anti-MAG Autoantibodies Elisa: MAG Myelin Associated Glycoprotein

anti-MAG Autoantibodies
ELISA
MAG = Myelin Associated Glycoprotein
EK-MAG 96 tests
Release Date: 2018-10-26

Version A1
BÜHLMANN LABORATORIES AG English page 2

Baselstrasse 55 Deutsch Seite 6
4124 Schönenbuch, Switzerland Français page 10
Tel.:+41 61 487 1212 Italiano pagina 14
Fax:+41 61 487 1234 Espanõl página 18
[email protected] Português página 23
ENGLISH Reagents Quantity Code Reconstitution
TMB Substrate 1 vial
B-TMB Ready to use
INTENDED USE TMB in Citrate buffer 11 mL
Ready to use
The anti-MAG Autoantibodies ELISA is intended for the Stop Solution 1 vial
B-STS Corrosive
quantitative in vitro diagnostic determination of human IgM- 0.25 M Sulfuric acid 11 mL
agent
auto-antibodies directed against Myelin Associated
Table 1
Glycoprotein (MAG) in serum. It serves as an aid to 1
After reconstitution, calibrators A, B, C and D contain 70000, 15000, 3000
diagnosis of Paraproteinemic Demyelinating Neuropathy
and 1000 BÜHLMANN Titer Units (BTU) of anti-MAG antibodies,
(PDN) in conjunction with other clinical and laboratory respectively.
findings (1-7). 2
Controls contain lot-specific amounts of anti-MAG antibodies. Refer to
the additional QC data sheet for exact concentrations.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS
The anti-MAG Autoantibodies ELISA employs the
quantitative enzymatically amplified sandwich-type Sealed / Unopened Reagents
immunoassay technique. The microtiter plates of the test are All sealed/unopened kit components are stable at 2-8 °C until the
precoated with highly purified MAG from human brain (1). expiration date printed on the labels.
Calibrator, controls, and patient sera are incubated in the Opened / Reconstituted Reagents
microtiter wells and any anti-MAG auto-antibodies present in Return unused strips immediately to the foil pouch
the samples bind to the immobilized human MAG. After Microtiter Plate containing the desiccant packs and reseal along
washing off of unbound substances, the anti-MAG auto- the entire edge of zip-seal. Store for up to 2
months at 2-8 °C.
antibodies are detected with horseradish-peroxidase (HRP)
Diluted Wash Buffer Store for up to 2 months at 2-8 °C.
labelled antibodies against human IgM. Following a second
washing step, in which unbound enzyme label is removed, a Calibrators
Store for up to 2 months at -20 °C.
substrate solution containing tetramethyl-benzidine (TMB) is Controls
added. A blue color develops in proportion to the amount of Incubation Buffer
antibodies bound to the immobilized human MAG. Color Enzyme Label IgM Store at 2-8 °C until expiration date printed on the
development is stopped by adding an acidic stop solution labels.
TMB Substrate
(diluted sulphuric acid) which turns the blue solution into
Store at 18-28 °C until expiration date printed on
yellow. The intensity of the color is measured at 450 nm. Stop Solution
the labels.
The measured absorbance is proportional to the titre of anti- Table 2
human MAG auto-antibodies present in a given sample. A
set of human anti-MAG auto-antibody calibrators is used to
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
plot a calibration curve of absorbance versus human anti-
MAG auto-antibody titer units. The concentrations of anti- • Precision pipettes with disposable tips: 20 µL, 100 µL
human MAG auto-antibodies in the samples is calculated and 1000 µL pipettes.
based on the calibration curve. • Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the
preparation of sample dilutions.
REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION • 1000 mL cylinder for the dilution of the wash buffer.
Reagents Quantity Code Reconstitution • Squeeze bottle for wash buffer or automatic microtiter
Microtiter Plate 12 x 8-wells plate washer.
96 wells precoated strips with B-MAG-MP Ready to use • Blotting paper.
with human MAG holder
• Orbital shaker for microtiter plates.
Plate Sealer 3 pieces
Dilute with
• Microtiter plate reader for measurement of absorbance at
Wash Buffer 1 bottle
B-MAG-WB 900 mL of 450 nm.
Concentrate (10x) 100 mL deionized water
Incubation Buffer 1 bottle PRECAUTIONS
B-MAG-IB Ready to use
with preservatives 100 mL
Safety precautions
Calibrators A to D1 Add 1 mL of
B-MAG- • The microtiter-plate (B-MAG-MP), calibrators (B-MAG-
Human serum with 4 vials Incubation
CASET
Buffer
CASET) and controls (B-MAG-CONSET) of this kit
preservatives
contain components of human origin. Although tested
Low and High and found negative for HBV surface antigen, HCV and
Control2 Add 1 mL of
B-MAG-
2 vials
CONSET
Incubation HIV1/2 antibodies, the reagents should be handled as if
Human serum with Buffer capable of transmitting infections and should be handled
preservatives
in accordance with good laboratory practices using
Enzyme Label IgM
appropriate precautions.
Anti-human IgM
1 vial Ready to use • Stop solution: The stop solution (B-STS) contains sulfuric
antibody conjugated B-MAG-ELM
to HRP in a protein- 11 mL Blue solution acid (0.25 M). The reagent is an irritant to eyes, skin and
based buffer with
mucous membranes. Avoid contact with eyes, skin and
preservatives
clothes. After contact with eyes or skin, wash
immediately with plenty of water.
Release date: 2018-10-26 2/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

• Reagents: Avoid contact of reagents with the skin, eyes, (18-28 °C), centrifuge for 10-30 minutes at 1000-2000 x
or mucous membranes. If contact does occur, g, collect the serum.
immediately wash with generous amounts of water; • Store serum samples at ≤–20 °C. Samples are stable for
otherwise, irritation / burns can occur. ≥1 year if stored at ≤–20 °C. Avoid repeated freeze-thaw
• Unused solution should be disposed of according to local cycles. Frozen samples should be thawed and mixed
state and federal regulations. thoroughly by gentle swirling or inversion prior to use.
Technical precautions • We recommend freezing aliquots of patient samples in
order to avoid repeated freezing/thawing.
• Read carefully the instructions prior to carrying out the
test. Test performance will be adversely affected, if
reagents are incorrectly diluted, modified or stored under ASSAY PROCEDURE
conditions other than those as detailed in this instruction 1. Dilute all patient samples to be investigated 1:1000 with
for use. incubation buffer. Use 2 µL of serum + 2000 µL of
• Residues in the microtiter plate wells result from the incubation buffer. Mix thoroughly by vortexing and leave
production process. They are removed in the washing diluted samples for one hour at 18-28 °C. Put samples as
step (assay procedure step 3) and do not affect the well as reconstituted calibrators and controls for 10
results. minutes on ice prior to pipetting in step 4.
• Prepare reagents before starting the assay procedure. 2. Prepare a plate-frame with the required number of strips
Reagents used in steps 3-9 must be cold (2-8 °C) and to test the calibrators, controls and patient samples.
kept cold while pipetting and washing. Put the TMB Reseal the remaining strips in the foil pouch together with
substrate at room temperature (18-28 °C). the desiccant packs immediately. Store refrigerated.
• Steps 3-9: Use cold (2-8 °C) reagents for all these steps Note: Use cold reagents in steps 3 to 9.
and keep them cold while pipetting. Recommendation: 3. Wash coated wells four times using at least 300 µL of
Prepare the wash buffer the evening before performing cold! wash buffer per well. Empty wells and tap plate
the assay and place it into the fridge overnight. firmly onto blotting paper to remove remaining liquid
• Wash steps 3, 6 and 9: The wash steps are crucial for completely.
removing residues in the microtiter plate wells resulting 4a. Pipet 100 µL of incubation buffer (blank) in duplicate into
from the production process (step 3) as well as any wells A1+A2.
unbound antibodies (steps 6 and 9). Pipet 100 µL of calibrator A in duplicate into wells B1+B2.
→ Always perform the wash steps with cold (2-8 ˚C) wash Pipet 100 µL of calibrator B in duplicate into wells C1+C2.
buffer.
Pipet 100 µL of calibrator C in duplicate into wells D1+D2.
→Make sure that all wells are completely empty after the
last washing cycle. Pipet 100 µL of calibrator D in duplicate into wells E1+E2.
• Step 10: Adjust TMB substrate to room temperature 4b. Pipet 100 µL of the low control in duplicate into wells
(18-28 °C) before using it. F1+F2.
Pipet 100 µL of the high control in duplicate into wells
• Step 11: Shake the microtiter plates during the incubation
with substrate. Depending on the plate shaker, we G1+G2.
recommend 400-600 rpm. The solution should move in 4c. Pipet 100 µL of each diluted sample in duplicate into the
the wells but must not spill over. subsequent wells.
• If an automated washer is used, “plate mode” should be 5. Cover the plate with a plate sealer and incubate for
chosen so that dispensing is performed sequentially on 2 hours (±5 min) at 2-8 °C.
all strips before aspirating. 6. Remove plate sealer. Empty the wells and wash four
• Components must not be used after the expiry date times using at least 300 µL of cold wash buffer (2-8 °C)
printed on the labels. per well. Empty the wells and strike the plate firmly onto
blotting paper in order to remove wash buffer completely.
• Do not mix different lots of reagents.
7. Add 100 µL of enzyme label IgM to all wells.
• Every effort should be made to ensure that no cross
contamination occurs between reagents, samples or 8. Cover plate with a plate sealer and incubate for
between wells. 2 hours (±5 min) at 2-8 °C.
9. Remove plate sealer. Empty the wells and wash four
• Microwells cannot be re-used.
times using at least 300 µL of cold wash buffer (2-8 °C)
per well. Empty the wells and strike the plate firmly onto
SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE blotting paper.
• The procedure requires <0.1 mL of blood or <50 µL of Note: Adjust TMB substrate solution to room temperature
serum, respectively. (18-28 °C).
• Lipemic, hemolytic and icteric samples should not be
10. Add 100 µL of TMB substrate solution to each well.
used in this assay. Lipemic samples can be avoided by
asking patients to fast for at least 12 hours prior to the 11. Cover plate with a plate sealer, incubate plate on an
sample being taken. orbital plate shaker at 400-600 rpm for 30 ± 2 minutes at
18-28 °C. Protect the plate from direct light.
• Collect blood into plain tubes (no anti-coagulant), avoid
hemolysis, leave to clot for one hour at room temperature 12. Add 100 µL of stop solution to all wells. Proceed to step
13 within 30 minutes.
13. Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate intersecting the calibration curve and read from the
reader. horizontal axis.
If the microtiter plate reader is not capable of reading
QUALITY CONTROL absorbance greater than 2 or greater than the absorbance
A good understanding of this instruction for use is necessary of the highest calibrator (calibrator A), a second reading at a
to obtain reliable results. These will be obtained only by wavelength of 490 or 492 nm is recommended (reference
using precise laboratory techniques (current GLP filter at 600 or 620 nm if available). In this case, proceed to
guidelines) and accurately following the instruction for use. construct a second calibration curve with the absorbance
Since there is no control serum for anti-MAG antibodies readings of all calibrators at 490 or 492 nm. The
commercially available, we recommend using a positive, and concentration of the off-scale samples at 450 nm are then
negative serum pool for internal quality control. read from the new calibration curve as described above. The
All controls must be within established confidence ranges readings at 490 or 492 nm should not replace the on-scale
(BTU). The confidence ranges of the controls are lot-specific readings at 450 nm.
and printed on the QC data sheet delivered with this kit. Note: The results presented in table 3 and figure 1 are
Performance characteristics should be within established examples. Calibrator and controls must be used in each
limits. If these characteristics are not in conformity with individual assay.
established limits and repetition excludes handling failures,
check the following issues: i) Have all reagents, used in step Results and calibration curve are provided for demonstration
3-10, been kept at 2-8 °C? ii) accuracy of pipets, purposes only. A calibration curve must be generated for
thermometers, and timers, iii) settings of ELISA washer and each set of samples to be assayed.
reader, iv) expiration date of the reagents v) storage and
incubation conditions vi) color of the TMB substrate solution LIMITATIONS
(should be colorless) vii) purity of the water. 1. Test results should be interpreted in conjunction with
information available from clinical assessment of the
STANDARDIZATION patient and other diagnostic procedures.
The calibrators included in this kit have been standardized 2. The anti-MAG Autoantibodies ELISA has not been
against an internal reference pool. The reference pool validated for plasmapheresis samples.
consists of more than ten human sera containing low,
medium and high titers of anti-MAG antibodies, respectively. REFERENCE INTERVALS AND CUT-OFF
Titers and specificity of each serum in the reference pool
The frequency of anti-MAG auto-antibodies in normal human
were first analyzed by anti-MAG immunoblots.
sera was determined using blood samples from
BÜHLMANN Titer Units (BTU) were established as follows: asymptomatic volunteer blood donors (adult men and
• Normal donor samples were assayed according to the women at the age of 18 to 70 years). 150 samples were
anti-MAG Autoantibodies ELISA assay procedure. assayed according to the assay procedure and the results
• Serially diluted samples of the reference pool were listed in table 4 were obtained.
assayed in the same run. Note: These titer ranges should be used as guidelines only.
• The dilution at which the reference pool sample falls short It is recommended that each laboratory establishes its own
of the cut-off corresponds to the titer of the reference expected ranges for its patient population.
pool.
Proposed cut-off Titer
Note: Serum titer values depend on the assay method and, The mean +3 SD results in a technical cut-off value of 729
in particular, on the specificity and the cut-off values BTU. For practical reasons, we recommend to use a cut-off
established with an individual assay method. Therefore, titer value of 1000 BTU, corresponding to the lowest calibrator
values obtained with different methods cannot be compared (=calibrator D) in the standard curve.
directly.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
RESULTS AND CALCULATION
Intra-Assay Precision (Within-Run): 6.5 %. The intra-
Calibration curve assay precision was calculated from the results of 20 pairs
Record the absorbance at 450 nm for each well to construct of values obtained in a single run (table 5).
a calibration curve from the average of the calibrator Inter-Assay Precision (Run-to-Run): 15.4 %. The inter-
duplicates, subtracting the average blank OD from each
assay precision was calculated from the results of 20 pairs
calibrator. It is recommended to use a software program to
of values obtained in 20 different runs (table 6).
calculate the calibration curve and to determine the
concentration of the samples, using a 4 parameter logistic Limit of Blank (LoB): 444 BTU. 20 duplicates of incubation
(4 PL) fit. buffer were assayed in a single run. Mean and standard
deviation were calculated for the absorbance values. The
Samples and controls
minimal detectable dose of anti-MAG antibodies was
• Record the absorbance at 450 nm for each sample and calculated to be 444 BTU by adding two standard deviations
control well. Subtract the average blank OD from the to the mean absorbance and intersecting this value with the
average of duplicate values for each sample and control. standard curve obtained in this run.
• Locate the absorbance values of the samples and Limit of Quantification (LoQ): 900 BTU. 20 duplicates of
controls on the vertical axis, draw a horizontal line low titer anti-MAG auto-antibodies were assayed in a single

run. Mean, standard deviation (SD) and coefficient of
variation (CV) were calculated from the absorbance values.
We found a titer of 900 BTU with a CV less than 10 %.
Dilution Linearity/Parallelism: 147 %. Seven human
serum samples containing high titer of anti-MAG antibodies
were diluted with incubation buffer 1:1000 to 1:64000, left for
one hour at 18-28 °C and subsequently assayed according
to the assay procedure (table 7). It is suggested that the
relatively high deviation in about 50 % of the samples is due
to antibody aggregations. In general, pathological sera show
strongly elevated titer of auto-antibodies therefore it has no
influence to the positive/negative discrimination.
Specificity: Four sets of experiments were performed to
assess the specificity of the anti-MAG Autoantibodies
ELISA:
1. Neutralization of anti-MAG auto-antibodies: Five sera
with high anti-MAG titers could be inhibited from binding to
the microtiter plates coated with MAG in a concentration-
dependent manner when preincubated for 1 hour with
incubation buffer supplemented with 1 to 200 µg/mL of MAG
prior to testing in the ELISA.
2. Specificity of anti-MAG auto-antibody binding: Five sera
with medium to high anti-MAG auto-antibody titers and five
negative sera were tested on GanglioCombi (EK-GCO)
plate coated with GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b and GQ1b.
None of the sample showed ratio higher than 10 %.
Similarly, six sera with high anti-Ganglioside auto-antibody
titers (see above) and five negative sera, were tested on
plates coated with MAG. None of these disease state sera
gave a signal higher than 300 BTU.
3. Comparison to immunoblot (Western Blot): 127 patients
sera (40 female; 87 male; age 4-90 years) with neurological
diseases suspectedly caused by anti-MAG auto-antibodies
were tested by the ELISA and a western blot method,
respectively. MAG isolated from human central nervous
system (CNS) was used in both methods. All twelve sera
showing medium to very high titers of anti-MAG IgM auto-
antibodies in the ELISA procedure were also clearly positive
when analyzed on immunoblots. 114 out of 115 sera
showing anti-MAG IgM antibody titers below the ELISA cut-
off value were also negative when analyzed on
immunoblots, whereas one serum was slightly positive by
the immunoblot method only (F. Ferracin and A.J. Steck,
unpublished results).
4. Comparison to indirect immunofluorescence assay
(IFA): Sera from 150 patients (unknown sex and age)
diagnosed as having IgM monoclonal gammopathies were
tested by the ELISA and an IFA method, respectively. In the
IFA method, sera were incubated on frozen and aceton-
fixed monkey sciatic nerve sections and bound anti-MAG
antibodies were detected by FITC-labeled anti-human IgM
antibody. 26 patients (17.3 %) were positive and 115
patients (76.7 %) were negative in both methods, whereas
five sera (3.3 %) were positive in the IFA method only and
four sera (2.7 %) were only positive in the ELISA method,
respectively (2).

