de contacto.
8. Seleccin y caracterizacin de cepas nativas de Azotobacter

sp. asociadas a especies forestales de inters en Colombia
El uso de microorganismos nativos con potencial biofertilizante se
involucra cada vez ms en los sistemas agropecuarios debido a que la prctica
de la bioinoculacin aporta numerosos beneficios a los cultivos desde el
momento de la germinacin hasta los estadios de su desarrollo posterior, lo
que determina incrementos en la produccin (Kizilkaya, 2008).
Se seleccionaron in vitro cepas promotoras de crecimiento vegetal
eficientes del gnero Azotobacter asociadas a especies de Eucalipto (Eucalyptus
sp.), Roble (Tabebuia rosea), Ceiba (Pachira quinata) y Melina (Gmelina arbrea).
Los criterios de seleccin fueron la eficiencia en la fijacin biolgica de
nitrgeno mediante la tcnica de reduccin de acetileno (ARA) (Eckert et al.
2001) y su capacidad en la produccin ndoles totales mediante la tcnica de
Salkowsky modificada (Carreno-Lopez et al. 2000). Se seleccionaron dos cepas
eficientes por cada una de las especies arbrea en estudio, con producciones
de etileno de 7,58 x 108 a 8,51 x 108 nmol mL-1 min-1 y valores promedios en la
164
prueba colorimtrica de AIA de 38,26 a 50 ug mL-1.

De igual forma, en estudios preliminares, se realizaron evaluaciones en
condiciones de invernadero con las cepas promisorias seleccionadas a partir
de las especies de Eucalipto (Eucalyptus sp.) y Roble (Tabebuia rosea). Los
resultados demostraron a los 30, 60 y 90 das despus de la siembra, la
prevalencia de la poblacin identificada presuntivamente como Azotobacter
sp. en suelo rizosfrico (P<0,05), el cual present el mayor nmero de clulas
por unidad de volumen (UFC mL -1) con respecto a los tratamientos sin
inoculacin y fertilizacin qumica. Asimismo, los parmetros agronmicos
evaluados: peso seco y fresco de parte area y races, dimetro de tallo,
longitud de la planta y contenido de nitrgeno presentaron diferencias
estadsticamente significativas entre los tratamientos inoculados con respecto
a los no inoculados (Figura 8).
Conclusiones
El desarrollo de sistemas agropecuarios sostenibles requiere del
conocimiento de los mecanismos que involucran las interacciones suelo-
microorganismo-planta-ambiente. El uso de fertilizantes biolgicos como
Monibac permite aumentar el rendimiento de diferentes cultivos de inters
econmico en Colombia, disminuyendo el impacto sobre el medio ambiente y
favoreciendo la calidad de vida del productor. La continuidad en la investigacin
pretende proyectar el uso de principios activos de tipo biolgico (Azotobacter
sp.) en biofertilizantes, los cuales contribuyan con la promocin del crecimiento
vegetal de especies promisorias en Colombia.
A partir de varios aislamientos provenientes de la zona Caribe colombiana
se obtuvo la cepa AC1 la cual evidenci en invernadero y campo promover el
crecimiento de diferentes cultivos de inters como el algodn, la lechuga,
tomate, aj o los pastos. Estos resultados fueron corroborados en el laboratorio
donde se evidenci que AC1 fue capaz de fijar nitrgeno, producir indoles y
solubilizar fosfatos. De igual forma, se demostr que la inoculacin con la
cepa AC1 representa una alternativa eficiente y rentable para la promocin
de ciertos cultivos donde la fertilizacin nitrogenada puede ser reducida
hasta en un 50%. Adicionalmente, los trabajos actuales tambin estn
dirigidos hacia la reduccin en los costos de produccin de los inoculantes.
Ciertos avances han sido realizados sobre el proceso tecnolgico, donde se
logr una reduccin del 98% en el proceso de produccin mediante el
desarrollo de un medio de cultivo alternativo para la produccin del
microorganismo. Azotobacter chroococcum es participe en la fijacin biolgica
de nitrgeno en los suelos, es decir, contribuye al ciclaje del nitrgeno en los
sistemas de produccin reduciendo la aplicacin de productos de origen
qumico. Adicionalmente, se le atribuye la capacidad de producir sustancias
promotoras del crecimiento vegetal, contribuyendo al desarrollo de la planta.
165
El efecto de compatibilidad de la bacteria con los herbicidas (S-metolachloro

y Fluometuron) demostr que A. chroococcum AC1, puede ser aplicado
conjuntamente con plaguicidas sin alterar su concentracin como una
estrategia en el manejo de los cultivos.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los financiadores: Conalgodn, Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), Fedegan y la Gobernacin del Cesar.
Adicionalmente, agradecen a Ever Mauricio Barn y a Edelberto Maestre
por su colaboracin tcnica durante la ejecucin de las actividades
implicadas en el desarrollo del biofertilizante y el apoyo durante el proceso
investigativo.
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171
172
Captulo 10
El gnero Pseudomonas en suelos
agrcolas y en rizosfera. De molculas a
comunidades
Pseudomonads in agricultural soils and rhizosphere.
From molecules to communities
Programa Interacciones Biolgicas, Departamento de Ciencia y Tecnologa, Universidad
Nacional de Quilmes. Roque Senz Pea 352, Bernal, B1876BXD, Argentina. Tel.: +54-
11-4365-7100. Fax: +54-11-4365-7132. Consorcio BIOSPAS (Biologa del Suelo y Produccin
Agraria Sustentable), proyecto PAE 36976, Ministerio de Ciencia, Tecnologa e Innovacin
Productiva, Argentina. E-mail: [email protected]
Introduction
Pseudomonads are Gram-negative, aerobic, non-sporulating, polarly
flagellated rods that are widely distributed in nature (Holt et al. 1994).
Here, the term pseudomonads will refer to members of the genus
Pseudomonas spp., also known as Pseudomonas sensu stricto, i.e., strains
whose 16S ribosomal DNA sequences fall into the rRNA I group defined by
Palleroni (Anzai et al. 2000). Representative members of the
pseudomonads are P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, P. syringae, P.
chlororaphis and P. stutzeri. These species include strains that are
opportunistic human pathogens (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens)
and plant pathogens (P. syringae), as well as strains that have plant growth
promoting or plant probiotic effects (P. putida, P. fluorescens, P.
chlororaphis). Despite this simplified categorization, the nature of the
interaction (pathogenic, probiotic or neutral) with a eukaryotic host (plant,
animal or human), can not be associated with a single pseudomonad
species and must be determined for every single isolate. An important
number of isolated pseudomonads produce water soluble pigments that
fluoresce under UV light, particularly under iron limitation; those strains
are referred to as fluorescent pseudomonads (Cornellis 2010).
Pseudomonads are detected in the rhizosphere of many healthy plants, as
important quantitative components of the microbial biota, suggesting that their
presence might be advantageous to the host plant (Haas, Defago 2005; Weller
2007). Moreover, specific lineages have been detected in certain crops associated
173
with reduced incidence of root diseases (Weller 2007). For several isolates, it has
been proved that their inoculation results on plant growth promotion under certain
controlled conditions. Such positive effects have been explained by different
mechanisms, some of which have been dissected at the molecular level (Haas,
Defago 2005). This aspect will be first illustrated here for a model P. fluorescens
probiotic strain, with a discussion about the critical role that a genetic regulatory
system has to protect plants against phytopathogenic fungi and, simultaneously, to
protect bacterial cells themselves from predation by bacterivorous eukaryotes. We
will then move from molecular details of a model strain into ecological aspects of
pseudomonads as members of the rhizosphere community, and briefly introduce
current studies on pseudomonads diversity in soil and rhizosphere in no-till farming
plots in Argentina.
Dual role of a P. fluorescens genetic regulatory system for plant

growth promotion and for avoidance of eukaryotic predation
Biocontrol features of P. fluorescens strain CHA0
More than two decades ago in Morens (Switzerland), a P. fluorescens strain
was isolated from a tobacco field suppressive to Thielaviopsis basicola, the
fungal agent causative of tobacco black root rot. The strain was able to avoid or
reduce the negative effects of T. basicola and several other phytopathogens
inoculated in plants under controlled conditions, and for this reason, it was
deemed a biocontrol microorganism (Stutz et al. 1986). The strain was
designated as P. fluorescens CHA0, and as will be briefly resumed below, it has
become a model bacterium to study genetic regulation of biocontrol expression
(Lapouge et al. 2008; Valverde, Haas 2008). The biocontrol ability of strain
CHA0 is due to the production and secretion of a variety of chemical compounds
and lytic enzymes on colonized host plant roots. Among the identified factors
that contribute to biocontrol, we can cite the antibiotics 2,4-
diacetylphloroglucinol (DAPG), pyrrolnitrin (PRN) and pyoluteorin (PLT), the
volatile toxin hydrogen cyanide (HCN), and the exometalloprotease A (AprA)
(Haas, Keel 2003). As expected, the production of all these biocontrol compounds
is not constitutive or, in other words, their expression is regulated by cellular
and environmental cues (Haas, Keel 2003). For instance, HCN production is
maximized under reduced O2 tension and it is strongly dependent on an adequate
iron supply (Blumer, Haas 2000); DAPG synthesis is higher on maize and wheat
roots than on bean or cucumber roots (Notz et al. 2001), and is also affected by
the presence of fusaric acid (Notz et al. 2002) and by soluble signals from
protozoans (Jousset et al. 2010). These abiotic and biotic cues operate as signals
that influence genetic regulatory systems that operate at the transcriptional
level through classical transcriptional regulatory proteins, like ANR for HCN
biosynthetic genes (Laville et al. 1998) and PhlF and PhlH for DAPG biosynthetic
genes (Schnider-Keel et al. 2000). These mechanisms allow specific adjustments
of gene expression in response to environmental signals, as O2 availability for
the HCN synthesis operon or nitrogen availability to the extracellular protease
174
Pseudomonads in agricultural soils and rhizosphere. From molecules to communities
operon (Haas, Keel 2003). The genes encoding proteins and enzymes for these
biocontrol factors are organized into separate operons that are dispersed into
the genome (Paulsen et al. 2005), that is, they are not physically linked so that
the above mentioned regulatory cues affecting transcription of the hcn or phl
operons do not influence expression of the plt, prn or aprA operons, and vice
versa.
However, early in the 90s, a classical genetic screening of a library of random
generated transposon mutants derived from strain CHA0, allowed the identification
of a single gene that when inactivated, it caused multiple phenotypes including loss
of all antibiotic factors and extracellular enzymes, and consequently, loss of tobacco
black root rot suppression (Laville et al. 1992). For this reason, the identified gene
was named gacA, namely, global antibiotic and cyanide regulator A. Amino acid
sequence homology indicated that GacA is a transcriptional regulatory protein,
typical of bacterial two-component systems (TCSs). TCSs are very common in
prokaryotes as sensory-transducing systems that permit bacteria to decode
environmental signals into genetic and cellular responses (Goulian 2010). The first
component is a transmembrane protein with at least three domains, a periplasmic
domain for interaction with the external stimulatory signal, a membrane anchorage
domain, and a cytoplasmic domain that contains a conserved histidine residue
where autophosphorylation occurs upon perception of the inducing signal. The
second component is the response regulator, i.e., a transcriptional regulator that
interacts with the sensor cytoplasmic domain and receives the phosphate in a
conserved aspartate residue, inducing a conformational change that permits binding
of the phosphorylated response regulator to the DNA to execute transcriptional
regulation of target genes and operons (Goulian 2010). In P. fluorescens strain
CHA0, GacA is the response regulator and GacS, is the partner membrane sensor
(Figure 1a; Zuber et al. 2003). One intriguing feature of the gacA mutant was that the
mutation did not affect transcription of all biocontrol operons, but the corresponding
biocontrol products were not synthesized. Thus, GacS/A seemed to have a global
regulatory positive effect on biocontrol gene expression at a post-transcriptional
level (Figure 1a). Two major questions arose: 1) how does the GacS/A executes the
global control on biocontrol gene expression? 2) Which is the signal perceived by
GacS? Significant advances at the molecular level have been achieved regarding
these issues in the last two decades for strain CHA0 (Lapouge et al. 2008; Valverde,
Haas 2008).
A keynote feature of the GacS/A system of strain CHA0 is that its global positive
effect on expression of biocontrol genes is maximal in cultures with high cell
density, with activation factors of 25-50 when cultures transit from exponential to
stationary phase (Lapouge et al. 2008). This behaviour is reminiscent of regulatory
systems of the quorum sensing type, i.e., regulatory circuits that respond to increasing
cell densities (Valverde 2010). In fact, strain CHA0 synthesizes a water soluble low
molecular weight compound that can be extracted from culture supernatants, and
that is able to activate the GacS/A system and advance biocontrol gene expression
to lower cell densities; that is, strain CHA0 produces an autoinducer that is sensed
175
by the GacS/A system. The chemical nature of the GacS/A autoinducer is unknown
yet (Dubuis, Haas 2007). So, the GacS/A TCS behaves as a quorum sensing system
with a positive feedback autoregulatory loop and an output branch for activation
of biocontrol gene expression (Figure 1a; Valverde, Haas 2008).
Figure 1: Molecular control of biocontrol gene expression in Pseudomonas fluorescens

strain CHA0 by the Gac/Rsm cascade. a) Cell-density dependent translational
activation of biocontrol gene expression depends on the two-component
system GacS/A, which responds to an autoinducer signal. b) Molecular detail
of the mechanism responsible for the translational activation of GacS/A-
controlled genes. At high cell densities, the phosphorylated response
regulator GacA~Pi promotes transcription of three small regulatory RNAs,
the antagonic sRNA mimics RsmX/Y/Z, that bind to and remove RsmA/E
repressor proteins from biocontrol target mRNAs, thus allowing
simultaneous translation and biosynthesis of biocontrol compounds.
As highlighted in the previous section, the GacS/A TCS is a global controller of

biocontrol genes acting at a post-transcriptional level. So, how does the system
act on multiple operons dispersed in the genome if not by a direct action of the
response regulator GacA, a likely transcriptional regulator? The point is that the
TCS GacS/A is the top element of a regulatory cascade that contains additional
intermediate elements. Two proteins, RsmA and RsmE (for regulator of secondary
metabolism), are RNA binding proteins that recognize and bind to sequence-
structural motifs in the leader regions of target mRNAs, around the ribosome
binding site, introducing a translational restriction to ribosome access (Lapouge
et al. 2007; Alvarez Crespo, Valverde 2009). Thus, RsmA and RsmE are global
translational regulators of biocontrol mRNAs (Figure 1b; Reimmann et al. 2005).
To relieve biocontrol mRNA repression by RsmA/E proteins, the GacS/A TCS makes
use of small non coding RNA molecules (Figure 1b). When a proper cellular density
is achieved and a threshold autoinducer signal concentration is attained,
autophosphorylated GacS activates GacA by trans-phosphorylation, and GacA~Pi
176
induces transcription of the three small RNA transcripts RsmX, RsmY and RsmZ,
that are the true effectors of the GacS/A system (Heeb et al. 2002; Valverde et al.
2003; Kay et al. 2005). These small regulatory RNAs have several structural-
sequence motifs that resemble those recognized by RsmA/E proteins in target
mRNAs (Valverde et al. 2004), so when the intracellular concentration of RsmX/Y/
Z small RNAs is increased, the RsmA/E proteins are outcompeted and displaced
from blocked mRNAs to form ribonucleoprotein RsmA/E-RsmX/Y/Z complexes,
thus permitting mRNA translation (Figure 1b; Valverde, Haas 2008). In this way,
the regulatory mechanism that controls biocontrol gene expression in strain CHA0
can be considered a cascade mastered by the GacS/A TCS, which output is executed
by small RNA molecules that act as antagonists of translational repressor proteins
(Figure 1). Which would be the advantages of such a complicated mechanism? On
the one hand, the response is quite fast and economic as it relies on synthesis of
small RNA molecules that must not be translated, and it operates on pre-formed
mRNAs. On the other hand, it allows coordinated expression of operons/genes
whose activation confers a competitive advantage for the cell under certain
environmental condition. So, one can imagine that plant roots profusely colonized
by strain CHA0 will benefit by the activation of the GacS/A system due to the high
cellular densities achieved on the rhizoplane/rhizosphere, resulting on good
expression of biocontrol genes for suppression of root pathogens (Figure 2).
Figure 2: Central role of the Gac/Rsm regulatory cascade in P. fluorescens

strain CHA0 for biocontrol of plant root pathogens and for avoidance of
eukaryotic predation. The correct functioning of the Gac/Rsm cascade
provides a selective advantage to P. fluorescens CHA0 cells to escape
predation from nematodes, ciliates, flagellates and amoebae and
simultaneously, it confers protection to colonized roots against
pathogens through activation of antibiotic and lytic enzyme synthesis.
Cell-to-cell communication through the Gac/Rsm is critical to

escape predation
Prokaryotes in soil and rhizosphere are exposed to eukaryotic predation
pressure, which contributes to shape bacterial community structure. Many
protists and nematodes feed on bacteria, and, as a consequence, several
177
bacterial species have developed strategies to overcome predation (e.g.,

morphological adaptations, cell surface modifications, biofilm formation
and toxin secretion) (Matz, Kjelleberg 2005). Isolated soil protists like the
amoeba Valkhampfia sp. And12, the flagellate Neobodo designis And31 and
the ciliate Colpoda steinii Sp1, can not grow in co-culture with wild type cells
of P. fluorescens strain CHA0, because protist cells are killed or induced to
enter into a dormant state (encystment) (Jousset et al. 2006). However, either
gacS, gacA or rsmXYZ mutants, are excellent source of food for the same protists
(Jousset et al. 2006). These three types of mutants have one thing in common:
they produce neither extracellular antibiotics nor lytic enzymes (see above).
Consequently, disarmed CHA0 gac mutant cells are exposed to predation in
the rhizosphere (Jousset et al. 2006). Thus it follows that one or several of
these extracellular compounds serves strain CHA0 to avoid protozoan grazing.
For instance, DAPG induces amoebae encystation and inhibits cyst reactivation,
whereas the exoprotease AprA delays encystation turning amoebae more
susceptible to other toxins (Jousset et al. 2006). HCN seems to have a minor
role against protists, but it is a strong toxin for the model nematode
Caenorhabditis elegans at high CHA0 cell densities (Romanowski et al. 2011).
Under these conditions, the nematodes suffer rapid paralysis without internal
infection, and HCN is a major contributor to this paralytic effect (Romanowski
et al. 2011). At low cell densities, C. elegans can feed on wild type CHA0 cells
without being paralyzed, but now the death comes from within as the intestine
becomes heavily colonized. As described for protists, gacS/A or rsmXYZ mutants
are not at all harmful for C. elegans (Jousset et al. 2009; Romanowski et al.
2011). Again, cell-to-cell communication by means of the Gac/Rsm cascade
turns out to be very important for strain CHA0, in this case to resist predation
by bacterivorous eukaryotes (Figure 2). These and other studies suggest that
predation promotes the production of bacterial defense compounds by
selectively eliminating non-toxic mutants (Jousset et al. 2009).
The Gac/Rsm cascade (Figure 1) appears to be a quite effective regulatory
system as it is conserved in pseudomonads, serving to impose a global control
on different set of genes, which depending on the strain are either probiotic
or pathogenicity-related genes (Valverde, Haas 2008). In particular, the gacA
gene has been proposed to be a reliable phylogenetic marker within the genus
Pseudomonas (de Souza et al. 2003), and it appears to be a suitable target for
the simultaneous analysis of Pseudomonas community structure and function
in soil (Costa et al. 2007).
Pseudomonads in soil and rhizosphere

Driving forces of pseudomonads diversity
Among soil bacteria, the genus Pseudomonas is one of the most diverse
and widespread in major natural environments. Its physiological adaptability
was recognized early (Stanier et al. 1966). With the development of molecular
178
techniques, the genetic diversity of the genus was realized. Different genetic
factors, from the genome size to its architecture, show a significant diversity
(Ginard et al. 1997; Schmidt et al. 1996; Rainey, Bailey 1996). Nevertheless,
this is not reflected at the DNA sequence level, supporting that these
microorganisms belong to the same bacterial genus (Spangenberg et al. 1998;
Kiewitz, Tummler 2000). The causes of this great diversity arent clear yet.
Microbiological studies tend to explain diversity at the DNA level, but they
generally forget the ecological factors that are certainly involved in shaping
biological diversity, like ecological opportunity and competition (Darwin 1859).
Ecological studies have been performed to elucidate which factors influence
the patterns of pseudomonads diversity. For instance, in a spatially
heterogeneous environment, the P. fluorescens SBW25 isolate rapidly diverges
into different colony morphologies with a marked niche preference (Rainey,
Travisano 1998). These niche-adapted classes, which bear mutations, had
competitive relationships, so that this diversity is durable.
Despite ecological opportunity and competition are considered the most
significant ecological causes of diversity, others like productivity, disturbance
and parasitism do also have an influence. Studies with strain SBW25 revealed
that the unimodal relationship between diversity and both productivity (Kassen
et al. 2000) and disturbance (Buckling et al. 2000) occurs in heterogeneous
environments, but not in homogeneous ones. Hence, these unimodal
relationships can be caused by selection of specialized types in the
heterogeneous environments, and they modulate the biological diversity. With
regards to parasites, the phage SBW25f2 has an important effect on
diversification of P. fluorescens SBW25 as it causes a reduction in sympatric
diversity but an increase in allopatric diversity (Buckling, Rainey 2002). So, the
exploiters (phages) can drive diversification between populations but may
inhibit diversification within populations by opposing diversifying selection
that arises from resource competition.
Obviously, evolution is not possible without genetic processes that affect
diversification. Mutation and recombination are the principal resources of
variation, and the pseudomonads have an enhanced capacity of evolutionary
divergence, i.e. evolvability. There is no evidence for a single mutational
mechanism or a main strategy for recombination in pseudomonads. However,
strains with elevated mutation rates (mutators) have been isolated (Oliver, Mena
2010), and recombination pathways occur in this genus of bacteria (Kiewitz et
al. 2000). Long-term infections, like those in lungs of cystic fibrosis patients, are
an excellent source of heterogeneous P. aeruginosa mutator isolates that are
defective in the DNA mismatch-repair system (Oliver et al. 2000; Moyano et al.
2007). An interesting related genetic event is phase variation, which occurs in
various Pseudomonas species. Phase variation consists in the diversification of a
single bacterial population into subpopulations with phenotypic and genotypic
differences. This is typical of bacteria occupying heterogeneous environments
such as the soil or rhizosphere. Phase variation often affects cell surface
179
components as a result of reversible genomic rearrangements caused by several

mechanisms (Snchez-Contreras et al. 2002). For example, P. aeruginosa suffers
the mucoid to non-mucoid colony transformation due to a number of point
mutations at different chromosomal loci (Govan, Deretic 1996); P. tolaasii, the
causal agent of brown blotch disease of the mushroom Agaricus bisporus,
undergoes phenotypic variation between pathogenic (wild type) and non-
pathogenic (phenotypic variant) forms, as a result of DNA rearrangement of the
pheN locus, a region involved in the regulation of gene expression (Grewal et al.
1995); P. fluorescens F113 experiences phase variation during colonization of
alfalfa roots, and this is caused by both the activity of a site-specific recombinase
encoded by the sss gene (the main factor of phase variation) and by a point
mutation in the gacA gene that alters the phenotype (Snchez-Contreras et al.
2002).
The large size of Pseudomonas genomes (5.9-7.0 Mb) likely reflects the
ability of most strains to colonize a broad range of ecological niches, as in a
larger genome there could be more catabolic pathways as well as more
regulatory genes which could control their expression. Pseudomonas genomes
are particularly rich in regulatory genes, mainly members of TCSs (Stover et
al. 2000). Because a central idea of adaptability is that regulatory pathways
have special properties relevant to evolutionary change, including versatile
protein elements and weak linkage among components (Kirschner, Gerhart
1998), this property of Pseudomonas genomes may be a special factor affecting
the ability of these bacteria to take advantage of foreign DNA. It appears that
pseudomonads are not naturally competent to acquire novel DNA by
transformation in the lab (Spiers et al. 2000). However, mobile accessory
genetic elements are one of the main tools for movement and integration of
foreign DNA sequences in pseudomonads. Isolated plasmids usually have a
broad host range and they encode complete pathways, often related to
virulence or catabolic activities (Thomas 2000).
Pseudomonads in the rhizosphere, a close relationship

One of the most interesting properties of Pseudomonas spp. is their ability
to form intimate associations with plants and animals, which can contribute
to health or disease in the host. As proven for other microorganisms (Whipps
2001), pseudomonads are quantitatively enriched in the rhizosphere (Figure
3). In a gnotobiotic experiment with wheat plants individually inoculated with
150 strains of fluorescent pseudomonads isolated from wheat rhizosphere,
40% of the isolates inhibited plant-growth, 40% stimulated plant growth, and
only 20% did not produce any effect (Campbell, Greave 1990). Most probably,
these percentages would differ in natural soil, due to the presence of lots of
other competitor bacteria. In line with this idea, the suppressive ability of a
biocontrol strain was higher in a gnotobiotic system than in soil (Lugtenberg
et al. 2001).
180
Among factors that influence the rhizospheric microbial community, soil

type, soil management, plant species and root zone location are the major
modeling agents. Soil type affects the microbial community because the
combination of soil texture and structure, organic matter content,
microaggregates, stability, pH, and available key nutrients determines the
habitable niches in soil (Latour et al. 1996). Crop rotation, tillage, irrigation,
and herbicide and fertilizer application are also key determinants of microbial
community structure (Picard, Bosco 2008). Through their root exudates,
different plants provide different carbon sources, ions, enzymes and mucilages.
The utilization of root exudates is the nutritional basis for the colonization
ability of some species (Lugtenberg et al. 2001; Smalla et al. 2001; Kamilova et
al. 2006). Although Pseudomonas is a ubiquitous genus, some degree of plant
and soil specificity exists (Latour et al. 1996; Berg et al. 2002; Picard, Bosco
2008). When considering the entire root system, pseudomonads show a
heterogeneous colonization pattern (Garbeva et al. 2004; Chin-A-Woeng et
al. 1997). Electron microscopy allowed visualizing a preferential colonization
of epidermal root cell junctions, indented parts of the epidermal surface, or
root hairs, which are all presumed sites for exudation (Chin-A-Woeng et al.
1997), resulting in microcolonies in which cell density dependent regulatory
mechanisms are likely to enhance production of secondary metabolites, most
of them involved in antagonism, and bacterial conjugation (Chin-A-Woeng et
al. 1997; van Elsas et al. 1998).
Figure 3: The rhizosphere effect for pseudomonads. The graph shows the average
load of pseudomonads (log CFU/g-1) in top soil (S) and rhizosphere (R) at
different geographical locations (1-4) in the humid Pampa, in agricultural
plots under no till management. BAP, plots selected by their bad
agricultural practices; GAP, plots selected by their good agricultural
practices (AAPRESID). The crops present at time of sampling (summer
2010) were: maize (R1) and soybean (R2, R3, R4) for BAP; soybean (R1, R2,
R4) and maize (R3) for GAP. Error bars indicate SD.
181
The ability of inoculated bacteria to reach the root tip during colonization
is considered of primary importance to cope with competition with the
indigenous soil microflora and with propagules of fungal plant pathogens
that can be found at different soil depths. So, the colonization competence is
defined as the ability of seed or seedling inoculated bacteria to reach the
growing root tip. An effective colonization can contribute to: i) cause diseases
(pathogenicity); ii) control disease by production of certain metabolites
(biocontrol); iii) direct plant growth promotion (phytostimulation); iv)
increasing availability of nutrients for plants, like phosphate, nitrogen and
micronutrients (biofertilization); v) phytoremediation, through degradation
of toxic organic compounds (Lugtenberg, Dekkers 1999).
Genetic approaches suggest that the colonization ability of pseudomonads
is a very complex process, implicating various mechanisms and multiple genetic
factors. Either by targeted mutagenesis of genes presumed to be involved in
colonization or by random mutagenesis, several mutants have been isolated
with an altered colonization competence. These mutants with impaired root
colonization suffered mutations in genes associated with motility, chemotaxis,
growth rate, carbon source usage, outer membrane proteins as OprF and efflux
pumps, and production of different cellular compounds, like the LPS O-antigen,
cellulose, thiamine, amino acids, and biotin (Lugtenberg et al. 2001; Haas,
Dfago 2005; Weller 2007). Interestingly, most of these factors involved in
root colonization are also critical for pathogenicity of other Gram negative
bacteria. Conversely, the opportunistic human pathogen P. aeruginosa PAO1
can function like a biocontrol bacterium on cucumber and wheat plants (Walker
et al. 2004). Furthermore, it has been found the type III secretion system (TTSS)
in non-pathogenic P. fluorescens (Lugtenberg et al. 2001; Kimbrel et al. 2010).
TTSS is a specialized protein transport pathway induced in response to contact
with eukaryotic host cells, involved in secretion of effector proteins into the
cytoplasm of eukaryotic cells. The plant pathogen P. syringae pv. tomato
DC3000 employs a TTSS to inject particular proteins into plant cells, and the
bacterium specificity by the host plant is carried out by the effectors protein it
produces and brings into to the cell plant (Fouts et al. 2003). As TTSS have
been previously described only for parasitic bacteria (Alfano, Collmer 1997),
it is still unknown the real function of this pathway in plant probiotic bacteria,
like P. fluorescens; a role in defense against eukaryotic grazers may be
speculated. Thus, similar strategies and mechanisms seem to be used by plant
beneficial as well as plant pathogens to colonize hosts.
Plant growth promotion (plant probiosis) by pseudomonads

Due to the negative environmental effects of chemical pesticides and
fertilizers, commercial agriculture is looking for alternative solutions to enhance
crop yield and health, like the use of microorganisms and the development of
genetically modified plants. As the last one is frowned upon by the general
182
public, the first one seems to be the more acceptable option (Adesemoye et al.
2009). Pseudomonads have several mechanisms for promoting crop growth
and health (Valverde, Ferraris 2010). Several properties make them interesting
candidates as plant growth-promoting rhizospheric (PGPR) or plant probiotic
agents, i.e.: high growth rate, wide carbon source utilization, great rhizosphere
colonization ability, important production of bioactive metabolites, aggressive
competence for niche and a good adaptation to a variety of stresses. However,
the fact that they do not sporulate limits formulation of commercial inoculants
for long term storage (Weller 2007).
Depending on the plant probiotic effect, PGPR microorganisms can be
classified into: 1) biofertilizers, with a direct effect on host plants (this grouping
includes phytostimulators); 2) biocontrol or biopesticide strains, that act
indirectly on plant growth (Haas, Defago 2005). Biofertilizer strains can directly
enhance plant growth by producing phytohormones or the ethylene lowering
enzyme 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, by synthesizing
siderophores, by supplying biologically fixed nitrogen, or by solubilizing
minerals like phosphorous. Biocontrol strains are able to protect plants from
infection by phytopathogenic organisms (Bloemberg, Lugtenberg 2001; Haas,
Dfago 2005). The great majority of isolated probiotic pseudomonads have
biofertilizer or biopesticide properties, although biological nitrogen fixation
seems to be only restricted to some P. stutzeri strains (Desnoues et al. 2003).
The primary mechanism of biocontrol performed by pseudomonads is the
production of antibiotics, namely DAPG, phenazines, PRN, PLT, HCN (Haas,
Dfago 2005; Weller 2007), and cyclic lipopeptides such as viscosinamide and
tensin (Nielsen et al. 1999). Secreted hydrolytic enzymes like exoproteases,
phospholipase C and chitinases also contribute to antagonism (Chernin et al.
1995; Heeb, Haas 2001). In addition to antibiosis, siderophore production and
induced systemic resistance (ISR) were identified as important traits for fungal
inhibition (Kloepper et al. 1980; Pieterse et al. 2003). Siderophores are small
molecules that can bind the poorly soluble ferric ion and make it available for
its assimilation. As iron is fundamental for life, its sequestration generates a
decrease of iron available for pathogen growth and germination of fungal
spores (Weller 2007), but this strategy is strongly dependent on soil pH (Haas,
Dfago 2005). Siderophores are also implicated in iron acquisition by plants, a
direct effect for their growth promotion (OSullivan, OGara 1992).
Pseudomonads produce various siderophores, mainly fluorescent yellow-green
molecules referred to as pyoverdines or pseudobactins, and other non
fluorescent compounds like pyochelin, pseudomonine, pyridine-2,6-
dithiocarboxylic acid, quinolobactin, corrugatin and nocardamine, which can
also complex metals other than iron, like cobalt, copper, nickel, zinc, vanadium
and molibdenum (Cornelis 2010). Finally, ISR was discovered due to the ability
of some PGPR strains to protect plants from leaf pathogens, as they can react
more quickly and strongly to pathogen attack, though there was not any direct
contact between microorganisms (Haas, Dfago 2005). This effect mimics the
systemic acquired resistance (SAR) mechanism, even though they are regulated
183
by different signal pathways (Pieterse et al. 2003). Several metabolites have

been identified as ISR elicitors, like phenazines, 2R,3R-butanediol and 4-
(aminocarbonyl)-phenylacetate (Park et al. 2008).
Despite the diverse probiotic properties already characterized in
pseudomonads, its commercial use as inoculant is incipient. This is mainly due
to the lack of formulations that ensure bacterial viability over long-time periods
(Haas, Dfago 2005). Another problematic issue is the large number of abiotic
and biotic soil factors that regulate bacterial performance, that make excellent
results in laboratory and greenhouse experiments to be not always
reproducible in the field (Nelson 2004). We now have the tools to screen for
the best isolates in terms of their widest spectrum of probiotic activities;
therefore, a much deeper understanding about the expression of biocontrol
traits in natural environments is required, to improve microbial utilization in
favor of chemical compounds moving towards a sustainable agriculture (Haas,
Dfago 2005; Weller 2007).
Studying pseudomonads in agricultural soils under no-till

management in Argentina
In Argentina, no-till management (NT) is the agricultural technique utilized
in mostly all agricultural plots (AAPRESID), as a result of the demonstrated
better crop yield results associated with the conservation of soil structure
and water infiltration, among some others factors (Derpsch 2008). Despite of
our knowledge about the benefits provided by this agricultural practice, there
is very few information available about the biology of NT soils. As Pseudomonas
is a prevailing bacterial genus recovered from diverse soils and plant
rhizospheres, we decided to study the pseudomonad community in NT plots
located in the humid Pampa, that is, the most productive area in Argentina.
This research line is part of a large and multidisciplinary consortium dedicated
to study soil biology in relation to crop productivity under sustainable
agricultural management (BIOSPAS; http://www.biospas.org). Four
geographical locations with different soil properties have been chosen, and
three treatments have been defined: 1) good agricultural practices (GAP), as
defined by AAPRESID; 2) bad agricultural practices (BAP), in which some or all
requisites for GAP are not satisfied; 3) natural environment (NE) without
human intervention as a control for the effect of agricultural practices. In
each site, both soil (the first top 10 cm) and plant root systems are sampled
from plots under these three treatments, in summer and winter time. Samplings
started in summer 2010 and will continue at least for three years.
The culturable Pseudomonas community is studied upon plating soil and
rhizosphere suspensions onto the highly selective S1 medium (Gould et al.
1985). We operationally define rhizosphere samples as the biological material
recovered from thorough washings of roots that have been previously shaken
by hand to remove loosely adhered soil. Thus, it is expected that our
184
rhizosphere suspensions contain bacteria from tightly adhered soil

particles as well as from microcolonies present on the root surface. Platings
on S1 medium serve both to quantitatively estimate the culturable bacterial
load in soil and rhizosphere, and to select isolates for screening of plant
probiotic activities and good crop colonization traits, looking for new
inoculant strains. For instance, a number of pseudomonad isolates were
obtained with a wide spectrum of antagonism to soil fungal pathogens also
isolated from crop plants sampled at the same sites.
Figure 4: Molecular analysis of pseudomonad community by PCR-RFLP and

selective enrichment of pseudomonads in the rhizosphere. The figure shows
the Hae III-RFLP pattern of the Pseudomonas marker gene oprF from the
most abundant pseudomonads present in soil and rhizosphere samples
of all treatments from one geographical site studied in the BIOSPAS
project.
In addition, S1 platings serve to obtain a source of DNA from the most

abundant culturable pseudomonads to analyze its diversity at the molecular
level. To this end, we resuspend all colonies from plates, lyse cells by thermal
incubation, and use the supernatant as template for specific PCRs (Polymerase
Chain Reaction). To approach the diversity of pseudomonads in the samples,
we perform RFLP analyses (Restriction Fragment Length Polymorphism) of the
PCR products targeting internal fragments of two genes that are markers of
185
the Pseudomonas genus, oprF (encoding the major outer membrane porin
OprF; Bodilis et al. 2006) (Figure 4) and gacA (encoding the response regulator
GacA, see above). To confirm the assumption that the S1 medium is strictly
selective for Pseudomonas spp., and that the oprF PCR is genus-specific, we
performed 16S rDNA and oprF sequencing of 50 colonies randomly picked up
from S1 plates from different soil and rhizosphere sources. All 16S rDNA and
oprF sequences confirmed that the picked S1 colonies were members of the
Pseudomonas genus (data not shown), thus supporting the use of S1 platings
and oprF PCR-RFLP as a mean to study the diversity of this bacterial group in
NT soil and rhizosphere samples.
Plate counts of the first two samplings (summer and winter 2010) confirmed
the known rhizosphere effect for pseudomonads, i.e., the total number of
S1 CFU/g-1 of rhizosphere material of different crops is higher by two orders of
magnitude compared to the respective bulk soil (Figure 3). Platings also
suggest a higher bacterial load in the soybean rhizosphere compared to maize,
despite the plot treatment in which plants were sampled (Figure 3). In terms of
diversity, PCR-RFLP analyses also revealed differences on the Pseudomonas
community of soil and rhizosphere from the same plot in all geographical sites,
suggesting that plant roots systems select specific strains from the surrounding
soil. Digital processing and comparative analyses of gacA PCR-RFLP patterns
preferentially grouped samples according to geographic sites but not by
treatments (data not shown). On the other hand, oprF PCR-RFLP results did
not reveal a defined grouping pattern yet. Overall, Shannon index calculations
of soil PCR-RFLP patterns seem to indicate that the population diversity is
higher in GAP plots than in BAP plots. These promising preliminary results
about load and diversity of culturable pseudomonads prompted us to set up
methods to evaluate the load and diversity of total pseudomonads (culturable
plus unculturable) by means of direct DNA extraction from soil and rhizosphere
samples, which are currently under development in our lab.
Conclusions and perspectives

