PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE a-AMILASA

DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE

FERMENTACIN EN FASE SLIDA
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF a-AMYLASE FROM
PENICILLIUM COMMUNE PRODUCED BY SOLID STATE
FERMENTATION
PURIFICAO E CARACTERIZAO DA a-AMILASA DE PENICILLIUM
COMMUNE PRODUZIDA MEDIANTE FERMENTAO EM FASE SLIDA
Esperanza Espinel1,2, Elizabeth Lpez1,3

Recibido: 17/12/08 Aceptado: 21/08/09

Este estudio reporta la purificacin y caracterizacin parcial de una a-amilasa

producida por Penicillium commune mediante fermentacin en fase slida, empleando yuca blanca colombiana (Manihot esculenta Crantz) como soporte. La
enzima fue purificada por precipitacin
fraccionada con sulfato de amonio, cromatografa de intercambio aninico
(DEAE-Sephadex A-50), cromatografa
de filtracin por gel (Sephadex G-75) y
cromatografa de intercambio catinico
(CM-Sephadex C-50) obteniendo una actividad especfica final de 314,82 U/mg,
un grado de purificacin del orden de 62 y
un rendimiento de 9%. La purificacin
hasta la homogeneidad fue confirmada
por SDS-PAGE. El peso molecular estimado fue 35 kDa. La enzima mostr m-

xima actividad de hidrlisis de almidn

soluble con pH 6,0, y estabilidad en un intervalo de pH de 5,0-7,0. La estabilidad
trmica de la enzima se present en el intervalo de temperatura 0-50 C y su temperatura ptima fue 70 C. Los iones
Ca2+, Ba2+ y Ag+ aumentaron significativamente la actividad de la enzima, siendo
el in Ca2+ el que tuvo el ms alto poder
activador. Cu2+ no alter significativamente la actividad de la enzima, mientras
que Li+ y Fe3+ la disminuyeron ligeramente (13%), y Co2+ y Hg2+ la disminuyeron 25% y 40% respectivamente. Los
valores de Km y Vmx fueron calculados
usando la linealizacin de LineweaverBurk, con el resultado Km = 0,48 mg/mL
y Vmx = 5,85 mmol glucosa/min. Entre
los principales productos de hidrlisis del
almidn de yuca se encuentran la maltosa

Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot. Bogot, Colombia.

Direccin actual Colegio Marruecos y Molinos IED, SED. Bogot, Colombia. [email protected]

[email protected]

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y la glucosa, este resultado proporciona

evidencia de que la enzima es capaz de
romper los enlaces glicosdicos a-1,4 del
almidn, comportamiento caracterstico
de una a-amilasa.
a-amilasa, Penicillium commune, fermentacin en fase slida, yuca blanca colombiana.

This study reports the purification and

partial characterization of an a-amylase
from Penicillium commune produced by
solid state fermentation using colombian
white tapioca (Manihot esculenta Crantz)
as support. The enzyme was purified by
ammonium sulphate precipitation, anion
exchange chromatography (DEAE-Sephadex A-50), gel filtration chromatography (Sephadex G-75) and cation exchange chromatography (CM-Sephadex
C-50). A purification factor of 62 with a
9% yield and final specific activity of
314.82 U/mg were recorded. Purification
to homogeneity was confirmed by SDS
PAGE. The molecular weight was estimated to be 35 kDa. The enzyme shows
maximal activity in the soluble starch
hydrolysis at pH 6.0, and is stable in a
range of pH from 5.0 to 7.0. Thermal stability was in the range of temperature
from 0 to 50 C, and its optimal temperature was 70 C. Ions Ca2+, Ba2+ and Ag+
significantly increase the activity of the
enzyme, with ion Ca2+ as the highest activator. Cu2+ does not alter significantly
the activity of the enzyme, whereas Li+
and Fe3+ decrease it slightly (13%) and
Co2+ and Hg2+ decrease it 25% and 40%
respectively. Km = 0.48 mg/mL and Vmax
= 5.85 mol glucose/min were calculated using the linearization of Linewea-

192

ver-Burk. Among hydrolysis products of

tapioca starch are maltose and glucose,
this result provides evidence of the enzyme ability to hydrolyze the starch a-1,4
glucosidic linkages, a characteristic
behavior of an a-amylase.
a-amylase, Penicillium
commune, solid state fermentation, colombian white tapioca.

