Aislado de Girasol

Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Exactas
Tesis Doctoral
Protenas de Girasol: aislamiento, caracterizacin

y aplicacin en la industria alimentaria
Tesista: Ing. Qco. Pablo Salgado
Directores: Dra. Adriana Mauri

Dra. Silvana Petruccelli
Ao 2009
El presente trabajo de tesis, para optar por el ttulo de Doctor de la Facultad de

Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata, fue realizado en el Centro de
Investigacin y Desarrollo en Criotecnologa de Alimentos (CIDCA-UNLP, La Plata,
Argentina).
Agradecimientos
Quisiera agradecer a:
Las Dras. Adriana Mauri, Silvana Petruccelli y Sara Molina Ortiz, por haber confiado en
m para llevar a cabo este trabajo de tesis.
Los integrantes de Protenas, por estar siempre presentes y dispuestos para compartir
tcnicas de laboratorio y anlisis de resultados entre mates, alegras y tristezas.
Rolando, Silvina D., Oscar, Adriana y Silvina L., por haberme hecho sentir uno ms del
ITA y por hacer realidad el sueo de la planta piloto.
Vivian, Joo y Carmen, por haberme recibido en Brasil y hacer de mi estada all un
grato recuerdo.
Gabriela Diosma y Aceitera Santa Clara (Molinos Ro de La Plata), por proveer el pellet
de girasol.
Edgardo Donati y Marisa
espectrofluormetro.
Viera
(CINDEFI),
por
poner
disposicin
el
Aldo, Daniel, Javier, Claudio y Arturo, por el apoyo tcnico.

Todos y cada uno de los integrantes del CIDCA, por nuestro tiempo de trabajo
compartido.
ASAGIR, ANPCYT y CONICET por haber financiado el trabajo.
La UNLP, por haberme brindado formacin de excelencia en forma gratuita.
Mis padres, mis hermanos y mi abuela, por sus esfuerzos de cada da, por apoyarme,
por haberme dado siempre lo mejor y por ensearme como ser una buena persona.
Jor, por su apoyo y por su amor incondicional, por elegir cada da compartir su vida
conmigo y hacerme feliz.
Agustn, por su dulzura y su capacidad de hacerme sonrer en los peores momentos,
por hacerme feliz.
Mi familia y mis amigos, por estar siempre presentes.
Dios, por mi vida. La paciencia todo lo alcanza. Quien a Dios tiene, nada le falta. Slo
Dios basta (Santa Teresa de Jess).
Lo importante no es llegar, lo importante es el camino (Fito Pez).
Resumen
Resumen
En el presente trabajo de tesis se estudi la obtencin de concentrados y
aislados proteicos de girasol a partir del pellet residual de la industria aceitera local, y
se caracteriz la funcionalidad de estos productos en relacin a sus potenciales
aplicaciones en la industria alimentaria y de packaging.
En particular se desarrollaron mtodos para la obtencin de productos
proteicos de girasol con distinto contenido de compuestos fenlicos con el fin de
analizar la necesidad de extraer este tipo de compuestos de la formulacin. Las
metodologas que resultaron ms promisorias se escalaron satisfactoriamente a nivel
de planta piloto. Los procesos ensayados permitieron obtener productos proteicos con
diferente composicin, caractersticas y propiedades fisicoqumicas. Los compuestos
fenlicos no pudieron extraerse totalmente, debido a que existe una proporcin de los
mismos que se encuentra interaccionando fuertemente con las protenas.
Independientemente de la concentracin de estos compuestos, todos los productos
presentaron solubilidades en agua superiores al 60%. Se observ, que la coloracin de
los productos no dependa de la concentracin de fenoles, sino de la etapa en donde
stos eran removidos, pero s que al aumentar su contenido aumentaba
significativamente el poder antioxidante de los productos. En cuanto al escalado en la
produccin, si bien no se observaron diferencias significativas en los rendimientos ni
en la solubilidad, s se manifestaron en la composicin y en el estado de agregacin
polipeptdica, en parte atribuible al cambio de la metodologa de secado (liofilizacin
por spray).
Se analiz si las caractersticas diferenciales observadas en las propiedades
estructurales repercutan en el comportamiento funcional de los productos proteicos
estudiados. Se encontr que los aislados de girasol presentaron baja capacidad de
imbibicin de agua y moderada capacidad de retencin de agua. Los cambios
conformacionales que sufrieron las protenas al realizar los lavados para eliminar
compuestos fenlicos, evidenciados en mayores Ho, favorecieron las interacciones
protena-agua. Los productos proteicos obtenidos en planta piloto fueron capaces de
formar espumas y emulsiones a distintos pHs y fuerzas inicas. Dichos factores
Resumen
afectaron mayoritariamente la estabilidad de estos sistemas, debido a que las

protenas presentaron diferentes estados de agregacin. Los aislados producidos en
planta piloto formaron geles autosoportables por induccin trmica, con distintas
caractersticas y propiedades. La presencia de compuestos fenlicos afect el aspecto
visual de los geles obtenidos y disminuy su dureza.
Los productos proteicos, especialmente los aislados, mostraron capacidad de
formar pelculas flexibles biodegradables y/o comestibles por casting, aplicables en
packaging. Los materiales desarrollados presentaron propiedades similares a las de
otras pelculas proteicas, con el adicional que la presencia de compuestos fenlicos,
adems de producir diferencias en la coloracin, activ naturalmente a las pelculas
otorgndoles caractersticas antioxidantes. Estos compuestos no interfirieron en la
formacin de la matriz proteica que constituye la pelcula, estabilizada principalmente
por puentes de hidrgeno y disulfuro, lo que tambin se evidenci en la ausencia de
diferencias en las propiedades barrera y mecnicas entre los materiales obtenidos a
partir de los distintos aislados. A travs de cambios sencillos en la formulacin (tipo y
concentracin de plastificante, pH de la dispersin, agregado de una capa de cera de
abejas, o de celulosa microcristalina), se modific el comportamiento funcional de las
pelculas proteicas de girasol, logrando materiales tiles para distintas aplicaciones.
Adems se estudi la obtencin de materiales rgidos compuestos por almidn
de mandioca, aislado proteico de girasol y fibras de celulosa, por foam baking,
aplicables como posibles sustitutos de las bandejas formadas por poliestireno. Se
observ que el agregado de protenas de girasol a las bandejas de almidn y fibras de
celulosa produjo una importante reduccin en el contenido de agua post-prensado y la
capacidad de absorcin de agua, sin afectar significativamente sus propiedades
mecnicas.
Indice
Indice
Resumen
Indice
Introduccin General
1.- Historia del cultivo de girasol
2.- Importancia econmica del girasol en Argentina
3.- Composicin qumica de las semillas de girasol y sus harinas proteicas
3.1.- Protenas de girasol
3.2.- Compuestos fenlicos presentes en las semillas de girasol
3.3.- Calidad nutricional del pellet proteico de girasol
4.- Obtencin de productos proteicos de girasol
5.- Propiedades funcionales de las protenas
5.1.- Relacin estructura-funcionalidad
5.2.- Propiedades funcionales de las protenas de girasol
6.- Ejes de trabajo
1
2
4
7
8
11
12
16
18
19
26
OBJETIVOS
28
Captulo I: OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE

GIRASOL
I.1.- Introduccin
29
I.2.- Materiales y Mtodos

I.2.1.- Materiales
I.2.2.- Obtencin de productos proteicos de girasol en escala laboratorio
I.2.3.- Determinacin de la composicin qumica
I.2.4.- Determinacin de componentes antinutricionales
I.2.5.- Solubilidad de protenas y fenoles en funcin del pH
I.2.6.- Hidrofobicidad superficial
I.2.7.- Calorimetra diferencial de barrido
I.2.8.- Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida
I.2.9.- Determinacin de Color
I.2.10.- Anlisis estadstico
31
31
31
33
34
35
36
38
38
39
40
I.3.- Resultados y Discusin

I.3.1.- Caracterizacin del pellet molido de girasol
I.3.1.1.- Componentes antinutricionales
I.3.1.2.- Protenas de girasol
I.3.2.- Seleccin de las condiciones de procesamiento para la obtencin
de productos proteicos de girasol
I.3.2.1.- Solubilidad de protenas y fenoles presentes en el pellet
41
41
42
43
45
45
Indice
molido de girasol en funcin del pH

I.3.2.2.- Condiciones operativas para la obtencin de productos
proteicos de girasol
I.3.3.- Caracterizacin de los concentrados y aislados proteicos
obtenidos
I.3.4.- Propiedades Fisicoqumicas de Concentrados Proteicos de Girasol
I.3.5.- Propiedades Fisicoqumicas de Aislados Proteicos de Girasol
I.4.- Conclusiones
46
49
56
60
64
Captulo II: PRODUCCIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE GIRASOL EN PLANTA

PILOTO
II.1.- Introduccin
66
II.2.- Materiales y Mtodos

II.2.1.- Materiales
II.2.2.- Procesos de obtencin de productos proteicos de girasol en
planta piloto
II.2.3.- Caracterizacin de concentrados y aislados proteicos de girasol
II.2.4.- Microscopa electrnica de barrido (SEM)
II.2.5.- Almacenamiento de los aislados proteicos obtenidos
II.2.6.- Anlisis estadstico
68
68
68
II.3.- Resultados y Discusin

II.3.1.- Escalado de las metodologas para la obtencin de productos
II.3.2.- Caracterizacin de Concentrados y Aislados Proteicos de Girasol
II.3.3.- Propiedades fisicoqumicas de concentrados y aislados proteicos
de girasol obtenidos en planta piloto.
II.3.4.- Comparacin Laboratorio vs. Planta Piloto
II.3.5.- Almacenamiento de aislados proteicos de girasol
71
71
II.4.- Conclusiones
84
70
70
70
70
73
76
80
81
Captulo III: PROPIEDADES FUNCIONALES y ANTIOXIDANTES DE PRODUCTOS

PROTEICOS DE GIRASOL
III.1.- Introduccin
86
III.2.- Materiales y Mtodos

III.2.1.- Materiales
III.2.2.- Propiedades funcionales dependientes de la interaccin
protena-agua.
III.2.3.- Propiedades de Superficie: Emulsiones y Espumas
89
89
89
92
Indice

protena-protena.
III.2.5.- Capacidad Antioxidante
III.2.6.- Anlisis estadstico
96
III.3.- Resultados y Discusin

protena-agua.
III.3.2.- Propiedades de Superficie
III.3.3.- Propiedades dependientes de la interaccin protena-protena.
III.3.4.- Capacidad antioxidante
99
99
104
115
118
III.4.- Conclusiones
121
96
98
Captulo IV: PELCULAS FLEXIBLES, BIODEGRADABLES Y COMESTIBLES

OBTENIDAS A PARTIR DE AISLADOS PROTEICOS DE GIRASOL
IV.1.- Introduccin
123
IV.2.- Materiales y Mtodos

IV.2.1.- Materiales
IV.2.2.- Formacin de las pelculas
IV.2.3.- Caracterizacin de las pelculas proteicas
IV.2.4.- Anlisis estadstico
126
126
126
127
133
IV.3.- Resultados y Discusin

IV.3.1.- Caracterizacin de pelculas biodegradables formadas a partir de
aislados proteicos de girasol
IV.3.2.- Optimizacin de la funcionalidad de las pelculas de Ai-P a travs
de variaciones simples en la formulacin utilizada.
134
134
IV.4.- Conclusiones
156
147
Captulo V: MATERIALES COMPUESTOS, RGIDOS Y BIODEGRADABLES

OBTENIDOS A PARTIR DE AISLADOS PROTEICOS DE GIRASOL, ALMIDN DE
MANDIOCA Y FIBRAS DE CELULOSA
V.1.- Introduccin
157
V.2.- Materiales y Mtodos

V.2.1.- Materiales empleados en la obtencin de bandejas
V.2.2.- Diseo experimental
V.2.3.- Obtencin de bandejas por foam baking
V.2.4. Caracterizacin de las bandejas obtenidas
V.2.5.- Anlisis estadstico
160
160
160
160
161
164
Indice
V.3.- Resultados y Discusin

V.3.1.- Formulaciones empleadas y variables del proceso de foam baking
V.3.2.- Estudio de las propiedades fsicas y mecnicas de las bandejas
biodegradables
V.3.3.- Morfologa de las bandejas biodegradables obtenidas
V.3.4.- Efecto del contenido de fenoles sobre las propiedades de las
bandejas biodegradables
165
165
166
V.4.- Conclusiones
177
CONCLUSIONES GENERALES
178
Referencias bibliogrficas
182
Anexo I: Cuantificacin de compuestos fenlicos en productos proteicos de

girasol
199
Anexo II: Balances de materia del proceso de obtencin de concentrados y

aislados proteicos de girasol en planta piloto
208
Anexo III: Materiales compuestos, rgidos y biodegradables obtenidos a partir de

almidn de mandioca, fibras de celulosa y aislados proteicos de girasol con
menor contenido de fenoles
213
174
176
Introduccin General
Introduccin General
1.- Historia del cultivo de girasol

El girasol, pertenece a la familia Asteraceae (Compositae), gnero Helianthus (del
griego helios (sol) y anthos (flor)) (Burger y col., 2008). Su nombre se debe a la
capacidad que posee la planta de orientarse a lo largo del da siguiendo la direccin del
sol.
El inicio de la domesticacin de este cultivo data de 2800 aos antes de Cristo. Sin
embargo, an existe controversia en torno a su origen geogrfico. Algunos autores
afirman que el proceso de domesticacin del girasol se inici en la zona este de
Estados Unidos (Arkansas, Missouri, Illinois y Tennesse), respaldando esta aseveracin
con restos arqueolgicos hallados en el sitio de Hayes (Tennesse) (Harter y col., 2004;
Burke y col., 2006; Heiser y col., 2007). Por otra parte, Lentz y col. (2008) encontraron
recientemente restos arqueolgicos de semillas de girasol en los sitios mexicanos de
San Andrs (Tabasco) y Cueva del Gallo (Morelos). Ellos tambin demostraron que las
culturas pre-colombinas denominaban a este cultivo con vocablos propios
(chimalacatl y d nukh, entre otros), y que empleaban las plantas de girasol con
fines ornamentales y religiosos (en templos y cementerios), mientras que sus semillas
les servan como alimento (semillas frescas o tostadas, atole: bebida obtenida con
semillas molidas de girasol y agua o leche) y medicina (contra dolores estomacales o
reumticos). Estos autores, apoyndose en las evidencias arqueolgicas, lingsticas y
etnogrficas presentadas, postularon la existencia de dos orgenes de domesticacin
independientes, Estados Unidos y Mxico.
Durante la conquista de Amrica, el girasol fue llevado a Europa, en donde tambin lo
emplearon con fines ornamentales, medicinales y alimenticios. La primera patente
sobre extraccin de aceite a partir de semillas de girasol es otorgada en 1716, a Arthu
Bunyan, para usos industriales en pinturas y barnices. En Francia, en 1787, aparecen
cultivos de girasol como planta oleaginosa, y se comienza a tratar de mejorar esta
caracterstica. En el siglo XVIII, fue introducido en Rusia, en donde el cultivo se
expande, emplendose para el consumo de la semilla y la produccin de aceite. En
este pas, en 1820, se extrae por primera vez aceite de girasol para uso alimenticio, y
en 1833 se instala la primera fbrica de aceite (Melgarejo, 2003). Actualmente, el
girasol domesticado es una de las fuentes ms importantes en la produccin de aceite
vegetal comestible (Wills y col., 2006).
1
Introduccin General
2.- Importancia econmica del girasol en Argentina

El girasol es introducido en Argentina a mediados del siglo XIX por inmigrantes rusos,
siendo empleado principalmente como alimento para aves de corral. A partir de 1920,
se empieza a extraer su aceite y se exporta en pequeas cantidades. En la dcada del
30 el cultivo se afianza y comienza a crecer la industria oleaginosa como consecuencia
de la guerra civil espaola (1936-1939) y la segunda guerra mundial (1939-1945) que
provocan el desabastecimiento de aceite de oliva en los pases exportadores (Espaa,
Italia y Grecia), y debido tambin al crecimiento del consumo interno (Melgarejo,
2003). Esta tendencia en crecimiento no fue constante a lo largo de los aos, y las
oscilaciones en los volmenes producidos se debieron principalmente a las variaciones
del precio de su aceite. A partir de 1972 aparecen girasoles hbridos que resultan
fundamentales para la expansin del cultivo y la obtencin de mayores rendimientos
en cantidad de semillas y de aceite.
El aceite de girasol es el producto principal de la industrializacin de estas semillas, sin
embargo, luego de su obtencin se origina como subproducto una harina proteica.
Esta harina se pelletiza para facilitar su transporte (pellet de girasol) y, en la actualidad
se emplea principalmente para alimentacin animal (Azcona y col., 2003). En la Figura
1. se muestran los volmenes de produccin, exportacin y consumo en el mercado
interno de estos dos productos correspondientes a las ltimas dcadas. Al analizar los
datos de produccin del aceite y del pellet de girasol se pueden observar dos etapas,
una inicial con tendencia en crecimiento (hasta la campaa 1999/00), seguida por una
cada en los volmenes de produccin y posteriormente un leve crecimiento (desde
2000/01 hasta la actualidad). Tambin se puede apreciar que, en promedio, el 75% del
aceite producido se destina a exportacin, fijando el consumo interno en el 25%
restante. Por su parte, el consumo interno de pellet de girasol tambin presenta dos
etapas, una inicial en donde slo se destinaba a tal fin, en promedio, el 10% de lo
producido; y otra, a partir de 2000/01, en donde el consumo interno se va
incrementando paulatinamente hasta llegar a 20-25%. Inicialmente, el pellet de girasol
se empleaba como suplemento proteico para dietas de rumiantes (con forrajes frescos
y silaje de maz) en sistemas de produccin de leche, mientras que en la produccin de
carne predominaban los sistemas extensivos. Sin embargo, esta situacin se revirti en
2001, debido a que los cambios estructurales y econmicos ocurridos en el pas
2
Introduccin General
impactaron fuertemente en los sistemas de produccin pecuaria, surgiendo la

necesidad de intensificar la produccin como va para mejorar la rentabilidad del
sector, situacin que se mantiene actualmente (Garca y col., 2003).
3,0
millones de toneladas
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
1970/79
1980/89
1990/91
1991/92
1992/93
1993/94
1994/95
1995/96
1996/97
1997/98
1998/99
1999/00
2000/01
2001/02
2002/03
2003/04
2004/05
2005/06
2006/07
1980/89
1990/91
1991/92
1992/93
1993/94
1994/95
1995/96
1996/97
1997/98
1998/99
1999/00
2000/01
2001/02
2002/03
2003/04
2004/05
2005/06
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1970/79
0,0
3,0
millones de toneladas
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Figura 1.: Produccin nacional ( ), exportacin ( ) y consumo interno ( ) de A) aceite

de girasol y B) pellet de girasol.
Fuente: Cmara de la Industria Aceitera de la Repblica Argentina (CIARA).
Durante la campaa 2007/2008, Argentina se posicion como el segundo productor

mundial de semillas y de aceite de girasol, siendo el primer exportador mundial de
aceite y harinas proteicas pelletizadas. En esta campaa se procesaron 3,0 millones de
toneladas de semillas de girasol, lo que permiti obtener 1,2 millones de toneladas de
3
Introduccin General
aceite de girasol y 1,3 millones de toneladas de pellet. El aceite de girasol exportado

represent el 4% de la balanza comercial del sector agroalimentario (Figura 2.). A
diferencia de lo que sucede con la soja, en que tanto su aceite como otros
subproductos tienen un peso importante, los subproductos de girasol se encuentran
sub-aprovechados. En la actualidad, el pellet de girasol se comercializa a 103 U$D por
tonelada
se
emplea
casi
exclusivamente
para
alimentacin
animal
(http://www.alimentosargentinos.gov.ar). Por lo tanto, resulta interesante la

posibilidad de conferirle mayor valor agregado a este subproducto industrial.
3%
2%
2%
2% 2%
4%
32%
5%
22%
26%
Figura 2.: Exportaciones de productos del sector agroalimentario durante el ao 2007.

Residuos del aceite de soja ( ), Aceite de soja ( ), Carne bovina fresca y refrigerada
( ), Aceite de girasol ( ), Vinos de uvas ( ), Carne bovina congelada ( ), Leche y
crema ( ), Crustceos ( ), Frutos y jugos de frutas ( ), Otros ( ).
Fuente: Direccin Nacional de Alimentos (SAGPyA), Argentina.
3.- Composicin qumica de las semillas de girasol y sus harinas proteicas

La semilla de girasol, est formada por un embrin (o semilla propiamente dicho)
cubierto por su tegumento seminal y por el pericarpio (o cscara) (Figura 3). El
embrin representa el 75-80% del peso seco de la semilla, y en l se encuentran dos
cotiledones en donde se almacenan las reservas de lpidos y protena (que son
utilizadas durante la germinacin de la semilla). Mientras que el pericarpio representa
4
Introduccin General
el 20-25% del peso seco de la semilla, y es principalmente de naturaleza lignocelulsica

(Gonzlez-Prez y col., 2003).
Embrin
Pericarpio
Tegumento
seminal
Figura 3.: Esquema de un corte transversal de una semilla de girasol en donde es

posible identificar sus constituyentes.
La composicin de las semillas vara de acuerdo a la variedad de girasol analizada

(Earle y col., 1968). En la Tabla 1. se muestra la composicin qumica porcentual
promedio de semillas de girasol, completas y descascaradas, y del pellet resultante de
la extraccin de aceite. All se puede apreciar que, como era de esperar, tanto las
semillas enteras de girasol como las descascaradas, son ricas en componentes lipdicos
(mayoritariamente triglicridos neutros, fosfolpidos, glicolpidos y ceras). Estas
tambin poseen importantes contenidos de protenas e hidratos de carbono
(Gonzlez-Prez y col., 2008; Azcona y col. 2003; http://www.asagir.org.ar;
http://www.sunflowernsa.com). La cscara aporta principalmente fibras y compuestos
fenlicos (Pomenta y col., 1971). En la Figura 4. se muestra un esquema simplificado
del proceso industrial de extraccin de aceite de semillas de girasol. Se puede observar
all que, el descascarado mecnico de las semillas es parcial, justificando as la
presencia de alto niveles de fibras y de componentes fenlicos en el subproducto
resultante. Este pellet residual posee adems elevados porcentajes de protenas e
hidratos de carbono (Tabla 1.). En l, las protenas son los componentes que poseen
mayor valor agregado, siendo interesante su recuperacin y su posterior empleo en
diversas aplicaciones. Sin embargo, las propiedades que presentan estas
macromolculas, por ejemplo su solubilidad, podran verse afectadas por las
5
Introduccin General
condiciones del proceso (temperatura, presin, solventes orgnicos, etc.; Figura 4.) y
por la presencia de compuestos fenlicos (Gonzlez-Prez y col., 2005; Moure y col.,
2006). Por lo tanto, resulta necesario conocer previamente algunas caractersticas de
las protenas de girasol y de los compuestos fenlicos presentes.
Tabla 1.: Composicin qumica porcentual promedio de semillas completas de girasol,

de semillas descascaradas y del pellet resultante de la extraccin de aceite.
Componente
Semilla Completa
Semilla Descascarada
Pellet
Lpidos
34 55
47 65
0,8 1,9
Protenas
10 27
20 40
25 35
Hidratos de Carbono
18 26
4 10
8 12
Fibra
22 24
8 12
15 29
Fenoles
1 4,5
0,3 3
1,5 5,8
Minerales
24
34
5 7
Fuentes:
Gonzlez-Prez
col.,
2008;
Azcona
col.,
2003;
http://www.asagir.org.ar
http://www.sunflowernsa.com
Semilla Entera
Descascarado mecnico
Semilla
Semilla + Cscara
Cscara
dp < 5mm
dp > 5mm
Laminadores
Caldera
Cocinadores
Prensa mecnica
Aceite Crudo
Extraccin con Solvente
Desolventizador o
Tostador
Pellet
Refinacin
Aceite Refinado
Figura 4.: Esquema simplificado de la industrializacin de las semillas de girasol.

Fuente: Aceitera Santa Clara, Molinos Ro de La Plata S.A.
Introduccin General
3.1.- Protenas de girasol

Las protenas de reserva de semillas normalmente se clasifican en base a su
solubilidad, segn lo propuso Osborne (1924), en: albminas (solubles en agua),
globulinas (insolubles en agua, pero solubles en soluciones salinas diludas),
prolaminas (solubles en alcoholes) y glutelinas (solubles en soluciones alcalinas).
Siguiendo esta clasificacin, las protenas mayoritarias en las semillas de girasol son
globulinas y albminas, representando el 40-90% y 10-30% del total de las protenas,
respectivamente (Gheyasuddin y col., 1970; Schwenke y col., 1973; Prasad, 1987;
Raymond y col., 1995). Algunos autores tambin han descripto la presencia de
pequeas cantidades de glutelinas y prolaminas (Sabir y col., 1973; Sripad y Rao, 1987;
Gonzlez-Prez y col., 2008).
Desde un punto de vista estructural, las globulinas y glutelinas pertenecen a la misma
familia de protenas que es conocida como cupinas (del latn cupas, que significa
barril pequeo) por estar formada por barriles de hojas beta conectados por lazos
muy cortos, lo que determina que tengan una estructura muy compacta (Dunwell,
1998). En la Figura 5.A. se presenta un diagrama de cintas mostrando la estructura
tpica de estos dominios. En particular pueden apreciarse dos dominios cupinas
indicados como y , que se encuentran codificados por un nico gen, que es
transcripto y traducido en una proglobulina en el retculo endoplsmico (RE) rugoso de
la semilla en desarrollo. Esta proglobulina durante su transporte hacia la vacuola de
reserva de la semilla sufre un clivaje proteoltico especfico generando la protena
madura o globulina, que queda integrada por dos polipptidos llamados y que
permanecen unidos por una unin disulfuro (Jung y col. 1998). Este procesamiento
proteoltico va acompaado por un cambio de la estructura trimrica, que es la forma
en que la protena sale del RE (Figura 5.B.) a la hexamrica (Figura 5.C.), que es la
forma en que se encuentra en la semilla madura (Adachi y col., 2003). Estas formas
hexamricas (de 300-350 kDa) poseen una constante de sedimentacin de 11S y este
es el nombre que se da habitualmente a las globulinas que sufren este tipo de
procesamiento; existiendo en algunas otras semillas (por ejemplo en porotos, arvejas,
etc.) globulinas 7S que no sufren este procesamiento y que mantienen formas
trimricas (Muntz, 1998).
7
Introduccin General
Figura 5.: Diagrama de cintas correspondiente a la estructura de una globulina de tipo

11S procesada. A) Estructura de una subunidad constituida por los polipptidos y
que se encuentran covalente unidos por una unin disulfuro. B) Estructura del trmero
en los que se observa una interaccin cola-cabeza (-) entre las distintas subunidades
monomricas. C) Estructura del hexmero de frente y perfil. El diagrama fue generado
con PyMol utilizando la estructura de la glicinina A3B4 1OD5.pdb como base.
Una de las caractersticas de las protenas de reserva de semillas es su polimorfismo.

En el caso de los genes codificando para globulinas 11S de soja se han descripto 5
genes que dan origen a subunidades de distintos tamaos (Beilinson y col., 2002).
Introduccin General
En el caso de girasol, el grado de polimorfismo ha sido poco estudiado pero se sabe

que al menos existiran dos familias gnicas (Vonder Haar y col., 1988), habindose
descripto tres familias en algunos genotipos (Duca y col., 2008). Este grado de
polimorfismo se manifiesta al analizar las protenas extradas de las semillas por
electroforesis desnaturalizantes en presencia de SDS y de un agente reductor,
observndose los polipptidos en tamaos comprendidos entre 30-40 kDa y los
polipptidos entre 21-27 kDa (Dalgalarrondo y col., 1984; Molina y col., 2004;
Gonzlez-Prez y col., 2005).
Por otra parte, las albminas son la segunda fraccin proteica mayoritaria presente en
las semillas de girasol. Estas se caracterizan por ser un grupo heterogneo de protenas
de coeficiente de sedimentacin 2S, formado por subunidades simples cuyos tamaos
moleculares oscilan entre 10 y 19 kDa y que son ricas en metionina y cistena (Guguen
y col., 1996, Anisimova y col., 2003). Una caracterstica distintiva respecto a albminas
de otras semillas, es que stas son cadenas polipeptdicas simples, sin uniones
disulfuro. (Burnett y col., 2002; Pantoja-Uceda y col., 2004).
3.2.- Compuestos fenlicos presentes en las semillas de girasol

Una particularidad de estas semillas es que presentan elevados contenidos de fenoles
(entre 15 y 52 mg de cido clorognico/g de harina desgrasada de girasol, en base
seca) (Sripad y col., 1987; Prasad, 1990). Estos compuestos fenlicos se encuentran
ampliamente distribuidos en el reino vegetal, por ejemplo en caf, yerba mate, te,
papas, cerezas, peras, manzanas, pomelos, etc. (Clifford y col., 1985; Marques y col.,
2009). Sus principales funciones en las clulas vegetales son las de actuar como
metabolitos esenciales para el crecimiento y reproduccin de las plantas. Tambin
actan como agentes protectores frente a la accin de patgenos, siendo secretados
como mecanismo de defensa, confirindole al cultivo ciertos beneficios agronmicos
(Martnez-Valverde y col., 2000).
En el caso particular del girasol, el cido clorognico (CGA: cido 5-cafeil-qunico) es el
ms abundante, representando entre el 50% y el 70% de los fenoles totales (Lawhon y
9
Introduccin General
col., 1982; Sastry y col., 1984). Tambin se reportaron importantes cantidades de sus
productos de hidrlisis: cido cafeico (CA) y cido qunico (QA) (Leung y col., 1981), as
como tambin cantidades minoritarias de los cidos p-cumrico, isoferlico, ferlico,
sinpico y trans-cinmico (Sabir y col., 1974). Las estructuras qumicas de CGA, CA y
QA, los componentes mayoritarios, se muestran en la Figura 6.
cido Cafeico (CA)
cido Qunico (QA)
cido Clorognico (CGA)
Figura 6.: Estructura qumica de los cidos clorognico (CGA), cafeico (CA) y qunico
(QA).
Una caracterstica importante de estos compuestos es su capacidad de interaccionar

con las protenas. Durante ms de tres dcadas, varios autores han estudiado esta
propiedad encontrando resultados contradictorios. La mayora informa que el CGA
interacciona preferencialmente con las protenas de bajo peso molecular (Sabir y col.,
1973; Kabirullah y col., 1983; Prasad, 1990; Venktesh y col., 1993); pero tambin es
posible que interaccione con las de alto peso molecular (Sastry y col., 1990); o de
manera indistinta (Rahma y col., 1981). Dichas interacciones entre compuestos
fenlicos y protenas pueden ser por medio de puentes de hidrgeno entre sus grupos
hidroxilos y el enlace peptdico (Loomis y col., 1966); o mediante interacciones inicas
y/o hidrofbicas (Pierpoint, 1969). Adems, es posible que se lleven a cabo uniones
irreversibles, cuando en medio alcalino o en presencia de la enzima polifenoloxidasa,
los compuestos fenlicos (o-dihidroxifenoles) son oxidados a o-quinonas, las que
pueden polimerizar, reducirse o unirse covalentemente a grupos funcionales de las
protenas (aminas, tioles, ndoles, imidazoles, y disulfuros) (Venktesh y col., 1993;
10
Introduccin General
Rawel y col., 2001). Estas interacciones pueden afectar de diversas maneras a las
protenas de girasol. Por ejemplo, disminuyendo su digestibilidad (Kroll y col., 2001), su
disponibilidad de lisina, metionina, cistena y/o triptfano (Sosulski, 1978; Rawel y col.,
2001) y su solubilidad (Pringent y col., 2002). Tambin es posible que modifiquen la
vida til de los productos y alteren sus propiedades organolpticas (Cater y col., 1970;
Sastry y col., 1990).
Por otra parte, en los ltimos aos ha crecido el inters en estos compuestos debido a
que varias investigaciones han probado que presentan capacidad antioxidante (RiceEvans y col., 1995; Brand-Williams y col., 1995; Velioglu y col., 1998; Glin, 2005;
Turkmen y col., 2006; Bastos y col., 2007). Diferentes estudios han mostrado que los
radicales libres presentes en el organismo humano causan dao oxidativo a diferentes
molculas, tales como lpidos, protenas y cidos nucleicos; y tienen que ver en la
iniciacin de algunas enfermedades degenerativas (Garca-Alonso y col., 2004). Estos
compuestos fenlicos tienen la capacidad de capturar radicales libres, por lo que
podran presentar beneficios en la prevencin de ciertas enfermedades, por ejemplo
cncer, enfermedades cardiovasculares y patologas de carcter inflamatorio, as como
tambin retardar procesos de envejecimiento (Oomah y col., 1999; Olthof y col., 2000;
Raskin y col., 2002; Gotteland y col., 2007; Marques y col., 2009).
3.3.- Calidad nutricional del pellet proteico de girasol

Como se mencion anteriormente, este subproducto es ampliamente utilizado como
alimento para aves de corral, ovejas y ganado vacuno (http://www.asagir.com.ar),
debido principalmente a sus elevados contenidos de protenas y fibras. Sin embargo,
es posible pensar en extraer estas protenas y emplearlas en la industria alimentaria
humana, ya que poseen buena calidad nutricional. Su composicin aminoacdica
cumple con los requerimientos proteicos para humanos que detalla la FAO (Food and
Agriculture Organization, 1985), excepto para lisina, que es su aminocido limitante
(Miller y col., 1985), por lo que es recomendable su complementacin con protenas de
leguminosas, crnicas o lcteas (Sosulski, 1979). Adems, las protenas de girasol
presentan moderado valor biolgico (60%) e ndice qumico (0,74) y alta digestibilidad
11
Introduccin General
(88%) (Rahma y col., 1979; Kabirullah y col., 1983; Azcona y col., 2003). No obstante,
estas caractersticas pueden verse disminuidas por la presencia de compuestos
fenlicos interaccionando con las protenas (Kroll y col., 2001; Rawell y col., 2001).
Por otra parte, estas protenas presentaran como ventaja la ausencia de factores
antinutricionales, por ejemplo inhibidores de proteasas (factor antitrptico),
hemaglutininas y otros componentes biolgicamente activos (Prasad y col., 1990). Sin
embargo, este tema an se encuentra en discusin, ya que Mendieta y col. (2004)
informaron la presencia de factor antitrptico en variedades de girasol resistente a
esclerotinia.
Es importante entonces, conocer cul es el efecto de los componentes fenlicos sobre
las propiedades de las protenas de girasol y determinar la presencia (o ausencia) de
factores antinutricionales en harinas provenientes de variedades de uso local y sus
condiciones de inactivacin.
4.- Obtencin de productos proteicos de girasol

La obtencin de productos enriquecidos en protenas, concentrados o aislados, a partir
de harina desgrasada tiene como objetivo principal la eliminacin lo ms completa y
selectiva posible de los compuestos no proteicos presentes en ella (Vioque y col.,
2001). Generalmente, estos procesos se basan en las diferencias en solubilidad que
presentan las protenas en funcin del pH del medio. Un perfil tpico de solubilidad
proteica en agua en funcin del pH se muestra en la Figura 7. All se puede observar
que solubilidad es mxima a pHs muy cidos (pH=2-3) o muy alcalinos (pH=9-11). En
dichas zonas, las protenas poseen carga neta positiva o negativa, respectivamente; y
las fuerzas repulsivas son la causa del incremento en su solubilidad. Tambin es posible
observar un mnimo de solubilidad en las cercanas del pH isoelctrico (pI) (pH=4-5), en
donde la carga neta de la protena es cero, por lo que disminuye la repulsin
electrosttica lo que promueve la agregacin.
12
Introduccin General
100
90
Solubilidad (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
11
12
13
14
pH
Figura 7.: Perfil tpico de solubilidad proteica en agua en funcin del pH del medio.
Por consiguiente, un proceso de concentracin clsico consiste en poner en contacto

harina desgrasada con agua y extraer las protenas en medio alcalino, recuperar el
sobrenadante por centrifugacin y secarlo; obtenindose as un producto enriquecido
en protenas, denominado concentrado proteico. An as, este producto posee otros
componentes no deseados en el producto final (fibra, azcares reductores, lpidos,
fenoles, sales, componentes antinutricionales, etc.). Algunos de estos componentes
pueden eliminarse en un paso posterior empleando diversas tecnologas, entre ellas
precipitacin isoelctrica o ultrafiltracin. As es posible obtener aislados proteicos,
por:
-
Precipitacin isoelctrica de las protenas y posterior separacin por

centrifugacin: El aislado as obtenido se presenta en forma de crema insoluble
concentrada. Tras lavarlo con agua a pH cido, y despus de una nueva
centrifugacin, el aislado se neutraliza y se seca. En esta etapa se pierden
protenas solubles en el pI y factores antinutricionales.
Concentracin proteica por ultrafiltracin: Las molculas solubles de bajo peso

molecular (incluidas algunas protenas) atraviesan la membrana y constituyen
13
Introduccin General
el permeado, mientras que las protenas de alto peso molecular son retenidas y
posteriormente secadas.
Algunos autores, entre ellos Vioque y col. (2001) clasifican a los productos proteicos en
concentrados y aislados, segn la metodologa empleada en su obtencin. Sin
embargo, para comercializar estos productos el Cdigo Alimentario Argentino (CAA)
exige como mnimo 70% y 90 % de protenas (N x 6,25) en base seca para
concentrados y aislados proteicos respectivamente. Estas dos clasificaciones no
siempre se condicen, siendo posible tener concentrados y aislados proteicos con
menor contenido de protenas que lo estipulado por el CAA. En este trabajo de tesis se
decidi denominar a los productos proteicos de acuerdo a la metodologa empleada
para su obtencin.
En el caso particular del pellet de girasol, la presencia de compuestos fenlicos capaces
de interaccionar con las protenas y la prdida de la solubilidad de estas por
desnaturalizacin proteica durante la extraccin de aceite, son los problemas que se
deben resolver para la produccin de concentrados y/o aislados con adecuadas
propiedades fisicoqumicas y funcionales. Como es posible observar en la Tabla 2.,
existe una gran variedad de mtodos que han sido propuestos para concentrar o aislar
las protenas de girasol, diferencindose principalmente en las etapas destinadas a
remover los compuestos fenlicos previo a la extraccin proteica en medio alcalino.
Estas metodologas se basan en extraccin con mezclas acuosas de solventes
orgnicos; con soluciones de cidos, sales y/o agentes reductores; filtracin por
membrana; precipitacin de pigmentos y compuestos no-proteicos; y combinacin de
ellas (Gonzlez-Prez y col., 2002). De todas estas, las ms promisorias son las que
emplean mezclas acuosas de solventes orgnicos para extraer los compuestos
fenlicos (Sodini y col., 1978; Rahma y col., 1981; Sripad y col., 1987; Vermeesch y col.,
1987; Saeed y col., 1988; Prasad, 1990; Venktesh y col., 1993; Gonzlez-Prez y col.,
2002), debido a que la solubilidad del CGA en estos solventes es mayor que en agua.
Por ejemplo, Sabir y col. (1974) reportaron que la solubilidad del CGA (a 20C) es 15,2%
en metanol, 6,2% en etanol y 0,6% en agua.
14
Introduccin General
Tabla 2.: Metodologas propuestas para obtener concentrados y/o aislados proteicos
de girasol con bajo contenido de compuestos fenlicos.
Materia
(1)
Prima
HDG-L
HDG-I
HDG-L
HDG-I
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-I
HDG-L
HDG-I
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
HDG-L
(1)
HDG-I:
Extraccin de Fenoles
Extraccin
de Protenas
Extracciones sucesivas (2-7) con

pH 9-11
agua; pH 3,5-6
Extraccin a pH 11 con sulfito de sodio
Extracciones sucesivas (8) con
pH 9,5
butanol; pH 2-6; T=4C
Soluciones salinas (acetato o cloruro de Ca o Mg) y
sulfito de sodio; pH 7-8,5 y 10-12,5
Soluciones con sales de Al (sulfato o cloruro) ; pH
10,5
Extracciones sucesivas (4) con Agua o
pH 7
soluciones de NaCl; etanol 70%;
butanol; pH 5
Extraccin a contracorriente-precipitacin isoelctrica
Extracciones sucesivas con
soluciones hexano/alcohol y
alcohol/agua.
Extraccin de protenas con agua a pH 9, en vaco
Solucin con borohidruro de sodio; pH 8,5-10; T=570C
Extraccin en solucin de cido
ctrico o sulfito de sodio
Agua; pH 4-7 y pH<4; T=20-50C
Extraccin de protenas con agua a pH 8,5; con
sulfito de sodio; T=50C
Producto
Referencia
PI
OConnor, 1971 (P)
PI
Gonzlez y col., 1975

Sodini y col., 1978 (P)
PI
Petit y col., 1979 (P)
PI con
ctrico
-
A
C
Nuzzolo y col., 1980

(P)
Rahma y col., 1981
Taha y col., 1981
Campbell y col., 1981

(P)
PI
PI
A
A
Lawhon y col., 1982

Johnson y col., 1983
(P)
Bau y col., 1983
PI o UF
PI o UF
A
A
(2)
(3)
Extraccin de protenas con agua a pH 8,5; con

PI
C
sulfito de sodio; T=50C
C
solucin de NaCl; pH 5
Extraccin con soluciones acuosas de alcoholes
C
(metanol, etanol, propanol, isopropanol, isobutanol)
A
Acetona 40%; Metanol 40% o Etanol
40%
pH 10
PI
C
butanol; pH 5
Acetona/Acetona-Agua/AcetonaA
Agua-cido (post a Extracc. Prot)
Extracciones sucesivas (3) con agua;
pH 2
PI
A
pH 5
Harina desgrasada industrial/ HDG-L: Harina desgrasada de laboratorio;
isoelctrica/ UF: Ultrafiltacin/ -: no se realiza dicha etapa;
(3)
(4)
PI-UF
Pearce, 1984 (P)

Raymond y col., 1984/
Castor-Normandin y
col., 1984
Sastry y col., 1984
Vermeersch y col.,
1987
Sripad y col., 1987
Saeed y col., 1988
Prasad, 1990
(2)
Lapteva, y col. 2004

(P)
Gonzlez-Prez y col.,
2005
PI: precipitacin
C: Concentrado/ A: Aislado;
(4)
P: patente.
15
Introduccin General
En general estos autores tambin proponen realizar las extracciones a pH cercano al

isoelctrico, para favorecer las interacciones protena-protena y minimizar as la
posibilidad de interacciones protena-fenoles (Saeed y col., 1989). La mayora de estos
protocolos fueron evaluados sobre harinas de girasol descascaradas y desgrasadas en
condiciones de laboratorio, y a partir de los mismos se obtuvieron productos proteicos
con bajo contenido de fenoles. Pero no se conoce en profundidad cmo afectan estos
componentes a las propiedades fisicoqumicas y funcionales de las protenas
obtenidas, y adems, son muy pocos los autores que emplearon como materia prima
el pellet de girasol (Gonzlez y col., 1975; Petit y col., 1979; Pearce, 1984; Sastry y col.,
1984).
5.- Propiedades funcionales de las protenas

Adems de su valor nutricional, las protenas presentan una amplia gama de
propiedades funcionales y juegan un rol importante en la expresin de los atributos
sensoriales de los alimentos. Estas propiedades funcionales pueden definirse como
aquellas propiedades fsicas y qumicas que afectan el comportamiento de las
protenas en los alimentos durante su procesamiento, almacenamiento, preparacin y
consumo (Kinsella, 1976; Damodaran, 1989). En particular, las propiedades
funcionales de las protenas pueden clasificarse en tres grupos:
-
Propiedades dependientes de la interaccin protena-agua.
Propiedades dependientes de las interacciones protena-protena.
Propiedades de superficie.
Cabe aclarar que esta clasificacin, basada en el tipo de interaccin molecular, no

implica que se establezca un nico tipo de interaccin, sino que la misma es
predominante para ese grupo de propiedades funcionales (Cheftel y col., 1989).
Dentro del grupo de las propiedades de hidratacin (dependientes de la interaccin de
protena-agua) podemos citar: adsorcin de agua, absorcin de agua, retencin de
agua, hinchamiento, mojabilidad, solubilidad, dispersabilidad, viscosidad (Pilosof,
2000). Estas propiedades cobrarn importancia de acuerdo al sistema alimentario en
estudio. Por ejemplo, la capacidad de adsorcin de agua puede limitar el tiempo de
almacenamiento de los productos proteicos; mientras que la dispersabilidad y la
16
Introduccin General
mojabilidad estaran afectando el proceso de rehidratacin del polvo proteico, previo a

su empleo como aditivo. El desarrollo de dispersiones viscosas podra beneficiar la
textura de un producto, pero tambin podra dificultar su desplazamiento por bombeo
dentro del establecimiento elaborador. Por otra parte, productos con elevada
capacidad de absorcin y retencin de agua podran ser empleados en embutidos,
masas y geles, mientras que productos altamente solubles podran utilizarse en
bebidas y alimentos espumados o emulsionados. En el segundo grupo se incluyen las
propiedades en donde las interacciones protena-protena son las ms importantes,
entre ellas: floculacin, coagulacin, gelificacin y formacin de estructuras (fibras,
masas, pelculas, etc.) (Petruccelli, 1993). Los procesos de floculacin implican la
agregacin al azar de protenas sin cambios estructurales, mientras que las protenas
desnaturalizadas pueden agregarse al azar (coagulacin) o de manera ordenada
(gelificacin). La formacin de un gel proteico y sus propiedades influyen en la calidad
de productos variados, por ejemplo quesos, yogures, salchichas, etc. Dentro de la
formacin de estructuras tipo masas, es ampliamente estudiada la capacidad de
panificacin de las protenas de gluten de trigo. Tambin es posible formar estructuras
tipo fibras proteicas por extrusin, las que se podran emplear como extendedores de
carne y productos proteicos de snack. En los ltimos aos ha crecido el inters en la
capacidad de las protenas de formar materiales biodegradables con potenciales
aplicaciones en packaging de alimentos o para la agricultura.
Finalmente, las propiedades de superficie dependen de la capacidad de la protena de
difundir hasta la interfase (agua-aire o agua-aceite) y formar una pelcula estable. A
este grupo pertenecen las propiedades espumantes y emulsificantes (Wagner, 2000).
En el mercado existen varios alimentos en los que son fundamentales estas
propiedades, por ejemplo merengues, mousses, souffles, marshmallow, postres, salsas,
cremas, aderezos, helados, entre otros.
Como se puede apreciar entonces, la funcionalidad de las protenas es de gran
importancia tecnolgica y existe un gran inters por conocer los mecanismos
implicados en ella (Bartholomai, 2000). Para tal fin, es frecuente emplear sistemas
modelos sencillos y determinar parmetros que brindan informacin sobre su
capacidad de contribuir a la propiedad de inters. Estas determinaciones no reflejan su
comportamiento final en el alimento, que es una matriz ms compleja, pero resultan
17
Introduccin General
una primera aproximacin muy importante como paso previo a la formulacin de

alimentos (Paulson y col., 1984).
5.1.- Relacin estructura-funcionalidad

Las propiedades funcionales que presenta una protena estn relacionadas con sus
propiedades fsicoqumicas y estructurales, tales como masa molecular, estructura
primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, composicin aminoacdica, distribucin
de cargas, carga neta, relacin hidrofobicidad/hidrofilicidad y flexibilidad molecular
(Damodaran, 1998). Por lo tanto, conocer la relacin entre estructura proteica y
funcionalidad es la base para el diseo racional de ingredientes proteicos con
funcionalidad especfica para ser aplicados en el desarrollo de alimentos con
caractersticas determinadas (Bartholomai, 2000). En este sentido, durante los ltimos
30 aos, varios autores han propuesto correlacionar distintos parmetros
fisicoqumicos de las protenas, como hidrofobicidad superficial, hidrofobicidad total,
hidrofobicidad promedio, carga superficial, tamao y flexibilidad molecular, contenido
de grupos sulfhidrilos (-SH) y puentes disulfuro (S-S), con su habilidad para
desempear una determinada propiedad funcional (Kato y col., 1980; Nakai, 1983;
Utsumi y col., 1985; Kinsella y col., 1989; Damodaran 1990; Wang y col., 1991;
Petruccelli y col., 1994; Petruccelli y col., 1995; Utsumi y col., 1997; Damodaran, 1998;
Maruyama y col., 1999; Sorgentini y col., 2001; Molina Ortiz y col., 2002; Maruyama y
col., 2004). Por ejemplo, las propiedades emulsificantes que presentan las protenas
estn relacionadas con su hidrofobicidad superficial y su solubilidad. Por otra parte, la
formacin de espumas depende de la hidrofobicidad total y de la solubilidad proteica,
mientras que su estabilidad se puede relacionar con la densidad de carga neta.
Tambin se describi que la dureza del gel proteico depende de la hidrofobicidad total
de las protenas y de su contenido de grupos sulfhidrilos (Nakai, 1983; Damodaran,
1989; Li-Chan y col., 1989; Damodaran, 1997). Aunque algunos parmetros
fisicoqumicos pueden medirse de manera relativamente simple y constituyen una
primera aproximacin a la relacin estructura-funcin, ya que, la estructura de las
protenas es tan compleja que la informacin obtenida es limitada. El empleo de otros
mtodos de estudio de la estructura como por ejemplo espectroscopa de absorcin
UV, de fluorescencia, infrarroja, resonancia magntica nuclear y dicrosmo circular
18
Introduccin General
proporcionan informacin difcil de interpretar cuando se trabaja con mezclas de

protenas. La incorporacin de otras herramientas como el estudio de funcionalidad de
protenas modificadas por ingeniera gentica o el uso de variedades que tienen
reducido el grado de polimorfismo de las protenas de reserva, han mostrado que
protenas con 90% de homologa en su secuencia se comportan de manera diferencial
y tambin la contribucin de algunos residuos de aminocidos y/o motivos
estructurales a la funcionalidad de una determinada protena (Utsumi y col., 1980,
1993 y 2002). Esta clase de estudios es de importancia para establecer relaciones
estructura funcin y generar las bases para una modificacin racional. A pesar de las
limitaciones que poseen las medidas de propiedades fisicoqumicas, su determinacin
complementa la informacin obtenida a travs de las medidas de las distintas
propiedades funcionales y constituye una forma de caracterizar los distintos productos
proteicos obtenidos.
5.2.- Propiedades funcionales de las protenas de girasol

Las propiedades funcionales de las protenas de girasol han sido estudiadas
fundamentalmente en productos obtenidos a partir de harinas desgrasadas y
descascaradas en el laboratorio, pero no de productos obtenidos a partir del pellet
residual de la industria aceitera. Por ejemplo, en bibliografa se informa que estas
protenas presentan buena solubilidad en agua, entre 50 y 75% a pH 7 (Sodini y col.,
1977; Saeed y col., 1988). Gonzlez-Prez y col. (2005) describe que las albminas de
girasol se mantienen solubles en agua (entre 95-100%) independientemente del pH y
la fuerza inica del medio. En contraste, la solubilidad de las globulinas (heliantinina)
se ve afectada por estos dos factores. A baja fuerza inica (30 mM), su perfil de
solubilidad en funcin del pH presenta un mnimo en pH 4-5,5; mientras que a alta
fuerza inica (250 mM) se mantiene con solubilidad mnima a pH<5 (Gheyasuddin y
col., 1970; Gonzlez-Prez y col., 2008). Adems, estas macromolculas poseen gran
capacidad de absorcin de agua, variando entre 2,1 y 5,1 g H2O/g producto, siendo
similar a la de las protenas de soja (Rahma y col., 1981; Vermeersch y col., 1987).
La bibiografa disponible respecto a las propiedades superficiales de estas protenas, es
muy amplia. En las Tabla 3. y Tabla 4. se muestran algunos de los estudios realizados
19
Introduccin General
sobre las propiedades emulsificantes y espumantes, respectivamente, de las protenas

de girasol y los resultados obtenidos. En primera instancia, se puede observar que se
han estudiado las propiedades de varias materias primas, entre ellas: harinas,
concentrados, aislados, aislados hidrolizados y fracciones proteicas (albminas y
globulinas). Resulta importante destacar que los resultados informados dependen,
adems de las materias primas y de las condiciones del medio (pH, fuerza inica,
temperatura y concentracin de protenas, entre otras), del mtodo usado para
testear la funcionalidad. De esta manera se dificulta la comparacin rpida de los
resultados y la extraccin de conclusiones ms generales. Sin embargo, es posible
afirmar que, en trminos generales, tanto concentrados como aislados proteicos de
girasol poseen buenas propiedades emulsificantes y espumantes; y en algunos casos,
comparables con las de las protenas de soja (Lin y col., 1974; Canella y col., 1977;
Schwenke y col., 1981; Raymond y col., 1985; Kabirullah y col., 1985; Brueckner y col.,
1986). Por su parte, las fracciones proteicas presentan diferente comportamiento, las
albminas poseen alta capacidad para formar espumas y emulsiones, pero estos
sistemas resultan menos estables que los obtenidos con la fraccin globulina
(heliantinina) (Canella y col., 1985; Booma y col., 1990; Guguen y col., 1996; Popineau
y col., 1998; Burnett y col., 2002; Gonzlez-Prez y col., 2005).
Las propiedades dependientes de la interaccin protena-protena tambin han sido
estudiadas. Algunos autores informan que las protenas de girasol no son capaces de
formar geles por induccin trmica (Fleming y col., 1975; Bilani y col., 1989; Snchez y
col., 1995; Pawar y col., 2001). Por otra parte, hay estudios que demuestran que es
posible obtener productos texturizados a partir de las protenas de girasol, y utilizarlos
como extendedores de carne (Vzquez y col., 1979; Rossi, 1988). Adems estas
protenas son capaces de formar pelculas por casting, termocompresin y extrusin,
con potencial aplicacin en packaging de alimentos (Ayhllon-Meixueiro y col., 2000;
Orliac y col., 2002; Orliac y col., 2003; Rouilly y col., 2006).
20
Introduccin General
Tabla 3: Propiedades emulsificantes de protenas de girasol.

Material
Harina;
Concentrado;
Aislado
Harina
Harina
Condiciones y parmetros
evaluados
Dispersin (5,5%); capacidad
de emulsificacin
Dispersin (6%); pH 5,2; 7;
10,8; capacidad de
emulsificacin
Dispersin pH 7; capacidad
de emulsificacin
Harina;
Concentrado;
Aislado
Dispersin (5,5%); capacidad

de emulsificacin
Harina
Dispersin (8%); capacidad

de emulsificacin
Dispersin (0,5%); pH 5 y 7;
capacidad de emulsificacin
, actividad emulsificante y
estabilidad
Aislado
Harina
Dispersin (7%), pH 5,2 ; 7 y

10; actividad emulsionante y
estabilidad
Harina;
Albminas;
Heliantinina
Dispersin (1%) para

capacidad de emulsificacin;
dispersin (7%) para
actividad emulsionante y
estabilidad
Aislado
Dispersin (10%); pH 8;
Aislado
Dispersin (0,1%); pH 3-10;

Dispersin (4%); pH 2-9;
y estabilidad
Harina;
Concentrado
Resultados y Conclusiones
Referencia
La capacidad de formacin de la emulsin es

mayor en la harina que en los concentrados o
aislados de girasol, incluso de soja
Mayor capacidad de emulsificacin a pH 7
Lin y col.,
1974
La re-extraccin de la harina con distintos

solventes (benceno, cloroformo, eter de
petrleo, cloroformo/metanol,
etanol/eter/agua) no afecta la capacidad de
emulsificacin
La capacidad de emulsificacin del aislado es
mayor que la de la harina, pero menor que la
del concentrado; la capacidad de emulsificacin
del aislado es mayor que la del aislado de soja,
pero la del concentrado es menor que la del
concentrado de soja
Lavados con etanol acuoso disminuye la
La actividad y capacidad emulsificante y la
estabilidad fueron mayores a pH 7; la
desnaturalizacin proteica (pH 2, 24 hs) no tuvo
efectos sobre la actividad emulsificante ni la
estabilidad, pero disminuy la capacidad de
emulsificacin; mejores propiedades que las de
las protenas de soja
La actividad emulsionante y la estabilidad
fueron mayores a pH >5; mnima actividad
emulsionante a pH cercano a 3,75; mejores
propiedades que las harinas de soja
Baja actividad emulsionante y estabilidad de la
heliantinina comparada con las albminas y con
la harina de girasol; la desnaturalizacin
trmica mejora la actividad emulsionante y la
estabilidad; la capacidad emulsionante es
mayor en la harina
Menor capacidad de emulsificacin que las
protenas de soja; al calentar se mejora la
capacidad emulsionante
Mxima capacidad de emulsificacin a pH 8;
equivalente a aislado de soja
Actividad emulsionante mxima (para harina y
concentrado) entre pH 6,5-7,5; y mnima a pH
4,5-5; el concentrado presenta alta estabiliadd
de la emulsin y es independiente del pH; las
propiedades emulsionantes son mejoradas
cerca del pI por adicin de sal, sin embargo la
desnaturalizacin por calor las empeora
Wu y col.,
1976
Huffman y
col., 1975
Canella y col.,
1977
Rahma y col.;
1981
Schwenke y
col., 1981
Rossi y col.,
1982
Canella y col.,
1985
Khalil y col.,
1985
Raymond y
col., 1985
Rossi y col.,
1985
21
Introduccin General
Tabla 3: Propiedades emulsificantes de protenas de girasol (continuacin).

Material
Concentrado;
Aislado
evaluados
Dispersin en agua;
actividad y capacidad
emulsionante, estabilidad
Harina;
Heliantinina
Harina
Dispersin (8,7 y 4%); pH 6;

actividad y capacidad
emulsionante, estabilidad
Concentrado;
Aislado
Aislado;
Aislado
hidrolizado
Aislado;
Aislado
hidrolizado
Albminas
Dispersiones en agua;
capacidad emulsionante
Dispersin (5 %); pH 7;
actividad emulsionante,
estabilidad
Solucin (0,3%); pH 7;
capacidad emulsificante
Albminas
Dispersin (0,05 y 0,1%); pH

8; cremado, floculacin y
resistencia a la coalescencia
Dispersin (0,1%); pH 7;
cremado, floculacin y
resistencia a la coalescencia
Harina;
Concentrado;
Aislado
Dispersin (8%); actividad y

capacidad emulsionante,
estabilidad
Albminas
tamao de gota, tensin
superficial y viscosidad
superficial
Soluciones de protenas
(0,2-0,5%); pH 3-8;
formacin de emulsin y
estabilidad; efecto de la T y
de desnaturalizacin cida
Dispersin (1%); pH 5,5 y 7;
tamao de gota, reologa de
la emulsin; efecto de NaCl.
Aislado;
Heliantinina;
Albminas
Aislado;
Aislado
hidrolizado
La actividad emulsionante y la estabilidad de
los concentrados son similares a los
concentrados de soja, con mayor capacidad
emulsionante; la actividad y capacidad
emulsionante y la estabilidad son mejores que
las de aislados de soja
La capacidad emulsionante de la heliantinina es
dos veces mayor que la de la harina de girasol
La mayor estabilidad fue en agua en presencia
de NaCl (1M); luego de tratamiento trmico y
en presencia de sal se mejora la capacidad
emulsionante y la estabilidad
Buena capacidad emulsionante
La actividad emulsificante y la estabilidad de la
emulsin se ven incrementadas cuando se
realiza el tratamiento enzimtico
La hidrlisis mejora la capacidad emulsionante
de las protenas de girasol; pero la mejora
depende de la enzima empleada
Emulsiones estables; las albminas ricas en
metionina son ms activas en la estabilizacin
de la emulsin
Resistencia a la coalescencia es mayor en las
albminas ricas en metionina; la reduccin de
puentes disulfuro aumenta la estabilidad de la
emulsin
Aumento en la actividad emulsionante, la
capacidad y la estabilidad en los productos con
pequeas cantidades de fitatos y compuestos
fenlicos
Emulsiones estables con albminas ricas en
metionina; albminas menos hidrofbicas dan
emulsiones inestables
Albminas, Heliantinina y aislado forman
emulsiones estables, con la excepcin de las
albuminas en pH alcalino y neutro; la
desnaturalizacin de la heliantinina mejora las
propiedades emulsionantes
El aislado hidrolizado produjo la emulsin con
menor tamao de gota (a pH 7). El agregado de
NaCl, no modific la estabilidad del aislado
hidrolizado.
Referencia
Brueckner y
col., 1986
Booma y col.,
1990
Venktesh y
col., 1993
Wastyn y col.,
1993
Pacheco de
Delahaye y
col., 1994
Cai y col.,
1996
Guguen y
col., 1996
Popineau y
col., 1998
Pawar y col.,
2001
Burnett y col.,
2002
GonzlezPrez y col.,
2005
Karayannidou
y col., 2007
22
Introduccin General
Tabla 4: Propiedades espumantes de protenas de girasol.

Material
Harina
Harina;
Concentrado;
Aislado
Harina
Harina
evaluados
Dispersin (8-12%); pH 4-6;
expansin de espuma en
presencia de azcar
de formacin y
estabilizacin de espumas
T 15-85C; expansin de
espuma y estabilidad
estabilidad de la espuma
Harina;
Concentrado;
Aislado
Dispersin (3%); expansin

de la espuma y estabilidad
Harina;
Concentrado

T 10-80C; expansin de las
Harina

de formacin de espuma y
estabilidad
Dispersin (5%), pH 2-7;
capacidad de formar
Harina
Harina;
Albminas
Semillas;
Harina;
Aislado
Aislado

expansin de la espuma y
estabilidad
Dispersin (0,3 mg/ml); pH
3-7; capacidad de formacin
y estabilidad de la espuma
capacidad de formacin de
espuma y viscosidad
Referencia
Similares resultados que harina de soja
Lawhon y col.,
1972
Aislado con similares resultados que aislado

de soja; harina y concentrado con mejores
resultados que harina y concentrados de soja.
A pH 4, mejor expansin de espuma; a pH 9
mejor estabilidad; T mayor a 55C disminuye
la expansin de la espuma
La re-extraccin de la harina con distintos
solventes (benceno, cloroformo, eter de
petrleo, cloroformo/metanol,
etanol/eter/agua) no afecta la estabilidad de
la espuma; los lavados con metanol la
incrementan
La expansin y estabilidad de la espuma
fueron los mayores para el aislado y los
menores para la harina; con peores
propiedades que las protenas de soja
La harina de girasol present la mayor
expansin de espuma a pH 7-10 y la menor
estabilidad; seguido por el concentrado de
girasol y el concentrado de soja; la mayor
estabilidad de la harina fue a pH 6-8 y la
menor a pH 2-5
Lavados con etanol acuoso disminuye la
capacidad de formar espumas; con butanol
aumenta; otros solventes la disminuyen
Formacin y estabilidad de la espuma es alta
a pH >5; aumenta el volumen de espuma y
disminuye la estabilidad con el aumento de la
fuerza inica; mejores propiedades que la
harina de soja
Albminas dan espumas voluminosas
(mximo a pH 7,7) y relativamente estables
(pH 6-10)
Aislado a pH 7 presenta menor capacidad de
formacin, pero mayor estabilidad que la
harina; la capacidad de formacin mxima de
la harina es a pH7 y la mnima a pH 4; la
estabilidad mxima de la harina es a pH 4-5, y
mnima a pH 7; calentando disminuye la
capacidad de formacin; las protenas de soja
tienen mayor capacidad de formar espumas
Menor capacidad de formacin de espumas
que las protenas de soja; al calentar
disminuye la expansin y viscosidad de la
espuma
Lin y col., 1974
Huffman y col.,
1975
Wu y col., 1976
Canella y col.,
1977
Canella y col.,
1978
Rahma y col.,
1981
Rossi y col.,
1982
Canella y col.,
1985
Khalil y col.,
1985
Khalil y col.,
1985
23
Introduccin General
Tabla 4: Propiedades espumantes de protenas de girasol (continuacin).

Material
Aislado
evaluados
Dispersin (0,5-5%); pH 1,510,5; T 15-60C; capacidad
de formacin de espuma y
estabilidad
Harina;
Concentrado

capacidad de formacin y
Harina;
Aislado
Dispersin (0,5-2,5%); pH 410; expansin de la espuma

y estabilidad
Aislado
Dispersin (5%); pH 2,5-8;

expansin de la espuma y
estabilidad
Harina;
Heliantinina
Dispersin (8,7 y 1%); pH 6;

Dispersin (3%); volumen de
Harina
Concentrado;
Aislado
Albminas
Albminas
Dispersiones en agua;
Dispersin (0,2 y 0,3%); pH
7,8 y 8; capacidad de
formacin y estabilidad de
espumas
estabilidad de espuma
Harina;
Concentrado;
Aislado

de formacin y estabilidad
de espuma
Aislado;
Aislado
hidrolizado
Soluciones (3%); pH 7;
estabilidad de espuma;
efecto de polisacridos
Referencia
Mxima expansin de la espuma a pH 7,5; la

mayor estabilidad a pH 6,5-10,5; no hay
efecto de la T; aislado de girasol con mayores
capacidad de formacin y estabilidad de
espuma que aislado de soja en condiciones
ptimas
Alta capacidad de formacin y estabilidad
lejos del pI (4,5-5); se mejoran las
propiedades de la espuma con el agregado de
sal (pH 4-6,5); la desnaturalizacin por calor
mejora levemente la expansin de la espuma
y su estabilidad
Similares propiedades de la espuma para
aislados de girasol o soja, pero peores para
harina de girasol; la mayor expansin de la
espuma a pH 7-10; la estabilidad de la
espuma disminuye a pH >6 en la harina
Correlacin lineal fuerte entre solubilidad y
expansin de espuma, pero no con
estabilidad; la desnaturalizacin por
acidificacin mejora la expansin y
Heliantinina estabiliza la espuma
Raymond y col.,
1985
Lavados con butanol y tratamientos trmicos

generalmente disminuyen el volumen de
espuma y la estabilidad
No presentan capacidad de formar espuma
Venktesh y col.,
1993
Espumas con baja estabilidad
Guguen y col.,
1996
Pobre capacidad de formacin y

estabilizacin de espumas, la reduccin de
puentes disulfuro da espumas ms densas y
moderadamente estables
Menor capacidad de formacin en harina; la
estabilidad es mayor en harina y aislado; la
capacidad de formacin se mejora luego de
lavados con butanol
Un tratamiento enzimtico limitado
(DH=1,5%) mejora las propiedades
espumantes. La capacidad de formacin
disminuy al agregar un polisacrido, pero
mejor la estabilidad
Popineau y col.,
1998
Rossi y col.,
1985
Kabirullah y col.,
1988
Claughton y
col., 1989
Booma y col.,
1990
Wastyn y col.,
1993
Pawar y col.,
2001
Martnez y col.,
2004
24
Introduccin General
Tabla 4: Propiedades espumantes de protenas de girasol (continuacin).

Material
Aislado;
Heliantinina;
Albminas
Aislado;
Aislado
hidrolizado
Aislado;
Aislado
hidrolizado
evaluados
Soluciones de protenas
(0,05%); pH 3-8; volumen de
espuma y estabilidad; efecto
de la T y de
desnaturalizacin cida
Soluciones (1 y 10%); pH 7;
estabilizacin de espuma
Dispersin (1%); pH 5,5 y 7;
estabilidad de la espuma;
efecto de polisacridos y
NaCl.
Referencia
Albminas forman espumas con altos

volmenes, pero poco estables; Heliantinina
produce bajos volmenes de espuma en
medio alcalino y neutro, pero con alta
estabilidad; la desnaturalizacin de
Heliantinina produce mejoras en las
propiedades de las espumas
La capacidad de formacin de la espuma y su
estabilidad son mayores, al incrementar la
concentracin de protenas
El aislado hidrolizado produce las espumas
ms estables. A pH 7 se logra la mayor
estabilidad. La adicin de NaCl mejora la
capacidad de formar la espuma, pero no su
estabilidad; lo que se logra agregando un
polisacrido
Gonzlez-Prez
y col., 2005
Rodrguez
Patino y col.,
2007
Karayannidou y
col., 2007
Tambin es posible encontrar estudios en donde se mejoran las propiedades

funcionales (solubilidad, espumas, emulsiones y geles) de las protenas de girasol por
medio de un tratamiento enzimtico limitado (Pacheco de Delahaye y col., 1994; Cai y
col., 1996; Snchez y col., 1996; Snchez y col., 1997; Villanueva y col., 1999; Yust y
col., 2003; Miones Conde y col., 2005; Martinez y col., 2005; Rodrguez Patino y col.,
2007; Karayannidou y col., 2007).
Algunos autores han desarrollado productos con el agregado de protenas de girasol.
Por ejemplo, Wills y col. (1981) proponen emplear aislado proteico de girasol en un
embutido crnico, logrando retener mayor cantidad de agua y una emulsin ms
estable, pero con problemas de aceptacin por parte del consumidor debido al color
desarrollado. Por otra parte, el volumen de pan disminuye cuando a la masa se le
adiciona harina proteica de girasol, as como tambin la aceptacin de los
consumidores (Della Gata y col., 1995).
An as, a diferencia de lo que ocurre con otras protenas como las de soja, hay pocos
estudios que analicen la incidencia de cambios en la estructura de las protenas de
girasol sobre las propiedades funcionales que estas exhiben.
25
Introduccin General
6.- Ejes de trabajo

Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, nos proponemos utilizar el pellet
de girasol como materia prima en la elaboracin de productos proteicos (concentrados
y aislados) con mayor valor agregado.
1.- El pellet de girasol sufre tratamientos trmicos intensos que pueden afectar
notoriamente las propiedades de las protenas de girasol, como por ejemplo su

solubilidad, lo que puede repercutir negativamente en los rendimientos de extraccin
y en sus propiedades funcionales. Por lo tanto, es el pellet de girasol generado por la
industria aceitera local adecuado para la produccin de concentrados y/o aislados
proteicos?
2.- Est descripto que los compuestos fenlicos reducen la solubilidad proteica
y le confieren color a los productos obtenidos; sin embargo, tambin poseen
propiedades antioxidantes que actualmente son deseables en la formulacin de
alimentos funcionales. Es necesario eliminar los compuestos fenlicos presentes?
3.- El suero suele contener la mayor parte de los compuestos antinutricionales,
como por ejemplo el factor antitrptico. En bibliografa existen datos contradictorios en
relacin a los compuestos antinutricionales de girasol. Entonces, es necesario
eliminar las protenas del suero? Los aislados proteicos presentan alguna ventaja
extra respecto a los concentrados?
4.- En general, los productos obtenidos en escala de planta piloto pueden
presentar propiedades fisicoqumicas y estructurales diferentes a las de los producidos
en escala laboratorio, y stas pueden afectar su comportamiento funcional. Es posible
extrapolar a escala de planta piloto los procedimientos desarrollados en el laboratorio
para la obtencin de concentrados y aislados de protenas de girasol?
5.- Existen varios estudios que demuestran que las protenas de girasol poseen
buenas propiedades funcionales (solubilidad, capacidad espumante y emulsionante),
sin embargo no se conoce la funcionalidad de las protenas extradas del pellet de
girasol. Por lo tanto, los productos proteicos obtenidos poseen propiedades
funcionales interesantes para su empleo como aditivo en la industria alimentaria?
26
Introduccin General
6.- Adems, se conoce que las protenas de girasol poseen la capacidad de

formar pelculas, pero resulta necesario evaluar sus propiedades y optimizarlas para
ampliar su campo de aplicacin. Sirven los productos proteicos de girasol como
materias primas para la formacin de materiales polimricos biodegradables aplicables
como packaging de alimentos o como plsticos para la agricultura?
7.- Conocer la relacin entre propiedades fisicoqumicas y funcionales es
importante para ver si es necesario y/o posible realizar cambios estructurales que
produzcan mejoras en la funcionalidad. Entonces, es posible establecer relaciones
entre las propiedades estructurales de las protenas de girasol y sus propiedades
funcionales?
Son
las medidas de
propiedades fisicoqumicas una
forma
complementaria de caracterizar y comparar los productos proteicos obtenidos por

distintos mtodos?
27
Objetivos
OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar la obtencin de concentrados y aislados proteicos de girasol, a partir
del pellet residual de la industria aceitera local; y analizar las propiedades de los
productos obtenidos en relacin a sus potenciales aplicaciones en la industria
alimentaria y de packaging.
Objetivos especficos
1.- Estudiar la obtencin de concentrados y aislados proteicos de girasol con
distintos contenidos de compuestos fenlicos, en escala de laboratorio, a partir del
pellet residual de la industria aceitera local.
2.- Caracterizar y evaluar las propiedades fisicoqumicas de los productos
proteicos de girasol resultantes.
3.- Estudiar la transferencia a escala de planta piloto de las metodologas
desarrolladas en el laboratorio que resultaron adecuadas para la obtencin de
productos proteicos de girasol con propiedades deseadas para su uso industrial.
4.- Evaluar las propiedades funcionales y antioxidantes que presentan los
distintos productos proteicos de girasol.
5.- Estudiar la obtencin de materiales polimricos biodegradables y/o
comestibles a partir de protenas de girasol y evaluar sus propiedades.
6.- Establecer relaciones entre las propiedades fisicoqumicas de las protenas
de girasol y sus propiedades funcionales.
28
Captulo I: Obtencin y caracterizacin de

productos proteicos de girasol
Captulo I
Captulo I: OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE

GIRASOL
I.1.- Introduccin
En la actualidad existe un inters creciente por la obtencin de productos proteicos
vegetales destinados para consumo humano debido, principalmente, a su menor costo
comparado con las protenas de origen animal, y adems a la menor presin que
tendra el sistema agropecuario si se modificaran los hbitos alimentarios de la
poblacin hacia este tipo de protenas (Chrispeels y col., 2003). Las harinas
desgrasadas vegetales, subproductos de la industria aceitera, constituyen importantes
fuentes de protenas. En general, el proceso industrial de extraccin de aceite provoca
desnaturalizacin proteica y disminucin de su solubilidad (Moure y col., 2006;
Gonzlez-Prez y col., 2008), afectando as los rendimientos de extraccin de protenas
y su rentabilidad.
En particular, el pellet de girasol se encuentra sub-aprovechado, emplendose casi
exclusivamente para alimentacin animal (Abraham y col., 1991), a pesar de poseer un
elevado contenido de protenas de buena calidad nutricional (Taha y col., 1980; Miller
y col., 1985). En parte, esto puede atribuirse a su gran cantidad de compuestos
fenlicos, capaces de interaccionar con las protenas y disminuir an ms su
solubilidad, adems de afectar las caractersticas organolpticas, las propiedades
funcionales y la vida til del producto (Sastry y col., 1984; Sripad y col., 1987; Prasad,
1990; Kroll y col., 2001; Pringent y col., 2002). Dado que estas razones limitan su
empleo para la produccin de productos proteicos, varios autores han propuesto
diversas metodologas tendientes a eliminar estos compuestos fenlicos, siendo las
ms promisorias las extracciones con soluciones acuosas de alcoholes (Sodini y col.,
1978; Rahma y col., 1981; Sripad y col., 1987; Vermeesch y col., 1987; Saeed y col.,
1988; Prasad, 1990; Venktesh y col., 1993; Gonzlez-Prez y col., 2002). Por otra parte,
y en paralelo, en los ltimos aos ha crecido el inters de mantener estos compuestos,
o en algunos casos agregarlos a la formulacin, dada su accin como antioxidantes
(Rice-Evans y col., 1995; Turkmen y col., 2006; Bastos y col., 2007), y los beneficios que
29
Captulo I
los mismos presentan en la prevencin de enfermedades y en el retardo del

envejecimiento (Oomah y col., 1999; Olthof y col., 2000; Raskin y col., 2002; Gotteland
y col., 2007; Marques y col., 2009). En este contexto, no est bien establecido si es o
no necesario remover este tipo de compuestos cuando se preparan productos
enriquecidos en protenas a partir del pellet de girasol. De la evaluacin de todas las
propiedades en conjunto, surgir un criterio ms concreto de la necesidad o no de
eliminarlos para los distintos tipos de aplicacin.
Adems debe considerarse que la informacin disponible en bibliografa sobre la
presencia de compuestos antinutricionales, por ejemplo inhibidores de proteasas, en
girasol es contradictoria. Algunos estudios muestran su ausencia (Miller y col. 1985;
Prasad, 1990), aunque la presencia de factor antitrptico en semillas de girasol ha sido
descripta en variedades menos sensibles a esclerotina (Mendieta y col., 2004). Por lo
tanto, pensando emplear los productos proteicos de girasol para alimentacin
humana, resulta imprescindible establecer la presencia o ausencia de estos
compuestos en el pellet generado por la industria aceitera local y, en caso de estar
presentes, conocer las condiciones necesarias para su inactivacin.
El objetivo de este captulo fue desarrollar metodologas que permitan obtener
productos proteicos de girasol con distinto contenido de fenoles, a partir del pellet
residual de la industria aceitera local; caracterizar sus propiedades estructurales y
evaluar su posible aplicacin para alimentacin humana.
30
Captulo I
I.2.- Materiales y Mtodos
I.2.1.- Materiales
Como materia prima se emple un pellet desgrasado de girasol (Helianthus annuus)
provisto por la Aceitera Santa Clara, de Molinos Ro de La Plata (Rosario, Argentina).
Durante la extraccin de aceite, la torta residual sufri tratamientos con presin (50
kg/cm2), solvente orgnico (hexano) y temperatura (150C-170C) (Figura 4.). El pellet
se moli en un molino Bhler Miag MLGV Variostuhl, y se tamiz empleando una malla
con dimetro de partcula de 1,19 mm, obtenindose de esta forma el pellet molido
de girasol.
I.2.2.- Obtencin de productos proteicos de girasol en escala laboratorio

Obtencin de concentrados proteicos de girasol: Se parti del pellet molido de girasol.
El mismo se puso en contacto con agua empleando una relacin 1:10 p/v. La extraccin
se realiz durante treinta minutos mantenindose con agitacin constante.
Posteriormente se ajust el pH con NaOH 2N. Se continu la extraccin durante treinta
minutos ms, midindose el pH a distintos tiempos y reajustndolo si fuera necesario.
Se centrifug a 30000 xg durante 15 minutos a 20C en una centrfuga Avanti J-25
(Beckman Coulter, California, Estados Unidos) y se separ el sobrenadante (S1). El
precipitado resultante (P1) se someti a una nueva extraccin de protenas en iguales
condiciones a la descripta anteriormente. El precipitado resultante (P2) se descart y
el sobrenadante obtenido en esta segunda etapa (S2) se mezcl con S1, se reajust el
pH, se congel a -80C y finalmente se liofiliz (Liofilizador Heto FD4, conectado a una
bomba de vaco Vacuubrand RZ 5). Se obtuvo as un concentrado proteico de girasol,
que se denomin Co-L (Concentrado-Laboratorio).
Para la obtencin de concentrados proteicos de girasol con menor contenido de
fenoles, se realizaron lavados sucesivos del pellet con diversos solventes a pH cido,
previo a la extraccin de protenas en medio alcalino. De esta manera, el pellet molido
de girasol se puso en contacto con el medio de extraccin de fenoles (relacin 1:15
31
Captulo I
p/v), se ajust el pH y se mantuvo en agitacin constante durante treinta minutos

(verificando la constancia en el valor de pH cada 10 minutos). Posteriormente se
centrifug a 30000 xg durante 15 minutos a 20C (Avanti J-25 Beckman Coulter,
California, Estados Unidos), se separ el precipitado al cual se lo someti a una nueva
extraccin de compuestos fenlicos en iguales condiciones que las mencionadas
anteriormente; mientras que el sobrenadante (extracto) se guard para cuantificar
protenas y compuestos fenlicos. Luego de realizar las extracciones de fenoles, el
pellet resultante se someti a la extraccin de protenas en pH alcalino como se
describi en la obtencin de Co-L.
Los medios de extraccin de compuestos fenlicos empleados en este trabajo fueron:
agua; solucin de Na2SO3 0,1% p/v; etanol 70% v/v; metanol 80% v/v y butanol (1butanol en HCl 0,005N; 92:8 v/v). Los concentrados proteicos obtenidos fueron
denominados como: CoExA-L, CoExS-L, CoExE-L, CoExM-L y CoExB-L, respectivamente.
Obtencin de aislados proteicos de girasol: se proces el pellet molido de girasol en

las condiciones descriptas anteriormente para la obtencin de los distintos
concentrados proteicos; pero en este caso, los sobrenadantes (S1 y S2) se mezclaron y
las protenas se precipitaron isoelctricamente, ajustando el pH con HCl 2N. Se agit
durante treinta minutos, centrifugndose posteriormente a 30000 xg durante 15
minutos a 4C (Avanti J-25, Beckman Coulter, California, Estados Unidos). El
sobrenadante resultante se desech, mientras que el precipitado se lav con agua
destilada a pH adecuado y se volvi a centrifugar nuevamente. El precipitado obtenido
se resuspendi en agua (hasta alcanzar aproximadamente 10% p/v) y se alcaliniz con
NaOH 2N. La suspensin se agit durante quince minutos, posteriormente se congel a
-80C y se liofiliz (Liofilizador Heto FD4, conectado a una bomba de vaco Vacuubrand
RZ 5). De esta forma se obtuvo Ai-L. AiExA-L y AiExS-L se obtuvieron agregando etapas
de lavados sucesivos con agua Na2SO3 0,1% p/v previo al procesamiento seguido
para aislar las protenas.
32
Captulo I
Rendimientos de los procesos se expresaron de dos formas: basados en materia seca

(g producto/g pellet molido) y en protenas (g protenas en el producto/g protenas en
el pellet molido). Tambin se determinaron los porcentajes de eliminacin de
compuestos fenlicos. Para todos los casos, se consider como el 100% la cantidad
inicial de pellet molido de girasol que se emple para la obtencin del producto en
estudio.
I.2.3.- Determinacin de la composicin qumica

Se determin la composicin qumica porcentual del pellet molido de girasol y de los
productos proteicos obtenidos.
Los valores de humedad y cenizas fueron determinados gravimtricamente, utilizando
los mtodos AOAC 935.29 y AOAC 923.03 (AOAC: Association of Official Analytical
Chemists Inc., 1995), respectivamente. El contenido de protenas se determin por el
mtodo de Kjeldahl (AOAC 920.53) utilizando 5,55 como factor de conversin de
nitrgeno en protenas (http://www.nal.usda.gov). La cuantificacin de compuestos
fenlicos se realiz mediante espectrofotometra en el UV a 324 nm empleando cido
clorognico (CGA, Chemika Fluka, Alemania) como patrn, como se detalla en Anexo I.
En el caso de pellet molido de girasol, adems se determin el contenido de lpidos por
Soxhlet (AOAC 920.39) empleando n-hexano como solvente de extraccin; y el de
hidratos de carbono totales segn el mtodo de Felhing-Causse-Bonnans (AOAC
14023/24), previa hidrlisis de dos horas en medio cido fuerte, empleando una
solucin de glucosa 0,5% p/v como patrn. El porcentaje de fibra se calcul por
diferencia.
Todas las determinaciones se realizaron como mnimo por duplicado.
33
Captulo I
I.2.4.- Determinacin de componentes antinutricionales

La determinacin de actividad uresica y antitrptica se realiz sobre el pellet molido
de girasol y una harina de porotos remojados de soja sin tratamiento trmico, esta
ltima empleada como control positivo.
Determinacin de actividad uresica: La actividad uresica remanente, de los

productos estudiados en presencia de urea en solucin, fue determinada segn el
mtodo AOCS, Ba 9-59 (1980) (Sorgentini y col., 1999). Este es un mtodo indirecto en
el que se determina el incremento de pH de la dispersin respecto al blanco (a un
tiempo fijo) debido a la formacin de amonaco, que es el producto de la hidrlisis
enzimtica de la urea. La muestra (200 mg) se dispers en 10 ml de buffer fosfato de
sodio 0,1 M, conteniendo urea 3% p/v (Riedel-deHan, Alemania) a pH 7. Se incub a
30C y luego de 30 minutos se determin el valor de pH. En las mismas condiciones se
realiz un blanco sin urea. En estas condiciones experimentales, la actividad uresica
remanente se expres como la diferencia de pH entre la muestra y el blanco registrada
en un perodo de 30 minutos de reaccin (pH). Esta determinacin se realiz por
triplicado.
Determinacin de actividad antitrptica: Para la determinacin de la actividad

antitrptica en las muestras se sigui el protocolo descripto por AOCS, Ba 1275 (1995)
(Della Gatta y col., 1988). En este mtodo se emplea el sustrato sinttico BAPA
(benzoil-DL-arginina-p-nitroanalida hidrocloruro), el cual es hidrolizado por la tripsina
produciendo p-nitroanilina, un compuesto de color amarillo, cuya produccin se puede
seguir por medida de la absorbancia a 410 nm. La presencia de inhibidores de tripsina
(actividad antitrptica), en una muestra de inters, se puede evaluar midiendo la
disminucin de velocidad de conversin de BAPA en p-nitroanilina cuando se emplea
una cantidad fija de la enzima comercial.
Procedimiento para las muestras: Se pes 1 g de muestra, se le agreg 50 ml de NaOH
0,01N, se incub con agitacin durante tres horas a temperatura ambiente. Luego se
34
Captulo I
tomaron alcuotas del extracto, de las que se separaron los sobrenadantes por
centrifugacin (23700 xg, 10 minutos a 20C; Avanti J-25, Beckman Coulter, California,
Estados Unidos). Se colocaron 400 l del extracto (con 1 mg protena/ml) en un tubo,
se agregaron 400 l de una solucin 20 ppm tripsina (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis,
Estados Unidos) en HCl 0,001M. Posteriormente se adicion 1 ml de una solucin 40
ppm BAPA (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Estados Unidos) en buffer Tris 0,05M, pH 8,2,
CaCl2 25 mM. Se incub a 37C y se agit ocasionalmente. Luego de 10 minutos, para
detener la reaccin enzimtica se agregaron 200 l de cido actico 30% v/v y se midi
la absorbancia a 410 nm (Absm).
Procedimiento para el blanco de la muestra: Se colocaron 400 l del extracto (con 1 mg
protena/ml) en un tubo y se agreg 1 ml de sustrato BAPA. Se incub a 37C durante
10 minutos, luego se agregaron 200 l de solucin de cido actico 30% v/v y 400 l de
la solucin de enzima. Posteriormente se midi la absorbancia a 410 nm (Absbm). Este
valor corresponde a la hidrlisis no enzimtica del sustrato. La diferencia entre los
valores de absorbancia de la muestra y el blanco de la muestra (Absm Absbm), luego
de 10 minutos de reaccin enzimtica, nos indica la actividad residual de la tripsina
(AbsrT) en las condiciones del ensayo.
Procedimiento para obtener la actividad tripsina total: Se colocaron 400 l de NaOH
0,01N en un tubo, se agregaron 400 l de la solucin 20 ppm de enzima y 1ml de
sustrato BAPA. Se mantuvo a 37C durante de 10 minutos, posteriormente se
adicionaron 200 l de solucin de cido actico 30% v/v, y se midi la absorbancia a
410 nm (AbsAT). Este valor de absorbancia determina la actividad mxima de la tripsina,
luego de 10 minutos de reaccin enzimtica.
La actividad antitrptica (AAT) se expres como la diferencia entre las absorbancias
mxima y residual (AbsAT AbsrT), luego de transcurridos 10 minutos de reaccin
enzimtica, en las condiciones del ensayo.
Las determinaciones se realizaron por cuadruplicado.
35
Captulo I
I.2.5.- Solubilidad de protenas y fenoles en funcin del pH

Se pesaron aproximadamente 10 g de pellet molido de girasol y se dispersaron en 200
ml de agua destilada. Se agit durante treinta minutos, se midi el pH de la suspensin
obtenida y se mantuvo con agitacin constante por un perodo de una hora. Se agreg
NaOH (2N) o HCl (2N) para ajustar el pH en el valor deseado, se registr el volumen de
solucin agregado, se mantuvo con agitacin durante treinta minutos y se verific el
pH. Se extrajo un volumen de dispersin que fue registrado. La dispersin se centrifug
a 23700 xg durante 15 minutos a 20C (Avanti J-25, Beckman Coulter, California,
Estados Unidos). En el sobrenadante se cuantificaron protenas solubles por el mtodo
de Bradford (Bradford, 1976) y compuestos fenlicos por espectroscopa en el UV a
324 nm (Anexo I). Como patrones se emplearon seroalbmina bovina (BSA, SigmaAldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) y cido clorognico (CGA, Chemika
Fluka, Alemania), respectivamente.
Tambin se determin la solubilidad de protenas y fenoles en agua a pH 8,25 de los
concentrados y aislados siguiendo la metodologa descripta anteriormente.
Los resultados se expresaron como porcentaje respecto a la cantidad de protenas o
fenoles presentes originalmente en el material de partida. Las determinaciones se
realizaron al menos por duplicado.
I.2.6.- Hidrofobicidad superficial

La hidrofobicidad superficial (Ho) de concentrados y aislados proteicos de girasol se
determin
empleando
la
sonda
fluorescente
ANS
(cido
8-Anilino-1-
naftalenosulfnico; Aldrich Chemical Company, Inc., Estados Unidos), cuya

fluorescencia se modifica al encontrarse en un ambiente hidrofbico, segn el mtodo
descripto por Kato y col. (1980).
Las muestras se disolvieron en agua destilada (5 mg/ml, pH 8,25), se agitaron
continuamente durante una hora a 20C y luego se centrifugaron a 23700 xg, 15
minutos a 20C (Avanti J-25, Beckman Coulter, California, Estados Unidos). La
concentracin de protenas en cada sobrenadante se determin por el mtodo de
36
Captulo I
Bradford. Cada sobrenadante se diluy con agua destilada de manera de obtener

soluciones con concentracin de protenas en el rango de 5 mg/ml a 0,05 mg/ml. Las
determinaciones se realizaron por duplicado.
El mtodo se estandariz por ajuste de la intensidad de fluorescencia relativa,
empleando un espectrofluormetro Perkin-Elmer 2000 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk,
CT, Estados Unidos), a un 80% de la escala cuando se agregan 15 l de ANS 8 mM a 3
ml de metanol absoluto (calidad HPLC, J.T. Baker, Estados Unidos). Las longitudes de
onda de excitacin y emisin fueron 365 nm y 485 nm, respectivamente.
Se determin la cantidad de sonda necesaria para producir la saturacin de la muestra.
Para ello, a la muestra ms concentrada se le adicionaron distintas cantidades de ANS
hasta que no se produjeron cambios en la intensidad de fluorescencia. La cantidad de
sonda necesaria para la saturacin fue 25 l de ANS 8 mM para 3 mL de muestra. Se
determin la longitud de onda de mxima emisin de un aislado haciendo un barrido
entre 395-600 nm. La longitud de onda determinada fue 475 nm.
A cada dilucin se le midi la intensidad de fluorescencia sin y con agregado de 25 l
ANS (8 mM en agua). Se calcularon las diferencias en intensidad de fluorescencia y se
graficaron versus la concentracin de protenas en cada dilucin. El valor de la
pendiente en la zona inicial del grfico intensidad de fluorescencia versus
concentracin de protenas (calculado por regresin lineal con el programa Microcal
Origin 6.0, Microcal Software Inc., Estados Unidos) fue usado como ndice de
hidrofobicidad superficial aromtica (Ho) (Ecuacin I.1.). Todas las determinaciones se
realizaron por duplicado.
IF Ho P a
Ecuacin I.1.
Donde: IF: diferencia en intensidad de fluorescencia entre la dilucin de la muestra

sin y con agregado de ANS (UA); [P]: concentracin de protenas en cada dilucin
(mg/ml, determinada por Bradford); Ho: hidrofobicidad superficial aromtica (UA
ml/mg); a: ordenada al origen resultante del ajuste matemtico.
37
Captulo I
I.2.7.- Calorimetra diferencial de barrido

Por esta metodologa se determin la temperatura y el grado de desnaturalizacin de
las protenas. Se prepararon dispersiones de las muestras (pellet molido o productos
proteicos de girasol) al 20% p/p en agua. Entre 15 y 20 mg de dichas dispersiones se
colocaron en cpsulas de aluminio que se sellaron hermticamente. Las muestras
fueron analizadas haciendo un barrido de temperaturas a 10C/min entre 20 y 120C,
usando un Calormetro Diferencial de Barrido (DSC) Q100 V9.8 Build 296 (TA
Instrument, New Castle, Del., Estados Unidos). El equipo fue previamente calibrado
usando indio, cido lurico y cido esterico como patrones de calor y temperatura.
Luego del ensayo, las cpsulas fueron punzadas y se secaron a 105C durante 24 horas
en una estufa de conveccin forzada para determinar la materia seca. De los
termogramas obtenidos se determinaron la temperatura de pico y el rea bajo la
curva, que corresponden a la temperatura y a la entalpa de desnaturalizacin trmica
de las protenas respectivamente (Td en C y H en J/g protena), empleando el
software Universal Analysis V4.2E (TA Instruments, New Castle, Del., Estados Unidos).
Las determinaciones se realizaron como mnimo por duplicado.
I.2.8.- Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida

La composicin polipeptdica del pellet molido y de los productos proteicos de girasol
fue analizada mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), siguiendo el mtodo de Laemmli (1970).
Se prepararon geles separadores de poliacrialmida al 12% p/v con geles apiladores al
4% p/v en un sistema de mini-placas (Bio-Rad Mini-Protean II Model). Se emplearon los
siguientes sistemas buffer: Buffer de separacin: 0,375 M Tris-HCl, 0,1% SDS, pH 8,8;
buffer de corrida: 0,025 M Tris-HCl, 0,192 M Glicina, 0,1% SDS, pH 8,3; buffer de
muestra: 0,125 M TrisHCl,
20% v/v glicerol, 1% p/v
SDS, 0,05% p/v azul de
bromofenol, pH 6,8.
Todas las muestras fueron disueltas en el buffer de muestra. En particular, para
analizarlas en condiciones reductoras, se les agreg 2- mercaptoetanol (5%v/v) y se
38
Captulo I
calentaron a 100C durante 5 minutos. Todas las muestras se centrifugaron 15 minutos

a 18000 xg y temperatura ambiente (A 15, B. Braun Biotech Intenational, Estados
Unidos). En cada calle se sembr un volumen de sobrenadante correspondiente a 2030 g de protenas. La electroforesis se realiz a voltaje constante (200V).
Los geles obtenidos se fijaron y colorearon simultneamente (12 horas) con una
solucin de metanol, cido actico y agua (5:5:2) conteniendo 0,1% de Coomasie
Brilliant Blue R-250 (Anedra, Argentina). Posteriormente fueron decolorados con una
solucin acuosa de etanol 25% p/v y cido actico 10% p/v.
Para estimar la masa molecular de las protenas, se separaron tambin en los geles
patrones de bajo peso molecular (Pharmacia, Amersham, Inglaterra), conteniendo lactoalbmina (14,4 kDa); inhibidor de tripsina (20,1 kDa); anhidrasa carbnica (30
kDa); ovoalbmina (43 kDa); seroalbmina bovina (67 kDa) y fosforilasa b (94 kDa).
Se tomaron imgenes de los geles y se analizaron con el software ImageJ (Bethesda,
MD: US National Institute of Health; http://resb.info.nih.gov/ij/).
I.2.9.- Determinacin de Color

El color de los concentrados y aislados proteicos de girasol fue determinado utilizando
un colormetro (CR 300, Minolta Chroma Co., Osaka, Japn). Se emple la escala
Hunter-Lab para medir luminosidad (L: 0=negro, 100=blanco) y cromaticidad (a:
+a=rojo, -a= verde; b: +b= amarillo, -b=azul). El equipo fue calibrado usando un set de
tres placas provisto por el fabricante. Las muestras se esparcieron de manera
homognea sobre la superficie de la placa blanca con coordenadas Lplaca= 97,3; aplaca=
0,14; bplaca= 1,71. La diferencia total de color (E) fue calculada mediante la Ecuacin
I.2. Se realizaron nueve determinaciones sobre cada una de las muestras analizadas.
E ( Lmuestra Lplaca)2 (amuestra a placa)2 (bmuestra bplaca)2
Ecuacin I.2.
Donde: E: diferencia total de color entre la muestra y la placa blanca. Parmetros

Hunter-Lab L: luminosidad, a y b: cromaticidad, de la muestra y de la placa blanca.
39
Captulo I
I.2.10.- Anlisis estadstico

Los resultados se expresaron como valor medio desviacin estndar y fueron
analizados mediante anlisis de varianza (ANOVA). Las medias fueron evaluadas por el
Test de Fisher de las mnimas diferencias significativas para comparacin de pares, con
un nivel de significacin =0.05. Para ello se emple el programa Statgraphics plus,
versin 5.1 (Statgraphics, Estados Unidos).
40
Captulo I
I.3.- Resultados y Discusin
I.3.1.- Caracterizacin del pellet molido de girasol

Con el objetivo de caracterizar la materia prima, el pellet molido de girasol, se
determin su composicin qumica (% en base seca). Los resultados obtenidos se
presentan en la Tabla I.1. Se puede observar que, debido al proceso industrial de
extraccin de aceite la cantidad de material lipdico es mnima, menor al 1%. Mientras
que posee elevados contenidos de protenas e hidratos de carbono. Tambin es
notorio el elevado porcentaje de sales y la gran cantidad de fibra que presenta la
muestra, debido a la presencia de restos de cscara. En general, la composicin
qumica porcentual detallada coincide con los resultados presentados por otros grupos
de trabajo que emplearon materias primas similares (Gonzlez y col., 1975; AyhllonMeixueiro y col., 2000; Vioque y col., 2001).
Tabla I.1.: Composicin qumica (% base seca) del pellet molido de girasol.
Composicin qumica (%)
Protenas (N x 5,55)
31,67 0,06
Hidratos de Carbono
23,19 0,87
Fibra
33,64 2,25
Cenizas
7,98 0,36
Fenoles
2,65 0,03
Lpidos
0,88 0,02
Se informa promedio desviacin estndar. Porcentaje de humedad: 10,980,91.
El alto contenido proteico que presenta este subproducto, mayor al 30%, lo posiciona
como una atractiva materia prima para la elaboracin de productos enriquecidos en
protenas, como por ejemplo concentrados, aislados y/o hidrolizados. Una
particularidad de este material, comparado con otras fuentes de protenas vegetales
41
Captulo I
como soja por ejemplo, es que posee un elevado porcentaje de compuestos fenlicos
(2,65%), mayoritariamente cidos clorognico (75%) y cafeico (19%) (Anexo I). El
contenido de fenoles totales presentes en este pellet se encuentra dentro de los
valores informados en bibliografa, entre 1,5 y 5,8%, para materias primas similares
(Tabla 1) y concuerda con los perfiles descriptos por Sastry y col. (1984), Sripad y col.
(1987) y Prasad (1990).
I.3.1.1.- Componentes antinutricionales

Se determinaron las actividades uresica y antitrptica del pellet molido de girasol. En
ambos casos, se emple como control positivo una harina de porotos remojados de
soja sin tratamiento trmico. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla I.2. All
se puede observar que en el pellet molido de girasol no se encontr actividad uresica
remanente (pH=0), mientras que la harina de soja present actividad positiva, siendo
esta ltima similar al valor informado por Wagner y Sorgentini (1998) y mucho mayor
que el mximo establecido en el Cdigo Alimentario Argentino (CAA) para harinas de
soja aptas para consumo humano (pH=0,3) (http://www.anmat.gov.ar). Esta
metodologa, por ser rpida, sencilla y de bajo costo, es ampliamente utilizada en la
industria alimentaria como indicador de tratamientos trmicos. Pero dado que este
hecho no es suficiente para afirmar la inactivacin del factor antitrptico debido a que,
en ciertas condiciones, su resistencia puede ser mayor que la de ureasa (Sorgentini y
col., 1999), se procedi a determinar su actividad (Tabla I.2.). Se encontr que las
muestras correspondientes al pellet molido de girasol mostraron una actividad
antitrptica muy baja (AAT=0,01), mientras que las correspondientes a harina de soja
presentaron una elevada actividad antitrptica (AAT=1,18), siendo este valor menor al
informado por Della Gatta y col. (1988) (AAT=1,70).
Por lo tanto, la ausencia de estos compuestos antinutricionales en el pellet residual
generado por la industria aceitera local permitira la elaboracin de productos
proteicos de girasol, tanto concentrados como aislados, para ser empleados en
alimentacin humana, evitando la necesidad de someterlos a tratamientos trmicos
intensos, que si bien inactivan los factores antinutricionales, tambin afectan las
42
Captulo I
caractersticas de los otros componentes presentes y significan un costo adicional de

procesamiento.
Tabla I.2.: Actividad uresica remanente y actividad antitrptica en pellet molido de

girasol y en harina de porotos remojados de soja sin tratamiento trmico.
Muestra
Actividad
uresica*
Actividad
antitrptica**
Pellet molido de girasol
0,00 0,01a
0,01 0,01a
Porotos remojados de soja sin tratamiento trmico
2,41 0,01b
1,18 0,04b
Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, los valores con distinto superndice
son significativamente diferentes con p0,05. *pH. **AAT.
I.3.1.2.- Protenas de girasol

Sabiendo que durante la extraccin de aceite, las protenas fueron tratadas con
solventes orgnicos y se sometieron a esfuerzos de corte, altas presiones y
temperaturas (Figura 4.), y que esto puede provocar desnaturalizacin proteica, se
procedi a determinar el grado de desnaturalizacin de las protenas de girasol
mediante calorimetra diferencial de barrido. El termograma del pellet molido de
girasol (Figura I.1.A.) present una nica endoterma correspondiente a la
desnaturalizacin de las protenas presentes, indicndonos que stas no se encuentran
totalmente desnaturalizadas, probablemente debido a su elevada estabilidad trmica.
Su temperatura de desnaturalizacin fue de 100,6C, mayor que la reportada para las
globulinas 11S de otras especies, por ejemplo soja, acorde con su elevado contenido
de aminocidos hidrofbicos (Molina y col., 2004). La energa puesta en juego en el
proceso de desnaturalizacin fue de 9,4 J/g protena. Tomando como referencia el
valor de H=14,5 J/g protena informado por Gonzlez-Prez y col. (2002) para un
aislado de girasol en condiciones nativas, puede estimarse que el grado de
desnaturalizacin proteica en el pellet utilizado es de 35%.
43
Captulo I
Sample: H2
Size: 1.4600 mg
Method: Ramp
File: C:...\Documents\DSC\17-06-08\H2.001
Operator: C. J. Lecot-R.D.R
Run Date: 17-Jun-2008 09:57
Instrument: DSC Q100 V9.8 Build 296
DSC
-3
kDa
Flujo calrico (W/g)
94
Heat Flow (W/g)
67
45
Td: 100,65C
H: 2,89 J/g Slido Seco
90.79C
8,26 J/g Protena Seca
2.888J/g
30
100.65C
20,1
Alb
14,4
-4
40
Exo Up
50
60
70
80
Temperature (C)
Temperatura
(C)
90
100
110
120
Universal V4.2E TA Instruments
Figura I.1. A) Termograma obtenido por DSC de las protenas presentes en el pellet
molido de girasol. B) Perfil de electroforesis SDS-PAGE de las protenas presentes en el
pellet molido de girasol. Calle 1: SDS-PAGE. Calle 2: SDS-PAGE en condiciones
reductoras (con 2- mercaptoetanol). Calle 3: Patrones de bajo peso molecular (LMW).
La composicin polipeptdica de las protenas presentes en el pellet molido de girasol

se analiz mediante electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) en condiciones no
reductoras y reductoras (Figura I.1.B.). Los perfiles electroforticos obtenidos
muestran la presencia de varias bandas con pesos moleculares entre 52-68 kDa (calle
1) correspondientes a las subunidades - de la globulina 11S (Heliantinina). Cada una
de estas subunidades est compuesta por dos cadenas polipeptdicas, una cida () de
peso molecular entre 30-40 kDa; y otra bsica () de peso molecular entre 20-30 kDa,
unidas entre s por medio de puentes disulfuro (Molina y col., 2004). En condiciones
reductoras (calle 2), es posible observar dichas bandas sealadas como y ,
respectivamente. Adems es posible la visualizacin de bandas de menor peso
molecular (15,6 kDa), las que corresponderan a albminas 2S (calle 1, Alb); como lo
describe Gonzlez-Prez y col. (2005). Tambin se evidencia la presencia de una banda
de elevado peso molecular (indicada con flecha en calle 1) correspondiente a
agregados solubles mediados por puentes disulfuro, ya que dicha banda desaparece
cuando se realiza el tratamiento con el agente reductor (calle 2).
44
Captulo I
Con estos resultados podemos concluir que el pellet molido de girasol posee un elevado
contenido de protenas, principalmente globulinas y albminas. Estas protenas se
encuentran parcialmente desnaturalizadas debido al tratamiento trmico al que fueron
sometidas durante la extraccin de aceite. Este tratamiento tambin ha provocado la
formacin de agregados solubles mediados por uniones disulfuro. Este pellet carece de
factores antinutricionales, por lo que no es necesario someter a nuevos tratamientos
trmicos a los productos proteicos que se obtengan a partir del mismo. Por lo tanto, el
pellet molido de girasol se podra emplear en la elaboracin de productos proteicos con
mayor valor agregado, destinados a alimentacin humana.
I.3.2.- Seleccin de las condiciones de procesamiento para la obtencin de productos

Entre los componentes del pellet, las protenas son las que poseen mayor valor
econmico, por lo que una de las formas de conferirle mayor valor agregado es
incrementar su concentracin.
I.3.2.1.- Solubilidad de protenas y fenoles presentes en el pellet molido de girasol en

funcin del pH
Con el objeto de definir las condiciones de procesamiento para la obtencin de
productos proteicos de girasol, se estudi la solubilidad de las protenas presentes en
el pellet molido de girasol en funcin del pH (Figura I.2.). Se puede observar que a pH
entre 2 y 6 se obtuvieron porcentajes de solubilidad proteica muy bajos
(aproximadamente de 1 a 4%), y que los mismos fueron incrementndose a medida
que el medio se torn alcalino, alcanzando un valor de solubilidad mximo a pH 11,
correspondiente al 40% de la protena total (determinado por Kjeldahl). Este hecho nos
estara indicando que las protenas presentes en el pellet han perdido solubilidad en
agua, posiblemente debido a su desnaturalizacin parcial, detectada por DSC (Figura
I.1.A.), producto del proceso industrial de extraccin de aceite. Por su parte, Saeed y
col. (1988) obtuvieron perfiles similares de solubilidad en funcin del pH, pero con
45
Captulo I
mayores porcentajes de solubilidad proteica (con un mnimo de 17% a pH 3-6 y un

mximo de 90% a pH 10), probablemente debido a que emplearon harinas de girasol
obtenidas en laboratorio en condiciones de procesamiento ms suaves (descascarado
manual y extraccin de lpidos con n-hexano en sistema soxhlet). Por otra parte, en la
Figura I.2. tambin se muestra la solubilidad de los compuestos fenlicos presentes en
50
10
45
40
35
30
25
20
15
10
Solubilidad CGA (%)
Solubilidad Protenas (%)
el pellet la cual vari de 2% a 3,5%, al pasar de pH cido o alcalino a neutro.
10
11
12
13
14
pH
Figura I.2. Perfil de solubilidad en agua de las protenas ( ) y de los fenoles ( )

presentes en el pellet molido de girasol en funcin del pH.
I.3.2.2.- Condiciones operativas para la obtencin de productos proteicos de girasol

Se procedi entonces a realizar un protocolo de obtencin de concentrados proteicos
de manera clsica: solubilizacin de las protenas en medio alcalino, separacin del
sobrenadante por centrifugacin y su posterior liofilizacin. A pH 11 se esperara un
mximo rendimiento en el proceso de solubilizacin de protenas, sin embargo
Provansal y col. (1975) han descripto en dichas condiciones la formacin de
isopptidos y compuestos que no son degradados por el organismo humano, por lo
que se eligi solubilizar las protenas en agua a pH 9. Para mejorar los rendimientos, se
realizaron dos etapas sucesivas de solubilizacin de protenas y los sobrenadantes
46
Captulo I
resultantes se mezclaron antes de su secado. El concentrado proteico obtenido

mediante esta metodologa se denomin Co-L (Figura I.3.).
Pellet Molido de Girasol
Extraccin de Compuestos Fenlicos a pH 5

Centrifugacin
Repetir
3 veces
Extraccin de Fenoles con:

- Agua
- Na2SO3 0,1% p/v
- Etanol 70%
- Metanol 80%
- Butanol
Pellet
Extracto
Solubilizacin de Protenas en agua a pH 9

Centrifugacin
Repetir
1 vez
Pellet
Sobrenadante
Ajuste pH del sobrenadante en 9
Precipitacin Isoelctrica agua a pH=4.5

Centrifugacin
Suero
Pellet
Resuspensin con agua a pH=9
-Ai-L
-AiExA-L
- AiExS-L
Secado
Concentrado
Lavado
- Co-L
- CoExA-L
- CoExS-L
- CoExE-L
- CoExM-L
- CoExB-L
Secado
Aislado
Figura I.3. Esquema empleado para la obtencin de concentrados y aislados proteicos

de girasol a partir del pellet molido, en escala laboratorio.
Para la obtencin de productos enriquecidos en protenas y con menor contenido de

fenoles, se ensayaron protocolos similares al descripto anteriormente, en donde se
anexaron etapas de lavado a pH 5 (para la remocin de compuestos fenlicos) previo a
la solubilizacin de protenas en pH alcalino. Se eligi este valor de pH debido a que las
protenas estn cerca de su pH isoelctrico, esto disminuye su interaccin con los
compuestos fenlicos (Saeed y col., 1989) y su prdida por solubilizacin en el
47
Captulo I
extracto, sin disminuir notoriamente la solubilidad del CGA (Figura I.2.). Segn ensayos
preliminares sobre el pellet, cuatro extracciones sucesivas con agua eliminaron
aproximadamente el 95% de los fenoles presentes, por lo que en todos los casos se
realizaron cuatro lavados en el medio extractivo correspondiente.
En este estudio, la remocin de los compuestos fenlicos la realizamos con distintos
sistemas de extraccin (todos a pH 5): agua, Na2SO3 0,1% p/v, etanol 70%, metanol
80% y butanol. Los concentrados proteicos obtenidos mediante el empleo de estos
protocolos se denominaron: CoExA-L, CoExS-L, CoExE-L, CoExM-L y CoExB-L,
respectivamente (Figura I.3.). La eleccin de los sistemas extractivos alcohol-agua se
basa en que la solubilidad del CGA en stos es mayor que en agua (Sabir y col., 1974),
pero restara asegurar su completa remocin del producto final. Por otra parte, se
propuso emplear sulfito de sodio como agente antioxidante, en concentraciones
menores a las permitidas por la legislacin alimentaria (< 500 ppm, CAA,
http://www.anmat.gov.ar), para evitar la oxidacin de los compuestos fenlicos y su
interaccin con las protenas. Tambin se evalu la reduccin de fenoles empleando
slo agua a pH 5, teniendo en cuenta su menor costo operativo.
Para la obtencin de los aislados proteicos de girasol se realiz un protocolo bsico
(solubilizacin-precipitacin isoelctrica), se sigui la metodologa descripta para la
elaboracin de concentrados, pero los sobrenadantes resultantes de las extracciones
de protenas se sometieron a precipitacin isoelctrica (a pH=4,5). Se eligi este valor
de pH para realizar la precipitacin por ser el que permiti mayor rendimiento proteico
en ensayos preliminares. Posteriormente, el precipitado fue separado por
centrifugacin, lavado, resuspendido a pH=9 y liofilizado (Figura I.3.). De esta manera
se obtuvo el aislado proteico de girasol Ai-L. Realizando las extracciones de
compuestos fenlicos con agua o Na2SO3 0,1% p/v se obtuvieron los aislados AiExA-L y
AiExS-L, respectivamente.
48
Captulo I
I.3.3.- Caracterizacin de los concentrados y aislados proteicos obtenidos

Composicin qumica: En la Tabla I.3. se muestran los resultados del anlisis de
composicin qumica de los productos proteicos de girasol en estudio. Al analizar los
concentrados proteicos de girasol, se puede observar que el Co-L, que es el producto
con menor cantidad de etapas de concentracin, fue el que present el menor
contenido de protenas y el mayor porcentaje de compuestos fenlicos. Este producto
tambin present elevados contenidos de sales y de otros componentes,
principalmente hidratos de carbono.
Tabla I.3.: Composicin qumica de concentrados y aislados proteicos de girasol

obtenidos en laboratorio.
Productos Proteicos
Protenas*
Fenoles*
Cenizas*
Otros*
Humedad
Co-L
46,64 0,42a
5,98 0,22d
9,09 0,37d
38,3
6,82 0,01c
CoExA-L
75,50 0,81f
1,99 0,15c
4,97 0,35b
17,5
8,12 0,13d
CoExS-L
71,43 0,56d
1,42 0,04a
6,36 0,16c
20,8
5,40 0,29b
CoExE-L
63,18 0,01c
1,40 0,09a
9,99 0,94d
25,4
9,37 0,66e
CoExM-L
59,80 0,01b
1,46 0,07a,b
12,54 0,52e
26,2
10,92 0,80f
CoExB-L
59,25 0,12b
1,47 0,05a,b
12,16 0,42e
27,1
10,03 0,71e,f
Ai-L
72,40 0,46e
1,69 0,05b
3,53 0,08a
22,4
3,32 0,98a
AiExA-L
78,83 0,18h
1,61 0,06a,b
2,69 0,02a
16,9
2,99 0,10a
AiExS-L
76,52 0,30g
1,41 0,08a
3,08 0,10a
19,0
2,76 0,01a
Valores expresados en porcentaje en base seca. Se informan valores promedio desviacin estndar.
En columnas, los valores con distintos superndices son significativamente diferentes con p0,05.
Al adicionar las etapas de extracciones sucesivas para eliminar compuestos fenlicos,

se produjo un aumento en el contenido de protenas de los concentrados, siendo este
ms significativo en los productos que se obtuvieron mediante los lavados con agua
(CoExA-L) o con Na2SO3 (CoExS-L). Estos productos se caracterizaron por presentar
49
Captulo I
menor contenido de sales que Co-L, debido a la solubilizacin de las mismas en los
medios extractivos acuosos. Tambin se puede observar que las etapas de lavado
disminuyeron significativamente el contenido de fenoles. Al emplear soluciones
acuosas de alcoholes, se logr una mayor reduccin de estos compuestos, comparable
con el empleo de sulfito de sodio. Sin embargo, estos lavados alcohlicos resultaron
menos eficientes en la extraccin de otros componentes (que se solubilizan ms
fcilmente en agua), por ejemplo protenas, sales e hidratos de carbono. De este
modo, los concentrados obtenidos CoExE-L, CoExM-L y CoExB-L presentaron
contenidos de protenas intermedios entre Co-L y CoExA-L CoExS-L, y elevados
porcentajes de sales. Adems, fueron los productos que presentaron mayor contenido
de humedad (10%), posiblemente debido a su elevado porcentaje de otros
componentes, mayoritariamente hidratos de carbono, capaces de ligar agua.
Al analizar la composicin qumica de cada uno de los aislados proteicos de girasol
estudiados (Tabla I.3.), se puede observar que Ai-L present el menor porcentaje de
protenas (72% en base seca) y los mayores contenidos de fenoles y otros
componentes, (hidratos de carbono). Al adicionar etapas de remocin de fenoles
(lavados acuosos) se obtuvieron aislados con mayor contenido proteico (76-78% en
base seca) y menores porcentajes de fenoles e hidratos de carbono, sin diferencias
estadsticamente significativas en sus contenidos de sales y humedad.
Los aislados proteicos presentaron, como era de esperar, mayores contenidos de
protenas que sus correspondientes concentrados. La mayor diferencia, se dio entre los
productos Co-L y Ai-L, debido a la adicin de la etapa de precipitacin isoelctrica. En
las otras muestras, las diferencias resultaron menores debido a que los lavados previos
realizados para extraer los fenoles estaran produciendo el mismo efecto concentrador
que el de la precipitacin isoelctrica. Todos los aislados proteicos presentaron
porcentajes de cenizas y humedad menores que los correspondientes a los
concentrados. Respecto al contenido de compuestos fenlicos, las diferencias entre los
distintos aislados son mnimas, pero significativas al compararlas con los respectivos
concentrados, siendo considerable la diferencia entre Co-L y Ai-L, indicndonos que
durante las etapas de precipitacin isoelctrica y lavado del precipitado proteico
tambin se eliminan fenoles.
50
Captulo I
Rendimientos: En la Tabla I.4. se muestran los porcentajes de recuperacin de masa y

protenas, y de eliminacin de compuestos fenlicos, para cada uno de los procesos
estudiados. All se puede apreciar que el proceso clsico de obtencin de Co-L tuvo el
mayor rendimiento en masa (de 29,9%), debido a que presentaba el menor nmero de
etapas de procesamiento. En este producto se logr recuperar el 46,1% de las
protenas presentes en el pellet y se elimin el 29,4% de los compuestos fenlicos. Al
adicionar etapas de extraccin de fenoles, el rendimiento en masa disminuy
significativamente (entre 10,5 y 14,5%). La misma tendencia se observ en el
rendimiento en protenas, posiblemente debido a que parte de stas se perdieron en
dichas etapas de lavado (probablemente durante las extracciones con las soluciones
acuosas) o que perdieron solubilidad por agregacin y no se extrajeron en medio
alcalino (posiblemente en los medios alcohlicos).
Tabla I.4.: Rendimientos en recuperacin de masa, protenas y eliminacin de fenoles.
Productos Proteicos
Rendimientos (%)
Masa
Protenas
Eliminacin de Fenoles
Co-L
29,9
46,1 0,6h
29,4 3,9a
CoExA-L
14,3
35,2 0,5f
88,9 1,3b
CoExS-L
14,5
34,8 1,0f
91,8 0,4b,c,d
CoExE-L
12,4
25,2 0,1c
93,3 0,7d
CoExM-L
11,7
22,1 0,1b
93,6 0,5d
CoExB-L
10,5
19,9 0,1a
94,1 0,3d
Ai-L
14,7
36,5 0,3g
89,8 1,0b,c
AiExA-L
10,7
29,1 0,1d
92,9 0,8c,d
AiExS-L
12,3
32,4 0,2e
92,9 1,1c,d
Se consider el 100% la cantidad de materia, protenas o fenoles presentes en el pellet molido de

girasol. Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, los valores con distintos
superndices son significativamente diferentes con p0,05. Todos los errores en rendimiento en masa
fueron menores al 3%.
51
Captulo I
Paralelamente, los porcentajes de eliminacin de compuestos fenlicos aumentaron al

incluir las etapas de lavado (del 29% al 89-94%). En la Figura I.4.A. se muestra la
cuantificacin de fenoles en los extractos mediante espectroscopa UV. Se puede
apreciar que la mayora de estos compuestos se extrajeron en el primer lavado (entre
60 y 85%), siendo considerablemente menor la cantidad removida en la segunda
extraccin (entre 10 y 15%). En estas dos extracciones, se logr eliminar entre el 8994% del total de fenoles totales, no siendo necesarios los dos lavados posteriores, en
donde slo fueron efectivas las extracciones en medio alcohlicos, removiendo menos
del 5%. De los medios extractivos analizados, slo el que posee butanol result
efectivo hasta la cuarta extraccin de fenoles. Las extracciones utilizando soluciones
acuosas de alcoholes (etanol, metanol y butanol) resultaron ser las ms efectivas en lo
que respecta a la eliminacin de fenoles, logrando mayores porcentajes de reduccin
(93-94%). Este hecho se explica debido a que el CGA es entre 10 y 25 veces ms soluble
en medios alcohlicos que en agua (Sabir y col., 1974). Sin embargo, en ninguno de los
casos estudiados se logr la remocin total de los compuestos fenlicos, posiblemente
debido a que una fraccin de los mismos se encuentra interaccionando fuertemente
con las protenas. En la Figura I.4.B. se muestran, a modo de ejemplo, los
cromatogramas RP-HPLC de Ai-L, detectados a 324 nm (longitud de onda utilizada para
detectar fenoles, ver Anexo I) y a 280 nm (longitud de onda caracterstica para
detectar protenas). En el cromatograma correspondiente a 324 nm se puede observar
la presencia de CGA y CA que eluyen a 15,1 y 18,3 minutos respectivamente, dos picos
de menor intensidad entre 4 y 8 minutos (marcados como 1), atribuibles a
compuestos fenlicos minoritarios o ismeros de posicin del CGA (Fujioka y col.,
2008), y otros dos picos que eluyen a mayores tiempos de retencin (entre 27-32
minutos, marcados como 2). Estos ltimos corresponderan a compuestos fenlicos
que eluyen libres con mayor tamao molecular o hidrofobicidad, o a fenoles que
estaran interaccionando con pptidos y/o protenas, las cuales eluyen entre 27 y 40
minutos, evidencindose por las altas absorbancias que presenta dicha fraccin en los
cromatogramas detectados a 280 nm (mayores que las absorbancias a 324 nm).
52
Captulo I
A 700
Masa de CGA (mg)
600
500
400
300
200
100
0
1 Extr
2 Extr
3 Extr
4 Extr
0,30
0,25
CGA
0,20
CA
UA
0,15
0,10
0,05
0,00
1
0
10
15
20
25
30
35
40
tiempo (minutos)
Figura I.3.: A) Cuantificacin de CGA (por espectroscopa UV) en las extracciones con
distintos medios -agua ( ), sulfito de sodio ( ), etanol ( ), metanol ( ), butanol ( )durante la obtencin de concentrados proteicos de girasol. B) Cromatograma RP-HPLC
del Ai-L registrado a 280 nm () y 324 nm ().
Todos los protocolos de obtencin de aislados que se ensayaron tuvieron rendimientos

en masa y en protenas menores que los de los concentrados correspondientes, debido
a la adicin de etapas de procesamiento (precipitacin isoelctrica y lavado del
precipitado) (Tabla I.4.). Adems, es necesario remarcar que la eliminacin de
compuestos fenlicos fue ms eficiente en los procesos de obtencin de aislados
53
Captulo I
proteicos (entre 90 y 93%), debido a la precipitacin isoelctrica, eliminndose parte

de estos compuestos en el suero. Sin embargo, este efecto es ms notorio al comparar
la eliminacin obtenida en Co-L y Ai-L, 30% y 90%, respectivamente.
Los rendimientos (en masa y en protenas) informados para la produccin de los
distintos aislados proteicos de girasol son similares a los informados por Petruccelli
(1994) y Martnez (1997) en la obtencin, a escala laboratorio, de aislados proteicos de
soja y amaranto respectivamente.
Color: Una particularidad de estas muestras es que presentaron diferente coloracin.

En la Figura I.5. se muestra una fotografa del pellet molido de girasol y de los
productos proteicos en estudio, y en la Tabla 1.5. los parmetros de color de HunterLab correspondientes a los concentrados y aislados. En la Figura I.5. se puede observar
que el pellet present coloracin heterognea, marrn oscuro con manchas negras,
debido a la presencia de restos de cscara. Los concentrados y aislados, mostraron
diferencias en su coloracin, dependiendo del procesamiento empleado para su
produccin. Las muestras Co-L y Ai-L presentaron color verde (valores negativos de a,
Tabla I.5.), debido a que durante la extraccin de protenas en medio alcalino se
produce la oxidacin de los compuestos fenlicos a o-quinonas, las cuales pueden
condensar o reaccionar con los grupos catinicos de las protenas (Sosulski, 1978).
Pellet molido
Co-L
CoExA-L
CoExE-L
CoExM-L
CoExB-L
CoExS-L
Ai-L
AiExA-L
AiExS-L
Figura I.5.: Fotografa del pellet molido de girasol y de los distintos productos proteicos
obtenidos en escala de laboratorio.
54
Captulo I
Tabla I.5.: Parmetros de color Hunter-Lab de concentrados y aislados proteicos de

girasol.
Productos Proteicos
Parmetros de Color Hunter-Lab

L
Co-L
45,51 0,46b
-4,60 0,07a
7,42 0,17b
52,32 0,44d
CoExA-L
49,02 0,55d
1,72 0,06c
10,85 0,16d
49,17 0,54b
CoExS-L
53,82 0,38e
4,44 0,06f
16,22 0,26f
46,03 0,40a
Ai-L
43,05 0,19a
-3,60 0,08b
4,33 0,14a
54,44 0,18e
AiExA-L
46,38 0,52c
1,84 0,03d
9,37 0,32c
51,52 0,47c
AiExS-L
49,44 0,25d
4,00 0,04e
11,76 0,24e
49,06 0,20b
son significativamente diferentes con p0,05.
Los productos proteicos a los que se les extrajeron los compuestos fenlicos con agua
o sulfito de sodio presentaron una tonalidad ms clara (mayores L) y su coloracin
vari de marrn-verde a marrn-amarillo, evidencindose en mayores valores de los
parmetros a y b (Tabla I.5.). CoExS-L y AiExS-L presentaron mayores valores de L, a y
b, o sea menor coloracin (E), que CoExA-L y AiExA-L respectivamente. Estos
resultados nos indican que el color se desarrolla durante la extraccin alcalina de las
protenas, y que si bien se debe a la presencia de fenoles, el mismo no puede
correlacionarse directamente con el contenido de fenoles en el producto final. Los
productos proteicos con menor coloracin son los que se obtuvieron realizando las
extracciones de fenoles con soluciones acuosas de alcohol, debido a que con estos
medios se logra una remocin ms efectiva de estos compuestos, previo a la
extraccin de protenas. Los CoExS-L y AiExS-L tambin presentaron menor coloracin
(E), posiblemente debido a la proteccin que ofrece el sulfito de sodio, actuando
como antioxidante. Obtener un producto con menor coloracin podra resultar
beneficioso para su empleo como ingrediente funcional, ya que este atributo podra
condicionar su aceptacin por parte del consumidor.
55
Captulo I
I.3.4.- Propiedades Fisicoqumicas de Concentrados Proteicos de Girasol

Muchas de las aplicaciones de productos proteicos como ingredientes funcionales
requieren que los mismos presente una alta solubilidad en agua, por este motivo se
procedi a su determinacin.
En la Figura I.6.A. es posible observar que los productos proteicos en estudio se
pueden dividir en dos grupos con distintas propiedades y caractersticas, por un lado
los concentrados acuosos (Co-L, CoExA-L y CoExS-L), y por otro los alcohlicos (CoExEL, CoExM-L y CoExB-L). Los primeros presentaron elevados porcentajes de solubilidad
proteica en agua, variando entre 77 y 97%, observndose un incremento de la misma
cuando se disminuye el contenido de compuestos fenlicos. La misma tendencia
siguieron los valores de Ho, mostrados en la Figura I.6.B. Aunque la diferencia en el
contenido de fenoles entre CoExS-L (1,4%) y CoExA-L (1,9%) es pequea, este ltimo
tiene una Ho mucho menor que el primero. La alta Ho de CoExS-L podra ser atribuida
a la reduccin de enlaces disulfuro de la muestra que permitiran la disociacin de
agregados. En cambio las muestras que no tienen un tratamiento reductor tienen una
Ho muy baja que podra atribuirse a oxidaciones causadas por oxgeno del aire tanto
en cistenas libres como en los compuestos fenlicos presentes. Estas oxidaciones
seran causantes de agregacin con la consecuente reduccin de la solubilidad y Ho.
Los termogramas correspondientes a estos tres concentrados acuosos presentaron
una nica endoterma, con temperatura de desnaturalizacin de 99C. En la Figura
I.7.A. se muestra, a modo de ejemplo, el termograma correspondiente a CoExA-L. Los
valores de entalpa de desnaturalizacin encontrados nos confirman que las protenas
estn parcialmente desnaturalizadas; siendo notorio el efecto sobre Co-L (Figura
I.7.B.). Esta muestra es la que posee mayor contenido de fenoles, posiblemente estos
compuestos estaran interaccionando con las protenas, y al ser removidos mediante
las extracciones acuosas, permitiran interacciones que estabilizaran a estas
macromolculas, incrementando as su entalpa de desnaturalizacin.
56
Captulo I
97,30 e
100
90
Solubilidad (%)
80
77,48 c
83,22 d
70
60
47,97 b
50
35,92 a
40
32,43 a
30
20
10
0
Co-L
Hidrofobicidad superficial (U A.ml/mg)
CoExA-L
120
CoExS-L
CoExE-L
CoExM-L
CoExB-L
107,9 f
100
71,0 e
80
53,5 c,d
60
40
57,1 d
46,2 b,c
39,2 a
20
0
Co-L
CoExA-L
CoExS-L
CoExE-L
CoExM-L
CoExB-L
Figura I.6.: A) Solubilidad en agua y B) Hidrofobicidad superficial de las protenas de

girasol presentes en los concentrados. Las barras con distintos superndices son
significativamente diferentes con p0,05.
Por otra parte, los concentrados alcohlicos presentaron solubilidades menores a 50%
(entre 32 y 48%), siendo CoExE-L el ms soluble (Figura I.6.A.), e hidrofobicidades
superficiales intermedias a las de los concentrados acuosos e independientes del
alcohol empleado (Figura I.6.B.). Sus termogramas se caracterizaron por presentar una
nica endoterma con elevadas temperaturas (110C) y entalpas de desnaturalizacin,
siendo ambos parmetros superiores a los encontrados para las protenas de los
concentrados sometidos a extracciones acuosas y para las presentes en el pellet
(Figuras I.7.A. y I.7.B.). Estos resultados nos indicaran que las protenas extradas
mediante estas metodologas se encuentran
agregadas, posiblemente por

57
Captulo I
interacciones hidrofbicas, aumentando as su estabilidad trmica. Tambin podra

atribuirse al elevado contenido de sales que presentan estas muestras. En bibliografa
es posible encontrar que, a pH 7,5 y I=0,54M, la heliantinina 11S de girasol presenta su
mxima estabilidad trmica (de 20 a 25 J/g protena), mostrando una endoterma a
105C (Molina y col., 2004).
Flujo calrico (W/g)
0,1
50
60
70
80
90
100
110
120
Temperatura (C)
30
26,2 c
25,4 c
26,1 c
H (J/g protena)
25
20
15
11,2 b
9,1 b
10
4,4 a
0
Co-L
CoExA-L
CoExS-L
CoExE-L
CoExM-L
CoExB-L
Figura I.7.: A) Termogramas obtenidos por DSC de CoExA-L () y CoExE-L () y B)

Entalpas de desnaturalizacin de las protenas de girasol presentes en los
concentrados. Las barras con distintos superndices son significativamente diferentes
con p0,05.
En la Figura I.8.A. se muestran los perfiles SDS-PAGE en condiciones no reductoras de

las muestras en estudio. All se observa que todos los concentrados contienen
mayoritariamente a las globulinas 11S de girasol, cuyas subunidades - poseen masa
58
Captulo I
molecular entre 55 y 65 kDa. Tambin se aprecia, en todas las muestras, agregados

solubles de alto peso molecular que no alcanzaron a entrar al gel (marcados con una
flecha), siendo estas bandas ms intensas para los concentrados alcohlicos. En las
calles correspondientes a los productos alcohlicos y a CoEXS-L, se destaca la
presencia de bandas de pesos moleculares entre 30-40 kDa y 20-30 kDa,
correspondientes a las subunidades cidas () y bsicas () respectivamente. Estos
resultados, confirman las suposiciones hechas anteriormente al analizar Ho y
solubilidad. Adems, los concentrados alcohlicos muestran bandas de peso molecular
entre 14 y 18 kDa, correspondiente a la fraccin albminas (2S), presentes en Co-L,
pero ausentes en CoExA-L y CoExS-L debido a que las mismas fueron extradas durante
los extracciones acuosas de compuestos fenlicos. En los perfiles SDS-PAGE en
condiciones reductoras, mostrados en la Figura I.8.B., todos los concentrados
presentaron las bandas caractersticas de las subunidades y , adems de agregados
solubles de alto peso molecular (que no se lograron separar con el gel) en menor
concentracin que en condiciones no reductoras.
kDa
kDa
94
94
67
67
45
45
30
30
20,1
20,1
Alb
14,4
14,4
Figura I.7.: A) Electroforesis SDS-PAGE. Calles: 1: Co-L, 2: CoExA-L, 3: CoExE-L, 4:

CoExM-L, 5: CoExB-L, 6: LMW, 7: CoExS-L. B) Electroforesis SDS-PAGE en condiciones
reductoras. Calles: 1: Co-L, 2: CoExB-L, 3: CoExM-L, 4: LMW, 5: CoExE-L, 6: CoExA-L, 7:
CoExS-L.
59
Captulo I
Con estos resultados, se puede concluir que el empleo de mezclas acuosas de alcoholes
con el objetivo de eliminar fenoles, produce concentrados proteicos de girasol de
menor coloracin -debido a la eficiente remocin de estos compuestos previo a la
solubilizacin de las protenas en medio alcalino-, menor solubilidad en agua e
hidrofobicidad superficial. Mientras que, las extracciones con agua o Na2SO3, adems
de lograr reducir el contenido de fenoles en un 90%, producen concentrados con
elevada solubilidad proteica en agua (83-97%) e hidrofibicidad superficial, a pesar que
en los mismos las protenas se encuentran parcialmente desnaturalizadas.
I.3.5.- Propiedades Fisicoqumicas de Aislados Proteicos de Girasol

Se continu el estudio obteniendo aislados proteicos de girasol empleando la
metodologa tradicional, y para eliminar compuestos fenlicos se utilizaron los medios
de extraccin acuosos.
La solubilidad en agua de las protenas presentes en los distintos aislados proteicos se
presenta en la Figura I.9.A. En ella se observa que todos los productos presentaron
elevados porcentajes de solubilidad en agua (84% en promedio), no encontrndose
diferencias estadsticamente significativas con respecto al procesamiento utilizado
para la remocin de fenoles. Estos valores de solubilidad resultaron superiores a los
que se presentan en bibliografa para aislados proteicos de girasol a partir de harinas
obtenidas en el laboratorio, por molienda de semillas desgrasadas no tratadas
trmicamente. Por ejemplo, Rodrguez Patino y col. (2007) obtuvieron aislados de
girasol con 30% de solubilidad, mientras que Bau y col. (1983) y Sripad y Rao (1987)
informan valores de 50-55% (todas medidas en agua a pH8).
A pesar de no observar diferencias en la solubilidad de las protenas en agua, al
analizar los valores de hidrofobicidad superficial, que se presentan en la Figura I.9.B.,
se encontr que el Ai-L present menor Ho que AiExA-L y AiExS-L. Si bien estos
productos tienen concentraciones de fenoles similares, los mismos se extrajeron en
distintas etapas. En principio, en los aislados con mayor Ho, los fenoles se eliminaron
principalmente en los lavados previos a la extraccin proteica, mientras que en el Ai-L
60
Captulo I
la remocin de fenoles se produjo durante la precipitacin isoelctrica. Por lo tanto

podra suponerse que las protenas presentes en los distintos aislados presentaron
diferentes estados de agregacin que condujeron a distintos valores de Ho.
100
90
84,0 a
82,2 a
Ai-L
AiExA-L
85,5 a
80
Solubilidad (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
B
140
119,4 b
120
100
AiExS-L
124,7 b
87,8 a
80
60
40
20
0
Ai-L
AiExA-L
AiExS-L
Figura I.8.: A) Solubilidad en agua y B) Hidrofobicidad superficial de las protenas de

girasol presentes en los aislados. Las barras con distintos superndices son
Los termogramas de los tres aislados presentaron una nica endoterma, con
temperatura de desnaturalizacin de 100C (no mostrados). En todos los casos, las
protenas
se
encontraron
parcialmente
desnaturalizadas.
Las
entalpas
de
desnaturalizacin de los distintos aislados, en promedio 7,2 J/g protena, se muestran

61
Captulo I
en la Figura I.9.A. All se aprecia que no hay diferencias estadsticamente significativas

entre las muestras analizadas, siendo el porcentaje de desnaturalizacin cercano al
50%.
En los perfiles electroforticos SDS-PAGE en condiciones no reductoras, que se
muestran en la Figura I.9.B., se puede observar que todos los aislados contienen a las
subunidades - de la globulina 11S de girasol, evidencindose en las bandas de masa
molecular entre 55 y 65 kDa. Tambin se aprecian agregados solubles de alto peso
molecular que no alcanzaron a entrar al gel (marcados con una flecha), que
desaparecen en condiciones reductoras (Figura I.9.C.), por lo que estaran unidos por
enlaces disulfuro. Por otra parte, no se pueden visualizar las bandas con masas
moleculares menores a 20 kDa, que corresponderan a las albminas (fraccin 2S),
posiblemente debido a que stas son altamente solubles en agua y en estos procesos
se realizaron varias etapas de concentracin en medio acuoso. En la SDS-PAGE en
condiciones reductoras (Figura I.9.C.) se pueden visualizar bandas de masa molecular
entre 30-40 kDa y 20-30 kDa, correspondientes a los polipptidos cidos () y bsicos
() respectivamente.
Comparando las propiedades fisicoqumicas de los concentrados proteicos con las de
los correspondientes aislados, se encontr que stos presentaron protenas con mayor
hidrofobicidad superficial y grado de desnaturalizacin que las de los concentrados.
Tanto los concentrados como los aislados proteicos de girasol presentaron similar
composicin polipeptdica -mayoritariamente globulinas-, y elevados valores de
solubilidad en agua.
62
Captulo I
H (J/g protena)
15
10
8,2 a
7,6 a
6,9 a
0
Ai-L
AiExA-L
kDa
94
67
45
AiExS-L
kDa
94
67
45
30
30
20,1
20,1
14,4
14,4
Figura I.9.: A) Entalpas de desnaturalizacin de los aislados proteicos de girasol. B)

Electroforesis SDS-PAGE. Calles 1: LMW, 2: AiExS-L, 3: AiExA-L, 4: Ai-L. C) Electroforesis
SDS-PAGE en condiciones reductoras. Calles 1: LMW, 2: AiExS-L, 3: AiExA-L, 4: Ai-L. Las
barras con distintos superndices son significativamente diferentes con p0,05.
Con estos resultados, se puede concluir que empleando las metodologas propuestas en
este trabajo se obtienen aislados proteicos de girasol, a partir del pellet de la industria
aceitera, con reducido contenido de compuestos fenlicos, que presentan diferente
composicin qumica, coloracin e hidrofobicidad superficial. Siendo para destacar sus
elevados valores de solubilidad en agua.
63
Captulo I
I.4.- Conclusiones
Con los resultados expuestos, se puede concluir que:
a.- El pellet de girasol, subproducto de la industria aceitera local, posee un
elevado contenido de protenas y carece de factores antinutricionales, resultando apto
para ser utilizado en la obtencin de productos proteicos para alimentacin humana
sin necesidad de recurrir al uso de tratamientos trmicos intensos o bien
precipitaciones isoelctricas y lavados para eliminarlos.
b.- Las metodologas desarrolladas permitieron obtener concentrados y
aislados proteicos de girasol con diferentes caractersticas y propiedades
fisicoqumicas. Aquellas con etapas de extraccin con mezclas acuosas de alcoholes
previo a la extraccin proteica en medio alcalino, fueron ms eficientes en la remocin
de compuestos fenlicos, pero produjeron protenas con menor solubilidad en agua,
baja hidrofobicidad superficial y con una alta temperatura de desnaturalizacin (que
podra deberse al alto contenido salino de estas muestras). Por su parte, las
metodologas que involucraron lavados con agua o solucin de sulfito de sodio previo a
la extraccin proteica, tambin lograron remover casi la totalidad de los fenoles
presentes a la vez de recuperar un porcentaje mayor de protenas -mayoritariamente
globulinas-, que si bien se encontraban parcialmente desnaturalizadas presentaron
mayores solubilidades en agua.
c.- Tanto el agregado de etapas acuosas previas, as como la precipitacin
isoelctrica, conduce a la eliminacin casi total de compuestos fenlicos. Existiendo un
contenido residual de los mismos que resulta imposible de eliminar, debido a que
estaran interaccionando intensamente con las protenas.
d.- La coloracin de los productos proteicos, atribuible a los compuestos
fenlicos presentes en la harina, varo segn el protocolo de extraccin ensayado,
dependiendo de la eficiencia en la remocin de los compuestos fenlicos previo a la
etapa de solubilizacin de protenas en medio alcalino.
e.- Los concentrados acuosos y todos los aislados proteicos de girasol
obtenidos, a pesar de poseer protenas con diferentes Ho y grados de
64
Captulo I
desnaturalizacin, presentaron elevados porcentajes de solubilidad en agua, siendo

sta una caracterstica importante para su empleo como ingredientes funcionales.
Considerando el buen valor nutricional de las protenas, que las mismas no contienen
componentes antinutricionales, y que presentan altas solubilidades en agua, nace el
inters en evaluar las propiedades funcionales que estos productos proteicos
presentan, pensando en sus posibles aplicaciones como ingredientes funcionales en
alimentos.
65
Captulo II: Produccin de productos proteicos de

girasol en planta piloto
Captulo II
Captulo II: PRODUCCIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE GIRASOL EN PLANTA

PILOTO
II.1.- Introduccin
Al pensar en la posibilidad de emplear estos productos proteicos como ingredientes
funcionales aplicables en la industria alimentaria o como materias primas en la
formacin de materiales biodegradables, surge la necesidad de obtenerlos en una
mayor escala. Es sabido que la funcionalidad que exhiben las protenas depende de sus
caractersticas estructurales y de sus propiedades fisicoqumicas, y que stas, a su vez y
entre otros factores, estn condicionadas por la metodologa empleada para su
extraccin y las condiciones de su almacenamiento (Gonzlez y col., 1995; Martins y
col., 2006).
Las condiciones de obtencin de concentrados y aislados proteicos en el laboratorio
son diferentes de las que se verifican en un proceso industrial, entre ellas gradientes
de temperatura, tratamientos mecnicos, niveles de concentracin, condiciones de
operacin, equipamiento, etc., y por lo tanto las propiedades de los productos
proteicos pueden diferir notablemente (Gonzlez y col., 1995). Wagner y col. (2000) y
An y col. (2001) encontraron diferencias marcadas al comparar la hidrofobicidad
superficial, la solubilidad y la funcionalidad de aislados proteicos de soja obtenidos en
laboratorio con las de los aislados proteicos de soja comerciales, atribuyendo estas
diferencias a efectos del proceso industrial, por ejemplo secado a altas
concentraciones de protenas o presencia de sales. En bibliografa no se encontraron
estudios similares realizados con productos proteicos de girasol. De hecho, existen
muy pocos trabajos (publicaciones y patentes) en donde se proponen mtodos a
escala piloto para obtener productos proteicos de girasol. Particularmente, Gonzlez y
col. (1975) estudiaron el equilibrio prctico de la extraccin de protenas a partir de
harinas industriales de girasol, con el objetivo de disear equipos extractores
contnuos. Lawhon y col. (1982) describieron un proceso en el que evitaron la
oxidacin de los fenoles presentes -controlando pH, presencia de oxgeno y actividad
de la enzima polifenoloxidasa-, mediante el cual lograron obtener un aislado proteico
66
Captulo II
de girasol de color blanco a partir de harina de girasol preparada en el laboratorio.

Castor Normandin y col. (1984) llevaron a escala piloto el mtodo para la obtencin de
aislados proteicos de girasol a partir del pellet propuesto por Raymnod y col. (1984).
Sin embargo, en estos trabajos no se estudiaron en profundidad las propiedades
fisicoqumicas ni funcionales de los productos obtenidos. En consecuencia, la escala
piloto es una etapa necesaria para todo intento de desarrollo de productos proteicos
con las propiedades deseadas para usos industriales masivos.
Las protenas tambin pueden sufrir cambios en sus propiedades en funcin de las
condiciones y los tiempos de almacenamiento. Da Silva Pinto y col. (2005) y Martins y
col. (2006) informaron que durante el almacenamiento de aislados proteicos de soja a
distintas temperaturas y humedades relativas (25-42C, 19-74%HR) se produjeron
reacciones de agregacin por formacin de uniones disulfuro o interacciones
hidrofbicas que provocaron una disminucin en su solubilidad, condicionando as la
potencial aplicacin de esos productos como ingredientes funcionales. El efecto del
almacenamiento sobre las propiedades fisicoqumicas y funcionales de productos
proteicos de girasol an no ha sido estudiado. El hecho de que los productos proteicos
de girasol posean compuestos fenlicos difciles de eliminar completamente, y que
estos sean sensibles a la oxidacin, determina la importancia de hacer estudios
detallados en estos sistemas.
En este contexto, los objetivos planteados en este captulo fueron: estudiar el escalado
a nivel de planta piloto de las metodologas desarrolladas en el laboratorio que
resultaron adecuadas para la obtencin de concentrados y aislados proteicos de girasol
con propiedades deseadas para uso industrial, y evaluar la estabilidad de los aislados
proteicos de girasol durante su almacenamiento.
67
Captulo II
II.2.- Materiales y Mtodos
II.2.1.- Materiales
Como materia prima se emple el pellet molido de girasol descripto en el Captulo I
(seccin I.2.1.).
II.2.2.- Procesos de obtencin de productos proteicos de girasol en planta piloto

Se obtuvieron concentrados y aislados proteicos de girasol en las instalaciones de la
Planta Piloto del Instituto de Tecnologa en Alimentos, ITA-UNL, Santa Fe, Argentina.
Las condiciones operativas para la produccin en planta piloto de concentrados y
aislados proteicos de girasol se fijaron basndonos en los resultados obtenidos en
escala de laboratorio y considerando al equipamiento disponible. Un esquema de los
procesos de obtencin de productos proteicos de girasol a partir del pellet se muestra
en la Figura II.1.
Extraccin de compuestos fenlicos: El pellet molido de girasol se puso en contacto
con agua o Na2SO3 0,1% p/v; en relacin slido/lquido inicial 1:15 p/v. Se ajust el pH
en 5 con HCl 3N. Se mantuvo en agitacin durante 1 hora (con agitador tipo ancla a 60
rpm), reajustando el valor de pH en caso necesario. La separacin slido/lquido se
realiz a con una centrfuga con tela filtrante a 2800 rpm a temperatura ambiente. De
este modo, se obtuvieron un extracto fenlico I (EF1) y un residuo I (R1). Para lograr
mayor rendimiento de extraccin, R1 fue extrado por segunda vez en iguales
condiciones, obtenindose un extracto fenlico II (EF2) y un residuo II (R2).
Obtencin de concentrados proteicos de girasol: el pellet molido de girasol o R2 -si
corresponda la extraccin de fenoles previa- se dispers en agua, en una relacin
slido/lquido inicial 1:10 p/v. Se ajust el pH a 9 con NaOH 3N y se mantuvo en
agitacin constante durante 1 hora -con agitador tipo ancla a 60 rpm- verificando el
valor de pH cada 10 minutos y reajustando en caso necesario. La separacin
slido/lquido se realiz con una centrfuga con tela filtrante a 2800 rpm a temperatura
68
Captulo II
ambiente. De este modo, se obtuvieron un extracto proteico I (EP1) y un residuo I

(RP1). Para lograr mayor rendimiento de extraccin, RP1 fue extrado por segunda vez
en iguales condiciones, obtenindose un extracto proteico II (EP2) y un residuo II
(RP2). La mezcla de EP1 y EP2 se deshidrat en un secador spray Niro Atomizer
Production Minor, con temperatura de entrada de 170-190C y temperatura de salida
de 80-90C.
De esta forma se obtuvieron tres concentrados proteicos de girasol: Co-P -al que no se
le realiz ninguna etapa de extraccin de fenoles-, y CoExA-P y CoExS-P, a los que se
les disminuy el contenido de fenoles con dos lavados sucesivos con agua Na2SO3
0,1% p/v respectivamente.
Obtencin de aislados proteicos de girasol: Para obtener los aislados proteicos de
girasol, los correspondientes extractos proteicos EP1 y EP2 se mezclaron y se
sometieron a una precipitacin isoelctrica a pH 4,5 con HCl 3N en agitacin continua
durante 30 minutos con un agitador tipo ancla a 60 rpm. La separacin del precipitado
I (PP1) y del suero I (S1) se realiz con una centrfuga de platos autodeslodante
Westfalia SADDH205. El PP1 se lav con agua a pH 4,5 durante media hora, y
posteriormente se centrifug, obtenindose el precipitado II (PP2) y el suero II (S2). El
PP2 se resuspendi en agua (relacin slido/lquido 1:5 p/v) y se pas por un
homogeneizador Manton Gaulin de dos etapas (200 y 50 kg/cm 2), ajustando el pH en 9
con NaOH 3N. La dispersin resultante PR se deshidrat en un secador spray Niro
Atomizer Production Minor, con temperatura de entrada de 170-190C y temperatura
de salida de 80-90C.
De esta forma se obtuvieron tres aislados proteicos de girasol: Ai-P -al que no se le
realiz ninguna etapa de extraccin de fenoles-, y AiExA-P y AiExS-P, a los que se les
disminuy el contenido de fenoles con dos lavados sucesivos con agua Na2SO3 0,1%
p/v respectivamente.
Los rendimientos de los procesos se calcularon segn se detall en el Captulo I (I.2.2.).
69
Captulo II
II.2.3.- Caracterizacin de concentrados y aislados proteicos de girasol

Se determin la composicin qumica (humedad, protenas, cenizas y fenoles), color,
solubilidad
en
agua,
hidrofobicidad
superficial,
temperatura
calor
de
desnaturalizacin por calorimetra diferencial de barrido, y composicin polipeptdica

por SDS-PAGE de los concentrados y aislados proteicos obtenidos en planta piloto
mediante la metodologa descripta en el Captulo I.
II.2.4.- Microscopa electrnica de barrido (SEM)

Los aislados proteicos de girasol, obtenidos en el laboratorio y en la planta piloto, se
dispersaron sobre una cinta adhesiva doble faz, se metalizaron con oro en un Sputter
coater (Pelco 91000) y se observaron con un microscopio electrnico de barrido
EVO40 (LEO, Cambridge, Inglaterra) a un potencial de 7 kV.
II.2.5.- Almacenamiento de los aislados proteicos obtenidos

Los aislados proteicos de girasol obtenidos, Ai-P, AiExA-P y AiExS-P, se colocaron en
bolsas de polietileno de baja densidad y se almacenaron por 6 meses bajo dos
condiciones de temperatura y humedad controladas: a 4C y 64,3 %HR y a 20C y 58,9
%HR (humedad relativa obtenida con solucin saturada de NaBr (Anedra, Argentina)).
La estabilidad de los respectivos aislados se evalu determinando solubilidad en agua,
hidrofobicidad superficial, grado de desnaturalizacin, composicin polipeptdica y
color, a diferentes tiempos de almacenamiento: 0, 30, 60, 90, 120 y 180 das.
II.2.6.- Anlisis estadstico

versin 5.1 (Statgraphics, USA).
70
Captulo II
II.3.- Resultados y Discusin
II.3.1.- Escalado de las metodologas para la obtencin de productos proteicos de

girasol
De acuerdo a los resultados obtenidos en el laboratorio y al equipamiento disponible
en la planta piloto, se efectu el escalado de las metodologas desarrolladas para la
produccin de concentrados y aislados proteicos a partir del pellet residual de girasol.
Cabe recordar que en el captulo anterior se mostr que el empleo de soluciones
acuosas de alcoholes (etanol, metanol o butanol) en las etapas iniciales del proceso,
con el fin de eliminar fenoles, produjo concentrados proteicos con menor contenido de
estos compuestos, pero tambin con menores rendimiento en protenas y solubilidad
en agua que los concentrados acuosos, por lo que esas metodologas no fueron
escaladas.
El procedimiento clsico de produccin de concentrados y aislados proteicos
(extraccin de protenas en medio alcalino, precipitacin isoelctrica, secado) se aplic
en escala de planta piloto al pellet molido de girasol, permitindonos obtener Co-P y
Ai-P (Figura II.1.). Como era de esperar, el equipamiento de planta piloto fue diferente
del empleado en el laboratorio. Se utilizaron centrfugas de tela filtrante y
autodeslodante para la separacin de los extractos proteicos y del precipitado proteico
respectivamente, en lugar de las centrfugas de botellas empleadas en el laboratorio.
La resuspensin del precipitado isoelctrico se llev a cabo en un molino coloidal y,
finalmente, el secado se realiz en un secador spray a diferencia del liofilizador
utilizado en el laboratorio.
Por otra parte, para la obtencin de productos proteicos con menor contenido de
fenoles se redujo a dos el nmero de lavados con agua o Na2SO3 0,1% p/v previos a la
extraccin de protenas en medio alcalino (CoExA-P, AiExA-P, CoExS-P y AiExS-P)
(Figura II.1.). Esta modificacin se realiz debido a que cuando se emplearon estos
sistemas extractivos en el laboratorio, slo los dos primeros lavados fueron eficientes
en la remocin de fenoles (89% a 94%), segn lo discutido en el Captulo I (Figura
71
Captulo II
I.3.A.). De este modo se logr, disminuir considerablemente el tiempo de

procesamiento y los volmenes de desechos acuosos (extractos de compuestos
fenlicos).
Estas condiciones de obtencin son semejantes a las de un proceso industrial, y
posiblemente las propiedades fisicoqumicas y funcionales de los productos proteicos
as obtenidos difieran de las encontradas para los producidos en escala de laboratorio.
Por lo tanto, resulta importante conocer cmo se modifican dichas propiedades en
funcin de la escala de procesamiento.
Pellet Molido de Girasol
Extraccin de Fenoles con:

- Agua
- Na2SO3 0,1%p/v
Extraccin de Compuestos Fenlicos a pH 5

Centrifugacin
Extracto
Fenlico
(EF1 y EF2)
Repetir
1 vez
Residuo
(R1 y R2)
Solubilizacin de Protenas en agua a pH 9

Centrifugacin
Repetir
1 vez
Residuo
Proteico
(RP1 y RP2)
Extracto Proteico
(EP1 y EP2)
Ajuste pH del sobrenadante en 9

Secado
Precipitacin Isoelctrica agua a pH=4,5
Concentrado
Centrifugacin
Suero
(S1 y S2)
Lavado
Precipitado Proteico
(PP1 y PP2)
- Co-P
- CoExA-P
- CoExS-P
Resuspensin con agua a pH=9

- Ai-P
- AiExA-P
- AiExS-P
Secado
Aislado
Co-P
CoExA-P
CoExS-P
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
Figura II.1.: Esquema empleado para la obtencin en planta piloto de concentrados y

aislados proteicos de girasol a partir del pellet molido.
72
Captulo II
II.3.2.- Caracterizacin de Concentrados y Aislados Proteicos de Girasol

Composicin qumica y rendimientos: La composicin qumica de cada uno de los
productos proteicos obtenidos se presenta en la Tabla II.1., mientras que los
rendimientos de los procesos de produccin se muestran en la Tabla II.2. En la Tabla
II.1. se puede observar que Co-P fue el producto que present el menor contenido
proteico (41,4 %) y las mayores cantidades de sales, hidratos de carbono y compuestos
fenlicos; y tambin el que present los mayores rendimientos del proceso expresados
tanto como masa de producto obtenido o como protena, referidos a los valores
iniciales en el pellet (Tabla II.2.). Estos resultados pueden atribuirse a la menor
cantidad de etapas de concentracin proteica durante su obtencin. Por el contrario,
los otros productos, que fueron sometidos a un nmero superior de etapas de
concentracin -lavados para eliminar fenoles y/o precipitacin isoelctrica- mostraron
mayores contenidos de protenas, entre 62% y 70%. Esta misma razn justifica los
menores valores de cenizas que presentaron los aislados respecto a los de los
correspondientes concentrados, as como tambin sus menores rendimientos en masa
y protenas (Tabla II.2.).
Tabla II.1.: Composicin qumica de concentrados y aislados proteicos de girasol

obtenidos en planta piloto.
Productos Proteicos
Protenas*
Fenoles*
Cenizas*
Otros*
Humedad
Co-P
41,39 2,91a
5,40 0,30c
11,40 0,09d
41,8
6,29 0,06c
CoExA-P
65,55 0,51c
1,91 0,22a
7,02 0,10b
25,5
5,47 0,07b,c
CoExS-P
62,12 0,19b
1,96 0,15a
8,79 0,02c
27,1
5,23 0,33b
Ai-P
70,35 0,75d
2,51 0,14b
4,02 0,10a
23,1
4,89 0,36a,b
AiExA-P
70,07 1,39d
2,15 0,12a
4,45 0,01a
23,3
5,68 0,10b,c
AiExS-P
66,69 0,80c
1,82 0,04a
4,02 0,44a
27,5
4,14 0,88a
Valores expresados en porcentaje en base seca. Se informan valores promedio desviacin estndar.
En columnas, los valores con distintos superndices son significativamente diferentes con p0,05.
73
Captulo II
Tabla II.2.: Rendimientos en el proceso de obtencin de aislados proteicos de girasol

en planta piloto.
Productos Proteicos
Rendimientos (%)*
Masa
Protenas
Eliminacin de Fenoles
Co-P
30,0
41,3 0,4d
35,7 0,5a
CoExA-P
11,8
25,9 0,3c
91,0 1,6b,c
CoExS-P
13,8
28,8 0,1c
89,1 1,2b
Ai-P
7,0
16,6 0,2b
92,9 0,6b,c
AiExA-P
5,3
12,4 0,3a
95,4 0,4c
AiExS-P
6,3
14,3 0,2a,b
95,4 0,2c
*Se consider el 100% la cantidad de materia, protenas o fenoles presentes en el pellet molido de
girasol. Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, los valores con distintos
superndices son significativamente diferentes con p0,05. Todos los errores en rendimiento en masa
fueron menores al 5%.
Respecto al contenido de compuestos fenlicos, se puede apreciar que la mayor

diferencia entre concentrados y aislados la presentan Co-P y Ai-P, indicndonos que
durante la precipitacin isoelctrica se remueven gran parte de estos compuestos. Los
aislados y concentrados sometidos a lavados previos con agua y o sulfito (CoExA-P,
CoExS-P, AiExA-P y AiExS-P) no presentaron diferencias significativas en su contenido
fenlico; logrndose remover entre el 91% y 95% de los mismos, porcentajes
superiores que los correspondientes a Ai-P. Estos resultados sugieren una mayor
efectividad de los lavados iniciales que la precipitacin isoelctrica en la eliminacin de
fenoles. Posiblemente porque la precipitacin isoelctrica se realiza despus de la
extraccin de protenas a pH alcalino, etapa en donde los fenoles se asociaran con las
protenas a travs de interacciones que no se rompen al disminuir el pH durante la
precipitacin isolelctrica. Mientras que al realizar los lavados previos se estaran
eliminando fenoles que an no se han asociado a las protenas (Anexo II). Los
rendimientos de estos procesos, en masa y protenas (Tabla II.2.), son similares a los
obtenidos en la obtencin de aislados proteicos de lupino o soja en planta piloto
74
Captulo II
(DAgostina y col., 2006; Gonzlez y col., 1995), pero mayores que los informados por
Andrich y col. (2007) en el aislamiento de protenas de amaranto.
Color: Los productos proteicos obtenidos en planta piloto mostraron diferencias en su

coloracin. Los parmetros Hunter-Lab se muestran en la Tabla II.3. All se puede
observar que Co-P y Ai-P son de color verde oscuro (a - ; mayor E), debido a la
oxidacin de los compuestos fenlicos, favorecida por el tratamiento a pH alcalino, y a
su interaccin con las protenas (Sosulski, 1978).
Tabla II.3.: Parmetros de color Hunter-Lab de concentrados y aislados proteicos de

girasol obtenidos en planta piloto.
Productos Proteicos
Parmetros de Color Hunter-Lab

L
Co-P
52,80 0,33c
-8,29 0,18a
15,50 0,13c
47,27 0,30c
CoExA-P
54,52 0,55d
2,12 0,06c
16,41 0,15d
45,28 0,53b
CoExS-P
59,44 0,28e
5,79 0,12e
19,50 0,28f
42,21 0,26a
Ai-P
42,33 0,15a
-1,71 0,06b
6,8 0,08a
55,24 0,16e
AiExA-P
49,12 0,44b
4,72 0,09d
13,83 0,12b
49,89 0,41d
AiExS-P
53,17 0,78c
7,87 0,08f
16,78 0,09e
47,27 0,74c
Al anexar etapas de remocin de fenoles previas al tratamiento alcalino, los valores de

a, b y L aumentaron, producindose as un cambio en la coloracin tendiente al
marrn, as como una disminucin en el parmetro E, indicndonos que estas
muestras (CoExA-L, CoExS-L, AiExA-L y AiExS-L) presentaron una menor coloracin.
Este hecho se explica debido a que, en estas muestras, es menor la concentracin de
fenoles presentes durante la extraccin proteica en medio alcalino, etapa en donde de
estar presentes los fenoles los aislados toman la coloracin verdosa. En particular, y a
75
Captulo II
pesar de poseer el mismo contenido de compuestos fenlicos, las muestras obtenidas

empleando sulfito de sodio fueron ms claras que las producidas realizando las
extracciones con agua (mayor L y menor E). En este caso, es posible pensar que
durante la solubilizacin de protenas estn presentes cantidades residuales de sulfito
de sodio, actuando como antioxidante y disminuyendo as la posterior oxidacin de los
fenoles remanentes y el desarrollo de una coloracin intensa. En los productos CoExSP y AiExS-P, la cantidad de sulfito de sodio residual fue menor que a 500 ppm,
contenido mximo establecido por el CAA (http://www.anmat.gov.ar), no siendo un
impedimento para su empleo en alimentacin humana.
II.3.3.- Propiedades fisicoqumicas de concentrados y aislados proteicos de girasol

obtenidos en planta piloto.
En la Figura II.2.A. se muestran los porcentajes de solubilidad en agua de las protenas
presentes en concentrados y aislados de girasol. Es para destacar que todas las
muestras presentaron altos valores de solubilidad en agua, superiores a los
mencionados en bibliografa para productos proteicos obtenidos a partir de harinas
desgrasadas obtenidas a partir de semillas de girasol en el laboratorio, en procesos que
no incluyen tratamientos trmicos (Lawhon y col., 1982; Miones Conde y col., 2007;
Bau y col., 1983; Sripad y Rao, 1987). Dentro del grupo de los concentrados, el CoExS-P
present la menor solubilidad, mientras que no se detectaron diferencias significativas
en las solubilidades de los aislados proteicos, siendo stas superiores a las de sus
respectivos concentrados con iguales etapas de extraccin de fenoles. Cabe sealar
que no se registr ninguna relacin entre la solubilidad y la concentracin de fenoles.
La hidrofobicidad superficial de las protenas se muestra en la Figura II.2.B. All se
puede observar que, tanto para concentrados como para aislados, al agregar etapas de
extraccin de compuestos fenlicos las protenas presentaron mayor hidrofobicidad
superficial. Este incremento fue mayor en las muestras tratadas con sulfito de sodio,
indicndonos que este tratamiento provoca que las protenas expongan ms sus zonas
hidrofbicas, posiblemente causada por disociacin de agregados solubles,
76
Captulo II
modificacin del estado oligomricos (equilibrios entre monmeros, trmeros y

hexmeros de la heliantinina) o simplemente cambios conformacionales.
100
90
89,5 c,d
84,8 b,c,d
80,0 b,c
73,3 a,b
80
Solubilidad (%)
93,4 d
70
60,8 a
60
50
40
30
20
10
0
Co-P
CoExA-P
CoExS-P
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
120
98,3 d
100
80
74,6 c
69,4 c
60
40
91,1 d
50,4 b
29,1 a
20
0
Co-P
CoExA-P
CoExS-P
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
Figura II.2.: A) Solubilidad en agua y B) Hidrofobicidad superficial de concentrados y

aislados proteicos de girasol obtenidos en planta piloto. Las barras con distinto
superndice son significativamente diferentes con p0,05.
Las protenas presentes en Co-P presentaron menor Ho que las de Ai-P, posiblemente
debido a la presencia de compuestos fenlicos capaces de interaccionar con las
protenas por medio de sus zonas hidrofbicas. Mientras tanto, los dems
concentrados de planta no presentaron diferencias significativas respecto a los
correspondientes aislados, probablemente debido a que para ambos aislados y
77
Captulo II
concentrados, los fenoles removibles fueron eliminados en las etapas de lavado (con
agua con o sin sulfito) dejando a las protenas con conformaciones similares, que no
fueron modificadas durante la precipitacin isoelctrica. Las diferencias observadas en
Ho no se correlacionaron con las solubilidades de las muestras estudiadas.
El grado de desnaturalizacin proteica se estudi mediante calorimetra diferencial de
barrido (DSC). Todos los termogramas presentaron una nica endoterma con
temperatura de desnaturalizacin de 100-102C. Las entalpas de desnaturalizacin se
muestran en la Figura II.3.A. All se puede observar que todas las muestras se
encuentran parcialmente desnaturalizadas, entre 50% y 70%, considerando que la
heliantinina en estado nativo presenta un H=14,5 J/g protena (Gnzalez-Prezy col.,
2005). La energa puesta en juego para desnaturalizar las protenas presentes en los
concentrados con menor contenido fenlico (CoExA-P y CoExS-P) fue ligeramente
mayor que la correspondiente a Co-P. Esta muestra es la que posee mayor contenido
de fenoles, posiblemente estos compuestos estaran interaccionando con las
protenas, y al ser removidos mediante las extracciones acuosas, permitiran
interacciones que estabilizaran a estas macromolculas, incrementando as su
entalpa de desnaturalizacin. Mientras que no se observaron diferencias significativas
en las entalpas de desnaturalizacin de los aislados proteicos. Se encontr que los H
de las muestras CoExA-P y CoExS-P fueron levemente mayores que la de sus
respectivos aislados.
La composicin polipeptdica se analiz mediante los perfiles electroforticos en SDSPAGE sin y con 2- mercaptoetanol (Figura II.3.B. y II.3.C. respectivamente). En estas
dos figuras se puede apreciar que todos los productos proteicos presentaron perfiles
electroforticos similares entre s. En la Figura II.3.B. se observaron bandas de peso
molecular entre 45 y 62 kDa, correspondientes a las subunidades - de la
heliantinina; las que, en presencia de un agente reductor, se disociaron en bandas de
peso molecular entre 30-40 kDa y 20-30 kDa correspondientes a los polipptidos
cidos () y bsicos () respectivamente (Figura II.3.C.). En todas las calles de ambos
geles, se pueden observar bandas de peso molecular menor a 20 kDa,
correspondientes a albminas 2S (sealadas como Alb). Tambin es para destacar que
todas las muestras presentaron bandas muy intensas (marcadas con flecha)
78
Captulo II
correspondientes a agregados solubles de alto peso molecular (que no ingresaron en el

gel), que en presencia del agente reductor no se visualizaron, por lo que estaran
estabilizados por uniones disulfuro, y cuya formacin podra estar favorecida por el
secado spray.
10
H (J/g protena)
6,7c
6,9 c
5,8 b
5,4 b
5,4 b
4,2 a
0
Co-P
CoExA-P
CoExS-P
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
3 kDa 4
kDa
94
94
67
67
45
45
30
30
20,1
14,4
20,1
Alb
14,4
Alb
Figura II.3.: A) Entalpas de desnaturalizacin de concentrados y aislados proteicos de

girasol obtenidos en planta piloto. B) Electroforesis SDS-PAGE. Calles: 1: LMW, 2: Co-P,
3: CoExA-P, 4: CoExS-P, 5: Ai-P, 6: AiExA-P y 7: AiExS-P. C) Electroforesis SDS-PAGE en
condiciones reductoras. Calles: 1: Co-P, 2: CoExA-P, 3: CoExS-P, 4: LMW, 5: Ai-P, 6:
AiExA-P y 7: AiExS-P. Las barras con distintos superndices son significativamente
diferentes con p0,05.
79
Captulo II
II.3.4.- Comparacin Laboratorio vs. Planta Piloto

Al comparar los productos proteicos obtenidos en planta piloto con los producidos en
el laboratorio, se observ que estos ltimos presentaron mayores rendimientos en
masa y protenas, pero similares porcentajes de remocin de fenoles. Cabe recordar
que si bien en el laboratorio se realizaron dos etapas de extraccin de fenoles ms que
en planta que favorecieron a la mayor concentracin de protenas, las mismas no
contribuyeron a una mayor eliminacin de fenoles, debido a que parte de estos no
pueden ser eliminados por estar interaccionando fuertemente con las protenas. Esta
variacin signific reducciones en los tiempos de proceso y costos operativos, y
tambin afect la composicin polipeptdica de los productos proteicos. En los
concentrados y aislados obtenidos en planta piloto se observa la presencia de
globulinas y albminas, mientras que en los de laboratorio no se observa la presencia
de componentes de bajo peso molecular correspondiente a la fraccin de albminas
(Figuras II.3.B y II.3.C. versus Figuras I.9.B. y I.9.C.), adems es para destacar la
presencia de agregados solubles mediados por uniones disulfuro en los productos de
planta piloto, posiblemente favorecidos por el secado spray. Las protenas presentes
en estos productos presentaron similar estabilidad trmica (Td 100C) y mayor grado
de desnaturalizacin (menores H) que las de los productos obtenidos en el
laboratorio. Durante el procesamiento en planta piloto, estas protenas podran haber
sufrido desnaturalizacin por tratamientos con presin debido a la homogeneizacin
en molino coloidal, o por temperatura durante el secado spray, en donde es posible
llegar a temperaturas cercanas a 90C en la salida, siendo este valor prximo a las
temperaturas de onset que presentaron las endotermas (entre 90 y 95C). El tipo de
secado tambin afect la morfologa de las partculas proteicas. Durante el secado
spray se formaron partculas esfricas, pequeas y porosas, cuya superficie posee
mayor carcter hidrofbico (Figura III.4.B), mientras que la morfologa de los aislados
liofilizados (de laboratorio) se correspondi con placas finas, irregulares y compactas
(Figura III.4.A.). Esta observacin coincide son las morfologas que describieron An y
col. (2001) para aislados proteicos de soja de laboratorio y comercial. Las protenas
presentes en los concentrados y aislados de planta piloto presentaron menor Ho que
las presentes en los correspondientes productos de laboratorio, posiblemente debido
80
Captulo II
a su mayor agregacin, siendo consistente con la mayor proporcin de agregados

solubles mediados por uniones disulfuro detectados en sus perfiles de SDS-PAGE. An
as, todos los productos proteicos presentaron elevados valores de solubilidad en agua,
siendo esta una caracterstica importante para su empleo como ingredientes
funcionales en alimentos.
200 m
200 m
20 m
20 m
II
Figura III.4.: Microscopas electrnicas de barrido (SEM) de aislados proteicos de

girasol de A) laboratorio (Ai-L en I) 100X, II) 1000X) y de B) planta piloto (Ai-P en I)
100X, II) 5000X).
II.3.5.- Almacenamiento de aislados proteicos de girasol

Se estudi la estabilidad de los aislados proteicos frente a diversas condiciones de
almacenamiento: refrigeracin o temperatura ambiente a una humedad relativa
intermedia. En las Figuras II.5.A. y II.5.B. se muestra, a modo de ejemplo, cmo
variaron la solubilidad en agua y la hidrofobicidad superficial del aislado proteico de
girasol Ai-P en funcin del tiempo de almacenamiento bajo las dos condiciones
estudiadas, 4C, 64,3 %HR y 20C, 58,9 %HR, ya que los otros dos aislados de planta,
81
Captulo II
AiExA-P y AiExS-P, presentaron igual comportamiento. En la Figura II.5.A. se observa

que inicialmente alrededor del 90% de las protenas presentes en los aislados son
solubles en agua, pero que en el primer mes de almacenamiento, la solubilidad
disminuy llegando a 65% (en promedio para Ai-P y AiExA-P) o 55% (para AiExS-P), y
luego se mantuvo aproximadamente constante durante el perodo estudiado (6
meses). Martins y Netto (2006) describieron un comportamiento similar en aislados
proteicos de soja, Da Silva Pinto y col. (2005) tambin informaron una disminucin en
la solubilidad de protenas de soja, pero en condiciones de almacenamiento ms
severas (42C).
100
Solubilidad en agua (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
30
60
90
120
150
180
tiempo de almacenamiento (das)
200
Hidrofobicidad Superficial (UA.ml/mg)
150
100
50
0
0
30
60
90
120
150
180
tiempo de almacenamiento (das)
Figura II.5.: A) Solubilidad en agua y B) hidrofobicidad superficial de un aislado

proteico de girasol obtenido en plata piloto (Ai-P), en funcin del tiempo de
almacenamiento a: 4C y 64,3 %HR ( ) 20C y 58,9 %HR ( ).
82
Captulo II
En cuanto a la hidrofobicidad superficial, en la Figura II.5.B. se puede apreciar que

durante los primeros 3 meses, los valores de Ho fueron incrementndose hasta llegar a
un valor mximo y durante los tres meses posteriores se produjo un decaimiento en
este valor. Estas observaciones sugieren que durante la primera etapa, se produciran
modificaciones en el estado de asociacin-disociacin o cambios conformacionales que
produciran exposicin de los residuos hidrofbicos al medio. Mientras que en la
segunda etapa, las protenas se estaran agregando, posiblemente, por medio de
interacciones hidrofbicas o por uniones disulfuro. Como se aprecia en ambas figuras,
no hay una relacin entre solubilidad e hidrofobicidad superficial, por lo que se podra
pensar que la prdida de solubilidad se debe a cambios conformacionales seguidos por
agregacin proteica. Estos cambios conformacionales no fueron confimados por
anlisis calorimtrico y electroforesis, ya que no se apreciaron cambios en
los
termogramas obtenidos por DSC, ni en los perfiles electroforticos. Tampoco se

observaron cambios en la coloracin de los productos proteicos durante el perodo
estudiado. Resultados similares describen Hou y Chang (2004) en el estudio de
protenas de soja (glicinina).
Cabe sealar, que no se observaron diferencias significativas en las propiedades
evaluadas respecto a las condiciones de almacenamiento (T y HR) a la que los
productos proteicos de girasol fueron sometidos. Y dado que las muestras estudiadas
presentaron similar comportamiento, independientemente del contenido de fenoles
presentes en cada aislado, podra suponerse que estos compuestos no estaran
afectando su almacenamiento. Probablemente los fenoles remanentes, que estaran
interaccionando con las protenas, se encuentran protegidos, o menos susceptibles a la
oxidacin que podran sufrir en el tiempo que si estuvieran libres.
83
Captulo II
II.4.- Conclusiones
a.- Se logr escalar satisfactoriamente a nivel de planta piloto la metodologa

de obtencin de concentrados y aislados proteicos de girasol a partir del pellet residual
de la industria aceitera.
b.- La metodologa propuesta en este trabajo permiti obtener concentrados y
aislados proteicos de girasol con elevadas solubilidades en agua (90% en promedio),
siendo este un requisito frecuente para su empleo como ingrediente funcional.
c.- Estos productos proteicos presentaron diferencias en su composicin
qumica, coloracin, hidrofobicidad superficial y grado de desnaturalizacin a pesar de
mostrar perfiles electroforticos similares (con presencia de agregados solubles
mediados por puentes disulfuro, posiblemente producidos durante el secado spray).
d.- Los procesos de obtencin de productos proteicos de girasol efectuados en
planta piloto presentaron menores rendimientos, expresados en masa y protenas, que
los obtenidos en escala de laboratorio. Mientras que la eficiencia en la remocin de
fenoles fue similar en las dos escalas de procesamiento ensayadas. Los productos
proteicos obtenidos en planta piloto presentaron menores valores de hidrofobicidad
superficial y mayor grado de desnaturalizacin. Adems se observaron diferencias en
los perfiles electroforticos al comparar productos de planta piloto con los de
laboratorio, lo que sugiere que los primeros tendran mayor cantidad de albminas
que los segundos y tambin poseen agregados solubles mediados por uniones
disulfuro, no observados en los productos de laboratorio. Estas diferencias podran
atribuirse al menor nmero de etapas de proceso y al secado spray realizado en la
planta piloto. Como consecuencia de las diferencias sealadas se esperara que estos
productos exhiban propiedades funcionales diferentes.
e.-Los ensayos de almacenamientos realizados nos indican que sera posible
almacenar durante 6 meses a los aislados proteicos de girasol obtenidos empleando
las metodologas aqu descriptas, perodo en el cual conservan una solubilidad en agua
de aproximadamente 55%-65%. Durante este perodo de almacenamiento se
84
Captulo II
produjeron cambios en la hidrofobicidad superficial de las protenas, pero no se

observaron cambios en los termogramas ni en los perfiles electroforticos. El
contenido de fenoles y el color tampoco se vieron afectados. Adems se demostr, en
base a las diferentes propiedades fisicoqumicas medidas, que los productos proteicos
pueden ser almacenados tanto a temperatura ambiente como en ambientes
refrigerados empleando una humedad relativa intermedia.
85
Captulo III: Propiedades funcionales y

antioxidantes de productos proteicos de girasol
Captulo III
Captulo III: PROPIEDADES FUNCIONALES y ANTIOXIDANTES DE PRODUCTOS

PROTEICOS DE GIRASOL
III.1.- Introduccin
Las protenas son componentes importantes en la formulacin de alimentos, no slo
por sus propiedades nutricionales, sino tambin porque exhiben una amplia gama de
propiedades funcionales que le otorgan a stos caractersticas organolpticas nicas.
Dentro de las propiedades funcionales de estas macromolculas podemos mencionar:
solubilidad, capacidad de absorcin y/o de retencin de agua o aceite, viscosidad,
capacidad de formacin y estabilizacin de espumas y emulsiones, formacin de
masas, fibras y geles, etc. (Petruccelli, 1994; Pilosof, 2000; Wagner, 2000). Estas
propiedades poseen gran importancia tecnolgica, por lo que resulta imprescindible
entonces conocer qu funcionalidad presentan las protenas en estudio para definir su
potencial campo de aplicacin como ingrediente funcional.
Para evaluar la funcionalidad de las protenas, es frecuente emplear sistemas modelos
sencillos y determinar parmetros que brinden informacin sobre su capacidad de
contribuir a la propiedad de inters. Estas determinaciones no reflejan su
comportamiento final en el alimento, que es una matriz ms compleja, pero resultan
una primera aproximacin muy importante como paso previo a su formulacin
(Paulson y col., 1984).
Las propiedades funcionales que pueden presentar las protenas son sumamente
complejas, ya que dependen de varios factores, por ejemplo del origen de las
protenas, de las propiedades fisicoqumicas y estructurales de las protenas, de las
caractersticas del medio, de la metodologa de estudio, etc. Es conocido que las
protenas vegetales, por lo general, poseen una funcionalidad ms limitada que las de
origen animal (Moure y col., 2006). An as, las protenas vegetales extradas de
distintas variedades del mismo cultivo tambin presentan funcionalidad diferente
(Utsumi y col., 1980, 1993 y 2002). Es deseable que las protenas presenten elevadas
solubilidades para poder ser empleadas como agentes espumantes y/o emulsificantes,
86
Captulo III
sin embargo, la presencia de fracciones proteicas insolubles, o parcialmente

desnaturalizadas, mejora la capacidad de imbibicin y de retencin de agua (Arrese y
col., 1991, Petruccelli y col., 1994, An y col., 2001). Por lo general, las albminas
forman rpidamente espumas y emulsiones, debido a su alta velocidad de migracin a
la interfase, sin embargo estos sistemas resultan ms inestables que cuando se forman
a partir de globulinas, molculas que presentan mayor flexibilidad molecular
(Gonzlez-Prez y col., 2005). Por otra parte, la presencia de polisacridos en el medio
permite obtener espumas ms estables (Martnez y col., 2004; Karayannidou y col.,
2007), mientras que al adicionar iones se puede incrementar la estabilidad de las
emulsiones (McClements, 2004; Damodaran y col. 2005), o mejorar las propiedades
gelificantes (Puppo y col., 1998). Como es posible observar existe una estrecha relacin
estructura-funcionalidad, sin embargo resulta muy difcil de establecer debido a la
multifactorialidad del problema.
En bibliografa existe un gran nmero de trabajos en donde se estudian las
propiedades funcionales de harinas, concentrados, aislados, hidrolizados y fracciones
proteicas de girasol. En ellos se describe que estas protenas presentan moderadas
propiedades espumantes y emulsificantes (Lawhon y col., 1972; Huffman y col., 1975;
Sosulski, 1979; Canella y col., 1985; Kabirullah y col., 1988; Venktesh y col., 1993;
Guguen y col, 1996; Pawar y col., 2001; Gonzlez-Prez y col, 2005), pero que no
poseen la capacidad de gelificar (Sosulski, 1979; Snchez y col., 1997). Varios autores
mencionan que es posible mejorar estas propiedades por medio de modificaciones
fsicas, qumicas o enzimticas (Claugthon y col., 1989; Snchez y col., 1997; Miones
Conde y col., 2005; Martnez y col., 2005; Karayannidou y col., 2007; Rodrguez Patino
y col, 2007). Cabe resaltar que en la mayora de estos trabajos se emplean productos
proteicos de girasol con muy bajo contenido de fenoles, obtenidos en el laboratorio a
partir de semillas de variedades europeas y sin tratamientos trmicos. En los captulos
anteriores se desarrollaron metodologa que permitieron obtener concentrados y
aislados proteicos de girasol, en escala de laboratorio y de planta piloto a partir del
pellet residual de la industria aceitera local. Estos productos presentaron diferencias
en su composicin qumica, perfiles polipeptdicos y caractersticas estructurales, por
lo que se esperara que su comportamiento funcional tambin sea diferente. Adems,
87
Captulo III
a diferencia de lo que ocurre con otras protenas como las de soja, son pocos los
estudios que analizan la incidencia de cambios en la estructura de las protenas de
girasol sobre las propiedades funcionales que stas exhiben.
Por otra parte, algunos autores mencionan que la presencia de compuestos fenlicos
disminuye la solubilidad de las protenas de girasol (Pringent y col., 2002), lo que
modificara su funcionalidad. Sin embargo, como se mostr en los captulos anteriores,
todos los productos proteicos estudiados en este trabajo, aun aquellos con diferentes
contenidos de compuestos fenlicos, mantienen una elevada solubilidad en agua (90%
en promedio). Si se tiene en cuenta que en los ltimos aos ha crecido el inters en las
propiedades antioxidantes que poseen estos compuestos (Rice-Evans y col., 1995;
Velioglu y col., 1998; Glin, 2005; Turkmen y col., 2006), sera importante analizar si
los distintos productos proteicos de girasol presentan adems de una funcionalidad
adecuada, capacidad antioxidante.
El objetivo de este captulo fue evaluar las propiedades funcionales y la capacidad
antioxidante de los distintos productos proteicos de girasol, y relacionarlas con las
propiedades fisicoqumicas y estructurales de sus protenas, siendo esta clase de
estudios una etapa necesaria para conocer y ampliar su potencial campo de aplicacin.
88
Captulo III
III.2.- Materiales y Mtodos
III.2.1.- Materiales
Se emplearon muestras de concentrados y aislados proteicos de girasol obtenidos en
laboratorio (Co-L, CoExA-L, CoExS-L, Ai-L, AiExA-L y AiExS-L) y en planta piloto (Co-P,
CoExA-P, CoExS-P, Ai-P, AiExA-P y AiExS-P). Los concentrados de girasol en los se
extrajeron los fenoles en sistemas alcohlicos (CoExE-L, CoExM-L y CoExB-L) fueron
descartados por presentar valores bajos de solubilidad en agua (entre 32 y 48%).
III.2.2.- Propiedades funcionales dependientes de la interaccin protena-agua.

Determinacin de actividad acuosa (aw): La actividad acuosa a 25C de concentrados y
aislados proteicos de girasol fue determinada en un equipo Aqualab 3TE (Decagon
Devices, Inc., Estados Unidos). Este equipo se basa en la medicin de la temperatura
de roco, que es detectada por el cambio de reflectancia de un haz luminoso sobre un
espejo instalado en la cmara donde se coloca la muestra. El equipo se calibr
utilizando soluciones saturadas de MgCl2, K2CO3 y MgNO3 (Anedra, Argentina), cuyas
actividades acuosas a 25C son 0,328, 0,432 y 0,529 respectivamente. La saturacin
(aw=1) fue corroborada usando agua bidestilada. Todas las determinaciones fueron
realizadas al menos por duplicado.
Solubilidad en agua: Se determin segn la metodologa descripta en el Captulo I,

seccin I.2.5.
Capacidad de imbibicin de agua (WIC): La capacidad de imbibicin de agua de los

aislados proteicos de girasol a 20C fue determinada empleando el dispositivo de
Baummann (Figura III.1.A.), siguiendo el mtodo modificado por Sorgentini y col.
(1991). Este mtodo determina la absorcin espontnea de agua (en estado lquido)
por parte de la muestra a una determinada temperatura. Un papel de filtro
89
Captulo III
humedecido se coloc en un embudo conectado, por medio de una manguera flexible,

a una pipeta graduada enrasada con agua destilada (1 ml), sostenida en posicin
horizontal y al mismo nivel que el papel de filtro. La muestra deshidratada (50 mg) se
esparci en forma de una fina capa uniforme sobre el papel de filtro y se cerr la boca
del embudo con una tapa. Para cada muestra, la cantidad de agua absorbida (ml) se
registr en funcin del tiempo, hasta llegar a un valor constante o de equilibrio
(Elisalde y col., 1996). Las curvas de absorcin de agua se describieron
matemticamente segn la Ecuacin III.1., propuesta por Pilosof y col. (1985) (Figura
III.1.B.).
Qt
Bt
Ecuacin III.1.
Donde: q: Cantidad de agua absorbida (ml H2O/g slido seco), Q: mxima capacidad de
absorcin de agua (ml H2O/g slido seco), t: tiempo de ensayo (s) y B: tiempo
necesario para absorber la mitad de la cantidad mxima de agua (s).
Los parmetros Q y B se obtuvieron por regresin no lineal empleando el programa
Microcal Origin 6.0 (Microcal Software Inc., Estados Unidos). Las determinaciones se
realizaron por duplicado, como mnimo.
Capacidad de retencin de agua (WHC): Se determin la capacidad de retencin de

agua de los aislados proteicos de girasol bajo la accin de una fuerza centrfuga. Para
tal fin se prepar una suspensin 10% p/v de la muestra en agua destilada. Se agit
cada 10 minutos con vortex durante una hora. Posteriormente se separ el
sobrenadante del precipitado por medio de centrifugacin a 9000 xg durante 20
minutos a 20C (A15, B. Braun Biotech Intenational, Estados Unidos). Se determin la
masa del precipitado y se cuantific la concentracin de protenas por Bradford en el
sobrenadante (m3). La capacidad de retencin de agua de los aislados se calcul
empleando la Ecuacin III.2.
WHC
m2 m1 m3
m1
Ecuacin III.2.
90
Captulo III
Donde: WHC: Capacidad de retencin de agua (ml H2O/g aislado), m1: peso inicial de
aislado inicial (g), m2: peso del precipitado (g), m3: peso de protenas en sobrenadante
(g) y : densidad del agua (1 g/ml).
Todas las determinaciones fueron realizadas por triplicado.
B
q (ml H2O/g slido seca)
Q/2
tiempo (s)
Figura III.1.: Capacidad de imbibicin de agua (WIC). A) Dispositivo empleado para la

determinacin de WIC. B) Curva de absorcin de agua en funcin del tiempo, en donde
se muestran los puntos experimentales ( ), el modelo matemtico (- - -) y como se
calculan los parmetros Q y B empleados para describir el comportamiento de la
muestras.
91
Captulo III
III.2.3.- Propiedades de Superficie: Emulsiones y Espumas

Preparacin de las muestras: Se prepararon dispersiones de concentrados y aislados
proteicos de girasol en buffer fosfato de sodio 0,1 M a pH 3 7 y fuerza inica 0,08 M
0,54 M NaCl. Las dispersiones se agitaron continuamente durante una hora y se
centrifugaron a 23700 xg durante 15 minutos a 20C (Avanti J-25, Beckman Coulter,
California, Estados Unidos). Se cuantific la concentracin de protenas de los
sobrenadantes por Bradford (Bradford, 1976), y se fij la concentracin proteica de los
mismos a 1 mg/ml realizando una dilucin adecuada con el sistema buffer
correspondiente.
Como patrones se emplearon soluciones acuosas de un aislado proteico de soja
comercial (ASoja, Supro 500E, Solae Company, Brasil) y seroalbmina bovina (BSA,
Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos).
Propiedades Emulsificantes: Se prepararon emulsiones aceite en agua (O/W 25:75

p/p) a temperatura ambiente con un homogeneizador ULTRA-TURRAX T25 (IKA-Werke,
GmbH & Co., Alemania; dimetro de rotor=0,8 mm) a 20000 rpm durante 60 segundos.
Las soluciones proteicas (1 mg/ml) fueron empleadas como la fase acuosa, mientras
que como fase lipdica se utiliz aceite de girasol Natura (Aceitera General Deheza,
Argentina). Las emulsiones se realizaron por duplicado.
Se determin el ndice de actividad emulsionante (IAE), segn la tcnica descripta por
Pearce y Kinsella (1978). El fundamento de este mtodo es que la turbidez producida
por una dispersin de partculas es proporcional al rea interfacial. La emulsin
preparada en las condiciones antes mencionadas se diluy inmediatamente con una
solucin estabilizadora (buffer fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,1 M, SDS 0,1% p/v, pH 7).
Se realizaron dos diluciones seriadas 1/10 y 1/25 rpidamente (a los 15 y 45 segundos
respectivamente, despus de finalizada la homogeneizacin), y se midi la absorbancia
de la ltima dilucin a 500 nm en un espectrofotmetro Beckman DU650. Los valores
de IAE se calcularon segn la Ecuacin III.3.
92
Captulo III
IAE
2 2,303 Abs500 D
L P 1000
Ecuacin III.3.
Donde: IAE: ndice de actividad emulsificante (m2/g), Abs500: Absorbancia a 500 nm de

la dilucin 1/250, D: factor de dilucin (250), L: camino ptico (0,01 m), : fraccin
volumtrica de fase lipdica (0,25) y [P]: Concentracin de protenas en la solucin
antes de la emulsificacin, cuantificada por Bradford (mg/ml).
Las determinaciones se realizaron por cuadruplicado para cada una de las emulsiones
obtenidas.
Todas las emulsiones, inmediatamente luego de la homogeneizacin, se colocaron en

celdas de medida cilndricas de vidrio y fueron caracterizadas empleando un analizador
vertical de barrido QuickScan (Beckman-Coulter Inc., Fullerton, CA, Estados Unidos).
Este equipo mide Back Scattering (BS) y transmitancia (T) en funcin de la altura de la
muestra (Figura III.2.A.). Dichos perfiles se determinaron cada un minuto durante una
hora y luego de 24 horas, a 20C. En la Figura III.2.B. se muestra un perfil tpico de una
emulsin y los parmetros definidos para su caracterizacin. Para evaluar la formacin,
se determin el valor de Back Scattering inicial (BS0, %) a lo largo del tubo a tiempo
cero. En la zona inferior del tubo (entre 15-20 mm) se determin la cintica de
desestabilizacin, obtenindose un valor de tiempo medio (t 1/2, s) definido como el
tiempo para el cual el BS es la mitad del BS0. Mientras que en la zona superior del tubo
(entre 45-50 mm) se determin la cintica de cremado, de all se pudo obtener el
ndice de cremado, segn la Ecuacin III.4.
IC
BS 24h BS 0
100
BS 0
Ecuacin III.4.
Donde: IC: ndice de cremado (%), BS0: Back Scattering inicial (en la zona superior del
tubo) y BS24h: Back Scattering a las 24 horas (en la zona superior del tubo).
Las determinaciones se realizaron, al menos por duplicado.
93
Captulo III
La morfologa de las gotas se observ por microscopa ptica. Se tomaron 20 l de la

emulsin, se colocaron entre cubre y portaobjetos, e inmediatamente despus se
observaron en un microscopio equipado con una cmara Leica DC100 (Bensheim,
Alemania) y se tomaron fotografas (10X).
asfa-ph7b-p2 (28/11/08 15:03)

100%
Transmission
A
0:00
T
0:05
Energa
transmitida
0:10
Detector
50%
Fuente
lumnica y
detector
mvil
Back Scattering
0:20
Detector
0%
0:15
0:25
BS
Energa de
retrodifusin
0mm
Back Scattering
100%
100%
50mm
asfa-ph7b-p2 (28/11/08 15:03)
Back Scattering
0:30
Tiempo
0:00
0:05
100%
0:10
0:20
BSo
0:30
40%
IC
0mm
0 mm
Parte inferior
0%
0:45
Longitud
0mmdel tubo
0:50
0:55
Parte
superior
50mm
50 mm50mm
0:50
0:35
0:40
20%
t1/2
0%
0%
0:45
0:25
60%
BSo/2
0:40
0:15
80%
50%
50%
0:35
0:59
Figura III.2.: Propiedades emulsificantes. A) Principio de funcionamiento del

QuickScan. B) Perfiles tpicos de la variacin temporal de BS en funcin de la longitud
del tubo, de donde se determinan los parmetros de formacin (BSo), y estabilizacin
(t1/2 e IC) de la emulsin en estudio.
Propiedades Espumantes: Las determinaciones se efectuaron en una columna (3 cm

de dimetro y 30 cm de alto) equipada con un par de electrodos verticales fijos
localizados en su base y con un disco de vidrio fritado (tipo G4, 5-15 m) (Petruccelli y
col., 1994) (Figura III.3.A.).
94
0:55
0:59
Captulo III
Espuma
Conexin a
conductmetro
Electrodos
de placas
Solucin
proteica
Vidrio
fritado
Flujo N 2
Volumen de lquido incorporado a la espuma (ml)
B
6
Vmax
Vmax/2
vo
t1/2
0
0
Burbujeo de N2
10
tiempo (min)
Figura III.3.: Propiedades espumantes. A) Dispositivo empleado para la formacin de

espumas por burbujeo. B) Grfico de variacin temporal del lquido incorporado a la
espuma, de donde se obtienen los parmetros de formacin (vo y Vmax) y de estabilidad
(t1/2) de la espuma en estudio.
En la columna se introdujeron 6 ml de la solucin de protenas, de manera de cubrir los

electrodos, y la espuma se gener por burbujeo de N 2 (caudal: 1,33 ml/s) durante 30
segundos. Se registr la variacin temporal de la conductividad de la solucin proteica
95
Captulo III
empleando un conductmetro y un adquisidor (ambos desarrollados en el laboratorio

de Electrnica del CIDCA). Sabiendo que la conductividad de la solucin es
inversamente proporcional al volumen de lquido incorporado en la espuma, fue
posible conocer su variacin en funcin del tiempo (Figura III.3.B.). De dichas curvas se
determinaron los siguientes parmetros: el volumen mximo de lquido incorporado
en la espuma (Vmax, ml), la velocidad de incorporacin de lquido a la espuma (vo,
ml/min), y el tiempo en el que drena la mitad del lquido incorporado en la espuma al
finalizar el perodo de burbujeo (t1/2, s). Se tomaron fotografas de la espuma formada
con una cmara Genius para estudiar su morfologa. Las determinaciones se realizaron
por quintuplicado.
III.2.4.- Propiedades funcionales dependientes de la interaccin protena-protena.

Gelificacin: Se prepararon suspensiones acuosas con distintas concentraciones de los
tres aislados proteicos obtenidos en planta piloto Ai-P, AiExA-P y AiExS-P (7,5, 10, 12,5
y 15% p/v) a pH 8 y a temperatura ambiente. Tubos conteniendo 5 ml de cada
suspensin se colocaron en un bao de agua a 100C durante 5, 10, 15, 20 y 25
minutos. Inmediatamente despus se enfriaron en un bao con agua a 4C y se
mantuvieron refrigerados a la misma temperatura durante 24 horas. La concentracin
mnima de gelacin fue determinada observando que la muestra no se deslizara ni
cayera cuando el tubo era invertido (Adebowale y Lawal, 2003). Se evalu
sensorialmente la dureza de los geles formados realizando un ensayo de compresin y
cuantificando los valores por medio de la siguiente escala hednica: 1: gel muy dbil,
2: gel dbil, 3: gel medio, 4: gel fuerte y 5: gel muy fuerte.
III.2.5.- Capacidad Antioxidante

En este ensayo se determin la capacidad de capturar al radical ABTS+ (cido 2,2azino-bis(3-etilbenzentiazolino-6-sulfnico)) que poseen los concentrados y aislados
proteicos de girasol en estudio, cuantificando la decoloracin del radical ABTS + (a 734
nm) a un tiempo determinado (10 minutos) (Re y col., 1999).
96
Captulo III
Preparacin del radical ABTS+: El radical ABTS+ fue producido a partir de una solucin
acuosa 7 mM de ABTS (Fluka, Sigma-Aldrich, Alemania), a la que se le agreg 2,45 nM
de persulfato de potasio (Anedra, Argentina) y se la almacen durante 12-16 horas a
temperatura ambiente y en oscuridad. Previo a su utilizacin, la solucin se diluy con
buffer fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4 hasta obtener una absorbancia a 734 nm de
0,70 0,03 en un espectrofotmetro Beckman DU650.
Preparacin de las muestras: De cada muestra se pesaron 2 mg, se disolvieron en 1 ml
de buffer fosfato de sodio 0,01 M a pH 7,4, se agitaron continuamente durante una
hora y posteriormente se separaron los sobrenadantes por centrifugacin a 13000 xg
durante 10 minutos a 20C (A15, B. Braun Biotech Intenational, Estados Unidos). En los
sobrenadantes obtenidos se determin la capacidad de capturar al radical ABTS + y el
contenido de fenoles por espectroscopa UV a 324 nm (Anexo I).
Ensayo: Para estudiar la capacidad antioxidante de cada muestra, a 950 l de la
solucin conteniendo el radical ABTS+ (con absorbancia de 0,7) se le adicionaron 25 l
de buffer fosfato de sodio 0,01 M (pH 7,4) y 25 l de la muestra en estudio. Se agit
inmediatamente, y a los 10 minutos se midi la absorbancia a 734 nm. Como blanco de
reactivo se realiz el mismo procedimiento, colocando 25 l de buffer fosfato de sodio
0,01 M pH 7,4 en lugar de la muestra. La capacidad antioxidante, de capturar al radical
ABTS+, se determin segn la Ecuacin III.5.
CAO
Abs br Abs m
100
Abs br
Ecuacin III.5.
Donde: CAO: capacidad antioxidante, de capturar al radical ABTS+ (%), Absbr:

Absorbancia a 734 nm del blanco de reactivos, Absm: Absorbancia a 734 nm de la
muestra.
Como patrones, se emplearon soluciones de cidos glico (cido 3,4,5trihidroxibenzoico, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Estados Unidos) y hidroxitolueno
butilado (BHT, 2,6-di(tertbutil)-4- metilfenol, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Estados
Unidos). Las concentraciones empleadas fueron: 10-1000 ppm.
Las determinaciones de capacidad antioxidante se realizaron por triplicado.
97
Captulo III
III.2.6.- Anlisis estadstico

98
Captulo III
III.3.- Resultados y Discusin
III.3.1.- Propiedades funcionales dependientes de la interaccin protena-agua.

Actividad acuosa (aw): En primera instancia se determin la actividad acuosa de
concentrados y aislados proteicos de girasol. Este parmetro resulta de importancia
para definir sus condiciones de almacenamiento y conocer su estabilidad qumica y
microbiolgica. Todas las muestras en estudio presentaron valores de aw entre 0,363 y
0,496 (Figura III.4.A.), asegurndonos que estos productos son estables desde el punto
de vista microbiolgico ya que presentan aw menores a 0,6 (Beuchat, 1981). Este
parmetro mostr diferencias debido a la composicin de las muestras y al proceso
por el cual stas fueron obtenidas. Se observ que la aw de los productos proteicos de
girasol disminuy al adicionar etapas de lavado para remover compuestos fenlicos. En
la Figura III.4.B. se muestra la relacin lineal inversa existente entre aw y Ho de los
distintos concentrados y aislados proteicos de girasol obtenidos en el laboratorio (r=0,9809) y en la planta piloto (r=-0,9419). Adems, en ella es posible observar que los
productos obtenidos en planta piloto presentaron, en trminos generales, menores a w
que las de sus respectivos productos de laboratorio, hecho que puede atribuirse a la
diferencia en la forma de secado. Los Co-L y Co-P presentaron mayores aw que Ai-L y
Ai-P, pudindose aribuir esta diferencia al mayor contenido de carbohidratos y fenoles
de los primeros. Los valores de aw encontrados fueron similares al que present el
ASoja (0,4320,003) y a los informados por Jovanovich y col. (2003) para aislados
proteicos de soja nativos (de laboratorio) y desnaturalizadas (comerciales). En
resumen, si bien existe una relacin inversa entre contenido de fenoles y Ho, no fue
posible encontrar una relacin entre fenoles y aw.
99
Captulo III
Actividad acuosa (aw)
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
c,d,e
c,d,e
f
c,d
b,c
d,e
e
b
d,e
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,60
Actividad acuosa (aw)
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0
20
40
60
80
100
120
140
Figura III.4.: Actividad acuosa. A) Valores de aw de los distintos productos proteicos de

girasol. B) Relaciones entre aw y Ho de los productos proteicos de girasol obtenidos en
laboratorio ( ) y en planta piloto ( ). Se muestran valores promedio desviacin
estndar. Las barras con distintos superndices son significativamente diferentes con
p0,05.
Solubilidad: Todos los productos proteicos de girasol presentaron elevados

porcentajes de solubilidad en agua, los resultados se presentaron en el Captulo I
(secciones I.3.4. y I.3.5.) y en el Captulo II (seccin II.3.3.). Tanto los aislados proteicos
de laboratorio como los de planta piloto fueron ms solubles en agua que sus
respectivos concentrados. Obtener productos proteicos con elevada solubilidad resulta
importante ya que es un requisito para que estos presenten otras propiedades
funcionales, por ejemplo capacidad espumante y emulsificante.
100
Captulo III
Capacidad de imbibicin de agua (WIC): Mediante la metodologa de WIC se cuantific

la cantidad de agua que el material proteico fue capaz de absorber en forma
espontnea bajo la fuerza de gravedad. Los valores de mxima capacidad de absorcin
de agua (Q) y tiempos de imbibicin (B) de los aislados proteicos de girasol estudiados
se muestran en las Figuras III.5.A. y III.5.B. respectivamente. Se puede observar que Q
se increment al adicionar etapas tendientes a eliminar los compuestos fenlicos
(Figura III.5.A.), siendo mayor en los productos extrados en presencia de sulfito de
sodio. Los tiempos de imbibicin (B) tambin mostraron dicha tendencia (Figura
III.5.B.), excepto para la muestra AiExS-P, que fue la que present la mayor Q y el
menor B. Los incrementos en ambos parmetros obtenidos al remover fenoles podran
atribuirse a que durante la extraccin de estos compuestos las protenas sufrieron
cambios conformacionales, evidenciados en Ho, permitiendo que los grupos
hidroflicos estn ms accesibles para interaccionar con el agua. En la Figura III.5.C. se
muestran las relaciones entre Q y Ho de los aislados proteicos obtenidos en el
laboratorio (r=0,906) y en la planta piloto (r=0,966). Tambin fue posible observar en
las Figuras III.5.A. y III.5.B. que los aislados obtenidos en planta piloto presentaron
mayores valores de Q y B que los respectivos aislados de laboratorio. Este hecho se
podra atribuir a que los aislados obtenidos en planta piloto estaban constituidos por
protenas con mayor grado de desnaturalizacin que los obtenidos en el laboratorio,
facilitando as las interacciones protena-agua. Resultados similares describieron
Arrese y col. (1991), quienes informaron que los aislados proteicos de soja
parcialmente desnaturalizados presentaron mayor Q que los nativos o los totalmente
desnaturalizados. Cabe recordar que los aislados proteicos de girasol de planta piloto y
los de laboratorio presentaron diferencias en sus morfologas (Captulo II, seccin
III.3.4.). Durante el secado spray se formaron partculas esfricas, pequeas y porosas,
cuya superficie posee mayor carcter hidrofbico (Figura III.4.A.), estas caractersticas
podran explicar los mayores valores de Q y B respectivamente; mientras que la
morfologa de los aislados liofilizados (de laboratorio) corresponde a placas finas,
irregulares y compactas (Figura III.4.B.). An y col. (2001) informaron similares
morfologas para aislados proteicos de soja de comercial y de laboratorio
respectivamente, y manifestaron diferencias en sus valores de WIC y en la viscosidad
de sus dispersiones proteicas.
101
Captulo III
5,0
Q (ml H2 O/g Slido seco)
4,5
4,0
3,5
2,9 e
3,0
2,4 d
2,5
2,0 b
2,0
2,2 c
1,9 b
1,5 a
1,5
1,0
0,5
0,0
Ai-L
AiExA-L
AiExS-L
Ai-P
AiExA-P
B 600,0
AiExS-P
554 d
500,0
B (s)
400,0
342 c
297b,c
259 b
300,0
354c
173a
200,0
100,0
0,0
Ai-L
AiExA-L
AiExS-L
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
4,0
C
Q (ml H2O/g slido seco)
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
Figura III.5.: Capacidad de imbibicin de agua (WIC) de los distintos aislados proteicos
de girasol en estudio. A) Mxima capacidad de absorcin de agua (Q) y B) tiempo de
imbibicin (B). C) Relaciones entre Q e Ho de los productos proteicos de girasol
obtenidos en laboratorio ( ) y en planta piloto ( ). Se muestran valores promedio
desviacin estndar. Las barras con distintos superndices son significativamente
102
Captulo III
La mxima capacidad de imbibicin de agua (Q) de las muestras de girasol vari entre
1,5 y 2,8 ml H2O/g slido seco. Estos valores son similares a los informados para
aislados proteicos de amaranto y quinua (1,7-2,8 ml H2O/g slido seco, Abugoch y col.,
2008), pero menores que para aislados proteicos de soja (4,2-12,8 ml H2O/g slido
seco, Arrese y col., 1991; Remondetto y col., 2001; Jovanovich y col., 2003). Los valores
de B encontrados en literatura son notablemente menores a los informados en este
trabajo (3-9 minutos). Estos resultados muestran que todos los aislados proteicos de
girasol poseen baja capacidad de imbibicin de agua, siendo consistente con sus
elevados valores de solubilidad.
Capacidad de retencin de agua (WHC): En el ensayo de WHC se determina la

cantidad de agua que un material puede retener bajo la accin de una fuerza
centrfuga. En la Figura III.6. se observan los valores de WHC de los aislados proteicos
de girasol. No se encontr dependencia de WHC con el contenido de fenoles de los
productos analizados, sin embargo, es evidente que los aislados obtenidos en el
laboratorio retienen aproximadamente el doble de agua que los obtenidos en planta
piloto. Est descripto en bibliografa que las muestras muy solubles en agua poseen
baja WHC (Petruccelli, 1993). Este hecho podra explicar el comportamiento de los
aislados obtenidos en planta piloto, sin embargo, las muestras de laboratorio tambin
poseen elevada solubilidad en agua. Se podra pensar entonces, que los aislados de
laboratorio se agregaron de manera ms homognea, permitiendo mayor interaccin
con el agua.
Los valores de WHC que presentaron las muestras en estudio fueron mayores que los
encontrados en bibliografa para aislados proteicos de girasol, variando entre 0,8-3,9
ml H2O/g slido seco (Lin y col., 1974; Sosulski y Fleming, 1977; Vermeersch y col.,
1987). Aislados de protenas de lupino, guayaba y quinua presentaron valores de 1,44,5 ml H2O/g slido seco (Lqari y col., 2002; DAgostina y col., 2006; BernardinoNicanor y col., 2007; Abugoch y col., 2008). Petruccelli y Ann (1994) informan valores
de WHC menores a 5 ml H2O/g slido seco para aislados nativos de protenas de soja,
103
Captulo III
mientras que al someterlos a un tratamiento trmico este valor se incrementa hasta

llegar a 20-25 ml H2O/g slido seco.
20
WHC (g H2 O/g Slido seco)
18
16
14
12
11,2 b
12,7 b
12,9 b
10
8
6,1 a
5,0 a
5,2 a
AiExA-P
AiExS-P
4
2
0
Ai-L
AiExA-L
AiExS-L
Ai-P
Figura III.6.: Capacidad de retencin de agua (WHC) de los aislados proteicos de

girasol. Se muestran valores promedio desviacin estndar. Las barras con distintos
superndices son significativamente diferentes con p0,05.
Se puede concluir que los productos proteicos de girasol son estables desde el punto de
vista microbiolgico y poseen elevada solubilidad en agua. Al disminuir el contenido de
fenoles o al producirlos en planta piloto se obtuvieron aislados proteicos de girasol con
mayor capacidad de imbibicin de agua. La capacidad de retencin de agua slo se vio
afectada por la escala de procesamiento, siendo mayor en los aislados de laboratorio.
III.4.2.- Propiedades de Superficie

Se analiz la capacidad de formar y estabilizar emulsiones y espumas de soluciones
obtenidas con concentrados y aislados proteicos de girasol (1 mg de protena/ml
buffer fosfato 0,1 M) producidos en planta piloto. Se cuantific protenas en la solucin
por el mtodo de Bradford (Bradford, 1976) y se realiz la dilucin correspondiente
para ajustar su valor. Con el objetivo de emplear estos productos como ingredientes
104
Captulo III
funcionales en la industria de alimentos, el pH del buffer fue ajustado en 3 7 y la

fuerza inica fue ajustada a 0,08 M 0,54 M por agregado de NaCl. Estas condiciones
experimentales son acordes a los valores lmites de pH y fuerza inica que se
encuentran en los alimentos (Lakemond y col., 2000). Es conocido que cambios en pH y
fuerza inica pueden modificar la estructura de las protenas de girasol (Molina y col.,
2004 y Gonzlez-Prez y col., 2008), por lo que es factible que estas protenas
presenten un comportamiento funcional diferente dependiendo del medio empleado.
Capacidad de formar y estabilizar emulsiones: El proceso de formacin de una

emulsin consiste en crear rea interfacial entre dos lquidos inmiscibles,
generalmente aceite y agua, mediante trabajo mecnico. Una emulsin es un sistema
termodinmicamente inestable y tiende a desestabilizarse por diferentes mecanismos
(cremado, floculacin, desproporcin, coalescencia e inversin de fases), resultando en
la separacin parcial o total de las fases inmiscibles (Wagner 2000). Las protenas, por
ser de naturaleza anfiflica, poseen la capacidad de disminuir la tensin interfacial
agua-aceite, para ello es necesario que sta migre del seno de la solucin a la interfase,
penetre en ella y se reordene. Durante esta etapa se prefieren molculas pequeas,
solubles, con adecuado balance hidrofbico-hidroflico y que presenten flexibilidad
molecular. Una vez en la interfase, las macromolculas deben interaccionar entre ellas
para formar una pelcula alrededor de cada gota de aceite. La naturaleza de estas
interacciones define las propiedades viscoelsticas de la pelcula interfacial y la
estabilidad de la emulsin formada. Por ejemplo, las protenas con capacidad de
polimerizar por intercambio de SH/SS forman un film interfacial con mayor resistencia
a la coalescencia, tambin se conoce que los residuos proteicos remanentes en la fase
acuosa pueden disminuir, por repulsin electrosttica o impedimento estrico, la
floculacin y coalescencia (Dickinson y col., 1991, 1998, 2001; Fang y col., 1996;
Damodaran y col., 1997; McClements, 2004).
En este estudio, la capacidad de formacin de las emulsiones se evalu mediante el
ndice de actividad emulsificante (IAE) y el Back Scattering inicial (BSo). El tiempo
medio (t1/2, definido como el tiempo necesario para que el BS tome el valor de BSo/2)
105
Captulo III
y el ndice de cremado (IC) los empleamos para determinar la estabilidad de las

emulsiones en estudio.
La capacidad de formacin de emulsiones a partir de los concentrados y aislados
proteicos de girasol obtenidos en planta piloto se muestran en la Figura III.7.A y III.7.B.
respectivamente. En ellas se puede observar que la capacidad de emulsificacin (IAE)
no se vio afectada por las diferencias en composicin de las muestras. En la Figura
III.7.C se muestran, a modo de ejemplo, las microscopas pticas de las emulsiones de
AiExS-P (sin dilucin, 10X), pudindose observar que las distribuciones iniciales de
tamao de gota fueron no unimodales y adems dependientes del pH y de la fuerza
inica del medio. Es posible apreciar que tanto para concentrados como aislados a pH
3 y 0,54 M NaCl presentaron los menores IAE (Figura III.7.A y III.7.B. respectivamente),
indicndonos que igual cantidad de protenas generaron menor rea interfacial,
produciendo as menor cantidad de gotas y de mayor tamao (Figura III.7.C.). En estas
condiciones (pH 3-0,54 M NaCl), la heliantinina se encuentra en forma de monmeros
(2S, subunidades ) (Molina y col., 2004 y Gonzlez-Prez y col., 2008), su elevada Ho
(430-2430 UA ml/mg) y menor flexibilidad podran interferir en su reordenamiento en
la interfase y en la formacin de la pelcula interfacial.
Por otra parte, altos valores de BSo nos indican que hay mayor densidad de gotas en la
emulsin. En todos los casos estudiados, los valores de BSo variaron entre 54-60% y no
se encontraron diferencias estadsticamente significativas entre ellos (datos no
mostrados). Las diferencias descriptas al comparar los IAE no se manifestaron en los
valores de BSo.
106
Captulo III
A
IAE (m 2 /g)
150
100
50
54 mM
8 mM
pH 3
pH 7
B
IAE (m 2 /g)
150
100
50
54 mM
8 mM
pH 3
pH 7
pH 3-0,08 M
pH 3-0,54 M
pH 7-0,08 M
pH 7-0,54 M
Figura III.7.: Propiedades emulsificantes. Capacidad de formacin (IAE) de emulsiones

a partir de A) concentrados (Co-P ( ), CoExA-P ( ) y CoExS-P ( )) y B) aislados (Ai-P (
), AiExA-P ( ) y AiExS-P ( )) proteicos de girasol obtenidos en planta piloto, en funcin
del pH y la fuerza inica. C) Microscopa ptica (10X) de las emulsiones O/W obtenidas
con AiExS-P en distintas condiciones de pH y fuerza inica, en donde se observa la
distribucin inicial de tamao de gota.
107
Captulo III
t 1/2 (s)
1800
1200
600
0
54 mM
8 mM
pH 3
pH 7
t 1/2 (s)
1800
1200
600
0
54 mM
8 mM
pH 3
pH 7
Figura III.8.: Propiedades emulsificantes. Estabilidad (t1/2) de las emulsiones formadas

a partir de A) concentrados (Co-P ( ), CoExA-P ( ) y CoExS-P ( ) y B) aislados (Ai-P ( ),
AiExA-P ( ) y AiExS-P ( )) proteicos de girasol obtenidos en planta piloto, en funcin
del pH y la fuerza inica.
Al analizar la estabilidad de las emulsiones de los concentrados proteicos se observ

que el t1/2 de CoExA-P y CoExS-P fueron similares entre s, y mayores que el t1/2 de CoP en todos los medios estudiados, excepto en pH 3-0,54 M NaCl, en donde todas las
muestras se comportan igual (Figura III.8.A.). La menor estabilidad en este medio se
podra atribuir a que las protenas de girasol, en su conformacin 2S, no son capaces
de formar una pelcula interfacial con las propiedades adecuadas y tambin a
diferencias en la carga de la protena a este pH. El parmetro IC ( 5-15%) sigui la
misma tendencia descripta para el t1/2 (datos no mostrados).
108
Captulo III
La estabilidad de las emulsiones de aislados proteicos de girasol, evaluada mediante

t1/2, fue mayor en las muestras con menor contenido fenlico por lo que la presencia
de estos compuestos incide negativamente en esta propiedad. Se observ adems una
relacin directa de la estabilidad de las emulsiones con los valores de Ho de las
protenas (con r2 > 0,90; Figura III.9.), resultados similares para varias protenas
diferentes informaron Kato y Nakai (1980). Sin embargo, esta relacin no es unvoca,
indicndonos que hay ms factores involucrados en el proceso de desestabilizacin,
por ejemplo la presencia de agregados, la carga neta y el grado de desnaturalizacin,
siendo ms difciles de cuantificar tales relaciones. El comportamiento observado para
las muestras tratadas con sulfito, indicara que las uniones disulfuro juegan un rol en la
estabilizacin de las emulsiones, pudiendo contribuir a este fenmeno tambin su
mayor Ho en relacin a las muestras que no sufrieron este tratamiento.
2500
t 1/2 (s)
2000
1500
pH 3 - 0,08M
pH 7 - 0,08M
1000
pH 7 0,54M
500
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Ho (UA.ml/mg)
Figura III.9.: Relaciones entre la estabilidad (t1/2) de las emulsiones y la Ho de las

protenas presentes en los aislados proteicos de girasol en distintos medios: pH 3-0,08
M NaCl ( ), pH 7-0,08 M NaCl ( ), pH 7-0,054 M NaCl ( ). Los puntos con distintos
colores corresponden a los aislados estudiados: Ai-P ( ), AiExA-P ( ) y AiExS-P ( ).
Mientras tanto, todas las emulsiones que se obtuvieron a pH 3-0,54 M NaCl fueron
muy inestables. Los aislados producen emulsiones estables a bajas fuerzas inicas
(0,08 M NaCl), siendo t1/2 levemente superior a pH cido, posiblemente debido a que la
109
Captulo III
protena posee carga neta positiva, ayudando a mantener separadas las gotas de
aceite por repulsin electrosttica. Estos resultados estn de acuerdo con los
informados por Gonzlez-Prez y col. (2005), quienes estudian la estabilidad de las
emulsiones de un aislado proteicos de girasol con reducido contenido de fenoles.
Finalmente, es para destacar que las emulsiones elaboradas a partir de los productos
proteicos de girasol obtenidos en planta piloto presentaron caractersticas similares a
las producidas con soluciones de aislado proteicos de soja comercial en agua (1 mg/ml)
(BSo=57%; t1/2=2218 s; IC=13%).
Con estos resultados, es posible concluir que los productos proteicos de girasol son
capaces de formar emulsiones, presentando mayor estabilidad a baja fuerza inica. Las
propiedades emulsificantes de los aislados fueron mejores que la de los concentrados.
Capacidad de formar y estabilizar espumas: El proceso de formacin de una espuma

consiste en la incorporacin de gas, en general aire, a una solucin proteica con
creacin de rea interfacial, o sea formar burbujas rodeadas por una pelcula proteica
(Wagner, 2000). Para ejercer accin tensioactiva, la protena debe ser rpidamente
adsorbida en la interfase, o sea que debe difundir del seno de la solucin hasta la
interfase, penetrar en ella y reacomodarse. En esta etapa se requieren molculas
solubles, pequeas, flexibles y con adecuado balance hidrofbico-hidroflico.
Posteriormente, las molculas adsorbidas en la interfase deben ser capaces de
interaccionar entre s para formar una pelcula proteica con propiedades reolgicas
adecuadas rodeando las burbujas, en esta etapa deben formar agregados de gran
tamao, mnima carga superficial y alta capacidad de absorcin de agua. Este sistema
tiende a desestabilizarse por diferentes mecanismos (drenaje del lquido, flotacin de
las burbujas, desproporcin y colapso), siendo la pelcula proteica la barrera mecnica
que se opone a este proceso (Damodaran, 1997).
Se evalu la capacidad de formacin de espumas mediante la velocidad de
incorporacin de lquido a la espuma (vo) y el volumen mximo de lquido incorporado
110
Captulo III
(Vmax). La estabilidad de la espuma formada se determin mediante el parmetro t1/2,

que nos indica el tiempo necesario para que drene la mitad del lquido incorporado a la
espuma al finalizar el burbujeo. En la Figuras III.10.A. y III.10.B. se muestra la
capacidad de formacin de espumas de los concentrados proteicos de girasol
producidos en planta piloto. Se observ que todas las muestras presentaron similares
vo y Vmax, excepto Co-P a pH 7, por lo que las diferencias en el contenido de fenoles no
estaran afectando significativamente estos parmetros. Las protenas presentes en
estas muestras migraron rpidamente a la interfase (elevados vo 10-12 ml/min) e
incorporaron gran cantidad de lquido en la espuma (V max 5 ml). La variacin de pH
slo afect a Co-P, que a pH 7 present la menor capacidad de formacin de espuma
(menores vo y Vmax), mientras que la fuerza inica no tuvo efecto significativo sobre
estos parmetros. Slo las muestras de Co-P a pH 7 presentaron menor capacidad
espumante. El Co-P es el que present los mayores contenidos de fenoles y de otros
componentes, mayoritariamente glcidos, que tal vez sean los responsables de este
comportamiento.
Respecto a la estabilidad, se observ que muestras con distinto procesamiento y
composicin se comportan de manera diferente (Figuras III.10.C.), tambin se apreci
que el pH y la fuerza inica del medio afectaron a t 1/2, sugirindonos que estas
variables modifican las propiedades de las pelculas proteicas interfaciales. Al disminuir
el contenido de fenoles en los concentrados se observ un incremento en la
estabilidad de las espumas formadas a ambos pHs, siendo ms notorio a pH 3. Las
espumas de concentrados proteicos de girasol presentaron la mayor estabilidad a pH 3
y 0,08 M NaCl (Figura III.10.C.). En esas condiciones las protenas presentaron carga
neta positiva y bajos valores de Ho (49-245 UA ml/mg). Al incrementar la fuerza inica
del medio a pH 3, la estabilidad de las espumas disminuy posiblemente debido a que
las protenas adquieren conformacin monomrica (2S subunidades , Figura 5.A.)
(Molina y col., 2004 y Gonzlez-Prez y col., 2008), siendo molculas pequeas, con
elevada Ho (430-2435 UA ml/mg) y con menor capacidad de formar una pelcula
proteica interfacial resistente. Mientras que, a pH neutro, la estabilidad de las
espumas aument con el incremento de la fuerza inica del medio. A pH 7-0,08 M NaCl
las protenas de girasol formaran agregados solubles 15-18S que constituiran una
111
Captulo III
pelcula proteica interfacial con mejores caractersticas que las formadas por la
conformacin hexamrica (11S, a pH 7-0,54 M NaCl, Figura 5.C.).
A
6
Vmax (ml)
5
4
3
2
1
0
0,54 M
0,08 M
pH 3
pH 7
vo (ml/min)
B
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0,54 M
0,08M
pH 3
pH 7
t 1/2 (s)
120
60
0,54 M
0,08 M
pH 3
pH 7
Figura III.10.: Propiedades espumantes de concentrados proteicos de girasol obtenidos

en planta piloto: Co-P ( ), CoExA-P ( ) y CoExS-P ( ) en funcin del pH y la fuerza
inica. Estudio de la capacidad de formacin: A) volumen mximo de lquido
incorporado a la espuma (Vmax) y B) velocidad de incorporacin de lquido a la espuma
(vo). C) Estabilidad (t1/2) de las espumas.
112
Captulo III
Al analizar las espumas de los aislados proteicos de girasol, se observ que todos
presentaron similar capacidad de formacin (vo 11 ml/min y Vmax 5 ml),
independientemente de la composicin o de las caractersticas del medio, slo el pH
tuvo efecto significativo sobre su estabilidad, siendo sta mayor a pH neutro que a pH
cido (Figura III.11.C.). En la Figura III.12. se muestra, a modo de ejemplo, la
desestabilizacin de espumas de Ai-P en pH 3 o pH 7 y 0,08 M NaCl. Se puede observar
que al finalizar el burbujeo estas espumas presentaron una distribucin homognea
con gran nmero de burbujas pequeas y esfricas. Si bien todos los mecanismos de
desestabilizacin ocurren de manera simultnea y sinrgicamente, en las espumas
recin formadas predominan el drenaje del lquido y la flotacin de las burbujas
(Walstra, 1989). Al transcurrir en el tiempo, las caractersticas de ambas espumas se
modificaron, las burbujas crecieron adquiriendo forma polidrica y presentando una
distribucin heterognea. En esta etapa los mecanismos que predominan son los de
desproporcin y colapso (Wagner, 2000). Se puede observar que stos son ms
importantes en la desestabilizacin de las espumas formadas a pH 3 y 0,08 M NaCl.
Este resultado no coincide con lo informado por Gonzlez-Prez y col. (2005), quienes
emplean un aislado proteico de girasol con reducido contenido de fenoles, y obtienen
espumas por el mtodo de batido.
Las espumas obtenidas con protenas de girasol presentaron caractersticas
comparables a las de BSA (1 mg protena/ml de agua) (vo=9,7ml/min, Vmax=4,7 ml y
t1/2=92 s).
Con los resultados obtenidos, no fue posible encontrar relacin entre los parmetros
empleados para caracterizar las espumas y las propiedades fisicoqumicas de las
protenas de girasol, entre ellas Ho. Esta situacin tambin la describen otros autores,
mencionando que sera conveniente relacionar dichos parmetros con la
hidrofobicidad promedio y la densidad de carga neta de las macromolculas
(Townsend y col., 1983; Nakai, 1983; Kato y col., 1983; Damodaran, 2005). Estas
observaciones podran explicarse pensando que la protena se depliega casi en su
totalidad en la interfase aire-agua, debido a su elevada energa libre, exponiendo sus
sitios hidrofbicos ocultos, por lo que la hidrofobicidad superficial slo facilitara el
anclaje de la protena en la interfase (Damodaran, 2005).
113
Captulo III
A
6
Vmax (ml)
5
4
3
2
1
0
0,54 M
0,08 M
pH 3
pH 7
vo (ml/min)
B
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0,54 M
0,08M
pH 3
pH 7
t 1/2 (s)
120
60
0,54 M
0,08 M
pH 3
pH 7
Figura III.11.: Propiedades espumantes de aislados proteicos de girasol obtenidos en

planta piloto: Ai-P ( ), AiExA-P ( ) y AiExS-P ( ) en funcin del pH y la fuerza inica.
Estudio de la capacidad de formacin: A) volumen mximo de lquido incorporado a la
espuma (Vmax) y B) velocidad de incorporacin de lquido a la espuma (vo). C)
Estabilidad (t1/2) de las espumas.
114
Captulo III
al finalizar el burbujeo
1 minuto
10 minutos
15 minutos
II
Figura III.12.: Desestabilizacin de espumas formadas con Ai-P a I) pH 3 y 0,08 M NaCl,

y a II) pH 7 y 0,08 M NaCl.
Estos resultados nos indican que los productos proteicos de girasol obtenidos en planta
piloto presentan buenas propiedades espumantes. Los concentrados proteicos forman
espumas ms estables en medio cido, mientras que a pH neutro es conveniente
emplear los aislados.
III.3.3.- Propiedades dependientes de la interaccin protena-protena.

Gelificacin: Se determin la concentracin mnima de aislado proteico de girasol que
produce, por induccin trmica, un gel capaz de autosoportarse. En este estudio se
requiere gran cantidad de muestra, por lo que slo se analizaron los aislados obtenidos
en planta piloto. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura III.13.A. En ella se
puede apreciar que todos los aislados proteicos de girasol fueron capaces de formar
geles. Se observ que las concentraciones mnimas de aislados requeridas para
producir un gel proteico disminuyeron de 12,5% a 10% a medida que el tiempo de
calentamiento se increment de 5-15 a 20-25 minutos. Slo se necesit, como mnimo,
15% del Ai-P para formar un gel al ser calentado durante 5 minutos, por lo que los
fenoles no tendran un efecto marcado en la formacin del gel para tiempos mayores a
5 minutos.
115
Captulo III
Es conocido que varias protenas de origen vegetal de la familia de las cupinas, como
soja y amaranto, presentan buenas propiedades gelificantes (Puppo y col., 1995;
OKane y col., 2004; Avanza y col., 2005; Makri y col., 2005; Ee y col., 2009), por lo que
se esperara que las protenas de girasol tambin presenten dichas propiedades. La
mnima concentracin para formar geles de aislados proteicos de amaranto es 7%
(Avanza y col., 2005), mientras que para aislados de soja vara entre 10 y 14% (Puppo y
col., 1995; OKane y col., 2004; Makri y col., 2005; Ee y col., 2009). Sin embargo, en
bibliografa es posible encontrar resultados controvertidos respecto a la capacidad de
gelificacin de las protenas de girasol. Por un lado, Sosulski (1979) y Snchez y Burgos
(1997) informaron que las protenas de girasol no poseen la capacidad de gelificar. Por
otro, Gonzlez-Prez y col. (2008) reportan que es posible formar geles por induccin
trmica (a 98C) a partir de dispersiones de protenas de girasol (al 10% p/v), pero que
stos resultaron ms dbiles que los obtenidos en iguales condiciones con las glicininas
de soja (G: 500 Pa y 5000 Pa, respectivamente).
El aspecto de los geles obtenidos fue diferente, su color vari dependiendo del aislado
proteico empleado para su elaboracin, segn lo discutido previamente. En todos los
casos se observ, como es de esperar, que al incrementar la concentracin de
protenas, stos se volvieron ms oscuros. Esta caracterstica tendra que tenerse en
cuenta al emplearlo en la formulacin de alimentos.
La dureza del gel se vio afectada por la concentracin de protenas, el tipo de aislado
proteico y el tiempo de calentamiento. Los resultados obtenidos se muestran en las
Figuras III.13.B., III.13.C. y III.13.D. All se puede observar que, para todos los aislados
estudiados en concentraciones mayores al 10%, al incrementar la concentracin de
protenas y/o el tiempo de calentamiento, se producen geles ms resistentes, con
mayor dureza. Posiblemente debido a la mayor probabilidad de interaccin entre las
cadenas polipeptdicas, debido a la concentracin y/o a la desnaturalizacin proteica
ocurrida en las condiciones de formacin, que permite que las protenas expongan sus
sitios de interaccin que antes estaban ocultos. Cabe recordar que las muestras en
estudio se encontraban parcialmente desnaturalizadas y no presentaban diferencias
significativas en sus grados de desnaturalizacin, sin embargo se observ un
comportamiento particular: el Ai-P form geles ms dbiles que los de aislados con
116
Captulo III
extraccin de fenoles. Este hecho nos indica que la presencia de fenoles interfiere en la
formacin de la matriz proteica, formando un gel ms blando. En general, en medio
alcalino, la estabilidad de los geles proteicos est relacionada principalmente con la
formacin de uniones disulfuro, y en menor medida por puentes de hidrgeno e
interacciones hidrofbicas. Las uniones disulfuro incrementan la dureza de la matriz
proteica, mientras que las interacciones no covalentes ayudan a mantener su
estructura (Zheng y col., 1993; Puppo y col., 1998; Avanza y col., 2005).
Consecuentemente, se podra pensar que los geles de Ai-P son ms blandos (menos
resistentes) que los de AiExA-P y AiExS-P, debido a que posee mayor cantidad de
compuestos fenlicos capaces de interaccionar con los grupos sulfhidrilos de las
protenas (Venktesh y col., 1993; Rawel y col., 2001), disminuyendo as la posibilidad
de formar de uniones disulfuro.
A
Concentracin de protenas (%)
15,0
B
5
12,5
Dureza (UA)
4
3
10,0
2
1
0
0
7,5
10
15
20
25
tiempo de calentamiento (min)
10
Dureza (UA)
15
10,00%
20
tiempo (min)
Ai-P
C
Dureza (UA)
30
25
12,50%
15,00%
2
1
2
1
AiExA-P
10
15
tiempo (min)
10,00%
20
25
10
15
12,50%
15,00%
AiExS-P
tiempo (min)
10,00%
20
25
12,50%
15,00%
Figura III.13.: Propiedades de gelificacin. A) Concentracin mnima de gelificacin de

los distintos aislados proteicos de girasol (Ai-P ( ), AiExA-P ( ) y AiExS-P ( )) en
funcin del tiempo de calentamiento. Efecto del tiempo de calentamiento (a 100C) y
la concentracin de B) Ai-P, C) AiExA-P y D) AiExS-P sobre la dureza de los geles
formados.
117
Captulo III
Cabe mencionar que estos estudios son preliminares, pero demuestran que los aislados
proteicos de girasol producidos en planta piloto poseen la capacidad de formar geles
autosoportados con diferentes caractersticas y propiedades. Por lo tanto, se genera la
necesidad de ahondar en el estudio de las propiedades fsicas, texturales y reolgicas
de los geles proteicos obtenidos, para permitirnos conocer el sistema y sus potenciales
aplicaciones en la industria de alimentos.
III.3.4.- Capacidad antioxidante

Est descrito en bibliografa que los compuestos fenlicos poseen propiedades
antioxidantes (Prior y col., 2005), por ende, se podra pensar que las muestras con las
que estamos trabajando tambin exhibiran dicha capacidad. La metodologa
desarrollada para evaluar la capacidad antioxidante es muy diversa. En este trabajo
elegimos realizar el ensayo de inhibicin del radical ABTS+ por ser un mtodo sencillo,
por ser el radical soluble en medios acuosos y orgnicos, y porque los cambios de pH y
fuerza inica no interfieren en su determinacin (Prior y col., 2005). En la Figura
III.14.A. se presentan los resultados obtenidos para los productos proteicos de girasol.
En ella se puede apreciar que todas las muestras en estudio presentaron capacidad
antioxidante. Los Co-L y Co-P son las muestras que presentaron mayor capacidad
antioxidantes y las que poseen mayor contenido de compuestos fenlicos. Tambin se
puede apreciar que CoExS-L present valores mayores que CoExA-L, a pesar que
ambos poseen bajo contenido de fenoles. Este hecho podra explicarse debido a que
CoExS-L podra retener cantidades residuales de sulfito de sodio (menor a 500 ppm),
compuesto con carcter reductor, que interferira en esta determinacin. El mismo
comportamiento lo registran los respectivos productos de planta. Todos los
concentrados presentaron mayor capacidad antioxidante que sus respectivos aislados
proteicos de girasol, debido a su mayor contenido de compuestos fenlicos. Por otra
parte, el cambio de escala (de laboratorio a planta piloto) slo afect a las muestras
que se obtuvieron sin extraccin de fenoles (Co-L, Co-P, Ai-L y Ai-P), logrndose menor
porcentaje de inhibicin en los productos de planta, posiblemente por oxidacin de
fenoles durante el secado spray.
118
Captulo III
Si bien los fenoles estn interaccionando con las protenas, stos no perdieron su
capacidad de capturar al radical ABTS+. Todas las muestras proteicas de girasol
presentaron mayor capacidad antioxidante que ASoja, el que present una capacidad
de inhibicin del radical ABTS+ de 12,9%. Finalmente, en la Figura III.14.B. se muestra
la correlacin lineal obtenida entre capacidad de inhibicin del radical ABTS + y
porcentaje de compuestos fenlicos solubles (r2=0,9501).
Captura del radical ABTS (%)
100
90
84 h
80
67g
70
60
46 f
50
40
46 f
44 f
28c,d
30
21a,b
25 b,c
31 d,e
34e
21a,b 19 a
20
10
0
Captura del radical ABTS (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Contenido de Fenoles (%)
Figura III.14.: Propiedades antioxidantes. A) Capacidad antioxidante (inhibicin del

radical ABTS+) de concentrados y aislados proteicos de girasol. B) Correlacin lineal
entre capacidad antioxidante y contenido de compuestos fenlicos presentes en las
muestras. Se muestran valores promedio desviacin estndar. Las barras con
distintos superndices son significativamente diferentes con p0,05.
119
Captulo III
Estos resultados nos indican que la presencia de compuestos fenlicos (imposibles de

eliminar por estar interaccionando fuertemente con las protenas) en productos
proteicos de girasol le confiere buenas propiedades antioxidantes. Este hecho plantea
la necesidad de realizar estudios ms detallados sobre esta propiedad, y al mismo
tiempo, ampla el campo de aplicacin de concentrados y aislados proteicos de girasol.
120
Captulo III
III.4.- Conclusiones
a.- Los productos proteicos de girasol obtenidos en este trabajo presentaron a w

menores a 0,6, resultando seguros desde el punto de vista microbiolgico. Adems,
presentaron elevada solubilidad, baja capacidad de imbibicin de agua y moderada
capacidad de retencin de agua. Los cambios conformacionales que sufrieron las
protenas al realizar los lavados para eliminar compuestos fenlicos, evidenciados en
mayores Ho, favorecieron las interacciones protena-agua, reflejndose en menores aw
y mayores Q.
b.- Los concentrados y los aislados proteicos de girasol fueron capaces de
formar emulsiones, siendo stas ms estables en medios con baja fuerza inica. Las
propiedades emulsificantes de los aislados fueron mejores que las de los
correspondientes concentrados proteicos. La estabilidad (t1/2) de los aislados proteicos
se pudo correlacionar de manera directa, pero no unvoca, con la Ho de las protenas
presentes. Las muestras tratadas con sulfito mostraron mayor estabilidad e
hidrofobicidad superficial.
c.- Los productos proteicos de girasol obtenidos en planta piloto presentaron
buena capacidad para formar espumas a distintos pHs y fuerzas inicas. Las mayores
diferencias se encontraron en la estabilidad de estos sistemas. Los concentrados
proteicos formaron espumas ms estables en medio cido, mientras que a pH neutro
son ms estables las obtenidas con los aislados proteicos.
d.- Empleando los aislados proteicos de girasol producidos en planta piloto fue
posible obtener geles autosoportables por induccin trmica, con distintas
caractersticas y propiedades. La presencia de compuestos fenlicos afect el aspecto
visual de los geles obtenidos y disminuy su dureza. Resultara importante la
realizacin de estudios ms detallados sobre las propiedades gelificantes de estos
productos proteicos de girasol.
e.- Todos los productos proteicos de girasol presentaron buenas propiedades
antioxidantes, encontrndose una correlacin lineal directa entre sta y el contenido
121
Captulo III
de compuestos fenlicos solubles. La capacidad antioxidante de los concentrados fue

mayor que la de los respectivos aislados proteicos. Con estos resultados surge la
necesidad de realizar estudios ms exhaustivos sobre esta propiedad, dado que ampla
el potencial campo de aplicacin de estos productos proteicos.
122
Captulo IV: Pelculas flexibles, biodegradables y/o

comestibles obtenidas a partir de aislados
Captulo IV
Captulo IV: PELCULAS FLEXIBLES, BIODEGRADABLES Y COMESTIBLES OBTENIDAS A

PARTIR DE AISLADOS PROTEICOS DE GIRASOL
IV.1.- Introduccin
Durante los ltimos aos ha crecido el inters por el uso de polmeros biodegradables
para el desarrollo de nuevos materiales como posible solucin a los problemas de
contaminacin ambiental y manejo de residuos slidos causados por la acumulacin
de envases sintticos no degradables, as como tambin al futuro incierto del
suministro de petrleo (Petersen y col., 1999; Arvanitoyannis, 1999; Heller y col.,
2003). El uso de biopolmeros derivados de la agricultura se presenta como una
alternativa interesante a los polmeros sintticos, especialmente para aquellas
aplicaciones de vida corta y/o cuando la degradacin rpida se presenta como una
ventaja, por ejemplo packaging de alimentos y plsticos para la agricultura (Cuq y col.,
1998). Estos polmeros naturales adems de ser recursos renovables y estar
ampliamente
biodegradables
disponibles,
(por
resultan
ejemplo
cido
econmicos
polilctico,
frente
otros
polmeros
polihidroxialcanoatos,
etc.),
especialmente si provienen de residuos o subproductos industriales (Cruz-Romero y

col., 2008).
Numerosas agro-protenas como las de gluten de trigo (Gontard y col., 1994; Mangata
y col., 2000; Irissin-Mangata y col., 2001; Olabarrieta y col., 2006), zenas de maz
(Gennadios y col., 1990; Lai y col., 1997), de soja (Brandengurg y col., 1993; Rhim y col.,
2003; Kim y col., 2003; Ou y col., 2005; Mauri y col., 2006; Denavi y col., 2009), de
amaranto (Tapia-Blcido y col., 2007), de arroz (Gnanasambandam y col., 1997;
Adebiyi y col., 2008), de algodn (Marquie y col., 1995), de sorgo (Emmambux y col.,
2004) y de girasol (Ayhllon-Meixueiro y col., 2000; Orliac y col., 2003; Roulliy y col.,
2006) han sido estudiadas por su capacidad de formar pelculas comestibles y/o
biodegradables (Gennadios, 2002).
En la actualidad, las pelculas formuladas a partir de protenas pueden formarse por
dos procesos tecnolgicos: uno hmedo basado en la dispersin o solubilizacin de
123
Captulo IV
las protenas (casting), y otro seco basado en las propiedades termoplsticas de

estas macromolculas a bajas concentraciones de agua (Cuq y col., 1997). Si bien en los
ltimos aos ha crecido el inters en la obtencin de estos materiales con tcnicas de
procesamiento de polmeros: moldeo por compresin, inyeccin y extrusin (Cuq y
col., 1997; Micard y col., 2001; Foulk y col., 2001; Zhang y col., 2001; Orliac y col., 2002;
Orliac y col., 2003; Rouilly y col., 2006; Hernndez-Izquierdo y col., 2008), la obtencin
de los mismos por el proceso hmedo sigue siendo extensamente estudiada, ya que
existen antecedentes de escalado de este tipo de procesos (spread coating) y
tambin es la forma en que generalmente se obtienen los recubrimientos.
Comparadas con las pelculas sintticas (polietileno de baja -LDPE- y de alta densidad HDPE-, por ejemplo), las pelculas proteicas suelen presentar excelentes propiedades
de barrera al oxgeno, a los lpidos y a los aromas; propiedades mecnicas moderadas,
pero comnmente muestran alta permeabilidad al vapor de agua, debido al carcter
hidroflico de estas macromolculas (Gennadios y col., 1994; Krochta 1997; Cuq y col.,
1998). Estas propiedades estn determinadas por la microestructura de las pelculas, la
que a su vez depende significativamente de la estructura inicial de las protenas y del
mtodo de preparacin (Denavi y col., 2008). La estructura tridimensional de las
protenas y las variaciones en la formulacin y en las condiciones de obtencin de las
pelculas condicionarn fundamentalmente la habilidad de las protenas para
interactuar entre s y con los otros componentes de la formulacin, determinando as
el nmero y tipo de interacciones que estabilizan la matriz polimrica, entre ellas:
enlaces
disulfuro,
puentes
de
hidrgeno,
interacciones
hidrofbicas
y/o
electrostticas. Las interacciones protena-protena involucradas en la formacin de la

pelcula determinarn el grado de entrecruzamiento y el carcter hidroflicohidrofbico de la matriz, y se correlacionarn con las propiedades fisicoqumicas,
mecnicas y de barrera de las pelculas resultantes (Mauri y col., 2006 y 2008).
Con el fin de mejorar las propiedades mecnicas y barrera de estos materiales y as
poder extender su uso, numerosos estudios se ocuparon de la modificacin de las
formulaciones iniciales por tratamientos fsicos, qumicos y enzimticos (Ghorpade y
col., 1995; Rangavajhyala y col., 1997; Stuchell y col., 1994; Krochta, 1997; Rhim y col.,
2000; Mauri y col., 2006 y 2008), de la formacin de materiales a partir de mezclas de
124
Captulo IV
protenas con otros polmeros (Shih, 1994; Rhim y col., 1999; Cao y col., 2007; Su y col.,
2007), del agregado de lpidos a la formulacin (Gontard y col., 1995; Weller y col.,
1998; Debeaufort y col., 2000) y del refuerzo de las matrices proteicas con fibras (Beg y
col., 2005, Liu y col., 2004 y 2005) y con nanocargas (Dufresne y col., 1997; Eichhorn y
col., 2001; Noishiki y col., 2002; Angles y col., 2000 y 2001). Los beneficios de estas
pelculas adems podran incrementarse an ms si se utilizan como vehculos de
distintos tipos de aditivos, tales como antioxidantes, agentes microbianos, vitaminas,
flavors y colorantes (Len y col., 2006; Flores y col., 2006; Han y col., 2007; GmezEstaca y col., 2008).
Particularmente, las protenas de girasol han demostrado poseer propiedades
adecuadas para su utilizacin en la obtencin de pelculas por casting (AyhllonMeixueiro y col., 2000) y por termoprensado (Orliac y col., 2003). En estos estudios
slo se evaluaron algunas de las propiedades de los materiales resultantes, sin
considerar relaciones entre stas y las caractersticas estructurales de estas protenas.
Como se mostr en los captulos anteriores, las protenas de girasol poseen
compuestos fenlicos asociados, los cuales presentaron elevada capacidad
antioxidante. Por lo tanto las pelculas formadas a partir de los aislados proteicos de
girasol en estudio podran presentar como ventaja estar activas naturalmente.
En este contexto, se plantearon como objetivos para este captulo:
-
Evaluar si los fenoles presentes en los productos proteicos de girasol convierten

a las pelculas proteicas obtenidas en activas, y analizar como su presencia
afecta la funcionalidad de estos materiales.
Optimizar las propiedades mecnicas y de barrera de las pelculas proteicas

desarrolladas mediante variaciones simples en la formulacin inicial.
125
Captulo IV
IV.2.- Materiales y Mtodos
IV.2.1.- Materiales
Se estudi la formacin de pelculas biodegradables y/o comestibles a partir de los
concentrados y aislados proteicos de girasol obtenidos en planta piloto: Co-P, CoExA-P,
CoExS-P, Ai-P, AiEXA-P, AiExS-P y un aislado proteico de soja comercial (ASoja, Supro
500E, The Solae Company, Brasil), que se us como patrn. Como plastificantes se
emplearon: glicerol (G, Anedra, Argentina), sorbitol (S, Anedra, Argentina),
polietilenglicol 400 (PEG, Anedra, Argentina). Se formaron pelculas bicapa agregando
una capa de cera de abejas (Bicapa, Sigma-Aldrich, Alemania), y pelculas compuestas a
las que se les agreg celulosa microcristalina (CM; Avicel PH-101, Fluka, SigmaAldrich, Alemania).
IV.2.2.- Formacin de las pelculas

