Current Biochemistry

Volume 3 (2): 54 - 65, 2016

CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877
Homepage: http://biokimia.ipb.ac.id
E-mail: [email protected]

Phylogenetic Analysis of Cytochrome Oxidase I from Buduk Toads

Duttaphrynus melanostictus and Phrynoidis asper from Bogor
(Analisis Filogenetik Gen Sitokrom Oksidase I dari Kodok Buduk Duttaphrynus melanostictus dan
Phrynoidis asper Asal Bogor)
Muhammad Dailami , I Made Artika1,3, Mirza Dikari Kusrini2, Dodi Safari3
1*

Department of Biochemistry, Bogor Agricultural University, Bogor, 16680, Indonesia

1

2
Department of Conservation of Forest and Ecotourism, Bogor Agricultural University, Bogor,
16680, Indonesia
3
Eijkman Institute for Molecular Biology, Jakarta, 10430, Indonesia

Received : 28 July 2015; Accepted: 14 Agustus 2016

Corresponding author: Muhammad Dailami; Departemen Biokimia, Jl. Agatis Gd. Fapet Lt. 5, Wing 5, Bogor 16680;
Telp/Fax. +6285282971777; E-mail: [email protected]

ABSTRACT

Indonesia have high diversity of Amphibians. Amphibians have an important role in eco­
system and produce many bioactive peptides. However, the genetic information of amphibians from
­Indonesia is very limited, especially Duttaphrynus melanostictus and Phrynoidis asper. The aims of
this study are to determine the nucleotide sequence of cytochrome oxidase I (COI) from D. melanos­
tictus and P. asper, to analyze their genetic diversity and their phylogenetic relationship. A total 668
base pairs of COI gene fragment were successfully amplified and their nucleotide sequence deter­
mined. P. asper (5 haplotypes) samples group have high haplotype diversity compared to D. mela­
nostictus (1 haplotype). The results of Basic Local Alignment Search Tools (BLAST) to the NCBI and
BOLD database, showed 99 % - 100 % identity to sequence of D. melanostictus. For the sequence
of P. asper showed 99.23 % identity to sequence P. asper in BOLD database. There was no sequence
of COI gene of P. asper in NCBI database. Genetic relationship among species in family Bufonidae,
indicated that D. melanostictus has closer relation to P. asper than to another species, inspite of their
pharapyletic characteristic. For intern species relationship of D. melanostictus, the data showed that
D. melanostictus from Bogor have closer relationship to D. melanostictus from India than D. mela­
nostictus from China.

Keywords: buduk toads, COI, phylogenetic, genetic diversity

54
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

ABSTRAK

Indonesia memiliki keanekaragaman amfibi yang tinggi. Amfibi memiliki peranan yang sa­
ngat penting dalam ekosistem dan dapat menghasilkan banyak peptida bioaktif yang bermanfaat
bagi manusia. Akan tetapi, informasi genetik dari amfibi asal Indonesia masih sangat minim, ter­
masuk jenis yang umum ditemukan di Indonesia yaitu D. melanostictus dan P. asper. Penelitian ini
bertujuan untuk menentukan sekuens gen sitokrom oksidase I (COI) dari D. melanostictus dan P.
asper, menganalisis keragaman genetik serta hubungan filogenetiknya. Total 668 pasang basa frag­
men gen COI berhasil diamplifikasi dan ditentukan urutan nukleotidanya. Kelompok sampel P. asper
memiliki keragaman haplotype (5 haplotype) yang lebih tinggi dibanding kelompok D. melanostictus
(1 haplotype). Hasil BLAST pada database NCBI dan BOLD sekuens D. melanostictus menunjukkan
kemiripan 99 % - 100 % dengan sekuens B. melanostitus. Sekuens P. asper memiliki kemiripan 99.23
% dengan sekuens P. asper pada BOLD system. Hubungan kekerabatan antar spesies dari famili Bu­
fonidae, menunjukkan D. melanostictus memiliki hubungan kekerabatan lebih dekat dengan P. asper
dibanding spesies lainnya, namun kedua spesies ini bersifat paraphyletik. Hubungan kekerabatan
intern spesies D. melanostictus, menunjukkan sampel D. melanostictus dari Bogor memiliki kekera­
batan yang lebih dekat dengan sekuens D. melanostictus dari India, diban­dingkan dengan sekuens
dari China.

