Microbiological Method Validation

Aseguramiento de la calidad y validacin
de metodologas para el anlisis microbiolgico

NORMA ISO 17025
Bqca. Alicia I. Cuesta
Normas
Sistema de calidad
ETA
Alimentos sanos
Mtodos analticos
SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA

Manejo sanitario
Bqca. Alicia Irene Cuesta
Normas
CALIDAD HIGIENICA
Y SENSORIAL
Sistema de calidad
Alimentos sanos
Mtodos analticos
VIDA UTIL
Manejo sanitario
Generalidades de la Norma ISO 17025

Los resultados de los mtodos analticos:
Basados en principios de aseguramiento de la calidad.
Validados
Acreditados segn la Norma ISO 17025
Son internacionalmente reconocidos

Considerados de referencia para la evaluacin
de conformidad de los productos de intercambio
en el comercio internacional.
NORMA ISO 17025: 2005

General requirements for competence of calibration and testing laboratory.
Es la norma vigente para acreditar laboratorios.

Esta norma tiene todos los requisitos que deben cumplir
los laboratorios de ensayos si desean demostrar que
poseen:
Un sistema de calidad.
Son tcnicamente competentes
Capaces de generar resultados tcnicamente vlidos.
Hay un reconocimiento mutuo con otros
laboratorios del mundo.
La ley est por encima de las normas

La Norma ISO 17025 no contempla el cumplimiento de :
requisitos regulatorios y
de seguridad relacionados con el funcionamiento del
laboratorio.
La Norma dice :
QU hay que hacer? (Requisito)
El laboratorio dice el
CMO? (cmo se implementa el requisito)
ACREDITACIN (Norma ISO 17025 )

Determinar la competencia tcnica del personal
y la validez tcnica de las operaciones.
Tiene que demostrar competencia
Los resultados de ensayo de un laboratorio
que tiene competencia tcnica
sern
CONFIABLES Y EXACTOS
Particularidades de ensayos microbiolgicos

A diferencia de las ciencias qumicas y fsicas,
en microbiologa se trabaja con
microorganismos que se multiplican por divisin
binaria y crecen exponencialmente.
Los ensayos microbiolgicos incluyen
ensayos de
esterilidad, deteccin, aislamiento, recuento e
identificacin de microorganismos y sus
metabolitos.
Pilares sobre los que se apoya la

COMPETENCIA TECNICA
COMPETENCIA TECNICA
Equipamiento
PERSONAL
MTODO
Ambiente
Laboratorio da resultados confiables y exactos?

Situacin del
laboratorio con
respecto a:
Caso 1
Caso 2
Caso 3
Personal
capacitado,
desarrolla bien su
tarea.
capacitado,
desarrolla bien su
tarea.
Personal no est
adecuadamente
capacitado
Instalaciones y
condiciones
ambientales
Equipos
Adecuados y
suficientes
Riesgo de
contaminacin
cruzada
Adecuados y
suficientes
no est validada
Validada
Validada
Validacin de la
metodologa
10
Los objetivos de un sistema de calidad son:

PREVENCIN: Evitar que se produzcan errores e
ineficiencias.
DETECCIN: Identificar los elementos causantes de los
errores.
CORRECCIN Y MEJORA: Eliminar las causas de los
errores y mejorar los procesos.
DEMOSTRAR: Evidenciar objetivamente que se ha
cumplido con los requisitos
11
ENSAYO MICROBIOLGICO
Las operaciones que se realizan dentro del
laboratorio de microbiologa pueden dividirse en
aquellas que son crticas para la calidad de
resultados del ensayo y aquellas que tienen un
menor impacto.
Las operaciones crticas deben ser:
controladas,
monitoreadas y
documentadas.
12
Aseguramiento de calidad
Norma ISO 17025
PERSONAL
Las personas son el motor de los sistemas de calidad

y por lo tanto este es un punto crtico y que la norma
ISO/IEC 17025 lo trata extensamente.
Tiene que haber motivacin interna para planificar,
implementar y mantener el sistema de calidad!!
13
Requisitos Personal (Norma ISO 17025):

El personal debe contar con conocimientos, experiencia y competencia de
acuerdo a las tareas y responsabilidades que tenga asignadas.
COMPETENCIA DEL PERSONAL: La competencia involucra conocimientos,
habilidades, comprensin y actitudes. La evaluacin debe ser continua.
El laboratorio debe tener documentado el personal autorizado para cada
ensayo.
PERSONAL AUTORIZADO: personal que posee el reconocimiento formal de
su capacidad para realizar en forma correcta una determinada tarea que se le
ha sido asignada.
Todo el personal tcnico que trabaja en el laboratorio de microbiologa debe
recibir un adecuado entrenamiento de modo de asegurar que ejecuta en forma
idnea las operaciones relacionadas con el ensayo.
La capacitacin es un requisito muy importante del sistema de calidad.
CAPACITACIN DEL PERSONAL: Definicin: proceso continuo y sistemtico
destinado a la formacin, entrenamiento, actualizacin o perfeccionamiento
especfico del personal.
La direccin debe definir y mantener actualizados los perfiles de puestos del
personal directivo, tcnico y de apoyo clave afectado a los ensayos.
PERFIL DEL PUESTO DE TRABAJO: Definicin: Son los requisitos mnimos de
formacin acadmica y experiencia que debe tener el personal para acceder al
puesto de trabajo.
14
CAPACITACIN DEL PERSONAL

Entrenamiento:
Actividad de ensear las habilidades que una persona
necesita para desarrollar su labor en un determinado
puesto de trabajo.
Tiene carcter eminentemente prctico .
Se relaciona directamente con la tecnologa, tiles,
equipos, etc. que se usan en el puesto de trabajo.
Formacin:
Actividades de incorporacin de conocimientos generales
y especficos necesarios para que el personal pueda
desarrollar su labor en un determinado puesto de trabajo.
Se hace referencia a la formacin acadmica del personal.
15
Norma ISO17025:2005 punto 5.2.2
La direccin del laboratorio debe formular

las metas con respecto a la educacin, la
capacitacin y las habilidades del personal del
laboratorio.
El laboratorio debe tener una poltica y
procedimientos para identificar las necesidades de
capacitacin del personal y para proporcionarla.
El programa de capacitacin debe ser pertinente a
las tareas presentes y futuras del laboratorio.
Se debe evaluar la eficacia de las acciones de
capacitacin implementadas.
16
Capacitacin del personal

LABORATORIO MICROBIOLOGIA
Todo el personal tcnico debe recibir un adecuado
entrenamiento que incluyen:
Tcnicas bsicas de microbiologa para la manipulacin
de cultivos y muestras en condiciones de esterilidad
Adecuado criterio para el manejo de material
potencialmente infeccioso.
Conocimiento de normas de bioseguridad, etc.
17
Requisitos Norma ISO 17025: PERSONAL

COMPETENCIA TECNICA
Calificacin bsica
Descripcin de actividades
y responsabilidades del personal
CONDUCCIN TCNICO
DE APOYO
Relacin de dependencia
CAPACITACION:
Identificacin de las
necesidades de capacitacin.
Planificacin de la capacitacin.
Realizacin de la capacitacin
Documentacin.
LABORATORIO
18
Norma ISO 17025
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Requisitos:
Las instalaciones del laboratorio de ensayo

(incluye fuente de energa, luz y condiciones
ambientales) deben ser capaces de facilitar
la realizacin correcta de los ensayos.
19
Instalaciones (cont)
Debe haber una efectiva separacin entre reas

vecinas en las que se realizan actividades
incompatibles.
Se deben tomar medidas para prevenir la
contaminacin cruzada.
La ubicacin, el diseo y la distribucin de las
diferentes reas que integran el laboratorio
deben minimizar el riesgo de contaminacin de
las muestras y los cultivos.
20
MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIN CRUZADA.

CRUZADA
En la prctica esto se puede lograr:

Separando las actividades en tiempo y espacio.
espacio
Mediante la construccin del laboratorio segn un
diseo sin camino de regreso se puede obtener una
reduccin significativa del riesgo de contaminacin
cruzada.
Llevando a cabo los procedimientos de una manera
secuencial,
secuencial usando las precauciones apropiadas para
asegurar la integridad de la muestra y del ensayo.
Por ejemplo uso de recipientes hermticamente cerrados.
21
SEPARACIN DE REAS DEL LABORATORIO:

No es aceptable que
el laboratorio de microbiologa
ocupe una sola sala polivalente.
Requisito: El rea analtica debe estar separada
de la de preparacin de medios de cultivo y lavado
de material.
22
Separacin de reas del Laboratorio:

