GENOMIC ANALYSIS

Disusun oleh:
Kristin Halim (237160006)

Dosen Pembimbing:
drg. Erik Idrus, PhD
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER GIGI SPESIALIS ORTODONTI
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2023
SLIDE PERTAMA
• Genomics is the study of all of a person's genes (the genome), including interactions of those genes with each other and with the person's
environment..
• Deoxyribonucleic acid (DNA) is the chemical compound that contains the instructions needed to develop and direct the activities of nearly
all living organisms. DNA molecules are made of two twisting, paired strands, often referred to as a double helix
• Each DNA strand is made of four chemical units, called nucleotide bases, which comprise the genetic "alphabet." The bases are adenine (A),
thymine (T), guanine (G), and cytosine (C). Bases on opposite strands pair specifically: an A always pairs with a T; a C always pairs with a G.
The order of the As, Ts, Cs and Gs determines the meaning of the information encoded in that part of the DNA molecule just as the order of
letters determines the meaning of a word.
• An organism's complete set of DNA is called its genome. Virtually every single cell in the body contains a complete copy of the
approximately 3 billion DNA base pairs, or letters, that make up the human genome.
• With its four-letter language, DNA contains the information needed to build the entire human body. A gene traditionally refers to the unit of
DNA that carries the instructions for making a specific protein or set of proteins. Each of the estimated 20,000 to 25,000 genes in the human
genome codes for an average of three proteins.
• Located on 23 pairs of chromosomes packed into the nucleus of a human cell, genes direct the production of proteins with the assistance of
enzymes and messenger molecules. Specifically, an enzyme copies the information in a gene's DNA into a molecule called messenger
ribonucleic acid (mRNA). The mRNA travels out of the nucleus and into the cell's cytoplasm, where the mRNA is read by a tiny molecular
machine called a ribosome, and the information is used to link together small molecules called amino acids in the right order to form a
specific protein.
 Sequence tags are merely short regions of known sequence in

SLIDE KE-2
known locations. They were originally needed to assemble
genomes with vast amounts of noncoding DNA.
EST come from transcribed regions of the DNA.