DEUTSCH Reagenz Inhalt Art-Nr. Rekonstitution
Enzymmarker IgM
ANWENDUNGSZWECK Anti-human-IgM
Antikörper, an HRP 1 Flasche Gebrauchsfertig
Der anti-MAG Autoantikörper ELISA Test wird gebraucht für konjugiert, in einem B-MAG-ELM
11 mL Blaue Lösung
die direkte und quantitative in vitro diagnostische Puffer auf Proteinbasis
Bestimmung von IgM-Autoantikörpern gegen das Myelin- mit Konservierungs-
mitteln
assoziierte Glykoprotein (MAG) im Serum. Er unterstützt in
TMB-Substrat 1 Flasche
Verbindung mit anderen klinischen Ergebnissen und B-TMB Gebrauchsfertig
Laborergebnissen die Diagnose einer paraproteinämischen, TMB in Citratpuffer 11 mL
demyelisierenden Neuropatie (PDN) (1-7). Stopp-Lösung 1 vial Gebrauchsfertig
B-STS
0,25 M H2SO4 11 mL Korrosiv
PRINZIP DER METHODE Tabelle 1
1
Nach der Rekonstitution enthalten die Kalibratoren A, B, C und D 70000,
Der vorliegende anti-MAG Autoantikörper ELISA Test ist ein 15000, 3000 und 1000 BÜHLMANN Titer Unit (BTU) anti-MAG Antikörper
immunometrischer Festphasen-Enzymimmunoassay. Die 2
Kontrollen enthalten lot-spezifische anti-MAG Antikörper Mengen. Für
Mikrotiterplatten des Tests sind mit hochreinem MAG aus Konzentrationsangaben siehe beigelegtes Kontrolldatenblatt.
dem menschlichen Gehirn vorbeschichtet (1). Kalibrator,
Kontrollen und Patientenseren werden in den Wells der LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN
Mikrotiterplatte inkubiert und alle in der Probe vorliegenden
Verschlossene/ Ungeöffnete Reagenzien
anti-MAG Autoantikörper binden an immobilisiertes
humanes MAG. Nach dem Abwaschen der Alle verschlossenen/nicht geöffneten Kitkomponenten sind bei 2-8 °C
nichtgebundenen Substanzen, werden die anti-MAG bis zu dem auf den Etiketten aufgedruckten Verfallsdatum stabil.
Autoantikörper mit HRP-konjugierten Antikörpern Geöffnete/ Rekonstituierte Reagenzien
nachgewiesen, die gegen humanes IgM gerichtet sind. Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Dessikator
Danach werden die ungebundenen Enzymkonjugat- Mikrotiterplatte versetzte Packung zurückbringen. Packung völlig
Antikörper durch Waschen entfernt. Die Substratlösung, die schliessen. Bis zu 2 Monate bei 2-8 °C haltbar.
Tetramethylbenzidin (TMB) enthält, wird hinzugefügt. Eine Wasch-Puffer Zu verwenden bis 2 Monate nach Rekonstitution.
(verdünnt) Bei 2-8 °C lagern.
blaue Farbe entwickelt sich proportional zur Menge der
Antikörper, die an immobilisiertes humanes MAG gebunden Kalibratoren Zu verwenden bis 2 Monate nach Rekonstitution.
sind. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe einer sauren Kontrollen Bei –20 °C lagern.
Stopplösung beendet (verdünnte Schwefelsäure) und Inkubations-
bewirkt einen Farbumschlag (gelb). Die Intensität der Farbe Puffer
wird bei 450 nm gemessen. Enzymmarker Bis zum auf den Etiketten aufgedruckten
Verfallsdatum bei 2-8 °C lagern.
Die gemessene Absorption ist proportional zum Titer der IgM
anti-human-MAG Autoantikörper, die in der jeweiligen Probe TMB Substrat
vorhanden sind. Zur Erstellung einer Kalibrierungskurve Bis zum auf den Etiketten aufgedruckten
Stopp-Lösung
wird die Absorption einer Reihe von humanen-anti-MAG Verfallsdatum bei 18-28 °C lagern.
Autoantikörper Kalibratoren gegen anti-MAG Autoantikörper Tabelle 2
Titer-Einheiten aufgetragen. Die Konzentrationen der anti-
MAG Autoantikörper in den Proben wird auf Basis der ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND
Kalibrierungskurve berechnet. HILFSMITTEL
• Präzisionspipetten mit Einwegspitzen für 20 µL, 100 µL
GELIEFERTE REAGENZIEN UND VORBEREITUNG und 1000 µL.
Reagenz Inhalt Art-Nr. Rekonstitution • Polystyren oder Polypropylen Einwegröhrchen zur
Mikrotiterplatte 8 x 12 Mikro- Vorbereitung der Verdünnungsproben.
Beschichtet mit küvetten mit B-MAG-MP Gebrauchsfertig • 1000 mL Zylinder zur Verdünnung des Waschpuffers.
humanem MAG Halter
• Spritzflasche für Waschpuffer oder automatischer
Abdeckfolien 3 Stück
Mikrotiterplattenwascher.
1 Flasche Mit 900 mL
Wasch-Puffer • Saugfähiges Papier.
B-MAG-WB deionisiertem
Konzentrat (10x) 100 mL H2O verdünnen • Orbitalschüttler für Mikrotiterplatten.
Inkubations-Puffer 1 Flasche
B-MAG-IB Gebrauchsfertig • Mikrotiterplatten-Photometer mit optischem Filter
Konservierungsstoffe 100 mL (450 nm).
Kalibrator A-D1 Mit 1 mL
B-MAG- Inkubations-
Humanserum; 4 Flaschen
CASET Puffer
VORSICHTSMASSAHMEN
Konservierungstoffe versetzen Sicherheitsmassnahmen
Kontrolle tief und Mit 1 mL
• Die Mikrotiterplatte (B-MAG-MP), Kalibratoren (B-MAG-
hoch2 B-MAG- Inkubations-
2 Flaschen CASET) und Kontrollen (B-MAG-CONSET) enthalten
Humanserum; CONSET Puffer
Konservierungstoffe versetzen Komponenten menschlicher Herkunft. Obwohl sie
negativ auf HBV Oberflächenantigen, HCV und HIV1/2
Antikörper getestet wurden, sollten sie gemäss Good
Laboratory Practice als potentiell infektiös behandelt

werden und die entsprechenden Sicherheits- Proben und zwischen den Wells der Mikrotiterplatte
vorkehrungen getroffen werden. kommt.
• Stopp-Lösung: Die Stopp-Lösung (B-BTS) enthält • Mikrotiterstreifen dürfen nicht wiederverwendet werden.
Schwefelsäure (0,25 M). Das Reagenz reizt die Augen,
Haut und Schleimhäute. Berührung mit Augen, Haut und UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG
Kleidung vermeiden. Nach Berührung mit den Augen
oder der Haut, sofort mit reichlich Wasser waschen. • Dieser Test benötigt <0,1 mL Blut oder <20 µL Serum.
• Reagenzien: Kontakt der Reagenzien mit der Haut, den • Lipämische, hämolytische oder ikterische Blutproben
Augen oder Schleimhäuten vermeiden. Bei Berührung, sollten nicht verwendet werden. Lipämische Proben
sofort mit reichlich Wasser waschen; ansonsten kann können verhindert werden, indem der Patient mindestens
eine Reizung / Verätzung auftreten. 12 Stunden vor der Blutentnahme keine Nahrung zu sich
nimmt.
• Ungebrauchte Lösungen sollten gemäss der
gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden. • Die Blutproben in den entsprechenden Röhrchen
sammeln (kein Antikoagulans), Hämolyse vermeiden,
Technische Vorsichtsmassnahmen eine Stunde lang bei Raumtemperatur (18-28 °C)
• Lesen Sie die Arbeitsanleitung sorgfältig vor der gerinnen lassen, 10-30 Minuten lang bei
Testdurchführung. Die Testqualität kann negative Raumtemperatur und 1000-2000 x g zentrifugieren,
beeinflusst werden, wenn die Reagenzien nicht korrekt danach Serum sammeln.
verdünnt oder verändert werden sowie nicht • Serumproben bei ≤–20 °C lagern. Die Proben sind ≥1
entsprechend der in dieser Anleitung angegebenen Jahr haltbar, wenn sie bei ≤–20 °C gelagert werden.
Lagerungsbedingungen gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden
• Aufgrund des Produktionsprozesses können Rückstände werden. Gefrorene Proben vor dem Gebrauch auftauen
in den Wells der Mikrotiterplatten sein. Sie werden mit und durch leichtes Rühren gut mischen.
dem 1. Waschen (Schritt 3) entfernt und haben keinen • Wir empfehlen das Einfrieren von Aliquoten der
Einfluss auf die Ergebnisse. Patientenproben, um ein wiederholtes Einfrieren/
• Vor dem Start der Analyse Reagenzien vorbereiten. Die Auftauen zu vermeiden.
in den Schritten 3-9 verwendeten Reagenzien müssen
kalt sein (2-8 °C) und beim Pipettieren und Waschen kalt ARBEITSANLEITUNG
gehalten werden. Das TMB-Substrat muss bei
1. Alle zu untersuchenden Patientenproben mit
Raumtemperatur (18-28 °C) gehalten werden.
Inkubationspuffer im Verhältnis 1:1000 verdünnen. 2 µL
• Schritte 3-9: Für all diese Schritte kalte (2-8 °C) Serum + 2000 µL Inkubationspuffer verwenden. Vor dem
Reagenzien verwenden und diese während des Pipettieren in Schritt 4 durch Vortexen gründlich mischen
Pipettierens kalt halten. Empfehlung: Waschpuffer am und die verdünnten Proben eine Stunde bei 18-28°°C
Abend vor der Analyse vorbereiten und über Nacht in den stehen lassen. Proben und rekonstituierte Kalibratoren
Kühlschrank. und Kontrollen für 10 Minuten auf Eis stellen.
• Waschschritte 3, 6 und 9: Die Waschschritte sind sehr 2. Einen Mikrotiterplatterahmen mit ausreichend Streifen für
wichtig, um Rückstände, die vom Produktionsprozess den Ansatz bestücken, um die Kalibratoren, Kontrollen
herrühren (Schritt 3), sowie alle nichtgebundenen und Patientenproben zu testen. Ungebrauchte Streifen
Antikörper (Schritte 6 und 9), von der Mikrotiterplatte zu vom Halter entfernen und sofort mit dem Trockenmittel
entfernen. verpacken. Gekühlt lagern.
→ Die Waschschritte immer mit kaltem (2-8 °C)
Hinweis: Verwenden Sie in den Schritten 3 bis 9 kalte
Waschpuffer durchführen.
Reagenzien.
→Die Wells müssen nach dem letzten Waschzyklus
vollständig entleert werden. 3. Beschichtete Wells der Mikrotiterplatte vier Mal mit
mindestens 300 µL kaltem! Waschpuffer pro Well
• Schritt 10: Das verwendete TMB Substrat muss auf
waschen. Wells und Platte durch Ausschlagen auf
Raumtemperatur (18-28 °C) gebracht werden.
saugfähigem Papier sorgfältig trocknen, um die
• Schritt 11: Während der Substratinkubation muss die Flüssigkeit vollständig zu entfernen.
Platte geschüttelt werden. Die angegebenen rpm (400-
4a. Jeweils100 µL Inkubations-Puffer in die Wells A1 und A2
600) können nicht direkt auf jeden Schüttler übertragen
pipettieren (Blank).
werden. Die Lösung in den Wells soll in Bewegung
gebracht werden, darf aber nicht überschwappen. Jeweils 100 µL Kalibrator A in die Wells B1 und B2
pipettieren.
• Wird ein Waschautomat eingesetzt, soll der sogenannte
„Platten-Modus“ gewählt werden. Das heisst, dass das Jeweils 100 µL Kalibrator B in die Wells C1 und C2
Einfüllen des Waschpuffers erst über die gesamte Platte pipettieren.
ausgeführt wird, bevor das Absaugen gestartet wird. Jeweils 100 µL Kalibrator C in die Wells D1 und D2
• Die Reagenzien dürfen nach Ablauf des Verfallsdatums pipettieren.
nicht mehr verwendet werden. Jeweils 100 µL Kalibrator D in die Wells E1 und E2
pipettieren.
• Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Kit Lots.
4b. Jeweils 100 µL Kontrolle tief in die Wells F1 und F2
• Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass es zu einer
pipettieren.
Kontamination zwischen verschiedenen Reagenzien,

