RMQS-Bio Bretagne Rapport final: microbiologie

RMQS BioDiv Bretagne Tome 3 - Microbiologie Tome 4 - Nématofaune du sol Tome 5 - Nématodes phytoparasites Claire RUAULT Coordinateur scientifique : Daniel CLUZEAU Bellido A., Boulonne L., Cannavacciuolo M., Chaussod R., Cortet J., Fargette M., Giteau J-L., Guernion M., Jolivet C., Lavelle P., Foucaud-Lemercier B., Martin F., Mateille T., Mercier V., Péres G., Pernin C., Plantard O., Ponge J.F., Ranjard L., Rougé L., Ruiz N., Tico S., Velasquez H., Villenave C., Walter C. Vol 3 / 2009 RMQS BioDiv Bretagne Tome 3 : Microbiologie Février 2006 – Février 2009 Coordinateur scientifique : Daniel CLUZEAU 3 Bellido 3 A., Boulonne 1 L., Cannavacciuolo 11 M., Chaussod 9 R., Cort et 5 J., Farget t e 7 M., Git eau 12 J- L., Guernion 3 M., Jolivet 1 C., Lavelle 4 P., Foucaud- Lem ercier 2 B., Mart in 9 F., Mat eille 7 T., Mercier 3 V., Péres3 G., Pernin 5 C., Plant ard 8 O., Ponge 6 J.F., Ranj ard 9 L., Rougé 3 L., Ruiz4 N., Tico 12 S., Velasquez4 H., Villenave 10 C., Walt er 2 C. 1 INRA Orléans InfoSol Agrocampus Rennes, UMR INRA SAS 3 Université de Rennes1, UMR CNRS EcoBio 4 Univ. Paris 12 - Bondy, UMR IRD BioSol 5 ENSAIA-INPL Nancy, UMR INRA Sols et Environnement 6 UMR CNRS Brunoy 7 IRD Montpellier, UMR CBGP 8 Agrocampus - INRA Rennes, UMR INRA Bio3P 9 INRA Dijon, UMR INRA MGS 10 IRD Montpellier, UMR Eco&Sols 11 ESA Angers 12 Chambre d’Agriculture de Bretagne 2 TOME 3 : MICROBIOLOGIE Biomasse microbienne et communautés microbiennes telluriques Contributeurs au rapport & analyses de laboratoire Rémi Chaussod, Fabrice Martin-Laurent, Jérémie Beguet, Samuel Dequiedt RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 2 Table des matières INTRODUCTION............................................................................................ 1 MATERIELS & METHODES.......................................................................... 5 Méthodes de prélèvement et paramètres étudiés .......................................................5 Nombre d’échantillons traités.......................................................................................6 Démarche d’exploitation des données ........................................................................6 1. Exploration des données......................................................................... 9 1.1 Caractérisation globale : biomasse microbienne et abondance relative de gènes bactériens ..............................................................................................................9 1.1.1. Biomasse microbienne (MOV) .................................................................................................................... 9 1.1.2. Biomasse microbienne par rapport au carbone total (MOV%Ct)........................................................... 11 1.1.3. Abondance relative de gènes bactériens (ADNr 16 S)............................................................................ 12 1.2 Caractérisation fonctionnelle : abondance relative des communautés fonctionnelles narG et pcaH ..........................................................................................14 1.2.1. Abondance relative de la communauté dénitrifiante (narG) .................................................................. 14 1.2.2. Ratio narG/16S ........................................................................................................................................... 16 1.2.3. pcaH ............................................................................................................................................................ 17 1.2.4. Ratio pcaH/16S ........................................................................................................................................... 18 1.3 Caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes ....19 1.4 Lien entre les paramètres microbiologiques.......................................................21 2. Approche spatiale .................................................................................. 23 2.1 Structuration spatiale des paramètres microbiologiques ..................................23 2.2 Structuration spatiale des communautés bactériennes fonctionnelles ...........27 3. Données microbiologiques et variables explicatives ......................... 31 3.1 Paramètres globaux et fonctionnels en lien avec les variables explicatives ...31 3.1.1 Paramètres microbiologiques et paramètres physico-chimiques .......................................................... 31 3.1.2 Paramètres microbiologiques et occupation des sols ............................................................................ 34 3.1.3 Paramètres microbiologiques et pratiques agricoles.............................................................................. 38 3.1.4 Paramètres microbiologiques et caractéristiques pédologiques ........................................................... 42 3.1.5 Paramètres microbiologiques et année de prélèvement ......................................................................... 46 3.1.6 Paramètres microbiologiques et humidité des sols ................................................................................ 47 3.2 Structure génétique des communautés bactérienne en lien avec les variables explicatives.....................................................................................................49 3.2.1 Données B-ARISA et paramètres physico-chimiques ............................................................................. 49 3.2.2 Données B-ARISA et année de prélèvement ............................................................................................ 49 3.2.3 Données B-ARISA et « système d’occupation des sols » ....................................................................... 50 3.2.4 Données B-ARISA et pratiques agricoles ................................................................................................. 51 SYNTHESE .................................................................................................. 53 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 3 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 4 INTRODUCTION Dans le cadre de ses missions, l'ADEME est membre fondateur du Groupement d’Intérêt Scientifique Sol (GIS Sol1) dont les objectifs sont de constituer et de gérer un système d'information sur les sols de France, par rapport à leur distribution spatiale, leurs propriétés et l'évolution de leurs qualités. Parmi les différents programmes menés par le GIS Sol, l'ADEME participe notamment au RMQS (Réseau de Mesure de la Qualité des Sols) dont le principal objectif est de mesurer périodiquement différentes variables afin d’être en mesure d’évaluer la qualité des sols et d’estimer son évolution (Jolivet, 2006). Actuellement, les mesures réalisées sont exclusivement physiques (ex : densité apparente) ou chimiques (ex : teneur en éléments traces). Ainsi, contrairement à d’autres réseaux européens de surveillance des sols, aucune mesure biologique n’est actuellement réalisée. Dès lors, le programme RMQS BioDiv a été accueilli très favorablement par le Haut Comité de Groupement du GIS Sol lors de sa présentation en juin 2005, d’une part car il constitue une expérience unique en France de mesure spatialisée de la diversité biologique des sols, et d’autre part car ses conclusions permettront d’orienter le choix des paramètres biologiques à mesurer ultérieurement sur le réseau. Ce programme complète également deux actions menées par l’ADEME à savoir : - le programme national ADEME "Bioindicateurs de qualité des sols" qui a besoin d’acquérir des données sur différentes composantes biologiques du sol, dans différents contextes, afin de constituer des référentiels d’interprétation des données acquises par différents bioindicateurs (ADEME, 2004) - le programme européen ENVASSO2 (ENVironmental ASsessment of Soil for mOnitoring) pour lequel l’ADEME est notamment chargée d’animer et de coordonner les actions concernant la mesure de la biodiversité des sols et son interprétation. 1 2 http://www.gissol.fr/index.php http://www.envasso.com/biodiversity.htm RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 1 Introduction Le RMQS BioDiv vise à établir un premier référentiel de la composante biologique des sols et de son activité grâce à une caractérisation de l’ensemble de la biodiversité des sols ; ses différents objectifs sont : ¾ évaluer des paramètres définissant l’état de la biodiversité structurelle et fonctionnelle ¾ étudier les relations possibles entre les paramètres définissant la qualité d’un sol et sa composante biologique ¾ pallier au manque d’outils de mesure des caractéristiques biologiques des sols Ce programme est mené par l’UMR ECOBIO (Université de Rennes 1 / CNRS) et financé, en partie, par l’ADEME. Différents partenaires de toute la France (Rennes, Paris, Dijon, Montpellier, Nancy) se sont associés pour permettre cet inventaire de la biodiversité des sols bretons. Les groupes biologiques étudiés dans le cadre de ce programme sont : la macrofaune totale, les lombriciens, la mésofaune, les nématodes et la microbiologie. Ainsi, plusieurs échelles de taille d’organismes sont explorées (Figure 1). 