Obtención de Semilla Biotecnológica de Caña de Azúcar
Obtención de Semilla Biotecnológica de Caña de Azúcar
Obtención de Semilla Biotecnológica de Caña de Azúcar
ISSN: 0123-3475
[email protected]
Universidad Nacional de Colombia
Colombia
Arellano-Litardo, Ana C.; Korneva, Sofa B.; Fischer, Fanny C.; Tola, Nataly A.; RamosLeal, Miguel; Pincay-Flores, Astolfo
Obtencin de semilla biotecnolgica de caa de azcar (Saccharum spp. hbrido) de alta
calidad gentica y fitosanitaria en el Ecuador
Revista Colombiana de Biotecnologa, vol. XVII, nm. 1, junio, 2015, pp. 101-110
Universidad Nacional de Colombia
Bogot, Colombia
ARTCULO DE INVESTIGACIN
Resumen
Los mtodos de saneamiento de plantas se basan fundamentalmente en el empleo combinado de cultivo in vitro de meristemos con tratamientos mediante hidrotermoterapia. Este trabajo se realiz con el objetivo de obtener plantas para usar
como semilla libre de patgenos sistmicos, con nfasis en la enfermedad raquitismo de los retoos de la caa de azcar
(RSD). El trabajo se llev a cabo con diferentes cultivares de caa de azcar, los cuales fueron previamente identificados
mediante marcadores bioqumicos basados en los patrones electroforticos de isoenzimas peroxidasas. El saneamiento
se realiz en tres etapas sucesivas mediante tratamiento hidrotrmico a 52 oC durante 2h y uso del fungicida vitavax, un
segundo tratamiento hidrotrmico a los meristemos a 51 oC durante 10 min y una tercera etapa donde las vitroplntulas
se propagaron en presencia del antibitico gentamicina. La deteccin de RSD se efectu mediante el empleo de la tcnica
de tincin de haces vasculares funcionales. Los resultados permitieron la creacin de un banco de germoplasma de plantas libres de los principales patgenos bacterianos sistmicos y con alta calidad gentica, lo que aport semilla bsica de
excelente calidad para establecer semilleros. La conservacin incluy el mantenimiento de plntulas in vitro y la creacin
de un banco de ADN que permite conservar el genofondo en condiciones de laboratorio. Se propone finalmente una
metodologa para la obtencin de plantas saneadas a partir de yemas y meristemos.
Palabras clave: Saccharum spp.; saneamiento; cultivo de yemas; meristemo.
Abreviaturas: BAP: 6-benzyl-aminopurina; LSD: Escaldadura foliar; RSD: Raquitismo de los retoos; VMCA: Virus del mosaico de la caa de azcar; THV: tincin de los haces vasculares;
Abstract
Methods for obtaining healthy plants are mainly based on the combined use of meristem in vitro culture and hydrothermotherapy. This work was carried out in order to obtain free- pathogen plants for using as seeds, emphasizing ratoon
stunting disease (RSD) of sugarcane. The work was performed using a group of sugarcane cultivars, which was confirmed
the variety identification by means of peroxidases isozymes electrophoretic patterns. Plant sanitation was performed in
three successive steps by means of hydrothermal treatment at 52 oC during 2h and using the fungicide vitavax, a second
*
Centro de Investigacin y Desarrollo, Unin Nacional de Caicultores del Ecuador (UNCE). Cantn El Triunfo, va Durn- Tambo km 53,
Guayas, Ecuador.
** Centro de Investigaciones Biotecnolgicas del Ecuador (CIBE). Escuela Superior Politcnica del Litoral (ESPOL), Guayaquil, Ecuador.
. Fallecida el 7 de septiembre de 2013.
*** Laboratorio de Biotecnologa, Dpto. Microbiologa y Virologa, Facultad de Biologa, Universidad de La Habana (UH), Cuba
Direccin actual: Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT). Ave. 7ma. No. 3005 e/30 y 32, Miramar, La Habana, Cuba. Telf.