• analisis seluruh gen, bukan hanya gen individu, baik melalui eksperimen maupun analisis data. Genom manusia sendiri
mengandung sekitar 20.000 gen yang mengkodekan protein. Meskipun bakteri pada umumnya hanya memiliki beberapa ribu
gen (4000 untuk bakteri model Escherichia coli, misalnya), beberapa bakteri memiliki sebanyak 10.000 gen-sekitar setengah
dari jumlah manusia.
• Pada akhirnya, semua fragmen urutan DNA dari sebuah genom harus disusun dalam urutan yang benar dan dikorelasikan dengan
peta genetik yang menunjukkan lokasi gen. Namun, pada organisme tingkat tinggi, gen hanya terdiri dari sebagian kecil DNA. Oleh
karena itu, diperlukan serangkaian penanda genetik selain gen itu sendiri. Bahkan, memasukkan motif sekuen seperti restriction
fragment length polymorphisms (RFLPs) (Bab 5: Manipulasi Asam Nukleat), dan variabel jumlah pengulangan tan-dem (VNTR)
serta mikrosatelit (lihat Bab 4: Gen, Genom, dan DNA) tidak cukup untuk memetakan genom yang besar. Pemecahan genom
manusia membutuhkan penggunaan situs penanda sekuen (STS) termasuk penanda sekuen yang diekspresikan (EST).
• Situs yang ditandai dengan urutan terdiri dari 100500 bp urutan unik STS terletak di daerah genom yang tidak berulang dan
memiliki panjang tertentu (Gbr. 9.01).
• EST adalah STS khusus yang berasal dari suatu daerah yang ditranskripsi menjadi mRNA. EST juga diamplifikasi dengan PCR tetapi
alih-alih menggunakan DNA genom total, EST diamplifikasi dari cDNA. Karena EST hanya mewakili sebagian kecil dari sebuah gen,
maka dimungkinkan untuk mendapatkan beberapa EST dari gen yang sama. Untuk menghindari duplikasi seperti itu, EST biasanya
berasal dari 30 daerah mRNA yang tidak diterjemahkan.
• Untuk merakit genom yang besar, lokasi relatif dari setiap STS (atau EST) diperlukan. Pemetaan dilakukan dengan menentukan
seberapa sering dua STS (atau EST) yang berbeda ditemukan pada fragmen DNA yang sama (Gbr. 9.02). Fragmen-fragmen tersebut
dapat berasal dari satu kromosom atau seluruh genom. Semakin dekat jarak dua STS pada kromosom asli, semakin besar peluang
mereka ditemukan pada fragmen DNA yang sama.
SLIDE KE-4
• Pemetaan STS ditampilkan untuk empat situs STS pada satu
kromosom. Berbagai macam pencernaan enzim restriksi dilakukan
untuk memotong kromosom menjadi fragmen-fragmen dengan
berbagai ukuran. PADA GAMBAR KIRI, dua STS ungu ditemukan pada
fragmen yang sama sebanyak 6 kali dan saling berdekatan pada
kromosom. PADA GAMBAR KANAN, dua sekuens STS ditemukan pada
fragmen yang sama menunjukkan seberapa dekat kedua penanda
tersebut satu sama lain. Dua STS hijau letaknya berjauhan, sehingga
hanya ditemukan pada fragmen yang sama sebanyak 2 kali. STS ungu
tidak pernah ditemukan pada fragmen yang sama dengan STS hijau
dan oleh karena itu mereka harus berjauhan pada kromosom.
SLIDE KE-6
• Structural genomics: Aims to determine the structure of every
protein encoded by the genome.
• Functional genomics: Aims to collect and use data from sequencing
for describing gene and protein functions.
• Comparative genomics: Aims to compare genomic features between
different species.
• Mutation genomics: Studies the genome in terms of mutations that
occur in a person's DNA or genome.
SLIDE KE-10
• Sanger sequencing (chain termination method) adalah sebuah metode untuk menentukan urutan nukleotida
DNA. Another term used to describe Sanger or chain-termination sequencing is cycle sequencing because the
reaction occurs via cycles in a thermocycler. The mixture of ingredients are placed in a thermocycler, which then
heats the ingredients to around 96C. The heat denatures the template DNA sample. Next, the temperature is
lowered so the primers can anneal to the starting point of the target DNA. Finally, the temperature is adjusted so
that DNA polymerase can synthesize the copies of the target DNA until a ddNTP is incorporated. Metode ini
dikembangkan oleh peraih Nobel dua kali, Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977.

1. DNA SEQUENCE FOR CHAIN TERMINATION PCR

• DNA sequence yang akan diobservasi dijadikan template untuk PCR khusus yaitu chain-termination PCR. Chain-
termination PCR ini seperti PCR standar, dengan satu perbedaan: penambahan modified nucleotides (dNTPs)
called dideoxynucleoside triphosphate (ddNTPs). Hasil dari chain-termination PCR adalah jutaan hingga miliaran
cetakan oligonucleotidedari sekuens DNA yang mau diamati, yang diterminasi pada Panjang yang acak oleh
senyawa 5’-ddNTPs (KE SLIDE 12!!!)
• Pada Sanger sequencing yang manual, terdapat 4 reaksi PCR, dengan ddNTP yang terpisah dan berbeda-beda
(ddATP, ddTTP, ddGTP, and ddCTP). Namun pada Sanger sequencing otomatis, seluruh ddNTPs digabungkan
dalam 1 reaksi, dan masing2 sudah mempunyai fluorescent labelnya. Sekarang akan dibahas yang otomatis.
SLIDE KE-10
2. PEMISAHAN UKURAN DENGAN ELEKTROFORESIS GEL
• Pada langkah kedua, oligonukleotida tadi akan dipisahkan berdasarkan ukurannya melalui
elektroforesis gel. Sampel DNA dimasukkan ke dalam salah satu ujung matriks gel, dan arus listrik
dialirkan; DNA bermuatan negatif, sehingga oligonukleotida akan ditarik ke arah elektroda positif
di sisi berlawanan dari gel. Karena semua fragmen DNA memiliki muatan yang sama per unit
massa, kecepatan pergerakan oligonukleotida hanya ditentukan oleh ukurannya. Semakin kecil
suatu fragmen, semakin sedikit friksi yang akan dialaminya saat bergerak melalui gel, dan
semakin cepat fragmen tersebut bergerak. Hasilnya, oligonukleotida akan tersusun dari yang
terkecil hingga terbesar.

