革蘭氏染色

經革蘭氏染色的炭疽桿菌（圖中藍紫色棒狀）

革蘭氏染色（Gram Staining）是用來鑒别細菌的一種方法，細菌細胞壁上的主要成份不同，利用這種染色法，可將細菌分成兩大類，即革蘭氏陽性菌与革蘭氏陰性菌。這種染色法是由一位丹麥醫生漢斯·克里斯蒂安·革蘭（Hans Christian Gram，1853年－1938年）於1884年所發明，最初是用來鑑別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關係。

革蘭氏染色的对象是细菌的细胞壁。染色后的细菌可在显微镜下更好的观察，以便于区分。

不同的细菌在该染色法的作用底下反应不同，借以区分成为两类：

• 革蘭氏阳性细菌，胞壁染色后呈蓝紫色
• 革蘭氏阴性细菌，染色后呈红色。

这是辨别细菌种类的一个重要特性，对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗很有帮助。相對於容易導致人類疾病的革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌通常是益生菌，不會對人類致病，還能促進腸道菌種平衡，加強人體健康。

革蘭氏阳性细菌和革蘭氏阴性细菌对抗生素的反应并不一样。通过抽取样品医生可以在很短的时间内（5分钟左右）确定细菌的革蘭氏性质。这样，医生就可以迅速的给病人注射抗生素，而不需要等待通过细菌培植得到的化验结果，这往往需要几天时间。

染色流程及原理

流程可概括为：染色-脱色-複染。

• 第一步初染剂（Primary Stain）：使用结晶紫染色，染色部位主要為染細胞壁上的肽聚醣。

• 第二步媒染劑（Mordant）

加入複方碘溶液或稱革蘭氏碘液（Gram's Iodine）後會形成不溶性的結晶紫-碘（CV-I）複合体。細菌呈紫黑色。第二步是關键，它的目的是分辨细菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌，此複合體係結合於細胞壁之鎂、核糖核酸（Magnesium Ribonucletic Acid），形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘（Mg-RNA-CV-I）複合體，不易脫去。

• 第三步脫色劑（Decoloring Agent）

使用酒精（95%）脱色，試劑具脂溶劑（Lipid Solvent）和蛋白脫水劑（Protein Dehydrating Agent）之雙重功能。此步驟對革蘭氏陽性細菌無效，因為細胞壁上厚厚的細胞壁(成分為肽聚醣)阻隔了結晶紫-碘複合體的外渗，只能留在细菌体内。革蘭氏陰性菌細胞壁層薄，會被脱色而成為無色。

• 第四步複染劑（Counterstain）

為了對比，在此之後会加入番红（Safranin）進行複染，革蘭氏阴性菌成红色，而革蘭氏阳性菌仍保有原來的紫色。

定性

KOH-试验

另外的一种方法是氢氧化鉀-试验。将培养好的细菌取出一小部分，使其悬浮于一滴KOH溶液中。革蘭氏阳性菌与之不发生反应，用细针穿过该溶液，溶液呈正常液体状。革蘭氏陰性菌因細胞壁中主要成分為脂多醣，脂質含量較高，接觸強鹼KOH後與KOH發生皂化反應，以細針穿過會有明顯黏稠狀

氨肽酶试验

除了个别例外，只有革蘭氏阴性菌才能证明氨肽酶的存在。这是该试验的基础。 将要进行试验的细菌放入试管加水。放入一张显示肽酶活性的试纸，在37°C下等待10到35分钟，试纸变成深黄色。

實驗方法

藥品

1. 結晶紫：作為初染劑
2. 碘液：作為媒染劑
3. 酒精：濃度為95%，作為脫色劑
4. 番紅：複染劑

實驗器材

實驗菌種、接種環、蒸餾水、玻片、酒精燈、吸水紙、顯微鏡

實驗步驟

1. 將菌種抹於玻片上，並置於酒精燈上加以熱固定。
2. 將結晶紫滴於玻片上，靜置一分鐘後用蒸餾水洗去多餘的結晶紫。
3. 將碘液滴於玻片上，靜置一分鐘後，用蒸餾水洗去多餘的碘液。
4. 酒精脫色，直至無結晶紫的顏色流出為止。
5. 以番紅複染，約45秒後用蒸餾水洗去。
6. 用吸水纸將多餘的水吸乾後，即可置於顯微鏡下觀察。

注意事項：

• 以酒精燈烘乾玻片時，應避免熱源持續對同一點加熱，以免玻片破掉。
• 以蒸餾水洗去多餘藥品時，應避免直接沖洗到樣品的位置，可將玻片與水平面呈一個角度，使蒸餾水由玻片較高處往樣品處流去。
• 此實驗的標準作法應於無菌的狀態下操作。
• 本實驗可以大腸桿菌和金黃葡萄球菌作為控制組。

實驗結果

• 革蘭氏陽性菌呈現紫色，或更深的藍黑色。
• 革蘭氏陰性菌呈現粉紅色或紅色。

大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)染色結果

金黃葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)染色結果