(53-7)2025526 [email protected].
**** Presidente UNCE. A quien debe dirigirse la correspondencia [email protected].
Rev.
Semilla
Colomb.
biotecnolgica
Biotecnol.deVol.
caa
XVII
deNo.
azcar
1 Junio
2015 101-110
101
hydrothermal treatment at 51 C during 10 min to the meristem and a third step in which vitroplantlets were propagated
in presence of the antibiotic gentamicin. RSD detection was done by using the staining transpiration methods (STM) of
functional bundles. Results allowed the creation of a germoplasm bank of sugarcane plants free of the most important systemic bacterial pathogens, with high genetic quality, which provided basic seed of excellent quality for establishing seedlings.
Conservation included an in vitro-plantlets bank and the creation of a DNA bank which allows preserving the genetic fond
in laboratory conditions. Finally a methodology for obtaining free-pathogens plants from buds and meristems is included.
Key words: Saccharum spp.; plant sanitation; culture of buds; meristem.
Recibido: noviembre 28 de 2014
Introduccin
La conservacin y el mantenimiento de los recursos
genticos de un pas, adems de ser un derecho soberano, es una necesidad que permite la manipulacin
sobre el germoplasma de un cultivo en cuestin.
El trmino germoplasma se refiere al material que se
conserva como semillas, cultivo de tejido o plantas
establecidas en colecciones de campo que rene la
variabilidad gentica intra-especfica de los materiales
genticos que pueden perpetuar una especie o una poblacin de un organismo. Existen diferentes formas de
conservar el germoplasma de un cultivo. Se destacan
entre ellas, la conservacin in situ en bancos, colecciones o jardines, la conservacin de tejidos y plantas
en medios de cultivos in vitro y la crio-conservacin,
tcnica que cobr desarrollo con el advenimiento de
las tcnicas de cultivo de tejido vegetal in vitro. De
estos mtodos, la conservacin in situ en bancos es la
forma ms comn, extendida y fcil de llevar a cabo
(Demey, 2008).
En aras de resolver las necesidades crecientes de alimento, el hombre ha logrado incrementar las producciones de los diferentes cultivos agrcolas de inters.
En este afn, el mejoramiento de las especies vegetales para casi todos los cultivos de inters econmico
ha conllevado el uso reiterado de las mejores variedades, cepas o lneas en trabajos de mejora gentica.
Esto ha causado que muchas de las variedades obtenidas estn emparentadas entre s, lo que provoca una
estrecha base gentica. Una forma de resolver esta
situacin es el empleo de diversas formas genticas
cercanas a la especie en cuestin, que aportan rusticidad en dicho proceso de mejora gentica.
medades para su posterior multiplicacin con fines comerciales, de investigacin y mejoramiento gentico.
Por el contrario, la propagacin de plantas no tratadas,
favorece la aparicin de otros focos de infeccin, lo
cual puede provocar epifitias y dao ambiental. Para el
caso del Ecuador, la enfermedad raquitismo de los retoos (RSD) causada por la bacteria Leifsonia xili ssp.
xili Davis resulta una de las principales enfermedades
sistmicas de inters para la caa de azcar.
El objetivo de este trabajo fue determinar la efectividad de los tratamientos que permitan obtener un
material inicial de caa de azcar bien identificado
y libre de enfermedades sistmicas para su posterior
propagacin acelerada, que permita el montaje de un
pequeo banco de germoplasma sano en un plazo relativamente breve.
Materiales y mtodos
El trabajo se desarroll en el Centro de Investigacin
y Desarrollo perteneciente a la Unin Nacional de Caicultores del Ecuador (UNCE), ubicado en el Cantn
El Triunfo km. 53 Va Duran Tambo, cuenca baja de la
Provincia del Guayas, sector Agua Santa, con una temperatura promedio anual de 25C, precipitacin media
anual de 1202,2 mm, humedad relativa del 80,1% y
una altura de 60 msnm, la ms importante regin azucarera del pas.
