Observacion en Fresco

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Practica de Microbiología 2010

Universidad Autó noma de Zacatecas


“Francisco García Salinas”
Á rea de Ciencias de la Salud
Unidad Acadé mica de Ciencias Químicas
Químico Farmacé utico Bió logo

REPORTE DE PRÁCTICA: LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA


PRACTICA 0 Y 1

MEDIDAS DE SEGURIDAD, MICROSCOPÍA Y OBSERVACIÓN


MICROSCÓPICA EN FRESCO

*López Arellano Abraham


M. en C. Rubén Méndez Márquez

*5°Semestre Grupo “C” Programa educativo Q.F.B. UACQ, ACS, Campus UAZ
Siglo XXI, carretera Zacatecas-Guadalajara Km 6 s/n ejido La Escondida Cp. 98160
Zacatecas Zac. Ciclo agosto-diciembre 2010

Lunes 23 de agosto-Lunes 30 de agosto 2010

OBJETIVO

Conocer las medidas de seguridad del laboratorio de microbiología aprender el correcto uso
y manejo del microscopio y observar la estructura, disposición y tamaño, así como la
movilidad y crecimiento en ausencia de tinción, de algunas clases de microorganismos que
se encuentran en la naturaleza mediante el uso del microscopio.

RESUMEN

La practica introductoria o número cero consistió en retomar los conocimientos de las


medidas de seguridad de un laboratorio añadiendo además las especificaciones para un
laboratorio donde se trabaja con microorganismos como lo es el de microbiología, también
repasamos un tanto la microscopia principalmente el uso del microscopio óptico así como
sus partes y cuidados al manejarlo ya que será nuestra principal herramienta de trabajo en
el laboratorio, para la práctica uno realizamos una observación microscópica en fresco de
una suspensión de levaduras así como una observación de orina.

Palabras clave: Medidas de seguridad, microscopía, observación en fresco.

INTRODUCCIÓN
Laboratorio de Microbiología
LÓPEZ ARELLANO ABRAHAM
UAZ, ACS, UACQ, QFB, QUINTO SEMESTRE GRUPO C
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Para un adecuado uso de las instalaciones de un laboratorio es necesario tener siempre


presentes las medidas de seguridad en este caso en un laboratorio de microbiología
(Bacteriología, parasitología, micología, virología) las normas serán de bioseguridad.
Las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de
transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas
de infección en el laboratorio vinculadas a accidentes por exposición a residuos peligrosos
biológico infecciosos.
Los objetivos de estas recomendaciones son establecer:
1) Las medidas de prevención de accidentes del personal de salud que está R.P.B.I.´s
2) La conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos.
Se debe tener presente que debido al desarrollo científico técnico se deben prever
revisiones periódicas de estas normas a los efectos de asegurar la actualización de las
mismas.
¿Qué es Bioseguridad?

Bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas orientadas a proteger
al personal que trabaja en el laboratorio, a los pacientes y al medio ambiente que pueden
verse afectados como resultado de la actividad del laboratorio.

Esta se desarrolla en conjunto con el personal que debe cumplir las normas, las autoridades
que deben hacerlas cumplir y la dirección del laboratorio que debe implementar los medios
para que se cumplan.

Debe existir una persona responsable de la bioseguridad en cada laboratorio, quien deberá
encargarse de controlar la capacitación de todas las personas que
trabajen o que ingresen al mismo y evaluar el cumplimiento de lo establecido en las normas
vigentes.

REGLAMENTO GENERAL

 El acceso al laboratorio está limitado a personal autorizado.


 El personal del laboratorio debe involucrarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
 Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada
contención biológica.
 Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre
que se produzca un derrame.
 Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incineradas o descartadas fuera
del laboratorio deben ser transportadas en contenedores cerrados, resistentes e
impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo
de residuo.
 El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado.
 El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera
que, en caso de caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo
en cajas herméticas o hieleras. Estas deberán ser rígidas y resistentes a los golpes,
contar con materiales absorbentes en su interior y ser de fácil desinfección.
 Ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc.,
deben estar disponibles en todo momento.
 Todo el personal debe poner especial cuidado para evitar
el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin, deben
usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles

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patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área de
trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se tomará
el teléfono, se tocarán cuadernos o formularios, etc.
 Después de quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.

 Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras


y/o aerosoles.

 Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto inoculación y de


generación de aerosoles.

 Está estrictamente prohibido pipetear con la boca.

 Las agujas y jeringas usadas, así como los bisturís, deben ser desechados sólo en
contenedores especiales diseñados para este propósito.

 No deben usarse zapatos abiertos en el laboratorio.   No se recomienda usar


sandalias, zuecos, tacones altos ni ningún tipo de zapatos que deje el pie al
descubierto.

 El personal con cabello largo debe llevarlo recogido.

 Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está estrictamente prohibido en el área


de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebidas.

 El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades


rutinarias, al concluir la jornada laboral y, siempre, antes de abandonar
el laboratorio.

 Se debe lavar por separado la ropa que se ha usado en el laboratorio.   Se


recomienda remojarla en una solución de cloro previo al lavado.   NO LA MEZCLE
CON LA ROPA DE
SU FAMILIA.

 Los suelos, paredes y techos deben ser impermeables al agua y resistentes a


diferentes productos químicos, de tal forma que permitan una limpieza profunda y
una posterior descontaminación.

 Todas las tuberías deben estar identificadas con códigos de color.

 Cada laboratorio debe tener extinguidores a los que debe dárseles mantenimiento
anualmente.

 Cada laboratorio debe contar con un botiquín con el equipo mínimo de primeros
auxilios, el cual debe ser renovado frecuentemente

 Evitar hábitos peligrosos como llevarse las manos a la boca, nariz y ojos.

 No guardar alimentos ni bebidas en los refrigeradores del laboratorio.

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 Etiquetar todo material que se incube con los siguientes datos: microorganismo
utilizado, fecha, grupo, nombre de las personas que trabajaron con el material

 Inactivar con solución de hipoclorito de sodio todo aquel material biológico antes de
su disposición final.

 Esterilizar material que contenga microorganismos, después depositar los residuos


en el recipiente correspondiente para RPBI´s. Todo desecho que no esté
contaminado con RPBI´s tirar en el bote de basura.[1]

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO


INFECCIOSOS
Paso 1.Identificacion de los residuos
Objetos punzocortantes, patológicos (placentas piezas anatómicas etc.), Residuos
no anatómicos (gasas torundas empapados de líquidos corporales), Utensilios
desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes
infecciosos, Sangre líquida y sus derivados.
Paso 2 Envasado de los residuos generados
Se envasaran de acuerdo al tipo por: Punzocortantes (en plástico duro color rojo),No
anatómicos materiales desechables y de curación goteando sangre( en
contenedores y bolsas rojas), Patológicos (muestras para análisis y partes
corporales) en bolsas y contenedores amarillos, Sangre liquida y fluidos corporales
en contenedor duro rojo, todos ellos marcados con el símbolo de “biohazard”.
Paso 3 Almacenamiento temporal
Los RBBI deberán almacenarse en contenedores con tapa y permanecer cerrados
todo el tiempo, no debe haber residuos tirados a los alrededores del contenedor.
Paso 4 Recolección y transporte externo
Recolección una o dos veces al día, no deben llenarse las bolsas mas de %80, no
comprimir las bolsas y certificar que los contenedores estén bien tapados, cerrar las
bolsas con nudo o cinta adhesiva, la basura común en los botes convencionales, los
carros de transporte se lavaran diario con agua y jabón para garantizar sus
condiciones higiénicas.
Paso 5 Tratamiento.
Los RPBI´s bien tratados tendrán que
Estar libres de agentes infecciosos-quedar irreconocibles.
Paso 6 Disposición final
A la basura, los RPBI´s sin tratamiento tendrán que enviarse a empresas
recolectoras autorizadas.