Este estudo reporta a purificao e caracterizao parcial de uma a-amilasa produzida por Penicillium commune mediante fermentao em fase slida usando
mandioca branca colombiana (Manihot
esculenta Crantz) como suporte. A enzima foi purificada por precipitao fraccionada com sulfato de amnio, cromatografia de intercambio aninico (DEAESephadex A-50), cromatografia de filtrao por gel (Sephadex G-75) e cromatografia de intercambio catinico (CMSephadex C-50) obtendo una actividade
especfica final de 314.82 U/mg, um grau
de purificao na ordem de 62 e um rendimento de 9%. A purificao at homogeneidade foi confirmada por SDSPAGE. O peso molecular estimado foi de
35 kDa. A enzima mostrou mxima actividade de hidrlises de amido solvel a
pH 6.0, e estabilidade num intervalo de
pH de 5.0-7.0. A enzima foi estvel num
intervalo de temperatura de 0-50 C, e
sua temperatura ptima de reaco foi de
70C. ons Ca2+, Ba2+ e Ag+ aumentaram significativamente a actividade da
enzima, sendo o io Ca2+, o que teve o
mais alto poder indutor. Cu2+ no alterou
significativamente a actividade da enzima, enquanto que Li+ e Fe3+ a diminuram ligeiramente (13%), e Co2+ e Hg2+ a

diminuram 25% e 40% respectivamente.

Os valores de Km e Vmx foram calculados
usando a linearizao de Lineweaver-Burk, obtendo Km = 0.48 mg/mL e
Vmx = 5.85 mmol glucosa/min. Entre os
principais produtos de hidrlises do amido de mandioca encontram-se a maltosa e
glucosa; este resultado proporciona evidencia de que a enzima capaz de romper
os enlaces glucosdicos a-1,4 do amido,
comportamento caracterstico de uma
a-amilasa.
a-amilasa, Penicillium commune, fermentao em fase slida, mandioca branca colombiana.

Las a-amilasas son enzimas que catalizan

al azar la hidrlisis de enlaces glicosdicos a-1,4 de polisacridos como el almidn y el glicgeno, para producir maltosa, oligosacridos de diferentes tamaos
y cadenas ms o menos ramificadas llamadas dextrinas lmite (1). Son de gran
importancia en la industria alimenticia,
textil, papelera y farmacolgica, y aunque las fuentes productoras de a-amilasas
incluyen plantas, animales y microorganismos, son las enzimas microbianas las
que encuentran mayor demanda en aplicaciones industriales (2). Tradicionalmente la produccin de a-amilasas se ha
llevado a cabo mediante procesos de fermentacin lquida sumergida (FLS) debido al mayor control de factores ambientales como temperatura y pH, sin embargo,
la fermentacin en fase slida (FFS)
constituye una alternativa interesante
puesto que los metabolitos se concentran,
y los procesos de purificacin son menos
costosos (3, 4). Los medios empleados en
FFS son semejantes en textura al hbitat

natural de hongos filamentosos como Penicillium commune, lo que genera

mayores rendimientos en la produccin
de enzimas y la mnima degradacin por
accin de proteasas (5).
Cada una de las aplicaciones industriales de las a-amilasas requiere propiedades nicas respecto a especificidad, estabilidad, temperatura y dependencia del
pH (6), y la bsqueda de enzimas que presenten propiedades diferentes a las conocidas se mantiene como un tema de inters en investigacin.
Recientemente se ha reportado la produccin de a-amilasa por hongos del gnero Penicillium (7, 8), sin embargo, en
estos trabajos no se lleva a cabo la purificacin y posterior caracterizacin de la
enzima, etapas fundamentales para establecer su potencial en aplicaciones biotecnolgicas.
En esta publicacin se describe la produccin, purificacin y caracterizacin cintica de una a-amilasa obtenida a partir
de una cepa nativa de Penicillium commune mediante fermentacin en fase slida,
empleando yuca blanca colombiana (Manihot esculenta crantz) como soporte.

Una cepa de Penicillium sp. fue donada

por el laboratorio de microbiologa del departamento de farmacia de la Universidad
Nacional de Colombia. El microorganismo se mantuvo a temperatura ambiente en
medio Saboraud agar-maltosa 4%. El almidn de yuca empleado fue adquirido en
Ciacomeq Ltda., Bogot, Colombia. La
yuca (Manihot esculenta Crantz) fue com-

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prada en un supermercado en Bogot y fue

rallada manualmente luego de retirar la
cscara empleando un rallador de plstico
domstico convencional.

