LIVRO SOBRE ANÁLISE DE ALIMENTOS

1ª Edição Digital Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital SES - CCD -IAL Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças Instituto Adolfo Lutz © 2008 Edições anteriores 1ª edição – 1967 Coordenação: Ariosto Büller Souto Mário Sampaio Mello 2ª edição –1976 Coordenação: A. B. Walkyria H. Lara Germínio Nazário Maria Eliza Wohlers de Almeida Waldomiro Pregnolatto 3ª edição – 1985 Coordenação: Waldomiro Pregnolatto Neus Sadocco Pascuet 4ª edição – 2005 Coordenação: Odair Zenebon Neus Sadocco Pascuet Instituto Adolfo Lutz (São Paulo). Métodos físico-químicos para análise de alimentos /coordenadores Odair Zenebon, Neus Sadocco Pascuet e Paulo Tiglea -- São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008 p. 1020 versão eletrônica 1. Análise de alimentos de saúde pública SES/CCD/CD 12/08 II - IAL 2. Alimentos / métodos 3. Serviços laboratoriais CDD 614.028 NLM QU50 1ª Edição Digital Coordenadores Odair Zenebon Neus Sadocco Pascuet Paulo Tiglea IV edição 1ª Edição Digital São Paulo, 2008 IAL - III Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Agradecemos a todos os técnicos que colaboraram nas edições anteriores, desenvolvendo alguns dos métodos contantes desta edição. Nosso especial agradecimento a: Alex Sandro P. Oliveira − Diagramação Carlos Adalberto de Camargo Sannazzaro - Diretor Geral do Instituto Adolfo Lutz Célia Maria Pompeo Mome − Ilustrações nos métodos Cristiano Correa de Azevedo Marques - Apoio Institucional Fernanda L. Machado − Digitação, revisão editorial, colaboração e bom humor Galdino Guttmann Bicho - pelo apoio incondicional na publicação e divulgação Iris Cristina de Moura − Revisão editorial Laurita Silveira de Brum − Revisão editorial Maria Auxiliadora Chaves − Apoio logístico Núcleo de Saúde Ocupacional e Biossegurança − Apoio logístico Rafael Pascuet − Criação da capa e projeto gráfico 1ª Ed. Digital - 2008 Núcleo de Informação e Tecnologia - NIT /IAL Paulo Padilha, Mario Medeiro, Valdevi Duarte, Ernesto Figueiredo, Patricia Abreu, Claudio Zenebon IV - IAL IAL - V Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital VI - IAL APRESENTAÇÃO “A saúde é direito de todos e dever do Estado, garantido mediante políticas sociais e econômicas que visem à redução do risco de doença e de outros agravos e ao acesso universal e igualitário às ações e serviços para sua promoção, proteção e recuperação.” A presentar uma obra de tamanho vulto é, sem sombra de dúvida, uma grande responsabilidade e um imenso prazer. Principalmente por se tratar de uma obra iniciada em 1967 e que desde seu lançamento teve todos os seus exemplares esgotados rapidamente, dado o interesse que desperta em profissionais da indústria, estudantes e profissionais de saúde pública do Brasil e de outros países da América Latina. Esta Obra é o resultado da evolução e avanços científicos e tecnológicos, que refletem na elaboração de novos métodos Analíticos, personificando os esforços e dedicação dos pesquisadores e técnicos da Divisão de Bromatologia e Química, elaborada sobre a coordenação do Dr. Odair Zenebon, Neus Sodocco Pascuet e Paulo Tiglea. Com todos os avanços científicos e tecnológicos, também não poderia deixar de ser incorporado o modelo de publicação desta edição, agora na sua versão digital, disponível gratuitamente no site do Instituto Adolfo Lutz, no momento que comemoramos os 20 anos da criação do Sistema Único de Saúde - SUS. São Paulo, 28 de outubro de 2008. Marta Lopes Salomão Diretora Geral do IAL IAL - VII Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital VIII - IAL INTRODUÇÃO análise bromatológica, dentro do contexto da química analítica aplicada, desempenha importante papel avaliador da qualidade e segurança dos alimentos. Em determinados momentos, a sua utilização torna-se decisiva para equacionar e resolver problemas de saúde pública e também para definir e complementar ações de vigilância sanitária. Atua, também, como coadjuvante nas inovações tecnológicas de alimentos. Devido à complexidade da sua constituição orgânica, os alimentos muitas vezes são considerados matrizes difíceis de serem manipuladas; o analista deverá estar devidamente treinado, e somente a experiência apreendida ao longo dos anos poderá fornecer segurança analítica. Dentre os requisitos essenciais para evidenciar a qualidade de um trabalho laboratorial e fornecer confiabilidade aos resultados emitidos, a escolha adequada de metodologia analítica é, sem dúvida nenhuma, de grande relevância. De nada adianta um laboratório dispor de instalação e equipamentos de ponta, se o método analítico selecionado não for apropriado. A Em razão dos avanços tecnológicos na ciência dos alimentos, tanto nos aspectos toxicológico como de identidade e qualidade, tornam-se imperativas a necessidade da modernização e a contínua atualização dos métodos analíticos. Novas técnicas instrumentais, baseadas em determinados princípios físicos e químicos, freqüentemente são desenvolvidas, assim como, também, a utilização da biologia molecular, para cada vez mais quantificar analitos em concentrações muito baixas. São inúmeros, na literatura científica corrente, os métodos de imunoensaios para detectar e quantificar níveis de contaminantes químicos e avaliar a autenticidade de alimentos. Muitas vezes, o laboratório fica incapacitado para acompanhar tão brusca modernidade. Há necessidade da disposição de métodos alternativos de análises, quando possível, que estejam ao alcance da maioria dos laboratórios, notadamente, os de saúde pública. Nem sempre o método que faz uso do equipamento sofisticado e dispendioso é o mais adequado; às vezes, dependendo do analito e da sua concentração em um dado alimento, a utilização de metodologia tradicional e de baixo custo torna-se mais eficiente. Por exemplo, os métodos volumétricos e espectrofotométricos na região do UV/VIS não devem ser considerados obsoletos e ultrapassados. Em face à grande dinâmica na atualização da legislação de alimentos no Brasil, principalmente nos últimos anos, e à luz dos novos conhecimentos científicos mundiais, torna-se IAL - IX Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital inevitável a adequação de metodologia analítica para que os laboratórios possam cumprir as novas exigências legais. Como, por exemplo, no caso da Portaria nº 518 de 25/03/04, sobre potabilidade de água para consumo humano, onde as análises de alguns novos parâmetros de verdadeiro significado para a saúde pública devem ser atendidas. Nos últimos anos, foram publicadas várias resoluções e Decretos a respeito de alimentos, tanto no Ministério da Agricultura como no da Saúde. O objetivo primordial do livro de métodos analíticos, elaborado pelo Instituto Adolfo Lutz, desde as três edições passadas, sempre foi o de fornecer aos analistas de alimentos metodologia físico-química testada, de confiabilidade e de fácil acesso à maioria dos laboratórios. Isto resultou do fruto de trabalho e da tradição do Instituto em análise de alimentos, um dos laboratórios pioneiros, na América Latina, nesta modalidade analítica. São metodologias amplamente testadas e referendadas e com muitas adequações que emergiram, ao longo dos anos, da vivência do seu corpo técnico. Nesse aspecto, ressaltamos os trabalhos pioneiros de seus dignos mestres, desde o Laboratório de Análises Bromatológicas, criado em 1892, passando pela criação do Instituto Adolfo Lutz, em 1940, até a presente data. Tantos foram os colaboradores, que não vamos mencionar nomes para não incorrer em nenhum esquecimento. A idéia da publicação do livro foi elaborar um compêndio de métodos físico-químicos implantados e amplamente testados pelo IAL, tornando possível a sua utilização pela rede de laboratórios de saúde pública. A IV edição deste livro, agora publicada, inclui métodos tradicionais que ainda são eficientes e adequados para análise de alimentos, substituição daqueles considerados obsoletos e a implantação de métodos para atender às novas exigências legais quanto à qualidade e segurança de alimentos. Por exemplo, análises de fibra alimentar, gorduras saturadas e sódio como exigência obrigatória da rotulagem nutricional. A adição de métodos de determinação de outras micotoxinas, além das aflatoxinas que constavam da edição anterior, de embalagens para alimentos, de bebidas, de água potável, entre outras, visam a atender aos desafios da legislação resultante do Mercosul e internalizadas em nosso país. O método para a determinação de histamina em pescados também foi introduzido por exigência legal. Alguns capítulos da edição anterior foram fundidos por se tratarem de produtos semelhantes. Os métodos alternativos apresentados têm o objetivo de oferecer aos analistas a possibilidade de escolha dos que mais se adaptem às condições de seus laboratórios; X - IAL às vezes mais trabalhosos, mas de precisão e exatidão equivalentes aos métodos que utilizam equipamentos sofisticados; por exemplo, os colorimétricos para a determinação de ferro e cobre, respectivamente, em água e aguardente; os volumétricos, como, para a determinação de cálcio, como alternativas opcionais viáveis aos laboratórios que não dispõem de espectrômetro de absorção atômica. A determinação de fósforo em alimentos, em substituição ao método com ICP OES, poderá ser efetuada por técnica colorimétrica. Da mesma maneira, a determinação de colesterol em produtos alimentícios com ovos, em substituição ao método Cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE. Neste livro apresentamos, como novidade em relação à edição anterior, um capítulo de análise de elementos traços (nutrientes inorgânicos) em alimentos. O Laboratório de Alimentos, como qualquer outro que realiza análises físicoquímicas, para configurar a confiabilidade de seus resultados, deverá estar engajado em Programas de Garantia da Qualidade, envolvendo o controle de qualidade analítica e também a biossegurança. Levando-se em conta que os critérios para seleção e escolha de uma determinada metodologia analítica estão dentro da contextualização da qualidade laboratorial, achamos por bem fazer constar neste livro um capítulo sobre a qualidade. A conscientização sobre biossegurança, felizmente, está cada vez mais incorporada nas atividades dos laboratórios analíticos; neste escopo, o nosso objetivo foi o de apresentar os conceitos básicos de segurança no laboratório, tais como cuidados na manipulação e descarte de reagentes químicos, principais providências em casos de acidentes com produtos químicos, entre outros. Finalizando e com o propósito de brindar os 20 anos da implantação do SUS, comemorado neste ano, estamos disponibilizando, gratuitamente, na página eletrônica do Instituto Adolfo Lutz, a IV edição revisada deste livro para que toda comunidade interessada em análise bromatológica possa ter acesso a esta importante obra. Odair Zenebon IAL - XI Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital XII - IAL Sumário SUMÁRIO SUMÁRIO CAPÍTULO I GESTÃO DA QUALIDADE LABORATORIAL................................... . .33-62 Apresentação ................................................................................................................................................ 35 Introdução .................................................................................................................... ............. ..............39 Siglas, Sites e Definições ............................................................................................................................... 40 Implantação do Sistema da Qualidade .......................................................................................................... 51 Motivação ................................................................................................................................................... 51 Capacitação .................................................................................................................................................. 52 Pessoal .......................................................................................................................................................... 55 Elaboração dos Documentos da Qualidade................................................................................................... 55 Controle dos Documentos ........................................................................................................................... 56 Treinamento nos documentos da qualidade .................................................................................................. 57 Preparação das unidades organizacionais ....................................................................................... .............. 57 Controle de acesso ........................................................................................................................................ 58 Calibração, controle e manutenção de equipamentos.................................................................................... 58 Apresentação dos resultados...................................................................................................................... ....59 Auditorias internas ....................................................................................................................................... 59 Critérios para qualificação de auditores internos ........................................................................................... 60 Garantia da qualidade dos resultados de ensaio ............................................................................................. 60 Análise crítica pela alta administração ........................................................................................................... 61 Referências bibliográficas .............................................................................................................................. 62 CAPÍTULO II GENERALIDADES................................................................................ .63-72 Grandezas, unidades e símbolos ................................................................................................................... 65 Fatores, prefixos e símbolos .......................................................................................................................... 66 Tabela periódica dos elementos..................................................................................................................... 66 Características de concentração de alguns reagentes ...................................................................................... 70 Siglas ............................................................................................................................................................ 71 Referências bibliográficas .............................................................................................................................. 72 CAPÍTULO III COLHEITA DE AMOSTRAS................................................................ .73-82 Amostragem para análise fiscal e de controle ................................................................................................. 76 Acondicionamento ....................................................................................................................................... 76 Lacração ....................................................................................................................................................... 77 Rotulagem .................................................................................................................................................... 77 Transporte .................................................................................................................................................... 77 Termo de colheita ......................................................................................................................................... 77 Colheita de amostras de produtos não homogêneos em grandes estoques ..................................................... 78 Conduta para obtenção da amostra de produtos pré-embalados.................................................................... 79 Colheita de água para determinações físico-químicas gerais .......................................................................... 80 Colheita e preservação de amostra de água para a determinação de metais totais ........................................... 80 IAL - XIII Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Colheita e preservação de amostra de água para a determinação de solventes orgânicos................................. 81 Colheita e preservação de amostra de água para determinação de agrotóxicos ............................................... 81 Referências bibliográficas .............................................................................................................................. 81 CAPÍTULO IV PROCEDIMENTOS E DETERMINAÇÕES GERAIS...................... . .83-158 Pré-tratamento da amostra ........................................................................................................................... 85 Inspeção da amostra ..................................................................................................................................... 85 Preparo da amostra para análise .................................................................................................................... 86 001/IV Determinação de espaço livre – Recipiente de forma regular ............................................................ 86 002/IV Determinação de espaço livre – Recipiente de forma irregular .......................................................... 87 003/IV Sólidos drenados em relação ao peso total ........................................................................................ 88 004/IV Reação para gás sulfídrico – Prova de Éber ....................................................................................... 88 005/IV Reação para amônia – Prova de Éber ............................................................................................... 90 006/IV Ponto de fusão – Substâncias facilmente reduzíveis a pó ................................................................... 91 007/IV Ponto de fusão – Substâncias não facilmente reduzíveis a pó ............................................................ 92 008/IV Ponto de fusão com aparelho elétrico .............................................................................................. 93 009/IV Ponto de congelamento .................................................................................................................... 93 010/IV Índice de refração....................................................................................................... ................ ......94 011/IV Densidade ....................................................................................................................................... 97 012/IV Perda por dessecação (umidade) – Secagem direta em estufa a 105ºC............................................... 98 013/IV Perda por dessecação (umidade) – Secagem em estufa a vácuo .......................................................... 99 014/IV Perda por dessecação (umidade) – Determinação pelo método Karl Fischer ..................................... 99 015/IV Resíduo Seco .................................................................................................................................. 102 016/IV Acidez ............................................................................................................................................ 103 017/IV Determinação eletrométrica do pH ............................................................................................... 104 018/IV Resíduo por incineração – Cinzas................................................................................................... 105 019/IV Cinzas sulfatizadas ......................................................................................................................... 106 020/IV Cinzas insolúveis em água .............................................................................................................. 107 021/IV Cinzas solúveis em água ................................................................................................................. 108 022/IV Alcalinidade das cinzas insolúveis em água ..................................................................................... 108 023/IV Alcalinidade das cinzas solúveis em água ........................................................................................ 109 024/IV Cinzas insolúveis em ácido clorídrico a 10% v/v ............................................................................ 109 025/IV Cinzas solúveis em ácido clorídrico a 10% v/v ............................................................................... 110 026/IV Sulfatos pelo método gravimétrico ................................................................................................. 110 027/IV Sulfatos por titulação com EDTA .................................................................................................. 111 028/IV Cloretos por volumetria ................................................................................................................. 112 029/IV Cloretos por potenciometria .......................................................................................................... 114 030/IV Fosfatos por titulação ..................................................................................................................... 114 031/IV Fosfatos por espectrofotometria...................................................................................................... 115 Lipídios ..................................................................................................................................................... 116 032/IV Lipídios ou extrato etéreo – Extração direta em Soxhlet ................................................................. 117 033/IV Lipídios ou extrato etéreo com hidrólise ácida prévia – Método A .................................................. 118 034/IV Lipídios ou extrato etéreo com hidrólise ácida prévia – Método B .................................................. 119 035/IV Extrato alcoólico ........................................................................................................................... 121 Protídios .................................................................................................................................................... 122 036/IV Protídios – Método de Kjeldahl clássico ......................................................................................... 123 037/IV Protídios – Método de Kjeldahl modificado ................................................................................... 124 Glicídios .................................................................................................................................................... 125 XIV - IAL Sumário 038/IV Glicídios redutores em glicose ........................................................................................................ 126 039/IV Glicídios não-redutores em sacarose .............................................................................................. 127 040/IV Glicídios totais em glicose .............................................................................................................. 129 041/IV Glicídios por cromatografia descendente em papel – Prova qualitativa ........................................... 130 042/IV Glicídios por cromatografia circular em papel - Prova qualitativa ................................................... 132 043/IV Amido ........................................................................................................................................... 133 Fibras ........................................................................................................................................................ 135 044/IV Fibra bruta ..................................................................................................................................... 136 045/IV Fibra alimentar total – Método enzimático-gravimétrico ................................................................ 137 046/IV Fibra alimentar solúvel e insolúvel – Método enzimático-gravimétrico .......................................... 139 047/IV Pectinas – Prova qualitativa ............................................................................................................ 140 048/IV Pectinas – Determinação por gravimetria ....................................................................................... 140 049/IV Dióxido de enxofre – Prova qualitativa ........................................................................................... 142 050/IV Dióxido de enxofre – Método quantitativo de Monier-Williams............. ............. ..........................143 051/IV Corantes artificiais orgânicos – Prova qualitativa ........................................................................... 144 052/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa ............................................................................ 146 053IV Determinação da composição de ácidos graxos saturados e insaturados por cromatografia em fase gasosa ....................................................................................................................................................... 148 054/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 1 .......................................................... 154 055/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 2 .......................................................... 156 056/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 3 .......................................................... 157 057/IV Pesquisa de compostos voláteis por cromatografia em fase gasosa com detector de massas e técnica de headspace................................... ............................................................... .....................158 CAPÍTULO V ADITIVOS...... .....................................................................................161-278 Aditivos ...................................................................................................................................................... 163 Acidulantes/Reguladores de acidez.............................................................................................................. 164 Antioxidantes ............................................................................................................................................. 164 Aromatizantes ............................................................................................................................................ 