Pseudomonads are members of soil prokaryotic flora and specific strains
appear to be enriched in the rhizosphere of different plants. Many species
display plant probiotic effects, a trait that turns these microorganisms
interesting for application purposes. For some isolates, like P. fluorescens strain
CHA0, the genetic determinants and regulatory mechanisms underlying the
probiosis have been characterized in detail. This is the case of the Gac/Rsm
cascade of strain CHA0, a system that serves to coordinate expression of genes
related to biocontrol of plant root pathogens and escape to eukaryotic grazing,
according to the cellular population density (Figures 1 and 2). Both in soils as
well in the rhizosphere, P. fluorescens cells coexist with other micro- and
macroorganisms. In this context, cellular communication is critical to
coordinate biological activities for competition strategies. It sounds logic that
186
microcolonies with high cell densities developed in soil particles and on

rhizoplane/rhizosphere, provide physiological conditions for induction of
the Gac/Rsm cascade. This represents a benefit for plants colonized by this
type of toxin producing bacteria, and at the same time, it favors persistence of
these species over non producers that are preferentially predated by
eukaryotes, thus influencing bacterial soil and rhizosphere community
structure. In this regard, most of the available literature on diversity of
pseudomonads in soil and rhizosphere of agricultural plots comes from foreign
countries (Picard, Bosco 2008). We dont know yet how diverse are
pseudomonads in agricultural soils in Argentina, which factors influence
pseudomonads populations in agricultural soils, if there is any kind of specificity
in crop rhizosphere colonization, if certain pseudomonad groups contribute
to crop health. Hopefully, isolation and characterization of probiotic lineages
locally adapted to soils and rhizospheres, will represent promising strains for
agricultural purposes. The research project initiated in our lab as part of the
BIOSPAS consortium, aims to provide answers to these issues, with approaches
that examine pseudomonads from molecules into communities.
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194
Captulo 11
Asociacin entre Azospirillum brasilense
y plantas de frutilla (Fragaria ananassa):
quimiotxis y colonizacin radicular
Association between Azospirillum brasilense and
strawberry plants (Fragaria ananassa): chemotaxis and
root colonization
Ral O. Pedraza1, Mara F. Guerrero-Molina1, Beatriz C. Winik2, Mara L. Tortora1,
Alicia L. Ragout3, Katia R. Teixeira4, Beatriz E. Baca5
1
Facultad de Agronoma y Zootecnia. Universidad Nacional de Tucumn. Av. Roca 1900. (4000)
Tucumn. Argentina. 2Centro Integral de Microscopa Electrnica. Facultad de Bioqumica,
Qumica y Farmacia. UNT. INSIBIO CCT-CONICET Tucumn. Chacabuco 461, (4000) Tucumn,
Argentina. 3PROIMI-CONICET. Av. Belgrano y Pje. Caseros. (4000) Tucumn. Argentina.
4
Laboratrio de Gentica e Bioqumica. EMBRAPA Agrobiologia. Seropdica, Rio de Janeiro.
Brasil. 5Centro de Investigaciones Microbiolgicas, Benemrita Universidad Autnoma de
Puebla, Cdad. Universitaria, Edif. 103. Col. San Manuel, 72570. Puebla, Pue. Mxico.
Introduction
The genus Azospirillum belongs to the so called plant growth-promoting
bacteria (PGPB) group. PGPB were defined as free-living soil, rhizosphere,
rhizoplane, and phylosphere bacteria that, under certain conditions, are beneficial
for plants (Bashan, Holguin 1998; Bashan, de-Bashan 2005). They are commonly
used as inoculants to improve crop yields, and besides their agricultural utility,
there are potential benefits in environmental applications (Bashan et al. 2008).
PGPB may promote plant growth in different ways (Bashan, Holguin 1998;
Bashan, de-Bashan 2005): they can directly affect the metabolism of the plants
by providing substances that are usually in short supply. For instance, they
are capable of fixing atmospheric nitrogen, solubilize phosphorus and iron,
and enhance production of plant hormones such as auxins, gibberellins and
cytokinins. In addition, they improve the plant tolerance to stresses, such as
drought, high salinity, metal toxicity, and pesticide load. One or more of these
mechanisms may contribute to the increased plant growth and development,
greater than plants grown under standard cultivation conditions.
In the other side, there is a group of PGPB, referred to as biocontrol-PGPB
(Bashan, Holguin 1998), that indirectly promote plant growth by preventing
195
Ral O. Pedraza, Mara F. Guerrero-Molina, Beatriz C. Winik, Mara L. Tortora, Alicia L. Ragout, Katia R. Teixeira y Beatriz
E. Baca
deleterious effects of phytopathogenic bacteria, fungi, nematodes and viruses.

Added to their value as crop inoculants, the potential benefits of PGPB have
been used in recent years in environmental applications. For example,
Azospirillum species enhance bioremediation of wastewater treated with
microalgae by increasing proliferation and metabolism of the microalgae;
hence increasing the effectiveness of the microalgae to clean wastewater
better than when used without PGPB (Bashan et al. 2008).
For many agronomic crops significant increases in growth and yield in
response to inoculation with PGPB have been reported (Asghar et al. 2002;
Bashan et al. 2004; Biswas, et al. 2000). The application of this type of bacteria
has resulted in an evident plant growth-promotion, observing an increase in
the emergence, vigour, biomass production, root system development and
enhancement of up to 30% in the production of commercially important crops,
such as sorghum (Raju et al. 1999; Vikram 2007), tomato (Gravel et al. 2007;
Siddiqui, Shaukat 2002), maize (Kozdroja et al. 2004), wheat (Ozturk et al.
2003; Khalid 2004), and various grains (Dobbelaere et al. 2001).
Most of the bacterial-plant associations occur in the rhizosphere, the soil
area that is strongly influenced by plant roots (Vanbleu, Vanderleyden 2003).
These associations are initiated in response to exchange of signals triggered
from the microbe-plant interaction (Vanbleu, Vanderleyden 2003). The
rhizosphere is rich in nutrients, due to the accumulation of a variety of organic
compounds released by roots through exudation, secretion, and deposition
(Curl, Truelove 1986). These compounds can be used as carbon and energy
sources by microorganisms, stimulating the microbial activity, particularly
intense in the rhizosphere. This was reflected by the number of bacteria found
around the roots that are generally 10 to 100 times higher than outside the
rhizosphere (Weller, Thomashow 1994).
Many bacteria use a complex performance called taxis to sense specific
chemicals or environmental conditions and move towards attractants and away
from repellents (Adler 1966). Bacterial taxis is directly involved in interactions
with plant host as a principal step in the colonization process (Kato et al. 2008;
de Weert 2002). Taxis, especially chemotaxis, together with the mechanism of
signal transduction and response regulation, have been well studied in
Escherchia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (Stock, Surette
1996). Chemotactic ligands are detected by cell surface chemoreceptors called
methylaccepting chemotactic proteins (MCPs). Upon binding a chemotactic
ligand, MCPs generate chemotactic signals that are communicated to the
flagellar motor via a series of chemotaxis (Che) proteins (Stock, Surette 1996).
The genus Azospirillum belongs to the -subdivision of Protobacteria and has
been isolated from the rhizosphere of many plant species in different regions of
the world, including tropical and temperate climates. The species belonging to
this genus are motile and exhibit chemotaxis to several compounds found in
roots exudates. The bacterial mobility in the rhizosphere responds to the
196
Asociacin entre Azospirillum brasilense y plantas de frutilla (Fragaria ananassa): quimiotxis y colonizacin radicular
chemotaxis, which allows them to move towards the roots to obtain benefits from
root exudates (mainly carbon and nitrogen compounds) (Pedraza et al. 2010).
Azospirillum was found in places where the oxygen concentration is optimal
for biological nitrogen fixation (Barak et al. 1982); some bacterial strains
associated on the root surface and others colonizing the root interior
(Dbereneir, Pedrosa 1987), where there is less competition for available
substrates, which is very important due to the high demand for the energy
required for nitrogen fixation (Falk et al. 1985).
Motility provides a survival advantage under a wide variety of
environments, allowing bacteria to respond to beneficial or negative conditions
and to compete successfully with other microorganisms. Azospirillum
brasilense possesses a polar flagellum in all culture conditions, and synthesizes
lateral flagella when growing on semisolid media (Hall, Krieg 1983). The flagella
of Azospirillum are one of the most complex and effective organelle for
locomotion, capable of propelling the bacterium through liquids (swimming)
and through viscous environments or over surfaces (swarming). Additionally,
these organelles play an important role in adhesion to substrates and biofilm
formation contributing to the interaction with the plant (Croes et al. 1993).
The bacterial colonization of at least part of the root system is required for
the favourable effects of Azospirillum inoculants when applied as biofertilizer
and phyto-stimulators (Okon, Vanderleyeden 1997).
Different varieties of strawberry are cultivated in diverse parts of the world,
including tropical, subtropical, and temperate areas. Besides its commercial
interest, this crop is of great social interest due to the high demand of workers
required for its production and processing at the field, packing, and industry
(Pedraza et al. 2007). The world production of strawberry is around three
million tons per year and it has increased in the last two decades. The annual
world production in 2007 was over 3.8 million metric tons, figure that is still
rising (FAO agricultural data: http://faostat.fao.org/faostat/). Argentina
produces strawberry during the 12 months of the year, being the province of
Tucumn one of the most important producers (Prez, Mazzone 2004).
Although this crop is frequently cultivated in soils with good natural fertility,
chemical fertilizers, mainly nitrogen, are applied at levels greater than 290
kg.ha-1.year-1 to improve fruit yields (Pedraza et al. 2007). The high rate of
application of fertilizers and pesticides have negative and unpredictable effects
in the environment, contributing to the contamination of soils, water, and
natural areas, casting serious risks to human and animal health. An attractive
alternative for the total or partial substitution of nitrogen fertilizers could be
the exploitation of PGPB, such as bacteria of the genus Azospirillum, capable
of affecting growth and yield of many plant species, several of agronomic and
ecological significance.
It was demonstrated the natural occurrence of A. brasilense colonizing
strawberry plants, including inner tissues of roots and stolons (Pedraza et al.
197
E. Baca
2007). The latter would provide an additional agronomic advantage,

considering the asexual propagation of strawberry plants in commercial
nurseries, by stolon fixation on the ground. Thus, if strawberry plants are
inoculated with Azospirillum strains selected by their PGPB characteristics,
the presence of this bacterium could be insured in their descendants.
From the results of inoculating strawberry plants with different strains of
A. brasilense, and considering that the best plant growth-promotion depends
on the interaction between specific genotypes of bacteria and plants (Pedraza
et al. 2010a), the use of this genus represents an interesting option for higher
agricultural production and significant ecological advantages. Therefore, in
this chapter it is considered the chemotaxis of A. brasilense towards root
exudates of strawberry plants and root colonization as a starting point for a
successful partnership between Azospirillum and strawberry plants.
Chemotaxis in Azospirillum
It has been demonstrated that A. brasilense polar flagellum rotates in both
clockwise and counterclockwise directions. The last one causes forward
movement of free-swimming cells, while the change in the direction of rotation
to clockwise produce a reversal in swimming direction. When Azospirillum cells
are exposed to malate, a strong attractant, some effects in swimming behaviour
are observed: suppression of direction change, the chemotaxis, and a long
term-increase in swimming speed as chemokinesis (Zhulin, Armitage 1993). In
fact, Azospirillum strains respond chemotactically to temporal gradient of some
effectors such as amino acids, sugars and organic acids, as well as to maize
mucilage. This behaviour is strain dependent, suggesting that a certain degree
of specificity exists in the establishment of plant-bacteria interaction (Reinhold
et al. 1985; Mandimba et al. 1986). The presence of oxidizable substrates
increased the number of attracted bacteria only 1.2 to 3-fold, a rather low ratio,
compared with other bacteria. Further work revealed that the attraction was to
oxygen gradient dissolved in water, and the exposure of the cells to an oxygen
gradient followed by aerotaxis, masked the chemotactic response of the bacteria
(Barak et al. 1982). Consequently, aerotaxis is an important response in A.
brasilense, which guide the bacterium to a preferred low oxygen concentration
for energy generation (3 to 5 M). Indeed, the proton motive force was lower at
oxygen concentrations that were higher or lower than the preferred oxygen
concentration. It was suggested for A. brasilense that reaching the optimal oxygen
concentration is relevant for energy generation and nitrogen fixation in the
rhizosphere (Zhulin et al. 1996). Recently, it was described a quimiotactic
cytoplasmic receptor noted as AerC, that was able to detect the redox status of
cell via the FAD cofactor associated to its PAS domains. The expression of AerC
as well as FAD content in cells were enhanced under nitrogen fixation conditions,
indicating a correlation between quimiotaxis and changes in redox homeostasis
necessary for nitrogen fixation (Xie et al. 2010).
198
There were described several ways to sense chemicals: chemotaxis usually

is referred as a metabolism-independent behaviour, while the use for energy
taxis denotes metabolism-dependent behaviour. Energy taxis is broadly
defined as a behavioural response to stimuli that affect cellular energy levels.
It includes responses directly linked to electron transport/energy generation,
such as aerotaxis, redotaxis and phototaxis (Taylor, Zhulin 1998). The most
important behaviour in A. brasilense is energy taxis and it was demonstrated
that certain compounds that are attractants for Azospirillum cells are also
metabolizable substrates, while their nonmetabolizable analogues are not
attractants. On the other hand, the inhibition of the metabolism of a chemical
attractant completely abolishes chemotaxis to this compound. Moreover, it
was observed a direct correlation between the efficiency of a chemical
compound as growth substrate and as chemoeffector (Alexandre et al. 2000).
Chemicals that interact directly as inhibitors of electron transport were
found to be strong repellents, and most important, a mutant lacking the
cytochrome ccb3-type terminal oxidase had significantly diminished chemotaxis
to all major attractants, but only under microaerobic conditions. When it was
assayed under fully aerobic conditions, where this respiratory system is not
functional, chemotactic responses in the mutant and wild-type strain were
identical. The results showed that the signal for chemotaxis toward major
attractants and repellents was originated within a functional electron transport
system in A. brasilense (Alexandre et al. 2000).
It was also demonstrated that by genetic complementation of a mutant
strain of A. brasilense, impaired in surface motility led to identification of the
gene chsA (chemotactic signaling protein) (Carreo-Lpez et al. 2009). The
deduced translation product, ChsA protein, contained a PAS sensory domain
and EAL active site domain. This latter has phosphodiesterase activity (PDE-
A) for the hydrolysis of c-di-GMP [cyclic-bis (3-5) dimeric GMP], a compound
known to function as a second messenger in different cellular processes
including motility, biofilm formation and cellular differentiation (Carreo-
Lpez et al. 2009). After cloning chsA, ChsA protein was expressed and purified
by affinity chromatography. ChsA activity in presence of bis-p-nitro phenyl-
phosphate was 0.59 M min-1 mg-1 protein, demonstrating that it displayed
phosphodiesterase activity. This suggested that ChsA is a component of the
signaling pathway controlling chemotaxis in Azospirillum, and that the redox
state of the cell is sensed through the PAS domain and directly coupled to the
transmitter EAL module, showing PDE-A activity (Carreo-Lpez et al. 2009;
Pedraza et al. 2010b).
Bacterial motility and chemotaxis in Azospirillum-plant

interaction
It was reported that certain strains of A. brasilense show positive chemotaxis
199
E. Baca
towards different attractants such as sugars, amino acids, organic acids

(Okon et al. 1980; Barak et al. 1982; Reinhold et al. 1985; Zhulin, Armitage
1992), as well as to root exudates (Heinrich, Hess 1985; Mandiambra et al.
1986; Okon et al. 1980; Bacilio-Jimnez et al. 2003; Pedraza et al 2010a). This
mobility is important as it allows bacterial access to a more suitable habitat
and become more competitive about other microorganisms in the soil.
In natural environments, soil moisture is a limiting factor in the migration
of A. brasilense to the roots (Bashan 1986). This suggests that the swimming
movement plays an important role in such environments. The ability of A.
brasilense to begin the root colonization of wheat was investigated with
different mutant strains (Vande Broek et al. 1998). Only non-flagellated and
non-chemostatic mutants showed a strong reduction in the ability for wheat
root colonization (Vande Broek et al. 1998).
Bashan and Holguin (1994) compared the inter-root movement of A.
brasilense wild-type and its isogenic non-motile strain, inoculated into the
root system of soybean and wheat seedlings, in presence of chemoattractants
and repellents. They found high differences between both strains; no
movement of A. brasilense Mot- - cells was detected. The inoculated A.
brasilense Mot-- remained at the seed inoculation and did not migrate with
the root tips, whereas the wild-type strain displayed a different pattern: Mot+
cells migrated several centimetres from inoculated to non-inoculated roots,
irrespectively of plants species. This indicate that motility and chemotaxis
are active processes involved in efficient colonization (Bashan, Holguin 1994)
By using the -galactosidase activity as a reporter system it was
demonstrated that only motility and chemotactic mutants of A. brasilense
Sp7 wild-type strain were affected in their capacity to initiate wheat root
colonization at the root hair zone (van Rhijn et al. 1990). Indeed, the -
galactosidase activity determined by qualitatively and quantitatively assays
from NM313 mutant strain (altered in chemotaxis to succinate and citrate),
and Sp7p90D84 strain (a non-flagellated mutant) (van Rhijn et al. 1990),
differed significantly from Sp7 wild-type strain in colonization to root wheat.
This also indicates that chemotactic movement is important in the initiation
of wheat root colonization (Vande-Broek et al. 1998).
In the rhizosphere, it may be advantageous to respond positively to any
compound that increases metabolic rates, such as organic acids and oxygen.
Low oxygen concentrations, typically in the rhizosphere, are seen to be one of
the main stimuli that attract bacteria to plant roots. Thus, aerotaxis in the
rhizosphere would be also expected to provide a real advantage to bacteria
when searching for nutrients and in competition with other microorganisms
(Barak et al. 1982; Zhulin, Armitage 1993).
Chemotaxis of A. brasilense towards strawberry root exudates

The positive chemotactic response of different strains of A. brasilense
200
towards root exudates of three cultivars of strawberry plants (Milsei, Selva,

Camarosa) was visualized by halo formation on culture medium surface
(Pedraza et al. 2010a). Results showed that the main effects of the factor
variety (p < 0.01) and the dilution factor (p < 0.05) were statistically significant,
as well as the interaction between bacterial strain and strawberry variety (p
< 0.05), indicating that the chemotactic response of the strain depended on
the variety of the plant.
Also, the effect of time in collecting root exudates from different
strawberry varieties in the chemotactic response of different strains of
Azospirillum brasilense was assessed (Pedraza et al. 2010a). In all cases, it
was observed higher number of positive responses to root exudates collected
at 7 and 14 days of plant growth. Furthermore, endophytic strains, isolated
from sterile roots, showed higher chemotactic response with halo formation
areas greater than 200 mm2. A low chemotactic activity was observed in
strains isolated from the rhizosphere and the first stolon of strawberry plants,
which showed in all cases halos surfaces minor to 200 mm 2. The best
chemotactic response was obtained with strain A. brasilense REC3, which
showed halos greater than 200 mm2 for root exudates taken at 7 and 14
days of plant growth, from variety Camarosa. The strain RLC3 showed halos
formation with surfaces smaller than 200 mm2, being the one with less
chemotactic response towards the root exudates of the three strawberry
varieties collected at different times (Pedraza et al. 2010a).
From the results obtained in testing agarose-plates (Pedraza et al.
2010a), three bacterial strains were chosen to quantify the chemotactic
response by capillary method and determine the Rchem (chemotaxis index)
of them: REC3 as the strain of higher chemotactic response, RLC3 as the
lowest response, and Sp7 as control. The quantification of the chemotactic
effect was performed by using the capillary method according to Guocheng
and Cooney (1993). The strain REC3 showed the highest chemotactic
activity with exudates from the three varieties of plants taken after 7 days
of growth. The highest values were obtained with the variety Camarosa
(11.98 2.39), followed by the variety Milsei (6.33 0.59) and Selva
(3.11 0.45). These results agree with those obtained by the plate method.
The minimum value obtained for this strain was 1.47 with exudates of the
variety Selva taken at 28 days.
The results determined by the capillary method confirmed that the
chemotactic activity depends on the bacterial strain, plant variety, and
time of collection of the exudates (Pedraza et al. 2010a). Although the
chemotactic response towards strawberry root exudates was performed
through two approaches: the method of plates and the quantitative
method of capillaries, similar results were obtained in both cases (Pedraza
et al. 2010a).
To explain the chemotactic behaviour previously observed, total sugars
and proteins content of root exudates were determined (Pedraza et al. 2010a).
201
E. Baca
The higher amount of sugars was detected in root exudates obtained at 7 days
of plant growing of the three varieties (Milsei, Selva, Camarosa), then, a
decrease of them was observed at 14 and 28 days. The amount of total
sugars varied among plant varieties, being Milsei the highest producer at
7, 14 and 28 days as compared with Camarosa and Selva. The maximum
concentration of sugar (0.0806 mg.ml-1) was found in root exudates of the
variety Milsei taken at 7 days of plant growth, followed by exudates from
the variety Selva (0.0629 mg.ml-1), taken in the same period, and finally in
the variety Camarosa (0.0466 mg.ml -1). The minimum value of sugar
concentration (0.0219 mg.ml-1) was determined in root exudates taken at
28 days from variety Camarosa. The variety Selva showed its lowest
concentration (0.0245 mg.ml-1) in exudates obtained at 14 days and in the
variety Milsei the lowest value (0.0358 mg.ml-1) was detected at 28 days of
plant growth. The decrease in total sugar concentration determined in
hydroponic culture after the second week, probably was caused by two
potential mechanisms: the accumulation of high levels of organic substances
in the vicinity of the roots that suppressed the release of additional organic
compounds (Jones, Darrah 1993; Prikryl, Vankura 1980), and the re-
absorption of organic compounds by the plant (Guckert et al. 1991; Jones,
Darrah, 1993).
In contrast, protein concentration of the root exudates was only detected
after 14 and 28 days of plant growth. At 28 days, in Camarosa it was
determined the maximum value (0.030 mg.ml-1), followed by the variety
Milsei (0.024 mg.ml-1) and finally the variety Selva with a concentration of
0.019 mg.ml-1. The minimum detected value was 0.018 mg.ml-1 in the variety
Selva, then Milsei with 0.024 mg.ml-1 and finally Camarosa (0.025 mg.ml-
1
), all determined at 14 days of plant growth.
Colonization of strawberry plants by A. brasilense

Azospirillum spp. are generally referred to as rhizosphere bacteria,
displaying strain-specific differences concerning root colonization. They
colonize mainly the root surface; however, some strains are able to colonize
plant internal tissues as endophytic bacteria that invade tissues of living
plants showing no external sign of infection or negative effect on the host
(Steenhoudt, Vanderleyden 2000; Schulz, Boyle 2006). Ultrastructural
studies of Azospirillum localization on roots surface revealed that it can be
found all along inoculated root systems (Okon, Vanderleyden 1997), but
they are concentrated on the elongation zone, root hairs (Levanony et al.
1989; Bashan, Levanony 1989a; Bashan et al. 1986), root tips (Bashan,
Levanony 1989b), the base of root hairs (Katpulnik et al. 1985) and in few
cases on root hair tips (Bashan, Levanony 1989a). The attachment of
Azospirillum to the plant roots is essential for efficient association with
202
the host plant; although much evidence indicates that extracellular

polysaccharides and proteins are involved in the root attachment process,
the precise mechanism of colonization remains unclear (Vanbleu,
Vanderleyden 2003).
The endophytic and rhizosphere colonization of strawberry roots by
Azospirillum brasilense was studied by using fluorescence microscopy and
scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM) (Guerrero-
Molina et al. 2010a). With this purpose, the wild type (wt) strain of A.
brasilense REC3 (BR12242) was used to inoculate plants for SEM and TEM
analysis. For fluorescence microscopy studies, the plants were inoculated
with the same strain tagged with the broad-host-range vector pHRGFPTC
expressing green fluorescent protein (gfp) gene constitutively from the pgen
promoter. The plasmid was transformed into Escherichia coli DH10B and
then mobilized into A. brasilense REC3 strain by triparental matting using E.
coli pRK2013 as helper. Strawberry in vitro plants var. Camarosa and Selva
were aseptically grown on test tubes containing 20 ml 50% Hoagland solution
(Hoagland 1975) and they were independently inoculated with 1 ml of
bacterial suspension (about 106 CFUml-1) containing wt REC3 or REC3::gfp
strains (Guerrero-Molina et al. 2010a).
SEM observations of inoculated strawberry roots showed bacteria firmly
attached to the root surface by a network of fibrillar-like material (Fig. 1a)
produced by bacterial cells as it can also be observed over Azospirillum pure
colony cells (Fig. 2). According to Vanbleu and Vanderleyden (2003), the fibrillar
network allows the bacteria to anchor to roots for better access to plant
exudates, and reciprocally, allows the plant to reach substances excreted by
the bacteria before consumption by other bacteria. Additionally, it provides
resistance against external physical forces applied to the root, such as washing
and agitation (Bashan et al. 1991). The fibrillar-like connections observed over
A. brasilense REC3 and PEC5 (Winik et al. 2009; Guerrero-Molina et al. 2010a)
were similar to those exhibited by A. brasilense Cd adsorbed to wheat roots
(Bashan et al. 1986), grass roots (Umali-Garcia et al. 1980) and sand particles
(Bashan et al. 1991). Although this material was demonstrated to participate
in the attachment of bacterial cells to biotic and abiotic surfaces, its chemical
composition is still discussed. Numerous studies affirm that proteinaceous
compounds may be involved in A. brasilense aggregation (Madi, Henis 1989;
Burdman et al. 1999), bacterial binding to roots (Bashan, Levanony 1988;
Michiels et al. 1991) and sand particles (Bashan et al. 1991). Likewise, many
authors affirm the involvement of extracellular polysaccharides in the
attachment process to roots (Michiels et al. 1991; Burdman et al. 1998). Besides
the fibrillar-like connections, bacterial cells were also found associated with
granular-like material accumulated on the root surface of strawberry plants
(Fig.1b); these may probably correspond to rhizodepositions that participate
in the bacteria-plant association (Winik et al. 2009; Guerrero-Molina et al.
203
E. Baca
Figura 1 (a, b): SEM of A. brasilense REC3 attached to the surface of

strawberry roots; arrows indicate the fibrillar-like F and granular-like
G material over the root surface.
Figura 2: (a) Single pure A.brasilense colony grown on NFb solid medium
observed by TEM. (b) Enlargement of framed area in (a) showing the fibrillar-
like material on top of bacterial cells.
2010a). Considering that strawberry plants are asexually reproduced at

nursery by fixing stolons into the soil, the translocation of Azospirillum through
stolons from inoculated mother-plants to uninoculated new-born daughter
plants represents an important agronomic advantage. According to this latter
only one inoculation would allow the producers to have many plant
generations already inoculated with selected bacteria, thus, these plants would
have better conditions to be placed at field.
A.brasilense REC3 showed three patterns of bacterial cell adsorption to
strawberry root surfaces: single-cells randomly dispersed along the root, small
bacterial aggregates and biofilm formation (Fig. 3) (Winik et al. 2009; Guerrero-
Molina et al. 2010a). These different adsorption patterns, observed by SEM, are
probably common features of this genus as they have been previously described
(Levanony, Bashan 1991; Levanony et al. 1989; Bashan et al. 1986; Umali-Garcia
et al. 1980). Also, the random and non polar orientation of A. brasilense cells
over the root surface has been observed by other authors (Levanony et al. 1989;
Bashan et al. 1991; Umali-Garcia et al. 1980).
204
Figura 3: Scanning electron micrographs of strawberry roots colonized

by A. brasilense. (a) roots without associated bacteria; (b) bacteria as
single cells on the root surface; (c) small bacterial aggregates; (d) A.
brasilense biofilm.
To confirm the endophytic root colonization by this strain, fluorescence

microscopy and TEM were carried out. Fig. 4a shows Azospirillum colonization
of inner tissues of strawberry roots observed by TEM, in comparison to
uninoculated roots without associated bacteria (Fig 4b). Besides confirming the
endophytic colonization, fluorescence microscopy allowed the localization of
A. brasilense in intercellular spaces of the cortex (Guerrero-Molina et al. 2010a).
Figura 4: (a) Transmission electron micrographs of bacteria colonizing

inner tissues of strawberry roots (x18,700); (b) root without associated
bacteria(x33,300).
205
E. Baca
Considering that strawberry plants are asexually reproduced at nursery

by fixing stolons into the soil, the translocation of Azospirillum through stolons
from inoculated mother-plants to uninoculated new-born daughter plants
represents an important agronomic advantage. According to this latter only
one inoculation would allow the producers to have many plant generations
already inoculated with selected bacteria, thus, these plants would have better
conditions to be placed at field.
The endophytic translocation of Azospirillum brasilense through strawberry
stolons was studied by microbiological, ultraestructural and molecular methods
(Guerrero-Molina et al. 2010b). Three commercial cultivars of strawberry
(Camarosa,Milsei,Selva) were inoculated with two strains of A. brasilense,
REC3 and PEC5, isolated from sterilized roots and stolons of strawberry plants
respectively (Pedraza et al. 2007).
Microbiological studies demonstrated that it was possible to re-isolate A.
brasilense REC3 and PEC5 from roots and stolons of all inoculated mother-plants
and non-inoculated daughter-plants. In all cases, most probable number (MPN)
values of Azospirillum isolated from roots were higher than values obtained
from stolons. The MPN determinations ranged from 1.5103 bacteriag-1 to 4.5106
bacteriag-1 for fresh root samples and from 1.1101 bacteriag-1 to 4.5104 bacteria
g-1 for fresh stolon samples (Guerrero-Molina et al. 2010b). This demonstrates
that roots are the most advantageous ecological niche for the development of
these bacterial strains (Guerrero-Molina et al. 2010b).
Electron microscopy observations of colonized strawberry stolons showed clear
attachment of A. brasilense to the stolon inner tissues. SEM also revealed
Azospirillum cells gathered on groups and enclosed with a condensed capsular
material in the vascular vessels area (Fig. 5). Similar ultrastructural characteristics
were observed in pure colonies grown on NFb solid medium (Fig. 2b). The presence
of A. brasilense inside stolons and its isolation from uninoculated daughter-plant
roots confirmed the translocation of the bacteria throughout stolons from
inoculated mother plants to the new-born plants (Guerrero-Molina et al. 2010b).
Figura 5: (a) SEM of bacteria colonizing inner structures of strawberry stolon; note
bacterial cells gathered on groups in the stolon vascular zone; (b) stolon of
strawberry plants without bacterial inoculation.
206
The preferential bacterial colonization of roots can be explained

considering that the root area is filled with nutrients and has adequate
microaerobic conditions for biological nitrogen fixation (Steehnoudt,
Vanderleyden 2000). Conversely, the low stolon colonization (expressed as
low MPN and few associated bacteria observed in their inner structures) and
the condensed capsular material showed by A. brasilense inside the stolons,
could reflect an ecological adaptation of A. brasilense strains to an
unfavourable environment. Therefore, Guerrero-Molina et al. (2010b) stated
that A. brasilense uses strawberry stolons only as a path in its way to colonize
the roots of a new-born daughter plant.
Additionally, the presence of the bacteria within strawberry plant tissues
was also demonstrated by molecular results as a 710 bp fragment of the gene
nifD of the nitrogenase enzyme, essential for the biological N2-fixing process,
was amplified by PCR from DNA samples of stolons and roots colonized by A.
brasilense (Guerrero-Molina et al. 2010b).
Conclusions
Root exudates from different varieties of strawberry plants can produce
positive chemotaxis of different strains of A. brasilense. This effect was greater
with endophytic strains than with those that colonize the root surface. Similar
results were observed by Bacilio-Jimnez et al. (2003) about the chemostatic
response of endophytic and rhizosphere bacteria toward root exudates in rice.
In the case of strawberry, the chemotactic behaviour of different strains
of A. brasilense towards strawberry root exudates depends on the plant variety,
where the best chemostactic response was obtained with exudates of the
variety Camarosa. However, differences in responses may be due to the origin
of the bacterial strains (rhizosphere or endophytic). Furthermore, the specificity
of strains probably reflects the adaptation of the bacterium to the nutritional
conditions provided by the plant and can, thus, play an important role in the
establishment of Azospirillum in the rhizosphere of the host, as previously
indicated by Reinhold et al. (1985).
The concentration of strawberry root exudates can affect chemotactic
response, as the best response was observed when using a low concentration.
This agrees with other studies regarding the ability of Azospirillum to detect
potential sources of nutrients at lower concentrations than other soil
microorganisms, favouring its survival in natural environments (Chet, Mitchell
1976; Roszak, Colwell 1987). In addition, the time elapsed in the root exudates
production has effects on chemotaxis as a major chemotactic response was
observed towards the exudates produced within the first two weeks of plant
growth.
Root exudates obtained from strawberry plants cultured in hydroponic
conditions showed a decreased concentration of carbohydrates with the
207
E. Baca
production time, and an increase in protein concentration. This would indicate