La identificacin se realiz mediante tcnicas de biologa molecular en el laboratorio de micologa y fitopatologa

(LAMFU) de la Universidad de los
Andes de Bogot. El Penicillium sp. fue
crecido en medio lquido SDY (sucrosa,
dextrosa y extracto de levadura) (9). A
partir de la biomasa generada se realiz
una extraccin de ADN total a travs del
mtodo de extraccin por fenol-cloroformo (10). Posteriormente, se amplific por PCR la regin ITS1- 5,8S-ITS2
de la subunidad ribosomal, con los cebadores universales ITS4 e ITS5 (11). La
regin amplificada fue secuenciada por
la compaa Macrogen (Sel, Corea). La
identificacin molecular se realiz comparando la secuencia obtenida contra todas las secuencias nucleotdicas de hongos reportadas en la base de datos del
NCBI (National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.
nlm.nih. gov), los anlisis bioinformticos
se hicieron utilizando el algoritmo Blastn.
Los alineamientos con mayor puntaje y mxima identidad obtenidos (E value = 0;
identidad 100%) permiten identificar el microorganismo como perteneciente a la especie P. commune.

El micelio de P. commune fue suspendido

en agua estril, con agitacin constante
durante 10 min. se filtr sobre gasa estril
en condiciones aspticas para retirar el
micelio sobrenadante, y se realiz el con-

194

teo de esporas con un hemacitmetro.

Una suspensin de 1x107 esporas/mL se
utiliz para inocular los medios de fermentacin.

Los medios de fermentacin se prepararon tomando como referencia el medio

Czapcek-Dox (9), y se suplementaron
con CaCl2. Se formularon dos medios,
segn la fuente de carbono, almidn de
yuca o yuca rallada, y se realizaron dos tipos de fermentaciones, FFS y FLS, en
condiciones estticas.
Para las FFS el medio se prepar con 10 g
de almidn 10 g de yuca rallada, humedecidos con 10 mL de solucin de sales.
El medio para la FLS contena 3,0 g de almidn de yuca 3,0 g de yuca rallada,
suspendidos en 100 mL de solucin de sales diluda 1:10. La solucin de sales contena (g/100 mL de agua destilada):
(NH4)2SO4, 3,00; MgSO4, 0,50; KCl,
0,50; FeSO4, 0,01; K2HPO4, 1,00;
CaCl2, 0,15.
Los medios se esterilizaron a 121 C
y 15 psi por 15 min, se inocularon con 1
mL de suspensin de esporas de P. commune y se incubaron a 22 C. Se hizo seguimiento cada 24 horas de la produccin de la enzima. Para la FLS se separ
el hongo mediante centrifugacin por 30
min a 8 000 rpm, en una centrfuga
MLW modelo T52; el sobrenadante
constituy el extracto crudo. En el caso
de la FFS se adicionaron 50 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0, se agit mecnicamente durante 30 min en un agitador
de placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscilaciones completas por minuto, se filtr
la solucin sobre algodn y se centrifug

por 30 min a 8 000 rpm, el sobrenadante

constituy el extracto crudo. Se tomaron
10 mL de cada extracto crudo y se dializaron contra agua destilada para realizar
medidas de concentracin de protena y
actividad enzimtica.
El trabajo se continu empleando la
FFS con yuca rallada, por ser el medio
en el cual se obtuvo la mayor produccin
de enzima.

Se emplearon bandejas de aluminio

(22,50 cm X 16,50 cm X 2,50 cm), en
cada una se puso una capa de 1 cm de espesor aproximadamente de la mezcla de
100 g de yuca rallada y 100 mL de solucin de sales. Las bandejas con el medio
se esterilizaron a 121 C y 15 psi durante
15 min y se inocularon con 3 mL de la
suspensin de esporas. La incubacin se
realiz a 22 C durante siete das. Para
obtener el extracto crudo se aadieron
150 mL de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0,
se agit mecnicamente durante una hora
a temperatura ambiente en un agitador de
placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscilaciones completas por minuto, y se filtr la
solucin sobre algodn para retirar los
slidos gruesos. Al residuo se le realiz
una segunda extraccin bajo las mismas
condiciones y se juntaron los dos extractos. El filtrado total se centrifug a 8 000
rpm por 30 min, en una centrifuga MLW
modelo T52, el precipitado se descart y
se obtuvo un sobrenadante con un volumen de 2085 mL. De este sobrenadante se
tomaron 100 mL para realizar ensayos
preliminares de precipitacin fraccionada
con sulfato de amonio.

