UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, Decana de Amrica)

FACULTAD DE QUMICA E INGENIERA QUMICA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE ING. AGROINDUSTRIAL
DEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICA ORGNICA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
GENERAL Y APLICADA

GUAS DE PRCTICAS

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

INSTRUCCIONES BSICAS DE SEGURIDAD DE LOS LABORATORIOS

La finalidad es garantizar la proteccin del personal docente, alumnado y personal de
apoyo, contra los riesgos originados por la manipulacin de sustancias qumicas y la
operacin de equipos e instrumentos.
Su alcance comprende a todas las personas involucradas en las prcticas de laboratorio,
trabajos de investigacin o produccin; as como al personal responsable de los
almacenes de materiales y reactivos.
INSTRUCCIONES GENERALES:
Al trabajar con microorganismos y reactivos qumicos se debe minimizar toda exposicin
a estos, para ello debe evitarse contaminacin externa (contacto con la piel) y la
contaminacin interna (por ingestin y/o inhalacin). Para lo cual se debe considerar:
1.
Toda sustancia desconocida o mezcla de las mismas deben asumirse como
txica. El profesor, personal no docente y los alumnos debern leer las
instrucciones de seguridad de los reactivos que manipulan.
2.
Evitar mojar el piso con agua u otro lquido (compuesto qumico). No trabajar
nunca con el piso mojado.
3.
Derrame de cualquier sustancia qumica o suspensin microbiana debe ser
limpiado de inmediato, siguiendo las instrucciones del profesor.
4.
No debe abandonar una reaccin u operacin qumica, si tuviera que retirarse
brevemente, indicar al profesor este hecho, para que otra persona controle el
experimento.
5.
En todo momento mantener el orden, la limpieza y el mximo de concentracin.
6.
Cualquier incidente producido en el desarrollo del trabajo comunicrselo al
profesor responsable.
PROTECCIN PERSONAL:
1.

2.
3.

El uso de la bata (mandil) de proteccin es obligatoria, siempre que trabaje en

un laboratorio. EL mandil debe ser de preferencia de algodn, con botones a
presin y con mangas largas.
No use sandalias ni pantalones cortos en el laboratorio. Use calzado de cuero.
Trabajar siempre con el cabello recogido, sobre todo si es largo.

DE LAS PROHIBICIONES:
1.
2.

Est prohibido comer, beber o fumar dentro de los laboratorios.

Est prohibido trabajar dentro del laboratorio sin mandil de trabajo apropiado.

3.

Est prohibido el uso de pulseras o joyas, dentro del laboratorio por que estas
pueden ser causa de accidentes sobre todo si se trabaja cerca de llamas
maquinas en funcionamiento.
INSTRUCCIONES BSICAS PARA EL ESTUDIANTE

Es importante que usted sepa que el Laboratorio es un lugar de trabajo y que su atencin
y comportamiento sern observados por los profesores encargados de la marcha del
laboratorio, quienes estn para guiarlo y responder a sus dudas.
ES OBLIGATORIO EL USO DEL MANDIL DURANTE LA PRCTICA DE LABORATORIO, como
medida de seguridad y proteccin. Es recomendable el uso de una pequea esponja o
franela de uso individual.
Slo tiene 15 MINUTOS DE TOLERANCIA, pasados los cuales NO se permitir el INGRESO
de alumnos a la sesin de laboratorio.
El alumno que no asista a alguna Prctica de Laboratorio, NO PODR PRESENTAR
INFORME, y tendr como nota CERO en el informe de dicha prctica, NO HABR
RECUPERACIN.
El alumno que falte a dos (02) prcticas esta automticamente desaprobado en el curso.
NO EXISTE RECUPERACIN DE PRCTICA.
Cada estudiante debe tener una libreta de apuntes para anotar todos sus datos y
observaciones, para que luego pueda responder el cuestionario en el informe de la
sesin de Laboratorio realizada.
El informe se presenta a la siguiente semana de realizada la Prctica, caso contrario se
disminuir 1 punto por cada da de demora. Posterior a la fecha de presentacin del
informe slo se recibirn hasta el final de la semana que corresponde a la realizacin de
la prctica. Los informes se presentan en grupo de 5 alumnos por mesa de trabajo en el
mismo horario de laboratorio.
Es responsabilidad de los integrantes del grupo de trabajo el cuidado de los materiales
que utilizan durante el desarrollo de la prctica. Asimismo, es de su responsabilidad el
entregar el material limpio y la zona de trabajo limpia y ordenada al finalizar la prctica.
El xito de un experimento est en la observacin acuciosa de los fenmenos que
ocurran como cambios trmicos, formacin de colores o precipitaciones o
desprendimiento de gases para buscarle su interpretacin, de ah que es de vital
importancia la exactitud de la anotacin de estos datos y medidas en el orden correcto.

RECOMENDACIONES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO

1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.
9.
10.

11.

Revise el material de vidrio que va a utilizar e informe al profesor de inmediato si

est rajado o roto. Si el alumno ROMPE o raja cualquier material, deber
REPONERLO, a ms tardar en la sesin siguiente.
Evite amontonar su espacio en la mesa con material innecesario.
Deje los aparatos, equipos y material de trabajo siempre limpios.
Devuelva los frascos con reactivos a su lugar tan pronto como haya hecho uso de
ellos.
Nunca devuelva reactivos sobrantes al frasco lleno del reactivo, sin estar seguro
que el envase donde los transfiri estaba limpio.
No use ms reactivos de lo que se indica. Los reactivos son caros, y lo ms
importante es que por exceso de estos puede obtener resultados negativos.
No desechar el producto obtenido hasta que est seguro de que no lo necesita.
Eche los desperdicios slidos en los depsitos que se encuentran junto a la mesa
o debajo del lavadero. Cuando estos sean cidos dejar correr bastante agua en el
lavadero con el fin de diluirlos y de esta manera evitar las corrosiones en las
tuberas
Lea la etiqueta del reactivo antes de sacar algo del frasco. El uso equivocado de un
reactivo puede causar algn accidente o echar a perder la experiencia.
Cuando caliente una sustancia en un tubo de ensayo, tenga mucho cuidado de no
dirigir la boca del tubo a su vecino, ni a si mismo.
Sea cuidadoso al trabajar con material caliente, suspensiones microbianas, cidos
y lcalis fuertes, as como tambin material inflamable. No se debe colocar frascos
de reactivos a lado de cocinillas elctricas.
No dude en preguntar al Profesor sobre algo que no haya entendido antes de
realizar la Prctica.

Al momento de recepcionar el material de

vidrio, revise cuidadosamente y pida el
cambio de cualquier material que est
rajado o roto.

SI EL ALUMNO ROMPE O RAJA

CUALQUIER MATERIAL, DEBER
REPONERLO
A
LA
SEMANA
SIGUIENTE.
El alumno NO podr ingresar al
laboratorio hasta que haya repuesto el
material roto.

PRCTICA N 1
I. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
1.

Objetivos:
- Conocer las normas fundamentales y acciones que permitan prevenir o reducir
accidentes y enfermedades en el laboratorio de Microbiologa derivado del
manejo de material biolgico, en base al conocimiento de los riesgos existentes.

2. Introduccin:
Desde hace tiempo la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) reconoce que la
seguridad y, en particular, la seguridad biolgica son importantes cuestiones de inters
mundial.
Los errores humanos, las prcticas incorrectas de laboratorio y el empleo inapropiado
del material de experimentacin son causa de la mayor parte de accidentes de
laboratorio e infecciones afines.
Los laboratorios de microbiologa se clasifican en niveles de bioseguridad, los cuales
corresponden a una combinacin de caractersticas de diseo, construccin, medios de
contencin, equipo, prcticas y procedimientos de operacin necesarios para trabajar
con agentes patgenos de distintos grupos de riesgo. Se clasifican como sigue:
laboratorio bsico nivel de bioseguridad 1; laboratorio bsico nivel de bioseguridad
2; laboratorio de contencin nivel de bioseguridad 3, y laboratorio de contencin
mxima nivel de bioseguridad 4.
En el siguiente cuadro se relacionan, los grupos de riesgo, el riesgo relativo que entraan
los microorganismos infectantes, que se clasifican en: Grupo de riesgo I, II, III y IV y los
laboratorios donde se trabaja con microorganismos se dividen segn sus caractersticas
de diseo, construccin y medios de contencin en tres tipos de laboratorio: bsico, de
contencin y contencin mxima.
GRUPO DE RIESGO I
Nivel de Bioseguridad 1
Tipo de laboratorio
Tipo de microorganismos
Prcticas de Laboratorio
Equipo de seguridad

GRUPO DE RIEGO II
Nivel de Bioseguridad 2

Escaso riego individual y comunitario.

Microorganismos con pocas probabilidades de
provocar enfermedades en el ser humano o
animales.
Bsico: Enseanza bsica, investigacin
Bacillus subtilis, Escherichia coli
Tcnicas microbiolgicas apropiadas.
Ninguno; Trabajo de mesa de laboratorio al
descubierto
Riesgo individual moderado y comunitario
moderado.
Agente
patgeno
que
puede
provocar
enfermedades en humanos, el riego de propagacin
es limitado.

Tipo de laboratorio
Tipo de microorganismos

Prcticas de Laboratorio
Equipo de seguridad

GRUPO DE RIESGO III

Nivel de Bioseguridad 3

Tipo de laboratorio
Tipo de microorganismos
Prcticas de Laboratorio
Equipo de seguridad

GRUPO DE RIESGO IV
Tipo de laboratorio

Tipo de microorganismos
Prcticas de Laboratorio

Equipo de seguridad

Bsico: Cmaras de seguridad, dispositivos de

proteccin personal.
Ejemplo: Servicios primarios de salud, laboratorios
de diagnstico, de enseanza
universitaria,
consultorios mdicos.
Salmonella typhi, virus de la Hepatitis B,
Mycobacterium tuberculosis.
Tcnicas
microbiolgicas
apropiadas,
ropa
apropiada, seal de riesgo biolgico.
Trabajo de mesa al descubierto y Cmara de
Seguridad Biolgica para posibles aerosoles.
Riesgo individual elevado y riesgo comunitario
escaso.
Agentes patgenos que provocan enfermedades
graves en humanos, pero no se propagan de una
persona a otra.
Contencin. Ejemplo: Laboratorios de diagnstico
especializado, investigacin.
Brucella sp, Histoplasma capsulatum
Prcticas del nivel 2 ms ropa especial, acceso
controlado y flujo direccional del aire.
Cmara de seguridad Biolgica adems de otros
medios de contencin primaria para todas las
actividades.
Elevado riesgo individual y comunitario
Contencin mxima. Unidades de patgenos
peligrosos. Agentes patgenos que provocan
enfermedades graves en personas y que se pueden
propagar
Virus Hanta
Virus fiebre aftosa
Prcticas de nivel 3 ms cmara de entrada con
cierre hermtica, salida con ducha y eliminacin
especial de residuos.
Cmara de seguridad Biolgica de clase III o trajes
presurizados junto con cmara de seguridad
biolgica de clase II, autoclave de doble puerta (a
travs de la pared), aire filtrado.

