MANUAL DE TECNICAS

INMUNOHEMATOLOGIA

DOCENTE: T.M. RODRIGO CARVAJAL AZUA

LA SERENA, 2014

CLASIFICACION SANGUINEA ABO

Introduccin:
El sistema ABO fue descubierto por Landsteiner en 1900. Se considera como un sistema
mayor de histocompatibilidad, por lo tanto tiene enorme importancia clnica. Determina la
presencia de los Antgenos A y B en los glbulos rojos y clasifica a los individuos en cuatro
grupos: A, B, AB y O. Existen numerosas variables de estos antgenos lo que en ocasiones
provoca problemas en la clasificacin, motivo por el cual deben ser tenidas muy en cuenta
cuando se est estudiando este sistema. Se heredan mediante las leyes de Mendel mediante
un sistema multiallico de los cuales los alelos ms importantes son tres: A, B y O.

Tabla N 1:

Fenotipo

Genotipo

A/A , A/O

B/B , B/O

O/O

AB

A/B

Genotipo de los cuatro grupos sanguneos ABO de acuerdo a la teora de Bernstein. Si

se agregan los subgrupos de A y B la tabla se ampla.

Los anticuerpos ABO (anti A y anti B) se encuentran normalmente presente en el suero

de los individuos que no poseen el antgeno correspondiente. Son generalmente de tipo IgM y
reaccionan a temperatura ambiente y en salino.

Los antgenos del sistema ABO se encuentran presentes en casi todas las clulas del
organismo y en las secreciones y fluidos.

CLASIFICACIN DEL SISTEMA ABO. TCNICA EN LMINA

I.

Con Sueros Testigos (investiga antgenos de los glbulos rojos).

Muestra

Sangre total con o sin anticoagulante.

Material

Lamina de vidrio
Baguetas
Pipetas Pasteur
Fuente luminosa

Reactivos

Mtodo

Sueros clasificadores anti-A, anti-B y anti AB.

1. En una lmina de vidrio dividida en tres secciones a temperatura ambiente y sobre la

fuente luminosa, colocar en la primera seccin 2 gota de antisuero anti A, en la
segunda seccin 2 gota de antisuero anti B y en la tercera seccin dos gotas de
antisuero anti AB.
2. Aadir una gota de glbulos rojos de la muestra a clasificar, suspendida al 50% en su
propio plasma o suero, a cada gota suero clasificador.
3. Mezclar con bagueta de vidrio, haciendo girar la lmina con las manos, observando si
aparece aglutinacin.
4. La aglutinacin se producir en unos cuantos segundos, exceptuando aquellos casos en
que participe un aglutingeno dbil que requiere un perodo de observacin ms
prolongado.
5. La lectura debe hacerse antes que se seque la mezcla. Tiempo mximo de lectura
minutos.
II.

Con Glbulos Rojos Testigos (estudio de anticuerpos del sistema ABO. Prueba
inversa)
Muestra

Suero o plasma del paciente en estudio.

Material

Lamina de vidrio
Baguetas de vidrio.

Pipetas Pasteur.
Fuente luminosa.
Papel parafilm.
Reactivos

Glbulos rojos testigos A y B lavados.

Suero fisiolgico al 0,9% o buffer salino pH 7.0.

Mtodo

1. Sobre una lmina de vidrio fra, dividida en dos secciones y sobre la fuente de luz,
colocar dos (2) gotas del suero en estudio en la primera seccin y dos (2) gotas en la
segunda seccin. A la primera seccin agregar una (1) gota de GR. A1 suspendidos al
50% y a la segunda seccin una (1) gota de GR. B.
2. Mezclar con una bagueta, rotar la lmina y observar si hay o no aglutinacin
macroscpica.
3. La aglutinacin aparece a los pocos segundos de realizada la mezcla. Tiempo mximo
de lectura 2 minutos.
Interpretacin :
1. La aglutinacin de los glbulos rojos en presencia de cualquier suero clasificador ABO,
constituye un resultado positivo.
2. La suspensin uniforme al cabo de 2minutos, constituye un resultado negativo.
3. Las muestras con reacciones dbiles o dudosas deben reevaluarse con la tcnica en
Tubo.

ANEXO I
TECNICA DE LAVADO DE GLOBULOS ROJOS TESTIGOS

1. En un tubo de centrfuga de 15 ml, colocar 1 ml de sangre total. Llenar el tubo con

suero fisiolgico invirtindolo varias veces para asegurar la mezcla apropiada.
2.

Centrifugar a 3.000 rpm por 5 minutos.

3. Eliminar el sobrenadante.
4.

Repetir lo anterior 3 veces.

5. Suspender en la dilucin apropiada de acuerdo a la tcnica a utilizar.

CLASIFICACIN DEL SISTEMA ABO. TCNICA EN TUBO

I.

Con sueros testigos (Prueba Directa)

Muestra

Sangre total con o sin anticoagulante.

Material

Gradillas plsticas
Tubos Khan de vidrio
Pipetas plsticas Pasteur
Centrfuga
Fuente de luz.

Reactivos

Mtodo

Sueros clasificadores anti- A, anti- B, anti-AB

1. En una gradilla colocar 3 tubos Khan, previamente marcados con las letras A, B y
AB, respectivamente, teniendo la precaucin de revisarlos antes de agregar los
reactivos.
2. Colocar dos (2) gotas del suero anti-A en el tubo marcado A , 2 gotas del suero anti-B
en el tubo marcado B y 2 gotas del suero anti AB en el tubo marcado AB .
3. Agregar a cada tubo una (1) gota de la suspensin de eritrocitos de la suspensin 2 a
4% en el propio plasma o suero.
4. Mezclar y centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. por 20 segundos,
o incubar 1 hora a temperatura ambiente.
5. Agitar suavemente y observar sobre la fuente de luz si existe o no aglutinacin
macroscpica.
II.

Con glbulos rojos testigos (Prueba Inversa)

Material

Gradilla plstica
Tubos Khan
Pipetas plsticas Pasteur
Centrfuga

Fuente de luz
Reactivos

Glbulos Testigos A y B lavados

Suero fisiolgico al 9% o buffer salino pH 7

Mtodo

1. En una gradilla colocar 2 tubos Khan, previamente marcados con GR A y GR B,

teniendo la precaucin de revisarlos antes de agregar los reactivos.
2. Colocar dos (2) gotas del suero en estudio en un tubo marcado GR A y otras dos (2)
gotas del mismo suero en un tubo marcado GR B.
3. Aadir una (1) gota de suspensin de Glbulos Rojos Testigos A al tubo marcado con
GR A y una (1) gota de suspensin de Glbulos Rojos Testigos B al tubo marcado con
GR B.
4. Centrifugar a 1.000 r.p.m. por 1 minuto o a 3.400 r.p.m. por 20 segundos, o incubar 1
hora a temperatura ambiente.
5. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe o no aglutinacin
macroscpica.

GRUPO

Anti A

Anti B

Anti AB

G.R. A

G.R. B

AB

+++

+++

+++

----

----

+++

----

+++

----

+++

----

+++

+++

+++

----

----

----

----

+++

+++

Tabla N 2: Cuadro de reacciones para los distintos grupos sanguneos segn su clasificacin por
antisueros y GR testigos.

Interpretacin :

La aglutinacin de los glbulos rojos en estudio y la hemlisis, o la aglutinacin en el

suero, constituyen resultados positivos.

La suspensin uniforme despus de la resuspensin de las clulas, constituye un

resultado negativo.

Todas las discrepancias entre los resultados de la prueba Directa y la Inversa deben
resolverse antes de registrar la interpretacin del tipo ABO del paciente o donante.

Las tcnicas realizadas en lmina son menos sensibles que las realizadas en tubo, por
lo que se recomienda clasificar siempre en tubo, usando tanto sueros como glbulos
testigos.

Si las reacciones obtenidas no concuerdan con las del cuadro, podra tratarse de:
a. Un sub-grupo.
b. Alguna interferencia ocasionada por macromolculas extraas o propias.
c. Baja potencia de los sueros.
d. Baja antigenicidad de los G.R.
Por lo tanto, habra que hacer otros estudios para completar y afirmar esa clasificacin.
Nota: Cuando se utilizan anticuerpos ABO, las reacciones positivas suelen mostrar aglutinacin
3+ a 4+; las reacciones entre los glbulos rojos y el suero en estudio son ms dbiles (Inversa).

FACTORES DE ERROR DE LA PRUEBA INVERSA

I.

RESULTADOS FALSOS NEGATIVOS

Dependientes de los glbulos:

Concentracin inadecuada (muy alta o muy baja).

Empleo de glbulos con ms de 5 das de conservacin.

Empleo de solucin salina no fresca.

Empleo de G.R. testigo A2 en vez de A1.

Dependientes del suero sanguneo:

Presencia de hemolisinas.

De orden fsico:

II.

Lectura apresurada.

RESULTADOS FALSOS POSITIVOS

De orden fsico

Lectura despus de 2 minutos, ya que la muestra se seca.

CLASIFICACION ABO DEL RECIEN NACIDO

Muestra

Sangre total con o sin anticoagulante

Sangre del cordn umbilical

Material

Gradillas plsticas
Tubos de Khan de vidrio
Pipetas plsticas Pasteur
Centrfuga
Fuente Luminosa

Reactivos

Sueros Clasificadores anti-A, anti-B y anti AB

Suero Fisiolgico al 9% o buffer salino pH 7

Mtodo

1. Lavar los glbulos rojos de la muestra del RN, si esta es tomada del cordn umbilical,
por lo menos 4 veces en abundante solucin salina, para eliminar la gelatina de
Wharton que interfiere en la clasificacin.
2. Si la muestra es de puncin capilar no es necesario realizar lavados de la muestra
directa.
3. Hacer una suspensin al 4% en suero fisiolgico de los glbulos rojos lavados.
4. Marcar 3 tubos Khan con las letras A, B y AB.
5. Agregar dos (2) gotas de suero anti-A al tubo marcado A, dos (2) gotas suero anti-B al
tubo marcado B y dos (2) gotas de suero anti-AB al tubo marcado AB.
6. Agregar a cada tubo una (1) gota de la suspensin de glbulos rojos de la muestra.
7. Centrifugar 1 minuto a 1.000 rpm. o 20 segundos a 3.400 rpm. o incubar 1 hora a
temperatura ambiente.
8. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar sobre la fuente luminosa
si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin

La interpretacin es la misma que cuando se utilizan sueros testigos en la clasificacin de

adulto, teniendo en cuenta lo siguiente:

Si existe aglutinacin en todos los tubos antes de informar el grupo sanguneo como AB
debe comprobarse que no exista aglutinacin inespecfica de los glbulos rojos lavados,
colocando en un tubo de Khan dos (2) gotas de la suspensin de glbulos rojos y
centrifugarlo a 1.000 rpm. por 1 minuto o 20 segundos a 3.400 rpm. Si la prueba es
negativa el Grupo del recin nacido es AB; si la prueba es positiva debe lavarse
nuevamente la muestra hasta obtener una prueba negativa. Si esto no es posible debe
pedirse nueva muestra y repetir la clasificacin.