Jeweils 100 µL Kontrolle hoch in die Wells G1 und G2 wurde zuvor mittels eines Anti-MAG Immunoblots
pipettieren. charakterisiert.
4c. Jeweils 100 µL von jeder verdünnten Serumprobe in die Die Definition der BÜHLMANN Titer Units (BTU) lautet wie
nächsten zwei Wells pipettieren. folgt:
5. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und 2 • Der Antikörpergehalt in Proben normaler Blutspender
Stunden (±5 Minuten) bei 2-8 °C inkubieren. wurde im anti-MAG Autoantikörper ELISA Test
entsprechend der Arbeitsanleitung bestimmt.
6. Abdeckfolie entfernen. Die Wells der Mikrotiterplatte
entleeren und vier Mal mit jeweils mindestens 300 µL • Lineare Verdünnungsreihen der Proben des internen
kaltem Waschpuffer pro Well waschen. Wells durch Referenzpools wurden in demselben Testansatz
Ausschlagen auf saugfähigem Papier sorgfältig mitbestimmt.
trocknen, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen. • Die Verdünnung, bei der die jeweilige Referenzprobe
7. 100 µL Enzymmarker IgM zu jedem Well zugeben. unter den zuvor auf der Basis der Normalproben
8. Mikrotiter-Platte mit einer Abdeckfolie abdecken und 2 errechneten Cut-Off fällt, entspricht dann dem Titer der
Stunden (±5 Minuten) bei 2-8 °C inkubieren. Referenzprobe in BÜHLMANN Titer Units.
9. Abdeckfolie entfernen und die Wells der Mikrotiterplatte HINWEIS: Die für die Anti-MAG ermittelten Serumtiter sind
entleeren und viermal mit jeweils ≥300 µL kaltem abhängig von der verwendeten Methode und daher nicht
Waschpuffer (2-8 °C) waschen. Platte durch Aus- direkt untereinander vergleichbar. Für longitudinale Studien
schlagen auf saugfähigem Papier sorgfältig trocknen. können nur solche Ergebnisse miteinander verglichen
werden, die mit derselben Methode ermittelt wurden.
Hinweis: TMB-Substratlösung auf Raumtemperatur
äquilibrieren (18-28 °C).
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
10.100 µL TMB-Substrat zu jedem Well zugeben.
Eichkurve
11. Mikrotiterplatte mit Abdeckfolie abdecken und 30 ± 2 Optische Dichte aller Wells der Mikrotiterplatte bei 450 nm
Minuten bei 18-28 °C auf einem Mikrotiterplattenschüttler aufzeichnen, um aus dem Mittelwert der
bei 400-600 U/min inkubieren. Platte vor direktem Licht Kalibratordoppelmessung eine Kalibrierungskurve zu
schützen. erstellen. Hierbei wird der mittlere Blank-OD von jedem
12.100 µL Stopp-Lösung zu jedem Well hinzugeben. Kalibratorwert subtrahiert. Zum Berechnen der
Innerhalb von 30 Minuten mit Schritt 13 fortfahren. Kalibrierungskurve und Bestimmen der Konzentration der
13.Absorption bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten- Proben wird die Nutzung eines Softwareprogramms
empfohlen, das eine 4-Parameter-Logistik (4 PL) verwendet.
Photometer messen.
Proben und Kontrollen
QUALITÄTSKONTROLLE • Absorption bei 450 nm für jede Probe und Kontrolle
Für zuverlässige Ergebnisse ist ein gutes Verständnis dieser messen. Der mittlere Blank-OD wird vom OD-Mittelwert
Gebrauchsanweisung notwendig. Zuverlässige Resultate jeder Probe und Kontrolle subtrahiert.
werden nur durch die Anwendung „Guter Laborpraxis“ • Konzentration der unbekannten Proben durch
(aktuelle GLP Richtlinien) und die genaue Einhaltung der Interpolation aus der Eichkurve bestimmen.
Arbeitsanleitung erreicht. Falls das Mikrotiterplatten-Photometer nicht fähig ist,
Da es keine kommerziell erhältlichen Kontrollen für Anti- Absorptionen grösser als 2 oder als die Absorption des
MAG-Antikörper gibt, wird empfohlen, positive und negative höchsten Kalibrators zu messen, sollte eine zweite Messung
Serumproben als interne Qualitätskontrolle anzuwenden. bei 490 oder 492 nm (mit 600 oder 620 nm-Referenzfilter,
Alle Kontrollen müssen im etablierten Vertrauensbereich falls vorhanden) durchgeführt werden. In diesem Fall sollte
liegen (BTU). Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind eine zweite Eichkurve aus den Absorptionsmessungen aller
lot-spezifisch und auf dem zusätzlichen Kontrollblatt Kalibratoren bei 490 oder 492 nm gebildet werden. Die
angegeben.Die Leistungsmerkmale müssen innerhalb der Konzentration, der ausserhalb des Anzeigebereiches
etablierten Grenzwerte liegen. Falls die Leistungsmerkmale liegenden Proben, kann dann mit der neuen Eichkurve
des Tests nicht in den angegebenen Bereichen liegen und bestimmt werden. Die Messungen bei 490 oder 492 nm
Wiederholungsmessungen ein technisches Problem dürfen in keinem Fall die „on-scale“ Messungen bei 450 nm
ausschließen, sind folgende Bedingungen zu überprüfen: i) ersetzen.
Wurden alle Reagenzien in Schritt 3-10 bei 2-8 °C
verarbeitet? ii) Pipetten, Temperatur- und Zeitmessende Hinweis: Die Ergebnisse in den Tabellen 3 und Abbildung 1
Geräte, iii) Photometer Eichung, iv) Verfallsdaten der sind Beispiele. Kalibrator und Kontrollen müssen in jedem
Reagenzien, v) Lagerung- und Inkubations-Bedingungen, individuellen Assay verwendet werden.
vi) die TMB Substratlösung sollte farblos sein, vii) Die Ergebnisse und die Kalibrierungskurve sind nur zur
Wasserreinheit. Veranschaulichung angegeben. Für jeden zu
analysierenden Probensatz muss eine Kalibrierungskurve
STANDARDISIERUNG erstellt werden.
Die Kalibratoren wurden gegen ein internes Referenzpool
(>zehn individuelle Humanseren mit niedrigem, mittlerem EINSCHRÄNKUNGEN DER LEISTUNGSMERKMALE
und hohem Anti-MAG Autoantikörper-Titer) standardisiert. 1. Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit der Anamnese
Die Spezifizität und der Autoantikörpergehalt dieser Proben, des Patienten und weiteren diagnostischen Tests
verwendet werden.
2. Der anti-MAG Antikörper ELISA wurde nicht für Plasma- eigentlichen Test mit der ELISA Methode,
phereseproben getestet. konzentrationsabhängig gehemmt.
2. Spezifität der anti-MAG Autoantikörper Bindung: Fünf
REFENZINTERVALLE UND CUT-OFF RATIO Seren mit mittleren bis hohen anti-MAG Autoantikörper
Titern sowie fünf negative Seren wurden auf einer
Die Frequenz der Anti-MAG Autoantikörper in normalem
GanglioCombi (EK-GCO) Mikrotiter-Platte getestet welche
Humanserum wurde mit Blutproben von asymptomatischen
mit den folgenden Gangliosiden beschichtet war: GA1,
Blutspendern (männliche und weibliche Erwachsene von 18
zu 70 Jahre alt) ermittelt. 150 Serumproben wurden GM1, GM2, GD1a, GD1b und GQ1b. Keine der Proben
zeigte ein Verhältnis (Ratio) welches grösser als 10 % war.
entsprechend der Arbeitsanleitung untersucht und die in
Auf ähnliche Weise wurden sechs Seren mit hohen anti-
Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse wurden erhalten.
Ganglioside Autoantikörper Titer (siehe oben), sowie fünf
HINWEIS: Die angegebenen Werte dienen nur als Richtlinie. negative Seren auf MAG beschichteten Mikrotiterplatten
Es wird empfohlen, dass jedes Labor eigene zu erwartende getestet. Keines dieser pathologischen Seren ergab ein
Normalbereiche ermittelt, welche auf ihre Patienten- Signal, das höher als 300 BTU war.
population zutreffen. 3. Vergleich mit der Immunoblot Methode (Western Blot):
Vorgeschlagener Grenzwert (Cut-Off) 127 Seren von Patienten (40 weibliche, 87 männliche, Alter
Der Mittelwert +3 Standardabweichung [SD] ergibt einen 4-90 Jahren) mit vermutlich anti-MAG verursachten
technischen Cut-Off von 729 BTU. Aus praktischen Gründen neurologischen Krankheiten wurden mit dem ELISA Test
wird ein Grenzwert von 1000 BTU als positive Cut-Off- und einer Immunoblot-Methode untersucht. In beiden
Konzentration empfohlen, der zum untersten Standard der Methoden wurde aus humanem Zentral-Nervensystem
Eichkurve (Kalibrator D) korrespondiert. isoliertes MAG eingesetzt. Alle zwölf Seren, die mit der
ELISA Methode mittelhohe bis sehr hohe anti-MAG-
Autoantikörper Werte zeigten, waren auch mit der
LEISTUNGSMERKMALE
Immunoblot Methode deutlich positiv. Von den 115 Proben,
Intra-Assay Präzision (Within-Run): 6,5 %. Die intra- die einen anti-MAG-Autoantikörper-Spiegel unter dem
assay Präzision wurde bestimmt durch die 20-fache Grenzwert (Cut-Off) der ELISA Methode hatten, sind auch
Doppelmessung im gleichen Ansatz (Tabelle 5). 114 mit Immunoblot negativ getestet worden. Ein Serum
Inter-Assay Präzision (Run-to-Run): 15,4 %. Die inter- war leicht positiv mit der Immunoblot Methode (F. Ferracin
assay Präzision wurde bestimmt durch die 20-fache and A.J. Steck, pers. Kommunkation).
Doppelmessung in 20 verschiedenen Ansätzen (Tabelle 6). 4. Vergleich mit der IFA (Indirect Immunofluorescence
Nachweisgrenze (LoB): 444 BTU. 20 Doppelansätze mit Assay) Methode: Es wurden 150 Serumproben von
Inkubations-Puffer wurden gleichzeitig angesetzt. Mittelwert Patienten (Geschlecht und Alter unbekannt) mit
und Standardabweichung wurden für die Absorptionswerte diagnostizierter IgM monoklonaler Gammopathie mit Hilfe
berechnet. Die kleinste nachweisbare Menge für anti-MAG der ELISA- und einer IFA-Methode getestet. In der IFA
Autoantikörper wurde durch Addition von zwei Methode wurden Seren mit gefrorenen und Azeton-fixierten
Standardabweichungen zum Mittelwert der Absorption Querschnitten von Affen-Ischiasnerven inkubiert.
berechnet. Die Intersektion dieses Wertes mit der Gebundene anti-MAG Antikörper wurden dann mittels anti-
Standardkurve ergab einen Wert von 444 BTU. human-IgM Autoantikörper ermittelt. 26 Proben (17,3 %)
waren mit beiden Methoden positiv getestet. 115 Patienten
Nachweisgrenze (LoQ): 900 BTU. 20 Doppelansätze von
(76,7 %) waren mit beiden Methoden negativ. Fünf Proben
Proben mit tiefen anti-MAG Autoantikörpern wurden
(3,3 %) sind nur mit der IFA Methode und vier Proben
gleichzeitig angesetzt. Mittelwert, Standardabweichung
(2,7 %) nur mit der ELISA Methode positiv getestet
(SD) und Variationskoeffizient (CV) wurde von den
worden(2).
Absorptionswerten berechnet. Einen CV von 10 % wurde bei
einem Titer von 900 BTU erreicht.
Verdünnungslinearität: 147 %. Sieben Serumproben mit
erhöhten anti-MAG Autoantikörper Titer wurden mit
Inkubations-Puffer 1:1000 bis 1:64000 verdünnt, für eine
Stunde bei 18-28 °C stehen gelassen und danach
entsprechend der Arbeitsanleitung getestet (Tabelle 7). Es
wird vermutet, dass die relativ hohen Abweichungen, in
ungefähr 50 % der Proben, aufgrund von Antikörper
Aggregaten zustande kommt. Im Allgemeinen enthalten
aber pathologische Seren sehr hohe Autoantikörper Titer,
sodass dies keinen Einfluss auf die positiv/negativ
Diskrimination hat.
Spezifität: Vier Versuchsansätze wurden durchgeführt, um
die Spezifizität des anti-MAG Autoantikörper ELISA Tests zu
ermitteln:
1. Neutralisierung der anti-MAG Autoantikörper: Die
Bindung zwischen der mit MAG beschichteten Mikrotiter-
Platte und fünf Seren mit hohen anti-MAG Antikörper-
Spiegel, wurde durch eine einstündige Vorinkubation mit
1 bis 200 µg/mL MAG und Inkubations-Puffer vor dem
FRANCAIS Réactifs Quantité Code Reconstitution
Marqueur
DOMAINE D’UTILISATION enzymatique IgM
Anticorps anti-IgM
Le test ELISA Autoanticorps anti-MAG a été conçu pour la 1 flacon Prêt à l’emploi
humaine conjugué à B-MAG-ELM
détermination diagnostique quantitative in vitro des auto- la HRP dans un 11 mL Solution bleue
anticorps IgM humains dirigés contre la glycoprotéine tampon à base de
protéines contenant
associée à la myéline (MAG) dans le sérum. Elle aide à des conservateurs
diagnostiquer la neuropathie démyélinisante para-
Substrat TMB
protéinémique (NDP) en conjonction avec d’autres résultats 1 flacon
TMB en tampon B-TMB Prêt à l’emploi
cliniques et analytiques (1-7). 11 mL
citrate
Solution stop 1 flacon Prêt à l’emploi
PRINCIPE DU DOSAGE B- STS
0,25 M H2SO4 11 mL Corrosif
Le test ELISA Autoanticorps anti-MAG repose sur la Tableau 1
technique d’amplification enzymatique quantitative de type 1
Après reconstitution, les calibrateurs A, B, C et D contiennent
“sandwich”. Les microplaques du test sont préalablement respectivement 70000, 15000, 3000 et 1000 Unités de Titrage
BÜHLMANN (BTU) d’anticorps anti-MAG.
revêtues de MAG hautement purifiée issue de cerveau 2
Les contrôles contiennent des quantités d’anticorps anti-MAG
humain (1). Le calibrateur, les contrôles et le sérum du spécifiques à chaque lot. Il convient de se référer aux limites de
patient sont incubés dans les puits de la microplaque et les confiance communiquées avec chaque lot de production.
éventuels auto-anticorps anti-MAG présents dans les
échantillons se lient à la MAG humaine immobilisée. Après STOCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS
le rinçage des substances non liées, les auto-anticorps anti-
MAG sont détectés avec des anticorps marqués à la Réactifs Fermés/ Non Entamés
peroxydase de raifort (HRP) dirigés contre l’IgM humaine. Tous les composants du kit scellés/fermés sont stables à 2-8 °C jusqu’à
Après une deuxième étape de lavage, dans laquelle le la date de péremption imprimée sur les étiquettes
marquage enzymatique non lié est éliminé, une solution de Réactifs Ouverts / Reconstitués
substrat contenant de la tétraméthyl-benzidine (TMB) est Replacer immédiatement les barrettes de 8 puits non
ajoutée. Une coloration bleue apparaît proportionnellement utilisées dans la pochette contenant le dessiccateur
Microplaque
à la quantité d’anticorps liés à la MAG humaine immobilisée. puis la refermer soigneusement. Stable pendant 2 mois
Le développement de la coloration est arrêté en ajoutant une à 2-8 °C.
solution stop acide (acide sulfurique dilué) qui change la Tampon de
Stable pendant 2 mois à 2-8 °C.
lavage dilué
solution bleue en une solution jaune. L’intensité de la
couleur est mesurée à 450 nm. Calibrateurs
Stables pendant 2 mois à –20 °C.
L’absorbance mesurée est proportionnelle au titre d’auto- Contrôles
anticorps anti-MAG humaine présents dans un échantillon Tampon
donné. Un ensemble de calibrateurs d’auto-anticorps anti- d’incubation
MAG humaine est utilisé pour tracer une courbe Marqueur Stable à 2-8 °C jusqu’à la date de péremption imprimée
d’étalonnage de l’absorbance en fonction des unités de titre enzymatique sur l’étiquette.
d’auto-anticorps anti-MAG humaine. Les concentrations Substrat de
d’auto-anticorps anti-MAG humaine dans les échantillons TMB
sont calculées en fonction de la courbe d’étalonnage. Stable à 18-28 °C jusqu’à la date de péremption
Solution stop
imprimée sur l’étiquette.
REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION Tableau 2
Réactifs Quantité Code Reconstitution

MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
Microplaque 12
barrettes
B-MAG-MP Prête à l’emploi
• Pipettes de précision de 20 µL, 100 µL et 1000 µL avec
96 puits, de 8 puits
précoatée-MAG
pointes jetables.
+ support
• Tubes en polystyrène ou polypropylène jetables, pour la
Film adhésif 3
préparation des dilutions.
1 flacon A reconstituer
Tampon de lavage • Eprouvette graduée de 1000 mL pour la préparation du
B-MAG-WB avec 900 mL
concentré (10x) 100 mL d’eau déionisée tampon de lavage à partir du concentré.
Tampon • Flacon souple pour tampon de lavage ou dispositif de
1 flacon
d’incubation B-MAG-IB Prêt à l’emploi
100 mL
lavage automatique de microplaques.
Avec conservateurs
• Papier absorbant
Calibrateurs A à D1 A reconstituer
avec 1 mL de • Agitateur orbital pour microplaques.
Sérum humain avec 4 flacons B-MAG-CASET
tampon
conservateurs d’incubation
• Lecteur de microplaques pour la mesure de l’absorbance
à 450 nm.
Contrôles élevé et A reconstituer
bas2 B-MAG- avec 1 mL de
2 flacons
Sérum humain avec CONSET tampon
conservateurs d’incubation

PRECAUTIONS microplaques. La solution doit s’agiter dans les puits
mais sans déborder.
Précautions de sécurité
• Pour les laveurs automatiques, BÜHLMANN utilise le
• La microplaque (M-MAG-MP), les calibrateurs (B-MAG-
mode “plate mode” i.e. chaque étape du processus
CASET) et les contrôles (B-MAG-CONSET) de cette
(distribution ou “dispense“) est réalisée séquentiellement
trousse contiennent des composants d’origine humaine.
pour toutes les barrettes, avant de procéder à l’étape
Bien que les tests de détection de l’antigène de surface
suivante du processus (aspiration).
du VHB et des anticorps des virus VHC et VIH1/2 se
soient révélés négatifs, il convient de considérer les • Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de
réactifs comme capables de transmettre des maladies la date d'expiration imprimée sur les étiquettes.
infectieuses, et de les manipuler conformément aux • Ne pas mélanger des réactifs de lots différents.
bonnes pratiques de laboratoire, en prenant les • Il convient de prendre toutes les précautions requises
précautions appropriées. pour empêcher toute contamination croisée entre
• Solution stop: La solution stop (B-STS) contient de réactifs, entre échantillons ou entre puits.
l’acide sulfurique (0,25 M). Le réactif est irritant pour les • Les micropuits sont à usage unique.
yeux, la peau ainsi que les muqueuses. Éviter tout
contact avec les yeux, la peau et les vêtements. En cas
de contact accidentel avec les yeux ou la peau, il faut PRELEVEMENT, PREPARATION ET
impérativement rincer à grande eau. CONSERVATION DES ECHANTILLONS
• Réactifs: Éviter tout contact des réactifs avec la peau, les • La procédure requiert <0,1 mL de sang ou <50 µL de
yeux ou les muqueuses. En cas de contact accidentel, il sérum.
faut impérativement rincer à grande eau pour éviter tout • Les échantillons lipémiques, hémolytiques et ictériques
risque d’irritation ou de brûlures. ne devraient pas être utilisés pour ce dosage. Les
• Pour en savoir plus sur les précautions pour la échantillons lipémiques peuvent être évités en
manipulation et l’élimination des réactifs du kit, nous vous demandant aux patients de jeûner durant au moins 12
recommandons fortement de consulter l’organisme heures avant le prélèvement.
réglementaire compétent pour votre pays. • Prélever le sang dans des tubes (pas d'anticoagulant),
Précautions techniques prévus à cet usage en évitant l’hémolyse, laisser
• Lire attentivement les instructions avant de réaliser le coaguler à température ambiante (18-28 °C) pendant 1
test. Le test ne donnera pas les résultats escomptés en heure, centrifuger durant 10-30 minutes à environ 1000-
cas de dilution incorrecte ou de modification des réactifs, 2000 x g à température ambiante et recueillir le sérum.
ou de stockage dans des conditions autres que celles • Conserver les échantillons de sérum à ≤–20 °C. Les
détaillées dans le présent mode d’emploi. échantillons sont stables durant ≥1 année s’ils sont
• Les puits de la microplaque sont recouverts de cristaux stockés à ≤–20 °C. Eviter les cycles de congélation et de
de sel formés lors du processus de production. Ils sont décongélation. Les échantillons congelés devraient être
éliminés par le lavage (voir l'étape 3 de la procédure) et décongelés et homogénéisés par inversion avant leur
n'ont aucune influence sur les résultats. utilisation.
• Préparer les réactifs avant de démarrer la procédure de • Nous recommandons de congeler les prélèvements
dosage. Les réactifs utilisés dans les étapes 3 à 9 doivent d’échantillons de patient pour éviter de répéter des
être froids (2-8 °C) et maintenus à basse température cycles de congélation/décongélation.
lors du pipetage et du lavage. Placer le substrat TMB à
température ambiante (18-28 °C). PROCEDURE
• Étapes 3-9: Utiliser des réactifs froids (2-8 °C) dans 1. Diluer tous les échantillons de patient à analyser au
toutes ces étapes et les maintenir à basse température 1/1000e avec du tampon d’incubation. Utiliser 2 µL de
lors du pipetage. Recommandation: Préparer le tampon sérum + 2000 µL de tampon d’incubation. Mélanger
de lavage le soir qui précède la mise en œuvre du vigoureusement au vortex et laisser les échantillons
dosage et le placer au réfrigérateur pendant une nuit. dilués pendant une heure à 18-28 °C. Placer les
• Étapes de lavage 3, 6 et 9: Les étapes de lavage sont échantillons ainsi que les calibrateurs et contrôles
cruciales pour éliminer les résidus des puits de la reconstitués pendant 10 minutes sur de la glace avant le
microplaque qui résultent du processus de production pipetage de l’étape 4.
(étape 3) ainsi que d’éventuels anticorps non liés (étapes 2. Préparer un cadre de plaque avec le nombre de barrettes
6 et 9). adéquat pour tester les calibrateurs, les contrôles et les
→ Toujours réaliser les étapes de lavage avec du tampon échantillons de patient. Resceller immédiatement les
de lavage froid (2-8 ˚C). barrettes restantes dans le sachet film contenant les
→S’assurer de vider les puits complètement après le paquets de dessicatifs. Conserver au réfrigérateur.
dernier cycle de lavage. Remarque: Utiliser des réactifs froids dans les étapes
• Etape 10: S’assurer d’utiliser du substrat TMB 3 à 9.
préalablement porté à température ambiante (18-28 °C). 3. Laver les puits revêtus quatre fois avec au moins 300 µL
• Etape 11: Bien agiter les microplaques durant de tampon de lavage froid! par puits. Vider les puits et
l’incubation avec le substrat. Les rpms données (400- taper fermement la plaque sur le papier absorbant pour
600) ne s’appliquent pas à tous les agitateurs de éliminer complètement le liquide restant.
4a. Distribuer 100 µL de tampon d’incubation (blanc) en conformes aux limites établies et que la répétition permet
double dans les puits A1 et A2. d’exclure les erreurs de manipulation, vérifier les conditions
Distribuer 100 µL de calibrateur A en double dans les suivantes : i) Tous les réactifs utilisés dans les étapes 3 à 10
puits B1 et B2. ont-ils été conservés à 2-8 °C ? ii) Précision des pipettes,
des thermomètres et des chronomètres iii) Paramètres du
Distribuer 100 µL de calibrateur B en double dans les
dispositif de lecture et de lavage ELISA, iv) Date de
puits C1 et C2.
péremption des réactifs v) Conditions de stockage et
Distribuer 100 µL de calibrateur C en double dans les d’incubation vi) Couleur de la solution de substrat TMB (elle
puits D1 et D2. doit être incolore) vii) Pureté de l’eau.
Distribuer 100 µL de calibrateur D en double dans les
puits E1 et E2. STANDARDISATION
4b. Distribuer 100 µL de contrôle bas en double dans les Les calibrateurs de cette trousse ont été standardisés par
puits F1 et F2. rapport à un pool de référence interne constitué de plus de
Distribuer 100 µL de contrôle elevé en double dans les 10 sérums humains présentant des taux d’auto-anticorps
puits G1 et G2. anti-MAG, respectivement bas, moyens ou élevés. Les taux
4c. Distribuer 100 µL d’échantillons dilués en double dans et la spécificité de chaque sérum du pool de référence ont
les puits suivants. été préalablement analysés par immuno-blots anti-MAG.
5. Couvrir la microplaque à l’aide du film adhésif fourni et Les BÜHLMANN Titer Units (BTU) (ou unités de titrage
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures (±5 minutes). BÜHLMANN) ont été établies comme suit:
• Les échantillons normaux des donneurs ont été testés
6. Retirer le film adhésif de la plaque. Vider puis laver les
selon le protocole anti-MAG ELISA standard.
puits quatre fois avec au moins 300 µL de tampon de
lavage froid (2-8 °C) par puits. Vider les puits et frapper • Des échantillons de dilutions en série du pool de
fermement la plaque contre le papier absorbant pour référence ont été testés au cours du même essai.
éliminer complètement le tampon de lavage. • La dilution de l’échantillon du pool de référence
7. Ajouter 100 µL de marqueur enzymatique dans chaque immédiatement inférieure à la valeur seuil des
puits. échantillons normaux correspond au taux du pool de
référence, exprimé en BÜHLMANN Titer Units (BTU).
8. Recouvrir la microplaque d’un nouveau film adhésif et
incuber à 2-8 °C pendant 2 heures (±5 minutes). REMARQUE: Les valeurs sériques dépendent de la
9. Retirer le film adhésif. Vider puis laver quatre fois chaque méthode de dosage utilisée, particulièrement de la
puits avec ≥300 µL de tampon de lavage froid. Vider les spécificité et de la valeur seuil établies pour cette même
puits et les sécher en tapant fermement la microplaque méthode. Les titres obtenus au moyen de deux méthodes
sur du papier absorbant. différentes ne peuvent donc être comparés directement.
Remarque: Ajuster la solution de substrat TMB à RESULTATS