Definiciones:
Bioseguridad: Es el conjunto de mtodos, principios y procedimientos cientfico
organizados que incluyen las tcnicas arquitectnicas, destinados a implementar
barreras de contencin para la proteccin del operador, la comunidad y el ambiente de

los riesgos que implica la manipulacin de agentes biolgicos, ya sean estos exticos,
nativos, manipulados genticamente o no y de qumicos o la liberacin de estos al medio
ambiente para reducir al mnimo o suprimir los efectos adversos que pueda generar
escapes inadvertidos.
Contencin: Describe los mtodos seguros para manejar materiales infecciosos en el
ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados, con el objetivo de
eliminar o reducir hasta lmites mnimos, la exposicin de quienes trabajan en el
laboratorio, otras personas y del ambiente externo a agentes potencialmente
peligrosos.
- Contencin primaria: es la proteccin personal y del ambiente inmediato del
laboratorio a la exposicin de agentes infecciosos, a travs de la prctica e
buenas tcnicas microbiolgicas y del empleo de equipos de seguridad
adecuados.
- Contencin secundaria: es la proteccin del ambiente externo al laboratorio de
la exposicin de agentes biolgicos, a travs de una combinacin del diseo de
la instalacin y prcticas operativas.
Agentes biolgicos: microorganismos patgenos (hongos, bacterias, virus, viroides,
fitoplasmas) los que pueden ser inhalados, inoculados y por contacto directo a travs de
la piel o mucosas. En funcin del riesgo de infeccin, los agentes infecciosos se clasifican
del siguiente modo:
- Agente biolgico del grupo 1: Aquel que resulta poco probable que cause una
enfermedad en el ser humano. Son agentes de bajo riesgo: nemtodos, caros,
bacterias y hongos ambientales.
- Agente biolgico del grupo 2: Aquel que puede causar una enfermedad en el ser
humano y puede suponer un peligro para los operadores, siendo poco probable
que se propague a la colectividad y existiendo probablemente profilaxis o
tratamiento eficaz. Son agentes de riesgo moderado: hongos, bacterias, virus.
- Agente biolgico del grupo 3: Aquel que puede causar una enfermedad grave y
presenta un serio peligro para los operadores, con riesgo que se propague a la
colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. Son
agentes de riesgo alto bacterias como Bacillus anthracis, Brucella suis,
Mycabacterium leprae.
- Agente biolgico del grupo 4: Aquel que causando una enfermedad grave en el
ser humano, supone un serio peligro para los operadores, con muchas
probabilidades que se propague a la colectividad y sin que exista una profilaxis o
tratamiento eficaz. Son agentes de riesgo intenso: Virus LASSA, virus Ebola, Virus
Marburg.
Agentes fsicos y mecnicos: como temperaturas extremas, contactos elctricos o
conexiones defectuosas y vidrios resquebrajados de recipientes daados o tubos rotos.

Agentes qumicos: pueden ser:

- Corrosivos, que causan destruccin o alteracin de tejidos.
- Txicos, cuyos efectos se manifiestan, segn la va de exposicin, por inhalacin,
ingestin o contacto directo con mucosas o piel;
- Cancergenos;
- Teratognicos;
- Inflamables;
- Explosivos.
CONCEPCIN GENERAL DEL LABORATORIO
El laboratorio bsico comprende todos aquellos que trabajan con agentes que entraan
un riesgo escaso o moderado para el personal de laboratorio, por lo cual habr que
prestar atencin a los factores conocidos por plantear problemas:
- La formacin de aerosoles.
- El trabajo con grandes cantidades y/o concentraciones elevadas de
microorganismos.
- Exceso de personal y material.
- Infestacin por roedores e insectos.
- La entrada de personas no autorizadas.
Material de Bioseguridad Recomendado
-

Dispositivos manuales de pipeteo, para no utilizar la boca. Est prohibido el uso

de la boca para succionar cualquier sustancia qumica o microbiana y llenar las
pipetas de trabajo.
Cmaras de seguridad biolgica que se utilizaran cuando apliquen
procedimientos con grandes probabilidades de producir aerosoles peligrosos y
cuando se manejen concentraciones elevadas de agentes infecciosos.
Microincineradores de asa.
Frascos y tubos con tapa rosca
Autoclaves
Siempre que sea necesario deber llevar guantes de proteccin; este debe ser
elegido segn la necesidad (consulte con el profesor). Asegrese que estos no
estn defectuosos antes de usarlos.
Siempre que sea necesario se debe utilizar una mascarilla de proteccin.
Antes de salir del laboratorio, lavarse las manos escrupulosamente.

Decontaminacin y eliminacin de desechos

La Decontaminacin y la eliminacin de desechos son operaciones de laboratorio
ntimamente relacionadas, ya que la desinfeccin o la esterilizacin constituyen la
primera fase de la eliminacin. El tratamiento en autoclaves constituye el procedimiento

de eleccin para todos los procesos de Decontaminacin. Si no se dispone de este

elemento, se puede recurrir a los siguientes mtodos:
- Ebullicin en agua que contenga bicarbonato.
- Empleo de una olla a presin a nivel mximo de presin de trabajo.
Hay que establecer un sistema de identificacin y separacin de material contaminado:
- Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura.
- Objetos aguzados y cortantes.
- Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilizacin.
- Material contaminando para eliminacin.
Riesgos qumicos:
La instalacin excesiva de vapores de solventes puede tener efectos txicos como
embotamiento, falta de coordinacin. En otros casos pueden producirse consecuencias
adversas como lesiones en sangre, pulmones, hgado, riones y aparato gastrointestinal.

Seguridad qumica, elctrica, radiolgica y proteccin contra incendios

Los incendios o los accidentes de origen qumico, elctrico o radiolgico pueden tener
como consecuencia indirecta un fallo de las medidas de contencin de microorganismos
patgenos. Es por ese menester mantener un elevado nivel de seguridad en estos
aspectos.

NORMAS BSICAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO:

1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Antes de iniciar el experimento debe limpiar la superficie de la mesa de trabajo

utilizando leja al 5 % o alcohol al 70 %; as tambin, debe verificar que todo el
material biolgico, de vidrio limpio, seco y sin daos, y reactivos necesarios estn
presentes para la realizacin de la prctica.
El material de vidrio roto debe lavarse, secarse y guardarse en un solo lugar para
luego ser separado o desechado definitivamente.
Los reactivos y soluciones preparadas deben de estar perfectamente etiquetados.
No debe usarse material de vidrio daado o roto. Verificar que los bordes de todo
material de vidrio estn pulidos y redondeados.
Hacer uso de embudos para el trasvase de lquidos de un recipiente a otro. Si el
derrame ocurriera evite que se extienda.
No dejar nunca las pipetas libres sobre la mesa, cuide de guardarlas siempre en el
porta pipetas.
Nunca coloque un termmetro en contacto directo con una plancha de
calentamiento, ya que puede estallar.
Para introducir un tubo de vidrio a un tapn de jebe, es necesario humedecerlos
con agua y protegerse las manos con guantes apropiados o por lo menos una toalla.
Al finalizar con cualquier prctica, deje su lugar de trabajo limpio, seco y ordenado.

10. Al terminar los experimentos, cierre todas las vlvulas de gas, agua, desconecte los
equipos elctricos, as como la llave general de energa elctrica.
11. Antes de iniciar cualquier trabajo, controlar los balones de gas, el mechero y
planchas de calentamiento.
12. Evite la presencia de sustancias voltiles cerca de mecheros encendidos o cocinillas
elctricas con resistencias visibles.
13. Las planchas de calentamiento deben ser conectadas solo a tomacorrientes con
amperaje adecuado. Nunca usar tomacorrientes caseros.
14. El calentamiento y los reflujos de solventes orgnicos deben hacerse con mantas de
calentamiento, nunca con mecheros o cocinillas elctricas.
15. Considerar que algunos compuestos qumicos explotan por efectos del calor o shock
mecnico; por ejemplo: cidos.
16. Si va a manipular balones con gases comprimidos, use las vlvulas de seguridad
adecuada para cada gas. No fuerce las vlvulas.
17. Si se produce fuego que no puede controlar, aljese del peligro, de aviso y active la
alarma. Toda persona que escuche la alarma de incendio debe evacuar el edificio.
18. Si el fuego es pequeo y controlable, use extintor para controlar y extinguir el fuego.
En caso de fuego en un recipiente pequeo tapar el recipiente con una luna de reloj,
un trapo hmedo o con una rejilla de cermica.

DE LOS DERRAMES:
1.

2.
3.
4.

5.

Si se produce un pequeo derrame de un compuesto qumico o suspensin

microbiana, avise al profesor y en lo posible evite que se extienda por la mesa o
caiga al piso.
Retirar los materiales, reactivos y equipos que se encuentren cerca.
Use lentes de seguridad, guantes y en lo posible mascarillas de respiracin de
acuerdo al tipo de compuesto.
Para el caso de derrame pequeo de lquidos o suspensiones:
a) Confinar el derrame en un rea pequea.
b) Si se trata de una suspensin microbiana debe ser limpiado de inmediato
vertiendo sobre ella leja al 5% o alcohol al 96% y retirar cuidadosamente
con la ayuda de un pao o trozo de algodn.
c) Si se trata de un cido inorgnico neutralizar soda o carbonatos.
d) Si se trata de una base inorgnica neutralizar sulfato cido de sodio.
e) Si se trata de otros compuestos usar material no reactivo como arena seca
o arcilla.
Para el caso de derrames mayores de lquidos, avise al profesor y si est
preparado realice las siguientes acciones:
a) Si se trata de cido o bases inorgnicas, usar grandes cantidades de agua; si
es que el agua no causa un dao mayor.
b) Si se trata de lquidos con vapores no txicos y miscibles en agua, limpiar con
absorbente de algodn (toalla), posteriormente lavar el absorbente con
abundante agua.
c) Si se trata de lquidos con vapores txicos. - Protegido con una mascarilla
adecuada, absorbe el lquido con un absorbente de algodn (toalla), traslade

el absorbente dentro de un recipiente hacia una campana extractora, donde

lo transferir a un recipiente de residuos lquidos peligrosos.
6.

Para el caso de derrames de slidos, avise al profesor y si est preparado realice

las siguientes acciones:
Colocarse guantes, mascarilla y luego barrer el slido con una brocha para luego
colocrselo en el recipiente de desechos qumicos slidos.