Los aglutingenos A y B de los recin nacidos son generalmente poco antignicos por lo
que se recomienda el uso de suero clasificadores muy potentes y el uso obligatorio del
suero anti AB como control. Es tambin por esta razn que las aglutinaciones son ms
dbiles.

Los RN no presentan aglutininas anti A y/o anti B en su suero o plasma, solamente

empiezan a formarse al tercer mes de vida extrauterina. Por este motivo no son
clasificados con glbulos rojos testigos A y B.

En ocasiones es posible detectar aglutininas anti A y/o anti B en el suero del RN

transferidas pasivamente por la madre, no correspondiendo a anticuerpos propios del
paciente.

TIPIFICACION Rh (antgeno D)
El sistema Rh fue demostrado por Levine y Stetson en 1939. Los antgenos se encontraron
solo en glbulos rojos.
El antgeno D se haya presente en aproximadamente el 92 % de la poblacin chilena.
Los anticuerpos anti D pertenecen al tipo IgG. Estos anticuerpos no estn presentes en forma
natural en individuos Rh negativos, es decir, a diferencia del sistema ABO en donde cada
individuo posee el anticuerpo contrario al antgeno que define su grupo (anticuerpos naturales),
aqu, la formacin de anticuerpos es de tipo inmune, es decir, se forman a partir del contacto
que tiene un individuo Rh negativo con sangre completa o glbulos rojos Rh positivos
(transfusiones o embarazos).
Este sistema posee una gran cantidad de antgenos, sin embargo, existen 5 antgenos mayores
estos son: D, C, E, e. c.

Muestra

Sangre completa con o sin anticoagulante.

Material

Pipetas plsticas Pasteur

Tubos Kahn de vidrio
Lminas de vidrio
Baguetas
Gradillas de metal o de madera
Fuente de luz y calor

Reactivos

Suero Clasificador anti Rh (anti D)

Suero antiglobulina humana (Coombs)
Suero fisiolgico 9% o buffer salino pH 7

Mtodo
I.

Tcnica en lmina
1. Preparar una suspensin al 50% de eritrocitos de la muestra en estudio en su propio
plasma o suero.

2. Colocar una lmina de vidrio sobre la fuente de luz y esperar hasta que se caliente a 40
45 C.
3. Depositar dos (2) gotas de suero anti-D para prueba en lmina en el centro de la placa.
4. Depositar una gota de la suspensin al 50% de eritrocitos de la muestra cerca de la
gota de suero anti-D.
5. Mezclar cuidadosamente con una bagueta o portaobjeto e inclinar la lmina a intervalos
de 10 segundos de modo que el lquido se acumule en uno de los extremos y volver
lentamente a la posicin horizontal. Repetir el procedimiento varias veces cambiando
cada vez la direccin de la inclinacin de la lmina.
6. Observar si existe o no aglutinacin macroscpica, la cual debe aparecer a los 30
segundos y completarse a los 2 minutos. La lectura debe realizarse dentro de este plazo
ya que despus puede presentarse una falsa aglutinacin por desecamiento.

II.

Tcnica en tubo
1. Depositar 2 gotas de suero anti D en un tubo Kahn previamente marcado.
2. Agregar una (1) gota de los eritrocitos de la muestra suspendidos al 4% en su propio
plasma o suero.
3. Mezclar e incubar 1 hora a temperatura ambiente.
4. Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.4000 r.p.m.
5. Leer sobre una buena fuente de luz removiendo suavemente los eritrocitos
sedimentados y observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin

Si hay aglutinacin, la persona es Rh D positiva. Si no hay aglutinacin, se debe seguir

el estudio de la muestra para descartar la existencia de la variante D dbil que es una
variedad dbil de este antgeno.

INVESTIGACION DEL ANTIGENO D DEBIL

Principios

Algunos glbulos rojos expresan los antgenos D en forma tan dbil que la mayora de los
reactivos anti D se aprecia menor mediante la prueba antiglobulina indirecta (Test de
Coombs Indirecto), despus de incubar los glbulos rojos con anti D.
Mtodo

1. Usar el mismo tubo que arroj resultado negativo para Rh. Agregar dos (2) gotas
ms de antisuero anti D, centrifugar y si el resultado es negativo, incubar 15
minutos a 37C. Si aparece positividad, puede deberse a la no agregacin de anti
D en la primera etapa o a una expresin un poco menor del antgeno. Por tanto
aqu el resultado es Rh positivo.
2. Si luego de los 15 minutos el resultado es negativo, incubar hasta completar 1
hora a 37 C.
3. Lavar los G.R. con abundante suero salino cuatro (4) veces.
4. Despus del ltimo lavado, eliminar tanto suero salino como sea posible, dejando
los glbulos rojos suspendidos en el suero salino que queda adherido a las
paredes del tubo.
5. Agregar dos (2) gotas de suero anti-globulina humana (Coombs).
6. Mezclar y centrifugar a 1.000 r. p. m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. durante 20
segundos.
7. Leer sobre una fuente de iluminacin removiendo suavemente los eritrocitos
sedimentados y observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin:

a)

Si el resultado del test es positivo en el punto 2, la muestra corresponde a un

individuo Rh (+).

Si el resultado del test en el punto 7 es ausencia de aglutinacin (-), se puede

afirmar que esa persona es Rh (-) con D dbil (-).

Si el resultado del test es positivo (aglutinacin ) en el punto 7, pueden haber dos

interpretaciones posibles:
La persona tiene en sus glbulos la variante D dbil.

15

b)

Los glbulos rojos presentan autoaglutinacin, ya sea por autoanticuerpos de tipo

IgG o bien por interaccin con el medio en que estn suspendidos los anticuerpos
anti Rh del antisuero usado.
8. Cuando el resultado es positivo (aglutinacin) luego de la adicin del suero de
Coombs, se debe proseguir la investigacin, efectuando un test de Coombs
Directo a los glbulos rojos en estudio (muestra) antes de emitir un informe,
incubndolos previamente con el medio de suspensin del antisuero o bien
albmina de bovino al 30% por 30 minutos.
9. Si el test de Coombs Directo es negativo, se puede concluir que la persona
pertenece a la variante Du.
10. Si el test de Coombs Directo es positivo con la misma intensidad que dio resultado
positivo la investigacin de la variante Du, no se puede llegar a conclusiones
apropiadas y el Rh de esa persona no puede ser diagnosticado hasta no efectuar
exmenes con suero anti Rh especiales, ya que una de las causales de falsos
resultados positivos es la solucin usada para preparar el suero anti Rh comercial
(Novasera, por ejemplo).

Resultados de la Investigacin

Tubo
anti D

Investigaci
n D dbil

Test de
Coombs
Directo

++++
(-)

(-)

Antgeno
D

Informe

Positivo

Rh positivo

Negativo

Rh negativo
Variante D
dbil (-)

(-)

++++

(-)

Positivo

Rh negativo
Variedad D
dbil positiva

(-)

++++

++++

Proseguir
estudio con
suero anti D
salino o
Novasera

16

TCNICA DE ANTIGLOBULINA HUMANA O TEST DE COOMBS

Fundamento

Es un test de aglutinacin que consiste en detectar anticuerpos de tipo IgG o

fracciones del complemento adherido a los G.R. ya sea in vivo o in vitro.
Para evidenciar estas IgG y/o fracciones del complemento se utiliza suero
antiglobulina humana (anti-gamma) o suero de Coombs o bien anti C 3d - C4 u otras
fracciones del complemento (anti- no gamma), producido por inmunizacin en animales
de experimentacin tales como conejo, cabra, ovejas, etc.
En forma general, en los Bancos de Sangre, se utilizan sueros comerciales que
contienen anticuerpos anti-gamma y anti no-gamma y de esa forma evidenciar tanto IgG
como fracciones de complemento adheridas a los GR. (C3d --> presentes en algunas
anemias hemolticas).
Es un test ampliamente usado en inmunohematologa, tanto en Enfermedades
Hemolticas del R.N., como en test de compatibilidad, en pesquiza y titulacin de
isoanticuerpos, en investigacin de variantes dbiles de ciertos antgenos (D dbil), etc.
Existen dos tcnicas de test de Coombs:
a) Test de Coombs Directo: Detecta los anticuerpos o componentes del
complemento fijados in vivo en los eritrocitos de un paciente, por ello podemos
aplicar dicha prueba al estudio de la enfermedad hemoltica del recin nacido y de
las anemias hemolticas, ya sean autoinmunes o inducidas por frmacos y para el
estudio post transfusional de las reacciones transfusionales.
b) Test de Coombs Indirecto: Detecta los anticuerpos o los componentes del
complemento fijados in vitro a los eritrocitos durante un tiempo de incubacin en
el laboratorio. Tiene aplicacin en el estudio de anticuerpos en un suero problema
(investigacin de anticuerpos irregulares de rutina) a travs de hemates de
composicin antignica conocida (paneles comerciales de clulas para screening
o identificacin de anticuerpos), determinacin de antgenos eritrocitarios a travs
de antisueros especficos y, por ltimo, en las pruebas de compatibilidad pretransfusionales.

Muestra

Sangre fresca completa con o sin anticoagulante

Materiales

Pipetas plsticas Pasteur

Tubos Kahn de vidrio
Fuente de Luz.
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Gradillas plsticas
Reactivos

Suero Fisiolgico 9% o buffer salino Ph 7

Suero de Coombs (anti gamma y anti no gamma)
Pool de GR. O Rh positivo.

Mtodo

I.