Es conveniente separar las siguientes reas:
zona de recepcin y almacenamiento de muestras.
Preparacin, muestreo y pesada de muestras.( importante si se
analizan productos en polvo)
Examen de muestras incluyendo su incubacin.
Manipulacin de patgenos.
Mantenimiento de microorganismos de referencia.
Verificacin de la esterilidad.
Preparacin de los medios y equipos incluyendo su esterilizacin
Descontaminacin.
El rea de Lavado de material ( despus de la descontaminacin)
pueden compartirse con otras partes del laboratorio (precaucin
contaminacin con trazas de sustancias que afecten crecimiento
microbiano).
23
El diseo del laboratorio depender de los ensayos

que se llevarn a cabo (depende del alcance de las
metodologas)
Ejemplo si adems de realizar ensayos por mtodos
tradicionales se llevan a cabo ensayos empleando tcnicas
de biologa molecular se necesitarn reas adicionales.
El laboratorio debe tomar las medidas necesarias para
reducir al mnimo el riesgo de contaminacin
siempre que dicho riesgo
sea importante para el tipo de ensayos realizados.
realizados
24
Medidas para de disminuir el riesgo de contaminacin

y facilitar la limpieza y desinfeccin de las diferentes reas.
Medidas relativas a los materiales :
Facilitar la limpieza:
Las paredes, techos suelos y superficies de trabajo del
laboratorio deben ser lisas.
Las superficies de madera de las instalaciones y
accesorios deben estar protegidas y selladas.
Evitar maderas rugosas y sin revestir.
25
Medidas relativas al diseo:
Espacio disponible:
Las reas del laboratorio deben ser suficientemente espaciosas.
El espacio necesario estar de acuerdo con el volumen de muestras analizadas
y la organizacin interna del laboratorio.
Facilitar la limpieza:
Las uniones entresuelo, paredes y techos deben ser cncavas.
Contar con canillas, adecuadamente ubicadas, para el lavado de manos del
personal.
Ventilacin:
Las reas de trabajo deben estar apropiadamente ventiladas y a una
temperatura adecuada.
Puede hacerse por ventilacin natural o forzada, o mediante el uso de
acondicionadores de aire. En este ltimo caso, los filtros deben revisarse,
mantenerse y reemplazarse peridicamente, acorde al tipo de trabajo que se
realiza.
Otros:
Evitar uso de cortinas y/o persiana internas
En caso de uso incluirlas en el plan de limpieza
26
Otras medidas :
Ausencia de documentos obsoletos, objetos
o mobiliario innecesario en el rea del laboratorio.
Minimizar la apertura de puertas y ventanas durante la
realizacin del ensayo.
Contar para el lavado de manos del personal con canillas
no manuales, el jabn desinfectante debe estar dispuesto
en dispensadores y toallas descartables para el secado.
Los armario estanteras, equipos deben estar colocados
de forma de evitar acumulacin de polvo.
Ejemplo armarios hasta el techo.
27
Se debe controlar el acceso y el uso de las reas que afecta la

calidad de los ensayos.
El acceso al laboratorio debe estar restringido slo al personal tcnico

o a personas autorizadas.
CONDICIONES AMBIENTALES
REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
las condiciones ambientales, bajo las cuales se realizan los
ensayos microbiolgicos,
no invaliden los resultados de ensayo ni comprometan la calidad
requerida de los resultados.
28
Ejemplos de
condiciones ambientales no deseables
Condiciones
Ambientales
Efecto posible sobre el ensayo
Lugar a monitorear
Deficiente esterilidad
biolgica
Contaminacin de las muestras y

cultivos
Sala de siembra y de
preparacin de muestras
Suministro elctrico
interrumpido
o deficiente
-Variacin de las condiciones de

ensayo.
-Prdida de viabilidad cepas de
referencia por descongelacin.
-Conservacin inadecuada de la
muestra, reactivos y medios de
cultivo.
Niveles de
ruido o
vibracin excesivos.
Interfiere en la pesada de la
muestra, polvos deshidratados
para preparacin de medios de
cultivos o reactivos
Sala de preparacin de
muestras
Mayor polvo en
suspensin en el aire
Contaminacin de las muestras y

cultivos
Sala de siembra y de
preparacin de muestras
Funcionamiento
de estufas, congeladores y
heladeras
29
Requisito
El laboratorio debe establecer:
Un programa documentado de limpieza y desinfeccin
que tenga en cuenta los resultados de vigilancia de las condiciones
ambientales y la posibilidad de contaminacin cruzada.
Objetivo:
Organizar las tareas de limpieza y desinfeccin del laboratorio de
microbiologa.
Establecer la frecuencia de realizacin de las mismas
Se detallan las superficies a limpiar y/o desinfectar, el nivel de
limpieza requerido (trapeo hmedo, trapeo mojado, etc.), los
desinfectantes a preparar y su modo de uso.
El personal que realiza la limpieza.
30
PLAN DE HIGIENE.
Son los procedimientos
operativos empleados durante la
realizacin del trabajo en el
laboratorio.
Tiene como principal objetivo
evitar la contaminacin en todas
las etapas del ensayo
lo que implicara obtener resultados
errneos, la infeccin del personal,
etc.
31
PLAN DE HIGIENE.
El laboratorio debe trabajar tomando las siguientes precauciones :
Relativo al trabajo propiamente dicho.
Por ejemplo:
Asegurarse que el rea de trabajo est limpia y que no haya corrientes de aire.
Limpiar la superficie de trabajo con un desinfectante adecuado, antes y despus del trabajo.
Durante la siembra y manipuleo estril de muestras no hablar y evitar toser.
Abrir los tubos de ensayo y botellas cerca de la llama.
Trabajar tan rpido como sea posible, evitando movimientos innecesarios.
la manipulacin del material patgeno o txico requiere trabajar en reas cerradas o bajo campanas
de flujo laminar, especialmente cuando se abren las cajas de Petri.
Evitar la formacin de aerosoles. Se pueden formar al abrir las cajas de Petri, los tubos, las botellas o
los frascos, al usar mezcladores, jeringas, centrfugas, etc. y cuando se esterilizan ansas hmedas.
Relativo al rea de trabajo:

Utilizar vestimenta de uso exclusivo en el laboratorio, guardapolvo de color claro, limpio y en buenas
condiciones, no debe ser usado fuera del rea de trabajo del laboratorio.
Dejar en zona de oficinas o externa al laboratorio los abrigos. portafolios, etc. Y en el rea del
laboratorio no comer, beber, fumar.
Relativo a la Higiene del personal tcnico:

Antes y al finalizar la labor en el laboratorio, el personal tcnico debe lavarse las manos con un
producto adecuado (jabn desinfectante).
El personal debe tener uas cortas y limpias, el pelo debe estar recogido, no tener anillos ni pulseras.
Uso de barbijo si es necesario.
El personal que presente infecciones serias en manos o cara no debe realizar exmenes
microbiolgicos.
32
MONITOREO AMBIENTAL:
La calidad microbiolgica
del aire y las superficies
del laboratorio en microbiologa
Es un indicador de la efectividad
de las tareas realizadas segn el:
Plan de limpieza, desinfeccin y mantenimiento
Plan de higiene.
Procedimiento: MONITOREO AMBIENTAL
Establece :
Metodologa para la toma de muestra.
Lugares de toma de muestra.
Lmites de tolerancia o criterios de aceptacin o rechazo.
Frecuencia de monitoreo.
Acciones correctivas a tomar en caso de desvos de los lmites
establecidos.
Esto se aplica tanto a control ambiental del rea analtica del laboratorio
como para la campana de flujo laminar.
33
El programa de muestreo para

monitoreo ambiental puede incluir
(dependiendo del ensayo que realiza el laboratorio):
Determinacin cuantitativa de microorganismos

presentes en el ambiente (recuento total o recuento de
determinados tipos de microorganismos como por ejemplo
hongos)
Determinacin cualitativa de algunos patgenos y/o
indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el
laboratorio (Ejemplo: Enterobacterias, Coliformes,
Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Listeria spp,
Staphylococcus aureus).
34
MTODOS PARA CONTROL

CALIDAD DEL AIRE:
Mtodo pasivo, por sedimentacin.
sedimentacin
Se realiza el recuento de microorganismos viables que se posan
sobre una superficie de medio de cultivo (tcnica cualitativa).
No existe relacin entre la cantidad de colonias encontradas en por
placa y el volumen de aire.
Mtodo activo, por impacto.
Se realiza el recuento de microorganismos viables retenidos
sobre una superficie de medio de cultivo forzando un
determinado volumen de aire.
Mtodos para control calidad del aire: MTODO PASIVO Y
ACTIVO
Los resultados de ambos mtodos no son comparables (el principio
de muestreo y las unidades en las cuales se expresan son diferentes).
SE RECOMIENDA INTERPRETAR TENDENCIAS Y NO
OBSERVACIONES AISLADAS.(tomar siempre la muestra en un mismo
lugar)
35
Mtodos para control calidad del aire:

Normas IRAM 14071-1:2002 EXPOSICIN DE PLACAS:
Toma de muestra: durante un tiempo estipulado, se exponen placas de

Petri (o sea se abren las placas) con medio de cultivo no selectivo, en el rea de
trabajo y durante el proceso de siembra.
reas a monitorear o zonas de toma de la muestra: sala

de siembra y sala de preparacin de muestras.
Medio de cultivo usado. Ejemplo PCA.

Tiempo y temperatura de incubacin: Luego de la exposicin al
aire, las placas se cierran e incuban durante Ejemplo 72 horas a 30 C.
Frecuencia de realizacin de los controles. Ejemplo mensual.