CUESTIONARIO
1. Observe el laboratorio donde efectuar las prcticas de Microbiologa y
determine el tipo de laboratorio, el nivel de bioseguridad y grupo de riesgo al
que pertenece. Fundamente su respuesta.
2. Si se utilizan en el laboratorio lquidos inflamables Es suficiente la ventilacin
mecnica para expulsar los vapores?
3. Dibuje los smbolos de riesgo qumico presentes en las etiquetas de los productos
qumicos que indican el tipo de peligro que involucra su uso, mencione su
significado (precaucin y significado) de cada uno de ellos y ejemplos de
reactivos donde son utilizados.
4. Cul sera la disposicin final de los reactivos qumicos cuando su fecha de
vencimiento caduca? Explique su respuesta.

II.

UTILIDAD Y PREPARACION DE MATERIALES USADOS EN MICROBIOLOGIA

OBJETIVOS:
-

I.

Familiarizar al alumno con el material de vidrio y de otra naturaleza de uso

frecuente en Microbiologa.
Adiestrar al alumno en la limpieza y preparacin del material para su
esterilizacin.
Confeccin de tapones de algodn para tubos y matraces, envolturas de placas
Petri, tubos de ensayo, pipetas, matraces Erlenmeyer, frascos, jeringas, etc.
MATERIAL DE VIDRIO

Aparte del instrumental y variado equipo que se requiere en todo laboratorio de

Microbiologa, el MATERIAL DE VIDRIO constituye una de las principales herramientas
de esta disciplina.
Como requisito general, el MATERIAL DE VIDRIO debe ser: de vidrio neutro, resistente a
cambios de temperatura, transparente, de superficie lisa, sin rajaduras, que contenga
una mnima calidad de lcali libre y de bajo coeficiente de dilatacin. Actualmente
existen marcas con estas propiedades. Como: PIREX, KIMAX, KIMBLE, GENA, GLASS,
ASSISTENT y otros. Se describe el material indispensable para el funcionamiento de un
Laboratorio de Microbiologa.
1.- TUBOS DE PRUEBA: Condiciones. - que sean de paredes gruesas, bien
equilibrados, de preferencia sin reborde para facilitar el taponamiento. Medidas. - de 16
x 150 mm y 15 x 125 mm para cultivos microbianos puros y para diluciones de anlisis
cuantitativos. Para efectuar estudios de fermentacin, hemlisis y utilizacin de
sustratos se recomienda usar tubos de 13x 100 mm y para estudios serolgicos de 10 x
75 mm.
Tubos de centrfuga. De vidrio. - Pueden ser de varias medidas, desde 10mL hasta 25 mL, graduados en cc o
en mm. Pueden ser de fondo cnico o redondo y siempre de paredes gruesas.
De polietileno: De idnticas medidas a las anteriores, se utilizan para centrifugaciones a
altas revoluciones (p.e. en ultracentrfugas).
Tubos Leishton, de las medidas antes indicadas para cultivos de clulas.
2.- CAPSULAS O PLACAS DE PETRI: Compuestas de dos cristalizadores, de los cuales
el ms grande hace de tapa. Las ms usadas son de 10, 12 20 mm x 100 mm y se
emplean para el cultivo y aislamiento de microorganismos. La tapa puede ser
reemplazada por material de porcelana o metal sin esmalte en la superficie interna.

3.- PLACA DE BREWER: Para el cultivo y aislamiento de microorganismos anaerobios.

Son idnticos a los anteriores, con excepcin de las tapas, que adems de pesadas tienen
una depresin central que impide la acumulacin de aire, ayudando a mantener la
anaerobiosis.
4.- PIPETAS: Las primeras son terminales y con capacidad de 0.1 a 25mL. Las mejor
aforadas, son las de las marcas PIREX Y EXAX. Las de mayor uso son:
-

Para medidas de lquidos en pequeos volmenes:

Pipetas de 10 mL

5 mL

1 mL

0.1 mL

5.- PIPETAS PASTEUR: Confeccionadas de varillas de vidrio de 4mm de dimetro y de

20 30 cm de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar reblandecimientos a la accin
directa de la llama del mechero, para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada;
es decir, es una pipeta con porcin capilar. Se las emplea para la toma de pequeos
inculos de siembra.
NOTA: La tcnica de preparacin se especifica en el procedimiento respectivo.
6.- MATRACES Y BALONES: Recipientes volumtricos de gran utilidad para la
preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo,
etc. La calidad debe ser la misma, recomendada en los requisitos generales.
Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esfrica con fondo plano.
En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde los que les confiere resistencia.
Los ms comunes son: 100, 250, 500, 1000 y 2000 mL. Hay de menores medidas a las
de 100mL.
7.- ESPATULAS DRIGALSKY: Se confeccionan a partir de varillas de vidrio macizo, la
fraccin recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias por
diseminacin.
NOTA: La tcnica de preparacin se especifica en el procedimiento respectivo.
8.- FIOLAS: Idnticas a los balones, estn calibradas a medidas exactas mediante un
aforo en la parte media del cuello del recipiente en el que se indica la medida. Se emplea
exclusivamente para la preparacin de soluciones molares y normales.
9.- KITASATO: Es un matraz que adems de la boca tiene una salida lateral corta para
unirla a la bomba de vaco. Se utiliza como parte del equipo de filtracin (esterilizacin
en fro).
Las medidas son las mismas que la de los matraces comunes.

10.- PROBETAS: Recipientes cilndricos con base para la estabilidad, sus paredes son
ms gruesas que el material antes indicado. Pueden estar o no graduadas; las primeras
para medidas de lquidos en la preparacin de cualquier solucin y las segundas, como
depsito de desinfectantes para pipetas, baguetas, etc. Las hay de diferentes
capacidades; las de 100, 250, 500 y 1000 son las de mayor uso en el laboratorio.
11.- VARILLAS DE VIDRIO MACIZO: fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven la confeccin
de agitadores o baguetas y esptulas de Drigalsky; los ms cortos son empleados
regularmente como mangos para asas de siembra.
12.- BEAKER o VASOS DE PRECIPITACION: Recipientes cilndricos de amplia utilidad en
la preparacin de soluciones y medios de cultivo. Se fabrican en varias medidas. El vidrio
debe ser necesariamente resistente al calor.
13.- FRASCOS VIALES PARA HEMOCULTIVOS, VACUNAS, CULTIVOS DE TEJIDOS: Son de
vidrio neutro, resistentes al calor, transparentes y con tapa de rosca. Con capacidad de
50, 100 y 150 mL.
Los frascos de vidrio neutro de 50 y 100 mL, blancos o de color mbar pueden ser
aprovechados para la reserva de soluciones y medios de cultivo en stock, previamente
taponados con algodn esterilizado.
OBSERVACION: El material de vidrio restante por ser muy conocido en variedad y usos
en todo laboratorio microbiolgico, solo lo mencionaremos:
MORTEROS, con PILON DE VIDRIO o PORCELANA; PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS;
LUNAS DE RELOJ de diversos dimetros; TERMOMETROS CLINICOS y de AMBIENTE;
ampolletas para almacenar cultivos, sueros y vacunas en lquido o liofilizado;
CAPSULAS DE PORCELANA con fondo redondo o plano; CAMARA y PIPETAS
CUENTAGLOBULOS,etc.

II.

MATERIAL DE OTRA NATURALEZA

La lista tambin es enorme; mencionaremos los que ms se utilizan:

1.- MANGOS DE KOHLE: Vstagos de metal con su cubierta de ebonita aislante del
calor y en el extremo proximal una tuerca para insertar el alambre de platino o nicrom
en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio, ya descritos
anteriormente.
2.- ESPATULAS DE METAL CON MANGOS DE MADERA: de preferencia de
material inoxidable, su uso es muy conocido.

3.- TRIPOIDES: son de metal, de preferencia de fierro, muy buenos soportes de

recipientes sometidos al calentamiento. Hay de varias alturas y dimetros.
4.ESTUCHES CILINDRICOS O CUBICULARES: De cobre estaado, para esterilizar
pipetas. Los hay cilndricos, solamente para la esterilizacin de Placas Petri.
5.- MECHEROS DE BUNSEN: Imprescindibles en Microbiologa. Son de metal con una
tuerca movediza para medir la intensidad de la llama. Algunos modelos llevan una llave
de control ad-hoc.
6.- CANASTILLAS O CESTOS DE METAL: Las mejores son de aluminio. Favorecen
el mejor almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas. Sin riesgos de
rotura.
7.- SOPORTES UNIVERSALES: Con tenazas y aros de metal, para asegurar cuellos y
bases de matraces, balones, beakers, etc.
8.- RECIPIENTES DE POLIETILENO O DE METAL: Cilndricos con bases circulares o
cuadrangulares, para lavado de pipetas. Puede ser de manejo manual o automtico.
9.- ADEMAS: Gradillas de madera o metal para tubos de prueba de varios tamaos y
para frascos, goteros, rejillas de asbesto, hilos de platino, aplicadores o vstagos de
metal o madera para confeccin de hisopos, tapones de jebe o corcho para tubos,
algodn, papel filtro, papel kraft envolvente, papel engomado en tiras, papel platina,
lpiz graso para escribir en fro o plumones de tinta indeleble, mangueras de jebe de 10
20 cm. De dimetro, bandejas de fierro enlozado, instrumental quirrgico, hilo de
sutura, papel indicador de pH, etc.
PREPARACION DEL MATERIAL PARA SU ESTERILIZACION - LIMPIEZA
El material de vidrio nuevo o usado, debe limpiarse en forma tal que elimine toda huella
de suciedad original. Se evita as la precipitacin y depsito de los agentes que ejercen
poder limpiador. El cristal de boro silicato (PYREX) o los instrumentos de vidrio sdico
lavados en fbrica, no requieren tratamiento alguno antes de su utilizacin, salvo el
lavado normal. El material de vidrio sdico nuevo debe sumergirse en HCI durante una
noche, para neutralizar el lcali contenido en el vidrio.
Es importante:
a.- Conocer el grado de dureza del agua (exceso de Ca, Fe, Mg, Cu).
b.Usar detergentes que no contengan lcalis, que ablanden el agua, que sean
fcilmente soluble en agua tibia y no precipiten en agua fra, tibia o caliente.
c.- Eliminar los residuos ms tenaces: protenas y grasas con facilidad y por completo.
d.- No producir deterioro alguno en los materiales de los instrumentos ni en la piel.
e.- No usar jabn ni detergentes no garantizados.

NOTA: En caso de material de vidrio usado, la limpieza debe hacerse tan pronto
como sea posible.
RECOMENDACIONES GENERALES

Elegir la mesa de trabajo, de preferencia cercana al equipo de esterilizacin.

