INDICE:

I.- PRESENTACIN.
II.- COMPETENCIAS.
III.- INSTRUCCIONES GENERALES.
IV.- NORMAS ADICIONALES
V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD.

I.- PRESENTACIN

La presente Gua de Practica permitir a los estudiantes de Medicina Humana de la Universidad de

Chiclayo, tener un alcance de los procedimientos experimentales que se llevaran a cabo en el laboratorio lo
que complementar las clases Tericas programadas durante este semestre acadmico. En esta se consideran
las Normas y Procedimientos generales de trabajo de Bioseguridad e instrucciones para el desarrollo de cada
una de las sesiones practicas a realizar. El estudiante de Medicina lograr cada una de las competencias que
implica la realizacin de las prcticas programadas por lo cual deber cumplir las normas de Bioseguridad,
cumplir satisfactoriamente el desarrollo total de las prcticas y llegar a las conclusiones que implica la temtica
propuesta. La presente Gua Prctica tiene como propsito el desarrollo de habilidades, destrezas, correlatos e
interpretacin por parte del estudiante de medicina para lograr sus competencias que la formacin profesional
exige.

II.- COMPETENCIAS

1.- Competencias Generales:

Al finalizar el curso de Microbiologa el alumno e Medicina ser capaz de:
1.1 Comprender, demostrar y explicar la morfologa, estructura, composicin qumica, fisiologa, gentica,
taxonoma y accin de los microorganismos y parsitos.

2.- Competencias del trabajo en el laboratorio:

2.1.- Identificar materiales y equipos empleados en el laboratorio.
2.2.- Trabajar en equipo y elaborar informes de las prcticas realizadas.
2.3.- Investigar y comprender temas relacionados a la medicina aplicando conocimientos de Microbiologa
 III.- INSTRUCCIONES GENERALES
Para el normal desarrollo de las Prcticas de Laboratorio el estudiante deber:
1.- Ser puntual y cumplir las normas de Bioseguridad.
2.- Usar en forma obligatoria una chaqueta blanca y un Mandil blanco manga larga limpios.
3.- Leer previamente la prctica correspondiente para su mejor interpretacin.
4.- Mantener disciplina, orden, seriedad y responsabilidad durante la prctica.
5.-Abstenerse de realizar experimentos no autorizado por el docente.
6.-Formar grupos de trabajo que se mantendr durante el semestre acadmico.
7.- Dejar limpio el material utilizado al finalizar la practica
8.- Evitar ruidos y el molestar a los otros compaeros, apagar celulares.
9.-Tomar nota de todos los datos de, observaciones y resultados.
10. Presentar el informe de lo que aprendi en la prctica, a la siguiente sesin de laboratorio.
11. Consultar con el docente sobre alguna duda o inquietud durante la prctica.
12. Lavarse las manos y dejar todo en orden antes de salir del laboratorio.
13. Reponer el material roto o deteriorado durante la prctica.

IV.- NORMAS ADICIONALES

14. No se permitir el ingreso al laboratorio despus de iniciada la prctica.
15. El Informe de laboratorio ser evaluado de acuerdo a lo dispuesto en el silabo.
16. Las prcticas son obligatorias, en caso de no poder asistir, las justificaciones sern por escrito y
Sustentadas por enfermedad
17. Observar las normas de Bioseguridad recomendadas.

V.- NORMAS DE BIOSEGURIDAD

1.- Leer cuidadosamente los rtulos de los reactivos a ser utilizados.
2.- Identificar zonas de proteccin y localizacin de extintores en le laboratorio.
3.- Cerrar las llaves de gas despus de cada prctica, evitar fugas de gas.
4.- Solventes inflamables mantenerlos lejos de los mecheros.
5.- No manipular equipos elctricos con las manos mojadas.
6.- Evitar verter agua a los cidos, por generar reacciones peligrosas.
7.- No tocar ni probar sustancia alguna durante la prctica.
8.- No tocarse la cara ni frotarse los ojos mientras se trabaja en el laboratorio.
9.- No pipetear directamente los reactivos, utilizar peras de aspiracin.
10. No coger directamente material de vidrio recientemente calentado.
11. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo.
12. Llevar a cabo la experiencia programada.
13. Si hubiera salpicado reactivo qumico en los ojos lavar con abundante agua.
14. Verter en el lavadero todos los residuos lquidos y dejar correr abundante agua
15. Manipular sustancias de gran evaporacin bajo campanas extractoras.
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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N 1 : BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

I. INTRODUCCION

El laboratorio de Microbiologa Clnica tiene sus peculiaridades y necesidades que lo hacen diferente
a otros laboratorios diagnsticos: su objetivo fundamental es el aislamiento y cultivo de microorganismos
patgenos. Esta actividad genera un riesgo para el personal de salud que en el labora; es por ello que toda la
instalacin deber cumplir, como mnimo, con los criterios de contencin o bioseguridad.
Por otro lado, la interpretacin de los cultivos de las muestras clnicas va a depender de forma importante de la
capacidad del laboratorio de evitar o minimizar la presencia de microbiota contaminante, siendo fundamental el
correcto manejo de las muestras y cultivos (condiciones aspticas, cabinas de bioseguridad).
Por ltimo, el laboratorio de microbiologa debe disponer de equipamientos especficos (Cmaras de
bioseguridad, autoclaves y estufas biolgicas, entre otros) para poder cumplir con sus objetivos.
Existe una amplia gama de documentos y normativas que afectan de forma directa a un laboratorio de
microbiologa, desde normativas muy generales, aplicables a cualquier centro de trabajo pblico, hasta
normativas especficas en funcin de los agentes biolgicos que se manejan.
La bioseguridad es la aplicacin de un conjunto de medidas preventivas probadamente eficaces encaminadas a
reducir el riesgo a la exposicin a agentes biolgicos infecciosos o considerados de riesgo biolgico, agentes
fsicos o qumicos potencialmente peligrosos, asegurando que el desarrollo de actividades de enseanza,
investigacin o los productos finales de dichos procedimientos no atenten contra la seguridad de los
trabajadores, profesores, alumnos, visitantes y el medio ambiente.

II. COMPETENCIAS:
Al finalizar la sgte prctica el alumno de medicina ser capaz de:
Conocer las normas de bioseguridad para proteger la salud de las personas que puedan estar expuestas a
riesgos relacionados con la exposicin a agentes biolgicos, qumicos y fsicos en los laboratorios
III. PROCEDIMIENTO :
El estudiante de medicina deber hacer un reconocimiento fsico del laboratorio de microbiologa
El profesor har una breve explicacin de las normas de bioseguridad aplicables a los laboratorios de
microbiologa y sus niveles de riesgo.