Test de Coombs Directo

1. Preparar una suspensin al 4% de los eritrocitos en su propio suero o plasma, y
depositar dos (2) gotas de esta suspensin en un tubo previamente marcado.
2. Lavar cuatro (4) veces estos eritrocitos con abundante solucin salina.
3. Despus del ltimo lavado eliminar tanta solucin salina como sea posible.
4. Aadir dos (2) gotas de suero de Coombs a estos glbulos rojos lavados.
5. Mezclar bien y centrifugar inmediatamente a 1.000 r.p.m. durante 1 min., o a 3.400
r.p.m. durante 20 segundos.
6. Leer sobre una fuente de luz, removiendo suavemente los eritrocitos
sedimentados y observar si existe o no aglutinacin.

Interpretacin:

II.

La aglutinacin de los eritrocitos indica que estos han sido recubiertos por
anticuerpos o complemento in vivo.

Test de Coombs Indirecto

1. Preparar una suspensin al 4% en solucin salina de eritrocitos grupo O Rh
positivo, seleccionados y lavados (pool de 3 personas).
2. Depositar una (1) gota de la suspensin de eritrocitos en un tubo de Kahn
previamente marcado.
3. Agregar dos (2) gotas del suero o plasma del paciente.
4. Incubar durante 30 60 minutos a 37 C o a temperatura ambiente (segn sea el
tipo de anticuerpo que se est estudiando). Cuando se est investigando un
18

anticuerpo srico de potencia desconocida, se recomienda un perodo de

incubacin no inferior a 60 minutos y a 37 C.
5. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 r.p.m. por un minuto o a 3.400 rpm durante 20
segundos.
6. Agitar suavemente y observar si existe o no aglutinacin macroscpica. Si el
resultado es positivo (aglutinacin en salino), detener el estudio e incubar a 4C
para ver qu ocurre con la intensidad de la aglutinacin. Luego reincubar a 37C
antes de seguir.
7. Si est dbil o negativa procdase de la forma siguiente:
8. Lavar los glbulos rojos cuatro (4) veces en solucin salina, despus del ltimo
lavado eliminar tanta solucin salina como sea posible.
9. Agregar dos (2) gotas de suero de Coombs.
10. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. durante
30 segundos.
11. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar sobre la fuente de
luz si existe o no aglutinacin macroscpica.
12. Esperar 5 minutos y observar si hay hemlisis.

Interpretacin

Si existe aglutinacin en el punto 5 significa que hay en el suero un anticuerpo de

tipo IgM.

Si se intensifica la aglutinacin luego de la incubacin a 4C, significa que hay

presencia de crioaglutininas.

Si existe aglutinacin en el punto 11 significa que hay en el suero del paciente un

anticuerpo de tipo IgG.

Si se observa hemlisis en el punto 12 indica que hay sensibilizacin por

complemento (C3d).

19

ANEXO II
CONTROL TECNICA ANTIGLOBULINA HUMANA
La adicin de una gota de clulas sensibilizadas a todos los tubos negativos, se realiza
para asegurar que el Suero anti-globulina Humana est activo y que no ha sido
neutralizado por alguna protena residual presente en el tubo. Estas clulas deben
aglutinarse, si no es as el test queda invalidado y todo el procedimiento debe ser
repetido.

TESTIGO NEGATIVO
1. Glbulos rojos de prueba (O Rh positivo) ms suero Fisiolgico, se sigue el
procedimiento de incubar a 37C durante 15 minutos.
2. Lavar 4 veces en solucin salina, desechar el ltimo lavado.
3. Agregar dos (2) gotas suero de Coombs.
4. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. durante
30 segundos.
5. Realizar lectura.

TESTIGO POSITIVO
1. Sensibilizar GR. O IV Rh positivo con suero anti Rh diluido 1/16 (o de acuerdo al
antisuero a utilizar) en solucin salina.
2. Incubar la mezcla a 37 C durante 15 minutos.
3. Centrifugar a 1.000 r.p.m. por un minuto o a 3.400 rpm durante 20 segundos.
4. Lavar cuatro (4) veces en solucin salina los eritrocitos recubiertos.
5. Agregar dos (2) gotas suero de Coombs.
6. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. durante
30 segundos.
7. Realizar lectura.

20

FACTORES CAPACES DE ALTERAR LA PRUEBA DE COOMBS

VARIABLES
1.

Temperatura de Incubacin.

2.

Tiempo de Incubacin.

3.

Medio de suspensin de los eritrocitos.

4.

Salino (Solucin salina isotnica)

Albuminoso (albmina bovina al 22 30 %)

Suero humano.

Relacin GR. - Suero

5.

Lavado Globular

6.

La proporcin ms utilizada es la de una gota de la suspensin globular al 2%. o al

5% en dos gotas del suero problema.

Una gota de suero sanguneo diludo 1/4000 (una gota de suero en 200 - 250 ml
de solucin salina) es capaz de neutralizar una gota de suero antiglobulina
humana.

Centrifugacin.

REACCIONES FALSAS POSITIVAS

1.

Centrifugacin Excesiva.

2.

Contaminacin Bacteriana (" in vitro" o " in vivo ").

3.

Tubos sucios.

4.

Slice Coloidal.

5.

Reticulocitosis.

21

REACCIONES FALSAS NEGATIVAS

1.

Contaminacin del Suero de Coombs con Suero Humano.

2.

Lavados insuficientes.

3.

Lavado interrumpido.

4.

Temperatura ptima.

5.

Suspensin Globular.

6.

Tiempo de Incubacin.

7.

Centrifugacin.

8.

Controles.

9.

Omisin del Reactivo.

10. Complemento.

22

TCNICA DE DETECCIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

EN DIFERENTES MEDIOS ENZIMATICOS

Muestra

5 ml. de sangre sin anticoagulante, se deja coagular y

se extrae el suero.

Materiales

Tubos de Kahn
Tubos de Centrfuga
Pipetas plsticas Pasteur
Gradillas de plstico
Fuente de luz

Reactivos

Suero Fisiolgico 9% o buffer salino pH 7

Fiscina 0,03 % en salino
Bromelina 0,35% en salino
Suero de Coombs
Pool de GR. O Rh positivo que contengan la mayora de los
antgenos clnicamente importantes (C, E, c, K, M, N, etc.).
Este pool debe ser de no ms y no menos de 4 personas.
Solucin de Baja Fuerza Inica.

Mtodo

1. Una vez seleccionados los glbulos rojos O Rh positivo adecuados, se lavan 4

veces con abundante suero fisiolgico, se elimina todo el sobrenadante despus
del ltimo lavado. A partir de este concentrado de glbulos rojos, preparar dos
suspensiones:
Suspensin A: Preparar una suspensin al 4 - 5% de los glbulos rojos O Rh
positivo previamente lavados, en solucin de Baja Fuerza Inica o Suero
Fisiolgico.
Suspensin B: Glbulos rojos fiscinados.
a. Colocar en un tubo de Kahn 1 ml de Fiscina al 0,03 % en Suero Fisiolgico.
b. Agregar 3,5 ml. de Suero Fisiolgico.
23

c. Agregar gotas del pool de glbulos rojos O Rh positivo ya preparados en

cantidad suficiente para obtener una suspensin al 4 - 5%.
d. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
e. Centrifugar por 3 minutos a 3.000 r.p.m. y descartar el sobrenadante.
f.

Lavar los glbulos rojos por dos (2) veces en abundante solucin salina y
eliminar el sobrenadante.

g. Suspender los glbulos rojos en 3,5 ml de suero fisiolgico.

2. Depositar en un tubo de Kahn marcado "A" dos (2) gotas de suero del paciente
ms una (1) gota de glbulos rojos de la suspensin A.
3. Depositar en un tubo de Kahn marcado "B" dos (2) gotas de suero del paciente
ms una (1) gota de glbulos rojos de la suspensin B.
4. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente por espacio de 1 hora.
a. Si se utiliza Bromelina esta se aade directamente a la mezcla de suero-GR O
IV testigos sin fascinar y se lee (despus de centrifugar) a los 5 minutos de
incubacin a temperatura ambiente.
b. Si se utiliza otro tipo de enzima comercial seguir las instrucciones del
fabricante.
5. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinacin macroscpica.
6. Si los resultados son positivos colocar los tubos por 15 minutos en bao Mara a
37C y observar si desaparece la reaccin (el tubo marcado B se descarta). Si la
reaccin se negativiza estamos en presencia de una crioaglutinina.
7. Si los resultados son negativos (antes de incubar a 37 C), agregar dos (2) gotas
de Albumina al 22 % o 30 % al tubo A e incubar 10 minutos a 37 C, leer
centrifugando, si la reaccin es negativa proseguir como sigue:
a. Lavar 4 veces con suero fisiolgico el tubo marcado "A"; despus del ltimo
lavado eliminar el mximo de sobrenadante, y agregar dos (2) gotas de Suero
de Coombs.
b. Centrifugar durante 1 min. a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m.
c. Observar si existe aglutinacin macroscpica, removiendo suavemente los
eritrocitos sedimentados, frente a una fuente de luz.

24

Interpretacin:

La aglutinacin en medio salino se informa como presencia de Anticuerpos de tipo

IgM.

La aglutinacin en los medios enzimticos, albumina o Coombs indica presencia

de Anticuerpos de tipo IgG.

Si la deteccin de Anticuerpos es positiva debe completarse con una seleccin e

identificacin del anticuerpo.

La no aparicin de aglutinacin se informa como ausencia de Anticuerpos

Irregulares, teniendo en cuenta que este resultado puede deberse a que el
antgeno correspondiente no estaba presente en el pool de glbulos rojos O IV Rh
positivo.

DETECCIN DE ANTICUERPOS IRREGULARES CON REACTIVOS

COMERCIALES
Esta tcnica est destinada a pesquisar anticuerpos irregulares de tipo IgM e IgG,
presentes en el suero en estudio, mediante la utilizacin de glbulos rojos de
antigenicidad conocida.
La seguridad de la prueba depende de los antgenos presentes en las clulas testigos
usadas. En la actualidad existen pool de clulas comerciales que en su superficie
manifiestan todos aquellos antgenos que poseen importancia clnica, es decir, capaces
de causar reacciones post-transfusionales.
Muestra

Suero de no ms de 48 horas

Reactivos

Pannel celular I y II (comerciales)

LISS
Suero fisiolgico 9% o buffer salino pH 7
Suero de Coombs

Mtodo

1. Marcar dos tubos con I y II.

2. Depositar dos (2) gotas a cada tubo del suero en estudio.

25

3. Agregar una (1) gota de Pannel I al tubo I y una (1) gota de Pannel II al tubo II
(asegurarse que la concentracin de estas clulas sea la adecuada para trabajar
en tubo, aproximadamente 4 %).
4. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, centrifugar y leer. Si el resultado
es positivo incubar a 4C por 15 minutos, centrifugar y leer. Anotar resultados.
5. Si el resultado es negativo, incubar luego a 37C por 30 minutos, centrifugar y leer.
6. Luego de incubacin, si da resultado negativo, lavar cuatro (4) veces con
abundante solucin salina, eliminando todo el sobrenadante en el ltimo lavado.
7. Agregar dos (2) gotas de suero de Coombs, centrifugar y leer.
8. Agregar clulas sensibilizadas para validar los resultados negativos.