température ambiante (18-28 °C).
Courbe d’étalonnage
10. Ajouter 100 µL de substrat TMB dans chaque puits.
Enregistrer l’absorbance à 450 nm pour chaque puits pour
11. Recouvrir la plaque d’un film adhésif, incuber la plaque tracer une courbe d’étalonnage à partir de la moyenne des
sur un agitateur de plaques orbital à 400-600 rpm deux valeurs de chaque calibrateur, en soustrayant la DO
pendant 30 ± 2 minutes à 18-28 °C. Protéger la plaque moyenne des blancs de chaque calibrateur. Il est
de la lumière directe. recommandé d’utiliser un logiciel pour calculer la courbe
12. Ajouter 100 µL de solution stop dans chaque puits. d’étalonnage et déterminer la concentration des
Passer à l’étape 13 dans les 30 minutes qui suivent. échantillons, en utilisant un ajustement logistique à
13. Lire l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de 4 paramètres (4 PL).
microplaques.
Echantillons et Contrôles
• Enregistrer l'absorbance à 450 nm de chaque puits
CONTROLE DE QUALITE
d'échantillon et de témoin. Soustraire la DO moyenne
Il est nécessaire de bien comprendre ces instructions des blancs de la moyenne des deux valeurs de chaque
d’utilisation pour obtenir des résultats fiables. Ce but ne sera échantillon et contrôle.
atteint que par un travail en laboratoire précis (bonnes
• Repérer les valeurs d’absorbance des échantillons et des
pratiques de laboratoire usuelles) et en suivant fidèlement
contrôles sur l'axe vertical. Tracer une droite horizontale
les recommandations de cette brochure.
coupant la courbe d'étalonnage. Lire la concentration sur
Comme il n’existe pas de sérum de contrôle pour les
l'axe horizontal.
anticorps anti-MAG commercialement disponible, nous
recommandons l’utilisation d’un pool des sérums positifs et Si le lecteur de microplaques ne permet pas la lecture
négatifs comme référence interne et contrôle qualité. d’absorbances supérieures à 2 ou à l’absorbance du
Tous les contrôles doivent être inclus dans les intervalles de calibrateur le plus haut (calibrateur A), une deuxième lecture
confiance établis (BTU). Les intervalles de confiance pour à 490 ou 492 nm est recommandée (filtre de référence à 600
les contrôles sont spécifiques au lot et inscrites sur la fiche ou 620 nm, si disponible). Dans ce cas, établir une
de données de QC fournie avec le kit. deuxième courbe d’étalonnage à l’aide des mesures
Les caractéristiques de performances doivent être incluses d’absorbance des calibrateurs à 490 ou 492 nm. La
dans les limites établies. Si ces caractéristiques ne sont pas concentration des échantillons hors limite à 450 nm est
ensuite lue à l’aide de la nouvelle courbe d’étalonnage,
selon la même méthode décrite ci-dessus. Les lectures à Linéarité de dilution: 147 %. Sept échantillons sériques
490 ou 492 nm de doivent pas remplacer les lectures à humains présentant des taux élevés d’auto-anticorps anti-
450 nm. MAG ont été dilués du 1000ème au 64000ème (de 1:1000 à 1:
64000) avec du le tampon d’incubation, puis incubés durant
Remarque: Les résultats présentés dans le tableau 3 et la
une heure à 18-28 °C puis dosés selon le protocole standard
figure 1 sont des exemples. Le calibrateur et les contrôles
(table 7). Il est probable que la haute déviation observée
doivent être utilisés dans chaque série de dosage.
dans environ 50 % des échantillons soit due à l’agrégation
Résultats et courbe d’étalonnage ne sont fournis qu'à titre d’anticorps. En général, les sérums pathologiques
d'exemple. Une courbe d’étalonnage doit être tracée pour présentent des taux d’auto-anticorps très élevés. Cette
chaque nouvelle série d'échantillons à doser. déviation n’a en conséquence pas d’influence sur
l’interprétation des résultats.
LIMITES Spécificité: Quatre types d’expérimentation ont été
1. Les résultats du test doivent être interprétés en tenant pratiqués afin d’évaluer la spécificité du test Autoanticorps
compte des informations résultant de l’examen clinique anti-MAG ELISA:
du patient et d’autres procédures diagnostiques. 1. Neutralisation des auto-anticorps anti-MAG: Cinq
2. Le test ELISA Autoanticorps anti-MAG n’a pas été validé sérums présentant des taux élevés d’auto-anticorps anti-
pour les échantillons de plasmaphérèse. MAG ont été inhibés dans leur fixation à la microplaque
coatée de MAG de manière concentration-dépendante
après préincubation pendant 1 heure dans du tampon
INTERVALLES DES REFERENCES VALEURS SEUIL
d’incubation supplémenté de 1 à 200 µg/mL de MAG avant
(CUT-OFF)
analyse en ELISA.
La concentration normale d’auto-anticorps anti-MAG dans le 2. Spécificité de liaison des auto-anticorps anti-MAG:
sérum humain a été évaluée en analysant les échantillons Cinq sérums présentant des taux moyens à élevés d’auto-
sanguins de donneurs asymptomatiques (hommes et anticorps anti-MAG ainsi que cinq sérums testés négatifs à
femmes âgés de 18 à 70 ans). 150 échantillons ont été l’aide du test anti-MAG ont été analysés au moyen d’une
testés d’après la procédure standard. Voir table 4 pour les microplaque GanglioCombi (EK-GCO) revêtue GA1, GM1,
résultats obtenus. GM2, GD1a, GD1b et GQ1b. Aucun échantillon n’a
REMARQUE: Ces valeurs ne sont données qu’à titre présenté de rapport supérieur à 10 %. De manière similaire,
indicatif. Il est recommandé à chaque laboratoire de définir six sérums avec de hauts taux d’auto-anticorps anti-
ses propres valeurs normales pour sa propre population de Ganglioside (voir plus haut) ainsi que cinq sérums négatifs
patients. ont été testés sur des microplaques revêtues de MAG.
Aucun de ces échantillons «pathologiques» n’a présenté un
Cut-off/valeur seuil proposé(e) signal supérieur à 300 BTU.
La moyenne +3 écarts types donne une valeur seuil
3. Comparaison avec la méthode immunoblot (Western
technique de 729 BTU. Pour des raisons pratiques, nous Blot): 127 échantillons sériques (40 femmes, 87 hommes
recommandons d’utiliser une valeur seuil de 1000 BTU, âgés de 4 à 90 ans) atteints de neuropathologies
correspondant au calibrateur le plus bas (calibrateur D) de soupçonnées d’être causées par des auto-anticorps anti-
la courbe d’étalonnage. MAG ont été testés par la méthode ELISA et par
immunoblot, La glycoprotéine MAG, isolée du système
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE nerveux central (SNC) humain, a été utilisée avec les deux
Précision intra-essai: 6,5 %. La précision intra-essai a été méthodes. Tous les douze sérums présentant des taux
calculée à partir des mesures de 20 duplicats de chaque d’auto-anticorps anti-MAG moyens à très hauts par ELISA
échantillon lors d’un seul et même essai (table 5). ont également été positifs par immunoblot. 114 des 115
échantillons présentant un taux d’auto-anticorps anti-MAG
Précision inter-essai: 15,4 %. La précision inter-essai a été
sérique inférieur à la valeur seuil par ELISA ont également
calculée à partir des résultats de 20 duplicats de chaque
été négatifs par immunoblot alors qu’un seul échantillon est
échantillons lors de 20 essais différents (table 6).
resté faiblement positif par immunoblot (F. Ferracin and A.J.
Limite de blanc (LoB): 444 BTU. 20 duplicats du tampon Steck, résultats non publiés).
d’incubation ont été mesurés lors d’un seul et même essai.
4. Comparaison avec la méthode IFA (Indirect
La moyenne et l’écart type des valeurs d’absorbance ont été
Immunofluorescence Assay): Les sérums de 150 patients
calculés. La dose détectable minimale d’anticorps anti-MAG
(de sexe et âge inconnus) atteints de gammapathies
a été définie à 444 BTU en additionnant 2 écarts types à
monoclonales d’IgM ont été testés par ELISA et IFA. Dans
l’absorbance moyenne puis en déterminant le titre
la méthode IFA, les sérums ont été incubés sur des sections
correspondant à cette valeur d’absorbance à l’aide de la
de nerf sciatique de singe congelées et fixées à l’acétone.
courbe d’étalonnage obtenue lors du même essai.
Les auto-anticorps anti-MAG ont été détectés par anticorps
Limite de quantification (LoQ): 900 BTU. 20 duplicats de FITC-marqués dirigés contre les IgM humaines. 26 patients
faibles titres d’auto-anticorps anti-MAG ont été testés lors (17,3 %) ont étaient positifs et 115 (76,7 %) étaient négatifs
d’un seul et même essai. La moyenne, l’écart type (SD) et le avec les deux méthodes, alors que cinq sérums (3,3 %)
coefficient de variation (CV) des valeurs d’absorbance ont étaient positifs par la méthode IFA uniquement et quatre
été calculés. Un taux de 900 BTU a été obtenu, avec un sérums (2,7 %) étaient positifs par la méthode ELISA
CV inférieur à 10 %. uniquement (2).

ITALIANO
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
USO Marcato enzimatico
IgM
Il dosaggio Autoanticorpi anti-MAG ELISA è un test Anticorpo anti-IgM 1 flacone Pronto all‘uso
diagnostico quantitativo in vitro per la determinazione umane coniugato a B-MAG-ELM
11 mL Soluzione Blu
degli auto-anticorpi IgM umani diretti verso la glicoproteina HRP in un tampone a
associata alla mielina (MAG) nel siero. Serve come ausilio base proteica con
conservanti
nella diagnosi della neuropatia demielinizzante
Substrato di TMB
paraproteinemica (PDN) in aggiunta ad altri risultati clinici 1 flacone
TMB in un tampone B-TMB Pronto all‘uso
e di laboratorio (1-7). 11 mL
citrato
Soluzione stoppante Pronto all‘uso
PRINCIPIO DEL DOSAGGIO 1 flacone
0,25 M di acido B-STS Agente
11 mL
Il dosaggio Autoanticorpi anti-MAG ELISA utilizza la solforico corrosivo
tecnica per immunodosaggi quantitativi tipo sandwich Tabella 1
amplificato enzimaticamente. Le micropiastre del test 1
Dopo la ricostituzione, i calibratori A, B, C e D contengono
sono pre-coattate con MAG di cervello umano altamente rispettivamente 70000, 15000, 3000 e 1000 Unità Titolate
BÜHLMANN (BTU) di anticorpi anti-MAG.
purificata (1). Un calibratore, i controlli e i sieri dei pazienti 2
I Controlli contengono quantitativi lotto-specifici di anticorpi MAG.
sono incubati nei pozzetti della piastra e gli eventuali auto- Fare riferimento ai fogli per i controlli per le concentrazioni esatte.
anticorpi anti-MAG presenti nei campioni si legano alla
MAG umana immobilizzata. Dopo l’eliminazione delle CONSERVAZIONE ED EMI-VITA DEI REAGENTI
sostanze libere mediante lavaggio, gli auto-anticorpi anti-
MAG vengono rilevati con anticorpi contro le IgM umane Reagenti Sigillati / (Non Aperti)
marcati con perossidasi di rafano (HRP). Dopo un Tutti i component del kit sigillati/non aperti sono stabili a 2-8 °C fino
secondo lavaggio, nel quale viene rimosso il marcatore alla data di scadenza indicata sulle etichette.
enzimatico libero, viene aggiunta una soluzione di Reagenti Aperti / Ricostituiti
substrato contenente tetrametilbenzidina (TMB). Si
Riporre le strip non utilizzate immediatamente
sviluppa un colore blu proporzionale alla quantità di nella busta che contiene il dessiccante e
Micropiastra
anticorpi legati alla MAG umana immobilizzata. Lo risigillare completamente chiudendo la zip.
sviluppo di colore viene interrotto mediante l’aggiunta di Conservare fino a 2 mesi a 2-8 °C.
una soluzione bloccante acida (acido solforico diluito) che Tampone di
Conservare fino a 2 mesi a 2-8 °C.
fa virare la soluzione da blu a giallo. L’intensità del colore lavaggio diluito
viene misurata a 450 nm. Calibratori
Conservare fino a 2 mesi a -20 °C.
L’assorbanza misurata è proporzionale al titolo di auto- Controlli
anticorpi anti-MAG umana presenti in un dato campione. Tampone
Un set di calibratori di auto-anticorpi anti-MAG umana d’incubazione
viene utilizzato per registrare una curva di calibrazione Marcato
Conservare a 2-8 °C fino alla data di scadenza
dell’assorbanza in funzione delle unità titolate di auto- indicata sulle etichette.
enzimatico IgM
anticorpi anti-MAG umana. Le concentrazioni di auto- Substrato di TMB
anticorpi anti-MAG umana nei campioni vengono
Soluzione Conservare a 18-28 °C fino alla data di
calcolate in base alla curva di calibrazione. stoppante scadenza indicata sulle etichette.
Tabella 2
REAGENTI FORNITI E PREPARAZIONE
Reagenti Quantità Codice Ricostituzione
MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
Micropiastra Strips da 12 x • Pipette di precisione con puntali monouso: 20 µL,
96 pozzetti precoattati 8-pozzetti con B-MAG-MP Pronto all‘uso 100 µL e 1000 µL.
con MAG umana supporto
Foglio sigillante per • Provette monouso di polipropilene o polistirene per la
3 fogli preparazione di diluizioni del campione.
la piastra
1 flacone Diluire con • Beuta a cilindro da 1000 mL per la diluizione del
Tampone di lavaggio
B-MAG-WB 900 mL di acqua
concentrato (10x) 100 mL tampone di lavaggio concentrato.
deionizzata
Tampone • Flacone dosatore per il tampone di lavaggio o
1 flacone lavatore automatico per micropiastre.
d’incubazione con B-MAG-IB Pronto all‘uso
100 mL
Con conservanti • Carta assorbente.
Calibratore A a D 1 Aggiungere • Agitatore orbitale per micropiastre.
B-MAG- 1 mL di
Siero umano con 4 flaconi • Lettore di micropiastra per la misurazione
CASET Tampone di
conservanti Incubazione dell’assorbanza a 450 nm.
Controllo basso ed Aggiungere
alto2 B-MAG- 1 mL di
2 flaconi
Siero umano con CONSET Tampone di
conservanti Incubazione

