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    La Prueba de Coombs

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    Carlos Alberto Di Berardino
    La prueba de Coombs, descrita por primera vez en 1945, detecta la presencia de anticuerpos unidos a los glóbulos rojos mediante el uso de un suero llamado reactivo de Coombs. Existen dos tipos de prueba de Coombs: la directa, que detecta anticuerpos ya unidos a los glóbulos rojos, y la indirecta, que detecta anticuerpos circulantes en la sangre que podrían unirse a los glóbulos rojos. Ambas pruebas se utilizan para diagnosticar enfermedades como anem

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    La prueba de Coombs, descrita por primera vez en 1945, detecta la presencia de anticuerpos unidos a los glóbulos rojos mediante el uso de un suero llamado reactivo de Coombs. Existen dos tipos de prueba de Coombs: la directa, que detecta anticuerpos ya unidos a los glóbulos rojos, y la indirecta, que detecta anticuerpos circulantes en la sangre que podrían unirse a los glóbulos rojos. Ambas pruebas se utilizan para diagnosticar enfermedades como anem

    Descripción original:

    hematologia

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    La prueba de Coombs, descrita por primera vez en 1945, detecta la presencia de anticuerpos unidos a los glóbulos rojos mediante el uso de un suero llamado reactivo de Coombs. Existen dos tipos de prueba de Coombs: la directa, que detecta anticuerpos ya unidos a los glóbulos rojos, y la indirecta, que detecta anticuerpos circulantes en la sangre que podrían unirse a los glóbulos rojos. Ambas pruebas se utilizan para diagnosticar enfermedades como anem

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    La Prueba de Coombs

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    La prueba de Coombs, descrita por primera vez en 1945, detecta la presencia de anticuerpos unidos a los glóbulos rojos mediante el uso de un suero llamado reactivo de Coombs. Existen dos tipos de prueba de Coombs: la directa, que detecta anticuerpos ya unidos a los glóbulos rojos, y la indirecta, que detecta anticuerpos circulantes en la sangre que podrían unirse a los glóbulos rojos. Ambas pruebas se utilizan para diagnosticar enfermedades como anem

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    La prueba de Coombs fue descrita por primera vez por los cientficos Rob Race, Arthur

    Morant, y Robin Coombs (por quien la prueba era llamada) en 1945.


    Es un examen de sangre que se usa en inmunologa y hematologa. Este anlisis puede
    detectar la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con antgenos en la
    superficie de los glbulos rojos. Hay dos tipos distintos de la prueba de Coombs: el
    directo y el indirecto.
    Ambas pruebas de Coombs emplean un antisuero llamado reactivo de Coombs, que
    contiene anticuerpos de animales inmunizados dirigidos contra IgG, IgM,
    y/o complemento humano. Estos anticuerpos se unen a los anticuerpos de los antgenos
    que estn en la superficie de los glbulos rojos, causando aglutinacin de las
    clulas.2 Esta aglutinacin observada corresponde a un resultado positivo, y la ausencia
    de aglutinacin es un resultado negativo.

    En esta prueba se utiliza el suero de Coombs, o reactivo de


    inmunoglobulina humana, el cual consiste, en su forma ms simple,
    en una inmunoglobulina dirigida contra la porcin Fc (cadenas
    pesadas) de los anticuerpos de tipo IgG. Existen igualmente reactivos
    que estn conformados no solamente por inmunoglobulinas antiIgG
    sino tambin por inmunoglobulinas dirigidas contra la molcula C3 del
    complemento, lo que permite reconocer la presencia de anticuerpos
    fijadores de complemento. Se han desarrollado asimismo reactivos
    dirigidos contra fracciones especficas de complemento, como C3b,
    C3d, C4b y C4d.
    Se obtiene al inmunizar animales con globulinas del suero humano, estaspueden ser
    inmunoglobulinas purificadas (IgG, IgM, IgA) y o fracciones decomplemento (C3b,
    C3d), producindose antiproteinas humanas en el sueroanimal, las que se purifican tras
    absorcin con eritrocitos humanos lavados queeliminan las aglutininas no
    deseadas.Sueros antiglobulinicos se obtienen de forma policlonal y mediante la
    tecnologade hibridomas, pueden ser mono o poliespecficos
    El suero antiglobulina Humana se obtiene inyectando conejos con purificados de IgG
    humana y fracciones del complemento (C3d); el conejo as sensibilizado con las
    globulinas humanas producir anticuerpos contra la IgG humana y contra el
    componente C3d del complemento.
    El suero antiglobulina puede ser adquirido comercialmente con diferentes
    especificidades, el mas usado es el poliespecifico, es decir, que contiene tanto actividad
    anti IgG como antiC3d; la actividad anti IgG del reactivo est dirigida contra la porcin
    Fc de la IgG humana, de igual forma se puede conseguir el reactivo con especificidad
    anti-IgG o anti-C3d por separado.
    La prueba de Coombs directa detecta anticuerpos ya unidos a la superficie de los
    glbulos rojos. Esta prueba se usa para determinar si hay complemento o anticuerpos ya
    fijados a los eritrocitos tomados directamente del paciente. Estas clulas, alcanzadas de
    una venopuncin, se lavan y se agrega el reactivo de Coombs. Los anticuerpos del
    reactivo se unen a IgG, IgM, o complemento que est unido a la superficie de los
    glbulos rojos. Estos se aglutinan, produciendo grupos de clulas que indican un
    resultado positivo.

    Aplicaciones: Muchas enfermedades y frmacos (quinidina, metildopa y


    procainamida) pueden llevar a la produccin de estos anticuerpos. Estos anticuerpos
    algunas veces destruyen los glbulos rojos y causan anemia. Esta prueba algunas veces
    se lleva a cabo para diagnosticar la causa de anemia o ictericia.
    Trastornos asociados con un resultado positivo
    Anemias hemolticas inducidas por frmacos
    Anemias hemolticas inmunitarias
    Reacciones a transfusin
    Enfermedad hemoltica del recin nacido
    Trastornos linfoproliferativos, como leucemia linfoctica crnica
    Mononucleosis infecciosa

    Muestras y Reactivos
    Solucin salina
    Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA u obtenida en tubo sin
    anticoagulante
    Bao mara a 37C.
    Reactivo de Antiglobulina Humana (Suero de Coombs)
    Albmina bovina 22%.
    Clulas de control de antiglobulina humana.

    Procedimiento:
    1. Rotular tres tubos con el nmero de muestra por analizar.
    2. Tomar una alcuota de la muestra y transferir al tubo correspondiente.
    3. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
    4. En el segundo tubo hacer una suspensin de trabajo al 3-5% a partir de la muestra de
    eritrocitos lavada.
    5. Aadir al tercer tubo 50 ul de la suspensin de trabajo realizada.
    6. Aadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana.
    7. Mezclar y centrifugar por 10 segundos a 3000 rpm
    8. Resuspender levemente, leer por aglutinacin y hacer las anotaciones respectivas.
    9. En caso de obtener un resultado negativo, corroborar el mismo utilizando las Clulas
    Control de Coombs.

    CAUSAS DE ERROR O DIFICULTADES EN LA DETERMINACIN DE LA


    PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA O COOMBS DIRECTO
    Falsos positivos:
    Hemates contaminados por manejo y almacenamiento inadecuado.
    Tiempo de centrifugacin excesiva.
    Sensibilizacin in Vitro producida por anticuerpos o por el complemento cuando
    se deja reposar la muestra a 4oC durante algn tiempo.
    Suero de coombs que contenga Acs inespecficos que reaccionan con clulas no
    sensibilizadas.
    Presencia de albmina en el suero de coombs
    Reaccin con slice coloidal de los tubos de vidrio.
    Falsos negativos:
    Lavado deficiente de los hemates., trazas de Igs y complemento no fijados
    pueden inactivar el reactivo de antiglobulina.
    Cuando el anticuerpo se eluye de las clulas durante la incubacin o el lavado.
    Para evitarlo se debe adicionar el suero antiglobulina una vez se terminen los
    lavados de los hemates.
    Deterioro del suero antiglobulina por contaminacin o almacenamiento
    inadecuado.
    Cuando el suero antiglobulina no se aade al sistema.
    Centrifugacin inadecuada.
    GR viejos.
    Agitacin vigorosa durante el proceso de lectura, desvanece las reacciones
    dbiles.

    La prueba de Coombs indirecta detecta anticuerpos libres que pueden


    reaccionar in vitro con glbulos rojos que tienen antgenos especficos.
    La prueba de Coombs indirecta busca anticuerpos circulantes libres contra una serie
    de glbulos rojos estandarizados. Esta prueba indirecta slo se usa rara vez para
    diagnosticar una afeccin mdica y, con ms frecuencia, se utiliza para determinar si
    una persona podra tener o no una reaccin a una transfusin de sangre.

    Aplicaciones:
    Esta tcnica de antiglobulina indirecta es muchas veces necesaria en el fenotipaje de
    grupos sanguneos en los que los antgenos se encuentran en baja densidad antignica,
    ya que se propicia la adsorcin de los anticuerpos gracias a la fase de incubacin.
    Igualmente es aplicable en aquellos casos en los que se buscan anticuerpos en el suero
    de una persona, ya que estos pueden estar en bajo ttulo y no ser detectados tras
    incubaciones cortas.
    Muestras y reactivos
    Solucin salina
    Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA u obtenida en tubo sin
    anticoagulante
    Bao mara a 37C.
    Juego de clulas rastreadoras 3%.
    Reactivo de Antiglobulina Humana (Suero de Coombs)
    Albmina bovina 22%.
    Clulas de control de antiglobulina humana.

    PROCEDIMIENTO:
    La prueba de Antiglobulina Indirecta cuenta con varias fases, siendo la primera una fase de
    centrifugacin, en la cual se detectan anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-
    anti-I, anti-M, anti-N, anti-Lewis, etc. Luego de esta fase se permite, por un tiempo prolongado
    y a una temperatura de 37C la reaccin entre antgenos y anticuerpos (de estar estos presentes).
    Dependiendo de las normativas establecidas por el Banco de Sangre, es posible que se utilicen
    otros medios potenciadores de la aglutinacin, como albmina, LISS, polietilenglicol o enzimas.
    En caso de que alguno de estos reactivos sea utilizado, es necesario apegarse a las instrucciones
    aportadas por el fabricante. Se espera que, de haber reconocimiento, al finalizar esta fase haya
    una sensibilizacin de los glbulos rojos. Una vez terminada esta incubacin, se pasa a realizar
    lavados con el fin de remover inmunoglobulinas u otro tipo de protenas que puedan interferir
    con la reaccin. La fase de los lavados es crtica, ya que la presencia de anti-anticuerpos u otros
    interferentes en el suero podran llevar a la neutralizacin del reactivo. Asimismo, es sumamente
    importante eliminar el exceso de solucin salina al finalizar estos lavados, ya que de lo
    contrario, el reactivo de antiglobulina es diluido, lo cual puede afectar la sensibilidad de la
    prueba. Posterior a los lavados se aade el reactivo de antiglobulina, se centrifuga y se lee la
    prueba. De haberse dado sensibilizacin, los anticuerpos adheridos a la superficie eritrocitaria
    sern reconocidos por el reactivo de Coombs y se podr observar una reaccin de aglutinacin.
    1. Rotular tubos para las Clulas I, Clulas II y Clulas III.
    2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de clulas
    rastreadoras.
    3. Aadir al tubo rotulado como clulas I, 50 ul del pool I. Debe tenerse
    especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en minimizar
    la posibilidad de contaminacin de los mismos.
    4. Aadir al tubo rotulado como clulas II, 50 ul del pool II.
    5. Aadir al tubo rotulado como clulas III, 50 ul del pool III.
    6. Aadir 100 ul del suero en anlisis a cada uno de los tubos.
    7. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de antiglobulina:
    i. Fase i, centrifugacin inmediata o prueba rpida:
    1. Centrifugar los tubos 15 segundos a 3000 rpm.
    2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados.
    ii. Fase ii, incubacin a 37C:
    1. Despus de la lectura anterior, colocar los tubos a 37C por 30 minutos.
    2. Centrifugar los tubos 10 segundos a 3000 rpm. Leer y anotar resultados.
    3. Realizar tres lavados con solucin salina fisiolgica.
    iii. Fase III, antiglobulina:
    1. Aadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecfico (suero de Coombs).
    2. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm.
    3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el control con Clulas Control,
    agregando 50ul de las clulas reactivo de Control de Antiglobulina Humana.
    4. Mezclar y centrifugar 10 segundos a 3000 rpm, leer y anotar resultados.

    Falsos positivos:
    Contaminacin bacteriana de muestras de sangre, reactivos y material de
    vidrio.
    Hemates sensibilizados In Vivo. Se debe realizar elusin de los anticuerpos
    fijados a las clulas
    Contaminacin de la solucin salina fisiolgica con slice coloidal.
    Por aglutinacin antes de aadir el suero de coombs debido a: Presencia de
    clulas poliaglutinables, Incubacin prolongada con clulas tratadas
    enzimticamente. Presencia de anticuerpos inesperados en el suero de coombs.
    Exceso de centrifugacin
    Coagulo de fibrina en la suspensin celular.

    Falsos negativos:
    Contaminacin con protenas sericas.
    Destruccin de anticuerpos por lavado excesivo.
    No adicionar el suero antiglobulina.
    Centrifugacin inadecuada o mal empleo de los reactivos.
    Lavados deficientes, no se eliminan las protenas y neutralizan el suero de
    coombs.

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