Se puede acortar el tiempo de incubacin del punto 5 a 15 minutos si se agrega

solucin Liss de acuerdo a lo establecido en cada laboratorio. Sin embargo, se
debe tener en cuenta que actualmente muchas de las clulas comerciales para
investigacin o identificacin de anticuerpos ya vienen diluidas en un medio de
baja fuerza inica (LISS) y el tiempo de incubacin con estas clulas es el mismo
que si se hubiera agregado LISS, es decir, 15 minutos de incubacin a 37C.

Existen en el mercado variados mtodos para la investigacin de aloanticuerpos

(gel, microplacas, cassette, etc.) los procedimientos asociados a ellos son
independientes y poseen especificaciones tcnicas particulares, por tanto, deben
seguirse las condiciones impuestas por el respectivo fabricante.

26

PRUEBA AUTOLOGA EN MEDIOS ENZIMATICOS

Para asegurar la veracidad de resultados de los exmenes de laboratorio en Banco de
Sangre se debe descartar la presencia de aglutinaciones inespecficas que no se
relacionan con el complejo antgeno-anticuerpo.
Este control tiene como objetivo detectar aglutinacin debida a: aglutininas fras,
autoanticuerpos, rouleaux, etc.

Muestra

Sangre Total con o sin anticoagulante

Materiales

Tubos Kahn de vidrio

Pipetas plsticas Pasteur
Gradillas
Centrfuga
Fuente de luz

Reactivos

Suero Fisiolgico
Bromelina 0,35 %
Papenzima (comercial)

Mtodo

1. Marcar 2 tubos de Kahn con A y B.

2. Colocar en ambos tubos dos (2) gotas de suero del paciente.
3. Colocar en ambos tubos una (1) gota de una suspensin de glbulos rojos del
paciente en su propio plasma o suero al 4 - 5 %.
4. Al tubo marcado B, agregar una (1) gota de Bromelina o Papenzima.
5. Incubar ambos tubos 1 hora a temperatura ambiente; el enzimtico depende del
tipo de enzima a utilizar.
6. Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m. y leer frente a
una fuente de luz si existe o no aglutinacin macroscpica. Si la reaccin es
positiva incubar 15 minutos a 37C. Si la reaccin desaparece estamos en
presencia de una crioaglutinina.
7. Si los resultados son negativos (despus de la hora de incubacin) agregar al
tubo A dos (2) gotas de albumina al 22% o 30% e incubar 10 minutos a 37 C.
27

Leer centrifugando, si la reaccin es positiva se trata de un autoanticuerpo de tipo

IgG.
8. Si es negativa, lavar cuatro (4) veces el tubo A con abundante solucin salina,
despus del ltimo lavado virtase tanta solucin como sea posible.
9. Agregar dos (2) gotas de Suero de Coombs.
10. Centrifugar igual que en el paso 6, observar frente a una fuente de luz si hay o no
aglutinacin macroscpica.

Interpretacin

Resultados positivos indican que el receptor tiene crioaglutininas, autoanticuerpos

o panaglutininas, que pueden interferir en otras determinaciones
inmunohematolgicas.

Resultados Negativos indican ausencia de autoanticuerpos fros y calientes,

panaglutininas.

PRUEBA AUTLOGA EN MEDIO SALINO

Muestra

Sangre fresca con o sin anticoagulante

Reactivos

Suero fisiolgico 9% o buffer salino pH 7

Mtodo

1. Marcar 1 tubo con PA y agregar dos (2) gotas de suero en estudio.

2. Colocar en el tubo una (1) gota de la suspensin de glbulos rojos del paciente en
su propio plasma o suero al 4 - 5 %.
3. Incubar a temperatura ambiente 1 hora y centrifugar para lectura.
4. Leer sobre fuente de luz, buscando aglutinacin.
5. Si el resultado es negativo, continuar como sigue:
a. Centrifugar a 1.000 r.p.m. por un minuto o a 3.400 rpm durante 20 segundos.
b. Lavar cuatro (4) veces en solucin salina los eritrocitos recubiertos.
c. Agregar dos (2) gotas suero de Coombs.

28

d. Mezclar bien y centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m.

durante 30 segundos.
e. Realizar lectura.

Interpretacin

Resultados negativos indican ausencia de autoaglutinacin.

Resultados positivos indican autoaglutinacin que invalida u obliga a revisar

resultados como clasificacin, ABO-Rh, Coombs directos, etc.

Resultados positivos en Coombs indican la presencia de IgG o fracciones del

complemento adheridas al glbulo rojo en estudio.

29

CONTROLDE CALIDAD EN INMUNOHEMATOLOGIA: ESPECIFICIDAD,

ACTIVIDAD Y POTENCIA DE SUEROS ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS)
I.

PRUEBA DE ESPECIFICIDAD
Materiales

Tubos Kahn de vidrio

Pipetas plsticas Pasteur
Fuente de luz

Reactivos

Suero antiglobulina humana en estudio.

G.R. testigos de grupo A, B y O

Mtodo

Equivale a efectuar test de Coombs directo a los glbulos rojos A, B y O por separado.
1. Lavar los glbulos con abundante solucin salina por 4 veces y preparar
suspensiones al 5-6%.
2. Colocar dos (2) tubos de Kahn marcados para los G.R. A; dos (2) tubos para los
G.R. B y dos (2) tubos para los G.R. O.
3. Colocar una (1) gota de suspensin de glbulos rojos A en cada tubo marcado A;
una (1) gota de glbulos rojos B en cada tubo marcado B y una (1) gota de
glbulos rojos O a cada tubo marcado O.
4. Agregar una (1) gota de suero antiglobulina en estudio al primer tubo A, al primer
tubo B y al primer tubo O.
5. Agregar una (1) gota de suero fisiolgico al segundo tubo A, al segundo tubo B
y al segundo tubo O (control).
6. Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m.
7. Leer sobre la fuente de luz y observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin:

No debe observarse aglutinacin en ninguno de los tubos si los controles dan

resultados negativos, por lo tanto esos glbulos estarn libres de IgG o C.

30

Si se encontraran resultados positivos en los tubos con antiglobulina y no en los

controles quiere decir que el antisuero tiene heteroanticuerpos o bien otro tipo de
protena que lo hace ineficiente para el trabajo a realizar.

Si los controles dan resultados positivos hay que cambiar los glbulos y repetir el
experimento.

II.

PRUEBA DE ACTIVIDAD DEL SUERO ANTIGLOBULINA

a. Con Glbulos Rojos sensibilizados con IgG

Mtodo

1. Sensibilizar GR. O Rh positivo (previamente lavados en abundante suero

fisiolgico por cuatro veces), con una dilucin 1/16 (o la dilucin adecuada) del
suero anti-D (IgG) comercial, incubndolo 60 minutos a 37C.
2. Lavar los GR. sensibilizados cuatro veces y resuspender al 5 - 6% en salino.
3. Colocar una (1) gota de la suspensin en dos (2) tubos de Kahn previamente
marcados.
4. Al primer tubo agregar una (1) gota del suero antiglobulina a probar y al segundo
agregar una gota de suero fisiolgico (control).
5. Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m. y leer para
observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin:

Si el control est negativo y el tubo con antiglobulina positivo, el suero puede

usarse.

Si ambos estn negativos el suero es deficiente.

Si ambos estn positivos hay que repetir el experimento haciendo una dilucin
mayor que la del 1/16 del suero anti-D para sensibilizar los GR, ya que la
aglutinacin del control indica que los GR ya estaban aglutinados antes de
agregar el suero antiglobulina.

31

b. Con GR sensibilizados con C3b

Mtodo:
1. Lavar GR. OIV Rh positivo por cuatro veces y resuspender al 50%.
2. Mezclar estos glbulos rojos volumen a volumen con suero humano fresco con
crioaglutininas e incubar 120 minutos a OC. En esta etapa la crioaglutininas
(fraccin IgM) unen C3b a los glbulos rojos.
3. Lavar los GR sensibilizados por tres veces en suero fisiolgico calentada a 37C.
En esta etapa las crioaglutininas se desprenden del glbulo rojo, permaneciendo el
C3b unido a ellos.
4. Resuspender los glbulos rojos al 5 - 6% y colocar una gota en los tubos
marcados.
5. Agregar 1 gota del suero antiglobulina a probar en el primer tubo y una gota de
suero fisiolgico al segundo tubo.
6. Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m. y leer sobre la
fuente de luz para observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin:

Si hay aglutinacin en el primer tubo y no en el segundo, significa que el suero

antiglobulina contiene la fraccin anti C3b.

Si ambos tubos dieran resultados negativos el suero a probar no contiene fraccin

anti C3b.

Si ambos tubos dan resultados positivos hay que repetir el experimento cambiando
los GR OIV Rh positivo.

Nota: Para asegurarse que la reaccin es por la fraccin C3b, y no por la fraccin anti IgG
es conveniente neutralizar previamente esta ltima fraccin del suero en estudio con
gamma globulina purificada antes de efectuar el test.

32

III.

POTENCIA DE UN SUERO DE COOMBS

Materiales

Pipetas de 1 ml. (1/10)

Bao inactivador a 37C
Centrfuga
Tubos de 10 x 75 mm.
Gradillas plsticas
Fuente de Luz

Reactivos

Suero anti-Rh (IgG) de ttulo aproximado de 1/64 (o el

adecuado) en medio proteico.
GR. OIV Rh positivo.