III. RESULTADOS:
El alumno deber hacer:
- Una relacin de las principales medidas de bioseguridad aplicables a los laboratorios de microbiologa,
- Un cuadro con la clasificacin de los agentes biolgicos por grupo de riesgo.
- Esquematizar las seales de seguridad y normas de uso utilizadas en un laboratorio de Microbiologa.

IV. CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

V. CUESTIONARIO
1. Definir El Concepto de Bioseguridad
2. Mencionar los Grupos de Riesgo por Microorganismos Infectantes, diciendo cul es ms y menos peligroso
3. Que es La Contaminacin por Aerosoles? Explicar detalladamente
4. Mencione 10 Normas de Bioseguridad
5. Que Usos Tiene La Cmara de Seguridad Biolgica?
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PRACTICA N 2: RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

I. INTRODUCCION
Existen diferentes tipos de laboratorio atendiendo a su rea de conocimiento y lneas de investigacin a la
que se dediquen sin embargo todos ellos disponen de un material comnmente conocido. Entonces para
una correcta realizacin de nuestro trabajo de prcticas es necesario familiarizarse con los materiales de
laboratorio sus nombres, manejo y sus aplicaciones, conocer el uso especfico que tiene cada uno de ellos,
pero ms importante es saber manejarlo correctamente en el momento oportuno, teniendo en cuenta los
cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que as lo requieran.
Los materiales de laboratorio pueden distribuirse segn el elemento que lo conforma en material de vidrio o
de plstico, as como segn su posibilidad de reutilizacin en desechable o reutilizable, siendo el material de
vidrio uno de los elementos fundamentales en el laboratorio. Sus ventajas son su carcter inerte,
manejabilidad y la posibilidad de disear piezas a medida. Buena resistencia qumica al agua, soluciones
salinas, cidos, lcalis y sustancias orgnicas, presenta una alta transparencia y Estabilidad de la forma a
altas temperaturas
Este material bsico no ha sufrido grandes transformaciones con el devenir del tiempo solo ha mejorado en
su calidad y capacidad de precisin.
La presente prctica tratar de exponer los materiales de este tipo ms relevantes y habituales que se
utilizan en el laboratorio, con el objetivo de que se adquiera la capacidad para definirlos, identificarlos,
compararlos y contrastarlos, permitiendo con ello el correcto uso y manejo de los mismos.
La presente prctica tratar de exponer los materiales de este tipo ms relevantes y habituales que se
utilizan en el laboratorio, con el objetivo de que se adquiera la capacidad para definirlos, identificarlos,
compararlos y contrastarlos, permitiendo con ello el correcto uso y manejo de los mismos.

II. COMPETENCIA :

Al finalizar la presente prctica alumno de medicina ser capaz de:

Identificar, reconocer, describir y comprende la estructura del material necesario en un laboratorio de
microbiologa y parasitologa, mediante la observacin de los mismos
Conocer el uso y funcin de los materiales y equipos de laboratorio aprendiendo su uso
Adquirir destreza en la manipulacin del material utilizado en el laboratorio de microbiologa y
parasitologa.

EQUIPOS
III. MATERIALES DE LABORATORIO
Autoclave
Probeta graduada
Centrifuga
Pipetas
Microscopio
Erlenmeyer
Bao mara
Morteros
Refrigeradora
Soporte Universal
Horno
Frasco lavador
Estufa
Baln Fondo plano y fondo recto
Tubos de ensayo
Vasos de precipitacin
Matraces
Balanzas

Trpode Embudos
Mechero de alcohol Asas de siembra
Mechero Bunsen Frascos goteros
Malla de asbesto Laminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Micropipetas
 Placas petri
Varillas de agitacin o vagetas
Gradillas

IV. PROCEDIMIENTO :
El estudiante de medicina deber hacer un reconocimiento fsico del laboratorio y de la mayor cantidad de
materiales y equipos de laboratorio que se les suministren. Esto significa mirar, tocar, y aprender a usar
cada uno de ellos, preguntando cada vez que lo considere necesario, teniendo en cuenta las precauciones
que se deben tener durante su manejo.
El profesor har una explicacin de cada tipo de material as como su uso.
El profesor har una demostracin experimental del uso de los materiales.

EXPERIENCIA 1:
MANEJO DE MICROSCOPIO Y PREPARADO EN FRESCO PARA EXAMEN DIRECTO
- Obtener una muestra de sarro dentario con asa bacteriolgica estril.
- Homogenizar la muestra en solucin salina fisiolgica (S.S.F) estril (1 gota) sobre una lmina
o porta- objetos.
- Cubrir el preparado con laminilla.
- Enfoque y observe el microscopio con objetivos de 4X, 10X y 40X.

EXPERIENCIA 2. MANEJO DE HORNO

- Colocar en el horno el material a esterilizar debidamente acondicionado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura del Horno a 170C 180C y mantener el material por espacio de 2
horas.
Precauciones en el manejo:
- No abrir la puerta del horno mientras la temperatura en su interior se mantenga elevada un
cambio brusco de la temperatura puede causar destrozos en el material de vidrio.
- Cuidar de no elevar excesivamente la temperatura; de esta manera se evitara la carbonizacin
del papel y tampones de algodn.
- No colocar materiales que pueden ser destruidos por la temperatura como delantales, guantes
de goma, etc.

EXPERIENCIA 3: MANEJO DEL AUTOCLAVE

- Depositar agua en la caldera hasta unos centmetros de la parrilla.
- Colocar el material a esterilizar en el aparato.
- Cerrar la tapa y asegurar el cierre ajustando los tornillos o mariposas, tomando de dos en dos
tornillos diagonalmente opuestos.
- Dejar abierta la espita.
- Encender la fuente de calor.
- Cerrar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.
- Observar la espita cuando se produzca un flujo de vapor continuo.

- Observar el manmetro y mantener la presin en 15 libras mediante el control de la

temperatura (121C) durante 15 a 20 minutos.
- Iniciar la cuenta del tiempo en el momento que se consigue la temperatura deseada.
- Apagar el sistema de calefaccin despus del tiempo de esterilizacin.
 - Dejar enfriar hasta que el manmetro marque cero.
- Abrir la espita para que salga el exceso de vapor de agua.
- Aflojar los tornillos y levantar la tapa ponindose detrs del aparato para evitar que los vapores
lleguen a la cara del operador.
Precauciones en el manejo:
- Par evitar la perdida de material por ebullicin se recomienda no llenar los recipientes.
- No colocar los materiales muy juntos. Es preferible dejar espacios libres para favorecer la
circulacin de vapor.
- No apresurar bajar la presin abriendo la espita. Esta medida puede ocasionar perdida de
material y rompimiento de los recipientes de vidrio por el cambio brusco de la presin.