Kata kunci: kodok buduk, COI, filogenetik, keanekaragaman genetik

1. PENDAHULUAN genetik dari kodok dan katak asal Indonesia

Indonesia merupakan negara yang masih sangat jarang.
memiliki keanekaragaman amfibi yang tinggi, Kodok dan katak memiliki peranan yang
sekitar 16 % spesies amfibi (dari 1100 spesies sangat penting dalam ekosistem, diantaranya
di seluruh dunia) dapat ditemukan di Indonesia yaitu sebagai pemangsa berbagai jenis serangga
(BAPPENAS 1993). Secara global, jumlah dan beberapa hewan invertebrata (kontrol
populasi amfibi di dunia semakin menurun. keseimbangan ekosistem) serta menjadi salah
Beberapa faktor yang diduga menjadi penyebab satu indikator kualitas lingkungan (García-
menurunnya jumlah amfibi di Indonesia yaitu Muñoz et al. 2010). Selain itu, sekresi kulit
penangkapan berlebih (untuk dikonsumsi dan anura mengandung peptida bioaktif yang
diperdagangkan), hilangnya habitat, pence­ bermanfaat sebagai antimikroba, antikanker
maran, penyakit, spesies introduksi dan juga dan lainnya yang bermanfaat bagi kesehatan
kecacatan (Kusrini 2007). Penurunan jumlah manusia. Beberapa senyawa peptida dari lendir
amfibi ini akan menyebabkan hilangnya banyak anura yang memiliki aktifitas antimikroba
informasi ilmiah yang belum dikaji terkait am­ yaitu senyawa peptida dari kelompok aurin,
fibi asal Indonesia. Salah satu informasi penting caerin, citropin, dahlein, maculatin, signiferin
yang masih jarang ditemukan adalah informasi dan uperin (Pukala et al. 2006). Xu dan Lai
genetik dari amfibi tersebut. Jika ditelusuri pada (2015) merangkum seluruh peptida antimikroba
database NCBI, jumlah sekuens atau informasi dari ampfibi (1900 AMPs) yang telah diteliti

55
 Curr. Biochem. 2016. 3 (2): 54 - 65

hingga tahun 2013 dan mengklasifikasikannya genetik. Gen COI juga banyak digunakan dalam
berdasarkan strukturnya menjadi 100 famili analisis pohon filogenetik, keragaman genetik,
peptida. sejarah evolusi, maupun genetika populasi. Gen
Penelitian mengenai senyawa aktif dari ini berada dalam genom mitokondria (DNA
lendir anura telah banyak dilakukan (Artika et mitokondria). Beberapa keistimewaan DNA
al. 2015a, Artika et al. 2015b, Suhyana et al. mitokondria yaitu diturunkan berdasarkan garis
2015, Xu et al. 2015) dan banyak dijadikan keturunan tetua betina, memiliki laju mutasi
dasar dalam pengembangan obat berbasis yang relatif lebih tinggi dibanding dengan DNA
antimicrobial peptides (AMPs). Akan tetapi, inti (Brown et al. 1979), memiliki genom yang
pengkajian mengenai sisi genetik dan biologi relatif pendek sehingga mudah untuk dipelajari
molekuler dari kodok dan katak asal Indonesia (Solihin 1994).
masih sangat jarang, termasuk famili Bufonidae Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji
yang banyak tersebar di Indonesia. D. sisi genetik dari D. melanostictus dan P. asper
melanostictus dan P. asper merupakan anggota yang berupa urutan nukleotida gen COI,
famili Bufonidae yang menarik untuk dikaji dari keanekaragaman genetik, identifikasi genetik,
sisi genetikanya. Kedua spesies ini memiliki hubungan kekerabatannya dengan spesies
bentuk morfologi yang mirip, dengan kulit lain dan hubungan kekerabatan intern spesies
berbintil kasar. Perbedaan mendasar terdapat yang berasal dari lokasi yang berbeda. Hasil
pada garis parental hitam pada bagian kepala. penelitian ini diharapkan dapat memberikan
Selain itu, habitat P. asper yaitu di area hutan
informasi ilmiah yang dapat dimanfaatkan
primer maupun sekunder yang dekat dengan
da­­­­lam konservasi genetik, sistematika dan
aliran sungai (Inger et al. 1974), sementara
pengelolaan sumberdaya alam.
D. melanostictus lebih menyukai area sekitar
permukiman manusia. D. melanostictus sangat
2. METODOLOGI
mudah beradaptasi dengan lingkungan baru,
sehingga jumlahnya relatif melimpah di sekitar Pengambilan Sampel
pemukiman manusia. Pengambilan sampel D. melanostictus
Dalam studi genetika, gen cytochrome dilakukan pada malam hari dengan menangkap
oxidase sub unit I (COI) merupakan gen penting langsung di habitatnya yaitu di sekitar gedung
yang banyak dipelajari. Gen COI ini menyandi kampus IPB Dramaga, Bogor dan untuk sam­
protein penting sitokrom c oksidase I yang ber­ pel ­P. asper ditangkap dari kebun percobaan
peran dalam proses transfer elektron pada saat Cikabayan kampus IPB, Dramaga, Bogor.
sintesis Adenosine Triphosphate (ATP) dalam Identifikasi morfologi, dilakukan oleh ahli
mitokondria. Gen COI dilaporkan memiliki herpetofauna (Dr. Mirza D. Kusrini), Departe­
potensi laju mutasi yang rendah dibandingkan men Konservasi Sumberdaya Hutan dan
gen sitokrom b (Da Fonseska et al. 2008). Gen Ekowisata.
sitokrom c oksidase sub unit I (COI) merupakan
DNA barcode (Hebert et al. 2003) yang biasa
digunakan sebagai acuan dalam identifikasi