Criterio de conformidad: nmero mximo de colonias por tiempo de
exposicin de las placas. Ejemplo durante 15 minutos se permite hasta 15
colonias. Los resultados se expresan como unidades de colonias (ufc) por placa
36
Mtodos para Control calidad

de superficies:
Mtodo
Recoleccin
Tipo de
superficie
Hisopado
Hisopo estril
Delimitada
Siembra directa
Esponjatrapeado
Esponja embebida
en medio especfico
Irregular
Superficies
100cm2
Siembra de
volumen
conocido
Caja de
contacto
o Petrifilm
Contacto, presin y
tiempo estndar
Plana
Incubacin
directa
Siembra
Normas de consulta: Mtodos para Control calidad de superficies: ISO 18593:2004 Microbiology
of food and animal feeding stuffs -- Horizontal methods for sampling techniques from surfaces
using contact plates and swabs
37
Instalaciones y condiciones ambientales
Equipamiento necesario
Limpieza y orden
Reglas de acceso
y utilizacin
de las reas
Plan de higiene
LABORATORIO
Separacin de
reas donde
se realizan
actividades incompatibles
Monitoreo ambiental
38
Norma ISO 17025
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
REQUISITO:
la calidad de los medios de cultivo y reactivos
sea apropiada para los ensayos realizados.
Este es un punto crtico!
Cmo se asegura su calidad?
39
Qu necesita un
microorganismo para crecer?
MEDIOS DE CULTIVO:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento,
la reproduccin y la identificacin de los
microorganismos.
Contienen sustancias nutritivas
pH adecuado
Deben estar estriles.
Incubacin:
Depende del metabolismo del microorganismo a
cultivar.
La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico,
anaerobio)
Tiempo.
Temperatura.
40
Clasificacin de medios de cultivo:

1.Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos.
2.Segn su finalidad en microbiologa:
No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para
soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
Selectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de
microorganismo.
Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega
sustancias como ser sangre, suero, albmina, etc... Para

microorganismos exigentes.
Diferenciales: son medios de cultivo que permiten
establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.
41
Los medios de cultivo se preparan:

1. En el laboratorio a partir de sus diferentes
componentes.
2. A partir de productos en polvo deshidratados
comerciales o
3. Pueden adquirirse medios listos para su uso.
La calidad de un medio de cultivo depende de la calidad de
los ingredientes bsicos, la correcta formulacin, calidad
del procedimiento de preparacin, ausencia de inhibidores,
envasado y almacenamiento.
Normas de consulta: ISO 7218:1996(E) Microbiology of
food and animal feeding stuff-General rules for
microbiological examinations y ISO/TS 11133-1:2000
42
Requisitos de los medio de cultivo

provistos por el fabricante :
Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.
(TRAZABILIDAD)
Cada lote recibido debe ir acompaado de evidencias del
cumplimiento de las especificaciones de calidad.
El fabricante debe proveer informacin acerca de las
especificaciones de calidad del medio de cultivo, debe incluir lo
siguiente:
Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento.
Fecha de vencimiento del medio.
Condiciones de almacenamiento.
Control de esterilidad.
Control del crecimiento de los microorganismos de inters (target) y de los
microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad.
Controles fsicos y criterios de aceptabilidad aplicados.
43
Manejo de los medios de cultivo:
1.El laboratorio debe registrar la fecha :

de recepcin
de apertura del envase.
de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas.
Envases: deben estar hermticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
44
CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA
Para la preparacin de medios, soluciones y tampones,

debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles peridicos que aseguren su calidad.
Controles peridicos:
Requisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminacin microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
45
Procedimiento para preparacin

de medios de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo
con un procedimiento documentado.
En dicho procedimiento debe haber una descripcin del
equipamiento necesario.
El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la
identificacin y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.(TRAZABILIDAD)
Debe haber un registro de preparacin de medios de
cultivo y reactivos.
46
LAVADO DE MATERIAL:
Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto

lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta
tarea.
Pasos:
Descontaminacin material de vidrio.
Enjuague y se lavado con agua caliente y detergente
apropiado ( extran neutro diluido al 2%)
Enjuague n de veces con agua corriente y luego un n de
veces con agua destilada. Eliminar el detergente
El material se seca en estufa y se acondiciona para ser
esterilizado.
47
Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes:
Fue efectivo el proceso de esterilizacin de los medios de

cultivo y diluyentes?
PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.
La temperatura y tiempo de incubacin para esta prueba se
corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.
Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del
comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o
distribuir los medios o diluyentes.
Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza
un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se
esteriliza por filtracin.
48
Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:

Posibles problemas
Anormalidad
Posible causa
Falla en la
solidificacin del
medio slido
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin

Peso incorrecto del agar
Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes
Formacin de
precipitado

pH medido incorrectamente
Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
pH incorrecto

pH medido incorrectamente.
Contaminacin externa con qumicos.
49
Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo:

Posibles problemas
Anormalidad
Posible causa
Color anormal

pH incorrecto
Contaminacin externa.
Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.
Selectividad pobre

pH incorrecto.
Formulacin inadecuada.
Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado
caliente o en alta proporcin.
Medio inhibitorio/
Productividad baja

Formulacin inadecuada Ej. ingredientes y suplementos mal pesados.
Pobre calidad del medio deshidratado
50
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
El objetivo es definir la: metodologa para evaluar la

PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de
cultivo slido, semislido o lquidos ya preparados y
esterilizados, utilizados en el laboratorio de
microbiologa.
Cultivo de trabajo (segn Instructivo de cultivos de
referencia) Se prepara un cultivo en fase estacionaria
de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas
en el laboratorio en un caldo no selectivo (por ejemplo
caldo cerebro corazn)
51
PRODUCTIVIDAD:
Definicin: rendimiento, recuperacin, crecimiento
de un microorganismo que se espera que desarrolle en
el medio de cultivo.
Segn el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo
como por ejemplo el PCA se evala el
adecuado desarrollo de las cepas target o
blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633
52
SELECTIVIDAD:
Definicin: la supresin del crecimiento de un
microorganismo que se espera sea inhibido
en el medio de cultivo.
Segn el medio se usa una cepa apropiada de referencia
no-target para evaluar la selectividad
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST)
se evala el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso las cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Evala reacciones caractersticas: gas y turbidez.
53
En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:
El crecimiento de las cepas target

Hay que prestar atencin tambin a la
apariencia, tamao y morfologa de las
colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas
no-target debe estar en parte o
completamente inhibido.
54
PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO

segn Norma ISO/TS 11133-2:2000
SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MTODOS:

a)Pruebas cuantitativas
b) Pruebas semi-cuantitativas
c) Pruebas cualitativas
55
MEDIO DE REFERENCIA
El uso de un medio de referencia especfico

es obligatorio en los mtodos de cuantitativos
Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas,
el uso de un medio especfico de referencia
o un medio de cultivo que da una la reaccin positiva"
ayuda al nterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)
56
PRODUCTIVIDAD:
Pruebas cuantitativas: la proporcin de Productividad PR
es definido como sigue:
PR = Ns /No
donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo a probar (obtenido de uno o ms placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de
cultivo de referencia definido obtenido de uno o ms placas
que debe ser 100 ufc.
57
PRODUCTIVIDAD: Pruebas cuantitativas

CRITERIO DE CONFORMIDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.
All figuran:
Los microorganismos
Tiempo y temperatura de incubacin
Criterios
Medio de referencia que debe usarse segn el medio a
evaluar.
PR debe ser mayor o igual a un valor lmite para que el
medio de cultivo sea conforme.
En general para que los medios no selectivos como el
PCA sea conforme, el PR debe ser a 0,7.
58
PRODUCTIVIDAD:
Ejemplo Pruebas cuantitativas
Se desea evaluar la productividad del PCA.
El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
2) Ns ( dil -6):100 ufc
No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
59
PRODUCTIVIDAD:
Pruebas semi-cuantitativas.
Se inocula en forma de estras diluciones del

cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o
modelo.
Las placas inoculadas se incuban a temperatura
y tiempo que depende del medio de cultivo
evaluado y se observa el crecimiento.
Se evala la productividad del medio teniendo en
cuenta el valor de cada estra con crecimiento.
60
PRODUCTIVIDAD :
Pruebas cualitativas
Se llevarn a cabo visualmente asignando
un score de crecimiento.
Score para medios slidos:
0 no hubo crecimiento
1 hubo crecimiento dbil
2 hubo buen crecimiento.
Score para medios lquidos:
0 no hubo turbidez
1 hubo turbidez muy tenue
2 hubo buena turbidez
61
SELECTIVIDAD:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,
el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.
Se emplea una suspensin del microorganismo
de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.
62
Certificado de control
de calidad de un medio de
cultivo no selectivo
63
Reactivos
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:
la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioqumicas
Realizo controles positivo y negativo utilizando
microorganismos que sean trazables a colecciones de
cultivos nacionales o internacionales reconocidas.
64
Sntesis
En microbiologa se le da especial nfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
Un punto crtico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO
17025 y acreditar el laboratorio es la preparacin, esterilizacin y
evaluacin de la calidad de los medios de cultivo empleados para
realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditacin
se basan en la Norma ISO/TS 11133-1:2000 y ISO/TS 111332:2000.
Esto implica una revisin de las prcticas cotidianas realizadas por
el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son
adecuados a la finalidad prevista.
65
Norma ISO 17025
CULTIVOS DE REFERENCIA
Cultivos de referencia: REQUISITO Para acreditar o mantener la

acreditacin de un ensayo, el laboratorio de microbiologa debe contar
con cultivos de referencia.
El nmero y la eleccin del gnero y especie de las mismas depender
de los ensayos que se efectan y las necesidades particulares de estos
ltimos.
El laboratorio debe elaborar e implementar un procedimiento
documentado para el uso y manejo de cultivos de referencia. Es
NECESARIOS PARA DEMOSTRAR TRAZABILIDAD.
Definicin de Material de referencia : Material o sustancia que
posee valores de una o ms propiedades suficientemente
homogneas y bien conocidas para permitir su uso en la calibracin
de aparatos, la evaluacin de un mtodo de medicin o la atribucin de
valores a estos materiales.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)
66
Para qu son necesarios

los cultivos de referencia ?
Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo.
Realizar controles de calidad interno durante la
ejecucin de los ensayos.
Realizar controles de calidad de reactivos.
Pruebas confirmatorias.
Ejemplo prueba de CAMP
Validar mtodos microbiolgicos.
Aseguramiento de la calidad de los resultados de
ensayo de mtodos microbiolgicos.
67
Cultivos de referencia:
Definicin:
Trmino colectivo que se refiere
a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.
Requisitos:
Clulas microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).
Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperacin.
Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).
Genticamente estables.( ESTABILIDAD)
( mantenimiento de caractersticas genotpicas y fenotpicas)
68
CEPAS DE REFERENCIA:
PARA DEMOSTRAR
LA TRAZABLIDAD DEBEN OBTENERSE DIRECTAMENTE
DE UNA COLECCIN NACIONAL O INTERNACIONAL DE
CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.
Son microorganismos definidos:
Por lo menos a nivel de gnero y especie.
catalogados.
muy caracterizados.
de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000]
Se comercializan liofilizadas.
Los organismos de acreditacin deben considerar vlida
la fuente de dnde provino la cepa.
69
En la prctica para cumplir con el requisito prevenir

mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas
tpicas de las cepas de
el nmero de repiques a partir de la cepa de referencia
debe ser limitado
( en general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la
cepa de referencia )
Si una cepa se adquiere por cualquier va que no sea la
propia coleccin, NO se puede mencionar utilizando el
nmero que tienen en esa coleccin, sino solamente como
derivada de la cepa de coleccin.
70
Cepas de coleccin
de referencia
http://www.atcc.org
71
REGISTRO DE
Identificacin de la cepa.
Gnero y especie del microorganismo
TIPO y N de coleccin.
N de lote.
Fecha de recepcin.
Control de calidad de la cepa de
referencia Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de la cepa.
Personal responsable.
Reconstitucin de las cepas de referencia:

Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de microbiologa se registran
en planilla segn procedimiento.
Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 C hasta su uso.
Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran utilizando el medio
de cultivo, las condiciones de incubacin y el procedimiento indicado en las
instrucciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de
las cepas.
En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un control de calidad
de pureza y viabilidad y se registra.
72
Control de calidad
de pureza y viabilidad:
Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGO UN
REPIQUE.
Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus
caracteres bioqumicos.
Frecuencia de realizacin de este control: para las cepas de reserva
almacenadas el laboratorio la establecer en cada caso.
Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:
Fecha del control.
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. TIPO y N
de coleccin.
Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).
Pruebas a realizar (depende del microorganismo): Coloracin de Gram,
Caractersticas de las colonias en medios selectivos, Pruebas bioqumicas y
serolgicas, etc.
En caso de no presentar las caractersticas establecidas se ejecuta la
Acciones correctivas establecida en el procedimiento.
73
Cepas de reserva:
Definicin: Cepas idnticas obtenidas mediante
un nico subcultivo de una cepa de referencia.
[ISO 11133-1:2000].
Las cepas de reserva son una serie de alcuotas de
cultivos idnticos obtenidas en el laboratorio por
subcultivo de la cepa de referencia.
CREF
REPIQUE UNICO
Cres
Cres
Cres
Cres
Cres
Cres
Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

74
MTODOS
PARA
LA PRESERVACIN
Y MANTENIMIENTO
DE
CEPAS DE RESERVA
obtenidas a partir
de cepas de referencia :
A)LIOFILIZACIN.
B) CONGELACIN
A BAJAS
TEMPERATURAS.
Uso
de agentes
Crioprotectores
Cepas de reserva: Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio)

Debe haber un lugar destinado a almacenar las cepas de reserva.
Debe estar claramente sealado que se trata de cepas potencialmente
peligrosas y su manipulacin restringida a personal autorizado.
75
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA
A) LIOFILIZACIN. Definicin: es un proceso de
desecacin desde el estado congelado.

Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
PRODUCTO: se puede conservar en refrigeracin o a
temperatura ambiente por aos.
B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:
Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiolgica
( esterilizacin por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
Glicerol al 10%
Caldo BHI con glicerol 20%. Bqca. Alicia Irene Cuesta
76
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA
B) CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS:

Proceso de congelacin:
Equipamiento o insumos para lograr la congelacin
(Congelador o cmara o uso de Nitrgeno lquido).
Temperaturas de congelacin:
Deseable a -70 o -80 C o menores temperaturas.
A temperaturas ms altas como -20 C no es lo ideal pero
tal vez sea la nica forma posible. Es preferible a -40 C.
Envases: Uso criovial o tubo estril.
PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura
congelacin por aos.
Inconveniente: problemas y prdida de las cepas la falta
de suministro de energa, falta de insumos o avera del
equipamiento.
77
LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO
DE CEPAS DE RESERVA
MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE

CEPAS DE RESERVA !! Es muy importante un buen mtodo de
conservacin de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y
la cepa microbiana autntica!!
Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos bsicos de
Microbiologa.
Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo.
Las instrucciones del fabricante de los sistemas de preservacin de
cepas disponibles comercialmente deben ser rigurosamente respetados
y observados.
En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no deben
volver a congelarse.
El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.
Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a
usar
78
FACTORES QUE AFECTAN

LA VIABILIDAD DE LA CEPA
La viabilidad de las cepas, sometidas a un proceso de congelacin
(para su almacenamiento), est determinada por los siguientes factores:
a)Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram positivas resisten mejor que las
Gram negativas.
b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones posibles antes de ser
expuesto a bajas temperaturas.
Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas temperaturas:
1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del microorganismo de
sobrevivir.
Cultivos demasiados jvenes o demasiado viejos son menos resistentes al
shock trmico.
Ideal es fin etapa logartmica principio fase estacionaria tiene mayor
probabilidad de recuperacin.
( en bacterias en general es 24 horas de incubacin a 37 C)
2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO tambin juegan un papel importante
Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen mayor resistencia
a la temperatura que aquellas que desarrollan en un medio slido
79
Ejemplo: Supervivencia de los microorganismos

almacenados a 20 C en Mast Cryobank
Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR
Microorganismo
Enterobacter aerogenes
Pseudomona aeruginosa
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
Rhodococcus equi
Bacillus cereus
Clostridium perfringes
Supervivencia en
meses
48
18
48
48
48
48
48
24
48
80
Cepas de trabajo:
Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las
cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo
precisen.
Obtencin de cepas de trabajo:
Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de
reserva sobre un medio slido o lquido no selectivo adecuado
utilizando un ansa estril e incubando en condiciones adecuadas.
Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.
81
CEPA DE REFERENCIA
Reconstitucin
Cultivada una sola vez
*
Obtencin de CEPAS DE RESERVA
Conservacin por distintos mtodos
( liofilizacin y congelacin)
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
Esquema de
cultivos de
referencia:
*Controles de
pureza y pruebas
bioqumicas de la
cepa.
Referencia:
Gua ENAC-04
Descongelacin/reconstitucin
CEPAS DE TRABAJO
(especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
Utilizacin en el control de calidad, validacin, etc de los ensayos
82
PASOS a seguir para el

manejo de los cultivos de referencia:
PROVEEDOR DE CEPA
LABORATORIO
LABORATORIO
LABORATORIO
Adquisicin de cepa de referencia (C Ref):

-Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida.
Subcultivo de C Ref:
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
Preparacin de la cepa de reserva (Cres)
-Control de pureza y viabilidad peridicos (REGISTRO).
-Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva
Incorporada al cepario.
CONDICIONES CONTROLADAS DE
ALMACENAMIENTO DE LA CEPA DE RESERVA
Subcultivo la cepa de reserva (C t):
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
USO PARA CONTROLES DE CALIDAD
83
Norma ISO 17025
EQUIPOS
REQUISITOS: EQUIPOS
El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos

necesarios para la correcta ejecucin del ensayo.
Los equipos y su soporte lgico usados en la realizacin del
ensayo y muestreo deben permitir lograr la EXACTITUD
REQUERIDA y cumplir con las especificaciones establecidas
para los ensayos.
Hay equipos cuya exactitud es clave en el impacto sobre la
incertidumbre de los resultados, por lo que es imprescindible que
cumplan siempre con las especificaciones ms relevantes del
mtodo.
84
Equipos habituales
de un laboratorio microbiolgico :
Material de uso general: Material de vidrio o plstico
(Ejemplo: tubos de ensayo, placas de Petri, etc.),
instrumentos de muestreo, ansas de siembra, etc.
Equipos volumtricos como pipetas, distribuidores
automticos, sembradores en espiral, etc.
Instrumentos de medida: termmetros, cronmetros,
balanzas, medidor de pH, contadores de colonias, etc.
Estufas, autoclaves, baos termostticos, heladeras,
congeladores, campanas de flujo laminar, equipos de
filtracin, etc.
85
Calibracin.
Definicin: Conjunto
de operaciones que
PERMITEN ESTABLECER,
en condiciones especificadas,
LA RELACIN EXISTENTE ENTRE :
los valores indicados por
el instrumento de medida o
un sistema de medida
o un material de referencia
y
los correspondientes valores conocidos del
mensurando.(valores de una magnitud obtenidos
mediante un patrn de referencia)
86
Calibracin:
Formas de establecer esta relacin es mediante:

Tablas de correccin
Rectas o curvas de calibracin
otras
CALIBRACION
Elimina el error
CORRECCION
Incertidumbre
87
Ejemplo:
Calibracin de un termmetro
Qu hago?
1.Mido n veces a una
Temperatura y completo la
TABLA 1.
2.Esto lo realizo para
diferentes temperaturas (Ti)
segn los requerimientos.
3. Calculo la correccin e
incertidumbre para cada
punto.
Tx
TABLA 1
Termmetro a calibrar (Tx)
Termmetro patrn (Tp)
Termmetro
a calibrar
(C)
Termmetro
patrn
(C)
Tp
Bao de agua
El bao se pone a Ti
88
Certificado de calibracin
de un termmetro
Ejemplo de resultados
Indicacin del
termmetro
( C)
Correccin
( C)
Incertidumbre
( C)
5.5
-0.4
+0.1
30.0
0.2
+0.2
36.8
0.2
+0.2
42.1
0.0
+0.3
89
Certificado de calibracin
de un termmetro
Debe figurar:
Descripcin e identificacin del
instrumento que se calibr.
Fecha de calibracin.
Fecha de emisin del certificado de
calibracin nombre del cliente
Metodologa empleada para calibrar.
Rango de calibracin.
Resultados: correccin e incertidumbre
para cada temperatura.
90
Incertidumbre de la medicin. Definicin: Parmetro

asociado al resultado de la medicin, que caracteriza la
dispersin de los valores que podran ser razonablemente
asignados al mensurando. INDICA LA CALIDAD DE UNA
MEDICIN.
Tolerancia. Definicin: Indica el rango de variabilidad

aceptable para un dado valor. Es un concepto asociado con
la especificacin.
Relacin de exactitud (RE)
RE = Especificacin
Incertidumbre
ISO 100012 recomienda RE>3:1, preferiblemente hasta 10:1