164 Conservadores ............................................................................................................................................ 164 Corantes ..................................................................................................................................................... 165 Edulcorantes .............................................................................................................................................. 165 Gomas........................................................................................................................................................ 165 Espessantes ................................................................................................................................................. 165 Geleificantes ............................................................................................................................................... 165 Estabilizantes .............................................................................................................................................. 166 Emulsificantes ............................................................................................................................................ 166 058/IV Acidulantes – Identificação de ácido cítrico, láctico e tartárico por cromatografia em papel ............ 166 059/IV Acidulantes – Identificação de ácido cítrico .................................................................................... 167 060/IV Acidulantes – Quantificação de ácido cítrico .................................................................................. 168 061/IV Antioxidantes – Titulação de ácido ascórbico e isômeros com solução de iodo ............................... 169 062/IV Antioxidantes – Determinação de ácido ascórbico e isômeros pelo método de Tillman´s................ 170 063/IV Antioxidantes – Titulação de ácido ascórbico e isômeros com solução de iodo na presença de polissorbato 80 ........................................................................................................................................... 171 064/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico por redução da solução de Fehling ..................... 172 065/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico por redução de solução de Tillmans ................... 173 066/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico pela reação com bicarbonato de sódio e sulfato ferroso ............................................................................................................................................ 174 IAL - XV Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 067/IV Antioxidantes – Determinação de butil-hidroxianisol (BHA) ......................................................... 174 068/IV Antioxidantes – Identificação de butil-hidroxianisol (BHA) ........................................................... 176 069/IV Antioxidantes – Determinação de butil hidroxitolueno (BHT) ...................................................... 177 070/IV Antioxidantes – Identificação de butil hidroxitolueno (BHT) ........................................................ 178 071/IV Antioxidantes – Identificação de galatos ......................................................................................... 179 072/IV Aromatizantes – Identificação e quantificação ................................................................................ 180 073/IV Aromatizantes – Teor alcoólico a 20°C ........................................................................................... 181 074/IV Aromatizantes – Identificação de óleos essenciais............................................................................ 181 075/IV Aromatizantes – Quantificação dos óleos essenciais ........................................................................ 182 076/IV Aromatizantes – Rotação óptica a 20°C.......................................................................................... 183 077/IV Aromatizantes – Índice de refração a 20°C ..................................................................................... 183 078/IV Aromatizantes – Densidade relativa a (20/20)°C ............................................................................ 184 079/IV Aromatizantes – Vanilina e correlatos ............................................................................................ 185 080/IV Conservadores – Determinação espectrofotométrica simultânea de nitrito e nitrato ...................... 186 081/IV Conservadores – Determinação de nitrato após redução em coluna de cádmio e de nitrito ........... 187 082/IV Conservadores – Determinação de propionatos.............................................................................. 188 083/IV Conservadores – Identificação de ácido sórbico e sorbatos .............................................................. 189 084/IV Conservadores – Determinação de ácido sórbico e sorbatos por espectrofotometria no UV ........... 191 085/IV Conservadores – Determinação de ácido sórbico e sorbatos por espectrofotometria no visível ............ ................................................................................................................................................................... 192 086/IV Corantes artificiais – Identificação por cromatografia em papel ...................................................... 194 087/IV Corantes artificiais – Identificação por espectrofotometria.............................................................. 196 088/IV Corantes artificiais – Quantificação por espectrofotometria ............................................................ 196 089/IV Corantes artificiais – Quantificação por titulação com cloreto de titânio ........................................ 198 090/IV Corantes artificiais – Determinação de eritrosina por gravimetria ................................................... 201 091/IV Corantes artificiais – Determinação de substâncias insolúveis em água ........................................... 202 092/IV Corantes artificiais – Determinação de substâncias voláteis a 135°C ............................................... 203 093/IV Corantes artificiais – Determinação de sulfatos .............................................................................. 204 094/IV Corantes artificiais – Determinação de cloretos .............................................................................. 205 095/IV Corantes artificiais – Determinação de corantes subsidiários .......................................................... 205 096/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de amarelo crepúsculo e bordeaux S.. 207 097/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de indigotina e bordeaux S .............. 209 098/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina, bordeaux S, indigotina e azul brilhante................................. ....................................................................... ......................210 099/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina, indigotina e azul brilhante......................................................................................................................................... 211 100/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina e amarelo crepúsculo .... 212 101/IV Teobromina e cafeína – Determinação por cromatografia líquida de alta eficiência ......................... 213 102/IV Corantes naturais – Identificação de antocianinas de cascas de uva por espectrofotometria ............. 215 103/IV Corantes naturais – Determinação da intensidade de cor em enocianinas por espectrofotometria.. 216 104/IV Corantes naturais – Identificação de carmim de cochonilha .......................................................... 217 105/IV Corantes naturais – Determinação de ácido carmínico em carmim de cochonilha .......................... 219 106/IV Corantes naturais – Identificação de cúrcuma ................................................................................ 219 107/IV Corantes naturais – Determinação do teor de curcumina na cúrcuma ............................................ 220 108/IV Corantes naturais – Identificação de curcumina ............................................................................ 221 109/IV Corantes naturais – Identificação de curcumina por cromatografia em camada delgada .................. 222 110/IV Corantes naturais – Determinação do teor de curcumina ............................................................... 223 111/IV Corantes naturais – Identificação de urucum lipossolúvel............................................................... 223 XVI - IAL Sumário 112/IV Corantes naturais – Determinação do teor de bixina ...................................................................... 225 113/IV Corantes naturais –Identificação do urucum hidrossolúvel ............................................................. 226 114/IV Corantes naturais – Determinação do teor de norbixina................................................................. 227 115/IV Corantes naturais – Identificação de corante caramelo ................................................................... 228 116/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação da intensidade de cor .................................... 229 117/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação de sólidos ...................................................... 230 118/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação do 4-metilimidazol (MEI) ............................. 231 119/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação da intensidade de cor ......................... 233 120/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação de sólidos ........................................... 234 121/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação do 4-metilimidazol (MEI) .................. 234 122/IV Corantes naturais – Identificação de beta-caroteno ....................................................................... 234 123/IV Carotenóides lipossolúveis (preparações a 30%) – Determinação do teor de beta-caroteno............. 235 124/IV Carotenóides hidromiscíveis (preparações com 10%) – Determinação do teor de beta-caroteno..... 236 125/IV Edulcorantes – Determinação de acesulfame-K por cromatografia líquida de alta eficiência ........... 237 126/IV Edulcorantes – Determinação de aspartame por cromatografia líquida de alta eficiência................. 238 127/IV Edulcorantes – Determinação de ciclamatos................................................................................... 240 128/IV Edulcorantes – Determinação de esteviosídeo por cromatografia líquida de alta eficiência .............. 240 129/IV Edulcorantes – Determinação de polióis (manitol e sorbitol) por cromatografia líquida de alta eficiência ....................................................................................................................................... 242 130/IV Edulcorantes – Determinação de sacarina por cromatografia líquida de alta eficiência .................. 243 131/IV Edulcorantes – Determinação de sucralose por cromatografia líquida de alta eficiência ................. 245 132/IV Espessantes – Extração de gomas em alimentos .............................................................................. 246 133/IV Espessantes – Extração de gomas em formulações de aditivos ......................................................... 247 134/IV Espessantes – Identificação de goma guar ...................................................................................... 247 135/IV Espessantes – Identificação de goma carragena (musgo irlandês) .................................................... 248 136/IV Espessantes – Identificação de goma arábica (acácia) ...................................................................... 249 137/IV Espessantes – Identificação de alginato de sódio ............................................................................. 250 138/IV Espessantes – Identificação de goma Konjak .................................................................................. 251 139/IV Espessantes – Identificação de agar-agar ......................................................................................... 252 140/IV Espessantes – Identificação de goma jataí ....................................................................................... 253 141/IV Espessantes – Identificação de carboximetilcelulose ........................................................................ 253 142/IV Espessantes – Identificação de pectina ............................................................................................ 254 143/IV Espessantes – Identificação de goma xantana .................................................................................. 255 144/IV Estabilizantes – Determinação de fosfatos, em P2O5, por gravimetria ............................................ 256 145/IV Estabilizantes – Determinação de fosfatos, em P2O5, por espectrofotometria ................................. 258 146/IV Estabilizantes – Determinação de fluoretos em fosfatos por potenciometria .................................. 259 147/IV Estabilizantes – Determinação de mono e diglicerídios e glicerol livre ............................................ 262 148/IV Realçador de sabor – Identificação de glutamato de sódio .............................................................. 264 149/IV Identificação de bromatos pelo método direto ................................................................................ 265 150/IV Identificação de bromatos pelo método indireto com o reativo fucsina-bissulfito............................ 266 151/IV Identificação de bromatos por método indireto com fluoresceína .................................................. 267 152/IV Determinação de arsênio em aditivos ............................................................................................. 268 153/IV Determinação de benzo(a)pireno em aromas de fumaça e alimentos defumados .......................... 273 CAPÍTULO VI ANÁLISE SENSORIAL.......................................................................279-320 Análise sensorial.................................................................................................................................. ......281 Visão........................................................................................................................................... ...............281 Olfato........................................................................................................................ ............... .................281 IAL - XVII Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Audição.................................................................................................................... ............... ................. 282 Tato........................................................................................................................... ............... .................282 Gosto......................................................................................................................... ................ ................282 Preparo e apresentação de amostras ......................................................................................................... 283 Formação da equipe sensorial .................................................................................................................. 284 Características sensoriais .......................................................................................................................... 285 154/IV Análise das características sensoriais ............................................................................................... 290 Testes discriminativos ............................................................................................................................... 290 155/IV Testes discriminativos – Teste triangular ........................................................................................ 291 156/IV Testes discriminativos – Teste duo-trio .......................................................................................... 294 157/IV Testes discriminativos – Teste de ordenação ................................................................................... 296 158/IV Testes discriminativos – Teste de comparação pareada ................................................................... 300 159/IV Testes discriminativos – Teste de comparação múltipla .................................................................. 302 160/IV Testes com escalas .......................................................................................................................... 307 Testes sensoriais descritivos ....................................................................................................................... 309 161/IV Testes descritivos – Perfil de sabor ................................................................................................. 310 162/IV Testes descritivos – Perfil de textura ............................................................................................... 311 163/IV Testes descritivos – Análise descritiva quantitativa .......................................................................... 311 Testes afetivos ............................................................................................................................................ 314 164/IV Testes afetivos – Testes de preferência ............................................................................................ 314 165/IV Testes afetivos – Testes de aceitação por escala hedônica ................................................................ 315 166/IV Testes afetivos – Testes de aceitação por escala do ideal ................................... ...................... .........316 167/IV Testes afetivos – Testes de escala de atitude ou de intenção ........................................................... 317 Referências bibliográficas ............................................................................................................................ 318 CAPÍTULO VII AÇÚCARES E PRODUTOS CORRELATOS..................................... 321-343 Açúcares e produtos correlatos .................................................................................................................... 323 168/IV Preparação da amostra de açúcares para análise............................................................................... 325 169/IV Açúcares – Sacarose por desvio polarimétrico direto ....................................................................... 325 170/IV Açúcares – Determinação da cor ICUMSA .................................................................................... 327 171/IV Açúcares – Determinação da umidade por secagem à pressão atmosférica....................................... 329 172/IV Açúcares – Determinação de anidrido sulfuroso pelo método modificado de Monier-Williams ...... 330 173/IV Méis – Determinação da umidade por refratometria ...................................................................... 330 174/IV Méis – Determinação da acidez livre, lactônica e total .................................................................. 332 175/IV Méis – Determinação de hidroximetifurfural ................................................................................ 333 176/IV Méis – Determinação de açúcares redutores pelo método A ........................................................... 335 177/IV Méis – Determinação de açúcares redutores pelo método B ........................................................... 337 178/IV Méis – Determinação de sacarose aparente pelo método A ............................................................ 337 179/IV Méis – Determinação de sacarose aparente pelo método B ............................................................. 338 180/IV Méis – Determinação de sólidos insolúveis em água por gravimetria .............................................. 338 181/IV Méis – Determinação da atividade diastásica .................................................................................. 339 182/IV Méis – Reação de Lund .................................................................................................................. 341 183/IV Méis – Reação de Fiehe .................................................................................................................. 342 184/IV Méis – Reações de Lugol ................................................................................................................ 343 CAPÍTULO VIII ÁGUAS.................................................................................................345-404 Águas ......................................................................................................................................................... 347 XVIII - IAL Sumário 185/IV Determinação de dureza................................................................................................................. 347 186/IV Determinação de dureza de carbonatos e de não carbonatos ........................................................... 349 187/IV Determinação da alcalinidade total por método volumétrico com indicador visual......................... 349 188/IV Determinação de amônia por método potenciométrico .................................................................. 352 189/IV Determinação de amônia por método espectrofotométrico ............................................................ 353 190/IV Determinação de cloreto ............................................................................................................... 355 191/IV Determinação da cor pelo método de comparação óptica por via instrumental .............................. 357 192/IV Determinação de ferro .................................................................................................................. 358 193/IV Determinação de fluoreto pelo método colorimétrico ................................................................... 361 194/IV Determinação de fluoreto pelo método potenciométrico ............................................................... 364 195/IV Determinação de nitrato pelo método espectrofotométrico na região do ultravioleta ..................... 366 196/IV Determinação de nitrato pelo método espectrofotométrico com desenvolvimento de cor .............. 367 197/IV Determinação de nitrIto pelo método espectrofotométrico com desenvolvimento de cor ............... 370 198/IV Determinação de nitrogênio albuminóide ..................................................................................... 372 199/IV Determinação do oxigênio consumido em meio ácido .................................................................. 373 200/IV Determinação de sódio e potássio ................................................................................................. 375 201/IV Determinação do pH ..................................................................................................................... 377 202/IV Determinação de sólidos totais secos a (103-105)°C....................................................................... 379 203/IV Determinação de sólidos dissolvidos, secos a 180°C, pelo método gravimétrico ............................ 381 204/IV Determinação de sólidos dissolvidos, secos a 180°C, pelo método condutivimétrico ..................... 382 205/IV Determinação da turbidez pelo método nefelométrico ................................................................... 383 206/IV Determinação da turbidez pelo método turbidimétrico .................................................................. 385 207/IV Determinação de resíduos de pesticidas e bifenilas policloradas pelo método multrresíduo ........... 386 208/IV Determinação de arsênio total por espectrometria de absorção atômica com gerador de hidretos .. 391 209/IV Determinação de metais totais por espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado ............................................................................................................... 394 210/IV Determinação de metais totais por espectrometria de absorção atômica com chama ...................... 395 211/IV Determinação de mercúrio total por espectrometria de absorção atômica com gerador de vapor frio ..........398 212/IV Determinação de metais totais por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite ............ ................................................................................................................................................................... 400 213/IV Identificação de cianeto – Prova de Pertusi-Gastaldi ....................................................................... 402 214/IV Determinação de sulfatos .............................................................................................................. 402 CAPÍTULO IX ... BEBIDAS ALCOÓLICAS....................................................................405-460 Bebidas alcoólicas ..................................................................................................................................... 407 215/IV Bebidas fermento-destiladas – Densidade relativa a 20ºC/20ºC com picnômetro.......................... 407 216/IV Bebidas fermento-destiladas – Densidade relativa a 20ºC/20ºC com densímetro de leitura direta ...... 408 217/IV Bebidas fermento-destiladas – Álcool em volume a 20ºC ou grau alcoólico real ............................. 409 218/IV Bebidas fermento-destiladas – Extrato seco ou resíduo seco ............................................................ 415 219/IV Bebidas fermento-destiladas – Glicídios totais em sacarose ............................................................. 416 220/IV Bebidas fermento-destiladas – Componentes secundários............................................................... 417 221/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação da acidez total .......................................................... 417 222/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação da acidez fixa ............................................................ 418 223/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de ácidos voláteis por diferença ............................... 419 224/IV Bebidas fermento-destiladas – Ésteres totais .................................................................................. 420 IAL - XIX Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 225/IV Bebidas fermento-destiladas – Aldeídos totais ............................................................................... 421 226/IV Bebidas fermento-destiladas – Furfural........................................................................................... 