56
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

Isolasi DNA dan Amplifikasi meng­gunakan program MEGA 5 kemudian

DNA genom diisolasi dari sampel disejajarkan dengan menggunakan ClustalW.
jaringan yang berasal dari ujung jari kaki de­ Identifikasi spesies secara genetik dilakukan
ngan menggunakan DNAeasy Blood and Tissue dengan Basic Local Search Alignment Tools
Kit Qiagen. Fragmen gen COI diamplifikasi (BLAST) pada server NCBI (http://www.
menggunakan mesin PCR (Applied Biosystem) ncbi.nlm.nih.gov/blast) dan BOLD (barcode
dengan primer Chmf4 (5’-TYTCWACW of life database). Untuk memperoleh sekuens
AAYCAYAAAGAYATCGG-3’) dan Chmr4 dari taxa yang memiliki kekerabatan terdekat
(5’-ACYTCRGGRTGRCC RAARAATCA- dengan sekuens sampel dilakukan MOLE-
3’) (Chee et al. 2011, Arian et al. 2016). Profil BLAST. Deduksi asam amino gen COI
suhu yang digunakan dalam PCR adalah 95 oC dilakukan dengan menggunakan kode genetik
selama 5 menit, denaturasi 94 oC selama 1 menit, mitokon­dria vertebrata yang tersedia pada
annealing 50 oC selama 1 menit, extention 72 oC software MEGA 5. Pohon filogenetik dibuat
selama 1 menit, dan extention akhir 72 oC selama dengan menggunakan dua metode: Neighbor
10 menit, jumlah siklus yang digunakan yaitu Joining (NJ) dan Maximum Likelihood (ML)
35 siklus. Hasil PCR divisualisasikan dengan menggunakan MEGA 5 (Tamura et al. 2011).
elektroforesis gel agarose 1.5 %, buffer TBE 1x, Model tes digunakan untuk mengetahui model
pewarna gel red dan marker 100 bp DNA lad­ substitusi yang paling sesuai dengan dataset ­
der (Biolabs Inc.). Sekuensing DNA dilakukan yang digunakan (Nei & Kumar et al. 2000).
oleh PT. Genetika Science, Jakarta. Metode bootstrap dengan 1000 replikasi di­
gunakan untuk mensupport setiap perca­ba­ngan
Analisis Data yang terbentuk pada pohon filogenetik (Nei &
Sekuens forward dan reverse dipasti­ Kumar et al. 2000). Jarak genetik dikalkulasi­­kan
kan kebenarannya dengan mencocokkan dengan menggunakan metode pairwise distance
urutan nukleotida dengan elektroforegramnya (p-distance).

Gambar 1 Hasil elektroforesis amplikon gen COI dari D. melanostictus (kode DM) dan P. asper (kode PA),
dengan marker (kode M)

57
 Curr. Biochem. 2016. 3 (2): 54 - 65

3. Hasil Urutan Nukleotida Fragmen Gen COI

Sepanjang 668 pasang basa DNA
Amplikon Gen COI
fragmen gen COI dari D. melanostictus dan P.
Hasil amplifikasi gen COI dari 18 sampel
asper berhasil ditentukan urutan nukleotidanya.
D. melanostictus dan P. asper menggunakan
Sembilan sampel D. melanostictus dapat
primer universal COI untuk amfibi (ChmF4 dan
dikelompokkan menjadi satu haplotype
ChmR4, Che et al. 2011) menunjukkan pita DNA ­­dan untuk sampel P. asper terbagi menjadi
pada gel agarose dengan panjang sekitar 700- lima haplotype (Tabel 1). Keanekaragaman
900 pasang basa (Gambar 1). Konsentrasi DNA haplotype dari P. asper lebih tinggi dari pada
hasil amplifikasi sangat tinggi, yang terlihat dari D. melaonstictus. Hasil pensejajaran sekuens
kecerahan pita DNA yang dibandingkan dengan dari sampel D. melanostictus tidak ditemukan
kecerahan pita DNA marker. Konsentrasi adanya titik polimorfisme. Untuk sampel P.
amplikon diperkirakan lebih dari 100 ng/µL. asper ditemukan adanya 12 titik polimorfisme
(Tabel 2).