Para medir la actividad a-amilasa se utiliz el mtodo de Nelson-Somogyi (12). La

mezcla de reaccin contiene 1 mL de solucin de almidn soluble al 1% (p/v),
200 mL de una dilucin apropiada de la
muestra que contiene la enzima, y 800
mL de CaCl2 5mM. Luego de 20 min de
reaccin a 37 C, se adicionan 500 mL
del reactivo de Somogyi y se lleva la mezcla a un bao Mara a temperatura de ebullicin. Pasados 10 min, se retira la mezcla del bao y se adicionan 500 mL del
reactivo de Nelson, se completa el volumen a 10 mL con agua destilada y se realiza la determinacin colorimtrica a 500
nm (espectrofotmetro Genesys 5).
Una unidad de actividad enzimtica se
define como la cantidad de enzima que libera 1 mg de glucosa por minuto bajo las
condiciones del ensayo, 37 C, pH 6,0.
La actividad especfica se define como las
unidades de actividad por miligramo de
protena.
La concentracin de protenas fue determinada por el mtodo colorimtrico de
Bradford (13), empleando albmina srica bovina como protena patrn.

Precipitacin con sulfato de amonio

El extracto crudo fue sometido a precipitacin fraccionada con sulfato de amonio.
La fraccin con la protena de inters precipit entre 50 y 80% de saturacin. Este
precipitado se disolvi en el mnimo volumen de agua destilada, se dializ 24 h
contra agua destilada y se liofiliz.

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Cromatografa de intercambio aninico

El liofilizado de la etapa anterior se disolvi en el mnimo volumen de buffer
fosfato 50 mM, pH 6,0, y se aplic a una
columna de DEAE Sephadex A-50 (2,5 x
30,0 cm) equilibrada con el mismo buffer. La elusin se realiz por medio de un
gradiente discontinuo de fuerza inica
(NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad de flujo fue de 30 mL/h. A cada fraccin (5 ml)
se le midi la absorbancia a 280 nm y la
actividad enzimtica. Las fracciones que
contenan la protena de inters, se mezclaron en un pool (pool DEAE-pico II),
que se dializ contra agua destilada y se
liofiliz.
Cromatografa de filtracin por gel
El pool DEAE-pico II se disolvi en
NaCl al 1% y fue sometido a cromatografa de filtracin por gel sobre Sephadex G-75 (2,5 X 30,0 cm). La elusin de
las protenas se realiz con NaCl al 1%.
La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. A
cada fraccin (4,5 mL) se le midi la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimtica. Las fracciones que mostraron
mayor actividad enzimtica, se mezclaron en un pool (pool G-75-pico II) que se
dializ contra agua destilada y se concentr por liofilizacin.
Cromatografa de intercambio
catinico
El pool G-75-pico II se disolvi en buffer
fosfato 0,05 M, pH 7,0 y fue sometido a
cromatografa de intercambio catinico
sobre CM Sephadex C-50 (2,5 x 30,0
cm). La elusin se realiz por medio de
un gradiente discontinuo de fuerza ini-

196

ca (NaCl 0,1 a 0,5 M). La velocidad de

flujo fue de 27 mL/h. A cada fraccin
(4,5 mL) se le midi la absorbancia a 280
nm y la actividad enzimtica. Las fracciones que contenan la protena de inters, se mezclaron en un pool (pool
CM-pico I) que se dializ contra agua
destilada y se liofiliz.

Determinacin del peso molecular

por electroforesis en condiciones
desnaturalizantes
Se corrieron electroforesis SDS-PAGE
(14), con geles de poliacrilamida al 12%,
los cuales se tieron con azul de Coomassie. Los marcadores de peso molecular
empleados fueron de la marca Bio-Rad,
con las siguientes protenas como estndares: fosforilasa B (104 kDa), albmina
de suero bovino (83 kDa), ovoalbmina
(49 kDa), anhidrasa carbnica (37 kDa),
inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y
lisozima (20 kDa).