EXPERIENCIA 4.- MANEJO DE LA INCUBADORA

- Colocar En la estufa el material a incubar: placas petri o tubos de ensayo conteniendo el medio
de cultivo inoculado.
- Cerrar la puerta y encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura de la estufa a 37C o la deseada y mantener el material en incubacin
durante 24 o 48 horas.

EXPERIENCIA 5.- MANEJO DEL BAO MARIA

- Colocar la cantidad de agua suficiente en la canastilla del equipo.
- Encender la fuente calorfica.
- Graduar la temperatura deseada.
- Colocar dentro del agua el material a calentar y mantenerlo durante el tiempo deseado.

V. RESULTADOS:
El alumno deber esquematizar cada uno de los materiales observados en la prctica y resaltar su principal uso.

VI. CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

VII. CUESTIONARIO
5. A qu temperatura debe encontrarse una incubadora para el crecimiento de bacterias patgenas?
6. Los medios de cultivo en que material de vidrio se preparan.
7. Qu uso tienen las asas?
8. Cul es la temperatura de esterilizacin en autoclave?
9. Cul es la temperatura y tiempo de esterilizacin en el horno

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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA
 PRACTICA N 02: TINCIN DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio
ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms
simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre
tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc
La observacin puede ser realizada en muestras hmedas sin colorear (examen en fresco) o en
preparacin previamente coloreadas. Las tcnicas son mltiples y en un trabajo se eligen aquellas que mejor
sirven a un propsito determinado.
Las coloraciones varan en forma extraordinaria, desde aquellas que usan un solo colorante, como el azul
de metileno, hasta otras en las que las tcnicas son ms complejas. Ellas varan de acuerdo con los fines del
estudio y guardan relacin con la naturaleza y caractersticas biolgicas del germen que se trata de observar.
En las prcticas que conforman este primer captulo se describen tcnicas bsicas de coloracin, tiles en
el estudio morfolgico y estructural de los microrganismos.

II. COMPETENCIAS:
Al finalizar la Prctica el alumno de medicina ser capaz de:
Ejecutar las tcnicas bsicas de coloracin en el estudio bacteriolgico: Tincin Simple y Diferencial.
Interpretar el fundamento del proceso de coloracin de las tcnicas estudiadas.

III.MATERIALES DE LABORATORIO:
Material Biolgico:
Secrecin farngea.
Heces frescas
Orina
Sarro dentario

Material de Vidrio y Otros: Reactivos y Colorantes:

Aceite de inmersin
Lminas portaobjetos.
Bateria Gram
Laminillas cubreobjetos
Azul de metileno.
Bajalenguas
Bateria Ziehl Neelsen
Asa en anillo
Nigrosina
Asa en punta
Lugol
Mechero de alcohol.
Tinta china
Hisopos estriles.
Solucin salina fisiolgica (SSF 0.9%)
Pipetas pasteur

Equipos:
Microscopios.
Centrfuga

IV. PROCEDIMIENTOS:
PREPARACIONES EN FRESCO:
En un extremo de una lmina portaobjetos colocar gota de SSF y en el otro extremo otra gota de lugol
 Con un aplicador de madera coger una pequea porcin de la muestra de heces y emulsionarla en la
gota de SSF y luego en la del lugol
Cubrir la muestra con una laminilla cubreobjetos
Observar al microscopio primero con el objetivo de 10X y luego en 40X

COLORACIONES MICROSCOPICAS:
PREPARACIN DE FROTIS Y FIJACIN
Muestra: Orina,
a. Esterilizar el asa al rojo vivo en el mechero.
b. Djela enfriar.
c. Con el asa en anillo coger una asada de la muestra y extenderla sobre la lmina portaobjetos
d. Dejar secar al medio ambiente
e. Fijar la muestra al mechero haciendo tres pases sucesivos sobre la llama
Muestra: Secrecin farngea
a. Con un hisopo estril obtener una muestra de secrecin farngea .
b. Realizar el frotis en la lmina portaobjetos
c. Se debe conseguir extensiones finas.
d. Fijacin: secar al aire la preparacin o pasndola ligeramente por el mechero.

COLORACIN SIMPLE
a. Realice el frotis y la fijacin de las muestras a estudiar
b. Colorear con una de las soluciones siguientes:
c. Cristal Violeta (violeta de genciana) durante 1 minuto.
d. Azul de metileno de Loeffler durante 5 minutos.
e. Fucsina fenicada (diluida) durante 30 segundos.
f. Lavar en agua corriente.
g. Secar y observar el microscopio con objetivo de inmersin.
h. Esquematice e interprete sus observaciones.

COLORACIN GRAM
a. Realice el frotis y la fijacin de la muestra de secrecin farngea
b. Colocar el colorante Cristal Violeta durante 1 minuto.
c. Lavar en agua corriente a chorro suave.
d. Aplicar solucin de yodo (lugol) durante 2 min.
e. Decoloracin con alcohol -. Acetona durante 1 minuto o hasta que no se desprenda ms el color (solo 5
- 15 seg. En el caso de las extensiones sean finas y bien hechas).
f. Lavar en agua corriente.
g. Coloracin de contraste, aplicar Safranina durante 10 - 30 seg.
h. Lavar en agua corriente.
i. Secar y observar el microscopio con objetivo de inmersin.
j. Esquematice e interprete sus observaciones.

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN:

a. Hacer un frotis de la muestra de esputo o secrecin farngea y dejarlo sobre el puente de tincin
b. Aplicar fucsina-fenicada. Calentar con un mechero hasta la emisin de 3 vapores y dejar la
coloracin de 5 minutos.
c. Lavar suavemente el colorante con agua corriente fra hasta que toda la tincin libre quede lavada.
d. Decolorar con alcohol-cido: Cubrir cada portaobjetos con la solucin decolorante, alcohol cido
 e. Enjuague con agua una vez ms los portaobjetos y quite el exceso de agua.
f. Aplicar azul de metileno (1 minuto).
g. Enjuagar con agua corriente
h. Secar al aire.
i. observar al microscopio con el objetivo de inmersin.