PRECAUZIONI essere agitata efficacemente, ma facendo in modo di
evitare la fuoriuscita di liquido.
Precauzioni di sicurezza
• Usando dispositivi automatici per lavaggio/ aspirazione
• La micropiastra (B-MAG-MP), il calibratore (B-MAG-
della micropiastra, BÜHLMANN consiglia l’utilizzo della
CASET) ed i controlli di questo kit (B-MAG-CONSET)
modalità: “plate mode”; dispensazione sequenziale in
contengono componenti di origine umana. Benché
tutte le strip e successiva aspirazione.
testati e risultati negativi all’antigene di superficie HBV
e agli anticorpi HCV e HIV1/2, i reagenti devono essere • I componenti non devono essere utilizzati dopo la data
maneggiati come potenzialmente infettivi e secondo le di scadenza riportata sulle etichette.
buone pratiche di laboratorio utilizzando le dovute • Non miscelare reagenti appartenenti a lotti diversi.
precauzioni. • Fare ogni tentativo per assicurarsi che tra i reagenti, i
• Soluzione stoppante: La soluzione stoppante (B-STS) campioni o tra i pozzetti non vi siano contaminazioni
contiene acido solforico (0,25 M). Il reagente è irritante incrociate.
per gli occhi, per la pelle e per le membrane mucose. • I micropozzetti non possono essere riutilizzati.
Evitare il contatto con gli occhi, la pelle e gli indumenti.
In caso di contatto con gli occhi o con la pelle, lavare
immediatamente con abbondante acqua. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI
• Reagenti: Evitare il contatto dei reagenti con la pelle, • La procedura richiede <0,1 mL di sangue o <50 µL di
gli occhi o le membrane mucose. In caso di contatto, siero.
lavare immediatamente con abbondanti quantità di • Campioni lipemici, emolizzati ed iterici, non devono
acqua, in caso contrario si possono sviluppare essere usati in questa analisi. I campioni lipemici
irritazione / ustioni. possono essere evitati chiedendo ai pazienti di
• In merito alle precauzioni adeguate per lo smaltimento digiunare per almeno 12 ore prima del prelievo del
di reagenti del kit, consigliamo vivamente di consultare campione.
prima le normative locali speciali del proprio paese. • Prelevare i campioni di sangue in provette semplici
Precauzioni tecniche (non anticoagulante), evitando l’emolisi, lasciare
• Leggere attentamente le istruzioni prima di eseguire il coagulare per un’ora a temperatura ambiente
test. Le prestazioni del test subiranno un effetto (18-28 °C), centrifugare per 10-30 minuti a circa
negativo se si utilizzano reagenti diluiti in modo errato, 1000-2000 x g a temperatura ambiente e prelevare il
modificati o conservati diversamente da come siero.
specificato nelle presenti istruzioni per l’uso. • Conservare i campioni di siero a ≤-20 °C. I campioni
• Residui rimasti nei pozzetti sono causati dal processo sono stabili per ≥1 anno se conservati a ≤-20 °C.
di produzione. Questi residui vengono completamente Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. I
eliminati dai lavaggi durante la procedura descritta e campioni congelati devono essere scongelati e
non compromettono in alcun modo i resultati. (fare mescolati completamente capovolgendoli o
riferimento al punto 3 delle istruzioni per l’uso). scuotendoli leggermente prima dell’utilizzo.
• Preparare i reagenti prima di iniziare la procedura del • Raccomandiamo di congelare aliquote di campioni del
test. I reagenti utilizzati nei punti 3-9 devono essere paziente per evitare cicli ripetuti di congelamento/
freddi (2-8 °C) e devono essere mantenuti freddi scongelamento.
mentre si pipetta e durante il lavaggio. Mettere il
substrato TMB a temperature ambiente (18-28 °C). DOSAGGIO
• Punti 3-9: Usare reagenti freddi (2-8 °C) per tutti questi 1. Diluire tutti i campioni del paziente da analizzare
punti e mantenerli freddi mentre si pipetta. 1:1000 con tampone di incubazione. Usare 2 µL di
Raccomandazione: preparare il tampone di lavaggio la siero + 2000 µL di tampone di incubazione. Miscelare
sera prima di eseguire il test e riporlo in frigorifero fino accuratamente con il vortex e lasciare i campioni diluiti
al giorno seguente. per un’ora a 18-28 °C. Mettere i campioni e i calibratori
• Punti di lavaggio 3, 6 e 9: Le fasi di lavaggio sono ricostituiti e i controlli per 10 minuti in ghiaccio prima di
essenziali per rimuovere dai pozzetti della micropiastra pipettarli nel punto 4.
i residui che derivano dal processo di produzione 2. Preparare il modulo di supporto per micropiastre con il
(punto 3), nonché eventuali anticorpi liberi (punti 6 e 9). numero necessario di strip per analizzare i calibratori,
i controlli e i campioni del paziente. Risigillare
→ Eseguire sempre il lavaggio con tampone di lavaggio
immediatamente le strip rimanenti nella busta di
freddo (2-8 ˚C).
alluminio assieme alle confezioni di essiccante.
→Dopo lùltimo ciclo di lavaggio delle strip, assicurarsi
Conservarle refrigerate.
che i pozzetti siano completamente vuoti.
• Punto 10: Assicurarsi prima dellùso che il substrato Nota: Usare reagenti freddi nei punti da 3 a 9.
TMB raggiunga 18-28 °C. 3. Lavare i pozzetti rivestiti quattro volte usando almeno
• Punto 11: Assicurarsi una buona agitazione della 300 µL di tampone di lavaggio freddo! per pozzetto.
micropiastra durante lìncubazione con il Substrato Svuotare i pozzetti e picchiettare fermamente la piastra
TMB bene. A seconda del tipo di agitatore è consigliata su carta assorbente per rimuovere completamente il
una velocità di 400-600 rpm. La micropiastra deve liquido rimanente.

4a. Dispensare 100 µL di soluzione d’incubazione (come Le caratteristiche di prestazione devono rientrare nei limiti
bianco) in duplicato nei pozzetti A1+A2 stabiliti. Se tali caratteristiche non sono conformi ai limiti
Dispensare 100 µL del calibratore A in duplicato nei stabiliti e la ripetizione del test esclude problemi di
pozzetti B1+B2. manipolazione, controllare i seguenti aspetti: i) tutti i
reagenti utilizzati nei punti 3-10, sono stati tenuti a 2-8 °C?
Dispensare 100 µL del calibratore B in duplicato nei
ii) accuratezza delle pipette, dei termometri e dei
pozzetti C1+C2.
cronometri, iii) impostazioni del lavatore e del lettore
Dispensare 100 µL del calibratore C in duplicato nei ELISA, iv) data di scadenza dei reagenti v) condizioni di
pozzetti D1+D2. conservazione e di incubazione vi) colore della soluzione
Dispensare 100 µL del calibratore D in duplicato nei di substrato TMB (deve essere incolore) vii) purezza
pozzetti E1+E2. dell’acqua.
4b. Dispensare 100 µL del controllo basso in duplicato nei
pozzetti F1+F2. STANDARDIZZAZIONE
Dispensare 100 µL del controllo alto in duplicato nei I calibratori del kit sono standardizzati vs. un pool interno
pozzetti G1+G2. di riferimento. Il pool di riferimento consiste in più di dieci
4c. Dispensare 100 µL di ciascun campione diluito in sieri umani contenenti rispettivamente, titoli, bassi, medi
duplicato nei pozzetti successivi. ed elevati di anticorpi anti-MAG. Titoli e specificità di
5. Coprire la piastra con un foglio sigillante ed incubare ciascun siero nel pool di riferimento sono stati inizialmente
per 2 ore (±5 min) a 2-8 °C. analizzati con immunoblot anti-MAG.
6. Rimuovere il foglio sigillante dalla piastra. Svuotare i Le Unità Titolate BÜHLMANN (BTU) sono state stabilite
pozzetti e lavare quattro volte usando almeno 300 µL come segue:
di tampone di lavaggio freddo (2-8 °C) per pozzetto. • Campioni normali sono stati dosati secondo la
Svuotare i pozzetti e picchiettare fermamente la piastra procedura Autoanticorpi anti-MAG ELISA.
su carta assorbente per rimuovere completamente il • Campioni diluiti serialmente appartenenti al pool di
tampone di lavaggio. riferimento sono stati dosati nella stessa seduta.
7. Aggiungere 100 µL di marcato enzimatico IgM a tutti i • La diluizione all’interno della quale rientra il pool di
pozzetti. campioni di riferimento in prossimità del cut-off
8. Coprire la piastra con un foglio sigillante ed incubare corrisponde al titolo del pool di riferimento.
per 2 ore (±5 min) a 2-8 °C. Nota: Valori titolati di siero dipendono dal metodo di
9. Togliere il foglio sigillante. Svuotare i pozzetti e lavare dosaggio e, in particolare, dalla specificità dei valori di cut-
quattro volte utilizzando almeno 300 µL di tampone di off stabiliti con un unico metodo di dosaggio. Quindi, valori
lavaggio a freddo (2-8 °C) per pozzetto. Svuotare i titolati ottenuti con metodi diversi non possono essere
pozzetti e picchiettarli su carta assorbente. comparati direttamente.
Nota: equilibrare la soluzione di substrato TMB a
temperatura ambiente (18-28 °C). RESULTATI E CALCOLO
10. Aggiungere 100 µL di soluzione di substrato TMB ad Curva standard

ogni pozzetto. Registrare l’assorbanza a 450 nm di ogni pozzetto, per
costruire una curva di calibrazione in base alla media dei
11. Coprire la piastra con un foglio sigillante per piastra,
duplicati del calibratore, sottraendo la densità ottica (OD)
incubare la piastra in un agitatore orbitale per piastre a
media del bianco da ogni calibratore. Si raccomanda di
400-600 rpm per 30 ± 2 minuti a 18-28 °C. Proteggere usare un programma software per calcolare la curva di
la piastra dalla luce solare diretta. calibrazione e per determinare la concentrazione dei
12. Aggiungere a tutti i pozzetti 100 µL di soluzione campioni, usando un modello logistico a 4 parametri
stoppante. Passare al punto 13 entro 30 minuti. (4 PL).
13. Leggere l’assorbanza a 450 nm in un lettore per Campioni e controlli
micropiastre.
• Registrare l’assorbanza a 450 nm per ogni pozzetto di
campione e di controllo. Sottrarre la OD media del
CONTROLLO DI QUALITA bianco dalla media dei valori duplicati di ogni campione
È necessario comprendere bene le presenti istruzioni per e controllo.
l’uso per arrivare a risultati affidabili, che si otterranno solo • Localizzare i valori di assorbanza dei campioni e dei
adottando tecniche di laboratorio precise (le attuali linee controlli sull’asse verticale, tracciare una linea
guida di buona pratica di laboratorio) e seguendo con orizzontale che intersechi la curva calibratore e leggere
attenzione le istruzioni per l’uso. dall’asse orizzontale.
Poiché non esiste in commercio un siero di controllo per Se il lettore di micropiastre non è in grado di leggere
gli anticorpi anti-MAG, raccomandiamo l’uso di un pool di assorbanze maggiori di 2 o superiori all’assorbanza dello
sieri positivi e di uno di sieri negativi per il controllo di calibratore più elevato (calibratore A), si consiglia una
qualità interno. seconda lettura alla lunghezza d’onda di 490 o 492 nm
Tutti i controlli devono rientrare negli intervalli di (sono disponibili filtri di riferimento a 600 o 620 nm). In
confidenza stabiliti (BTU). Gli intervalli di confidenza dei questo caso, procedere alla costruzione di una seconda
controlli sono specifici per lotto e sono indicati nella curva standard con le letture delle assorbanze di tutti gli
scheda informativa di controllo qualità inclusa nel kit. calibratori a 490 o 492 nm. La concentrazione dei
campioni fuori scala a 450 nm vengono lette dalla nuova MAG sono stati diluiti con tampone d’incubazione 1:1000
curva standard come più sopra descritto. Le letture a 490 fino a 1:64000, lasciati per una ora a 18-28 °C ed in
o 492 nm non devono sostituire le letture in scala a seguito determinanti seguendo le istruzioni di procedura.
450 nm. Si considera che la deviazione relativamente elevata in
ca. 50 % dei campioni sia dovuta a delle aggregazioni di
Nota: I risultati presentati in tabella 3 e in figura 1 sono
anticorpi. In genere, campioni patologici mostrano
esempi. Si devono usare calibratore e controlli per ogni
concentrazioni altamente elevate, e dunque non ha un
singolo dosaggio.
influsso nella discriminazione tra positivo e negativo
Risultati e curva di calibrazione sono forniti a scopo (tabella 7).
esclusivamente dimostrativo. La curva di calibrazione Specificità: Sono stati effettuati quattro set di esperimenti
deve essere creata per ogni set di campioni da analizzare. per determinare la specificità del dosaggio Autoanticorpi
anti-MAG ELISA:
LIMITI DELLE PRESTAZIONI 1. Neutralizzazione degli auto-anticorpi anti-MAG: cinque
1. I risultati del test vanno interpretati insieme alle sieri con titoli elevati d’anti-MAG possono essere inibiti dal
informazioni derivanti dagli studi epidemiologici, dalla legarsi alle micropiastre coattate con MAG in modo
valutazione clinica del paziente e da altre procedure dipendente dalla concentrazione se preincubati per un’ora
diagnostiche. con il tampone d’incubazione fornito e da 1 a 200 µg/mL
2. Il dosaggio Autoanticorpi anti-MAG ELISA non è stato di MAG prima del dosaggio con ELISA.
validato per campioni di plasmaferesi. 2. Specificità del legame degli auto-anticorpi anti-MAG:
cinque sieri di medi ed alti titer d’anticorpi anti-MAG e
VALORI DI CUT-OFF E STANDARDIZZAZIONE cinque sieri negativi sono stati determinati su una
micropiastra GanglioCombi (EK-GCO) coattata con GA1,
La frequenza degli auto-anticorpi anti-MAG nei sieri umani GM1, GM2, GD1a, GD1b e GQ1b. Nessuno dei campioni
normali è stata determinata utilizzando campioni di ha mostrato rapporti maggiori a 10 %. Similarmente, sei
sangue da volontari asintomatici (donne ed uomini adulti sieri con alte concentrazioni d’auto-anticorpi anti-
dai 18 ai 70 anni). Sono stati dosati 150 campioni secondo gangliosidi (veda sopra) e cinque sieri negativi sono stati
la metodica. In tabella 4 sono riportati i risultati ottenuti. determinati su micropiastre coattate con MAG. Nessuno
Nota: Questi range devono essere utilizzati solo come di questi campioni positivi ha dato segnali maggiori a 300
linee guida. Si consiglia ad ogni laboratorio di stabilire i BTU.
propri range attesi per la propria popolazione di pazienti. 3. Comparazione con immunoblot (Western Blot): 127
campioni di sieri (40 femmine; 87 maschi; età 4-90 anni)
Cut-off titolati suggeriti
con malattie neurologiche presumibilmente causate da
La media +3SD produrre un valore di cut-off tecnico di 729 auto-anticorpi anti-MAG sono stati testati rispettivamente
BTU. Per ragioni pratiche, consigliamo l’utilizzo di un con il metodo ELISA e Western Blot. MAG isolata dal
valore di cut-off di 1000 BTU, corrispondente allo sistema nervoso centrale umano (CNS) è stata utilizzata
calibratore più basso (=calibratore D) nella curva in entrambi i metodi. Tutti e dodici i sieri che presentano
standard. titoli da medi a molto elevati di auto-anticorpi anti-MAG
IgM nella procedure ELISA si sono rivelati chiaramente
CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI positivi se analizzati con immunoblot. 114 sieri su 115 che
Precisione Intra-Dosaggio (Intra-Seduta): 6,5 %. La presentavano titoli di anticorpi IgM anti-MAG al di sotto del
precisione intra-dosaggio è stata calcolata dai risultati di valore di cut-off ELISA erano negativi anche se analizzati
20 coppie di valori ottenuti in un’unica seduta (tabella 5). con immunoblot, mentre un siero era leggermente
positivo solo con il metodo immunoblot. (F. Ferracin and
Precisione Inter-Dosaggio (Da Seduta a Seduta):
A.J. Steck, risultati non pubblicati).
15,4 %. La precisione inter-dosaggio è stata calcolata dai
risultati di 20 coppie di valori ottenuti in 20 sedute diverse 4. Comparazione con il dosaggio ad immuno-
(tabella 6). fluorescenza indiretta (IFA): I sieri di 150 pazienti (sesso
ed età ignoti) con gammopatie monoclonali IgM
Limite del Blanco (LoB): 444 BTU. 20 duplicati di
diagnosticate sono stati testati rispettivamente con un
tampone d’incubazione sono stati determinati in un unico
metodo ELISA ed un metodo IFA. Nel metodo IFA, i sieri
run. Valori medi e di deviazione standard sono stati
sono stati incubati su sezioni di nervo sciatico di scimmia
calcolati per i valori d’assorbanza. La dose minimale
congelato e fissato con acetone; gli anticorpi legati anti-
detestabile d’anticorpi anti-MAG di 444 BTU è stata
MAG erano stati individuati con anticorpi anti-IgM umane
calcolata aggiungendo due deviazioni standard alla media
marcati con FITC. 26 pazienti (17,3 %) erano positivi e
d’assorbanza ed intersezionando questo valore con la
115 pazienti (76,7 %) erano negativi con entrambi i
curva standard ottenuto in questo run.
metodi, mentre cinque sieri (3,3 %) erano positivi solo con
Limite di Quantificatione (LoQ): 900 BTU. 20 duplicati il metodo IFA e quattro sieri (2,7 %) erano positivi solo con
di lievi concentrazioni d’auto-anticorpi anti-MAG sono stati il metodo ELISA, rispettivamente (2).
deluminati in un unico run. Valori medi di deviazione
standard (SD) e coefficiente di variazione (CV) sono stati
calcolati con i valori d’assorbanza. Abbiamo ritrovato 900
BTU risultando con una CV di 10 %.
Linearità/Parallelismo di Diluzione: 147 %. Sette sieri
umani contenenti alte concentrazioni di anticorpi anti-

