NB: Versin adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2009

CAPTULO 2.3.15.

RINOTRAQUETIS DEL PAVO (Infecciones por metapneumovirus aviares)

RESUMEN
El metapneumovirus aviar (MPVa) causa una infeccin aguda muy contagiosa de las vas respiratorias altas, principalmente en pavos y pollos. Originalmente, a la enfermedad causada por el MPVa se la conoca como infeccin por pneumovirus aviar y como rinotraquetis aviar; tambin se la ha denominado rinotraquetis de los pavos y los pollos, y sndrome de la cabeza hinchada (SCH) de los pollos. El MPVa es un virus de ARN de sentido negativo no segmentado y monocatenario que pertenece a la familia Paramyxoviridae, en el gnero Metapneumovirus. La enfermedad puede causar importantes prdidas econmicas en parvadas de pavos y de pollos, en concreto cuando se exacerba por la presencia de agentes patgenos secundarios. La nica especie aviar en la que se sabe que el MPVa se replica, adems de los pavos y los pollos, son los faisanes, los patos de Moscovia, los patos de Pekn y las pintadas. La enfermedad se distribuye de forma global por las regiones productoras de aves de corral, a excepcin de Oceana y Canad, que estn libres de infeccin por el MPVa. Se han identificado cuatro subtipos del MPVa antignicamente bien diferenciados, A, B, C y D, mediante neutralizacin con anticuerpos monoclonales, posible reactividad cruzada escasa en el enzimoinmunoensayo (ELISA), y el anlisis de la secuencia de la glucoprotena de insercin, G. En pavos susceptibles, puede aparecer infeccin del tracto respiratorio a cualquier edad, aunque parece que los pavipollos de corta edad resultan afectados de forma ms grave. La gravedad de la enfermedad y la mortalidad estn influidas en gran parte por las infecciones bacterianas secundarias, aunque otros factores de manejo tambin pueden exacerbar la gravedad de la enfermedad. Tambin es posible observar variabilidad en la gravedad de los signos clnicos y la morbilidad entre las aves de una parvada y entre parvadas. La infeccin por el MPVa puede dar lugar a problemas graves en la produccin de huevos en parvadas de reproductores tanto de pavos como de patos. Otros signos clnicos son estornudos, depresin, estertores traqueales, respiracin entrecortada, jadeo, secrecin nasal y ocular, hinchazn de senos infraorbitarios y conjuntivitis. La aparicin de los signos y la propagacin de la infeccin por una parvada pueden tener lugar en apenas 24 horas. En los pollos, las infecciones por el MPVa se comprenden menos y suelen asociarse a signos de las vas respiratorias altas con disminucin de la produccin de huevos en reproductoras y ponedoras. La enfermedad tambin se puede caracterizar por la aparicin de hinchazones de los senos periorbitarios e infraorbitarios y de la cara, denominada SHS. A lo anterior puede seguir con frecuencia la desorientacin cerebral, tortcolis y opisttono. En los pollos, el MPVa no se considera un agente patgeno que acte solo ni que sea primario, sino asociado a otros agentes patgenos del SHS u otros complejos multifactoriales de enfermedad respiratoria. Identificacin del agente: Para detectar el MPVa se han utilizado con xito el aislamiento del virus en cultivos celulares, huevos de gallina en embrionaje y cultivos de rgano traqueal, as como mtodos moleculares para la identificacin del cido nucleico. El grado de xito depende de la cepa vrica, el tipo de muestra y el momento en el que se haya recogido, as como del almacenaje y la manipulacin de las muestras. Para la identificacin del virus, se utilizan mucho la microscopa electrnica, la neutralizacin vrica y las tcnicas moleculares. La deteccin e identificacin del virus puede resultar difcil si las muestras no se toman al inicio del curso de la enfermedad. Las cepas atenuadas y virulentas del MPVa se replican hasta el ttulo ms elevado en tejidos de las vas respiratorias altas de pavos de corta edad; el virus solo puede aislarse durante unos 10 das.

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Se han utilizado anticuerpos monoclonales frente a la glucoprotena de la espcula, G, en pruebas de neutralizacin vrica para diferenciar los subtipos A y B, mientras que se ha demostrado, mediante pruebas de neutralizacin en las que se utiliza antisuero policlonal, que los subtipos A y B pertenecen a un nico serotipo. El subtipo C se neutraliza de forma deficiente por el antisuero monoespecfico de los subtipos A o B, pero no por los anticuerpos monoclonales que diferencian los subtipos A y B. Estos datos sugieren que el subtipo C representa un segundo serotipo del MPVa. Se pueden utilizar un antisuero monoespecfico y anticuerpos monoclonales para la identificacin del agente mediante la neutralizacin vrica y la tincin por inmunofluorescencia de cultivos celulares infectados; no obstante, se han de considerar las caractersticas antignicas. Tambin se ha utilizado la prueba de inmunodifusin para confirmar las cepas de MPVa. Se han utilizado procedimientos moleculares basados en los genes Fusion (F), G, Matrix (M) y Nucleoprotena (N) del MPVa para la deteccin y/o subtipificacin genmica del MPVa. Las protenas codificadas por los genes F y G son inmungenos importantes y, como tales, presentan variabilidad en los nucletidos. Se ha utilizado el anlisis de secuencias de nucletidos del gen G para confirmar estudios anteriores de neutralizacin vrica en los que se diferenciaban los subtipos A y B. Tambin se pueden utilizar los procedimientos convencionales de la reaccin en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) para la subtipificacin genmica del MPVa A y B. Adems, el anlisis de la secuencia de nucletidos del gen que codifica la protena de la matriz (M), respalda aun ms la divisin entre subtipos A y B. El anlisis de secuencias del gen M del subtipo C de MPVa muestra que la cepa de EE.UU. se diferencia claramente de los subtipos A y B del virus. Las pruebas de RT-PCR orientadas a los genes F y M son especficas de subtipo y tiles para la deteccin del MPVa cuando se sabe cul es el subtipo de virus. Sin embargo, se ha demostrado que un solo conjunto de cebadores para la RT-PCR dirigido al gen N detecta los subtipos A, B, C y D y es posible que se puedan utilizar como cebadores universales para la deteccin del MPVa. Pruebas serolgicas: Debido a las dificultades para el aislamiento y la deteccin del MPVa, a menudo se logra la confirmacin de la infeccin mediante mtodos serolgicos, sobre todo en parvadas sin vacunar. El mtodo ms comn es el ELISA. Otros mtodos utilizados son la neutralizacin vrica (NV), la inmunofluorescencia y la inmunodifusin. La prueba de la NV puede llevarse a cabo en cultivos de rgano traqueal, fibroblastos de embrin de pollo (CEF) e hgado de embrin de pollo (CEL); tambin se han utilizado con xito varias lneas celulares, como Vero, MA104 o QT35. Sin embargo, la NV y el ELISA muestran una sensibilidad semejante y el ELISA es la prueba ms comnmente utilizada. Se han creado numerosos kits comerciales de ELISA as como pruebas internas. Se han observado diferencias en la sensibilidad y especificidad entre pruebas en funcin del kit comercial utilizado. Debe utilizarse como antgeno una cepa homloga del MPVa debido a la variabilidad en la antigenicidad. En muchos pases en los que la enfermedad es endmica se utilizan tambin vacunas, complicando as la interpretacin de los resultados. Lo ideal es que para las pruebas se obtengan muestras de suero de aves que se encuentren en la fase aguda de la enfermedad, y tambin de aves convalecientes. En los pollos, la respuesta serolgica a la infeccin por el MPVa es dbil en comparacin con la respuesta en los pavos. Requisitos para las vacunas y el material biolgico de diagnstico: Para el control de la RTP, se dispone de dos tipos de vacuna: vacunas vivas atenuadas y vacunas inactivadas adyuvantadas con emulsin oleosa.

A. INTRODUCCIN
El metapneumovirus aviar (MPVa), anteriormente denominado pneumovirus aviar (APV) y virus de la rinotraquetis aviar (ARTV), causa una infeccin aguda muy contagiosa en las vas respiratorias altas de los pavos y los pollos. En los pavos, el virus causa una enfermedad conocida como rinotraquetis del pavo (RTP). El agente etiolgico es un virus con envoltura de ARN de sentido negativo monocatenario no segmentado, de unas 14 kilobases y situado dentro de una nucleocpsida con simetra helicoidal (19). El virus presenta ciertas caractersticas de pneumovirus, pero difiere molecularmente de los pneumovirus de los mamferos y ha sido clasificado recientemente como la cepa tipo de un nuevo gnero, Metapneumovirus, en la familia Paramyxoviridae (41). Se han detectado metapneumovirus en humanos y se asocian a infeccin de las vas respiratorias altas en nios (36, 53, 55). El metapneumovirus aviar no tiene protenas no estructurales NS1 y NS2 y el orden de los genes (3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5) es diferente del de los pneumovirus de los mamferos (3NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5) (50). El metapneumovirus aviar se ha clasificado en cuatro subtipos: A, B, C y

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D, mediante el anlisis de la secuencia de nucletidos. Utilizando anticuerpos monoclonales, se ha observado escasa reactividad cruzada entre subtipos en el enzimoinmunoensayo (ELISA) y en la prueba de neutralizacin (8, 14). Puede que existan otros subtipos, pero an no se han detectado ni identificado. En los pavos puede tener lugar una infeccin con el MPVa desde que son muy jvenes y se caracteriza por respiracin entrecortada, estertores, estornudos, secrecin nasal, conjuntivitis con formacin de espuma, hinchazn de los senos infraorbitarios y edema submandibular (44). La intervencin de agentes patgenos secundarios puede exacerbar drsticamente los signos clnicos. En una infeccin sin complicaciones, la recuperacin es rpida y las aves vuelven a la normalidad en unos 14 das. Cuando se aplica un mal manejo o se producen infecciones bacterianas secundarias, la aerosaculitis, la pericarditis, la neumona y la perihepatitis pueden prolongar la enfermedad y puede haber un aumento de la morbilidad y la mortalidad (12, 34). Los agentes patgenos secundarios que se ha observado que exacerban y prolongan la enfermedad clnica son Bordetella avium, microorganismos tipo Pasteurella, Mycoplasma gallisepticum, Chlamydophila y Ornithobacterium rhinotracheale (1, 12, 25, 45, 58). La morbilidad puede llegar al 100%, y la mortalidad puede oscilar entre el 0,5% en los pavos adultos y el 80% en los pavipollos de corta edad (5, 19, 56). Los signos clnicos de la infeccin en los pollos son menos caractersticos que los de los pavos. Pueden tener lugar problemas respiratorios graves en pollos, en concreto cuando se exacerban por agentes patgenos secundarios, como el virus de la bronquitis infecciosa, micoplasmas, y Escherichia coli (39, 40). A diferencia de lo que ocurre con los subtipos A y B, no se ha observado que la cepa de EE.UU. -Colorado, o subtipo C- induzca de forma natural enfermedad en los pollos, aunque en pollos infectados de forma experimental se ha observado que son susceptibles a la cepa del MPVa del subtipo C del pavo (47). Se ha demostrado que cada cepa de MPVa tiene un tropismo especfico para pollos o para pavos (15). En otras especies de aves se ha observado que se infectan con el MPVa, pero casi nunca con signos clnicos (20). Virus caracterizados como MPVa subtipo C y con un 7583% de coincidencia de nucletidos con el MPVa subtipo C Colorado de EE.UU. se han asociado a signos respiratorios y a disminucin de la produccin de huevos en patos de Francia (51, 54). El anlisis molecular retrospectivo de virus aislados en la dcada de los aos 80 en pavos de Francia indica la presencia de un cuarto subtipo de MPVa denominado subtipo D (2). Los resultados de algunos estudios experimentales sugieren que es necesario el contacto directo para la transmisin del virus de un ave a otra (1, 12). En condiciones comerciales, la infeccin aergena tras la transmisin por el aire tambin es probable, puesto que la enfermedad se limita al tracto respiratorio. Tras la infeccin experimental de pavos de 2 semanas de edad solo con el MPVa, el virus se detect en el tracto respiratorio durante solo unos pocos das (3). Sin embargo, en aves inoculadas con MPVa y B. avium, se detect el virus hasta 7 das despus de la inoculacin (dpi) (7, 15, 36). No existen pruebas de que el MPVa pueda producir infeccin latente ni se conoce la existencia de portadores asintomticos. Aunque de forma espordica pueden infectarse algunos pavos neonatos (46), no se ha informado de la existencia de transmisin vertical del MPVa. En los pavos de engorde la replicacin del virus se limita a las vas respiratorias altas con una corta viremia. La replicacin de las cepas, tanto atenuadas como virulentas, de MPVa persiste durante aproximadamente 10 dpi (12, 56). Se produce una replicacin escasa en la trquea y el pulmn, pero no se ha observado la replicacin en otros tejidos tras la infeccin natural (9, 10). Estudios histopatolgicos e inmunocitoqumicos secuenciales han mostrado una replicacin vrica en los cornetes nasales que causa una intensa rinitis con gran actividad glandular, exfoliacin epitelial, prdida focal de cilios, hiperemia e infiltracin mononuclear leve en la submucosa e inclusiones intracitoplasmticas eosinoflicas en las clulas ciliadas de los cornetes nasales a los 2 dpi. Entre los 3 y 4 dpi se observ una rinitis catarral con exudado mucopurulento, lesin en la capa epitelial y una abundante infiltracin inflamatoria mononuclear en la submucosa. Se observaron lesiones transitorias en la trquea, con pocas o ninguna lesin en la conjuntiva y en otros tejidos (17, 30). La infeccin respiratoria es menos grave en las pavas ponedoras; sin embargo puede producirse una disminucin de la produccin de huevos de hasta el 70% (49) y estos pueden ser de mala calidad durante el perodo de recuperacin, que dura hasta 3 semanas. En pavas ponedoras infectadas experimentalmente, se ha observado replicacin vrica tanto en el tracto respiratorio como en el genital hasta los 9 dpi (26). En pollos, existen claros indicios que sugieren que el MPVa es uno de los agentes etiolgicos del sndrome de la cabeza hinchada (SCH). Este sndrome se caracteriza por una enfermedad respiratoria, apata, hinchazn de los senos infraorbitarios e hinchazn periorbitaria unilateral o bilateral y facial, que se extiende por toda la cabeza. A estos signos les sigue con frecuencia la desorientacin cerebral, tortcolis y opisttonos Aunque la mortalidad no suele sobrepasar el 12%, la morbilidad puede alcanzar el 10%, y la produccin de huevos se suele ver afectada (21, 35, 39, 40, 43, 50). La evidencia serolgica sugiere que el MPVa est extendido por todo el mundo y tiene un impacto econmico considerable, en concreto en la produccin de pavos. Oceana y Canad son las nicas regiones en las que no se ha informado de la existencia del MPVa (9, 10, 19). Existe evidencia serolgica y molecular de que el MPVa infecta otras varias especies de aves, incluidos los faisanes, las pintadas, las avestruces, los gorriones y las aves acuticas (4, 19, 28, 48), pero sin indicios de enfermedad.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

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1.

Identificacin del agente

A fin de optimizar las posibilidades de conseguir un aislamiento vrico eficaz, se recomienda un enfoque mltiple del diagnstico. Esto es importante sobre todo al tratar con diferentes subtipos o genotipos que pueden requerir distintos mtodos de aislamiento in-vitro. Esto se ilustr en EE.UU., donde los primeros intentos de aislar el subtipo C del MPVa fracasaron. El subtipo C de EE.UU. no se ha asociado a ciliostasis en los cultivos de rgano traqueal (13, 45), y el agente solo se ha cultivado tras mltiples pases por embrin y cultivo celular. Este hecho contrast con la experiencia en Europa y en otros lugares, donde se observ que los cultivos de rgano traqueal y/o clulas Vero constituan el mtodo ms fiable para el aislamiento primario de los subtipos A, B, C y D del MPVa (11, 17, 51, 52).

Recogida y seleccin de muestras para el diagnstico

Es muy importante que las muestras para el aislamiento vrico se tomen en las primeras fases de la infeccin, ya que el virus puede estar en los senos y en los cornetes nasales solo durante un corto periodo de tiempo. Lo ideal es tomar muestras de las vas respiratorias altas de aves vivas durante el periodo agudo de la enfermedad utilizando hisopos estriles (19, 49). Las muestras ms eficaces han sido los exudados nasales, hisopos de la hendidura coanal y raspados de tejido de los senos y los cornetes nasales. El virus tambin se ha aislado de la trquea y los pulmones y, en ocasiones, de las vsceras de los pavipollos afectados (5, 13). No suele ser eficaz el aislamiento vrico en pollos con signos crnicos graves, ya que los signos clnicos ms graves se deben normalmente a agentes patgenos secundarios. Este es el caso de los pollos con el SCH, en los que los signos tpicos se deben a la infeccin secundaria por Escherichia coli. Es ms, por razones poco claras, el aislamiento del virus puede ser ms difcil en los pollos que en los pavos. Es fundamental que las muestras se enven de inmediato sobre hielo al laboratorio de diagnstico. Cuando se presuma que el envo va a tardar en realizarse ms de 3 das, deben congelarse antes del envo. Los hisopos para el aislamiento vrico deben enviarse en hielo y completamente sumergidos en medio de transporte de virus, pero los que se enven para ser sometidos a la prueba de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) pueden enviarse secos, aunque sobre hielo o congelados. Para el aislamiento vrico, se prepara una suspensin al 20% (v/v) del exudado nasal o tejido homogeneizado en solucin salina tamponada con fosfato (PBS) o en caldo de infusin de corazn-cerebro (BHI) que contenga antibiticos, a un pH de 7,07,4. Esta suspensin se clarifica mediante centrifugacin a 1.000 g durante 10 minutos y se pasa el sobrenadante por un filtro de membrana de 450 nm.

Cultivo e identificacin del metapneumovirus aviar (MPVa)

El mejor mtodo para el aislamiento primario del virus a partir de aves infectadas es un cultivo de trquea o en huevos de pavo o pollo en embrionaje, y el cultivo posterior en cultivos celulares (5, 13); el pase seriado por clulas Vero tambin se ha observado que es un mtodo sensible para el aislamiento del MPVa (17). El aislamiento original del MPVa en Sudfrica a finales de los aos 70 y el del MPVa Colorado ms reciente se llevaron a cabo en huevos en embrionaje; sin embargo, los aislamientos de los subtipos A y B del MPVa se han realizado de forma sistemtica en cultivos de trquea (11). El subtipo C del MPVa, y tal vez otros APV no identificados, no causan ciliostasis en cultivos de rganos; por ello: el pase por huevos de gallina en embrionaje y pases posteriores por cultivo celular constituyen el mtodo de eleccin para el aislamiento del virus (19, 45). Los cuatro subgrupos del MPVa pueden aislarse utilizando clulas Vero (51, 52). Se preparan cultivos de trquea a partir de embriones de pavo o de pavos de muy corta edad procedentes de parvadas libres de anticuerpos especficos contra el MPVa. Tambin se puede utilizar la trquea de embriones de pollo, o de pollos de 12 das de edad. Se lavan cortes transversales de trquea en PBS (pH 7,2), colocando un corte por tubo en medio Eagles con antibitico, y se mantienen a 37C. Tras la incubacin, se retiran los medios de los cultivos y se aaden 0,1 ml de inculo libre de bacterias. Tras la incubacin durante 1 hora a 37C, se aade medio de crecimiento y se incuban los cultivos a 37C en un aparato rotador a 30 revoluciones por hora. Los cultivos se examinan a diario despus de agitarlos en un mezclador de laboratorio para separar los desechos del lumen. Puede presentarse ciliostasis en un plazo de 7 das tras la inoculacin en pase primario, pero normalmente aquella se produce de forma rpida y consistente slo despus de varios pases ciegos (19). Se inoculan por va vitelina huevos de pollo o de pavo en embrionaje de entre 6 y 8 das procedentes de parvadas que se sepa que estn libres de anticuerpos contra el MPVa con 0,2-0,3 ml de material libre de bacterias extrado de aves infectadas, y se incuban a 37C. Si no hay indicios de infeccin (falta de crecimiento o mortalidad en los embriones) tras el primer pase, debe procesarse material de saco vitelino para un segundo pase ciego por embrin. En un plazo de 710 das, normalmente hay constancia del retraso en el crecimiento de los embriones, con algunas muertes. A menudo se requieren pases seriados antes de que el agente cause mortalidad continua en los embriones. El aislamiento en huevos en

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embrionaje es un proceso lento, caro y trabajoso, y requiere mltiples pases posteriores en cultivos celulares para la identificacin (19). Se han utilizado varios cultivos celulares para el aislamiento primario del MPVa, incluyendo clulas de embrin de pollo, clulas Vero y, ms recientemente, las clulas QT-35, con diversos grados de xito. El aislamiento primario del subtipo C de EE.UU. se ha llevado a cabo tras mltiples (5-6) pases seriados en cultivos de clulas Vero (4). Sin embargo, una vez que el virus se adapta al crecimiento en huevos en embrionaje o en cultivos de trquea, en los que crece hasta alcanzar slo ttulos bajos, se replicar de inmediato hasta ttulos moderados tras pases mltiples en distintos tipos de cultivos primarios de clulas de embrin de pavo o de pollo, clulas Vero y clulas QT-35 (5, 9, 10, 22). Se ha observado un aislamiento primario de los cuatro subgrupos del MPVa tras pases seriados en clulas Vero (52). El virus produce un efecto citoptico (ECP) caracterstico con formacin de sincitios en un plazo de 7 das. La identificacin de cultivos celulares infectados con el virus puede lograrse mediante tincin por inmunofluorescencia de clulas infectadas o por mtodos moleculares. Mediante microscopa electrnica de contraste negativo puede observarse una morfologa del virus parecida a la de los paramixovirus. Se observan con frecuencia partculas con bordes pleomrficos, casi esfricas y con un dimetro de 80200 nm. Ocasionalmente, hay formas filamentosas mucho ms grandes, que pueden medir hasta 1.000 nm de longitud. Las proyecciones superficiales miden 1314 nm de longitud y la nucleocpsida helicoidal, a la que a veces se ve sobresalir entre las partculas desorganizadas, mide 14 nm de dimetro con una inclinacin estimada de 7 nm por cada giro (7, 17).

Identificacin molecular
La PCR con transcripcin inversa (RT-PCR) es un mtodo de deteccin del MPVa significativamente ms sensible y rpido que los mtodos estndares de aislamiento vrico, debido a que el MPVa es difcil de cultivar (11, 19). Para la deteccin del MPVa se utilizan procedimientos de la RT-PCR dirigidos a los genes F, M, N y G; sin embargo, debido a la heterogeneidad molecular de las cepas de MPVa, la mayora de los mtodos de la RT-PCR son especficos de subtipo o no sirven para detectar todos los subtipos (3, 11, 41, 42). Se utilizan con xito pruebas especficas de subtipo para la deteccin y el diagnstico de cepas endmicas (2, 11, 32, 37, 42). No obstante, deben reconocerse las limitaciones de las pruebas especficas de subtipo cuando se realizan pruebas de diagnstico de enfermedad respiratoria. Se ha demostrado que los cebadores dirigidos a las regiones conservadas del gen N tienen una especificidad ms amplia, y sirven para detectar cepas representativas de los subtipos A, B, C y D (3). Para la identificacin de los genotipos o subtipos tambin se han utilizado con xito pruebas de la RT-PCR dirigidas al gen G (2, 27, 29, 31). Se ha elaborado y evaluado una gama de tcnicas de RT-PCR que han sido ampliamente revisadas en otros trabajos (11, 38). Las muestras preferidas son los exudados nasales, hisopos de la hendidura coanal, y las muestras de los cornetes nasales recogidas entre 2 y 7 das despus de la exposicin (15, 19, 42, 49). Es preciso recoger las muestras en cuanto aparezcan los primeros signos clnicos, ya que en varios estudios recientes se ha observado que, a los 3 das de la post-inoculacin, se encuentra en la trquea y en los cornetes la mayor cantidad de virus, y el ARN vrico persiste durante 9 das en la trquea y hasta 14 das en los cornetes nasales (59). Se ha observado que el MPVa puede detectarse en muestras recogidas entre 7 y 10 das despus de la exposicin; no obstante, la concentracin del virus es considerablemente ms baja, con lo que disminuye el xito de la deteccin (1, 42). Pueden agruparse hisopos de una sola parvada en grupos de no ms de cinco para poder procesar muestras de un gran nmero de aves y, por tanto, aumentar la probabilidad de deteccin. Se puede extraer ARN molde para la RT-PCR a partir de un tejido homogeneizado, hisopos secos o grupos de hisopos hmedos con columna de slice o con reactivos comerciales para la extraccin del ARN mediante perlas magnticas siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras integradas por el sobrenadante del hisopo traqueal y lquido de seno (140 l/600 l de tampn de lisis) tambin se pueden procesar mediante el procedimiento RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Tabla 1. Ejemplo de cebadores que pueden utilizarse para la deteccin del gen N de los serogrupos A, B, C y D del MPVa (3, 51) Diana Cebador ID Nc Nx Secuencia 53 Posicin Tamao del producto Cebador RT 115

Gen N

5TTC-TTT-GAA-TTG-TTT-GAG-AAG-A3 5CAT-GGC-CCA-ACA-TTA-TGT-T3

632653 830812

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Nd i)

5AGC-AGG-ATG-GAG-AGC-CTC-TTT-G3

716737

115

La sntesis del ADNc puede llevarse a cabo en un volumen de 20 l con el cebador Nc para RT (o cualquier cebador adecuado, como un oligodT o el cebador inverso del par de cebadores que se utilizar en la PCR) y enzima SuperScript II Rnase H-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se calienta 1 l de cebador para RT (2 pmoles), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM de cada), con ARN extrado y agua destilada estril (QS hasta 20 l) hasta los 65C durante 5 minutos. Se enfra rpidamente y se centrifuga. Se aaden 4 l de tampn First-Strand 5, 2 l de DTT 0,1 M, y 1 l de RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se calientan los contenidos hasta los 42C durante 2 minutos y se aade 1 l (200 unidades) de SuperScript II, y se mezcla cuidadosamente. Se realiza la RT a 42C durante 50 minutos, y a continuacin se aplican 70C durante 15 minutos para la inactivacin del enzima para la RT. La amplificacin mediante PCR puede llevarse a cabo con polimerasa AmliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las condiciones de amplificacin son las siguientes: 94C durante 15 minutos y 30 ciclos de 94C durante 20 segundos, 51,0C durante 45 segundos (para el par de cebadores ND/Nx, pero si se utiliza otro par, la temperatura de hibridacin debe ajustarse) y 72C durante 45 segundos con una extensin final de 72C durante 10 minutos.

ii) iii) iv) v) vi)

Se han utilizado con xito varias RT-PCR dirigidas a los genes F, G y M para la deteccin e identificacin de los subtipos o para el diagnstico del MPVa endmico (22, 25, 30). Se ha utilizado la secuencia de nucletidos y el anlisis filogentico del gen G para genotipar los subtipos A, B y C del MPVa, y ese es el procedimiento recomendado para la identificacin del subtipo de un virus no identificado. Se han descrito los procedimientos de la RT-PCR recomendados para el anlisis de las secuencias del gen G (2, 27, 29, 54). Recientemente se ha comprobado que la RT-PCR en tiempo real permite la deteccin especfica, la identificacin y la cuantificacin de los subgrupos A, B, C y D del MPVa (24). Tambin se han descrito los procedimientos para la identificacin del ARN de los subtipos A y B en muestras de diagnstico (37), as como los procedimientos para la deteccin de los virus de los subtipos A y B (42). El aislamiento del MPVa en los pollos es difcil y slo ha funcionado en unos pocos casos; por esta razn, para la deteccin del MPVa en pollos se han utilizado principalmente pruebas moleculares (11, 31). Es importante recordar que mediante la RT-PCR se detecta el ARN vrico, no el virus vivo, de modo que est an por determinar la significacin de un resultado positivo en la PCR en cuanto a la deteccin de una infeccin activa.

2.

Pruebas serolgicas

La serologa es el mtodo de diagnstico de infecciones por el MPVa ms frecuente, en concreto en parvadas no vacunadas, debido a las dificultades en el aislamiento y la identificacin del MPVa. El mtodo ms comn es el ELISA; sin embargo, se han utilizado las pruebas de neutralizacin vrica, la microinmunofluorescencia y la inmunodifusin. Existen varios kits de ELISA comerciales y del propio laboratorio que son tiles para analizar suero tanto de pavos como de pollos; sin embargo, se ha informado de la existencia de diferencias de sensibilidad y especificidad entre kits comerciales (16, 33, 34). Se han creado kits de ELISA de competicin o de bloqueo que incorporan un anticuerpo monoclonal especfico para el MPVa. Se afirma que estos kits tienen una sensibilidad y especificidad de amplio espectro para todos los subtipos del MPVa y pueden utilizarse para analizar sueros de varias especies aviares. Los antgenos para el ELISA interno, tal como se describen ms adelante, se han preparado en varios sustratos, que incluyen distintos cultivos celulares y cultivos de trquea (6, 11). Por lo general, los anticuerpos frente al MPVa se detectan con ms dificultad cuando se utiliza como antgeno una cepa heterloga del MPVa, a pesar de que las cepas parecen estar estrechamente relacionadas, segn la prueba de neutralizacin (11, 16). La situacin se complica an ms por las discrepancias relativas a la capacidad de los distintos ELISA de detectar anticuerpos vacunales cuando se utilizan diferentes cepas del MPVa como antgenos de revestimiento (16). Las pruebas internas en las que se emplea un antgeno homlogo se han utilizado mucho para la vigilancia de cepas del MPVa endmico. Lo ideal es que las muestras de suero para las pruebas se tomen durante la fase aguda y durante la convalecencia. En los pollos, la respuesta serolgica a la infeccin por el MPVa es dbil en comparacin con la respuesta en los pavos (12).

Enzimoinmunoensayo
Puede utilizarse el siguiente protocolo (6), o mtodos alternativos con resultados bien documentados (18, 23).

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El virus se propaga en fibroblastos de embrin de pollo (FEP) o en cultivos de clulas Vero hasta que se infecta entre el 70 y el 100% de la monocapa de forma simultnea (3 a 4 das). Se decanta el lquido del cultivo celular y se lava la monocapa con PBS (pH 7,2). Se lisa la monocapa con 0,5 ml (por cada frasco de 75 cm2) de una solucin de un detergente no inico (IGEPAL CA-630 o Nonidet P-40) al 0,5% mediante una placa de balanceo durante 1 hora a 4C. Despus de la perturbacin fsica de las clulas lisadas, se clarifica todo el lisado del antgeno vrico a 3.000 g durante 15 minutos. Se tratan del mismo modo los cultivos de clulas no infectadas para obtener un antgeno control negativo. Se analizan las diluciones seriadas del antgeno frente a diluciones seriadas del conjugado de peroxidasa de rbano con IgG antiespecie por el sistema de doble entrada para establecer la dilucin conjugado/antgeno ptima. Se recubren una dilucin de trabajo de antgeno del MPVa y un antgeno normal (100 l) en el fondo de las placas de microtitulacin con un tampn de recubrimiento carbonato/bicarbonato (6). Se analiza cada suero frente al MPVa y al antgeno normal para determinar la proporcin S/P. Las placas recubiertas se incuban a 4C durante toda la noche y se lavan un total de cinco veces con solucin de lavado Tween 20 (6) antes de usarlas o tres veces antes de almacenarlas durante un largo perodo de tiempo a 70C. Al congelar las placas, queda solucin de lavado residual en la placa. Despus del almacenaje y la descongelacin a temperatura ambiente, se lavan las placas dos veces y se secan con papel absorbente antes de su utilizacin. i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Se diluyen los sueros de la prueba a 1/40 en tampn de disolucin/bloqueo (6). Se aplican 50 l de los sueros problema y de las soluciones de trabajo de los sueros positivos y negativos al antgeno del MPVa y a los pocillos recubiertos de antgeno. Se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavan las placas cinco veces en solucin de lavado Tween 20. Se aplican 50 l de la solucin de trabajo del conjugado de peroxidasa de rbano con IgG anti-especie a cada pocillo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan las placas cinco veces con solucin de lavado Tween 20. Se aplican 100 l de la solucin preparada con el sustrato ortofenilendiamina (OPD) a cada pocillo y se incuban durante 10 minutos a oscuras. Se mezclan los siguientes reactivos para la preparacin del sustrato OPD: 243 ml de cido ctrico 0,1 M y 257 ml de ortofosfato monosdico 0,2 M; se ajusta el pH a 5,0 y con QS hasta 1 litro de agua destilada.

viii) Se interrumpe la reaccin con 25 l/pocillo de cido sulfrico 2,5 M. ix) Se lee la DO a 490/450 nm.

Los resultados se expresan como diferencias de OD entre los pocillos recubiertos de antgeno vrico y los recubiertos con el antgeno que acta como control negativo. Se determina la media de OD490 de cada conjunto duplicado de pocillos con el antgeno positivo y el negativo para cada suero. Los antgenos suelen calibrarse de modo que una muestra con una diferencia de OD490 entre los pocillos recubiertos con antgeno y los pocillos recubiertos con antgeno control negativo de ms de 0,2 se considera positiva (llevando a cabo el mtodo en un laboratorio, este umbral podra tener que reevaluarse en las condiciones locales, evaluando un conjunto de sueros negativos con los antgenos recin preparados). Las reacciones positivas no especficas y espordicas son inherentes a la prueba ELISA, especialmente las realizadas con sueros de pollo o pato, y se puede utilizar la inmunofluorescencia para las pruebas confirmativas.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL BIOLGICO DE DIAGNSTICO

Para el control de la RTP, se dispone de dos tipos de vacuna: vacunas vivas atenuadas y vacunas inactivadas adyuvantadas con emulsin oleosa (9). Las vacunas estn pensadas para ser utilizadas solo en pavos. Existe la posibilidad de desarrollar vacunas vivas recombinantes basadas en el virus de la viruela aviar actuando como vector que exprese la protena F del MPVa (49), vacunas de ADN que codifiquen distintas protenas del MPVa (50) y, ms recientemente, MPVa genticamente atenuado producido mediante gentica inversa (51). Las directrices de produccin de vacunas veterinarias se describen en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se muestran aqu y en el captulo 1.1.8. pretenden ser de carcter general y pueden completarse mediante requisitos nacionales o regionales.

Vacunas vivas: mtodos de utilizacin

Se producen vacunas vivas contra la RTP a partir de cepas vricas que se han atenuado mediante pases seriados en huevos en embrionaje, cultivos de trquea o cultivo celular (distintas lneas celulares o fibroblastos

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de embrin de pollo), o mediante pases alternos utilizando una combinacin de estos mtodos. Ciertas vacunas vivas atenuadas contra la RTP comercialmente disponibles derivan de cepas europeas del subgrupo A o el subgrupo B del MPVa, y de una cepa americana del subgrupo C del MPVa. El subgrupo del MPVa al cual pertenece la vacuna debe mencionarse en la etiqueta de la vacuna, puesto que esta informacin es importante para el desarrollo de un seguimiento serolgico post-vacunacin eficiente. Las vacunas vivas contra la RTP estn pensadas para ser utilizadas en aves de corta edad para inducir una respuesta inmunitaria activa que contribuya a prevenir la enfermedad respiratoria causada por el MPVa. Adems, en pavos progenitores tambin se utilizan vacunas vivas contra la RTP para producir una respuesta primaria antes de la vacunacin cerca del pico de puesta, utilizando vacuna inactivada (vase ms adelante). Se suelen aplicar vacunas vivas contra la RTP varias veces mediante spray de gota gruesa, en el agua de bebida o mediante administracin oculonasal. Existe un informe publicado sobre la utilizacin de una inyeccin nica inovo (48), pero es ms habitual que la primera vacunacin contra la RTP con vacuna viva se administre a los pavipollos durante su primera semana de vida. La segunda vacuna viva contra la RTP se aplica aproximadamente a las 6 semanas de edad (en cuyo caso solo se realizan dos aplicaciones), o a las 3 semanas de edad (en cuyo caso hay una tercera aplicacin) o despus de las 6 semanas de edad. El motivo de estas repetidas vacunaciones tiene que ver, en primer lugar, con las dificultades de inducir una respuesta de anticuerpos de larga duracin durante toda la vida del pavo de carne, y en segundo lugar con la necesidad de evitar la vacunacin contra la RTP en pavos de corta edad cuando han sido vacunados recientemente contra la enteritis hemorrgica (las vacunas contra el virus de la enteritis hemorrgica [VEH] se suelen administrar aproximadamente a los 28 das de edad para evitar la interferencia con los anticuerpos maternos [MDA] contra el VEH). Aunque se ha publicado que los MDA contra el TRTV no previenen la infeccin en pavipollos de un da de vida con cepas virulentas del MPVa (53), se ha observado que puede tener lugar cierta interferencia entre los MDA y algunas vacunas vivas contra la RTP y dar lugar a una menor captacin de la vacuna en pavos de corta edad con niveles ms altos de MDA. Se ha observado proteccin clnica cruzada entre vacunas vivas y virus de desafo pertenecientes a los subgrupos A o B (y viceversa) (15, 59, 60). Tambin se ha observado inmunidad protectora cuando aves inmunizadas contra los serogrupos A o B del MPVa a continuacin han sido expuestas a un virus virulento del subgrupo C, pero no en el experimento opuesto (60). Los metapneumovirus aviares se neutralizan muy fcilmente en el ambiente mediante agentes fsicos y qumicos, y puede ser difcil garantizar una buena vacunacin con vacuna viva contra estos virus. Si la vacuna se administra en el agua de bebida, debe utilizarse agua limpia de pH neutro, sin olor ni sabor a cloro ni metales. Puede aadirse leche desnatada en polvo a razn de 2 g por litro. Debe tenerse cuidado de garantizar que todas las aves reciban su dosis de vacuna. Para ello, todo el agua debe retirarse (cortarse) durante 2-3 horas antes de poner a disposicin de las aves el agua medicada, y debe tenerse cuidado de que no quede nada de agua en las tuberas ni en los bebederos. Si la vacuna se administra mediante spray, debe utilizarse agua de calidad y de pH neutro sin residuos desinfectantes. Debe utilizarse un nebulizador concreto, que no se aplicar a ningn otro fin ms que a la vacunacin. Lo ideal es que este aparato permita una presin constante a lo largo de todo el proceso de vacunacin (y, por tanto, un tamao constante de las gotitas de vacuna). Los pavos a vacunar deben agruparse antes de la vacunacin y debe llevarse a cabo varios pases con el nebulizador para garantizar que todas las aves quedan verdaderamente expuestas al spray. La ventilacin y la calefaccin de la nave deben bajarse todo lo posible, de modo que la vacuna nebulizada no se elimine por la ventilacin, ni quede inactivada por el sobrecalentamiento (el calor, adems, favorece la evaporacin, que disminuye el tamao de las gotitas de vacuna nebulizada y causa un aumento de la proporcin de vacuna que llega a las vas respiratorias bajas, un fenmeno que se ha sospechado que contribuye a las reacciones adversas a la vacunacin con vacuna viva). Es importante dejar que las aves se tranquilicen inmediatamente despus de aplicar el spray, puesto que cuando las aves se arreglan las plumas tras ser expuestas al spray vacunal, pueden absorber una cantidad no desdeable de la vacuna. Se ha observado que las vacunas del MPVa no interfieren con las vacunas contra la enfermedad Newcastle en pollos (56, 61); sin embargo, en pavos no est documentada la compatibilidad de las vacunas contra la RTP. Como ocurre con otras vacunas, solo deben vacunarse aves sanas. Los viales de vacuna liofilizada deben mantenerse a temperaturas de entre 2C y 8 C hasta el momento de utilizarlos.

Vacunas inactivadas: Mtodo de utilizacin

Las vacunas contra el MPVa inactivadas se utilizan principalmente para producir niveles altos, duraderos y uniformes de anticuerpos en pavos reproductores que han sido previamente vacunados con vacuna viva o expuestos de forma natural al virus natural durante el crecimiento. Dado que el motivo por el que se utilizan vacunas inactivadas en los reproductores es mejorar su proteccin no solo contra los signos respiratorios de la RTP sino tambin contra los signos reproductivos (cadas de la puesta) asociados a la infeccin por el MPVa, no es infrecuente que las vacunas inactivadas contra el MPVa tambin asocien este virus a otros varios virus tambin involucrados en trastornos respiratorios y/o reproductivos. El programa habitual consiste en administrar la vacuna inactivada al menos 4-6 semanas despus de la ltima vacuna viva, hasta las 28 semanas de edad en pavos, evitando las 4 semanas previas a la entrada en puesta. La vacuna inactivada se fabrica como emulsin agua-en-aceite, y tiene que inyectarse en cada una de las aves. Las vas preferidas de administracin son la

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intramuscular en el msculo del muslo, evitando la proximidad a las articulaciones, tendones o vasos sanguneos grandes, o la va subcutnea. Puede utilizarse una jeringa multidosis, sujeta al aparato en pleno funcionamiento y segn las instrucciones del fabricante y las prcticas de higiene recomendadas. Todo el equipamiento debe limpiarse y esterilizarse entre parvadas, y los equipos de vacunacin deben cumplir estrictamente las normas de higiene al pasar de una parvada a otra. La vacuna no debe congelarse; en lugar de ello, debe guardarse a 4-8C (pero debe dejarse que alcance la temperatura ambiente antes de inyectarla). Las vacunas inactivadas no deben exponerse a la luz directa ni a altas temperaturas. Solo deben vacunarse aves sanas, que se sepa que estn sensibilizadas por exposicin previa al MPVa. Utilizada de este modo, la vacuna inactivada debe inducir una buena respuesta de anticuerpos que proteger a los reproductores contra los signos respiratorios y reproductivos durante todo el ciclo de puesta (57). El nivel concreto y la duracin de la inmunidad que confieren las vacunas inactivadas dependern principalmente de la concentracin de antgeno por dosis. El objetivo de la fabricacin debe ser obtener una alta concentracin de antgeno y, por tanto, una vacuna muy potente.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Vacuna viva Debe demostrarse que el virus del inculo est libre de virus extraos, bacterias, micoplasmas u hongos, en concreto agentes patgenos para las aves. Debe demostrarse que el virus del inculo es estable, y que no presenta tendencia a revertir a la virulencia. Esto se puede confirmar llevando a cabo al menos cinco pases consecutivos pavo a pavo a intervalos de 26 das. Se utilizan pavos de no ms de 3 semanas y libres de MDA contra el MPVa. El pase se puede lograr mediante la propagacin natural o inoculando una suspensin preparada a partir de la mucosa de los cornetes nasales y la parte alta de la trquea de aves previamente inoculadas, o de hisopos traqueales. Debe tenerse cuidado de evitar la contaminacin por virus de pases previos. Debe demostrarse que el virus se ha transmitido. Debe evaluarse la estabilidad demostrando que no hay indicios de aumento de la gravedad de los signos clnicos al comparar el virus de ms pases con la vacuna sin pases. Puede utilizarse un sistema de puntuacin para cuantificar la gravedad de los signos. Vacuna muerta (inactivada)

En el caso de las vacunas inactivadas (con virus muerto), las caractersticas ms importantes son un alto rendimiento y una buena antigenicidad. Debe demostrarse que el virus del inculo est libre de virus extraos, bacterias, micoplasmas u hongos, en concreto, de agentes patgenos para las aves.

b)

Mtodo de cultivo
El virus del inculo de metapneumovirus aviar puede propagarse en distintos sistemas de cultivo celular. La vacuna a granel se distribuye en alcuotas y se liofiliza en recipientes sellados.

c)

Validacin como vacuna

Deben obtenerse datos sobre la eficacia antes de que empiece la fabricacin de la vacuna a granel. La vacuna debe administrarse a aves del mismo modo en que se utilizar en el campo. Puede administrarse vacuna viva a aves de corta edad y la respuesta puede medirse serolgicamente y mediante la resistencia al desafo experimental. En el caso de las vacunas muertas, debe llevarse a cabo una prueba en aves de mayor edad que sigan poniendo, utilizando el programa de vacunacin recomendado, de modo que pueda demostrarse la prolongacin de la seroconversin. Puede utilizarse un sistema de puntuacin para cuantificar la gravedad de los signos. Vacuna viva (atenuada)

Prueba de eficacia: Debe comprobarse la eficacia de cada una de las vas de administracin recomendadas. Se utilizan pavos que tengan como mximo la edad mnima recomendada para la vacunacin y estn libres de anticuerpos contra el MPVa. Se administra una dosis de campo de la vacuna del ttulo mnimo recomendado por una de las vas recomendadas a cada uno de 20 pavos, manteniendo 10 pavos como controles no vacunados. Pasados 21 das, se expone a todos los pavos mediante la administracin oculonasal de una dosis adecuada de una cepa virulenta del MPVa (en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la RTP se pueden adquirir virus de desafo adecuados; vase la Tabla de la Parte 3 de este Manual sobre Animales Terrestres). Se observan los pavos a diario durante 10 das y se registran sus signos clnicos individualmente. La vacuna no supera la prueba a no ser que al menos el 90% de los pavos vacunados sobreviva sin presentar signos clnicos ni lesiones atribuibles a una infeccin por el MPVa. Puede utilizarse un sistema de puntuacin para cuantificar la gravedad de los signos. Si menos de un 80% de los pavos no vacunados presenta signos clnicos tras el desafo, o ms de un 10% de las aves

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control o inoculadas muere por causas no atribuibles a la prueba, la prueba no es vlida. En el caso de que los resultados sean satisfactorios, esta prueba tiene que llevarse a cabo solo con uno de los lotes de entre todos los preparados a partir del mismo inculo. Vacuna muerta (inactivada)

Prueba de eficacia: Dado que las cadas de la puesta no son fciles de reproducir experimentalmente, la proteccin inducida por la vacuna frente a la cada de la puesta tras una exposicin a un MPVa virulento puede ser difcil de documentar y, por tanto, tambin son aceptables protocolos destinados a demostrar la reduccin en los niveles de excrecin. Como alternativa, tambin puede utilizarse la induccin de una respuesta inmunitaria duradera tras la inyeccin de la vacuna inactivada. Para el ltimo experimento, se administra a un mnimo de 20 pavos no inmunizados una dosis de vacuna a la edad recomendada (cerca del pico de puesta) por una de las vas recomendadas, y la respuesta de anticuerpos se mide 4 a 6 semanas despus de la vacunacin, mediante ELISA o neutralizacin srica. Si se recomienda una vacunacin primaria con una vacuna viva, a otro grupo de pavos se administra solo la vacunacin primaria, de modo que el efecto real de la vacuna inactivada pueda evaluarse individualmente.

2.

Mtodo de fabricacin

La vacuna debe fabricarse en instalaciones adecuadas limpias y seguras, totalmente independientes de las instalaciones de diagnstico y de las que albergan aves de corral comerciales. La produccin de la vacuna debe llevarse a cabo mediante un sistema de lotes de inculo utilizando una cepa vrica adecuada de la cual se conozca el origen y el historial de pases. Deben utilizarse huevos libres de patgenos especficos para todos los materiales utilizados en la propagacin y anlisis de la vacuna. Las vacunas vivas se preparan mediante el crecimiento en huevos o cultivos celulares. Las vacunas inactivadas pueden prepararse utilizando virus virulentos cultivados en cultivo celular o en huevos en embrionaje. Es necesaria una alta concentracin vrica. Estas vacunas se preparan como emulsiones agua-en-aceite. Una formulacin habitual es utilizar un 80% de aceite mineral con un 20% de suspensin vrica, con agentes emulsionantes y conservantes adecuados.

3.

Control durante el proceso

Contenido en antgeno: tras haber cultivado el virus hasta una concentracin alta, su ttulo debe determinarse mediante un cultivo de trquea o cultivos celulares, segn convenga, para la cepa vrica utilizada. El contenido en antgeno necesario para producir lotes satisfactorios de la vacuna depender de las determinaciones realizadas en la vacuna problema, que se ha demostrado que es eficaz en pruebas de laboratorio y en ensayos de campo. Inactivacin de vacunas muertas: esto a menudo se realiza con -propiolactona o bien con formalina. El agente inactivante y el procedimiento de inactivacin deben demostrarse en las condiciones de fabricacin de la vacuna para inactivar el virus de la vacuna y cualquier posible agente contaminante, como bacterias que pueden surgir a partir de las materias primas. Antes de la inactivacin, debe tenerse cuidado de asegurar una suspensin homognea libre de partculas que podran no ser penetradas por el agente inactivante. Debe llevarse a cabo una prueba para la inactivacin de la vacuna en cada lote tanto de la vacuna a granel tras la inactivacin, como del producto final. La prueba escogida debe ser adecuada para el virus vacunal utilizado y debe consistir en al menos dos pases en cultivos celulares susceptibles, embriones o pavos, con diez rplicas por pase. No debe observarse ningn indicio de la presencia de ningn virus ni microorganismo vivo. Esterilidad de las vacunas muertas: El aceite utilizado en la vacuna debe esterilizarse por calor a 160C durante 1 hora, o por filtracin, y debe demostrarse que el procedimiento es eficaz. Se llevan a cabo pruebas adecuadas para las vacunas basadas en una emulsin oleosa en cada uno de los lotes de vacuna final, como se ha descrito, por ejemplo, en la Farmacopea Europea.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las determinaciones de esterilidad y ausencia de contaminacin en materiales biolgicos se detallan en el Captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
Prueba de inocuidad en las vacunas vivas Se administran diez dosis de campo de la vacuna por va oculonasal a 10 pavos de la edad mnima recomendada para la vacunacin y libres de anticuerpos contra el MPVa. Se observan los pavos a diario al

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menos durante 21 das. La vacuna no supera la prueba si alguno de los pavos muere o presenta signos de enfermedad atribuible a la vacuna. Si ms de dos pavos presentan signos clnicos anmalos o mueren debido a causas no relacionadas con la vacuna, la prueba debe repetirse. Esta prueba se lleva a cabo en cada lote de la vacuna final. Prueba de inocuidad en las vacunas vivas

Se inoculan diez pavos, libres de anticuerpos maternos contra el MPVa, y de 14-28 das de edad, por las vas recomendadas con el doble de la dosis de campo. Las aves se observan durante 3 semanas. No deben aparecer reacciones anmalas locales ni sistmicas. Esta prueba se lleva a cabo en cada lote de la vacuna final.

b)

Potencia
Prueba de potencia en las vacunas vivas En cada lote de vacuna producido debe llevarse a cabo una prueba de potencia (titulacin del virus) en huevos en embrionaje, cultivos de trquea o cultivos celulares adecuados, segn convenga para el virus vacunal. En el momento de la expedicin, el ttulo de la vacuna debe ser lo bastante alto como para garantizar que el ttulo vrico mnimo por dosis se mantendr al menos hasta la fecha de caducidad. Adems, el mtodo descrito en el apartado C.1.c Vacuna viva (prueba de eficacia) debe utilizarse en un lote representativo de todos los lotes preparados a partir del mismo lote de inculo. Prueba de potencia en las vacunas vivas

La prueba de potencia para vacunas inactivadas se lleva a cabo a partir de los resultados de la prueba de eficacia en un lote representativo de virus de inculo primario de la vacuna, midiendo la produccin de anticuerpos.

d)

Estabilidad
Deben aportarse pruebas para al menos un lote representativo de la vacuna para demostrar que la vacuna supera la prueba de potencia del lote 3 meses despus de la fecha de caducidad indicada.

e)

Conservantes
En el caso de las vacunas que se presentan en recipientes multidosis, normalmente se requiere un conservante. Debe comprobarse la concentracin del conservante en la vacuna final y su persistencia a lo largo de todo el periodo de validez. Debe utilizarse un conservante adecuado ya establecido para este fin. Existen requisitos de niveles mximos de antibiticos, conservantes y agentes inactivantes residuales.

f)

Precauciones (riesgos)
El metapneumovirus aviar no est reconocido como agente zoontico, pero deben aplicarse precauciones a los pasos de fabricacin y durante la vacunacin, con el fin de minimizar la exposicin del personal a aerosoles de vacuna. Las vacunas en emulsin oleosa causan graves lesiones a la persona que administra la vacuna si se inyectan accidentalmente en la mano u otros tejidos. En caso de que suceda un accidente de este tipo, la persona debe acudir de inmediato a un hospital, llevando consigo el envase de la vacuna y el prospecto del fabricante. Cada frasco de vacuna y envase deben mostrar una advertencia clara de las graves consecuencias de una auto-lesin accidental.

5.
a)

Pruebas en el producto final

Inocuidad
Vase el apartado C.4.b.

b)

Potencia
Vase el apartado C.4.c.

BIBLIOGRAFA

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1.

ALKHALAF A.N., WARD L.A., DEARTH R.N. & SAIF Y.M. (2002). Pathogenicity, transmissibility and tissue distribution of avian pneumovirus in turkey poults. Avian Dis., 46, 650659. BYON-AUBOYER M.H., ARNAULD C., TOQUIN D. & ETERRADOSSI N. (2000). Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J. Gen. Virol., 81, 27232733. BYON-AUBOYER M.H. JESTIN V., TOQUIN D., CHERBONNEL M. & ETERRADOSSI N. (1999). Comparison of F-, Gand N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch. Virol., 144, 10911109. BENNETT R.S., NEZWORSKI J., VELAYUDHAN B.T., NAGARAJA K.V., ZEMAN D.H., DYER N. GRAHAM T., LAUER D.C., NJENGA M.K. & HALVORSON D.A. (2004). Evidence of avian pneumovirus spread beyond Minnesota among wild and domestic birds in central North America. Avian Dis., 48, 902908. BUYS S.B., DU PREEZ J.H. & ELS H.J. (1989). The isolation and attenuation of a virus causing rhinotracheitis in turkeys in South Africa. Onderstepoort J. Vet. Res., 56, 8798. CHIANG S., DAR A.M., GOYAL S.M., SHEIKH M.A., PEDERSEN J.C., PANIGRAHY B., SENNE D., HALVORSON D.A., NAGARAJA K.V. & KAPUR V. (2000). A modified enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of avian pneumovirus antibodies. J. Vet. Diagn. Invest., 12, 381384. COLLINS M.S. & GOUGH R.E. (1988). Characterization of a virus associated with turkey rhinotracheitis. J. Gen. Virol., 69, 909916. COLLINS M.S., GOUGH R.E. & ALEXANDER D.J. (1993). Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antibody and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathol., 22, 469479. COOK J.K.A. (2000). Avian rhinotracheitis. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 19, 602613.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10. COOK J.K.A. (2000). Avian pneumovirus infections of turkey and chickens. Vet. J. 160, 118125. 11. COOK J.K.A. & CAVANAGH D. (2002). Detection (metapneumoviruses). Avian Pathol., 31, 117132. and differentiation of avian pneumoviruses

12. COOK J.K.A., ELLIS M.M. & HUGGINS M.B. (1991). The pathogenesis of turkey rhinotracheitis virus in turkey poults inoculated with the virus alone or together with two strains of bacteria. Avian Pathol., 20, 155166. 13. COOK J.K.A., HUGGINS M.B., ORVELL S.J. & SENNE D.A. (1999). Preliminary antigenic characterization of an avian pneumovirus isolated from commercial turkeys in Colorado, USA. Avian Pathol., 28, 607617. 14. COOK J.K.A., JONES B. V., ELLIS M. M., LI J. & CAVANAGH D. (1993). Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies. Avian Pathol., 22, 257273. 15. COOK J.K.A., KINLOCH S., & ELLIS M.M. (1993). In vitro and in vivo studies in chickens and turkeys on strains of turkey rhinotracheitis virus isolated from the two species. Avian Pathol., 22, 157170. 16. ETERRADOSSI N. TOQUIN D., GUITTET M & BENNEJEAN G. (1995). Evaluation of different turkey rhinotracheitis viruses used as antigens for serological testing following live vaccination and challenge. J. Vet Med. [B], 42, 175186. 17. GIRAUD P., GUITTET M., TOQUIN D. & BENEJEAN G. (1988). La rhinotrachite infectieuse de la dinde: description et rle dun nouvel agent viral. Rec. Med. Vet., 164, 1, 3944. 18. GIRAUD P., TOQUIN D., PICAULT J.P., GUITTET M. & BENEJEAN G. (1987). Utilisation de la mthode ELISA pour le srodiagnostic de linfection par le virus de la rhinotrachite infectieuse chez la dinde la poule et la pintade. Bull. Lab. Vet., 2728, 7175. 19. GOUGH R.E. (2003). Avian pneumoviruses. In: Diseases of Poultry, eleventh edition, Saif Y.M., Barnes H.J., Glisson J.R., Fadly A.M., McDougald L.R. & Swayne D. eds. Blackwell Publishing, 9299. 20. GOUGH R.E., COLLINS M.S., COX W.J. & CHETTLE N.J. (1988). Experimental infection of turkeys, chickens, ducks, guinea fowl, pheasants and pigeons with turkey rhinotracheitis virus. Vet. Rec., 123, 5859. 21. GOUGH R.E., MANVELL R.J., DRURY S.E.N. & PEARSON D.B. (1994). Isolation of an avian pneumovirus from broiler chickens. Vet. Rec., 134, 353354.

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22. GOYAL S.M., CHIANG S.J., DAR A.M., NAGARAJA K.V., SHAW D.P., HALVORSON D.A. & KAPUR V. (2000). Isolation of avian pneumovirus from an outbreak of respiratory illness in Minnesota turkeys. J. Vet. Diagn. Invest., 12, 166168. 23. GRANT M., BAXTER-JONES C. & WILDING G.P. (1987). An enzyme-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of turkey rhinotracheitis infection. Vet. Rec., 120, 279280. 24. GUIONIE O., TOQUIN D., ZWINGELSTEIN F., ALLEE C., SELLAL E., LEMIERE S. & ETERRADOSSI N. (2007). A laboratory evaluation of a quantitative real-time RT-PCR for the detection and identification of the four subgroups of avian metapneumoviruses. J. Virol. Methods, 139, 150158. 25. JIRJIS F.F., NOLL S.L., HALVORSON D.A., NAGARAJA K.V., MARTIN F. & SHAW D.P. (2004). Effects of bacterial coinfection on the pathogensis of Avian Pneumovirus infection in turkeys. Avian Dis., 48, 3449. 26. JONES R.C., WILLIAMS R.A., BAXTER-JONES C., SAVAGE C.E. & WILDING P. (1988). Experimental infection of laying turkeys with rhinotracheitis virus: distribution of virus in the tissues and serological response. Avian Pathol., 17, 841850. 27. JUHASZ K., & EASTON A. J. (1994). Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J. Gen. Virol., 75, 28732880. 28. LEE E.H., SONG M.S., SHIN J.Y., LEE Y.M., KIM C.J., LEE Y.S., KIM H. & CHOI Y.K. (2007). Genetic characterization of avian metapneumovirus subtype C from pheasants in a live bird market. Virus Res., doi:10106/j.virusres.2007.03.029. 29. LWAMBA H.C.M., ALVAREZ R., WISE M.G., YU Q. HALVORSON D., NJENGA M.K. & SEAL B.S. (2005). Comparison of full-length genome sequence of Avian metapneumovirus subtype C with other paramyxoviruses. Virus Res., 107, 8392. 30. MAJO N., ALLAN G.M., OLOAN C.J., PAGES A. & RAMIS A.J. (1995). A sequential histopathologic and immunocytochemical study of chickens, turkey poults and broiler breeders experimentally infected with turkey rhinotracheitis virus. Avian Dis., 39, 887896. 31. MASE M.S., ASAHI S., IMARI K. NAKAMURA K & YAMAGUCHI S. (1996). Detection of turkey rhinotracheitis virus from chickens with swollen head syndrome by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). J. Vet. Med. Sci., 58, 359361. 32. MASE M., YAMAGUCHI S., TSUKAMOTO K., IMADA T., IMAI K. & NAKAMURA K. (2003). Presence of avian pneumovirus subtypes A and B in Japan. Avian Dis., 47, 481484. 33. MCFARLANE-TOMS I.P. & JACKSON R.J.H. (1998). A comparison of three commercially available ELISA tests for detecting antibodies to turkey rhinotracheitis virus (TRTV). Proceedings of the International Symposium on Infectious Bronchitis and Pneumovirus infections in Poultry, Rauischholzhausen, Germany, 1518 June, pp 2637. 34. MEKKES D. R. & DE WIT J.J. (1999). Comparison of three commercial ELISA kits for the detection of turkey rhinotracheitis virus antibodies. Avian Pathol., 27, 301305. 35. MORLEY A.J. &THOMSON D.K. (1984). Swollen-head syndrome in broiler chickens. Avian Dis., 28,238243. 36. NAYLOR C.J. & JONES R.C. (1993). Turkey rhinotracheitis: a review. Vet. Bull., 63, 439449. 37. NAYLOR C., SHAW K., BRITTON P. & CAVANAGH D. (1997). Appearance of type B avian pneumovirus in Great Britian. Avian Path., 26, 327338. 38. NJENGA M.K., LWAMBA H.M. & SEAL B.S. (2003). Metapneumoviruses in birds and humans. Virus Res., 91, 163169. 39. OBRIEN J.D.P. (1985). Swollen head syndrome in broiler breeders. Vet. Rec., 117, 619620. 40. PATTISON M., CHETTLE N., RANDALL C.J. & WYETH P.J. (1989). Observations on swollen head syndrome in broiler and broiler breeder chickens. Vet. Rec., 125, 229231. 41. PEDERSEN J.C., REYNOLDS D.L. & ALI A. (2000). The sensitivity and specificity of a reverse transcriptasepolymerase chain reaction assay for the avian pneumovirus (Colorado strain). Avian Dis., 44, 681685.

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42. PEDERSEN J.C., SENNE D.A., PANIGRAHY B. & REYNOLDS D.L. (2001). Detection of avian pneumovirus in tissue and swab specimens from infected turkeys. Avian Dis., 45, 581592. 43. PICAULT J.P., GIRAUD P., DROUIN P., GUITTET M., BENNEJEAN G., LAMANDE J., TOQUIN D. & GUEGUEN C. (1987). Isolation of a TRTV-like virus from chickens with swollen-head syndrome. Vet. Rec., 121, 135. 44. PRINGLE C.R. (1998). Virus Taxonomy-San Diego. Arch. Virol., 143, 14491459. 45. SENNE D.A., EDSON R.K., PEDERSEN J.C. & PANIGRAHY B. (1997). Avian pneumovirus update. In: Proceedings of the American Veterinary Medical Association, 134th Annual Congress, Reno, Nevada, July 1997, p 190. 46. SHIN H.J., JIRJIS F.F., KUMAR M.C., NJENGA M.K., SHAW D.P., NOLL S.L., NAGARAJA K.V. & HALVORSON D.A. (2002). Neonatal avian pneumovirus infection in commercial turkeys. Avian Dis., 46, 239244. 47. SHIN H.J., MCCOMB B., BACK A., SHAW D.P., HALVORSON D.A. & NAGARAJA K. (2000). Susceptibility of broiler chicks to infection by avian pneumovirus of turkey origin. Avian Dis., 44, 797802. 48. SHIN H.J., NAGARAJA K.V., MCCOMB B., HALVORSON D.A., JIRJIS F.F., SHAW D.P., SEAL B.S. & NJENGA M.K. (2002). Isolation of avian pneumovirus from mallard ducks that is genetically similar to viruses isolated from neighbouring commercial turkeys. Virus Res., 83, 207212. 49. STUART J.C. (1989). Rhinotracheitis:turkey rhinotracheitis (TRT) in Great Britain. Recent Advances in Turkey Science. Poultry Science Symposium, 21, 217224. 50. TANAKA M., TAKUMA H., KOKUMAI N., OISHI E., OBI T., HIRAMATSU K. & SHIMIZU Y. (1995). Turkey rhinotracheitis virus isolated from broiler chicken with swollen head syndrome in Japan. J. Vet. Med. Sci., 57, 939945. 51. TOQUIN D., BAYON-AUBOYER M.H., ETERRADOSSI N., MORIN H. & JESTIN V. (1999). Isolation of a pneumovirus from a Muscovy duck. Vet. Rec., 145, 680. 52. TOQUIN D., BYON-AUBOYER M.H., SENNE D. & ETERRADOSSI N. (2000). Lack of antigenic relationship between early French and recent North-American non-A non-B turkey rhinotracheitis viruses. Avian Dis., 44, 977982. 53. TOQUIN D., DE BOISSESON C., BEVEN V., SENNE D.A. & ETERRADOSSI N. (2003). Subgroup C avian metapneumovirus (MPV) and the recently isolated human MPV exhibit a common organization but have extensive sequence divergence in their putative SH and G genes. J. Gen. Virol., 84, 21692178. 54. TOQUIN D., GUIONIE O., JESTIN V., ZWINGELSTEIN F., ALLEE C. & ETERRADOSSI N. (2006) European and American subgroup C isolates of avian metapneumovirus belong to different genetic lineages. Virus Genes, 32, 97103. 55 VAN DEN HOOGEN B.G., DE JONG J.C., GROEN J., KUIKEN T., DE GROOT R., FOUCHIER R.AM. & OSTERHAUS A.D.M.E. (2001) A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nature Med., 7, 719724.

56. VAN DE ZANDE S., NAUWYNCK H., DE JONGHE S. & PENSAERT M. (1999). Comparative pathogenesis of a subtype A with a subtype B avian pneumovirus in turkeys. Avian Pathol., 28, 239244. 57. VAN DE ZANDE S., NAUWYNCK H., NAYLOR C. & PENSAERT M. (2000). Duration of cross-protection between subtypes A and B avian pneumovirus in turkeys. Vet. Rec., 147, 132134. 58. VAN LOOCK M, LOOTS K, ZANDE SV, HEERDEN MV, NAUWYNCK H, GODDEERIS BM, VANROMPAY D. (2006) Pathogenic interactions between Chlamydophila psittaci and avian pneumovirus infections in turkeys. Vet. Microbiol., 10, 5363. 59. VELAYUDHAN B.T., MCCOMB B., BENNETT R.S., LOPES V.C., SHAW D., HALVORSON D.A., NAGARAJA K.V. (2005). Emergence of a virulent type C avian metapneumovirus in turkeys in Minnesota. Avian Dis., 49, 520526. 60. WORTHINGTON K.J., SARGENT B.A., DAVELAAR F.G. & JONES R.C. (2003). Immunity to avian pneumovirus infection in turkeys following in ovo vaccination with an attenuated vaccine. Vaccine, 21, 13551362. 61. YU Q., DAVIS P.J., LI J. & CAVANAGH D. (1992). Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveals a gene order different from that of respiratory syncytial virus. Virology, 186, 426434.

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NB: Existe un Laboratorio de Referencia de la OIE para la rinotraquetis del pavo (en la Tabla del final de este Manual Terrestre o en la pgina web de la OIE, www.oie.int, puede consultarse la lista actualizada).

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