2 1 3 ƒ Macrofaune 5 2 - Macro invertébrés (IRD Bondy UMR 137 BioSol, N. Ruiz) 1 - Lombriciens (UMR CNRS Rennes EcoBio, D. Cluzeau) 4 Zone d’étude ƒ Mesofaune 3 Equipes partenaires - Collemboles & Acariens (ENSAIA-INPL/INRA Nancy, J. Cortet ƒ Microfaune et UMR CNRS 7179 Brunoy, JF. Ponge) 4 - Nématofaune totale (IRD Montpellier, UMR Seq-Bio, C. Villenave) 4 - Nématodes phytoparasites (IRD Montpellier, UMR CBGP, T. Mateille) ƒ Microflore 5 - Biomasse microbienne (UMR INRA Dijon, R. Chaussod) 5 - Structure génétique des communautées microbienne (UMR INRA Dijon, F. Martin) Mesures complémentaires 2 - Indice d’Humus (UMR CNRS 7179 Brunoy, JF. Ponge) Figure 1 : Groupes biologiques étudiés et équipes partenaires associées du programme RMQS BioDiv RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 2 Introduction Ce tome présente les résultats de microbiologie. Il est constitué de trois parties. La première partie est consacrée à l’exploration de paramètres globaux et fonctionnels. Pour chacun des indicateurs biologiques utilisés, la distribution des valeurs est tout d’abord analysée. En cas de besoin, les données sont transformées pour remplir les conditions de normalité exigées par les analyses statistiques ultérieures. Enfin, les statistiques élémentaires sont présentées. La deuxième partie illustre les résultats de l’approche spatiale à l’échelle régionale afin de mettre en évidence, le cas échéant, une structuration spatiale des données. Dans la troisième partie, ces données microbiologiques sont mises en relation avec diverses variables explicatives, afin de rechercher d’éventuelles corrélations entre les valeurs mesurées et d’autres facteurs (caractéristiques physico-chimiques des sols, système de culture, pratiques culturales…). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 3 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 4 MATERIELS & METHODES Méthodes de prélèvement et paramètres étudiés Divers paramètres microbiologiques sont étudiés dans le cadre du programme RMQS BioDiv. Tout d’abord, la biomasse microbienne (MOV et MOV%Ct) est déterminée par la méthode de fumigation-extraction (Chaussod et al., 1988). Il s’agit d’une méthode aujourd’hui validée par la communauté scientifique et qui a donné lieu à une norme internationale (ISO 14-240.2). Les communautés bactériennes telluriques sont également étudiées à l’aide de techniques basées sur l’extraction directe de l’ADN du sol selon la procédure décrite par Martin-Laurent et al. 2001 et en cours de normalisation auprès de l’ISO (texte ISO/CD 11063). Plusieurs analyses ont été conduites : (i) L’abondance relative de la communuauté globale bactérienne est déterminée par qPCR ciblant l’ADNr 16S de l’opéron ribosomique bactérien (ADNr 16S) à partir des extraits de l’ADN de sol (ii) L’abondance relative des communautés bactériennes fonctionnelles impliquées dans la dénitrification (narG) et des communautés impliquées dans la dégradation du protocatechuate un intermédiaire clef de la voie des β-cetoadipates responsable de la biodégradation des composés phénoliques (pcaH), sont quantifiées. (iii) La structure génétique de la communauté bactérienne globale est analysée par B-ARISA (Bacterial-Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis, Ranjard et al., 2003). On dispose ainsi de paramètres globaux purement quantitatifs (biomasse microbienne) et, pour les populations bactériennes, d’une part de paramètres qualitatifs (B-ARISA), d’autre part de paramètres semi-quantitatifs portant sur l’abondance relative de gènes marqueurs de populations (ADNr 16S) ou de fonctions (narG et pcaH). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 5 Matériels et méthodes Nombre d’échantillons traités Les données microbiologiques sont disponibles pour les 109 sites RMQS BioDiv. Deux sites ne sont pas clairement identifiés (666 et 829) pour les données qPCR. Démarche d’exploitation des données Les logiciels utilisés pour réaliser les analyses sont les suivants : - XLStat (Version 2007.6 © 1995-2007 AddinSoft), - Minitab (Version 12.2 © 1998 Minitab Inc), - R (Version 2.8.0 (2008-10-20) © 2008 The R Foundation for Statistical Computing), - ArcGis (Version 9.2 © 1999-2006 ESRI Inc.). a) Exploration des données : analyses descriptives Les statistiques descriptives et les représentations graphiques sous forme de boîtes à moustaches et d’histogrammes, permettent de caractériser chaque paramètre microbiologique. Ainsi, les valeurs moyenne, minimale, maximale et extrême3 sont identifiées. Des transformations (box-cox4) peuvent être réalisées pour normaliser les données. Pour l’étude des structures des communautés (bande B-ARISA), des analyses multivariées (Analyse en Composantes Principales : ACP sur matrice de covariance) sont réalisées. 3 Les valeurs extrêmes sont des valeurs exactes, mais considérées statistiquement comme anormalement faibles ou élevées. Elles sont représentées, dans les boîtes à moustaches, par deux symboles "*" et "o". Les valeurs "o" sont comprises dans l’intervalle [Q1 - 3 (Q3 – Q1); Q1 – 1.5 (Q3 – Q1)] ou [Q3 + 1.5 (Q3 – Q1); Q3 + 3 (Q3 – Q1)]. Les valeurs "*" correspondent à l’intervalle ] Q1 - 3 (Q3 – Q1); Q3 + 3 (Q3 – Q1) [. 4 La transformation box-cox permet d’augmenter la normalité des données grâce à l’équation suivante : La valeur de Lambda peut être imposé ou optimisé avec le logiciel XLSTAT. L’optimisation est choisie car elle permet de maximiser la vraisemblance de l’échantillon, étant supposé qu’après transformation l’échantillon suit une loi normale. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 6 Matériels et méthodes b) Approche spatiale La représentation cartographique permet une visualisation à l’échelle régionale des valeurs de chaque paramètre. Pour caractériser la structure spatiale des paramètres, le corrélogramme de l’indice de Moran (1948, 1950) est utilisé ainsi que l’analyse géostatistique (semi-variogramme) effectuée sur les paramètres qui suivent une distribution normale. La présence d’autocorrélation spatiale des taxons lombriciens a été testée par un test Join-Count (Dacey, 1968). c) Relations avec les variables explicatives Les liens avec les variables explicatives (paramètres physico-chimiques, occupation des sols, pratiques agricoles, données pédologiques, …), obtenues dans le cadre du programme RMQS « classique » géré par l’unité Infosol d’Orléans, sont étudiés. Des tests de corrélation de Spearman (alpha = 0,05) sont réalisés lorsque les variables explicatives sont quantitatives (ex : paramètres physico-chimiques). Lorsque les variables explicatives sont qualitatives, des tests non paramétriques de KruskalWallis et Mann-Whitney sont effectués. Les variables explicatives sont représentées sur le plan factoriel des observations (sites) de l’ACP afin de visualiser les groupes et leurs centres de gravité, regroupés par classe d’une variable catégorique (package ade4 ; fonction : s.class). Le lien entre la structure des communautés et les variables explicatives est évalué par analyse de co-inertie (Dolédec & Chessel, 1994). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 7 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 8 1. Exploration des données 1.1 Caractérisation globale : biomasse microbienne et abondance relative de gènes bactériens 1.1.1. Biomasse microbienne (MOV) La biomasse microbienne fait référence à la fraction vivante de la matière organique, considérant l’ensemble des micro-organismes du sol comme un tout (Chaussod, 1996). Les sols des sites RMQS BioDiv présentent des valeurs de biomasse microbienne (ou matière organique vivante : MOV) relativement élevées avec en moyenne 397 ± 265 mg C.kg-1 de sol. Les valeurs varient fortement entre 129 (pour un site maraîcher du Finistère nord) et 1916 mg C.kg-1 de sol. Cette forte hétérogénéité des valeurs est confirmée par le coefficient de variation qui est de 0,66 (Figure 2.1). Au delà de 800 mg C.kg-1 de sol les valeurs de MOV sont considérées statistiquement comme extrêmes. Ce type de valeurs, particulièrement élevées, est observé sur 5 sites. Il s’agit principalement de sites forestiers (719, 603, 664, 427) et d’un site prairial (671). Les données brutes de MOV ne suivent pas une distribution normale. Seule une transformation box-cox (lambda = 0,01) des données (sans les valeurs extrêmes : 104 sites) permet de respecter la condition de normalité. Le coefficient de variation passe alors de 0,66 à 0,48. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 9 1. Exploration des données 2.1 : Statistiques descriptives sur l’ensemble des 109 sites RMQS BioDiv (avec les valeurs extrêmes) a) c) b) 2000 0,35 1800 0,3 1600 0,25 1400 Fréquence MOV 109 397,05 264,51 129 223 325 483 1916 1787 0,66 MOV (mg C / kg de sol) Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 1200 1000 800 0,2 0,15 0,1 600 0,05 400 0 0 200 500 1000 1500 2000 MOV (mg C / kg de sol) 0 2.2 : Statistiques descriptives sans les sites qui présentent des valeurs extrêmes (N=104 sites) b) a) c) 900 25% 800 20% 700 600 500 Fréquence MOV 104 355,13 170,28 129 220 314 461,5 830 701 0,477 MOV (mg de C / kg de sol) Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 15% 10% 400 5% 300 200 0% 0 100 100 200 300 400 500 600 700 800 900 MOV (mg de C / kg de sol) Figure 2 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données de MOV Ces données sont exprimées en mg de carbone par kg de sol. (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 10 1. Exploration des données 1.1.2. Biomasse microbienne par rapport au carbone total (MOV%Ct) La biomasse microbienne peut également être exprimée en pourcentage du carbone total (MOV%Ct), ce qui permet une comparaison plus aisée de sols différents. Le site dunaire 713 ne participe pas aux analyses car il présente une valeur de MOV%Ct particulièrement élevée (12,70) et qui peut être considérée comme anormale. Sur les 108 sites RMQS BioDiv, la biomasse microbienne rapportée au carbone total est en moyenne de 1,58 ± 0,77. L’hétérogénéité