that probably the sugar residues have a greater attractive effect than protein,
at least in the early stages of this partnership.
SEM observations of inoculated strawberry roots demonstrated colonizing
bacteria firmly attached to the root surface by a network of fibrillar-like
material, and also associated with granular-like material accumulated on
the root surface. Bacterial cells were observed by SEM on the root surfaces as
single-cells randomly dispersed along the root, small bacterial aggregates
and biofilm formation.
Fluorescence microscopy and TEM revealed the colonization of strawberry
inner root tissues by A. brasilense, being located in intercellular spaces of the
cortex. Besides, SEM observations showed bacterial colonization of stolon
inner tissues. A. brasilense was reisolated from inoculated strawberry mother-
plants, uninoculated daughters and stolons. In all cases, the MPN from root
samples was higher than from stolons, indicating that the effective colonization
of the root system leads towards bacterial translocation throughout stolons.
In addition, a 710 bp fragment of the bacterial nifD gene was PCR-amplified
using DNA from roots and stolons, confirming the presence of the inoculated
bacteria within these tissues.
By assessing the chemotactic activity of different strains of A. brasilense
and by microscopy methods it was possible to observe the affinity of certain
genotype in the association Azospirillum-strawberry plants. Considering that
A. brasilense posses biotechnological application, addressing to a sustainable
agriculture, the determination or the screening of the chemotactic activity of
different strains towards root exudates may represent an initial step in
selecting them for use as inoculants in different crops.
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213
214
Captulo 12
Etileno como mediador de los mecanismos
directos e indirectos de la promocin del
crecimiento vegetal ejercido por rizobacterias
Ethylene as a mediator of direct and indirect
mechanisms carried out by plant growth promoting
rhizobacteria
Claudia M. Ribaudo1, Daniela S. Riva1, Jos A. Cur1, Clara Ponds2,
Antonio Granell-Richart2, Mara L. Cantore1
1
Ctedra de Bioqumica, Facultad de Agronoma, UBA. Av San Martn 4453. DSE1417. C.A.B.A.
2
Instituto de Biologa Molecular y Celular de Plantas, CSIC, Valencia, Espaa.
Introduccin
Bacterias promotoras del crecimiento vegetal
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) son un grupo de
bacterias que interactan con las plantas favoreciendo su crecimiento y/o
controlando los fitopatgenos que puedan infectarlas aumentando as la
productividad vegetal. El grupo ms estudiado son las rizobacterias promotoras
del crecimiento de plantas (PGPRs). Entre los microorganismos con actividad
PGPR ms conocidos se encuentran especies de los gneros Rhizobium,
Pseudomonas y Azospirillum (Glick 1995). Los mecanismos que utilizan estas
bacterias para promover el crecimiento de las plantas son numerosos y
variados, y no solo difieren de un microorganismo a otro sino que tambin
pueden diferir de una cepa a otra. A diferencia de Rhizobium, donde la principal
contribucin de la bacteria al crecimiento de la planta parece ser la fijacin de
nitrgeno por la bacteria, las PGPRs de vida libre probablemente no cuentan
con un solo mecanismo para promover el crecimiento de la planta. Se postula
que en la mayora de los casos opera ms de un mecanismo, y que los efectos
en las plantas tratadas son aditivos (Bashan, Dubrovsky 1996). Los mecanismos
directos de la promocin del crecimiento son los que se encuentran en juego
cuando los metabolitos producidos por algunas cepas son utilizados como
reguladores de crecimiento o precursores de stos por parte de la planta. Son
ejemplos de estos mecanismos la fijacin biolgica de nitrgeno por Azospirillum
en asociacin con plantas de maz y de trigo (Ribaudo et al. 2001); asimilacin
215
Claudia M. Ribaudo, Daniela S. Riva, Jos A. Cur, Lic.Clara Ponds, Lic.Antonio Granell-Richart y Mara L. Cantore
de nitratos (Garca de Salamone, Dbereiner 1996; Ribaudo et al. 1998);

produccin de hormonas y solubilizacin de fosfatos (Shoebitz, Ribaudo et al.
2009; Nico et al. 2012). Los mecanismos indirectos son los utilizados por las
PGPR con capacidad de control biolgico que evitan el dao que los
fitopatgenos ocasionan en las plantas; los mecanismos de control biolgico
son variados por ejemplo competencia con el patgeno, secrecin de
siderforos, (Glick et al. 1999) y sntesis de antibiticos (Raaijmakers et al.
2002) e induccin de una respuesta sistmica en la planta (ISR), en la cual no
se evidencian daos sobre la planta y que resulta en una inmunizacin contra
el ataque de patgenos. El mecanismo bioqumico que media a ISR se describe
en detalle ms adelante.
Mecanismos directos de la promocin del crecimiento vegetal

ejercido por las PGPRs
Entre los mecanismos directos de accin ejercidos por las PGPRs, se
encuentra la sntesis de hormonas que resultan reguladores del crecimiento
vegetal. Tien et al. (1979) sugirieron que un aumento en los niveles de las
fitohormonas podra ser responsable del mejor crecimiento de la raz y de la
parte area de las plantas ya que los efectos de la inoculacin son similares a
los que se observan cuando las plantas son tratadas con fitohormonas. El
mecanismo de la produccin de auxinas es el ms estudiado especialmente el
del cido indol actico (AIA) (Jain, Patriquin 1985). El AIA producido por las
bacterias puede modificar el contenido endgeno de AIA de la planta y este a
su vez incrementar el contenido de ET (Glick et al. 1999). En cultivos de
Azospirillum, adems de AIA se han encontrado otros compuestos indlicos y
metabolitos que an no han sido identificados (Perrig et al. 2007). Se ha
demostrado que A. lipoferum Op33 es capaz de metabolizar formas inactivas
de giberelinas a sus formas con actividad biolgica, por ejemplo GA20 a GA1 y
GA9 a GA3, confirmando la capacidad del microorganismo para aumentar en
la planta el pool endgeno de formas activas de GAs por la eliminacin de
glucosa a partir de conjugados sin actividad biolgica (Piccoli et al. 1998).
Bottini et al. (2004) demostraron que A. lipoferum tiene adems la capacidad de
producir giberelinas (GAs, GA1, GA3 e iso-GA3) en medio de cultivo qumicamente
definido. Estos resultados permitiran suponer que la promocin del crecimiento
de plantas inoculadas con Azospirillum se debera, al menos en parte, a la
capacidad bacteriana de metabolizar precursores inactivos de GAs a sus formas
activas. Por otro lado Perrig et al. 2007 demostraron en medios de cultivo
definidos que A. brasilense AZ39 y A. brasilense Cd son capaces de sintetizar ET
y que esta sntesis es dependiente de la concentracin de metionina en el
medio. Es posible entonces que la promocin del crecimiento de la raz estuviera
afectado positivamente por el nivel de ET endgeno, al cual contribuyen el ET
sintetizado por la bacteria y el producido por la misma planta.
216
Etileno como mediador de los mecanismos directos e indirectos de la promocin
del crecimiento vegetal ejercido por rizobacterias
Biosntesis y degradacin del etileno en plantas

El ET es una hormona vegetal difusible que tiene un rol sumamente
importante en la integracin entre los eventos metablicos y del desarrollo y
los estmulos externos. El ET est involucrado en procesos muy diversos en el
desarrollo de las plantas tales como germinacin de las semillas, desarrollo de
pelos radiculares, nodulacin de la raz, maduracin de los frutos, absicin y
senescencia. Tambin es un importante mediador en la respuesta a distintos
tipos de estrs tanto biticos (por ejemplo ataque por patgenos) como
abiticos (como dao, hipoxia, fro, sequa). A nivel gnico, en respuesta a los
estmulos mencionados, el ET induce la transcripcin de un gran nmero de
genes.
En las plantas superiores el ET es sintetizado a partir de metionina va los
intermediarios S-adenosil-L-metionina (SAM), y cido 1-aminociclopropano-
1-carboxlico (ACC). Las enzimas involucradas secuencialmente en el proceso
son SAM sintetasa, ACC sintasa (ACS) y ACC oxidasa.
La ACS es una enzima citoslica, exclusiva de plantas superiores, que est
presente en concentraciones extremadamente bajas en los tejidos vegetales
y que regula el paso limitante de la sntesis del ET. Actualmente estn clonadas
ACSs de una gran variedad de especies vegetales como tomate, manzana y
Arabidopsis lo que ha permitido establecer que los genes que codifican para
esta enzima pertenecen a familias multignicas (Jonson, Ecker 1998). Los
miembros de las familias multignicas de la ACS se expresan diferencialmente
en respuesta al desarrollo, a factores ambientales y a hormonas. En el caso
de tomate se ha visto que la expresin de una determinada isoforma aumenta
en la maduracin del fruto, otra en respuesta al dao y una tercera en respuesta
a auxinas (Kende, Zeevart 1997). La ACS est regulada tanto a nivel
transcripcional como postraduccional. En tomate la fosforilacin/
defosforilacin de la ACS2 regula su recambio aguas arriba del sendero de
degradacin va ubiquitina. Se ha demostrado que esta isoforma se estabiliza
por fosforilacin y se degrada despus de la defosforilacin. Se vio que la
cantidad de LeACS2 es afectada por inhibidores de quinasas y fosfatasas y
afecta significativamente la actividad celular de la ACS, el contenido de ACC y
la produccin de ET en frutos de tomate, sugiriendo que la regulacin
postraduccional por fosforilacin juega un rol importante en el control de la
produccin de ET (Kamiyoshihara et al. 2010).
La ACC oxidasa cataliza la ltima etapa de la biosntesis de ET, requiere O2,
Fe 2+ y ascorbato como cofactores dando como producto ET. Se expresa
constitutivamente a bajos niveles en la mayora de los tejidos vegetales y su
actividad aumenta durante la maduracin del fruto, la senescencia floral, el
dao mecnico y la presencia de efectores fngicos (Wang, Woodson 1992;
Fluhr, Mattoo 1996). Tambin se ha encontrado aumento de la actividad de
ACC oxidasa en respuesta a ACC y a hormonas como auxinas (y el mismo ET)
(Kende 1993). As, el tratamiento de los tejidos con ET estimula la actividad
217
ACC oxidasa a travs de un feedback positivo: la induccin de ACC sintasa

por ET lleva a la produccin de ACC que a su vez estimula la ACC oxidasa
constitutiva del tejido y produce ms ET. El aumento de la actividad est
asociado a regulacin de la transcripcin de la enzima (Fluhr, Mattoo 1996).
La ACC deaminasa degrada el ACC a amonio y -cetobutirato. Es una enzima
citoplasmtica, trimrica, exclusiva de microorganismos y ha sido detectada
en un gran nmero de cepas bacterianas, principalmente Pseudomonas spp,
aisladas de suelo, muchas de las cuales tienen la capacidad de promover el
crecimiento vegetal (Glick et al. 1995). Esta actividad enzimtica les permite
a estas bacterias utilizar el ACC como fuente de nitrgeno en medio mnimo.
Actualmente estn clonados los genes de ACC deaminasa de un gran nmero
de especies de Pseudomonas y Enterobacter. Del estudio de la relacin existente
entre la presencia de actividad ACC deaminasa en las bacterias promotoras
del crecimiento vegetal y del efecto inhibitorio del ET sobre este, se ha
propuesto un posible rol de la enzima en el mecanismo de interaccin PGPR/
planta. La capacidad de promover el crecimiento vegetal de las cepas con
actividad de ACC deaminasa se manifiesta, por ejemplo, en el aumento de la
elongacin de las races en plantas sensibles al ET inoculadas con estas
bacterias (Shah et al. 1997); este efecto es comparable al logrado utilizando
el inhibidor de la ACC sintasa aminoetoxivinilglicina (AVG) (Hall et al. 1996).
Por otro lado, las cepas mutantes defectivas en ACC deaminasa pierden su
capacidad promotora de la elongacin de las races (Glick et al. 1994).
Asimismo, el contenido de ACC en las races provenientes de plantas tratadas
con la PGPR P. putida es menor que en las semillas no tratadas y no vara
cuando se utiliza una mutante defectiva en ACC deaminasa (Glick et al. 1995).
Estas observaciones permitieron proponer un modelo que explicara de qu
manera las PGPRs podran disminuir los niveles de ET en las plantas
promoviendo as su crecimiento (Glick et al. 1999). Segn este modelo, la
bacteria se une a la superficie de la semilla o de la raz de la planta y en
respuesta a triptofano y otros exudados de la planta, sintetiza y excreta AIA
que es tomado en parte por la planta. Este AIA, junto con el endgeno generado
en la misma planta puede estimular la proliferacin y la elongacin celular
e inducir la actividad de ACC sintasa para convertir SAM en ACC y finalmente
en ET. Se postula que parte del AIA es exudado junto con otras molculas y
podra ser incorporado por la bacteria cuya actividad ACC deaminasa lo
degrada a amonio y -cetobutirato promoviendo el aumento de la liberacin
de AIA por la planta y en consecuencia disminuyendo su concentracin interna
y la induccin de la sntesis de ET. Dado que la regulacin de los niveles de ET
es de suma importancia en muchos cultivos para regular la maduracin de
los frutos y prevenir los efectos deletreos en vegetales y flores, la
manipulacin de los niveles de ACC deaminasa es una herramienta
potencialmente importante para este fin. De hecho, la enzima ha sido utilizada
para obtener plantas de tomate transgnicas que muestran una fase de
maduracin ms prolongada y un menor nivel de ET desencadenado por la
infeccin por patgenos (van Loon et al. 2006).
218
Percepcin del etileno y sealizacin

Despus de su sntesis el ET es percibido por receptores especficos y se
gatilla un sendero de transduccin que finalmente desencadena respuestas
biolgicas especficas. Si bien la mayora de los componentes de este sendero
han sido identificados y su funcin estudiada en Arabidopsis, la estructura
bsica del sendero de sealizacin parece ser universal en otras plantas aunque
puede variar el nmero de componentes del sendero de una especie a otra. El
ET es censado por una familia de receptores unidos a la membrana del retculo
endoplsmico que presentan similitud de secuencia con los sistemas
bacterianos de dos componentes con actividad de histidina quinasa
involucrados en la deteccin de cambios ambientales. La Figura 1 muestra un
esquema resumido del sendero de transduccin que media la seal de ET en
Arabidopsis. El ET se une a una regin hidrofbica del dominio N terminal de
los receptores, localizada dentro del retculo endoplasmtico, y requiere la
presencia de Cu 2+ . En Arabidopsis existen cinco de estos receptores,
denominados ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 y EIN4, que se clasifican en dos familias,
I y II, dependiendo de la presencia o ausencia del dominio cannico de histidina
quinasa. La ausencia de fenotipos para las distintas mutantes deficientes en
uno solo de estos genes sugiere que pese a las diferencias estructurales, son
funcionalmente redundantes. De los resultados de estudios bioqumicos y
genticos se concluy que el mecanismo de transduccin mediado por ET
sigue el modelo del agonista inverso, es decir en ausencia de ET el receptor es
constitutivamente activo en la transduccin y cuando el ET se une al receptor
estos son inactivados. Los receptores actan como reguladores negativos a
travs de CTR1 que codifica una Raf-like MAPKKK. Estudios genticos y de co-
localizacin sugieren que CTR1 es parte del complejo de receptores y que
media la sealizacin convergente de varios receptores que activan su actividad
quinasa de protenas en ausencia de ET. En respuesta a ET es probable que
CTR1 sea inactivado por un cambio conformacional. La protena EIN2 regula,
por un mecanismo an no conocido, la disponibilidad del factor de transcripcin
clave del sendero EIN3. Otras dos protenas con actividades redundantes EBF1
y EBF2 se unen a EIN3 activando permanentemente su degradacin a travs
del proteasoma S26. En respuesta al ET, EIN3 se estabiliza y se acumula en el
ncleo activando la transcripcin primaria: EIN3 y una protena homloga EIL1,
activan la transcripcin del factor de transcripcin que responde a ET (ERF1) y
de otros genes de respuesta primaria que contienen los sitios de unin de
EIN3 en sus promotores. ERF1 y factores de transcripcin relacionados con
actividad de unin a boxes GCC inducen la expresin de los genes de respuesta
secundaria en la cascada de transcripcin del ET. Estos productos gnicos estn
involucrados en la resistencia, defensa y crecimiento de la planta como las
protenas de la patognesis (PRs). Es notable que la expresin de ERS1, ERS2 y
ETR2 aumentan en respuesta al ET. Los receptores recin sintetizados que no
han interactuado an con la hormona podran suprimir la seal del ET y
disminuir o anular la respuesta hormonal como una forma de mecanismo de
219
retroinhibicin. El regulador gnico EIN5 (EIN7, XRN4, AIN1) es una 5-

3exorribonucleasa que podra modular el metabolismo del RNAm de EBF1, 2.
Si bien se han identificado un gran nmero de componentes del sendero de
sealizacin del ET, no est claro de qu manera se conectan los complejos
receptor-CTR1 con los factores de transcripcin nucleares EIN3 y EIL1. Se han
identificado recientemente dos quinasas MPKK9 (MAPKquinasa 9) y MPK3
(MAPK3) activadas por ET en la mutante CTR1 que podran constituir una
segunda cascada de MAPK actuando positivamente en la sealizacin aguas
debajo de CTR1. Solamente cuando la activacin de la cascada MPKK9-MPK3
y 6 es simultnea con la inactivacin de CTR1, el sendero del ET puede ejecutarse
correctamente. Actualmente existe un cmulo de informacin que indica que
los componentes del sendero de sealizacin por ET descripto en Arabidopsis
se encuentran altamente conservados en otras plantas como ser tomate (Yoo
et al. 2009.)
Figura 1: Esquema del sendero de transduccin que media la seal del ET.
Modificado de Yoo et al. 2009, Trends in Plant Science 14: 270-279.
EIN3 se une al promotor del factor de transcripcin inducible ERF1 que

pertenece a la familia de genes EREBPs (por Ethylene Response Binding Proteins).
Experimentos de sobre expresin sugieren que ERF1 participa en la regulacin
de una serie de genes que se expresan en respuesta a ET y JA.
Rol del etileno en la promocin del crecimiento de plantas

inoculadas con Azospirillum
Los mecanismos bioqumicos que median la respuesta de las plantas de
220
arroz a tres especies bacterianas de las que por las cuales se conoce su
capacidad promotora del crecimiento de plantas de maz y arroz fue asignada
fundamentalmente a la capacidad que las PGPRs poseen de fijar el nitrgeno
atmosfrico (FBN) y hacerlo disponible para los cultivos (Ribaudo et al. 2000;
Ribaudo et al. 2001; Cur et al. 2005; Ribaudo et al. 2006 a, Curzi et al. 2008).
Sin embargo no es el nico mecanismo ejercido por las mismas. El efecto
hormonal ejercido por las bacterias como se describi anteriormente se
debe a la accin de AIA, GAs, ABA, y ET entre otras. Como ya se mencion, el ET
tiene un rol preponderante como mediador y coordinador de las seales
internas y externas que modulan la dinmica del crecimiento y los programas
de desarrollo en las plantas (Santner, Estelle 2009). Tambin juega un papel
importante en la sealizacin que media algunas interacciones planta/bacteria
como la formacin de ndulos en la simbiosis rizobio/leguminosa (Penmetsa,
Cook 1997) y en el modelo de estudio Arabidopsis Pseudomonas sp., o en la
defensa frente a patgenos. Partiendo de la base de que gran parte del control
de los eventos mediados por una hormona ocurre a nivel de su sntesis la
medicin de la cantidad de ET producida por las plantas en respuesta a la
inoculacin es un buen parmetro del efecto ejercido por estas sobre los
cultivos. A. irakense, A. brasilense y Herbaspirillum seropedicae resultan en el
establecimiento de una relacin beneficiosa para las plntulas de arroz. Estas
PGPRs promueven muy tempranamente un aumento en los niveles de ET,
que se hace francamente evidente a las 24 h, se mantiene hasta las 72 h
despus de la inoculacin y luego disminuye (Ribaudo et al.,2000). Como era
esperable esta respuesta no fue igual en las tres asociaciones estudiadas. En
el caso de A. irakense los resultados fueron concluyentes ya que solo las
mediciones de 24 horas indicaron diferencias estadsticamente significativas.
En cambio la inoculacin con A. brasilense result en los mayores incrementos
significativos a las 48 y 72 horas (entre 4 y 5 veces) seguido de H. seropedicae.
Este aumento en el nivel de la hormona coincidi con un aumento en la
actividad y en la expresin de ACS (Curzi et al., 2008). La familia ACS en arroz
comprende a seis miembros OsACS1-6 cuya regulacin transcripcional depende
de varios factores ambientales, tales como la hipoxia o de los niveles de
hormonas, por ejemplo OsACS1 y OsACS3, cuyos mensajeros son inducidos
por hipoxia y por anaerobiosis en tejido areo y en races respectivamente.
OsACS1, OsACS3 y OsACS2 son inducidos por auxinas y este aumento se
acompaa por un aumento en la liberacin de ET. Los aumentos registrados
en la expresin de OsACS en plantas de arroz inoculadas con H. seropedicae y
A. brasilense indican, en ambos casos, un aumento de entre 50 y 60% en la
cantidad de mensajero para OsACS1. La amplificacin con los cebadores para
OsACS3 no indicaron diferencia en la expresin de este gen (Ribaudo,
comunicacin personal).
Tomados en conjunto los resultados de expresin (tanto a nivel de protena
como de mensajero de ACS) los de actividad enzimtica y los de niveles de ET
sugieren fuertemente que la inoculacin con H. seropedicae y A. brasilense
promueve una activacin del sendero biosinttico de la hormona en la planta
221
de arroz. En consecuencia podra pensarse como hiptesis que el ET tiene

algn rol mediador en el mecanismo promotor del crecimiento de estas PGPRs
sobre arroz, tal como se ha demostrado en otras asociaciones PGPRs/husped
(Baldani et al. 2000).
De acuerdo a nuestras mediciones las concentraciones de ET en las plantas
inoculadas estn en el rango considerado, como de alto ET el cual de acuerdo a
la hiptesis bifsica de respuesta a la hormona corresponde a concentraciones
inhibitorias para la mayora de las plantas excepto para algunas especies de
plantas acuticas y para arroz en condiciones de inundacin (Pierik et al. 2006).
La relacin entre los niveles de ET y la expresin de OsACS1 con los cambios
observados en la morfologa radicular parecen sugerir un rol intermediario del
ET en el sendero de transduccin que lleva a una respuesta fisiolgica a la
inoculacin. Cuando el nivel de ET se aument artificialmente inyectando la
hormona en el ambiente de crecimiento de las plantas, este fue estimulatorio del
crecimiento y el bloqueo de su percepcin revirti el efecto. Estos resultados
indican que la respuesta de las plntulas de arroz, an no sumergidas, a la
presencia de ET es positiva en un amplio rango de concentraciones de la hormona
y que el aumento de esta, provocado por la inoculacin, favorece el crecimiento.
El rol del ET en la interaccin planta/bacteria promotora del crecimiento
tiene que ser analizado desde dos puntos de vista: su efecto como promotor
del crecimiento vegetal una vez establecida la asociacin y anterior a este, su
funcin en el establecimiento mismo de la asociacin. A nivel celular los
mecanismos que podran explicar la estimulacin del crecimiento en
respuesta al ET son prcticamente desconocidos. Una enorme cantidad de
trabajos relacionan al ET con modificaciones de la expansin celular regulada
por protenas como expansinas, con cambios en la divisin celular y en la
orientacin de microfibrillas y microtbulos (Pierik et al. 2006). A nivel
molecular la interaccin del ET con otras hormonas ha recibido especial inters
en relacin con el efecto estimulador del ET en el crecimiento. Por ejemplo,
una alta concentracin de ET en el crecimiento sumergido de Rumex palustris
y arroz lleva a un fuerte aumento en el crecimiento que ha sido asociado
funcionalmente a una disminucin de los niveles endgenos de ABA. En ambos
sistemas la disminucin del nivel de ABA va acompaada de un aumento en
los niveles de GA activo y en la sensibilidad a esta hormona que resultan
finalmente en la elongacin del tallo inducida por ET. Si bien no se conoce la
naturaleza de la interaccin entre estas hormonas se propone que en ltima
instancia lo que se modifica es la estabilidad de las protenas DELLA cuya
degradacin regula la elongacin celular. La estabilidad de DELLA tambin
est controlada por auxina, una hormona que frecuentemente interacciona
con ET. La interaccin entre estas dos hormonas ha sido descripta para el
crecimiento de pelos radiculares, formacin de races adventicias y elongacin
de la raz y otros eventos relacionados con el crecimiento. Estos resultados
implican una estrecha relacin entre el transporte, sealizacin y biosntesis
de ET y auxinas. De hecho, es bien sabido que auxina estimula la sntesis de
222
ET a travs de la regulacin transcripcional de varias isoformas de la ACS

(Tsuchisaka, Theologis 2004).
Entre los mltiples efectos que el ET tiene sobre las plantas, est el efecto
sobre el desarrollo radicular (Glick et al., 1996). Como se discuti
anteriormente, la sntesis de esta hormona est estimulada por la presencia
de AIA. En el estudio de la promocin del crecimiento de tomate inoculado
con Azospirillum brasilense FT326 se observ un aumento en el crecimiento de
las plantas medido en la biomasa de tallos y races, altura de los tallos y
superficie total de la raz. Estos resultados concuerdan con los informados
previamente por Bashan (1998) relativos al efecto de diferentes especies de
Azospirillum sobre plantas de tomate. Adems el contenido de AIA en las
plantas inoculadas, aument 7 y 19 veces en tallos y races respectivamente.
Junto con el aumento de AIA se encontr que tambin las plantas inoculadas
producan ms ET. La actividad de ACS aument en tallo y races despus de la
inoculacin. En tomate la familia LeACS tiene 9 miembros (Lin et al. 2009).
Cuando se midi la expresin de ACS utilizando un anticuerpo de la isoforma
ACS2, se vi claramente un aumento en la cantidad de protena presente en
tallos; en raz debido a la baja cantidad de protena presente, esta no pudo
ser detectada por el anticuerpo. Los datos de actividad y expresin de ACS
sugieren que ambas podran estar moduladas en el proceso. La observacin
microscpica de las races de las plantas inoculadas mostr que adems de
los cambios en la densidad de los pelos radiculares su distribucin a lo largo
de la raz principal estaba alterada (Ribaudo et al. 2006 b). Como las auxinas
tienen un rol en el desarrollo de los pelos radiculares es posible que la alteracin
del balance AIA/ET sea responsable de esta localizacin anormal de los pelos
radiculares observados en plantas inoculadas con A. brasilense. El ET
suministrado exgenamente reprodujo el efecto de la inoculacin, induciendo
un aumento en la superficie de la raz y de la longitud de los pelos radiculares.
El uso de bloqueantes de la percepcin del ET result de gran utilidad. Los
experimentos llevados a cabo utilizando 1-MCP, permitieron demostrar que
esta hormona es un regulador positivo del desarrollo de los pelos radiculares
y en consecuencia del aumento de la superficie radicular y que es al menos
una de las seales que median el efecto de la inoculacin con A. brasilense
FT326 en plntulas de tomate.
En estudios ms recientes, como resultado del anlisis transcriptmico de
tomate inoculado con A. brasilense, se observ que la isoforma 4 de tomate,
LeACS4, aument dos veces la expresin con respecto al control sin inocular.
Este resultado fue confirmado posteriormente por PCR semicuantitativa
(Ribaudo et al. 2010). Tambin la isoforma 2, LeACS2, apareci sobreexpresada
como resultado de la inoculacin. Posteriormente esto fue confirmado por
anlisis de expresin de la protena usando anticuerpos contra la isoforma 2
de tomate. Se demostr un aumento de ACS2 a nivel de protena presente en
las muestras de parte area de plantas inoculadas. De hecho, las plantas de
tomate lnea A11.1 antisentido para el gen de ACS2, derivadas de las Cv VF36
223
usadas en el anlisis transcriptmico tuvieron una produccin de ET 40 %

menor que la cepa salvaje y adems las plantas son ms sensibles a la
infeccin por el hongo necrotrfico Sclerotium rolfsii (Riva et al. 2012, enviado
para su publicacin). Se ha propuesto un modelo segn el cual uno de los
roles de las PGPRs sera modular el nivel de ET en las plantas evitando as el
efecto inhibitorio de un alto nivel de ET. El nivel de ET en la planta sera
resultado del balance entre su sntesis, estimulada por un alto nivel de AIA
inducido por la PGPR y su degradacin mediada por la ACC deaminasa
bacteriana (Glick et al. 1999). De acuerdo a este modelo, la capacidad de una
bacteria de actuar como PGPR dependera, al menos en lo que respecta a la
elongacin de la raz, de la presencia de actividad ACC deaminasa. Nuestros
resultados le asignan al ET un rol intermediario en el sendero de sealizacin
que lleva a un desarrollo aumentado de la densidad de los pelos radiculares
en plantas de tomate inoculadas con A. brasilense (Ribaudo et al., 2006 b).
Para profundizar estos estudios a nivel de los mecanismos bioqumicos y
moleculares involucrados, se encar un estudio del perfil transcripcional de
las plntulas inoculadas con A. brasilense cuyos resultados se comentan
ms adelante.
Mecanismos moleculares de defensa en la planta. Rol del

etileno
Todos los organismos vivos evolucionan continuamente adquiriendo
diversas caractersticas adaptativas que le permiten sobrevivir en un ambiente
particular. Como las plantas son inmviles y carecen del sistema inmune de
los vertebrados, han desarrollado complejos mecanismos de defensa que
reconocen a los agentes biticos y abiticos generadores de diferentes tipos de
estrs minimizando as los daos que pudieran ocasionarle (para una revisin
del tema ver Ausubel, 2005). Los sistemas de defensa incluyen defensas
preformadas como ceras, algunos componentes de la pared y metabolitos
secundarios. Una vez detectada la presencia del patgeno la planta activa
otros mecanismos que involucran un aumento en la expresin de genes
relacionados con la defensa, produccin de compuestos antimicrobianos,
formacin de lignina y produccin de especies reactivas de oxgeno. Una
proporcin relativamente pequea de microorganismos han evolucionado como
patgenos eficientes que logran suprimir y/o evitar los mecanismos de defensa,
son los que causan enfermedad y pueden provocar prdidas severas en los
cultivos (De Wit, 2007). La magnitud de los daos causados por estos patgenos
ha estimulado un rpido progreso en la investigacin de los mecanismos de
defensa de las plantas. Los patgenos pueden liberar localmente compuestos
efectores que son percibidos por el husped o penetrar la pared y/o la membrana
de la clula vegetal. Para responder rpidamente a la infeccin de un patgeno
la planta posee un sofisticado sistema de vigilancia que debe distinguir entre
las seales generadas por ella misma de las emitidas por los patgenos. Ms
an, cuando una seal es reconocida como no propia, la planta debe discriminar
224
entre los patgenos y los organismos benficos como es el caso de Rhizobium

para las leguminosas, las micorrizas y las PGPRs. Los mecanismos que permiten
esta discriminacin han comenzado a estudiarse recientemente.
Las plantas han desarrollado un sistema defensivo innato contra los patgenos
que tiene dos niveles: la resistencia basal o primaria y la resistencia secundaria. La
resistencia basal es la primera lnea de defensa y se induce cuando ciertos
compuestos derivados del patgeno (conocidos tambin como efectores generales
o del ingls microbe-associated molecular patterns, MAMPs) son reconocidos por
receptores no especficos de la membrana plasmtica. La resistencia secundaria
se induce cuando los productos de los genes de avirulencia del patgeno (genes
avr) son reconocidos por el producto del gen de resistencia correspondiente de la
planta, especfico de un determinado cultivar. Este ltimo mecanismo, tambin
conocido como inmunidad inducida por efector, desencadena una fuerte respuesta
hipersensible (HR) que resulta en la muerte celular localizada en la zona del ataque
y restringe el crecimiento del patgeno (Jones, Dangl 2006). Las respuestas primaria
y secundaria que llevan a generar resistencia se basan en la activacin rpida de
cascadas de transduccin de seales, de las cuales los cambios intracelulares
generados por las respuestas secundarias son los ms importantes.
Los efectores generales son compuestos vitales para el funcionamiento
de los microorganismos, por lo tanto estn constitutivamente presentes en
los mismos y estn conservados en una misma clase de microorganismos.
Varios de ellos han sido identificados en patgenos de plantas incluyendo
flagelina, lipopolisacridos (LPS) y factor de elongacin Tu (EF-Tu) para
bacterias Gram negativas, lo mismo que quitina y -glucanos para hongos y
oomicetes (Zipfel, Felix 2005). El reconocimiento de los patgenos por las
plantas est mediado por un grupo de protenas receptoras que pueden
agruparse en unas pocas clases importantes. Las protenas smil receptor
(RLPs) y los receptores con actividad de quinasa (RLKs) estn localizados en
la membrana plasmtica y contienen dominios con repeticiones ricas en
leucina (LRRs). Los RLPs carecen de dominios intracelulares de transduccin
de seales y los RLKs contienen un dominio citoslico con actividad de quinasa
que media la transduccin. Otras dos clases de receptores estn formadas
por protenas con localizacin citoplasmtica que adems del dominio LRR
contienen un dominio de unin de nucletidos (NB). Una clase se conoce
como TIR-NB-LRRs ya que contiene un extremo N terminal similar al receptor
Toll de Drosophila y al receptor de interleuquina 1 (TIR). La otra clase se
refiere como CC-NB-LRRs ya que el dominio N terminal contiene un motivo
coiled coil o leucine zipper adems de los otros dominios nombrados. Es
llamativo que la respuesta primaria de defensa (non-host) inducida por
MAMPs y la respuesta secundaria inducida por factores especficos (race-
specific inductors) estn mediadas por receptores muy parecidos. Actualmente
se los conoce como receptores PRRs y protenas R (RP) respectivamente (Bent,
Mackey 2007). En la Figura 2 se muestra un esquema de las estructuras
modulares, ubicacin y funcin de algunos de estos receptores.
225
Figura 2: Ubicacin celular y sealizacin de los receptores que median la

inmunidad en plantas. Modificado de Bent, Mackey 2007. Annu. Rev.
Phytopathol. 45, 399-436.
Los verdaderos patgenos tanto de plantas como de animales son capaces

de suprimir o sobrepasar la defensa basal activada por el sistema innato de
inmunidad primaria. Las bacterias patgenas de animales y de plantas
contienen cuatro sistemas secretorios de los cuales el sistema secretorio tipo
III (TTSS III) parece ser el ms importante para la virulencia. A travs de este
sistema las bacterias patgenas de plantas inyectan mltiples efectores en la
planta husped. Si el TTSS es no funcional solo se puede inducir la respuesta
primaria de defensa y la bacteria no es patognica (Grant et al. 2006). Se han
descripto un gran nmero de efectores de bacterias patognicas y para algunos
de ellos se han dilucidado sus mecanismos de accin; por ejemplo, los efectores
de P. syringae AvrPto, AvrRpt2 y AvrRpm1 comprometen las respuestas
inducidas por MAMPs, y AvrPtoB tambin induce el sendero de ABA
favoreciendo el desarrollo de la enfermedad (de Wit, 2007).
Para defenderse de los patgenos que suprimen o rebasan la respuesta
defensiva primaria las plantas han desarrollado una respuesta defensiva secundaria
que se induce cuando los efectores o sus efectos son detectados por el husped
(Jones, Dangl 2006). Las protenas de resistencia (RPs) registran a estos efectores
o a algunas protenas blanco de la planta que han sido alteradas por estos efectores
y disparan la respuesta de defensa secundaria (tambin llamada respuesta mediada
por RPs) que usualmente culminan en una respuesta HR (una respuesta localizada
de muerte celular) que asociada a otras respuestas localizadas de defensa bloquea
el crecimiento posterior del patgeno. La deteccin de los efectores o de sus
efectos por las protenas RPs del husped es especfica mientras que la HR inducida
no lo es y en general es efectiva contra muchos patgenos de plantas. Los efectores
226
son especficos de una determinada cepa de patgeno y algunas veces modifican

distintos dominios de un mismo componente del husped que a su vez es
controlado por diferentes RPs. Por lo tanto la especificidad y diversidad del
reconocimiento de los patgenos podra lograrse por la interaccin combinatoria
de distintos dominios y/o protenas del husped. Como se dijo ms arriba, los RPs
tienen localizacin tanto citoplasmtica como transmembrana de manera que
algunas pueden sensar ligandos secretados o componentes de la superficie del
patgeno y otras reconocen ligandos que aparecen en el interior de la clula (Figura
2). En algunos casos los mecanismos de induccin de defensa mediados por RPs
han sido dilucidados. El caso de las protenas RIN4 de A. thaliana y Pto de tomate
son un ejemplo de mecanismo indirecto de induccin de la respuesta. RIN4 es
blanco de tres efectores bacterianos (AvrRpm1, AvrB, y AvrRpt2) y es controlada
por dos RPs intracelulares diferentes (RPM1 y RPS2) y Pto es reconocida por dos
efectores bacterianos Avrpto y AvrptoB y controlada por una RP tambin
intracelular (PRF). Este mecanismo indirecto de reconocimiento de las
modificaciones inducidas por un efector se conoce tambin como modelo de
guarda (Van der Hoorn et al. 2002). Los efectores AvrRpm1 y AvrB fosforilan a
RIN4 y Avrpto y AvrptoB fosforilan a Pto que a su vez activan las protenas
receptoras citoplasmticas RPM1 (del tipo CC-NB-LRR) en el caso de RIN4 o PRF
(del tipo NB-LRR) en el caso de Pto. Finalmente estas protenas activadas median
la respuesta secundaria de defensa (Mackey et al. 2002; Axtell, Staskawicz 2003).
En la Figura 3 se muestra un esquema simplificado de los mecanismos en que
estn implicadas RIN4 y Pto (se esquematiza uno solo de los mecanismos descriptos
para cada protena intermediaria).
Figura 3: Mecanismo de defensa mediado por RIN4 y Pto.