V. RESULTADOS

El alumno deber esquematizar cada una de las observaciones realizadas

En las conclusiones deber fundamentar el principio de cada una de las coloraciones realizadas

VI CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

VII. CUESTIONARIO
1. Mencione Ud. la utilidad del preparado en freso
2. Mencione Ud. la utilidad de las coloraciones microscpicas
3. Mencione Ud. los tipos de coloraciones ms utilizadas para microorganismos esporulados
4. Defina los siguientes trminos: Estudio in vivo, Estudio in vitro, Estudio post mortem, Fijacin de clulas
y tejidos, Fijador, Frotis

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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N 04: TCNICAS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION:
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos
bajo condiciones artificiales. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa
consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un medio de
cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos.
LA SIEMBRA es el paso inicial en el estudio de las propiedades culturales de un germen. Es el procedimiento
por el cual se pone en contacto el microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de
temperatura y tiempo de incubacin pueda desarrollarse y multiplicarse in vitro. La siembra se efecta utilizando
el asa bacteriolgica, que permite una diseminacin de los grmenes en el medio de aislamiento, cuando este es
slido, la misma que deber esterilizarse previamente. El fin perseguido es el de conseguir que un germen quede
aislado de otro en la superficie del medio, donde se reproducir hasta el punto de dar una colonia, cuyos
componentes en ultimo termino descienden de un solo germen (o de un acumulo de grmenes de un solo tipo).
Esta forma de aislamiento fue un aporte fundamental a la tcnica bacteriolgica y se debe a Roberto Koch.
Tambin se puede utilizar medios lquidos para cultivos primarios, sobre todo cuando se trate de aislar
anaerobios, debiendo anotarse que en este ltimo caso, no siempre es posible conseguir un cultivo puro.
La prctica pretende dar al estudiante la manualidad necesaria para sembrar muestras en diversos medios y
comprender que la meta del trabajo es el aislamiento de los grmenes.

MODALIDADES DE SIEMBRAS:
Para la diseminacin de los microorganismos es necesaria una amplia superficie de medio nutritivo, sta se logra
en las placas de Petri y en menor medida en el agar inclinado.
La tcnica de la siembra en si, consiste en pasar sobre toda la superficie del medio, el instrumento portador del
inculo; en esta modalidad es recomendada evitar daar la superficie del medio.
Los tubos y placas petri donde se har la siembre, se marcan con un lpiz para vidrio poniendo nombre o
numero de registro, fecha u otro dato importante.
Siempre debe trabajarse cerca del mechero para flamear la boca del tubo o la placa Petri con el medio, antes y
despus de sembrar para evitar contaminaciones.

INCUBACIN: Despus de la siembra, las placas Petri deben quedar en la incubadora con la tapa hacia abajo,
para que el agua de condensacin (Desprendida por el calor de la estufa) no malogre la siembra.

LECTURA DE LA SIEMBRA: Esta se realiza entre las 12 y 24 horas tiempo en que aparecen por lo comn las
primeras colonias y es cuando comienzan la observacin del cultivo.
En las colonias se estudia la forma, tamao, contorno, coloracin, emulsionabilidad, grado de opacidad,
superficie y consistencia.

En los medios lquidos se observa el grado de turbidez o la formacin de una pelcula sobre el medio.
Uno de los caracteres fundamentales en una colonia es el referente a su contorno y superficie. Las colonias de
contorno regular y superficie lisa, se llaman colonias S (de la palabra inglesa Smooth que significa suave - liso).
Las de contorno y superficie irregulares, se llaman colonias R (de Rouge que significa rugoso). Estos aspectos
tienen relacin con la virulencia de algunos grmenes.

TRANSPLANTE O RESIEMBRA:
El estudio macroscpico de las colonias se completa con un estudio microscpico que se realiza emulsionando
una fraccin de la colonia en una pequea gota de suero fisiolgico cuidando que la extensin sobre la lmina
sea fina. Se fija, se colorea y se observa con aceite inmersin.
Luego se proceder al trasplante o resiembra que consiste en tomar con el asa la fraccin de la colonia elegida
(repicaje de colonias) y llevar este inculo a otro medio liquido o slido en el que se obtendr el desarrollo de una
sola especie de grmenes, lo cual constituye la fase final del proceso de aislamiento. El germen aislado en
estado de pureza constituye una cepa,
Los procedimientos de siembra en los trasplantes varan segn el medio que se va a usar.
Si el medio es liquido, bastar tocar la superficie de este con el inoculo.
Si el medio es slido varia la forma de siembra siendo en unos casos por estra, o sea pasando el inculo en zig-
zag sobre la superficie del medio inclinado, y en otros por puncin o picadura, que consiste en introducir la aguja
hasta el fondo o a poca profundidad segn la naturaleza del medio.
El asa se esteriliza al rojo antes y despus de su empleo.

II. COMPETENCIAS:
- Al trmino de la practica el alumno debe:
- Adquirir la manualidad y destreza en la siembra de microorganismos que le
permitan la obtencin de cultivos puros.
- Obtiene cultivos puros mediante trasplante en caldo, Agar inclinado y agar por
picadura.

III MATERIAL:
- Material Biolgico: Muestras de Orina y Heces
- Asa bacteriolgica en anillo y en punta,
- Mechero.
- Tubos con suspensin bacteriana
- Placas de Agar Nutritivo
- Placas con Agar Mc Conkey
- Placas con Agar XLD
- Placas con Agar SS
- Tubos con Caldo Nutritivo estril.
- Tubos con Agar TSI
- Tubos con Agar LIA
- Tubos con Agar SIM
- Tubos con Agar Citrato
- Tubos con Agar Urea

IV. PROCEDIMIENTOS:
a. MTODO DE AISLAMIENTO.-

AISLAMIENTO POR DISEMINACIN (mtodo en superficie).

Muestra: Orina
- Esterilizar un asa bacteriolgica y dejar enfriar por 5 seg.
- Introduzca el asa bacteriolgica y retire una asada de la suspensin bacteriana.
- Flamear los bordes de una placa de agar Mc Conkey. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario
para introducir el asa bacteriolgica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso
de estriacin por agotamiento. Segn esto la primera estriacin contendr ms cultivo que la segunda, esta
 ms que la tercera y as sucesivamente de modo que en las ltimas estar suficientemente agotado para dar
colonias aisladas.
- Marcar las placas sembradas, con plumn indeleble, a fin de que permitan su identificacin posterior.
- Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs.
- Realizar el estudio de las colonias y/o realice el Transplante de las colonias para obtener cultivos puros.

Para sembrar en placa Petri es importante que la superficie del medio este completamente seca, para
conseguir esto las placas deben quedar en reposo durante 2 reposo.

AISLAMIENTO POR DISEMINACIN (mtodo en superficie).

Muestra: Heces
- Esterilizar un asa bacteriolgica y dejar enfriar por 5 seg.
- Introduzca el asa bacteriolgica y retire una asada de la suspensin bacteriana.
- Flamear los bordes de una placa de agar XLD. Levante la tapa de la placa justamente lo necesario para
introducir el asa bacteriolgica cuya carga es diseminada por la superficie del agar mediante el proceso de
estriacin por agotamiento. Segn esto la primera estriacin contendr ms cultivo que la segunda, est
ms que la tercera y as sucesivamente de modo que en las ltimas estar suficientemente agotado para dar
colonias aisladas.
- Marcar las placas sembradas, con plumn indeleble, a fin de que permitan su identificacin posterior.
- Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 hs.
- Realizar el estudio de las colonias y/o realice el Transplante de las colonias para
obtener cultivos puros.

b. MTODOS DE TRANSPLANTE:
SIEMBRA POR ESTRAS EN AGAR INCLINADO:
- Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5sg.
- Tomar con la mano izquierda un tubo con suspensin bacteriana en desarrollo, y
homogenizar.
- Tomar un tubo con agar inclinado (citrato): con el dedo meique de la mano
derecha quite el tapn de
algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia y realice la

siembra por estras sobre la superficie del agar inclinado

- Retire la aguja bacteriolgica, vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de
nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla.
- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.
- Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 hs.
- Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.