91
VERIFICACIN.
Definicin: Confirmacin por examen y provisin de
evidencia de que los requerimientos especificados han
sido satisfechos.
Ejemplo: Verificar diariamente una balanza con una pesa calibrada.
Verificacin del instrumento de medicin
VERIFICACIN
Asignar a la
tarea de medicin
TOMO
DECISION
Reparar/ ajustar
Usarlo para otro equipo

Declararlo fuera de uso
92
REQUISITOS: EQUIPOS (cont)

Antes de poner en servicio un equipo se lo debe calibrar o
verificar con el fin de asegurar que responde a las exigencias
especificadas del laboratorio y est conforme a las
especificaciones normalizadas pertinentes.
El equipo debe ser verificado o calibrado antes de su uso.
El laboratorio debe documentar e implementar Programas
para calibracin y/o verificacin limpieza, mantenimiento y
esterilidad de los equipos cuando sea necesario. (Los que
tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos).
REQUISITOS PROVEEDORES DE CALIBRACION DE
EQUIPOS:
La calibracin de los equipos debe ser llevada a cabo por
laboratorios de calibracin que demuestren su competencia y
su capacidad de medicin y trazabilidad (Laboratorio acreditado o
aceptado por el organismo de acreditacin).
93
Tipo de Equipamiento
Requisitos
Recalibrado y plenamente
trazable
Recalibrado y plenamente
trazable
Frente a un termmetro de
referencia en punto de
congelacin y/o rangos de
temperatura de trabajo
Frente a un termmetro de
referencia en punto de
congelacin y/o rangos de
temperatura de trabajo
Calibracin plenamente
trazable
Frecuencia sugerida
Pesas de calibracin
Calibracin plenamente
trazable
Bianualmente/
Anualmente.
Pesas de control
Frente a pesa calibrada o

verificar en la balanza
Anualmente.
inmediatamente despus de
la calibracin trazable
Microscopios
Calibracin trazable al
micrmetro (cuando sea
apropiado)
Inicialmente
Centrifuga
Calibracin trazable o
verificacin con un
tacmetro independiente
Anualmente.
Cronmetro
Frente a la hora oficial
Anualmente.
Termmetro de referencia
Termocupla de referencia
Termmetro de trabajo
Termocupla de trabajo
Balanza
Cada 5 aos
Anualmente.
Anualmente.
Directrices para calibracin

de equipos en el laboratorio
de microbiologa.
Anualmente.
Anualmente.
G-ENAC-04. Gua para la

acreditacin de laboratorios
que realizan anlisis
microbiolgicos
94
REQUISITOS: EQUIPOS (cont)

Es de primordial importancia que el laboratorio cuente con un programa
formal, documentado e implementado de mantenimiento de equipos.
El mantenimiento de los equipos esenciales debe realizarse a intervalos
especificados.
(por el departamento de mantenimiento, por el proveedor, fabricante, etc).
En el documento ISO 7218: 1996 (E), se facilitan directrices sobre el
mantenimiento de los equipos.
PARA CADA EQUIPO UTILIZADO EN LOS ENSAYOS EL LABORATORIO
DEBE TENER:
Identificacin inequvoca y registro del equipo (con su soporte lgico o
software).
Los resultados de las calibraciones y verificaciones.
Las instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento del equipo
disponibles (incluido el manual suministrado por el fabricante) para el uso del
personal del laboratorio.
95
Autoclave
Los controles biolgicos:
Evalan la efectividad de la totalidad del proceso de
esterilizacin.
Contienen esporas
de gnero Bacillus.
En todos los casos los resultados obtenidos de
controles qumicos y biolgicos se deben registrar.
96
Verificacin de la
temperatura de trabajo:
Registro de control de
temperatura:
Se realiza un monitoreo
continuo de las
temperaturas de las estufas,
-Equipo.
heladeras, congeladores
usados para la realizacin
-N de inventario.
del ensayo.
-Instrumento:
Correccin e
La temperatura del bao
incertidumbre del
termosttico se registra
termmetro.
antes de su uso.
-Rango de aceptacin.
-Tolerancia.
97
Norma ISO 17025
MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS
El laboratorio debe tener procedimientos para :

El transporte
La recepcin
La proteccin, el almacenamiento.
La manipulacin
La conservacin o la disposicin final de las
muestras a ensayar.
98
Requisitos:
MUY IMPORTANTE: El laboratorio debe tener un sistema
para la identificacin unvoca de las muestras a ensayar.
La identificacin debe ser conservada a lo largo de la vida
de la muestra en el laboratorio.
El sistema debe ser diseado y operado de modo tal que
asegure que las muestras no puedan ser confundidas
fsicamente o cuando se haga referencia a ellas en registros u
otros documentos.
El laboratorio debe tener procedimientos e instalaciones
apropiadas para evitar el deterioro, la prdida o dao de
las muestras durante su manipulacin, preparacin y
almacenamiento.
99
REQUISITOS:
RECEPCIN DE LAS MUESTRAS: Las condiciones de llegada al
laboratorio de las muestras deben ser verificadas por el personal
perteneciente al mismo.
Si la muestra es:
Insuficiente o
se encuentra en mal estado por deterioro fsico, temperatura
inapropiada, envase roto o etiquetado defectuoso.
El laboratorio debe consultar con el cliente antes de decidir si analiza o
rechaza la muestra.
Debe indicar su estado en el informe del ensayo.
Una vez recibidas las muestras se analizarn lo antes posible.
La preparacin de las muestras y porciones de ensayo realizado por el
laboratorio inmediatamente antes del ensayo debe efectuarse conforme a
procedimientos documentados basados en normas nacionales o
internacionales, si es que existen, o a mtodos internos validados.
Los procedimientos de preparacin de las muestras y porciones de
ensayo deben disearse teniendo en cuenta las directrices generales
contenidas en los documentos en ISO 6887 e ISO 7218.
100
REQUISITOS:
Se debe llevar los registros del desarrollo del trabajo.
Las muestras que se encuentren a la espera de ser analizadas
deben almacenarse en condiciones adecuadas para reducir al
mnimo cualquier modificacin en la poblacin microbiana presente.
Debe existir un procedimiento documentado para la conservacin
y eliminacin de muestras.
Las muestras deben conservarse hasta que se hayan obtenido
los resultados del ensayo, o ms tiempo segn sea necesario.
Cuando se sepa que algunas porciones de muestras de ensayo
del laboratorio estn altamente contaminadas, deben
descontaminarse antes de su eliminacin.
101
Los tiempos lmites de almacenamiento

dependern del tipo de producto
Referencia: Norma ISO 7218:1996 (E)
(1) Si no se puede procesar

en ese tiempo, las muestras
se pueden congelar por
debajo -18 C.
Esto debe ser mencionado en
el informe de ensayo.
Precaucin: En algunos
productos el congelamiento
produce un cambio de la
composicin de la flora.
Tipos de Productos
Estables
Fresco o refrigerados
Pasteurizados y
productos similares
Unidades estables
daadas
Tiempos lmites de
almacenamiento (horas)
Tan rpido como sea
posible y
antes de su fecha de
vencimiento
dentro de 24 horas de la
recepcin la muestra (1)
Tan rpido como sea
posible y
antes de su fecha de
vencimiento
Tan rpido como sea
posible y dentro de 48
horas
102
Norma ISO 17025
ENSAYOS INTRALABORATORIOS
ENSAYOS INTERLABORATORIOS
CONTROL DE CALIDAD: Es la combinacin de sistemas, procedimientos,

actividades, instrucciones y estudios que realiza la organizacin para
controlar y mejorar las operaciones llevadas a cabo. Ejemplo: monitoreo
del ambiente, capacitacin del personal, evaluacin de la calidad y esterilidad de los medios
de cultivo, calibracin, verificacin y mantenimiento de equipos
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD: Es un sistema de actividades que