INTRODUCCION A LA MICROSCOPIA

Microscópio

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El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento


que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El
tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un
instrumento óptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen
aumentada del objeto y que funciona por refracción.
La ciencia que investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama
microscopía.
En general, cualquier microscopio requiere los siguientes elementos: una fuente (como un
haz de fotones o de electrones), una muestra sobre la que actúa dicha fuente, un receptor
de la información proporcionada por la interacción de la fuente con la muestra, y un
procesador de esta información (en general, un ordenador)
Historia del microscopio
El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo Galilei, según los italianos, o
por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. En 1628 aparece en la obra de
William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares
sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia.
En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el
material era poroso. y con poros, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a
modo de cajas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células
muertas. Unos años más tarde, Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células
vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.
A mediados del siglo XVII un holandés, Anton Van Leeuwenhoek, utilizando microscopios
simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias,
espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación
científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas
sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo
de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias
focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las bacterias y los
protozoos; examinó por primera vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene
espermatozoides. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723,
26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.
Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por
asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John
Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En
el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con
combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos
acromáticos excelentes.
Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su
estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras
ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe
publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de
inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de
2000. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los
microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o 1000X. Sin
embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares
(núcleo, mitocondria, etc.).
El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de microscopio
electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra
consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en
Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de
barrido (SEM).
Tipos de microscopios
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Microscopio electrónico de barrido.


 Microscopio óptico
 Microscopio simple
 Microscopio compuesto
 Microscopio de luz ultravioleta
 Microscopio de fluorescencia
 Microscopio petrográfico
 Microscopio en campo oscuro
 Microscopio de contraste de fase
 Microscopio de luz polarizada
 Microscopio confocal
 Microscopio electrónico
 Microscopio electrónico de transmisión
 Microscopio electrónico de barrido
 Microscopio de iones en campo
 Microscopio de sonda de barrido
 Microscopio de efecto túnel
 Microscopio de fuerza atómica
 Microscopio virtual
 Microscopio de antimateria

Partes del microscopio óptico

Partes Mecánicas
 Sistema de soporte o estativo:  
Pie    
Brazo
       Tubo
        Platina
         Revolver
 Sistema de ajuste:
        Tornillo macrométrico
        Tornillo micrométrico
 Parte óptica:
o Fuente de iluminación
o Condensador y diafragma
o Lentes: oculares (10x y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y 100x).[2]

Microscopía
La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles
demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la microscopía se evidencia los
grandes aportes que la física ha hecho a la biología.
Exceptuando técnicas como el microscopio de fuerza atómica, el microscopio de iones en
campo y el microscopio de efecto túnel, la microscopía generalmente implica la difracción,
reflexión o refracción de radiación incidente en el sujeto de estudio. En la microscopía de luz
clásica, esto implica el paso de luz transmitida a través o reflejada desde el sujeto mediante
una serie de lentes, para poder ser detectada directamente por el ojo o impresa en una
placa fotográfica.
En el microscopio compuesto, para tener una imagen detallada y fiel en cuanto a calidad, de
los microorganismos y sus fenómenos, se debe tener correspondiente a la parte óptica: la
luz, la cantidad de esta y su concentración en la muestra, además de que proviene de forma
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directa por medio de un bombillo incorporado (electricidad) o un espejo en donde se dé la


reflexión de la luz. Están los lentes, con los poderes de aumento y resolución, y en tercer
lugar está el índice de refracción con los distintos líquidos que se utilizan para las
observaciones. En cuanto a la parte mecánica tenemos los tornillos y sus engranajes.
También hay una forma de microscopía basada en una sonda muy pequeña que reconoce
las perturbaciones que ocurren al extremo de la sonda debidas a efectos eléctricos.
Anton van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un vendedor de telas, aficionado a pulir
lentes, logró fabricar lentes lo suficientemente poderosas como para observar bacterias,
hongos y protozoos, a los que llamó "animálculos"
El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir de éste, los
avances tecnológicos permitieron llegar a los modernos microscopios de nuestro tiempo, los
que existen de varios tipos y son usados con diferentes fines.
Para impedir desviaciones de la luz, se utiliza el aceite de cedro o inmersión en la muestra.