Tabel 1 Daftar Haplotype dari sampel D. melanostictus dan P. asper

No Spesies Haplotype Kode Sampel
1 D. melanostictus Haplotype 1 DM1 – DM9
2 P. asper Haplotype 2 PA1
Haplotype 3 PA2, PA9
Haplotype 4 PA3, PA4, PA9
Haplotype 5 PA5
Haplotype 6 PA6, PA7

Tabel 2 Posisi titik polimorfisme dari sample P. asper

Posisi Polimorfisme
No Sampel
210 222 255 381 390 555 588 636
1 PA1 A C C A C G G G
2 PA2 . T T G T A A .
3 PA3 . . . . T . . .
4 PA4 . . . . T . . .
5 PA5 . . . . T . . A
6 PA6 C T T G T A A .
7 PA7 C T T G T A A .
8 PA8 . . . . T . . .
9 PA9 . T T G T A A .
Tv Ts Ts Ts Ts Ts Ts Ts
Jenis Mutasi
Syn Syn Syn Syn Syn Syn Syn Syn
Catatan : Tidak ditemukan titik polimorfisme dari kelompok sampel D. melanostictus, Tv (Transversi), Ts
(Transisi), Syn (synonymous), NS (non-synonymous).

58
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

Tabel 3 Hasil BLAST pada database NCBI dan BOLD

BLAST NCBI
No Haplotype
Kemiripan Spesies Kode Akses
1 Haplotype 1 99 % B. melanostictus AJ584640.1
2 Haplotype 2 84 % B. campbelli JN867958.1
3 Haplotype 3 84 % B. campbelli JN867958.1
4 Haplotype 4 84 % B. campbelli JN867958.1
5 Haplotype 5 84 % B. campbelli JN867958.1
6 Haplotype 6 84 % B. campbelli JN867958.1
BLAST BOLD SYSTEM
No Haplotype
Kemiripan Spesies Kode Akses
1 Haplotype 1 100 % Duttaphrynus melanostictus N/A
2 Haplotype 2 99.23 % P. asper N/A
3 Haplotype 3 99.23 % P. asper N/A
4 Haplotype 4 99.23 % P. asper N/A
5 Haplotype 5 99.23 % P. asper N/A
6 Haplotype 6 99.23 % P. asper N/A

Hasil BLAST (Tabel 3) pada database maksimal perbedaan 0.75 yang selanjutnya di
gene bank (NCBI) menunjukkan sekuens dari dipilih 39 sekuens dari Bufonidae (termasuk 18
sampel D. melanostictus 1 sampai 9 identik sekuens sampel penelitian ini) dan juga diambil
dengan sekuens Bufo melanostictus (kode akses 4 sekuens dari famili lain yang masih memiliki
AJ584640.1) dengan tingkat kemiripan menca­ kemiripan sangat tinggi (hasil MOLE-BLAST)
pai 99 %. Untuk sampel P. asper, menunjukkan
dan satu sekuens dari famili lain yang berkerabat
kemiripan tertinggi (84%) dengan sekuens B.
jauh. Sekuens dari famili lain digunakan sebagai
campbelli (kode akses JN867958.1). Identifikasi
out group.
dengan menggunakan database BOLD System
(Barcoding of Life Database, http://www.
Pohon filogenetik berdasarkan metode
boldsystems.org/) menunjukkan bahwa sampel
Neighbor Joining (NJ) dan model substitusi
D. melanostictus identik dengan sekuens
standar yaitu Kimura 2 Parameter digunakan
Duttaphrynus melanostictus dengan kemiripan
100 %, dan untuk sampel P. asper identik dalam analisis filogenetik. Metode bootstrap
dengan sekuens P. asper dengan kemiripan dengan 1000 replikasi digunakan sebagai
99.23 %. Akan tetapi kedua sekuens yang mirip parameter untuk menguji pohon filogenetik yang
tersebut, tidak bisa diakses maupun di download dihasilkan dengan metode NJ dan Maximum
datanya, sehingga tidak bisa digunakan sebagai Likelihood (ML). Hasil pohon filogenetik
pembanding dalam pembuatan filogenetik. dengan nilai bootstrap dari metode NJ dan ML
disajikan pada Gambar 2 dan jarak genetiknya
Analisis Filogenetik (Genetic Distance) disajikan pada Tabel 4. Se­
Diperoleh sebanyak 112 sekuens hasil lain itu, analisis pohon filogenetik dari kelom­
MOLE-BLAST dari NCBI dengan perbedaan pok D. melanostictus dengan perbandingan data