Efecto del pH sobre la actividad

y la estabilidad de la enzima
El pH ptimo de la enzima fue determinado realizando medidas de actividad en un
rango de pH entre 2,0 y 12,0 a 37 C.
Para establecer el efecto del pH sobre la
estabilidad, la enzima fue incubada a 37
C por 1 h en diferentes buffers en un rango de pH entre 2,0 y 12,0 y la actividad
residual fue determinada bajo las condiciones normales del ensayo. Se usaron
buffers glicina-HCl, acetato-actico, fosfato y glicina-NaOH, todos con concentracin 100 mM.

Efecto de la temperatura sobre la

actividad y la estabilidad de la enzima
La temperatura ptima de la enzima fue
determinada en un rango de temperatura
entre 0 y 92 C en buffer fosfato 100 mM,
pH 6,0. El efecto de la temperatura sobre
la estabilidad fue establecido incubando
por 1 h la enzima en buffer fosfato 100
mM, pH 6,0 en un rango de temperatura
entre 40 y 92 C. La actividad residual
fue determinada bajo las condiciones normales del ensayo.

nes metlicos fue definida como de

100%. Para medir los efectos de EDTA y
SDS, la enzima fue incubada con el componente respectivo por 30 min a 37 C,
luego se realiz la medicin de actividad
enzimtica residual bajo las condiciones
normales del ensayo. La concentracin
final en la mezcla de reaccin para ambos
compuestos fue 10 mM. La actividad en
ausencia de EDTA y SDS fue considerada como de 100%.
Capacidad para hidrolizar el almidn
de yuca y productos de hidrlisis

Efecto de la concentracin de sustrato

Se utilizaron siete concentraciones diferentes de almidn soluble (0,2-1,4
mg/mL). Las mediciones de actividad se
realizaron bajo las condiciones normales
del ensayo. La mezcla de reaccin contena 100 mL de enzima purificada; 100 mL
de CaCl2 5 mM; 800 mL de buffer fosfato
100 mM, pH 6,0, y 1 mL de solucin de
almidn. La estimacin de Km y Vmx se
realiz a partir de la linealizacin de Lineweaver-Burk.

Los productos finales de hidrlisis luego

de 10, 20, 30 y 60 min de incubacin fueron evaluados segn Hmidet et al. (15),
mediante comparacin con patrones de
glucosa y maltosa en una cromatografa
de capa delgada (silica gel 60 F254
Merck), la fase mvil fue cloroformo/actico/agua (70:60:10, v/v/v) y el
revelado se hizo con H2SO4/metanol
(5:95, v/v). Los productos de hidrlisis
fueron observados como manchas oscuras luego de adicionar el revelador y calentar a 120 C por 3 min.

Efecto de algunos iones metlicos,

EDTA y SDS sobre la actividad
enzimtica
Se utilizaron las siguientes sales:
CaCl2.2H2O,
LiCl,
CuSO4.5H2O,
FeCl3.6H2O, AgNO3, HgCl2, BaCl2 y
CoCl2. La concentracin final de sal en la
mezcla de reaccin para todos los casos
fue 1,0 mM. La enzima, previamente dializada contra agua destilada, se incub
con la solucin de la sal durante 30 min a
37 C, luego se determin la actividad residual bajo las condiciones normales del
ensayo. La actividad sin adicin de los io-

La cintica de produccin de a-amilasa

en los diferentes medios de cultivo se presenta en la Figura 1.
En los medios con yuca rallada hay un
incremento de la actividad a-amilasa a
partir de 48 horas, con un mximo a las
168 horas (siete das), en las que la actividad enzimtica fue de 8,21 U/mL para la
FFS y 6,15 U/mL para la FLS. En cuanto
a los medios con almidn de yuca, la acti-

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Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS () usando almidn de yuca (O) y yuca rallada (p) como sustrato. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

vidad enzimtica comienza a aumentar a

partir de las 120 horas (5 das) sin alcanzar los valores observados con yuca rallada, no obstante, a partir de las 168 horas
(7 das) se aprecia un incremento en la actividad enzimtica en la fermentacin lquida sumergida que presenta un valor
mximo de 7,76 U/mL a los 10 das de
observacin.
El crecimiento de P. commune, un
hongo filamentoso, se favoreci en el medio slido empleando yuca rallada; este
medio ofreca una mayor rea superficial
y presentaba una textura ms rugosa, semejante a las condiciones de los hbitats
usuales de este microorganismo.