423 227/IV Bebidas fermento – destiladas – Metanol ....................................................................................... 432 228/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de metanol e componentes secundários .................. 434 229/IV Bebidas fermento – destiladas – Determinação de carbamato de etila ou uretana por cromatografia a gás e detecção por espectrometria de massa .................................................................................. 439 230/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de cobre .................................................................. 440 Bebidas fermentadas.............................................................................................................................. .. 441 231/IV Bebidas fermentadas – Exame preliminar de vinhos ...................................................................... 442 232/IV Bebidas fermentadas – Preparação da amostra de vinhos .............................................................. 442 233/IV Vinhos – Álcool em volume ou grau alcoólico............................................................................... 442 234/IV Vinhos – Álcool em peso............................................................................................................... 443 235/IV Vinhos – Acidez total .................................................................................................................... 444 236/IV Vinhos – Acidez volátil ................................................................................................................. 444 237/IV Vinhos – Acidez fixa...................................................................................................................... 445 238/IV Vinhos – Extrato seco .................................................................................................................. 445 239/IV Bebidas fermentadas – Açúcares redutores em glicose ..................................................................... 449 240/IV Bebidas fermentadas – Açúcares não redutores em sacarose ............................................................ 450 241/IV Bebidas fermentadas – Sulfatos pelo método aproximativo de Marty.............................................. 450 242/IV Bebidas fermentadas – Extrato seco reduzido ................................................................................. 452 243/IV Vinhos – Relação entre álcool em peso e extrato seco reduzido ...................................................... 452 244/IV Bebidas fermentadas – Metanol ..................................................................................................... 452 245/IV Cervejas – Preparação da amostra .................................................................................................. 453 246/IV Cervejas – Álcool em volume a 20ºC .......................................................................................... 453 247/IV Cervejas – Álcool em peso .............................................................................................................. 454 248/IV Cervejas – Extrato real pelo método 1 ........................................................................................... 455 249/IV Cervejas – Extrato real pelo método 2 ........................................................................................... 456 250/IV Cervejas – Extrato aparente ........................................................................................................... 459 251/IV Cervejas – Extrato primitivo ou original......................................................................................... 460 Bebidas alcoólicas por mistura ................................................................................................................. 460 CAPÍTULO X BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS..........................................................461-475 Bebidas não alcoólicas....................................................................................................... ................ .......463 252/IV Determinação de dióxido de carbono em refrigerantes ................................................................... 464 253/IV Determinação de acidez total ........................................................................................................ 464 254/IV Determinação de cafeína por método espectrofotométrico ............................................................. 465 255/IV Determinação de tanino ................................................................................................................ 467 256/IV Determinação de quinina pelo método espectrofotométrico .......................................................... 469 257/IV Determinação de acessulfame K, sacarina e aspartame, ácidos benzóico e sórbico e cafeína por cromatografia líquida de alta eficiência .......................................................................................... 470 258/IV Determinação de ciclohexilsulfamato (sais de ciclamato) em bebidas dietéticas e de baixa caloria pelo método gravimétrico .............................................................................................................. 472 259/IV Determinação do resíduo seco pelo método gravimétrico ............................................................... 473 260/IV Determinação de glicídios redutores em glicose .............................................................................. 473 261/IV Determinação de glicídios não redutores em sacarose ..................................................................... 474 262/IV Corantes orgânicos artificiais – Análise qualitativa......................................................................... 474 CAPÍTULO XI XX - IAL CACAU E CHOCOLATE...................................................................477-483 Sumário Cacau ........................................................................................................................................................ 479 Chocolate e produtos à base de chocolate ................................................................................................. 479 263/IV Determinação de lipídios com hidrólise prévia ............................................................................... 479 264/IV Pesquisa de gorduras estranhas em chocolate .................................................................................. 481 CAPÍTULO XII CAFÉ, CHÁ E DERIVADOS............................................................. .485-498 Café ........................................................................................................................................................... 487 265/IV Café – Extrato aquoso .................................................................................................................... 487 266/IV Café – Determinação de cafeína pelo método espectrofotométrico ................................................. 488 Infusão do café .......................................................................................................................................... 490 267/IV Infusão do café – Determinação do resíduo seco ............................................................................ 490 268/IV Infusão do café – Determinação de cinzas ...................................................................................... 491 269/IV Infusão do café – Determinação de lipídios ................................................................................... 491 270/IV Infusão do café – Determinação de protídios ................................................................................. 491 Café solúvel ............................................................................................................................................... 491 271/IV Café solúvel – Determinação do pH ............................................................................................ 492 272/IV Café solúvel – Determinação de cafeína ...................................................................................... 492 273/IV Café solúvel – Determinação de glicídios redutores e não redutores em glicose ............................. 492 Café solúvel preparado ............................................................................................................................. 496 274/IV Café solúvel preparado – Determinação do resíduo seco................................................................. 496 Chá ............................................................................................................................................................ 496 Infusão do chá ........................................................................................................................................... 497 Mate .......................................................................................................................................................... 497 275/IV Mate – Determinação de cafeína .................................................................................................... 497 Infusão do mate ........................................................................................................................................ 497 Mate solúvel .............................................................................................................................................. 497 Mate solúvel preparado ............................................................................................................................ 498 CAPÍTULO XIII CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS.......................................... .....499-531 Carnes ..................................................................................................................................................... 501 Preparo da amostra ..................................................................................................................................... 502 Características sensoriais ............................................................................................................................. 503 276/IV Prova de cocção .............................................................................................................................. 504 277/IV Prova para sulfito com verde de malaquita...................................................................................... 504 278/IV Prova para nitritos .......................................................................................................................... 505 Produtos cárneos ....................................................................................................................................... 506 279/IV Reação de Kreis .............................................................................................................................. 507 280/IV Prova para formaldeído .................................................................................................................. 508 281/IV Determinação espectrofotométrica de amido.................................................................................. 509 282/IV Determinação espectrofotométrica de hidroxiprolina ..................................................................... 512 283/IV Determinação espectrofotométrica de nitritos ................................................................................ 515 284/IV Determinação espectrofotométrica de nitratos................................................................................ 517 285/IV Determinação de proteínas de soja pelo método ELISA ................................................................. 522 CAPÍTULO XIV EMBALAGENS E EQUIPAMENTOS EM CONTATO COM ALIMENTO................ 533-566 Embalagens e equipamento em contato com alimentos ........................................................................... 535 Terminologia ............................................................................................................................................ 537 IAL - XXI Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 286/IV Embalagens e equipamentos – Classificação dos alimentos ............................................................ 538 287/IV Embalagens e equipamentos – Seleção dos simulantes de alimentos ............................................... 540 288/IV Embalagens e equipamentos – Condições dos ensaios de migração ................................................ 541 289/IV Embalagens plásticas – Preparo das amostras .................................................................................. 542 290/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração total com simulantes aquosos e n- heptano ............ ................................................................................................................................................................... 545 291/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração total com n-heptano após extração com .............. clorofórmio ................................................................................................................................................ 547 292/IV Embalagens plásticas – Determinação de metais em corantes e pigmentos...................................... 548 293/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração de corantes e pigmentos .................................. 549 294/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração específica de metais e outros elementos ............ 549 295/IV Embalagens de vidro e cerâmica – Determinação da migração global ............................................. 550 296/IV Embalagens de vidro e cerâmica – Determinação da migração específica de metais pesados........... 551 297/IV Embalagens metálicas – Determinação da migração global ............................................................. 553 298/IV Embalagens metálicas – Resíduo solúvel em clorofórmio corrigido ................................................ 553 299/IV Embalagens metálicas – Resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco ................................ 554 300/IV Embalagens metálicas – Determinação da migração específica de metais em embalagens de folhas de flandres....................................................................................................................................................... 555 301/IV Embalagens celulósicas – Determinação da migração global ........................................................... 556 302IV Embalagens celulósicas – Extração em materiais contendo pigmentos minerais ............................... 558 303/IV Embalagens celulósicas – Extração em materiais revestidos ou tratados superficialmente com parafinas e/ou laminados ............................................................................................................... 559 304/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio ................................... 560 305/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco ....... 561 306/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para ceras, ....... vaselinas e óleos minerais ............................................................................................................................ 562 0307/IV Embalagens elastoméricas – Determinação de ditiocarbamatos, tiouramas e xantogenatos ........... 565 CAPÍTULO XV CONSERVAS VEGETAIS, FRUTAS E PRUDUTOS DE FRUTAS....... 567-587 Conservas vegetais..................................................................................................................................... 569 Preparo das amostras de conservas vegetais ................................................................................................. 570 Frutas e derivados ....................................................................................................................................... 570 Preparo das amostras de produtos de frutas................................................................................................. 573 308/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação do peso das frutas drenadas ........................................ 573 309/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da umidade em frutas secas em estufa a vácuo .......... 574 310/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável por volumetria com indicador ............ ................................................................................................................................................................... 575 311/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável por volumetria potenciométrica......... 576 312/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável em ácido orgânico ...................... 577 313/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação dos sólidos totais ....................................................... 578 314/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação dos sólidos insolúveis em água ................................... 579 315/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação dos sólidos solúveis por refratometria ....................... 579 316/IV Frutas e produtos de frutas – Relação Brix/acidez total para sucos .................................................. 582 317/IV Coco ralado – Determinação da acidez titulável ........................................................................... 582 318/IV Coco ralado – Determinação de glicídios redutores em glicose ...................................................... 583 319/IV Coco ralado – Determinação de glicídios não redutores em sacarose ............................................. 584 XXII - IAL Sumário 320/IV Leite de coco – Determinação da acidez titulável .......................................................................... 586 321/IV Leite de coco – Determinação de lipídios pelo método de Soxhlet ................................................ 586 322/IV Leite de coco – Determinação de lipídios pelo método de Gerber ................................................ 586 323/IV Leite de coco – Determinação de glicídios redutores em glicose .................................................... 587 324/IV Leite de coco – Determinação de glicídios não redutores em sacarose ............................................ 587 CAPÍTULO XVI ÓLEOS E GORDURAS ......................................................................589-625 Óleos e gorduras ........................................................................................................................................ 591 325/IV Determinação da acidez ................................................................................................................ 591 326/IV Determinação do índice de peróxido .............................................................................................. 593 327/IV Determinação do índice de refração .............................................................................................. 594 328/IV Determinação do índice de saponificação ....................................................................................... 596 329/IV Determinação do índice de iodo pelo método de Wijs ................................................................... 597 330/IV Determinação do índice de iodo por cálculo .................................................................................. 599 331/IV Determinação do índice de Bellier ................................................................................................ 599 332/IV Determinação do ponto de fusão ................................................................................................... 600 333/IV Reação de Kreis .............................................................................................................................. 601 334/IV Determinação de umidade e matéria volátil................................................................................... 602 335/IV Determinação de impurezas insolúveis em éter............................................................................. 603 336/IV Determinação de resíduo de por incineração (cinzas) ..................................................................... 604 337/IV Determinação da densidade relativa ............................................................................................... 605 338/IV Teste do frio ................................................................................................................................... 605 339/IV Determinação de matéria insaponificável ....................................................................................... 606 340/IV Prova de Halphen-Gastaldi ............................................................................................................ 608 341/IV Prova de Holde ............................................................................................................................. 609 342/IV Prova de Villavecchia-Fabris .......................................................................................................... 610 343/IV Determinação da extinção específica por absorção na região do ultravioleta.................................... 610 344/IV Análise por cromatografia em fase gasosa dos ésteres metílicos de ácidos graxos ............................ 613 345/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência ................. 621 346/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência em produtos processados contendo ésteres de tocoferóis ...................................................................... 624 CAPÍTULO XVII OVOS E PRODUTOS DE OVOS..................................................627-631 Ovos e produtos de ovos ............................................................................................................................ 629 Ovo desidratado........................................................................................................................................ 629 347/IV Prova da solubilidade ..................................................................................................................... 629 348/IV Determinação dos sólidos da gema do ovo ..................................................................................... 630 CAPÍTULO XVIII PESCADOS E DERIVADOS..........................................................633-643 Pescados e derivados ................................................................................................................................. 635 349/IV Reação de Éber para gás sulfídrico .................................................................................................. 635 350/IV Determinação do pH ..................................................................................................................... 636 351/IV Determinação de bases voláteis totais ............................................................................................ 633 352/IV Determinação de histamina por espectrofluorimetria ................................................................... 637 353/IV Determinação de lipídios totais pelo método de Bligh-Dayer modificado....................................... 640 354/IV Determinação de lipídios totais pelo método de Folch ................................................................... 642 Conservas de pescado ................................................................................................................................ 643 CAPÍTULO XIX VITAMINAS......................................................................................645-682 IAL - XXIII Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 0355/IV Determinação de carotenóides em produtos naturais.................................................................... 647 0356/IV Determinação de ß-Caroteno em massas alimentícias................................................................... 650 0357/IV Determinação de vitamina A em alimentos .................................................................................. 652 0358/IV Determinação de vitamina A em matéria-prima ........................................................................... 654 0359/IV Determinação de vitamina B1 em alimentos ................................................................................. 656 0360/IV Determinação da concentração da vitamina B12 em matéria-prima ............................................... 658 0361/IV Doseamento microbiológico de vitamina B12................................................................................ 660 0362/IV Determinação de vitamina B2 em alimentos ................................................................................. 662 0363/IV Determinação de vitamina B6 em matéria-prima ......................................................................... 665 0364/IV Determinação de vitamina C com iodato de potássio ................................................................... 666 0365/IV Determinação de vitamina C pelo método de Tillmans ............................................................... 668 0366/IV Determinação espectrofotométrica de vitamina C por redução de íons cúpricos .......................... 670 0367/IV Determinação de vitamina E (tocoferóis totais) ........................................................................... 673 0368/IV Determinação de vitamina E em matéria-prima ........................................................................... 675 0369/IV Determinação de niacina e nicotinamida...................................................................................... 676 CAPÍTULO XX RESÍDUOS DE PESTICIDAS............................................................683-701 Resíduos de pesticidas ............................................................................................................................... 685 370/IV Método multi-resíduo para determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais ............... 687 371/IV Método mult-iresíduo para determinação de resíduos de pesticidas e bifenilas policloradas em ........... produtos gordurosos ................................................................................................................................... 694 372/IV Método para determinação de resíduos de ditiocarbamatos em frutas e vegetais ............................ 697 CAPÍTULO XXI FERMENTOS.....................................................................................703-711 Fermentos biológicos ................................................................................................................................. 705 373/IV Fermentos biológicos – Determinação de amido ........................................................................... 