ESPAÑOL
Reactivos Cantidad Código Reconstitución
INDICACIONES DE USO Control bajo y alto2 Añadir 1 mL de
B-MAG-
Suero humano con 2 viales tampón de
El ELISA de Autoanticuerpos anti-MAG ha sido diseñado CONSET
conservantes incubación
para realizar la determinación diagnóstica in vitro
Marcada enzimatica-
cuantitativa de auto-anticuerpos IgM humanos dirigidos mente IgM
contra la glicoproteína asociada a la mielina (MAG) en el Anticuerpo anti-IgM 1 vial Listo para usar
suero. Sirve como ayuda, junto con otros hallazgos humana conjugado B-MAG-ELM
11 mL Solución azul
clínicos y de laboratorio, en el diagnóstico de la con HRP en un
neuropatía desmielinizante asociada a paraproteínas tampón proteico con
conservantes
(PDN) (1-7).
Substrato de TMB
1 vial
TMB en tampón B-TMB Listo para usar
PRINCIPIOS BÁSICOS DEL ENSAYO 11 mL
citrato
El enzimoinmunoanálisis (ELISA) de Autoanticuerpos Listo para usar
Solución de parada 1 vial
anti-MAG utiliza la técnica cuantitativa de inmunoanálisis B- STS Agente
tipo sandwich. Las placas de microtitulación de la prueba Ácido sulfúrico 0,25 M 11 mL
corrosivo
vienen previamente recubiertas con MAG altamente Tabla 1
purificada procedente de cerebro humano (1). El 1
Después de la reconstitución, los calibradores A, B, C y D contienen
calibrador, los controles y los sueros de paciente se respectivamente 70000, 15000, 3000 y 1000 unidades de titulación
incuban en los pocillos de microtitulación, con lo que BÜHLMANN (BTU) de anticuerpos anti-MAG.
2
Los controles contienen cantidades específicas del lote de
cualquier auto-anticuerpo anti-MAG presente en las anticuerpos anti-MAG. Consulte la hoja de datos de control adicional
muestras se une a la MAG humana inmovilizada. Tras un para las concentraciones exactas.
lavado para retirar las sustancias no unidas, los auto-
anticuerpos anti-MAG se detectan con anticuerpos frente ALMACENAMIENTO Y DURACIÓN DE LOS
a IgM humana marcados con peroxidasa de rábano REACTIVOS
picante (HRP). Tras un segundo paso de lavado en el que
se retira el marcador enzimático no unido, se añade una Reactivos Sellado / Sin Abrir
solución substrato que contiene tetrametilbencidina Todos los componentes del kit sellados/sin abrir permanecen
(TMB). Se desarrolla así una coloración azul proporcional estables a una temperatura de entre 2 y 8 ºC hasta la fecha de
caducidad impresa en las etiquetas.
a la cantidad de anticuerpos unidos a la MAG humana
inmovilizada. El desarrollo de color se detiene añadiendo Reactivos Abiertos / Reconstituidos
una solución de parada ácida (ácido sulfúrico diluido) que Guarde inmediatamente las tiras que no ha
hace virar la solución azul hacia el amarillo. Se mide utilizado en la bolsa metalizada que contiene los
entonces la intensidad del color a 450 nm. Microplaca sacos desecantes y vuelva a cerrarla
completamente por toda la cremallera.
La absorbancia medida es proporcional al título de Almacénese hasta 2 meses a 2-8 °C.
autoanticuerpos anti-MAG humana presente en una
Tampón de
determinada muestra. Se utiliza un conjunto de lavado diluido
Almacénese hasta 2 meses a 2-8 °C.
calibradores de auto-anticuerpos anti-MAG humana para
Calibradores
trazar una curva de calibración de la absorbancia frente al Almacénese hasta 2 meses a -20 °C.
Controles
título de autoanticuerpos anti-MAG humana. Las
concentraciones de auto-anticuerpos anti-MAG humana Tampón de
incubación
presentes en las muestras se calculan en base a esa
curva de calibración. Marcador Almacénese a entre 2 y 8 ºC hasta la fecha de
enzimético IgM caducidad impresa en las etiquetas.
Substrato de
REACTIVOS INCLUIDOS Y PREPARACIÓN
TMB
Reactivos Cantidad Código Reconstitución Solución de Almacénese a entre 18 y 28 ºC hasta la fecha
Microplaca parada de caducidad impresa en las etiquetas.
12 tiras de 8 Tabla 2
96 pocillos pocillos con B-MAG-MP Listo para usar
recubiertos con MAG soporte
humana MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS
Sellador de placas 3 unidades
• Pipetas de precisión con puntas desechables: pipetas
Diluir con
Tampón de lavado 1 botella de 20 µL, 100 µL y 1000 µL.
B-MAG-WB 900 mL de agua
concentrado (10x) 100 mL desionizada • Tubos desechables de poliestireno o polipropileno
Tampón de para la preparación de las diluciones de muestra.
1 botella
incubación B-MAG-IB Listo para usar
100 mL • Cilindro de 1000 mL para la dilución del tampón de
Con conservantes lavado concentrado.
Calibrador A a D1 Añadir 1 mL de
B-MAG- • Frasco lavador para el tampón de lavado o lavador de
Suero humano con 4 viales tampón de
CASET
incubación
placas de microtitulación automático.
conservantes
• Papel secante.
• Agitador orbital para placas de microtitulación.

• Lector de placas de microtitulación para la medición de • Paso 11: Agite las placas del microtítulación bien
la absorbancia a 450 nm. durante la incubación con el substrato. Las RPM dadas
(400-600) no solicitan cada rotor. La solución debe
PRECAUCIONES moverse en pocillos – evite salpicaduras.
• BÜHLMANN utilize una lavadora de placa
Precauciones de seguridad
automatizada, programada en "modo supuesto de
• La microplaca (B-MAG-MP), los calibradores (B-MAG- placa" es decir que cada paso de proceso (dispense)
CASET) y los controles (B-MAG-CONSET) de este kit se realiza en todas las tiras secuencialmente, antes de
contienen componentes de origen humano. Aunque se procesar al paso siguiente (aspiración).
ha comprobado y encontrado negativo para el
• Los componentes no deben utilizarse después de la
antígeno de superficie de HBV y anticuerpos HCV y
fecha de caducidad impresa en las etiquetas.
VIH1/2, los reactivos deben manipularse como si
fueran capaces de transmitir infecciones y deben • No mezcle diferentes lotes de reactivos.
manejarse de acuerdo con las buenas prácticas de • Debe hacerse todo lo posible para garantizar que no
laboratorio, tomando las precauciones adecuadas. se produzca contaminación cruzada entre reactivos,
• Solución de parada: La solución de parada (B-STS) muestras o entre pocillos.
contiene ácido sulfúrico (0,25 M). El reactivo es • Los micropocillos no pueden ser reutilizados.
irritante para los ojos, la piel y las membranas
mucosas. Evitar el contacto con los ojos, la piel y la RECOGIDA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS
ropa. Tras un contacto con los ojos o la piel, lavar
inmediatamente con abundante agua. • El procedimiento requiere <0,1 mL de sangre o <50 µL
de suero.
• Reactivos: Evitar el contacto de los reactivos con la
piel, los ojos o las membranas mucosas. Si se produce • Muestras lipemicas, hemoliticas o ictericas pueden
el contacto, lavar inmediatamente con cantidades interferir con el ensayo y no deben sér utilizadas. Se
generosas de agua; de lo contrario, se pueden puede evitar la obtención de muestras lipémicas
producir irritación o quemaduras. pidiendo a los pacientes que ayunen durante como
mínimo las 12 horas previas a la extracción de la
• Las soluciones/reactivos no utilizados deben
muestra.
eliminarse según la normativa local.
• Recoja la sangre en tubos limpios (sin anticoagulante),
Precauciones técnicas evite la hemólisis, deje coagular durante una hora a
• Lea atentamente las instrucciones antes de realizar el temperatura ambiente (18-28 °C), centrifugue durante
ensayo. El rendimiento del ensayo se verá gravemente 10-30 minutos a aproximadamente 1000-2000 x g a
afectado si los reactivos son incorrectamente diluidos, temperatura ambiente y recoja el suero.
modificados o almacenados en condiciones distintas a
• Almacene las muestras de suero a ≤-20 °C. Las
las que se detallan en estas instrucciones de uso.
muestras son estables durante ≥1 año si se almacenan
• Residuos pueden formarse en los pocillos durante el a ≤-20 °C. Evite ciclos repetidos de congelación-
processo de la producción. Ellos estan eliminado descongelación. Las muestras congeladas deben
completamente durante lavar los pocillos y no tienen descongelarse y mezclarse completamente por
ninguna influencia en los resultados (véase a punto 3 agitación o inversión suave antes de su uso.
de la instrucción de uso).
• Recomendamos congelar alícuotas de las muestras de
• Prepare los reactivos antes de iniciar el procedimiento pacientes a fin de evitar ciclos repetidos de
de ensayo. Los reactivos empleados en los pasos nº 3 congelación y descongelación.
a 9 deben estar fríos (entre 2 y 8 °C) y mantenerse
fríos durante el pipeteo y el lavado. Ponga el substrato
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
de TMB a temperatura ambiente (entre 18 y 28 ˚C).
• Pasos 3 a 9: Utilice reactivos fríos (entre 2 y 8 °C) en 1. Diluya todas las muestras de pacientes a estudiar en
proporción 1:1000 con tampón de incubación. Utilice
todos estos pasos y manténgalos fríos durante el
pipeteo. Recomendación: Prepare el tampón de 2 µL de suero + 2000 µL de tampón de incubación.
lavado la tarde anterior a la realización del ensayo y Mezcle bien mediante vórtex y deje las muestras
déjelo en el frigorífico hasta el día siguiente. diluidas durante una hora a entre 18 y 28 °C. Ponga
tanto las muestras como los controles y calibradores
• Pasos de lavado nº 3, 6 y 9: Los pasos de lavado son reconstituidos durante 10 minutos en hielo antes de
cruciales para retirar los residuos presentes en los proceder al pipeteo en el paso nº 4.
pocillos de la placa de microtitulación como resultado
2. Prepare un soporte de placa con el número de tiras
del proceso de producción (paso nº 3) así como
necesario para ensayar los calibradores, los controles
cualquier anticuerpo no unido (pasos nº 6 y 9).
y las muestras de pacientes. Vuelva a sellar
→ Realice siempre los pasos de lavado con tampón de inmediatamente las tiras restantes dentro de la bolsa
lavado frío (entre 2 y 8 °C). metalizada junto con los paquetes de desecante.
→Cerciórese de vaciar los pocillos totalmente después Consérvelas refrigeradas.
del ultimo ciclo que de lavado.
Nota: Utilice reactivos fríos en los pasos nº 3 a 9.
• Paso 10: Cerciórese de utilizar el substrato de TMB
que fue equilibrado a la temperatura ambiente
(18-28 °C).
3. Lave los pocillos recubiertos cuatro veces utilizando Puesto que no existe ningún suero de control de
como mínimo 300 µL de tampón de lavado ¡frío! por anticuerpos anti-MAG disponible comercialmente,
pocillo. Vacíe los pocillos y golpee firmemente la placa recomendamos utilizar una combinación de suero positivo
sobre papel secante para eliminar completamente el y negativo con fines de control de calidad interno.
líquido restante. Todos los controles deben estar dentro de los intervalos
4a.Pipetee 100 µL de tampón de incubación (como de confianza establecidos (BTU). Los intervalos de
blanco) por duplicado en los pocillos A1+A2. confianza de los controles son específicos del lote y
aparecen impresos en la ficha de datos de CC que se
Pipetee 100 µL de estándar A por duplicado en los
suministra con este kit.
pocillos B1+B2.
Las características del rendimiento deben estar dentro de
Pipetee 100 µL de estándar B por duplicado en los los límites establecidos. Si esas características no son
pocillos C1+C2. conformes con los límites establecidos y la repetición del
Pipetee 100 µL de estándar C por duplicado en los ensayo permite excluir errores de manipulación,
pocillos D1+D2. compruebe las posibles fuentes de problemas siguientes:
Pipetee 100 µL de estándar D por duplicado en los i) ¿se han mantenido a entre 2 y 8 °C todos los reactivos
pocillos E1+E2. utilizados en los pasos nº 3 a 10?, ii) exactitud de las
pipetas, los termómetros y los cronómetros, iii)
4b. Pipetee 100 µL del control bajo por duplicado en los
parámetros del lavador y el lector de ELISA, iv) fecha de
pocillos F1+F2.
caducidad de los reactivos, v) condiciones de
Pipetee 100 µL del control alto por duplicado en los conservación e incubación, vi) color de la solución
pocillos G1+G2. substrato de TMB (debe ser incolora), vii) pureza del
4c.Pipetee 100 µL de cada muestra diluida en los pocillos agua.
subsiguientes.
5. Cubra la placa con un sellador de placa e incube ESTANDARIZACIÓN
durante 2 horas (±5 min) a 2-8 °C. Los calibradores del kit están estandarizados frente a una
6. Retire el sellador de placas. Vacíe los pocillos y lávelos reserva de referencia interna. La reserva de referencia
cuatro veces utilizando como mínimo 300 µL de consiste en más de diez sueros humanos que contienen
tampón de lavado frío (entre 2 y 8 °C) por pocillo. titulaciones bajas, medias y altas de anticuerpos anti-
Vacíe los pocillos y golpee firmemente la placa sobre MAG, respectivamente. Las titulaciones y la especificidad
papel secante para eliminar completamente el tampón de cada suero en la reserva de referencia se analizaron
de lavado. en primer lugar con técnicas de inmunotransferencia anti-
7. Añada 100 µL de marcador enzimético IgM a todos los MAG.
pocillos. Las unidades de titulación BÜHLMANN (BTU) se
8. Cubra la placa con un sellador de placa e incube establecieron como se indica a continuación:
durante 2 horas (±5 min) a 2-8 °C. • Se analizaron las muestras de donantes normales
9. Retire el sellador de placa. Vacíe los pocillos y lávelos según el procedimiento de ensayo ELISA de
cuatro veces utilizando como mínimo 300 µL de Autoanticuerpos anti-MAG.
tampón de lavado en frío (2-8 °C) por pocillo. Vacíe los • Se ensayaron muestras diluidas en serie de la reserva
pocillos y sacuda la placa firmemente en papel de referencia en la misma prueba.
secante.
• La dilución en la que la muestra de la reserva de
Nota: Ajuste la solución substrato de TMB a temperatura referencia no alcanza el corte corresponde a la
ambiente (entre 18 y 28 °C). titulación de la reserva de referencia.
10. Añada 100 µL de la solución substrato de TMB a cada NOTA: Los valores de titulación del suero dependen del
pocillo. método de ensayo y, en particular, de la especificidad y
11. Cubra la placa con un sellador de placas e incúbela en de los valores de corte establecidos con un método de
un agitador de placas orbital a entre 400 y 600 rpm ensayo individual. Por lo tanto, los valores de titulación
durante 30 ± 2 minutos a entre 18 y 28 °C. Proteja la obtenidos con diferentes métodos no pueden compararse
placa de la luz directa. directamente.
12. Añada 100 µL de solución de parada a todos los
pocillos. Proceda con el paso nº 13 antes de pasados RESULTADOS
30 minutos. Curva estándar
13. Lea la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de Registre la absorbancia a 450 nm de cada pocillo para
microtitulación. trazar una curva de calibración a partir de los promedios
de los valores por duplicado de cada calibrador
CONTROL DE CALIDAD substrayendo el promedio de DO del blanco. Se
recomienda utilizar un programa de software para calcular
Para obtener resultados fiables se requiere una
la curva de calibración y determinar la concentración de
comprensión adecuada de estas instrucciones de uso.
las muestras utilizando un ajuste logístico de 4
Solo se obtendrán resultados fiables utilizando técnicas
parámetros (4PL).
de laboratorio precisas (según las directrices de BPL
vigentes) y siguiendo de manera exacta las instrucciones
de uso.

