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    TP3 Tai

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    Este documento describe los fundamentos de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC), incluyendo la instrumentación, objetivo de separar una mezcla de uridina y uracilo, y procedimiento para evaluar cómo optimizar los resultados modificando variables como la velocidad de flujo y los porcentajes de solventes.

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    Tcnicas Analticas Instrumentales - Universidad Nacional de Quilmes

    Profesor: Gerardo M. Caballero


    Instructora: Carolina S. Martinez

    Trabajo Prctico N3
    Fundamentos de Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC)
    INTRODUCCIN
    La

    cromatografa

    lquida

    de

    alta

    presin

    (High

    Performance/Pressure

    Liquid

    Chromatography: HPLC) se realiza con partculas de tamao pequeo (5-10 m), lo que
    aumenta la superficie de contacto entre la fase mvil y la fase estacionaria; el aumento de
    equilibrios entre ambas fases incrementa la capacidad de resolver muestras complejas.

    Instrumentacin.
    Bomba B
    Precolumna

    Mezclador

    SvB

    Columna

    Desgasificador
    Bomba A

    Inyector

    Detector

    Sistema
    de
    registro

    SvA

    i) Reservorios para solvente y sistema para desgasificado. Si hay gases disueltos en la fase
    mvil, como oxgeno y nitrgeno, se forman burbujas en la columna y en el sistema de
    deteccin causando el ensanchamiento de las picos. Por ello, se desgasifican los solventes
    hacindolos pasar por un tubo capilar permeable a los gases que est conectado a un
    sistema de vaco. Si el HPLC no contara con esta opcin, es posible desgasificar los
    solventes agitndolos cuidadosamente mientras estn conectados a una bomba de vaco.
    ii) Bombas. La presin de salida de estas bombas va desde 70 kg/cm2 - 420 kg/cm2. En
    general la presin mxima de trabajo est dada por la mxima presin que la fase
    estacionaria de la

    columna puede

    soportar sin

    modificar sus

    condiciones de

    empaquetamiento.
    iii) Sistemas de inyeccin. Los inyectores incorporan la muestra de inters al equipo para
    que la misma sea movilizada por la fase mvil a la precolumna, columna y finalmente al

    Tcnicas Analticas Instrumentales - Universidad Nacional de Quilmes


    Profesor: Gerardo M. Caballero
    Instructora: Carolina S. Martinez

    detector. Los inyectores pueden ser manuales o automticos. Los volmenes de inyeccin
    pueden variar entre 2-100 ul para sistemas analticos.
    iv) Precolumna y Columna. La precolumna evita la contaminacin de la columna ya que
    funciona como un filtro de retencin de material particulado. Luego en la columna ocurre
    la separacin de la muestra. Las longitudes habituales de las mismas van desde 5 a 45cm y
    su dimetro vara entre 2-5 mm.
    Los tipos de columnas ms utilizados son:
    -fase normal (fase estacionaria polar) por ej (SiO2)n, Al2O3, etc...
    -fase reversa (fase estacionaria no polar) por ej C8, C18.
    -intercambio inico.
    -exclusin molecular.
    v) Detectores. Los detectores ms habituales son: 1) absorcin UV-Vis, 2) ndice de
    refraccin, 3) fluorescencia, 4) conductimetra y 5) espectrometra de masas.

    OBJETIVO
    Separar una mezcla de Uridina (nucleosido) y Uracilo (base); evaluar cmo optimizar los
    resultados del cromatograma modificando variables como la velocidad de flujo y los
    porcentajes de distintos solventes.

    Uracilo

    Uridina

    PROCEDIMIENTO
    Materiales.
    -Equipo HPLC Gilson 321/322 de inyeccin automtica acoplado a detector Gilson
    -Columna LichroCART Purospher STAR RP-18 endcapped (5 m), pH: 1,5 10,5
    -Solventes grado HPLC: Metanol y Agua desionizada y filtrada
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    Tcnicas Analticas Instrumentales - Universidad Nacional de Quilmes


    Profesor: Gerardo M. Caballero
    Instructora: Carolina S. Martinez

    -Muestra: Uridina/ Uracilo


    Condiciones de corrida.
    a) 95:5 Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min. Ura 1mM Uri 1mM.
    b) 90:10 Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min. Ura 1mM Uri 1mM.
    c) 85:15 Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min. Ura 1mM Uri 1mM.
    c) 85:15 Agua:Metanol a flujo 0,7 ml/min. Ura 0.5mM + Uri 0.5mM.
    d) 85:15 Agua:Metanol a flujo 0,5 ml/min. Ura 0.5mM + Uri 0.5mM.
    Metodologa.
    1. Colocar en la gradilla de inyeccin un vial con 150 ul de una solucin 1mM segn
    corresponda
    2. Inyectar las muestras
    3. Llevar a cabo la elucin en condiciones isocrticas segn flujo correspondiente
    4. Obtener los cromatogramas de cada inyeccin

    ANLISIS DE DATOS
    - Determinar las condiciones ptimas de corrida para cada sistema.
    - Describir detalladamente la influencia de cada variable ensayada.
    - Indicar como podra optimizar an ms la resolucin de los sistemas descriptos.
    - Cul es el principio de las columnas de afinidad?

    BIBLIOGRAFA.
    -HPLC of macromolecules, A practical approach. R. W. A. Oliver
    -Anlisis Instrumental. D.A. Skoog, D. H. West. 4 edicin.

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