dan confianza que los sistemas de control de calidad funcionan y
permiten con eficacia obtener resultados analticos de alta calidad.
Es un programa de actividades llevadas a cabo por el laboratorio con la
finalidad de verificar que los resultados obtenidos tienen una precisin y
exactitud aceptable
y mejorar en conjunto el funcionamiento del mismo.
Estos programas son planificados y revisados peridicamente
Ejemplo es participacin en ensayos intralaboratorios e interlaboratorios
103
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS
Dicho programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el
alcance de acreditacin del laboratorio.
La frecuencia de realizacin de cada uno de estos Programas queda
establecida por el laboratorio.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS RESULTADOS DE
ENSAYO: El laboratorio debe tener procedimientos de control de
calidad para monitorear la validez de los ensayos llevados a cabo.
Son las actividades que se deben realizar para todos los ensayos
acreditados.
Comprenden:
1. Control interno: Un programa de controles peridicos es necesario
para demostrar que se controla la variabilidad (por ejemplo, entre
analistas y entre equipos o materiales, etc.). Permite la evaluacin
continua del trabajo el laboratorio.
2. Control externo (intercomparaciones):
La participacin en Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency
Testing) permite la evaluacin del sesgo de forma que el laboratorio
pueda demostrar que se mantiene dentro de los criterios de
aceptacin definidos por normas, reglamentos, por el cliente o por el
laboratorio.
104
Control interno:
El principal objetivo es asegurar la coherencia de los resultados
obtenidos diariamente y el cumplimiento de los criterios establecidos.
Control de las condiciones de trabajo: proporciona informacin
sobre la buena prctica en la realizacin de los ensayos y sobre la
esterilidad de los medios y materiales auxiliares utilizado. Evala la
posible contaminacin cruzada. Ejemplo: muestras estriles o control de
esterilidad.
ENSAYOS CUANTITATIVOS
Control de la precisin: muestras naturales sin inocular y/o
muestras naturales inoculadas con materiales de referencia.
Control de recuperacin: muestras inoculadas con materiales de
referencia.
ENSAYOS CUALITATIVOS
El Control de la calidad interno debe incluir actividades que
garanticen un adecuado control del lmite de deteccin.
105
Control interno:
Uso de cepas de referencia: Empleo de cepas de referencia
durante la realizacin del ensayo como control positivo, negativo,
muestras inoculadas para control.
ENSAYOS INTRALABORATORIO: Son las verificaciones de calidad
para evaluar el desempeo de los analistas del laboratorio en un
ensayo.
Mtodos cuantitativos: Se comparan los resultados obtenidos :
Por cada analista perteneciente al laboratorio que realiza por
duplicado el anlisis de la muestra (repetibilidad de cada analista).
Entre analistas del mismo laboratorio para un ensayo
(reproducibilidad entre analistas).
Mtodos cualitativos: verifico que los resultados entre analistas sean
concordantes y conformes.
Se comparan los resultados obtenidos entre analistas del mismo
laboratorio para un ensayo.
106
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
DE LOS RESULTADOS
LOS CONTROLES DE CALIDAD INTERNOS NO SON

SUFICIENTES.
No puedo determinar mediante ellos el Valor verdadero!!
Realizo un Control de calidad externo.
Definiciones:
Valor verdadero : valor en consistencia con la definicin de una
magnitud (concepto abstracto, no realizable).
Valor asignado o valor de referencia: es el valor
convencionalmente verdadero.
Exactitud de una medicin: Proximidad entre el resultado de una
medicin y el valor verdadero del mensurando.
107
Ejemplo:
Precisin. Justeza y Exactitud
Resultados imprecisos y justos:

No exactos
Resultados precisos y No justos:

No exactos
Resultados precisos y justos:

exactos
108
Resultados imprecisos y No justos:

No exactos
Clculo del valor de referencia o valor asignado:

Uso un material de referencia certificado.
Casi nunca son estos los casos en ensayos microbiolgicos.
Se considera que el valor medio obtenido por el conjunto de
laboratorios luego de eliminar los outliers en el propio ejercicio puede
utilizarse como valor de referencia o valor verdadero.
Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :
Los programas de ensayos de aptitud organizados externamente por
un proveedor de ensayos interlaboratorio
CONSTITUYEN UN MEDIO INDEPENDIENTE por el cual un
laboratorio se puede EVALUAR OBJETIVAMENTE
y demostrar la veracidad y precisin de los resultados obtenidos por
sus mtodos analticos.
109
Ensayos de Aptitud Interlaboratorio (Proficiency Testing) :

Constituye una herramienta para la evaluacin externa de la calidad
de los resultados de ensayo o desempeo del laboratorio.
La participacin en estos ensayos PERMITE AL LABORATORIO
COMPARAR SUS RESULTADOS FRENTE A LOS DE OTROS
LABORATORIOS.
Los laboratorios deben participar regularmente en ensayos de
aptitud relacionados con el alcance de su acreditacin, dando
preferencia a los programas de ensayos de aptitud que utilicen
matrices apropiadas.
Cuando los resultados de los ensayos NO resultan dentro del
intervalo de conformidad o se visualice una tendencia determinada
tomar respectivamente acciones correctivas o preventivas, siguiendo
los lineamientos establecidos en el Procedimiento Reclamos,
sugerencias, no conformidades, acciones correctivas y acciones
preventivas.
110
fa
ct
o
Clasificacin
Satisfactorio
Cuestionable
Insatisfactorio
in
sa
tis
Valor de Z-score:
lzl<2
2 < lzl < 3
lzl >3
Z-
cu
rio
es
tio
na
bl
sa
e
tis
fa
ct
or
sa
io
tis
fa
ct
or
sa
io
tis
fa
ct
or
cu
io
es
tio
na
in
bl
sa
e
tis
fa
ct
or
io
Ensayos de Aptitud
Interlaboratorio
Mtodos cuantitativos
(Proficiency Testing) :
STAPHYLOCOCCUS aureus - cereal

Z-score-2=5257ufc/g valor asignado=21000ufc/g
score+2=83891ufc/g
80
70
60
50
40
30
20
10
0
111
Ensayo:
Matriz:
Proveedor del
Ensayo
Interlaboratorio
Registro Ensayos de Aptitud Interlaboratorio

Ensayos cualitativos (Proficiency Testing) :
Identificacin
de las
Muestras
Fecha de
anlisis
de las
muestras
Analista
Metodologa
usada por el
laboratorio
Resultado
obtenido
por el
laboratorio
Valor
asignado
Clasificacin
obtenida
Satisfactorio
/Insatisfactorio
Firma del
responsable
112
IMPORTANTE!!!
Los datos obtenidos a
travs
del programa el
aseguramiento de la calidad
deben ser registrados en
forma tal
que se puedan detectar las
tendencias
y aplicar tcnicas
estadsticas
para la revisin de los
resultados.
113
Periodicidad de las actividades

de control de calidad
Se deben establecer considerando diversos factores:
La robustez del mtodo utilizado ( en funcin de los
controles especficos incluidos en el mismo, empleo de
placas duplicadas, mtodo de referencia o de rutina,
datos de validacin, etc)
La frecuencia con la que el laboratorio ejecuta dichos
ensayos.
Los resultados histricos de control de calidad y
aseguramiento de calidad.
114
Validacin de los mtodos

microbiolgicos
Norma ISO 17025
Objetivos Generales a desarrollar:

Intentaremos contestar las siguientes preguntas:
Qu es validar un mtodo?
Por qu y para qu valido un mtodo?
Cmo valido un mtodo?
Cundo valido un mtodo?
115
Ejemplo: Un laboratorio dise una nueva metodologa

para la deteccin de E coli O157:H7 basada en el uso de
anticuerpos monoclonales para evaluar la inocuidad y
calidad de alimentos crnicos.
Qu caractersticas tendrn que tener los resultados
que arroja dicho mtodo?
Puedo emplearlo inmediatamente para emitir
resultados que impliquen una decisin de conformidad o
no con las especificaciones alimentarias vigentes?
116
La respuesta es:
Antes de usar un mtodo debo asegurarme que haya sido validado
Necesito que el mtodo sea:
Adecuado para el propsito.
Los datos que arroja un ensayo le permiten al usuario
tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas
para un propsito preestablecido.
La Norma ISO 17025 en el punto 5.4.2 establece que El laboratorio debe
utilizar mtodos de ensayo que satisfagan las necesidades del cliente y sean
apropiadas para el uso previsto
Definiciones:
Validacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que
se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin
especfica.[ISO 9000: 2000]
Verificacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que
se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]
Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de
acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario.
117
Por qu y para qu
es necesario
validar un mtodo?
Respuesta:
El laboratorio microbiolgico tiene la responsabilidad de garantizar
que los resultados que l produce son exactos, validos y confiables
de modo de proporcionar informacin til acerca de la inocuidad y
calidad sanitaria de los alimentos.
Si el resultado de un ensayo no es confiable, el ensayo no
presenta ninguna utilidad y sera mejor no realizarlo.
Cuando un cliente recurre a un laboratorio microbiolgico a solicitar
un anlisis, lo hace porque necesita resolver un problema
y no puede hacerlo por s mismo y espera poder confiar en los
resultados.
PARA SABER SI ESE ENSAYO SIRVE PARA LO QUE LO
QUIERO USAR.
PARA CONOCER EL COMPORTAMIENTO DEL MTODO.
118
Evidencias objetivas: Cmo puedo aportarlas?