• Secara manual, oligonukleotida dari masing-masing dari empat reaksi PCR dijalankan dalam
empat jalur gel yang terpisah. Hal ini memungkinkan pengguna untuk mengetahui
oligonukleotida mana yang sesuai dengan setiap ddNTP. Dalam pengurutan Sanger otomatis,
semua oligonukleotida dijalankan dalam elektroforesis gel kapiler tunggal di dalam mesin
pengurutan.
SLIDE KE-10
3. ANALISIS GEL & PENENTUAN SEKUENS DNA
• Langkah terakhir hanya melibatkan pembacaan gel untuk menentukan urutan DNA yang terinput.
Karena DNA polimerase hanya mensintesis DNA dalam arah 5 'ke 3' mulai dari primer yang
disediakan, setiap terminal ddNTP akan sesuai dengan nukleotida tertentu dalam urutan asli
(misalnya, fragmen terpendek harus berakhir pada nukleotida pertama dari ujung 5', fragmen
terpendek kedua harus berakhir pada nukleotida kedua dari ujung 5', dll.) Oleh karena itu, dengan
membaca pita gel dari yang terkecil hingga terbesar, kita dapat menentukan urutan 5 'ke 3' dari untai
DNA asli.

• Sanger otomatis, komputer membaca setiap pita gel kapiler, secara berurutan, menggunakan
fluoresensi untuk menentukan identitas setiap terminal ddNTP. Singkatnya, laser mengeksitasi tag
fluoresen di setiap pita, dan komputer mendeteksi cahaya yang dipancarkan. Karena masing-masing
dari empat ddNTP ditandai dengan label fluoresen yang berbeda, cahaya yang dipancarkan dapat
secara langsung dikaitkan dengan identitas terminal ddNTP. Hasil outputnya disebut kromatogram,
yang menunjukkan puncak fluoresen setiap nukleotida di sepanjang template DNA.
SLIDE KE-11
• Setiap dNTP mengandung gugus fosfat, gugus gula, dan salah satu
dari empat basa nitrogen [adenin (A), timin (T), guanin (G), atau
sitosin (C)]. dNTP dirangkai secara linier oleh ikatan kovalen
fosfodiester antara gula dari satu dNTP dan gugus fosfat dari dNTP
berikutnya; pola gula-fosfat yang diulang ini membentuk tulang
punggung gula-fosfat.
• Basa nitrogen dari dua untai yang terpisah diikat bersama oleh ikatan
hidrogen di antara basa-basa komplementer untuk membentuk
double helix DNA
SLIDE KE-13
• Prosedur NGS:
1. Isolasi genomic DNA (gDNA)
1. GDNA harus murni, dan hanya mengandung bagian DNA dari sampel. DNA manusia yang khas diperoleh dari sampel
darah, tetapi juga dapat diperoleh dari pengikisan bagian dalam pipi.
2. Pembuatan NGS Library
a. Fragmentasi gDNA menjadi potongan-potongan kecil double-strand dengan ukuran yang
relatif sama (Slide 14)
b. Memodifikasi fragmen agar kompatibel dengan platform sequencing
3. Memilah fragmen ke lokasi terpisah dan membuat cluster untuk hasil yang identik
4. Sequencing kluster
5. Menganalisis data
SLIDE KE-15
• Adapters are short double-stranded DNA fragments with a known sequence that are created using chemical
synthesis of DNA. These are added onto each end of the whole genome fragments in order to give the
sequencing primers a place to anneal, and as will be explained later, give each fragment a known sequence in
order to get them to attach to the solid surface for partitioning. After breaking up the whole human genome
into frag- ments, the ends are not even. The top strand of the double-stranded fragment is often a different
length than the bottom strand. So to get the adapter to attach, the two strands of each fragment must be equal
or blunt-ended, and the 50 ends must be phosphorylated. A mixture of T4 DNA polymerase, Klenow
polymerase, T4 polynucleotide kinase, and a supply of deoxyribonucleotides makes all the ends equal, and
then add the 50 phosphate groups (Fig. 8.09). In addition, Klenow polymerase has terminal transferase
activity, which adds a single adenine onto the 30 end of the genomic DNA fragments. (Note: Taq polymerase
also has this activ- ity, and this is used for TA cloning.) The single A overhang facilitates the binding of the
adapters to the ends.