Mtodo

1. Efectuar diluciones del suero anti-Rh desde 1/4 hasta 1/1024, deben prepararse 1
ml de cada dilucin.
2. Lavar tres veces en solucin salina el pool de GR O IV Rh positivo y resuspenderlos
en salino al 5%.
3. Agregar los glbulos rojos ya preparados volumen a volumen a cada dilucin del
suero anti Rh.
4. Efectuar un control negativo usando glbulos rojos y solucin salina.
5. Incubar 60 minutos a 37C.
6. Lavar cuatro veces en salino los GR ya sensibilizados y resuspender en suero
fisiolgico a una concentracin final de 4 - 5 %.
7. Probar la sensibilizacin correcta de los glbulos rojos efectuando un test de
Coombs a cada una de las suspensiones con un suero antiglobulina conocido.
8. Hacer diluciones del suero de Coombs en estudio, en suero salino desde 1/2 hasta
1/128 de tal forma que el volumen final en cada tubo sea de 2 ml.
9. Numerar los tubos del 1 al 54 y distribuirlos en gradillas segn esquema siguiente:

33

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

10

11

12

13

14

15

16

17

18

1/8

19

20

21

22

23

24

25

26

27

1/16

28

29

30

31

32

33

34

35

36

1/32

37

38

39

40

41

42

43

44

45

1/64

46

47

48

49

50

51

52

53

54

10. Repartir dos (2) gotas de glbulos rojos sensibilizados con la dilucin 1/4 a los
tubos 1 - 10 - 19 - 28 - 37 - 46, que se encuentran bajo esta dilucin. Efectuar lo
mismo con todas las diluciones.
11. Repartir dos (2) gotas de la dilucin de Suero de Coombs 1/2 a los tubos que
estn en esa corrida: 1 - 2 - 3 - 4 - 5, etc. y hacer igual cosa con las otras
diluciones.
12. Agitar las gradillas para mezclar los reactivos y luego centrifugar todos los tubos a
1.000 r.p.m. durante 1 minuto o 29 segundos a 3.400 r.p.m.
13. Ordenar los tubos por su ubicacin inicial y leer los resultados sobre una fuente de
luz.

Interpretacin

El suero de Coombs debe tener un ttulo mnimo de 1/64 (lo da el tubo N 46).

La sensibilidad del suero de Coombs debe ser suficiente como para detectar GR
bloqueados con anti Rh diluido 1/1024 (lo encontramos en el tubo N 9).

El ttulo del Suero de Coombs se lee en la columna vertical en que se usan GR

sensibilizados con anti D a una dilucin 1/4. La potencia se lee en la columna
horizontal en que se usa dilucin 1/2 del suero de Coombs.

34

Nota: Este estudio completo se debe efectuar cada vez que se recibe una partida nueva
de sueros de Coombs y como un control diario de este reactivo bastara con pesquizar los
valores lmites de ttulo y sensibilidad sin efectuar todas las diluciones sino que llegando a
ellas en forma directa.

ANEXO III
PREPARACIN DE GLBULOS ROJOS SENSIBILIZADOS
Mtodo

1. Lavar glbulos rojos O IV Rh positivos cuatro (4) veces en buffer salino.

2. Colocar 10 ml buffer en un tubo y agregar 10 gotas de anti-D (IgG) o realizar
diluciones del suero anti-D hasta 1/16.
3. Agregar una cantidad suficiente de glbulos rojos lavados hasta obtener una
concentracin de 4 %.
4. Mezclar e incubar por 60 minutos a 37C.
5. Lavar estas clulas 4 veces y resuspender al 4 % en buffer salino.
6. Tomar una gota de la suspensin anterior y agregar suero de Coombs. Centrifugar
y leer.
7. La aglutinacin debe ser de una intensidad de 2 a 3 cruces.
8. Estos glbulos rojos sensibilizados pueden guardarse a 4C por 48 horas.

35

CLASIFICACIN DE MUESTRAS EN GRADILLA COMPLETA

( CON SCREENING DE ANTICUERPOS IRREGULARES Y
AUTOANTICUERPOS )

Materiales

Gradillas plsticas para tubos Khan

Pipetas plsticas Pasteur
Fuente de Luz
Centrfuga
Tubos de Khan de vidrio
Bao Mara

Reactivos

Sueros Clasificadores anti-A, anti-B, anti AB y anti-D

Glbulos rojos testigos A, B y O.
Ficina 0,03% en suero fisiolgico.
Bromelina 0,35% en suero fisiolgico o Papenzima.
Suero fisiolgico 9% o buffer salino pH 7
Suero de Coombs.
Solucin de baja fuerza inica 1,25 % (glucosa en suero
fisiolgico) o LISS

Mtodo

1. En una gradilla de clasificacin colocar en sentido vertical los siguientes reactivos:

Tubo N 1

2 gotas de Anti A.

Tubo N 2

2 gotas de Anti B.

Tubo N 3

2 gotas de Anti AB.

Tubo N 4

2 gotas de Anti Rh.

Tubo N 5

1 gota de GR A testigos.

Tubo N 6

1 gota de GR B testigos.

Tubo N 7

1 gota de GR Pannel I Comerciales

36

Tubo N 8

1 gota de GR Pannel II Comerciales

Tubo N 9

-----

Tubo N 10

-----

Tubo N 11

-----

2. Agregar a los tubos N 5, 6, 7, 8 y 9, dos (2) gotas de suero o plasma de la

muestra y en los tubos N 1, 2, 3, 4 y 9, una (1) gota de una suspensin de GR de
la muestra al 4% en su propio plasma o suero.
3. Dejar incubar por una hora a temperatura ambiente segn corresponda.
4. Observar si existe aglutinacin macroscpica en cada tubo frente a una fuente de
luz.
5. Segn los resultados debe continuarse la tcnica como corresponda en cada caso
(ver pasos prcticos anteriores) e interpretar de acuerdo a cada tcnica antes
descrita.

Interpretacin

Los tubos 1, 2, 3, 5 y 6 se usan para clasificar el sistema ABO.

El tubo 4 se usa para clasificar el Ag D del sistema Rh.

Los tubos 7 y 8 se usan para detectar anticuerpos irregulares utilizando glbulos

rojos comerciales Panneles I y II.

El tubo 9 representa la Prueba Autloga en medio salino.

El tubo 10 contiene el suero o plasma en estudio.

El tubo 11 contiene la dilucin al 4% de glbulos rojos del paciente diluido en su

propio suero o plasma (o solucin salina).

37

TCNICA DE DETERMINACIN DE HEMOLISINAS

Materiales

Tubos de Khan de vidrio

Gradillas plsticas
Pipetas plsticas Pasteur
Bao Mara
Centrfuga
Fuente Luminosa

Reactivos

Suero Fisiolgico 9% o buffer salino pH 7

Glbulos rojos lavados A y B

Muestra

Mtodo

Suero fresco de no ms de 24 horas

1. Poner en dos tubos de Kahn, previamente marcados con A y B

respectivamente, dos (2) gotas de suero en estudio en cada uno de ellos.
2. Agregar dos (2) gotas de una suspensin salina de glbulos rojos AI al 2 - 4% al
tubo marcado A y dos (2) gotas de una suspensin salina de GR. B al 2 - 4% al
tubo marcado B.
3. Mezclar suavemente e incubar por 2 horas a 37C
4. Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m.
5. Sobre una buena fuente de luz y un fondo claro, observar el sobrenadante en
busca de hemlisis.

Interpretacin

La presencia de hemlisis indica existencia de hemolisinas.

38

PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD
Introduccin
Las pruebas de compatibilidad son exmenes que deben realizarse de rutina en todo
Banco de Sangre, ya que es el nico medio de asegurar la compatibilidad entre el
donante y el receptor, evitando as problemas post transfusionales.
Existen dos tipos de pruebas de compatibilidad: mayor y menor, siendo la ms
importante la primera, ya que asegura que el receptor no tiene anticuerpos contra los
glbulos rojos del donante. La prueba de compatibilidad menor detecta anticuerpos del
dador contra glbulos rojos del receptor y en la actualidad est fuera de uso, por lo que no
sern revisados en el presente manual.
Son procedimientos que deben realizarse en diferentes medios y a diferentes
temperaturas para detectar el mayor tipo de anticuerpos presentes.
Materiales

Pipetas plsticas Pasteur

Tubos de Khan
Centrfuga
Bao de temperatura regulable
Gradillas
Fuente luminosa

Reactivos

Suero Fisiolgico 0,9% o buffer salino pH 7

Solucin de baja fuerza inica (Liss)
Suero de Coombs

Muestra

Mtodo

Suero o plasma en estudio.

1.

Preparar suspensiones al 4% en solucin de baja fuerza inica de los glbulos

rojos del dador.

2.

En dos tubos previamente marcados con la identificacin del donante y depositar

dos (2) gotas del suero del receptor.

3.

Agregar al tubo una (1) gota de la suspensin de glbulos rojos del dador.

4.

Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

5.

Centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 20 segundos a 3.400 r.p.m.

39

6.

Leer sobre la fuente de luz y observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

7.

Si el resultado es negativo incubar durante 15 minutos a 37C.

8.

Lavar cuatro (4) veces los glbulos rojos con abundante suero fisiolgico.

9.

Despus del ltimo lavado eliminar la mayor cantidad de sobrenadante y agregar

una (1) gota de suero antiglobulina humana (suero de Coombs).

10.

Centrifugar y leer igual que en el paso 5.

Interpretacin

La prueba de compatibilidad mayor tiene como finalidad detectar si el receptor

tiene anticuerpos contra los glbulos rojos del dador. Si la prueba es negativa,
significa que los glbulos rojos del dador son totalmente compatibles con la sangre
del receptor y por lo tanto nos aseguramos que no habr problemas hemolticos
postransfusionales.

La prueba negativa no nos asegura que el receptor no tenga anticuerpos en

cantidades mnimas, ni nos asegura que ese receptor pueda ser inmunizado con la
sangre inyectada.

Si la prueba es positiva significa que el receptor tiene anticuerpos contra los

glbulos rojos del donante y por lo tanto son incompatibles, debindose buscar
otra sangre para poder transfundir al receptor.

Los pasos a seguir, despus de una prueba de compatibilidad positiva, dependen

del grado de urgencia de la transfusin solicitada, pudindose realizar nuevas
pruebas de compatibilidad, identificacin de anticuerpo presente, determinacin
del genotipo, etc.

PROBLEMAS QUE SE PRESENTAN EN LAS PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD

I.

Incompatibilidad en suero fisiolgico a 18C, pero no a otras temperaturas.