705 374/IV Fermentos biológicos – Poder fermentativo .................................................................................... 706 Fermentos químicos .................................................................................................................................. 708 375/IV Fermentos químicos – Determinação de CO2 total pelo método gasométrico 1 ........................... 708 376/IV Fermentos químicos – Determinação de CO2 total pelo método gasométrico 2 ........................... 710 CAPÍTULO XXII . SAL..................................................................................................713-734 Sal ............................................................................................................................................................. 715 377/IV Determinação da granulometria ..................................................................................................... 716 378/IV Determinação da umidade ............................................................................................................ 717 379/IV Determinação de insolúveis totais em água..................................................................................... 717 380/IV Determinação de insolúveis inorgânicos em água ........................................................................... 719 381/IV Determinação de cloretos em cloreto de sódio................................................................................ 719 382/IV Determinação de iodo adicionado na forma de iodeto ................................................................... 720 383/IV Determinação de iodo adicionado na forma de iodato ................................................................... 721 384IV Determinação da turbidez .............................................................................................................. 722 385/IV Determinação de cálcio por permanganometria ............................................................................. 723 386/IV Determinação de cálcio por titulação com EDTA .......................................................................... 724 387/IV Determinação de magnésio por precipitação .................................................................................. 726 388/IV Determinação de magnésio por titulação com EDTA..................................................................... 727 389/IV Determinação de sulfatos por precipitação ..................................................................................... 728 390/IV Determinação de sulfatos por titulação com EDTA ....................................................................... 730 XXIV - IAL Sumário 391/IV Determinação da composição provável ........................................................................................... 731 392/IV Sal hipossódico .............................................................................................................................. 734 CAPÍTULO XXIII MINERAIS E CONTAMINANTE INORGÂNICOS...................735-754 Minerais e contaminantes inorgânicos ..................................................................................................... 737 Tratamento da amostra ............................................................................................................................... 737 393/IV Digestão da amostra ...................................................................................................................... 738 394/IV Determinação de minerais por espectrometria de absorção atômica com chama ............................. 740 395/IV Determinação de minerais por espectrometria de emissão atômica por plasma de argônio ................... indutivamente acoplado ............................................................................................................................ 743 396/IV Determinação de cálcio por volumetria com EDTA ....................................................................... 744 397/IV Determinação espectrofotométrica de ferro com α-α’-dipiridila.................................................... 746 398/IV Determinação de fósforo por espectrofotometria na região do visível.............................................. 748 399/IV Determinação de chumbo por espectrometria de absorção atômica com chama ............................. 750 400/IV Determinação de cádmio por espectrometria de absorção atômica com chama............................... 752 CAPÍTULO XXIV MICOTOXINAS.............................................................................755-797 Micotoxinas ............................................................................................................................................... 757 Riscos no manuseio de micotoxinas ............................................................................................................ 758 As micotoxinas e a amostragem ................................................................................................................ 758 401/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia em camada delgada ............................. 759 402/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por CCD ou CLAE após separação em coluna de ................. imunoafinidade .......................................................................................................................................... 760 403/IV Determinação de aflatoxinas por cromatografia em camada delgada ............................................... 764 404/IV Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por CCD, após separação em coluna de imunoafinidade ............................................................................................................................. 770 405/IV Determinação de desoxinevalenol .................................................................................................. 772 406/IV Determinação de fumonisina B1 por CCD ou CLAE, após separação em coluna de imunoafinidade ............................................................................................................................. 775 407/IV Determinação de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenona por cromatografia em camada delgada .... 778 408/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD ou CLAE após separação em coluna de ...... imunoafinidade – Método 1 ....................................................................................................................... 784 409/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD ou CLAE após separação em coluna de ........ imunoafinidade – Método 2 ..................................................................................................................... 787 410/IV Determinação de ocratoxina A em café cru em grão por cromatografia em camada delgada .......... 790 411/IV Determinação de patulina em suco de maçã ................................................................................... 795 CAPÍTULO XXV GELADOS COMESTÍVEIS................................................................799-803 Gelados comestíveis ................................................................................................................................... 801 412/IV Determinação de gorduras pelo método de Rose Gottlieb .............................................................. 802 CAPÍTULO XXVI CEREAIS, AMILÁCEOS E EXTRATO DE SOJA.........................805-818 Cereais e amiláceos ................................................................................................................................... 807 Farinhas e produtos similares ................................................................................................................... 807 413/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de umidade a 130°C ............................................... 808 414/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de umidade a 105°C ............................................... 809 415/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de acidez álcool solúvel ........................................... 809 416/IV Determinação da acidez da gordura extraída da farinha de trigo ..................................................... 810 IAL - XXV Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 417/IV Farinhas e produtos similares – Determinação do pH .................................................................... 811 418/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de glúten ................................................................ 811 419/IV Pesquisa de bromato em massa fresca para pão (prova de triagem) .................................................. 812 420/IV Prova confirmatória de bromato por cromatografia em camada delgada ........................................ 813 421/IV Colesterol em massas alimentícias .................................................................................................. 815 Malte ......................................................................................................................................................... 817 422/IV Malte – Determinação do extrato................................................................................................... 817 Extrato de soja e bebida com extrato de soja ........................................................................................... 818 CAPÍTULO XXVII LEITES E DERIVADOS.................................................................819-877 Leite fluido: in natura, pasteurizado e UHT ........................................................................................... 821 423/IV Leites – Determinação da densidade a 15ºC .............................................................................. 821 424/IV Leites – Determinação do grau refratométrico do soro cúprico a 20ºC....................................... 824 425/IV Leites – Determinação da adição de água por crioscopia eletrônica............................................. 825 426/IV Leites – Determinação da acidez em ácido láctico ..................................................................... 827 427/IV Leites – Determinação da acidez em graus Dornic ..................................................................... 828 428/IV Leites – Estabilidade ao etanol a 68% (teste do álcool) ............................................................... 829 429/IV Leites – Determinação do extrato seco total (resíduo seco a 105°C)........................................... 829 430/IV Leites – Determinação do extrato seco total por métodos indiretos ............................................ 830 431/IV Leites – Determinação do extrato seco desengordurado .............................................................. 835 432/IV Leites – Determinação de glicídios redutores em lactose ............................................................. 835 433/IV Leites – Determinação de gordura pelo método de Gerber ......................................................... 836 434/IV Leites – Extração de gordura para determinação de ácidos graxos ............................................... 837 435/IV Leites – Determinação de protídios ............................................................................................ 838 436/IV Leites – Determinação de caseína ............................................................................................... 838 437/IV Leites – Determinação de resíduo por incineração (cinzas) ......................................................... 838 438/IV Leites – Determinação da alcalinidade das cinzas em carbonato de sódio .................................. 839 439/IV Leites – Determinação da alcalinidade das cinzas em solução normal ........................................ 840 440/IV Leites – Determinação de cloretos em cloreto de sódio .............................................................. 841 441/IV Leites – Identificação de amido .................................................................................................. 842 442/IV Leites –Identificação de sacarose com resorcina .......................................................................... 843 443/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com guaiacol................................................... 844 444/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com pentóxido de vanádio .............................. 844 445/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com iodeto ..................................................... 845 446/IV Leites – Identificação de formaldeído com floroglucina ............................................................. 845 447/IV Leites – Identificação de formaldeído com cloreto férrico ........................................................... 846 448/IV Leites – Identificação de formaldeído com ácido cromotrópico .................................................. 846 449/IV Leites – Determinação de cloro e hipocloritos ............................................................................ 847 450/IV Leites – Determinação de fosfatase ............................................................................................. 848 451/IV Leite e derivados – Prova de peroxidase ...................................................................................... 850 Leite em pó ................................................................................................................................................ 851 452/IV Leite em pó – Prova de reconstituição ......................................................................................... 851 453/IV Leite em pó – Determinação da acidez em ácido láctico .............................................................. 851 454/IV Leite em pó – Determinação de substâncias voláteis .................................................................... 852 455/IV Leite em pó – Determinação de resíduo por incineração (cinzas)................................................. 853 456/IV Leite em pó – Determinação da alcalinidade das cinzas ............................................................... 853 457/IV Leite em pó – Determinação de gordura ..................................................................................... 853 458/IV Leite em pó – Extração de gordura para determinação de ácidos graxos....................................... 854 XXVI - IAL Sumário 459/IV Leite em pó – Determinação de protídios.................................................................................... 854 460/IV Leite em pó – Determinação de glicidios redutores em lactose ................................................... 854 461/IV Leite em pó – Cromatografia de açúcares .................................................................................... 854 Leite evaporado......................................................................................................................................... 854 462/IV Leite evaporado – Prova de reconstituição ................................................................................... 855 Queijo ....................................................................................................................................................... 855 Preparo e conservação da amostra ............................................................................................................... 855 463/IV Queijo – Determinação da acidez em ácido láctico...................................................................... 855 464/IV Queijo – Determinação de substâncias voláteis ........................................................................... 856 465/IV Queijo – Determinação de gordura utilizando butirômetro especial ........................................... 856 466/IV Queijo – Determinação de gordura utilizando butirômetro para leite.......................................... 857 467/IV Queijo – Determinação de protídios ......................................................................................... 858 468/IV Queijo – Determinação de ácido sórbico e sorbato...................................................................... 858 469/IV Queijo – Reação de Kreis ........................................................................................................... 858 Coalho ....................................................................................................................................................... 858 470/IV Coalho – Poder coagulante ......................................................................................................... 859 Manteiga ................................................................................................................................................... 860 471/IV Manteiga – Determinação de acidez em solução normal ............................................................. 860 472/IV Manteiga – Determinação de substâncias voláteis........................................................................ 860 473/IV Manteiga – Determinação de insolúveis em éter.......................................................................... 861 474/IV Manteiga – Determinação da gordura ......................................................................................... 862 475/IV Manteiga – Determinação de resíduo por incineração (cinzas) .................................................... 862 476/IV Manteiga – Determinação de cloreto em cloreto de sódio ........................................................... 863 477/IV Manteiga – Determinação do índice de refração.......................................................................... 863 478/IV Manteiga – Determinação do índice de iodo ............................................................................... 863 479/IV Manteiga – Determinação do índice de saponificação ................................................................. 863 480/IV Manteiga – Reação de Kreis ....................................................................................................... 864 Margarina ................................................................................................................................................. 864 Doce de leite .............................................................................................................................................. 864 Preparo e conservação da amostra.............................................................................. .................... ............ 864 481/IV Doce de leite – Determinação de acidez em solução normal ....................................................... 864 482/IV Doce de leite – Determinação de acidez em ácido láctico ........................................................... 865 483/IV Doce de leite – Determinação de substâncias voláteis .................................................................. 866 484/IV Doce de leite – Determinação de substâncias voláteis em estufa a vácuo ...................................... 866 485/IV Doce de leite – Determinação de resíduo por incineração (cinzas) ............................................... 867 486/IV Doce de leite – Determinação de gordura .................................................................................. 868 487/IV Doce de leite – Determinação de protídios.................................................................................. 869 488/IV Doce de leite – Determinação de glicídios redutores em lactose .................................................. 869 489/IV Doce de leite – Determinação de glicídios não redutores em sacarose .......................................... 870 490/IV Doce de leite – Determinação de glicídios não redutores em amido ............................................ 872 491/IV Doce de leite – Cromatografia de açúcares .................................................................................. 873 Leite condensado ....................................................................................................................................... 873 Leites fermentados .................................................................................................................................... 874 492/IV Leites fermentados – Determinação do pH ................................................................................. 874 493/IV Leites fermentados – Determinação de acidez em ácido láctico ................................................... 874 494/IV Leites fermentados – Determinação de substâncias voláteis e extrato seco total............................ 875 495/IV Leites fermentados – Determinação de resíduo por incineração (cinzas) ...................................... 875 496/IV Leites fermentados – Determinação da gordura ......................................................................... 875 IAL - XXVII Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 497/IV Leites fermentados – Determinação da gordura com o butirômetro de Gerber ............................ 876 498/IV Leites fermentados – Determinação de protídios ......................................................................... 876 499/IV Leites fermentados – Determinação de glicídios redutores em lactose .......................................... 876 500/IV Leites fermentados – Determinação de glicídios não redutores em sacarose ................................. 876 Bebida láctea ............................................................................................................................................ 876 Creme de leite............................................................................................................................................ 877 501/IV Creme de leite – Determinação de acidez em ácido láctico .......................................................... 877 CAPÍTULO XXVIII CONDIMENTOS E VINAGRES...............................................879-888 Condimento vegetais ................................................................................................................................. 881 Condimentos preparados............................................................................................................................ 882 502/IV Determinação de isotiocianato de alila em mostarda preparada .................................................... 882 503/IV Condimentos – Determinação de óleos essenciais ........................................................................ 883 Vinagres .................................................................................................................................................... 885 504/IV Acidez total em vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico ................................... 886 505/IV Acidez volátil em vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico ................................. 886 506/IV Acidez fixa para vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico ................................... 887 507/IV Vinagres e fermentados acéticos – Determinação de álcool em volume......................................... 888 508/IV Vinagres e fermentados acéticos – Determinação de extrato seco total .......................................... 888 509/IV Vinagres e fermentados acéticos – Determinação de extrato seco reduzido ................................... 888 CAPÍTULO XXIX SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS DE QUÍMICA..................891-915 Introdução ................................................................................................................................................. 893 Algumas regras de segurança ....................................................................................................................... 894 Noções de toxicologia, riscos e prevenções no manuseio de produtos químicos........................................... 897 O laboratório: projeto, construção e instalações .......................................................................................... 900 Acondicionamento de produtos químicos em laboratório ........................................................................... 903 A água ........................................................................................................................................................ 905 Derramamento de produtos químicos ........................................................................................................ 906 Cilindros de gás .......................................................................................................................................... 907 Descarte de materiais .................................................................................................................................. 908 Cuidados com relação a alguns equipamentos ............................................................................................ 909 Materiais de vidro....................................................................................................................................... 912 Lavagem de vidrarias .................................................................................................................................. 913 Nota final ................................................................................................................................................... 914 Referências bibliográficas ............................................................................................................................ 914 APÊNDICE I Soluções tituladas, indicadores, papel reativo e clarificadores..........................................................917-936 Ácido clorídrico .......................................................................................................................................... 919 Ácido oxálico .............................................................................................................................................. 920 Ácido perclórico ......................................................................................................................................... 921 Ácido sulfúrico ........................................................................................................................................... 922 EDTA ........................................................................................................................................................ 923 Hidróxido de bário ..................................................................................................................................... 924 Hidróxido de potássio ................................................................................................................................ 