198

Los resultados obtenidos sugieren que

la yuca rallada constituye un mejor soporte para la produccin de a-amilasa por P.
commune y que en caso de usar almidn
de yuca en fermentacin en fase slida, la
produccin de la misma cantidad de
a-amilasa tomara ms tiempo.

La purificacin de a-amilasa de P. commune se resume en la Tabla 1. El extracto

crudo fue precipitado por adicin de sulfato de amonio, la mayor actividad
a-amilasa se encontr en la fraccin
50-80%, esta fraccin fue aplicada a una
columna de DEAE Sephadex A-50, cuyo
perfil de elusin (Figura 2) mostr un ni-

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Resumen de la purificacin de a-amilasa de Penicillium commune.

Extracto crudo

1985

873,40

4446,40

5,09

1,00

100

Precipitado sulfato
de amonio fraccin
50 80%

10

220,08

3414,14

15,51

3,05

76

DEAE-Sephadex
A-50

49,65

2660,55

53,59

10,53

59

Sephadex G-75

3,66

535,61

146,34

28,75

12

CM Sephadex C-50

0.7

1,28

402,97

314,82

61,85

co pico con actividad a-amilasa luego de

la adicin de buffer fosfato 50 mM, pH
6,0 NaCl 0,2 M. Las fracciones del pico
con actividad fueron reunidas en el pool
DEAE-pico II, el cual fue dializado contra agua destilada y liofilizado, alcanzando un grado de purificacin de 10,53.

con NaCl al 1%. El perfil cromatogrfico

(Figura 3) mostr un nico pico de actividad a-amilasa, las fracciones del pico activo fueron reunidas en el pool G-75 pico
II, el cual fue dializado contra agua destilada y liofilizado, con este paso se alcanz un grado de purificacin de 28,75.

Este pool fue aplicado a una columna

de Sephadex G-75, la elusin se realiz

El pool G-75 pico II se disolvi en

buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, y fue apli-

Perfil de elusin sobre DEAE-Sephadex A-50. (O) Absorbancia 280 nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

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Perfil de elusin sobre Sephadex G-75. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica. Cada
punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

cado a una columna de CM Sephadex

C-50. El perfil de elusin (Figura 4) mostr un nico pico con actividad a-amilasa
luego de la adicin de buffer fosfato 50
mM, pH 7,0 NaCl 0,1 M. Las fracciones
con actividad fueron reunidas en el pool
CM- pico I, el cual fue dializado contra
agua destilada, liofilizado y disuelto en
buffer fosfato 50 mM, pH 7,0, alcanzando un grado de purificacin final de
61,85. Este pool mostr una sola banda
en la electroforesis SDS-PAGE (Figura
5), indicando la purificacin hasta la homogeneidad de la enzima.

La comparacin de la movilidad electrofortica de la a-amilasa de P. commune

con la de los marcadores de peso molecular en una electroforesis SDS-PAGE (Figura 6) permite establecer un peso molecular de 35 kDa. El rango de peso
molecular para las a-amilasas oscila entre

200

10 y 210 kDa (2), sin embargo, la mayora de las a-amilasas microbianas tienen
su peso molecular entre 30 70 kDa, rango en el que se encuentra la a-amilasa de
P. commune.

Cuando la actividad de la enzima fue ensayada con diferentes valores de pH, la

mxima actividad se obtuvo con pH 6,0.
En otros estudios, el pH ptimo de la
a-amilasa de Penicillium chrysogenum
fue de 5,0 (7) y el de la a-amilasa de Penicilium griseofulvum de 5,5 (8). Aunque el
pH ptimo para las a-amilasas vara entre
2,0 y 12,0 (2), la mayora de las a-amilasas microbianas tienen su pH ptimo en el
rango ligeramente cido a neutro, rango
en el que se encuentra el pH ptimo de la
a-amilasa de Penicillium commune.

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Perfil de elusin sobre CM Sephadex C-50. (O) Absorbancia 280nm; (p) actividad enzimtica.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

Electroforesis SDS-PAGE de las fracciones de purificacin de a-amilasa de Penicillium commune

1) Extracto crudo 2) Sulfato de amonio fraccin 50-80% 3) DEAE-pico II 4) G-75 pico II 5) CM-pico I.