59
 Curr. Biochem. 2016. 3 (2): 54 - 65

GeneBank yang berasal dari beberapa negara 4. PEMBAHASAN

yang berbeda disajikan pada Gambar 3 dan jarak Fragmen gen COI dari semua sampel
genetiknya pada Tabel 5. penelitian ini dapat dengan mudah diamplifi­
kasi dengan menggunakan primer universal
COI untuk amfibi. Panjang amplikon yang diper­
oleh relatif bervariasi antara 700-900 pasang
basa. Hal ini menunjukkan kurang spesifiknya

Gambar 2 Pohon filogenetik dengan metode Neighbour joining dan Maximum likelihood (angka disetiap percabangan
adalah nilai Bootstrapt: Neighbor Joining /Maximum Likelihood)

60
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

Gambar 3 Filogenetik kelompok D. melanostictus asal bogor dengan sekuens GeneBank dengan asal lokasi yang ber-
beda-beda

daerah penempelan primer pada DNA template kecerahan pita DNA sampel yang dibandingkan
dari setiap individu, sehingga produk amplikon dengan kecerahan pita DNA marker (sesuai
yang diperoleh memiliki panjang pasang protokol produsen), dapat diprediksikan
basa yang berbeda-beda. Akan tetapi, hasil konsentrasi DNA amplikon yang diperoleh
sekuensing menunjukkan bahwa daerah target adalah lebih dari 97 ng (produk information).
amplifikasi dari setiap individu adalah fragmen Hal ini didasarkan pada kecerahan pita ke 5
gen yang sama yaitu fragmen gen COI. Selain dan 10 dari DNA marker yang menunjukkan
itu, spesifitas dari primer yang digunakan sangat konsentrasi 97 ng (Sambrock et al. 1989),
berkaitan erat dengan sifat universal dari primer sementara pita DNA sampel, jauh lebih cerah
ini yang ditujukan untuk dapat mengamplifikasi jika dibandingkan DNA marker. Konsentrasi
fragmen gen COI dari berbagai spesies amfibi amplikon ini lebih dari cukup untuk dapat
(Che et al. 2011). digunakan pada proses sekuensing.
Konsentrasi DNA amplikon akan sangat Keragaman haplotype dari P. asper
berpengaruh pada hasil sekuensing. Konsentrasi lebih tinggi dari pada keragaman haplotype
DNA yang disyaratkan dari setiap penyedia jasa dari D. melanostictus. Hanya ditemukan
sekuensing sangat bervariasi, namun umumnya satu haplotype dari sembilan individu D.
meminta konsentrasi diatas 100 ng. Berdasarkan melanostictus yang diambil dari sekitar kampus

61
 Curr. Biochem. 2016. 3 (2): 54 - 65

Tabel 4 Jarak genetik D. melanostictus dan P. asper dengan data GeneBank

1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 D. melanostictus
0.211-
2 P. asper 0.214
0.136- 0.250-
3 B. melanostictus NCBI 0.140 0.253
0.197-
4 B.occidentalis 0.23 0.27
0.199
0.198- 0.242-
5 B.tutelarius 0.224 0.168
0.201 0.243
0.196-
6 B.macrocristatus 0.24 0.237 0.16 0.06
0.198
0.236- 0.191- 0.244- 0.160- 0.063-
7 B.campbelli 0.023
0.239 0.195 0.247 0.164 0.067
0.228- 0.200-
8 C._chompipe 0.215 0.221 0.208 0.198 0.21
0.235 0.204
0.226- 0.214- 0.238- 0.190- 0.298- 0.179-
9 B.americanus 0.191 0.213
0.231 0.219 0.245 0.194 0.203 0.183

Tabel 5 Jarak genetik antara kelompok D. melanostictus Bogor dengan data GeneBank
1 2 3 4 5
1 DM_Bogor_clade_1
2 BM_unknown_clade_1 0.006
3 BM_India_clade_2 0.002-0.004 0.009-0.011
4 BM_westernghat_India_clade_3 0.022 0.029 0.020-0.022
5 BM_China_clade_4 0.130-0.143 0.135-0.148 0.133-0.146 0.119-0.130