925 Hidróxido de sódio..................................................................................................................................... 926 Iodo ........................................................................................................................................................... 927 XXVIII - IAL Nitrato de prata .......................................................................................................................................... 928 Permanganato de potássio........................................................................................................................... 929 Tiocianato de amônio................................................................................................................................. 931 Tiossulfato de sódio.................................................................................................................................... 932 Solução de Dornic (NaOH 1/9 N) ............................................................................................................. 933 Solução de Fehling ..................................................................................................................................... 933 Indicadores ................................................................................................................................................. 934 Papel reativo ............................................................................................................................................... 935 Clareadores................................................................................................................................................. 935 Areia purificada para a determinação de substâncias voláteis ....................................................................... 936 APÊNDICE II Guia para qualidade em química analítica...............................937-1002 Índice.......................................................................................................... ................ ...............................942 01. Metas e objetivos .................................................................................................................................. 943 02. Introdução ........................................................................................................................................... 944 03. Definições e terminologia ..................................................................................................................... 945 Ensaios de proficiência............................................................................................. ................. .................947 04. Acreditação........................................................................................................................................... 948 05. Escopo ................................................................................................................................................. 953 06. A tarefa analítica ................................................................................................................................... 954 07. Especificação do requisito analítico....................................................................................................... 954 08. Estratégia analítica ................................................................................................................................ 955 09. Análises fora-de-rotina .......................................................................................................................... 955 10. Pessoal .................................................................................................................................................. 957 11. Amostragem, manuseio e preparação de amostras ................................................................................. 958 12. Ambiente ............................................................................................................................................. 965 13. Equipamentos ...................................................................................................................................... 966 14. Reagentes ............................................................................................................................................. 969 15. Rastreabilidade ..................................................................................................................................... 970 16. Incerteza de medição ............................................................................................................................ 972 17.Métodos/procedimentos para ensaios e calibração ................................................................................. 976 18. Validação do método ............................................................................................................................ 977 19.Calibração ............................................................................................................................................. 982 20. Materiais de referência (MR) ................................................................................................................ 985 21.Controle de qualidade e ensaios de proficiência ..................................................................................... 987 22. Computadores e sistemas controlados por computador ........................................................................ 989 23. Auditoria do laboratório e análise crítica ............................................................................................... 993 Referências bibliográficas ............................................................................................................................ 994 Siglas ........................................................................................................................................................ 1002 IAL - XXIX CAPÍTULO I GESTÃO DA QUALIDADE LABORATORIAL IAL - 33 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 34 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial GESTÃO DA QUALIDADE LABORATORIAL Apresentação I nternacionalmente, o processo de padronização das atividades dos laboratórios de ensaio e calibração teve início com a publicação da ISO/IEC Guia 25 em 1978, revisado posteriormente em 1993. Na Europa, em razão da não-aceitação da ISO Guia 25, vigorava a EN 45.001 como norma para reconhecer a competência dos ensaios e calibrações realizados pelos laboratórios. I Tanto a ISO Guia 25 como a EN 45.001 continham aspectos cujos níveis de detalhamento eram insuicientes para permitir uma aplicação/interpretação consistente e sem ambigüidades, como, por exemplo, o conteúdo mínimo a ser apresentado na declaração da política da qualidade do laboratório, a rastreabilidade das medições, as operações relacionadas às amostragens e o uso de meios eletrônicos. Para suprir essas lacunas, a ISO iniciou em 1995 os trabalhos de revisão da ISO Guia 25 através do Working Group 10 (WG 10) da ISO/CASCO (Committee on Conformity Assessment). Dessa revisão resultou a norma ISO/IEC 17.025 – Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração, oicialmente datada de 15 de dezembro de 1999 e publicada internacionalmente no início do ano 2000. No Brasil, foi publicada pela ABNT a NBR/ISO/ IEC 17.025, em janeiro de 2001. A ISO/IEC 17.025 foi produzida como resultado de ampla experiência na implementação da ISO Guia 25 e da EN 45.001, que foram canceladas e substituídas de modo a serem utilizados textos idênticos nos níveis internacional e regional. Ela estabelece os critérios para aqueles laboratórios que desejam demonstrar sua competência técnica, que possuam um sistema de qualidade efetivo e que são capazes de produzir resultados tecnicamente válidos. Os principais objetivos da 17.025 são: IAL - 35 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital • Estabelecer um padrão internacional e único para atestar a competência dos laboratórios para realização de ensaios e/ou calibrações, incluindo amostragem. Tal padrão facilita o estabelecimento de acordos de reconhecimento mútuo entre os organismos de credenciamento nacionais; • Facilitar a interpretação e a aplicação dos requisitos, evitando ao máximo opiniões divergentes e conlitantes. Ao incluir muitas notas que apresentam esclarecimentos sobre o texto, exemplos e orientações, a 17.025 reduz a necessidade de documentos explicativos adicionais; • Estender o escopo em relação à ISO Guia 25, abrangendo também amostragem e desenvolvimento de novos métodos; • Estabelecer uma relação mais estreita, clara e sem ambigüidade com a ISO 9.001 e 9.002 (a 17.025 é de 1999, portanto antes da publicação da 9.001:2000). As principais modiicações introduzidas pela 17.025 com relação à ISO Guia 25 podem ser divididas em dois grupos: mudanças estruturais e mudanças conjunturais. As estruturais dizem respeito à introdução de novos conceitos e enfoques, bem como ao ordenamento e à disposição dos requisitos listados na ISO/IEC 17.025, cuja apresentação difere completamente da estrutura existente na ISO Guia 25. São diferenças não apenas de forma, mas também de conteúdo, e que demonstram claramente a preocupação da nova norma em estabelecer orientações gerais e modernas para que os laboratórios desenvolvam um sólido gerenciamento das suas atividades segundo padrões de qualidade reconhecidos internacionalmente. Além disso, o aprofundamento de alguns requisitos de caráter técnico, antes supericiais na ISO Guia 25, propiciará melhores condições para que os laboratórios demonstrem de forma mais consistente sua competência técnica. Dentre as principais mudanças de caráter estrutural introduzidas pela 17.025, destacam-se: • Na ISO/IEC 17.025 há uma nítida separação entre os requisitos gerenciais e os requisitos técnicos; a seção 4 contém os requisitos para a administração, e a seção 5 especiica os requisitos para a competência técnica dos ensaios e/ou calibrações que o laboratório realiza. Essa separação facilita a condução das avaliações, quer sejam internas ou externas; • Maior atenção deve ser dada aos clientes do laboratório (item 4.7 – Atendimento ao cliente). Deverá ser privilegiada uma cooperação mais estreita com os clientes no que tange aos aspectos contratuais e ao acesso do cliente às áreas do laboratório para acompanhamento dos ensaios e/ou calibrações. Embora não sejam requisitos auditáveis, os laboratórios são encorajados a estabelecer canais de comunicação e obter feedback dos clientes; • Foi incluído o requisito que trata das ações preventivas a serem tomadas pelo laboratório (item 4.11), pelo qual deverão ser identiicadas oportunidades de melhoria; • Como conseqüência da extensão do escopo com o desenvolvimento de novos métodos 36 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial pelo laboratório (item 5.4.3), critérios e orientações especíicos foram estabelecidos para a validação de métodos (item 5.4.5); • Compatibilidade e convergência com as normas ISO 9.001/9.002. Foram incorporados na ISO/IEC 17.025 todos os requisitos da 9.001 e 9.002 (ação preventiva, por exemplo) que são pertinentes ao escopo dos serviços de ensaio e calibração cobertos pelo sistema da qualidade do laboratório. Portanto, se os laboratórios de ensaio e calibração atenderem aos requisitos da 17.025, eles operarão um sistema da qualidade que também estará de acordo com os requisitos da 9.001 ou 9.002. Contudo, para efeitos de credenciamento do laboratório, a existência de um sistema da qualidade é condição necessária mas não suiciente para o pleno atendimento da 17.025, uma vez que os laboratórios terão que demonstrar ainda sua competência técnica para produzir dados e resultados tecnicamente válidos, o que não está presente na 9.001 nem na 9.002. Com a nova versão da ISO 9.001:2000, é provável que a ISO/CASCO forme um grupo de trabalho para estudar a possibilidade de serem feitos aditamentos técnicos para alinhar a ISO/IEC 17.025:1999 com a ISO 9.001:2000. O segundo grupo de mudanças introduzidas pela 17.025, em comparação à ISO Guia 25, são as diferenças de natureza conjuntural, ou seja, melhorias e modiicações pontuais que se constituem em ponto de partida para a evolução de aspectos gerenciais e de competência técnica abordados anteriormente na ISO Guia 25, mas que, por estarem redigidos de forma pouco abrangente, davam margem a dúvidas, omissões e conlitos. Dentre essas mudanças destacam-se: • Deinição do conteúdo mínimo a ser contemplado na declaração da política da qualidade do laboratório; • Inclusão de um requisito especíico (item 4.10) para a implementação de ações corretivas; • Como conseqüência do alinhamento da ISO/IEC 17.025 com as ISO 9.001 e 9.002, o item 4.4 detalha em profundidade como deve ser desenvolvida a atividade de análise crítica dos pedidos, propostas e contratos, de modo a prover maior coniança na prestação dos serviços e no relacionamento entre o cliente e o laboratório; • A rastreabilidade das medições é tratada no item 5.6 de modo detalhado e abrangente, contendo inúmeras notas explicativas e de orientação. Há um tratamento diferenciado na ISO/IEC 17.025 para a rastreabilidade a ser demonstrada pelos laboratórios de calibração (item 5.6.2.1) e pelos laboratórios de ensaio (item 5.6.2.2); • Destaque maior é dado à apresentação dos resultados dos ensaios e/ou calibrações, sendo este tópico muito mais extenso do que aquele contido na ISO Guia 25. Há uma distinção clara entre a emissão de relatórios de ensaio (item 5.10.3) e a emissão de certiicados de calibração (item 5.10.4). No item 5.10.5 são especiicados os requisitos a serem cumpridos pelo laboratório quando forem incluídas opiniões e interpretações em um relatório de ensaio, o que antes não era abordado na ISO Guia 25. IAL - 37 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital À primeira vista, as modiicações introduzidas pela ISO/IEC 17.025:1999 dão a impressão de tê-la tornado uma norma mais rigorosa e “pesada” do que a ISO Guia 25. De fato, aquela é agora mais extensa e descritiva do que esta. Entretanto, uma leitura cuidadosa da 17.025 nos permite airmar que ela, por ser mais detalhada e explicativa, é de aplicação mais pragmática e menos ambígua do que a ISO Guia 25. As regras do jogo foram modernizadas, os requisitos icaram mais claros, pontos obscuros foram mais bem explicitados e, por demanda dos laboratórios e como conseqüência da proliferação do uso de sistemas da qualidade, houve uma convergência completa com os requisitos das ISO 9.001 e 9.002. Como mencionado anteriormente, em um futuro não muito distante será necessário fazer um alinhamento entre a ISO/IEC 17.025 e a nova ISO 9.001:2000. No mundo globalizado, a padronização é de fundamental importância para viabilizar e incrementar as trocas comerciais nos âmbitos regional, nacional e internacional. As organizações que desenvolvem suas atividades e operam os seus processos produtivos de acordo com normas e procedimentos harmonizados e aceitos como padrões estarão em condições mais favoráveis para superar possíveis barreiras não-tarifárias e atender a requisitos técnicos especiicados. Nesse contexto, a aplicação da ISO/IEC 17.025 é de grande relevância econômica, pois confere um valor diferenciado aos certiicados de calibração e aos relatórios de ensaio emitidos por laboratórios cuja competência técnica é reconhecida por um organismo de credenciamento. Esse reconhecimento poderá se reverter em vantagens econômicas para os laboratórios, tais como: • Diferencial competitivo, fator de divulgação e marketing, o que poderá resultar em maior participação no mercado e, conseqüentemente, em maior lucratividade; • Fidelização dos clientes atuais e conquista de novos clientes, uma vez que o credenciamento conirma e reconhece a competência técnica do laboratório para produzir dados e resultados tecnicamente válidos, o que aumenta a sua credibilidade perante o mercado; • Laboratórios que fazem parte de organizações maiores e que operam em conformidade com os requisitos da ISO/IEC 17.025 poderão comprovar que os produtos da organização foram ensaiados e são tecnicamente capazes de atender às especiicações de desempenho, segurança e coniabilidade; • Crescimento das atividades de certiicação de produtos representa um novo mercado a ser explorado pelos laboratórios de ensaio e/ou calibração; • Os resultados de ensaio e calibração poderão ser aceitos em outros países, desde que o laboratório utilize os critérios da ISO/IEC 17.025 e seja credenciado por um organismo que estabeleça acordos de reconhecimento mútuo com organismos equivalentes de outros países. Este é o caso do INMETRO, que recentemente estabeleceu um acordo de reconhecimento mútuo com a European Co-operation for Acreditation (EA); • Atender a exigências legais de autoridades regulamentadoras, como, por exemplo, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária; 38 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial • O uso da ISO/IEC 17.025 facilitará a cooperação entre laboratórios e outros organismos, auxiliando na troca de informações e experiências, bem como na harmonização de normas e procedimentos, o que poderá signiicar redução de custos. Em suma, a adequação das atividades gerenciais e técnicas do laboratório de acordo com os critérios da ISO/IEC 17.025 deve ser vista não como um custo, mas como um investimento de médio e longo prazos, cujo retorno comercial e inanceiro certamente será garantido pela comprovação da competência técnica do laboratório perante o mercado. (Valle & Bicho) Introdução Atualmente é indiscutível a importância do trabalho com qualidade, em qualquer esfera proissional. A demonstração da competência técnica alicerçada em regras internacionais consensuadas é pré-requisito para a sobrevivência de qualquer laboratório. O artigo que apresenta este capítulo é a prova cabal da importância da implantação da norma NBR ISO/IEC 17025. O primeiro passo para a concretização de um Sistema de Qualidade em um laboratório é a criação de uma Comissão Permanente da Qualidade, capitaneada por um gerente ou coordenador da qualidade e um substituto ou vice-gerente, com a total aprovação da alta administração do laboratório. Esta comissão deve desenvolver várias atividades no sentido de implementar o Sistema de Qualidade, de acordo com os requisitos da norma ABNT ISO/IEC 17.025, sendo que a maioria delas diz respeito à motivação, conscientização e capacitação dos funcionários, preparando-os para incorporar uma mentalidade pró-ativa, capaz de lidar com as mudanças de forma dinâmica e de enxergar as oportunidades de melhoria onde antes só viam problemas. Deve também, na medida do possível, prover os laboratórios dos meios necessários para o desenvolvimento das atividades relacionadas com a qualidade. A grande maioria dos laboratórios que desenvolvem suas atividades no controle da qualidade de alimentos deve optar pela Norma ABNT ISO/IEC 17.025. Entretanto, aqueles que, além das atividades de rotina desenvolvem pesquisas como nos seguintes casos: a) estudos que fundamentem a concessão, renovação ou modiicação de registro de aditivos para alimentos, agrotóxicos, alimentos transgênicos, rações e outros ains, por organismos regulamentadores/iscalizadores com ins de responsabilização para comercialização. b) estudos conduzidos em resposta a questionamentos de organismos de qualquer setor governamental, deverão também seguir as Boas Práticas de Laboratório (BPL), além da norma descrita acima para suas atividades de rotina. IAL - 39 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital O Guia para Qualidade em Química Analítica - Uma Assistência à Acreditação, guia da EURACHEM traduzido para o português encontra-se no Apêndice 2. Ele é de grande valia para a implantação da qualidade nos laboratórios de ensaio e uma referência importante para consulta. Siglas, Sites e Definições Algumas siglas, sites e deinições estão descritas a seguir e são úteis na compreensão deste capítulo e de outros textos relacionados com temas da qualidade. Siglas ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária BIPM – Bureau Internacional de Pesos e Medidas CB – 25 – Comitê Brasileiro da Qualidade GGLAS – Gerência Geral de Laboratórios em Saúde, da ANVISA IEC – International Electromechanical Comission INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial ISO – International Organization for Standardization. LNM – Laboratório Nacional de Metrologia NIG – Norma Geral – INMETRO. NIST – National Institute of Standards and Technology NIT – Norma Técnica – INMETRO. NPL – he National Physical Laboratory OIML – Organização Internacional de Metrologia Legal PDCA – Plan, Do, Check, Act POP – Procedimento Operacional Padrão. PTB – Physikalisch -Technische Bundesanstalt RBC – Rede Brasileira de Calibração. REBLAS – Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde. SI - Sistema Internacional de Unidade Sites Farmacopéia Brasileira http://coralx.ufsm.br/farmacopeia Farmacopéia Alemã http://www.bfarm.de/de/Arzneimittel/azbuch/index.php 40 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Farmacopéia Americana http://www.usp.org Farmacopéia Britânica http://www.pharmacopoeia.org.uk Farmacopéia Européia http://www.pheur.org Farmacopéia Francesa http://agmed.sante.gouv.fr/htm/pharma/accueil.htm Farmacopéia Japonesa http://moldb.nihs.go.jp/jp/index.html Farmacopéia Mexicana h t t p : / / w w w. s s a . g o b . m x / u n i d a d e s / d g c i s / f a rm a c o p e a / i n d e x F E U M . h t m Index of Pharmacopoeias, by WHO http://www.who.int/medicines/organization/qsm/activities/qualityassurance/pharmacopea/who-edm-qsm-2002_6.doc Índice de farmacopéias mundiais, compilado pela Organização Mundial de Saúde - OMS. Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT http://www.abntdigital.com.br Responsável pela normalização técnica no país, fornecendo a base necessária ao desenvolvimento tecnológico brasileiro. Fundação Nacional de Saúde - Funasa http://www.funasa.gov.br Órgão executivo do Ministério da Saúde, tem como missão ser uma agência de excelência em promoção e proteção à saúde. Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ http://www.fiocruz.br Fundação vinculada ao Ministério da Saúde do Brasil, desenvolve ações na área da ciência e tecnologia em saúde. Fundação Jorge Duprat Figueiredo de Segurança e Medicina do Trabalho - FUNDACENTRO http://www.fundacentro.gov.br Entidade vinculada ao Ministério do Trabalho e Emprego - é o centro brasileiro de pesIAL - 41 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital quisas em segurança, saúde e meio ambiente no trabalho. Fundação Bio-Rio http://www.biorio.org.br Instituição de direito privado sem ins lucrativos, foi instituída por duas Agências inanciadoras de pesquisa e desenvolvimento, a FINEP e o CNPq. Instituto Butantan - SP http://www.butantan.gov.br O Instituto Butantan é um centro de pesquisa biomédica vinculado à Secretaria da Saúde do Governo do Estado de São Paulo. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO http://www.inmetro.gov.br Organismos de Certiicação e Inspeção ao mesmo tempo em que vem trabalhando para que o país ingresse competitivamente no mercado externo. Rede Metrológica RS http://www.redemetrologica.com.br A Associação Rede de Metrologia e Ensaios do Rio Grande do Sul - Rede Metrológica RS, é uma Organização não-governamental de cunho técnico-cientíico. A Rede é constituída por laboratórios especializados em Calibração e Ensaios, avaliados periodicamente de acordo com padrões internacionais. Sociedade Brasileira de Metrologia - SBM http://www.sbmetrologia.org.br Tem como principal objetivo a persuasão de cientistas e proissionais de todos os níveis de formação acadêmica e proissional interessados na ciência e na tecnologia das medições. Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé - AFSSAPS http://agmed.sante.gouv.fr Site da Agência Francesa de Segurança Sanitária de Produtos para a Saúde; contém informações sobre a farmacopéia francesa, textos regimentais e monograias em consulta pública naquele país. American National Standards Institute - ANSI http://www.ansi.org Instituição americana de normalização técnica, fornecendo a base necessária ao desenvolvimento tecnológico do país. Asia Paciic Laboratory Accreditation Cooperation – APLAC 42 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial http://www.ianz.govt.nz Instituição que conglomera os organismos da Ásia e Pacíico com responsabilidade de credenciamento de laboratórios, ensaios e calibração. Association of Oicial Analytical Chemists - A.O.A.C. International http://www.A.O.A.C..org Instituição americana que trata de credenciamento de laboratórios de alimentos Bundesnastait für Materialforachung und - prüfung - BAM http://www.bam.de Instituição pública alemã que trata de teste em materiais. Bureau International des Poids et Mesures (BIPM) http://www.bipm.fr Organização Metrológica Internacional sediada em Paris-França, estabelecida pela Convenção do Metro (Convention of the Metre) com a a atribuição de assegurar a uniformidade mundial de pesos e medidas e sua rastreabilidade ao Sistema Internacional de Unidades (SI). Code of Reference Materials (COMAR) http://www.comar.bam.de Informações sobre o COMAR (Base de Dados de Materiais de Referência Certiicados), criado com o intuito de auxiliar aos proissionais de laboratórios de ensaios na busca por materiais de referência (MR’s) adequados aos seus trabalhos. Idealizado pelo Serviço de Materiais de Referência do Laboratório Nacional de Ensaios (Reference Materials Service of the Laboratoire National d’Essais), um dos 5 laboratórios básicos do Departamento Nacional de Metrologia Francês (French Bureau National de Métrologie), foi desenvolvido e é mantido com a colaboração de vários países. Environment, Health and Safety - OECD http://www.oecd.org Organização econômica que trata das questões técnicas na comunidade européia e discute no Painel GLP os seus critérios. EURACHEM http://www.eurachem.bam.de Instituição européia que conglomera instituições que tratam da química analítica na Europa. European Co-operation for Accreditation – EA http://www.european-accreditation.org Instituição européia que conglomera instituições de organismos credenciadores na Europa e em outros continentes IAL - 43 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital European Federation of National Associations of Measurament, Testing and Analytical Laboratories – EUROLAB http://141.63.4.16/maintext.html Instituição européia com enfoque em química analítica na comunidade européia. European Information System on Proiciency Testing Schemes - EPTIS http://www.eptis.bam.de Sistema de informação europeu de teste de proiciência. Food Analysis Performance Assessment Scheme - FAPAS http://ptg.csl.gov.uk/fapas.cfm Organismo do Reino Unido que trata de credenciamento de laboratório de alimentos. Indian Systems of Medicine & Homoeopathy http://indianmedicine.nic.in Site do Sistema Indiano de Medicina e Homeopatia. Instituto Português da Qualidade – IPQ http://www.ipq.pt Organismo português destinado ao credenciamento de laboratórios. International Laboratory Accreditation Cooperation – ILAC http://www.ipq.pt Instituição internacional que conglomera instituições credenciadoras de laboratórios de ensaio e calibração. International Organization for Standardization http://www.iso.ch Organização não governamental estabelecida em 1947, tem por missão promover o desenvolvimento mundial da padronização e demais atividades relacionadas, visando facilitar o intercâmbio internacional de bens e serviços e fomentar a cooperação nas esferas intelectual, cientíica, tecnológica e da atividade econômica. National Athletic Trainers’ Association – NATA http://www.nata.asn.au Instituição privada australiana que trata do credenciamento de laboratórios microbiológicos. National Committee for Clinical Laboratory Standards –NCCLS http://www.nccls.org Organismo normalizador na área laboratorial no E.E.U.U que desenvolve padrões que 44 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial melhoram os valores dos testes clínicos dentro da comunidade de saúde através do desenvolvimento e disseminação dos padrões, guias e melhores práticas. National Conference of Standards Laboratories – NCSL http://www.ncsli.org Sociedade de normalização americana com interesse na ciência da medição e sua aplicação na pesquisa, desenvolvimento e educação nos laboratórios de análises clínicas. National Institute of Health Sciences - NIHS (Japão) http://www.nihs.go.jp Instituição de saúde japonesa estabelecida em Tókio em 1874, originalmente com o nome de Tokyo Drug Control Laboratory (Laboratório de Controle de Drogas de Tókio), é hoje a principal organização dentro do Ministério da Saúde e Bem-Estar do Japão, sendo também o mais antigo instituto de pesquisa naquele país. National Institute of Standards and Technology – NIST http://www.nist.gov Instituição pública americana que trata da metrologia, padrões e tecnologias de medição. Organização Pan-Americana da Saúde – OPAS http://www.opas.org.br Organismo internacional de saúde pública com um século de experiência, dedicado a melhorar as condições de saúde dos países das Américas. Ela também atua como Escritório Regional da Organização Mundial da Saúde (OMS/WHO) para as Américas e faz parte dos sistemas da Organização dos Estados Americanos (OEA/OAS) e da Organização das Nações Unidas (ONU/UN). Panalimentos.org http://www.panalimentos.org Página mantida pelo Instituto Pan-americano de Proteção de Alimentos e Zoonose (INPPAZ), organização que tem a missão de fornecer cooperação técnica em inocuidade alimentar a todos os países das Américas, com o objetivo de diminuir os riscos para a saúde da população humana, originados pelas enfermidades transmitidas por alimentos, e considerando todas as etapas da cadeia alimentar. Physikalisch Techaische Bundesanstalt – PTB http://www.ptb.de Instituição pública alemã que trata da política e guarda dos padrões primários e política de calibração. IAL - 45 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital he Centers for Disease Control and Prevention – CDC http://www.cdc.gov Agência federal estadunidense responsável pela segurança e proteção da saúde da população daquele país. O CDC trabalha no desenvolvimento e administração de medidas de prevenção e controle de enfermidades (incluindo doenças emergentes), na manutenção da saúde ambiental, e na promoção e planejamento de atividades educativas voltadas para a melhoria da saúde da população dos Estados Unidos da América. United Kingdom Accreditation Service – UKAS http://www.ukas.com Organismo inglês privado que trata do credenciamento de laboratório de ensaio e de calibração. U.S. Food and Drugs Administration – FDA http://www.fda.gov Órgão governamental norte americano responsável pela regulamentação de produtos das áreas médica, cosmética e alimentícia, produzidos e comercializados naquele país. Definições Ação corretiva – Ação implementada nas ocorrências de não conformidades em relação aos produtos, serviços associados e processos de acordo com o Sistema de Gestão da Qualidade. Ação preventiva – Ação implementada para eliminar ou prevenir as causas de possível não-conformidade, um defeito ou uma situação indesejável. Deve ser veriicada sempre sua eicácia. Acreditação – Procedimento pelo qual um organismo autorizado reconhece formalmente que um laboratório é competente para desenvolver os ensaios que realiza. Alta administração – É o órgão ou pessoa que executa a política traçada pela administração superior, dirigindo, coordenando e controlando os recursos humanos e materiais que assegurem eiciência e bom desempenho administrativo e, é o executor das análises críticas do sistema de qualidade. Análise crítica – Avaliação formal, feita pela alta administração de um sistema da qualidade quanto ao estado e adequação aos requisitos e política da qualidade. Área de acesso controlado – Área em que somente pessoas autorizadas podem entrar e circular. 46 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Auditado – Laboratório ou organização que está sendo auditada; deve concordar com os elementos da auditoria. Auditor da qualidade – Pessoa qualiicada para desenvolver uma auditoria da qualidade; deve conhecer as ferramentas da qualidade. Auditoria da qualidade – Exame sistemático e permanente, independente, para veriicar se as atividades da qualidade e seus objetivos e resultados estão de acordo com as disposições planejadas. Calibração – Conjunto de operações que estabelece, sob condições especiicadas, a relação entre os valores indicados por um instrumento de medição ou sistema de medição ou valores representados por uma medida materializada ou um material de referência e os valores correspondentes das grandezas estabelecidas por padrões. Cliente – Comprador irmado em contrato; destinatário de um produto ou serviço; consumidor inal; usuário; segunda parte. Comparações interlaboratoriais – Organização, desempenho e avaliação de ensaios nos mesmos itens ou em itens de ensaios similares, por dois ou mais laboratórios, de acordo com condições predeterminadas. Competência – Capacidade demonstrada para aplicar conhecimento e habilidades. Conformidade – Atendimento a requisitos especiicados. Contratado – Fornecedor irmado em contrato. Documentos da qualidade – São todos os documentos gerados internamente ou obtidos de fontes externas e que fazem parte do sistema da qualidade. Ex.: manuais de equipamentos, legislações, pops, manual da qualidade, instruções, registros, dados brutos, etc. Eficácia – Extensão na qual as atividades planejadas e os resultados planejados, alcançados. Eficiência – Relação entre o resultado alcançado e os recursos usados. Ensaio – Operação técnica que consiste na determinação de uma ou mais características de um dado produto, processo ou serviço, de acordo com procedimento especiicado. Ensaio de proficiência – Determinação do desempenho de ensaios de laboratórios, por meio de comparações interlaboratoriais. IAL - 47 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Equipamento e Instrumento de medição – Dispositivo utilizado para uma medição, sozinho ou em conjunto com dispositivo(s) complementar(es). Equipamentos críticos – Aqueles que interferem diretamente no resultado dos ensaios. Equipamentos não críticos – São aqueles que não interferem no resultado dos ensaios. Evidência objetiva – dados que apóiam a existência ou a veracidade de alguma coisa. Exatidão da medição – Grau de concordância entre o resultado de uma medição e um valor verdadeiro do mensurando. Fornecedor – Organização que fornece produtos ao cliente. Garantia da qualidade – Conjunto das atividades que são implementadas pelo Sistema da Qualidade para prover a coniança adequada de que o laboratório ou a organização adere aos requisitos da qualidade que lhe são exigidos. Gestão da qualidade – Conjunto de atividades da gerência de uma organização que determinam a política da qualidade, seus objetivos e responsabilidades. Deve ser liderada pela alta administração da organização. Incerteza da medição – Parâmetro associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser fundamentalmente atribuídos a um mensurando. Item de ensaio – Material ou artefato apresentado ao laboratório para análise, amostra. Laboratório de referência – Laboratório que fornece valores de referência para um item de ensaio. Manual da qualidade – Documento que declara a política da qualidade e descreve o sistema da qualidade de um laboratório ou organização. Manutenção corretiva – Manutenção não programada a ser conduzida quando for detectado desvio de funcionamento do equipamento. Manutenção preventiva – Manutenção programada com determinada freqüência e deinida pelo laboratório. Material de referência – Material ou substância que tem um ou mais valores de propriedades que são suicientemente homogêneos e bem estabelecidos, para ser usado na calibração de 48 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial um aparelho, na avaliação de um método de medição ou atribuição de valores a materiais. Material de referência certificado – Material de referência, acompanhado por um certiicado, com um ou mais valores de propriedades, e certiicado por um procedimento que estabelece sua rastreabilidade à obtenção exata da unidade na qual os valores da propriedade são expressos. E cada valor certiicado é acompanhado de uma incerteza para um nível de coniança estabelecido. Medição – Conjunto de operações que têm por objetivo determinar o valor de uma grandeza. Melhoria da qualidade – Parte da gestão da qualidade focada no aumento da capacidade de atender aos requisitos da qualidade, que podem estar relacionados com a eicácia e a eiciência ou a rastreabilidade do sistema. Mensurando – Objeto da medição, grandeza especíica submetida à medição. Método de ensaio – Procedimento técnico especiicado para realizar um ensaio. Não-conformidade – Não-atendimento a requisitos especiicados. Organismos credenciadores – Organizações nacionais e internacionais que estabelecem, por um ciclo deinido de avaliações e de auditorias, a competência técnica de um laboratório de ensaios ou de calibrações. Organização – Grupo de instalações ou pessoas com um conjunto de responsabilidades, autoridades e relações. Padrão de referência – Geralmente tem a mais alta qualidade metrológica disponível em um dado local ou em uma dada organização, a partir do qual as medições lá executadas são derivadas. Padrão de trabalho – Padrão utilizado rotineiramente para calibrar ou controlar medidas materializadas, instrumentos de medição ou materiais de referência. Parâmetros críticos – Grandezas ou faixas que interferem diretamente no ensaio. Precisão – Grau de concordância entre os resultados independentes de ensaios obtidos conforme condições preestabelecidas. Procedimento – Forma especiicada de executar uma atividade. Podem ser chamados de procedimentos escritos ou documentados. IAL - 49 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Processo – Conjunto de atividades inter-relacionadas ou interativas que transformam insumos (entradas) em produtos (saídas). Qualidade – Grau no qual um conjunto de características inerentes satisfaz os requisitos. Totalidade das características de uma instituição que lhe confere a capacidade de satisfazer as necessidades explícitas e implícitas de seus clientes internos e externos. Rastreabilidade de uma medição – Propriedade do resultado de uma medição ou do valor de um padrão estar relacionado a referências estabelecidas, geralmente padrão nacional ou internacional, por meio de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas estabelecidas. Rastreabilidade do Sistema da Qualidade – Capacidade de recuperação do histórico da aplicação ou da localização de um documento/amostra/ensaio por meio de registros. Registro – Documentos que fornecem a evidência objetiva das atividades relacionadas aos resultados obtidos de um sistema de qualidade. Regulagem – Ajuste realizado com os recursos disponíveis no instrumento. Repetitividade – Grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo mensurando efetuadas sob as mesmas condições de medição. Reprodutividade – Grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mensurando, efetuadas sob condições variadas de medição. Requisito – Necessidade ou expectativa que é expressa, geralmente de forma implícita ou obrigatória. Resultado de ensaio – Valor obtido de uma característica por um método de medição especiicado realizado por completo. Sistema – Conjunto de elementos inter-relacionados ou interativos. Sistema de gestão – Sistema para estabelecer política e objetivos, e para atingir estes objetivos. Sistema de gestão da qualidade – Sistema de gestão para dirigir e controlar uma organização no que diz respeito á qualidade. Sub-contratado – Organização que fornece um produto ou serviço a um fornecedor; subfornecedor. 50 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Verificação periódica – Conferência periódica das condições dos equipamentos. Implantação do Sistema da Qualidade Este capítulo não tem a pretensão de capacitar o leitor para implantar um Sistema de Qualidade Laboratorial. Nossa intenção é fornecer alguns subsídios da experiência do Instituto Adolfo Lutz que talvez possam ser úteis para iluminar um pouco mais o caminho daqueles laboratórios que estão iniciando a implantação de seu Sistema da Qualidade. Para a implantação de um Sistema de Qualidade em um laboratório, independentemente de seu tamanho e número de análises realizadas, sugere-se seguir as seguintes etapas: motivação, capacitação, elaboração dos documentos da qualidade, treinamento nos documentos da qualidade, preparação do laboratório, auditorias internas, habilitação/acreditação. Motivação É difícil deinir exatamente o conceito de motivação, uma vez que este termo tem sido utilizado com diferentes sentidos. De um modo geral, “motivo é tudo aquilo que impulsiona a pessoa a agir de determinada forma ou, pelo menos, que dá origem a uma propensão a um comportamento especíico”. Este impulso à ação pode ser provocado por um estímulo externo (provocado pelo ambiente) ou interno (provocado pelo próprio indivíduo). O ponto de partida para a implantação da qualidade em um laboratório ou em qualquer organização é o fator motivacional. Estamos vivenciando uma época de mudanças constantes e velozes e as organizações e seus funcionários devem se moldar a esta realidade para competirem e sobreviverem. À medida que as organizações crescem, o número de níveis hierárquicos aumenta e ocorre um distanciamento entre a alta administração e os funcionários, o que conduz a um conlito entre os objetivos individuais (pessoais) e organizacionais (da alta administração). A implantação da qualidade acarreta um volume de trabalho maior, o que ocasiona na maioria dos indivíduos desmotivação, desinteresse e desânimo, pois eles não conseguem perceber que, a longo prazo, seu trabalho será enormemente facilitado. A integração entre as pessoas e a alta administração é complicada e dinâmica e, para melhor resolver esta complicação e trabalhar este dinamismo, atividades motivacionais passam a ser um excelente meio IAL - 51 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital facilitador, não somente entre o indivíduo e a organização, mas entre os próprios indivíduos. O grande desaio é justamente despertar e desenvolver o fator motivacional existente no interior de cada ser humano. Qualquer que seja a forma de motivação (curso, palestra, vivência, vídeo, etc.) ela deve deixar nos técnicos os seguintes principais conceitos: • a qualidade implica em melhoria contínua. • todos são igualmente importantes para a qualidade. • a qualidade depende do trabalho em equipe. • qualidade não se impõe, conquista-se por meio de motivação, treinamento e experiência. A forma de motivação escolhida deve, também, provocar em seus colaboradores um comportamento positivo e produtivo, garantindo a vontade de aprimoramento, o prazer de produzir resultados com qualidade e a vontade de seguir os princípios básicos da qualidade: • total satisfação do cliente (interno ou externo). • gerência participativa. • desenvolvimento dos recursos humanos. • constância de propósito. • aperfeiçoamento contínuo. • gerência de processo. • não-aceitação dos erros. • delegação. • disseminação de informações. • garantia de qualidade. Capacitação O Programa da Qualidade deve ser implantado gradualmente, contemplando ações de produção de conhecimento, baseadas na análise sistemática dos resultados, gerando instrumentos que contribuam para obter êxito a médio e longo prazo ou de impacto, segundo o definido nos objetivos do Sistema da Qualidade. Um dos passos mais importantes para a implementação da Qualidade no laboratório se refere à capacitação de seus funcionários. 52 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial O planejamento do treinamento para os recursos humanos deve ser estabelecido com muito critério, respeitando-se o grau de escolaridade de cada funcionário e suas atribuições dentro da qualidade. A capacitação deve iniciar sempre com uma sensibilização de todos os funcionários da instituição, a im de garantir a assimilação dos conceitos de qualidade; deve icar claro o papel de cada funcionário com relação a todo o processo, para atingir a melhoria contínua da qualidade. O pessoal técnico mais envolvido com o Programa da Qualidade e que realiza os ensaios que eventualmente serão habilitados ou acreditados, deve ser objeto de treinamentos específicos e mais aprofundados, para capacitação em qualidade. O Quadro 1 sugere alguns cursos que podem ser ministrados aos funcionários dos laboratórios, de acordo com suas funções e grau de escolaridade. Quadro 1 - Relação de cursos de acordo com a escolaridade e funções dos funcionários. CURSO/TREINAMENTO Histórico da qualidade Introdução à qualidade A importância do trabalho com qualidade Fatores motivacionais para o trabalho Quais os benefícios da qualidade Como obter a melhoria contínua no trabalho Atitudes pessoais para a qualidade Mudanças culturais nos trabalhadores Princípios da qualidade em uma Instituição Capacitação para o trabalho Conceito sobre o PDCA e o aprimoramento contínuo Atendimento ao cliente Conceitos sobre o modelo de gestão baseada em processos Como construir indicadores e apresentar resultados Indicadores de desempenho de qualidade Os desaios a serem enfrentados na implantação da qualidade NÍVEL FUNÇÃO Td Td Td Td Td Td Td Td Td Td EM Td EM EM EM EM Td Td Td Td Td Td Td Td Td Td ADM Td ADM ADM/T ADM/T ADM/T IAL - 53 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital CURSO/TREINAMENTO Noções de acreditação pelo INMETRO Noções de habilitação pela GGLAS Vantagens da acreditação / habilitação Biossegurança (ênfase em resíduos) Interface entre qualidade e biossegurança Construção de mapas de risco Segurança ocupacional e biossegurança Regras universais de biossegurança Níveis de biossegurança laboratorial Equipamentos de proteção individual e coletiva Segurança química e emergências químicas Resíduos de serviços de saúde Limpeza, descontaminação e esterilização Transporte de amostras dentro do laboratório Programa Cinco Esses Norma ISO/IEC 17.025 – Apresentação Norma ISO/IEC 17.025 – Requisitos gerenciais aprofundados Norma ISO/IEC 17.025 – Inteira aprofundada Auditorias internas Formação de auditores Elaboração de procedimentos Temporalidade de documentos e amostras Comprando com qualidade Validação de métodos Estudos colaborativos Organismos internacionais envolvidos na validação de métodos analíticos Cálculo de incerteza de medição Interpretação dos certiicados de calibração Boas Práticas de Laboratório / BPL ADM = área administrativa T = área técnica Td = todos EF = ensino fundamental EM = ensino médio MEM = no mínimo ensino médio 54 - IAL NÍVEL EM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM MEM EF EF Td Td MEM MEM MEM MEM Td MEM MEM MEM MEM FUNÇÃO ADM/T ADM/T ADM/T T T T T T T T T T T T Td Td ADM T ADM/T ADM/T ADM/T ADM/T ADM/T T T MEM T MEM MEM MEM T T T Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Pessoal Além da capacitação para a qualidade, o pessoal técnico e administrativo tem que demonstrar sua competência na área em que atua. Isto é demonstrado por meio de seu currículo. Em cada laboratório ou setor administrativo, deve existir uma pasta, individual ou coletiva, com os currículos de todos os funcionários daquele local, com os seguintes principais dados: nome, tempo de atuação na área, escolaridade, pós-graduação (se for o caso), cursos, treinamentos, simpósios e seminários, publicações (se for o caso), experiência proissional, outras atividades proissionais relacionadas, assinaturas do funcionário e de seu chefe imediato e data. Além disso, se possível nesta mesma pasta, cada funcionário deve assinar um termo de conidencialidade, onde se compromete a manter o caráter conidencial das informações decorrentes das atividades por ele desenvolvidas no laboratório. Elaboração dos Documentos da Qualidade Uma das principais características de qualquer Sistema da Qualidade é documentar todas as atividades realizadas no laboratório ou organização, com a inalidade de padronizá-las. A documentação da qualidade descreve e deine políticas, diretrizes, procedimentos técnicos e administrativos, ações preventivas e corretivas, instruções de uso de equipamentos, planos de calibração, especiicações técnicas, registros de dados brutos, planos de capacitação de pessoal, análises críticas do sistema da qualidade, entre outros, necessários para a implantação e implementação do Sistema da Qualidade em um laboratório ou organização. Os documentos mínimos necessários para a implantação do Sistema da Qualidade são: o Manual da Qualidade, que contém a declaração formal da política da qualidade do laboratório e os componentes do seu Sistema da Qualidade, os procedimentos operacionais padrão – POPs, especiicamente referidos na norma NBR ISO/IEC 17.025 e os documentos referentes aos ensaios realizados, como os registros dos dados brutos, os certiicados de calibração dos equipamentos, a qualidade dos materiais de referência, entre outros. Normalmente, costuma-se hierarquizar estes documentos na igura de um triângulo, onde, no vértice, estaria o Manual da Qualidade, pela sua importância, pois nele estão contidas todas as diretrizes e as políticas da qualidade. Na parte central, encontram-se os POPs, que são em maior número e descrevem todas as atividades técnico-administrativas do Sistema da Qualidade. Na base do triângulo, encontram-se as intenções de trabalho os dados brutos e os registros, que são aqueles em maior número no sistema. IAL - 55 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Manual da Qualidade Procedimentos Registros e dados brutos Os procedimentos escritos têm por inalidade descrever as atividades a serem realizadas, passo a passo, com um texto claro, evitando o excesso de detalhamento, porém sem omitir etapas. Sempre que possível, o funcionário que executa a tarefa deve escrever o procedimento; um outro companheiro que também conhece o trabalho deve revisar o texto para veriicar possíveis omissões de etapas ou falta de clareza e o gerente da qualidade ou seu representante deve aprovar o POP, apenas quanto na forma padronizada para procedimentos da qualidade. Podem haver casos em que o funcionário que executa a tarefa não tenha familiaridade com elaboração de textos. Nesta eventualidade, alguém do laboratório deve ajudá-lo nesta tarefa, não estando excluídas as demais etapas de revisão e aprovação. Cabe ao pessoal técnico e administrativo deinir quais os procedimentos que devem ser elaborados em cada área e que farão parte do Sistema da Qualidade. Controle dos Documentos Os documentos da qualidade devem possuir uma numeração unívoca para facilitar seu controle. Estes documentos devem ter em seu rodapé a inscrição “cópia controlada – reprodução proibida” ou frase de semelhante teor, para que não sejam reproduzidos e seja mantido um rigoroso controle das cópias distribuídas pelo sistema da qualidade. Periodicamente estes documentos devem ser objeto de uma análise crítica para atualização e melhoria. Caso hajam alterações, devem ser emitidos novos documentos com números atualizados de revisão e as cópias antigas segregadas, mantendo-se uma cópia em arquivo, como histórico de documentação. 56 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial O controle de toda a documentação deve ser efetivado por meio de uma lista mestra, onde constam todos os documentos do sistema da qualidade, com seu status de revisão. Treinamento nos documentos da qualidade Todos os documentos elaborados pelo sistema da qualidade, inclusive o manual da qualidade, devem ser apresentados a seus possíveis usuários mediante um treinamento, antes de serem distribuídos. Este treinamento garante que todos aqueles que forem usar aqueles documentos compreenderam os mesmos na sua totalidade e que não terão nenhuma dúvida na sua correta utilização. Sempre que a gerência técnica do laboratório sentir necessidade, se houver alguma alteração signiicativa no procedimento, ou quando um novo funcionário ingressar no laboratório ou ainda quando o plano de treinamento assim o exigir, deverá ser iniciado um novo treinamento naquele procedimento. Nestes casos, deve-se também assegurar e manter todos os registros destes treinamentos. A gerência da qualidade deve ainda garantir que os usuários dos documentos, dados e registros estejam utilizando sempre as últimas versões das cópias controladas. Deve ainda assegurar que uma cópia controlada de cada documento obsoleto seja armazenada como histórico, sendo as demais cópias inutilizadas. Preparação das unidades organizacionais Uma boa ferramenta para iniciar a preparação do laboratório e áreas administrativas para a sua inserção no sistema da qualidade é o Programa Cinco “S”, criado inicialmente no Japão e que consiste em cinco conceitos simples: Senso de descarte – deve-se separar, dentro do laboratório, os objetos e equipamentos úteis dos inúteis, identiicando, dentro do útil, o que é usado com maior freqüência, mantendo-o próximo do usuário, do que é usado esporadicamente, armazenando-o em áreas de menor acesso. Quanto ao inútil, deve-se veriicar se pode ser útil em algum outro local, se pode ser vendido ou doado. Caso contrário, deve-se descartar. Senso de ordenação e organização – deve-se deinir um arranjo simples, que permita obter apenas o que se precisa, na hora certa. Isto permite um menor tempo de busca do que é preciso para operar; evita a compra de matérias-primas e componentes desnecessários e os danos a materiais ou produtos armazenados. Aumenta a produtividade das pessoas e equipamentos e permite uma maior racionalização do trabalho, causando menor cansaço físico e mental, IAL - 57 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital melhoria no ambiente, facilitando o transporte interno, o controle de estoque e a execução do trabalho no prazo. Senso de limpeza – deve-se eliminar o lixo, a sujeira e os materiais estranhos, tornando o local de trabalho mais limpo. Deve-se usar a limpeza como uma forma de inspeção de equipamentos, reagentes, vidrarias e materiais. Este procedimento facilita a credibilidade nos serviços e é fundamental para a imagem interna e externa das unidades organizacionais do laboratório. Senso de asseio, higiene e saúde – deve-se manter os objetos e equipamentos organizados, arrumados e limpos, incluindo os aspectos pessoais e os relacionados à poluição. Este procedimento facilita a segurança e o melhor desempenho das pessoas e evita danos à saúde do funcionário e do cliente. Melhora a imagem do laboratório para os clientes internos e externos, além de elevar o nível de satisfação e motivação do pessoal para com o trabalho e o laboratório. Senso de autodisciplina e ordem mantida – deve-se fazer naturalmente a coisa certa. Assim se reduz a necessidade de controle e se facilita a execução de toda e qualquer tarefa ou operação. Este procedimento evita perdas devido à falta de rotinas e traz previsibilidade do resultado inal de qualquer operação. Controle de acesso Para garantir a conidencialidade e a coniabilidade dos resultados analíticos, além de assegurar a conidencialidade de processos e outros documentos sigilosos das áreas administrativas do laboratório, devem ser estabelecidos procedimentos para o controle de acesso de pessoal autorizado e não autorizado em todas as unidades organizacionais do laboratório. Calibração, controle e manutenção de equipamentos Os equipamentos críticos devem ser calibrados periodicamente e antes de serem colocados em uso, de modo a garantir a precisão e exatidão dos mesmos. Os certiicados de calibração devem ser fornecidos por empresas ou laboratórios credenciados pela Rede Brasileira de Calibração – RBC, sempre que possível. A freqüência de calibração dos equipamentos críticos é estabelecida em função da utilização de cada equipamento. Em função disso, deve ser elaborado um plano de calibração e de manutenção dos mesmos. 