entre les valeurs est assez faible puisque les valeurs s’étendent de 0,46 à 4,55. Trois sites forestiers 719, 611 et 664 présentent des valeurs au delà de la valeur limite de 3,2 (Figure 3). Les données suivent une distribution normale lorsqu’une transformation box-cox (lambda = 0,01) est appliquée. a) c) b) 5 16% 4,5 14% 4 3,5 3 2,5 12% Fréquence MOV%Ct 108 1,58 0,77 0,46 1,02 1,43 2,02 4,55 4,09 0,49 MOV%Ct Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 10% 8% 6% 2 4% 1,5 2% 1 0% 0,5 0 1 2 3 4 MOV% Ct 0 Figure 3 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données de MOV%Ct (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 11 5 1. Exploration des données 1.1.3. Abondance relative de gènes bactériens (ADNr 16 S) L’abondance relative de la communauté bactérienne peut être estimée par une approche moléculaire consistant à extraire directement l’ADN du sol (Martin-Laurent et al. 2001) et à amplifier par PCR quantitative l’ADNr 16S de l’opéron ribosomique bactérien (Henry et al. 2004). Les sites RMQS BioDiv présentent une forte hétérogénéité des valeurs d’ADNr 16S. En effet, les valeurs observées s’étendent de 1,06 x 102 à 6,62 x 105 copies par nanogramme d’ADN de sol. Toutefois, ces valeurs sont conformes à celles déjà rapportées dans des sols Français (Lopez-Gutierez et al. 2004). La valeur moyenne est de 9,12 x 104 ± 1,05 x 105 copies d’ADNr 16S / ng d’ADN de sol. Le coefficient de variation de l’abondance relative d’ADNr 16S dans les sols breton de 1,14 est assez élevé (Figure 4). Les sites 418, 726, 432, 828 et 550 présentent des quantités d’ADNr 16 S élevées (au delà de 2,50 x 105 copies / ng d’ADN) considérées statistiquement comme valeurs extrêmes. L’interprétation possible de ces valeurs élevées pourrait être à mettre en relation avec la proximité maritime de ces sites (toujours à moins de 20 kilomètres des côtes). Des valeurs d’ADNr 16S faibles (1 et 2,6 x 102 copies par nanogramme d’ADN) sont observées sur deux sites 656 et 665. Les données brutes ne suivent pas une loi normale et aucune transformation des données n’est actuellement satisfaisante pour obtenir la normalité des données. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 12 1. Exploration des données a) c) b) 16S 109 9,13E+04 1,05E+05 1,06E+02 2,99E+04 5,04E+04 1,18E+05 6,62E+05 6,62E+05 1,14 50% 6,E+05 40% 5,E+05 4,E+05 3,E+05 2,E+05 1,E+05 Fréquence Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation ADNr 16 S (Nb de copies/ ng d'ADN) 7,E+05 30% 20% 10% 0% 0,E+00 1,E+05 2,E+05 3,E+05 4,E+05 5,E+05 6,E+05 7,E+05 0,E+00 ADNr 16 S (Nb de copies/ng d'ADN) Figure 4 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données qPCR ADNr 16S Ces données sont exprimées en nombre de copies d’ADNr 16 S par nanogramme d’ADN de sol. (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 13 1. Exploration des données 1.2 Caractérisation fonctionnelle : abondance relative des communautés fonctionnelles narG et pcaH La caractérisation de l’abondance relative des communautés bactériennes fonctionnelles est appréhendée par PCR quantitative à partir de l’ADN extrait directement du sol : - narG impliqué dans la dénitrification (Henry et al. 2004) - pcaH impliqué dans la dégradation du protocatechuate un intermédiaire métabolique de la voie des β-cetoadipates impliquée dans la biodégradation des composés phénoliques 1.2.1. Abondance relative de la communauté dénitrifiante (narG) Les sites RMQS BioDiv présentent, en moyenne, des densités narG de 6,5 x 103 ± 6,9 x 103 copies / ng d’ADN. Les valeurs sont comprises entre 2,3 x 102 et 3,3 x 104 nombre de copies / ng d’ADN. Ces valeurs sont comparables à celles observées sur d’autres sols (Lopez-Gutierrez et al. 2004). Le coefficient de variation (1,05) est assez élevé (Figure 5.1). Au delà de 2,2 x 104 copies du gène narG / ng d’ADN les valeurs sont considérées statistiquement comme extrêmes. Ce type de valeurs, particulièrement élevées, est observé sur 3 sites (670, 724 et 609). Les données brutes ne suivent pas une loi normale et aucune transformation des données (racine carré, ln, box-cox, …) ne permet actuellement de satisfaire la condition de normalité des données. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 14 1. Exploration des données 5.1 : Statistiques descriptives sur l’ensemble des 109 sites RMQS BioDiv (« avec les valeurs extrêmes ») a) b) c) 35000 30000 Fréquence narG 109 6486,9 6864,1 234,3 1685,6 2964,3 10278,2 32938,3 32704,0 1,05 narG (Nb de copies/ng d'ADN) Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 40% 25000 20000 30% 20% 15000 10% 10000 0% 0 5000 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 narG (Nb de copies/ng d'ADN) 0 5.2 : Statistiques descriptives sans les sites qui présentent des valeurs extrêmes (N=106 sites) c) b) a) 25% 25000 20% 20000 15000 10000 Fréquence narG 106 5865,45 5824,46 234,35 1632,22 2943,99 9701,27 21578,79 21344,44 0,99 narG (Nb de copies/ng d'ADN) Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 15% 10% 5% 0% 5000 0 5000 10000 15000 20000 narG (Nb de copies/ng d'ADN) 0 Figure 5 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) de l’abondance des séquences narG dans l’ADN du sol Ces données sont exprimées en nombre de copies du gène narG par nanogramme d’ADN de sol. (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 15 1. Exploration des données 1.2.2. Ratio narG/16S L’abondance relative de la communauté dénitrifiante par rapport à la communauté bactérienne globale peut-être estimée par le calcul du ratio narG/16S. Cette abondance relative renseigne en quelque sorte de la richesse spécifique du sol en communauté dénitrifiante. Les sites RMQS BioDiv présentent des valeurs de ratio narG/16S comprises entre 0,002 et 0,32. Ces valeurs sont dans l’ordre de grandeur de celles observées précédemment pour des sols Français (Lopez-Gutierrez et al. 2004). Le ratio moyen observé est de 0,082 ± 0,055. Le coefficient de variation est de 0,67 (Figure 6). Notons que les deux sites 665 et 656 présentant des ratios extrêmement élevés, de 4,9 et 27,7, ne participent pas aux analyses. Notons que des valeurs anormalement faibles du nombre de copies du gène ADNr16S avaient été enregistrées sur les échantillons de sol provenant de ces deux sites. Des ratios élevés sont également observés sur les sites 548, 602 et 424 (respectivement 0,217, 0,266, et 0,318). Les données brutes du ratio narG/16S ne suivent pas une distribution normale. Une transformation box-cox des données (lambda = 0,267) permet de remplir la condition de normalité. Pour cela, les sites 665 et 656 ne sont pas pris en compte. Il ne reste donc que 107 sites étudiés. b) a) c) 0,35 0,3 20% 0,25 0,2 0,15 Fréquence narG/16S 107 0,08 0,06 0,00 0,04 0,06 0,11 0,32 0,31 0,67 narG/16S Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 25% 15% 10% 5% 0,1 0% 0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 narG/16S 0 Figure 6 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) du ratio narG/16S Ces données sont exprimées en pourcentage (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 16 1. Exploration des données 1.2.3. pcaH L’abondance de la communauté bactérienne dégradant le protocatechuate a été estimée par qPCR à partir de l’ADN extrait directement des sites du RMQS BioDiv. Les sites RMQS BioDiv présentent des valeurs de densité de pcaH comprises entre 6,5 x 101 et 1,5 x 104 copies du gène / ng d’ADN de sol. A titre de comparaison, des valeurs de 103 à 104 copies de pcaH par ng d’ADN ont été trouvées par El Azhari et al. (2008). En moyenne, on retrouve 3,9 x 103 ± 2,8 x 103 copies / ng d’ADN de sol. Le coefficient de variation de 0,71 est moyennement élevé. Deux sites (312 et 597) présentent des valeurs élevées, au-delà de 1,15 x 104 nombre de copies de pcaH / ng d’ADN de sol, considérées statistiquement comme extrêmes (Figure 7). La proximité avec l’océan constitue un des points communs de ces deux sites. Les données brutes ne suivent pas une loi normale mais les données qui subissent une transformation racine carré ou box-cox (lambda = 0,42) sont normales. a) b) c) 25% 16000 20% 14000 12000 10000 8000 6000 4000 Fréquence PcaH 109 3969,6 2814,1 65,5 1775,3 3498,6 5679,6 15546,4 15480,8 0,71 PcaH (Nb de copies/ng d'ADN) Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 15% 10% 5% 0% 0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 2000 PcaH (Nb de copies/ng d'ADN) 0 Figure 7 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données qPCR pcaH Ces données sont exprimées en nombre de copies du gène pcaH par nanogramme d’ADN de sol. (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 17 1. Exploration des données 1.2.4. Ratio pcaH/16S L’abondance relative de la communauté dégradant le protocatechuate par rapport à la communauté bactérienne globale peut-être estimée par le calcul du ratio pcaH/16S. Cette abondance relative renseigne en quelque sorte de la richesse spécifique du sol dans la communauté dégradant des composés phénoliques. Les sites RMQS BioDiv présentent des valeurs de ratio pcaH/16S comprises entre 0,002 et 0,188. Le ratio moyen observé est de 0,06 ± 0,04. Le coefficient de variation est de 0,6 (Figure 8). Les valeurs observées ici sont en bonne cohérence avec les valeurs publiées par El Azhari et al. (2008), qui se situaient entre 0.002 et 0.109. Des valeurs légèrement élevées, entre 0,162 et 0,188, sont observées sur quatre sites (780, 661, 482, 597). Notons que trois sites sont exclus de l’analyse en raison de valeurs du ratio sont très élevées. Il s’agit des sites 656, 665 et 421 qui présentent respectivement des valeurs de 17,8, 0,405 et 0,459. Rappelons