IPB. Tingkat keragaman haplotype yang rendah arboretum IPB, memiliki keragaman haplotype
ini menunjukkan bahwa gen COI dari D. yang tinggi, dimana ditemukan 5 haplotype
melanostictus sangat conserved, yakni relatif sta­ dari sembilan sampel yang dikoleksi. Hal ini
bil dari satu generasi ke generasi berikutnya. Gen berbeda dengan kergamanan haplotype dari gen
COI merupakan gen yang memiliki laju mutasi penyandi histone H2A, dari sampel yang sama,
sangat rendah (Da Fonseska et al. 2008), sehing­­ga D. melanostictus memiliki keragaman haplotype
variasi genetik dari gen ini sangat sedikit. Se­lain yang lebih tinggi (dua haplotype dari sembilan
itu, juga dimungkinkan sembilan sampel yang sampel) (Dailami et al. 2016).
digunakan dalam penelitian ini masih berada Sebanyak delapan titik polimorfisme
dalam satu jalur keturunan betina. Sifat dari gen yang ditemukan berupa mutasi titik yang
COI yang merupakan salah satu gen dari genom bersifat synonymous, yaitu mutasi yang tidak
mitokondria adalah diturunkan hanya dari garis menyebabkan terjadinya perubahan asam
keturunan betina tanpa adanya hibridisasi dari amino yang disandinya. Hal ini dikarenakan,
genom mitokondria pejantan (Hutchison et al. satu jenis asam amino memiliki beberapa jenis
1974). Populasi P. asper yang dikoleksi dari kodon, sehingga terjadinya mutasi pada posisi

62
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

kodon ke tiga memiliki peluang yang sangat terhadap C. chompipe, B. americanus dan P. asper
kecil untuk dapat merubah asam amino yang masing-masing 0. 215, 0.226-0.231 dan 0.211-
disandinya. Jika ditinjau dari jenis basa purin 0.214. Hal ini berarti bahwa D. melanostictus
dan pirimidinnya, dari delapan mutasi titik memiliki kekerabatan yang le­bih dekat terhadap
tersebut, tujuh diantaranya berupa mutasi transisi P. asper dibandingkan terha­dap ­­ C. chompipe
dan hanya satu yang berupa mutasi transversi. dan B. americanus. Frost et al. (2006)
Mutasi transisi ini terlihat pada posisi nukleotida memisahkan ketiga spesies (D. melanostictus,
nomor 222, 255, 381, 390, 555, 588, 636 yang P. asper dan B. americanus) menjadi tiga
kesemuanya terjadi mutasi dari nukleotida genus yang berbeda, yaitu genus Duttaphrynus,
yang memiliki basa purin menjadi nukleotida Phyrinoidis, dan Anaxyrus. Sedangkan untuk
yang memiliki basa purin atau dari pirimidin ke Crepidophyrene chompipe, baru dideskripsikan
pirimidin. Sedangkan untuk mutasi pada posisi pada tahun 2007, sehingga tidak termasuk dalam
210, terjadi mutasi dari basa A (purin) menjadi C pengelompokkan yang dilakukan oleh Frost et
(pirimidin) sehingga mutasi ini disebut sebagai al. (2006). Meskipun D. melanostictus dan P.
mutasi transversi. asper memiliki kekerabatan yang lebih dekat,
Pohon filogenetik menunjukkan bahwa namun kedua spesies ini bersifat paraphyletic.
semua spesies dari famili Bufonidae yang Hal ini sesuai dengan pendapat Graybeal (1997)
digunakan dalam pohon ini, berada dalam satu yang menyatakan bahwa kedua spesies tersebut
clade besar atau bersifat monofiletik. Semua adalah paraphyletic berdasarkan gen 12S, 16S,
sampel D. melanostictus berada dalam satu Cytochrome b dan c-mos (n-DNA).
clade terpisah dari spesies lain dari famili Pada clade selanjutnya, terlihat bahwa
Bufonidae, demikian juga dengan P. asper. B. occidentalis, B. tutelaris, B. macrocristatus,
Pada clade D. melanostictus, terbagi menjadi dan B. campbelly berada dalam satu clade yang
dua clade kecil yang teripsah dengan sangat sama atau bersifat monophyletic. Jarak genetik
jelas dengan support bootstrapt 99 % dan 100 dari B. occidentalis terhadap B. tutelaris, B.
% untuk NJ dan ML. Pemisahan ini terjadi macrocristatus, dan B. campbelly masing-
dikarenakan adanya perbedaan geografi dari masing yaitu 0.168, 0.160 dan 0.160-0.164.
sampel yang digunakan dengan sekuens dari Pada penamaan baru, keempat spesies tersebut
GeneBank. Sampel D. melanostictus asal dikelompokkan dalam satu genus Cranopsis
kampus IPB (Indonesia) memiliki kekerabatan (Frost et al. 2006). Jarak genetik dari empat
yang lebih dekat dengan data GeneBank dengan spesies ini yang masih berada dalam satu genus,
kode 44843547 dibandingkan dengan sekuens jauh lebih kecil jika dibandingkan 4 spesies (D.
dengan kode 46981593 dan 347015315. Oleh melanostictus, C. chompipe, B. americanus dan
karenanya, perlu dilakukan analisis hubungan P. asper) yang berasal dari empat genus yang
filogenetik dari sampel D. melanostictus dari berbeda. Dari beberapa informasi tersebut,
kampus IPB dengan sekuens dari lokasi lain terlihat bahwa, pohon filogenetik dari beberapa
yang ada di GeneBank. spesies dalam family Bufonidae yang dibangun
Berdasarkan jarak genetiknya, D. dengan menggunakan sekuens gen COI,
melanostictus dari Bogor memiliki jarak gene­tik memiliki hubungan genetik yang sesuai dengan