Modificada de Gmez-Gmez 2004. Molecular Immunology 41 (2004)
10551062.
227
En otros casos el reconocimiento efector/receptor es directo como en el

caso de los efectores de la bacteria patgena Ralstonia solanacearum
(Deslandes et al. 2003).
Respuesta sistmica adquirida (SAR) e inducida (ISR)

El cido saliclico (SA), es un conocido inductor de la Respuesta Sistmica
Aquirida (SAR) en la interaccin planta/patgeno. El SA se acumula
rpidamente en el sitio de la infeccin durante la reaccin hipersensible y es
luego distribuido en el resto de la planta donde induce una cantidad de
respuestas de defensa entre ellas la induccin de genes relacionados con la
sntesis de algunos metabolitos secundarios (Mikkelsen et al. 2003). El cido
jasmnico (JA) y sus derivados son transductores de las seales de inductores
para la sntesis de metabolitos secundarios de distinta naturaleza qumica como
terpenoides, flavonoides, alcaloides, etc. y se los relaciona con la respuesta a
patgenos (Farmer et al. 2003). Todos estos compuestos pueden activar la
sntesis de metabolitos secundarios que juegan roles defensivos en la planta.
El ET regula varios procesos muy importantes en las plantas como se describi
anteriormente y la produccin puede ser inducida por diferentes situaciones
de estrs. Contrariamente a lo que ocurre con JA y sus derivados, el ET en
contados casos est asociado a la acumulacin de metabolitos secundarios de
defensa (Zhao et al. 2004).
SAR es especialmente efectiva frente a los microorganismos biotrficos
como P. syringae que colonizan tejidos vegetales vivos (Glazebrook 2005). JA
y ET, por otro lado, estn involucrados en la resistencia contra patgenos
fundamentalmente necrotrficos, como Botritys cinerea y Erwinia carotovora,
a travs de la induccin de genes de defensa y la activacin de complejos
senderos de sealizacin (Devoto, Turner 2003). Estas hormonas no participan
en forma aislada en los procesos que regulan sino que interactan entre s y
con otras molculas sealizadoras. Se han descripto un importante nmero
de interacciones entre los JAs y otras rutas de sealizacin como las de ET,
auxinas, SA o ABA.
Ambos tipos de respuesta comparten ciertas caractersticas bioqumicas y
moleculares aguas abajo como ser activacin del sendero de sealizacin de
MAPK, modificacin post traduccional de protenas preexistentes (Stulemeijer,
Joosten 2008), activacin transcripcional de los genes relacionados con la
patognesis (PRs), produccin de protenas antimicrobianas, induccin de la
aparicin de las formas reactivas de oxgeno (ROS) para el reforzamiento de
las paredes celulares y de compuestos txicos contra los invasores. Bacterias
rizosfricas como Pseudomonas, Bacillus y Serratia despiertan en la planta
una ISR similar a SAR pero sin daos visibles sobre el husped (Sharma,
Nowak 1998). Los microorganismos que disparan la va ISR a diferencia de
los que inducen el SAR son benficos. La mayora de ellos son rizosfricos
como Pseudomona fluorescens que resulta ser el organismo modelo. Los MAMPs
228
como flagelina y los lipopolisacridos presentes en los microorganismos

patgenos se encuentran tambin es estos benficos y resultan ser potentes
inductores de ISR. Adems los antibiticos producidos por varios de estos
microorganismos tambin funcionan como MAMPs en el encendido de esta
respuesta inmune, un ejemplo de esto es el 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG)
producidos por cepas de P. fluorescens. As como la va SAR es dependiente
de SA, ISR requiere componentes de JA y ET (Pieterse et al. 1998). Las dos vas
son controladas por el regulador transcripcional NPR1. La expresin de los
genes PRs en el camino SAR es dependiente de este regulador, en cambio en
ISR no lo es, y depende de una molcula seal que est ro arriba de NPR1
(Van Wess et al. 2000). El anlisis transcriptmico de A. thaliana inoculada
con Pseudomonas fluorescens cepa WCS417 revel la expresin diferencial
Figura 4: Modelo del camino ISR. El reconocimiento de MAMPs por los

microorganismos benficos rizosfricos como Pseudomonas fluorescens WCS417
o Trichoderma asperellum T34 conduce a la activacin local en la raz del factor
de transcripcin MYB72, el cual posiblemente interacciona con el factor de
transcripcin EIL3. Ro abajo o paralelamente con MYB72/EIL3 un componente
no identificado an del camino de transduccin del ET, es necesario en la raz
para activar un juego de genes en la parte area del camino ISR. La cascada
de transduccin del camino ISR requiere NPR1 probablemente en los tejidos
sistmicos. La resistencia sistmica est asociada con un priming para la
expresin aumentada de genes que responden a JA y o ET y una formacin
aumentada de papila conteniendo calosa en el sitio de entrada del patgeno.
El ataque por patgenos o insectos activa la respuesta de defensa de la
planta (borde superior de la figura en amarillo), la cual se acelera en plantas
cebadas en ISR (flechas amarillas combinadas con azul). Modificado de Van
der Ent et al. 2008, Current Opinion in Plant Biology, 11:443448.
229
de 94 genes localmente expresados en races. El factor de transcripcin MYB72

tiene un papel clave en los primeros pasos de la va ISR y ste a su vez
interacciona, al menos in vitro, con otro factor de transcripcin EIL3, del tipo
EIN3-like que responde a ET. Adems la resistencia inducida en Arabidopsis
por el hongo benfico Trichoderma asperellum T34 parece depender de
MYB72. MYB72 funciona como un nodo de convergencia en la defensa inducida
por los microorganismos benficos del suelo (Van der Ent et al. 2008). En la
Figura 4 se resume la participacin de los componentes del sendero ISR.
El estado inducido de defensa que despiertan estas bacterias en la planta,
dispara una aumentada sensibilidad a JA/ET, hecho que se conoce como
priming o potenciacin de la planta para responder ms rpidamente y con
mayor intensidad al ataque de patgeno.
La interaccin entre las plantas y sus patgenos ha llevado a distintos modos
de adaptacin a las respuestas defensivas primarias, secundarias y
probablemente sistmicas. La co evolucin de las plantas y sus patgenos ha
llevado a la generacin de nuevos efectores que ya no interaccionan con las
RPs o que perturban a las protenas blanco de las plantas de una forma tal que
ya no son sensadas por las RPs en los casos de mecanismos indirectos de
induccin de la respuesta defensiva. Distintos tipos de mutaciones son
responsables de estos cambios; dependiendo de su importancia y modo de
accin los genes de algunos efectores pueden ser completamente removidos
por delecin y otros sufren leves cambios en su secuencia aminoacdica que
disminuye o impide su reconocimiento por las RPs pero que mantienen algunas
funciones de virulencia (Arnold, 2007).
Mecanismos indirectos de la promocin del crecimiento

ejercido por las PGPRs
Las plantas que establecen interacciones endofticas deben mantener el
nmero de endfitos bajo estricto control para asegurar la no patogenicidad
de la infeccin. Resultados recientes indican que las respuestas defensivas de
las plantas regulan su colonizacin por las bacterias endofticas y que el ET,
mediador de la respuesta ISR, disminuye la colonizacin en varios modelos
planta/microorganismo (Len-Kloosterziel et al. 2005). En caa de azcar se
llev a cabo una caracterizacin molecular de algunos integrantes del camino
de sealizacin del ET en relacin con la colonizacin por bacterias endofticas
fijadoras de nitrgeno (Cavalcante et al. 2007). Se encontr que un receptor
de ET, ER1, y dos factores de transcripcin que responden a ET, ERF1 y ERF2,
se expresan diferencialmente en respuesta a la interaccin con bacterias
benficas y patgenas: la expresin de ER1 y de ERF2 aumenta drsticamente
y la de ERF1 disminuye en la infeccin con endfitos fijadores de nitrgeno y
estos cambios se invierten en la asociacin con patgenos. Los receptores de
ET son reguladores negativos del sendero (Ciardi et al. 2000) y su sobre
expresin en tomate y L. japonicus produce una disminucin en la capacidad
230
defensiva de la planta (Ciardi et al. 2000; Nukui et al. 2004). Por lo tanto, el
aumento especfico del receptor ER1 en la infeccin disminuira la sensibilidad
al ET y por lo tanto la defensa de la planta frente a la colonizacin. De estos
resultados se puede concluir por un lado, que la inoculacin no gatilla una
respuesta general sobre los receptores de ET y por otro que ER1, ERF1 y ERF2
podran participar en cascadas de transduccin alternativas, todas mediadas
por ET, con la capacidad de discriminar entre los dos tipos de asociaciones
(beneficiosas y patgenas). Es importante sealar que de la comparacin de
secuencias de los dos factores de transcripcin con las del banco de datos del
NCBI surge que las secuencias con mayor identidad (98% para ScERF1 y 85%
para ScERF2) corresponden a dos ERFs de arroz.
Los transcriptos de numerosas protenas relacionadas con la patognesis
(PRs) se acumulan rpidamente en muchas especies de plantas despus de
minutos u horas de la infeccin con hongos, bacterias o virus o de ataques por
insectos. Las PRs son de naturaleza muy variada y se han agrupado en 17
familias (PR1 a PR17). Tambin su localizacin celular es variada: se las ha
encontrado en los fluidos xilemticos, lo que sugiere que habra una secrecin
hacia el sistema de transporte, pero otras tienen una localizacin
citoplasmtica. Algunas pueden aparecer solo en el rgano en que se dio la
infeccin. Los senderos de transduccin de seales mediados por SA, JA y ET
regulan la activacin transcripcional de numerosos genes PR. Algunas de estas
protenas son quitinasas (PRs 3, 4, 8 y 11) y glucanasas (PR2) que degradan
polisacridos estructurales de las paredes de los hongos perturbando as su
proliferacin. Algunos miembros de la familia PR8 tienen actividad de lisozima
que limita el crecimiento de las bacterias.
A. brasilense puede limitar el crecimiento de bacterias no patognicas (Romero
et al. 2003). La capacidad de biocontrol estara relacionada con la produccin de
bacteriocinas, de siderforos y la sntesis de cido fenilactico con actividad
antimicrobiana (Somers et al. 2005). Adems hay evidencias que sealan la
induccin de una respuesta sistmica de defensa en plantas de tomate inoculadas
con A. brasilense (Ribaudo et al. 2010). El anlisis transcriptmico de la respuesta
sistmica de tomate a la inoculacin con A. brasilense Cd ponen de manifiesto un
gran nmero de genes que cambian su expresin en forma diferencial debido a la
inoculacin. Tomados en conjunto los resultados indican que la inoculacin de
tomate con A. brasilense modul la expresin de un nmero importante de genes
involucrados en la regulacin de diferentes aspectos fisiolgicos de la planta. Los
ms interesantes para nuestros objetivos son los relacionados con el metabolismo
y la defensa. Entre estos ltimos varias PRs (como PR1, PR2, PR5) algunas de las
cuales responden a ET aparecen tempranamente sobrexpresadas en plantas
inoculadas a los 7 das posteriores a la inoculacin y se mantienen en este estado
hasta los 14 das posteriores a la inoculacin. Esto est en concordancia por lo
sealado por Wang et al., 2005, en plantas de A. thaliana inoculada por la
rizobacteria Pseudomonas fluorescens FPT 9601. Varios factores de transcripcin
como los de la familia WRKY, bZIP o ERF que responden a JA/ET se han encontrado
231
sobreexpresados como respuesta a la inoculacin. Haciendo un estudio comparativo

de nuestros resultados con los hallados por Alba et al. 2005 sobre el transcriptoma
de tomate en respuesta a ET encontramos varias coincidencias en los genes que
cambiaron su perfil de expresin como resultado al tratamiento con ET. Adems la
expresin de las ACS tambin se vi afectada por la inoculacin. En el caso particular
de LeACS2 encontramos que esta enzima cumple un papel importante en los primeros
estadios de la infeccin de S. rolfsii con plantas de tomate (Riva et al. 2012). Los
perfiles de induccin y represin de genes de defensa obtenidos en nuestro estudio
muestran similitudes y diferencias con los sistemas planta/microorganismos
benficos. Verhagen et al. (2004) y Cartieaux et al. (2008) analizando la respuesta
de A. thaliana a la inoculacin con PGPRs no relacionadas como P.fluorescens WCS
4175 y Bradyrhizobium sp. Strain ORS278 respectivamente, encontraron que ambas
inducan la expresin de genes asociados a la respuesta ISR, dependiente de JA/ET,
tpica de la inoculacin con PGPRs, y que esta induccin slo era detectada despus
que la planta haba sido desafiada con un patgeno. Este estado de las plantas
inoculadas, conocido como estado cebado, le proveera una mayor capacidad de
respuesta frente a un patgeno invasor en cuanto a la rapidez y a la intensidad de
la misma. En cambio, Wang et al. (2005) en un anlisis transcriptmico llevado a
cabo tres semana despus de la inoculacin de A. thaliana con una especie endoftica
de Pseudomonas, encontraron que se modulan genes pertenecientes al sistema ISR
y tambin al sistema SAR. Como en nuestro caso, se sobreexpresan algunos genes
relacionados con las reacciones de defensa (como protenas PRs) y se sub expresan
otros y todos estos cambios ocurren sin que las plantas inoculadas hayan sido
infectadas con patgenos. En otro estudio menos extensivo, Conn et al. (2008)
analizaron la expresin de PR1 y PR5 como representativas de respuesta SAR y de
PDF1.2 y Hel como representativas de ISR en el sistema A.thaliana/actinobacterias
endofticas a las siete semanas de la inoculacin. Si bien no todas las especies
utilizadas en el estudio respondieron cuali y cuantitativamente de la misma forma,
en tres de las cuatro se evidenci una induccin relativamente baja de genes SAR y
de genes dependientes de JA/ET an cuando las plantas no haban sido infectadas
con patgenos. Despus de la infeccin con un patgeno estos mismos genes se
sobre expresan fuertemente y aparecen sobre expresados una gran cantidad de
otros genes relacionados con la defensa. Se propone que la sobre expresin de
genes de defensa como resultado de la inoculacin con la PGPR prepara a la planta
para una respuesta de mayor intensidad y ms rpida cuando es atacada por un
patgeno. Resultados recientes de Niu et al. (2011) indican que el fenmeno de
induccin paralela de respuestas dependientes de SA e ISR no est limitado a las
PGPRs endofticas; en efecto, Bacillus cereus AR156 induce resistencia sistmica en
A. thaliana activando simultneamente senderos de defensa dependientes de SA y
de JA/ET que resulta en un efecto aditivo en el nivel de proteccin en A. thaliana. van
Wees et al. (2000) por su parte demostraron que la activacin simultnea de los
senderos SAR e ISR resulta en un mayor nivel de proteccin frente a la infeccin de
Arabidopsis por P. syringae pv. tomato DC3000 que la activacin de cada uno de
ellos individualmente. Es decir, las PGPR capaces de inducir simultneamente
respuestas sistmicas que compartan caractersticas de ambos senderos son
capaces de establecer un nivel de resistencia mayor y ms verstil en el husped.
232
A. brasilense comparte la caracterstica de estas PGPRs de inducir una respuesta de

defensa en la que se solapa la expresin de genes pertenecientes a las vas ISR y
SAR. En consecuencia es de esperar que A. brasilense tenga la capacidad de proteger
a las plantas contra la infeccin por patgenos que operan por diferentes
mecanismos. Cuando evaluamos esta hiptesis llevando a cabo experimentos de
biocontrol utilizando plantas de tomate infectadas con diferentes patgenos como
un hongo necrotrfico (Sclerotium rolfsii), un hongo biotrfico (Fusarium solani pv
solani) y una bacteria hemibiotrfica (Xanthomonas campestris pv vesicatoria)
encontramos que A. brasilense disminuy la incidencia de la infeccin (15%) y la
mortalidad (40%) en plantas de tomate infectadas con S. rolfsii (Riva 2009). Las
plantas infectadas con F. solani resultaron protegidas contra el dao (evaluada
como peso de la planta) en un 100% a los 40 das despus de la infeccin (Pardo
2006). Con respecto a la infeccin con X. campestris el parmetro evaluado fue el
rea foliar y se observ que en las plantas tratadas con A. brasilense no hubo
inhibicin del crecimiento en tanto que plantas control se inhibieron en un 40%. Es
decir la hiptesis elaborada en base a la expresin de genes de defensa en plantas
de tomate inoculadas segn la cual A. brasilense debera comportarse como inductor
de ISR se ve apoyada por los resultados comentados.
Conclusiones
Es muy poco lo que se conoce acerca de los genes que median el
reconocimiento y la asociacin efectiva de A. brasilense con plantas de inters
agronmico. Gran parte de los estudios de expresin gnica global en respuesta
a la inoculacin con PGPRs han sido llevados a cabo utilizando como modelo
A. thaliana debido a que los senderos de defensa en esta planta han sido muy
estudiados. Es importante destacar que nuestros trabajos ms recientes se
llevaron a cabo utilizando plantas de tomate que tienen una importancia
econmica relevante como fuente de alimento y los patgenos utilizados para
evaluar su potencial capacidad de biocontrol son causantes de enfermedades
que, debido a las prcticas habituales de cultivo, tienen una alta incidencia en
el rendimiento econmico. El ET tiene un rol importante en este sistema A.
brasilense-tomate, tanto desde la promocin directa del crecimiento como
desde la induccin de una respuesta defensiva en la planta que en algunos
casos result ser efectiva an despus de 60 das de la inoculacin (Riva, 2009).
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239
240
Captulo 13
Ms all del tratamiento a las semillas:
Evolucin de productos basados en PGPRs que
contienen complejas comunidades
microbianas
Beyond seed treatments: evolution of PGPR products
containing complex microbial communities
Joseph W. Kloepper1, Juan David Castillo, Marleny Burkett-Cadena, Katheryn
S. Lawrence
Department of Entomology and Plant Pathology, 209 Life Science Building, Auburn University,
Auburn AL 36849 USA. 1Corresponding author. E-mail: [email protected]
Introduction
Various groups of microorganisms have been investigated for their capacity to
improve plant growth or reduce plant disease. Plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR) are beneficial root-colonizing bacteria that elicit increased plant growth or
reduced damage due to plant diseases. These benefits that result from inoculation
of seeds or plant parts with PGPR are due both to production of bacterial metabolites
such as plant growth regulators and antibiotics that alter the plant or the native
rhizosphere community. In addition, some PGPR alter the host plants physiology in
a way that induces resistance to diseases (Kloepper et al. 2004b) and stress (Yang
et al. 2009). Several reviews (de Bashan 2010; Kloepper et al. 2004b; Persello-
Cartieaux et al. 2003; Vissey 2003) summarize the theoretical basis of PGPR, their
mechanisms of action, and efficacy in greenhouse and field trials.
Early applications of PGPR focused on their use as biological control
agents more than growth promotion. Recently with the growing global concern
about reducing fertilizer run-off and contamination of surface and ground
waters, there is a renewed interest in growth promotion. The goal is to select
PGPR that increase root growth; because an increased root system will enable
the plant to enhance the uptake of applied fertilizers while reducing
application rates (Adesemoye et al. 2009). This use of PGPR to raise nutrient
uptake is termed integrated nutrient management (Adesemoye et al. 2008)
and is a common current aim in many countries.
Over the past decade, there has been a proliferation in PGPR-based products
in the United States. The majority of these products contain a single purified
241
Joseph W. Kloepper, Juan David Castillo, Marleny Burkett-Cadena, Katheryn S. Lawrence
strain of PGPR applied as a seed treatment. Seed treatments have been the
preferred delivery system in the U.S. partly due to integration of agricultural
inputs into the seed. Growers tend to prefer purchasing inputs from a single
source, such as the seed supplier, rather than purchasing multiple inputs from
various sources. Hence, companies developing microbial inoculants have
focused on seed treatment. A decision to limit the delivery system to a seed
treatment has profound implications and limitations for which kinds of PGPR
can be developed. For example, many strains of Pseudomonas are active as
PGPR, however, they cannot be formulated as seed treatments. This is because
the sales and distribution network of seeds requires that a bacterial seed
treatment remain viable for 12-18 months and that it be compatible with seed
treatment chemicals such as fungicides and insecticides which are also
stacked onto seeds. This requirement means that for all practical purposes,
only spore-forming PGPR, such as Bacillus spp. or Streptomyces spp. can be
formulated as seed treatments. Examples of such PGPR that have been registered
by the U.S. Environmental Protection Agency and that are sold as seed treatment
products include Bacillus pumilus strain INR-7 (Hu et al. 2003; Kloepper et al.
2004b), Bacillus subtilis strain GB03 (Brannen, Backman 1993 and 1994; Hammon,
Berrada 2001; Koepper et al. 2004a; Turner, Backman 1991), and Bacillus subtilis
strain MBI 600 (Bennett et al. 2003; Kumar et al. 2009; Rossall, McKnight 1991).
Applying PGPR as seed treatments has been a successful approach for the
products that are currently registered. However, as stated above, the PGPR
which can be used as seed treatments are limited. In addition, seed treatments
are obviously only applied once per year, thereby eliminating the potential to
apply additional dosages, commonly referred to as boosters, of PGPR during
the growing season. Also, many research studies demonstrate that a combination
of the living cells of PGPR and their metabolic products produced by fermentation
can have more consistent or stronger beneficial effects on plants than
application of only spores of the PGPR. Hence, there have been many attempts
to produce PGPR products that are not limited to seed treatments.
Our aim in this manuscript is to present the evolution of products containing
a common core consortium of PGPR strains which have recently been blended
into a thixotropic formulation. This is done by presenting results of studies done
at Auburn University over a 10 year period with various previous formulations of
the main bacterial mixture currently used in the evolved thixotropic formulation.
This formulation represents a new advancement in application of PGPR, since it
allows PGPR to be applied multiple times during the growing season.
Methods
Description and origin of PGPR-based products tested
Beginning in 2002, tests at Auburn were conducted with an evolving group
of products, all of which contained a core group of 50 PGPR strains which
242
Evolucin de productos basados en PGPRs que contienen complejas comunidades microbianas
were originally selected, maintained, and formulated by Organica Biotech in

Norristown, Pennsylvania. The core bacterial group included 39 strains of
spore-forming bacilli, 6 strains of Pseudomonas spp., and 5 strains of
Streptomyces spp. The historical development and evolution of products
containing this core microbial group is as follows. The company Naturize Inc.
in Jacksonville, Florida developed Equity TM as an aqueous flowable
formulation for use in transplant water or in irrigation water, using the core
group of bacteria from Organica Biotech.
After developing Equity, the same company developed Naturize Potted Plant
Food which was a water-soluble fertilizer (14-29-14) containing spores of the
same Bacillus spp. strains that were in Equity and that were produced by
Organica Biotech. At the same time that Equity and Naturize Potted Plant Food
were being developed and marketed, Organica Biotech produced and marketed
Plant Growth Activator TM (PGA). PGA was a powdered formulation of the same
microbial mixture used in Equity and Naturize, aimed mainly at the home
garden market.
The company Pathway Holdings in Palmetto, Florida purchased Organica
Biotech in 2008. Personnel from Pathway Holdings had contributed to the
original design of the PGPR mixtures and formulation of products from Naturize
and Organica Biotech. During 2010, Pathway Holdings reformulated the same
core group of PGPR into a thixotropic formulation, and this product is named
Restore. Thixotropy is the property of certain gels and thick fluids to become
soluble when exposed to shearing forces, such as those caused by moving
water. Thixotrophic technology utilizes chemical properties of metals, organic
compounds, and phosphorus to produce a positionally stable material. Two
or more liquids or solids are combined whereby a thickening reaction occurs.
The resulting material is stable until friction, water movement, or mechanical
force is applied. Another property of the thixotropic mixture is the ability to
add both liquid and dry materials together that would otherwise not be feasible
due to materials falling out of solution and segregating in the mix. Hence,
mixing PGPR into a thixotropic formulation creates a slow and constant release
of PGPR. Restore can be applied in the irrigation water or as in-furrow
formulations based on extrusions of the thixotropic formulation.
Tests with Equity

Two routine growth promotion assays were developed to allow quality
control testing of different batches of manufactured Equity. In Equity test 1,
these bioassays were used to assess efficacy of a new batch of Equity and a
batch that had been manufactured one year earlier and stored at room
temperature. The first bioassay involved planting seeds of tomato cultivar
Florilina in 248 Speedling Styrofoam trays in Promix soilless potting mix from
Premier Peat, Riviere-du-Loup, Quebec, Canada. Each seed of the Equity
treatments received 0.3 ml of a stock suspension of 33 ml Equity in 1.0 L
243
Joseph W. Kloepper, Juan David Castillo, Marleny Burkett-Cadena y Katheryn S. Lawrence
water. Controls consisted of seeds that received 0.3 ml of water. In the second
bioassay, cucumber cultivar Diva seeds were planted in 128 Speedling trays,
and each seed received 0.5 ml of the same stock suspension of Equity; controls
received 0.5 ml water. After 21 days of growth in the greenhouse, 10 replicate
plants per treatment were removed from trays, washed, blotted dry, and the
fresh weight of the entire plant, roots, and shoots were recorded. Data were
analyzed using ANOVA in JMP (SAS, Cary North Carolina) with comparison of
treatment means using LSD at P < 0.05.
Equity test 2 used the routine tomato bioassay described above to
assess growth promotion potential of Equity at several stages of a
production run. The treatments were Equity sampled at the beginning,
middle, and end of the production as well as a mixture of the final product.
Stock suspensions of each treatment were prepared and applied to seeds
as described above. The control received the same volume of water on
each seed. In addition to the data collected in Equity test 2. the R/S ratio
(root/shoot ratio) was calculated by dividing the mean weight of roots by
the mean weight of shoots for each treatment. R/S ratios are important in
the transplanted vegetable industry as a way of insuring that transplants
have sufficient root systems to minimize transplant shock. Data were
analyzed as in Equity test 1.
Five field trials were also conducted with Equity to determine if increased
root system development that was noted in bioassays with Equity would result
in reduced severity of root-knot nematode (Meloidogyne incognita). Trial 1 in
2001 was at the North Alabama Horticultural Research Center of the Alabama
Agricultural Experiment Station in Cullman, Alabama. Trial 2 in 2002 was at
the Sand Mountain Research and Education Center in Crossville, Alabama.
Each of the selected fields had infestations of root-knot nematodes in the
year prior to the test. Each trial consisted of 6 replicate plots of Equity and a
water control, with each plot containing 10 transplanted tomato plants. At
the time of transplanting, Equity was applied at a rate of 37 L/ha (1 gallon/
acre). Root systems of 36 plants in 2001 and 54 in 2002 were sampled after
harvest from within 6 replicate blocks of each treatment and rated for gall
severity using a 0 10 scale, where 10 is most severe according to the
procedure described by Zeck (1971). Means were analyzed using the paired t- test
with calculation of LSD at P < 0.05 from the calculated t-value. The number of
plants that received each rating (0 10) was recorded to examine frequency
of severe gall ratings.
In 2003, trials 3, 4 and 5 were conducted at the Cullman Research Center.
These trials were part of a sustainable agriculture test, and hence, they differed
in aspects of the cover crop or tillage used. Trials 3 and 4 were in fields that
had a mixture of three cover crops the winter preceding the test; in trial 3,
tomato plants were transplanted using a mechanical no-till transplanter; in
trial 4, tomato plants were transplanted using strip-tillage. Trial 5 was in a
field that had no cover crops and was cultivated with raised beds covered
244
with polyethylene tarp. There were 6 replicate plots, each with 10 plants. At
the time of transplanting, Equity was applied at a rate of 2 quarts/acre (18.5
L/ha) half the rate of the initial trials in 2001 and 2002. Plants were sampled
and rated, and data were analyzed as in the initial trials.
Tests with Naturize Potted Plant Food

Two experiments were conducted with this product that contained the
same mixture of PGPR strains as Equity, but now formulated by mixing spores
with a water-soluble fertilizer. Both experiments were designed to determine
the effects of the product with and without 1% humate on tomato and pepper
growth, in comparison to a control of 14-29-14 (N-P-K) fertilizer without
bacteria. These tests were designed as quality control tests for the
manufacturing company which was considering adding 1% humate to the
product formulation.
In experiment Naturize 1, tomato and pepper seeds were planted into 128
Speedling transplant trays containing Promix and were treated immediately
by watering with a solution containing the label rate of 1 tablespoon/gallon
(3.9 cc/L) of Naturize potted plant food with and without humate or the same
concentration of 14-29-14 fertilizer without bacteria as the control. The
treatment and control fertilizer applications were applied once again at 14
days after planting. After 21 days for tomato and 24 days for pepper, 10
replicate plants per treatment were removed from each tray, washed, and
blotted dry. Measurements were recorded for total plant weight, root weight,
and shoot weight. The R/S ratio was calculated for each treatment. With tomato,
measurements were also made for height of the seedlings and the stem caliper.
Data were analyzed using ANOVA with comparison of treatment means using
LSD at P = 0.05.
Experiment Naturize 2 tested the effects of the same treatments on tomato
and pepper seedlings transplanted to 10-cm square pots containing Promix.
The seedlings had been grown for 3 weeks in Speedling trays and had received
one treatment of 14-29-14 fertilizer without bacteria at 7 days after seeding.
Plants were treated with the same concentration of Naturize potted plant
food with and without humate or the fertilizer control immediately after
transplanting and once again 14 days after transplanting. At 21 days after
transplanting, 6 replicate plants per treatment were removed and processed
as described for experiment Naturize 1 to determine total plant weight, root
weight, and shoot weight. Data were analyzed as in the previous experiment.
Pepper transplants treated with Naturize potted plant food with and without
humate had previously shown a marked increase growth rate compare to the
fertilizer control without bacteria; hence, in experiment Naturize 2, the height
and width of each plant was measured at 2, 9, and 14 days after planting, and
the plant growth index was calculated as height (cm) X width (cm).
245
Tests with Plant Growth Activator

Two experiments were conducted with Plant Growth Activator (PGA).
Experiment PGA-1 was designed to detect effects of Plant Growth Activator
(PGA) on sunflower seedling growth and other parameters related to flower
quality in the greenhouse. The MPN (most probable number) test was used to
quantify the total bacterial population in the product, and then spore
concentrations were adjusted to three final densities (106, 107, and 108 CFU/
ml). PGA was applied by submerging sunflower cv. Valentine seeds for five
minutes in the bacterial suspension prior to planting in 128 Speedling trays in
Promix. One ml of the appropriate spore concentration was placed over each
seed after planting. Eight days after planting, seedlings were fertilized with 20-
10-20 soluble fertilizer at a rate of 2.5 g/L of water. After initial application,
plants were not fertilized again and were watered as needed. Twelve days after
planting, seedlings were removed from trays, dipped into bacterial suspensions,
and transplanted into 10-cm square pots, with 30 replicate pots per treatment.
A control without PGA was included. The experiment was a completely
randomized design. Plants were sampled three times, with 10 plants being
sampled per treatment at each time. At 12 and 35 days after seeding, roots
were washed, blotted dry, and total plant weight, root weight, and shoot weight
were measured. Caliper diameter was recorded at the first sampling time. The
third sample was taken 48 days after seeding, when chlorophyll content and
leaf surface area were measured as indicators of photosynthetic capacity, and
stem length (plant height) and flower diameter were measured as indicators of
quality. Chlorophyll content was measured using a SPAD-502 Chlorophyll Meter
(Spectrum Technologies, Inc. Plainfield, IL 60544); the mean of three readings
per leaf from two mature leaves per plant was recorded. Leaf surface area was
calculated with the AgVision system (Decagon Devices Inc., Pullman, WA 99163)
by sampling two mature upper leaves of each plant. Stem length and flower
diameter were measured on plants with market-quality flowers. Data were
analyzed using ANOVA and were subjected to the paired Students t-test (P <
0.05) comparing treatments means by using Fishers protected LSD.
Experiment PGA-2 was designed to evaluate effects of PGA on tomato
seedling growth and root architecture. Seeds of tomato cv. Juliette were
planted in 128 Speedling trays in Promix. PGA was applied by mixing 1
tablespoon of product/gallon water (3.9 cc/L) and watering trays with this
suspension. Controls received only water. Seedlings were fertilized at 1, 7,
and 14 days after seeding with 20-20-20 soluble fertilizer. Six replicate seedlings
were removed from the trays at 6, 10, 14, and 30 days after planting. Roots
were carefully washed and blotted dry prior to recording the fresh weight of
roots and shoots. Root systems of each plant were then examined for root
architecture as previously described using scanner model LA 1600+ and
WinRhizo software. Data from the resulting analyses were collected for root
surface area, root volume, mean root diameter, root length, and number of
root tips. Data were analyzed as described for experiment PGA-1.
246
Tests with Restore from Pathway Holdings