que pour les deux premiers sites, des valeurs anormalement faibles du nombre de copies du gène ADNr 16S avaient été trouvées. Les données brutes du ratio pcaH/16S ne suivent pas une distribution normale. Une transformation box-cox des données (lambda = 0,357) permet d’obtenir la normalité des données avec 106 sites. Les sites 656, 421 et 665 sont écartés. a) b) c) 0,2 16% 14% 12% 0,15 10% 0,1 Fréquence PcaH/16S 106 0,061 0,038 0,002 0,035 0,052 0,082 0,188 0,186 0,623 PcaH/16S Statistique Nb. d'observations Moyenne Ecart-type (n-1) Minimum 1er Quartile Médiane 3ème Quartile Maximum Amplitude Coefficient de variation 8% 6% 4% 2% 0,05 0% 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 PcaH/16S Figure 8 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) du ratio pcaH/16S Ces données sont exprimées en pourcentage (+ : la moyenne ; barre du milieu : la médiane ; ° et * : les valeurs extrêmes ; ● : valeur minimale et maximale) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 18 1. Exploration des données 1.3 Caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes La caractérisation de la structure génétique des communautés bactériennes est réalisée grâce à la méthode B-ARISA (Bacterial-automated ribosomal intergenic spacer analysis) (Ranjard et al., 2000). Cette technique fournit des empreintes génétiques complexes du type code barres, révélant la structure de la communauté bactérienne globale. Une analyse en composantes principales (ACP) est réalisée sur la matrice de covariance (n-1) des 341 bandes RISA sur les 109 sites RMQS BioDiv. Les trois premiers axes permettent d’extraire 43,4% de l'inertie totale de ce tableau, respectivement 23,9% pour l'axe 1, 13,6% pour l'axe 2 et 5,7% pour l’axe 3 (Figure 9). Les variables V45, V46 et V76 se détachent particulièrement du nuage de points. Elles sont liées respectivement au site 826, 598 pour l’axe1 et 421 pour l’axe 2. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 19 1. Exploration des données d = 0.1 d = 0.02 V76 421 608 554 727 542 607 660 488 659 601 548 545 597 365 671718 776 605 543 422 830 491 600 658 490 666 773 723 420 662 312 484 656 363 669 720 779 721 604 431 716 426 772 364 663 670 494 606 362 423 829 774 717 486610 828 775 547 482 609 496 715 424 553 418 551 366 544 432428 425 483599 722 668 724 427 657 602 485 550 661 430 665 552 539 492 546726368603 489 664 481 713 777 780 778 480 719 612 725 493 611 540 541 V66 826 667 V225 V75 V59 V80 V81 V77 V68 V65 V58 V224 V82 V69 V79 V226 V67 V44 V211 V98 V193 V60 V49 V222 V55 V209 V223 V150 V148 V205 V210 V213 V104 V107 V170 V191 V183 V212 V214 V217 V169 V160 V194 V192 V200 V186 V189 V208 V100 V219 V220 V233 V234 V230 V57 V241 V84 V85 V71 V39 V41 V38 V37 V36 V171 V167 V166 V165 V147 V146 V163 V161 V149 V157 V158 V54 V33 V24 V23 V22 V21 V18 V17 V14 V13 V12 V11 V10 V28 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V195 V201 V188 V206 V207 V204 V215 V102 V218 V221 V123 V228 V232 V231 V235 V229 V341 V340 V338 V240 V243 V242 V335 V334 V333 V253 V272 V271 V256 V262 V261 V260 V259 V258 V257 V277 V286 V321 V320 V296 V295 V302 V301 V300 V311 V40 V175 V173 V174 V164 V144 V139 V162 V135 V151 V156 V30 V32 V25 V20 V19 V16 V15 V27 V196 V199 V198 V197 V202 V185 V187 V216 V117 V105 V227 V238 V246 V236 V244 V337 V336 V339 V252 V329 V267 V270 V268 V264 V263 V280 V282 V285 V278 V325 V324 V323 V322 V319 V318 V326 V305 V287 V294 V304 V306 V310 V309 V308 V297 V299 V303 V307 V74 V43 V42 V172 V141 V140 V145 V130 V133 V132 V131 V128 V153 V31 V184 V182 V176 V177 V114 V116 V26 V122 V120 V56 V61 V97 V239 V245 V247 V237 V330 V332 V254 V275 V274 V328 V327 V269 V279 V283 V314 V288 V312 V168 V159 V143 V127 V129 V134 V152 V155 V136 V203 V181 V101 V121 V248 V251 V250 V255 V276 V331 V266 V265 V281 V284 V70 V72 V316 V317 V313 V142 V154 V52 V50 V34 V118 V124 V106 V94 V249 V273 V90 V293 V290 V111 V119 V99 V91 V315 V289 V78 V138 V51 V35 V178 V108 V113 V103 V83 V137 V112 V298 V180 V179 V109 V29 V48 V190 V126 V115 V291 V62 V89 V53 V95 V292 V110 V96 V86 V125 V73 V47 V92 V93 V64 V88 V63 V87 V45 598 V46 Plan factoriel des sites Plan factoriel des variables Figure 9 : Plan factoriel (1-2) de l’ACP sur la matrice de covariance des données B-ARISA RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 20 1. Exploration des données 1.4 Lien entre les paramètres microbiologiques Il existe des liens entre les paramètres microbiologiques mesurés sur les sites RMQS BioDiv. Le test de corrélation de Spearman permet d’appréhender ces relations. Les résultats sont illustrés par la matrice de corrélation (Tableau 1) et les nuages de points (Figure 10). Des corrélations assez significatives (supérieur à 0,6) sont retrouvées entre l’ADNr 16S et narG, entre l’ADNr 16S et pcaH et entre narG et pcaH (Tableau 2). La corrélation entre MOV et MOV%Ct, est en partie attendue puisque MOV%Ct est un ratio calculé à partir des données MOV. Toutefois, les MOV ne sont pas proportionnelles à Ct mais « plus que proportionnelles » ; à des valeurs absolues élevées de MOV sont généralement associées des valeurs relatives (en % Ct) élevées. Le niveau de MOV s’avère donc plus discriminant que Ct pour la caractérisation des sols au plan biologique. De manière générale, il n’existe pas de lien entre les paramètres de biomasse microbienne et les paramètres obtenus par la qPCR. La raison en est que la première est exprimée sur la base d’une masse de sol sec alors que les seconds sont exprimés par rapport à une quantité d’ADN extrait. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 21 1. Exploration des données Tableau 1 : Matrice de corrélation de Spearman entre les paramètres microbiologiques (N=109) MOV%Ct 16 S narG narG/16S PcaH MOV Variables MOV%Ct 0,660 16 S 0,196 0,145 narG 0,209 0,755 0,111 PcaH 0,670 0,680 0,098 0,055 narG/16S 0,454 0,002 0,079 -0,174 0,069 PcaH/16S -0,550 -0,271 0,271 -0,045 -0,162 0,144 Les valeurs en gras sont significativement différentes de 0 à un niveau de signification alpha=0,05 Tableau 2 : R, p value et R² des corrélations les plus significatives p R² 0,641 0,755 0,670 0,680 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,411 0,569 0,449 0,463 1400 35000 1200 30000 1000 25000 800 20000 narG MOV MOV et MOV%Ct (N = 107) ADNr 16 S et narG (N = 109) ADNr 16 S et PcaH (N = 109) narG et PcaH (N = 109) R 600 400 10000 200 5000 0 0 0 1 2 3 4 5 MOV% Ct 0 200000 16000 16000 14000 14000 12000 12000 10000 10000 8000 600000 8000 6000 6000 4000 4000 2000 2000 0 400000 16 S b) PcaH PcaH a) 0 0 c) 15000 200000 400000 600000 16 S 0 d) 10000 20000 30000 narG Figure 10 : Nuages de points des corrélations les plus significatives entre paramètres microbiologiques a) MOV et MOV%Ct ; b) ADNr 16S et narG ; c) ADNr 16S et pcaH ; d) narG et pcaH RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 22 2. Approche spatiale 2. Approche spatiale 2.1 Structuration spatiale des paramètres microbiologiques Les valeurs de biomasse microbienne (MOV et MOV%Ct) sont représentées spatialement sous forme de cartes (Figure 12 et 13). Cette représentation ne permet pas d’identifier visuellement des patterns spatiaux à l’échelle régionale pour la MOV. Ceci est probablement dû au fait que d’autres facteurs interviennent de façon prépondérante, tel que l’usage des sols (cultures, prairies, forêts) ou d’autres facteurs anthropiques, ou des propriétés de sols variant à une échelle autre que celle de l’échantillonnage. En revanche pour le paramètre MOV%Ct, il semble que les valeurs soient un peu plus importantes en Ille-et-Vilaine. De fait, des études antérieures ont montré que les sols du Finistère sont globalement plus riches en matière organique. Ceci est en partie lié aux types de sols majoritairement rencontrés : beaucoup de sols sur schistes dans le Finistere ; sols limoneux du bassin de Rennes (Walter et al., 2004). Les données box-cox transformées (Annexe I) ont été utilisées pour réaliser les analyses de géostatistiques (semi-variogramme), qui nécessitent une distribution normale des données. Le site insulaire d’Ouessant (n° 418) ne participe pas aux analyses. Tableau 3 : Synthèse des résultats géostatistiques pour les paramètres microbiologiques. Paramètres microbiologiques Indice p.value P value de permutation Significativité Significativité du corrélogramme du variogramme 0,0385 0,0632 0,2298 0,1307 0,2243 0,1353 ns ns ns ns -0,0965 -0,0571 -0,0839 0,9115 0,7712 0,8745 0,9129 0,7658 0,8696 ns ns ns ns ns ns de moran Paramètres globaux MOV MOV%Ct ADNr 16 S Paramètres fonctionnels narG narG/16S pcaH pcaH/16S L’existence de structuration spatiale à l’échelle régionale n’est pas mise en évidence pour la biomasse microbienne (MOV). Lorsque cette biomasse est exprimée par RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 23 2. Approche spatiale rapport au carbone total, deux points sont significatifs à faible distance dans le corrélogramme (Figure 11). Cependant, le corrélogramme pris dans son ensemble n’est pas significatif (Tableau 3). b) 0.8 0.6 0.4 semivariance 0.0 0.0 -0.2 0.2 -0.1 Moran I statistic 0.1 1.0 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 distance classes 0 50000 100000 150000 200000 250000 distance Figure 11 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de la biomasse microbienne (MOV%Ct) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 24 2. Approche spatiale Biomasse microbienne sur les sites RMQS BioDiv Légende MOV (mgC/kg sol) 100 ® 250 500 750 0 16 Kilomètres 1 000 Sites non réalisés Figure 12 : Carte de la biomasse microbienne Biomasse microbienne rapporté au carbone total sur les sites RMQS BioDiv Légende MOV%Ct ® 0,1 0,25 0,5 0,75 0 16 Kilomètres 1 Sites non réalisés Figure 13 : Carte de la biomasse microbienne (exprimée en pourcentage du carbone total) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 25 2. Approche spatiale L’abondance de la communauté bactérienne globale estimée par qPCR ciblée sur l’ADNr 16S de l’opéron ribosomique bactérien déterminé dans l’ADN du sol extrait des échantillons du RMQS BioDiv (ADNr 16S) est représenté spatialement sous forme de cartogramme (Figure 14). Comme les données ne suivent pas une distribution normale et qu’aucune transformation des données n’a permis de remplir cette condition, les analyses géostatistiques n’ont pu être réalisées pour ce paramètre. 