Colocar sobre la mesa y en forma ordenada todo el equipo a prepararse: matraces,
tubos de prueba, pipetas, etc. trozos de papel engomado y de pabilo, lpiz grazo.
Rotular los materiales con datos de: medidas, fecha y nombre del grupo o persona
a quien pertenecen.
No manipular bruscamente el material a fin de evitar posibles roturas.
Nunca taponar o envolver los recipientes sin un previo y total secado de los
mismos. Caso contrario aparecern manchas negras despus de la esterilizacin,
sobre las zonas donde qued humedad.
A. PREPARACIN DEL MATERIAL CONTAMINADO PARA SU ESTERILIZACIN

Se recomienda el uso de guantes de jebe de tamao adecuado a las manos del alumno.
Los pasos a seguir son:
1.- Borrar con algodn empapado con alcohol de 96, el rotulado de las placas Petri
y de los tubos de ensayo.
2.- Recipientes con cultivos descartados o contaminados, deben descontaminarse en
autoclave, quitando luego tapones y contenido en caliente. Los restos de agar deben ser
removidos de las placas Petri o tubos de ensayo y colocados en bolsas para su
eliminacin. Las pipetas u otros dispositivos se deben desinfectar en las probetas
cilndricas sin graduar conteniendo solucin bactericida sulfocrmica o detergentes ms
1% de fenol, durante 24 horas.
3.- Remojar en una solucin de agua con detergente todos los materiales de vidrio.
Limpiar el material por dentro frotando con escobilla a la medida. Cuando la escobilla
por el uso queda en alambre en su extremo distal, se recomienda desechar para evitar
roturas.
4.- Enjuagar con agua de cao a chorro continuo hasta eliminar el detergente o agente
bactericida. Continuar el enjuague con 2 3 cambios de agua destilada.
5.- Escurrir el agua del material colocndolos sobre soportes sin rajaduras con la boca
hacia abajo y esperar que sequen por si solos. De ninguna manera se deben usar lienzos
para el secado, por los restos de hilachas que quedaran sobre la superficie del material.
En caso de porta y cubre objetos, como paso final se pasan por alcohol de 70 para su
desengrase.

Las lminas portaobjeto, se deben:

Frotar con papel toalla para retirar el aceite en caso el portaobjeto este cubierto
con residuos de aceite de inmersin.
- Retirar el cubreobjeto de los portaobjetos con una pinza.
Remojar los porta y cubreobjetos en una solucin de agua con detergente durante
24 horas.
- Frotar las lminas con una esponja en la misma solucin de detergente.
- Enjuagar las lminas por separado en abundante agua a chorro contino en la
grifera.
- Enjaguar las lminas con agua destilada, retirarlas y dejarlas secar.
B. PREPARACIN DEL MATERIAL LIMPIO PARA SU ESTERILIZACIN
Material. 1.- Trozos de algodn de varias dimensiones.
2.- Papel Kraft en tiras y trozos rectangulares y cuadrados.
3.- Pabilo
4.- 10 a 12 tubos de prueba de 16 x 150 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 13 x 100 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 10 x 75 mm.
5.- Matraces Erlenmeyer y Kitasato de 1000, 500 y 250 mL. Uno de cada uno.
6.- Probetas de 1000, 500 y 100 mL, dos de cada una.
7.- Pipetas graduadas de 10, 5, y 1 mL, dos de cada una. Pipeta volumtrica de 100
50 mL.
8.- 4 5 placas Petri de 10 x 100 mm/
9.- Jeringas hipodrmicas de 10, 5 y 2 cc.
10.- Varillas de vidrio hueco de 20 a 30 cm. De longitud por 4 a 6 cm de calibre.
11.- Varillas de vidrio macizo de 40 a 60 cm.
12.- Alambre de platino o nicrom
13.- Lpiz graso o plumn de tinta indeleble (marcador)
PROCEDIMIENTO.I.

CONFECCION DE TAPONES DE ALGODN

Mtodo N 1
a.- Tomar un trozo rectangular de tamao adecuado para adaptar al dimetro de
la
boca del recipiente a taponar.
b.- Practicar un doblez en tres a lo largo de la fibra.
c.- Hacer una torsin de 90 en el primer tercio, doblar sobre el tercio medio y
plegar
el ltimo tercio sobre el primero.

d.- Rotar con los dedos el trozo confeccionando para darle forma y dimetro a la
medida de los tubos y matraces.
Mtodo N 2
Tomar un trozo rectangular, practicar a lo largo el doblez en tres y enrollarlo
transversalmente a su eje longitudinal hasta darle la medida y dimetro deseado. Para
mejor duracin del tapn, amoldar un trozo de gasa que lo cubra totalmente. El tapn
en los tubos, matraces u otro recipiente debe quedar introducido en sus dos terceras
partes; no muy ajustado ni muy flojo, para evitar contaminaciones y dificultades en su
manipulacin.
II.

PREPARACION DE TUBOS DE PRUEBA

Hacer manojos de tubos taponados (10 a 12) sujetos con pabilo y cubrir por sus bordes
con el papel envolvente asegurando el paquete con pabilo o papel engomado. Los
paquetes deben corresponder a tubos de iguales medidas. Se colocan en latitas o
canastillas para facilitar su esterilizacin.
III.

PARA LOS MATRACES, KITASATOS, FRASCOS Y PROBETAS

Despus de su taponamiento, cubrirlos aisladamente con un capuchn de papel. Para

la confeccin seguir instrucciones del profesor. Se puede prescindir de los tapones y del
papel Kraft, cubriendo las bocas de los recipientes con trozos de papel platina ajustados
ntimamente a su superficie.
PREPARACION DE MATRAZ KITASATO
La tcnica es idntica a la de los matraces. En este caso, se tapona adems la tubuladura
lateral y se cubre con un papel. Aparte se envuelve el tapn de jebe correspondiente,
que despus de esterilizarse se adaptar al Kitasato para la filtracin.
IV.

PREPARACION DE PIPETAS SEROLOGICAS Y VOLUMETRICAS

a.- Colocar tapones de algodn a manera de filtros moderadamente ajustados, en

las boquillas de las pipetas.
b.- Colocar oblicuamente la pipeta serolgica a una tira de papel y hacer un
doblez
de ste en un extremo, cubrir el extremo proximal (punta de la pipeta). El extremo
donde se coloca la punta de la pipeta debe tener un doblez para evitar la exposicin del
material por roturas accidentales del papel.
c.- Deslizar el papel en espiral sobre la longitud de la pipeta hasta la boquilla.
Hacer torsin de la tira de papel para permitir la proteccin completa. Evitar queden
vacos.

Preparacin de la Pipeta Volumtrica:

Seguir la misma tcnica con dos tiras de papel para cubrir las partes delgadas de la
pipeta. Se aseguran los extremos proximales, con trozos de papel engomado. Queda sin
cubrir la porcin bulbosa de la pipeta.
Mediante otra tcnica, se protege toda la pipeta con tiras de papel (ms anchas y largas)
en tal forma que el papel envolvente la cubra como estuche. Se hace torsin del papel
a la altura de las regiones delgadas de la pipeta, hasta el remate a ambos extremos.
V.

PREPARACION DE LAS PLACAS PETRI

Se pueden envolver aisladamente o en nmero de 2, con los trozos rectangulares de

papel Kraft.
a.- Colocar las placas sobre el papel en posicin invertida y doblar los mrgenes uno
sobre otro, a manera de cubrirla.
b.- Completar el doblez con los extremos del papel sobrante asegurndolos con
papel engomado. Los bordes de las placas deben quedar ntimamente adheridos al
papel que los cubre, para evitar vacos.
VI.

PREPARACION DE PIPETAS PASTEUR

a.- Lisar los extremos de la varilla de vidrio hueco a la llama del mechero. Introducir
los taponcitos de algodn en 2/3 quemndose el excedente.
b.- Calentar el centro de la varilla en forma continuada, rotando a la vez ambos
extremos para evitar el cierre de la luz interna del tubo reblandecido.
c.- Retirar de la llama la regin calentada y reblandecida de la varilla y tirar de los
extremos para obtener la capilaridad. El calibre vara con el tiempo de estiramiento
d.- Separar las dos pipetas por estiramiento brusco despus del calentamiento y
refrendar el cierre a la llama de la porcin distal capilar.
ESTERILIZACIN
Ordenar el material a esterilizar dentro del autoclave, de manera que haya el suficiente
espacio para que el aire caliente circule alrededor de todos los materiales.
Es recomendable el uso de estufa para la esterilizacin del material de vidrio, si en caso
no se cuenta con este equipo se puede utilizar el autoclave para lo cual las placas Petri
y pipetas deben colocarse dentro de bolsas plsticas de polipropileno para evitar que
estas se humedezcan. Al final, el material debe secarse de un da para otro dentro de
espacios limpios.
III.- EQUIPO DE LABORATORIO
1. CABINA DE FLUJO LAMINAR: Emplea un ventilador para forzar el paso de aire a travs
de un filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de

partculas de hasta 0.1 micras. Este tipo de equipo presenta una nica cara libre (la
frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo, que
normalmente permanece limpia y estril. La esterilidad de la superficie de trabajo se
logra por la accin germicida de la luz ultravioleta emitida desde un fluorescente
presente en el interior del equipo. Dentro de estas cabinas o campanas se trabaja con
medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos o cultivos celulares y en el
cual es vital evitar la contaminacin con partculas minsculas. Estas cabinas estn
diseadas para proporcionar un aire limpio y constante a una velocidad de paso de aire
de 0.30 a 0.50 metros por segundo para as barrer la superficie de la zona de trabajo y
evitar la suspensin de partculas, as como una posible contaminacin de las muestras.
El aire es inyectado a la zona de trabajo a travs del filtro HEPA o ULPA e insuflado en
forma de un flujo laminar o flujo unidireccional, muy suave, hacia el usuario. La
superficie de trabajo de la cabina se construye generalmente de acero inoxidable grado
304 o superior para facilitar su limpieza y aumentar su durabilidad por el uso, con
acabados sanitarios, sin espacios o juntas donde las esporas pueden llegar a acumularse.
Dentro del laboratorio, la cabina de flujo laminar debe instalarse lo ms lejos posible de
las rejillas de aire acondicionado, campanas de gases, puertas y zonas de trnsito
intensivo de personal, que pueda interferir en el flujo de aire en la cabina.
El adecuado manejo de la cabina de flujo laminar consiste en:
- Poner en marcha la cabina durante 5 minutos antes de empezar a trabajar, de esta
forma se forma un barrido de partculas de la zona de trabajo.
- Limpiar la superficie de trabajo y las paredes laterales con un pao estril (que no
desprenda partculas ni fibras) o de un solo uso, embebido en alcohol de 70.
- Encender la luz ultravioleta y mantenerla durante por 10 minutos para esterilizar el
interior del equipo.
- Encender la luz fluorescente de la cabina.
- Antes y despus de realizar el trabajo en la cabina de flujo laminar se realiza el
lavado de manos y uas con jabn germicida. Evitar tocarse la boca, as como los
ojos.
- Es recomendable usar guantes de ltex para minimizar el desplazamiento de
contaminantes cutneos hacia el interior del rea de trabajo y la vez proteger el
operador.
- Usar mascarillas descartables evitando dejar descubierta la boca y nariz, debido a
que este tipo de cabina solo protege a la muestra.
- Colocar el material a utilizar en la zona de trabajo antes de empezar, situando el
material contaminado en un extremo de la superficie de trabajo y el no
contaminado en el extremo opuesto de la misma.
- Es recomendable trabajar a unos 5 a 10 cm alejado de los bordes de la superficie de
trabajo, procure no obstruir las rejillas de aire con materiales o residuos.
- No use nunca la cabina de flujo laminar cuando este sonando algunas de sus
alarmas.