Five tests were conducted in the greenhouse with Restore. Restore test 1 was
designed to calculate the populations of PGPR that are delivered to plants when
the product is applied through irrigation. Two application methods were used,
a tank mix and a process column, which represent the two common ways in
which farmers are now using the product in irrigated agriculture. For the test,
small scale models were designed of the actual tank mix and process columns
used by farmers. The model for the tank mix application consisted of a 20 L
container with a circulating pump and a section of pipe (PVC - polyvinylchloride)
8 cm diameter X 20 cm long, capped at the bottom end with slits in the cap.
Using products and rates provided by the manufacturer, a thixotropic formulation
of nutrients for the microorganisms was placed into the pipe and a powdered
formulation of the Restore microorganisms was placed into container. The
mixture was incubated at room temperature with the circulating pump for 10
hrs. The resulting suspension was diluted 1:20 with water to recreate the
concentration applied through irrigation systems, and the population was
determined using most probable number (MPN) technique in tryptic soy broth
with two replications and three tubes of each dilution per replication. The model
for the process column was a section of PVC pipe 20 cm diameter X 75 cm long
with caps on both ends and an output line that delivered the contents in the
same concentration used in field irrigation systems. Populations were determined
in the process column by inserting into the column a thixotropic formulation
that contained both the microorganisms and the microbial nutrients, pressurizing
the system by connecting it to a residential water hose, and collecting the
suspension that flowed from the output line for a 15 min. period. Aliquots were
removed and used to determine the population using MPN. Each of tests with
the tank mix and process column was conducted three times, and populations
were calculated as means of the three tests.
Restore tests 2-5 evaluated the effects of the PGPR consortia applied in a
manner designed to replicate the commonly used system in vegetable
production, by alternating applications of PGPR from the tank mix and the
process column. Each experiment was a randomized block with 3 treatments
and 8- 10 replications. Treatments were 1) tank mix alone, 2) tank mix + process
column and 3) water control. Each replicate consisted of a 25-cm-diameter
pot containing a soilless potting mix. Applications began one week prior to
planting 10 cucumber seeds in each pot, by adding 100 ml of formulation per
pot. Treatment 1 was applied three times during each test: 7 days before
planting, day of planting, and 7 days after planting (DAP). With treatment 2,
the application from the process column was applied at the same times as
treatment 1, and the application from the tank mix was applied 4 days after
each of these. Treatment 3 was treated with water on the same schedule.
Restore test 2 evaluated seedling growth promotion using the PGPR
applications. The experimental design was doubled so that the test could be
destructively sampled at 7 and 14 days after planting. At these times, seedlings
247
were washed and weighed to determine whole seedling and root weights.
Then, using WinRhizo analysis, the mean total root length, surface area, and
number of root tips were determined as measurements of root architecture.
Restore tests 3-5 were biological control assays of the PGPR applications against
three soilborne pathogens: Pythium ultimum (test 3), Pythium aphanirdermatum
(test 4), and Rhizoctonia solani (test 5). Pathogens were applied at the time of planting
by pipetting 5 ml of inoculum over the cucumber seeds before covering. Inoculum
was prepared by growing cultures on corn meal agar (Pythium sp.) or potato dextrose
agar (R. solani for 5 days and then homogenizing agar from 4 plates in 400 ml sterile
water. All of the pathogens can cause both pre- and post-emergence damping off
and stunting of plant growth. Hence, data were collected on emergence at 5 DAP,
final stand of healthy seedlings at 14 DAP, and disease incidence calculated as the
number of missing, dead, or wilted seedlings at 20 DAP.
Results
Tests with Equity
In Equity test 1, both the freshly prepared batch of Equity and the one-
year-old batch increased (P = 0.05) the total plant weight, root weight, and
shoot weight of tomato and cucumber, compared to the control in (Table 1).
On tomato, the one-year-old batch of Equity induced a 45% increase in root
weight, and on cucumber, the corresponding increase in root weight was 48%.
Table 1.
Promotion of tomato and cucumber plant growth with a new and 1-yr old
batch of Equity.a
a
Tomato seeds were planted in a 248 Speedling tray with Promix soilless medium.
Equity was applied by adding to each seed 0.3 ml of a stock suspension of 33 ml Equity
in 1.0 liter of water. Cucumber seeds were planted in a 128 Speedling tray using 0.5 ml
of the same stock suspension of Equity. Ten replicate plants of each treatment were
assessed 21 days after planting.
b
Equity new indicates a fresh batch of Equity from the manufacturer.
c
Equity 1-yr indicates Equity that was stored at room temperature one year after
manufacturing.
* Indicates significant increase relative to the control at P < 0.05.
248
Equity test 2 was a typical quality control bioassay testing the growth-
promoting potential of samples of Equity taken at various times during the
production run. Results (Table 2) indicate that all samples of Equity increased
(P < 0.05) total plant weight, root weight, shoot weight, and the R/S ratio,
compared to the water treated control.
Table 2.
Quality control bioassay for growth promotion of tomato with Equity. a
a
Tomato seeds were planted in a 248 Speedling tray with Promix soilless medium.
Equity was applied by adding to each seed 0.3 ml of a stock suspension of 33 ml Equity
in 1.0 liter of water. Ten replicate plants of each treatment were assessed 21 days after
planting.
b
Treatments represent samples taken at various stages of the preparation of the
product. Start of run is at the beginning of the mixing, middle of run is half-way through
the mixing, end of run is near the final mixing, and mixed final product is a sample from
the final mixing.
* Indicates significant increase relative to the control at P = 0.05.
Results of 5 field trials demonstrated that the PGPR mixture in Equity can
reduce damage from root-knot nematodes. In trial 1, the nematode pressure
gall rating of the control was relatively low, and Equity reduced (P < 0.01)
the mean gall rating of the control from 2.2 to 0.7. In trial 2 where nematode
pressure was higher, Equity reduced (P = 0.01) the mean gall rating of the
control from 4.1 to 2.3. In addition to lowering the mean gall rating, treatment
with Equity resulted in a marked change in frequency of gall ratings. In trial 1
(Figure 1), 92% of the plants sampled from the Equity treatment had a gall
rating of 0 or 1, while 69% of the control plants had a gall rating of 2 or 3. In
trial 2 (Figure 2), this same trend was noted; 51% of the plants sampled from
the Equity treatment had a gall rating of 1 or 2, while only 18% of control
plants had a rating of 1 or 2, and 27% of control plants had a rating of 5 8.
Reductions (P = 0.05) in gall ratings also occurred with Equity in all three tests
conducted in 2003 (Table 3). The nematode pressure in trials 3, 4, and 5 was similar to
that in trial 2, with mean gall ratings of the controls ranging from 3.64 to 4.11. In each of
the field trials, the following observation was made: Equity-treated plants produced
new roots after nematode infection while control plants generally did not (Figure 3).
249
Figure 1: Reduction in root-knot nematode damage on tomato by Equity in field

trial 1. Root systems of 36 plants sampled from within 6 replicate blocks
of each treatment were dug after harvest and rated for gall severity
using a 0 10 scale (Zeck 1971), where 10 is most severe. The mean gall
rating for Equity was 0.7 and it was 2.2 for the control (significant
difference at P < 0.01).
Figure 2: Reduction in root-knot nematode damage on tomato by Equity field

trial 2. Root systems of 54 plants sampled from within 6 replicate blocks
of each treatment were dug after harvest and rated for gall severity
using a 0 10 scale (Zeck 1971), where 10 is most severe. The mean gall
rating for Equity was 2.3 and it was 4.1 for the control (significant
difference at P < 0.01).
250
Table 3.
Reduction in severity of root-knot nematode galls on tomato treated with
Equity in three field trials in 2003.
a
Root systems of 36 plants sampled from within 6 replicate blocks of each treatment
were dug after harvest and rated for gall severity using a 0 10 scale (Zeck 1971),
where 10 is most severe.
Figure 3: Production of new roots after nematode infection on Equity-treated tomato

plants. Photograph depicts common observation in field trials 3, 4, and
5 in which Equity treated plants (left) continued producing new roots
after nematode infection while control plants (right) did not.
251
Tests with Naturize Potted Plant Food

Naturize Potted Plant Food (NPPF) was evaluated on seedlings and on transplants
of tomato and pepper. In experiment Naturize 1 (Table 4), NPPF with and without
1% humate increased (P = 0.05) total plant weight, root weight, shoot weight, and
R/S ratio of tomato and pepper seedlings, compared to the control treatment of the
corresponding fertilizer without bacteria. In addition, the treatments with the
bacterial consortia in NPPF also increased height and stem caliper of tomato seedlings.
The effect of humate on seedlings depended on the crop. There were no statistical
differences among treatments on any growth parameters of pepper, but on tomato,
the addition of humate increased, compared to NPPF without humate, all parameters
except R/S ratio and significantly increased shoot weight.
Table 4.
Promotion of tomato and pepper seedling growth with Naturize Potted
Plant Food containing PGPR (experiment Naturize 1).
a
NPPF = Naturize Potted Plant Food
b
R/S is the root/shoot ratio.
c
ND indicates that the value was not determined.
On transplants in experiment Naturize 2 (Table 5), NPPF with and without

humate increased (P = 0.01) tomato total plant, root, and shoot weights
and pepper total and root weights, compared to the fertilizer control
without bacteria. The addition of humate did not further increase the
measured weights compared to NPPF without humate. Pepper transplants
treated with NPPF with or without humate exhibited a faster growth rate,
compared to plants treated with the fertilizer control without bacteria, as
indicated by divergent growth indexes beginning at 9 days after
transplanting (Figure 4).
252
Table 5.
Growth promotion of tomato and pepper transplants with Naturize
Potted Plant Food containing PGPR (experiment Naturize 2).
a
NPPF = Naturize Potted Plant Food.
Figure 4: Stimulation of pepper transplant growth rate by Naturize Potted

Plant Food (NPPF) with and without 1% humate. NPPF contains 14-29-14
soluble fertilizer plus spores of the same Bacillus spp. strains that
were in Equity. The fertilizer control is 14-19-14 soluble fertilizer without
bacteria.
Tests with Plant Growth Activator

Treatment of sunflower seeds with PGA at concentrations of 106, 107, and 108
CFU/ml in experiment PGA-1 resulted in increased (P = 0.05) total plant, shoot,
and root weights (Table 6A), while stem caliper was increased with the two highest
253
rates of PGA. This increased plant growth continued through 35 days after planting,
when all three PGPR concentrations also increased total plant, shoot, and root
weights. At 48 days after planting, plants that received all concentrations of PGA
had enhanced (P = 0.05) photosynthetic capacity, as indicated by chlorophyll
content and leaf area (Table 6B). Quality of flowers, as measured by stem length
and flower diameter, were also generally greater with PGA-treated plants.
Table 6A.
Effects of PGA on sunflower seedling growth (experiment PGA-1).
Values shown are means of two experiments with 10 replicate plants.

* Indicates significant difference from the control value of the same column at P < 0.05.
Table 6B.
Effects of PGA on photosynthetic capacity and quality of sunflower 48 days
after planting (experiment PGA-1).
Values shown are means of two experiments with 10 replicate plants.

In experiment PGA-2, PGA increased (P = 0.05) parameters of tomato plant

growth and root architecture from 6 through 30 days after planting (Table 7). Growth
promotion on plants treated with PGA was evident as early as 6 days after planting,
when the mean root weight was increased, which resulted in a higher R/S ratio. At
254
the subsequent sampling times (10, 14, and 30 days after planting) PGA-treated
plants had higher shoot and root weights than control plants. Significant (P = 0.05)
changes in root architecture on PGA-treated plants were also evident as early as 6
days after planting, when root surface area, root length, length of fine roots (those
with a diameter of 0 0.5 mm), and number of root tips were greater than on
control plants. At 30 days after planting, significant increases existed in all measured
parameters of root architecture on PGA-treated plants except root volume.
Table 7.
Effects of PGA on tomato seedling growth and root architecture (experiment PGA-2).
Values shown are means of 6 replicate plants.

a
Fine roots are the smallest diameter class (0 0.5) determined by the WinRhizo
analyses.
* Indicates increase compared to control at P < 0.05.
Tests with Restore from Pathway Holdings

In Restore test 1, which simulated two delivery systems for the thixotropic
formulations of the PGPR consortia, the mean populations determined from
three tests were log 6.06/ml with the process column and log 9.82/ml for the
tank mix. In Restore test 2 (Table 8), both application systems of PGPR (tank
mix alone and tank mix + process column) promoted early seedling growth.
This growth promotion was evident as significantly increased overall seedling
weight and root weight as well as changes in the root architecture, including
increased root length, surface area, and numbers of root tips.
Results from the three biological control assays (Table 9) showed that the
disease pressure in the tests was moderately severe, with mean disease
255
Table 8.
Effects of Restore applications on cucumber seedling growth and root
architecture (Restore test 2).
incidence of the non-inoculated controls ranging from 35% with Pythium

ultimum to 45% with P. aphanidermatum. Under these conditions, Restore,
applied with both applications systems significantly reduced damage to all
three soilborne pathogens. Protection was evident as reductions in both pre-
emergence damping-off (emergence at 5 DAP) and post-emergence damping
off (final stand). Restore also resulted in healthier root systems (Fig. 5).
Figure 5: Biological control of Pythium ultimum damping-off by Restore.

From Restore test 3. Right = water control; left = Restore; both were
inoculated with the pathogen.
256
Table 9.
Biological control activity of Restore against soilborne pathogens on
cucumber (Restore tests 3-5).
Values shown are means of 10 replications, each with 10 seedlings.

1
Days after planting.
2
Number of missing, dead, or wilted plants.
Discussion
The results presented here demonstrating plant growth promotion and
biological control with Restore (the thixotopic formulation of PGPR from
Pathway Holdings) and earlier product formulations of the same core bacterial
consortium (Equity, Naturize Potted Plant Food, and PGA) are in agreement
with results from several published studies with two of the earlier products.
For example, two publications have reported effects of Equity. In the first study,
Equity was reported to increase plant growth and to reduce salt uptake of
squash plants growing under conditions of salinity stress (Yildirim et al.
2006). In another study with root-knot nematode (Meloidogyne incognita) on
tomato, treatment with Equity induced significant reductions in nematode
eggs per gram root, juvenile nematodes in soil, and galls per plant (Burkett-
Cadena et al. 2008).
257
Three publications have reported benefits of PGA. Kalogridis et al. (2006)

presented results of two field trials in Florida using PGA against Fusarium wilt
disease, caused by Fusarium oxysporum, on the ornamental plant Lisianthus
(Eustoma grandiflorum) demonstrating that the PGPR consortium provided
protection against the pathogen and that this protection with the consortium
was superior to products with limited or single microbial species.. The same
publication also presented results of a field trial showing that PGA reduced disease
incidence on two varieties of basil (Ocimum basilicum) transplanted into a field
infested with the Fusarium wilt pathogen, F. oxysporum. As summarized by the
authors, basil treated with the bacterial consortium showed a drastic decrease
in the incidence of Fusarium wilt with both susceptible and resistant varieties
benefiting from applications. In the second report with PGA (Adesemoye et al
2008), PGA alone and with mycorrhizae increased yield and nutrient uptake in a
two-year field study on corn under conventional tillage and no-till with inorganic
fertilizer and poultry litter. The third report (Adesemoye et al. 2009) was a
greenhouse study with tomato under different fertilization levels. Inoculation with
PGA resulted in levels of plant growth, yield and nitrogen uptake per gram of
tomato shoot at 70% and 80% of recommended fertilizer that were statistically
equivalent to the values for non-inoculated plants with 100% fertilizer.
The thixotropic formulation, as embodied in the product Restore, represents
a promising advancement in the development of PGPR as microbial inoculants
by allowing formulations of mixed communities together with microbial food
bases that can aid bacterial population development. Considering that a typical
drip, furrow, or overhead irrigation system can deliver 100 ml per plant, the
finding in Restore test 1 that the populations of PGPR delivered were log 6.06
per ml with the process column and 9.82 per ml with the tank mix suggests that
Restore can be applied at populations of log 7 11 per plant with each irrigation.
In some agricultural settings, such as vegetable production in Florida, plants are
irrigated 4 6 times per week. Adding thixotropic formulations such as Restore
into each irrigation has the potential to dramatically modify the rhizosphere
microflora and to maintain the introduced PGPR in a metabolically active stage
during the entire growing season. In addition, because the components of the
thixotropic formulation can be changed relatively easily and inexpensively, one
can envision a future with customized PGPR consortia being applied periodically
during a season to address a particular site-specific need such as biocontrol of a
disease outbreak or alleviation of an abiotic stress.
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260
Captulo 14
Bacterias promotoras de crecimiento vegetal
como componentes en el mejoramiento
ambiental
Plant growth-promoting bacteria as a component for
environmental improvement
Luz E. de-Bashan, Juan-Pablo Hernndez y Yoav Bashan
Grupo de Microbiologa Ambiental, Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste
(CIBNOR), Mar Bermejo 195, Col. Playa Palo de Santa Rita, La Paz, B.C.S. 23090, Mxico, The
Bashan Foundation, 3740 NW Harrison Blvd., Corvallis, Oregon 97330, USA.
Introduccion
Las Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal [PBPB por sus siglas en
ingles Plant Growth Promoting Bacteria Bashan (Holguin 1998) o PGPR, Plant
Growth Promoting Rhizobacteria (Kloepper et al. 1980) en este capitulo nos
referiremos a estas como PGPB, trmino aceptado internacionalmente], son
bacterias aisladas de diversos ambientes con la habilidad potencial de afectar
de manera positiva el crecimiento de las plantas. La inoculacin con PGPB/
PGPR es una prctica agrcola comn que ha ido en aumento en aos recientes
(Bashan 1998; Diaz-Zorita, Fernandez-Canigia 2009). Las PGPB afectan a las
plantas mediante una multitud de mecanismos diferentes y existen en la
literatura revisiones extensivas que los describen (Lucy et al. 2004; Bashan, de-
Bashan 2005, 2010; Lugtenberg, Kamilova 2009). Probablemente algunos de
ellos son vlidos para las PGPB empleadas en los estudios ambientales, por
tal motivo, este capitulo no se centrara en la discusin de tales mecanismos.
Es bien conocido que existe un continuo descenso en la calidad ambiental
en todo el planeta debido a actividades humanas, principalmente
deforestacin y liberacin desmedida de contaminantes, tales como metales
pesados, y exceso de nutrientes (N y P) al ambiente. La opcin de retirar y
trasladar los contaminantes a rellenos sanitarios es costosa y con frecuencia
poco practica, debido principalmente a la cantidad de suelo involucrado,
como sucede en los desechos mineros, y al aumento constante de los sitios
contaminados. De esta manera, es importante encontrar opciones
biotecnolgicas de remediacin de bajo costo. Una de las estrategias
261
emergentes es el uso de tecnologas que usan las plantas como extractoras,

mitigadoras y estabilizadoras de los contaminantes (fitorremediacin) o que
estabilizan y recuperan la productividad del suelo (reforestacin)
(Cunningham et al. 1995; McCutcheon, Schnoor 2003). Los beneficios que
presenta la fitorremediacin involucran, entre otros, crear suelo ms sano,
promover y sostener comunidades bacterianas esenciales para una
biorremediacin a largo plazo y en ltimas, mejorar el paisaje (Mendez,
Maier 2008). Algunas plantas no pueden establecerse en estos sistemas
degradados, y aun en el caso en que lo hagan, generalmente se ven afectadas
por las condiciones ambientales adversas, tales como la excesiva
concentracin de los contaminantes, el pH extremo (alto o bajo), la escasez
de nutrientes, la pobre estructura del suelo y una comunidad microbiana
severamente afectada; como una forma de ayudar en su establecimiento se
ha propuesto su inoculacion con PGPB y con hongos micorrzicos
arbusculares. Estos microorganismos se encuentran actualmente bajo
experimentacin en programas de revegetacin, reforestacin de suelos
erosionados, tratamiento biolgico de aguas residuales, fitorremediacin,
fitoestabilizacion y restauracin de ecosistemas de manglar (Bashan et al.
1999; Bashan, Holguin 2002; de-Bashan et al. 2002a, 2004; Hernandez et al.
2006; Lebeau et al. 2007; Grandlic et al. 2008).
El objetivo de este capitulo es presentar el estado del arte en el uso de
PGPB en re-vegetacin y reforestacin de sitios desertificados y sitios
contaminados, fitoestabilizacion de desechos mineros, fitoextraccin de
metales pesados y contaminantes orgnicos, fitodegradacin de
contaminantes, reforestacin de manglares y mejoramiento de tratamiento
terciario de aguas residuales.
Uso de PGPB en la revegetacin y reforestacin de suelos

desertificados y erosionados
Los suelos de zonas ridas se ven continuamente degradados por las
actividades humanas (Wang et al. 2004) en un proceso llamado desertificacin.
La desertificacin reduce las tierras cultivables, aumenta la erosin del suelo
y el riesgo de inundaciones, reducen la produccin agrcola y producen
enfermedades respiratorias debido a la polucin por polvo (Mctainsh 1986;
Ortega-Rubio et al. 1998; Wang et al. 2004).
La restauracin de zonas desrticas severamente degradadas, con
arbustos, rboles y cactus es siempre difcil y en muchos casos solo
marginalmente exitosa (Glenn et al. 2001; Roundy et al. 2001; Bean et al.
2004; Banerjee et al. 2006). Entre los principales problemas que se presentan
en estas reas estn el que sistema de rboles nodriza que gobiernan la
vegetacin natural en el desierto se encuentra destruido y la capa superficial
de suelo con sus microorganismos benficos esta erosionada por accin del
viento y el agua, la materia orgnica es muy baja, la estructura del suelo esta
262
Bacterias promotoras de crecimiento vegetal comocomponentesenelmejoramientoambiental
destruida, hay una limitada disponibilidad de nutrientes y el agua es escasa.

Por estas razones, la sucesin natural y la revegetacin en estas zonas ridas,
si ocurre, es muy lenta, por lo que cualquier intento de reforestar el desierto
con plantas nativas debe considerar primordialmente la restauracin de la
microflora benfica asociada con estos rboles y arbustos, adems de
proporcionar una fuente adicional de materia orgnica (Velzquez-Rodrguez
et al. 2001; Bacilio et al. 2006; Grandlic et al. 2008; Bashan, de-Bashan 2010).
Entre las estrategias utilizadas para encarar la desertificacin estn la de
reforestar con plantas nativas y exticas (Moore, Russell 1990; Miyakawa 1999),
crear una cobertura agrcola y de pastizales (Portnov, Safriel 2004), mejorar la
calidad del suelo con compost o lodos para aumentar el contenido de materia
orgnica y la capacidad de retencin de agua (Mendez et al. 2007), e inocular las
plantas con microorganismos promotores de crecimiento vegetal (Grandlic et al.
2008; Bashan et al. 2011). De manera especifica, la reforestacin en suelos
desrticos degradados involucra al menos tres etapas (Grover, Musick 1990).
Primero, es necesario establecer de manera rpida una cubierta vegetal con plantas
anuales nativas que contrarresten el proceso de erosin, una tarea difcil de realizar
cuando las lluvias son espordicas o impredecibles (Roundy et al. 2001; Banerjee
et al. 2006). Segundo, se requiere el establecimiento de una cobertura de plantas
tipo arbustivas para lograr la reforestacin a corto y mediano plazo (Bean et al.
2004). El ultimo paso es el establecimiento de un programa a largo plazo que
controle la erosin del suelo, utilizando plantas de crecimiento lento tales como el
cactus cardn gigante Pachycereus pringlei (Bashan et al. 1999, 2000b).
Como una forma de coadyuvar en programas de revegetacin, deben
introducirse de manera artificial algunos microorganismos esenciales que
promuevan el crecimiento de las plantas. Las PGPB y los hongos micorrzicos
arbusculares son benficos en ambientes limitantes y adversos, debido a su
rol en la mitigacin de estreses ambientales en las plantas (Sylvia, Williams
1992). Las PGPB del genero Azospirillum ejercen sus principales efectos
promotores de crecimiento cuando las plantas estn sometidas a estrses
tales como alta salinidad (Bacilio et al. 2004), sequa (Creus et al. 1997, 1998),
excesivos cidos hmicos (Bacilio et al. 2003), pH (de-Bashan et al. 2005), y
metales pesados (Belimov, Dietz 2000). Las hifas de los hongos micorrzicos
arbusculares permean grandes volmenes de suelo (Camel et al. 1991),
interconectando los sistemas radicales de las plantas adyacentes -lo cual facilita
el intercambio de nutrientes entre ellas- contribuyendo al crecimiento de las
plantas y al mejoramiento de la estructura del suelo, debido a su intima
asociacin con las clulas vivas dentro de las races y el suelo (Bethlenfalvay,
Schepp 1994; Wright, Upadhyaya 1998; Bethlenfalvay et al. 2007).
Hasta el momento se ha publicado una relativamente gran cantidad de
trabajos que describen la utilizacin de la PGPB Azospirillum brasilense, de amplio
uso en agricultura, para mejorar el crecimiento de plantas en desiertos que han
perdido su capacidad natural de revegetacin (Puente, Bashan 1993; Bashan et
al. 1999; Carrillo-Garcia et al. 2000; Carrillo et al. 2002; Bacilio et al. 2006). A.
263
brasilense posee mltiples mecanismos de promocin de crecimiento tales como

la produccin de varias fitohormonas principalmente IAA, giberelinas y oxido
ntrico, tiene capacidad diaztrofa, adems de varios mecanismos menores, todos
trabajando en secuencia para mejorar el crecimiento de las plantas (Bashan et
al. 2004; Bashan, de-Bashan 2010). Estudios iniciales han demostrado que al
inocular el cactus Pachycereus pringlei con A. brasilense hay un aumento en el
crecimiento de la planta (Puente, Bashan, 1993). En un experimento de campo a
lo largo de un camino de ripio altamente erosionado en Mxico, tres especies
diferentes de cactus fueron inoculadas con la bacteria y como resultado se
obtuvo un porcentaje mayor de sobrevivencia, 76%, de estas plantas en
comparacin con plantas control no inoculadas, donde menos del 2% de las
plantas sobrevivieron despus de 3.5 aos. El resultado ms significativo en
este cultivo de cactus fue el control de la erosin del suelo en el rea y la
acumulacin de suelo superficial nuevo (Bashan et al. 1999). Adicionalmente, A.
brasilense afecta la actividad de las enzimas de la va del fosfogluconato y mejora
el crecimiento de plntulas de mezquite amargo (Prosopis articulata) que han
sido cultivadas en suelos pobres (Leyva, Bashan 2009).
En un ensayo en invernadero, se estudi el efecto que la inoculacin con
PGPB (A. brasilense y Bacillus pumilus), hongos micorrzicos arbusculares no
identificados (principalmente Glomus sp.) y compost comn, ejerca sobre tres
rboles de leguminosa de lento crecimiento, comnmente usados en programas
de reforestacin y en jardinera en el desierto de Sonora, en el noroeste de
Mxico y el suroeste de Estados Unidos. El mezquite amargo y el palo verde
(Parkinsonia microphylla) respondieron de manera positiva en varios de los
parmetros medidos, mientras que no se obtuvo respuesta con palo junco
(Parkinsonia florida). La sobrevivencia de las tres especies fue de ms del 80%,
con una sobrevivencia del mezquite de ms del 100% despus de 10 meses de
cultivo. La inoculacin con microorganismos promotores de crecimiento ocasion
efectos significativos en el intercambio gaseoso en las hojas de estas plantas,
medido como la transpiracin y la resistencia a la difusin, cuando estos rboles
fueron cultivados sin restricciones de agua (Bashan et al. 2009). Con esta misma
combinacin de inoculacin se realizaron siete ensayos en campo, utilizando
adicionalmente cactus cardn. La estrategia para reducir el largo proceso de
sucesin ecolgica en el desierto, que usualmente se presenta durante el
establecimiento de plantas clmax tales como el cactus cardn, fue asociar las
plntulas del cactus con rboles de leguminosa que actan como nodrizas y
ayudan al establecimiento y crecimiento del cactus (Bashan et al. 1999, 2000b;
Carrillo-Garcia et al. 1999). Este estudio de campo demostr que la restauracin
de zonas desrticas severamente erosionadas es posible utilizando rboles de
leguminosa nativos ayudados parcialmente por agentes microbianos y compost,
destinados a aumentar la fertilidad del suelo y la actividad microbiana cerca de
estos (Bashan et al. 2011).
Adicional al uso de las PGPB de origen agrcola, se han aislado PGPB nativas
del desierto de la superficie de races de cactus cardon (Puente et al. 2004a),
264
endfitas de cardones (Puente et al. 2009a) y endfitas del cactus Mammillaria

fraileana (Lopez et al. 2011a), estas dos especies de cactus creciendo como
plantas pioneras sobre rocas y riscos en ausencia de suelo. Las bacterias
endfitas aparentemente intemperizan las rocas sobre las cual crecen las
plantas, liberando minerales esenciales y al mismo tiempo producen pequeas
cantidades de suelo que posteriormente ser lavado de las pendientes y
acumulado en las tierras bajas, permitiendo de esta manera el crecimiento de
otras plantas del desierto que no son capaces de crecer sobre rocas (Lopez et
al. 2009). Al eliminar las endfitas de las semillas se obtiene un crecimiento y
desarrollo ms lento en las plntulas de cactus. Cuando se inocularon semillas
de estos cactus con las mismas bacterias y se cultivaron en roca molida por un
periodo largo de tiempo, casi todas las bacterias mostraron ser promotoras
de crecimiento para estas plantas, permitindoles establecerse en ambientes
extremadamente adversos (Puente et al. 2004b, 2009b; Lopez et al. 2011b).
Finalmente, varias PGPB aisladas de zonas ridas mejoraron el enraizamiento
de esquejes de mezquite (Felker et al. 2005).
El empleo de hongos micorrzicos arbusculares es comn en la reforestacin
con arbustos y rboles en zonas templadas aunque menos en zonas desrticas.
A pesar de que se ha demostrado la existencia de hongos micorrzicos
arbusculares en numerosas especies de rboles y cactus del desierto (Carrillo-
Garcia et al. 1999; Bashan et al. 2000; Bashan et al. 2007), la inoculacin con
estos microorganismos es todava escasa. Es probable que los hongos
micorrzicos arbusculares jueguen un papel similar en las plantas del desierto al
que ejercen en cultivos agrcolas, porque las plantas dependen de estos hongos
simbiticos para la adquisicin de nutrientes, especialmente fsforo y en general,
el transporte de minerales. Sin embargo, los datos cientficos son aun escasos.
Combinaciones de hongos micorrzicos arbusculares nativos (Glomus
coronatum) y no nativos (G. intraradices), Rhizobium y otras PGPB han sido
utilizadas para aumentar el crecimiento de plantas en un desierto semirido.
La inoculacin con Rhizobium dio como resultado un aumento en la biomasa
de raz y tallo y en la nodulacin de las races, mientras que las PGPB
aumentaron la germinacin de las semillas. Los hongos micorrzicos
arbusculares nativos fueron mas efectivos que los no nativos, sugiriendo que
los aislados nativos pueden ser mas apropiados para las condiciones especificas
de este ecosistema (Requena et al. 1997). De manera similar, bacterias
genticamente modificadas que colaboran con las micorrizas, fueron
desplazadas por las cepas silvestres (Valdenegro et al. 2001). En un estudio
de 5 aos, se encontr que la inoculacin con hongos micorrzicos arbusculares
y rhizobia mejoro el establecimiento de plantas clave del ecosistema y,
adicionalmente, aument la fertilidad del suelo (Requena et al. 2001).
Uso de PGPB en la restauracin y reforestacin de manglares

Los bosques de mangle son ecosistemas marinos tropicales
265
constantemente amenazados por el desarrollo costero y la proliferacin de

la acuacultura (Rnnbck 1999). Estos ecosistemas proporcionan un servicio
ambiental importante, al actuar como sitios de reproduccin de incontables
especies marinas y de aves acuticas que son un requisito irreemplazable
para las pesqueras en los trpicos (Holguin et al. 2001). Adems, los manglares
constituyen una barrera natural que protege a las poblaciones costeras y los
arrozales de las tormentas tropicales y tsunamis, principalmente en Asia.
Aunque los manglares en los trpicos hmedos son mas fciles de reforestar
(Primavera et al. 2004), los manglares en ambientes ridos y semiridos son
especialmente sensibles y tienen dificultades para regenerarse despus de
una perturbacin (Toldeo et al. 2001; Vovides et al. 2011). Se ha predicho que
sin la restitucin de la red nutricional microbiana, la restauracin de los
manglares puede ser difcil, si no imposible (Holguin et al. 2001). En
consecuencia, se han realizado estudios para caracterizar estos ecosistemas,
sus comunidades y procesos microbianos, incluyendo estudios con bacterias
fijadoras de nitrgeno y el proceso de fijacin de nitrgeno (Holguin et al.
1992; Toledo et al. 1995a; Flores-Mireles et al. 2007; Vovides et al. 2011), la
solubilizacin de fosfato (Vazquez et al. 2000; Rojas et al. 2001), metanognesis
(Strangmann et al. 2008) y las poblaciones de bacterias hetertrofas (Gonzalez-
Acosta et al. 2006), con el fin de desarrollar estrategias exitosas de revegetacin
(Holguin et al. 2006).
Bashan y Holguin (2002) propusieron inicialmente el uso de PGPB para
reforestar manglares deteriorados y realizaron un bosquejo de las posibles
interacciones microbianas que estn involucradas en este proceso. Ellos
identificaron una coleccin de bacterias aisladas de este ecosistema que poseen
mecanismos de promocin de crecimiento, tales como fijacin de nitrgeno,
solubilizacin de fosfato y produccin de fitohormonas. Trabajos iniciales
inoculando mangle con la cianobacteria diaztrofa Microcoleus chthonoplastes,
aislada de los neumatforos de mangles, dieron como resultado el aumento en
la colonizacin radicular y la acumulacin de nitrgeno in planta (Toledo et al.
1995b; Bashan et al. 1998). Esta cianobacteria y varias otras PGPB del manglar,
han sido tambin benficas para Salicornia bigelovii, una planta oleaginosa
halfita anual que habita en marismas en asociacin con bosques de mangle.
La inoculacin de estas plantas aument la biomasa vegetal en un 70% y mejor
la calidad de sus aceites esenciales (Bashan et al. 2000a).
Se han realizado tambin importantes trabajos inoculando A. brasilense
en plntulas de mangle. Trabajos iniciales demostraron que dos especies, A.
brasilense y A. halopraeferens, colonizaron la superficie de las races de
plntulas de manglar negro (Puente et al. 1999). Estudios adicionales se han
enfocado en el aislamiento y caracterizacin de grandes colecciones de
potenciales PGPB de las plantas de mangle y de las condiciones que controlan
su proliferacin (Holguin, Bashan 1996; Rojas et al. 2001; Kathiresan, Selvam
2006; Flores-Mireles et al. 2007). Kathiresan y Selvam (2006) estudiaron una
coleccin de 48 aislamientos y reportaron que dos de ellos demostraron el
266
potencial de aumentar el crecimiento de las plantas en ms del 100%,

hacindolos excelentes candidatos para proyectos de reforestacin.
Uso de PGPB en la fitorremediacin de suelos contaminados

La fitorremediacin es una estrategia para solucionar la contaminacin
de suelos mediante el uso de plantas que actan como mitigadoras del
problema, sin necesidad de extraer el material contaminante y disponerlo en
otro sitio. Las plantas son capaces de acumular, degradar o eliminar metales,
pesticidas, solventes, petrleo y una gran variedad de contaminantes
industriales. Se han documentado muchos ejemplos de fitorremediacin
exitosa (Suresh, Ravishankar 2004). La fitorremediacin es generalmente
considerada como una tecnologa limpia, econmica, ambientalmente
amigable y no disruptiva, con la posibilidad adicional de recuperar y reusar
los metales extrados. La principal desventaja es que requiere un compromiso
a largo plazo, ya que el proceso depende del crecimiento de la planta, su
tolerancia a la toxicidad y su capacidad de bioacumulacin. La
fitorremediacin comprende varias aproximaciones independientes en
algunas de las cuales las PGPB podran tener un efecto positivo:
a. Fitodegradacin
La poblacin microbiana de la rizsfera de algunas plantas puede contar
con especies capaces de degradar xenobiticos (Donnelly et al. 1994; Mackov
et al. 2007; Mendez, Maier 2008) y puede servir como promotora de
crecimiento cuando las plantas crecen en estos suelos contaminados. En un
suelo contaminado artificialmente con creosote, la inoculacin con bacterias
degradadoras de hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) y PGPB
(Pseudomonas putida, Azospirillum brasilense y Enterobacter cloacae) aument
la velocidad de eliminacin de los HAP en presencia de las PGPB, debido
posiblemente a que estas son capaces de mitigar el estrs en plantas por la
actividad de la ACC-deaminasa, un mecanismo comn en este tipo de bacterias
(Huang et al. 2004). Adicionalmente, las PGPB Pseudomonas spp. mejoraron
el crecimiento de canola en presencia de cobre o HAP (Reed, Glick 2005; Reed
et al. 2005). Las PGPB tambin participaron en la degradacin de cido 2-
clorobenzoico y petrleo en suelos donde crece Vicia faba (Radwan et al.
2005). Un plsmido fue transferido de Burkholderia cepacia a una cepa de
PGPB endfita de esta planta para proteger el nuevo husped contra la
toxicidad de tolueno y reducir su evaporacin (Barac et al. 2004; Glick 2004).
b. Fitoextraccin
En la fitoextraccin (conocida tambin como fitoacumulacin) las plantas
eliminan los contaminantes del ambiente concentrndolos en su biomasa
267
vegetal. El proceso ha sido evaluado principalmente en la extraccin de

metales pesados. Dentro de la biomasa vegetal, los contaminantes estn ms
concentrados que en el ambiente, un hecho que facilita su disposicin final.
La fitoextraccin puede realizarse con plantas hiperacumuladoras, es decir,
plantas que pueden tolerar y absorber mayor cantidad de metales txicos
que las plantas regulares. Estas plantas tambin pueden producir quelantes
que faciliten la movilizacin de los mentales y permitan una ms fcil absorcin
(Cunningham et al. 1995; Pilon-Smits 2005).
Dado que las plantas absorben contaminantes del suelo mediante el
sistema radicular, los factores biolgicos que modifican el metabolismo de las
races tales como la inoculacin con PGPB podran mejorar este proceso. Las
PGPB mejoran la fitoextraccin de dos maneras: 1) aumentando el crecimiento
general de la planta de manera que la mayor biomasa absorba una mayor
cantidad del contaminante, y 2) mejorando la dilucin y/o biodisponibilidad
del contaminante, hacindolo ms fcil de absorber por las plantas (Lebeau
et al. 2007). Una PGPB ideal podra tener los dos mecanismos (Sheng, Xia
2006; Saravanan et al. 2007; Rajkumar, Freitas, 2008a) pero usualmente se ha
estudiado uno solo ellos. La biomasa seca de soya creciendo en suelos
contaminados con arsnico aument como respuesta a la inoculacin con
Bradyrhizobium japonicum (Reichman 2007). La elongacin de las races de
helechos y la acumulacin de arsnico aumentaron debido a la inoculacin
con bacterias rizosfricas (Jankong et al. 2007). Variovorax paradoxus tiene la
capacidad de aumentar la elongacin de la raz de la mostaza india (Brassica
juncea ) en presencia de cadmio (Belimov et al. 2005). La inoculacin con
cepas bacterianas en diferentes plantas aument significativamente la
acumulacin de varios metales, pero sin aumento en la biomasa vegetal; sin
embargo, la inoculacin podra mejorar la nutricin vegetal como un todo
(Hoflich, Metz, 1997; Whiting et al. 2001; Reed, Glick 2005; Rajkumar, Freitas
2008a). Varias cepas rizosfricas mejoraron la volatilizacin y la acumulacin
de Se y Hg en tejidos vegetales en un humedal construido artificialmente (de
Souza et al. 1999a, b). El aumento en la solubilidad de metales y la subsiguiente
absorcin por parte de la planta de estos contaminante puede ser el resultado
de la produccin de cidos orgnicos por algunas PGPB (Saravanan et al. 2007),
ya que se sabe que muchas PGPB solubilizadoras de fosfato producen cidos
orgnicos (Vazquez et al. 2000; Puente et al. 2004 a,b; Rodriguez et al. 2004,
2006; Lopez et al. 2011b).
c. Fitoestabilizacion de desechos mineros