Identificacin de cultivares
102
Adicionalmente, se determin la presencia de sntomas correspondientes a la enfermedad sistmica escaldadura foliar, causada por la bacteria Xanthomonas
albilineans Ashby (Dowson).
Para la creacin del banco de ADN, se llev a cabo la
extraccin del material gentico de acuerdo a lo descrito por Doyle y Doyle en 1983.
Resultados y discusin
La identificacin de los cultivares utilizados mediante
los patrones de isoenzimas peroxidasas se muestra en
la figura 1. El patrn electrofortico de cada cultivar
result nico, como haba sido descrito anteriormente
(Arellano et al., 2012). La importancia de la identificacin de los cultivares obedece al hecho de evitar la presencia de mezclas varietales en los campos, situacin
que puede producir disminucin en los rendimientos
o la posibilidad de ataques inesperados por patgenos
en cultivares que son resistentes, pero mezclados con
otro que puede ser susceptible.
Los caracteres agro-morfolgicos descritos anteriormente estn conformados por caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual o medicin tales
como: color y altura del tallo, forma de la yema y de
los entrenudos, rendimiento, susceptibilidad o resistencia a stress hdrico, plagas o enfermedades. Estos
caracteres se definen como descriptores para cada
cultivo y son aprobados por los organismos internacionales encargados de ello.
En el caso de los caracteres bioqumicos y moleculares,
los descriptores estarn conformados por la expresin
genotpica a travs del patrn multi-banda observado
para cada individuo despus de su visualizacin mediante electroforesis de protenas o de productos de
amplificacin de la molcula de ADN. Debe sealarse
que en trminos de bancos de germoplasma, los marcadores bioqumicos y moleculares se han convertido
en uno de los descriptores ms tiles y ms empleados de los ltimos tiempos. En este sentido, la figura
1 constituye el descriptor bioqumico empleado para
el manejo de las variedades en estudio y que fue el
Figura 1. Patrones de electroforesis de isoenzimas peroxidasas de los cultivares de caa de azcar empleados en este trabajo. A)
patrn de electroforesis de isoenzimas peroxidasas; B) zimograma correspondiente al patrn electrofortico obtenido. Cultivar:
1: Ragmar; 2: CC85-92; 3: RD75-11; 4: SP70-1143; 5: CR74-250; 6: C87-51; 7: Mex64-1487; 8: BJ70-46
104
Total
Germinacin
%
germinacin
Ragnar
48
37
77.0
CC85-92
43
34
79.0
RD75-11
47
36
76.5
CR74-25O
42
25
59.5
BJ70-46
53
41
77.3
C87-51
41
27
95.8
SP70-1143
38
29
76.3
Mex 64-1487
52
31
59.6
105
A pesar de los controles en las condiciones experimentales, no fue posible disminuir las prdidas ocasionadas en esta etapa. Las excesivas manipulaciones del
material vegetal (manejo de instrumentos, calor excesivo, corte inadecuado del meristemo) pudieran ser
algunas de las causas de las prdidas. Estas prdidas en
la supervivencia no pueden vincularse a una reduccin
de la masa seca, la cual est asociada a la presencia
de brotes hiperhdricos. Segn Kevers et al. (2004), la
hiperhidricidad implica problemas de diferenciacin
celular, por lo que los brotes no pueden tener un de-
Tabla 2. Tratamiento trmico a meristemos de los cultivares de caa de azcar en estudio provenientes de las yemas tratadas.