SIEMBRA EN SUPERFICIE Y PICADURA:

El inculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo
cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del
agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra.

SIEMBRA EN AGAR POR PICADURA:

- El inculo es introducido con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo
movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la
boca del tubo antes y despus de la siembra
- Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5sg.
- Tomar con la mano izquierda una placa con colonias en desarrollo
- Coger una asada de la colonia sospechosa con una asa en punta
- Tomar un tubo con agar no inclinado y con el dedo meique de la mano derecha
quite el tapn de algodn; flamee la boca del tubo; introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la colonia
y realice la siembra por picadura en el agar profundo.
- Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de
nuevo el tapn de algodn deje el tubo en la gradilla.
- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.
- Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas.
- Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.

SIEMBRA EN CALDO
- Esterilizar una aguja bacteriolgica. Dejar enfriar 5 seg.
 - Tomar con la mano izquierda una placa con las colonias en desarrollo, flamee los
bordes de la plazca y levante justamente lo necesario para introducir la aguja bacteriolgica y
extraer una colonia.
- Tomar un tubo con caldo nutritivo; con el dedo meique de la mano derecha quite el
tapn de algodn, flamee la boca del tubo, introduzca la aguja bacteriolgica que contiene la
colonia y realice la siembra por suspensin en el medio liquido.
- Retire la aguja bacteriolgica; vuelva a flamear el tubo por sus bordes y coloque de
nuevo el tapn de algodn. Deje el tubo en la gradilla.
- Marcar los tubos a fin de identificarlos posteriormente.
- Incubar los tubos sembrados a 37C durante 24 horas.
- Realice el estudio de las caractersticas del cultivo.
- Anotar los resultados

V. RESULTADOS

El alumno deber esquematizar cada una de las observaciones realizadas

VI CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

VII CUESTIONARIO:
1. Qu diferencias hay entre siembra por difusin y siembra por diseminacin-
2. Cul es el objetivo de la siembra de microorganismos
3. Qu mtodos utilizara para cultivar y aislar microorganismos anaerobios
4. A qu se llama unidad formadora de colonia
5. DEFINIR: SIEMBRA BACTERIANA
6. Cules son los requerimientos indispensables para el desarrollo in vitro de los microorganismos
7. Esquematice y explique la curva de crecimiento bacteriano

UNVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA
 GUIA DE PRACTICA N 05

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCION
Cultivar un microorganismo significa promover el desarrollo de ste en medios de cultivo y
condiciones de laboratorio controladas.
En consecuencia, los medios de cultivo son compuestos necesarios para el desarrollo bacteriano y
deben contener:
a) Sustancias nutritivas apropiadas (protenas, carbohidratos, sales minerales, etc)
b) Tener un pH conveniente; generalmente de 6.8 a 7.6.
c) Estar previamente esterilizados.
d) Estar protegidos de contaminacin.

Tipos de medios de cultivo.

Por su CONSISTENCIA:
a) Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente
agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio
inclinada).
b) Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.
Por su COMPOSICIN:
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.
b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de
microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado,
inhibiendo el desarrollo de los dems.
d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un
determinado tipo de microorganismos posee.

La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste

contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico (proveniente de
una sola clula), cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo
mixto.
Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. Tomando las precauciones especiales,
en el laboratorio, instrumentos y recipientes utilizados, ya que los microorganismos estn por todas
partes, en la naturaleza., los microorganismos contaminantes deben ser eliminados.
Una colonia est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo
lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.

OBJETIVOS:
Al finalizar la presente prctica el alumno de medicina ser capaz de:
Conocer y aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo, su esterilizacin y
almacenaje
 Conocer y comprender la importancia, utilidad, composicin y usos de los medios de cultico ms utilizados
en microbiologa.
Conocer el fundamento de los medios de cultivo

III. MATERIAL:
Placas petri estriles
Tubos de ensayo estriles
Matraces erlenmeyer
Mechero,
esptula, autoclave y bao mara.
Algodn, papel, hilo
Balanza

MEDIOS DE CULTIVO:
o Agar Mac Conkey
o Agar XLD
o Agar SS
o Agar LIA
o Agar TSI
o Agar SIM
o Agar CITRATO
o Agar Mueller Hinton
o Agar Manitol Salado

IV. PROCEDIMIENTOS:
- Pesar las sustancias segn indique la composicin del medio de cultivo y
agregarlos a un matraz erlenmeyer.
- Disolver los ingredientes, a bao mara, en la cantidad de agua destilada
indicada.
- Enfriar moderadamente y ajustar el pH entre 6.8 7.4 u otro que fuese
indicado.
- Colocar un tapn de algodn en la boca del matraz y cubrirlo con papel
ajustndolo con hilo al cuello del recipiente.
- Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min.
- Distribuir los medios de cultivo en placas y/o tubos estriles:
a) Los medios lquidos repartirlos en tubos y/o placas estriles frente a la llama de mechero. A
los medios slidos repartidos en tubos, antes que solidifiquen, se les dar la inclinacin
respectiva.
b) Realizar el control de esterilidad de los medios de cultivo incubado los tubos y/o placas en la
estufa a 37C durante 24 horas.
c) Conservar los tubos y/o placas de medio de cultivo en la refrigeradora hasta su posterior
uso.
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FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N 6 : METABOLISMO BACTERIANO

 PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

I. INTRODUCCION:
El Metabolismo bacteriano consiste de un gran nmero de reacciones qumicas destinadas a transformar las
molculas nutritivas en energa y componentes estructurales necesarios para los microorganismos, dichas
reacciones qumicas son catalizadas por enzimas.
Las necesidades mnimas para el crecimiento son una fuente de carbono, nitrgeno, una fuente de energa,
agua y diversos iones. Aunque el oxgeno es esencial para unas bacterias, para otras constituye una
sustancia txica. Este tipo de bacterias son conocidas como anaerobias estrictas. En cambio otras bacterias
como Mycobacterium tuberculosis requieren la presencia de oxgeno molecular para su crecimiento y en
consecuencia se denominan Aerobias estrictas y otras pueden crecer tanto en presencia como en ausencia
de oxgenos a estas se les llama anaerobias facultativas. Aunque algunas bacterias obtienen la energa de
compuestos qumicos otros lo toman directamente de la energa luminosa