En el marco de un adecuado criterio microbiolgico, tengo
dos herramientas fundamentales que permiten sacar
conclusiones:
Diseo de experimentos estadsticamente vlidos.
Anlisis de los resultados usando mtodos estadsticos.
Antes de realizar la validacin se deben especificar:
ALCANCE:
Matriz
Concentracin en la que se aplica.
Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA
LOS FINES (teniendo en cuenta los requisitos particulares
para un uso especfico previsto).
119
Buenos resultados del ensayo

Se identifican 6 principios de la prctica analtica, los cuales cuando se
implementan simultneamente conducen a una buena prctica:
1.Las mediciones analticas deben hacerse de forma tal que satisfagan
un requerimiento acordado (un objetivo definido)
2.Deben realizarse utilizando mtodos y equipos que hayan sido
probados para asegurar que son aptos para un determinado
propsito.
3.El personal que realiza las mediciones debe ser competente y
estar calificado.
Debe haber una verificacin independiente (externa) y peridica de
la competencia tcnica del laboratorio.
5. Las mediciones analticas realizadas en un laboratorio deben ser
consistentes con las que se realizan en cualquier otro lugar.
6. Los laboratorios que realicen ensayos deben tener procedimientos
bien definidos de control de calidad y de aseguramiento de la
calidad.
120
MTODO DE REFERENCIA. Definicin:

Mtodo investigado a fondo, que describe con claridad y
exactitud las condiciones y los procedimientos
necesarios para medir los valores de una o ms
propiedades.
Que ha demostrado tener una exactitud y una precisin
apropiadas para el uso que pretende hacerse del
mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la
exactitud de otros mtodos empleados para realizar la
misma medicin y, en particular, para caracterizar un
material de referencia.
En general se trata de un mtodo normalizado nacional
o internacional.
121
En nuestro caso ejemplo:

La presencia de E.coli O157:H7 en un alimento puede ocasionar, para
un determinado grupo poblacional, enfermedad y muerte.
Tambin, cuando se desee comercializar, la partida de alimento ser
rechazada en los sitios de control provocando un dao econmico y de
prdida de imagen. PROBLEMAS DE INOCUIDAD Y CALIDAD.
Por lo tanto, este mtodo propio desarrollado por el laboratorio debe
ser capaz de:
Detectar ese microorganismo.
Detectar la presencia del microorganismo en muy pequeas
cantidades.
Dar los mismos resultados cuando lo repito.
Detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro.
122
Validacin Mtodos de
ensayo microbiolgicos
CUALITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:
LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA

EFECTO MATRICIAL
EXACTITUD RELATIVA
REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD
123
Validacin
Mtodos de ensayo microbiolgicos
CUANTITATIVOS
1 Descripcin detallada del mtodo de ensayo.
Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:
LMITE DE CUANTIFICACIN.
EXACTITUD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
124
LMITE DE DETECCIN
Definicin: Es el nmero mnimo de microorganismos

que pueden ser detectado por el mtodo, pero en
cantidades que no pueden estimarse con precisin.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cualitativos)
Los resultados de los anlisis cualitativos deben
expresarse como : detectado/no detectado en una
cantidad o volumen definidos.
Determino el lmite de deteccin antes de evaluar la
sensibilidad.
125
Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO

MTODO MICROBIOLGICO
Matriz naturalmente o artificialmente
contaminada
Mtodo a
validar
Mtodo de
referencia
Target 1
Target 2
Target 3
Target 4
Target 5
NO Target 1
NO Target 2
NO Target 3
NO Target 4
NO Target 5
126
Ejemplo: DISEO DE EXPERIMENTO

MTODO MICROBIOLGICO
Resultado del
mtodo
a validar
Positivo
Resultado
asignado
POSITIVO*
Resultado
asignado
NEGATIVO *
Total
+/+ (PV)
+/- (DP)
PV + DP
Negativo
-/+ (DN)
-/- (NV)
DN + NV
Total
PV + DN
DP + NV
*por mtodo de referencia o

por inoculacin de cepa de referencia.
127
Desviacin negativa (DN). Definicin: Ocurre cuando

el mtodo a validar da un resultado negativo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado positivo.
Esta desviacin se convierte en un resultado negativo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo.
DESVIACIN POSITIVA (DP). Definicin: Ocurre cuando:
el mtodo a validar da un resultado positivo sin confirmacin y
el mtodo de referencia da un resultado negativo.
Esta desviacin se convierte en un resultado positivo falso cuando
puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo.
FALSOS POSITIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un
resultado positivo cuando la muestra no contiene el analito.
F + = DPc/ DP + NV = 1- ESPECIFICIDAD
FALSOS NEGATIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un
resultado negativo cuando la muestra contiene el analito.
F - = DNc/ DN + PV = 1- SENSIBILIDAD
128
SENSIBILIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias POSITIVOS
que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Sensibilidad %= PV/(DN c + PV) x100
Capacidad del mtodo de dar positivo cuando las muestras tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Sensibilidad %= 3/5x100= 60%
ESPECIFICIDAD:
Definicin: Fraccin del nmero total de cultivos o colonias
NEGATIVOS que son correctamente asignados con el mtodo
utilizado. [ISO 13843:2000]
Especificidad %= NV/(DPc + NV) x100
Capacidad del mtodo de dar negativo cuando las muestras no tienen el
analito
Resultado del caso ejemplo: Especificidad %= 4/5x100= 80%
129
EXACTITUD RELATIVA.
Definicin: Grado de concordancia entre los resultados
del mtodo evaluado y los obtenidos utilizando un mtodo
de referencia reconocido
EXACTITUD RELATIVA %= PV + NV/(PV + NV + DN + DP) x100
Definicin: Nmero mnimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que puede determinarse en
las condiciones experimentales del mtodo evaluado.
Tengo en cuenta la incertidumbre del mtodo para valores
bajos.
(Aplicado a anlisis microbiolgicos cuantitativos)
130
Repetibilidad (r). Definicin: Grado de

concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en las
mismas condiciones de medicin.
Reproducibilidad (R). Definicin: Grado de
concordancia entre los resultados de sucesivas
mediciones del mismo mesurando realizadas en
diferentes condiciones de medicin.
El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo
pero en diferentes condiciones.
131
ROBUSTEZ definicin: insensibilidad de un mtodo

analtico a pequeos cambios en el procedimiento. Para
examinar la robustez es aconsejable abusar del mtodo en
un camino controlado.
ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIN
EN MICROBIOLOGA: la incertidumbre de medicin es un
parmetro asociado al resultado de la medicin,
que caracteriza la dispersin de los valores que
podran ser razonablemente asignados al
mesurando.(mtodo cuantitativo)
132
INCERTIDUMBRE DE MEDICIN Y
CUMPLIMIENTO DE ESPECIFICACIONES
A Declaracin de no cumplimiento con la especificacin.

B y C Limitarse a informar los resultados y su incertidumbre
(INDETERMINADO)
D Declaracin de cumplimiento con la especificacin.
Rango de especificacin
133
En nuestro caso ejemplo:

Ensayo de Deteccin de E.coli O157:H7 en un alimento
Dijimos que:
Necesito un mtodo capaz de detectar ese
microorganismo=Sensibilidad
Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia del
microorganismo en muy pequeas cantidades.= Lmite
de deteccin
Realizo muchas veces el mtodo y los resultados del
ensayo se repitan = repetibilidad y reproducibilidad
Necesito un mtodo capaz de detectar la presencia de
ese microorganismo y no de otro = Especificidad
134
PROTOCOLO DE VALIDACIN
El laboratorio acuerda con el cliente el mtodo a usar
para realizar un ensayo.
El laboratorio debe usar los mtodos y procedimientos
ms apropiados dentro de su alcance para todos los
ensayos.
Caractersticas que se tienen en cuenta para
seleccionar el mtodo de ensayo:
Propiedades analticas: precisin, exactitud,
especificidad, sensibilidad, el lmite de cuantificacin y/o
de deteccin, los efectos matriciales
Facilidad de uso o automatizacin.
Rapidez de anlisis o respuesta.
Costo.
Mtodo normalizado
135
PROCESO DE VALIDACION
METODO A VALIDAR
DISEO Y
EJECUCION
DE ENSAYOS
DATOS
METODO VALIDADO
COMPARACION
CON
REQUISITOS
DE USO
PREVISTO
ANALISIS
ESTADISTICO
136
Definicin de mtodo alternativo:

Es un mtodo de anlisis que demuestra o estima un
analito (un microorganismo, sus componentes o su
producto), para una categora dada de productos, como lo
hace su correspondiente mtodo de referencia.
El mtodo alternativo exhibe atributos apropiados a las
necesidades de los usuarios, por ejemplo:
- la velocidad de anlisis y/o respuesta;
- la facilidad de ejecucin y/o automatizacin;
- las propiedades analticas (la precisin, exactitud, el
lmite de deteccin, etc.);
- la miniaturizacin;
- el reduccin de costo.
137
Qu mtodos se validan?
LOS MTODOS basados en normas.
LOS MTODOS QUE DISEA O DESARROLLA EL LABORATORIO.
LOS MTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL
ALCANCE PREVISTO.
Verifico USO MTODOS OFICIALES, MTODOS NORMALIZADOS O
MTODOS DE ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES
RECONOCIDOS.
es recomendable la utilizacin de mtodos normalizados o de
referencia,
siempre y cuando stos estn disponibles
y sean apropiados
138
Bsqueda de informacin sobre datos de validacin

previa.
CUANDO HAY GRAN INFORMACIN SOBRE UNA
METODOLOGA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR
SON RELATIVAMENTE SENCILLOS,
SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIN
SER EXTENSA.
139

MTODOS DESARROLLADOS
POR EL LABORATORIO:
Debe ser :
Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO)
Ser asignada a personal calificado
Proveer los recursos necesarios.
Los planes deben ser actualizados a medida que avanza

el desarrollo y deben asegurar que la comunicacin sea
eficaz entre todo el personal involucrado.
En este caso, el proceso de validacin es mucho ms
arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido
responde a lo esperado.
140
LOS MTODOS NORMALIZADOS

EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO
Mtodos normalizados aplicados a matrices que no se

especifiquen en el procedimiento normalizado.
Ampliaciones y modificaciones de los mtodos
normalizados.
Para demostrar que una versin modificada de un mtodo
cumple las mismas especificaciones que el mtodo
original, deben realizarse comparaciones utilizando
replicados.
141
Sistemas de ensayo comerciales (kits)