Cultivar
106
Termoterapia (51C)
Supervivencia (%)
Meristemos
P0 (brotes)
P1 (brotes)
P2 (brotes)
Ragnar
37
30
81
26
80
37
CC85-92
34
29
90
20
68.9
20
RD75-11
36
27
75
21
77.7
21
CR74-25O
33
25
76
19
76
48
BJ70-46
41
28
68
19
68
35
C87-51
27
25
96
23
92
22
SP70-1143
29
23
79
20
86
20
Mex 64-1487
31
21
65.6
18
85.71
26
Tabla 3. Tratamiento con antibitico y nmero de plantas saneadas de los cultivares de caa de azcar en estudio
Cultivar
Plantas saneadas
Enraizamiento
P3 (brotes)
P4 (brotes)
P5 (brotes)
P6 (brotes)
Plantas
Ragnar
52
296
440
1024
1424
CC85-92
43
356
1014
2739
4383
RD75-11
67
144
408
992
2210
CR74-25O
116
438
1095
2209
3264
BJ70-46
59
114
350
800
1523
C87-51
61
140
322
966
2125
SP70-1143
20
88
203
632
1316
Mex64-1487
42
108
296
680
1855
107
Una posibilidad que brindan los bancos de germoplasma es conservar y mover material de alta calidad
fitosanitaria. La utilizacin de termoterapia junto a la
desinfeccin del material de trabajo, es una prctica
antigua pero muy eficiente para erradicar patgenos
que se mueven de forma sistmica a travs del vegetal. En el caso de trabajar con meristemos in vitro, su
pequeo tamao y su velocidad de propagacin disminuyen extraordinariamente la probabilidad de desarrollo de esos patgenos sistmicos, bacterias o virus
principalmente. Unido a esto, se conoce de la existencia de sustancias que actan impidiendo el desarrollo
de patgenos, en particular la presencia de guanina,
que segn estudios realizados, parece tener una accin antimicrobiana (Shuravlev, 1979).
La preservacin de los recursos fitogenticos entendidos stos como el material hereditario con valor
econmico, cientfico o social contenido en las especies, es de importancia capital en la lucha contra diferentes calamidades, como el hambre, la malnutricin
mundial, pero tambin el decaimiento gentico de los
cultivos y la prdida de diversidad gentica. Es aqu
donde juegan un papel importante los bancos de germoplasma y de genes. Los bancos de germoplasma
resguardan la fuente de variabilidad requerida por los
mejoradores de plantas para el desarrollo de cultivares
que permitan al agricultor superar las limitaciones naturales a fin de obtener mayores beneficios de su actividad, as como asegurar la fuente contra la erosin
gentica (Demey, 2008). Los estudios de la diversidad
gentica dentro de estos bancos de genes son una de
las herramientas que ayudan a tener un control ms
efectivo sobre la erosin gentica. Permiten definir los
patrones de variacin que determinan la incorporacin de individuos a programas de mejoramiento gentico, ya sea por sus caractersticas promisorias o por
susceptibilidad a condiciones biticas o abiticas, facilitando la incorporacin de genes y el establecimiento
de la mejor estrategia reproductiva. Esto garantiza la
elevada calidad gentica.
Un importante aspecto que se debe tambin sealar
como resultado de este trabajo es el mantenimiento
de un Banco de germoplasma in vitro con las variedades que hay en el banco in situ en el campo. Aunque
no se muestran detalles en este trabajo, como complemento de sto, el genofondo se conserv a travs del
mantenimiento del ADN a temperaturas de -20 oC durante tiempos prolongados. Esta creacin de los bancos in vitro y del banco de ADN permite conservar el
material gentico en espacios muy reducidos, durante
largos periodos con independencia de las condiciones
ambientales.
Finalmente, se propone una metodologa de obtencin de material agmico de caa de azcar, donde se
combinan el tratamiento hidrotrmico con el cultivo
de yemas mediante la micropropagacin de meristemos en diferentes etapas. Esta propuesta de metodo108
Conclusiones
Se propone una metodologa para obtencin de semilla
de alta calidad gentica, que combina los tratamientos
hidrotrmicos con las manipulaciones de los meristemos, los cuales favorecen el proceso de saneamiento.
Se estableci un banco de donantes que sirve como
material para plantar semilleros de semilla bsica, que
permita controlar la diseminacin de algunas enfermedades sistmicas como el RSD.