Pasos a seguir:
a. Descartar que el problema se deba a la formacin de rouleaux.
b. Realizar un control de autoaglutinacin para ver la posibilidad de crioaglutininas o
panaglutininas. Si el resultado es positivo, estudiar ambas posibilidades.
c. Ver si la dificultad se debe a contaminacin de la muestra.
d. Una vez excluida la interferencia de los rouleaux y la autoaglutinacin inespecfica,
debe pensarse en la posibilidad de un anticuerpo especfico IgM, anti P 1, etc.
40

Aunque estos anticuerpos pueden tener un ptimo trmico ms amplio (hasta

37C) pueden no detectarse a esas temperaturas.
e. Identificar el anticuerpo.
f. Basndose en la identificacin del anticuerpo, seleccionar un dador que carezca
del antgeno correspondiente. Repetir el test de compatibilidad a 18C, 30C y
37C.
II.

Incompatibilidad solamente en test de antiglobulina

a. Puede deberse a los glbulos rojos del dador, el suero del paciente, a una
contaminacin del suero antiglobulina, a un error de tcnica, a un autoanticuerpo,
o bien a la presencia de un aloanticuerpo activo solamente en este medio.
b. Efectuar test de antiglobulina humana directo a los glbulos rojos del dador. El uso
rutinario de esta tcnica a todos los dadores ayuda a evitar este problema, ya que
los dadores con test de antiglobulina directo positivo no son utilizados.
c. El suero antiglobulina da falsos positivos cuando est contaminado con
antiespecies. Controlar dicho suero con glbulos rojos lavados A, B y O sin
sensibilizar.
d. No exceder el tiempo de centrifugacin indicado y usar suspensiones globulares
apropiadas.
e. Realizar un test de antiglobulina directo al receptor para descartar auto y
pananticuerpos.
f. Si se debe a un aloanticuerpo especfico, identificar el anticuerpo.
g. Seleccionar una sangre que carezca del antgeno correspondiente.
h. Repetir el test de compatibilidad con dicho dador.

41

ANTIGENOS SOLUBLES ABH

Principio

Las sustancias de grupo sanguneo ABO, se encuentra tambin, en una forma soluble, en
los lquidos del organismo de casi el 80% de los individuos.
Estos individuos reciben el nombre de "secretores". El 20 - 22% restante, carece de
estos antgenos solubles, o sea son "no secretores". Esta condicin est determinada
por un gen dominante; el gen Se. Los individuos "no secretores" son de genotipo se-se,
mientras que los "secretores" pueden ser Se-Se (forma homocigota) o bien Se-se (forma
heterocigota).
Todas las personas secretoras (Se-Se, Se-se), tienen sustancia H en la saliva,
independiente de su grupo sanguneo ABO:

Persona Grupo:

Sustancia que contiene su saliva:

H y A

H y B

AB

H, A y B

Estos antgenos son glicoprotenas, solubles en agua.

Su estudio se realiza generalmente en la saliva por ser una de las fuentes
ms ricas en antgenos solubles y por su fcil obtencin pero tambin encontramos estos
antgenos en lgrimas, sudor, orina, jugo digestivo, leche y lquido amnitico as como
tambin en el suero.
Para saber si una persona es "secretora" o "no secretora" de sustancia
especfica, se emplea la tcnica de la Inhibicin de la Hemaglutinacin, basndose en
la capacidad de los antgenos solubles o sustancia especfica de neutralizar los
anticuerpos correspondientes.

42

TCNICA DE INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN

Materiales

Tubos de Kahn.
Papel parafilm
Gradillas plsticas.
Pipetas plsticas Pasteur.
Mechero o Bao Mara
Centrfuga.
Vasos Precipitados
Lectinas:

Anti H: Ullex europeus

Anti A1: Dolichos biflorus

Reactivos

Sueros Clasificadores ABO.

Lectina anti H (anticuerpo de origen vegetal de especificidad
anti H, acta con intensidad proporcional a la cantidad de
sustancia H presente en el eritrocito).
Suero Fisiolgico 0,9% o buffer salino pH 7.
Glbulos Rojos testigos A, B y O lavados y suspendidos en
suero fisiolgico al 2 - 5%.

Muestra

Mtodo

Saliva en estudio.

1. Inactivar 5 a 10 ml de saliva llevndola a ebullicin durante 10 minutos en Bao

Mara, en tubo tapado (inactivar actividad enzimtica).
2. Centrifugar durante 5 minutos a 3.400 r.p.m. y extraer el lquido opalescente
sobrenadante (el sedimento se elimina ya que son solo impurezas). Este material
as obtenido, es capaz de mantener su actividad durante aos, si se conserva
congelado.
3. Colocar en un tubo un volumen de saliva (2 gotas) y un volumen de antisuero (2
gotas) que contenga el anticuerpo que se desea neutralizar. Por ejemplo, si se
desea saber si una persona grupo A es secretora de sustancia A, se pondr la
saliva de esa persona con suero anti-A. Si se quiere saber si es secretora de
sustancia H, se pondr la saliva del paciente con lectina anti-H.
43

4. Mezclar completamente y dejar reposar los tubos a temperatura ambiente durante

10 minutos.
5. Poner en contacto la mezcla con dos (2) gotas de Glbulos Rojos al 2 - 5% que
contengan el antgeno del grupo del paciente.
6. Mezclar y dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto o a 3.400 r.p.m. durante 20 segundos.
8. Remover suavemente los eritrocitos y sobre una fuente de luz observar si existe o
no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin

Prueba Positiva:
Presencia de aglutinacin indica
ausencia de sustancias solubles ABH en la saliva (NO
SECRETOR).

Prueba Negativa:
Ausencia
presencia de sustancias
(SECRETOR).

de aglutinacin indica
solubles ABH en saliva

Usos de esta Tcnica:

Determinacin de Grupo Sanguneo en secreciones.

Preparacin de reactivos de alto ttulo anti A y anti B por estimulacin con

sustancia A o B.

Neutralizacin de aglutininas para uso en laboratorio anti A y anti B IgM.

Neutralizacin de anticuerpos IgM anti A y anti B en estudios de RN con EHRN

(presencia de Ac anti A y anti B anti IgG causantes de la enfermedad).

Factores de Error:

Inactivacin insuficiente de la actividad enzimtica.

44

TITULACIN DE ANTICUERPOS IgM (Anti-A Y Anti-B)

Es un mtodo clsico que, en ciertas condiciones de temperatura (22C) y medios de
reaccin, determina las concentraciones aproximadas de un anticuerpo de tipo IgM en
suero. Se expresa como el recproco de la mayor dilucin del suero que produce una
reaccin visible con glbulos rojos seleccionados.
Los usos de este procedimiento son mltiples, pero principalmente se utiliza en la
preparacin de antisueros.

Materiales

Centrfuga
Bao Mara
Fuente de Luz
Gradilla plstica
Tubos de Khan o de ensayo pequeos (12 x 75 mm)
Pipetas plsticas Pasteur de borde parejo.

Reactivos

Suero Fisiolgico 0,9% o buffer salino pH 7.

Pool de Glbulos Rojos A o Glbulos Rojos B para detectar
anti-A y anti-B respectivamente.

Muestra

Mtodo

Suero del paciente.

1. Para titular anti-A , anti-B u otro anticuerpo de tipo IgM, marcar 10 tubos de Khan
con los nmeros 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 y 1024, que representan la
dilucin del suero en cada tubo.
2. Agregar dos (2) gotas de Suero Fisiolgico a los 10 tubos con una pipeta Pasteur
de borde liso y en un ngulo de 90.
3. Secar bien la pipeta y agregar dos (2) gotas del suero a titular en el primer tubo
con la misma pipeta y con el mismo ngulo.
4. Mezclar bien este primer tubo aspirando y soltando el lquido con la pipeta Pasteur,
evitando la formacin de burbujas.
5. Aspirar todo el lquido del tubo y transferir dos (2) gotas al segundo tubo.

45

6. Proceder en la misma forma hasta el final y guardar en otro tubo las ltimas dos
(2) gotas por si es necesario proseguir la titulacin.
7. Para titular anticuerpos anti-A, agregar una (1) gota de la suspensin de GR A al 25% a los tubos con la misma pipeta previamente enjuagada con suero fisiolgico.
8. Para titular anticuerpos anti-B, agregar una (1) gota de la suspensin de GR B al
2-5% a los tubos de la corrida con la misma pipeta previamente enjuagada con
suero fisiolgico.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
10. Centrifugar todos los tubos a 1.000 rpm por 1 minuto o a 3.400 rpm por 20
segundos.
11. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinacin macroscpica. La lectura del ttulo debe iniciarse desde el tubo 10 al
1 para evitar leer precipitadamente los primeros tubos como negativos y omitir el
resto que pueden ser en realidad positivos. Esto ocurrira en caso de existir el
fenmeno de prozona.
12. Los resultados deben ser anotados inmediatamente al realizar la lectura de cada
tubo y expresar en cruces el grado de aglutinacin.
Si se necesita titular anticuerpo anti AB se procede de la siguiente manera.
1. Marcar 10 tubos de ensayo pequeos con los nmeros 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128,
256, 512 y 1024, que representan la dilucin del suero en cada tubo. Estos tubos
conformarn la primera corrida A.
2. Enseguida marcar 10 tubos de Khan en igual forma. Estos ltimos, conforman la
segunda corrida B.
3. Agregar dos (2) gotas de Suero Fisiolgico a los 10 tubos de la primera corrida con
una pipeta Pasteur de borde liso y en un ngulo de 90.
4. Secar bien la pipeta y agregar dos (2) gotas del suero a titular en el primer tubo de
la primera corrida (A) con la misma pipeta y con el mismo ngulo.
5. Mezclar bien este primer tubo aspirando y soltando el lquido con la pipeta Pasteur,
evitando la formacin de burbujas.
6. Aspirar todo el lquido del tubo y transferir una (1) gota al primer tubo de la
segunda corrida (B), dos (2) gotas al segundo tubo de la primera corrida y devolver
una (1) gota al tubo inicial.
7. Proceder en la misma forma hasta el final y guardar en otro tubo las ltimas dos
(2) gotas por si es necesario proseguir la titulacin.
46

8. Para titular anticuerpos anti-A, agregar una (1) gota de la suspensin de GR A a

los tubos de la corrida A con la misma pipeta previamente enjuagada con suero
fisiolgico.
9. Para titular anticuerpos anti-B, agregar una (1) gota de la suspensin de GR B a
los tubos de la corrida B con la misma pipeta previamente enjuagada con suero
fisiolgico.
10. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
11. Centrifugar todos los tubos a 1.000 rpm por 1 minuto o a 3.400 rpm por 20
segundos.
12. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinacin macroscpica. La lectura del ttulo debe iniciarse desde el tubo 10 al
1 para evitar leer precipitadamente los primeros tubos como negativos y omitir el
resto que pueden ser en realidad positivos. Esto ocurrira en caso de existir el
fenmeno de prozona.
13. Los resultados deben ser anotados inmediatamente al realizar la lectura de cada
tubo y expresar en cruces el grado de aglutinacin.