FUNDAMENTO DE LA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA EN FRESCO


Técnica de Observación en Fresco
Son todas aquellas formas o métodos de observación, mediante los cuales los objetos a
investigarse, no sufren cambios o alteraciones en cuanto a su forma, estructura o
composición química o sentido de vitalidad de los mismos; para ello los objetos deberán ser
observados tal como existen o máximo inmersos en un medio similar, como el caso de las
soluciones fisiológicas. Solo así podrán ser estudiados en su real y verdadera naturaleza.
Estos métodos no suelen dar sin embargo la máxima visualización del objeto. Su uso se
recomienda para el estudio de parásitos en heces, de secreciones corporales, etc.
Las preparaciones en fresco permiten observar a los microorganismos suspendidos en un
líquido en condiciones de vida normal. Es muy útil para observar especies que se dañarían
al teñirlas o fijarlas, como espirilos, así como para observar la movilidad, fenómenos de
multiplicación y esporulación.[3]
Sedimento de orina
El sedimento de orina centrifugada es muy importante y representa el primer paso en el
laboratorio para el diagnóstico de una IU
El sedimento de orina es la modalidad más básica de análisis. Sirve para determinar la
presencia de elementos tridimensionales en la orina (generalmente células o cristales). La
forma tradicional de realizarlo es con la observación de una muestra de orina centrifugada al
microscopio. Actualmente existe aparataje que da automáticamente el resultado del
sedimento de orina. El resultado suele estar listo en unos pocos minutos.

Para recoger la muestra suele pedírsele al paciente que orine una vez dentro de un botecito.
La muestra fresca es mirada al microscopio (óptico o automático). Partiendo de la base de
que en la orina no debe existir prácticamente ninguna célula o cuerpo sólido, el hallazgo de
cualquiera de ellas suele ser patológico y orienta a una u otra enfermedad.[4]

MATERIAL Y EQUIPO
 Laminas portaobjetos
 Cubreobjetos
 Pipetas Pasteur
 Microscopio Óptico ( marca Carl Zeizz)línea Axiostar Plus (serie student).
 Tubos para centrifuga.
 Centrifugador

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REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS


 Una muestra de orina recientemente obtenida
 Una suspensión de levadura Sacharomyces cereviceae

PROCEDIMIENTO
1.- Agitar la suspensión de levadura y con la pipeta Pasteur tomar una pequeña porción
depositarla en el portaobjetos.
2.-Cubrir con el cubreobjetos y observar al microscopio con el objetivo seco débil, después
de enfocar con este objetivo pasar al seco fuerte y examinar al menos tres campos
microscópicos, dibujar y anotar lo observado.
3.- Centrifugar la orina a 2500 rpm durante 5 minutos, decantamos la orina para obtener el
sedimento.
4.-Tomamos la muestra del sedimento y observamos en fresco al igual que la levadura.

5.-Dibujamos y anotamos lo observado.


OBSERVACION Y RESULTADOS

Suspensión de levaduras Sacharomyces cereviceae

Seco débil 10x Seco fuerte 40x

Sedimento urinario

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Seco débil 10x Seco fuerte 40x

Se observan levaduras Sacharomyces cereviceae tienen forma redonda u ovalada se


observan individualmente, como también agrupaciones o colonias de algunas decenas de
ellas. Su color transparente amarillezco tal vez debido a la luz de la lámpara de tungsteno de
la fuente luminosa, su contorno más oscuro denota la membrana celular se observa que aun
tienen movimiento debido a que fluyen en el líquido.
En el otro portaobjetos observamos sedimento urinario el cual contiene principalmente
agrupaciones de cristaloides sedimentarios amorfos aunque se puede apreciar la forma de
agujas o estrellas, aparecen unas cuantas células epiteliales procedentes de la vejiga o de
la uretra externa. Cristales: la orina normal contiene cristales y componentes amorfos que
precipitan al enfriarse la orina. Según el pH de la orina pueden precipitar:
Orina alcalina: cristales de urato amónico, trifosfatos, fosfato cálcico, fosfatos
amorfos y carbonato cálcico
Orina ácida: cristales de ácido úrico, cristales de oxalato cálcico, cristales de urato
sódico y uratos amorfos. Sulfamidas
Estos cristales se consideran normales si proceden de solutos que se encuentran
fisiológicamente en la orina.