16S sur les sites RMQS BioDiv Légende nb de copies/ŋ d'ADN ® 100 000 100 1 000 1 000 000 0 16 Kilomètres 10 000 Sites non réalisés Figure 14 : Carte du nombre de copies de l’ADNr 16 S par ng d’ADN du sol RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 26 2. Approche spatiale 2.2 Structuration spatiale des communautés bactériennes fonctionnelles Les paramètres caractérisant l’abondance relative de communautés bactériennes fonctionnelles impliquées dans la dénitrification et la biodégradation du protocatechuate quantifiée par qPCR à partir de l’ADN de sol sont présentés spatialement sous la forme de cartes (Figures 16a et 17a respectivement pour narG et pcaH). Le ratio de l’abondance de ces gènes de fonction rapportée à l’abondance du gène ADNr 16S est également représenté sous la forme de cartes (Figures 16b et 17b). Visuellement, on ne distingue pas de patterns spatiaux à l’échelle régionale pour ces paramètres. Les analyses géostatistiques ont été conduites uniquement sur les données qui suivent une distribution normale. Il s’agit de : - pcaH (transformation box-cox) sur 109 sites - ratio pcaH/16S (transformation box-cox) sur 106 sites - ratio narG/16S (transformation box-cox) sur 107 sites Les outils géostatistiques, corrélogramme de l’indice de Moran et semi-variogramme, ont été utilisés afin de mettre en évidence l’existence ou non de structuration spatiale. Les résultats des corrélogrammes et semi-variogrammes (Tableau 3) confirme le constat qu’il n’existe pas de structuration spatiale des valeurs de pcaH (Figure 15), de ratio pcaH/16S et narG/16S à l’échelle régionale. b) 1500 semivariance 1000 -0.1 -0.2 0 -0.4 500 -0.3 Moran I statistic 0.0 2000 0.1 2500 0.2 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 distance classes 0 50000 100000 150000 200000 250000 distance Figure 15 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de pcaH RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 27 2. Approche spatiale a) b) Ratio narG/16S sur les sites RMQS BioDiv narG sur les sites RMQS BioDiv Légende Légende nb de copies/ŋ d'ADN narG/16S ® 100 500 1 000 0 5 000 16 Kilomètres ® 0,001 0,005 0,01 0 0,05 10 000 0,1 Sites non réalisés Sites non réalisés Figure 16 : Carte du nombre de copies de narG par ng d’ADN du sol (a) et du ratio narG/ADNr 16S (b) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 28 16 Kilomètres 2. Approche spatiale a) b) Pcah sur les sites RMQS BioDiv Ratio pcaH/16S sur les sites RMQS BioDiv Légende Légende nb de copies/ŋ d'ADN pcaH/16S 100 ® 500 1 000 5 000 0 16 Kilomètres ® 0,001 0,005 0,01 0,05 10 000 0,1 Sites non réalisés Sites non réalisés 0 Figure 17 : Carte du nombre de copies de pcaH par ng d’ADN de sol (a) et du ratio pcaH/ADNr 16S (b) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 29 16 Kilomètres RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 30 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1 Paramètres globaux et fonctionnels en lien avec les variables explicatives 3.1.1 Paramètres microbiologiques et paramètres physico-chimiques Les paramètres microbiologiques ont été confrontés aux résultats d’analyses physico-chimiques des sites RMQS. Il existe plusieurs outils statistiques qui permettent d’étudier ce lien tels que les corrélations de Spearman (alpha = 0,05). La biomasse microbienne (MOV) est corrélée négativement avec le phosphore assimilable alors qu’elle est corrélée positivement avec le carbone et l’azote (Figure 18). La MOV exprimée en pourcentage de carbone total (MOV%Ct) présente plus de corrélations significatives avec les éléments physico-chimiques. En effet des corrélations négatives sont également retrouvées avec le phosphore assimilable mais également avec le thallium et le plomb total (Figure 19). Pour ce qui concerne le phosphore (P_ass), la relation négative peut s’expliquer par des niveaux élevés de biomasse microbienne dans les sols « naturels », pauvres en P. En ce qui concerne le thallium et le plomb, diverses hypothèses (non exclusives) peuvent être avancées : lien avec le type pédologique, sols contaminés, etc. Figure 18 : Corrélations significatives entre biomasse microbienne et paramètres physico-chimiques a) tableau des corrélations significatives et b) illustrations des corrélations les plus significatives (p < 0,0001) MOV (N = 109) a) MOV Variables CARBONE AZOTE_TOT CR_EXT NA_ECH MG_ECH CsurN FE_ECH CU_TOT CU_EXT P_ASS RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie R p R² 0,423 0,343 0,319 0,296 0,242 0,240 0,219 -0,190 -0,240 -0,434 < 0,0001 0,000 0,001 0,002 0,011 0,012 0,022 0,048 0,012 < 0,0001 0,179 0,117 0,102 0,088 0,059 0,058 0,048 0,036 0,058 0,188 31 3. Données microbiologiques et variables explicatives 2000 2000 1800 1800 1600 1600 MOV (mg C / kg de sol) MOV (mg C / kg de sol) b) 1400 1200 1000 800 600 400 1400 1200 1000 800 600 400 200 200 0 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 10 20 P_ASS (g/kg) 30 40 50 60 CARBONE (g/kg) Figure 19 : Corrélations significatives entre biomasse microbienne rapportée au carbone total et paramètres physico-chimiques a) tableau des corrélations significatives et b) illustrations des corrélations les plus significatives (p < 0,0001) MOV%Ct (N = 108) a) MOV%Ct Variables MN_ECH CO_TOT ZN_EXT CD_EXT CD_TOT CA_ECH AL_TOT CARBONE K_TOT AZOTE_TOT PB_TOT TL_TOT P_ASS p 0,000 0,045 0,047 0,047 0,020 0,005 0,002 0,002 0,001 0,000 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 5 5 5 4,5 4,5 4,5 4 4 3,5 3,5 3 2,5 2 1,5 MOV%Ct 4 3,5 MOV%Ct MOV%Ct b) R 0,346 0,193 -0,191 -0,192 -0,224 -0,272 -0,295 -0,302 -0,331 -0,360 -0,433 -0,435 -0,521 3 2,5 2 3 2,5 2 1,5 1,5 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0,05 0,1 0,15 P_ASS 0,2 0,25 0,3 0,35 0 10 20 (g/kg) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 30 40 50 PB_TOT (mg/kg) 60 70 80 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 TL_TOT (mg/kg) 32 3. Données microbiologiques et variables explicatives Le nombre de copies d’ADNr 16 S par ng d’ADN extrait du sol est négativement corrélé avec le phosphore assimilable. Les gènes narG et pcaH ne présentent pas de corrélations significatives avec des paramètres physico-chimiques. Le ratio narG/ADNr 16S présente des corrélations négatives avec l’aluminium et le fer échangeable et des corrélations positives avec le cuivre extractible, le phosphore assimilable, le nickel extractible et le pH. Enfin, le ratio pcaH/ADNr 16S est quant à lui corrélé avec le phosphore assimilable et le thallium total (Figure 20) Figure 20 : Corrélations significatives entre paramètres « qPCR » et paramètres physico-chimiques ADNr 16S (N = 107) ; narG/16S (N = 105) ; pcaH/16S (N = 106) ADNr 16S Variables P_ASS R p -0,252 0,009 narG/16S Variables CU_EXT P_ASS NI_EXT PH_EAU FE_ECH AL_ECH R p 0,266 0,222 0,201 0,196 -0,231 -0,270 0,006 0,023 0,039 0,046 0,018 0,005 pcaH/16S Variables TL_TOT P_ASS RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie R p 0,232 0,199 0,017 0,041 33 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.2 Paramètres microbiologiques et occupation des sols 3.1.2.1 Occupation du sol : premier niveau Les sites RMQS BioDiv ont été classés dans un premier temps selon la nature du système (culture, prairie, forêt) auquel ils appartiennent. Des tests de Kruskal-Wallis sont effectués pour chaque paramètre en fonction des 3 systèmes. Une procédure de comparaisons multiples est ensuite appliquée pour identifier les groupes présentant des différences (methode de Dunn et correction du niveau de signification de Bonferroni). Les boîtes à moustaches illustrent les résultats. Notons que ces tests sont réalisés sur 107 sites car la dune (site n° 713) et la friche (site n° 551) ne sont pas intégrés dans ces analyses. Les tests de Kruskal-Wallis sont significatifs pour les paramètres MOV et MOV%Ct. Ils sont également significatifs pour ADNr 16S, narG et pcaH (Figure 21). Par contre, les ratios narG/16S et pcaH/16S ne présentent pas de relations significatives avec le mode d’occupation des sols (Tableau 4). Tableau 4 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis par système d’occupation des sols (1er niveau) Paramètres biologiques Valeur de H p.value significativité C (N=52) P (N=47) F (N=8) 53,9 35,7 11,3 < 0,0001 < 0,0001 0,003 s s s a a a b b b b c a,b 13,4 2,7 8,3 4,2 0,001 0,265 0,016 0,121 s ns s a b a,b a b a,b Paramètres globaux MOV MOV%Ct ADNr 16 S Paramètres fonctionnels narG narG/16S pcaH pcaH/16S RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie ns 34 3. Données microbiologiques et variables explicatives b) 2000 5 1800 4,5 1600 4 1400 3,5 1200 3 MOV%Ct MOV a) 1000 800 2,5 2 600 1,5 400 1 200 0,5 0 Culture Prairie Forêt a b b 0 Culture Prairie Forêt a b c c) 700000 600000 ADNr 16S 500000 400000 300000 200000 100000 0 Culture Prairie a d) Forêt b a,b e) 35000 16000 30000 14000 12000 25000 PcaH narG 10000 20000 15000 8000 6000 10000 4000 5000 2000 0 0 Culture Prairie Forêt Culture a b a,b a Prairie b Forêt