Interpretacin

La lectura de las dos corridas, en que el suero a titular est en contacto solo con suero
fisiolgico y Glbulos Rojos A o Glbulos Rojos B corresponden a un medio salino, por lo
tanto determina el ttulo de anticuerpos de tipo IgM.

Notas

La titulacin tambin puede efectuarse usando pipetas de 1 ml graduadas en 0,1 ml, en

este caso debe pipetearse 0,1 ml tanto de suero fisiolgico, suero a titular y los GR que
correspondan.
Si desea titularse un anticuerpo diferente al anti-A o anti-B, debe tener la precaucin de
que el antgeno est presente en los GR del pool a usar.

47

Consideraciones:
Existen mltiples razones por las que este mtodo de cuantificacin de anticuerpos, da
valores slo aproximados de su concentracin:
a) Solo determina la cantidad de anticuerpo unido al GR, y no la cantidad total
existente en el suero.
b) Tiene mucha influencia la afinidad del anticuerpo por el antgeno, por ejemplo: si
dos sueros tienen la misma concentracin de un anticuerpo, pero uno de ellos
tiene una constante de afinidad 10 veces mayor, tendr un ttulo aproximadamente
10 veces superior que el otro.
c) Se ignora el factor de dilucin que introduce la adicin de suspensin de Glbulo
Rojo.
d) Se informa como el recproco de la ltima dilucin positiva, pero el valor real del
ttulo puede estar sobre el ltimo valor positivo y bajo el primer valor negativo.

48

TITULACIN DE ANTICUERPOS IgG (Anti-A, Anti-B Y Anti-D)

Fundamento:
Es un mtodo clsico que, en ciertas condiciones de temperatura (37C) y medios de
reaccin, determina las concentraciones aproximadas de un anticuerpo de tipo IgG en
suero, se expresa como el recproco de la mayor dilucin del suero que produce una
reaccin visible con GR. seleccionados.
Los usos de este procedimiento son mltiples, pero principalmente se utiliza en:
a) Preparacin de Antisueros.
b) Conocimiento de la magnitud de sensibilizaciones, especialmente en mujeres
embarazadas.
Materiales

Centrfuga.
Bao Mara.
Fuente luminosa
Gradilla plstica.
Tubos de Khan o de ensayo pequeos (12 x 75 mm)
Pipetas plsticas Pasteur de borde parejo.

Reactivos

Solucin de Bromelina 0,35% en Suero Fisiolgico (ficina,

papenzima).
Albmina de Bovino al 30%
Pool de GR OIV Rh positivo en suspensin salina (para
detectar anti-D), Glbulos Rpjos A o Glbulos Rojos B para
detectar anti-A y anti-B respectivamente.

Muestra

Suero del Paciente (para titulacin de anti-A y anti-B debe

ser previamente neutralizado).

Neutralizacin de Ig M:
1. A un tubo marcado A, aadir 0.3 ml de sustancia especfica de grupo sanguneo
"A" y 0.1 ml de plasma o suero en estudio sin diluir para neutralizar.
2. A un tubo marcado B, aadir 0.3 ml de sustancia especfica de grupo sanguneo
"B" y 0.1 ml de plasma o suero en estudio sin diluir para neutralizar.
3. Mezclar y dejar reposar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente

49

4. Comprobar la neutralizacin sacando 2 gotas de la mezcla y agregar a estas 1

gota de GR A o B, segn sea el caso, centrifugando a continuacin, si se observa
aglutinacin agregar 0.1 ml de sustancia especifica y repetir el procedimiento.

Mtodo

1. Marcar 10 tubos de ensayo pequeos con los nmeros 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128,
256, 512 y 1024, que representan la dilucin del suero y titulo del mismo en cada
tubo. Estos tubos conformarn la primera corrida A y se utilizarn para realizar el
ensayo en medio salino, protico y Coombs.
2. Enseguida marcar 10 tubos de Kahn en igual forma. Estos ltimos, conforman la
segunda corrida B y en ellos se realiza la prueba en medio enzimtico.
3. Agregar 2 gotas de Suero Fisiolgico a los 10 tubos de la primera corrida con una
pipeta Pasteur de borde liso y en un ngulo de 90.
4. Secar bien la pipeta y agregar dos (2) gotas del suero a titular en el primer tubo de
la primera corrida con la misma pipeta y con el mismo ngulo (para titular Acs antiA o anti-B de tipo IgG, el suero debe ser previamente neutralizado para dejarlo
libre de Acs anti-A y anti-B de tipo IgM).
5. Mezclar bien este primer tubo aspirando y soltando el lquido con la pipeta Pasteur,
evitando la formacin de burbujas.
6. Aspirar todo el lquido del tubo y transferir una (1) gota al primer tubo de la
segunda corrida, dos (2) gotas al segundo tubo de la primera corrida y devolver 1
gota al tubo inicial.
7. Proceder en la misma forma hasta el final y guardar en otro tubo las ltimas dos
(2) gotas por si es necesario proseguir la titulacin.
8. Agregar una (1) gota de Bromelina o Papenzima a los tubos de la segunda corrida
con la misma pipeta previamente enjuagada (o usar GR ficinados).
9. Para titular anticuerpos anti-D, agregar una (1) gota de la suspensin de GR O Rh
positivo a los tubos de ambas corridas con la misma pipeta previamente
enjuagada con suero fisiolgico (si se trabaja con ficina los GR de la segunda
corrida deben ser previamente ficinados).
10. Para titular anticuerpos anti-A, agregar una (1) gota de la suspensin de GR A a
los tubos de ambas corridas con la misma pipeta previamente enjuagada con
suero fisiolgico (si se trabaja con ficina los GR de la segunda corrida deben ser
previamente ficinados).

50

11. Para titular anticuerpos anti-B, agregar una (1) gota de la suspensin de GR B a
los tubos de ambas corridas con la misma pipeta previamente enjuagada con
suero fisiolgico (si se trabaja con ficina los GR de la segunda corrida deben ser
previamente ficinados).
12. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
13. Centrifugar todos los tubos a 1.000 rpm por 1 minuto o a 3.400 rpm por 20
segundos.
14. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinacin macroscpica. La lectura del ttulo debe iniciarse desde el tubo 10 al
1 para evitar leer precipitadamente los primeros tubos como negativos y omitir el
resto que pueden ser en realidad positivos. Esto ocurrira en caso de existir el
fenmeno de prozona. Desechar los tubos de la segunda corrida (medio
enzimtico).
15. Los resultados deben ser anotados inmediatamente al realizar la lectura de cada
tubo y expresar en cruces el grado de aglutinacin.
16. Agregar dos (2) gotas de Albmina de Bovino al 22-30% a todos los tubos de la
primera corrida que arrojen resultado negativo.
17. Incubar en Bao Mara (37 C) durante 15 minutos.
18. Centrifugar todos los tubos a 1.000 rpm por 1 minuto o a 3.400 rpm por 20
segundos.
19. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe o no
aglutinacin macroscpica frente a una fuente de luz, efectuando la lectura en la
forma antes mencionada.
20. Efectuar test de Coombs, a los tubos de la primera corrida que den resultado
negativo con albmina de bovino al 22-30%, lavando 4 veces los eritrocitos con
suero fisiolgico y eliminando la mayor cantidad posible de sobrenadante, agregar
una (1) gota de Suero de Coombs despus del ltimo lavado.
21. Centrifugar en la forma acostumbrada y remover suavemente los eritrocitos
sedimentados para observar si existe o no aglutinacin macroscpica.

Interpretacin:
La primera lectura de la primera corrida, en que el suero a titular est en contacto solo con
suero fisiolgico y GR O, GR A o GR B corresponde al medio salino, por lo tanto
determina el ttulo de los anticuerpos de tipo IgM. La lectura tanto en medio albuminoso,
enzimtico y Coombs, determina el ttulo de anticuerpos IgG.
51

Notas:

La titulacin tambin puede efectuarse usando pipetas de 1 ml graduadas en 0,1

ml, en este caso debe pipetearse 0,1 ml tanto de suero fisiolgico, suero a titular y
los GR que correspondan.

Si desea titularse un anticuerpo diferente al anti-D, debe tener la precaucin de

que este antgeno est presente en los GR del pool O Rh positivo.

Consideraciones: Las mismas que para titulacin IgM.

Existen mltiples razones por las que este mtodo de cuantificacin de

anticuerpos, da valores slo aproximados de su concentracin:

Solo determina la cantidad de anticuerpo unido al GR, y no la cantidad total

existente en el suero.

Tiene mucha influencia la afinidad del anticuerpo por el antgeno, por ejemplo: si
dos sueros tienen la misma concentracin de un anticuerpo, para uno de ellos
tiene una constante de afinidad 10 veces mayor, tendr un ttulo aproximadamente
10 veces superior que el otro.

Se ignora el factor de dilucin que introduce la adicin de suspensin de GR.

Se informa como el recproco de la ltima dilucin positiva, pero el valor real del
ttulo puede estar sobre el ltimo valor positivo y bajo el primer valor negativo.

52

TECNICA DE ADSORCION
Fundamento:
Los anticuerpos pueden extraerse del suero por adsorcin a glbulos rojos portadores de
los antgenos correspondientes. Cuando los anticuerpos se fijan a los antgenos de la
membrana y se separa el suero de las clulas, los anticuerpos especficos permanecen
unidos a los glbulos rojos. Es factible extraer estos anticuerpos por elucin.
Esta tcnica es til en los siguientes casos:
a. Separacin de anticuerpos mltiples presentes en el suero.
b. Eliminacin de la actividad de autoanticuerpos para permitir la deteccin de
aloanticuerpos coexistentes.
c. Eliminacin de anticuerpos no deseados (a menudo anti-A y/o anti-B) de un suero
que contiene anticuerpos apropiados para su empleo como reactivos.
d. Confirmacin de la presencia de la presencia de antgenos eritrocitarios
especficos por su capacidad de extraer los anticuerpos de la especificidad
correspondiente, del suero ya caracterizado.
Materiales

Centrfuga.
Bao Mara.
Fuente luminosa
Gradilla plstica.
Tubos de Khan o de ensayo pequeos (12 x 75 mm)
Pipetas plsticas Pasteur de borde parejo.