La gran cantidad de desechos mineros, producidos por el procesamiento
de minerales en minas tanto abandonadas como productivas, es una amenaza
de salud a largo plazo en las poblaciones urbanas circundantes, en forma de
polvo toxico y contaminacin de las fuentes de agua. Esto sucede porque los
desechos mineros, al carecer de una cobertura vegetal y estructura de suelo
268
como tal, son fcilmente degradados por accin del viento y la lluvia,
convirtindose en una continua fuente de contaminacin por metales (Pilon-
Smits 2005). De esta manera, se ha propuesto la fitoestabilizacin usando
plantas nativas como una estrategia econmica para reducir estos riesgos
(McCutcheon, Schnoor 2003). Esta aproximacin involucra la creacin de
una cobertura vegetal sobre los desechos mineros que sea suficientemente
densa para prevenir su erosin. Un importante desafo es que algunos de
esos desechos mineros no sirven, en su estado natural, como sustrato para el
crecimiento de la mayora de las plantas, debido a su concentracin de metales
txicos, bajo pH, carencia de minerales esenciales, de arcillas y material
orgnica que pueda retener agua, de cualquier estructura de suelo, de un
banco de semillas de plantas nativas o la combinacin de todos estos
parmetros ambientales (Mendez, Maier 2008). De esta manera, los desechos
mineros pueden permanecer desprovistos de plantas por dcadas o en el mejor
de los casos, solo contar con una ligera cobertura vegetal (Gonzalez-Chavez et
al. 2008). Una solucin parcial puede ser la adicin de gran cantidad de
compost, bioslidos y agua (Ye et al. 2001; Chiu et al. 2006) de manera que se
restituyan las condiciones del suelo. Aunque posible, tales enmiendas son
costosas debido al gran volumen de estos desechos mineros y en algunos
casos a su remota localizacin. Ms aun, en zonas desrticas no existe un
suministro de agua constante y suficiente.
Se ha propuesto la inoculacin con PGPB y con hongos micorrzicos
arbusculares como una forma de ayudar a las plantas a establecerse en los
desechos mineros, y reducir la cantidad de compost necesaria para su
mejoramiento (Petrisor et al. 2004; Zhuang et al. 2007; Mendez, Maier 2008;
Sols-Domnguez et al. 2011). Existen dos aproximaciones en la bsqueda de
PGPB compatibles con los desechos mineros. Una es aislar bacterias nativas,
con capacidad de promover el crecimiento, directamente de los desechos
mineros o de las plantas que crezcan sobre estos, propagarlas y usarlas como
inoculantes. Este procedimiento aunque laborioso, ha sido probado de manera
exitosa (Grandlic et al. 2008, 2009). La premisa en esta aproximacin es que
las PGPB aisladas de los desechos mineros pueden ayudar a la planta a
sobrevivir y crecer a travs de varios mecanismos incluyendo el aumento en
disponibilidad de nutrientes, aumento en la resistencia a la toxicidad por
metales o la disminucin de la biodisponibilidad de metales txicos en la
rizsfera (Burd et al. 1998, 2000; Pishchik et al. 2002; Glick 2003; Belimov et
al. 2004; Reed, Glick, 2005; Reed et al. 2005; Vivas et al. 2006; Wu et al. 2006a;
Li et al. 2007; Rajkumar, Freitas 2008a, b). La aproximacin alternativa es
examinar muchas PGPB utilizadas en agricultura (Bashan, de-Bashan 2005)
que pudieran ayudar a las plantas a establecerse sobre estos desechos. Por
ejemplo, el gnero Bacillus, que se encuentra comnmente en varios tipos de
desechos mineros (Natarajan 1998; Vijayalakshmi, Raichur 2003; Wu et al.
2006b; Tsuruta 2007; Zhang et al. 2007), ejerce un efecto positivo en el
crecimiento de cultivos agrcolas, plantas silvestres, rboles y microalgas, a
travs de de diferentes mecanismos de promocin de crecimiento vegetal
269
(Enebak et al. 1998; Vessey 2003; Kloepper et al. 2004 a,b; Ryu et al. 2005;
Hernandez et al. 2009). Otro gnero potencial es Azospirillum. La estimulacin
del crecimiento de races adventicias por A. brasilense no solo mejora la toma
de nutrientes, sino que tambin, como se expuso anteriormente, alivia el estrs
salino en diferentes plantas agrcolas (Creus et al. 1997; Bacilio et al. 2004;
Dimkpa et al. 2009). Este modo de accin fitoestimulatorio proporciona una
mayor rea superficial para la absorcin de nutrientes, una cualidad vital para
la sobrevivencia de las plantas en ambientes mineros altamente impactados y
con pocos nutrientes. De manera adicional, el aumento en la masa radicular
es deseable para la estabilizacin fsica de los desechos mineros contra la
erosin por viento y agua. Adems de la promocin de crecimiento y el
mejoramiento de la resistencia a estrs abitico, propiedades de que son
relevantes en su uso en desechos mineros, Azospirillum tambin ayuda a las
plantas a crecer en condiciones de bajo pH (Bashan 1999, de-Bashan et al.
2005) y metales pesados (Belimov, Dietz 2000).
Varios estudios han demostrado la factibilidad de utilizar PGPB de diferentes
fuentes en combinacin con compost. Algunos trabajos han mostrado que los
niveles ptimos de compost requeridos para el establecimiento de varias
especies de pastos y plantas en residuos mineros puede ser reducido por la
adicin de PGPB aisladas de residuos mineros adyacentes (Petrisor et al. 2004;
Zhuang et al. 2007; Gradlic et al. 2008). El reemplazar fertilizantes qumicos
por repetidas inoculaciones con Azotobacter chroococcum y Bacillus
megaterium mejor significativamente el crecimiento de plantas nativas y la
actividad microbiana en dos residuos mineros cidos (Petrisor et al. 2004).
Una serie de experimentos utilizando varios arbustos del desierto y rboles
demostr la capacidad de PGPB nativas y de origen agrcola para mejorar su
crecimiento en varios tipos de desechos mineros. Las PGPB aisladas de estos
desechos mineros, con capacidad de sobrevivir a pH cido y en concentraciones
altas de metales pesados (Mendez et al. 2008), junto con una moderada
cantidad de compost (Iverson, Maier 2009) aument significativamente la
biomasa del arbusto Atriplex lentiformis y del pasto Buchloe dactyloides. De
manera similar, como resultado de la inoculacin con la PGPB Bacillus pumilus
-aislada de races de cactus que crecen en rocas en ausencia de suelo (un
ambiente extremo para las plantas)- el crecimiento del arbusto Atriplex
lentiformis aumento significativamente, con un nivel de compost sub-optimo
(10% peso/peso comparado con el 15% normalmente requerido en estos
residuos mineros); adicionalmente, se vio un marcado efecto en la comunidad
bacteriana de desechos mineros tanto de tipo cido con alto contenido de
metales, como en residuos neutros con bajo contenido de metales (de-Bashan
et al. 2010a). La inoculacin con varias cepas de Azospirillum brasilense produjo
un efecto similar en el crecimiento de las plantas y en la comunidad bacteriana
en residuos cidos metalferos (de-Bashan et al. 2010 a,b). De manera similar,
la inoculacin de pasto bfalo con una mezcla de dos Arthrobacter spp. afect
a la comunidad bacteriana de la rizsfera despus de 75 das de crecimiento
(Grandlic et al. 2009). El efecto de la inoculacin sobre la comunidad bacteriana
270
en estos desechos, que no es aparente cuando la inoculacin se realiza con

estas bacterias en suelos agrcolas, puede estar relacionado con el
extremadamente bajo nivel de bacterias heterotrficas presentes (<103 UFC g-
1
) (Mendez et al. 2007). En el trasfondo de una comunidad bacteriana baja,
como la que existe en los residuos mineros, la inoculacin con B. pumilus o
A. brasilense (a un nivel de 106 UFC g-1) crea un cambio drstico y evidente en
la poblacin bacteriana nativa. Otra explicacin puede ser el que las PGPB
tienen una respuesta indirecta a mas largo plazo debido a la influencia del
inoculo en el crecimiento de la raz y/o en los exudados de las plantas despus
de que su poblacin inicial ha disminuido (de-Bashan et al. 2010 a,b).
Debido a que el mezquite tiene una alta tolerancia a la contaminacin
con metales (Senthilkumar et al. 2005), es un candidato potencial para la
revegetacin de desechos mineros. La inoculacin con una combinacin de
PGPB y A. brasilense aument significativamente el crecimiento de plntulas
de mezquite en desechos mineros de roca fosfrica (Moreno et al. sin publicar),
de manera similar al efecto de los hongos micorrzicos arbusculares en este
rbol. Aunque la inoculacin algunas veces aumenta la absorcin de metales
en mezquite, esto no sucedi cuando se inocularon varios tipos de hongos
micorrzicos arbusculares en mezquite creciendo en desechos cidos con altas
concentraciones de metales pesados (Sols-Domnguez et al. 2011). La
nodulacin y el crecimiento de rboles de Albizia lebbeck creciendo en residuos
de minas de yeso y piedra caliza aumentaron como resultado de su inoculacin
con Bradyrhizobium sp. (Rao, Tak 2001).
Podra haber sin embargo un lado negativo en el uso de PGPB para la
fitoestabilizacion de desechos mineros; el aumento en la extraccin de metales
del suelo hacia la biomasa vegetal podra dar como resultado plantas toxicas
para los animales, tanto silvestres como ganaderos, que se alimentan de ellas.
En plantas de Brassica juncea, la inoculacin con PGPB tuvo un efecto menor
en la absorcin de Cu, Pb y Zn, pero un aument significativo en la absorcin
de Cd en el tejido del vstago (Wu et al. 2006 a,b), y un aumento en las
concentraciones de Cu, Cd, Mn y Zn en tejidos del vstago en plantas nativas
(Petrisor et al. 2004). El aumento en la concentracin de metales en el vstago
de canola despus de la inoculacin puede suceder principalmente en bajas
concentraciones de metales permitiendo el crecimiento de la planta (Reed,
Glick 2005).
Se puede concluir que en un ambiente extremadamente estresante como
el de los desechos mineros txicos, una PGPB inoculada, no solo puede persistir
y estimular el crecimiento vegetal, sino que tambin puede directa o
indirectamente influir en el desarrollo de la comunidad rizobacteriana. Estas
PGPB pueden ser tanto nativas de los residuos mineros como inoculantes
agrcolas comunes. Las PGPB como un componente en programas de
fitoestabilizacion, junto con compost y plantas que no acumulen metales, para
evitar afectar a los animales que las pastorean, son la opcin ms viable para
271
lograr la cobertura vegetal de estos desechos txicos. Sin embargo, es

necesario encontrar le combinacin optima entre PGPB y compost o encontrar
una combinacin planta-PGPB que no requiera la aplicacin de esta.
Uso de PGPB como ayuda en el tratamiento terciario de agua

residual
En el tratamiento terciario de aguas residuales se busca eliminar
principalmente el exceso de nutrientes (compuestos de nitrgeno y fsforo)
resultado del tratamiento secundario -digestin de la material orgnica- antes
de su descarga a cuerpos de agua naturales o de su venta para irrigacin (de-
Bashan, Bashan 2004, 2010). El desarrollo de tratamientos que eliminen de
manera eficiente y econmica estos nutrientes es de mayor importancia ya que
su produccin aumenta da con da. Numerosas especies de microalgas son
usadas comnmente para remover nitrgeno y fsforo de aguas residuales
tanto domesticas como municipales (Tam, Wong 2000; Valderrama et al. 2002;
de-Bashan, Bashan, 2004). Tradicionalmente, las PGPB no se emplean en estas
tecnologas. Sin embargo, la idea de usar PGPB para el tratamiento de aguas
residuales se origin de la presuncin que las microalgas usadas para tales
tratamientos son bsicamente plantas unicelulares. Como plantas, ellas deben
responder a inoculacin con PGPB. El modelo bsico de la asociacin entre la
microalga Chlorella vulgaris y la PGPB Azospirillum brasilense inmovilizadas de
manera conjunta en esferas de alginato ha sido desarrollado en la ultima
dcada (Gonzalez, Bashan 2000; de-Bashan, Bashan 2008). Esta combinacin
de los dos microorganismos es altamente eficiente en la eliminacin de
nutrientes de varios tipos de agua residual, dejando el agua mas limpia y
produciendo una biomasa utilizable (de-Bashan et al. 2002a, 2004). En esta
asociacin, la microalga utiliza los nutrientes asistida por la PGPB, que mejora
su capacidad de absorcin al afectar su metabolismo y proliferacin.
A pesar de ser relativamente nueva, esta idea ha sido estudiada en aos
recientes de manera intensiva, investigando la efectividad del uso de las
microalgas Chlorella vulgaris y C. sorokiniana inmovilizadas de manera
conjunta con A. brasilense bajo diversas condiciones ambientales variando
desde moderadas hasta extremas (Gonzalez, Bashan 2000; de-Bashan et al.
2002 a,b; 2004; 2005, 2008c; Lebsky et al. 2001). Otros estudios han
demostrado que otros gneros bacterianos incluyendo Rhodanobacter ,
Pseudomonas, Bacillus y Paenibacillus sp. tienen el potencial de mejorar el
tratamiento de aguas residuales (Mouget et al. 1995; Ogbonna et al.
2000;Hernandez et al. 2009).
Estudios iniciales han mostrado que A. brasilense aumenta la tasa de
crecimiento y extiende la vida promedio de C. vulgaris (Gonzalez, Bashan
2000; Lebsky et al. 2001). La inmovilizacin conjunta de estas microalgas
con A. brasilense dio como resultado la eliminacin casi absoluta de amonio
y cerca de un tercio del fsforo despus de dos das de incubacin en cultivos
272
en lotes, comparado con las clulas de C. vulgaris sola (de-Bashan et al.

2002a). A. brasilense ha mostrado efectos benficos en parmetros de
crecimiento de la microalga tales como la produccin de pigmentos,
contenido total de lpidos, cambio en el patrn de cidos grasos, aumento
en el numero de clulas en la poblacin y aumento en el tamao celular (de-
Bashan et al. 2002b).
Para mejorar el efecto sinergstico entre estos dos componentes biolgicos,
se han estudiado los factores ambientales que afectan el crecimiento de la
microalga y los mecanismos celulares que controlan este sistema. Estos incluyen
pH, concentraciones de carbono y nitrgeno, intensidad luminosa combinada
con alta temperatura, toxicidad del triptofano y efectos hormonales (de-Bashan
et al. 2005, 2008a, b, c, de-Bashan, Bashan 2008). Los estudios fisiolgicos
indicaron que los posibles mecanismos que controlan el crecimiento son la
produccin la fitohormona AIA y el efecto en dos enzimas clave (glutamato
deshidrogenasa y glutamino sintetasa) en el metabolismo del nitrgeno,
responsables por la absorcin de amonio. El someter a los microorganismos
a periodos de ayuno antes del tratamiento de aguas tiene un efecto positivo en
la asimilacin de fsforo por parte de C. vulgaris y C. sorokiniana (Hernandez et
al. 2006). La inmovilizacin conjunta mejoro la absorcin de fsforo en las
dos especies en agua residual sinttica, y en C. sorokiniana en agua residual
domestica, despus de un periodo de tres das de ayuno en solucin salina. La
eliminacin de fsforo ms efectiva, 72%, cerca del doble de la eliminacin de
fsforo por mtodos biolgicos, se alcanz cuando un cultivo coinmovilizado
de clulas previamente sometido a ayuno fue usado para el tratamiento por un
ciclo y reemplazado con un cultivo fresco tambin en ayuno. Cuando se
cambiaron las condiciones de cultivo de autotrfico a heterotrfico (sin luz y
con una fuente adicional de carbono) el sistema coinmovilizado funcion de
mejor manera (Perez-Garcia et al. 2010).
La principal caracterstica de esta tecnologa es que la microalga
inmovilizada junto a Azospirillum siempre elimina ms fsforo que la microalga
sola. Como los dos microorganismos estn inmovilizados en esferas de alginato
que pueden ser fcilmente removidos del agua residual por sedimentacin.
Esta tecnologa podra potencialmente ser una alternativa econmica a la
precipitacin qumica comnmente usada para tratar el agua residual.
Conclusiones
Las bacterias promotoras de crecimiento vegetal pueden servir como
valiosos componentes en proyectos de biorremediacin de suelos, de agua,
de revegetacin y reforestacin de suelos degradados. Por si mismas, pocas
cepas pueden servir como biorremediadores directos al ser propagados en
grandes poblaciones. Sin embargo, su potencial aumenta al asociarse con
las plantas que son el principal componente en los procesos de remediacin.
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Captulo 15
Diversidad funcional de comunidades
microbianas rizosfricas en suelos
expuestos a sustancias contaminantes
Functional diversity of rhizosphere microbial
communities in soils exposed to contaminants
Jhovana S. Escobar Ortega, Luciana P. Di Salvo, Florencia DAuria, Sebastian
M. Gatica, Ins E. Garca de Salamone
Ctedra de Microbiologa Agrcola - Facultad de Agronoma - Universidad de Buenos Aires.
Av. San Martn 4453 (1417) Buenos Aires. E-mail: [email protected]
Introduccin
La degradacin del suelo se produce cuando se acumulan en l sustancias
que alteran negativamente su funcionamiento (Garca, Dorrosoro 2000). La
FAO define la contaminacin como una forma de degradacin qumica que
provoca la prdida parcial o total de la productividad del suelo. Por otra parte,
el diccionario de la Real Academia define a la contaminacin como la alteracin
de la pureza de alimentos, agua, aire, etc. Entonces, se puede considerar
contaminante a cualquier sustancia que altera la pureza de un sistema, ya sea
porque su concentracin es mayor a la usual o porque la misma esta presente
pero no es natural del sistema.
Existen diferentes tipos de sustancias contaminantes que llegan de distintas
maneras al suelo. Entre las mismas se pueden mencionar el fenantreno, el
antraceno y otras sustancias comnmente utilizadas en la agricultura, como el
glifosato. Los dos primeros son hidrocarburos policclicos aromticos (PAHs-
por su sigla en ingles) de bajo peso molecular formados por tres anillos
bencnicos condensados (Corona, Iturbe 2005). La fuente de contaminacin
con PAHs se debe a los derrames o desechos de algunas actividades industriales,
as tambin a la utilizacin de combustibles fsiles y a la quema de bosques
(Dean et al. 2001; Corgi et al. 2004). Adems, se conoce que estos PAHs,
presentan un potencial cancergeno elevado (IARC 1983), una alta toxicidad,
poca solubilidad en agua ya que son liposolubles y son muy persistentes en el
ambiente (Schwartz et al. 2002; Corona, Iturbe 2005). Por su parte, el glifosato
(N-fosfonometilglicina, C3H8NO5P, CAS 1071-83-6) es un herbicida total no
selectivo de amplio espectro absorbido por las hojas y no por las races, utilizado
287
Jhovana S. Escobar Ortega, Luciana P. Di Salvo, Florencia DAuria, Sebastian M. Gatica, Ins E. Garca de Salamone
para eliminacin de malezas indeseables y de arbustos, en especial para plantas

perennes ya sea en ambientes agrcolas, forestales y/o paisajsticos (Kaczewer
2003). El glifosato ejerce su accin herbicida a travs de la inhibicin de una
enzima, enol-piruvil-shikimato-fosfato-sintetasa (EPSPS), impidiendo as que
las plantas elaboren tres aminocidos aromticos esenciales para su
crecimiento y supervivencia. Adems se conoce que puede interferir con algunas
funciones enzimticas en animales. Los distintos compuestos incluidos en la
formulacin del glifosato pueden ser txicos para la microflora edfica. como
los componentes considerados inertes, por lo tanto las caractersticas
toxicolgicas de los productos de mercado son diferentes a las del glifosato
puro (Kaczewer 2003). Se sabe que el glifosato y sus sales presentan gran
solubilidad en el agua y por ello son mviles en el suelo (Tooby 1985).
Por su parte, este herbicida es de uso ms generalizado ya que se usa en
la agricultura, por ello la superficie de suelos expuestos a este compuesto es
mucho mayor que la superficie afectada por PAHs. Asimismo, stos ltimos
poseen menor degradabilidad que el glifosato. De acuerdo a la definicin
planteada para un contaminante, tanto los PAHs, tales como fenantreno y
antraceno, como el herbicida glifosato, pueden ser considerados
contaminantes de suelos ya que ambos tipos de sustancias alteran la pureza
del sistema edfico.
La contaminacin por hidrocarburos afecta las propiedades fsico-qumicas
del suelo, tales como la estructura, retencin hdrica y la saturacin de bases.
Las propiedades biolgicas del suelo y la fertilidad del suelo tambin son
afectadas por estos contaminantes (Prez Vargas et al. 2002). Distintos estudios
mostraron absorcin de PAHs en cultivos tales como: arroz (Tao et al. 2006a; Jiao
et al. 2007), repollo (Tao et al. 2006b) y maz (Lin et al. 2007). Tambin se observaron
mermas en los rendimientos de los distintos suelos agrcolas (Leyval, Binet 1998).
En el caso del glifosato, la probabilidad de que el herbicida pueda lixiviar,
alcanzando aguas subterrneas es definida por las propiedades del glifosato, del
suelo y de las condiciones climticas. Si bien muchos estudios cientficos afirman
que el glifosato es poco mvil en el suelo, algunos autores ponen en duda esta
afirmacin (Dinham 1998). La retencin de este herbicida en el suelo es el principal
proceso que regula su movilidad. En este sentido, se sabe que posee una alta
afinidad a ser retenido por las partculas del suelo, aunque, existen antecedentes
que muestran prdidas por lixiviacin a travs de vas de flujo preferencial cuando
las precipitaciones ocurren inmediatamente despus de la pulverizacin sobre
suelos hmedos (AEGA 2009). Cuando esta unido a otros compuestos, este herbicida
no puede degradarse, y cuando se une a los minerales del suelo, queda protegido
y puede volver a liberarse y dispersarse (Pessagno, dos Santos Afonso 2006). De
esta manera, el glifosato puede tener toxicidad para los microorganismos presentes
en el mismo en forma instantnea y diferida. Complementariamente, este herbicida
puede aportar carbono, fsforo y nitrgeno en forma de residuos y as favorecera
la proliferacin y el rpido crecimiento de los microorganismos oportunistas en el
suelo (Zabaloy et al. 2009).
288
Diversidad funcional de comunidades microbianas rizosfricas en suelos expuestos a sustancias contaminantes
En suelos sin ninguna alteracin, las sustancias biodegradables son

mineralizadas bajo las condiciones imperantes. As, el principal mecanismo
de disipacin de los contaminantes es la degradacin biolgica (Dean et al.
2001) debido a la actividad de la comunidad microbiana nativa del suelo
(Madigan et al. 1997). Por el contrario, en suelos alterados por el agregado de
una o mas sustancias contaminantes, la biodegradacin ocurre a una tasa ms
lenta que la normal por lo cual el suelo requiere ser biorremediado pues es un
sistema en el cual la comunidad biolgica ha interrumpido su normal
funcionamiento (Tate 2000).
Es para destacar que la principal fuente de carbono para los
microorganismos en los distintos sistemas terrestres son los restos vegetales
y los exudados radicales de los mismos (Kanopka et al. 1998). En base a este
ultimo, la fitorremediacin esta basada en la biodegradacin que ocurre en la
rizosfera. Esta depende de la cantidad de carbono proveniente de estos
exudados radicales y de los componentes especficos de dichos exudados
(Corgi et al. 2004). En este sentido, el aumento de la actividad metablica
sera producto de la exudacin de compuestos y de una mayor aerobiosis
dada por la mayor porosidad causada por la presencia de races en el suelo
(Corgi et al. 2004). Tambin se debe aclarar que la biodegradacin de los
contaminantes depende de los niveles de macro y micronutrientes,
necesitando por lo tanto del agregado de los mismos para as aumentar la
tasa metablica, sobre todo cuando la disponibilidad de sustratos carbonados
es alta (Tate 2000; Joner et al. 2002).
Por otra parte, en la agricultura, se utiliza el glifosato para el secado de
cultivos de cobertura tales como Avena strigosa (avena negra), Avena
byzantina (avena amarilla), Raphanus sativus var. oleiferus y el Lolium
multiflorum (ryegrass italiano) (FAO 1994), siendo estos utilizados para
mantener el suelo cubierto, protegindolo de la erosin, evitando la prdida
de nutrientes por lavado y escurrimiento, y favoreciendo la incorporacin de
nutrientes al sistema (Reeves, Touchton 1991; Carfagno et al. 2008). De esta
manera, tanto las races como la biomasa area de estos cultivos estaran
tambin estimulando la biodegradacin del contaminante (Gnther et al.
1996; Di Salvo et al. 2007; Lee et al. 2008).
Para la fitorremediacin algunos trabajos utilizan el ryegrass (Gnther et
al. 1996; Vouillamoz, Milke 2001; Corgi et al. 2003), ya que estos pastos
presentan sistemas radicales densos y ramificados, los cuales hacen que
presente mayor superficie de contacto con el suelo (Aprill, Sims 1990; Gnther
et al. 1996; Tesar et al. 2002; Krutz et al. 2005; Rivera Cruz et al. 2006).
Adems, el ryegrass libera gran cantidad de exudados a la rizosfera (Meharg,
Killham 1995), los cuales son convenientes para el proceso de
fitorremediacion.
El estudio de la funcionalidad de las comunidades microbianas se puede
realizar mediante el estudio de los perfiles de uso de fuentes carbonadas
(CLPP, sigla de Carbon Level Physiological Profiles) (Garland, Mills 1991).
289
Esta es una tcnica complementaria a las metodologas de aislamiento y

anlisis taxonmico. Este estudio posibilita la manifestacin de
microorganismos que no sobreviven con otras metodologas tradicionales
de cultivo (Preston Mafham et al. 2002). A partir de la siembra de muestras en
microplacas con las distintas fuentes carbonadas (FC) se puede obtener un
patrn de desarrollo caracterstico. La comparacin de los patrones de uso
de FC permite distinguir diferencias entre muestras (Garland, Mills 1991). A
partir de la medicin de absorbancia de cada una de las FC se puede realizar
tambin un estudio de diversidad presente en las muestras, utilizando para
esto el ndice de Diversidad de Shannon Weaver (Gmez et al. 2004).
En este capitulo se describen los resultados obtenidos a partir de dos
ensayos que fueron realizados con el objetivo de analizar la diversidad funcional
de las comunidades microbianas rizosfricas (CMR) expuestas a dos tipos de
contaminantes distintos.
Materiales y metodos
Descripcin de los ensayos
Se realizaron dos ensayos, uno de ellos en condiciones de campo donde se
utiliz glifosato para el secado de cultivos de cobertura (ensayo con glifosato)
y el otro en condiciones controladas donde se contamin el suelo con
antraceno y fenantreno (ensayo con PAHS). El ensayo con glifosato se realiz
en el Establecimiento El Correntino, que est ubicado a 36 8 50.9" Latitud
Sur y 62 21 51.9" Longitud Oeste de la localidad de Treinta de Agosto,
provincia de Buenos Aires. El ensayo con PAHs se realiz en las instalaciones
de la FAUBA. El suelo de ambos ensayos est clasificado como un Hapludol
tpico. El diseo utilizado fue en bloques completos aleatorizados (DBCA),
con tres repeticiones para ambos ensayos.
En el ensayo con glifosato en la parcela principal se establecieron dos
niveles de fertilizacin: 0 y 46 Kg N ha-1 con urea (F) aplicado en el momento
de la siembra de los cultivos de cobertura (CC). En las subparcelas se
establecieron dos CC, centeno (Secale cereale var. Quehu) y avena (Avena
sativa var. Aurora) que fueron sembradas luego de la cosecha de soja, y un
testigo (barbecho invernal). En las sub-subparcelas se asignaron dos
momentos de secado con glifosato, que fueron: julio y septiembre segn
describen Escobar Ortega, et al. (2010).
Las muestras se extrajeron con un barreno con el que se tomaron suelo y
races (suelo rizosfrico). Se realizaron tres muestreos, antes del secado con
glifosato (AG), al mes del secado con glifosato (DG) y a la cosecha de soja (CS)
ya sea para el primer y el segundo momento de secado. La descripcin de los
tratamientos se detalla en la Tabla I.
Para el ensayo con PAHs realizado en condiciones controladas se utilizaron
macetas plsticas con capacidad de 250g. El suelo se homogeneiz mediante
290
Tabla I.
Tratamientos utilizados en el ensayo de glifosato para el primer momento
de secado (Julio) y segundo momento de secado (Septiembre).
tamizado antes de colocar en las macetas. Luego de la aplicacin de los

tratamientos, las macetas fueron mantenidas en condiciones estables de luz y
temperatura, adems de ser provistas de riego peridico para el mantenimiento
de la capacidad de campo del suelo a 80% como describen Di Salvo et al.
(2007). La descripcin de los tratamientos se detalla en la Tabla II.
Tabla II.
Descripcin de los tratamientos utilizados en el ensayo de PAHs.
291
El suelo se contamin con 1g de cristales de antraceno o fenantreno (Fluka,

Sigma-Aldrich. Argentina) por Kg-1 de suelo hmedo, segn el tratamiento
correspondiente. Los suelos contaminados se homogenizaron mediante el
mezclado con cuchara (Ruberto et al. 2006). Posteriormente se dejaron
estabilizar durante dos meses, mantenindose a 80% de capacidad de campo.
Ambos contaminantes, presentaban valores de pureza mayores al 90%.
Para cada uno de los tratamientos con vegetacin, se realiz la siembra
de RG con 0,4g de semilla por maceta. En este ensayo se realiz un nico
muestreo a los dos meses de emergencia de las plntulas de RG. Para los
tratamientos con fertilizacin, se aplic una solucin conteniendo 1 g L-1 de
fertilizante NPK (15:15:15), la cual se utiliz 3 ml dos veces por semana a
partir de la emergencia de las plntulas. Las muestras fueron tomadas
mediante un sacabocado considerando la profundidad total de la maceta.
Adems, por el tamao pequeo de las macetas y la estructura radical en
forma de cabellera del RG que ocupaba el total del volumen, se consider que
todo el suelo muestreado en aquellas macetas corresponda a suelo rizosfrico
(Binet et al. 2000; Chiapusio et al. 2007).
Determinacin de Perfiles de uso de fuentes carbonadas

En ambos ensayos se realiz un estudio de los perfiles fisiolgicos (PF) de
las CMR expuestas a dos tipos de contaminantes, el glifosato y los PAHS. Con
el suelo rizosfrico se realizaron diluciones decimales sucesivas de cada una
de las muestras. A partir de stas se analiz la fisiologa de las comunidades
microbianas presentes mediante la obtencin de perfiles de utilizacin de
fuentes carbonadas segn describen Naiman et al. (2009) y Escobar Ortega,
et al. (2010).
Para este estudio se utilizaron microplacas preparadas con distintas fuentes
carbonadas en laboratorio de Microbiologa Agrcola de FAUBA segn
describieron Garca de Salamone et al. (2004), Naiman et al. (2009) y Di Salvo,
Garca de Salamone (2012). Una vez preparadas las microplacas y sembradas
con cada una de las suspensiones de las distintas muestras, se incubaron en
estufa a 30C y se realizaron lecturas de absorbancia cada 24 horas por
cuatro das, segn como sugieren Mills, Garland (2002) y Naiman et al.
(2009).
El anlisis de los perfiles de uso de FC se realiz agrupando las mismas en
ocho grupos. Estos fueron: aminocidos, tween 20, putrescina, cido itacnico,
azcares, alcoholes, cidos carboxlicos, cidos orgnicos. Este agrupamiento
se realiza frecuentemente para aumentar el porcentaje de varianza explicada
por cada uno de los componentes principales (CP) en base a los criterios de
Mills y Garland (2002), Zak et al. (1994) y Preston Mafham et al. (2002).
El anlisis estadstico de los datos se realiz utilizando el programa Infostat
(Versin 1.1 - Universidad Nacional de Crdoba).
292
Resultados
Para el ensayo con glifosato el anlisis de CP indica que la varianza total
explicada por ambos ejes fue del 70% cuando se analiza la interaccin entre el
momento de secado con glifosato y nivel de fertilizacin nitrogenada (Figura
1). El CP1 explic el 55% de la varianza total y el CP2 represent el 15% de la
varianza total.
En la Figura 1 se muestran las medias de los CP para el primer momento de
secado (julio) y el segundo momento de secado (septiembre) con glifosato.
En dicho anlisis se observa que para ambos momentos de secado, tanto el
CP1 como el CP2, no mostraron diferencias significativas entre la fisiologa de
las CMR para la variable fertilizacin. Comparado los dos momentos de secado
se observa que el CP2 mostr diferencias significativas para el perfil de uso de
fuentes carbonadas. Esto nos indica que en alguna medida las CMR fueron
distintas dado que los CC en Julio estaban en un estado ontognico distinto al
de septiembre. Una situacin similar se observ para las CMR en distintos
estadios ontognicos del cultivo de trigo (Naiman et al. 2009).
Figura 1: Anlisis de componentes principales de la rizosfera para los dos momentos

de secado con glifosato y los dos niveles de fertilizacin nitrogenada. Letras
maysculas distintas indican diferencias para el CP1 y letras minsculas
distintas indican diferencias significativas entre tratamientos para el CP2,
mediante test de Tukey (p<0,05).
En cambio, la Figura 2 muestra el efecto de los tres muestreos (AG, DG y

previa a la CS) en julio y septiembre. Donde el CP1 permiti observar que en el
primer momento de secado con glifosato el muestreo CS present diferencias
significativas en la fisiologa de las CMR respecto a los muestreos AG y DG. En
cambio, en el segundo momento de secado con glifosato los perfiles fisiolgicos
de las CMR de los tres muestreos difirieron significativamente entre si. Por
otro lado, el CP2 permiti observar que en el primer momento de secado con
glifosato las fisiologas de las CMR difirieron entre si en los tres muestreos. Sin
293
embargo, el segundo momento de secado con glifosato mostr que el muestreo

DG difiri significativamente de las fisiologas de las CMR del muestreo AG y
previa a la CS.
Figura 2: Anlisis de componentes principales de las rizosferas para los dos

momentos de secado con glifosato y los distintos muestreos. Letras
maysculas distintas indican diferencias para el CP1 y letras minsculas
distintas indican diferencias significativas entre tratamientos para el
CP2, mediante test de Tukey (p<0,05).
En julio las CMR a la CS mostraron diferencias en su fisiologa esto puede

ser atribuido a que este muestreo se realiz sobre el cultivo de soja previa a
ser cosechada, en cambio en los dos muestreos anteriores (AG y DG), estaban
presentes los cultivos de cobertura de invierno (centeno, avena y testigo). En
cambio en septiembre adems de permanecer esa diferencia en las CMR con
respecto a los muestreos AG y DG, los tres muestreos difieren entre si. Esto
puede ser atribuido a que las CMR estuvieron en presencia de los CC en
crecimiento hasta un estadio ontognico ms avanzado, de esta manera los
exudados de las races que poseen una gran cantidad de compuestos son
utilizados por las CMR (Kloepper, 1994). Adems el secado de los CC con
glifosato aport materia orgnica seca lo cual pudo haber afectado el perfil
de uso de fuentes carbonadas de las CMR o bien, es posible que el glifosato al
ingresar al suelo rizoferico se una a otros compuestos que llegan a modificar
la fisiologa de las CMR. Respecto a esto ltimo, hay autores como Pessagno
y dos Santos Afonso (2006) que mencionan que el glifosato cuando est
unido a otros compuestos no es de fcil degradacin y cuando se une a los
minerales del suelo, queda protegido y puede volver a liberarse y dispersarse.
Puede deberse tambin a que el glifosato haya aportado algunos
macronutrientes como carbono, fsforo y nitrgeno y as haber favorecido el
crecimiento de algunas CMR, as como indican Zabaloy et al. (2009).
294
Cuando se analiz el ndice de diversidad de Shannon-Weaver (H) (Figura