Los laboratorios deben conservar los datos sobre la
validacin de los sistemas de ensayo comerciales (kits)
que utilicen.
Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de
intercomparacin o de datos sobre validacin remitidos
por los fabricantes y sujetos a la evaluacin de una
tercera parte (p. ej., AOAC). www.aoac.org
Si no se dispone de datos sobre validacin o si stos no
son plenamente aplicables, el laboratorio ser
responsable de completar la validacin del mtodo.
142
MTODOS NORMALIZADOS:
Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios
debern verificar su capacidad para cumplir de forma
satisfactoria todos los requisitos establecidos en
dichos mtodos.
El laboratorio debe confirmar que puede operar
correctamente los mtodos normalizados antes de
introducir los ensayos.
Se debe mantener actualizadas las normas.
Si el mtodo normalizado cambia, se debe repetir la
confirmacin.
143
LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE ENSAYO DEBE:

REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO.
(USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE
CONTAMINADAS).
LA EXTENSIN DE LA VALIDACIN NECESARIA DEPENDER
DEL MTODO Y SU APLICACIN.
LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA
ACTIVIDAD.
EN TODOS LOS CASOS UN PARMETRO PARA LA
VALIDACIN DE ENSAYOS MICROBIOLGICOS ES LA
DESCRIPCIN DEL MTODO DE ENSAYO.
144
Uso de muestras naturalmente contaminadas

y preparacin de muestras artificialmente
contaminadas en estudios de validacin
Anexo C ISO 16140:2003
1ra opcin: Muestras naturalmente

contaminadas
2da opcin: Contaminacin por mezcla.
3ra opcin: Muestras inoculadas (el nivel de
microflora debe representar la contaminacin de
las muestras naturalmente contaminadas).
4ta opcin: Materiales de referencia
145
Validar mtodos microbiolgicos requiere:

Comparar con un MTODO DE REFERENCIA.
REFERENCIA
Usar cepas de referencia y cepas de referencia
certificadas.(Material de referencia).
LA EVALUACIN SISTEMTICA DE FACTORES.
Ensayos Interlaboratorios.
Interlaboratorios
La estimacin de la incertidumbre.
146
El PROTOCOLO INCLUYE:
Primera FASE: Estudios precolaborativos o
validacin interna (estudios comparativos):
Defino la aplicabilidad (concierne al analito de inters y a las
categoras de alimentos a las que se aplica el mtodo).
(TABLA: Clasificacin de categoras de alimentos para
estudios de validacin Anexo A AOAC).
Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos

Cuando la exigencia es de disponer de mtodos validados
plenamente, se considera habitualmente que la validacin
plena de un mtodo de anlisis comprende un examen de las
caractersticas del mtodo en un estudio del funcionamiento
del mtodo entre laboratorios .
147
Primera etapa de la validacin Ensayos selectivos

se usan cepas en estudios de( VALIDACION INTERNA):
INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos

pertenecientes al grupo deben ser detectados por
el mtodo.
SENSIBILIDAD
EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que

no pertenecen al grupo no deben ser detectados
por el mtodo.
ESPECIFIDAD
148
Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G

Categoras de Grupos Target:
Eleccin de microorganismos qu
cepas uso?
a) Un grupo Ejemplo Coliformes,

levaduras, bacterias acido-lcticas
Aquellas que dan reaccin tpica en el

mtodo de referencia.
b) De la Familia Ejemplo
Enterobacteriaceae
Incluir miembros representativos de

todos los gnero pertenecientes a la
familia
c) Gnero Ejemplo Salmonella spp
Incluir miembros representativos si es

posible de todas las especies
pertenecientes al gnero.
d) Especie Ejemplo Listeria

monocytogenes
Rango de cepas pertenecientes a la

especie
e) Cepa Ejemplo Listeria

monocytogenes 1a
Rango de fuentes de esta cepa
149
Cepas para ensayos de selectividad: ISO 16140:2003 ANEXO G

Categoras de Gruposno Target :
Eleccin de microorganismos
a) Un grupo no target
Aquellas que dan reaccin negativa

(segn microorganismo target)
b) De la Familia
Incluir cepas no pertenecientes a la

familia.
c) Gnero
Incluir cepas no pertenecientes al

gnero similar a la cepa target
d) Especie
Incluir cepas no pertenecientes a la

especie, incluidas en el gnero
e) Cepa
Incluir cepas no target, incluidas en

la especie.
150
Validacin mtodo cualitativo
Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

LMITE DE DETECCIN
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN
NEGATIVA
EFECTO MATRICIAL
Exactitud relativa
repetibilidad y reproducibilidad
151
Diseo de un estudio de validacin

mtodo cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative
and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)
Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Compara el mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Los realiza slo el laboratorio organizador.
1.AMPLITUD MATRICES:
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar, analizar 20 o ms alimentos de cada categora.
Obtencin de muestras artificialmente contaminadas:
Inoculo una sola cepa (de inters) por matriz.
Segn proceso al que se somete al alimento uso:
-microoganismo estressado Alimentos procesados-microoganismo sin estress Alimentos no procesados-microoganismo liofilizado-productos en polvo.
152

mtodo cualitativo :
Estudios precolaborativos o validacin interna

(estudio comparativos).
NIVEL DE INOCULO:
Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas.

Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para
obtener distintos niveles inculo.
CUANTIFICACIN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIN

POR NMP: el mismo da que se analizan las muestras.
Nmero de ensayos por nivel de analito: 20
2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la

cepa.(cultivo puro)
Pruebo 50 o ms cepa target y 30 no target (mtodo a validar y mtodo de
referencia).
153

mtodo cualitativo :
Estudios o ensayos colaborativos:

IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian
minuciosamente el protocolo de ensayo.
Nmero de laboratorios:10 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.
Los laboratorios participantes no conocen los valores de las
muestras.(Muestras a ciegas)
Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de
alimentos a validar.
Estudios o ensayos colaborativos:
PREPARACIN DE MUESTRAS:
a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target.
b) Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas)
EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA
HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.
154
Validacin mtodo cuantitativo
Descripcin detallada del mtodo de ensayo.

EXACTITUD
Desviacin positiva y desviacin negativa
sensibilidad
especificidad
155

mtodo cuantitativo :
Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios

comparativos).
Comparacin del mtodo a validar con el mtodo de referencia.
Aplica lo visto anteriormente para mtodos cualitativos.
(tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad slo para
ensayos selectivos)
NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y
alto) que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos
no selectivo (no realizo el control)
ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la
cepa.(cultivo puro)
Pruebo 30 o ms cepa target y 20 no target.(mtodo a validar y mtodo de
referencia)
ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS
Estimacin de desviacin aleatorias y sistemticas del mtodo.
Nmero de laboratorios: 8 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de
alimento.
156

mtodo cuantitativo :
ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS:

a)Recuento de microorganismos especficos: inoculacin del microorganismo
especfico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS
b) NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y alto)
alto
que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no
selectivo (no realizo el control)
Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el
mtodo a validar y el mtodo de referencia.
Se realizan test para eliminar los outliers.
INDICADORES DE APTITUD:
Anlisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inculo.
Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inculo.
RSD es la desviacin estndar relativa.
Es independiente del valor del analito
157
INFORME DE VALIDACION
El laboratorio debe registrar:
RESULTADOS OBTENIDOS.
Establecer el rango de validacin (es la parte del
intervalo de concentracin de un mtodo de anlisis
que ha sido validado). Todo esto debe ser
documentado y archivado.
PROCEDIMIENTOS USADOS.
Declaracin que el mtodo es apropiado para el
fin previsto.
Toda la informacin referida a la validacin debe
documentarse y archivarse.
158
Extensin de la validacin
La extensin de la validacin necesaria depender del
mtodo y su aplicacin.
La validacin es siempre un equilibrio entre costos,
riesgos y posibilidades tcnicas.
Cada laboratorio establecer los requisitos que debe
cumplir el mtodo, con objeto de demostrar que son
adecuados para la finalidad establecida.
159

Microbiological Method Validation

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Aseguramiento de la calidad y validacin

de metodologas para el anlisis microbiolgico

Bqca. Alicia I. Cuesta

SEGURIDAD e INOCUIDAD ALIMENTARIA

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Generalidades de la Norma ISO 17025

Son internacionalmente reconocidos

NORMA ISO 17025: 2005

Es la norma vigente para acreditar laboratorios.

Bqca. Alicia Irene Cuesta

La ley est por encima de las normas

Bqca. Alicia Irene Cuesta

ACREDITACIN (Norma ISO 17025 )

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Particularidades de ensayos microbiolgicos

Pilares sobre los que se apoya la

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Laboratorio da resultados confiables y exactos?

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Los objetivos de un sistema de calidad son:

Las personas son el motor de los sistemas de calidad

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Requisitos Personal (Norma ISO 17025):

Bqca. Alicia Irene Cuesta

CAPACITACIN DEL PERSONAL

Norma ISO17025:2005 punto 5.2.2

La direccin del laboratorio debe formular

Capacitacin del personal

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Requisitos Norma ISO 17025: PERSONAL

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Las instalaciones del laboratorio de ensayo

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Debe haber una efectiva separacin entre reas

Bqca. Alicia Irene Cuesta

MEDIDAS PARA PREVENIR LA CONTAMINACIN CRUZADA.

En la prctica esto se puede lograr:

SEPARACIN DE REAS DEL LABORATORIO:

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Separacin de reas del Laboratorio:

El diseo del laboratorio depender de los ensayos

Medidas para de disminuir el riesgo de contaminacin

Medidas relativas a los materiales :

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Medidas relativas al diseo:

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Se debe controlar el acceso y el uso de las reas que afecta la

El acceso al laboratorio debe estar restringido slo al personal tcnico

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Efecto posible sobre el ensayo

Contaminacin de las muestras y

-Variacin de las condiciones de

Contaminacin de las muestras y

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Bqca. Alicia Irene Cuesta

Relativo al rea de trabajo:

Relativo a la Higiene del personal tcnico: