METODOS DE SIEMBRA DE HONGOS FILAMENTOSOS.

Los hongos se presentan bajo dos formas principales:

hongos filamentosos (antiguamente llamados "mohos")

hongos levaduriformes. (Levaduras)

PARA LA SIEMBRA

Los Medios de Cultivo:

Es donde se ponen a crecer los hongos. Se pueden usar los siguientes medios:

Agar Sabouraud
Agar Neopeptone-glucose-rose Bengal-aureomycin
Agar Czapek (para Aspergillus, penicillium y hongos relacionedos
Agar Yeast extract-malt extract-glucose
Agar Diamalt (para levaduras)

Principales mtodos de identificacin de hongos filamentosos

Para estudiar a los hongos se dispone de dos tipos especiales de

cultivo:
1. E l c u l t i v o d e p o r t a o b j e t o s o microcultivo
2. El cultivo en cajas de Petri. El micro cultivos se pueden observar directamente
da a da, lo que permite hacer el seguimiento del desarrollo del hongo en
estudio. Los cultivos en placa se obtienen sembrando por picadura, el
centro de las cajas que contienen diferentes medios, a simple vista .el

aspecto de las colonias es a veces tan caracterstico, que permite identificar

enseguida el tipo de hongo.

CULTIVO EN CAJAS PETRI

MATERIALES:
cajas de Petri, conteniendo: una capa delgada de algodn o un disco de papel
filtro
una varilla de vidrio en forma de v o de triangulo quede quedar ajustada
a los bordes de la caja y dos portaobjetos (esterilizar el conjunto en
horno.

PROCEDIMIENTO:
1. En zona asptica, con el bistur estril corte el agar en cuadros de
aproximadamente 1cm32.
2. Colocar en el centro de uno de los portaobjetos contenidos en la caja de petri
un cuadrito de agar- sabouraud(o un cuadrito en cada uno de los extremos
3. Con el asa micologica (o con el asa bacteriolgica recta) , inocular cada uno de
los lados del cuadrito ( o de los cuadritos )
4. Con ayuda de unas pinzas flameadas, coloque sobre esta preparacin el
segundo portaobjetos estril.
5. Para mantener la humedad, agregar aproximadamente 10 ml de agua glicerina,
teniendo cuidado de saturar el algodn de papel, evitando la inundacin
para que el lquido no toque el cultivo.- Incube durante das 7
6. En condiciones de asepsia, saque los portaobjetos de la caja.
7. El desarrollo del hongo que se presenta alrededor de los cuadros de agar 9.Separe cuidadosamente los portaobjetos.
8. Retirar el agar, tratando de no daar el desarrollo del hongo el que debe
quedar adherido el portaobjetos.
9. Colocar los cuadros de agar sobre la caja y llevarlos a esterilizar.
10. Fijar las preparaciones, agregando 5 a 6 gotas de metanol, eliminar
inmediatamente el exceso y dejar secar el aire
11. Cubra la preparacin con un pedazo de papel filtro y saturarlo con eritrosina.

12. Calentar la preparacin, durante 10 minutos teniendo cuidado de no

dejar secar la preparacin, debiendo adicionar colorante cada vez que sea
necesario.
13. Decolore con etanol durante 10 segundos.
14. Colocar la preparacin en una caja de koplin que contiene acetona una mezcla
de xilol-acetona y dejar actuar 10 minutos. Transferir la preparacin a una
segunda caja de koplin, la que contiene una mezcla de xilol-acetona y
dejar actuar 10 minutos
15. Repetir el procedimiento empleando xilol y dejar actuar 10 minutos19
La identificacin de los hongos filamentosos se basa en el examen
macroscpico
de la colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas
macroscpicas como la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la
produccin de pigmentos son muy tiles para la identificacin. En general, la
morfologa microscpica de los hongos es estable y presenta pocas variaciones. La
identificacin definitiva se basa en la forma caracterstica, mtodo de produccin y
ordenamiento de las esporas, siendo tambin importante conocer el tamao y la
disposicin de las hifas.
La preparacin del material para la observacin microscpica puede realizarse:
En fresco
Con cinta de celofn adhesiva
Mediante cultivo sobre portaobjetos.
CULTIVO EN FRESCO
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin:
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar de forma que se
convierta en un objeto cortante.
3. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular de la colonia que
contenga adems un poco de agar en la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente,
se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia y
el agar; de esta forma, la muestra est disponible para su observacin al
microscopio.
Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios, ya que las
muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas de
las especies de hongos ms habituales. El mayor inconveniente de la observacin en
fresco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al
presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es vlido en los casos
en que es necesario conocer la disposicin de las esporas.

PREPARACIN CON CINTA DE CELOFN ADHESIVA

El procedimiento se lleva a cabo como sigue:
1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la
superficie de una colonia.
2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de
anilina colocada, a su vez, sobre un portaobjetos.
3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento caracterstico
de las esporas.
Este mtodo puede considerarse como el ms simple, econmico y adecuado para la
identificacin de hongos, recomendable para los laboratorios microbiolgicos de
cualquier nivel. La preparacin de la cinta transparente permite observar al
microscopio como se desarrolla el microorganismo en el cultivo.
Generalmente las esporas se mantienen intactas y la identificacin se realiza con
facilidad.
Una de las desventajas de este mtodo es que si la cinta transparente no se presiona
con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya
que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar.
En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas deber realizarse la
preparacin en fresco.

CULTIVO SOBRE PORTAOBJETOS

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin:

1. Cortar un bloque pequeo de un medio slido adecuado (agar), que ha sido

vertido en una cpsula de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede
cortarse con la ayuda de un bistur estril o con un tubo de ensayo estril sin
reborde (lo que permite obtener un taco redondo).
2. Colocar un portaobjetos estril sobre una capa de agar al 2% contenida en una
cpsula de Petri.
3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.
4. Con una asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ngulo recto,
inocular los cuatro cuadrantes del taco con el microorganismo a identificar.
5. Colocar un cubreobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar.
6. Tapar la cpsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o C.
7. Finalizado el perodo de incubacin, retirar el cubreobjetos (este proceso debe
realizarse en una cabina de seguridad biolgica), y colocarlo en un portaobjetos
que contenga azul de lactofenol o azul de anilina.
8. La observacin al microscopio permite distinguir la forma y disposicin de las
esporas.
9. Si con este proceso no ha sido posible la identificacin, el resto del cultivo
puede ser usado ms adelante si se contina incubando. Entonces se retira el
bloque de agar y se agrega una gota de azul de lactofenol o azul de anilina
sobre la zona del cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es
recomendable realizar dos cultivos sobre el mismo portaobjetos de modo que
si en uno no se pueden observar las caractersticas microscpicas puede
disponerse del segundo despus de un perodo adicional de incubacin.
Este mtodo permite la observacin microscpica del hongo mientras se desarrolla
directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las caractersticas microscpicas
se distinguen con facilidad, las estructuras se mantienen intactas y puede observarse
un gran nmero de reas representativas.
No deben realizarse cultivos en portaobjetos de hongos de crecimiento lento que
pueden ser patgenos dimorfos, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces derma
titidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasilien sis o Sporothrix schenckii

Preparacin y diluciones:
Una vez recolectada las muestras en el campo se deben hacer diluciones de las mismas
antes de sembrar en placas. Cuando se procesan muestras de agua de quebradas se
deber hacer diluciones de 1/10 de la muestra original.
Para muestras de agua con gran material orgnico se debern hacer diluciones
de 1/100 o 1/1,000.
Para muestras de suelo, utilizar diluciones de 1/1,000 o 1/10,000.
Para realizar diluciones de las muestras se deber usar agua estril y toda la cristalera
tambin estriles.
Cultivo en placas:
1. Preparar placas para cada dilucin a ser examinada.
2. Transferir 10 ml de medio a 45 0C a placas Petri de 9 cm.
3. Aadir 1 ml de la muestra diluida y mezclar mediante rotacin de la
placa.
4. Solidificar el agar lo ms rpido posible.
5. Tapar de inmediato las placas para evitar contaminacin.
Incubacin:
1. Incubar las placas sin invertirlas a temperatura de saln (20-240C) en
luz, pero evitar que sea directa.
2. Examinar y contar las colonias en las placas luego de 3, 5 y 7 das.
RECOMENDACIONES
1. Descartar placas con ms de 300 colonias.
2. Se puede calcular el nmero de hongos por volumen de agua en las
muestras y as comparar varios sitios muestreados.
3. Deben ser procesadas no ms tarde de 24 horas de recoleccin de
campo. Si el anlisis no se comienza prontamente se debe refrigerar.
4. Las muestras de agua o suelo se debe coleccionar en envases
esterilizados con tapas.

DIUREX
Hongos filamentosos.
1. Revisar y registrar las caractersticas coloniales (cuadro 7).
2. Mediante la tcnica de impronta con diurex, tomar una muestra del hongo
filamentoso para hacer una preparacin en fresco y teir, para ello:
Cortar un pedazo de diurex de aproximadamente 1.5 cm.
Colocar una gota de lactofenol azul de algodn en un portaobjetos limpio y
desengrasado.

 Esterilizar el asa micolgica y dejar enfriar.

Pegar el diurex en el extremo del asa y con el lado de goma hacia abajo
presionar el diurex sobre el cultivo de hongo cuidando de no frotar (Figura 2).
Con ayuda del asa bacteriolgica depositar el diurex (con la muestra hacia el
colorante) en el portaobjetos (Figura 3).
Colocar una gota sobre el diurex y encima un cubreobjetos (Figura 4).
Observar al microscopio con los objetivos 10x y 40x.
3. Registrar los resultados en el cuadro 7, para ello describir las caractersticas de los
hongos con ayuda de los esquemas del Manual de Microbiologa General.

OBTENCION DE ESPORAS
Las esporas son el equivalente fngico de la semilla de los vegetales, su germinacin es
necesaria para la obtencin de micelio.

Para obtener esporas de ciertos hongos, basta con triturar algunos ejemplares, en
fresco o en seco y en la papilla o polvo resultante habr suficiente cantidad de esporas
para realizar el inculo, este sencillo mtodo resulta til para inocular especies
simbiticas con sus vegetales en vivero, simplemente esparciendo el polvo (o una
pasta hecha con agua) por encima del sustrato con la plntula, bien mezclndola con el
sustrato antes del trasplante o bien rebozando con el polvo las races desnudas de la
planta.
Para realizar una siembra directa de esporas en un lugar determinado, se puede colgar
de un rbol u otro punto elevado un saco de arpillera o una red con unos cuantos
ejemplares del hongo elegido, a sobreviento de la zona elegida. Este mtodo, en
principio, vale para los tres grupos de hongos, siempre y cuando la eleccin de la
especie y del lugar sean apropiados
ESPORAS AISLADAS
En muchos casos, interesa obtener solamente las esporas aisladas y disponer de ellas
para germinarlas en el sustrato elegido. Para ello, se necesita:

Materiales:

Papel de aluminio.
Agua oxigenada, alcohol u otro desinfectante (agua con leja al 50%)
Pulverizador
El sombrero de la seta elegida
Un recipiente abierto de dimetro algo mayor que la seta

Procedimiento:
1. Las setas tienen que estar abiertas con el sombrero casi plano.

2. Lavar las manos y ponte

una mascarilla
3. Corta el papel de aluminio en trozos de unos 15 x 8 cm en forma cuadrada.
4. Dobla el papel de aluminio por la mitad y vuelve a abrirlo (esto har que luego nos
sea ms fcil volver a doblarlo para su cierre).
5. Limpiar los trozos de papel de aluminio y los vasos con alcohol empleando un
pauelo de papel o algodn y ponlos sobre una de las caras de los trozos de
aluminio dejando la otra fuera del vaso.

6. lavar las manos de nuevo y abre el recipiente donde tengas la muestra.

7. Escoge la seta que est abierta completamente y que tenga un poco de esporas
depositadas ya en el pie; recuerda que las esporas son de color purpura/morado.
As te aseguras que ya est soltando esporas.
8. Pincha la chincheta en el medio del sombrero y sepralo del pi cortando con la
cuchilla estril. Asegrate de que cortas el pie lo ms cerca posible del sombrero ya
que queremos que ste quede plano sobre el papel de aluminio.

9. Pon el sombrero con las laminillas hacia abajo encima del papel de aluminio
levantando lo ms brevemente posible el vaso. No toques nunca el sombrero con
los dedos, para eso hemos empleado este tipo de chinchetas, para no tener que
tocar el sombrero en ningn momento.
10. A continuacin posicionaremos el vaso con mucho cuidado de modo que tape
parte del papel de aluminio y parte del trapo. Esto facilitar la salida de humedad y
las

esporas se depositarn ms fcilmente (mirar

a la derecha en la foto de arriba). El sombrero tiene que poder perder humedad
lentamente.

11. Segn se va secando, suelta las esporas mejor, como pasa en la naturaleza. De otra
manera, se produce condensacin dentro del vaso, un exceso de humedad, y las
esporas se quedan pegadas en las laminillas no cayendo en el papel de aluminio.
12. Repetir con el siguiente sombrero y as hasta que tengamos la cantidad deseada.
Tapa todo el con el otro pao limpio de cocina y ponlo en un lugar tranquilo y
oscuro.
13. Deja reposar entre 12-24 horas, aunque a veces tarda ms.

14. Una vez cadas las esporas, se retira la seta y se dobla el aluminio formando un
sobre cerrado con las esporas dentro, para que no le caiga polvo y dems
contaminantes, No queremos que despus del trabajo se nos llenen las esporas de
moho.
CONCLUSIN:

Una vez pasado el tiempo, saca la bandeja del armario y quita el pao que tapa los
vasos. Si miras con cuidado a travs del cristal del vaso, deberas ver una espora en el
papel de aluminio. Fjate en la parte del papel que coincide con el final de la seta (los
bordes) que se habrn doblado hacia arriba debido a la prdida de humedad.

RECOMENDACIN:

Se pulveriza el desinfectante sobre la superficie de trabajo y sobre las manos,

es aconsejable trabajar con guantes de laboratorio y el uso de mascarilla. El
objetivo es trabajar en las condiciones ms estriles posibles.
Se pueden guardar de esta manera, en principio, por tiempo indefinido, si bien
es aconsejable no hacerlo ms de 3 o 4 meses, pues aumentara la posibilidad
de que perdiesen viabilidad.
Si no ves un polvillo de color purpura/morado, espera otro da ms.
Con mucho cuidado, quita los vasos uno por uno quitando los sombreros
cogindolos por la chincheta que la habremos dejado puesta.
Limpiar la mitad de papel de aluminio que ha quedado fuera del vaso con
alcohol y un pauelo de papel o algodn. Se cierra el papel de aluminio y se
doblan los bordes como si quisiramos hacer un sobre, dejando una de las
caras sin cerrar para que la espora pierda la humedad que pueda contener.
No queremos que despus del trabajo se nos llenen las esporas de moho
El objetivo es cerrar el papel de aluminio lo ms rpidamente posible para
evitar que cualquier partcula pueda caer sobre ella. Una sola partcula nos
puede estropear la espora entera. Imagina que alguna espora de cualquier
moho domstico cae en la espora, terminaras produciendo gran cantidad de
ese moho.

INOCULAR CON JERINGUILLA.

Las esporas obtenidas se pueden inocular directamente (con bastantes posibilidades
de fracaso) o se pueden disolver en suero fisiolgico estril para inocular con
jeringuilla. Para este segundo paso se necesitar:
Materiales:

1 o ms botes estriles, van bien los que se usan para almacenar muestras de
orina (1 distinto para cada especie o variedad de hongo)
1 o ms botellas pequeas de suero fisiolgico con tapn de silicona (1 por
especie)
1 jeringuilla con su aguja (o ms, una para cada especie de hongo que se
trabaje)
Los sellos de esporas preparados como se explica previamente.

PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.

Basta con abrir el sello de esporas sobre el bote estril.

Rascar con la punta de la aguja todas las esporas para que caigan.
Se saca un poco de suero con la jeringuilla y se vierte en el bote.
Se agita un poco para que las esporas se mezclen con el lquido.
Finalmente se reabsorbe el lquido y se vuelve a introducir en la botella.

RECOMENDACIONES:

Es conveniente etiquetar las botellas con la fecha y guardarlas en fro. Para

inocular las esporas, bastar extraer el lquido con la jeringa e inocular 0,5 o 1
cc en el sustrato elegido.
Siempre que se trabaje con esporas, es conveniente trabajar en condiciones
cuanto ms estriles mejor.

CONDICIONES PARA LA OBTENCION DE ESPORAS:

Las esporas para ser almacenadas a temperatura de 4C durante 15 semanas,

en solucin Ringer
Las esporas pueden incubar durante tres das a 28C
Se coloca en envases de cultivo sobre un sustrato mineral estril
A los 90 das de crecimiento de cultivo se extrae el inoculante.
El inoculante consiste en una mezcla de sustrato, races, esporas y cuerpos
fructferos

Mtodos que se utilizan para la determinacin de la actividad enzimtica

Mtodo de DNS
Medicin de la actividad de xilanasa por medio de azucares reductores por el cido
dinitrosalicilico (DNS Miller,1959).
Primero se realiza una curva estndar de diluciones seriadas, conociendo la
concentracin inicial de la muestra. Se etiquetaron tubos del 1 al 6 y se agrega un 1ml
de agua destilada, al tubo 1 se le agrega 1ml de solucin estndar, se agito en vortex,
de este tubo se tom 1 ml y se adiciono al tubo 2 y as sucesivamente, hasta el tubo 5
despus de la agitacin se extrajo un 1ml. El tubo 6 que solo contena agua se lo utiliza
como blanco. Finalmente a todos los tubos se les agrega 1.5 ml del reactivo DNS y se
mede la absorbancia.
Para cuantificar la actividad enzimtica se utilizan tubos rotulados A y B. Los tubos A
para la reaccin enziamtica y los tubos B como testigos (ambos por duplicado).
Primero se prepara un sustrato una solucin de xilano de madera de haya 1% en buffer
de citrato-fosfato a pH 7. En ambos tubos se agregan 0.9 ml de sustrato y se somete a

una temperatura de 50 C y 130 RPM pasado este tiempo se agrega 1.5 ml de DNS y se
agita en vortex.

Mtodo semicualitativo API ZYM

Determinacion de actividades enzimticas en cepas de Microsporum canis y
Microsporum gypsium.
Para realizar este ensayo se utilizo el mtodo API ZYM, que permite la deteccin
Lipasa, Trpsina, Fosfoamidasa, -Galactosidasa, -Galactosidasa, Glucuronidasa, Glucosidasa, -Glucosidasa, N-acetil--glucosaminidasa,-Manosidasa y -Fucosidasa.
La inoculacin de la galera se realizo depositando en cada micro tubo 65 ul de un
cultivo liquido exento de micelio obtenido al incubar, en 5 ml de caldo glucosado de
Sabouraud a 28C durante 14 das, un disco de 5 mm de dimetro de un cultivo de la
cepa un estudio desarrollado en AGS durante 14 das a 28C. La incubacin de la galera
se realiz a 28C durante 6h. Transcurrido este periodo de tiempo se precedi a realizar
la lectura del ensayo siguiendo las normas de la casa comercial.

Universidad Estatal de Guayaquil

Facultad de Ingeniera Qumica
Laboratorio de Microbiologa
(418)

Prof(a):
Juliet Chediak
Pertenece:
Edwin Quizhpi J.
Curso:
Cuarto C
Grupo:
G-9

Guayaquil Ecuador
2014 - 2015