II. COMPETENCIAS:
Al finalizar la Practica el alumno ser capaz de:
- Realizar pruebas bioqumicas que son de utilidad general para la identificacin de bacterias.
- Realizar las lecturas e interpretaciones correspondientes de las pruebas bioqumicas efectuadas

III. MATERIALES Y MTODOS:

Homogenizados de cepas bacterianas - Tubos con Agar TSI
Placas con Agar Nutritivo - Tubos con Agar LIA
Placas con Agar Mac Conkey - Tubos con agar SIMS
Placas con Agar XLD - Tubos con Agar Citrato de Simonds
Placas con Agar SS - Tubos con Agar Urea de Christiansen
Tubos con Caldo Nutritivo - Mecheros
Anzas de cultivo - Gradillas

IV. PROCEDIMIENTO
A. DEGRADACIN DE GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA, PRODUCCIN DE GAS E H 2S en medio Agar
TSI: (Triple Azcar,
Hierro)
Medio empleado para la diferenciacin de enterobacterias en base a la fermentacin de los hidratos de
Carbono glucosa, sacarosa y lactosa y a la produccin de cido sulfdrico
Muestra: Cultivos Bacterianos
Medio de Cultivo: TSI
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio de TSI
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano y sembrar por picadura en el fondo y estra en la superficie del medio TSI
flameando la boca del tubo

Incubar a 37C por 24 hrs.

Realizar la lectura
Lectura e interpretacin del TSI:
a) La degradacin de los azcares con formacin de cido (acidez positiva) se manifiesta por un cambio
de color del indicador Rojo de fenol que hace virar
- el color del medio de anaranjado rojizo a amarillo, en caso de acidez y se simboliza con la letra A,
- o por un viraje del medio de anaranjado rojizo a rojo intenso en caso de alcalinizacin (alcalinidad
positiva) y se simboliza con la letra K.
b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio (Gas positivo). Se simboliza
segn su intensidad de 1+ a 3+.
c) Produccin de H2S: El tiosulfato es reducido por algunos grmenes a cido sulfhidrco, el cual
reacciona con la sal frrica produciendo sulfuro de hierro que se manifiesta por un precipitado negro en el
medio (H2S positivo). Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 3+.

d) Lectura:
- Pico alcalino/fondo alcalino (NN): No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras.
- Pico alcalino/fondo Amarillo (K/A) : Glucosa fermentada, Ni lactosa ni sacarosa fermentadas.
- Pico alcalino/fondo Amarillo y negro (K/A/H 2S +): Glucosa fermentada, Ni lactosa, ni sacarosa fermentadas,
produccin de cido sulfhdrico.
- Pico Amarillo/fondo Amarillo ( A/A/H2S - ): Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. H2S : Negativo.

B. DESCARBOXILACION DE LA LISINA en medio agar LIA:

Esta prueba permite diferenciar los microorganismos que producen descarboxilacin o desaminacin de
la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S y es ms sensible que el TSI para la
deteccin H2S
Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.
Muestra: Cultivos Bacterianos
Medio de Cultivo: LIA
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio de LIA
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar tanto por por picadura central en el taco como por estra
sobre la superficie inclinada.
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin del Agar LIA:
La Lisina puede ser descarboxilada (Descarboxilacin) por microorganismos LD positivas, que la
transforman en la amina cadaverina, esto produce un viraje del indicador Prpura de bromocresol a un
color violeta intenso.
Se simboliza con la letra K.
Puesto que la descarboxilacin solo tiene lugar en un medio cido (pH inferior a 6) es necesario que se
produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo por fermentacin de la glucosa.
Los microorganismo LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de
la totalidad del medio de cultivo. Se simboliza con la letra A. La incubacin prolongada puede ocasionar
una alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un
viraje al violeta. La produccin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro
producido.

C. DESAMINACIN DE LA LISINA en medio Agar LIA:

Las cepas del grupo Proteus y Providencia, con excepcin de algunas cepas de Proteus morganii,
desaminan la Lisina a cido alfa-cetocarbnico formando compuestos pardorojizos en la superficie del
medio con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno. Se simboliza con la letra R.

D. PRUEBA DE MOVILIDAD, HIDROGENO SULFURADO Y PRODUCCIN DE INDOL en Medio de

cultivo: Agar SIM
El medio SIM es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro
de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio SIM
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por picadura central en la columna vertical del medio
 Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e Interpretacin:
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de
la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de
dicho canal.
La formacin de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento.
La produccin de Indol pone de manifiesto la presencia de la Enzima Triptofanasa que degradar el
triptofano y liberar al medio Indol que se combina con el aldehido (paradimetilbenzaldehido)
presente en el reactivo de Kovacs, si hay indol se formar un anillo rojo en la superficie.

E. DEGRADACIN DEL CITRATO en medio Agar Citrato de Simons

Algunas enterobacterias tienen la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa
Finalidad: Determinar la utilizacin del citrato por bacterias como la nica fuente de carbono.
Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons
Procedimiento:
Rotular los tubos con medio CITRATO
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por estra en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpreatcin
La degradacin del citrato como nica fuente de carbono origina la alcalinizacin del medio.
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira a azul oscuro, dando
una reaccin positiva (Citrato +) si el crecimiento es visible; y como reaccin negativa (citrato -) si no
cambia de color

F. DEGRADACION DE LA UREA
Evala en las bacterias la capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrgeno, mediante la enzima
ureasa, que degrada la urea en dixido de carbono y amoniaco. El amoniaco acta como fuente de
nitrgeno y capta protones, transformndose en amonio y alcalinizando el medio. Contiene rojo fenol como
indicador de pH, el cual vira el medio a fucsia cuando el pH se torna alcalino.
Finalidad: Determinar la hidrlisis de la Urea por bacterias.