63
 Curr. Biochem. 2016. 3 (2): 54 - 65

klasifikasi yang dilakukan berdasarkan data dari Afrika dan India pada masa Triassic sampai
morfologi dan kombinasi antara gen 16S, 12S pada awal masa Jurassic (160-240 juta tahun
dan Cytochrome b (Frost et al. 2006). Oleh yang lalu).
karenanya, dapat dikatakan bahwa, gen COI dari
famili Bufonidae, dapat mewakili ketiga gen 5. UCAPAN TERIMA KASIH
di atas untuk menjelaskan sejarah evolusi atau
Penulis mengucapkan terima kasih
hubungan kekerabatan dari anggota Bufonidae
kepada mahasiswa HIMAKOVA IPB, yang
sampai taraf spesies. Akan tetapi, sedikitnya
membantu dalam koleksi sampel. Terima kasih
sekuens COI yang tersedia pada data GeneBank,
juga kepada asisten peneliti Laboratorium
menyebabkna analisis filogenetik dari seluruh
Bakteriologi Molekuler, Lembaga Biologi
spesies anggota famili Bufonidae, belum dapat
Molekuler Eijkman, Majid Khoeri dan Wisnu
dilakukan. Sehingga perlu dilakukan sekuensing
Tafroji yang telah membantu dalam pengerjaan
dari gen COI dari spesies lain dalam famili
penelitian laboratorium.
Bufonidae dan dibandingkan dengan data gen
lain yang ada di GeneBank.
6. DAFTAR PUSTAKA
Pohon Filogenetik dari kelompok D.
melanostictus asal kampus IPB dengan sekuens Arian P, Artika IM, Falah S. 2016. Amplification
and analysis of cytochrome oxidase I of
dari lokasi lain, menunjukkan adanya 4 clade Polypedates leucomystax from Bogor
yang berbeda. Clade pertama merupakan Agricultural University Area. Curr Biochem
kelompok D. melanostictus dari Bogor dengan 3: 13-19
satu sekuens dari genebank, namun sekuens Artika IM, Pinontoan S, Kusrini MD. 2015a.
tersebut tidak diketahui asal lokasinya. Antifungal activity of skin secretion of
bleeding toad Leptophrine cruentata and
Berdasarkan pohon filogenetik tersebut, terlihat
javan tree frog Rachophorus margaritifer.
bahwa, sekuens D. melanostictus dari Bogor Am J Biochem Biotechnol 11: 5-10
memiliki hubungan kekerabatan yang lebih Artika IM, Pinontoan S, Kusrini MD. 2015b.
dekat dengan sekuens yang berasal dari India, Antifungal activity of skin secretion of
dibandingkan dengan sekuens yang berasal bleeding toad Leptophrine cruentata and
dari China. Jarak genetik antara sampel dari javan tree frog Rachophorus margaritifer.
Am J Biochem Biotechnol 11: 127-131
Bogor dengan sekuens dari India (clade 2)
BAPPENAS (Badan Perencanaan Pembangunan
yaitu antara 0.002-0.004. Nilai ini sangat kecil
Nasional). 1993. Biodiversity Action
jika dibandingkan dengan jarak antara sampel Plan for Indonesia. Jakarta: Ministry of
Bogor dengan sekuens China yang mencapai National Development Planning/National
0.130-0.143. Hal ini menunjukkan adanya aliran Development Planning Agency. 141 p.
genetik (genetic drift) antara D. melanostictus Brown WM, George MJR, Wilson AC. 1979. Rapid
asal Bogor dan India. Ada kemungkinan bahwa evolution of animal mitochondrial DNA.
(primates/restriction endonuclease cleavage
D. melanostictus Bogor merupakan hasil maps/gel electrophoresis/DNA melting).
introduksi dari India. Hal ini didasarkan pada Proceeding Natural Academi of Science.
hipotesis Zhang et al. (2005) yang menyatakan USA. Genetics. 76(4):1967-1971.
bahwa, asal muasal dari penyebaran anura yaitu