DISCUSION

Durante las prácticas hicimos énfasis en la seguridad dentro del laboratorio porque
estamos trabajando con microorganismos y residuos peligrosos así que es mejor
tomar todas las medidas y precauciones posibles a fin de minimizar los riesgos, por
lo mismo también fue necesario revisar los conocimientos acerca del uso y el
manejo del microscopio el cual usaremos para nuestras observaciones de los
distintos microorganismos, en el sedimento urinario observamos varios tipos de
cristales y partículas que se discute que pueden ser distintos tipos de cristales y
algunas células consultando en un atlas de sedimento urinario pudimos deducir y
suponer que se trataba de los ya mencionados en las observaciones.

CONCLUSION

Siempre seguir el reglamento interno del laboratorio maximizara nuestra eficiencia y


seguridad durante el trabajo, Es necesario aprender el buen manejo y correcto uso
del microscopio óptico para realizar una buena observación de las muestras,
Es muy útil la observación en fresco, El sedimento de orina no es el único tipo de
análisis de orina, pero es el más frecuentemente solicitado como técnica de
exploración para el diagnóstico de enfermedades, no solo de la vía urinaria
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CUESTIONARIO

1.- ¿Qué significa el poder de resolución de un microscopio?


El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio de percibir por separado
dos puntos pequeñ os, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la capacidad para percibir
detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa
dichos puntos.

2.- Describa los tipos de agrupación de los cocos.


Coco, tipo morfológico de bacteria. Tiene forma más o menos esférica (ninguna de sus
dimensiones predomina claramente sobre las otras).Algunos ocasionan enfermedades a los
humanos (Ej:neumococo y estafilococo) también es causante de enfermedades como el de
la meningitis, otros resultan inocuos o incluso benéficos.
Los cocos se dividen en:
 Diplococos: Son pares.
 Estreptococos: En cadena.
 Estafilococos: En racimo.
 Tetradas: En número de 4.
 Sarcinas: En paquetes.

3.- Mencione el tamaño promedio de las bacterias.


Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan un tamaño de algunos
micrómetros de largo (entre 0,5 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo
esferas(cocos), barras(bacilos) y hélices.
4.- ¿Que significa el término para focal?
Los objetivos se pueden cambiar con un mínimo o sin re-enfoque, esto se conoce como
parafocal.
5.- Mencione otros elementos que podemos observar el un sedimento urinario.
En condiciones normales, el sedimento urinario no contiene células, o su número es escaso, y no
contiene tampoco microorganismos ni otros sólidos como proteínas o cristales.
Permite el recuento e identificación de elementos celulares como glóbulos blandos o rojos, de
cristales como los de calcio o ácido úrico, y de microorganismos, presentes en la orina.
Podemos ver ademá s de materia orgá nica sedimentos de materia inorgá nica como lo es
cristales de algunos minerales como calcio, ademá s de células del epitelio urinario que
se ven frecuentemente.
Elementos que aparecen en el sedimento[5]
 Células del epitelio de transición
 Células del epitelio tubular
 Cristales de Fosfatos
 Cristales de Acido Úrico
 Cristales de Carbonato de Calcio
 Cristales de Oxalato de Calcio
 Glóbulos Rojos y Blancos
 Cilindros Urinarios
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REFERENCIAS

1.-http://64.47.84.11/biosafetylab/index.html

2.-http://www.mailxmail.com/curso-microscopio/partes-microscopio-optico
3.-http://www.uvg.edu.gt/dti/profesores/ggini/bacteriologia/pruebas.htm
http://www.iqb.es/monografia/fichas/orina/orina.htm
4.-Macías A. Diagnóstico de IVU.: el cultivo de orina y sus alternativas. Infectología 1991;
n°8,p.427-431.
5.-JA Simerville, WC. Maxted, JJ Pahira. Urinalysis: A Comprehensive Review. Am Fam
Physician 2005;71:1153-62

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