58 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Quando a temperatura for crítica para o ensaio, deve ser elaborado um controle periódico e mantido próximo aos equipamentos (estufas, banhos-maria, mulas, geladeiras etc.). O mesmo procedimento deve ser realizado para outros parâmetros críticos para os ensaios. Apresentação dos resultados Os certiicados de análise devem ser descritos em documentos contendo as informações solicitadas pelo cliente e necessárias à interpretação dos mesmos, as referências e valores de referência, quando deinidos e todas as informações requeridas pelo método utilizado, a partir das quais as interpretações do resultado podem ser realizadas. Além disso, devem constar: a data do recebimento da amostra, a data de realização do ensaio e as assinaturas e funções de pelo menos dois responsáveis pelo relatório. Para preservar os direitos do laboratório, é aconselhável que no relatório constem uma ou mais das seguintes observações: “O laboratório não se responsabiliza pela amostragem”; “os resultados se referem somente à amostra ensaiada” e “este relatório de análise somente deve ser reproduzido por completo”. O relatório de análise apresentado deve ser claro, objetivo, preciso, sem rasuras e não pode, em sua versão inal, permanecer com campos em branco, para diicultar sua falsiicação. O documento deve apresentar identiicação unívoca que assegure que cada página seja reconhecida como parte integrante do relatório de ensaio e tenha, em seu inal, uma clara identiicação de término. Os resultados analíticos devem ser acompanhados da incerteza estimada e de suas unidades, de acordo com o Sistema Internacional. Cuidados especiais devem ser tomados quando da entrega do resultado para terceiros ou quando enviados por fax ou meio eletrônico. Somente em casos de alerta sanitário ou de extrema urgência poderão ser utilizados estes meios, pois existe o risco de quebra de conidencialidade. Um procedimento escrito deve ser elaborado para estes casos, para evitar que isso ocorra. Auditorias internas Deinição – Segundo a NBR ISO 8402, a auditoria é o “exame sistemático e independente para determinar se as atividades da qualidade e seus resultados estão de acordo com as disposições planejadas, se estas foram efetivamente implementadas e se são adequadas à consecução dos objetivos”. A realização de auditorias internas é requisito obrigatório para o atendimento da norma da qualidade. Para sua execução, é necessária a formação de uma equipe de auditores, capitaneada pelo auditor-líder, que é responsável por todas as fases da auditoria e também deve participar da seleção dos outros membros da equipe auditora, preparar o IAL - 59 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital plano de auditoria, representar a equipe auditora junto à gerência da qualidade e apresentar o relatório da auditoria. É de responsabilidade da equipe auditora: cumprir os requisitos aplicáveis da auditoria, comunicar e esclarecer os requisitos da auditoria da mesma, planejar e realizar a auditoria sob sua responsabilidade, documentar as observações, relatar os resultados e veriicar a eicácia das ações corretivas adotadas como resultado da auditoria. Ao laboratório auditado cabe: informar aos técnicos envolvidos os objetivos e o escopo da auditoria, apontar os membros responsáveis para acompanhar a equipe auditora, prover a equipe auditora de todos os recursos necessários para assegurar um processo de auditoria eicaz e eiciente, prover o acesso às instalações e ao material comprobatório, conforme solicitado pelos auditores e determinar e iniciar ações corretivas baseadas no relatório de auditoria. Critérios para qualificação de auditores internos Os auditores devem, no mínimo, ter cursado até o segundo grau escolar e ter competência para expressar-se oralmente e por escrito. Possuir conhecimento e compreensão das normas nas quais se baseia a auditoria do sistema da qualidade. Habilidades adicionais necessárias na gestão de uma auditoria: planejamento, organização, comunicação, direção, facilidade na elaboração de questionários, avaliação e preparação de relatórios. É aconselhável que tenham no mínimo, quatro anos de experiência proissional na área técnica a ser auditada (no caso dos auditores especialistas nos ensaios). Atributos pessoais do auditor: mentalidade aberta e madura, julgamentos dignos de coniança, capacidade analítica e tenacidade, habilidade para perceber situações de maneira realista, compreensão das operações complexas sob uma perspectiva mais ampla, bem como o papel das unidades individuais dentro de um todo, auto-análise, objetividade, imparcialidade, persistência, cooperação, bom senso para revisão, maturidade, ética, conidencialidade, boa comunicação verbal e escrita, bom relacionamento interpessoal. Garantia da qualidade dos resultados de ensaio O laboratório deve ter procedimentos para monitorar a qualidade dos resultados dos ensaios. Essa monitorização deve ser planejada e analisada criticamente pela gerência técnica do laboratório. 60 - IAL Capítulo I - Gestão da Qualidade Laboratorial Os dados devem ser registrados de forma sistemática para que tendências sejam detectáveis e sanadas. Quando possível deve ser aplicada técnica estatística para a análise crítica dos resultados. Este controle de qualidade pode ser interno ou externo. O controle de qualidade interno pode ser realizado por meio de ensaios em replicata, análises utilizando-se material de referência, comparações intralaboratoriais, repetições do ensaio e amostra cega. Como o controle de qualidade externo, pode-se participar de ensaios de proiciência, que tem como principais vantagens: veriicação da capacidade técnica, veriicação de desempenho de metodologias, reagentes e equipamentos, tomadas de ações corretivas, entre outros. Análise crítica pela alta administração Pelo menos uma vez por ano, e visando a melhoria contínua do sistema da qualidade, deve ser realizada uma análise crítica do sistema. Os principais responsáveis por essa avaliação são: a alta administração e a gerência da qualidade. Nesta ocasião são avaliados os seguintes e principais indicadores: • • • • • • • • • • • • • • • resultados de ensaio de proiciência auditorias internas auditorias externas reclamações de clientes sugestões de clientes quantidade de análises realizadas ações corretivas ações preventivas número de treinamentos realizados planejamento anual sugestões de melhoria do sistema principais não conformidades principais fontes de investimento opiniões dos diretores sugestões dos funcionários Estas reuniões devem ser registradas, normalmente em forma de ata e as conclusões devem ser divulgadas e cumpridas. IAL - 61 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências Bibliográicas ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR ISO 9.000: Sistemas de gestão da qualidade – Fundamentos e vocabulário. Rio de Janeiro, 2000. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR ISO/IEC GUIA 2 1995 Normalização e atividades relacionadas – Vocabulário geral - Vocabulário Internacional de Metrologia. Rio de Janeiro, VIM, 1995. INMETRO - DOQ-DQUAL - 007 - Orientações sobre acordos de reconhecimento mútuo. Abr. 2001. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS - NBR 10.012-1: Requisitos de garantia da qualidade para equipamentos de medição. Nov. 1993. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: Informação e documentação - Referências - Elaboração. Rio de Janeiro, Ago. 2000. INMETRO – Vocabulário internacional de termos fundamentais e gerais de metrologiaVIM. 2. ed., Brasília, SENAI/DN, 2000. 75p. INMETRO - Vocabulário de metrologia legal. 2. ed., Brasília, SENAI/DN, 2000. 27p. REBLAS – Procedimentos operacionais da REBLAS, agosto, 2001. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS ISO GUIA 30: Termos e deinições relacionados com material de referência. 2000.. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS ISO/IEC GUIA 30: Ensaios de proiciência por comparações interlaboratoriais. Parte 1: Dsenvolvimento e operação de programas de ensaios de proiciência. 1999. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS ABNT/ISO/IEC GUIA 2 Normalização e atividades relacionadas – Vocabulário geral. 1998. VALLE, B.; BICHO, G.G. ISO/IEC 17.025: A Nova norma para Laboratórios de Ensaio e Calibração. Laboratórios & Controle de Processos, ano. 1, n. 5, abr. 2001. Colaboradores: Neus Sadocco Pascuet e Galdino Guttmann Bicho 62 - IAL CAPÍTULO II GENERALIDADES IAL - 63 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 64 - IAL Capítulo II - Generalidades II GENERALIDADES A s unidades de pesos e medidas adotadas neste livro são as do Sistema Nacional de Metrologia. Quadro 1 – Grandezas, unidades e símbolos de acordo com o SI Grandeza Comprimento Massa Tempo Corrente elétrica Temperatura termodinâmica Quantidade de matéria Intensidade luminosa Força Energia Pressão Superfície Volume Concentração Temperatura Diferença de potencial elétrico Unidade SI Nome Metro Quilograma Segundo Ampère Kelvin Mol Candela Newton Joule Pascal Metro quadrado Metro cúbico Mol por metro cúbico Grau Celsius Volt Símbolo m kg s A K mol cd N J Pa m2 m3 mol/m3 °C V IAL - 65 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Os múltiplos e sub-múltiplos decimais das unidades do Sistema Internacional constam no Quadro 2 Quadro 2 – Fatores, preixos e símbolos de acordo com o SI Fator 1024 1021 1018 1015 1012 109 106 103 102 101 Preixo Yotta Zetta Exa Peta Tera Giga Mega Quilo Hecto deca Símbolo Y Z E P T G M k h da Fator 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 10-21 10-24 Preixo deci centi mili micro nano pico femto atto zepto yocto Símbolo d c m m n p f a z y Os elementos, seus símbolos, números e pesos atômicos estão relacionados na Tabela 1. Tabela 1 – Tabela períodica dos elementos, seus respectivos números e pesos atômicos. Elemento Actínio Símbolo n° atômico Peso atômico Ac 89 227 Elemento Neodínio Símbolo n° atômico Peso atômico Nd 60 144 Alumínio Al 13 27 NeônIo Ne 10 20 Amerício Am 95 243 Neptúnio Mp 93 237 Antimônio Sb 51 122 Níquel Ni 28 58,5 Argônio Ar 18 40 Nióbio Nb 41 93 Arsênio As 33 75 Nitrogênio N 7 14 Astatínio At 85 210 Nobélio No 102 259 Bário Ba 56 137 Ósmio Os 76 190 Berquélio Bk 97 247 Oxigênio O 8 16 Berílio Be 4 9 Paládio Pd 46 106 Bismujto Bi 83 209 Fósforo P 15 31 Boro B 5 11 Platina Pt 78 195 Bromo Br 35 80 Plutônio Pu 94 244 66 - IAL Capítulo II - Generalidades Símbolo n° atômico Peso atômico Cádmio Cd 48 112 Cálcio Ca 20 Califórnio Cf Carbono C Elemento Símbolo n° atômico Peso atômico Polõnio Po 84 209 40 Potássio K 19 39 98 251 Praseodínio Pr 59 141 6 12 Promécio Pm 61 145 Elemento Cério Ce 58 140 Protactínio Pa 91 231 Césio Cs 55 133 Rádio Ra 88 226 Cloro Cl 17 35,5 Radônio Rn 86 222 Cromo Cr 24 52 Rênio Re 75 186 Cobalto Co 27 59 Ródio Rh 45 103 Cobre Cu 29 63,5 Rubídio Rb 37 85,5 Cúrio Cm 96 247 Rutênio Ru 44 101 Disprósio Dy 66 162,5 Samário Sm 62 150 Einstênio Es 99 252 Escândio Sc 21 45 Érbio Er 68 167 Selênio Se 34 79 Európio Eu 63 152 Silício Si 14 28 Férmio Fm 100 257 Prata Ag 47 108 Flúor F 9 19 Sódio Na 11 23 Frâncio Fr 87 223 Estrôncio Sr 38 87,5 Gadolínio Gd 64 157 Enxofre S 16 32 Gálio Ga 31 70 Tantâlio Ta 73 181 Germãnio Ge 32 73 Tecnécio Tc 43 98 Ouro Au 79 197 Telúrio Te 52 127,5 Háfnio Hf 72 178,5 Térbio Tb 65 159 Hélio He 2 4 Tálio Tl 81 204 Holmio Ho 67 165 Tório h 90 232 Hidrogênio H 1 1 Túlio Tm 69 169 Índio In 49 115 Estanho Sn 50 119 Iodo I 53 127 Titânio Ti 22 48 Irídio Ir 77 192 Tungstênio W 74 184 Ferro Fe 26 56 Unilquádio Unq 104 261 Kriptônio Kr 36 84 Unilpêntio Unp 105 262 Lantânio La 57 139 Unilhexio Unh 106 263 Lawrêncio Lr 103 262 Unilseptio Uns 107 262 Chumbo Pb 82 207 Urânio U 92 238 Lítio Li 3 7 Vanádio V 23 51 IAL - 67 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Símbolo n° atômico Peso atômico Lutécio Lu 71 175 Magnésio Mg 12 Manganês Mn Mendelévio Md Elemento Símbolo n° atômico Peso atômico Xenõnio Xe 54 131 24 Itérbio Yb 70 173 25 55 Itrio Y 39 89 101 258 Zinco Zn 30 65 Zircônio Zr 40 91 Mercúrio Hg 80 200 Molibdênio Mo 42 96 Elemento Baseada na tabela de pesos atômicos padrão da IUPAC de 1987. A expressão “até peso constante” signiica que os valores obtidos em duas pesagens sucessivas diferem, no máximo, em 0,0005 g por grama de substância. As temperaturas são dadas em graus Celsius (centígrados). Quando não for especiicada a temperatura em que devem ser feitas as determinações, subentende-se que seja à “temperatura ambiente”, isto é, entre (20 - 25)°C. Por “banho-maria” entende-se o processo de aquecimento no qual a substância é contida em recipiente mergulhado em água mantida em ebulição, ou em outras temperaturas, quando forem especiicadas. A expressão “mm de mercúrio”, usada para as medidas de pressão, refere-se ao uso de manômetros ou barômetros calibrados em relação à pressão exercida por uma coluna de mercúrio de igual número de milímetros de altura, a uma temperatura de 0ºC, medida num ambiente em que a aceleração da gravidade é normal. Densidade relativa é o termo empregado nos métodos analíticos como sinônimo de peso especíico. Representa a relação entre a massa aparente de uma substância, ao ar, a 20ºC e a massa de igual volume de água mantém nas mesmas condições de temperatura e pressão. Porcentagens são dadas, conforme as circunstâncias, em uma das quatro formas: • por cento m/m (massa por massa), expressando o número de gramas de substâncias contido em 100 g do produto • por cento m/v (massa por volume), expressando o número de gramas de substâncias contido em 100 mL do produto • por cento v/v (volume por volume), expressando o número de mililitros de substâncias em 100 mL do produto • por cento v/m (volume por massa), expressando o número de mililitros por 100 g do produto. 68 - IAL Capítulo II - Generalidades As concentrações das soluções de sólidos em líquidos são expressas em porcentagens de massa em volume (m/v), e as de líquidos em líquidos, em porcentagens de volume em volume (v/v) ou pela expressão soluções (a + b), indicando “a” o número de gramas ou mililitros da substância e “b” o número de mililitros de água adicionada. Por exemplo: HCl (1+2) signiica uma solução preparada adicionando-se 1 volume de HCl a 2 volumes de água. As soluções tituladas empregadas nas análises volumétricas são soluções de concentrações deinidas. Todas as soluções contidas neste livro estão expressas em molaridade, de acordo com a recomendação da International Union of Pure and Applied Chemistry IUPAC. Molar, M ou 1 M indica que a solução contém o peso do mol da substância de interesse por litro de solução. Entretanto, no caso de acidez titulável, o resultado pode ser expresso em: “acidez em solução Normal” ou em miliequivalentes por litro ou por quilo, quando a legislação vigente assim o indicar. Soluções indicadoras ou indicadores são as substâncias que se empregam, em solução ou in natura, para estabelecer o ponto inal desejado de uma reação química ou para medir a concentração de íons de hidrogênio, ou pH. Os recipientes utilizados para as medidas volumétricas devem ser calibrados tendo-se em vista a temperatura em que foram graduados. Devem ser de vidro neutro e estar perfeitamente limpos. A limpeza pode ser feita com solventes orgânicos (éter, acetona); solução de hidróxidos ou detergentes; mistura sulfocrômica, seguida de lavagens sucessivas com água comum (8 vezes) e água (3 vezes). Nas medições de volume, o nível inferior do menisco do líquido contido nos recipientes deve alorar o traço de aferição; somente nos casos de líquidos fortemente corados é que se deve usar como referência a borda superior do menisco. Os volumes medidos com vidraria de precisão (bureta, pipeta, balão volumétrico etc.) devem ser considerados com precisão até a 2ª casa após a virgula. O mesmo se aplica para pesagens em balança analítica, que devem ser feitas com precisão até a 4ª casa após a virgula. Neste livro não foram colocados, nos métodos, esses algarismos signiicativos. O termo “água” refere-se a água destilada, exceto quando houver outra especiicação e também no caso em que a água não izer parte da análise, como por exemplo, no caso do banho–maria. O termo “éter” refere-se a éter etílico, livre de peróxidos. O termo “álcool” refere-se a álcool etílico a 95%, v/v. Soluções alcoólicas x% podem ser preparadas pela diluição de x mL de álcool a 95% e completadas a 100 mL com água. Álcool absoluto é aquele com 99,5% de álcool em volume. Os ácidos e os hidróxidos utilizados são sempre os concentrados, a menos que, na técnica, seja indicada a diluição. IAL - 69 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 2 – Características de concentração de alguns reagentes Reagentes Ácido sulfúrico Ácido clorídrico Ácido nítrico Ácido fosfórico Ácido acético Hidróxido de amônio Densidade (kg/L) 1,84 1,19 1,42 1,69 1,05 0,90 Porcentagem m/m 95 – 98 36,5 – 38,0 69,0 – 71,0 85,0 99,7 28 – 30 Se não houver outra especiicação, solução de fenolftaleína usada como indicador é uma solução alcoólica a 1%; a solução de metilorange é uma solução aquosa a 0,1% e a de vermelho de metila usada, também, como indicador é uma solução alcoólica a 0,1%. Soluções reagentes prontas, oferecidas no comércio, devem ser analisadas antes de sua utilização em metodologias especíicas, pois podem conter tampões, agentes quelantes, estabilizantes ou outros compostos que podem interferir nas análises. Solução sulfocrômica de limpeza é preparada a partir de uma das seguintes formas: a) Adicione 1 L de ácido sulfúrico comercial a aproximadamente 35 mL de solução aquosa saturada de dicromato de sódio. b) Dissolva cuidadosamente 200 g de dicromato de potássio e 170 mL de ácido sulfúrico comercial em água e leve a 1000 mL. Estes reagentes podem ser de grau técnico. Use somente após uma primeira lavagem por meios convencionais, isto é, com detergente e após secagem. Esta mistura tem alto custo e é perigosa. Use repetidas vezes até que ela esteja diluída ou apresente uma coloração acinzentada ou esverdeada. Descarte cuidadosamente com bastante água. Estas operações devem ser realizadas por pessoal treinado. As preparações das principais soluções tituladas e dos reagentes usualmente empregados neste livro estão descritos no apêndice. Os métodos qualitativos e quantitativos descritos neste livro estão numerados em ordem seqüencial, independentemente do capítulo ao qual pertencem, objetivando facilitar sua utilização como referência, nos casos de habilitação, acreditação, ou mesmo troca de informações entre analistas de laboratórios distintos. Ao inal da descrição de cada método estão relacionadas as referências bibliográicas utilizadas. 70 - IAL Capítulo II - Generalidades Siglas a – absortividade A – absorbância AAS – espectrômetro de absorção atômica AFM1 – alatoxina M1 A.O.A.C. – Association of Oicial Analytical Chemists atm – atmosfera CCD – cromatograia em camada delgada CI – coluna de imunoainidade CLAE – cromatograia líquida de alta eiciência DAD – detector de aranjo de diodos DIC – detector de ionização de chama. – absortividade referente a absorbância de uma solução a 1% da espécie absorvente num solvente adequado, em cubeta de 1 cm. EDL – electrodeless discharge lamp (lâmpada de descarga sem eletrodo) ELISA – enzyme-linked immunisorbent assay ETAAS – espectrômetro de absorção atômica com forno de graite f – fator de correção FAAS – espectrômetro de absorção atômica com chama FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA – Food and Drug Administration FID – detector de ionização de chama GRAS – generally recognized as safe HCL – hollow cathode lamp (lâmpada de catodo oco) ICUMSA – International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis ICP OES – espectrômetro de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado ISO – International Organization for Standardization IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry mµ – milimicron (10-6 mm) NED – alfa-naftiletilenodiamina ng – nanograma (10-9 g) NIST – National Institute of Standards and Technology OTA – ocratoxina A PI – padrão interno ppb – partes por bilhão (1/109) ppm – partes por milhão (1/106) Rf – quociente entre as distâncias percorridas simultaneamente desde o ponto de partida até o centro de maior concentração da mancha do soluto e até a frente da fase móvel - cromatográia em papel ou em camada delgada. rpm – rotações por minuto IAL - 71 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital SCAN – varredura completa na faixa de massas selecionadas SIM – monitoramento de alguns íons selecionados com determinados valores da relação massa/carga. Split – divisor de amostra T – transmitância TFS – solução-tampão salina TSFT – solução-tampão salina de trabalho TISSAB – total ion strenght adjustor bufer UV/VIS – ultravioleta/visível µg – micrograma (10-6 g) µm – micron ou micrômetro (10-6 m) WHO – Word Health Organization Referências bibliográicas BRASIL. Leis, Decretos etc, - Resolução nº 01/82 do Conselho Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Diário Oicial, Brasília, 10 maio 1982. Seção 1, p. 8384-8393. INMETRO. Vocabulário internacional de termos fundamentais e gerais de metrologia. Duque de Caxias, RJ, 1995. 52 p. INMETRO. Sistema Internacional de Unidades. SI. 6. ed. Brasília, SENAI/DN, 2000.114 p. Convênio SENAI/DN/INMETRO. MORITA, T.; ASSUMPÇÃO, R.M.V. Manual de soluções, reagentes & solventes: padronização, preparação, puriicação. 