Muestras y controles Precisión Inter-Ensayo (Prueba a Prueba): 15,4 %. La
• Registre la absorbancia a 450 nm de cada pocillo de precisión inter-ensayo se calculó a partir de los resultados
muestra y control. Substraiga el promedio de DO del de 20 pares de valores obtenidos en 20 pruebas
blanco del promedio de los valores por duplicado diferentes (tabla 6).
correspondientes a cada muestra y control. Sensibilidad Analitica (LoB): 444 BTU. Se ensyaron 20
• Localice los valores de absorbancia de las muestras y pruebas de tampón de incubación en un unico curso. El
de los controles en el eje vertical, dibuje una línea promedio y (tambien) la deviación de estándar (SD) se
horizontal que corte la curva estándar y lea en el eje calculéron de los valores de absorbancia. La dosis mínima
horizontal. detectable de anticuerpos anti-MAG se calculó en 444
BTU añadiendo dos desviaciones estándar a la
Si el lector de placas de microtitulación no es capaz de
absorbancia media y obteniendo la intersección de ese
leer una absorbancia mayor de 2 o mayor que la
valor con la curva estándar obtenida en el ensayo.
absorbancia del estándar más alto (estándar A), se
recomienda una segunda lectura a una longitud de onda Sensibilidad Funcionál (LoQ): 900 BTU. 20 duplicados
de 490 ó 492 nm (filtro de referencia a 600 ó 620 nm si de titulaciones bajas de auto-anticuerpos anti-MAG se
está disponible). En este caso, construya una segunda probarón en un unico curso. La media, la deviación de
curva estándar con las lecturas de absorbancia de todos estándar (SD) y el coeficiente de variación (CV) se
los Calibradores a 490 ó 492 nm. Las concentraciones de calcurerón de los valores de absorbancia. La titulacion
las muestras fuera de escala a 450 nm se leen entonces obtenida es 900 BTU con un coeficiente de variación de
con la nueva curva estándar tal como se ha descrito 10 %.
anteriormente. Las lecturas a 490 ó 492 nm no deben Linealidad/Paralelismo de Dilución: 147 %. Se han
reemplazar las lecturas dentro de la escala a 450 nm. diluido siete muestras de suero humanos ricos de anti-
MAG anticuerpos con tampón de incubación de 1:1000 a
Nota: Los resultados que se presentan en la tabla 3 y en
1:64000. Las pruebas diluidas han sido a 18-28 °C y han
la figura 1 son ejemplos. Es preciso utilizar el calibrador y
sido examinados por el procediemento del ensayo
los controles en cada ensayo individual.
(tabla 7). La deviación relativamente alta en 50 % de
Los resultados y la curva de calibración se ofrecen sueros resulta de agregados de anticuerpos. Por lo
únicamente con fines de demostración. Debe generarse general la titulación de los sueros patológicos es elevata.
una curva de calibración para cada conjunto de muestras Por eso la titulación no pergudica la discriminación entre
que se vaya a ensayar. pruebas positivas y negativas.
Especificidad: Se realizaron cuatro tipos de
LIMITACIONES experimentos para evaluar la especificidad del ELISA de
1. Los resultados de la prueba se deben interpretar Autoanticuerpos anti-MAG:
conjuntamente con la información disponible de la 1. Neutralización de auto-anticuerpos anti-MAG: Cinco
evaluación clínica del paciente y otros procedimientos sueros con titulaciones anti-MAG altas podría inhibirse de
diagnósticos. la unión a las placas de microtitulación recubiertas con
2. La prueba anti-MAG Autoantibodies ELISA no ha sido MAG de manera dependiente de la concentración cuando
validada para muestras de plasmaféresis. se preincuban durante una hora con tampón de
incubación con un suplemento de 1 a 200 µg/mL de MAG
antes de probarlos en el ELISA.
INTERVALOS DE REFERENCIA Y PUNTO DE
CORTE 2. Especificidad de la unión de auto-anticuerpos anti-
MAG: Cinco sueros con titulaciones medias a muy altas
Se determinó la frecuencia de auto-anticuerpos anti-MAG de auto-anticuerpos anti-MAG y cinco sueros negativos
en sueros humanos normales utilizando muestras de se probaron en placas recubiertas con GA1, GM1, GM2,
sangre de donantes de sangre voluntarios asintomáticos GD1a, GD1b y GQ1b. Niguna de las muestras mostró un
(hombres y mujeres adultos entre 18 y 70 años de edad). proporción superior a 10 %. Del mismo modo una serie
Se ensayaron 150 muestras según el procedimiento del de sueros de enfermidades neurologicas (titulaciones
ensayo y se obtuvieron los resultados listados en tabla 4. anti-MAG altas) y negativas a auto-anticuerpos
NOTA: Estos rangos de titulación deben utilizarse antigangliosidos se probaron en placas recubiertas con
únicamente como orientativos. Se recomienda que cada anti-MAG. Ningun de los sueros de estas enfermedades
laboratorio establezca sus propios rangos esperados para produjó una señal superior a 300 BTU.
su población de pacientes. 3. Comparación con inmunotransferencia (Western Blot):
Los sueros de 127 pacientes (40 mujeres; 87 hombres;
Titulación de corte propuesta
edad 4-90 años) con enfermedades neurológicas
La media +3DE produce un valor de corte tecnico de 729 causadas presuntamente por auto-anticuerpos anti-MAG
BTU. Por razones prácticas recomendamos el uso de un se probaron con el método ELISA y un método “western
valor de corte de 1000 BTU, que corresponde al estándar blot”, respectivamente. Se utilizó MAG aislado de sistema
más bajo (= estándar D) en la curva estándar. nervioso central (SNC) humano en los dos métodos. Los
doce sueros que mostraban titulaciones medias a muy
CARACTERÍSTICAS DE EFICIENCIA altas de auto-anticuerpos IgM anti-MAG en el
Precisión Intra-Ensayo (Dentro de la Prueba): 6,5 %. procedimiento ELISA también fueron claramente
La precisión intra-ensayo se calculó a partir de los positivos cundo se analizaron por inmunotransferencia.
resultados de 20 pares de valores obtenidos en una única 114 de los 115 sueros que mostraban titulaciones de
prueba (tabla 5). anticuerpos anti-MAG por debajo del valor de corte del
ELISA también fueron negativos cuando se analizaron
con inmunotransferencia, mientras que un suero fue
ligeramente positivo por el método de
inmunotransferencia únicamente (F. Ferracin and A.J.
Steck, resultados no publicados).
4. Comparación con el ensayo indirecto de
inmunofluorescencia (IFA): Los sueros de 150 pacientes
(sexo y edad desconocidos) diagnosticados de
gammapatías monoclonales IgM se probaron
respectivamente con el método ELISA y con un método
IFA. En el método IFA los sueros se incubaron en
secciones del nervio ciático de mono congeladas y fijadas
con acetona y la unión de anticuerpos anti-MAG se
detectó con anticuerpos anti-IgM humana marcados con
FITC. 26 pacientes (17,3 %) fueron positivos y 115
pacientes (76,7 %) fueron negativos en los dos métodos,
mientras que cinco sueros (3,3 %) fueron positivos
solamente con el método IFA y cuatro sueros (2,7 %)
fueron positivos sólo con el método ELISA,
respectivamente (2).

PORTUGUÊS
Reagentes Quantidade Código Reconstituição
USO PRETENDIDO Controles alto e
Adicionar 1 mL
baixo2 B-MAG-
2 frascos de tampão de
O anti-MAG Autoantibodies ELISA é indicado para a Soro humano com CONSET
incubação
determinação quantitativa para diagnóstico in vitro dos conservantes
auto-anticorpos IgM humanos dirigidos contra a Marcador
glicoproteína associada à mielina (MAG) no soro. O teste enzimático IgM
serve como auxiliar na monitorização da neuropatia Pronto para
Anticorpo anti-IgM 1 frasco B-MAG- utilização
desmielinizante paraproteinêmica (NDP), em conjunto humano conjugado à ELM
HRP em um tampão à 11 mL Solução azul
com outros resultados clínicos e laboratoriais (1-7).
base de proteína com
conservantes.
PRINCÍPIO DO ENSAIO Substrato de TMB
1 frasco Pronta para
B-TMB
O anti-MAG Autoantibodies ELISA emprega uma técnica TMB em tampão de
11 mL utilização
quantitativa enzimaticamente amplificada de imunoensaio citrato
do tipo sanduíche. As placas de microtitulação do teste Pronta para
Solução de parada 1 frasco utilização
são pré-revestidas com MAG altamente purificada do B-STS
Ácido sulfúrico 0,25 M 11 mL Agente
cérebro humano (1). O calibrador, os controles e os soros corrosivo
dos pacientes são incubados nos poços de microtitulação
Tabela 1
e os auto-anticorpos anti-MAG presentes nas amostras 1
Depois da reconstituição, os calibradores A, B, C e D contêm 70.000,
ligam-se à MAG humana imobilizada. Depois da lavagem 15.000, 3.000 e 1.000 Unidades de Título BÜHLMANN (BÜHLMANN
para remoção das substâncias não ligadas, os auto- Titer Units, ou BTU) de anticorpos anti-MAG, respectivamente.
anticorpos anti-MAG são detectados com anticorpos
2
Os controles contêm quantidades de anticorpos anti-MAG
específicas ao lote. Consulte a folha de dados de CQ adicional para
marcados com peroxidase de raiz-forte (HRP) contra o obter as concentrações exatas.
IgM humano. Após uma segunda etapa de lavagem, na
qual o marcador enzimático não fixado é removido, uma
ARMAZENAMENTO E VIDA ÚTIL DOS
solução de substrato contendo tetrametilbenzidina (TMB)
REAGENTES
é adicionada. Surge então uma coloração azul
proporcional à quantidade de auto-anticorpos ligados à Reagentes Selados / Não Abertos
MAG humana imobilizada. O desenvolvimento da cor é Todos os componentes de kits selados/não abertos são estáveis na
interrompido adicionando-se uma solução de parada faixa de temperatura de 2-8 °C até a data de validade impressa nos
ácida (ácido sulfúrico diluído), que muda a cor da solução rótulos.
de azul para amarelo. A intensidade da cor é medida em Reagentes Abertos / Reconstituídos
450 nm. Retorne imediatamente as tiras não usadas
A absorbância medida é proporcional ao título dos auto- para a embalagem aluminizada contendo os
Placa de sachês de dessecante e torne a selar ao longo
anticorpos anti-MAG humana presentes em uma
microtitulação de toda a borda do fecho tipo zip. Guarde por
determinada amostra. Um conjunto de calibradores para até 2 meses a uma temperatura na faixa de
auto-anticorpos anti-MAG humana é usado para plotar 2-8 °C.
uma curva de calibração de absorbância vs. unidades de Tampão de Guarde por até 2 meses a uma temperatura na
título dos auto-anticorpos anti-MAG humana. Essa curva lavagem diluído faixa de 2-8 °C.
então pode ser usada para calcular concentrações de Calibradores Guarde por até 2 meses a uma temperatura
auto-anticorpos anti-MAG humana nas amostras. Controles de -20 °C.
Tampão de
REAGENTES FORNECIDOS E PREPARAÇÃO incubação
Guarde a uma temperatura na faixa de 2-8 °C
Reagentes Quantidade Código Reconstituição Marcador
até a data de validade impressa nos rótulos.
enzimático IgM
Placa de
microtitulação Substrato de TMB
12 tiras
x 8poços com B-MAG-MP Pronta para Guarde a uma temperatura na faixa de
96 poços pré- utilização
revestidos com MAG suporte Solução de parada 18-28 °C até a data de validade impressa nos
humana. rótulos.
Tabela 2
Selador da placa 3 unidades
Concentrado do 1 frasco Diluir com
tampão de lavagem B-MAG-WB 900 mL de água MATERIAIS NECESSÁRIOS, PORÉM NÃO
(10x) 100 mL deionizada. FORNECIDOS
Tampão de 1 frasco • Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis:
incubação Pronto para
B-MAG-IB
100 mL utilização pipetas de 20 µL, 100 µL e 1000 µL.
Com conservantes
Calibradores A a D1
• Tubos descartáveis de poliestireno ou polipropileno
Adicionar 1 mL
4 frascos
B-MAG-
de tampão de para a preparação de diluições de amostras.
Soro humano com CASET
conservantes incubação • Cilindro de 1000 mL para a diluição do tampão de
lavagem.
• Pisseta para o tampão de lavagem ou lavador
automático para a placa de microtitulação.