3) se observ, que en ambos momentos de secado el agregado de fertilizante
no tuvo efecto en las CMR. Sin embargo, se observaron diferencias significativas
entre ambos momentos de secado.
Figura 3. ndice de Shannon-Weaver (H) para los dos momentos de secado con
glifosato y los dos niveles de fertilizacin nitrogenada. Letras distintas indican
diferencias significativas entre tratamientos, mediante test de Tukey
(p<0,05).
Como el primer momento de secado fue realizado en Julio y el segundo momento

de secado en Septiembre,y entre ambos periodos los factores ambientales pueden
cambiar, el ndice H de las CMR pudo haber sido afectado por estas condiciones.
Alvarez et al. (1995); Alvarez y Alvarez (2000) afirman que la actividad microbiana,
la tasa de descomposicin de la materia orgnica y la calidad del carbono en el
suelo son afectadas por las condiciones ambientales, por la disponibilidad del
sustrato y por los sistemas de manejo de suelo. Por lo tanto, el ndice H de las CMR
puede ser diferente en distintos momentos de secado, ya que la densidad y diversidad
de microorganismos segn Marschner et al. (2004) puede tambin variar segn:
las condiciones ambientales, las caractersticas fsico-qumicas del suelo, su
manejo, el tipo de especie vegetal, edad y estado nutricional de la planta. Por otra
parte, el no observar diferencias significativas en el ndice H en cada momento de
secado con respecto al agregado de fertilizante podra deberse a la utilizacin de
CC ya que estos mantienen o mejoran la fertilidad de los suelos (Flores, 1991). Por
esta razn promover la utilizacin de estos CC es importante ya que pueden reducir
la dependencia a los fertilizantes de sntesis qumica, los cules son costosos y
muchas veces poco disponibles.
Cuando se analiz el ndice H en el primer momento de secado con respecto a
los tres muestreos (AG, DG y CS) no se observaron diferencias significativas en las
CMR. En cambio en la Figura 4 el ndice H, muestra que en el segundo momento de
295
secado el muestreo DG mostr diferencias significativas con respecto a las

comunidades de los muestreos AG y CS. El secado con glifosato de los CC mostro un
efecto temporario ya que a la CS esa diferencia desaparece con respecto al muestreo
AG. Esto puede atribuirse a que al secarse los CC dejan materia seca, el glifosato
puede aportar carbono, nitrgeno y fosforo segn Zabaloy et al. (2009) y junto a
ciertas condiciones las CMR son favorecidas o desfavorecidas, tal como Reyes y
Valery (2007) que encontraron una disminucin de las poblaciones microbianas
al alterarse l las condiciones fsico-qumicas de los suelos estudiados.
H)
Figura 4: ndice de Shannon-Weaver (H) para el segundo momento de secado

con glifosato y sus respectivos muestreos. Letras distintas indican diferencias
significativas entre tratamientos, mediante test de Tukey (p<0,05).
La Figura 5 muestra el anlisis de medias de los valores de CP entre los

distintos tratamientos del ensayo en condiciones controladas (PAHs) para el
contaminante Fenantreno. En ella se observa que la varianza total explicada
por ambos ejes fue del 65%. El CP1 y el CP2 representaron el 48% y 17% de la
varianza total, respectivamente. Se observa que el CP1 permiti diferenciar
significativamente (P<0,05) la fisiologa de las CMR de los suelos testigo (T)
de la fisiologa de las CMR de los tratamientos T+RG+N, F, F+N, F+RG y F+RG+N.
Adems, la fisiologa de las CMR de los suelos T no se diferenci de la fisiologa
de las CMR de los suelos T+N y T+RG. Por otro lado, el CP2 permiti diferenciar
significativamente (P<0,05) las fisiologas de las CMR de suelos sin
contaminar, con presencia de la planta, y con y sin agregado de fertilizante
(T+RG y T+RG+N) de las fisiologa de las CMR de los suelos contaminados y
bajo algunos tratamientos de remediacin (F, F+N y F+RG). Esto indica que la
presencia del contaminante genera diferencias fisiolgicas en las CMR,
similares aunque no idnticas a las diferencias que genera la presencia de la
296
planta y la planta con la fertilizacin en los suelos que no fueron

contaminados. Adems, la presencia de la planta y la fertilizacin en los
suelos contaminados con fenantreno (F+RG+N) gener que la fisiologa de
sus CMR sea similar a la fisiologa de las CMR de los suelos no contaminados
y bajo el mismo tratamiento (T+RG+N) (Figura 5).
Figura 5: Anlisis de componentes principales de las rizosferas para todos los

tratamientos de los grupos Testigo y Fenantreno. Letras maysculas
distintas indican diferencias para el CP1 y letras minsculas distintas
indican diferencias significativas entre tratamientos para el CP2,
Cuando se analiz el ndice de diversidad de Shannon-Weaver (H)

(Figura 6), ste mostr diferencias significativas entre las CMR del suelo
T en comparacin a las CMR de los suelos T+RG, T+RG+N y de todos los
tratamientos relacionados con el grupo F. Adems de que las fisiologas
de las CMR de los suelos contaminados (F, F+N, F+RG y F+RG+N) y las de
los suelos testigo con presencia de planta (T+RG y T+RG+N) presentan
similitudes no reflejadas en el anlisis de varianza pero s en el
agrupamiento que muestran en el sector derecho del grfico (Figura 5)
dado por el CP1, los resultados presentados en la Figura 6 muestran que
los valores de diversidad de las CMR de dichos tratamientos no presentan
diferencias significativas.
La Figura 7 muestra el anlisis de medias de los CP entre tratamientos del
ensayo en condiciones controladas (PAHs) para el contaminante Antraceno. En
ella se observa que la varianza total explicada por ambos ejes fue del 64%. El
CP1 y el CP2 representaron el 46% y 18% de la varianza total, respectivamente.
El CP1 mostr que las fisiologas de las CMR del suelo sin contaminar (T) difiri
297
Figura 6: ndice de Shannon-Weaver (H) para los grupos Testigo y Fenantreno.

Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos,
significativamente (P<0,05) de las fisiologas de las CMR de los suelos

contaminados (A, A+N, A+RG y A+RG+N) y de los suelos sin contaminar y con
presencia de planta (T+RG y T+RG+N). Por su parte, el CP2 mostr que la fisiologa
de las CMR del suelo contaminado y con agregado de fertilizante (A+N) difiri
significativamente (P<0,05) de las fisiologas de las CMR de los suelos T+RG+N
y A+RG. Al igual que lo observado en el anlisis de los perfiles fisiolgicos de
las CMR correspondientes a los tratamientos testigo y contaminados con
fenantreno (Figura 5), el anlisis presentado anteriormente indica que la
presencia del contaminante genera diferencias fisiolgicas en las CMR,
similares aunque no idnticas a las diferencias que genera la presencia de la
planta y la planta con la fertilizacin en los suelos que no fueron contaminados.
Adems, la presencia de la planta con y sin agregado de la fertilizacin en los
suelos contaminados con antraceno (A+RG y A+RG+N) gener que la fisiologa
de sus CMR sea similar a la fisiologa de las CMR de los suelos no contaminados
y bajo los mismos tratamientos (T+RG y T+RG+N) (Figura 7).
Es decir en la rizosfera de la planta el aporte de C atravs de la
rizodeposicin genera modificaciones fisiolgicas de las CMR similares a
las generadas por el aporte de C provisto por ambos PAHs. Un anlisis
estructural mediante tcnicas moleculares permitira conocer la asociacin
entre estructura y funcin de las CMR.
Cuando se analiz el ndice de diversidad de Shannon-Weaver (H) (Figura
8), ste mostr diferencias significativas entre las CMR de los suelos T en
comparacin a las CMR de los suelos T+RG+N y de los tratamientos
contaminados (A+N; A+RG y A+RG+N). A diferencia del anlisis de H para los
298
tratamientos testigo y contaminados con fenantreno (Figura 6), en este anlisis

de H (Figura 8) las diferencias en diversidad no guardan estrecha relacin
con lo observado en el anlisis de los patrones fisiolgicos de las CMR para
estos tratamientos (Figura 7).
Figura 7: Anlisis de componentes principales de las rizosferas para todos los

tratamientos de los grupos Testigo y Antraceno. Letras maysculas distintas
indican diferencias para el CP1 y letras minsculas distintas indican
diferencias significativas entre tratamientos para el CP2, mediante
test de Tukey (p<0,05).
Figura 8: ndice de Shannon-Wiener (H) para los grupos Testigo y Antraceno.

Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos,
299
Sintesis y perspectivas
El presente trabajo present el impacto de dos sustancias diferentes
sobre la diversidad funcional de las comunidades microbianas rizosfricas.
De acuerdo a la definicin sealada en este trabajo se consider que
ambos tipos de compuestos evaluados son contaminantes. Tambin se
tuvo en cuenta que ambas sustancias poseen diferencias no slo en sus
caractersticas moleculares, sino tambin en la probabilidad de ingreso al
sistema suelo, y a la tasa de degradacin una vez presentes en ste. A
pesar de las diferencias que presentan ambos contaminantes, se encontr
que ambos generan diferencias en los PF de las CMR y en la diversidad
funcional de las mismas. En el caso del ensayo a campo donde se utiliz
glifosato para el secado de cultivos de cobertura, las diferencias en los
PF de las CMR fueron temporales. El anlisis de diversidad de Shannon
Weaver mostr que la aplicacin del fertilizante tuvo efecto entre los dos
momentos de secado. El segundo momento de secado mostr un efecto
temporario en el muestreo DG. En el ensayo que se llev a cabo en
condiciones controladas utilizando el Fenantreno y Antraceno para la
contaminacin de suelos, se pudo determinar que la presencia del
contaminante y de la planta genera diferencias en la fisiologa de las
CMR. Similares resultados se determinaron con los anlisis del ndice de
Diversidad de Shannon-Weaver.
El estudio que se realiz es un aporte que nos permite determinar la
medida en que las CMR nativas de los suelos son afectados por estos dos
tipos de contaminantes (fenantreno antraceno y glifosato) y a la vez es un
punto de inicio para seguir con una determinada estrategia de manejo o
remediacin en el caso de ser necesario.
Agradecimientos
A la empresa Sastre Inchauspe del establecimiento El Correntino y a
los Ing. Agr. Maximiliano Eiza, Patricia Carfagno y Roberto Michelena por
la colaboracin brindada en la instalacin y conduccin a campo del ensayo
de glifosato. Este cont con financiacin de la FAUBA (CO 12-64). El ensayo
con PAHs cont con la financiacin del proyecto PICT 08-15014/FONCYT
ANPCyT.
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305
306
Captulo 16
Acumulacin y tolerancia al metal pesado
cadmio en rizobios de vida libre y en
simbiosis con leguminosas
Accumulation and tolerance to heavy metal cadmium
in free-living rhizobia and in symbiosis with legumes
Stella Castro 1, Eliana Bianucci 1, Jsica Rivadeneira 1, Mara del Carmen
Tordable1, Adriana Fabra2, Juan Sobrino-Plata 3, Luis Hernndez3, Ramn
Carpena-Ruiz3
1
Departamento de Ciencias Naturales. Facultad de Ciencias Exactas, Fsico-Qumicas y Naturales.
Universidad Nacional de Ro Cuarto. Ruta 36 Km 601. 5800-Ro Cuarto, Crdoba, Argentina.
2
Departamento de Ciencias Naturales. Facultad de Ciencias Exactas, Fsico-Qumicas y
Naturales. Universidad Nacional de Ro Cuarto. Ruta 36 Km 601. 5800-Ro Cuarto, Crdoba,
Argentina. 3Laboratorio de Fisiologa Vegetal, Departamento de Biologa. Universidad
Autnoma de Madrid. Campus de Cantoblanco, 28049-Madrid, Espaa. 3Departamento de
Qumica Agrcola. Universidad Autnoma de Madrid. Campus de Cantoblanco, 28049-
Madrid, Espaa. E-mail: [email protected]
Con este captulo se pretende contribuir al conocimiento de los efectos

que ocasiona el metal pesado cadmio (Cd) sobre los rizobios en vida libre y
en simbiosis con leguminosas de inters agrcola, as como tambin del aporte
del sistema antioxidante en la defensa contra la toxicidad de dicho metal. En
particular, se enfoca a dilucidar la influencia del metal Cd sobre las cepas de
Bradyrhizobium sp., la leguminosa man (Arachis hypogaea L.) y la asociacin
simbitica entre ambos.
Los metales pesados como contaminantes del suelo

Los metales pesados son aquellos elementos de transicin de la tabla
peridica con densidad > 5 g cm-3. Algunos son esenciales para la vida (Cu,
Zn, Mn, Fe, Ni o Mo), aunque pueden llegar a ser txicos para diferentes
organismos vivos cuando se encuentran en altas concentraciones en el medio
ambiente. Otros metales en cambio no poseen una funcin biolgica conocida
(Cd, Pb, Hg, Cr) y suelen provocar daos metablicos a concentraciones
relativamente bajas. Asimismo, metaloides como As y Se, si bien no son
pesados, participan tambin en muchos episodios de contaminacin
ambiental.
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S. Castro, E. Bianucci, J. Rivadeneira, M.C. Tordable, A. Fabra, J. Sobrino-Plata, L. Hernndez, R. Carpena-Ruiz
Los metales pesados estn presentes naturalmente en los suelos, pero

en los ltimos aos la polucin ambiental por metales y metaloides es
cada vez ms intensa como consecuencia del aumento de una variedad de
actividades antropognicas: aguas residuales urbanas, aplicacin de
fertilizantes, uso de pesticidas, operaciones en la industria minera, etc.,
que estn afectando progresivamente a ms y diversos ecosistemas (Pinto
et al. 2004). Uno de los metales pesados ms perjudiciales para la
naturaleza, an a bajas concentraciones, es el Cd. Este metal presenta
una elevada velocidad de adsorcin y desorcin en las partculas del
suelo, adems de una movilidad relativamente alta, que se incrementa a
medida que el pH del suelo disminuye (Khalid et al. 1981). El Cd se encuentra
en cantidades muy bajas en la corteza terrestre aproximadamente 0,15
mg kg -1 suelo (Roberts 1996). No obstante, su contenido en los suelos
agrcolas flucta entre 1 y 3 mg kg-1 suelo, considerndose como suelo no
contaminado aquel que contenga concentraciones inferiores a 1 mg kg -1
(EPA- Estados Unidos 1999). En dichos suelos, las principales fuentes de
Cd las constituyen el uso de fertilizantes a base de fosfatos, lodos y
residuos industriales (Figura 1).
Figura 1: Contribucin relativa de las diferentes fuentes de Cd al medio

ambiente (Regoli 2005).
El aporte de Cd por los fertilizantes fosfatados es considerado uno de los

problemas ms graves de contaminacin, sobre todo en aquellos pases que
tienen una intensa economa de exportacin agrcola. La principal materia
prima de los fertilizantes fosfatados, es la roca fosfrica constituida
principalmente por apatita que, adems de P, contiene Cd en cantidades que
varan entre 8 y 500 mg kg-1 (Laegreid et al. 1999). Los fertilizantes de mayor
aplicacin en el mundo son los superfosfatos (simple y triple) y el fosfato mono
y diamnico. En Argentina, Lpez-Camelo et al. (1997) analizaron el contenido
de Cd en los fertilizantes fosfatados ms utilizados en cultivos de gramneas y
leguminosas, encontrando que dicha concentracin dependa del tipo de
fertilizante, siendo la roca fosfrica el componente con mayor concentracin
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Acumulacin y tolerancia al metal pesado cadmio en rizobios de vida libre y en simbiosis con leguminosas
del metal. Un dato relevante es que en el suelo persiste al menos el 80% del Cd
contenido como impurezas de los fertilizantes fosfatados aplicados
(Kponbleku, Tabatabai 1994).
Numerosos pases poseen legislaciones que regulan la aplicacin de
fertilizantes y su concentracin de Cd, y son muy rigurosos en cuanto a su
cumplimiento. Por ejemplo, en Dinamarca se ha desarrollado un modelo que
explica el ciclo del Cd que cuantifica las entradas y salidas del sistema
agrcola (Hovmand et al. 1983). Australia tiene programas de informacin a
agricultores en los que se tratan diversas estrategias para la disminucin de
las concentraciones de Cd en el ambiente, particularmente en el recurso
suelo (Mc Laughlin 2001). En Estados Unidos y Nueva Zelandia se han
desarrollado numerosas investigaciones para evaluar la concentracin de
este elemento en los fertilizantes y el efecto de su acumulacin en suelos y
plantas. Los estudios realizados indican que la aplicacin reiterada de
fertilizantes fosfatados incrementa las cantidades de Cd en el suelo, afectando
los cultivos (Bonomelli et al. 2003). En Argentina no existen reglamentaciones
que estipulen concentraciones mnimas permitidas de metales pesados en
los fertilizantes, lo cual constituye un grave problema a nivel ambiental y de
salud humana.
Las plantas tienen una tendencia natural a asimilar metales. Sin embargo,
la eficacia de su captacin es dependiente de su disponibilidad, la que a su
vez se relacionan con factores tales como pH, contenido de materia orgnica
en el suelo, entre otros (Greger 2004). Se ha informado que la concentracin
de Cd en plantas de la leguminosa lupino creciendo en suelos australianos
vara entre 0,01-0,08 mg kg-1, con algunas muestras que exceden el mximo
valor permitido de 0,05 mg kg-1 (NHMRC-Australia 1987; Petterson, Harris
1995). Asimismo, para la leguminosa man se encontr alta concentracin
de Cd en el tegumento y en el grano (0,67 mg kg-1; Bell et al. 1997). Es
importante destacar que, teniendo en cuenta que el fruto de la planta de
man es hipogeo la probabilidad de contaminacin con Cd aumenta
considerablemente.
La biorremediacin se comenz a utilizar en las ltimas dcadas para
contrarrestar los efectos de los contaminantes metlicos. Este proceso
ofrece la posibilidad de emplear microorganismos y plantas que posean
la propiedad de acumular o metabolizar metales pesados para la
recuperacin de suelos contaminados. Carpena et al. (2006) proponen
que en suelos contaminados con metales pesados el empleo de ciertas
leguminosas que se asocian simbiticamente con microorganismos
fijadores de nitrgeno es recomendable por su capacidad de acumular en
raz y ndulos gran parte del elemento absorbido y, adems, por ejercer
un efecto beneficioso mejorando la fertilidad del suelo y manteniendo la
poblacin microbiana.
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Generacin de especies reactivas del oxgeno y rol del sistema

antioxidante en el mecanismo de tolerancia a los metales
pesados
Aunque los efectos txicos del Cd en sistemas biolgicos han sido
descriptos por varios autores, el mecanismo no est completamente
dilucidado. En general, la toxicidad por metales pesados se debe en parte al
estrs oxidativo producido por las especies reactivas del oxgeno (EROs)
generadas a travs de diferentes mecanismos dependiendo del metal de que
se trate. Las EROs son formas parcialmente reducidas del O2, y resultan de la
excitacin del oxgeno singlete (1O2) o de la ganancia de uno, dos y tres
electrones por el oxgeno para formar radical superxido (O2-), perxido de
hidrgeno (H2O2) o radical hidroxilo (OH), respectivamente. Por ejemplo, los
metales de transicin tales como Fe y Cu participan en el conocido ciclo de
Haber-Weiss produciendo radical hidroxilo a partir de superxido y perxido.
El Cd no experimenta cambios redox y por lo tanto, a diferencia del Fe o Cu, no
acta directamente en la generacin de EROs. Sin embargo, puede actuar
como pro-oxidante a travs de la alteracin de los sistemas de defensa
antioxidante de las clulas.
El estrs oxidativo puede entenderse como una situacin en la que se
observa un aumento en la velocidad de produccin de especies oxidantes o
una disminucin en la actividad de las defensas antioxidantes, resultando
en un aumento sostenido de las concentraciones en estado estacionario de
las EROs. Actualmente se interpreta la actividad antioxidante no slo como
aquella capaz de detoxificar las EROs, sino que tambin incluye a aquellos
mecanismos que evitan la formacin de estas especies y que participan en la
reparacin y eliminacin de los productos de oxidacin. Hoy se conoce que
numerosos mecanismos imprescindibles para el normal funcionamiento
celular, entre los que se destacan procesos de expresin gnica, pueden ser
regulados por radicales libres y/o antioxidantes. Asimismo, frente a
situaciones de estrs oxidativo, las clulas protegen su funcionamiento con
una detencin del crecimiento, la apoptosis o la necrosis.
Los microorganismos y las plantas poseen sistemas de defensa
antioxidante (enzimtico y no enzimtico) para mantener el estado redox y
mitigar el dao causado por el estrs oxidativo. El sistema de defensa
antioxidante enzimtico incluye varias enzimas como la superxido
dismutasa (SOD) involucrada en la detoxificacin del anin superxido,
catalasa (CAT) y ascorbato peroxidasa (APX) que descomponen al perxido
de hidrgeno en agua. La molcula de glutatin (GSH), tripptido formado
por gGlu-Cys-Gly, es uno de los ejemplos mejores conocidos del sistema de
defensa antioxidante no enzimtico. Las enzimas relacionadas con el
metabolismo del GSH tambin juegan un rol crucial en la defensa
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antioxidante. La enzima GSH peroxidasa (GPX) cataliza la reduccin de

hidroperxidos orgnicos y perxidos de lpidos, usando al GSH como
donador de electrones. La enzima GSH reductasa (GR) es responsable de la
reduccin del glutatin oxidado (GSSG) a GSH y su actividad resulta
fundamental para mantener una elevada relacin GSH/GSSG, controlando
el estado redox de la clula (Figura 2).
Figura 2: Ruta enzimtica para la detoxificacin de las especies reactivas

del oxgeno.
Por otra parte, las plantas han desarrollado distintas estrategias para
protegerse de la toxicidad del Cd. Estos mecanismos involucran a la raz
como primera barrera de defensa mediante la inmovilizacin de dicho metal
por pectinas o carbohidratos extracelulares, tales como el muclago y la
calosa de la pared celular, disminuyendo as el transporte del metal al interior
de la clula (Benavides et al. 2005). Otras estrategias de defensa al Cd son la
reduccin del transporte o el aumento del eflujo del Cd por transportadores
de cationes de la membrana plasmtica (Thomine et al. 2000), y el secuestro
del Cd intracelular, por cidos orgnicos, aminocidos, fitoquelatinas (PCs)
y su posterior compartimentalizacin en la vacuola para prevenir su toxicidad
(Clemens 2006).
Las PCs son polipptidos de composicin (gGlu-Cys)n-Gly, donde n=2-11,
y constituyen uno de los principales mecanismos de defensa frente a metales
pesados en plantas. Su sntesis se induce en presencia de Cd y tiene lugar a
partir del GSH por la enzima fitoquelatina sintasa (PCS). En la Figura 3 se
muestra la sntesis de GSH que ocurre en dos etapas dependientes de ATP: 1)
la cistena y el glutamato son combinados por medio de la enzima g-
glutamilcistena sintetasa para formar g-glutamilcistena (gEC), 2) la reaccin
de sntesis del GSH, catalizada por la enzima GSH sintetasa, combina la gEC
con glicina para generar el tripptido g-glutamilcistenilglicina (GSH).
Finalmente, la PCS cataliza la incorporacin de una unidad de gEC procedente
de una molcula de GSH (unida al sitio donador de la enzima) a otra
molcula de GSH o PC (unida al sitio aceptor de la enzima) en presencia
de Cd.
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Figura 3: Sntesis de glutatin y fitoquelatinas en plantas.
Respuesta fisiolgica y bioqumica de los rizobios en vida libre

y en simbiosis con leguminosas al cadmio
Si bien hasta el momento el efecto del Cd en clulas procariotas no ha
sido muy estudiado, algunos de los mecanismos descriptos por los cuales
los metales ejercen toxicidad en las bacterias estn asociados a: a)
sustitucin de ligandos (el metal reemplaza a otro alterando o inactivando
su funcin biolgica) (Nieboer, Fletcher 1996), b) reduccin-oxidacin del
metal con componentes celulares tilicos (R-SH) en particular el GSH (Zannoni
et al. 2007), c) modificacin del estado oxidativo de la clula (Sandalio et al.
2001) por incremento de las especies reactivas del oxgeno (EROs) o por
disminucin de la capacidad antioxidante (Sies 1990) y d) alteracin en el
crecimiento y morfologa celular (Lakzian et al. 2002; Khan, Scullion 2002).
Por su parte, el contacto de plantas con metales puede generar cambios
celulares y metablicos significativos con tan slo pocos minutos de exposicin.
Uno de los sntomas caractersticos de toxicidad en plantas por metales pesados
es la reduccin de la proliferacin celular (Hall 2002). En general, la presencia
de Cd en plantas ocasiona: a) interferencia en la entrada, transporte y
utilizacin de elementos esenciales (Ca, Mg, P y K) y del agua, provocando
desequilibrios nutricionales e hdricos (Singh, Tewari 2003), b) reduccin de
la absorcin y del transporte de nitratos desde la raz al tallo, adems de inhibir
la actividad nitrato reductasa en tallos (Gouia et al. 2000), c) reduccin de la
actividad ATPasa de la membrana plasmtica (Astolfi et al. 2005), alteraciones
en la funcionalidad de la membrana plasmtica (Sandalio et al. 2001),
desequilibrios en el metabolismo del cloroplasto, inhibiendo la sntesis de
clorofila y reduciendo la actividad de enzimas implicadas en la fijacin de
dixido de carbono (Maksymiec et al. 2007) y d) daos oxidativos en lpidos
de las membranas (Balestrasse et al. 2004) y en protenas por formacin de
grupos carbonilo (Romero-Puertas et al. 2002). Las races generalmente
acumulan ms Cd que la parte area actuando como una barrera que restringe
el transporte a sta ltima. Por otra parte, es conocido que altos niveles de Cd
en el suelo afectan la persistencia de los rizobios en la rizosfera de las plantas
as como la eficiencia de la nodulacin (Matsuda et al. 2002).
En la simbiosis rizobio-leguminosa, la fijacin biolgica de nitrgeno (FBN)
es de considerable importancia en agricultura ya que incrementa
significativamente el N disponible para las plantas. Este proceso es altamente
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sensible a la toxicidad por metales pesados (Porter et al.1981; Balestrasse et

al. 2001). En particular, el Cd en el suelo reduce la formacin y funcionalidad
del ndulo en numerosas leguminosas tales como garbanzo (Hernndez et al.
1995), soja (Huang et al. 1974), alfalfa (Porter et al. 1981), poroto (Vigue et al.
1981) y lupino (Carpena et al. 2003). Hasta el momento no hay informacin
disponible sobre el efecto que este metal pueda ocasionar sobre los rizobios
nodulantes de man, tato en vida libre como en simbiosis.
Caractersticas de los rizobios

Actualmente, se conoce que los rizobios son miembros del Phylum
Proteobacteria, ubicndose la mayor parte de ellos en el orden VI Rhizobiales,
de la clase I -Proteobacterias. La mayora de los rizobios nodulantes de man
son de crecimiento lento, pertenecen a la familia Bradyrhizobiaceae y han
sido clasificados como Bradyrhizobium sp., no habindose an definido las
especies (Cheng et al. 2003). Sin embargo, se ha informado de la presencia de
bacterias de crecimiento rpido asociados a ndulos de plantas cultivadas en
el rea manisera de Crdoba (Taurian et al. 2002; Ibez et al. 2008).
Crecimiento y acumulacin de cadmio en los rizobios

A pesar de que los mecanismos de toxicidad del Cd han sido poco estudiados
en rizobios, algunos de los efectos que este metal ocasiona en los
microorganismos estn relacionados con la alteracin del crecimiento y
viabilidad as como tambin, de molculas involucradas en los mecanismos
de defensa antioxidante. Estudios de crecimiento y viabilidad en bradyrizobios
capaces de nodular plantas de man, revelaron que la cepa Bradyrhizobium sp.
SEMIA6144, recomendada como inoculante (MIRCEN), fue capaz de crecer hasta
10 M de Cd. Sin embargo, en la cepa mutante defectiva en GSH por disrupcin
del gen gshA, Bradyrhizobium sp. SEMIA6144-S7Z, el crecimiento a esta
concentracin fue totalmente inhibido (Bianucci et al. 2010). Del mismo modo,
cepas de Escherichia coli deficientes en la sntesis de GSH por mutacin de los
genes gshA y gshB, redujeron significativamente su crecimiento en presencia
de Cd (100273 M) principalmente aquellas cepas mutadas en el gen
involucrado en el primer paso de biosntesis de GSH (gshA). Esto revela que la
capacidad de formar el dipptido -EC, por parte de las mutantes gshB, estara
proveyendo cierta tolerancia (Cruz-Vsquez et al. 2002). Este comportamiento
pone en evidencia la importancia del GSH, demostrando que las clulas
necesitan de esta molcula para proveer tolerancia contra elementos con gran
afinidad a grupos tilicos como es el Cd. El estudio en cepas nativas aisladas
de suelos de Ro Cuarto, Bradyrhizobium sp. NLH25 y Bradyrhizobium sp. NOD31,
mostr que si bien el crecimiento disminua a medida que las concentraciones
del metal se incrementaban, estos microorganismos pudieron crecer hasta 30
M de Cd (Figura 4).
313
Figura 4: Viabilidad de cepas de B. sp. a diferentes concentraciones de

Cd. Los datos son la media error estndar (n=4).
El anlisis del crecimiento de las cepas de rizobios nodulantes de man

muestra que las cepas nativas podran estar mejores adaptadas a las
condiciones del ambiente alcanzando una mayor actividad metablica y
consecuentemente mayor viabilidad que la cepa recomendada como
inoculante. Esta respuesta diferencial que cada cepa presenta frente al Cd
revela que existen variaciones especficas de cepa que influyen en la tolerancia
a este metal. Estos resultados permitieron realizar una clasificacin diferencial
de los rizobios. De este modo, B. sp. SEMIA6144 y NLH25 fueron consideradas
como sensible y tolerante al Cd, respectivamente.
Adems de los disturbios en el crecimiento, el Cd ocasiona importantes
cambios en la morfologa celular (Khan, Scullion 2002). La presencia de
inclusiones o cuerpos en el citoplasma, as como tambin deformaciones a
nivel de pared celular, son algunas de las modificaciones que presentan los
microorganismos frente a un estrs ambiental. Inclusiones electro-
transparentes y cuerpos electro-densos se observaron en el citoplasma de
cepas de Rhizobium loti Lu7, Bradyrhizobium japonicum USDA 110, Rhizobium
etli CE3 y Rhizobium trifolii 0403 (Dazzo et al. 1984; Cevallos et al. 1996; Yang,
Lin 1998). Estos autores explican que las inclusiones electro-transparentes
se deben a la presencia de grnulos de poli--hidroxibutirato (PHB), mientras
que los cuerpos electro-densos a la presencia de grnulos de polifosfatos,
ambos polmeros de reserva intracelular. Por regla general, una especie dada
slo formar un tipo de material de reserva. Por ejemplo algunas especies del
gnero Clostridium sintetizan solamente glucgeno o almidn, mientras que
ciertas especies de Pseudomonas, Azotobacter y Bacillus almacenan
314
nicamente PHB. Las cepas B. sp. SEMIA6144 y NLH25, en presencia de Cd,

mostraron un incremento en el tamao y nmero de inclusiones electro-
transparentes y cuerpos electro-densos en el citoplasma, respectivamente
(Bianucci et al. datos no publicados). Posiblemente, estos agregados
intracelulares se deban a cambios metablicos producidos por el metal, lo
cual lleva a la clula a un estado de estrs que inducira la formacin excesiva
de PHB en la cepa sensible y grnulos de polifosfatos en la cepa tolerante. De
la misma forma, inclusiones electro-transparentes de gran tamao fueron
observadas en cepas de Rhizobium leguminosarum bv trifolli expuestas a Cd
(Purchase et al. 1997). Por otra parte, en cepas de Streptomyces sp. F4 se
detect la presencia de grnulos oscuros en el citoplasma celular, manifestando
que estas estructuras corresponderan a la deposicin de Cd en dicha zona
(Louis-Sieriz et al. 2009).
Estrategias de tolerancia de los rizobios al cadmio

Numerosas investigaciones se han llevado a cabo para explicar los
mecanismos de defensa que las bacterias presentan frente a los metales
pesados (Bruins et al. 2000; Nies 2003; Cervantes et al. 2006). Con respecto a
la tolerancia al Cd, algunos de los mecanismos propuestos son: a) la pared
celular como barrera de defensa ante la entrada de Cd, reteniendo y
reduciendo el influjo del metal; b) los componentes celulares que capturan
iones, neutralizando su toxicidad tales como el GSH y las enzimas relacionadas
con su metabolismo y c) los transportadores de membrana que expulsan al
Cd del citoplasma celular, tales como los facilitadores de difusin de cationes
(CDF), las ATPasas tipo P y los transportadores de la familia RND (Resistance
Nodulation Cell Division) (Silver, Phung 2005).
Los estudios sobre la acumulacin de Cd en rizobios no han aportado
demasiada informacin acerca de las estrategias de defensa que utilizan
para evitar su toxicidad. En cambio, el anlisis de la distribucin de Cd
resulta importante para conocer en qu fraccin celular el metal se est
acomplejando. En rizobios capaces de nodular trbol (R. leguminosarum
biovar trifolii) y man (B. sp. SEMIA 6144 y NLH25), el anlisis de la distribucin
mostr que la mayor concentracin del metal queda retenido en la pared
celular y slo una mnima fraccin se encuentra intracelularmente (Purchase
et al. 1997; Bianucci et al. 2007). Es conocido que aquellos microorganismos
que no acumulan metales en el interior celular podran utilizar mecanismos
de detoxificacin basados en bombas de eflujo e influjo, o bien molculas
extracelulares que secuestren al metal, tales como los polisacridos
extracelulares (Cervantes, Gutierrez-Corona 1994; Bruins et al. 2000). Algunos
de los exportadores ms conocidos en bacterias Gram negativas involucrados
en la expulsin de Cd al medio extracelular, son los pertenecientes a la familia
de protenas RND tales como Czc y Ncc, que transportan Zn y Ni,
respectivamente (Nies 2003). De esta manera, se evita que estos metales
315
interacten con componentes celulares vitales. Adems, se proponen

mecanismos de detoxificacin del Cd basados en la precipitacin del metal
(Blake et al. 1993) o en la formacin de complejos quelantes con grupos -SH
que involucra a la molcula de GSH (Nies 1992).
El GSH est presente en todas las fases de crecimiento de los
microorganismos, aunque su concentracin se incrementa en fase estacionaria
(Fahey et al. 1978). En simbiontes de man se observ que su contenido est
relacionado con la tolerancia de las cepas al Cd ya que la cepa B. sp. SEMIA6144
(sensible) no modific el contenido endgeno de GSH en presencia de Cd mientras
que las cepas tolerantes, B. sp. NOD31 y NLH25, expuestas 30 M Cd lo
incrementaron de manera significativa (Bianucci et al. 2010). El GSH protege al
citoplasma secuestrando a los iones Cd, impidiendo que stos interacten
principalmente con protenas que cuenten con residuos tilicos, alterando as
su funcionalidad (Helbig et al. 2008). La defensa enzimtica antioxidante juega
tambin un rol fundamental disminuyendo los niveles de EROs generadas por
la ruptura del balance redox ante la presencia de Cd. Los estudios realizados
en rizobios son contradictorios respecto a la actividad que cada enzima presenta
frente a este metal. En cepas sensibles y tolerantes de R. leguminosarum biovar
viciae las actividades de las enzimas SOD y CAT incrementaron frente al agregado
de Cd (Corticeiro et al. 2006). En Bradyrhizobium sp., slo la cepa tolerante
increment significativamente la actividad SOD, mientras que la actividad CAT
result drsticamente inhibida en los dos simbiontes de man analizados (B.
sp. SEMIA6144 y NLH25) (Bianucci et al. datos no publicados). B. sp. NLH25
mostr tambin un incremento de las actividades de las enzimas GPX y GR en
presencia de Cd. Ello permitira mantener una elevada relacin GSH/GSSG
intracelular, siendo sta una de las posibles causas de la tolerancia al metal.
Es evidente que un solo tipo de mecanismo de defensa no es suficiente para
proveer tolerancia o bien detoxificar un metal pesado tan perjudicial como lo
es el Cd. Es por eso que la combinacin de distintas estrategias de defensa
(intra/extracelular) resultaran indispensables para la resistencia a elementos
que presentan una alta afinidad a compuestos tilicos como el GSH.
En simbiontes de man, la tolerancia observada en las cepas nativas
permite suponer que estaran mejor adaptadas a crecer a altas
concentraciones de Cd alcanzando una mayor actividad metablica y
consecuentemente mayor viabilidad. Adems, el incremento en el contenido
de GSH endgeno, de estas cepas, en presencia de Cd sugiere que las clulas
poseen la capacidad de inducir la sntesis de este tiol. Este incremento podra
ser un indicador de estrs oxidativo y es posible inferir que el GSH juega un
rol fundamental en la tolerancia al Cd.
Influencia del cadmio sobre el crecimiento de plantas de man

El man es de alto valor agronmico y en Argentina el 92% de su produccin
se obtiene en la zona central de la provincia de Crdoba donde se concentra el
316
cultivo, comercializacin, seleccin del man de confitera e industrializacin.