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Determinacin del peso molecular de a-amilasa de Penicillium commune por electroforesis

SDS-PAGE. 1) Marcadores de peso molecular. 2) a-amilasa purificada de Penicillium commune.

Luego de la incubacin de la enzima

por 1 h en buffer de diferente pH, se observa que la enzima fue estable en el rango de pH 5,0-7,0. La enzima retuvo 95%
de su actividad con un pH 5,0 y 98,8%
con un pH 7,0. Rangos de estabilidad en
el pH similares han sido reportados para
las a-amilasas de Aspergillus awamori
(16) y Thricoderma viride (17).

La temperatura a la cual se alcanza la mxima actividad y, por tanto, corresponde

a la temperatura ptima de reaccin, es 70
C. Cuando se sobrepasa este valor, la
actividad disminuye rpidamente porque
la enzima se va desnaturalizando.
Como se puede observar en la Figura
7, cuando la enzima fue incubada durante
una hora en buffer fosfato 100 mM, pH
6,0 en un rango de temperatura entre 40 y
92 C, la actividad decreci rpidamente
a partir de 50 C, indicando que el rango

202

de estabilidad trmica de la enzima es

0-50 C. Vale la pena destacar que la enzima conserva 35% de su actividad despus de ser calentada una hora a 92 C.
Una consecuencia de orden prctico derivada de este hallazgo, es la necesidad de
revisar cul es el tiempo requerido para la
inactivacin total de la enzima en las medidas de actividad por el mtodo de Nelson-Somogyi.
Con los datos obtenidos en la determinacin de la temperatura ptima se
construy una grfica de Arrhenius
(Figura 8) para as poder analizar la inactivacin trmica de la enzima. El cambio
de pendiente cerca a los 50 C que se observa en la grfica, sugiere que la incubacin por periodos prolongados de tiempo
a esta temperatura induce un cambio conformacional de la enzima. Un caso de
comportamiento similar fue reportado
por Uchino, para una a-amilasa de Bacillus sp. (18).

Orgnica y Bioqumica

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Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de a-amilasa de Penicillium commune. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

Grfica de Arrhenius. Se observan dos lneas rectas con cambio de pendiente cerca de los 50 C.
Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.

203

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Los valores de Km y Vmx determinados

usando la linelizacin de LineweaverBurk (Figura 9) fueron 0,48 mg/mL y
5,85 mmol glucosa/min, respectivamente. La a-amilasa de Penicillium commune
presenta una cintica tpica de Michaelis-Menten y posee una alta afinidad por
el almidn soluble respecto a otras a-amilasas microbianas como Thermofibida
fusca (0,88 mg/mL), Aureobasidium pullulans (5,75 mg/mL) y Bacillus sp. (1,64
mg/mL) (18, 19, 20), sin embargo, es
muy similar a la del hongo filamentoso
Aspergillus fumigatus (0,42 mg/mL)
(21).

El efecto de algunos iones metlicos, del

EDTA y del SDS sobre la actividad enzimtica de la a-amilasa de Penicillium
commune se muestra en la Figura 10. Las

a-amilasas son protenas pequeas que

contienen por lo menos un in Ca2+ por
molcula. La cantidad de iones Ca2+ puede variar de uno a diez dependiendo del
origen de la enzima. De acuerdo con
Gupta, et al. (2), para lograr una completa remocin de los iones Ca2+ no basta
con dializar contra agua destilada, se hace
necesario tratar la enzima con EDTA o
EGTA. Adems, segn Nielsen, et al.
(22), de los tres iones calcio (CaI, CaII,
CaIII) que la a-amilasa de Bacillus halmapalus contiene, es posible remover
CaIII sin observar cambios estructurales
significativos, pero no CaI o CaII. Lo anterior justifica que luego de la dilisis
contra agua destilada no se genere prdida total de la actividad enzimtica y, por
lo tanto, se pueda evaluar el efecto de los
iones escogidos, del EDTA y del SDS.
Como se puede notar, Ca2+, Ba2+ y
Ag+ aumentan significativamente la actividad de la enzima, siendo el in Ca2+ el
que tiene el ms alto poder activador. El
efecto activador del calcio puede estar re-

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de a-amilasa de Penicillium commune.