Recomendaciones
Se recomienda completar con mtodos moleculares
basados en la reaccin en cadena de la polimerasa
Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XVII No. 1 Junio 2015 101-110
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Asistencia Oficial
para el Desarrollo de Japn y al Ministerio de Agricultura, Ganadera, Acuacultura y Pesca (MAGAP) por el
financiamiento a partir del Proyecto 2KR; tambin a la
Unin Nacional de Caicultores del Ecuador (UNCE),
por el apoyo financiero y las facilidades para el desarrollo de este trabajo. Agradecemos igualmente al
Ing. Rodolfo Samaniego, al Ing. Carlos A. Ochoa y a
Jorge Franco por su ayuda invaluable en diferentes etapas del trabajo. M. Ramos-Leal agradece al acuerdo
de colaboracin Biotecnologa de la caa de azcar
y empleo de residuos de la agro-industria azucarera,
entre el Laboratorio de Biotecnologa del Dpto. Microbiologa y Virologa de la Facultad de Biologa de la
Universidad de La Habana, la UNCE y las Facultades
de Ciencias Agrarias y Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil, Ecuador, que ha permitido realizar
parte de este trabajo.
Referencias bibliogrficas
Arellano, A.C., Korneva, S.B., Fischer, F.C., Cabanilla, L., Tola, N.,
Ochoa, L.A., Ramos- Leal, M. y Pincay, A. (2009). Micropropagacin de caa de azcar en Ecuador. Revista Biotecnologa
Vegetal, 9(4), 235-238
Arellano, A.C., Ramos-Leal, M., Korneva, S., Pilco, J., Chvez, G., Cabrera, C. y Pincay, A. (2011). Evaluacin de la resistencia a la
roya parda (Puccinia melanocephala Syd.) de somaclones de
caa de azcar (Saccharum spp. hbrido) obtenidos en el Ecuador. Rev. Fitosanidad, 15(4), 245-250
Arellano, A.C., Ramos-Leal, M., Loor, Z., Cabanilla, L., Korneva, S.B.
y Pincay, A. (2012). Identificacin de cultivares comerciales de
caa de azcar (Saccharum spp. hbrido) mediante el empleo
de isoenzimas peroxidasas. Revista CENIC Ciencias biolgicas,
43(3).
CINCAE. (2011). Informe Anual del Centro de Investigaciones de la
Caa de Azcar del Ecuador. Manejo de Enfermedades, 12-17.
Chagas, P.R.R., Tokeshi, H. (1994). Staining by transpiration method
for the diagnosis of ratoon stunting disease in sugarcane. In Rao
GP, Gillespie A, Upadhyaya P, Filho B, Agnihotri V, (eds.) Current Trends in Sugarcane Pathology, New Delhi, India, 159-162
Chinea, A. y Prez, J.R. (1997). Secuencia y manejo de la hidrotermoterapia para el control de enfermedades de la caa de azcar. Rev. Asociacin de Tcnicos Azucareros de Cuba (ATAC),
1, 31-34.
Costet, L., Le Cunff, L., Royaert, S., Raboin, L.M., Hervouet, C., Toubi,
L., Telismart, H., Garsmeur, O., Rousselle, Y., Pauquet, J., Nibouche, S., Glaszmann, J.C., Hoarau, J.Y. and DHont, A. (2012).
Haplotype structure around Bru1 reveals a narrow genetic
basis for brown rust resistance in modern sugarcane cultivars.
Theoretical and applied genetics, 125(5), 825-36.
Demey, J.R. (2008). Diversidad gentica en bancos de germoplasma: un enfoque biplot. Disertacin de Tesis doctoral. Univ. Salamanca, Espaa, 244 p.
Graur, D. and Wen-Hsiung, R.I. (2000). Fundamentals of Molecular
Evolution. Sinauer Associates Inc. USA, 481p.
Harrison, N.A. and Davis, M.J. (1988). Colonization of vascular
tissues by Clavibacter xyli subsp. xyli in stalks of sugarcane
109
110