En los ltimos aos, el uso de prcticas agrcolas no sustentables, la aplicacin
desmesurada de fertilizantes y enmiendas, ha provocado la disminucin de la
fertilidad del suelo y la inestabilidad en los rendimientos de los cultivos. En el
rea manisera la presencia de metales pesados como el Cd puede atribuirse a la
fertilizacin fosfatada, al uso de lodos y residuos industriales. La absorcin por
las plantas de este elemento depende de diversos factores tales como el tipo de
suelo, el pH y el genotipo de man. Inga et al. (2003) analizaron los niveles de Cd
en granos de man provenientes de la regin manisera de Crdoba, los cuales
presentaron valores inferiores a lo establecido por las regulaciones
internacionales de Australia y Nueva Zelandia (0,05 mg Kg-1). Considerando que
los niveles de Cd en man estn relacionados con los niveles de este elemento
en el suelo, el agregado de compuestos o suplementos minerales podra generar
una acumulacin de Cd que, a largo plazo, provocara el deterioro de este recurso
natural y en consecuencia de la calidad de man en la regin.
En plantas, el GSH est involucrado en el control de las EROs en forma directa
e indirecta (Foyer, Noctor 2009). La participacin de este tiol en respuesta a la
toxicidad por metales pesados ha sido muy estudiada encontrndose que
generalmente disminuye en presencia de Cd (Li et al. 1997). Algunos autores
asocian dicha disminucin con el aumento de las PCs ya que el GSH es una de las
molculas involucradas en su biosntesis (Noctor, Foyer 1998; Xiang, Olivier 1998).
En alfalfa se demostr que el agregado del metal induce la sntesis de PCs (Ortega-
Villasante et al. 2005; Sobrino-Plata et al. 2009) las que juegan un importante
rol en la detoxificacin de metales (Cobbett, Goldsbrough 2002).
Resultados obtenidos en nuestro grupo de trabajo indican que hojas y races
de plantas de man expuestas a 10 M de Cd en un medio semi-hidropnico
(perlita), no presentaron peroxidacin lipdica ni oxidacin de protenas. Sin
embargo, las races fueron capaces de incrementar la sntesis de diferentes
tipos de PCs (PC2, PC3 y PC4). Es posible asumir que la produccin de PCs
evit el dao del metal sobre los componentes celulares como lpidos y
protenas. Por lo tanto, las PCs cumpliran un rol importante en el mecanismo
de defensa de la planta secuestrando el Cd intracelular y limitando el dao
oxidativo a macromolculas (Bianucci et al. datos no publicados). Estos
resultados permiten suponer que frente a condiciones de estrs por Cd, las
plantas desarrollan un complejo mecanismo de defensa antioxidante que le
permite su adaptacin. Sin embargo, cuando la toxicidad es alta, dichos
sistemas son incapaces de actuar y las plantas manifiestan sntomas
morfolgicos y bioqumicos de dao celular.
Impacto del cadmio en la asociacin simbitica rizobio-man

En la asociacin simbitica Bradyrhizobium sp.-man, la adicin de 10 M
de Cd al medio de cultivo disminuy significativamente el nmero y peso
seco de ndulos en las plantas inoculadas con la cepa sensible (B. sp.
317
SEMIA6144) con la cepa tolerante (B. sp. NLH25). Adems, se encontr un

aumento de la produccin de superxido y perxido en ndulos. Por otra
parte, si bien el tamao de los ndulos no se encontr afectado por el agregado
de Cd, se observ una disminucin significativa en las zonas infectadas de
ndulos inoculados con ambas cepas. Adems, los ndulos en presencia de
Cd presentan cambios en su estructura anatmica e histolgica destacndose
el depsito de material de aspecto amorfo en la superficie de la corteza. De
igual forma, en plantas de soja expuestas a Cd se observaron cambios en la
ultraestructura de los ndulos con una disminucin en el tamao en la zona
activa de fijacin de N, as como tambin una reduccin en el nmero de
clulas infectadas (Chen et al. 2002). Asimismo, ndulos de lupino expuestos
a Cd mostraron degeneracin de clulas infectadas y oclusin de espacios
intercelulares de la corteza (Carpena et al. 2003). Si bien las EROs juegan un
papel fundamental en el establecimiento de la simbiosis (Puppo et al. 2005) y
existen estudios que demuestran su aumento durante el metabolismo normal
en los ndulos (Matamoros et al. 2003) poco se conoce acerca de su produccin
como consecuencia del estrs causado por el Cd.
En cuanto a la acumulacin del metal, las races de man sin inocular
mostraron menor concentracin en comparacin a las races de plantas
inoculadas. Los ndulos de races inoculadas con la cepa sensible presentaron
mayor acumulacin de Cd en relacin a la cepa tolerante. El hecho de que las
races y los ndulos incorporen Cd estara indicando que existe una alta
retencin por parte de estos rganos, que podra deberse a la elevada tasa de
transporte entre el esporofito y el procariota: importacin de fotosintatos
para mantener la alta actividad metablica del ndulo y la exportacin de
productos asimilados de N hacia la planta. En los ndulos de plantas de lupino
se han detectado algunos mecanismos de tolerancia frente a la toxicidad de
Cd como la retencin del metal en la pared celular y elevados niveles de
compuestos tilicos (Carpena et al. 2003).
Conclusiones
El incremento de la concentracin de metales en los suelos hasta niveles
txicos, por las actividades antropognicas, constituye actualmente un
importante problema ambiental. En este contexto, las plantas y los
microorganismos pueden ser tiles para desarrollar bioensayos con el objeto
de promover nuevos estndares para la monitorizacin de situaciones de riesgo
ambiental. Es por ello, que el conocimiento de la acumulacin y tolerancia al
Cd por los rizobios en vida libre y en simbiosis con plantas de leguminosas
pueden contribuir a mejorar el rendimiento de los cultivos en condiciones de
campo bajo situaciones de exceso de metal, a la vez que a limitar el paso del
metal a la cadena trfica. Particularmente, en la asociacin simbitica
Bradyrhizobium sp.-man, el rol del sistema antioxidante (glutatin y
fitoquelatinas) parece ser crucial en la estrategia de tolerancia al metal.
318
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324
Captulo 17
Micorrizorremediacin como alternativa
para la recuperacin de suelos contaminados
por actividades mineras
Myco-rhizoremediation as alternative for recovering soils
polluted by mining activities
1
Scientific and Technological Bioresource Nucleus, BIOREN-UFRO. Universidad de La
Frontera. Avda. Francisco Salazar 01145, Temuco, Chile. E-mail: [email protected].
Introduccin
Uno de los principales problemas a nivel mundial es la degradacin de
los recursos naturales, en particular la originada por actividades industriales,
en las cuales se genera un elevado volumen de desechos contaminantes.
Algunos de estos desechos resultan muy difciles de manejar, confinndolos
o mitigando su efecto deletreo sobre el medio ambiente, como sucede con
los metales pesados (MP). En general, se denominan as a los elementos cuya
densidad especfica es mayor a 5 g cm-3, y destacan entre otros mercurio (Hg),
cadmio (Cd), arsnico (As), cromo (Cr), talio (Tl) y plomo (Pb), adems de
otros elementos traza con actividad biolgica como lo son el cobre (Cu),
hierro (Fe) y zinc (Zn) (Adriano 2001). No obstante, la principal caracterstica
de estos elementos es su potencial toxicidad sobre los diversos organismos
vivos, y su alta persistencia, debido a que no son biodegradables (Reimann et
al. 2001). Estos MP se encuentran presentes en altas concentraciones en los
residuos mineros, desde donde pueden ser transferidos a ecosistemas
naturales, agrcolas y a la cadena trfica, alterando el funcionamiento de los
diversos organismos, lo cual conlleva una disminucin en la actividad
biolgica de los microorganismos del suelo, y una prdida de diversidad y
cobertura de las plantas que conforman la cubierta vegetal (Giller et al.
1998).
La prdida de la actividad biolgica y la biodiversidad repercuten
negativamente, generando un descenso en la actividad de las distintas
especies asociadas, lo que finalmente desencadena un crculo de efectos
negativos que disminuye la sostenibilidad de los ecosistemas (Kennedy,
Smith 1995). En particular, en los ecosistemas terrestres, el efecto primario
de niveles txicos de MP condicionara una degradacin de la cubierta
325
vegetal y la microbiota edfica, repercutiendo en segunda instancia en

una prdida de la calidad fsico-qumica del suelo, retroalimentando as
los efectos negativos sobre la biota remanente en el ecosistema (Cornejo
et al. 2008a). Las interacciones entre los principales procesos de
degradacin en suelos sometidos a la descarga de metales pesados se
muestran en la Figura 1.
Figura 1: Interacciones presentes en la degradacin de suelos

sometidos a la descarga de metales pesados (modificado de Barea et
al. 1999 y Cornejo et al. 2008a).
A pesar de los efectos negativos debidos a la presencia de niveles txicos

de MP en suelos, la exposicin continua puede favorecer la seleccin y
crecimiento de poblaciones microbianas que posean la capacidad o hayan
desarrollado diversos mecanismos de tolerancia a estas condiciones de estrs,
resultando en poblaciones ms especializadas capaces de realizar los diversos
procesos bioqumicos en los que normalmente estn envueltos (Ellis et al.
2003; de la Iglesia et al. 2006). En este sentido, el poder manipular estas
poblaciones microbianas puede ser una valiosa herramienta para la
remediacin de suelos afectados por actividades mineras, o que en general
estn contaminados con MP (Cornejo et al. 2008a).
En particular, resultan todava ms valiosos aquellos organismos que
promueven el establecimiento y crecimiento vegetal, ya que aceleraran el
proceso de restablecimiento de la cubierta vegetal en los ecosistemas
326
Micorrizorremediacin como alternativa para la recuperacin de suelos contaminados por actividades mineras
contaminados con MP. En este contexto, la denominada simbiosis micorrcico

arbuscular (MA) es extensamente conocida por desempear un papel clave
en el establecimiento y crecimiento de la gran mayora de las especies de
plantas terrestres (Barea et al. 2005). Por tanto, la utilizacin de hongos
formadores de micorrizas arbusculares (HMA) puede representar una eficiente
alternativa para utilizar en conjunto con plantas capaces de establecer la
simbiosis MA, dado las numerosas ventajas ecolgicas que sta presenta, su
ubicuidad en diversos suelos y ecosistemas, y tambin por haber desarrollado
diversas estrategias que permitan a las plantas tolerar altas concentraciones
de MP en el suelo (Ghre, Paszkowski 2006; Hildebrandt et al. 2007). Esta
utilizacin conjunta de HMA y plantas micotrficas en procesos de
biorremediacin se denomina micorrizorremediacin (Khan 2006), y se
entiende como una innovadora aplicacin de programas de fitorremediacin
de suelos contaminados por actividades mineras y/o MP en general.
Aspectos generales de la simbiosis micorrcico arbuscular

La asociacin MA es la simbiosis terrestre ms extendida, y es capaz de
establecerla aproximadamente un 80-85% de todas las especies de plantas
superiores (Smith, Read 2008). Los hongos que forman las MA pertenecen al
phylum Glomeromicota (Walker, Schussler 2004), y se caracterizan, entre otros
aspectos, por poseer una biotrofa obligada, lo cual determina que para
completar su ciclo de vida, y as formar propgulos viables, el HMA deba
encontrarse en estado simbitico con una raz.
La base de la simbiosis MA es principalmente nutricional, pero las ventajas
ecosistmicas que se producen en el ambiente circundante a donde se
establece son muy numerosas, y se mencionarn a lo largo de este captulo.
En esta simbiosis, diversos propgulos de HMA (micelio, esporas, trozos de
raz previamente colonizados) presentes en el suelo se activan en presencia
de races factibles de ser colonizadas, emitiendo hifas que entran en contacto
con la superficie de la raz (ver Figura 2). Con posterioridad, el HMA extiende
sus hifas de forma intra- e intercelular por las clulas corticales de la raz,
generando tambin una extensa red de micelio en el suelo, y la estructura
tpica de esta simbiosis, denominada arbsculo. Esta estructura se genera por
continuas separaciones dicotmicas en la zona terminal de las hifas
intercelulares, y es donde se realiza el intercambio nutritivo.
Las hifas extrarradicales funcionan como un sistema radical
complementario, que permite aumentar la captacin de nutrientes,
especialmente los menos mviles como el P, y agua desde el suelo
direccionndolo posteriormente hacia la planta (Bolan 1991; Cornejo et al.
2008c). Por contraparte, el HMA recibe un aporte de compuestos carbonados
originados en la fotosntesis vegetal, dado que no puede obtener sus fuentes
carbonadas si no se encuentra asociado a una raz funcional, y que puede ser
el principal aspecto que determine su biotrofa obligada (Azcn-Aguilar et al.
327
1998). Debido a este comportamiento bidireccional, el desarrollo de esta

simbiosis resulta un componente ecolgico altamente eficiente, que permite
que las plantas se establezcan y crezcan en suelos que puedan presentar
incluso altos niveles de contaminacin por MP, basado primariamente en la
mejora de la nutricin mineral de las plantas micotrficas (Arriagada et al.
2007).
Figura 2: Diferentes estructuras de la simbiosis micorrcico arbuscular.

A) Esporas de hongos micorrcico arbusculares (HMA) aislados de suelos
contaminados con Cu en la zona central de Chile; B) Inicio de la
colonizacin de una raz de Lavandula latifolia por el HMA Glomus
coronatum; C) Desarrollo de numerosos arbsculos dentro de las clulas
radicales; D) Micelio extrarradical teido con el colorante azul de
tripano (fotografas obtenidas por Pablo Cornejo).
Como se mencion anteriormente, la principal contribucin de la simbiosis

MA es de tipo nutricional, con el consiguiente beneficio en el crecimiento
vegetal, lo que por s slo justificara la utilizacin biotecnolgica de HMA en
programas de biorremediacin utilizando plantas. No obstante, las ventajas
de su incorporacin en programas para la recuperacin de ecosistemas
contaminados y/o degradados son mucho ms extensas. Entre otras ventajas,
destaca su capacidad para estabilizar fsicamente los suelos, previniendo o
revirtiendo procesos comunes en suelos degradados y contaminados, como
es el caso de la erosin. Esto es debido a que la extensa red de hifas del HMA
en el suelo circundante a la raz entrelaza las partculas, favoreciendo la
328
formacin de agregados estables (Miller, Jastrow 2000; Borie et al. 2008;

Curaqueo et al. 2010). En este mismo sentido, una glicoprotena producida
inicialmente por los HMA, -glomalina-, y acumulada en el suelo en cantidades
significativas, puede funcionar como un verdadero adhesivo, aumentando el
estado de agregacin de las partculas del suelo (Rillig, Mummey 2006;
Curaqueo et al. 2010).
Adicionalmente, los HMA pueden contribuir de manera significativa, por
distintos medios, a la tolerancia de plantas que crecen en suelos contaminados
por actividades mineras (Ghre, Paszkowsky 2006; Hildebrandt et al. 2007;
Cornejo et al. 2008a), disminuyendo el efecto txico de los MP y favoreciendo
el establecimiento de diversas especies vegetales en estos suelos. A
continuacin se mencionan los distintos mecanismos de tolerancia en plantas
que se ven potenciados por la presencia de la simbiosis MA en suelos
contaminados con MP.
Tolerancia a metales en la simbiosis micorrcica arbuscular y su

aporte a procesos de fitorremediacin
En el caso particular de los suelos contaminados por actividades mineras o
por la descarga de residuos enriquecidos en MP, resulta muy importante el
hecho que los HMA presenten una serie de mecanismos de tolerancia/
resistencia, que en conjunto favorecen y facilitan la presencia de distintas
especies de plantas bajo esas condiciones de estrs ambiental (Ghre,
Paszkowski 2006; Hildebrandt et al. 2007; Figura 3).
Figura 3: Formas por las cuales los hongos micorrcico arbusculares

(HMA) contribuyen a la tolerancia/resistencia de plantas creciendo en
suelos contaminados con metales pesados (MP).
329
Entre estos mecanismos, destaca la quelacin e inmovilizacin extracelular de

los MP, a travs de la glomalina y la quitina de sus paredes celulares. Diversos
estudios muestran la capacidad de adsorcin de MP (en particular Cd y Cu) al
micelio extrarradical de HMA, el cual incluso es significativamente mayor al de
algunos organismos utilizados comnmente en biosorcin, como Rhizopus arrhizus
(Joner et al. 2000; Gonzlez-Chvez et al. 2002; Chen et al. 2003). Por otra parte, se
ha observado que importantes mecanismos bioqumicos de homeostasis de MP
estn presentes en el hongo, los que le permiten entre otras funciones confinar
altos contenidos de estos elementos en vacuolas, o quelarlos intercelularmente
mediante protenas del tipo metalotionenas (Gonzlez-Guerrero et al. 2007, 2008).
Adicionalmente, la existencia de determinados transportadores de membrana puede
producir la transferencia de MP hacia el exterior del citoplasma fngico, y
eventualmente depositarlos en la matriz interfacial (zona de contacto entre los
arbsculos y la membrana plasmtica de las clulas radicales). Esto explicara que
en muchos casos las races de plantas micorrizadas presenten concentraciones de
MP mucho mayores que plantas no micorrizadas (Davies et al. 2001; Chen et al.
2005), o que eventualmente queden disponibles para ser translocados a la parte
area, lo que favorecera procesos de fitoextraccin (Giasson et al. 2005; Carvalho
et al. 2006; Leung et al. 2006; Trotta et al. 2006). Un ejemplo de lo anterior sera la
utilizacin de plantas de Eucalyptus globulus inoculadas con HMA y hongos saprobios
como alternativa para la fitoextraccin de Zn y As (Arriagada et al. 2009a,b).
Por otra parte, recientemente se ha observado en distintos grupos de
investigacin que algunas esporas de los HMA Glomus intraradices y G.
claroideum son destinadas al almacenamiento de precipitados de sales de Cu,
las cuales hipotticamente confinan estos metales pesados, protegiendo al resto
de la poblacin de HMA de los efectos oxidativos originados por los altos niveles
intracelulares de este elemento (Ferrol et al. 2009; Meier et al. En prensa).
Todos estos mecanismos, o la preponderancia de alguno de ellos en
determinados aislados o ecotipos de HMA, pueden potenciar
significativamente programas ya sean de fitoestabilizacin o bien de
fitoextraccin de MP para su implementacin en ecosistemas afectados por
actividades mineras, o como medida paliativa en la finalizacin y cierre de
explotaciones mineras. Adicionalmente, la utilizacin de HMA en este tipo de
programas debe considerar la eleccin de las especies vegetales propicias para
acometer el plan de fitorremediacin. Particularmente, las especies metalofitas
surgen como la mejor opcin a ser consideradas para estos planes, ya que
estas plantas poseen per se mecanismos que les permiten establecerse en
ambientes contaminados con MP (Baker 2000; Ginocchio 2000). Sin embargo,
como se puede observar, muchos de los aportes que producira el HMA se
orientan a favorecer programas de fitoestabilizacin, ya sea estabilizando los
MP en sus estructuras y/o glomalina, o permitiendo una mayor acumulacin
en las races de las plantas. Por tanto, la seleccin de ecotipos de HMA y plantas
para acometer estos programas debiera, primariamente, centrarse en la
bsqueda de las combinaciones ms efectivas en este tipo de fitorremediacin,
en particular la que promueva una mayor acumulacin de glomalina en el
330
suelo, dada la importancia que esta protena puede representar en este tipo
de suelos, como se detalla a continuacin.
Rol de la glomalina en la fitoestabilizacin de suelos

contaminados por metales pesados
Como se mencion previamente, la glomalina es una glicoprotena producida
inicialmente por los HMA, y que posteriormente es liberada al suelo por
transformaciones de las estructuras fngicas, siendo finalmente acumulada en
grandes cantidades (Wright, Upadhyaya 1998; Purin, Rillig 2007). Una vez en el
suelo, contribuye a unir las partculas del suelo, estabilizando de esta forma los
agregados (Rillig, Mummey, 2006), y favoreciendo la resistencia fsica del mismo
ante procesos degradativos como son por ejemplo la erosin hdrica y/o elica.
En general, no existe concordancia respecto de la composicin y estructura de
esta protena, aunque se la ha considerado formando parte de las paredes celulares
de hifas y esporas, desde donde llega al suelo por degradacin de las mismas
(Driver et al. 2005), y que su identidad estara muy relacionada con protenas del
tipo HSP (Gadkar, Rillig 2006), caracterizadas por inducirse inespecficamente frente
a diversos tipos de estrs ambiental, como podra ser el caso de los altos niveles de
MP en suelos contaminados por actividades mineras. De hecho, algunos estudios
han establecido una correlacin directa y muy significativa entre el nivel de MP en
el suelo (en particular Cu, Zn y Pb) y la cantidad de glomalina acumulada en el
mismo (Cornejo et al. 2008b; Vodnik et al. 2008).
Adicionalmente, esta protena tiene la capacidad de incorporar y
secuestrar en su estructura diversos metales a travs de uniones estables
con algunos de sus grupos funcionales, pudiendo llegar a representar
cantidades importantes de la totalidad de MP presentes en el suelo (Gonzlez-
Chvez et al. 2004; Chern et al. 2007; Cornejo et al. 2008; Vodnik et al. 2008).
En la Tabla 1 se resumen algunos de los estudios relacionados a la capacidad
de inmovilizacin de MP por esta protena.
Tabla 1.
Contribucin de la glomalina a la inmovilizacin de metales pesados.
331
Por otra parte, los altos rangos en que esta protena ha sido encontrada
en distintos suelos (hasta ms de 60 mg g-1) y su alta recalcitrancia (ms de
40 aos de vida media) la convierten en una fraccin cuantitativamente muy
importante y temporalmente muy estable para inmovilizar MP. Sin duda, estos
aspectos sugieren un rol activo muy importante de la glomalina en la mitigacin
de la toxicidad ocasionada a las plantas que se encuentran creciendo en suelos
contaminados con MP. En particular, el efecto beneficioso de la acumulacin
de glomalina en el suelo, y su subsecuente capacidad de inmovilizacin de
MP, convierten a este compuesto en uno de los principales medios por los
cuales los HMA contribuiran a potenciar procesos de fitoestabilizacin, aspecto
muy importante a tener en consideracin al disear programas de
micorrizorremediacin.
Aplicacin de enmiendas como complemento a la micorrizorre-

mediacin
La aplicacin de enmiendas orgnicas al suelo se ha utilizado
extensivamente con una gran cantidad de finalidades, como por ejemplo en
la recuperacin de reas desertificadas, como forma de hacer frente a la sequa,
para incrementar el crecimiento vegetal (fertilizante), para mejorar las
condiciones fsico-qumicas del suelo mediante el aumento de materia orgnica
edfica, as como tambin para la remediacin de suelos contaminados con
MP (Roldn et al. 1996; Medina, Azcn 2010). En este sentido, cabe mencionar
que en suelos contaminados con MP, la calidad biolgica es altamente
reducida, siendo uno de los factores responsables de ello la prdida en los
contenidos de materia orgnica, por lo que su aumento debe ser una de las
estrategias recomendadas con fines de biorremediacin. Adicionalmente, los
estudios realizados a la fecha combinando el uso de residuos agroindustriales
transformados e inoculantes de HMA muestran un efecto sinrgico (Arriagada
et al. 2009a; Azcn et al. 2009), lo que ratifica su uso potencial en programas
de fitorremediacin.
En particular, se ha utilizado residuos de remolacha azucarera biotransformados
por Aspergillus niger en suelos contaminados con Cu, utilizando HMA nativos del
suelo y supuestamente adaptados a las condiciones de estrs por los altos niveles
de Cu, as como tambin HMA no adaptados a esas condiciones. Se observ que la
aplicacin de la enmienda orgnica produjo un significativo incremento nutricional
en las plantas utilizadas, y tambin una reduccin del estrs oxidativo, en particular
cuando estaban colonizadas por los HMA adaptados a Cu (Medina, Azcn 2010;
Meier et al. En prensa). Adems, se ha demostrado la importancia de seleccionar
los endofitos ms eficientes de HMA y otros hongos no patognicos de la rizosfera,
como son los hongos saprobios, a fin de estimular el crecimiento y desarrollo de
plantas cultivadas en suelos contaminados por metales pesados y la combinacin
de ambos hongos (efectos sinrgicos) juega un rol de vital importancia en la
tolerancia y fitoextraccin de metales pesados por parte de E. globulus (Arriagada
et al. 2004, 2005, 2007, 2009b).
332
En suelos contaminados con Zn, la aplicacin de HMA y de residuos orgnicos

transformados permiti el establecimiento de una planta no metalfita (Trifolium
repens), la que en estos casos present una produccin de biomasa hasta 28
veces mayor que plantas creciendo sin inoculacin y aplicacin de residuos
(Medina et al. 2006), efectos benficos que tambin fueron observados en suelos
contaminados con Cd (Medina et al. 2005), y en suelos multicontaminados (Azcn
et al. 2009). En este ltimo caso (suelos multicontaminados), Arriagada et al.
(2007) observaron que la inoculacin de Eucalyptus globulus con Glomus deserticola
aument igualmente la absorcin de Pb.
Perspectivas de la utilizacin de programas de micorrizorre-

mediacin
En base a lo expuesto, es evidente el efecto beneficioso que tiene la
utilizacin de HMA en procesos de biorremediacin de suelos contaminados
por actividades mineras, y en general de aqullos con alta presencia de MP.
En este sentido, uno de los aspectos que se hace necesario conocer es la
diversidad de HMA que naturalmente presentan o han desarrollado
adaptaciones para hacer frente a los efectos txicos de los altos niveles de
MP en los suelos, para poder seleccionarlos, multiplicarlos y aplicarlos en
programas de micorrizorremediacin.
No obstante, es igualmente importante conocer cules son los principales
mecanismos que utiliza el HMA seleccionado para hacer frente al estrs originado
por los MP, y cul es el efecto final que produce cuando se encuentra asociado
con las plantas escogidas, ya que esto determinar si finalmente se est
potenciando procesos de fitoextraccin, o por el contrario, se est potenciando
la fitoestabilizacin, si el MP queda inmovilizado/secuestrado bajo la superficie
del suelo (Figura 4). De forma general, cabe mencionar que gran parte de los
mecanismos de tolerancia previamente descritos actuaran favoreciendo
principalmente procesos de fitoestabilizacin de suelos contaminados por
actividades mineras, an cuando combinaciones especficas entre determinados
ecotipos de HMA y alguna especie vegetal en particular pueden potenciar la
hiperacumulacin de determinados MP. Es por tanto imprescindible conocer las
bases que determinen la adopcin final de una de estas alternativas, previo a la
implementacin de plantas micorrizadas en terrenos contaminados.
Sumado a lo anterior y al enorme avance tecnolgico que puede representar
la inclusin de HMA en programas de fitorremediacin, se hace necesario
contar con herramientas adicionales, que permitan realizar el control
posterior del proceso, considerando parmetros que permitan analizar la
funcionalidad, efectividad y persistencia de los ecotipos utilizados a lo largo
del tiempo, dado que es bien conocido que los programas de fitorremediacin
son generalmente lentos y planificados a largo plazo. Entre estas
herramientas, los avances en el estudio gentico de este grupo de hongos
permiten en la actualidad realizar su identificacin, incluso dentro de las
333
races colonizadas, utilizando marcadores especficos que puedan servir para

monitorizar su presencia a lo largo del tiempo (Cornejo et al. 2004).
Figura 4: Estrategias propuestas para el estudio de la diversidad de

HMA en suelos contaminados por actividades mineras con vistas a la
utilizacin de ecotipos eficientes en programas de micorrizorre-
mediacin y revegetacin de suelos contaminados por actividades
mineras (modificado de Cornejo et al. 2008a).
Otro aspecto clave a tener en consideracin, es la necesidad de incorporar

procesos de produccin viverstica de las plantas micorrizadas a ser
establecidas en campo para, de esta forma, asegurar que el HMA se encuentre
simbiticamente activo al momento de ser sometido a los efectos txicos
debido a los altos niveles de MP en el suelo contaminado. Este hecho es muy
importante si se considera que estos ecosistemas han presentado una
importante prdida o incluso desaparicin de los propgulos microbianos del
suelo, y que en buena parte esto se ha podido deber a la escasa capacidad de
micorrizacin que pueden presentar los HMA naturalmente presentes en el
suelo, dificultando el inicio de nuevas colonizaciones.
Por otra parte, la aplicacin de otras tecnologas adicionales que permitan
mejorar y acelerar el proceso de biorremediacin deben ser igualmente
consideradas. En este sentido, conociendo que buena parte del funcionamiento
de los ecosistemas terrestres es dependiente de los microorganismos del suelo
(Jeffries, Barea 2001), se debe analizar la factibilidad de incorporar rizobacterias
que doten a la planta de una rizosfera optimizada, y que la ayuden a superar los
distintos estreses ambientales, aumentando las probabilidades de xito en el
establecimiento de la cubierta vegetal (Barea et al. 2005). Finalmente, la aplicacin
de enmiendas, en particular las de tipo orgnico y aquellas que reduzcan la actividad
txica de los MP, podra ser una enorme contribucin al proceso global de
334
remediacin, por cuanto contribuyen a revertir buena parte de los procesos de

degradacin del suelo originados por la descarga de metales pesados, resultando
en prcticamente todas las experiencias analizadas sinrgicos con la utilizacin de
microorganismos rizosfricos, en particular con los HMA.
Agradecimientos
A los proyectos Fondecyt N 3070052 y 11080131 de la Comisin Nacional
de Investigacin Cientfica y Tecnolgica (CONICYT-Chile) por el financiamiento
para el desarrollo de esta lnea de investigacin.
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La presente edicin se termin de editar de manera digital en Marzo
de 2013. Todos los derechos reservados.
340
RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y AGRICULTURA SUSTENTABLE
Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez, Claudio Penna & Fabricio Cassn
EDITORES
2013
ISBN 978-987-26716-1-7
Ciudad Autnoma de Buenos Aires
http://www.aam.org.ar/
La rizosfera es una parte del suelo inmediata a las races en donde se desarrolla una fuerte
y nica interaccin de tres componentes, la planta, el suelo y las micro y macrofauna que
habitan esta fraccin del sistema. En un sentido ms amplio de la denicin, la rizosfera es
la porcin de suelo en la que estn presentes las races de los vegetales y en la que se dan
una serie de complejas relaciones fsicas y qumicas que afectan tanto la estructura del
sistema suelo como los organismos que en l viven. La rizosfera provee un microambiente
complejo y dinmico, donde las bacterias, los hongos y el resto de los organismos rizosfri-
cos forman una comunidad nica en asociacin con las races y de considerable potencial
para su estudio y aplicacin tecnolgica desde los puntos de vista agrcola y ecolgico.
El TIRBAS 2010 tuvo como objetivos fundamentales: (1) Generar un marco interdisciplina-
rio para el intercambio de informacin cientco-tecnolgica sobre el estudio de la rizosfe-
ra en Argentina, (2) Promover el desarrollo de un espacio institucional sobre el estudio,
uso y aplicacin agro-industrial de los conocimientos relacionados con la rizosfera en
nuestro pas, que permita de manera estratgica integrar la investigacin bsica y agrcola
con la demanda tecnolgica del sector industrial, y (3) Compartir la experiencia de investi-
gadores de diferentes pases del mundo que han contribuido de manera decisiva a la
comprensin del modelo bsico de estudio.
ISBN 978-987-26716-1-7
Imagen de Portada
Azospirillum brasilense colonizing stolon inner structures of strawberry plants (Fragaria ananassa Duch).
Micrograph, obtained with a ZEISS SUPRA 55VP scanning electron microscope, shows bacterial cells gathered in groups
(pink) within tissues of the stolon vascular zone (green). Authors: M.F. Guerrero-Molina1, B.C. Winik2, R.O. Pedraza1.
1
Facultad de Agronoma y Zootecnia, Universidad Nacional de Tucumn. Av. Roca 1900. (4000) San Miguel de Tucumn, Argentina. 2Centro Integral
de Microscopa Electrnica. Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia. UNT. INSIBIO CCT CONICET Tucumn. Chacabuco 461, (4000) San
Miguel de Tucumn, Argentina.

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Publicacion Tirbas 2013 PDF

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RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y

Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez

Asociacin Argentina de Microbiologa

Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez

Ins Eugenia Garca de Salamone, Susana Vzquez

Publicacin Electrnica del Taller Internacional sobre

Asociacin Argentina de Microbiologa

1. Biologa de Suelos. I. Garca de Salamone, Ins II. Garca de Salamone,

Fecha de catalogacin: 21/11/2012

RIZOSFERA, BIODIVERSIDAD Y AGRICULTURA SUSTENTABLE

Queda hecho el depsito que marca la ley 11.723.

Asociacin Argentina de Microbiologa

Comit Organizador TIRBAS 2010

Comisin Directiva AAM 2010-2011

Comisin Directiva DIMAYA/AAM 2010-2011

Rizosfera, Biodiversidad y Agricultura Sustentable son temas muy amplios

(captulo 8), como la aplicacin del gnero Azotobacter (captulo 9),

Ins Eugenia Garca de Salamone

Rhizosphere bacteria: deleterious and beneficial

Soil steaming and its effects on soil and rhizosphere bacteria

Effects of fungicide application on rhizosphere and endophytic

could reduce or alter normal plant growth via production of allelochemicals

Ratings of FDS, and sampling for fluorescent pseudomonads

Fernery History of Benlate Quadrant Location Incidence Mean Severity*

Bacterial populations were determined in the rhizosphere, rhizomes, and

* Means followed by different letters are significantly different. Capital letters

In addition to culturable bacterial counts, culture-independent PCR-DGGE

Figure 1: Intensity of Pseudomonas 16S rRNA amplicons in 8 replicate

Rhizome diameter, root weight, and microscopy of rhizomes

diameters were observed in asymptomatic plants from Floricrops, with a mean

Treatment Rhizome diameter (mm)a Root weight from a5-cm

*Means followed by different letters are significantly different at P < 0.01.

Figure 2: Rhizome diameter of asymptomatic plants from Floricrops

Microscopic analysis of rhizomes revealed the presence of natural openings

Figure 3: Photomicrograph of a growing tip of a typical rhizome of an

Effects of fungicide application on rhizosphere pseudomonads:

Figure 4: PCR-DGGE analysis of the rhizosphere total bacteria community 6

Figure 5: CR-DGGE analysis of Bacillus spp. from rhizosphere samples 6

Figure 6: PCR-DGGE analysis of Pseudomonas spp. from rhizosphere

Production of IAA by fluorescent pseudomonads isolated from

Fernery and appearance of ferns % of % of % of strains %ofstrains

* 100 isolates from each fernery were tested.

These results indicated a functional change within the population of

Treatment % of strains % of strains + % of strains + % of strains

* 50 isolates from each fernery were tested.

Treatment % of strains % of strains + % of strains + % of strains

* 50 isolates from each fernery were tested.

Allelopathic effects in cucumber seed bioassays

Increased overall growth of KHD, deformed 0 0

* A collection of 100 strains from normal-appearing ferns at Floricrops and 100

Figure 7: Representative negative visual ratings (reduced growth of cucumber

In this study we determined the effect of Benlate application on

Conclusions and remarks

interactions that exist in rhizobia-legume and plant-pathogens. In the same

Loper J.E., Schroth M. 1986. Influence of bacteria sources of indol-3-acetic

Sturz, A.V., Christie, B.R., Nowak, J. 2000. Bacterial Endophytes: Potential

ese hbitat y de algunas interacciones entre sus poblaciones, con efectos

2004) y la extraccin de cidos nucleicos del suelo han permitido estudiar la

Microorganismos patgenos de plantas