Reactivos

Glbulos rojos portadores de los antgenos correspondientes

a la especificidad de los anticuerpos a adsorber.

Muestra

Mtodo

Suero con los anticuerpos a adsorber.

1. Lavar los glbulos rojos por lo menos tres veces con solucin salina.
2. Despus del ltimo lavado, centrifugar los glbulos rojos durante por los menos 5
(cinco) minutos a 3000 rpm y eliminar el sobrenadante. La solucin salina
remanente podra extraerse tocando la masa de glbulos rojos con papel filtro.

53

3. Mezclar volmenes apropiados de glbulos rojos concentrados y suero a incubar a

la temperatura deseada durante 30 a 60 minutos.
4. Durante la incubacin, mezclar en forma peridica.
5. Centrifugar los glbulos rojos durante 5 (cinco) minutos a 3000 rpm para
condensarlos. Si es factible, centrifugar a la temperatura de incubacin, para evitar
la disociacin de los anticuerpos de la membrana eritrocitaria.
6. Transferir el sobrenadante el suero adsorbido a un tubo de ensayo limpio. Si se
planea preparar un eluato, conservar los glbulos rojos.
7. Evaluar una alcuota de suero adsorbido, en lo posible con una alcuota adicional
de las clulas usadas en la adsorcin para verificar si se eliminaron todos los
anticuerpos.
Interpretacin

Si la reactividad persiste, los anticuerpos no se eliminaron por completo.

La ausencia de reactividad significa que los anticuerpos se adsorbieron por

completo.

Notas

1. La adsorcin es ms efectiva si el rea de contacto entre los glbulos rojos y el

suero es amplia; se aconseja emplear tubos gruesos (13 mm o ms).
2. La eliminacin completa de los anticuerpos podra requerir adsorciones mltiples,
pero este procedimiento incrementa la posibilidad de dilucin del suero y
atenuacin de los anticuerpos no adsorbidos.
3. Para repetir la adsorcin se utiliza una nueva alcuota de clulas y no la de la
previa.
4. En el caso de antgenos resistentes a las enzimas, es factible pretratar las clulas
adsorbentes para aumentar la captacin de anticuerpos.

54

TECNICA DE ELUCION DE ANTICUERPOS

Fundamento

El objetivo de las tcnicas de elucin es interferir con las fuerzas de ligadura no covalente
que fijan los complejos antgeno-anticuerpo a la superficie de los glbulos rojos. La
membrana celular puede alterarse con calor, ultrasonido, congelacin-descongelamiento,
detergentes o solventes orgnicos. Las fuerzas de ligadura de los complejos antgenoanticuerpo pueden anularse modificando el pH o la concentracin de sales.
Principio

La elucin por calor es la ms apropiada para la investigacin de la enfermedad

hemoltica del recin nacido por incompatibilidad ABO y la elucin de los anticuerpos IgM
de los glbulos rojos. No debe emplearse en el estudio de alteraciones causadas por auto
o aloanticuerpos de tipo IgG.
Las tcnicas de elucin son tiles para:
1. Investigar los TCD positivos. Demuestra e identifica anticuerpos que se encuentran
en los glbulos rojos de un recin nacido con enfermedad hemoltica. Si no se
cuenta con suero de la madre, el eluato puede usarse para pruebas de
compatibilidad.
2. Demostrar e identificar anticuerpos causantes de anemias hemolticas adquiridas
(autoinmunes).
3. Aislar un anticuerpo de una mezcla de ellos.
4. Concentrar y purificar anticuerpos, detectar antgenos de expresin dbil e
identificar especificidades mltiples.
5. Preparar glbulos rojos sin anticuerpos para fenotipificacin o estudios de
adsorcin autlogos.
Materiales

Centrfuga.
Bao termorregulable
Fuente luminosa
Gradilla plstica.
Tubos de Khan o de ensayo pequeos (12 x 75 mm)
Pipetas plsticas Pasteur de borde parejo

Muestra

Glbulos rojos concentrados TCD positivo.

Reactivos

Suero fisiolgico.
55

Albmina bovina al 6% que se prepara diluyendo albmina

bovina al 22% o 30% con solucin salina (para estabilizar los
eluatos).
Sobrenadante salino del lavado final de los glbulos rojos en
estudio.
Mtodo

1. Lavar 6 (seis) veces una cantidad de 2 ml de glbulos rojos de la muestra

utilizando solucin salina fra a 4C. Guardar el ltimo sobrenadante.
2. Mezclar volmenes iguales de glbulos rojos concentrados lavados y suero
fisiolgico en un tubo de Khan.
3. Incubar durante 10 (diez) minutos a 56C. Agitar suavemente en forma peridica.
4. Centrifugar rpidamente durante 2 (dos) a 3 (tres) minutos a 1000 rpm, si es
factible en una centrfuga calentada.
5. Transferir de inmediato el eluato sobrenadante a un tubo limpio y evaluar en
paralelo con el sobrenadante salino del lavado final (punto 1).
Notas

1. Algunos anticuerpos IgM como los anti-A pueden disociarse de las clulas durante
los lavados. Para minimizar esta prdida de anticuerpos fijados, el lavado puede
realizarse con solucin salina fra (4C).
2. Los glbulos rojos sensibilizados deben lavarse con minuciosidad antes de la
elucin para evitar la contaminacin con anticuerpos sricos residuales. Si el suero
no contiene anticuerpos, el lavado con solucin salina podra ser innecesario. Si el
suero contiene ttulos altos de anticuerpos, se requieren seis lavados con solucin
salina o ms.
3. Puede comprobarse que la elucin fue completa realizando un test de
antiglobulina a los glbulos rojos.
4. Puede comprobarse que hay anticuerpos en el eluato realizando un test de
antiglobulina indirecto.
5. Para preparar los eluatos puede usarse suero AB o albmina de bovino al 6% en
vez de suero fisiolgico, excepto cuando se requiere elur anti A y/o anti B, ya que
estos anticuerpos puede neutralizarse.
6. Los eluatos pueden conservarse congelados para pruebas futuras. Los eluatos
salinos no se conservan bien por lo que se recomienda estudiarlos
inmediatamente.
56

Interpretacin

Con esta tcnica se obtienen glbulos rojos libres de anticuerpos, y anticuerpos en

solucin en el eluato; este anticuerpo debe identificarse para completar el estudio.

Si no hay anticuerpos en el eluato se deben revisar el sobrenadante del ltimo

lavado, ya que ste puede haber retirado previamente los anticuerpos.

57

DETERMINACIN DE ANTIGENOS DEL SISTEMA RH HR o FENOTIPO RH

(Genotipo ms probable)
Introduccin:
En 1943 Fischer y Race descubrieron que el sistema Rh estaba compuesto por
varios factores sanguneos que se heredaban en bloque ya que sus alelos ocupaban
locus muy cercanos en el cromosoma 1. De estos antgenos, los tres sistemas allicos
mas importantes son: D - d; C - c; E - e.
Debido a que el alelo d no ha podido ser demostrado ya que no se ha encontrado
un anticuerpo anti-d que evidencie el antgeno en los GR, al anotar "d" se est sealando
ausencia de "D" solamente y es por este motivo que no se puede afirmar un genotipo,
sino la probabilidad de l.
Con los antisueros especficos se determinan la presencia o ausencia de los
antgenos D, C, E, c y e en los GR (fenotipo) y se calculan las probabilidades genotpicas
de acuerdo a la frecuencia con que se asocian los alelos en el cromosoma (genotipo ms
probable).
Este examen tiene gran importancia en el estudio de paternidad, Enfermedad.
Hemoltica del R.N., en reacciones post-transfusionales, Antropologa, Gentica
poblacional, etc.

58

Frecuencia de las Combinaciones Genticas:

Fischer - Race

Wiener

COMPLEJO
GENTICO

ANTGENOS

GEN

FACTORES

FRECUENCIA

DCe

D,C,e

R1

Rho , rh ', hr''

40 %

dce

c,e

hr' , hr''

38 %

DcE

D,c,E

R2

Rho , hr' , rh''

14 %

Dce

D,c,e

R0

Rho , hr' , hr''

2% ,
46%

dCe

C,e

r'

rh' , hr''

1%

dcE

c,E

r ''

hr' , rh''

1%

DCE

D,C,E

Rz

Rho , rh' , rh''

0,2 %

dCE

C,E

ry

rh' , rh''

0,01 %

Mtodo

negro

Determinacin de Fenotipo Rho - Hr:

1. Preparar una serie de 5 tubos de Kahn marcados "D", "C", "E", "c", "e"
respectivamente.
2. Depositar una (1) gota de suero anti "D" en el tubo marcado "D"; una (1) gota de
suero anti "C" en tubo marcado "C"; una (1) gota de suero anti "E" en el tubo

59

marcado "E"; una (1) gota de suero anti "e" en el tubo marcado "e", y una (1) gota
de suero anti "c" en el tubo marcado "c".
3. Hacer una suspensin al 2 - 4% de los GR en estudio en su propio plasma o suero
y aadir una (1) gota a cada uno de los 5 tubos.
4. Incubar 15 minutos a 37C.
5. Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm, durante un minuto o a 3.400 rpm. durante 20
segundos.
6. Leer, los resultados positivos indican que el antgeno correspondiente est en esos
glbulos. Los resultados negativos deben seguir estudio posterior en los puntos
que siguen.
7. Incubar 30 minutos ms a 37C.
8. Lavar cuatro (4) veces con solucin salina. Despus del ltimo lavado eliminar
tanta solucin como sea posible y resuspender los eritrocitos en la que quede en
el tubo.
9. Agregar una (1) gota de suero de Coombs a cada tubo.
10. Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm, durante un minuto o a 3.400 rpm. durante 20
segundos.
11. Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y ver si hay aglutinacin
macroscpica.
12. Una vez obtenidos todos los resultados (fenotipo) calcular el genotipo ms
probable

60

Interpretacin

Determinacin de fenotipos basado en reacciones con 5 antisueros y clculo del

genotipo ms probable:

Fenotipo

CcDEe

CDe / cDE

CcDee

CDe / cde

ccDEe

cDE / cde

CCDee

CDe / CDe

ccDEE

cDE / cDE

ccDee

cDe / cde

ccee

cde / cde

61

Genotipo
Probable

ms

62