Medio de cultivo: Agar Urea de Christensen

Procedimiento:
Rotular los tubos con medio Urea
Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger un cultivo bacteriano sembrar por estra en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e Interpretacin de los resultados.
La positividad viene dada por una coloracin rosada o fucsia en el medio. Ejm Proteus sp es positivo
para la prueba

G. AGAR Mc CONKEY :
El Agar Mc Conkey es un medio Slido, Diferencial y Selectivo para el aislamiento de Enterobacterias
Permite diferenciar bacterias que fermentan o no, la lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos.
Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano,
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
 Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Fundamento:
Por fermentacin de la lactosa, se producir cido lo que disminuye el pH alrededor de la colonia.
Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), y darn al medio un aspecto rosceo
con un halo turbio debido al descenso del pH provocados por los cidos biliares en las colonias. Si por
el contrario son Lactosa (-) el medio se alcalinizar por el uso de la peptona y se tornar amarillo o
incoloro
Lectura e Interpretacin
Las colonias lactosa positivas son rojas o rosadas con un halo turbio debido al descenso de pH
Las colonias Lactosa negativas son incoloras

H. Agar XLD :
El Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato) es un medio selectivo y de diferenciacin, utilizado para el
aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas especialmente del gnero Salmonella,
Shigella y Providencia.
- La xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prcticamente todos los entricos,
excepto Shigella, y esta propiedad hace posible la diferenciacin de dicha especie
- La lisina se incluye para permitir la diferenciacin del grupo Salmonella de los organismos no
patgenos, dado que, sin lisina, Salmonella fermentara rpidamente la xilosa y no se distinguira
de las especies no patgenas. Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la lisina es
atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH alcalino que imita la
reaccin de Shigella.
- Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los
microorganismos gram positivos

- El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formacin de cido sulfdrico por la precipitacin de sulfuro
de hierro produciendo un color negro en las colonias.
Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin:
La degradacin de la xilosa, lactosa y sacarosa a cido produce un viraje al color amarillo alrededor
de las colonias por su indicador rojo de fenol (Xilosas +)
Las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se reconocen por la presencia de
un color rojo prpura, debido al aumento de pH, alrededor de sus colonias (Xilosas -)

I. AGAR SS (SALMONELLA Y SHIGELLA) Empleo e Interpretacin:

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y
Shigella a partir de muestras clnicas, heces y de alimentos
El verde brillante, la bilis de buey y la elevada concentracin de tiosulfato y de citrato inhiben
considerablemente la flora acompaante, bacterias Gram positivas, la mayora de bacterias Gram
negativas
 Con el tiosufato e iones de hierro se pone de manifiesto la formacin de sulfuro por el ennegrecimiento
de las correspondientes colonias. Las colonias de coliformes quedan sealadas por la demostracin de
la degradacin de lactosa a cido, a cargo del indicador de pH Rojo de fenol
Procedimiento:
Rotular las placas
Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar
Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la superficie del medio
Incubar a 37C por 24 hrs.
Realizar la lectura
Lectura e interpretacin:
Las colonias de grmenes Lactosa + son rosadas hasta rojas
Las colonias de grmenes lactosa negativas son incoloras
Las colonias de microorganismos formadoras de H2S presentan un centro negro.

V. RESULTADOS:
El alumno deber dibujar cada uno de los medios utilizados del color de inicio y las variaciones de color que
stos tuvieron con su debido fundamento, ordenadamente.

VI CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

VII. CUESTIONARIO:
Por qu es necesario ajustar el pH del medio?
Para qu se aade el agar-agar? Qu cualidades tiene esta sustancia?

PRINCIPALES PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE

BACTERIAS

Medio
Color
de Prueba Indicador Color final Resultado
inicial
cultivo
Negruzco H2S (+)
Tiosulfato de sodio y Rojo Amarillo H2S (-)
H2S
sulfato ferroso naranja
Glucosa, Amarillo Acido: A
TSI Rojo
Sacarosa y Rojo de fenol rojo Alcalino: K
naranja
Lactosa,
burbujas de aire o Gas (burbujas) Gas (+)
Gas resquebrajamiento No Gas Gas (-)
del medio

Violeta intenso Decarboxilacin

Decarboxilas Prpura de
LIA violeta Amarillo (+)
a Bromocresol
Decarboxilacin
(-)
 LIA Deaminasa Prpura de violeta Rojizo Deaminacin (+)
Bromocresol

Citrato Azul Citrato (+)

de Verde Citrato (-)
Citrato Azul de bromotimol verde
Simon
s
Transparencia del transpare Turbidez del Motilidad (+)
Motilidad
medio nte medio
SIMS Negruzco H2S (+)
Tiosulfato de sodio y transpare
H2S
sulfato ferroso nte

Paradimetilbenzaldeh Anillo Grosella Indol (+)

transpare
Indol do (reactivo de Anillo Amarillo Indol (-)
nte
Kovacs)
Rosado Urea: +
UREA Ureasa Rojo de fenol amarillo amarillo Urea: -
Colonias Lactosa +
Mc rosadas Lactosa -
Fermentacin Color del
Conke Rojo Neutro C. incoloras
de la Lactosa medio
y

Colonia Xilosas +
Fermentacin
XLD Rojo de fenol rojo amarillas Xilosas -
de la Xilosa
incoloras
Fermentacin Purpura Rosadas Lactosa +
SS Rojo de fenol
de la Lactosa bajo Incoloras Lactosa -

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PRACTICA N 7: CONTENIDO TEMATICO PROCEDIMENTAL: EL ANTIBIOGRAMA

I. INTRODUCCION:

El diagnstico y tratamiento de un paciente son muy complejos, el aislamiento del agente infeccioso no es
con frecuencia suficiente para establecer la terapia adecuada. Ya que no se puede predecir la susceptibilidad
de las bacterias, hongos y virus a los agentes antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la
sensibilidad individual de cada patgeno a estas drogas.
El antibiograma es una prueba microbiolgica que se realiza para determinar la sensibilidad de una colonia
bacteriana a un antibitico o grupo de antibiticos. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia
a los agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales ms
actuales, por lo que con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patgeno a estas
drogas, pudindose elegir entonces el agente apropiado (el antibitico ms activo contra el patgeno, el
 menos txico para el husped, con las caractersticas farmacolgicas apropiadas y el ms econmico), que
proporcione mayores posibilidades de una evolucin favorable.
El objetivo primordial del antibiograma es ofrecerle al mdico una prediccin sobre la posibilidad de xito del
tratamiento que se lograr alcanzar con el uso de un antibitico determinado en donde se ha determinado l
o los grmenes causales de la infeccin. Los microbilogos slo pueden recomendar agentes teraputicos
sobre la base de sus actividades in vitro, el clnico es quien debe tomar la decisin final, teniendo en cuenta
su conocimiento sobre todos los factores pertinentes. Sin embargo para el microbilogo y epidemilogo
resulta de vital importancia el poder aportar datos sobre la resistencia microbiana en una comunidad
determinada o quizs para conocer nuevos mecanismos de resistencia.

II. COMPETENCIAS:

Al finalizar la sgte. Prctica el alumno de medicina ser capaz de:

Conocer cmo se realiza la valoracin de la actividad antimicrobiana de un compuesto qumico (antibitico)
mediante la tcnica de Kirby-Bauer.
Determinar la sensibilidad in vitro de los microorganismos frente a los antibiticos.
Seleccionar los antibiticos adecuados en la terapia especfica de infecciones bacterianas.