Al finalizar el trabajo, retire el material e instrumentos contaminados.

Limpiar y descontaminar la superficie de trabajo retirando cualquier materia
orgnica que se haya adherido a la superficie y que sirve de sustrato a los
microorganismos. Utilizar un pao embebido con alcohol de 70.
Apagar.

2. AUTOCLAVE: Recipiente de presin metlico de paredes gruesas con un cierre

hermtico que permite trabajar a alta presin para realizar la esterilizacin con vapor
de agua. Su construccin permite su resistencia a presin y temperatura elevada
desarrollada en su interior. Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o
generacin de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presin
interna de 1 atmsfera, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121
grados Celsius, condiciones tpicas de esterilizacin en tiempo de 15-20 minutos. La
presin elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 C. La
accin conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulacin de las protenas de
los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproduccin de stos,
cosa que lleva a su destruccin. Para esterilizar se aplica los siguientes pasos:
Cerrar la llave del agua y del vapor.
Llenar con agua el fondo del autoclave hasta el soporte de la canasta evitando el
contacto con el agua.
Colocar la canasta de malla metlica con los materiales que se van a esterilizar
dejando el espacio adecuado para que el vapor tenga libre acceso.
Cerrar la puerta del autoclave con presin leve.
Encender el autoclave
Calibrar el control de presin a 15 lb o 1 atm en el manmetro.
Cuando la temperatura llegue a 121 C, mantenerlo por 30 minutos.
El autoclave disminuye la presin despus del tiempo requerido por el material a
esterilizar.
Apagar el autoclave.
Una vez que la presin haya bajado totalmente a cero, abrir lentamente la llave
del vapor hasta que el vapor haya escapado por completo.
Abrir lentamente la compuerta y dejarla entreabierta para dejar que los materiales
enfren ligeramente, evitndose la rotura de la cristalera y peligros para el
operador por cambios bruscos de temperatura.
3.- CONTADOR DE COLONIAS: Instrumento utilizado para contar colonias de
bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de medio de cultivo.
Cuenta con una superficie iluminada sobre la que se coloca la placa permitiendo marcar
las colonias con un rotulador en la superficie externa de la placa, de tal manera que cada

vez que se marca una colonia el instrumento emite una seal audible y en la pantalla
numrica.
4.- POTENCIOMETRO: Requerido para las mediciones del pH de las soluciones buffer
y medios de cultivo. Constituido por un par de electrodos sensibles a concentraciones
de hidrogeniones, conectado a un circuito elctrico que mide las fuerzas
electromagnticas y a un potencimetro que indica las mediciones.
Los potencimetros emplean un electrodo de vidrio, unido a un electrodo de calomel
como standard. El electrodo de vidrio es una delgada membrana de vidrio especial
colocado entre una media celda de Plata-Cloruro de Plata y la solucin cuyo pH se quiere
conocer, el electrodo de calomel est formado por HgCl slido sobre Mercurio
metlico. Dentro de la celda de vidrio que contiene el electrodo Ag-AgCl, se encuentra
HCl 0.1 M lo que establece en uno de los lados de la membrana de vidrio un pH
constante y conocido con exactitud. La solucin de pH desconocido y la media celda
estn unidas por un puente de KCl. El electrodo de vidrio vara con los cambios de pH
de la solucin problema, este potencial es una funcin lineal de pH.
Debe tenerse extremado cuidado en el manejo de electrodos, especialmente con la
membrana del electrodo de vidrio que es muy delicada y se rompe al primer contacto
con punzo-cortantes. El electrodo de calomel debe estar siempre lleno con solucin
adecuada de sal, usualmente cloruro potsico saturado.

5.- CENTRIFUGACION: Aceleracin del proceso de sedimentacin, donde la clula o

partcula a sedimentar se ve sujeta a dos fuerzas de sentido opuesto: una dirigida al
centro del tubo y la otra que se opone debido a la viscosidad del medio. La primera
responde a la frmula: f1=my, donde y es la aceleracin debido al peso, y = 1g (unidad
de gravitacin); m es la masa de la partcula.
La segunda es donada por la frmula de Stockes: f2 =6 nrv y depende del radio (r) de
la partcula, de la viscosidad del medio (n) y de la velocidad de migracin (v). Cuando
se acelera el valor de y utilizando la fuerza centrfuga, slidas suspendidas en lquidos.
La velocidad de la cual sedimentarn las partculas en un lquido depende de varios
factores:
_ Tamao de la partcula.
_ Peso de la partcula.
_ Viscosidad del lquido.
_ Fuerza gravitacional
La fuerza gravitacional es incrementada mecnicamente. El grado de incremento de la
fuerza gravitacional se mide por comparacin con una fuerza centrfuga relativa
(FCR expresada en G) del siguiente modo:
F C R = 1.118 x 10-5 x R x rpm2

Donde R es el radio de la centrfuga en cm; rpm es la relacin del nmero de

revoluciones por minuto.
El radio corresponde a la distancia del tubo al eje de rotacin.
Factores que influyen en la centrifugacin eficiente:
TIEMPO: El desplazamiento de una partcula en el tubo est en funcin de la duracin
de la centrifugacin.
TEMPERATURA: Las centrfugas refrigeradas se emplean para aquellos productos que
se deterioran fcilmente por el calor desprendido por la friccin de los tubos.
ULTRACENTRIFUGACION.- Para obtener aceleraciones elevadas (mayores o iguales a
50,000 G) se necesitan motores que establezcan un vaco a fin de evitar el
calentamiento del rotor por friccin con el aire. Existen dos tipos:
- Ultracentrifugacin Analtica: Para determinacin de caractersticas fsicas de
protenas o de cidos nucleicos. La migracin de estas molculas es seguida
gracias a un estroboscopio.
- Ultracentrifugacin
Preparativa: Permite la separacin
de organelas
(mitocondrias, microsomas). La separacin de macromolculas se debe efectuar
en gradiente de densidad.

6.- INCUBADORAS Y HORNOS: Se basan en el mismo principio. Son gabinetes

provistos de un calentador interconstrudo. La temperatura requerida puede
controlarse mediante un termostato. El termostato se compone de una tira bimetlica
que opera como un conmutador o interruptor elctrico conectado a un aparato de
calentamiento. Si se sueldan entre s dos metales con ndices de expansin diferentes,
uno de ellos se dilatar ms rpidamente que el otro, haciendo que toda la tira se
doble; esta tira est conectada a un interruptor elctrico; se interrumpir el circuito y el
calentador dejar de funcionar hasta que la temperatura descienda o suficiente para
que la tira metlica vuelva a su posicin original.
La diferencia entre los hornos y las incubadoras radica simplemente en la temperatura
que puede obtenerse en el interior. Un aparato capaz de soportar temperaturas de
100 C o mayores se denomina usualmente HORNO.
Hay dos tipos bsicos de incubadoras: en el tipo de conveccin por gravedad, se hace
calcular el aire por medio de las corrientes de conveccin, son inadecuadas para circular
aire caliente a travs de toda la cmara, cuando debe elevarse la temperatura slo muy
ligeramente sobre la del exterior. Cuando la incubadora es ms grande, ms serio es el
problema. En los tipos de corriente mecnica de conveccin, el aire circula por accin
de un ventilador.

Un punto importante que con frecuencia se descuida, es la carga de las incubadoras. Si

se colocan los paquetes que van a esterilizarse o los cultivos para su incubacin, en
recipientes que no permiten un precalentamiento adecuado disminuye la eficacia del
instrumento.
Las incubadoras ms costosas vienen provistas de un humedecedor, pues los
microorganismos desarrollan mejor en una atmsfera hmeda.
7.- BAOS DE AGUA: Estn constituidos por una bandeja que posee un dispositivo
enrollable que puede sumergirse en ella para calentarlo. Estos dispositivos estn
protegidos por una rejilla que impide el contacto directo entre enrollamiento y los
objetos que van a incubarse, adems de promover una distribucin ms uniforme en las
corrientes de conveccin formadas. Un buen bao de agua es la incubadora ms sensible
que pueda tenerse.
Bajo condiciones ptimas puede regularse la temperatura dentro de lmites. La cubierta
o tapa de la incubadora tiene la finalidad doble de mantener la temperatura requerida
en el interior del aparato y reducir el ndice de evaporacin. El agua de condensacin se
acumular en la parte interior de la tapa, para impedir que esta agua gotee a los tubos
de ensayo, debe tener una tapadera que permita un adecuado drenaje.
Para evitar la formacin de precipitados o costras debe emplearse siempre agua
destilada; para impedir la contaminacin con algas y bacterias puede agregarse 1 mL al
10% de Zafiran por cada galn (3.785 lt) de agua. Se debe comprobar a diario la
temperatura y nivel de agua.
8.- REFRIGERADORAS Y CONGELADORAS: Son incubadoras de temperatura fra. Se
requiere para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos perecederos. Las
congeladoras se requieren para almacenamiento ms prolongado de sueros, enzimas,
etc. Debe localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores, de tuberas de
agua caliente.
9.- FILTRACION.- La filtracin bacteriolgica generalmente libera los lquidos de
partculas no deseadas. Se ve favorecida por la aplicacin de presin a travs del filtro,
bien sea presin positiva sobre el lquido no filtrado. Se emplean para lquidos y
soluciones que resultaran alterados por el calor.
En la actualidad su utilizan generalmente tres tipos de filtros para la esterilizacin:
- Filtros de Membrana: Discos de elevada porosidad de steres de celulosa
(acetato de celulosa), con gama de formas, dimetros y poros. Retienen en su
superficie aquellas partculas que sobrepasan el tamao dado. El tamao del poro
ms grande es menor que las pequeas partculas retenidas. La retencin de
partculas se efecta por medio de poros y no por atraccin o adsorcin
electrosttica.