• Papel mata-borrão. • Etapa 10: Deixe que o substrato de TMB atinja a
• Agitador orbital para placas de microtitulação. temperatura ambiente (18-28 °C) antes de usá-lo.
• Leitora de placa de microtitulação para medição da • Etapa 11: Agite as placas de microtitulação durante a
absorbância a 450 nm. incubação com o substrato. Dependendo do agitador
de placas, recomendamos 400-600 rpm. A solução
deve se movimentar nos poços, mas sem transbordar
PRECAUÇÕES
nem derramar.
Precauções de segurança • Se uma lavadora automática for utilizada, o “modo de
• A placa de microtitulação (B-MAG-MP), os placa” deve ser selecionado para que a dispensação
calibradores (B-MAG-CASET) e os controles (B-MAG- seja executada sequencialmente em todas as tiras
CONSET) deste kit contêm componentes de origem antes da aspiração.
humana. Embora testados negativos para o antígeno
• Os componentes não devem ser usados depois da
de superfície do HBV, anticorpos HCV e HIV1/2, os
data de validade impressa nos rótulos.
reagentes devem ser manuseados como se fossem
capazes de transmitir infecções, sempre de acordo • Não misture lotes diferentes de reagentes.
com boas práticas laboratoriais e usando-se as • Todas as providências devem ser tomadas para
precauções apropriadas. assegurar que não ocorra contaminação cruzada entre
• Solução de parada: A solução de parada (B-STS) os reagentes, amostras ou entre poços.
contém ácido sulfúrico (0,25 M). Esse composto é um • Os micropoços não podem ser reutilizados.
irritante dos olhos, pele e membranas mucosas. Evite
o contato com os olhos, a pele ou a roupa. Após o COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
contato com os olhos ou a pele, lave imediatamente
com água em abundância. • O procedimento requer <0,1 mL de sangue ou <50 µL
de soro.
• Reagentes: Evite o contato dos reagentes com a pele,
os olhos ou as membranas mucosas. Em caso de • Amostras lipêmicas, hemolíticas ou ictéricas não
contato, lave imediatamente com quantidades devem ser usadas neste ensaio. As amostras
abundantes de água, caso contrário, lipêmicas podem ser evitadas pedindo-se aos
irritação/queimaduras poderão ocorrer. pacientes que jejuem por pelo menos 12 horas antes
da coleta da amostra.
• A solução não usada deve ser descartada de acordo
com as regulamentações locais, estaduais ou federais. • Colete o sangue em tubos comuns (sem
anticoagulante), evite a hemólise, deixe em repouso
Precauções técnicas para coagular por uma hora à temperatura ambiente
• Leia atenciosamente as instruções antes de executar (18-28 °C), centrifugue por 10-30 minutos a
o teste. O desempenho dos testes será afetado 1.000-2.000 g e colete o soro.
negativamente se os reagentes forem diluídos • Armazene as amostras de soro a ≤-20 °C. As amostras
incorretamente, modificados ou armazenados em permanecem estáveis por mais de 1 ano se mantidas
condições diferentes daquelas detalhadas nesta a ≤-20 °C. Evite ciclos repetidos de congelamento-
instrução de uso. descongelamento. As amostras congeladas devem
• Os resíduos nos poços da placa de microtitulação ser descongeladas e bem misturadas por meio de
resultam do processo de produção. Eles são inversão ou movimentos circulares suaves antes da
removidos na etapa de lavagem (etapa 3 do utilização.
procedimento do ensaio) e não afetam os resultados. • Recomendamos congelar alíquotas de amostras de
• Prepare os reagentes antes de iniciar o procedimento pacientes para evitar descongelar/congelar o material
de teste. Os reagentes utilizados nas etapas 3-9 repetidas vezes.
devem estar frios (2-8 ˚C) e devem ser mantidos frios
durante a pipetagem e lavagem. Deixe que o substrato PROCEDIMENTO DO ENSAIO
de TMB atinja a temperatura ambiente (18-28 ˚C).
1. Dilua todas as amostras de pacientes a serem
• Etapas 3-9: Utilize reagentes frios (2-8 °C) em todas
investigadas na proporção de 1:1000 com o tampão de
estas etapas e mantenha-os frios durante a
incubação. Use 2 µL de soro + 2000 µL de tampão de
pipetagem. Recomendação: Prepare o tampão de
incubação. Misture bem em um agitador vórtex e deixe
lavagem no fim do dia anterior à execução do ensaio e
as amostras diluídas em repouso por uma hora a
deixe-o no refrigerador a noite toda.
18-28 °C. Coloque as amostras , bem como os
• Etapas de lavagem 3, 6 e 9: As etapas de lavagem são calibradores e os controles reconstituídos, por 10
fundamentais para a remoção de resíduos dos poços minutos no gelo antes de pipetar na etapa 4.
da placa de microtitulação gerados pelo processo de
2. Prepare uma placa com a quantidade necessária de
produção (etapa 3), assim como todos os anticorpos
tiras para testar os calibradores, controles e as
não ligados (etapas 6 e 9).
amostras dos pacientes. Sele as tiras remanescentes
→ As etapas de lavagem devem ser sempre realizadas imediatamente na embalagem aluminizada,
com o tampão de lavagem frio (2-8 ˚C). juntamente com os sachês de dessecante. Mantenha
→Certifique-se de que todos os poços estejam sob refrigeração.
completamente vazios depois do último ciclo de Nota: use reagentes frios nas etapas 3 a 9.
lavagem.
3. Lave os poços revestidos quatro vezes, usando pelo Todos os controles devem estar dentro dos intervalos de
menos 300 µL de tampão de lavagem frio! por poço. confiança estabelecidos (BTU). Os intervalos de
Esvazie os poços e bata a placa com firmeza sobre confiança dos controles são específicos a cada lote e
papel mata-borrão para remover completamente todo estão impressos na folha de dados de CQ fornecida com
o líquido remanescente. este kit.
4a. Pipete 100 µL do tampão de incubação (branco) em As características de desempenho devem permanecer
duplicata nos poços A1+A2. dentro dos limites estabelecidos. Se essas características
não atenderem aos limites estabelecidos e a repetição
Pipete 100 µL do calibrador A em duplicata nos poços
excluir falhas de manuseio, verifique os seguintes
B1+B2.
problemas: i) se todos os reagentes usados nas etapas
Pipete 100 µL do calibrador B em duplicata nos poços 3-10 foram mantidos a 2-8 °C, ii) a exatidão das pipetas,
C1+C2. termômetros e temporizadores, iii) a configuração da
Pipete 100 µL do calibrador C em duplicata nos poços lavadora e da leitora do ELISA, iv) a data de validade dos
D1+D2. reagentes, v) as condições de armazenamento e
Pipete 100 µL do calibrador D em duplicata nos poços incubação, vi) a cor da solução do substrato de TMB
E1+E2. (deve ser incolor), e vii) a pureza da água.
4b. Pipete 100 µL do controle baixo em duplicata nos
poços F1+F2. PADRONIZAÇÃO
Pipete 100 µL do controle alto em duplicata nos poços Os calibradores incluídos neste kit foram padronizados
G1+G2. com base em um pool de referências internas. Esse pool
4c. Pipete 100 µL de cada amostra diluída em duplicata de referências consiste em mais de dez amostras de soro
nos poços subsequentes. humano contendo títulos baixos, médios e altos de
anticorpos anti-MAG.
5. Cubra a placa com um selador e incube por Os títulos e a especificidade de cada soro em relação ao
2 horas (±5 minutos) a 2-8 °C. pool foram inicialmente analisados por imunoblots anti-
6. Remova o selador da placa. Esvazie os poços e lave MAG.
quatro vezes usando pelo menos 300 µL de tampão de As Unidades de Título BÜHLMANN (BTU) foram
lavagem frio (2-8 °C) por poço. Esvazie os poços e estabelecidas como se segue:
bata a placa com firmeza sobre papel mata-borrão
• Amostras de doadores normais foram testadas de
para remover o tampão de lavagem completamente.
acordo com o procedimento de ensaio do anti-MAG
7. Adicione 100 µL do marcador enzimático IgM a todos Autoantibodies ELISA.
os poços.
• Amostras do pool de referência diluídas serialmente
8. Cubra a placa com um selador e incube por foram testadas na mesma corrida.
2 horas (±5 minutos) a 2-8 °C.
• A diluição em que a amostra do pool de referência não
9. Remova o selador da placa. Esvazie os poços e lave alcançou o valor de corte corresponde ao título do pool
quatro vezes usando pelo menos 300 µL de tampão de de referência.
lavagem frio (2-8 °C) por poço. Esvazie os poços e
bata a placa com firmeza sobre papel mata-borrão. Nota: Os valores de título de soro dependem do método
de ensaio e, em particular, da especificidade e dos valores
Nota: Deixe que o substrato de TMB atinja a temperatura de corte estabelecidos com um método de teste
ambiente (18-28 °C). individual. Assim, valores de título obtidos com diferentes
10. Adicione 100 µL da solução do substrato de TMB a métodos não podem ser comparados diretamente.
cada poço.
11. Cubra a placa com um selador e a incube em um RESULTADOS E CÁLCULO
agitador orbital a 400-600 rpm por 30 ± 2 minutos a Curva de calibração
18-28 °C. Proteja a placa contra a luz direta. Registre a absorbância a 450 nm para cada poço para
12. Adicione 100 µL da solução de parada em todos os gerar uma curva de calibração a partir da média das
poços. Execute a etapa 13 dentro de até 30 minutos. duplicatas dos calibradores, subtraindo a densidade
13. Leia a absorbância a 450 nm em uma leitora de placa óptica (OD) média dos brancos de cada calibrador.
de microtitulação. Recomenda-se usar um programa de software para
calcular a curva de calibração e determinar a
concentração das amostras, usando ajuste por regressão
CONTROLE DE QUALIDADE
logística de 4 parâmetros (4 PL).
Uma boa compreensão destas instruções de uso é
Amostras e controles
necessária para se obter resultados confiáveis. Esses
resultados serão obtidos somente com o emprego de • Registre a absorbância a 450 nm para cada amostra e
técnicas laboratoriais precisas (diretrizes atuais de Boas poço de controle. Subtraia a OD média dos brancos da
Práticas de Laboratório-BPL) e do cumprimento exato das média dos valores das duplicatas de cada amostra e
instruções de uso. controle.
Uma vez que não existe soro de controle para anticorpos • Localize os valores de absorbância das amostras e
anti-MAG comercialmente disponíveis, recomendamos o controles no eixo vertical, trace uma linha horizontal
uso de um pool de soros positivos e negativos para até a intersecção com a curva de calibração e leia o
controle de qualidade interno. valor resultante no eixo horizontal.
Se a leitora da placa de microtitulação não conseguir ler seguida da intersecção desse valor na curva padrão
uma absorbância maior que 2 ou maior que a absorbância obtida para esta corrida.
do maior calibrador (calibrador A), recomenda-se uma Limite de quantificação (LoQ): 900 BTU. 20 duplicatas
segunda leitura em um comprimento de onda de 490 ou de auto-anticorpos anti-MAG de título baixo foram
492 nm (filtro de referência a 600 ou 620 nm, se analisadas em uma única corrida. A média, o desvio
disponível). Neste caso, desenvolva uma segunda curva padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV) foram
de calibração com as leituras de absorbância de todos os calculados para os valores de absorbância. Um título de
calibradores a 490 ou 492 nm. A concentração das 900 BTU foi encontrado, com um CV menor do que 10 %.
amostras fora da escala a 450 nm é então lida conforme
Linearidade/ paralelismo da diluição: 147 % 7
descrito acima na nova curva de calibração. As leituras a
amostras de soro humano contendo títulos altos de
490 ou 492 nm não devem substituir as leituras em escala
anticorpos anti-MAG foram diluídas com tampão de
a 450 nm.
incubação entre 1:1000 e 1:64.000, deixadas em repouso
Nota: Os resultados apresentados na tabela 3 e na por uma hora a 18-28 °C e então submetidas ao ensaio
figura 1 são exemplos. O calibrador e os controles devem de acordo com o procedimento de teste (tabela 7).
ser utilizados em cada ensaio individual. Sugere-se que o desvio relativamente alto em cerca de
50 % das amostras se deva a agregações de anticorpos.
Os resultados e a curva de calibração são fornecidos
De modo geral, soros patológicos mostram títulos
somente para fins de demonstração. Uma curva de
bastante elevados de auto-anticorpos e, portanto, não
calibração deve ser gerada para cada conjunto de
têm influência na discriminação positivo/negativo.
amostras a ser analisado.
Especificidade: Quatro conjuntos de experimentos foram
LIMITAÇÕES realizados para avaliar a especificidade do anti-MAG
Autoantibodies ELISA:
1. Os resultados dos testes devem ser interpretados em 1. Neutralização de auto-anticorpos anti-MAG: Cinco
conjunto com as informações disponíveis da avaliação amostras de soro com títulos elevados de anti-MAG
clínica do paciente e de outros procedimentos de foram inibidos para não se ligarem às placas de
diagnóstico. microtitulação revestidas com MAG de maneira
2. O anti-MAG Autoantibodies ELISA ainda não foi dependente da concentração, quando pré-incubados por
validado para amostras de plasmaférese. 1 hora com um tampão de incubação suplementado por
1 a 200 µg/mL de MAG antes do teste no ELISA.
INTERVALOS DE REFERÊNCIA E VALORES DE 2. Especificidade da ligação dos auto-anticorpos anti-
CORTE MAG: Cinco amostras de soro com títulos médios a altos
A frequência dos auto-anticorpos anti-MAG no soro de auto-anticorpos anti-MAG e cinco amostras negativas
humano normal foi determinada usando-se amostras de de soro foram testadas na placa GanglioCombi (EK-
sangue de doadores assintomáticos voluntários GCO) revestida com GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b e
(mulheres e homens adultos com idade entre 18 e 70 GQ1b. Nenhuma das amostras apresentou uma razão
anos). 150 amostras foram analisadas de acordo com o percentual superior a 10 %. Similarmente, seis amostras
procedimento do ensaio e os resultados listados na de soro com títulos altos de auto-anticorpos
tabela 4 foram obtidos. antigangliosídeos (ver acima) e cinco amostras de soro
negativas foram testadas em placas cobertas com MAG.
Nota: Estas faixas de título devem ser usadas apenas Nenhum destes soros de estado de doença sinalizou um
como diretrizes. Recomenda-se que cada laboratório valor superior a 300 BTU.
estabeleça suas próprias faixas esperadas para suas
3. Comparação com imunoblots (Western Blot): 127
populações de pacientes.
soros de pacientes (40 mulheres e 87 homens com idade
Título de corte proposto entre 4 e 90 anos) com doenças neurológicas
A média +3 DP resulta em um valor técnico de corte de suspeitamente causadas por auto-anticorpos anti-MAG
729 BTU. Por motivos práticos, recomendamos o uso de foram testados com o ELISA e com um método Western
um valor de corte de 1000 BTU, correspondente ao Blot. MAG isolada do sistema nervoso central (SNC)
calibrador mais baixo (calibrador D) da curva padrão. humano foi usada em ambos os métodos. Todas as doze
amostras de soro com títulos com variação de médio a
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO muito alto dos auto-anticorpos anti-MAG IgM no
procedimento do ELISA também se mostraram
Precisão intraensaio: 6,5 %. A precisão intraensaio foi claramente positivas quando analisadas com imunoblots.
calculada a partir dos resultados de 20 pares de valores Das 115 amostras de soro com títulos de anticorpos anti-
obtidos em uma única corrida (tabela 5). MAG IgM abaixo do valor de corte do ELISA, 114 também
Precisão interensaios: 15,4 % A precisão interensaios se mostraram negativas quando analisadas com
foi calculada a partir dos resultados de 20 pares de imunoblots, enquanto uma amostra de soro resultou
valores obtidos em 20 corridas diferentes (tabela 6). ligeiramente positiva com o método do imunoblot, apenas
Limite do branco (LoB): 444 BTU. 20 duplicatas do (F. Ferracin e A. J. Steck, resultados não publicados).
tampão de incubação foram analisadas em uma única
corrida. A média e o desvio padrão foram calculados para
os valores de absorbância. A dose mínima detectável de
anticorpos anti-MAG foi calculada como 444 BTU através
da adição de dois desvios padrão à absorbância média,
4. Comparação com ensaio de imunofluorescência
indireta (IFD): Amostras de soro de 150 pacientes (sexo
e idade desconhecidos) diagnosticados com gamopatias
monoclonais do tipo IgM foram testadas pelo ELISA e por
um método IFD. No método IFD, o soro foi incubado em
seções de nervo ciático de macaco fixado em acetona e
congelado, e os anticorpos anti-MAG ligados foram
detectados pelo anticorpo anti-IgM humano marcado com
isotiocianato de fluoresceína (FITC). 26 pacientes
(17,3 %) resultaram positivos e 115 pacientes (76,7 %)
resultaram negativos em ambos os métodos, enquanto
cinco amostras de soro (3,3 %) resultaram positivas no
método IFD, apenas, e quatro (2,7 %) se mostraram
positivas apenas no método ELISA (2).

APPENDIX I
TABLES AND FIGURES / TABELLEN UND ABBILDUNGEN / TABLES ET FIGURES / TABELLE E FIGURE /
TABLAS Y FIGURAS / TABELAS E FIGURAS
Examples of results Cut-off values and Standardization

Calc. CV
Conc. Absorbance Total (n) 150
Conc. Conc.
[BTU] [OD] Range (BTU) 0 -832
[BTU] [%] Mean Value (BTU) 173
Blank 1 0.046 SD (BTU) 186
Mean + 3 SD (BTU) 729
Blank 2 0.049
Table 4
Average 0.048
Calibrator A 70000 2.195 70497
Calibrator A 70000 2.188 69508 Intra-Assay Precision (Within-Run)
Average 70000 2.191 70000 0.2 Mean SD CV
Sample Type
Calibrator B 15000 1.272 15313 [BTU] [BTU] [%]
Calibrator B 15000 1.245 14693 Serum 1 (Low) 3764 176 4.7
Average 15000 1.258 15000 1.5 Serum 2 (High) 35384 2920 8.3
Calibrator C 3000 0.417 3070 Mean 6.5
Calibrator C 3000 0.400 2931 Table 5
Average 3000 0.408 3000 2.9
Calibrator D 1000 0.135 1009
Inter-Assay Precision (Run-to-Run)
Calibrator D 1000 0.132 991
Mean SD CV
Average 1000 0.134 1000 1.5 Sample Type
[BTU] [BTU] [%]
Control LOW 0.360 2602 Serum 3 (Low) 4208 714 17.0
Serum 4 (High) 17112 2362 13.8
Control LOW 0.376 2731 Mean 15.4
Average 0.368 2666 3.1 Table 6
Control HIGH 1.395 18433
Control HIGH 1.383 18090
Dilution Linearity
Average 1.389 18261 0.6
Serum Range
Sample 1 0.001 255 Mean Observed/Expected
Samples Min-Max
Sample 1 0.009 297
5 78-96 % 86 %
Average 0.005 276 116.5
6 99-119 % 107 %
Sample 2 1.092 11599
7 105-151 % 123 %
Sample 2 0.969 9511
8 162-229 % 206 %
Average 1.030 10555 8.5
9 135-231 % 196 %
Table 3
10 112-292 % 233 %
11 59-98 % 76 %
Example of Standard Curve (OD450) Mean 147 %
Table 7
Concentration (BTU)
Figure 1

APPENDIX II
REFERENCES / LITERATURREFERENZEN / RÉFÉRENCES / RIFERIMENTI / REFERENCIAS/ REFERÊNCIAS
1. Willison, H.J. et al.: Use of antibody testing in 5. Hadden R.D.M et al., Paraproteinemic
nervous system disorders. European Handbook of demyelinating neuropathies; European Handbook of
Neurological Management, Vol 1, 2nd edition, edited Neurological Management: Volume 1, 2nd Edition, ©
by Glilhus N.E. et al., (2011). 2011 Blackwell Publishing Ltd. ISBN: 978-1-405-
2. Bourque, R. P. et al.: Autoimmune peripheral 18533-2
neuropathies. Clin Chim Acta 449, 37-42 (2015). 6. Pruppers M.H.J. et al., Improving future assessment
3. Nobile-Orazio E Update on neuropathies associated and Research in IgM anti-MAG peripheral
with monoclonal gammopathy of undetermined neuropathy: a consensus collaborative effort;
Neuromuscular Disorders 27, 1065-1072, (2017)
significance . JPNS 15, 302-306 (2010) .
7. Dalakas M C.; Advances in the diagnosis
4. Kuijf M et al.; Detection of anti-MAG antibodies in
immunopathogenesis and therapies of IgM- anti-
polyneuropathy associated with IgM monoclonal
MAG antibody-mediated neuropathies; Ther Adv
gammopathy. Neurology 73(9), 688-95 (2009). Neurol Disord 11, 1-12 (2018)

APPENDIX III
SHORT PROTOCOL
anti-MAG Autoantibodies ELISA
Precoated Microtiter Plate
wash 4 x
100 µL Standards, Controls or

Serum Samples (1:1000)
incubate 2 hours (± 5 min) at 2-8 °C
wash 4 x
add 100 µL Enzyme Label
incubate 2 hours (± 5 min)at 2-8 °C
wash 4 x
add 100 µL TMB Substrate
incubate 30 minutes (±2 min) at 18-28 °C

on a plate rotator
add 100 µL Stop Solution

Read absorbance at 450 nm (within 30 minutes)
TIME TO RESULT: 4.5 HOURS

APPENDIX IV
NOTES / NOTIZEN / NOTES / NOTE / NOTAS

APPENDIX V
SYMBOLS / SYMBOLE / SYMBOLES /SIMBOLI / SIMBOLOS
Symbol Explanation Symbol Explanation

Use By Microtiter Plate
Verwendbar bis Mikrotiterplatte
Utiliser jusqu’au Microplaque
Utilizzare entro
MP Micropiastra
Fecha de caducidad Microplaca
Data de expiração Placa de microtitulação
Catalogue Number Wash Buffer Concentrate (10x)
Bestellnummer Waschpuffer Konzentrat (10x)
Référence du catalogue Tampon de lavage concentré (10x)
Numero di catalogo
BUF WASH 10X Tampone di lavaggio concentrato (10x)
Número de catálogo Tampón de lavado concentrado (10x)
Número de catálogo Concentrado do tampão de lavagem (10x)
Batch Code Calibrator A - D
Chargenbezeichnung Kalibrator A - D
Code du lot
CAL A - CAL D Calibrateur A - D
Codice del lotto Calibratore A - D
Codigo de lote Calibrador A - D
Código lote Calibrador A - D
In Vitro Diagnostic Medical Device Low Control
In Vitro Diagnostikum Kontrolle tief
Dispositif médical de diagnostic in vitro Contrôle bas
IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro
CONTROL L
Controllo basso
Producto sanitario para diagnóstico in vitro Control bajo
Producto sánitario para diagnóstico in vitro Controle baixo
Contains Sufficient for <n> Tests High Control
Ausreichend für ”n” Ansätze Kontrolle hoch
Contenu suffisant pour „n“ tests Contrôle elevé
CONTROL H
Contenuto sufficiente per „n“ saggi Controllo alto
Contenudo sufficiente para <n> ensayos Control alto
Conteúdo suficiente para <n> tests Controle alto
Consult Instructions for Use- Enzyme Label IgM
Gebrauchsanweisung beachten Enzymmarker IgM
Consulter le mode d’emploi Marqueur enzymatique IgM
Consultare le istruzioni per l‘uso
EL IgM Marcatore enzimatico IgM
Consulte las instrucciones de uso Marcador enzimático de IgM
Leia cuidadosamente as instruções Marcador enzimático IgM
Temperature Limitation TMB Substrate
Zulässiger Temperaturbereich TMB Substrat
Limites de température Substrat TMB
Limiti di temperatura
SUBS TMB Substrato di TMB
Limite de temperatura Substrato TMB
Límite de temperatura Substrato TMB
Incubation Buffer Stop Solution
Inkubationspuffer Stopp-Lösung
BUF INC
Tampon d’incubation SOLN STOP Solution stop
Tampone di incubazione Soluzione stoppante
Tampón de incubación Solución de parada
Solução de parada
Tampão de incubação

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anti-MAG Autoantibodies

MAG = Myelin Associated Glycoprotein

Release Date: 2018-10-26

BÜHLMANN LABORATORIES AG English page 2

Release date: 2018-10-26 2/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 4/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 5/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 6/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 7/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Réactifs Quantité Code Reconstitution

Release date: 2018-10-26 10/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Remarque: Ajuster la solution de substrat TMB à RESULTATS

Release date: 2018-10-26 13/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 14/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 15/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

10. Aggiungere 100 µL di soluzione di substrato TMB ad Curva standard

Release date: 2018-10-26 17/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 18/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 20/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 22/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 23/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Release date: 2018-10-26 27/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

Examples of results Cut-off values and Standardization

Release date: 2018-10-26 28/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

REFERENCES / LITERATURREFERENZEN / RÉFÉRENCES / RIFERIMENTI / REFERENCIAS/ REFERÊNCIAS

Release date: 2018-10-26 29/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

anti-MAG Autoantibodies ELISA

Precoated Microtiter Plate

100 µL Standards, Controls or

incubate 2 hours (± 5 min) at 2-8 °C

add 100 µL Enzyme Label

incubate 2 hours (± 5 min)at 2-8 °C

add 100 µL TMB Substrate

incubate 30 minutes (±2 min) at 18-28 °C

add 100 µL Stop Solution

TIME TO RESULT: 4.5 HOURS

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NOTES / NOTIZEN / NOTES / NOTE / NOTAS

Release date: 2018-10-26 31/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

SYMBOLS / SYMBOLE / SYMBOLES /SIMBOLI / SIMBOLOS

Symbol Explanation Symbol Explanation

Release date: 2018-10-26 32/32 anti-MAGAutoantibodies ELISA

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