III. MATERIALES:
Cepas de microorganismos identificados.
Placas con agar Mueller Hinton
Tubos con caldo Mueller Hinton
Vernier o regla
Hisopos de algodn estriles
Discos de sensibilidad antibitica
Pinzas

IV. PROCEDIMIENTOS:

PREPARACIN DE INCULO:
Puede realizarse de dos formas:

1. Mtodo del desarrollo previo:

Seleccionar 3 a 4 colonias bien aisladas, del mismo tipo morfolgico, de un cultivo en placa.
Tocar la superficie de cada colonia con un asa de siembra y transferirlo a un tubo que contiene de 4 a 5
ml de caldo apropiado (Ejm. Caldo Tripticasa Soya).
Incubar el caldo a una temperatura entre 35 a 37C hasta que alcance o exceda la turbidez del
estndar 0.5 de la escala de Mc Farland (por lo general de 2 a 6 hrs.).
Ajustar la turbidez del inculo con solucin salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escala de Mc
Farland, por comparacin visual con el estndar.

2. Mtodo de inoculacin a partir de colonias aisladas:

De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 a 24 hrs. Seleccionar las colonias
aisladas y preparar una solucin directa en solucin salina o caldo.
La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0.5 de Mc. Farland.

INOCULACIN DE LAS PLACAS:

 Dentro de los 15 minutos sgtes. al ajuste de la turbidez del inculos, sumergir un hisopo estril en la
suspensin, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima
del nivel del lquido para remover el exceso de inculo.
Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para
asegurar una distribucin uniforme del inculo. Antes de colocar los discos dejar secar la placa a
temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea
absorbido.

APLICACIN DE LOS DISCOS:

Colocar los discos individuales sobre la superficie del agar con la ayuda de una pnza estril o la punta
de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar.
Distribuir los discos uniformemente, de modo que queden a una distancia de 25 mm uno del otro.
No debe colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6 en una placa de 100 mm de
dimetro interno, para evitar la superposicin de las zonas de inhibicin.
Un disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que
algunos antibiticos se difunden rpidamente.

INCUBACION:
Incubar las placas en posicin invertida a 35C dentro de los 15 min posteriores a la aplicacin de los
discos.

LECTURA E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:

Medir los dimetros de la zona de inhibicin completa (incluyendo el dimetro del disco), usando una
regla.
Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luz reflejada localizada a unos
cuantos centmetros sobre un fondo negro. Tener la precaucin de observar la placa siguiendo una
vertical directa para evitar una lectura errnea de las marcas de la regla
El punto final debe tomarse como el rea que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede ser
detectado mediante observacin visual

Los dimetros de inhibicin son interpretados basndose en tablas. La sensiblilidad de la cepa

bacteriana ser reportada como Sensible (S), Intermedio (I) o Resistente

V. RESULTADOS:
El alumno deber dibujar cada uno de los medios utilizados del color de inicio y las variaciones de color
que stos tuvieron con su debido fundamento, ordenadamente.

VI CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 UNVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO
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ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N 8: ACCION DE LOS AGENTES FSICOS Y QUMICOS SOBRE EL DESARROLLO

BACTERIANO

I. INTRODUCCION:
La mayor parte de las bacterias patgenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones extremas en su medio
ambiente y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo vivo. Otras en cambio producen esporas que
son muy resistentes a las condiciones fsicas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor
incrementado de supervivencia, lo que constituye un problema en los procedimientos quirrgicos, preparacin de
los medios de cultivo y material utilizado en la prctica mdica.
Los principios bsicos de esterilizacin y desinfeccin, son de utilidad en el ejercicio de los profesionales de
la salud; sobre todo en aquellos procesos de instrumentacin de pacientes tales como colocacin de sondas, de
marcapasos o intervenciones quirrgicas locales o en pabelln, en donde se requieren de condiciones aspticas
para prevenir las infecciones adquiridas durante el acto mdico.
 Para realizar una prctica inteligente de la medicina resulta fundamental comprender los principios bsicos
de la esterilizacin y desinfeccin.
Se denomina esterilizacin al conjunto de procedimientos fsicos o qumicos que permiten destruir
microorganismos patgenos o saprfitos que se encuentran en el interior o en la superficie de los objetos y
sustancias. La desinfeccin es la destruccin de microorganismos por agentes qumicos. De los agentes fsicos
uno de los ms empleados es el calor hmedo (ebullicin, autoclave). Como agentes qumicos tenemos a los
desinfectantes (empleados sobre superficies inanimadas: fenol, cloro, HCL) y a los antispticos (de aplicacin
sobre la piel y las mucosas: alcoholes, colorantes, sales de metales pesados, jabones).
Los agentes qumicos pueden a su vez clasificarse con base a su mecanismo de accin: los que
desnaturalizan protenas (fenol, etanol); los que afectan los procesos de oxidorreduccin (KMnO 4) y modificando
la permeabilidad de la membrana (jabones) entre otros. Si bien la mayor parte de los agentes qumicos simples
que alguna vez se utilizaron en teraputica han sido remplazados por agentes quimioterpicos ms especficos,
muchos de este grupo han mantenido su importancia como antispticos o desinfectantes eficaces en la
destruccin de microorganismos en el medio ambiente inerte.
En el cuidado de personas con enfermedades trasmisibles la destruccin del patgeno es necesaria para
prevenir la diseminacin de la infeccin a personas susceptibles. Con este propsito una desinfeccin resulta
adecuada y en general se le emplea en el procedimiento de limpieza.

II. COMPETENCIAS:
Al finalizar la Prctica el alumno de la facultad de Medicina ser capaz de:
Conocer mediante la observacin la accin de los agentes fsicos y qumicos sobre las bacterias

III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:

Placas con Agar tripticasa soya (TSA).
Cultivos bacterianos.
Alcohol al 70%
Formaldehdo al 10%
Fenol al 1%

IV PROCEDIMIENTO

ACCION DE LA TEMPERATURA:
Dividir la placa de agar TSA como indica en la figura
Sembrar en tubos con caldo de cultivo, cultivos bacterianos
Someterlos a temperatura de ebullicin durante diferentes periodos de tiempo: 1 min., 5 min. y 10 min.
Sembrar los cultivos sometidos a esterilizacin en las placa de TSA
Marcar y llevar a incubar a 37C por 24 hrs.

0 min 1 min

5 min 10 min
ACCION DE AGENTES QUIMICOS:
Sembrar cultivos bacterianos en placas de agar TSA
Colocar en la superficie sembrada, discos estriles de papel filtro embebidos en cada uno de los sgtes.
elementos
Alcohol al 70%
Formaldehdo al 10%
Fenol al 1%
Incubar a 37C por 24 hrs. Realizar la lectura

formaldehi
Alcoh
do
ol

fenol

V. RESULTADOS:
Dibuje los resultados obtenidos en la prctica

VI CONCLUSIONES Y REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS