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    Extracción de ADN FS

    Cargado por

    Matthew Perkins
    El documento describe un método de extracción de ADN vegetal utilizando el buffer CTAB. El método implica macerar tejido vegetal con buffer CTAB a 65°C, extraer el ADN con cloroformo, precipitarlo con isopropanol y lavarlo con etanol antes de resuspenderlo en buffer TE. El buffer CTAB contiene Tris, EDTA, NaCl, CTAB y PVP para aislar el ADN de plantas.

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    Extracción de ADN FS

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    Matthew Perkins
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    El documento describe un método de extracción de ADN vegetal utilizando el buffer CTAB. El método implica macerar tejido vegetal con buffer CTAB a 65°C, extraer el ADN con cloroformo, precipitarlo con isopropanol y lavarlo con etanol antes de resuspenderlo en buffer TE. El buffer CTAB contiene Tris, EDTA, NaCl, CTAB y PVP para aislar el ADN de plantas.

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    El documento describe un método de extracción de ADN vegetal utilizando el buffer CTAB. El método implica macerar tejido vegetal con buffer CTAB a 65°C, extraer el ADN con cloroformo, precipitarlo con isopropanol y lavarlo con etanol antes de resuspenderlo en buffer TE. El buffer CTAB contiene Tris, EDTA, NaCl, CTAB y PVP para aislar el ADN de plantas.

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    El documento describe un método de extracción de ADN vegetal utilizando el buffer CTAB. El método implica macerar tejido vegetal con buffer CTAB a 65°C, extraer el ADN con cloroformo, precipitarlo con isopropanol y lavarlo con etanol antes de resuspenderlo en buffer TE. El buffer CTAB contiene Tris, EDTA, NaCl, CTAB y PVP para aislar el ADN de plantas.

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    Extraccin de ADN (Mtodo CTAB)

    1. Colocar el tejido vegetal fresco (hojas, 2550 mg) en un mortero o tubo Eppendorf de 1.5 ml y macerar con nitrgeno lquido. Tambin se puede agregar buffer de extraccin primero y luego macerar con pistilo y Celite (diatomeas). 2. Agregar inmediatamente 500 ul de buffer de extraccin [2% p/v CTAB, 1.42 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 2% p/v polyvinylpyrrolidone (PVP-40), 5 mM cido ascrbico, 4 mM cido dietilditiocarbmico DIECA (Doyle and Doyle 1990)] precalentado a 65 C. Mezclar en vortex e incubar a 65 C por 1 hora. 3. Agregar 500 ul de cloroformo : alcohol isoamilico (24:1) e invertir el tubo varias veces (10). Centrifugar a mxima velocidad por 10 min a temperatura ambiente. Transferir la fase superior (acuosa, como 400 ul) que contiene el ADN a un nuevo tubo Eppendorf. 4. Precipitar el ADN con 0.7 volmenes de isopropanol (270) y mezclar por inversin varias veces. Se puede dejar las muestras a temperatura ambiente o 4C por 5-60 min para incrementar la cantidad de ADN. Centrifugar a mxima velocidad por 10 min. 5. Eliminar el sobrenadante y lavar el botn de ADN con etanol al 70%, dejar secar y resuspender en 15-50 ul de buffer TE. 6. Se puede agregar incubacin con ARNasa para eliminar ARN. Agregue 1 ul de ARNasa (20 mg/ml) por cada 100 ul de ADN.

    Composicin del Buffer CTAB


    100 mM Tris-Cl (pH 8.0) 20 mM EDTA (pH 8.0) 1.4 M NaCl 2% (p/v) CTAB (bromuro de hexadecil trimetil amonio) 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) Para hacer 250 ml: 25 ml de Tris-Cl 1 M pH 8.0, Preparar con agitacin a 65 C, agregar el CTAB lentamente. Almacenar indefinidamente a temperatura ambiente despus de autoclavar. Justo antes de usar, agregue 6 ul de 2-mercaptoetanol por ml del buffer.

    Stewart Jr, C. N. (1997). Rapid DNA extraction from plants. Fingerprinting Methods Based on Arbitrarily Primed PCR, 25-28. Chen, D. H., & Ronald, P. C. (1999). A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Molecular Biology Reporter, 17(1), 53-57. Tripta Jhang, Ajit K. Shasany. (2012). Random Amplified Marker Technique for Plants Rich in Polyphenols. In: Plant DNA Fingerprinting and Barcoding, Methods in Molecular Biology Volume 862, 61-74.

    Tris 1 M
    Agregue 12.11 gramos de Tris base en 80 ml de agua. Ajuste el pH de la solucin a 8.0 con HCl (~42 ml) cuando la solucin ya se ha enfriado a temperatura ambiente. Ajuste el volumen de la solucin a 100 ml y autoclave.

    Preparacin EDTA (0.5 M, pH 8.0)


    Agregue 18.61 gramos de EDTA disdico2H2O en 80 ml de agua. Mezcle vigorosamente en un agitador magntico y ajuste el pH a 8.0 con NaOH (~2 g de NaOH). Ajuste el volumen de la solucin a 100 ml y autoclave. El EDTA no se disolver hasta que el pH de la solucin sea ajustado a 8.0.

    NaCl 5 M
    Agregue 29.22 gramos de NaCl en 100 ml de agua.

    Acetato de sodio 3 M
    Agregue 24.61 gramos de acetato de sodio en 80 ml de agua. Ajuste el pH con HCl a 5.2 y el volumen de la solucin a 100 ml. Autoclave.

    Otros reactivos
    Cloroformo : Alcohol isoamilico (24:1 v/v): 480 ml de Cloroformo y 20 ml de alcohol isoamilico. Almacenar indefinidamente a temperatura ambiente. Isopropanol y etanol (100% y 70%). TE (1X) 10 mM TrisHCl, pH 8.0 y 1 mM EDTA, pH 8.0.

    Stewart Jr, C. N. (1997). Rapid DNA extraction from plants. Fingerprinting Methods Based on Arbitrarily Primed PCR, 25-28. Chen, D. H., & Ronald, P. C. (1999). A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications. Plant Molecular Biology Reporter, 17(1), 53-57. Tripta Jhang, Ajit K. Shasany. (2012). Random Amplified Marker Technique for Plants Rich in Polyphenols. In: Plant DNA Fingerprinting and Barcoding, Methods in Molecular Biology Volume 862, 61-74.

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