a,b Figure 21 : Paramètres microbiologiques par occupation du sol (niveau 1) Culture (N = 52) ; Prairie (N = 47) ; Forêt (N = 8) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 35 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.2.2 Occupation du sol : deuxième niveau Dans un second temps, la classification de l’occupation du sol à été affinée en se basant, dans la mesure du possible, sur la codification FAO5. Pour les systèmes cultivés, une distinction est établie entre les systèmes toujours en grandes cultures (AA) et les systèmes en grandes cultures incluant des prairies dans la rotation (AA/M). Pour les systèmes prairiaux, les prairies temporaires (M/AA) sont dissociées des prairies permanentes (Mp). Les mêmes traitements statistiques que précédemment sont appliqués (test de Kruskal-Wallis et correction de Boneferroni). Le test de Kruskal-Wallis est hautement significatif pour les paramètres de biomasse microbienne. La MOV discrimine les grandes cultures vis-à-vis des prairies permanentes et forêts alors que les rotations grandes cultures-prairies (AA/M et M/AA) sont intermédiaires. Il l’est également pour les paramètres ADNr 16S, narG et pcaH (Figure 22). En revanche les ratios narG/16S et pcaH/16S ne présentent pas de différences en fonction de l’occupation du sol (Tableau 5). Tableau 5 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis par système d’occupation des sols (2ème niveau) Paramètres lombriciens Valeur de H p.value significativité Paramètres globaux MOV MOV%Ct ADNr 16 S 59,1 39,7 14,4 < 0,0001 < 0,0001 0,006 s s s Paramètres fonctionnels narG narG/16S pcaH pcaH/16S 5 16,2 0,002 3,8 0,429 11,7 0,019 5,3 0,261 s ns s ns AA AA/M M/AA Mp F (N=42) (N=11) (N=23) (N=23) (N=8) c a a,b b,c c a,b a b,c c c a a,b a,b b a,b (N=42) (N=10) (N=22) (N=23) (N=8) a a,b b b a,b a a,b a,b b a,b ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0541e/a0541e00.pdf RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 36 3. Données microbiologiques et variables explicatives a) b) 2000 5 1800 4,5 4 1400 3,5 MOV%Ct 1600 MOV 1200 1000 800 3 2,5 2 600 1,5 400 1 200 0,5 0 AA AA/M MAA a a,b b,c Mp F c c 0 AA a,b AA/M MAA Mp F a b,c c c c) 700000 600000 ADNr 16S 500000 400000 300000 200000 100000 0 AA AA/M MAA Mp F a a,b a,b b a,b d) e) 16000 30000 14000 25000 12000 20000 10000 PcaH narG 35000 15000 8000 6000 10000 4000 5000 2000 0 AA AA/M a a,b MAA Mp F b b a,b 0 AA AA/M MAA Mp F a a,b a,b b a,b Figure 22 : Paramètres microbiologiques par occupation du sol (niveau 2) AA : Grande culture (N = 42) ; AA/M : Culture dans rotation grande culture-prairie (N = 11) ; M/AA : Prairie dans rotation grande culture-prairie (N = 23) ; Mp : Prairie permanente (N = 23) ; F : Forêt (N=8) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 37 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.3 Paramètres microbiologiques et pratiques agricoles Les pratiques agricoles étudiées, ici, sont : - le type de fertilisation (pas de fertilisation, fertilisation minérale, organique, minérale et organique) - la présence d’amendement et fertilisation organique (pas de paillage, lisier, fumier, mixte) - le travail du sol (pas de travail, travail sans labour, travail inf à 25, travail sup à 25) - les traitements phytosanitaires (oui, non) Les mêmes traitements statistiques sont appliqués que précédemment (test de Kruskal-Wallis et correction de Bonferroni) pour la majorité des variables. Un test de Mann-Whitney est réalisé pour la variable présence ou absence de traitements phytosanitaires. Les paramètres de biomasse microbienne (MOV et MOV%Ct) discriminent les quatre variables de pratiques agricoles (Figure 23, 24, 25 et 26). Les paramètres ADNr 16S et narG présentent des résultats significatifs avec la variable « amendement et fertilisation pailleuse dans la fertilisation » (Figure 24). Les autres paramètres microbiologiques ne sont pas significativement liés avec les variables de pratiques agricoles (Tableau 6). b) 2000 5 1800 4,5 1600 4 1400 3,5 1200 3 MOV%Ct MOV a) 1000 800 2,5 2 600 1,5 400 1 200 0,5 0 pas_ferti b Fmin a Forg a,b min+org a 0 pas_ferti b Fmin a Forg min+org a a Figure 23 : Biomasse microbienne par type de fertilisation a) Biomasse microbienne (MOV : mg C / kg de sol) b) Biomasse microbienne par rapport au carbone total F min : Fertilisation minérale (N = 20) ; F org : Fertilisation organique (N = 8) ; min + org : Fertilisation minérale et organique (N = 68) ; pas de ferti : Pas de fertilisation (N = 15 pour MOV et 14 pour MOV%Ct) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 38 3. Données microbiologiques et variables explicatives Tableau 6 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis et Mann-Whitney avec les variables de pratiques agricoles KW ou MW p-value Significativité 27,7824 9,5953 38,2028 1823,5 4,035e-06 0,02234 2,560e-08 5,007e-07 s s s s 21,5637 13,5008 30,6378 1861 8,039e-05 0,00367 1,013e-06 1,226e-07 s s s s 1,662 8,5258 3,493 1149 0,6454 0,03631 0,3217 0,4879 ns s ns ns 1,2359 9,8427 6,6826 1209 0,7444 0,01995 0,08273 0,2587 ns s ns ns 5,5012 4,3975 6,6561 1060 0,1386 0,2216 0,0837 0,9623 ns ns ns ns 0,8705 7,6996 3,0867 1040 0,8325 0,05265 0,3784 0,9277 ns ns ns ns 2,948 7,2595 1,8197 928,5 0,3997 0,06407 0,6107 0,3677 ns ns ns ns MOV MOV et Ferti MOV et Pailleux MOV et Travail_sol MOV et Phyto MOV%Ct MOV.Ct et Ferti MOV.Ct et Pailleux MOV.Ct et Travail_sol MOV.Ct et Phyto ADNr 16S ADNr 16S et Ferti ADNr 16S et Pailleux ADNr 16S et Travail_sol ADNr 16S et Phyto narG narG et Ferti narG et Pailleux narG et Travail_sol narG et Phyto narG_16S narG_16S et Ferti narG_16S et Pailleux narG_16S et Travail_sol narG_16S et Phyto PcaH PcaH et Ferti PcaH et Pailleux PcaH et Travail_sol PcaH et Phyto PcaH_16S PcaH_16S et Ferti PcaH_16S et Pailleux PcaH_16S et Travail_sol PcaH_16S et Phyto MOV (N = 109) ; MOV%Ct ( N = 108) ; ADNr 16S, narG, narG/16S, PcaH, PcaH/16 (N = 107) Des pratiques de fertilisation différentes induisent donc des différences sur les paramètres MOV et MOV%Ct. Pour les autres paramètres microbiens, seule l’ l’amendement et fertilisation pailleuse augmente significativement l’ADNr 16S et narG. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 39 3. Données microbiologiques et variables explicatives b) 2000 5 1800 4,5 1600 4 1400 3,5 1200 3 MOV%Ct MOV a) 1000 800 2,5 2 600 1,5 400 1 200 0,5 0 rien a non pailleux pailleux a a 0 mixte a b non pailleux pailleux a,b a,b mixte a d) 700000 35000 600000 30000 500000 25000 400000 20000 narG 16S c) rien 300000 15000 200000 10000 100000 5000 0 0 rien a,b non pailleux pailleux b a mixte rien a,b a,b non pailleux pailleux b a mixte a,b Figure 24 : Paramètres microbiologiques par type d’amendement et de fertilisation organique a) Biomasse microbienne (MOV : mg C / kg de sol) b) Biomasse microbienne par rapport au carbone total c) Biomasse bactérienne (nb de copies d’ADNr 16 S / ng d’ADN) d) narG (nb de copies / ng d’ADN) Rien : Pas de fertilisation et fertilisation minérale (N = 35) ; Non pailleux : lisier, fientes et purin (N = 24) ; Pailleux : fumier (N = 28) ; Mixte : fumier + lisier (N = 21) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 40 3. Données microbiologiques et variables explicatives a) b) 2000 5 1800 4,5 1600 4 1400 3,5 MOV%Ct MOV 1200 1000 800 600 3 2,5 2 1,5 400 1 200 0,5 0 pas de travail b TCL travail inf 25 labour sup 25 a,b a a 0 pas de travail b TCL a,b travail inf 25 a labour sup 25 a Figure 25 : Biomasse microbienne par type de travail du sol a) Biomasse microbienne (MOV : mg C / kg de sol) b) Biomasse microbienne par rapport au carbone total Pas de travail : Pas de travail du sol (N = 27) ; TCL : Technique sans labour (N = 9) ; Travail inf 25 : travail inférieur à 25 cm (N = 36) ; Labour sup 25 : labour sup ou égal à 25 (N = 37). a) b) 5 1800 4,5 1600 4 1400 3,5 MOV%Ct 2000 MOV 1200 1000 800 3 2,5 2 600 1,5 400 1 200 0,5 0 pas_phyto phyto 0 pas_phyto phyto Figure 26 : Biomasse microbienne par gestion phytosanitaire a) Biomasse microbienne (MOV : mg C / kg de sol) b) Biomasse microbienne par rapport au carbone total Pas de phyto : Pas de traitements phytosanitaires (N = 26) ; Phyto : Traitements phytosanitaires (N = 82) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 41 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.4 Paramètres microbiologiques et caractéristiques pédologiques Les données pédologiques utilisées ici sont basées sur le code tarière. Ce code synthétique rassemble des informations sur : - la géologie - l’hydromorphie - le profil de sol - la profondeur de sol Les mêmes traitements statistiques que précédemment sont appliqués (test de Kruskal-Wallis et correction de Bonferroni). Quelques paramètres microbiologiques présentent des résultats significatifs avec les variables pédologiques : - ratio pcaH/ADNr 16S et géologie (Figure 27) - biomasse microbienne rapporté au carbone total et hydromorphie (Figure 28) - narG et hydromorphie - ratio narG/ADNr 16S et hydromorphie - ratios narG/ADNr 16S et profil de sol (Figure 29) Notons qu’aucun résultat significatif n’est retrouvé avec la variable profondeur de sol (Tableau 7). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 42 3. Données microbiologiques et variables explicatives Tableau 7 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis avec les variables pédologiques KW p-value Significativité 6,99 13,21 9,88 9,05 7,11 12,79 20,97 0,64 0,15 0,36 0,43 0,63 0,17 0,01 ns ns ns ns ns ns s KW p-value Significativité 0,05 0,00 0,60 0,03 0,34 0,04 0,81 ns s ns s ns s ns p-value Significativité 0,68 0,15 0,53 0,17 1,00 0,01 0,74 ns ns ns ns ns s ns p-value Significativité 0,91 0,05 0,64 0,60 0,96 0,51 0,37 ns ns ns ns ns ns ns Géologie MOV MOV%Ct ADNr 16S narG pcaH narG/ADNr 16S pcaH/ADNr 16S Hydromorphie MOV MOV%Ct ADNr 16S narG pcaH narG/ADNr 16S pcaH/ADNr 16S 7,86 16,6 1,88 8,78 3,37 8,42 0,94 KW Profil de sol MOV MOV%Ct ADNr 16S narG pcaH narG/ADNr 16S pcaH/ADNr 16S 0,76 3,80 1,29 3,55 0,01 9,11 0,61 KW Profondeur MOV MOV%Ct ADNr 16S narG pcaH narG/ADNr 16S pcaH/ADNr 16S 0,54 7,68 1,70 1,86 0,29 2,31 3,15 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 43 3. Données microbiologiques et variables explicatives Ratio pcaH/ADNr 16S 0,2 0,15 0,1 0,05 0 F G I L a,b b a,b a,b N O R a,b a,b a,b UetV autres a a,b Figure 27 : Ratio pcaH/ADNr 16S par matériau parental F : Micashiste (N = 5) ; G : Granite (N = 26) ; I : Gneiss (N = 10) ; L : Limon (N = 13) ; N : Schiste tendre (N = 21) ; O : Schiste moyen (N = 11) ; R : Schiste gréseux (N = 8) ; UetV : Matériau d'apport colluvial et alluvial (N = 5) ; autres : Sable, Terrasse caillouteuse, Grès dur, Eboulis de pente (N = 5) Biomasse microbienne (MOV%Ct) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1et2 3et4 5et6 a b a,b b Figure 28 : Biomasse microbienne (MOV%Ct) par classe d’hydromorphie 0 : Absence d’hydromorphie (N = 61) ; 1 et 2 : taches d'oxydo-réduction à une prof sup à 80 cm (N = 12) ; 3 et 4 : taches d'oxydo reduction à une prof entre 40 et 80 cm (N = 25) ; 5 et 6 : taches d'oxydo reduction dès la surface (N = 10) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 44 3. Données microbiologiques et variables explicatives 0,35 Ratio narG /ADNr 16S 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 A B C a,b a b Figure 29 : Ratios narG/ADNr 16S par type de sol B : Sol brun (N = 72) ; C : Sol brun faiblement lessivé (N = 20) ; A : Autres sols (N = 13) RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 45 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.5 Paramètres microbiologiques et année de prélèvement L’étude de la variabilité interannuelle a été appréhendée par un test de MannWhitney réalisé uniquement sur les systèmes prairiaux (N= 45) dont 22 sites ont été réalisé en 2006 et 23 sites en 2007. Les résultats montrent qu’il n’y a pas de différences significatives entre les prairies échantillonnés en 2006 et celle en 2007 pour les paramètres de biomasse microbienne (Figure 30.a) et le ratio et pcaH/ADNr 16S. En revanche, pour l’ADNr 16S (Figure 30.b), narG (Figure 30.c), pcaH et le ratio narG/ADNr 16S, des différences significatives existent entre les valeurs des deux années en milieu prairial (Tableau 8). Tableau 8 : Résultats des tests de Mann-Whitney par année pour les sites prairiaux MOV MOV%Ct 16S narG PcaH narG_16S PcaH_16S U 212,000 269,000 412,000 493,000 408,000 348,500 214,000 a) Significatif Non Non Oui Oui Oui Oui Non b) 30000 600000 1200 25000 500000 800 600 400 200 20000 400000 narG ADNr 16S 1000 0 c) 700000 1400 Biomasse microbienne (MOV) p-value 0,358 0,725 0,000 < 0,0001 0,000 0,031 0,382 300000 200000 10000 100000 5000 0 2006 15000 2007 2006 2007 0 2006 2007 Figure 30 : Paramètres microbiologiques par année en système prairial a) Biomasse microbienne (MOV) ; b) ADNr 16S ; c) narG ; N = 45 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 46 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.1.6 Paramètres microbiologiques et humidité des sols L’humidité du sol des échantillons RMQS BioDiv a été mesurée par l’équipe de Montpellier. Pour identifier un lien entre l’humidité du sol et les paramètres microbiologiques des tests de corrélation (Spearman) ont été effectués. Une corrélation significative (R = 5,17 ; p <0,0001 ; r² = 0,267) existe entre les valeurs de biomasse microbienne (MOV) et le pourcentage d’humidité des échantillons. Ce dernier est lié à la teneur en argile et secondairement à la matière organique, ces deux paramètres influençant positivement le niveau de biomasse microbienne (Figure 31). 2000 MOV (mg C.kg-1 de sol) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 40 50 60 % d'humidité Figure 31 : Biomasse microbienne en fonction de l’humidité des échantillons sur les sites RMQS BioDiv A l’inverse, lorsqu’il s’agit de la MOV exprimé en pourcentage de carbone total il n’y a pas de corrélation significative. De la même manière, les paramètres issus de la qPCR (ADNr 16S, narG, pcaH) et les ratios (narG/16S et pcaH/16S) qui en découlent ne présentent pas de corrélations significatives avec le pourcentage d’humidité des échantillons. RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 47 3. Données microbiologiques et variables explicatives RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 48 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.2 Structure génétique des communautés bactérienne en lien avec les variables explicatives 3.2.1 Données B-ARISA et paramètres physico-chimiques La mise en évidence de liens entre les paramètres physico-chimiques et les données B-ARISA des sites RMQS BioDiv est appréhendée par l’analyse de co-inertie. Cette analyse permet de mettre en évidence l’existence de co-structure entre deux jeux de données. Dans ce cas, aucune co-structure avec les paramètres physico-chimiques n’a pu être mise en évidence. 3.2.2 Données B-ARISA et année de prélèvement Les années de prélèvement des sites RMQS BioDiv ont d = 0.1 été représentées sur le plan factoriel de l’ACP des données B-ARISA (cf : 1.3). Sur l’axe 1, une opposition très distincte entre les deux années 2006 et 2007 est observée (Figure 32). Ceci sous entend génétique que des la structure 2006 2007 communautés bactérienne présentent une variabilité inter annuelle. Cette variabilité interannuelle peut être d’origine climatique ou méthodologique. Figure 32 : Plan factoriel (1-2) des sites de l’ACP sur les bandes B-ARISA par année de prélèvement RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 49 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.2.3 Données B-ARISA et « système d’occupation des sols » Les trois systèmes (Culture, Praire, Forêt) sont illustrés sur le plan factoriel de l’ACP des données B-ARISA (Figure 33). Lorsque les trois systèmes sont représentés seuls, les ellipses se recouvrent largement. En revanche, lorsque l’information est dissociée entre les deux années, un gradient entre les sites cultivés, prairiaux puis forestiers se distingue sur l’axe 2 représentant 13,64 % de la variance. d = 0.1 d = 0.1 AA/M C MAA P AA Mp autre F F d = 0.1 06C 06P 07C 07P 06F 07F Figure 33 : Plan factoriel (1-2) des sites en fonction de l’occupation des sols RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 50 3. Données microbiologiques et variables explicatives 3.2.4 Données B-ARISA et pratiques agricoles d = 0.1 d = 0.1 Forg mixte non_pailleux min+org pailleux Fmin rien pas_ferti d = 0.1 1 2 3 0 d = 0.1 phyto pas_phyto Figure 34 : Plan factoriel (1-2) des sites en fonction des pratiques agricoles RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 51 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 52 SYNTHESE Biomasse microbienne (MOV et MOV%Ct) : ¾ Les valeurs de biomasse microbienne ne montrent pas de structuration spatiale à l’échelle régionale. Ceci montre que d’autres facteurs, liés au sol et à son utilisation, ont une importance majeure. ¾ La comparaison des résultats obtenus sur les échantillons prélevés au printemps 2006 et au printemps 2007 ne met pas en évidence de variabilité interannuelle. Ceci indique que le niveau de biomasse microbienne est moins sensible à une éventuelle variabilité climatique interannuelle qu’à des facteurs plus « permanents » comme le type de sol et son utilisation (système de culture, pratiques culturales). ¾ L’expression de la biomasse microbienne en valeurs relatives (MOV%Ct) discrimine très bien les trois systèmes d’occupation des sols ¾ Des corrélations intéressantes sont mises en évidence entre la biomasse microbienne et certains paramètres physico-chimiques. Par exemple, la corrélation négative avec le Phosphore assimilable est à mettre en relation avec un gradient d’intensification agricole entre les sols naturels, les prairies, les cultures. La corrélation positive avec l’humidité des sols est probablement une fonction indirecte de propriétés des sols (texture, teneur en matière organique, etc.). Abondance relative de la communauté bactérienne (qPCR ADNr 16S) : ¾ L’abondance relative du gène ADNr 16S montre, comme les autres approches basées sur l’extraction directe de l’ADN, une nette variabilité interannuelle. Bien que l’on ne puisse exclure totalement un effet de la climatologie, il est très probable que cette variabilité soit en réalité d’origine méthodologique : l’ADN des échantillons traités en 2007 a été purifié avec un lot de PVPP différent de celui de 2006 et il a été observé par ailleurs que ce changement pouvait affecter RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie les résultats. 