Las pelculas proteicas se obtuvieron por casting a partir de dispersiones acuosas de
los productos proteicos (5% p/p) y el plastificante. Las dispersiones se formaron
agitando magnticamente los componentes durante 30 minutos a temperatura
ambiente, ajustando el pH al valor deseado (2,5, 7 u 11) y volviendo a agitar por otros
30 minutos. Posteriormente, 10 ml de las dispersiones formadoras de pelculas fueron
colocados en placas de Petri de poliestireno (64 cm2) y secadas en una estufa con
conveccin forzada (Yamato, DKN600, Estados Unidos) a 60C durante 5 horas. Las
pelculas as formadas se acondicionaron a 20C y 58% HR (solucin saturada de NaBr)
durante 48 horas previo a su caracterizacin.
Las variables que se estudiaron fueron: tipo de producto proteico -Co-P, CoExA-P,
CoExS-P, Ai-P, AiExA-P, AiExS-P y ASoja-, tipo de plastificante -G, S, PEG-, cantidad de
plastificante -10%, 20%, 30%, 40% p/p respecto de la masa de aislado- y pH de la
dispersin inicial -2,5, 7, 11-. Adems se estudi el agregado de celulosa microcristalina
en polvo en la dispersin inicial (5% y 10% p/p respecto de la masa de aislado, CM-5 y
CM-10 respectivamente). Tambin, se adicion una capa de cera de abejas fundida
sobre la pelcula proteica previamente formada, se esparci de manera homognea y
se enfri permitiendo la formacin de una pelcula bicapa (Bicapa) (Denavi, 2009).
126
Captulo IV
IV.2.3.- Caracterizacin de las pelculas proteicas

Contenido de humedad: Se determin luego de secar la pelcula en una estufa a 105C
durante 24 horas. Las pelculas fueron cortadas en pequeos especmenes y se
colocaron en placas de Petri, se pesaron antes y despus del secado en la estufa. El
contenido de humedad se calcul como el porcentaje de prdida de peso, respecto del
peso original (ASTM D644-94; 1994). Las determinaciones se realizaron por triplicado.
Espesor: Se utiliz un medidor de espesor digital (Check Line DCN-900, Estados Unidos)
para materiales no conductores ni ferrosos. Sobre cada uno de los especmenes que se
emplearon para determinar propiedades mecnicas y de barrera, se realizaron 9
determinaciones, una en el centro y ocho sobre el permetro; informando el valor
promedio.
Opacidad: Se analiz el espectro de absorbancia de las pelculas en funcin de la

longitud de onda, entre 400 y 800 nm. Para ello se cortaron porciones de pelculas con
las dimensiones internas de la cubeta y se colocaron cuidadosamente dentro de la
misma. La lectura de absorbancia se efectu en un espectrofotmetro Beckman
DU650 (Beckman, Alemania) utilizando una cubeta vaca como referencia. La opacidad
de las pelculas (UA mm-1) se determin dividiendo el valor de absorbancia a 500 nm
por el espesor de la muestra (expresado en mm) (Cao y col., 2007). Todas las
determinaciones se realizaron por cuadruplicado.
Color: para su determinacin se emple un colormetro (CR 300, Minolta Chroma Co.,
Osaka, Japn), procediendo como se detall en el Captulo I, seccin I.2.9. Los valores
informados son la media de nueve determinaciones sobre cada una de las muestras.
Determinacin de temperatura de transicin vtrea (Tg): Las Tg se determinaron por

calorimetra diferencial de barrido (DSC), empleando un calormetro Q100 V9.8 Build
296 (TA Instrument, New Castle, Del., Estados Unidos). El equipo fue calibrado usando
indio, cido lurico y cido esterico como patrones de calor y temperatura. Se
127
Captulo IV
colocaron pequeos trozos de las pelculas proteicas ( 10 mg) en cpsulas de aluminio

que se sellaron hermticamente. Las muestras fueron sometidas al siguiente
tratamiento trmico: 1 minuto a 20C (para equilibrar las muestras), enfriamiento
hasta -100C a 10C/min, isoterma durante un minuto y por ltimo calentamiento
entre -100 y 220C a 10C/min. La temperatura de transicin vtrea (Tg, en C) fue
definida como el punto de inflexin en la lnea de base causado por la discontinuidad
en el calor especfico de la muestra (Gontard y col., 1996). Para su determinacin se
emple el software Universal Analysis V4.2E (TA Instruments, New Castle, Del., Estados
Unidos). Los ensayos se realizaron como mnimo por duplicado.
Capacidad antioxidante: La capacidad antioxidante de las pelculas proteicas se

determin mediante el ensayo con el radical ABTS+ (cido 2,2-azino-bis(3etilbenzentiazolino-6-sulfnico)), que fue producido segn se describi en el Captulo
III, seccin III.2.5. Para realizar el ensayo, se colocaron 5 mg de la pelcula proteica, se
le agregaron 50 l de buffer fosfato de sodio (0,01M y pH 7,4) y 950 l de la solucin
conteniendo el radical ABTS+ (con absorbancia de 0,7). Se agit durante 2 minutos en
vortex y posteriormente se centrifug a 9000xg durante 3 minutos a temperatura
ambiente (A15, B. Braun Biotech Intenational, Estados Unidos). El sobrenadante fue
separado y, a los 6 minutos de haber agregado el radical ABTS+, se midi su
absorbancia a 734 nm. Como blanco de reactivo se realiz el mismo procedimiento,
colocando 25 l adicionales del buffer fosfato de sodio en lugar de la pelcula proteica.
La capacidad antioxidante, de capturar el radical ABTS+, se calcul segn la Ecuacin
IV.1.
CAO
Absbr Abs m
100
Absbr
Ecuacin IV.1.
Donde: CAO: Capacidad antioxidante, de capturar el radical ABTS+(%); Absbr:

Absorbancia a 734 nm del blanco de reactivos; Absm: Absorbancia a 734 nm de la
muestra.
Las determinaciones se realizaron por duplicado.
128
Captulo IV
Isotermas de sorcin: Se determinaron las isotermas de sorcin de las pelculas

proteicas por el mtodo esttico. Las pelculas fueron almacenadas a 20C en
atmsferas con diferentes humedades relativas (aw: 0,07, 0,249, 0,337, 0,431, 0,580,
0,655, 0,754, 0,853, 0,907) obtenidas utilizando distintas soluciones salinas saturadas
(NaOH, KC2H3O2, MgCl2, K2CO3, NaBr, NaNO2, NaCl, KCl, y BaCl2 respectivamente)
(Labuza y col., 2000). Se colocaron pequeas porciones de las pelculas previamente
deshidratadas en recipientes cerrados a humedades relativas constantes a 20C y sin
circulacin de aire, hasta asegurarse alcanzar el equilibrio (21 das). Se determin la
cantidad de agua absorbida por gramo de pelcula seca (Xeq) por diferencia entre el
peso inicial y el peso final. Para cada formulacin se realizaron triplicados.
Los valores experimentales (Xeq) se ajustaron con el modelo de GuggenheimAnderson-de Boer (GAB), segn la Ecuacin IV.2.
X eq
X o K C aw
(1 K aw ) (1 K aw C K aw )
Ecuacin IV.2.
Donde: Xeq: contenido de humedad de las muestras (en base seca) en el equilibrio
(gH2O/g pelcula seca) a determinada actividad acuosa (aw), Xo: contenido de humedad
(en base seca) de la monocapa (gH2O/g pelcula seca), C: constante de Guggenheim
asociada al calor de sorcin en la monocapa, y K: Constante asociada al calor de
sorcin de multicapas.
Los parmetros del modelo (Xo, K y C) se determinaron por regresin cuadrtica de
aw/Xeq versus aw, empleando el programa Statgraphics plus, versin 5.1 (Statgraphics,
Estados Unidos).
Permeabilidad al vapor de agua (WVP): Las determinaciones se realizaron siguiendo el

mtodo ASTM E96-80 (1989) con las modificaciones propuestas por Gennadios y col.
(1994). Las pelculas se colocaron en una celda de permeacin con una abertura
circular de 0,00185 m2. La determinacin se efectu a 20C, colocando las celdas en un
desecador (Figura IV.1.a.). La fuerza impulsora a travs de la pelcula, expresada como
el gradiente de presin parcial de vapor, fue de 1753,35 Pa. Para mantener dicha
fuerza impulsora se utiliz slica anhidra (HRc=0) en la celda de permeacin, y solucin
saturada de NaCl (HRd=0,75) en el desecador. La humedad relativa dentro de la celda
129
Captulo IV
fue siempre menor que la del desecador, por lo que la permeacin de vapor de agua a
travs de la pelcula fue determinada por la ganancia de peso en la celda de
permeacin. Luego de alcanzar el estado estacionario (aproximadamente 1 hora), se
realizaron 8 determinaciones de peso de la celda de permeacin, durante 5 horas. Los
cambios en el peso de la celda fueron registrados y graficados en funcin del tiempo.
Se determin la pendiente del grfico obtenido por medio de regresin lineal
(Microsoft Office Excel 2007), siendo sta la velocidad de permeacin del vapor de
agua (Figura IV.1.B.). La permeabilidad al vapor de agua se calcul segn la Ecuacin
IV.3.
WVP
Pv
H 2O
(m / t )
.e
.( HRd HRc ). A
Ecuacin IV.3.
Donde: WVP: Permeabilidad al vapor de agua (g H2O Pa-1 s-1 m-1); m/t: velocidad de
permeacin del vapor de agua (g H2O s-1); e: espesor de la pelcula; PvH2O: presin de
vapor de agua (Pa); HRc: Humedad relativa en la celda de permeacin; HRd: Humedad
relativa en el desecador; A: rea de permeacin (m2).
Las determinaciones se realizaron por triplicado.
0,18
0,16
Celda de
permeacin
con pelcula
proteica y
slica
Cmara
con HR
controlada
m (g H2 O)
0,14
0,12
0,10
0,08
m/t
0,06
0,04
0,02
0,00
0
3600
7200
10800
14400
18000
21600
25200
tiempo (s)
Figura IV.1. Medida de la permeabilidad al vapor de agua. A) Dispositivo de medida, en

donde se puede observar la pelcula proteica colocada en la celda de permeacin (con
slica en su interior, HRc=0) dentro de una cmara con humedad relativa controlada
(con solucin saturada de NaCl, HRd=0,75). B) Determinacin de la velocidad de
permeacin del vapor de agua a travs de la pelcula proteica (m/t).
130
Captulo IV
Coeficientes de solubilidad y difusividad efectiva del agua en la pelcula: Se

determinaron empleando la metodologa descripta por Larotonda y col. (2005). El
coeficiente de solubilidad del agua en la pelcula proteica (), se calcul por medio de
la Ecuacin IV.4., que se obtiene de diferenciar el modelo de GAB (Ecuacin IV.2.)
respecto de aw y dividir el resultado por la presin de vapor de agua (P vH2O) a la
temperatura de trabajo (20C).
1
1 K a 1 K a C K a
w
w
w
aw
C K Xo
Ecuacin IV.4.
2
a
PvH 2O
w
w
w
K 1 K aw C K aw 1 K aw K C K
Donde: : coeficiente de solubilidad del agua en la pelcula proteica (g H2O/Pa g

pelcula seca); s: densidad de la pelcula seca (g pelcula seca/m3); Xo, C y K los
parmetros del modelo de GAB (a 20C), Xo: contenido de humedad (en base seca) de
la monocapa (g H2O/g pelcula seca), C: constante de Guggenheim asociada al calor de
sorcin en la monocapa y K: constante asociada al calor de sorcin de multica; PvH2O:
presin de vapor de agua (Pa) y aw: actividad acuosa.
El coeficiente de difusin efectivo del agua en la pelcula proteica (Def) se determin

mediante la Ecuacin IV.5.
Def
WVP
s
Ecuacin IV.5.
Donde: Def: coeficiente de difusin efectivo del agua en la pelcula proteica (m2 s);
WVP: permeabilidad al vapor de agua determinada a 75% HR y 20C (g H2O Pa-1 s-1 m1
); : coeficiente de solubilidad del agua en la pelcula proteica a aw=0,75; 20C (g
H2O/Pa g pelcula seca); s: densidad de la pelcula seca (g pelcula seca/m3).
Propiedades mecnicas: se determinaron las propiedades mecnicas en ensayos de

traccin, de acuerdo al mtodo ASTM D882-91 (1991), empleando un texturmetro
(TA.XT2i, Stable Micro Systems, Inglaterra), equipado con un sistema de mordazas para
131
Captulo IV
tensin A/TG (Figura IV.2.A.). Se ensayaron probetas rectangulares de 80 mm de largo

por 6 mm de ancho, utilizando una separacin inicial de mordazas de 50 mm y una
velocidad de separacin de las mismas de 0,5 mm/s. Se registr la curva fuerza vs.
distancia, que se transform en tensin (=fuerza/rea transversal de la pelcula) vs.
deformacin (=porcentaje de elongacin respecto de la separacin de mordazas
inicial). En la Figura IV.2.B. se muestra una de estas curvas a modo de ejemplo. De las
mismas se obtuvieron la resistencia mxima a la traccin al momento de ruptura
(max), el porcentaje mximo de elongacin (max) y el mdulo elstico (E) como la
pendiente de la recta tangente a la curva tensin-deformacin, en su seccin lineal
inicial (a bajas deformaciones). Se realizaron seis determinaciones por cada pelcula
evaluada, empleando al menos dos pelculas por formulacin.
max
Tensin (MPa)
3
2
1
max
0
-1
10
15
20
25
30
35
Deformacin (%)
Figura IV.2. Evaluacin de las propiedades mecnicas. A) Dispisitivo empleado en el

ensayo de traccin. B) Curva tensin vs. deformacin para una pelcula proteica de
girasol, en donde se pueden observar los parmetros evaluados: mdulo elstico (E),
resistencia mxima a la traccin al momento de ruptura (max), y el porcentaje mximo
de elongacin (max).
Solubilidad diferencial de protenas: Se determin la solubilidad diferencial de las

protenas presentes en las pelculas segn el mtodo descripto por Mauri y col. (2006),
con algunas modificaciones menores. Pequeas porciones de las pelculas ( 100 mg)
fueron pesadas y colocadas en tubos conteniendo 1 ml de solvente. Se estudi la
solubilidad en agua (A) y cinco sistemas buffer diferentes: i) BF: buffer fosfato pH 7,5
132
Captulo IV
0,1M, ii) BFD: BF con dodecil sulfato de sodio 0,1% p/v (SDS, Anedra, Argentina), iii)
BFU: BF con urea 6M (Riedel-deHan, Alemania), iv) BFDU: BF con dodecil sulfato de
sodio 0,1% p/v y urea 6M, v) BFDUM: BFSU con mercaptoetanol 2,5% v/v (SigmaAldrich, Alemania), todos a pH 7,5. Los tubos fueron agitados a temperatura ambiente
durante 24 horas y posteriormente las suspensiones fueron centrifugadas a 9000 xg
durante 20 minutos a temperatura ambiente. La concentracin de protenas en los
sobrenadantes fue determinada utilizando el mtodo de Bradford (Bradford, 1976),
realizando curvas de calibracin con seroalbmina bovina (BSA, Sigma-Aldrich
Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) en agua y en cada uno de los sistemas buffer, y
expresada como porcentaje (%p/p) respecto a la cantidad total de protena presente
en cada pelcula. Las determinaciones se realizaron por triplicado. Alcuotas de los
sobrenadantes se corrieron en geles de electroforesis SDS-PAGE, siguiendo la
metodologa descripta en el Captulo I (seccin I.2.8.) con el fin de observar la
composicin polipeptdica disuelta.
IV.2.4.- Anlisis estadstico

133
Captulo IV
IV.3.- Resultados y Discusin

Se formaron pelculas biodegradables por casting a partir de dispersiones proteicas de
los productos proteicos de girasol con distinto contenido de fenoles, obtenidos en
planta piloto: Co-P, CoExA-P, CoExS-P, Ai-P, AiExA-P y AiExS-P (5% p/p), usando
glicerol (G; 1,5% p/p) como plastificante. Dada la gran cantidad de materia prima
requerida para estos estudios, los productos proteicos obtenidos en laboratorio no
fueron includos. Tambin se emple un aislado proteico de soja comercial (ASoja)
como patrn de comparacin, debido al conocimiento previo de sus propiedades. Si
bien todas las muestras derivadas del pellet de girasol fueron capaces de formar
pelculas homogneas, las producidas a partir de los concentrados proteicos de girasol
(Co-P, CoExA-P y CoExS-P) no pudieron ser desmoldadas. Esto podra deberse a que,
bajo las condiciones de procesamiento utilizadas (concentraciones de protena y
plastificante, y condiciones de secado), estas pelculas sufren un proceso de
deshidratacin incompleta, que podra atribuirse a sus mayores contenidos de hidratos
de carbono y/o sales, que retendran mayor contenido de agua. Los porcentajes de
humedad de estas pelculas fueron elevados, prximos a 35-37%.
IV.3.1.- Caracterizacin de pelculas biodegradables formadas a partir de aislados

En la Tabla IV.1. se presentan los espesores y los porcentajes de humedad de las
pelculas obtenidas por casting a partir de Ai-P, AiExA-P, AiExS-P y ASoja. Todas las
pelculas presentaron espesores entre 71 y 80 m y contenidos de humedad cercanos
al 25%, no observndose diferencias significativas en estos valores al variar el aislado
proteico utilizado.
Los termogramas obtenidos por DSC de todas las pelculas proteicas estudiadas
presentaron dos temperaturas de transicin vtrea, una a temperaturas cercanas a 69C y otra a -28C (Tabla IV.1.), no observndose diferencias significativas en sus
valores al variar el aislado, ni siquiera al comparar las pelculas de girasol con las de
soja. Dado que todas las pelculas presentaban el mismo contenido de plastificantes
134
Captulo IV
(glicerol y agua), si se hubiesen encontrado diferencias estas se hubiesen atribuido a

distintos grados de entrecruzamiento. La presencia de dos temperaturas de transicin
vtrea, segn Sobral y col. (2001), es tpica de sistemas que presentan separaciones de
fases. Las mismas podran atribuirse a la existencia de zonas enriquecidas en los
distintos componentes, siendo Tg1 (-69C) correspondiente a una fase rica en glicerol,
mientras que Tg2 (-28C) se debera a una fase rica en protenas. Cherian y col. (1995)
tambin informaron dos valores de Tg en pelculas de protenas de gluten de trigo
plastificadas con sacarosa y, por su parte, Sobral y col. (2001) observaron el mismo
comportamiento en pelculas de protenas sarcoplasmticas y miofibrilares de peces
plastificadas con glicerol. Mientras que, otros autores slo informaron una Tg en
pelculas de protenas de suero de leche (Anker y col., 1991), de gluten de trigo
(Gontard y col., 1996) y de soja (Shaw y col., 2002; Denavi y col., 2009), todas
plastificadas con glicerol.
Tabla IV.1.: Espesor, contenido de humedad y temperaturas de transicin vtrea (Tg1,

Tg2) de las pelculas obtenidas a partir de aislados proteicos de girasol
Aislados
Espesor
Humedad
Transicin Vtrea
Proteicos
(m)
(%)
Ai-P
71 11a
25,88 2,38a
-69,94 0,01a
-29,12 0,18a
AiExA-P
74 13a
26,34 1,13a
-69,93 0,01a
-28,74 0,11a
AiExS-P
80 10a
24,93 1,35a
-69,94 0,01a
-28,93 0,52a
ASoja
75 17a
23,97 1,45a
-69,92 0,02a
-28,71 0,21a
Tg1 (C)
Tg2 (C)
Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, los valores con distintos superndices
Para conocer las potenciales aplicaciones de estos materiales proteicos, es necesario

evaluar sus propiedades de barrera y mecnicas. Se determinaron entonces las
permeabilidades al vapor de agua (WVP) de las pelculas obtenidas, los resultados se
muestran en la Tabla IV.2. En ella es posible apreciar que no se encontraron
diferencias estadsticamente significativas en los valores de WVP, a pesar que los
135
Captulo IV
aislados con menor contenido de fenoles (AiExA-P o AiExS-P) haban mostrado tener
protenas con mayor hidrofobicidad superficial (Captulo II, seccin II.3.3.). La WVP
depende, tanto de la solubilidad como de la difusividad efectiva del agua en la pelcula
proteica, por lo tanto se determinaron dichos parmetros ( y Def respectivamente) y
los resultados se muestran en la Tabla IV.2. All se observa que las distintas muestras
no presentaron diferencias en estos parmetros, explicando de este modo los
resultados de WVP. Tampoco se observaron diferencias entre la WVP de las pelculas
proteicas de girasol y de soja, a pesar de la diferencia en la composicin en residuos de
aminocidos entre estas protenas (Molina y col., 2004). Los valores de WVP
encontrados en este estudio son caractersticos de pelculas proteicas (Gennadios y
col., 1993; Rhim y col., 2000; Mauri y col., 2006; Martelli y col., 2006; Denavi y col.,
2009), pero mayores que las WVP de los polmeros sintticos (polipropileno: 6,5*10-13,
cloruro de polivinilo: 0,7-2,4*10-13, polietileno de baja densidad: 7,3-9,7*10-13 y
polietileno de alta densidad: 2,4*10-13 g H2O Pa-1 s-1 m-1 ) (Gennadios y col., 1993; Cuq y
col., 1998; Lin y col., 2007).
Tabla IV.2.: Permeabilidad al vapor de agua (WVP), parmetros del modelo de GAB
para las isotermas de sorcin de las pelculas proteicas en estudio, coeficiente de
solubilidad del agua en la pelcula () y difusividad efectiva (Def).
Aislados
WVP*
Isotermas de Sorcin - Modelo GAB*
Proteicos
(*10-10)
Xo
Ai-P
1,45 0,01a
0,2416
50,40
AiExA-P
1,49 0,07a
0,1756
AiExS-P
1,46 0,01a
ASoja
1,49 0,07a
-1 -1
Def*
r2
(*10-4)
(*10-7)
0,8724
0,9840
7,7
1,28
86,15
0,9459
0,9761
8,5
1,17
0,1793
41,52
0,9265
0,9761
7,9
1,23
0,1647
9,98
0,9508
0,9879
8,5
1,21
-1
*Unidades de WVP: gH2O Pa s m ; Xo: g H2O/g pelcula seca; de : g H2O/Pa g pelcula seca; de Def: m
-1
s . Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, los valores con distintos
En la Figura IV.3. se muestran las isotermas de sorcin de las pelculas proteicas en

estudio. All se observa que las isotermas presentaron una forma sigmoidea (con C >2),
136
Captulo IV
volvindose asinttica cuando la aw tiende a 1, siendo esta forma caracterstica de

productos ricos en protenas o almidn. Adems es posible apreciar que las pelculas
de Ai-P fueron las que adsorbieron mayor cantidad de agua en el rango de 0,0700,853, mientras que a mayores valores de aw todas las pelculas presentaron el mismo
comportamiento. El modelo de GAB fue adecuado para describir matemticamente las
isotermas de sorcin (r2 0,97). Sin embargo a altas humedades relativas (aw 0,9) el
modelo se separa de los datos experimentales, debido a que asume adsorcin fsica en
multicapas, y en esta zona el sorbato presenta propiedades de agua pura.
Xeq (g H2 O/g pelcula seca)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Actividad acuosa
0,7
0,8
0,9
1,0
Figura IV.3.: Isotermas de sorcin de las pelculas proteicas de girasol: Ai-P ( ), AiExAP ( ) y AiExS-P ( ) y de soja: ASoja ( ). Los smbolos llenos corresponden a los puntos
experimentales y las curvas punteadas a su ajuste empleando el modelo de GAB.
En la Tabla IV.2. se presentan los parmetros que se obtuvieron al ajustar los datos
experimentales con el modelo de GAB. En ella es posible observar que el valor de
humedad en monocapa (Xo) fue mayor en las pelculas de Ai-P, siendo este aislado el
que present la mayor cantidad de hidratos de carbono y adems, sus protenas
fueron las que posean la menor hidrofobicidad superficial. Cabe sealar que los
niveles de adsorcin de agua encontrados en este estudio fueron similares a los
informados por otros autores para distintas pelculas proteicas (Gennadios y col., 1994;
Cuq y col., 1997; Velsquez y col., 2001).
137
Captulo IV
Los resultados obtenidos en la evaluacin de las propiedades mecnicas de las

pelculas proteicas en traccin se presentan en la Tabla IV.3. No se encontraron
diferencias estadsticamente significativas en los valores de tensin ( 4 MPa) y de
elongacin a lo rotura ( 24%), ni en el mdulo elstico ( 0,58 %/MPa) de las pelculas
obtenidas con los distintos aislados proteicos de girasol. Estas propiedades mecnicas
son moderadas y se encuentran en el rango de las reportadas en bibliografa para otras
pelculas proteicas (Aydt y col., 1991; Gennadios y col., 1993; Rhim y col, 2000; Sobral y
col., 2001; Ou y col., 2005; Moore y col., 2006; Tapia-Blcido y col., 2007; Denavi y col.,
2009). Cabe destacar que Ayhllon-Meixueiro y col. (2000) obtuvieron pelculas de
protenas de girasol por casting con similares valores de tensin (3,9 MPa) pero con
mayores valores de deformacin a la rotura (250%), a partir de dispersiones proteicas
ms concentradas (10% p/p) y mayor proporcin de glicerol (50% p/p respecto de la
masa de aislado). El mayor espesor de esas pelculas (170-200 m), as como el mayor
contenido de plastificante seguramente hayan influido negativamente en el
comportamiento barrera al vapor de agua de esas pelculas, valor que no fue
informado (McHugh y col., 1993; Ghorpade y col., 1995; Gennadios y col., 1996).
Tabla IV.3.: Propiedades mecnicas en traccin. Tensin a la ruptura (max),

deformacin (max) y mdulo elstico (E) de las pelculas proteicas en estudio.
Aislados
Propiedades mecnicas
Proteicos
max (MPa)
max (%)
E (MPa/%)
Ai-P
4,21 1,12a,b
25,96 3,06b
0,60 0,17a
AiExA-P
3,62 0,59a
25,86 5,27a,b
0,53 0,11a
AiExS-P
4,07 0,50a,b
19,98 7,08a
0,60 0,10a
ASoja
4,55 0,70b
102,18 10,94c
0,89 0,18b
Por otra parte, las pelculas de ASoja evaluadas en este trabajo, presentaron similar
resistencia pero mayores deformaciones a la rotura (aproximadamente 4 veces) y
138
Captulo IV
mdulo elstico (aproximadamente 1,5 veces) que las formadas con aislados proteicos
de girasol. Estos resultados sugieren que hay caractersticas diferenciales entre las
matrices proteicas de girasol y de soja que afectan las propiedades de las pelculas,
especialmente la capacidad de deformarse antes de alcanzar la ruptura (max) y el
mdulo elstico (E). Dado que todas las pelculas estaban constituidas por la misma
concentracin de protenas y plastificante (agua y glicerol), las diferencias encontradas
tendran que estar asociadas a la forma en que las protenas se encuentran
interactuando en la matriz que forma la pelcula. Para avanzar en este sentido se
estudi la solubilidad diferencial de las protenas de las pelculas en sistemas buffers
que tienen la capacidad de romper distintos tipos de interacciones, con el fin de
conocer el tipo y la proporcin de interacciones involucradas en la estabilizacin de la
red proteica. En la Figura IV.4.A. se muestran los resultados obtenidos. Se observ que
las pelculas obtenidas a partir de Ai-P presentaron valores moderados de solubilidad
en agua ( 40%). En este sistema estamos cuantificando los polipptidos libres que no
estn fuertemente ligados a la red proteica. Como era de esperar, estos valores fueron
menores que la solubilidad proteica en agua del aislado Ai-P ( 90%). Al emplear buffer
fosfato de sodio 0,1M a pH 7,5 (BF), la solubilidad proteica de la pelcula disminuy,
posiblemente porque este medio estara favoreciendo las interacciones inicas entre
las cadenas polipeptdicas produciendo un efecto de salting out. El detergente SDS
(BFD) tiene la capacidad de debilitar interacciones hidrofbicas, mientras que la urea
(BFU) modifica la capacidad de formar puentes de hidrgeno. El incremento de la
solubilidad observado al tratar las pelculas con estos buffers indicara que tanto las
interacciones hidrofbicas como puentes de hidrgeno estabilizaran la estructura de
la pelcula. Finalmente, la adicin de -mercaptoetanol (BFDUM) pone en evidencia la
presencia de enlaces por puentes disulfuro. Se puede ver que este tipo de interaccin
tambin cumple un importante papel en la formacin de la red proteica, ya que al
romper este tipo de enlace, es posible alcanzar valores de solubilidad muy altos (8090%). En la Figura IV.4.A. tambin es posible observar que las pelculas proteicas de
girasol obtenidas a partir de AiExA-P y AiExS-P, presentaron mayores solubilidades en
agua pero comportamientos similares en el resto de los buffers respecto de los
descripto para las pelculas de Ai-P.
139
Captulo IV
A100
90
Protena soluble (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
A
BF
BFD
BFU
BFDU
BFDUM
kDa
94
67
43
30
20,1
14,4
Figura IV.4.: Solubilidad diferencial de las pelculas proteicas: Ai-P ( ), AiExA-P ( ),

AiExS-P ( ) y ASoja ( ). A) Porcentajes de protena soluble en medios con distinta
actividad qumica: Agua (A), Buffer fosfato de sodio 0,1M (BF), BF con SDS 0,1% p/v
(BFD), BF con urea 6M (BFU), BF con SDS 0,1% p/v y urea 6M (BFDU), BFDU con mercaptoetanol 2,5% v/v (BFDUM), todos a pH 7,5. B) Electroforesis SDS-PAGE. Calles:
1) solucin filmognica inicial de Ai-P, protenas solubles en 2) A, 3) BF, 4) BFD, 5) BFU,
6) BFDU, 7) BFDUM, 8) patrones de bajo peso molecular (LMW). Se informan valores
promedio desviacin estndar.
En la Figura IV.4.B. se muestran los perfiles electroforticos de las fracciones proteicas

solubles en cada sistema, de las pelculas de Ai-P, a modo de ejemplo. Se puede
observar la presencia de subunidades de la heliantinina (45-62 kDa) en la solucin
140
Captulo IV
filmognica inicial (calle 1). Estas subunidades tambin fueron extradas de la pelcula
con agua (calle 2), pero estn ausentes en las calles 3 y 4, en donde se solubilizaron
componentes de menor tamao molecular. Las subunidades tambin pudieron ser
extradas al utilizar los buffers conteniendo urea y SDS (calles 5 y 6), y cuando se
agreg un agente reductor se observ la disociacin de la misma en los polipptidos
y (calle 8). Estos resultados indican que la globulina 11S tiene un rol preponderante
en la formacin de la estructura de la pelcula. La disminucin de solubilidad de las
pelculas observada al emplear el BF, estara de acuerdo con la tendencia de esta
protena a formar agregados 15S a esta fuerza inica (Molina y col., 2004).
Las protenas presentes en las pelculas de ASoja presentaron un perfil de solubilidades
diferenciales distinto a las de girasol. En la Figura IV.4.A. se observa que las de soja
presentaron menores valores de solubilidad en agua y en buffer fosfato, hecho que
llama la atencin ya que las globulinas 7S y 11S de soja son mucho ms polares y
solubles que las de girasol. Evidentemente estas caractersticas les permiten generar
asociaciones mucho ms fuerte entre s y con otros componentes de las pelculas.
Estas interacciones fueron debilitadas al incluir SDS y urea en el buffer, alcanzndose
en este caso valores an menores pero ms cercanos a los de girasol. En presencia de
un agente reductor tambin se alcanzaron valores de solubilidad altos ( 90%).
Las altas solubilidades obtenidas tanto para las pelculas conteniendo protenas de
girasol como de soja, en un medio desnaturalizante en presencia de un agente
reductor, indicaran que las uniones disulfuro juegan un rol muy importante en la
formacin de este tipo de pelculas. Se ha mostrado en bibliografa que aquellos
materiales con mayor capacidad de unirse por este tipo de interacciones forman
matrices ms resistentes y ms elongables (Prez-Gago y col., 2001; Choi y col., 2003).
En este trabajo no se encontraron diferencias en resistencia, pero s en elongacin.
Este hecho sugiere que la cantidad de uniones disulfuros que forman la red proteica de
ASoja es tal que permite incrementar la elongacin (cuatro veces mayores que los de
girasol), sin modificar significativamente la tensin que puede soportar el material. Las
protenas de soja presentan menor contenido de cistena que las de girasol
(http://www.expasy.org; http://www.asagir.org.ar; http://www.solae.com), por lo que
se podra pensar que estas ltimas tienen mayor probabilidad para formar uniones
141
Captulo IV
disulfuro, sin embargo tambin hay que considerar que este proceso se ve facilitado
cuando las protenas se encuentran desnaturalizadas (Darby y col., 1995), como sucede
en ASoja. Cabe recordar que los aislados proteicos de girasol obtenidos en planta
piloto presentaron una alta proporcin de agregados solubles mediados por uniones
disulfuro y que sus protenas an mantenan cierto grado de conformacin nativa
(grado de desnaturalizacin del 60%) (Captulo II, Figura II.3.A.), estas razones
justifican la menor disponibilidad de estos grupos para interaccionar entre s y las
diferencias de solubilidad en BFDUM descriptas (Figura IV.4.A.).
La elasticidad asociada a la presencia de uniones disulfuro puede compararse con lo
que sucede en la formacin de la red de gluten en la masa panaria (Lindsay y col.,
1999), en este caso estas protenas poseen una estructura de tipo ordenamiento al
azar, lo que apoyara la hiptesis que una desnaturalizacin de la protena sera
importante para conferir las caractersticas a la pelcula.
Entre el 15 y 20% de las protenas presentes en las pelculas de girasol o de soja no
fueron solubilizadas en los medios extractivo utilizados. Este hecho nos estara
indicando la presencia de interacciones covalentes como las que se forman al someter
protenas a pH alcalino y altas temperaturas y/o a la reaccin entre los grupos amino
de la protena y los azcares reductores presentes en los aislados (reaccin de
Maillard).
Las interacciones que forman la red proteica afectan las propiedades de barrera de
estas
pelculas.
En
bibliografa
se
menciona
que
los
materiales
unidos
mayoritariamente por puentes de hidrgeno, como sucede en las pelculas proteicas

de girasol comparadas con las de soja, en general terminan presentando mayores WVP
(Sobral y col., 2008), sin embargo, esta relacin no se observ en este trabajo.
Las pelculas de Ai-P, el aislado con mayor contenido de fenoles, presentaron
propiedades trmicas, mecnicas y de barrera similares a las de los otros aislados
proteicos de girasol estudiados (AiExA-P y AiExS-P), sugirindonos que el contenido de
compuestos fenlicos no afecta estas propiedades. Sin embargo, el aspecto de las
pelculas fue totalmente diferente (Figura IV.5.).
142
Captulo IV
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
ASoja
Figura IV.5.: Fotografa de las pelculas obtenidas por casting a partir de aislados
proteicos de girasol de planta piloto: Ai-P, AiExA-P y AiExS-P, y de ASoja.
Las propiedades pticas (color y opacidad) de las pelculas obtenidas se muestran en la

Tabla IV.4. Se evidenci una relacin directa entre la coloracin de las pelculas y el
color de los aislados proteicos que las formaron. Las pelculas de Ai-P presentaron los
menores valores de a (siendo estos negativos), de L y b indicndonos una tonalidad
verde oscura. Mientras que al emplear los aislados proteicos de girasol con menor
contenido de fenoles (AiExA-P y AiExS-P) en la formulacin de las pelculas, se observ
un incremento en sus parmetros de cromaticidad y luminosidad, indicndonos que las
pelculas se vuelven de color marrn (a y b positivos) y ms claras (mayor L), lo que
resulta en una menor coloracin general (menor E). Las pelculas de ASoja, que a la
vista presentan una suave coloracin amarilla, mostraron los mayores valores de L,
moderados valores de a y b y el menor E. En cuanto a su opacidad (Tabla IV.4.), la
tendencia de este parmetro result similar a la descripta para el E. Las pelculas de
girasol presentaron mayor opacidad que las de ASoja, siendo las pelculas de Ai-P las
que mostraron mayor opacidad. La coloracin intensa sin duda limita algunas posibles
aplicaciones de estos materiales en packaging de alimentos. As por ejemplo, no
podran utilizarse para empacar productos que interesan visualizarse a travs del
envoltorio (por ejemplo vegetales mnimamente procesados), pues la dificultad en la
visualizacin disminuira la aceptabilidad por parte de los potenciales consumidores.
143
Captulo IV
Tabla IV.4.: Propiedades pticas de las pelculas proteicas obtenidas a partir de

aislados proteicos de girasol y de soja.
Aislados
Parmetros de Color Hunter Lab
Opacidad
E
(UA mm-1)
2,72 1,13a
67,85 0,83a
22,34 1,63c
6,59 0,10c
15,06 2,94b
61,92 1,38b
17,75 1,00b
43,10 1,52c
15,21 0,64d
24,62 2,11c
60,79 0,57b
16,81 0,47b
93,23 0,69d
-3,83 0,32a
16,91 1,53b
16,24 1,65c
1,50 0,48a
Proteicos
Ai-P
29,49 0,86a
-1,49 0,55b
AiExA-P
37,27 2,10b
AiExS-P
ASoja
Como recubrimientos solo podran proteger alimentos de coloracin similar, aunque

dado el espesor muy delgado de los recubrimientos no siempre se observan cambios
en la coloracin de los productos recubiertos. Sin embargo podran emplearse, si sus
propiedades lo admiten, para aplicaciones donde no interesa la coloracin o donde
sta termina teniendo alguna finalidad extra. Este el caso de los plsticos utilizados en
mulching -o acolchado-. Esta es una tcnica que consiste bsicamente en cubrir el
suelo con distintos materiales, evitando as que el terreno quede expuesto al contacto
con el aire. Tiene efectos sobre el suelo y el ambiente: conserva la humedad, mantiene
una buena estructura, ofrece una mejor utilizacin de los abonos, da proteccin en el
nacimiento de las plantas, reduce el nmero de frutos daados y favorece a la
eliminacin de las malas hierbas. El color y la transparencia como aditivos inteligentes
agregados a la fabricacin pueden lograr un material con un efecto trmico y herbicida
que no mancha ni quema los frutos. Actualmente, con esta finalidad se comercializan
materiales sintticos con distintas coloraciones, entre ellas mulching verde, que por
presentar la capacidad de reflejar luz fotosintticamente activa y permitir pasar el
resto del espectro logra un efecto herbicida, un mayor desarrollo radicular y la
mineralizacin de la materia orgnica (http://www.agroredes.com.ar). La aplicacin de
materiales biodegradables en agricultura intensiva, es de suma importancia debido a la
dificultad que implica la gestin de residuos plsticos en las zonas donde se encuentra
los invernaderos en nuestro pas, y la distancia que separa unos de otros. En la Figura
144
Captulo IV
IV.6. se muestra el espectro visible de las pelculas proteicas de girasol y el de la

clorofila. De la misma se deduce que especialmente la pelcula de Ai-P podra llegar a
emplearse para esta finalidad dado que absorbe en la misma zona que la clorofila, por
lo que seguramente no permitira el crecimiento de malezas.
4,0
Absorbancia (UA)
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
400
450
500
550
600
650
700
750
800
Longitud de onda (nm)
Figura IV.6.: Espectros visibles de las pelculas proteicas de girasol: Ai-P (), AiExA-P
() y AiExS-P (), pelculas proteicas de soja: ASoja (), y de clorofila () extrada de
espinaca (Spinaca oleracea) con una solucin acuosa de acetona 40%.
En los ltimos aos se han publicado trabajos en donde se agregan compuestos

antioxidantes a distintas matrices proteicas para aumentar la vida til del producto en
contacto con la pelcula (Han y col., 2007; Gmez-Estaca y col., 2008). Debido a la
actividad antioxidante registrada en los productos proteicos de girasol, por la
presencia de compuestos fenlicos, se evalu esta propiedad en las pelculas proteicas,
encontrndose que todos los materiales producidos con protenas de girasol
presentaron propiedades antioxidantes (Figura IV.7.). Entre ellas, las pelculas de Ai-P
y AiExS-P presentaron una mayor capacidad de capturar al radical ABTS+ ( 10%), que
las de AiExA-P (que slo lo capturaron en un 7,5%). A diferencia de las pelculas de
girasol, las de ASoja no presentaron esta propiedad. Esta caracterstica resulta de
inters, ya que las pelculas proteicas de girasol estaran actuando como carriers de
compuestos antioxidantes, de forma natural, sin la necesidad de agregar otro tipo de
145
Captulo IV
compuestos, que despus habra que evaluar si lograron tener la actividad una vez
retenidos en la matriz proteica. A pesar que los resultados de evaluacin de las
propiedades antioxidantes resultaron positivos, sera necesario evaluar la actividad de
estas pelculas en un sistema alimentario real, siendo necesario realizar estudios ms
exhaustivos. Por otra parte, cabe resaltar que si es esta propiedad la que resulta
interesante aplicar en un sistema real, valdra la pena buscar las condiciones
apropiadas de obtencin de las pelculas proteicas a partir del concentrado proteico
Co-P, que de los productos estudiados en este trabajo de tesis es el presentaba mayor
contenido de compuestos fenlicos.
Capacidad de capturar al radical ABTS+

(%)
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
a
Ai-P
AiExA-P
AiExS-P
ASoja
Figura IV.7.: Actividad antioxidante, capacidad de capturar al radical ABTS+, de las

pelculas proteicas de girasol (Ai-P, AiExA-P y AiExS-P) y de soja (ASoja). Se informan
valores promedio desviacin estndar. Los valores con distintos superndices son
De esta manera se puede concluir que los aislados proteicos de girasol obtenidos en
planta piloto pueden formar pelculas biodegradables por casting. Estas presentan
permeabilidad al vapor de agua y tensin a la ruptura comparables a las pelculas de
ASoja. Si bien estas propiedades son inferiores a las que presentan los materiales
sintticos, estos materiales proteicos serviran para aplicaciones determinadas,
teniendo como ventaja adicional su biodegradabilidad. El contenido de fenoles slo
146
Captulo IV
afect su apariencia (color) y sus propiedades pticas (opacidad), lo que si bien podra
pensarse como una limitacin para algunas aplicaciones como packaging de alimentos,
podra llegar a ser ventajosa para otros usos, tales como en plsticos para la
agricultura (por ejemplo en mulching). Adems estas pelculas pueden considerarse
activas debido a la actividad antioxidante que presentan, y estn actuando
naturalmente como carriers de compuestos fenlicos.
IV.3.2.- Optimizacin de la funcionalidad de las pelculas de Ai-P a travs de

variaciones simples en la formulacin utilizada.
Con el fin de mejorar algunas de las propiedades presentadas por estos materiales, se
estudiaron algunas variaciones sencillas en las formulaciones en base a aislados
proteicos de girasol Ai-P.
Efecto del tipo y concentracin de plastificante: Las pelculas slo formadas a partir de
protenas son muy frgiles, debido al gran nmero de interacciones entre las cadenas
polipeptdicas, por lo que se quiebran fcilmente al manipularlas (Gennadios, 2002).
Este comportamiento se puede evitar con el agregado de plastificantes, los cuales por
lo general son molculas pequeas que se introducen entre las cadenas polimricas,
aumentando el volumen libre y la movilidad entre ellas, disminuyendo as el nmero
de interacciones protena-protena y produciendo pelculas ms elsticas pero menos
resistentes (Orliac y col., 2003; Sobral y col., 2008). En general, con esta funcin se
agregan glicerol, sorbitol, polietilenglicol, sacarosa, etc. a la formulacin. El agua
presente en las pelculas, tambin acta como plastificante. El tipo y la cantidad de
plastificante tambin afectan las propiedades de barrera al vapor de agua de las
pelculas proteicas o de polisacridos (Gennadios y col., 1996; Mali y col., 2006).
En este trabajo se estudi el efecto del agregado de tres plastificantes: glicerol (G),
sorbitol (S) polietilenglicol 400 (PEG), en distintas proporciones (10%, 20%, 30% y
40% p/p respecto a la masa de aislado) a la formulacin inicial.
El tipo y la cantidad de plastificante no tuvieron efecto sobre el espesor de las pelculas
(75 m, en promedio). El contenido de humedad de las pelculas proteicas se presenta
147
Captulo IV
en la Tabla IV.5. Se observ que las pelculas de Ai-P plastificadas con S o con PEG
presentaron contenidos de humedad cercanos al 12-14%, sin mostrar variaciones al
incrementar el contenido de plastificante. El mismo contenido de humedad
presentaron las pelculas con 10% de glicerol, sin embargo este valor se increment
con la concentracin de plastificante. Estos resultados nos indican que G posee mayor
poder plastificante que S y PEG. Similares resultados describieron Gennadios y col.
(1996).
Tabla IV.5.: Contenido de humedad (%) de las pelculas proteicas obtenidas a partir de
Ai-P, con diferente tipo -Glicerol (G), Sorbitol (S) y Polietilenglicol (PEG)- y contenido
de plastificantes.
Tipo de
Contenido de Plastificante (%)
Plastificante
10
20
30
40
13,96 2,51a
19,77 0,02b
25,88 2,38c
32,63 0,96d
14,21 0,74a
12,94 0,48a
13,33 0,13a
13,64 1,80a
PEG
12,07 0,54a
13,66 1,72a
12,12 1,25a
13,33 0,56a
Se informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, y en filas, los valores con distintos
Las propiedades de barrera al vapor de agua y mecnicas de las pelculas en estudio se

muestran en las Figura IV.8.A. y IV.8.B., respectivamente. Las pelculas plastificadas
con 10% y 20% de S PEG y con 10% de G no pudieron ser evaluadas debido a su gran
fragilidad. En la Figura IV.8.A. se puede observar que la WVP de las pelculas, aument
con el incremento de G o PEG. Mientras que el aumento en el contenido de S no
produjo diferencias significativas en esta propiedad, siendo stos los menores valores
de WVP. En general, las pelculas proteicas (Gontard y col., 1993; Gennadios y col.,
1994; Jangchud y col, 1999; Lim y col., 1999; Coupland y col., 2000; Alvarez Hayes y
col., 2003; Tapia-Blcido y col., 2007) o de polisacridos (Garca y col., 1998; Mali y col.,
2005; Mller y col., 2008) plastificadas con glicerol son ms higroscpicas y presentan
mayor WVP que las obtenidas empleando sorbitol. En bibliografa se ha reportado que
148
Captulo IV
el sorbitol posee tendencia a cristalizar durante el almacenamiento de las pelculas, lo

que representa una desventaja significativa que se deber tener en cuenta cuando
este es utilizado como plastificante (Mller y col., 2008).
2,5E-10
1,5E-10
b,c
1,0E-10
S-40
b,c
S-30
WVP (gH2O/Pa.s.m)
2,0E-10
5,0E-11
40
35
30
Tensin (MPa)
PEG-40
PEG-30
PEG-20
PEG-10
G-40
G-30
G-20
G-10
10
d
c
20
15
25
Elongacin (%)
S-20
S-10
0,0E+00
10
PEG-30
PEG-20
PEG-10
G-40
G-20
G-10
S-40
S-30
S-20
S-10
e,f
PEG-40
f,g
G-30
Figura IV.8.: Propiedades A) de barrera (WVP) y B) mecnicas (Tensin ( ), en eje

izquierdo, y Elongacin ( ), en eje derecho) de las pelculas de Ai-P en funcin del tipo
y cantidad de plastificante (tipo: S, G y PEG; cantidad: 10%, 20%, 30% y 40%) empleado
en su formulacin. Se informan valores promedio desviacin estndar. Los valores
con distintos superndices son significativamente diferentes con p0,05.
El comportamiento mecnico de las pelculas fue distinto, dependiendo del

plastificante empleado en su formulacin, tal como se observa en la Figura IV.8.B. Al
aumentar la concentracin de G en la formulacin, las pelculas resultaron ms
elongables pero menos resistentes (siendo ms significantes los cambios en
149
Captulo IV
deformacin que en tensin), resultados similares describen Gennadios y col. (2006) y

Alvarez Hayes y col. (2003) en la obtencin de pelculas de protenas de soja y de
amaranto plastificadas con glicerol. Sin embargo, al aumentar la concentracin de S o
PEG, las pelculas aumentaron significativamente su resistencia a la rotura y levemente
su elongacin. Ayhllon-Meixueiro y col. (2000) tambin estudiaron la obtencin por
casting de pelculas proteicas de girasol (10% p/p) con distintos plastificantes (50%
p/p). Ellos informaron que las pelculas con glicerol fueron ms elongables que las
plastificadas con sorbitol (max= 250% y 80% respectivamente), pero con resistencia
similar (3,9 MPa).
Finalmente, se observ que el tipo y la concentracin de plastificantes no afectaron las
propiedades pticas de las pelculas proteicas estudiadas.
Podemos concluir entonces que, las pelculas de Ai-P plastificadas con 30% de glicerol
presentaron buenas propiedades mecnicas y de barrera. Sin embargo, al emplear 40%
de sorbitol como plastificante es posible obtener materiales con mayor resistencia y
menor WVP, pero mucho menos elongables. El empleo de PEG como plastificante
produce pelculas con WVP similares a las obtenidas con glicerol, pero con peores
propiedades mecnicas, por lo que se descart para estudios posteriores.
Efecto de pH en la formulacin inicial: El pH es una de las tantas variables

experimentales posibles de cambiar con el fin de modificar la estructura de las
protenas y las interacciones que forman entre ellas. Dependiendo cmo se modifique
el estado de asociacin y disociacin de la protena, se podrn formar diferentes tipos
de redes (por asociacin de monmeros u oligmeros). De esta manera, las redes
proteicas que forman las pelculas tendrn caractersticas estructurales diferentes y en
consecuencia propiedades distintas. Por lo tanto, se estudi el efecto del pH de las
dispersiones proteicas iniciales (2,5, 7 y 11) en las propiedades de las pelculas
plastificadas con 30% de glicerol.
150
Captulo IV
En primera instancia, se observ que el pH no tuvo efecto sobre el espesor ni el

contenido de humedad. La WVP de las pelculas tampoco se modific al variar el pH de
la formulacin (Figura IV.9.A.), a diferencia de lo informado por Mauri y col. (2006 y
2008) quienes describieron que al incrementar el pH de las dispersiones de protenas
nativas de soja se formaban pelculas menos permeables al vapor de agua.
1,8E-10
b
1,6E-10
WVP (gH2O/Pa.s.m)
1,4E-10
1,2E-10
1,0E-10
8,0E-11
6,0E-11
4,0E-11
2,0E-11
0,0E+00
pH 2,5
pH 11
Bicapa
CM-5
10
40
35
30
Tensin (MPa)
CM-10
6
5
3
2
25
20
15
Elongacin (%)
pH 7
e
10
0
pH 2,5
pH 7
pH 11
Bicapa
CM-5
CM-10
Figura IV.9.: Propiedades A) de barrera (WVP) y B) mecnicas (Tensin ( ), en eje

izquierdo, y Elongacin ( ), en eje derecho) de las pelculas de Ai-P en funcin del pH
de la dispersin inicial (pH 2,5, pH 7 y pH 11) y del agregado de distintos aditivos: Cera
de abejas (Bicapa), 5% o 10% de celulosa microcristalina (CM-5 y CM-10
respectivamente). Se informan valores promedio desviacin estndar. Los valores
con distintos superndice son significativamente diferentes con p0,05.
151
Captulo IV
Por otra parte, las pelculas a pH 11 fueron las que presentaron las mejores
propiedades mecnicas (Figura IV.9.B.). Las pelculas menos elongables fueron las que
se obtuvieron al disminuir el pH de la dispersin inicial (a 2,5 o 7), mientras que las
menos resistentes fueron producidas a pH 7. Al trabajar a pH extremos (2,5 y 11), las
cadenas proteicas poseen carga neta y esto podra favorecer las interacciones entre
ellas. Adems a pH alcalino se favorecen las reacciones de intercambio SH/SS y la
formacin de uniones disulfuro, resultando as una matriz con mayor grado de
entrecruzamiento, reflejndose en su mayor resistencia y elongacin. En general, las
pelculas con mayor grado de entrecruzamiento presentan mayor resistencia y menor
WVP (Ou y col., 2005; Chambi y col., 2006). Las propiedades mecnicas encontradas en
este estudio se condicen con lo expuesto, aunque la variacin en el pH de la
formulacin inicial no afect significativamente los valores de WVP.
Las variaciones en el pH modificaron las propiedades pticas de las pelculas. A pH
cido se obtuvieron pelculas verdes ( a - ) con menor coloracin (mayores L y b,
menores E) que a pH neutro o alcalino. Mientras que las pelculas a pH neutro
presentaron la menor opacidad (12,522,38 UA mm-1).
Por lo tanto, se seguirn estudiando las propiedades de las pelculas de Ai-P

plastificadas con 30% de glicerol a pH 11, por haber presentado buenas propiedades de
barrera y las mejores propiedades mecnicas.
Efecto del agregado de aditivos: Con el objetivo de disminuir la WVP se agreg una
capa de cera de abejas (Bicapa) fundida sobre la pelcula ya formada, mientras que
para mejorar las propiedades mecnicas se adicion celulosa microcristalina (CM-5 y
CM-10) a la formulacin inicial. Se estudi el efecto del agregado de estos aditivos
sobres las propiedades de las pelculas proteicas resultantes y se compararon con las
pelculas de Ai-P a pH 11 plastificadas con 30% de glicerol.
Con el agregado de la capa de cera se logr reducir 5 veces la WVP de la pelcula
control Ai-P, logrando un valor de 2,97*10-11 g H2O/Pa s m (Figura IV.9.A.). Adems se
152
Captulo IV
observ que la pelcula Bicapa present mayor espesor (11325 m) y menor

contenido de humedad (18,731,29 %) que la pelcula control, debido a la adicin de la
capa de material lipdico. Esta modificacin tambin afect las propiedades mecnicas,
produciendo pelculas menos resistentes y elongables que las de Ai-P (Figura IV.9.B.).
Los termogramas de las pelculas Bicapa, obtenidos por DSC, mostraron una nica Tg a
-76C, y un pico endotrmico a 64C correspondiente a la fusin de la cera de abejas,
indicando que la cera en la pelcula est parcialmente cristalizada ( 40%). Las pelculas
Bicapa presentaron un aumento en los parmetros b (4,561,56) y E (82,561,52).
Datos obtenidos en nuestro laboratorio, mostraron que la adicin de una capa de cera
de abejas sobre pelculas proteicas de soja disminuy 19 veces la WVP sin afectar
significativamente las propiedades mecnicas de la misma (Denavi, 2009).
Por otra parte, la adicin de CM a la formulacin tiene como objetivo obtener
materiales con mayor resistencia a la traccin, pudiendo tambin disminuir su WVP
por generar mayor tortuosidad en la matriz polimrica (Dogan y col., 2007). Sin
embargo en las condiciones estudiadas en este trabajo no pudimos observar dichos
efectos. En la Figura IV.9.A. se muestra que las WVP de CM-5 y CM-10 no presentan
diferencias significativas con las de Ai-P, mientras que en la Figura IV.9.B. se puede
observar una leve disminucin en la elongacin de las pelculas con CM, sin modificar
significativamente sus valores de tensin. Estas pelculas presentaron espesores (entre
79-88 m) y coloracin similar a las de Ai-P. Slo el contenido de humedad ( 22%) y la
opacidad ( 20 UA/mm) fueron disminuyeron con respecto a la pelcula control, debido
a la presencia de CM.
Finalmente se estudiaron las isotermas de sorcin de las pelculas de Ai-P con mejores
propiedades: 1) Ai-P; 2) S-40; 3) Bicapa; 4) CM-5. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura IV.10. Los resultados experimentales fueron ajustados
satisfactoriamente con el modelo de GAB (r2 > 0,93), los parmetros resultantes se
muestran en la Tabla IV.6. All se puede apreciar que las pelculas Ai-P y CM-5 son las
ms higroscpicas, reflejndose en los valores de humedad de monocapa (X o).
Mientras que las pelculas menos permeables al vapor de agua (Bicapa y S-40) fueron
las que presentaron menores valores de Xo. Sin embargo, sus menores WVP se
explican por distintos mecanismos. Las pelculas S-40 presentaron menor ,
153
Captulo IV
indicndonos que a las molculas de agua les cuesta solubilizarse en la matriz proteica.
Por otra parte, los materiales Bicapa mostraron el menor Def (disminuye en un orden
de magnitud), significando que hay una resistencia mayor al flujo de las molculas de
agua, debido a la capa de cera de abejas depositada sobre la pelcula.
Xeq (g H2 O/g pelcula seca)
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Actividad acuosa
0,7
0,8
0,9
1,0
Figura IV.10.: Isotermas de sorcin de pelculas proteicas de girasol: Ai-P ( ). Efecto

del agregado de sorbitol: S-40 ( ), de una capa de cera: Bicapa ( ) y de celulosa
microcristalina: CM-5 ( ). Se representan con smbolos llenos los puntos
experimentales y con lnea punteada su ajuste empleando el modelo de GAB.
Tabla IV.6.: Efecto del agregado de aditivos: cera de abejas (Bicapa), celulosa
microcristalina (CM-5), sorbitol (S-40); sobre los parmetros de GAB y los coeficientes
de solubilidad () y difusividad efectiva (Def) del agua en las pelculas de Ai-P.
WVP*
Isotermas de Sorcin - Modelo GAB*
Def*
(*10-10)
Xo
r2
(*10-4)
(*10-7)
Ai-P
1,45 0,01c
0,2416
50,40
0,8724
0,9840
7,7
1,28
S-2,0
0,80 0,03b
0,0889
7,70
0,9375
0,9605
4,2
1,34
Cera
0,30 0,04a
0,1508
76,30
0,9136
0,9379
6,1
0,32
CM-5
1,47 0,01c
0,2051
39,97
0,8776
0,9367
6,8
-1 -1
-1
1,52
2 -1
*Unidades de WVP: gH2O Pa s m ; Xo: g H2O/g pelcula seca; : g H2O/Pa g pelcula seca; Def: m s . Se
informan valores promedio desviacin estndar. En columnas, y en filas, los valores con distintos
154
Captulo IV
Por lo tanto, al agregar una capa de cera de abejas es posible reducir 5 veces la WVP
de las pelculas proteicas de girasol Ai-P, mientras que, en las condiciones estudiadas,
la CM no tuvo efecto sobre sus propiedades mecnicas y de barrera de las pelculas.
Podemos concluir entonces que realizando modificaciones simples en la formulacin
inicial resulta posible obtener una amplia gama de pelculas biodegradables de Ai-P
con diferentes propiedades mecnicas y de barrera, que podran emplearse en
aplicaciones especficas dependiendo de sus requerimientos.
155
Captulo IV
IV.4.- Conclusiones
a.- Los aislados proteicos de girasol son adecuados para la obtencin de

pelculas biodegradables flexibles por casting, con propiedades mecnicas y de barrera
en el orden de otras pelculas proteicas. El contenido de compuestos fenlicos
remanentes en los aislados slo modific el color y la opacidad de las pelculas,
adems de conferirle propiedades antioxidantes.
b.- Se observ que la red proteica que constituye la pelcula est formada
mayoritariamente por puentes de hidrgeno y uniones disulfuro, y estabilizada en
menor medida, por interacciones hidrofbicas e inicas.
c.- Modificando la formulacin inicial fue posible obtener materiales con
distintas propiedades. Al incrementar el contenido de glicerol se obtuvieron pelculas
ms permeables al vapor de agua, menos resistentes, pero ms elongables. El empleo
de sorbitol produjo pelculas con menores WVP pero muy frgiles. El pH tuvo efecto
sobre las propiedades en estudio, la opacidad y la tensin a la ruptura disminuyen a pH
7, mientras que la elongacin es mxima a pH 11. Las pelculas proteicas de girasol
plastificadas con glicerol al 30% p/p presentaron buenas propiedades de barrera y
mecnicas. Se logr mejorar su WVP 5 veces por formacin de pelculas bicapa con
cera de abejas. Bajo las condiciones experimentales estudiadas no se logr reforzar la
matriz proteica por agregado de celulosa microcristalina.
d.- Si bien bajo las condiciones estudiadas no se lograron obtener buenas
pelculas a partir de los concentrados proteicos de girasol, es de esperar que con
modificaciones de la metodologa de obtencin se logren formar las mismas, que
seguramente tendrn todava mejores propiedades antioxidantes dado su mayor
concentracin de fenoles
e.- Si bien la coloracin de estas pelculas podra limitar algunas de sus posibles
aplicaciones en packaging de alimentos, estos materiales podran emplearse, si sus
propiedades lo admiten, como mulching en agricultura intensiva.
156
Captulo V: Materiales compuestos, rgidos y

biodegradables obtenidos a partir de
aislados proteicos de girasol, almidn de
mandioca y fibras de celulosa
Captulo V
Captulo V: MATERIALES COMPUESTOS, RGIDOS Y BIODEGRADABLES OBTENIDOS A

PARTIR DE AISLADOS PROTEICOS DE GIRASOL, ALMIDN DE MANDIOCA Y FIBRAS DE
CELULOSA
V.1.- Introduccin
Aproximadamente el 41% de los plsticos producidos a partir de derivados del
petrleo son destinados a la industria de envases, siendo los envases de los alimentos
uno de las destinos ms importantes (47%) (Fomin y col., 2001), por lo que la
sustitucin de estos plsticos por biopolmeros, con el objetivo de disminuir los
actuales problemas de contaminacin ambiental y de recurrir al uso de productos
renovables, constituye un desafo. En este contexto, los polmeros naturales obtenidos
de distintas fuentes constituyen una alternativa interesante para ser empleado en
packaging. En el captulo anterior, se estudi la capacidad que presentan las protenas
de girasol para la formacin de pelculas flexibles por casting. Estas protenas
presentan propiedades termoplsticas, por lo que tambin resulta posible su
procesamiento por metodologas ms cercanas a las de los plsticos sintticos, entre
ellas termoprensado, inyeccin, moldeo y extrusin (Orliac y col., 2003; Rouilly y col.,
2006), con las que es posible obtener materiales flexibles o rgidos.
Entre los materiales ms empleados como contenedores de alimentos, se encuentran
las espumas de poliestireno expandido, utilizadas como bandejas con distintas
aplicaciones (por ejemplo para fiambres, carnes, productos de panadera, etc.). Para
algunas aplicaciones, estas bandejas podran ser reemplazadas por materiales
biodegradables, entre ellos biopolmeros, por distintos procesos. Por ejemplo se ha
descripto el uso de mezclas de almidn y agua para la obtencin de este tipo de
materiales por procesos como la filtracin en vaco (Matsui y col., 2004) o el
termoprensado (Shogren y col., 1998; Glenn y col., 2001; Shogren y col., 2002;
Soykeabkaew y col., 2004; Schmidt, 2006; Shey y col., 2006). Estos materiales tambin
se pueden obtener por un proceso conocido como foam baking. Este proceso
cuando es aplicado a suspensiones de almidn, consta de dos etapas: en una primera
ocurre la gelatinizacin del almidn y la evaporacin del agua, expandiendo la mezcla y
157
Captulo V
formando una espuma, mientras que en la segunda etapa la espuma se seca hasta
alcanzar valores de humedad entre 2 y 4% (Shogren y col., 1998). Las grandes
limitaciones que tiene el uso de estos polmeros en la fabricacin de este tipo de
material es que los productos obtenidos poseen una fragilidad elevada y una gran
afinidad por el agua (Glenn y col., 2001).
Con el fin de mejorar estas propiedades se ha estudiado la formacin de estos
materiales a partir de almidones modificados, as como el agregado de plastificantes,
polmeros, fibras y/o aditivos a la formulacin inicial. Shogren y col. (1998)
encontraron que al aumentar la concentracin de almidn, el peso molecular y el
contenido de amilosa, se increment la resistencia y la densidad de las espumas (o
bandejas), mientras que su flexibilidad disminuy. Tambin se ha informado que los
almidones de tubrculos, por ejemplo papa, producen bandejas con baja densidad y
mayor flexibilidad que las correspondientes a almidones de cereales, por ejemplo
maz. Otros autores describieron que espumas de almidones qumicamente
modificados presentaron menores tiempos de proceso, menores pesos y mayores
deformaciones que los almidones sin modificar; y que las formadas con almidones
genticamente modificados (waxy) adicionadas con polivinil alcohol presentaron
mayores elongaciones a la rotura (Shogren y col., 2002). Tambin se mejor la
resistencia de espumas de almidn, y en algunos casos la deformacin a la rotura, con
el agregado de distinto tipo de fibras, como por ejemplo fibras de madera de lamo,
yute y lino (Glenn y col., 2001; Shogren y col., 2002; Lawton y col., 2004; Soykeabkaew
y col., 2004). Adems, se logr mejorar la resistencia al agua de bandejas de almidn
con el agregado de una proporcin alta de fibras de maz y polivinilalcohol, agregando
ltex de caucho a las formulaciones, y obteniendo espumas de almidn laminadas con
aluminio, papel tissue, polivinilalcohol y pelculas de policloruro de vinilo (Glenn y col.,
2001; Cinelli y col., 2006). Gspr y col. (2005) estudiaron el efecto de agregar otros
polisacridos o protenas, como celulosa, hemicelulosa y zenas de maz a la
formulacin, encontrando las mejores propiedades mecnicas para los compuestos
con hemicelulosa y zenas. Otros autores tambin informaron que la combinacin de
almidones con otros biopolmeros, como protenas o celulosas, produjeron materiales
biodegradables con mejores propiedades (Arvanitoyannis y col., 1996; Psomiadou y
158
Captulo V
col., 1996; Arvanitoyannis y col., 1997; Jagannath y col., 2003; Coughlan y col., 2004;
Wongsasulak y col., 2006; Wongsasulak y col., 2007).
Conociendo estos antecedentes, nos planteamos la posibilidad de utilizar protenas de
girasol, mayoritariamente globulinas, en la produccin de materiales rgidos
compuestos a partir de almidn de mandioca y fibras de celulosa. Para ello, no
propusimos los siguientes objetivos: Evaluar las posibilidades de obtencin de
materiales rgidos biodegradables compuestos, a partir de almidn de mandioca,
protenas de girasol y fibras de celulosa, mediante el proceso foam baking; y
optimizar la formulacin variando las proporciones relativas de los tres componentes a
fin de mejorar las propiedades fsicas y mecnicas de los materiales resultantes.
159
Captulo V
V.2.- Materiales y Mtodos
V.2.1.- Materiales empleados en la obtencin de bandejas

Se utiliz almidn de mandioca con 17% de amilosa (Molinari S.A., Brasil), aislados
proteicos de girasol (Ai-P, AiExA-P y AiExS-P) y fibras cortas de celulosa proveniente de
eucaliptus (Klabin S.A., Brasil). Tambin se utilizaron estearato de magnesio (Quimidro
Ltda., Brasil), glicerol (Nuclear Casa da Qumica Ind. e Com. Ltda., Brasil) y goma guar
(Nicrom Qumica Ltda., Brasil) como aditivos.
V.2.2.- Diseo experimental

Para estudiar el efecto de la formulacin en las propiedades de los materiales
resultantes, se plante un diseo experimental factorial con dos factores (porcentaje
de fibras, F, y contenido de protenas, P) y tres niveles (32) en un bloque y sin punto
central, resultando un total de 9 experiencias (Statistica 6.0, StatSoft, Inc, Estados
Unidos) (Montgomery, 2003). En base a resultados preliminares, se evaluaron
porcentajes de fibra entre 10-20% y concentraciones de protenas entre 0-20%. Las
formulaciones iniciales de los materiales estudiados se muestran en Tabla V.1.
V.2.3.- Obtencin de bandejas por foam baking

Para preparar cada formulacin (Tabla V.1.), inicialmente se dispersaron las fibras de
celulosa en el agua mezclando 5 minutos con un agitador mecnico (Fisaton modelo
713D, Brasil), posteriormente se agreg el almidn de mandioca, el aislado proteico de
girasol y los aditivos (4% p/p de estearato de magnesio, 1,5% p/p de goma guar y 4%
p/p de glicerol) y se continuaron mezclando 5 minutos con el agitador mecnico. Entre
42 y 45 g de cada formulacin se esparcieron homogneamente sobre un plato de
Teflon de 16 cm por 11 cm, con una gua metlica de 1,5 mm de espesor. Se dispuso
una tapa de Teflon encima de la mezcla y se termoprens con una prensa hidrulica
con sistema elctrico de calentamiento, medidor de temperatura Pt100 y controlador
PID. Primero se realiz una pre-prensada a 150-155C durante 4 minutos con el
160
Captulo V
objetivo de eliminar agua por evaporacin y producir la expansin de la mezcla,

seguido de una prensada de 3 minutos a 0,36 MPa a la misma temperatura.
Finalmente las bandejas se retiraron de la prensa, se enfriaron 3 minutos a
temperatura ambiente y se desmoldaron.
Las bandejas obtenidas se acondicionaron 4 das a 25C y 75 %HR previo a la
caracterizacin de sus propiedades fsicas y mecnicas.
Tabla V.1.: Diseo experimental factorial. Formulaciones iniciales para la obtencin de

bandejas biodegradables.
Muestras
Almidn de
mandioca (g)
Fibras de
celulosa (g)
Aislado proteico
de girasol (g)
Agua (g)
10F-0P
90
10
170
10F-10P
81
10
170
10F-20P
72
10
18
170
15F-0P
85
15
190
15F-10P
76,5
15
8,5
190
15F-20P
68
15
17
190
20F-0P
80
20
210
20F-10P
72
20
210
20F-20P
64
20
16
210
V.2.4. Caracterizacin de las bandejas obtenidas

Espesor: se determin empleando un calibre digital (Digimatic, Mitutoyo, Japn). El
valor informado para cada formulacin result de promediar tres medidas sobre cada
10 cuerpos de prueba.
Densidad: La densidad se calcul mediante la relacin entre peso y volumen (Shogren

y col., 1998). Los valores presentados son promedios de cinco determinaciones para
cada formulacin.
161
Captulo V
Contenido de humedad: Se determin luego del secado en estufa a 105C durante 24

horas. Muestras de 12,5 cm2 fueron colocadas en placas de Petri y fueron pesadas
antes y despus del secado (ASTM D644-94, 1994). Los valores informados son el
promedio de 10 determinaciones para cada formulacin, y se calcul como el
porcentaje de peso perdido respecto del peso original.
Color: El color de las bandejas fue determinado utilizando un colormetro (CR 300,
Minolta Chroma Co., Osaka, Japn), como se describi en Captulo I, seccin I.2.9. Los
valores informados son la media de cinco determinaciones sobre cada cuerpo de
prueba, empleando cinco probetas para cada formulacin.
Absorcin de agua por inmersin: Para esta determinacin, muestras de 2,5 cm por 5
cm previamente pesadas se sumergieron en agua destilada por 60 segundos. Luego se
retiraron, se sec el exceso de agua con papel tissue y se pesaron nuevamente. La
cantidad de agua absorbida se obtuvo por diferencia de los pesos registrados y se
expres como g H2O/g bandeja inicial (norma ABNT NBR NM ISO 535, 1999). Los
resultados mostrados son el promedio de cinco determinaciones para cada
formulacin.
Adsorcin de agua a altas humedades relativas: Las bandejas de almidn conteniendo

20% de fibras, sin y con 10% de protenas (20F-0P y 20F-10P; respectivamente) fueron
colocadas en desecadores a 75%HR y 90%HR hasta alcanzar el equilibrio. Luego, la
humedad de equilibrio (en base seca) fue determinada por el mtodo gravimtrico.
Microscopa electrnica de barrido (SEM): Las muestras se recubrieron con una fina
capa de oro con un metalizador (SCD 005, BALTEC, Suiza). Las microscopas se
realizaron en un microscopio electrnico de barrido (XL-30, Philips, Holanda). El voltaje
de aceleracin utilizado para el anlisis de todas las muestras fue de 10 kV.
162
Captulo V
Propiedades Mecnicas: Se emple un texturmetro modelo TA.XT2i (SMS, Surrey,

Inglaterra), con una celda de carga de 25 N para determinar las propiedades mecnicas
de las bandejas en ensayos de tensin y puncin.
Los ensayos en traccin se realizaron utilizando probetas de 100 mm de longitud por
25 mm de ancho, con una separacin inicial de mordazas de 80 mm y una velocidad de
cabezal de 2 mm/s (Figura V.1.A.). Se registraron las curvas de tensin-deformacin y
se determinaron los valores de tensin de ruptura (). Se realizaron 10
determinaciones para cada formulacin, los valores informados son el promedio de
ellas.
Ensayos de puncin: se utilizaron probetas de 10 cm por 10 cm. Durante el ensayo se
registr la curva fuerza-distancia de penetracin, usando una sonda esfrica de 21 mm
de dimetro. La velocidad de puncin fue de 1 mm/s con una carga de 0,5 N (Figura
V.1.B.). La deformacin relativa () se calcul como el cociente entre la distancia
vertical que recorri la sonda desde que se contact con la muestra hasta la ruptura y
el dimetro de la muestra que coincide con el dimetro del orificio del accesorio
utilizado para medir (80 mm). Los valores informados son el promedio de cuatro
determinaciones para cada formulacin.
Los valores de tensin a la ruptura () y de deformacin relativa (), nomenclados
como Yi, se ajustaron con Statistica 6.0 (StatSoft, Inc, Estados Unidos) a una ecuacin
de segundo grado (Ecuacin V.1.) en funcin de las variables independientes:
contenido de Fibras (F) y porcentaje de Protenas (P), siendo bn constantes de ajuste.
Yi b0 b1 F b2 P b12 FP b11F 2 b22 P 2
Ecuacin V.1.
163
Captulo V
Figura V.1.: Dispositivos empleados para la evaluacin de las propiedades mecnicas

en A) ensayo de traccin y B) puncin de las bandejas obtenidas.
V.2.5.- Anlisis estadstico

Test de Tuckey, con un nivel de significacin =0.05. Para ello se emple el programa
SigmaStat 2.0 (Jandel Corporation, Estados Unidos).
164
Captulo V
V.3.- Resultados y Discusin
V.3.1.- Formulaciones empleadas y variables del proceso de foam baking

Los lmites de concentracin para cada componente (almidn, protenas y fibras)
(Tabla V.1.) se fijaron en base a resultados experimentales preliminares y datos
bibliogrficos. En este estudio el almidn de mandioca (Manihot esculenta) es el
componente que forma la matriz polimrica, siendo el ingrediente mayoritario de la
formulacin. Con el objetivo de mejorar las propiedades mecnicas de los materiales
obtenidos, se adicionaron fibras de celulosa y protenas de girasol (Helianthus annus),
esperando que estas ltimas tambin pudieran disminuir la afinidad por el agua de las
bandejas. En cuanto a la concentracin de fibras, Shogren y col. (2002) informaron que
la adicin de bajos contenidos de fibras de madera de lamo (Populus alba) (5-10%)
mejor las propiedades mecnicas de bandejas de almidn de maz (Zea mays). Cinelli
y col. (2006) reportaron que al incrementar el contenido de fibras (hasta 54,7%) en las
mezclas de almidn de papa (Solanum tuberosum), se produca un aumento en la
viscosidad de la mezcla inicial impidiendo llevar a cabo el proceso. Finalmente, Schmidt
(2006) inform que las bandejas de almidn de mandioca con porcentajes mayores a
30% de fibra de celulosa presentaron discontinuidades (huecos) que afectaron sus
propiedades mecnicas. Teniendo en cuenta estos resultados, en este trabajo se vari
la concentracin de fibras de celulosa entre 10 y 20%. Adems, se estudi el agregado
de protenas de girasol hasta un 20%, ya que para concentraciones superiores las
bandejas presentaron imperfecciones superficiales que afectaban sus propiedades
mecnicas adems de su apariencia. Por otra parte, el volumen de agua agregado a
cada formulacin estuvo directamente relacionado con el contenido de fibras. Los
valores que se muestran en la Tabla V.1. corresponden a los volmenes mnimos de
agua que facilitaron la incorporacin de las fibras de celulosa y que permitieron lograr
una dispersin homognea de la mezcla. A todas las formulaciones se les agreg:
estearato de magnesio, que es un compuesto hidrofbico que ayuda al desmolde de
las bandejas; goma guar para aumentar la viscosidad de la suspensin y evitar la
separacin de los slidos; y glicerol como plastificante (Shogren y col., 1998).
165
Captulo V
Durante la obtencin de bandejas por foam baking, las mezclas de almidn y fibras se
someten a temperaturas entre 180 y 200C durante dos a cuatro minutos (Glenn y col.,
2001; Lawton y col., 2004 y Schmidt, 2006). Al repetir esas condiciones de proceso
sobre las formulaciones que contenan protenas de girasol, las bandejas resultantes
presentaron un aspecto quemado, an utilizando menores tiempos de proceso. Por
este motivo, se decidi procesar las mezclas a menor temperatura (150-155C) durante
7 minutos, resultando este proceso similar al realizado por Gspr y col. (2005) para
obtener bandejas a partir de almidn de maz con zenas.
V.3.2.- Estudio de las propiedades fsicas y mecnicas de las bandejas biodegradables

En esta seccin se presentan y discuten los resultados de las bandejas obtenidas con el
aislado proteico de girasol Ai-P. En primera instancia se determinaron el espesor, la
densidad y el contenido de humedad de las bandejas obtenidas (Tabla V.2.), debido a
que estas caractersticas afectan sus propiedades mecnicas. En la Tabla V.2. se puede
observar que todos los materiales desarrollados presentaron espesores promedios
entre 1,55 y 1,76 mm y densidades promedios entre 0,46 y 0,59 g/cm 3. La variacin en
el contenido de fibras de celulosa no afect el espesor ni la densidad de las bandejas
de almidn. Solo en presencia de un 10% de protenas, se observ que al aumentar el
contenido de fibras disminuy el espesor de las bandejas acompaado de un aumento
en su densidad. Para las bandejas con 10% de fibras, al aumentar el contenido de
protenas, el espesor aument sin modificarse significativamente la densidad. Pero
para mayores porcentajes de fibra, el espesor fue mnimo y la densidad fue mxima
para las bandejas que contienen un 10% de protenas. La mxima densidad fue
registrada para la bandeja de almidn con 10% de protenas y 15% de fibra. Glenn y
col. (2001) observaron, como en este trabajo, que la densidad de sus bandejas
disminua con el agregado de fibras de maz. La misma tendencia fue descripta por
Schmidt (2006) para bandejas de almidn de mandioca, fibras de celulosa y CaCO 3. Los
valores de densidad registrados en este trabajo son superiores al que presenta el
poliestireno expandido - aproximadamente de 0,06 g/cm3 segn Shey y col. (2006) y
Glenn y col. (2001) -, el paperboard - 0,18 g/cm3 (Glenn y col., 2001)-, y las obtenidas
166
Captulo V
por otros autores para bandejas de almidones de trigo (Triticum aestivum), maz,
papas y mandioca - 0,07-0,41 g/cm3 (Shogren y col., 1998; Glenn y col., 2001; Cinelli y
col., 2006; Carr y col., 2006)-. Pero son inferiores a las informadas por Schmidt (2006)
para bandejas formuladas con el mismo almidn e iguales fibras, pero con el agregado
de CaCO3 -entre 0,63-1,3 g/cm3-.
Tabla V.2.: Espesor, densidad y contenido de humedad de las bandejas en estudio.

Muestras
Densidad (g.cm-3)
Espesor (mm)
a,b
0,482 0,043
a,b,c
Humedad (%)
10,81 0,01e
10F-0P
1,6298 0,0987
10F-10P
1,7216 0,0853b,c
0,474 0,038a,b,c
10,32 0,14c,d
10F-20P
1,7623 0,0910c
0,511 0,049b,c
10,18 0,05b,c
15F-0P
1,6197 0,0650a,b
0,518 0,042c
10,58 0,04d,e
15F-10P
1,5509 0,0750a
0,587 0,044d
10,14 0,19b,c
15F-20P
1,7207 0,0873b,c
0,463 0,028a,b
10,00 0,13a,b
20F-0P
1,6932 0,1480b,c
0,476 0,044a,b,c
10,35 0,12c,d
20F-10P
1,5490 0,0587a
0,522 0,034c
10,00 0,18a,b
20F-20P
1,6866 0,0691b,c
0,456 0,013a
9,74 0,12a
Si bien el porcentaje de humedad de las bandejas al momento de ser desmoldadas se

encontraba entre 2 y 4%, las mismas adsorbieron agua durante el almacenamiento (4
das a 25 C y 75 %RH). En la Tabla V.2. se muestra el contenido de humedad para cada
formulacin al momento de su caracterizacin. Se puede observar una leve
disminucin del contenido de agua con el agregado de protenas y de fibras, que se
correlaciona con una disminucin en la concentracin de almidn de la formulacin.
Pero no se observaron diferencias significativas en este valor al aumentar el contenido
de protenas del 10 al 20%.
Una de las principales limitaciones de los materiales basados en almidn y fibras es
que presentan poca resistencia al agua, debido a la gran higroscopicidad de sus
167
Captulo V
componentes. En particular, si se piensa en ellos para ser empleados como

contenedores de alimentos, interesa conocer su capacidad de absorcin de agua. Este
ensayo resulta ms drstico que las condiciones reales a las que se sometern estos
materiales, debido que involucra someter a los mismos a una inmersin total en agua,
pero es la tcnica habitualmente usada para informar estos resultados. Intentando
conseguir asemejarnos al comportamiento de las bandejas de poliestirenos, el
resultado deseado es que la capacidad de absorcin de agua fuera mnima, para poder
asegurar as su integridad y funcionalidad. Los resultados correspondientes a este
ensayo se presentan en la Figura V.2. Se puede observar que para las bandejas de
almidn, al aumentar el contenido de fibras del 10 al 20%, aument la absorcin de
agua aproximadamente en un 18%, mientras que el agregado de protenas de girasol a
la formulacin la disminuy hasta un 44%, siendo estas variaciones significativas al
agregar solo un 10% de protenas. En presencia de protenas no se observ el aumento
en esta propiedad con el agregado de fibras.
b
20F
a
d
a,b
15F
a
e
b
10F
a,b
c
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Absorcin de agua (g H2 O/g bandeja)
Figura V.2.: Absorcin de agua por inmersin de las bandejas biodegradables

formuladas a partir de almidn de mandioca, fibras de celulosa (10F, 15F, 20F) y
protenas de girasol (Ai-P; 0P ( ); 10P ( ); 20P ( )). Se muestran valores promedio
desviacin estndar. Las barras con distintos superndices son significativamente
168
Captulo V
Con estos resultados, resulta evidente que la presencia de protenas disminuy la

sensibilidad al agua de las bandejas y enmascar el efecto de las fibras. Si bien la
absorcin de agua alcanzada por estos materiales fue mayor que las respectivas a las
bandejas obtenidas en otros estudios por el proceso de impregnacin o utilizando
acetato de almidn o polivinil alcohol (Cinelli y col., 2006), la reduccin alcanzada es
importante en magnitud y ampla las posibilidades de estos materiales.
Con el objetivo de evaluar la aplicabilidad de las bandejas obtenidas, se estudi el
efecto del agregado de fibras y de protenas a la formulacin sobre sus propiedades
mecnicas, especficamente sobre su resistencia a la ruptura al ser sometidas a
ensayos de traccin y sobre su deformacin relativa en ensayos de puncin, ya que
estas dos son las propiedades mecnicas ms significativas de este tipo de materiales.
Los valores de tensin de ruptura obtenidos para las distintas bandejas se presentan
en la Figura V.3. En ella se puede apreciar que para las bandejas de almidn, la
resistencia a la traccin no se modific significativamente al aumentar el porcentaje de
fibra del 10 al 20%. En contraste, para las bandejas que poseen protenas de girasol, la
tensin aument con el agregado de fibras, siendo este aumento ms significativo para
las que contienen 20% de protenas. Se puede apreciar tambin que el agregado de un
10% de protena a la formulacin aument los valores de tensin respecto de los de las
bandejas de almidn de mandioca con el mismo contenido de fibras, pero al aumentar
la cantidad de protenas a un 20% la tensin disminuy, especialmente para los
materiales con 10 y 15% de fibra. Los mayores valores de tensin (6,57 1,16 MPa) se
encontraron para la muestra con 20% de fibra y 10% de protena. Existe una estrecha
relacin entre la tensin y la densidad de las bandejas, las bandejas ms densas son las
que presentaron la mayor resistencia. En concordancia con estos resultados, Shogren y
col. (1998) observaron que la tensin y rigidez de las espumas de almidn estaban
altamente relacionadas con la densidad y con su contenido de amilosa. En la Figura
V.3. tambin se muestra la superficie de respuesta que ajust a los datos
experimentales con r2=0,945, y que es representada por la Ecuacin V.2. Del anlisis
estadstico de los resultados, se encontr que la variable concentracin de protena (P)
result ser significativa (p 0,05) en los trminos lineales y cuadrticos, mientras que
la concentracin de fibras (F) solo result ser significativa (p 0,05) para el trmino
169
Captulo V
lineal. Mientras que las interacciones Fibra-Protena (F P) y Fibra-Fibra (F2) no fueron

significativas (p 0,05).
= 4,035 + 0,198 F + 0,028 P + 0,006 F P - 0,005 F2 - 0,009 P2
Ecuacin V.2.
(MPa)
Figura V.3.: Tensin a ruptura presentada por la bandejas (en ensayo de traccin) en
funcin de contenido de protenas y fibras. Se muestran los puntos experimentales ( )
y la superficie de respuesta resultante del ajuste matemtico (r2=0,945).
Por otra parte, los porcentajes de deformacin relativa que soportan las bandejas
cuando son sometidas al ensayo de puncin, se presentan en la Figura V.4. Se puede
observar que el agregado de fibras a las bandejas de almidn produjo un aumento en
la deformacin a la rotura de las bandejas, pero esta variacin fue menos significativa
en la medida que se aument la concentracin de protenas. Si bien en dicha figura
tambin se observa una tendencia marcada a disminuir la deformacin relativa con el
agregado de protenas, las diferencias solo fueron estadsticamente significativas para
las muestras que contenan 20% de fibra. En la Figura V.4. tambin se muestra la
170
Captulo V
superficie de respuesta representada por la Ecuacin V.3., que ajusta a los datos
experimentales con r2=0,891. Mediante el anlisis estadstico de los datos podemos
afirmar que slo el trmino lineal de protenas result ser significativo (p<0,05) en la
deformacin relativa, mientras que no se observ un efecto de las Fibras, ni
interacciones Protenas-Fibra (F P).
= 0,07304 + 0,00018 F - 0,00112 P - 0,00004 F P + 0,00002 F2 + 0,00006 P2 Ecuacin
V.3.
Deformacin
relativa,
(%)
Figura V.4.: Deformacin relativa de las bandejas (en ensayo de puncin) en funcin
del contenido de protenas y fibras. Se muestran los puntos experimentales ( ) y la
superficie de respuesta resultante del ajuste matemtico (r2=0,891).
Las propiedades mecnicas de los materiales obtenidos son similares a los descriptos
por Schmidt (2006) para bandejas de almidn de mandioca, fibras de celulosa y CaCO 3.
Lawton y col. (1999) informaron que usando almidones con alto contenido de
amilopectina resultaron en espumas livianas con menores resistencias. Cabe resaltar
171
Captulo V
que las bandejas producidas en este trabajo, que poseen densidades superiores a las
informadas en la bibliografa, resultaron ser materiales ms resistentes. Otros autores
mostraron mejoras en la resistencia de sus materiales al agregar entre 15 y 30% de
fibras de madera de lamo a la formulacin, dado que en ese rango, las fibras se
adhirieron bien a la matriz de almidn y lograron reforzarla; por debajo de esas
concentraciones no se observaron mejoras, y por encima, la resistencia comenz a
disminuir a causa de la distribucin no homognea de las fibras en la matriz de
almidn (Shogren y col., 2002; Lawton y col., 2004). Gspr y col. (2005) tambin
observaron una mejora en la tensin de bandejas de almidn de maz, agregando un
10% de zenas a la formulacin. Ellos atribuyeron este efecto y el de baja absorcin de
agua a la compatibilidad de ambos biopolmeros que le permite formar una estructura
ms compacta. A pesar de conocer que el agua tiene un fuerte efecto plastificante en
los materiales basados en polisacridos y protenas (Gontard y col., 1993; Wongsasulak
y col., 2006), en este trabajo no se encontr relacin entre las propiedades mecnicas
y el contenido de agua post-prensado de las bandejas.
Sabiendo que la adsorcin de agua durante el almacenamiento de estos materiales
puede modificar sus propiedades mecnicas y determinar su empleo comercial, se
cuantific la humedad de equilibrio (Xeq) en ambientes con elevada humedad relativa
(75% y 90% de HR) del material con mejores propiedades mecnicas (20F-10P) y de su
correspondiente bandeja sin el agregado de protenas (20F-0P). Las Xeq de las muestras
20F-0P y 20F-10P acondicionadas a 75% de HR fueron 0,078 y 0,082 g H2O/g bandeja
seca respectivamente, no encontrndose diferencias significativas entre estos valores.
El mismo comportamiento se observ a 90% de HR, en donde las Xeq de ambas
muestras fueron cercanas a 0,105 g H2O/g bandeja seca. Estos niveles de humedad no
cambiaron las caractersticas de las bandejas, indicndonos que estos materiales son
estables en ambientes de alta humedad relativa. Este efecto tambin fue observado
por Gspr y col. (2005) al agregar protenas de maz (zenas) a bandejas de almidn de
maz. Ellos realizaron estudios de adsorcin de agua a diferentes humedades relativas
sobre bandejas de almidn de maz con celulosa, hemicelulosa, zenas y
policaprolactona. Todos estos materiales compuestos presentaron una alta resistencia
a la adsorcin de agua, pero luego de 14 das de acondicionamiento, los materiales
172
Captulo V
basados en almidn de maz con zenas fueron los ms resistentes, presentando los
menores porcentajes de adsorcin de agua.
El color de los materiales desarrollados fue diferente, en la Tabla V.3. se muestran los
parmetros Hunter-Lab de las bandejas estudiadas. Como se mencion en los captulos
anteriores, los aislados proteicos de girasol (Ai-P) presentaron una coloracin verde (L=
42,33 0,15, a= -1,71 0,06, b= 6,80 0,08 y E= 55,24 0,16), debida a la oxidacin
de los fenoles presentes en la harina de girasol durante el tratamiento alcalino en el
proceso de obtencin de los aislados (Shamanthaka Sastry y col., 1997).
Tabla V.3.: Parmetros de color Hunter-Lab de las bandejas biodegradables obtenidas.

Muestras
a
0,03 0,07
10F-0P
88,68 0,42
10F-10P
51,82 1,58d
-2,99 0,41a
9,15 0,18c
46,19 1,58d
10F-20P
41,54 0,65e
-2,58 0,17a
8,01 0,29c
56,18 0,64c
15F-0P
87,57 0,71f
0,10 0,14c
7,48 0,32b
11,32 0,63b
15F-10P
53,62 1,08e
-2,84 0,12a
9,69 0,28c
44,51 1,07c
15F-20P
44,85 1,20a
-2,65 0,41a,b
9,29 0,34b
53,07 1,13e
20F-0P
89,43 0,33g
-0,20 0,07c
7,49 0,35b
9,78 0,40a
20F-10P
54,63 1,08b
-2,90 0,34a,b
9,36 0,66c
43,47 1,09f
20F-20P
46,86 0,61c
-2,33 0,36b
9,75 0,76c
51,14 0,52g
f,g
6,77 0,27
9,99 0,47a,b
Dado que el almidn de mandioca y las fibras de celulosa son blancas, las bandejas sin
protenas presentaron una leve coloracin amarillenta (b levemente positivos),
probablemente debido a las altas temperaturas de procesamiento utilizadas en su
obtencin. En esas bandejas, no se observaron diferencias significativas en el color
debidas a cambios en la concentracin de las fibras de celulosa. Al aumentar la
proporcin de protenas en la formulacin, se intensific la coloracin verdosa (a - y b
+) y los valores de L disminuyeron, produciendo un aumento en el parmetro E.
173
Captulo V
V.3.3.- Morfologa de las bandejas biodegradables obtenidas

Los materiales biodegradables obtenidos fueron analizados mediante microscopa
electrnica de barrido (SEM), permitindonos conocer su microestructura y
relacionarla con sus propiedades mecnicas. En la Figura V.5. se muestran las
microestructuras superficial (a) y transversal (b) de las bandejas obtenidas con: 1)
almidn + 20% de fibra (20F-0P), 2) almidn + 20% de fibra + 10% de protena (20F10P), y 3) almidn + 10% de fibra + 20% de protena (10F-20P). Producto de su proceso
de obtencin, las bandejas de almidn presentaron cscaras superficiales ms densas
debido a que al estar en contacto con el molde caliente, la pasta de almidn se sec
ms rpidamente y no se pudo expandir demasiado (Shogren y col., 1998). Adems, las
mismas presentaron numerosas cavidades o agujeros en sus superficies (C),
posiblemente causadas por burbujas de vapor o aire, que se contrajeron y se
rompieron durante el secado (Figura V.5.A.). Mientras que el interior de este tipo de
bandejas result menos denso, como una espuma, con celdas abiertas formadas al
escaparse el agua hacia el molde con la consecuente ruptura de las celdas (Glenn y
col., 2001; Shogren y col., 2002; Cinelli y col., 2006). En la micrografa del rea
transversal de la bandeja formada por almidn y fibras (Figura V.5.BI.), se observan
celdas no demasiado grandes, con las fibras esparcidas homogneamente en todo el
material. Lawton y col. (2004) describieron que las fibras de madera de lamo
reforzaron las espumas de almidn de maz, pero no se orientaron debido a las
caractersticas del proceso de produccin (foam baking). En la microscopa Figura
V.5.BII. correspondiente al rea transversal de la bandeja que contiene igual cantidad
de fibra pero con un 10% de protenas, se observa una mayor homogeneidad y
densidad que en la bandeja sin protenas (Figura V.5.BI.). La misma diferencia puede
ser observada en sus superficies (Figuras V.5.AI. y V.5.BI. respectivamente). En las
bandejas que incluyen protenas en su formulacin prcticamente no se observaron las
celdas abiertas interiores, y tampoco se lograron identificar zonas atribuibles a cada
componente. Este material es el que present las mejores propiedades mecnicas, una
menor absorcin de agua, un menor espesor y una mayor densidad. Al aumentar la
concentracin de protena a 20%, el interior de la bandeja cambi nuevamente su
aspecto (Figura V.5.BIII.) parecindose ms al de la bandeja 20F-0P, con celdas tal vez
an ms grandes. El interior no result homogneo, la regin S1 ms cerca de la
174
Captulo V
superficie present una apariencia ms esponjosa, mientras que hacia el interior las
paredes de las celdas ms grandes, fueron ms lisas (S2).
II
III
S1
S2
Figura V.5.: Microscopas electrnicas de barrido (SEM) A) superficiales (a 120X) y B)

transversales (a 50X) de las bandejas en estudio. Los nmeros I, II y III representan a
las bandejas 20F-0P, 20F-10P y 10F-20P, respectivamente. En esta figura se muestran
numerosas cavidades superficiales (C), mientras que en el interior se presentan zonas
con distinta apariencia (S1 y S2).
Conociendo la microestructura que presentan las pelculas proteicas y de almidn
obtenidas por casting (Mauri y col., 2006; Tapia-Blcido y col., 2007), estas zonas (S2)
podran ser atribuibles a una fase rica en protenas. En esa fase, las fibras se observan
bien arraigadas e impregnadas, seguramente reforzando a esa matriz. Probablemente
al aumentar la concentracin de protenas, estas interfieren en la formacin de la red
de almidn, lo que se refleja en una disminucin de la densidad y en la obtencin de
bandejas con peores propiedades mecnicas. Se conoce que los sistemas protenaspolisacridos
se
caracterizan
por
su
limitada
compatibilidad
entre
estos
175
Captulo V
macrocomponentes, resultando ocasionalmente en separacin de fases (Donald y col.,

1995; Arvanitoyannis y col., 1996; Arvanitoyannis y col., 1997; Grinberg y col., 1997).
Para estos sistemas, al agregar fibras de celulosa, estas se impregnaran
principalmente en la matriz proteica, mejorando las propiedades mecnicas sin afectar
la absorcin de agua.
V.3.4.- Efecto del contenido de fenoles sobre las propiedades de las bandejas
biodegradables
La obtencin de bandejas compuestas tambin se realiz utilizando como fuente de
protenas otros dos aislados proteicos de girasol (AiExA-P y AiExS-P) con menor
contenido de fenoles que Ai-P. Los resultados se presentan en el Anexo III. Los
materiales obtenidos presentaron el mismo comportamiento que las bandejas con AiP. Sus propiedades mecnicas tambin siguieron las tendencias descriptas
anteriormente, la tensin se increment con la adicin de fibras de celulosa, mientras
que la deformacin relativa disminuy al incrementar la concentracin de protenas en
la formulacin. El agregado de protenas de girasol a las bandejas, tambin disminuy
hasta en un 44% su capacidad de absorcin de agua, siendo las variaciones
significativas al adicionar 10% de AiExA-P o AiExS-P. Estas materias primas slo
afectaron significativamente el color de las bandejas obtenidas, las que adoptaron la
coloracin caracterstica de dichos aislados proteicos, segn se discuti anteriormente
(Captulo II, seccin II.3.2.). Adems, se observ que al aumentar el contenido de
protenas se produjo un incremento en los parmetros a y b, obtenindose bandejas
de color marrn; mientras que el valor de L disminuy, resultando as materiales ms
oscuros (con mayores E).
Estos resultados muestran que es posible obtener materiales rgidos biodegradables a
partir de almidn de mandioca y fibras de celulosa, y que al adicionarle 10% de aislado
proteico de girasol, disminuye su capacidad de absorcin de agua y mejoran sus
propiedades mecnicas en tensin. Estos materiales podran ser una alternativa al
empleo de bandejas de poliestireno expandido en algunas aplicaciones, sin embargo su
utilizacin an requiere estudios ms detallados
176
Captulo V
V.4.- Conclusiones
a.- Se obtuvieron bandejas biodegradables por foam baking a partir de almidn

de mandioca, aislado proteico de girasol y fibras de celulosa.
b.- La adicin de protenas de girasol a las bandejas de almidn y fibras de
celulosa produjo una importante reduccin en el contenido de agua post-prensado y la
capacidad de absorcin de agua, sin afectar significativamente otras propiedades.
c.- La formulacin que contiene 70% de almidn de mandioca, 20% de fibras de
celulosa y 10% de aislado proteico de girasol (Ai-P) fue la que exhibi las mejores
propiedades, incluyendo mxima resistencia y una notable reduccin en la absorcin
de agua. Estas caractersticas se corresponden su microestructura ms homognea y
compacta.
d.- El contenido de compuestos fenlicos presentes en los aislados proteicos de
girasol slo modific la coloracin de los materiales obtenidos.
e.- Los resultados informados en este trabajo muestran que estos materiales
representan una alternativa a las bandejas de poliestireno expandido, sin embargo su
utilizacin an requiere estudios ms detallados, considerando las necesidades
especficas de cada caso y la seguridad que cada alimento necesite.
177
Conclusiones generales
Conclusiones Generales
CONCLUSIONES GENERALES
Se encontr que el pellet de girasol, subproducto de la industria aceitera local, posee
un elevado contenido de protenas y carece de factores antinutricionales, por lo que
result apto para ser utilizado en la obtencin de productos proteicos para
alimentacin humana sin necesidad de recurrir al uso de tratamientos trmicos
intensos o bien precipitaciones isoelctricas y lavados para eliminarlos.
La baja solubilidad de las protenas presentes en el pellet junto con la presencia de
compuestos fenlicos fueron los problemas a resolver para obtener productos
proteicos de girasol con potenciales aplicaciones en la industria alimentaria y de
packaging.
En este trabajo se desarrollaron metodologas que permitieron producir concentrados
y aislados proteicos de girasol con diferente composicin, caractersticas y propiedades
fisicoqumicas. Empleando las metodologas que involucraron lavados con agua o con
solucin de sulfito de sodio previo a la extraccin proteica, se logr remover casi la
totalidad de los fenoles presentes y recuperar un porcentaje mayor de protenas que al
utilizar los lavados alcohlicos. Los productos proteicos as obtenidos presentaron
elevados porcentajes de solubilidad en agua, siendo sta una caracterstica importante
para su empleo como ingrediente funcional.
Estas metodologas fueron escaladas satisfactoriamente a planta piloto, logrando
obtener productos proteicos altamente solubles y con similar reduccin en el
contenido fenlico. Los productos obtenidos en planta piloto presentaron diferente
composicin qumica y polipeptdica, caractersticas y propiedades fisicoqumicas.
Como consecuencia de las diferencias sealadas se esperara que estos productos
exhiban diferente funcionalidad.
La presencia de compuestos fenlicos en los productos proteicos de girasol, tanto de
laboratorio como de planta piloto, afect su coloracin, pero no disminuy la
solubilidad en agua de sus protenas. Si bien todos estos productos presentaron
capacidad antioxidante, debido a la presencia estos compuestos, resulta necesario
178
realizar estudios ms exhaustivos, ya que este hecho permitira ampliar su campo de

aplicacin.
Se evaluaron las propiedades funcionales de los productos proteicos de girasol. Los
aislados de girasol presentaron baja capacidad de imbibicin de agua y moderada
capacidad de retencin de agua, debido a su elevada solubilidad. Al eliminar fenoles
las protenas sufrieron cambios conformacionales, evidenciados en mayores
hidrofobicidades superficiales, que favorecieron las interacciones protena-agua,
reflejndose en menores aw y mayores Q. Los productos proteicos de girasol obtenidos
en planta piloto fueron capaces de formar emulsiones, siendo stas ms estables en
medios con baja fuerza inica. Las propiedades emulsificantes de los aislados fueron
mejores que las de los correspondientes concentrados proteicos, y su estabilidad (t1/2)
se pudo correlacionar de manera directa, pero no unvoca, con la Ho de las protenas
presentes. Estos productos tambin presentaron buena capacidad para formar
espumas a distintos pHs y fuerzas inicas. Las mayores diferencias se encontraron en la
estabilidad de estos sistemas. Los concentrados proteicos formaron espumas ms
estables en medio cido, mientras que a pH neutro fueron ms estables las obtenidas
con los aislados proteicos. Si bien estos productos poseen buenas propiedades, an se
podra plantear la posibilidad de incrementar su funcionalidad por tratamientos fsicos,
qumicos o enzimticos.
Los aislados producidos en planta piloto fueron capaces de formar geles
autosoportables por induccin trmica, con distintas caractersticas y propiedades. La
presencia de compuestos fenlicos afect el aspecto visual de los geles obtenidos y
disminuy su dureza. Resultara importante la realizacin de estudios ms detallados
sobre las propiedades gelificantes de estos productos proteicos de girasol.
Adems se estudi la obtencin de materiales polimricos biodegradables y/o
comestibles a partir de protenas de girasol. Los aislados proteicos de girasol son
adecuados para la produccin de pelculas biodegradables flexibles por casting, con
propiedades mecnicas y de barrera en el orden de otras pelculas proteicas.
Modificando la formulacin inicial fue posible obtener materiales con distintas
propiedades. Dicha red proteica est formada mayoritariamente por puentes de
179
hidrgeno y uniones disulfuro, y estabilizada en menor medida, por interacciones

hidrofbicas e inicas. Se logr mejorar su WVP por formacin de pelculas bicapa con
cera de abejas, sin embargo bajo las condiciones experimentales estudiadas no se
logr reforzar la matriz proteica por agregado de celulosa microcristalina. El contenido
de compuestos fenlicos remanentes en los aislados, adems de modificar el color y la
opacidad de las pelculas, le confiri propiedades antioxidantes a la pelcula,
activndola naturalmente. Sera importante ajustar la metodologa de obtencin de
pelculas a partir de concentrados proteicos, dado su mayor contenido de fenoles es
esperable que sus propiedades antioxidantes aumentan.
Tambin se obtuvieron bandejas biodegradables por foam baking a partir de almidn
de mandioca, aislado proteico de girasol y fibras de celulosa, que podran ser utilizadas
como sustitutos de las bandejas de poliestireno para algunas aplicaciones. La adicin
de protenas de girasol a las bandejas de almidn y fibras de celulosa produjo una
importante reduccin en el contenido de agua post-prensado y la capacidad de
absorcin de agua, sin afectar significativamente otras propiedades. La formulacin
que contena 70% de almidn de mandioca, 20% de fibras de celulosa y 10% de aislado
proteico de girasol (Ai-P) fue la que exhibi las mejores propiedades, incluyendo
mxima resistencia y una notable reduccin en la absorcin de agua. Estas
caractersticas se corresponden su microestructura ms homognea y compacta. El
contenido de compuestos fenlicos presentes en los aislados proteicos de girasol slo
modific la coloracin de los materiales obtenidos. Estos materiales representan una
alternativa a las bandejas de poliestireno expandido, sin embargo su utilizacin an
requiere estudios ms detallados, considerando las necesidades especficas de cada
caso y la seguridad que cada alimento necesite.
Estos estudios muestran:

- que el pellet de girasol de la industria aceitera local, actualmente utilizado para
alimentacin animal, constituye una materia prima interesante por su rica composicin
en protenas de buena calidad y por la ausencia de factores antinutricionales.
180
- que es posible a travs de procesos relativamente sencillos obtener productos

enriquecidos en protenas: aislados o concentrados, a escala de laboratorio e industrial
(probado en planta piloto).
- que independientemente de la cantidad de compuestos fenlicos que estos
productos retengan presentan altas solubilidades en agua, lo que los hace atractivos
para algunas aplicaciones:
i) como ingredientes alimentarios: Ya que
presentan la capacidad de formar y estabilizar espumas y emulsiones, aun a pH cidos
que son los que tienen la mayora de los alimentos. As como la de formar geles por
induccin trmica.
ii) como materias primas para la formacin de
materiales biodegradables y /o comestibles flexibles y rgidos aplicables en packaging
de alimentos o en plsticos para la agricultura.
- que la presencia de estos compuestos fenlicos adems le otorgan propiedades
antioxidantes a estos productos proteicos, hoy muy revalorizadas. En particular
interesantes para la formacin de recubrimientos comestibles.
- que las propiedades funcionales resultantes de estos productos todava pueden
optimizarse ya sea por modificacin estructural de las protenas, as como por
variaciones en las formulaciones o por modificaciones en las tcnicas utilizadas para la
formacin de las espumas, de las emulsiones o de los materiales.
Los resultados obtenidos en este trabajo tanto por los rendimientos del proceso como
por las propiedades funcionales estudiadas muestran que los productos enriquecidos
en protenas de girasol podran emplearse en la elaboracin de productos de mayor
valor agregado de la misma manera que actualmente se emplean las protenas de soja.
181
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198
Anexos
Anexo I
Anexo I: Cuantificacin de compuestos fenlicos en productos proteicos de girasol
AI.1.- Introduccin
Una particularidad del pellet de girasol es que posee un elevado contenido de
compuestos fenlicos, siendo el cido clorognico (CGA: cido 5-cafeil-qunico) el ms
abundante. Tambin se han reportado importantes cantidades sus productos de
hidrlisis: cido cafeico (CA) y cido qunico (QA), as como tambin cantidades
minoritarias de los cidos p-cumrico, isoferlico, ferlico, sinpico y trans-cinmico
(Sabir y col., 1974; Lawhon y col., 1982; Sastry y col., 1984).
Existen varios mtodos que permiten cuantificar compuestos fenlicos, entre ellos
podemos citar: espectroscopa en el ultravioleta (UV), colorimetra Folin-Ciocalteu y
cromatografa lquida de alta performance en fase reversa (RP-HPLC).
Las tcnicas espectrofotomtricas fueron las que primero se desarrollaron, basndose
en que la estructura base de estos compuestos es un anillo aromtico y que, por lo
tanto, presentan absorbancia en el UV entre 200 y 400 nm. En esta zona del espectro
tambin absorben protenas y cidos nucleicos, por lo que podran interferir en este
mtodo. En la bibliografa se ha reportado el uso de esta metodologa para la
cuantificacin de cido clorognico en caf y papas (Moore y col., 1948; Dao y col.,
1992).
Otra tcnica ampliamente utilizada para cuantificar fenoles totales es la colorimetra
de Folin-Ciocalteu. En este mtodo, se lleva a cabo la reaccin de oxidacin de los
grupos fenlicos presentes empleando los cidos fosfomolbdico y fosfotngstico,
producindose un producto coloreado que absorbe a 760 nm (Singleton y Rossi, 1965).
En este caso hay que tener presente que la reaccin detecta todos los grupos fenlicos
presentes en el extracto, incluidos los de las protenas, por lo que deben tomarse
recaudos para disminuir esta interferencia. Adems los compuestos con capacidad
reductora, como azcares reductores, cido ascrbico y sulfito de sodio entre otros,
interfieren en esta determinacin. (Prior y col., 2005).
199
Anexo I
Mediante cromatografa RP-HPLC es posible lograr la separacin de los compuestos

fenlicos segn su tamao e hidrofobicidad y adems se pueden cuantificar, por
ejemplo, utilizando un detector de fotodiodo UV (Dreher y col., 1983; Gonzlez-Prez y
col., 2002). Esta metodologa presenta mayor sensibilidad que los mtodos
espectrofotomtricos y colorimtricos, pero sus costos fijos y operativos son ms
elevados, justificndose su empleo cuando es imprescindible conocer el perfil fenlico
de la muestra en estudio. La gran ventaja de este mtodo es que se evitan las
interferencias antes mencionadas, ya que incluye una etapa de separacin de los
distintos compuestos que interfieren en la cuantificacin de los fenoles.
Conociendo los fundamentos y las limitaciones de cada mtodo, y sabiendo que la
cantidad de fenoles informada depende, entre otras variables, de la complejidad de la
muestra en estudio y de la metodologa de anlisis empleada (Dreher y col., 1983),
resulta necesario contar con un mtodo confiable para su cuantificacin.
El objetivo planteado en esta seccin fue evaluar la metodologa a utilizar en la
cuantificacin de compuestos fenlicos en productos proteicos de girasol.
AI.2.- Materiales y mtodos

La determinacin de compuestos fenlicos se realiz por tres mtodos diferentes:
espectroscopa UV, colorimetra Folin-Ciocalteu y cromatografa RP-HPLC. Las muestras
slidas (concentrados) se solubilizaron en agua (1 mg/ml), mientras que las lquidas
(extractos fenlicos) se procesaron tal cual.
Espectroscopa en UV: Se sigui el protocolo propuesto por Moores y col. (1948). Se

realizaron diluciones de las muestras en buffer fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,5, y se
registr el espectro UV entre 200 y 400 nm en un espectrofotmetro (Beckman DU
650 Spectrophotometer, Estados Unidos). Tambin se obtuvieron los espectros UV de
los patrones fenlicos: cidos clorognico (CGA, Chemika Fluka, Alemania), cido
cafeico (CA, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) y cido qunico (QA,
Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos); y de seroalbmina bovina (BSA,
200
Anexo I
Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos), empleada como patrn de
protenas. La cuantificacin de fenoles se realiz a partir de los valores de absorbancia
obtenidos a 324-328 nm, emplendose soluciones de cido clorognico de 0,1 a 0,5
mg/ml, como patrn.
Colorimetra Folin-Ciocalteu: Se sigui el protocolo descripto por Singleton y col.

(1965). Se tomaron 50 l de la muestra correspondiente y se le adicionaron 600 l de
agua destilada y 100 l de reactivo de Folin (1N) (Anedra, Argentina). Se dej a
temperatura ambiente durante 3 minutos y luego se agregaron 750 l de solucin de
Na2CO3 20% p/v (Anedra, Argentina). Despus de una hora se midi la absorbancia a
760 nm (Beckman DU 650 Spectrophotometer, Estados Unidos). En el caso de
concentrados y aislados, previo a la determinacin se realiz una precipitacin de las
protenas por agregado de cido tricloroactico (TCA, Anedra, Argentina) hasta una
concentracin final de 8%. Las protenas se separaron por centrifugacin a 18000 xg
durante 15 minutos a temperatura ambiente (A15, B. Braun Biotech Intenational,
Estados Unidos), y el sobrenadante se neutraliz con NaOH 1N y se tom como la
muestra correspondiente. Para la cuantificacin de fenoles se emplearon soluciones de
CGA (de 0,1 a 0,5 mg/ml) como patrn.
Cromatografa RP-HPLC: Se tom 1 ml de la muestra correspondiente, se filtr con

membrana (0,2 m) y 10 l del filtrado se inyectaron en una columna Symmetry C18
(4,6 x 150 mm, 5 m, 100 ) equilibrada con la mezcla A (4% CH3COOH; 6% CH3OH;
90% H2O). Se emple un cromatgrafo Waters Millipore con un arreglo de fotodiodos
como detector (996 Photodiode Array Detector). La separacin se realiz a
temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 0,95 ml/min, emplendose la
mezcla A y la B (4% CH3COOH, 90% CH3OH, 6% H2O). Las condiciones utilizadas fueron:
5 minutos de 100% A, gradiente lineal de 100% A a 70% A en 10 minutos, elucin
isocrtica por 10 minutos, gradiente lineal de 70% A a 100% B en 10 minutos, elucin
isocrtica por 10 minutos, gradiente lineal de 100% B a 100% A en 20 minutos. Se
registr la absorbancia a 280 y 324 nm en funcin del tiempo de retencin. Para la
201
Anexo I
cuantificacin de fenoles se utilizaron los valores obtenidos a 324 nm. Patrones de

CGA, CA y QA fueron separados en las mismas condiciones que las muestras. Se
construy una curva de calibracin graficando rea del pico con tiempo de retencin
de 15 minutos (UA) vs. la concentracin del patrn CGA. Para la cuantificacin de
fenoles totales, se sumaron todas las reas de los picos con absorbancia a 324 nm y se
expresaron como CGA.
En todos los casos, las determinaciones se hicieron, como mnimo, por duplicado.
Anlisis estadstico: los resultados se expresaron como valor medio desviacin

estndar y fueron analizados mediante anlisis de varianza (ANOVA). Las medias
fueron evaluadas por el Test de Fisher de las mnimas diferencias significativas para
comparacin de pares, con un nivel de significacin =0.05. Para ello se emple el
programa Statgraphics plus, versin 5.1 (Statgraphics, Estados Unidos).
AI.3.- Resultados y Discusin

Cuantificacin de fenoles por espectroscopa UV: Los espectros UV caractersticos de
CGA, CA y QA, usados como patrones de compuestos fenlicos, y de seroalbmina
bovina (BSA), empleada como patrn de protenas, se muestran en la Figura AI.1.a. All
se puede apreciar que el CGA present un pico de absorcin mxima a 324 nm,
mientras que a esta longitud de onda no absorbieron el QA ni las protenas. El CA
posee un mximo a 310 nm que contribuye a la absorbancia determinada a 324 nm.
Por lo tanto, al emplear la deteccin a 324 nm estamos cuantificando fenoles totales principalmente CGA, pero tambin CA-, sin interferencia de las protenas.
Por otra parte, se observ que dependiendo del solvente en donde se encuentre el
CGA, su pico de absorcin mxima se puede desplazar de 324 nm cuando se emplea
agua a 328 nm cuando se emplean alcoholes, por ejemplo etanol, metanol o butanol.
Otra caracterstica distintiva del CGA puro es que en su espectro UV posee un mnimo
de absorcin a 260 nm (Figura AI.1.A.). Este comportamiento tambin es posible
observarlo en el espectro UV del primer extracto acuoso para eliminar fenoles, que se
202
Anexo I
le realiz al pellet, sugirindonos la extraccin de fenoles libres (Figura AI.1.B.). Sin

embargo, el espectro del CoExA-L (Figura AI.1.b.) presenta un mximo en dicha
longitud de onda, que correspondera a la interaccin de protenas y fenoles (Venktesh
y col., 1993).
3,0
2,5
Absorbancia
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
200
250
300
350
400
Longitud de Onda (nm)
3,0
2,5
Absorbancia
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
200
225
250
275
300
325
350
375
400
Longitud de onda (nm)
Figura AI.1.: A) Espectros UV (=200-400 nm) de los patrones que se utilizaron en la

cuantificacin de compuestos fenlicos: CGA (), CA () y QA (), y protenas: BSA
(). B) Espectros UV del primer extracto fenlico acuoso realizado sobre el pellet de
girasol () y CoExA-L ().
203
Anexo I
Finalmente, en la Figura AI.1.A. tambin es posible apreciar que los compuestos

fenlicos (CGA y CA) interfieren cuando se dosa protenas midiendo absorbancia a 280
nm, resultando en una sobreestimacin del contenido proteico real. En todos los
espectros se observan picos a longitudes de onda menores a 250 nm, caractersticos
de los dobles enlaces, entre otros.
Cuantificacin de fenoles por colorimetra Folin-Ciocalteu: Las protenas interfieren en

este mtodo debido a la presencia de residuos de aminocidos aromticos (tirosina,
triptfano y fenilalanina), resultando necesario eliminarlas del medio, por ejemplo
precipitndolas con cido tricloroactico (TCA). Sin embargo, al precipitarlas tambin
se eliminan los compuestos fenlicos que estaban interaccionando con ellas, teniendo
una estimacin de su contenido por defecto.
Cuantificacin de fenoles por cromatografa RP-HPLC: Los cromatogramas RP-HPLC de

la separacin de los patrones de CGA, CA y QA se muestran en la Figura AI.2.A. En ella
se pueden ver que el CGA eluy a 15,1 minutos y el CA lo hizo a 18,3 minutos, mientras
que el QA no se pudo cuantificar por este mtodo, por no absorber en el UV. En la
Figura AI.2.B. se muestran los cromatogramas (a 280 y 324 nm) del primer extracto
fenlico acuoso realizado sobre el pellet molido de girasol. En ella se puede apreciar la
presencia de dos picos que corresponderan a CGA y CA en base a sus tiempos de
retencin, representando el 75% y el 19% de los fenoles totales respectivamente.
Tambin es posible observar la presencia de varios picos cuya absorbancia a 324 nm es
superior que a 280 nm, y que corresponderan tambin a compuestos fenlicos que no
hemos identificado. De estos picos se pueden diferenciar dos grupos, uno con menores
tiempos de elucin (entre 4 y 8 minutos, marcados como 1) que corresponderan a
fenoles que eluyen libres, posiblemente ismeros de posicin del CGA (Fujioka y col.,
2008); y otro con mayores tiempos de elucin (entre 27 y 32 minutos, marcados como
2) posiblemente fenoles libres con mayor tamao o hidrofobicidad, o fenoles
unidos a protenas, ya que stas eluyen entre 27 y 40 minutos (presentando mayor
204
Anexo I
absorbancia a 280 nm). Los fenoles pertenecientes al primer grupo representan el

2,5%, mientras que los que se encuentran dentro del segundo constituyen el 3,5% de
los compuestos fenlicos totales presentes en este extracto.
1,5
100
1,4
90
1,3
1,2
80
1,0
70
0,9
60
UA
0,8
0,7
50
0,6
40
0,5
30
0,4
0,3
cido Clorognico
cido Cafeico
cido Qunico
0,2
0,1
Gradiente B (%)
1,1
20
10
0,0
0
0
10
15
20
25
30
35
40
tiempo (minutos)
UA
CGA
CA
1
0
2
10
15
20
25
30
35
40
tiempo de elucin (min)
Figura AI.2.: A) Cromatograma RP-HPLC con detector UV (=324 nm) de los patrones
que se utilizaron en la cuantificacin de fenoles -CGA (), CA () y QA ()-, y el
gradiente empleado en la elucin de las muestras (- - -) (Solucin A: cido actico: 4%,
metanol: 6%, agua: 90%. Solucin B: cido actico: 4%, metanol: 90%, agua: 6%). B)
Cromatograma RP-HPLC con detector UV -a 280 nm () y a 324 nm ()- del primer
extracto fenlico acuoso realizado sobre el pellet molido de girasol.
205
Anexo I
Comparacin de las metodologas: Para comparar las metodologas descriptas, se

solubilizaron en agua distintos concentrados proteicos de girasol: Co-L, CoExA-L,
CoExS-L, CoExE-L y CoExM-L. Posteriormente, los fenoles se cuantificaron por
espectroscopa UV (a 324 nm), colorimetra Folin-Ciocalteu (F-C) y cromatografa RPHPLC. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla AI.1. En ella se puede observar
que para los concentrados acuosos Co-L y CoExA-L, UV y F-C no presentaron
diferencias estadsticamente significativas. Mientras que en las otras muestras (CoExSL, CoExE-L y CoExM-L) el contenido de fenoles determinado por F-C fue mayor que el
encontrado por UV. Este hecho se podra explicar debido a interferencias en F-C
producidas por la presencia de componentes con caractersticas reductoras, por
ejemplo, el sulfito de sodio residual en CoExS-L o los azcares reductores en CoExE-L y
CoExM-L (en mayor concentracin que en Co-L).
Tabla AI.1.: Contenido de compuestos fenlicos presentes en concentrados proteicos

de girasol evaluados por espectroscopa UV, colorimetra Folin-Ciocalteu (F-C) y
cromatografa RP-HPLC.
Contenido de compuestos fenlicos (mg/ml)
Co-L
CoExA-L
CoExS-L
CoExE-L
CoExM-L
UV
0,495 0,008c
0,245 0,007c
0,175 0,009b
0,105 0,007c
0,105 0,007c
F-C
0,465 0,021c
0,235 0,007c
0,540 0,014d
0,215 0,007d
0,245 0,009d
RP-HPLC Total
0,355 0,010b
0,214 0,007b
0,203 0,009c
0,076 0,002b
0,072 0,002b
RP-HPLC CGA
0,195 0,008a
0,056 0,007a
0,041 0,008a
0,018 0,001a
0,018 0,001a
Por otra parte, los valores de CGA informados por RP-HPLC representan el 55% de los
fenoles totales presentes en Co-L, en concordancia con lo informado por Sastry y col.
(1984). Mientras que en las otras muestras, el CGA representa entre el 20-26% de los
fenoles totales. An as, se obtiene que los valores de fenoles totales informados por
UV sobreestiman los valores encontrados con RP-HPLC, excepto en CoExS-L. Dreher y
206
Anexo I
col. (1983) tambin informaron un comportamiento anlogo al comparar el contenido

de fenoles detectado por UV o RP-HPLC en extractos acuosos realizados sobre harinas
desgrasadas de girasol. Por lo tanto, al cuantificar fenoles por espectroscopa UV
estamos sobreestimando el valor real, siendo ste entre 12 y 30% menor,
dependiendo de la muestra analizada.
AI.4.- Conclusiones
A partir de estas observaciones, se seleccion la espectroscopa UV como metodologa
para la cuantificacin de los fenoles presentes en los productos proteicos de girasol
estudiados en este trabajo de tesis, debido a que es una tcnica reproducible, rpida,
sencilla y de bajo costo, teniendo en cuenta sus limitaciones. La tcnica de RP-HPLC se
emple para comprobar la existencia de interacciones entre los compuestos fenlicos
y las protenas. Folin-Ciocalteu se descart por presentar mayor cantidad de
interferencias.
207
Anexo II
Anexo II: Balances de materia del proceso de obtencin de concentrados y aislados

proteicos de girasol en planta piloto
AII.1.- Objetivo
En este anexo se presentan los balances de materia de los procesos de obtencin de
concentrados y aislados proteicos de girasol a partir del pellet residual de la industria
aceitera local, en escala de planta piloto. El objetivo de esta seccin fue evaluar la
prdida de protenas y la eliminacin de compuestos fenlicos, permitindonos
optimizar los procesos desarrollados.
AII.2.- Materiales y Mtodos

Se realizaron los protocolos detallados en el (Captulo II, seccin II.2.2.), representados
esquemticamente en la Figura II.1. En cada una de las etapas del proceso (extraccin
de fenoles -EF1, R1, EF2 y R2-, solubilizacin de protenas -EP1, RP1, EP2, RP2 y
EP1+EP2-, precipitacin isoelctrica -PP1 y S1-, lavado -PP2 y S2-, resuspensin -PR-) se
determinaron los porcentajes de slidos totales (AOAC 935.29) y protenas (AOAC
920.53). La cantidad de compuestos fenlicos se determin slo en las muestras
lquidas mediante espectroscopa en el UV (=324 nm) segn Moores y col. (1948),
como se detall en el Anexo I. Todas las determinaciones se realizaron como mnimo
por duplicado.
Los porcentajes de prdida de protenas y de eliminacin de fenoles se calcularon
respecto al contenido inicial de estos componentes en el pellet molido de girasol.
AII.3.- Resultados y Discusin

En las Figuras AII.1 se muestran los porcentajes (en base seca) de protenas (AII.1.A.) y
de compuestos fenlicos (AII.1.B.) presentes en cada una de las etapas. Mientras que
la prdida de protenas y la eliminacin de fenoles en los extractos fenlicos (EF1 y
208
Anexo II
EF2) y en los sueros (S1 y S2) se muestran en las Figuras AII.2.A y AII.2.B
respectivamente.
Contenido de Protenas (% base seca)
Contenido de Fenoles (% base seca)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
14
12
10
8
6
4
2
0
Figura AII.1.: Porcentajes (en base seca) de A) protenas y B) fenoles en cada una de las
etapas de los procesos de obtencin de productos proteicos de girasol en planta
piloto: sin extraccin de fenoles ( ), extraccin de fenoles con agua ( ) Na2SO3 0,1
%p/v ( ). Se muestran promedios desviacin estndar.
En la Figura AII.1.A. se puede observar que, para la produccin de Ai-P, el porcentaje

de protenas en los residuos de las extracciones proteicas (RP1 y RP2) fue
disminuyendo, mientras que en los extractos proteicos (EP1 y EP2), las protenas
representaron el 46% y 56%, respectivamente. En la segunda extraccin proteica se
209
Anexo II
extrajo menor cantidad de slidos, entre el 25% y 30% de lo obtenido en EP1, siendo
mayoritariamente protena. Por lo que la cantidad de protenas aportada por el EP2
represent entre 10-15% del total de las protenas presentes en el pellet, mejorando
as los rendimientos obtenidos. Tambin se observa que durante las etapas de
precipitacin isoelctrica y lavado del precipitado se produjo un incremento en el
porcentaje de protenas, debido a la eliminacin de slidos en el suero (S1 y S2). En
ambas etapas se perdi menos del 4% de las protenas totales (Figura AII.2.A.), valor
coincidente con la cantidad de protenas solubles en cercanas del punto isoelctrico
que se describi anteriormente (Captulo I, Figura I.2.). Respecto al balance para los
compuestos fenlicos (Figura AII.1.B.), se puede apreciar que durante la solubilizacin
de protenas parte de los fenoles presentes en el pellet las acompaaron; pero
aproximadamente el 65% de estos se eliminaron durante la precipitacin isoelctrica y
el lavado del precipitado proteico (S1 y S2, en Figura AII.2.B.).
Cuando se analizan los procesos destinados a eliminar fenoles, se puede observar que
en los extractos EF1 y EF2, entre el 7% y 10% de los slidos removidos fueron
compuestos fenlicos. En estas etapas, a pesar de estar trabajando a pH 5 (cercano a
su pI) tambin se removieron protenas (entre 15-20% de las protenas totales, EF1 y
EF2 en Figura AII.2.A.). Como es de esperar, en los residuos fenlicos (R1 y R2) el
porcentaje de protenas disminuy. Mientras tanto, el porcentaje de fenoles presentes
en los extractos proteicos fue menor a los informados para Ai-P, debido a que parte de
estos compuestos ya fueron eliminados en las etapas previas (entre 80 y 84%, EF1 y
EF2 en Figura AII.2.B.). Finalmente, cuando se realizaron las etapas de precipitacin
isoelctrica y lavado del precipitado, tambin se eliminaron fenoles, entre 7-8% y 2-3%
respectivamente (S1 y S2 en Figura AII.2.B.). Considerando las muestras EP1+EP2 y PR,
que corresponden a los concentrados y aislados proteicos antes de alimentar el
secador spray, se puede observar que los porcentajes de protenas y de compuestos
fenlicos informados en la Tabla II.1. coinciden con los presentados en el seguimiento
de los procesos, con diferencias del 10%, aceptables desde el punto de vista ingenieril.
210
Anexo II
Prdida de protenas (%)
20
15
10
Eliminacin de fenoles (%)
EF1
EF2
S1
S2
EF1
EF2
S1
S2
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Figura AII.2.: Porcentajes de A) prdida de protenas y B) eliminacin de fenoles en los

extractos fenlicos (EF1 y EF2) y en los sueros provenientes de la precipitacin
isoelctrica (S1) y del lavado del precipitado (S2) durante los procesos de obtencin de
productos proteicos de girasol en planta piloto: sin extraccin de fenoles ( ),
extraccin de fenoles con agua ( ) Na2SO3 0,1 %p/v (
). Los porcentajes fueron
calculados respecto al contenido de protenas o fenoles presentes en el pellet, en

todos los casos se muestran los promedios desviacin estndar.
AII.4.- Conclusiones
Se encontr que en los lavados con agua o solucin de sulfito de sodio se extraen entre
80-84% de los fenoles iniciales. Las etapas de precipitacin isoelctrica y lavado del
precipitado ayudan a reducir el contenido de fenoles inicial (10% 65%) dependiendo
del proceso. Adems, se observ que durante los lavados destinados a eliminar
211
Anexo II
fenoles, se pierde entre 15-20% del total de las protenas, mientras que en los sueros,
dicho valor no supera el 4%. Sin embargo, la segunda extraccin proteica aporta entre
10-15% de protenas.
212
Anexo III
Anexo III: Materiales compuestos, rgidos y biodegradables obtenidos a partir de

almidn de mandioca, fibras de celulosa y aislados proteicos de girasol con menor
contenido de fenoles
AIII.1.- Objetivo
En el Captulo V de esta tesis se estudi la obtencin y caracterizacin de materiales
compuestos, rgidos y biodegradables a partir de almidn de mandioca, fibras de
celulosa y protenas de girasol provenientes del aislado proteico Ai-P. En esta seccin
se estudi el efecto del agregado de aislados proteicos de girasol con menor contenido
de fenoles sobre las propiedades de las bandejas obtenidas.
AIII.2.- Materiales y Mtodos

Las bandejas se obtuvieron y caracterizaron segn la metodologa descripta en el
Captulo V (seccin V.2.). En este caso se emplearon como fuente de protenas dos
aislados proteicos de girasol, AiExA-P y AiExS-P, con menor contenido de fenoles que
Ai-P.
AIII.3.- Resultados y Discusin

Los espesores, densidades y contenidos de humedad de los materiales obtenidos se
muestran en la Tabla AIII.1. Se puede observar que las bandejas con los aislados
proteicos de girasol con menor contenido de fenoles (AiExA-P y AiExS-P) presentaron
espesores entre 1,57 y 1,76 m, densidades entre 0,45 y 0,59 g/cm 3 y contenidos de
humedad entre 9,47 y 10,68%; y mostraron similar comportamiento que las bandejas
con Ai-P.
213
Anexo III
Tabla AIII.1.: Espesor, densidad y contenido de humedad de las bandejas obtenidas.

Espesor (mm)
Densidad (g.cm-3)
Humedad (%)
10F-0P
1,6298 0,0987c,d
0,482 0,043a,b,c
10,81 0,01i
15F-0P
1,6197 0,0650c
0,518 0,042c,d,e
10,58 0,04h
20F-0P
1,6932 0,1480e,f
0,476 0,044a,b,c
10,35 0,12g
10F-10P
1,7324 0,0946f,g
0,514 0,040c,d,e
10,68 0,15h,i
15F-10P
1,6162 0,0811c
0,505 0,025b,c,d
10,28 0,11f,g
20F-10P
1,6006 0,0597b,c
0,495 0,034b,c,d
9,47 0,39a
10F-20P
1,5649 0,0681a,b
0,526 0,064c,d,e
10,31 0,13g
15F-20P
1,6880 0,0864e
0,517 0,037c,d,e
10,06 0,05d,e
20F-20P
1,7668 0,0607g
0,434 0,023a
10,03 0,18c,d
10F-10P
1,5470 0,1141a
0,595 0,010f
10,00 0,07c,d
15F-10P
1,7113 0,1051e,f
0,501 0,029b,c,d
9,63 0,16b
20F-10P
1,7122 0,0774e,f
0,550 0,037d,e,f
9,60 0,13a,b
10F-20P
1,6725 0,0561d,e
0,567 0,019e,f
10,40 0,08g
15F-20P
1,6318 0,0526c,d
0,450 0,058a,b
9,90 0,07c
20F-20P
1,6392 0,0520c,d
0,551 0,048d,e,f
10,17 0,12e,f
Muestras
Control sin
protenas
10 % de
AiExA-P
20% de
AiExA-P
10% de
AiExS-P
20% de
AiExS-P
En la Tabla AIII.2. se presentan los resultados correspondientes a la capacidad de

absorcin de agua de estos materiales. Se observ que el agregado de protenas de
girasol a las bandejas, disminuy hasta en un 44% su capacidad de absorcin de agua,
siendo las variaciones significativas al adicionar 10% de AiExA-P o AiExS-P. Este
comportamiento fue similar al presentado por las bandejas con Ai-P. Sus propiedades
mecnicas, presentadas en la Tabla AIII.2. tambin siguieron las tendencias descriptas
anteriormente, para Ai-P, la tensin se increment con la adicin de fibras de celulosa,
mientras que la deformacin relativa disminuy al incrementar la concentracin de
protenas en la formulacin.
214
Anexo III
Tabla AIII.2.: Absorcin de agua, tensin a ruptura y deformacin relativa de las

bandejas obtenidas.
Muestras
Control sin
protenas
10 % de
AiExA-P
20% de
AiExA-P
10% de
AiExS-P
20% de
AiExS-P
Absorcin de agua
(g agua/g bandeja)
Tensin a ruptura
(MPa)
Deformacin
relativa (%)
10F-0P
0,38 0,03f
5,39 1,07a,b
0 ,076 0,013b,c,d,e
15F-0P
0,51 0,01h
6,18 1,10b,c,d,e,f
0,084 0,020e
20F-0P
0,44 0,01g
5,84 1,58a,b,c,d,e
0,082 0,001d,e
10F-10P
0,28 0,03b,c
5,53 0,61a,b,c
0,067 0,003b
15F-10P
0,32 0,04d,e
5,65 1,05a,b,c,d
0,081 0,013c,d,e
20F-10P
0,32 0,03d,e
5,50 0,73a,b,c
0,069 0,001b,c,d
10F-20P
0,24 0,01a
5,87 0,83a,b,c,d,e
0,051 0,003a
15F-20P
0,28 0,02b,c
6,38 0,89d,e,f
0,069 0,0016b,c,d
20F-20P
0,32 0,04d,e
5,28 0,48a
0,068 0,001b,c
10F-10P
0,33 0,01e
5,54 0,94a,b,c
0,065 0,003b
15F-10P
0,29 0,02c,d
5,26 0,73a
0,065 0,001b,c
20F-10P
0,25 0,04a,b
6,40 0,71d,e,f
0,068 0,001b,c
10F-20P
0,27 0,02a,b,c
6,23 0,36c,d,e,f
0,066 0,001b
15F-20P
0,34 0,02e
6,45 0,93e,f
0,067 0,020b
20F-20P
0,25 0,03b,c,d
6,74 0,81f
0,070 0,001b,c,d
Los distintos aislados proteicos de girasol empleados slo afectaron significativamente

el color de las bandejas obtenidas, las que adoptaron la coloracin caracterstica de
dichos productos proteicos, segn se discuti anteriormente (Captulo II, seccin
II.3.2.). Los parmetros de color Hunter-Lab de las bandejas se presentan en la Tabla
AIII.3. Las bandejas de almidn de mandioca y fibras de celulosa poseen una leve
coloracin amarillenta (b levemente positivos). Al aumentar el contenido de protenas
se produjo un incremento en los parmetros a y b, obtenindose bandejas de color
marrn; mientras que el valor de L disminuy, resultando as materiales ms oscuros
215
Anexo III
(con mayores E). Las bandejas con AiExS-P poseen menor coloracin (menor E) que
las de AiExA-P.
Tabla AIII.3.: Parmetros de color Hunter-Lab de las bandejas biodegradables

obtenidas.
Muestras
Control
sin
protenas
10F-0P
88,68 0,42j
0,03 0,07c
6,77 0,27a
9,99 0,47a
15F-0P
87,57 0,71i
0,10 0,14c
7,48 0,32b
11,32 0,63b
20F-0P
89,43 0,33j
-0,20 0,07b
7,49 0,35b
9,78 0,40a
10 % de
AiExA-P
10F-10P
54,30 1,20d
0,06 0,34c
11,84 0,75e
44,18 1,15h
15F-10P
56,26 1,19e
0,33 0,47d,e
12,53 0,64f
42,45 1,19g
20F-10P
58,53 1,06f
-0,44 0,12a
11,01 0,43c
39,88 0,98e
10F-20P
46,51 1,02a
0,21 0,34c,d
11,35 0,48c,d
51,70 0,93l
15F-20P
50,60 1,54b
-0,20 0,12b
11,60 0,40d,e
47,74 1,44j
20F-20P
52,13 1,09c
0,45 0,14e
11,40 0,44c,d
46,16 1,00i
10F-10P
59,14 0,99f
3,34 0,26g
16,10 0,26i
40,91 1,01f
15F-10P
62,27 1,44g
2,82 0,16f
15,47 0,28h
37,73 1,43d
20F-10P
64,00 0,41h
2,67 0,05f
14,85 0,39g
35,89 0,42c
10F-20P
50,27 1,00b
4,52 0,11j
15,98 0,40i
49,35 0,86k
15F-20P
53,93 0,85d
3,90 0,22i
15,89 0,31i
45,78 0,86i
20F-20P
56,10 1,28e
3,63 0,20h
15,45 0,40h
43,58 1,29h
20% de
AiExA-P
10% de
AiExS-P
20% de
AiExS-P
AIII. 4.- Conclusiones

Estos resultados muestran que la presencia de compuestos fenlicos residuales en los
distintos aislados proteicos de girasol slo modific significativamente el color de los
materiales rgidos biodegradables obtenidos a partir de almidn de mandioca y fibras
de celulosa.
216

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Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Exactas

Protenas de Girasol: aislamiento, caracterizacin

Tesista: Ing. Qco. Pablo Salgado

Directores: Dra. Adriana Mauri

El presente trabajo de tesis, para optar por el ttulo de Doctor de la Facultad de

Aldo, Daniel, Javier, Claudio y Arturo, por el apoyo tcnico.

Lo importante no es llegar, lo importante es el camino (Fito Pez).

afectaron mayoritariamente la estabilidad de estos sistemas, debido a que las

Captulo I: OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE

I.2.- Materiales y Mtodos

I.3.- Resultados y Discusin

molido de girasol en funcin del pH

Captulo II: PRODUCCIN DE PRODUCTOS PROTEICOS DE GIRASOL EN PLANTA

II.2.- Materiales y Mtodos

II.3.- Resultados y Discusin

Captulo III: PROPIEDADES FUNCIONALES y ANTIOXIDANTES DE PRODUCTOS

III.2.- Materiales y Mtodos

III.2.4.- Propiedades funcionales dependientes de la interaccin

III.3.- Resultados y Discusin

Captulo IV: PELCULAS FLEXIBLES, BIODEGRADABLES Y COMESTIBLES

IV.2.- Materiales y Mtodos

IV.3.- Resultados y Discusin

Captulo V: MATERIALES COMPUESTOS, RGIDOS Y BIODEGRADABLES

V.2.- Materiales y Mtodos

V.3.- Resultados y Discusin

Anexo I: Cuantificacin de compuestos fenlicos en productos proteicos de

Anexo II: Balances de materia del proceso de obtencin de concentrados y

Anexo III: Materiales compuestos, rgidos y biodegradables obtenidos a partir de

1.- Historia del cultivo de girasol

2.- Importancia econmica del girasol en Argentina

impactaron fuertemente en los sistemas de produccin pecuaria, surgiendo la

Figura 1.: Produccin nacional ( ), exportacin ( ) y consumo interno ( ) de A) aceite

Durante la campaa 2007/2008, Argentina se posicion como el segundo productor

aceite de girasol y 1,3 millones de toneladas de pellet. El aceite de girasol exportado

(http://www.alimentosargentinos.gov.ar). Por lo tanto, resulta interesante la

Figura 2.: Exportaciones de productos del sector agroalimentario durante el ao 2007.

3.- Composicin qumica de las semillas de girasol y sus harinas proteicas

el 20-25% del peso seco de la semilla, y es principalmente de naturaleza lignocelulsica

Figura 3.: Esquema de un corte transversal de una semilla de girasol en donde es

La composicin de las semillas vara de acuerdo a la variedad de girasol analizada

Tabla 1.: Composicin qumica porcentual promedio de semillas completas de girasol,

Figura 4.: Esquema simplificado de la industrializacin de las semillas de girasol.

3.1.- Protenas de girasol

Figura 5.: Diagrama de cintas correspondiente a la estructura de una globulina de tipo

Una de las caractersticas de las protenas de reserva de semillas es su polimorfismo.

En el caso de girasol, el grado de polimorfismo ha sido poco estudiado pero se sabe

3.2.- Compuestos fenlicos presentes en las semillas de girasol

cido Qunico (QA)

cido Clorognico (CGA)

Una caracterstica importante de estos compuestos es su capacidad de interaccionar

3.3.- Calidad nutricional del pellet proteico de girasol

4.- Obtencin de productos proteicos de girasol

Por consiguiente, un proceso de concentracin clsico consiste en poner en contacto

Precipitacin isoelctrica de las protenas y posterior separacin por

Concentracin proteica por ultrafiltracin: Las molculas solubles de bajo peso

Extracciones sucesivas (2-7) con

OConnor, 1971 (P)

Gonzlez y col., 1975