Ejm. Millipore grado 08, dimetro de poro 0.22-0.02 u, 0.45 u para bacterias. Las
membranas de nitrato de celulosa se conocan con el nombre de Oradocel, dimetro 310 u son usadas para determinar el tamao de muchos virus.
ULTRAFILTRACION.- La ultrafiltracin bajo membrana de permeabilidad selectiva
permite la separacin de sustancias segn su tamao molecular, las membranas juegan
un papel de filtros a nivel molecular.
Las membranas ms utilizadas son de Digflo (Amicon), fuerza que permite la
ultrafiltracin, es una presin ejercida sobre el lquido a filtrar por el nitrgeno. La
ultrafiltracin puede ser utilizada con centrifugacin, la fuerza motriz de la ultrafiltracin
ser entonces la fuerza centrfuga. APLICACIONES:
1.- Concentracin de macromolculas
2.-Eliminacin de sustancias de bajo peso molecular
3.-Separacin de virus, con utilizacin de membranas especiales cuyos lmites alcanzan
pesos moleculares de 300,000.
10.- LIOFILIZADOR: Procedimiento de conservacin que es acompaado de una
transformacin de la sustancia a conservar, la que contiene al principio una
concentracin elevada.
El principio de liofilizacin consiste en congelar bruscamente a bajas temperaturas. El
procedimiento comprende varias etapas: Congelacin, eliminacin del agua
(directamente del estado slido al vapor, sin pasar por lquido). Este procedimiento
permite conservar al estado seco un nmero de productos que pueden reconstituirse
por hidratacin. Para la congelacin es necesario que el solvente sea acuoso, ya que la
mayor parte de solventes disminuyen el punto de congelacin bajo el riesgo de
desnaturalizacin, sobre todo si el material es proteico.
El liofilizador comprende una o dos bombas de vaco (la segunda bomba permite
obtener presiones residuales inferiores a 0.1 mm Hg y un sistema que permite obtener
el vapor de agua).
11.- ESPECTROFOTOMETRO.- Es un instrumento que permite medir la intensidad de la
luz transmitida; se utiliza mucho en anlisis bioqumicos. Comprende un espectrmetro
y un fotmetro. Mediante una fuente de luz y un dispositivo de monocroma el
espectrmetro puede emitir frecuencias luminosas conocidas que varan segn el tipo
de aparato empleado pero que corresponden a la regin del espectro visible entre 400
y 700 nm. El fotmetro es una clula fotoelctrica sensible a la gama de longitudes de
onda de la luz emitida y un galvanmetro que registra las potenciales originados por la
clula fotoelctrica. Estos potenciales son transcritos a una escala donde figuran
lecturas por 100 de transmitancia o de absorbancia.
Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas
longitudes de onda de la luz y dejan pasar otras. Cada sustancia absorbe energa
radiante de una u otra longitud de onda.

Ejm. La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores complementarios del
rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas del azul y del verde.
IV. CONFECCION DE ESPATULAS DE DRIGALSKY
Se preparan a partir de la pipeta Pasteur.
a.- Calentar en un punto del tercio anterior de la zona capilar doblando en ngulo el
resto de la fraccin capilar.
b.- Mediante dos calentamientos sucesivos en dos puntos equidistantes del tercio
medio, formar una varilla capilar horizontal, de manera que los bordes de la esptula
formen un tringulo abierto, entre la fraccin capilar distal y el ngulo del tercio
anterior.
V.

CONFECCION DE AGITADORES O BAGUETAS

a.- Lisar los bordes cortantes de la varilla de vidrio macizo a la llama del mechero.
b.- Calentar uno de los extremos al rojo vivo y con una pinza de extremos romos,
presionar fuertemente sin retirar de la llama. Este quedar aplanado y corresponder al
extremo distal de la bagueta.

VI.

CONFECCION DE ASAS DE SIEMBRA

a.- Fijar el fragmento de alambre nicrom o platino de 6 a 8 cm en el extremo
proximal del mango de Kolhe, mediante la tuerca.
b.- Doblar en crculo, ngulo o rombo al extremo libre del alambre mediante una
pinza. El conjunto constituye el ASA DE SIEMBRA.
Puede quedar simplemente en aguja. El asa en crculo se puede moldear en una varilla
de vidrio. El dimetro vara de 2 a 8 mm segn el tipo de inculo a sembrar.

CUESTIONARIO.1.

Dibujar todos los materiales de vidrio vistos en prctica y mencionar brevemente

el uso de cada uno.

2.

Por qu es necesario preparar el material de vidrio antes de hacer los cultivos?

3.

Por qu no se pueden usar tubos con tapones de jebe?

4.

Qu efecto tendra el algodn quemado sobre el crecimiento de los

microorganismos?

5.

Por qu no se puede utilizar material de vidrio roto con rayaduras?

6.

Cul es la longitud de onda de la luz ultravioleta con efecto germicida y en que

consiste este efecto?

7.

Mencione otros tipos de esterilizacin adicionales al uso del calor hmedo o seco
utilizados en los laboratorios de Microbiologa. Explique el fundamento de cada
tcnica.

Defina:
- Esterilizacin
- Asepsia
- Solucin sulfocrmica
- Propgulos
- Inculo

I.

PRACTICA N 2
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVOS.-

Determinar los requerimientos nutricionales de microorganismos.

Preparar los diferentes medios de cultivo.

A. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MICROORGANISMOS

Los microorganismos de acuerdo a sus requerimientos nutricionales se clasifican en
general en AUTOTROFICOS Y HETEROTROFICOS, existiendo variaciones nutricionales
dentro de estos grupos.
- MICROORGANISMOS AUTOTROFICOS: Son aquellos que obtienen su energa de la
oxidacin de sustancias inorgnicas simples. Dentro de este grupo tenemos a los
microorganismos LITO-AUTOTROFICOS, QUIMIO AUTOTROFICOS y los AUTOTROFICOS
FOTOSINTETICOS, los cuales extraen su energa de reacciones fotoqumicas o reacciones
qumicas de xido-reduccin y fijan el CO2 como fuente de carbono. A este grupo de
microorganismos se les puede cultivar en medios de composicin qumica definida que
satisfacen sus exigencias nutricionales.
- MICROORGANISMOS
HETEROTROFICOS: Son aquellos que requieren de
compuestos orgnicos ms complejos como fuente de carbono y nitrgeno, requieren
del suministro de protenas, carbohidratos, lpidos, vitaminas, sales inorgnicas y otros
factores de crecimiento para la sntesis de compuestos estructurales y citoplasmticos
en su desarrollo, los organismos heterotrficos pueden ser: FOTO-ORGANOTROFICOS Y
QUIMIO ORGANOTROFICOS.
B. MEDIOS DE CULTIVO
DEFINICION
Son sustancias nutritivas lquidas o slidas, que se utilizan en el laboratorio para el
crecimiento de los microorganismos, pudiendo ser similares a sustratos naturales, en
los cuales estos crecen normalmente.
COMPOSICION
Sus componentes bsicos deben satisfacer las mnimas exigencias nutricionales para el
desarrollo microbiano y varan segn el tipo de bacteria. Incluyen: agua, nutrientes
como fuentes de nitrgeno, carbono y energa; y en ciertos casos, factores de
crecimiento. Se considerarn adems para el crecimiento necesidades de O2 (aerobios),
C O2 parcial o total (microaerfilos o anaerobios) y condiciones ptimas de pH y
temperaturas de incubacin.

UTILIDAD
Los medios de cultivo de acuerdo a su naturaleza pueden ser animal-vegetal (orgnicos)
y mineral (inorgnicos). La mayora de los medios de cultivo empleados para el
desarrollo inicial y aislamiento de microorganismos heterotrficos, son ricos en
componentes proteicos derivados de carnes, corazn, cerebro, casena, fibrina, soya,
por digestin con enzimas proteolticas (pepsina, tripsina, papana). Estos derivados son
principalmente pptidos, peptonas, proteosas, aminocidos, sales inorgnicas como
fosfatos y trazas de K y Mg que los organismos utilizan como compuestos
parcialmente degradados, al ser incapaces la mayora de hidrolizar protenas
completas. Los EXTRACTOS DE CARNE son los nutrientes bsicos de muchos medios de
cultivo a los cuales suelen aadir carbohidratos y sales inorgnicas, para constituir
MEDIOS BASALES.
Contienen los productos de degradacin proteica: gelatina, albumosas, peptonas,
proteosas, aminocidos y otras fuentes de nitrgeno como creatina, carnosina,
anserina, purina y glutatin.
Tambin contienen sales minerales (KH2PO4) y NaCl), factores de crecimiento (tiamina,
cido nicotnico, riboflavina, piridoxina, c. Pantotnico y colina) y algunos
carbohidratos. EL EXTRACTO DE LEVADURA que se utiliza como fuentes de factores de
crecimiento y que sustituye al extracto de carne, se prepara a partir de clulas lavadas
de levadura de cervecera y panadera, que son inducidas a autolisarse por calor a 55 C
o pueden ser hidrolizadas con HCl o enzimas proteolticas. Los extractos son ricos en
protenas de bajo peso molecular y en factores de crecimiento. El NaCl que se aade al
nutriente aumenta la presin osmtica del medio.
El AGAR es el agente solidificante de un nutriente lquido, al igual que la gelatina y el gel
de slice; este ltimo es utilizado para aislamiento de microorganismos autotrficos.
El agar se prepara a partir de una variedad de algas (Gelidium, Euchema, Pterocladia)
en estado seco, por procesamiento con agua caliente. El producto es luego clarificado,
secado y luego suministrado en grnulos, en hebras o en polvo. Su principal
componente es un polisacrido de cadena larga, mayormente constituido por Dgalactopiranosa. Tambin contiene una variedad de impurezas incluyendo sales
inorgnicas, pequea cantidad semejante a protenas y trazas de cidos grasos de
cadena larga que son inhibitorios del crecimiento.
Los minerales presentes son: Mg y Ca; antes se pensaba que el agar era un ster de
sulfato de Mg o de Ca del polisacrido. Para eliminar impurezas y exceso de fosfatos, se
ajusta el pH a 8.0, se mantiene a 100 C para precipitar fosfatos, se separa y al enfriar
se reajusta el pH del agar a 7.4.
CLASIFICACION
Segn su composicin y objetivos se clasifican de la siguiente manera:

1.
MEDIOS COMUNES
Aquellos que contienen los mnimos componentes nutricionales para organismos
heterotrficos no exigentes. Estos pueden ser LIQUIDOS, SOLIDOS Y SEMISOLIDOS.
Ejemplos:
-

Medios Lquidos: Caldo nutricio, caldo peptonado, caldo triptosa, caldo carne y
otros.

Medios Slidos: Nutrientes compuestos de un medio lquido base, al que se le

agregan sustancias orgnicas de poco o nulo valor nutritivo como el agar o gelatina,
para dar al medio consistencia de gel. Ejemplo: Agar nutricio, agar peptonado, agar
almidn, medio de gelatina y otros. El agar nutricio depositado en grandes recipientes
de superficie plana como placas Petri, permite el aislamiento de bacterias no exigentes
al estado de pureza, a partir de una fuente problema. Tambin es importante su utilidad
para otros fines como para la preparacin de cosechas bacterianas masivas en la
elaboracin de antgenos, vacunas, conservacin de cepas para estudios culturales en
tubos de prueba, etc.
Medios Semislidos: Compuesto por cualquiera de los medios lquidos antes
mencionados, a los que se adiciona una cantidad suficiente de agar para obtener un
estado de gel blando (0.5%). Principalmente se les usa para estudios de motilidad
macroscpica en columna de los microorganismos, mantenimiento en cepario y
estudios de la capacidad respiratoria.
2.

MEDIOS ENRIQUECIDOS O SUPLEMENTADOS

Preparados para reunir los requerimientos nutricionales de bacterias ms exigentes. Se

componen de un medio basal ordinario suplementado con factores de crecimiento
como sangre, suero sanguneo, lquido asctico, lquido pleural, vitaminas, extracto de
levadura, bases nitrogenadas, carbohidratos y sales minerales. Estos medios pueden
ser: LIQUIDOS O SOLIDOS.
Ejemplos:
-

Medios Lquidos: Caldo cerebro corazn, caldo extracto de levadura, caldo

suero, caldo asctico, caldo tripticasa soya, etc.

Medios Slidos: Agar cerebro corazn, agar extracto de levadura, agar sangre,
agar chocolate, suero coagulado de Loeffler y otros.

3.

MEDIOS SINTETICOS DEFINIDOS O QUIMICAMENTE DEFINIDOS

Preparados exclusivamente de sustancias qumicas.

Medios Sintticos Simples: Contienen carbono como fuente de energa (glucosa

o lactato), una fuente inorgnica de nitrgeno (ClNH4); fosfato o sulfato y varias otras
sales minerales; sustancias tampn y agentes quelantes como el citrato. Ejemplo:
Medio mnimo de Falkow, medio mnimo de Davis y Mingioli.
Medios Sintticos Complejos: Incorporan aminocidos, purinas, pirimidinas y
otros factores de crecimiento, para cepas exigentes.
4.- MEDIOS ESPECIALES
Son aquellos que adems de contener los requerimientos nutricionales bsicos, llevan
en su composicin sustancias inhibidoras con carcter selectivo y compuestos
especficos e indicadores para poner de manifiesto los principales caracteres
bioqumicos esenciales para el diagnstico especfico. Entre las sustancias inhibidoras,
los medios pueden contener sales biliares, antibiticos, colorantes u otros; pueden
afectar el metabolismo o sistema enzimtico con carcter de seleccin. Comprende:
Medios de ENRIQUECIMIENTO: Que favorecen el crecimiento de uno o un grupo
de microorganismos en particular, e inhiben en lo posible a otros de la microflora
acompaante.
Ejemplo: agua peptonada alcalina (APA) para Vibrio parahaemolyticus, caldo selenito de
Leifson, caldo tetrationato de Kauffman (entricos patgenos), caldo GN y otros.
Medios SELECTIVOS: Que favorecen el aislamiento de un determinado grupo de
microorganismos mediante la obtencin de colonias (cepas puras). Todos son utilizados
en condiciones slidas. Ejemplo: Agar Staphylococcus N 110 ( para el aislamiento de
Staphylococcus patgenos); Agar Chapman, Agar Mitis Salivarius (para el aislamiento de
Streptococcus mitis y S. salivarius); Agar Cetrimide y Agar GSP ( para aislamiento de
Pseudomonas); Agar McConkey; Agar EMB y Endo (medios moderadamente
selectivos para aislamiento de Coliformes y entricos patgenos, lactosa negativos);
Agar SS, Agar Verde Brillante y Agar Sulfito de Bismuto ( medios altamente selectivos
para el aislamiento de entricos patgenos, lactosa positivos).
Medios DIFERENCIALES: Empleados para detectar reacciones bioqumicas, con
carcter diferencial de grupos, gneros y especies microbianas. Para algunos es un solo
medio diferencial se pueden interpretar dos o ms pruebas bioqumicas, como el Agar
TSI utilizado para estudios de fermentacin o no de lactosa y sacarosa de organismos
entricos, y fermentacin obligada de glucosa por los mismos; lectura de produccin
o no de H2S. El Agar SLU presenta una mayor ventaja sobre el primero, porque le
permite a la vez la interpretacin de varias pruebas bioqumicas; fermentacin o no de
lactosa, produccin o no de H2S, produccin o no de ureasa, produccin o no de indol,
lectura de motilidad (para diferenciar entricos). Otros medios diferenciales: Agar LIA,
Citrato de Simmons, Medio SIM, Caldo KCN, Caldo Malonato (para estudios de

entricos); Medio de Hugh y Leifson (para lecturas de oxidacin y fermentacin de

carbohidratos).

MATERIALES
-

Medios de cultivo deshidratados o sus componentes deshidratados:

Para Caldo Nutricio: Peptona
Extracto de carne
NaCI
Para Agar Nutricio: Los antes mencionados ms Agar granulado
Para el Medio Selectivo: Agar McConkey deshidratado
Una balanza ordinaria de 2000 gr de capacidad
Un matraz Erlenmeyer de 1000 mL de capacidad, con tapn de algodn.
Una probeta graduada de 1000 mL. De capacidad.
Un litro de agua destilada
Varillas o baguetas de vidrio
Pipetas de 10 mL.
Tubos de prueba de 16 x 150 mm con tapn de algodn.
Placas Petri
Solucin de HCI 0.1 N y NaOH 0.1 N
Papel indicador de pH.

PROCEDIMIENTO
1. Pesar los ingredientes segn la cantidad requerida por los medios a preparar (ver
frmulas de los medios en la pgina)
2. Colocar la cantidad pesada en el matraz Erlenmeyer (con excepcin del agar
granulado que se adiciona en caliente), adicionar agua destilada en la proporcin
requerida.
3. Homogenizar la mezcla mediante la varilla de vidrio.
4. Colocar el matraz sobre un trpode provisto de una rejilla de asbesto. Calentar la
muestra (mezcla), empleando la llama del mechero, hasta lograr la total disolucin
de los ingredientes. En la preparacin del agar, se adiciona el agar granulado en
caliente y se sigue calentando hasta su completa disolucin.
5. Disueltos los componentes, enfriar a 55-55 C y ajustar el pH a 7.2 7.4 con HCI 0.1
N NaOH 0.1 N. Distribuir los medios en las botellas de vidrio hasta la mitad.
Taponar
6. Esterilizar al autoclave a 15 lb de presin (121 C) por 15 minutos. Terminado el
tiempo de esterilizacin, esperar que la aguja del manmetro descienda y extraer
los medios.
7. Para asegurar las condiciones de esterilidad de los medios, extraer aspticamente

8. Alcuotas de cada medio en 1-2 tubos estriles e incubar a 37 C por 24 h, el resto

del medio de cultivo mantener en stock conservando en refrigeracin hasta su
empleo.
9. Los medios slidos sometidos al proceso de esterilizacin y enfriados a 50-55 C,
deben de repartirse en alcuotas de 12 a 15 mL en 1-2 placas Petri en condiciones
aspticas; al solidificarse los medios invertir las placas para evitar que el agua de
condensacin se acumule sobre la superficie del agar. Incubar las placas a 37 C por
24 h, para control de esterilidad. Para medios slidos de igual forma.
10. Rotular datos: nombre del medio y fecha de preparacin.
FORMULAS Y PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS COMUNES
CALDO NUTRICIO
Composicin:

- Bacto-Peptona
- Extracto de Carne
- NaCI
- H2O destilada

10g
3g
5g
1000 mL

Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. Calentar hasta su completa

disolucin; enfriar y ajustar el pH a 7.2 7.4; repartir en frascos y autoclavar a 15 lb
de presin (121 C) por 15 minutos. Rotular datos y conservar en stock.

AGAR NUTRICIO
Composicin:

- Peptona
10g
- Extracto de carne
3g
- NaCI
5g
- Agar-agar
18g
-H2O destilada
1000mL

Preparacin: Disolver los 3 primeros ingredientes en agua destilada; calentar hasta su

completa disolucin; agregar luego el agar granulado; seguir calentando hasta disolver
completamente el agar; enfriar a 55 C y ajustar el pH a 7.2; repartir en frascos y
autoclavar a 121 C por 15 minutos. Rotular datos y conservar en stock.

PREPARACION DE MEDIOS SELECTIVOS: AGAR Mac CONKEY

El agar McConkey es un medio diferencial empleado para el aislamiento de
ENTEROBACTERIACEAS y enumeracin de bacterias coliformes de aguas; productos
lcteos, productos crnicos y otras fuentes. Su carcter diferencial est basado en la
presencia de sales biliares y cristal violeta, adems de la base nutricional, que inhiben el

desarrollo de microorganismos Gram (+) y la presencia de lactosa como carbohidrato

diferencial de la capacidad fermentativa de las enterobactericeas. Los organismos
coliformes desarrollan dando colonias rojas o rosadas debido a la acidez que produce
por la fermentacin de la lactosa y por absorcin del Rojo Neutro que acta como
indicador. Los microorganismos entricos que desarrollan formando colonias incoloras
indican que no fermentan la lactosa, son presuntivas de entricos patgenos.
Composicin:

- Peptona
17g
- Proteosa peptona
3g
- Lactosa
10g
- Sales Biliares N 3
1.5g
- NaCI
5g
- Agar
13.5g
- Rojo Neutro
0.03 g
- Cristal Violeta
0.001 g
- H2O destilada
1000 mL

Preparacin: Suspender 50 g de agar McDonnell en 100 mL de agua destilada y calentar

hasta disolver completamente. Enfriar a 55 C y ajustar el pH a 7.2 7.4; distribuir en
frascos hasta la mitad de su capacidad y esterilizar al autoclave a 15 lb de presin por 15
minutos. Enfriar a 55 C y repartir en placas Petri estriles.
DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MINIMOS PARA EL CRECIMIENTO
Idealmente todos los distintos medios que se emplean en Microbiologa deberan ser
del tipo llamado sinttico. Un medio sinttico es aquel cuya frmula qumica estructural
se conoce con exactitud. Por otro lado, la gran parte de los medios microbiolgicos
contienen substancias de frmula qumica desconocida. Tales substancias, como
extracto de carne, varias protenas, peptonas y extracto de levadura, representan
mezclas heterogneas de composicin y estructura qumica no identificada. Cuando las
protenas se someten a la accin de los cidos o al desdoblamiento enzimtico, se
acumulan distintos productos de varios tamaos intermedios, estos son simplemente
cadenas de aminocidos de longitud variable. En orden descendiente de tamao, se les
conoce como proteosas, peptonas y pptidos. En todas estas preparaciones tambin se
encuentran aminocidos libres. Por medio del control cuidadoso de las condiciones del
hidrlisis, todas estas preparaciones se pueden estandarizar en productos
razonablemente uniformes; pero es imposible conocer con exactitud las frmulas
qumicas de todos los componentes del hidrolizado. Siempre que se le aadan estos
productos al medio de cultivo, este deja de ser sinttico. Por medio del empleo de
medios sintticos se puede aprender mucho sobre la nutricin microbiana. En el
siguiente experimento Usted emplear un medio simple para demostrar que no todos
los microorganismos tienen los mismos requerimientos alimentarios.

CUESTIONARIO
1. Qu interpretaciones puede hacer respecto a la habilidad de los distintos
microorganismos para proliferar en los distintos medios usados?
2. Cul es la razn de calentar el medio slido en preparacin antes de
esterilizarlo?
3. Puede usted medir y ajustar el pH en un medio caliente? Por qu?

II.

MTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

OBJETIVOS:
-

Aislar BACTERIAS AERBICAS por los mtodos de ESTRIADO, DISEMINACIN Y

DIFUSIN
Reconocer los diversos parmetros que se toman en cuenta para describir una
colonia bacteriana.
Relacionar la morfologa de la colonia con la capacidad tintorial.

MATERIALES:
Muestra biolgica
- Abono
- Fermentaciones espontneas (vino artesanal, vinagre artesanal, chicha de
jora, tocosh sin cocinar, etc).
Otros:
- Asa de siembra
- Alambre de nicrom en aro
- Agua destilada
- Plumn marcador
- Encendedor
- Mascarilla
- Guantes
- Leja
- Pao
- Gradilla
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1.

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Gracias a la aplicacin de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente el

comportamiento cultural y fisiolgico de la variada flora microbiana que pulula en los
ambientes permitindose la identificacin especfica. Para ello es necesario considerar
la metodologa que conduzca a la exacta determinacin de la especie en el laboratorio.
a.

Siembra y Aislamiento de microorganismos

Siembra: Acondicionamiento de un microorganismo en un medio de cultivo, de
acuerdo a sus exigencias vitales, para que, en condiciones ptimas de temperatura
y tiempo de incubacin, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. Se siembra con
dos finalidades: a) Para hacer un aislamiento y b) para hacer un trasplante.

Aislamiento: Permite la separacin del microorganismo a un estado de pureza a

partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie
para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, genere su
progenie formando colonias separadas. Si se aslan colonias distintas, cada colonia
tendr caracteres especiales. La morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
Trasplante: Separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en
tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por tanto
trasplantes en medios especiales, se logran conocer las propiedades culturales y
bioqumicas y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes pueden
ser:
-

De lquido a lquido
De lquido a slido
De slido a lquido
De slido a slido

ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA SIEMBRA

(1) Conocer la procedencia de la muestra (tierra, agua, plantas, secreciones,
desecho industrial, un cultivo en particular)
(2) El medio de cultivo estril y apropiado que condiciona el crecimiento del
microorganismo que se quiere estudiar.
(3) Los dispositivos de siembra: asas de siembra, pipetas graduadas, esptula de
Drigalsky, mecheros, etc.
(4) El cubculo de siembra apropiado para el cultivo en condiciones de asepsia.
Deben ser instalados en lugares fuera de corrientes de aire, lmparas germicidas
UV, mecheros, etc.
(5) Equipo complementario: gradillas, lpiz graso, lminas desinfectantes, etc.
RECOMENDACIONES PARA COLECTAR ALGUNAS MUESTRAS A SEMBRARSE
(1) Muestras de Leche: Botellas de 100 mL de capacidad con tapa limpios. Tomar 50
a 100 mL.
(2) Muestras de Agua: Almacenar en recipientes de vidrio blanco limpios con
capacidad de 250 mL. Se recomienda colectar 100 a 200 mL para asegurar el
estudio de los microorganismos. Si es agua turbia, recolectar 20 a 50 mL en
frascos de menor capacidad.
(3) Muestras de tierra: Si est abonada, basta 1 a 4 g en tubos de prueba de 25 x 120
mm. En caso de tierra virgen la recolecta se har en bolsas de polietileno de
mayor capacidad.

En general, toda muestra slida debe ser diluida de preferencia en solucin salina o en
agua destilada estril antes de la siembra. Adems, la cantidad de inculo debe
dosificarse en relacin con la densidad de la muestra, dispositivo de siembra y volumen
de medio utilizado.
2.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PETRI

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio
slido. Se va descargando gradualmente el inculo para que en los ltimos planos del
medio queden escasas clulas que en el ambiente nutricio se irn multiplicando
logartmicamente hasta formar colonias puras.
Los mtodos de siembra varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir
el inculo. Cualquiera que sea el mtodo ensayado se aprovecha al mximo la superficie
del medio, logrndose aislar el mayor nmero de cepas microbianas.
a. Aislamiento por el Mtodo del Estriado
Con el asa de siembra se distribuye el inculo por ESTRIAS en ZAG, con escasa separacin
unas de otras (1-3) mm). La distribucin puede ser por estra simple (inculo descrito en
un solo plano por todo el medio) y estra en tringulo, cuadrado o pentgono (estras en
3, 4 5 planos en el mismo medio respectivamente). El nmero de estras depende de
la cantidad de inculo y los planos de siembra ensayados. Se evita romper el medio.
TECNICA N 1
1.Con la mano derecha, cargar el asa en aro, previamente al rojo, con inculo de
cultivo mixto que sostiene la mano izquierda; destapar el cultivo con el dedo meique y
margen cubital de la mano derecha. Se debe flamear el tubo antes y despus de extrada
la muestra.
2.- Tomar con la izquierda la placa Petri con agar, descansando la base sobre los dedos
medio, anular y meique; el ndice acta de bisagra y con el pulgar, levantar la tapa lo
suficiente para el paso del asa cargada. Esta operacin se realiza a la altura del mechero
encendido.
3.- Descargar el inculo en un punto marginal de la superficie del medio y con el asa
misma, describir la ESTRIAS hasta el margen opuesto de la placa, cuidando de no romper
el medio (ESTRIADO SIMPLE).
En caso de estriado por PLANOS, repetir los pasos 1, 2, 3 hasta la descarga del inculo,
diseminar en el primer plano. Hacer 1/4 de giro de la placa y continuar con el estriado
en el segundo plano. Volver a hacer de giro ms para diseminar en estras en el tercer
plano, de igual modo en el cuarto plano. Puede hacerse el estriado en 5 planos y an en
la parte central del medio, con un solo inculo.
4.- Dejar caer suavemente la tapa con el control de los dedos pulgar e ndice.

5.- Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada as: nmero de grupo, tipo
de siembra y fecha.
6.- Incubar a 37 C por 24 hrs. Colocar las placas en la estufa en posicin invertida.
TECNICA N 2
1.- Levantar con la izquierda y a la altura de la llama el dorso o base de placa Petri que
esta invertida sobre la mesa. Con la derecha cargar el asa y depositar el inculo sobre
el medio. Describir las ESTRIAS simples o por planos, manteniendo casi vertical la placa,
con la superficie del medio frente al operador.
2.- Regresar la base sembrada en su posicin normal en la mesa de trabajo.
3.- Poner datos e incubar en igual forma a la anterior.

b. Aislamiento por Diseminacin

Se practica mediante la pipeta Pasteur estril para la toma del inculo. Esta, por la
capilaridad, permite el ascenso del inculo a discrecin el cual es depositado en un
margen del medio y esparcido sobre el medio de cultivo con una esptula de Drigalsky.
La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha
penetracin de la esptula de siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de la
tcnica en la parte experimental.

PROCEDIMIENTO. 1.- Tomar el inculo del cultivo mixto con la pipeta Pasteur y depositar una gota
sobre el medio de la placa Petri N 2, que descansa en posicin normal sobre la mesa.
2.- Devolver el sobrante al tubo de cultivo.
3.- Destapar con la izquierda la placa Petri, lo necesario para introducir la esptula de
Drigalsky y diseminar la gota por la superficie del medio, no pasando dos veces por el
mismo plano.
4.- Desechar la esptula en el frasco bactericida.
5.- Rotular: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha.
6.Incubar igual a los mtodos anteriores.
NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inculo debe ser muy pequeo. Si est diluido,
inocular en el medio ms de una gota.

c.- Aislamiento por Difusin

Se practica de preferencia en ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por ejemplo, una
muestra de agua en la que se desea conocer el nmero de microorganismos por mL.
Es diluida primero al 1/10, 1/1000, etc. de acuerdo a la turbiedad. Se toman alcuotas
(1ml) de cada dilucin y se depositan separadamente en placas Petri vacas y estriles.
Sobre cada una se vierte agar fundido y enfriado a 45 C (10-15 mL). La mezcla se agita
moderadamente con movimientos ondulantes; se espera a que el medio solidifique, se
rotulan los datos y se incuban las placas en posicin invertida, a 37 C. A las 24 horas
aparecern colonias aisladas en superficie y profundidad, a diferentes planos. Estas
ltimas, de forma lenticular y de dimetros diversos. Los clculos matemticos de las
cuentas es motivo de otra prctica.

Una variedad del mtodo consiste en depositar los inculos en tubos de prueba
conteniendo agar fundido. Se agita vigorosamente cada tubo entre las palmas de las
manos y el medio se vierte sobre cada una de las placas estriles antes que solidifique.
Otra modificacin: se toma de la muestra una cantidad conocida del inculo, se vierte
en el primer tubo con el agar fundido, se agita para difusin uniforme, de ste se toma
igual cantidad y se vierte en el segundo tubo, se agita, se toma igual cantidad de inculo
y se vierte en el tercer tubo, se agita y con movimientos rpidos se vierten los 3 tubos
sembrados sobre las respectivas placas estriles. Se obtienen as las diluciones seriadas
y el nmero de colonias ser mayor en las ltimas diluciones. Las placas de cultivo para
incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin de la cara
interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de colonias
aisladas.
PROCEDIMIENTO. El profesor har la demostracin con una muestra de tierra a 3 diluciones: 10-1, 10-2 y
10-3.
Para los fines de la tcnica seguir cuidadosamente lo indicado por el instructor luego
de la demostracin.
NOTA: Hacer esquemas de cada uno de los mtodos de aislamiento y anotar
cualquier otra observacin no estipulada en la gua.