53 Synthèse ¾ En termes de systèmes d’occupation des sols, ce paramètre discrimine les prairies des cultures. On n’observe pas, en revanche, de corrélations avec des paramètres physico-chimiques du sol. Le Phosphore assimilable est le seul paramètre pour lequel une tendance se dessine. Abondance relative des communautés bactériennes fonctionnelles (narG et pcaH) : ¾ Les gènes marqueurs d’activité fonctionnelle (narG et pcaH) ne montrent pas de structuration spatiale à l’échelle régionale. ¾ Comme pour les gènes ADNr 16S, on observe une nette variabilité interannuelle. Comme évoqué précédemment, cette variabilité est plus probablement d’origine méthodologique et en lien avec la purification de l’ADN extrait du sol. ¾ L’abondance relative (en nombre de copies par ng d’ADN) des gènes narG et pcaH permet de discriminer les systèmes d’occupation des sols (prairies, cultures), alors que ce n’est pas le cas des ratios narG/ADNr16S et pcaH/ADNr16S. ¾ En ce qui concerne les paramètres physico-chimiques, la seule corrélation significative est celle observée entre le ratio narG/ADNr16S et l’aluminium échangeable. La relation négative entre ces deux paramètres est logique dans la mesure où il y a généralement peu de nitrates les sols très acides (dans lesquels on peut trouver de l’aluminium échangeable). Structure génétique de la communauté bactérienne globale (B-ARISA) : ¾ Comme les paramètres précédents, basés sur une extraction directe de l’ADN du sol, on observe pour les B-ARISA une très forte variabilité interannuelle dont on a vu qu’elle est très probablement d’origine méthodologique (lots de PVPP). ¾ Pour une année donnée, les B-ARISA discriminent assez bien les systèmes d’occupation des sols (prairies, cultures, forêts). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 54 Synthèse ¾ En revanche, les matrices de co-inertie ne mettent pas en évidence de relations claires avec les paramètres physico-chimiques des sols. Il possible que ces derniers aient moins de poids que les cultures (plantes) sur la structure des populations bactériennes (effet rhizosphère et nature biochimique des rhizodépositions). RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 55 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 56 Table des illustrations Figure 1 : Groupes biologiques étudiés et équipes partenaires associées du programme RMQS BioDiv............... 2 Figure 2 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données de MOV ........ 10 Figure 3 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données de MOV%Ct . 11 Figure 4 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données qPCR ADNr 16S ........................................................................................................................................................... 13 Figure 5 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) de l’abondance des séquences narG dans l’ADN du sol .................................................................. 15 Figure 6 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) du ratio narG/16S .............. 16 Figure 7 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) des données qPCR pcaH .. 17 Figure 8 : Statistiques descriptives (a), boîtes à moustaches (b) et histogramme (c) du ratio pcaH/16S .............. 18 Figure 9 : Plan factoriel (1-2) de l’ACP sur la matrice de covariance des données B-ARISA................................ 20 Figure 10 : Nuages de points des corrélations les plus significatives entre paramètres microbiologiques ............ 22 Figure 11 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de la biomasse microbienne (MOV%Ct) ............................... 24 Figure 12 : Carte de la biomasse microbienne ...................................................................................................... 25 Figure 13 : Carte de la biomasse microbienne (exprimée en pourcentage du carbone total)................................ 25 Figure 14 : Carte du nombre de copies de l’ADNr 16 S par ng d’ADN du sol........................................................ 26 Figure 15 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de pcaH................................................................................. 27 Figure 16 : Carte du nombre de copies de narG par ng d’ADN du sol (a) et du ratio narG/ADNr 16S (b)............. 28 Figure 17 : Carte du nombre de copies de pcaH par ng d’ADN de sol (a) et du ratio pcaH/ADNr 16S (b) ............ 29 Figure 18 : Corrélations significatives entre biomasse microbienne et paramètres physico-chimiques................. 31 Figure 19 : Corrélations significatives entre biomasse microbienne rapportée au carbone total et paramètres physico-chimiques .......................................................................................................... 32 Figure 20 : Corrélations significatives entre paramètres « qPCR » et paramètres physico-chimiques.................. 33 Figure 21 : Paramètres microbiologiques par occupation du sol (niveau 1) .......................................................... 35 Figure 22 : Paramètres microbiologiques par occupation du sol (niveau 2) .......................................................... 37 Figure 23 : Biomasse microbienne par type de fertilisation ................................................................................... 38 Figure 24 : Paramètres microbiologiques par type d’amendement et de fertilisation organique............................ 40 Figure 25 : Biomasse microbienne par type de travail du sol ................................................................................ 41 Figure 26 : Biomasse microbienne par gestion phytosanitaire .............................................................................. 41 Figure 27 : Ratio pcaH/ADNr 16S par matériau parental....................................................................................... 44 Figure 28 : Biomasse microbienne (MOV%Ct) par classe d’hydromorphie ........................................................... 44 Figure 29 : Ratios narG/ADNr 16S par type de sol................................................................................................ 45 Figure 30 : Paramètres microbiologiques par année en système prairial .............................................................. 46 Figure 31 : Biomasse microbienne en fonction de l’humidité des échantillons sur les sites RMQS BioDiv ........... 47 Figure 32 : Plan factoriel (1-2) des sites de l’ACP sur les bandes B-ARISA par année de prélèvement ............... 49 Figure 33 : Plan factoriel (1-2) des sites en fonction de l’occupation des sols....................................................... 50 Figure 34 : Plan factoriel (1-2) des sites en fonction des pratiques agricoles ........................................................ 51 Tableau 1 : Matrice de corrélation de Spearman entre les paramètres microbiologiques (N=109) ....................... 22 Tableau 2 : R, p value et R² des corrélations les plus significatives ...................................................................... 22 Tableau 3 : Synthèse des résultats géostatistiques pour les paramètres microbiologiques. ................................. 23 Tableau 4 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis par système d’occupation des sols (1er niveau) ..................... 34 Tableau 5 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis par système d’occupation des sols (2ème niveau) ................. 36 Tableau 6 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis et Mann-Whitney avec les variables de pratiques agricoles ... 39 Tableau 7 : Résultats des tests de Kruskal-Wallis avec les variables pédologiques ............................................. 43 Tableau 8 : Résultats des tests de Mann-Whitney par année pour les sites prairiaux........................................... 46 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 57 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 58 Bibliographie 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Résultats des analyses géostatistiques RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 61 Annexe I : Conditions de normalité Tableau : Condition de normalité des paramètres microbiologiques Paramètres microbiologiques Transformation des données Nombre de sites restants Sites écartés box-cox (λ = 0,01) 104 719, 603, 664, 427, 671 box-cox (λ = 0,01) 108 713 narG/16S box-cox (λ = 0,267) 107 665 et 656 pcaH box-cox (λ = 0,42) 109 pcaH/16S box-cox (λ = 0,357) 106 MOV MOV%Ct ADNr 16 S narG RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 656, 421 et 665 62 Annexe II : Résultats des analyses géostatistiques II.1 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de la biomasse microbienne (MOV) b) 0.8 0.4 0.6 semivariance -0.2 -0.3 -0.6 0.0 -0.5 0.2 -0.4 Moran I statistic -0.1 1.0 0.0 1.2 a) 20000 60000 100000 140000 180000 220000 260000 0 50000 distance classes 100000 150000 200000 250000 distance II.2 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de la biomasse microbienne rapporté au carbone total (MOV%Ct) b) 0.8 0.6 0.4 semivariance 0.0 0.0 -0.2 0.2 -0.1 Moran I statistic 0.1 1.0 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 distance classes RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 0 50000 100000 150000 200000 250000 distance 63 II.3 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) du ratio narG/16S b) 0.4 0.0 -0.6 0.1 0.2 0.3 semivariance -0.4 -0.2 Moran I statistic 0.0 0.5 0.6 0.2 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 0 50000 100000 distance classes 150000 200000 250000 distance II.4 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) de pcaH b) 1500 1000 semivariance -0.1 -0.2 0 -0.4 500 -0.3 Moran I statistic 0.0 2000 0.1 2500 0.2 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 distance classes RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 0 50000 100000 150000 200000 250000 distance 64 II.5 : Corrélogramme (a) et variogramme (b) du ratio pcaH/16S 0.05 b) 0.1 0.2 semivariance -0.10 -0.15 -0.20 0.0 -0.30 -0.25 Moran I statistic -0.05 0.3 0.00 a) 20000 60000 100000 160000 220000 280000 distance classes RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie 0 50000 100000 150000 200000 250000 distance 65 RMQS BioDiv Bretagne – Vol 3 - Tome 3 : Microbiologie View publication stats 66