64
 Dailami - Analisis Filogenetik Gen COI Kodok Buduk

Che J, Chen HM, Yang JC, Jin JQ, Jiang K, Yuan Kusrini MD. 2007. Konservasi Amfibi Di Indonesia:
ZY, Murphy RW, Zhang YP. 2011. Universal Masalah Global Dan Tantangan. Media
COI primers for DNA barcoding amphibians. Konservasi. XII(2):89-95.
Molecular Ecology Resources. doi: 10.1111/
Nei M dan Kumar S. 2000. Molecular Evolution and
j.1755-0998.2011. 03090.
Phylogenetics. New York: Oxford University
Press.
Da Fonseska RR, Johnson WE, Brien SJ, Ramos MJ, Pukala TL, Bowie JH, Maselli VM, Musgrave IF,
Antunes A. 2008. The adaptive evolution of Tyler MJ. 2006. Review: Host-defence
the mammalian mitochondria genome. BMC peptides from the glandular secretions of
Genomic. doi:10.1186/1471-2164-9-119. amphibians: structure and activity. Natural
Product Reports. doi: 10.1039/b512118n
Dailami M, Artika IM, Kusrini MD, Safari D. 2016.
Analysis and prediction of some histone- Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular
derived antimicrobial peptides from toads Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.).
Duttaphrynus melanostictus and Phyrinoidis 10.51-10.67
asper. The Journal of Pure and Applied
Solihin DD. 1994. Peranan DNA mitokondria dalam
Chemistry Research. 5(2): 67-76, ISSN
studi keragaman genetik dan biologi populasi
2302-4690.
pada hewan. Jurnal Hayati. 1(1):1-4, ISSN
Frost DR, Grant T, Faivovich J, Bain RH, Has A, 0854-8587.
Haddad CLFB, De Sa’ RO, Channing A,
Suhyana J, Artika IM, Safari D. 2015. Activity
Wilkinson M, Donnellan SC, Raxworthy CJ,
of skin secretions of frog Fejervarya
Campbell JA, Blotto BL, Moler P, Drewes
limnocharis and Limnonectes macrodon
RC, Nussbaum RA, Lynch JD. 2006.
against Streptococcus pneumoniae multidrug
The amphibian tree of life. Bulletin of the
resistant and molecular analysis of species F.
American Museum of Natural History. No.
limnocharis. Curr Biochem 2: 90-103
297. 370 pp.
Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar
García-Muñoz E, Gilbert JD, Parra G, Guerrero F,
S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary
2010. Wetlands classification for amphibian
Genetics Analysis using maximum
conservation in Mediterranean landscapes.
likelihood, evolutionary Distance and
Biodiversity Conservation. 19(3): 901–911.
Maximum Parsimony methods. Molecular
Graybeal A. 1997. Phylogenetic relationships of Biology and Evolution. 28: 2731-2739.
bufonid frogs and tests of alternate macro-
Xu X and Lai R. 2015. The chemistry and biological
evolutionary hypotheses characterizing their
activities of peptides from amphibian skin
radiation. Zoological Jouma1 of the Linnean
secretions. Chemical Reviews. 115 (4):1760-
Society. 119:297-338
1846. doi: 10.1021/ cr4006704
Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR.
Zhang P, Zhou H, Chen YQ, Liu YF, Qu LH. 2005.
2003.Biological identifications through
Mitogenomic perspectives on the origin and
DNA barcodes. Proceedings of the Royal
phylogeny of living amphibians. Systematics
Society London B, 313-321.
Biology. 54(3):391–400, doi: 10.1080/10635
Hutchison CA, Newbold JE, Potter SS, Edgell MH. 150590945278
1974. Maternal inheritance of mammalian
mitochondrial DNA. Nature. 251:536–8.
Inger RF, Voris HK, Voris HH. 1974. Genetic
variation and population ecology of some
Southeast Asian frogs of the genus Bufo and
Rana. Biochemical Genetics, 12(2), 121-
145.

65