Km=0,48mg/ml, Vmx=5,85 mmol glucosa/min.

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Efecto de algunos iones metlicos, del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimtica. La actividad fue determinada luego de la incubacin de la enzima por 30 min a 37 C con diferentes sales, EDTA y
SDS. La concentracin final de los iones metlicos fue 1 mM, la de EDTA y SDS 10 mM. Al control no se le
adicionaron sales, EDTA o SDS.

lacionado con interacciones adicionales

favorables que contribuyen a la neutralizacin de las cargas negativas en la de los
dominios estructurales A y B de la enzima
(22). Cu2+ no altera significativamente la
actividad de la enzima, mientras que Li+
y Fe3+ la disminuyen ligeramente y Co2+
y Hg2+ la disminuyen considerablemente.
La inhibicin por iones mercurio sugiere, tal como lo indican Li, et al. (20),
que residuos aminoacdicos con grupos
sulfihidrilo o imidazol son importantes en
la funcin de la enzima. Esta afirmacin
concuerda con el hecho de que varios residuos de histidina (His210, His122, numeracin para Taka amilasa) estn implicados en el mecanismo cataltico de las
a-amilasas. El agente quelante EDTA y
el surfactante SDS tambin mostraron accin inhibitoria sobre la actividad de la
enzima. La inhibicin que ocasiona el
EDTA apoya la sugerencia de que la
a-amilasa de P. commune contiene calcio, y que su actividad es dependiente de
este in. En cuanto al SDS, se corrobora

su efecto sobre la estructura terciaria de

la enzima, sin que se presente completa
desnaturalizacin con la concentracin
ensayada.

El anlisis cromatogrfico de los productos de hidrlisis del almidn de yuca por

a-amilasa de Penicillium commune se
muestra en la Figura 11. Entre los principales productos de hidrlisis se encuentran maltosa y glucosa. La produccin de
trazas de glucosa fue determinada desde
los 10 min de reaccin, as como la formacin de pequeas cantidades de maltosa y dextrinas, cuya cantidad fue aumentando a medida que aumentaba el tiempo
de reaccin. Este resultado proporciona
evidencia de que la enzima presenta el
comportamiento caracterstico de una
a-amilasa, ya que es capaz de romper los
enlaces glicosdicos a-1,4 del almidn de
yuca, lo cual es de inters por su potencial
en la produccin de biocombustibles.

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Cromatografa de capa delgada de los productos de hidrlisis de almidn de yuca por a-amilasa de
Penicillium commune. Las muestras fueron removidas con intervalos determinados de tiempo.

Resultados similares en la hidrlisis de

almidn han sido reportados para las
a-amilasas de Penicillium griseofulvum y
Penicillium chrysogenum (7, 8).

xima estabilidad en el rango 0-50 C.

Con temperaturas superiores probablemente la enzima adquiere un estado conformacional que le permite conservar
35% de su actividad despus de ser calentada a 92 C durante una hora.

Tanto el almidn de yuca como la yuca

blanca colombiana (Manihot esculenta
crantz) empleados como soporte, permiten el crecimiento de Penicillium commune. En las condiciones usadas en esta investigacin, el microorganismo slo
produce una a-amilasa. La comparacin
de las cinticas de produccin de la enzima en cultivos en FFS y FLS esttico,
permite establecer que la fermentacin en
fase slida con yuca blanca rallada arroja
los mejores resultados en cuanto a actividad a-amilasa.

La grfica de Arrhenius presenta un

cambio de pendiente cerca a los 50 C,
sugiriendo que la incubacin por periodos prolongados de tiempo a esta temperatura induce un cambio conformacional
de la enzima.

La enzima presenta un pH ptimo de

6,0 y fue estable en un rango de pH entre
5,0 y 7,0 a 37 C, adems tiene una temperatura ptima de 70 C y presenta m-

La a-amilasa de Penicillium commune

es activa sobre almidn de yuca usado
como sustrato, lo cual se evidencia en la
produccin de maltosa y glucosa en la

206

Dado que Ca2+ tiene el ms alto poder

activador y el EDTA causa una fuerte inhibicin, se confirma que la a-amilasa de
Penicillium commune contiene calcio, y
que su actividad es dependiente de este
in.

cromatografa de capa delgada sobre silica gel.

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