2. ed. São Paulo: Edgard Blücher, 1976. p. 279. Colaboradores Neus Sadocco Pascuet e Odair Zenebon 72 - IAL CAPÍTULO III COLHEITA DE AMOSTRAS IAL - 73 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 74 - IAL Capítulo III - Colheita de Amostras III COLHEITA DE AMOSTRAS colheita de amostras constitui a primeira fase da análise do produto. As amostras de produtos alimentícios destinadas à análise poderão ser colhidas nos locais de fabricação, preparo, depósito, acondicionamento, transporte e exposição à venda. A colheita deverá ser feita com observância das condições técnicas prescritas por estes procedimentos. A colheita adequada da amostra, cercada de todas as precauções, viabilizará as condições corretas para o processo de análise; caso contrário, este processo será comprometido ou impossibilitado. A amostra colhida em quantidade suiciente para a realização da análise deverá ser acondicionada de forma a resguardá-la de qualquer alteração e ser adequadamente identiicada. A amostra, identiicada e rotulada, será acompanhada de um relatório com as informações necessárias para a realização da análise e a emissão do laudo analítico. As amostras facilmente deterioráveis serão conservadas em refrigerador e, quando for o caso, em congelador. O seu processamento, desde a colheita até a análise, deverá ser efetuado o mais rápido possível. A amostra deverá ser representativa do lote, estoque ou partida, em proporção adequada à quantidade do produto existente no local da colheita. Daí a necessidade de que a colheita seja previamente planejada, não só no que se refere à quantidade das amostras, mas também com relação à espécie do produto e aos parâmetros a serem analisados. Dentro do conceito fundamental de que a análise começa com a colheita da amostra, torna-se necessário que este procedimento seja efetuado com todas as precauções necessárias. No laudo analítico, deverão ser registradas todas as condições em que a amostra foi recebida, tais como, embalagem, temperatura, entre outras. O agente responsável pela amostragem deverá ser a autoridade sanitária que tenha recebido treinamento, tanto na parte tecnológica como na analítica. O treinamento tecnológico, no que se refere ao processo de fabricação dos alimentos possibilitará a aquisição de informações úteis que devem ser registradas no termo de colheita da amostra a ser analisada, bem como instruir os produtores, visando corrigir possíveis deiciências nas instalações, no equipamento, enim, concorrer para a melhoria do alimento a ser comercializado. A IAL - 75 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital As amostras de alimentos devem ser colhidas segundo um plano particular de procedimentos. Sempre que possível esse plano deverá proporcionar amostras representativas do lote. Um dos problemas mais freqüentes a respeito da análise bromatológica é a determinação do tamanho da amostra a ser colhida. Quando nenhuma instrução especíica é , sendo x igual ao número fornecida, a regra geral é colher amostras correspondentes a de unidades do lote. Ordinariamente, quando se refere a grandes cargas, por exemplo, existentes em indústrias e armazéns, devem ser colhidas não menos que 12 unidades e não mais que 36, sendo que cada unidade deverá ser proveniente de recipientes diferentes. Amostragem para análise fiscal e de controle As amostras para análise iscal devem ser colhidas em triplicata: uma delas é deixada em poder do detentor ou depositário do produto para eventual perícia de contraprova e as outras duas são encaminhadas ao laboratório, respectivamente, para análise e perícia desempatadora, se necessário. Quando a quantidade ou a natureza do alimento não permitir a colheita das amostras em triplicata, a análise iscal será realizada em amostra única. Os procedimentos para a realização das análises iscais estão previstos em legislações especíicas. A análise de controle é efetuada no laboratório após o registro do alimento no órgão competente de Vigilância Sanitária e também para aqueles dispensados da obrigatoriedade de registro no Ministério da Saúde, quando de sua entrega ao consumo e serve para provar a conformidade do produto com o seu respectivo padrão de identidade e qualidade. Na análise de controle serão observadas as normas estabelecidas para a análise iscal. A análise de controle também é realizada para a liberação de alimentos importados em postos alfandegários. Acondicionamento As amostras colhidas deverão ser imediata e devidamente acondicionadas. Este acondicionamento será considerado adequado se for capaz de impedir qualquer alteração na amostra. A escolha do tipo de acondicionamento ou do recipiente depende do estado físico do produto: líquido, sólido ou semi-sólido. Na escolha do acondicionamento deverá ser levado em conta o tipo de análise à qual vai ser submetida. Assim, se a amostra se destina a testes microbiológicos, tornar-se-à imprescindível acondicioná-la em recipiente ou material de embalagem estéril que impeça a sua eventual contaminação do produto. Os produtos industrializados poderão ser colhidos em suas embalagens originais. Recomenda-se o uso de recipientes de vidro, louça e outras embalagens semelhantes para gordura, frituras, produtos úmidos ou higroscópicos (carnes e outros). As amostras de substâncias líquidas são geralmente acondicionadas em frascos plásticos ou de vidro. Para 76 - IAL Capítulo III - Colheita de Amostras análise de resíduos de metais, não é aconselhável utilizar vidro para acondicionar amostras de alimentos; alternativamente, deve-se usar recipientes de polietileno. Diferentemente, para acondicionar amostras para análise de pesticidas utilize embalagens de vidro e, quando for possível, de papel. Lacração A lacração dos invólucros das amostra iscais e de controle terá por objetivo evitar qualquer alteração deliberada do conteúdo da embalagem. Isto pode ser obtido não somente com o uso do lacre mas, ainda, por vedação hermética para que em caso de violação, esta se torne evidente. Assim, poderão ser empregados selos e botões de pressão que permitam seu uso por uma só vez ou engenhos semelhantes. Poderão ser usados, como invólucros, sacos de plástico ou papel resistentes para acondicionar amostras de todos os tipos de alimentos, os quais poderão ser posteriormente lacrados pelos métodos acima citados. O uso de sacos de papel lacrado será especialmente recomendado quando o fechamento for diicilmente conseguido por outro método. Quando forem tomadas várias unidades da mesma partida, a lacração deverá ser feita juntando-se os recipientes como foi acima descrito. Quando a embalagem for constituída por saco plástico, torna-se importante que a parte da costura inferior ique presa ao lacre da amostra. Rotulagem Cada amostra colhida deverá ser rotulada de modo a não se confundida. O método mais simples é escrever as características da amostra diretamente no papel do invólucro do recipiente. Nos recipientes em que é difícil escrever, poderão ser ixados e amarrados rótulos ou etiquetas onde estejam descritas as características da amostra. No caso de amostras já acondicionadas em pacotes ou garrafas, será necessário tomar cuidado para que a descrição do produto e outros detalhes importantes na embalagem original não sejam ocultos pelo rótulo da amostra. Transporte A amostra deverá ser remetida para o laboratório de análise o mais rapidamente possível. Serão tomadas as devidas precauções para assegurar que o resultado da análise não seja comprometido pela utilização de um método inadequado de transporte que acarrete longas demoras ou no qual a amostra esteja sujeita à deterioração. Termo de colheita O agente responsável pela colheita da amostra deverá remetê-la ao laboratório de análise, juntamente com um termo de colheita contendo todas as informações necessárias IAL - 77 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital para o analista, por exemplo: a data da colheita e motivo de apreensão; origem da mercadoria e data de sua produção ou aquisição; tipo e duração da armazenagem; nome e endereço do fabricante ou detentor; quantidade em estoque da mercadoria, após a colheita da amostra; os números dos lacres das amostras colhidas; o tipo de exame necessário ou uma breve descrição do motivo que originou tal colheita. É aconselhável, também, fazer uma descrição sucinta do local onde foi apreendida a amostra. No caso de alimentos perecíveis que necessitem de refrigeração, é fundamental mencionar a temperatura em que se encontravam no momento da colheita. Colheita de amostras de produtos não homogêneos em grandes estoques Quando tiver que ser exarado um laudo sobre produtos que não apresentem homogeneidade ou com tendência a apresentar separação de fases, as amostras deverão ser tomadas em vários pontos ou de vários recipientes da partida. Para se obter uma amostra que permita chegar a uma conclusão da qualidade média de toda a partida (ou da parte adequada da partida, a ser misturada), deverá ser tomada precaução para que a amostra (em volume signiicante em comparação com o volume da mercadoria a ser analisada) seja semelhante, em qualidade, à que seria obtida se retirada da quantidade total da mercadoria após ser cuidadosamente misturada. Quanto maior for a partida de mercadorias a serem testadas, para veriicação de sua qualidade média, tanto maior o número de recipientes individuais dos quais as porções deverão ser retiradas. Essas serão depois perfeitamente misturadas e a quantidade de amostra a ser remetida para análise deverá ser tirada da mistura resultante. Quando se tratar de amostras de alimentos armazenados em sacos, barris, engradados ou qualquer grande recipiente (inclusive produtos em grandes parcelas, tais como batatas, frutas e outros), será, por vezes, necessário esvaziar os recipientes, misturar bem e considerar o todo para obter uma amostra realmente média. No caso de grandes estoques de alimentos assim armazenados, mas que, presumivelmente, apresentam homogeneidade, será necessário tomar a amostra média de 1 recipiente, se o número de recipientes não for superior a 5, de 10% dos recipientes com um mínimo de 5, se não excederem a 100; de 5%, com um mínimo de 10, se não excederem a 200; de 3% com um mínimo de 25, se excederem a 2000 , e de 1% com um mínimo de 50, se excederem a 2000. Um número de 5 amostras deve ser obtido de vários pontos da carga de um caminhão ou de uma grande pilha de mercadoria, tomando-se as devidas precauções para que unidades de diferentes tamanhos sejam reunidas proporcionalmente à composição da partida toda. Nos recipientes com produtos granulados (por exemplo: 78 - IAL Capítulo III - Colheita de Amostras cereais), os componentes não são igualmente distribuídos porque as partículas menores, terra, areia, pequenas sementes, ou as mais pesadas, caem no fundo do recipiente. Por essa razão, as diferentes camadas deverão ser levadas em conta para a obtenção da amostra média. O conteúdo de pequenas gavetas ou caixas deverá, como medida prática, ser esvaziado e reunido em monte cuidadosamente misturado, e a amostra retirada do total. Em um produto ensacado, a amostra deverá ser obtida retirando-se partes do alto, centro e fundo do saco; estas partes devem ser misturadas e, a partir da mistura, retirada a amostra média. No caso de serem grandes os lotes de produtos ensacados, o número de sacos dos quais se retira a amostra, será determinado de acordo com o padrão acima descrito. A amostra retirada de um único ponto é casual, não permite avaliar a qualidade de um grande volume do alimento. Líquidos que se separam em camadas devem ser cuidadosamente misturados antes da tomada da amostra. Líquidos contidos em pequenos barris icam melhor homogeneizados quando se rola o barril. O conteúdo de latas deve ser homogeneizado por agitação, antes da tomada da amostra para análise. Pequenas porções de líquido são homogeneizadas passando-as diversas vezes de um para outro recipiente, mexendo-as e agitando-as. A amostra de líquidos que não se separam em fases, sempre que possível, deve ser tomada do centro do recipiente, com sifão ou pipeta. Líquidos parcial ou completamente gelados deverão ser perfeitamente homogeneizados, como foi acima descrito, antes da retirada da amostra. O modo descrito para amostragem com líquidos pode ser adotado também para mercadorias de consistência oleosa, viscosa ou untuosa. Contudo, se as mercadorias não puderem ser misturadas por rotação ou agitação do recipiente, deverá ser utilizada uma espátula ou equivalente para homogeneização da amostra. Obviamente, as informações explicativas que devem ser enviadas ao laboratório encarregado da análise, que acompanham as várias amostras obtidas de diferentes partes de uma grande partida de mercadoria, ou a amostra média de uma partida de mercadorias, que se supõe ser homogênea, devem conter, além dos informes usuais, particularidades de observação sobre as diferenças de qualidade entre várias partes que compõem a partida ou quaisquer outros detalhes que possam ser úteis aos analistas. Conduta para obtenção da amostra de produtos pré-embalados Em produtos pré-embalados ou acondicionados em vasilhames, deverá ser coletada como amostra o menor recipiente ou vasilhame exposto à venda ao consumidor, como item isolado e, quando necessário, mais de um. Quando as amostras forem tomadas de grandes vasilhames, o produto deverá ser perfeitamente misturado, se não for homogêneo ou apresentar tendência à separação de fases. O conteúdo de IAL - 79 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital cada vasilhame deverá corresponder ao respectivo padrão mínimo. No caso de ser necessário veriicar a qualidade de uma grande partida de produtos pré-embalados, proceder como para colheita de amostras de produtos não homogêneos, em grandes estoques. Colheita de água para determinações físico-químicas gerais Para determinações físico-químicas gerais em água, como cor, turbidez, dureza e outros parâmetros, a colheita pode ser feita em frasco de água mineral de primeiro uso, com sua tampa original. O frasco e sua tampa devem ser enxaguados, com a água a ser coletada, por seis vezes. Se a colheita for feita em torneiras, deixe a água escorrer naturalmente durante três minutos aproximadamente. Após a colheita, ixe a tampa de modo a evitar vazamentos e identiique a amostra, que deve ser transportada sob refrigeração. Colheita e preservação de amostra de água para a determinação de metais totais Na colheita de água para a determinação de metais totais, deve-se utilizar frascos de polipropileno ou polietileno de alta densidade com tampa do mesmo material. A capacidade do frasco dependerá da técnica a ser utilizada para a quantiicação dos metais, conforme Tabela 1. Frascos de vidro borossilicato poderão ser utilizados, porém cuidados devem ser observados para não utilizar frascos de vidro comum. Preparo dos frascos para colheita – Use frascos previamente lavados e descontaminados quimicamente com ácido nítrico e enxaguados em água destilada e deionizada, conforme orientação técnica do laboratório. Colheita da amostra – No ponto de amostragem, abra o frasco e colha a água evitando o contato da boca do frasco com as mãos ou qualquer objeto metálico (incluindo torneiras), para evitar problemas de contaminação. No caso de torneiras, deixe-as abertas com a água escorrendo por cerca de três minutos. Feche o frasco imediatamente após a colheita da amostra e agite para homogeneizar o conservante. Para cada ponto de amostragem, colha dois frascos de água. Use 0,5 mL de HNO3 a 40% para 100 mL de amostra. No caso da determinação de mercúrio, para cada frasco de colheita de 100 mL, coloque 2 g de NaCl (previamente testado para veriicar a ausência de mercúrio) e adicione 5 mL de HNO3 a 40%. O laboratório deve fornecer os frascos contendo o conservante. Em cada ponto de amostragem, colha dois recipientes para a determinação de mercúrio e outros dois para os outros metais. 80 - IAL Capítulo III - Colheita de Amostras Tabela 1 - Capacidade do frasco de colheita para cada tipo de técnica analítica TÉCNICA ANALÍTICA Absorção atômica com chama Absorção atômica com forno de graite ICP OES e gerador de hidretos Absorção atômica com gerador de vapor frio CAPACIDADE DO FRASCO (mL) 1000 100 100 100 Colheita e preservação de amostra de água para a determinação de solventes orgânicos Utilize frascos de vidro com capacidade de 500 mL, com tampas de vidro ou outro material inerte, à prova de vazamentos, lavados com detergente neutro, esfregando muito bem as paredes com gaspilhão; retire totalmente o detergente com água. Adicione aos frascos 1 mL de HCl 6 M, como conservante. Ajuste o luxo da torneira em 500 mL/min. Se a amostra contiver cloro livre ou combinado, adicione, como agente redutor, 50 mg de tiossulfato de sódio ou 250 mg de ácido ascórbico para 500 mL de amostra de água. As amostras devem ser transportadas, o mais rápido possível, em caixas isotérmicas com gelo reaproveitável ou gelo embalado em saco plástico. Colheita e preservação de amostra de água para a determinação de agrotóxicos Utilize frascos de vidro com capacidade de 2000 mL, com tampas de vidro ou outro material inerte, como por exemplo tampa de rosca com batoque de telon, à prova de vazamentos. Lave com detergente neutro, esfregando muito bem as paredes internas com gaspilhão e retire totalmente o detergente com água. Enxágüe o frasco e sua tampa com a água a ser analisada por seis vezes. Em cada ponto de amostragem, colha em um recipiente e feche-o imediatamente. Proceda a colheita evitando o contato da boca dos recipientes com a parte externa do ponto de amostragem, prevenindo a contaminação da amostra. As amostras devem ser conservadas refrigeradas e transportadas, o mais rápido possível, em caixas isotérmicas com gelo reaproveitável ou gelo embalado em saco plástico bem fechado. Referências bibliográicas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods IAL - 81 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington D.C.:A.P.H.A., Chapter 3,1995, p.5. CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. Guia de coleta e preservação de amostras de água. 1. ed., São Paulo, 1987. 150 p. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Manuals of food quality control. 5. Food inspection. Chapter 3, Rome:FAO/WHO, 1981. p. 23-43. (FAO Food and Nutrition paper 14/5 prov.). INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 4-9. WEISS, H. V.; SHIPMAN, W. H.; GUTTMAN, M. A. effective storage of dilute mercury solutions in polyethylene. Anal. Chim. Acta, v. 81, p. 211-217, 1976. Colaboradores Alice Momoyo Sakuma; Maria Anita Scorsafava; Vera Regina Rossi Lemes; Odair Zenebon e Sabria Aued Pimentel 82 - IAL CAPÍTULO IV PROCEDIMENTOS E DETERMINAÇÕES GERAIS IAL - 83 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 84 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais IV PROCEDIMENTOS E DETERMINAÇÕES GERAIS Pré-tratamento da amostra E xamine cuidadosamente as condições da amostra. Retire partes representativas dela e em quantidade suficiente para análise em triplicata e eventuais repetições do ensaio. Conserve ao abrigo de umidade, da luz e de contaminações. Quando necessário, mantenha em temperatura mais baixa que a do ambiente. Se houver necessidade, a amostra deve ser homogeneizada em liqüidificador ou multiprocessador. Amostras sólidas – Quando possível, homogeneíze a amostra agitando a embalagem antes ou após abertura, neste último caso evite o uso de utensílios de metal. As amostras de carne e produtos de carne devem ser separadas dos ossos, pele ou couro. No caso de pescado, devem-se retirar os diferentes componentes não comestíveis da amostra (sem pele e espinhas), utilizando somente o filé. Dependendo do tipo de análise, quando as amostras forem hortaliças in natura, elas devem ser lavadas, descascadas (quando for o caso) e utilizadas somente as partes comestíveis. Amostras líquidas – Agite a amostra a fim de homogeneizar completamente. Inspeção da amostra Inspecione cada amostra, anotando marcas, códigos, rótulos e outros fatores de identificação. Examine, cuidadosamente, cada amostra para verificar indicações de anormalidade que se manifestem em seu aspecto físico, formação de gás, cheiro, alteração de cor, condições da embalagem e anote o resultado. Antes de abrir os enlatados, observe se há tufamento das latas e, depois de abertos, o estado interno das mesmas. IAL - 85 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Preparo da amostra para análise A amostra para análise deve-se apresentar homogênea. Precisa ser conservada ao abrigo de umidade e de contaminações. Em certos casos, deverá ser conservada também ao abrigo da luz e em temperatura mais baixa que a do ambiente. Amostras sólidas em pó ou em grânulos – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Triture em gral ou moinho, se necessário, e passe por um tamis de 144 furos por cm2. Espalhe com uma espátula sobre uma folha grande de papel de filtro. Separe em quatro partes em forma de cruz. Retire dois segmentos opostos e devolva para o pacote. Misture as duas partes restantes e repita o processo de separação de quatro segmentos. Continue assim até obter quantidade suficiente de material, para análise em triplicata. Amostras líquidas – Agite a amostra até homogeneizar bem. Filtre se necessário. Nos casos de produtos gaseificados, como refrigerantes e vinhos espumantes, transfira, antes de filtrar, para um béquer seco e agite com um bastão de vidro até eliminar o gás. Sorvetes e gelados – Deixe em repouso à temperatura ambiente, até liquefazerem, para depois serem homogeneizados e guardados em frascos com rolha esmerilhada. Produtos semi-sólidos ou misturas líquidas ou sólidas – Produtos como queijo e chocolate devem ser ralados grosseiramente. Tire a amostra por método de quarteamento. Pastas semiviscosas e líquidos contendo sólidos – Produtos como pudins, sucos de frutas com polpa, geléias com frutas, doces de massa com frutas devem ser homogeneízados em liqüidificador ou multiprocessador. No caso de se desejar a análise em separado dos diferentes componentes da amostra (balas, bombons, compotas, conservas e recheios), proceda inicialmente à separação dos componentes por processo manual ou mecânico. Determinações Gerais 001/IV Determinação do espaço livre – Recipiente de forma regular Nos produtos embalados, é de interesse a determinação do espaço livre, pois por meio deste procedimento pode-se controlar o conteúdo da embalagem e a tecnologia empregada neste envasamento. 86 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Procedimento – Abra o recipiente e meça, com precisão de milímetros, a distância compreendida entre o nível superior do produto e o nível da altura da tampa. Retire o conteúdo e meça, com precisão de milímetros, a distância compreendida entre o fundo do recipiente e o nível da altura da tampa. Cálculo d1 = distância entre o nível superior do produto e a tampa, em mm d2 = distância entre o fundo do recipiente e a tampa, em mm Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 13. 002/IV Determinação do espaço livre – Recipiente de forma irregular Procedimento – Marque, com caneta de retroprojetor ou com fita crepe, os níveis da tampa e do conteúdo do recipiente. Transfira o conteúdo do recipiente para uma proveta e anote o volume com precisão de mL (V1). Encha o recipiente com água até o nível da tampa, transfira o líquido para uma proveta e anote o volume com precisão de mL (V2). Cálculo V2 = volume máximo do recipiente em mL V1 = volume da amostra em mL Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 13. IAL - 87 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 003/IV Sólidos drenados em relação ao peso total Em conservas, compotas e similares, em que frutas, vegetais etc. se encontram misturados a líquidos, como caldas, óleo, vinagre etc., muitas vezes é importante o controle desta relação. Procedimento – Pese o recipiente com todo o seu conteúdo, com precisão de 0,1 g. Abra o recipiente e escorra o conteúdo sobre um tamis, mantendo-o ligeiramente inclinado, durante cinco minutos. Pese o recipiente vazio, com precisão de 0,1 g. Coloque no recipiente o produto sólido e pese novamente, com precisão de 0,1 g. Calcule o conteúdo porcentual de sólidos em relação ao peso total. Cálculo P1 = peso do recipiente após ter escorrido o líquido, em g P2 = peso do recipiente vazio, em g P3 = peso do recipiente com todo seu conteúdo Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 13-14. 004/IV Reação para gás sulfídrico – Prova de Éber O estudo da conservação de certos produtos protéicos poderá ser avaliado também por meio desta reação, onde se constata a presença de gás sulfídrico, proveniente da decomposição de aminoácidos sulfurados que normalmente são liberados nos estágios de decomposição mais avançados. O H2S combinado com acetato de chumbo ou plumbito de sódio produz sulfeto de chumbo (PbS), revelando mancha preta espelhada em papel de filtro. No caso de produtos embalados, estas reações deverão ser feitas ao abrir-se o recipiente. No de carnes, conservas de carne, pescados etc., tão logo se inicie o exame da amostra. 88 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Material Balança semi-analítica, banho-maria, espátula, elástico para papel, frasco Erlenmeyer de 125 mL, papel de filtro de 9 cm de diâmetro e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Solução de acetato de chumbo a 5% (m/v) Ácido acético glacial Solução saturada de acetato de chumbo (alternativa) Solução de hidróxido de sódio a 10% (m/v) Solução de acetato de chumbo – Prepare 100 mL de solução de acetato de chumbo a 5% (m/v). Adicione 1 mL ácido acético. Agite vigorosamente. Conserve a solução em frasco de vidro âmbar fechado. Solução de plumbito de sódio (alternativa) – Prepare uma solução saturada de acetato de chumbo e adicione solução de hidróxido de sódio a 10% até dissolver o precipitado. Conserve a solução em frasco de vidro âmbar fechado. Procedimento – Transfira 10 g da amostra homogeneizada para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Feche com dois discos sobrepostos de papel de filtro com auxílio de elástico. Com uma pipeta, embeba a superfície do papel com solução de acetato de chumbo (ou plumbito de sódio). Coloque o frasco em banho-maria de modo que o fundo do frasco fique a 3 cm acima do nível da água fervente. Aqueça por 10 minutos. O aparecimento de mancha preta no papel de filtro em contato com os vapores indica a presença de gás sulfídrico. Considere em bom estado de conservação – reação negativa – as amostras que apresentarem uma reação de gás sulfídrico inferior à produzida por 0,1 mg de Na2S.9H2O em meio ácido, que corresponde a 0,014 mg de H2S, nas condições do método adotado. Notas Em lugar da solução de acetato de chumbo pode-se usar a solução de plumbito de sódio. A reação de Éber não se aplica no caso de alimentos muito condimentados, temperados com alho, cebola e de conservas de carne e pescado que foram processadas em alta temperatura e baixa pressão. Em alguns casos, somente o conjunto desta e outras provas será decisório para uma avaliação do estado de conservação do produto. IAL - 89 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 14-15. 005/IV Reação para amônia – Prova de Éber O estado de conservação de alimentos protéicos pode ser avaliado por meio da reação de Éber para amônia. A liberação de amônia indica o início da degradação das proteínas. A amônia, ao reagir com o ácido clorídrico, forma cloreto de amônio (NH4Cl) sob a forma de vapores brancos. Material Provetas de 50 e 150 mL, balão volumétrico de 250 mL, tubos de ensaio de 25 mL e arame de 20 cm de comprimento com extremidade recurvada tipo anzol. Reagentes Ácido clorídrico Éter Álcool Reagente de Éber – Em balão volumétrico de 250 mL, misture 50 mL de ácido clorídrico e 150 mL de álcool. Resfrie e complete o volume com éter. Procedimento – Transfira 5 mL do reagente de Éber para um tubo de ensaio de 25 mL. Fixe um pedaço da amostra na extremidade do arame tipo anzol e introduza no tubo de ensaio de modo que não toque nem nas paredes do tubo nem na superfície do reagente. O aparecimento de fumaças brancas e espessas indica que o produto está em início de decomposição. Notas Repita a prova com diferentes porções da amostra. Em alguns casos somente o conjunto desta e outras provas será decisório para uma avaliação do estado de conservação do produto. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 15. 90 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais 006/IV Ponto de fusão – Substâncias facilmente reduzíveis a pó Ponto de fusão de um sólido é a faixa de temperatura em que este inicia a sua transformação para o estado líquido, até se fundir totalmente. A determinação é feita em aparelhos como o descrito abaixo ou em qualquer outro capaz da mesma precisão. Como todo aparelho, deve ser submetido à calibração empregando uma das substâncias puras da Tabela 1. Tabela 1 – Relação de substâncias puras e seus pontos de fusão Substâncias puras Vanilina Acetanilida Fenacetina Sulfanilamida Acido 5,5-dietilbarbitúrico Cafeína Ponto de fusão 81 - 83°C 114 - 116°C 134 - 136°C 164,5 - 166,5°C 187 - 190°C 234 - 237°C Material O aparelho para determinação do ponto de fusão consiste essencialmente de um recipiente de vidro de capacidade apropriada para um banho de líquido incolor; um agitador, que poderá ser um bastão de vidro, convenientemente dobrado duas vezes em ângulo reto; um termômetro cuidadosamente calibrado e controlado de (-10 a 365)°C (em lugar deste termômetro único, pode-se usar, com vantagens, uma coleção de termômetros de escala curta, cada um abrangendo um intervalo de 50°C); um tubo capilar de 9 cm de altura, (0,9 a 1,1) mm de diâmetro interno, e paredes de espessura entre 0,2 a 0,3 mm; uma lente de aumento (cerca de dez vezes) e uma fonte de calor, elétrica ou chama direta. Os líquidos empregados no banho são escolhidos, de acordo com a temperatura a ser determinada, pela Tabela 2. Tabela 2 – Relação de líquidos empregados em banhos para determinação do ponto de fusão Temperatura até 100°C até 150°C até 250°C até 400°C Líquidos água glicerol parafina líquida silicone IAL - 91 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital O uso de silicone líquido torna mais simples esta escolha, uma vez que ele cobre todo o intervalo da temperatura acima. Procedimento – A substância é reduzida a pó fino e seco no vácuo ou em estufa abaixo do ponto de fusão. É introduzida, em pequenas porções, no tubo capilar fechado numa das suas extremidades. Depois de colocar cada porção, insira o capilar com a ponta fechada para baixo dentro de um tubo de vidro de 50 cm, aberto nas duas extremidades e apoiado verticalmente de encontro a uma superfície dura. Repita esta operação várias vezes até obter uma coluna compacta de cerca de 2 mm da substância. Aqueça o banho com o líquido apropriado até que sua temperatura esteja 30°C abaixo do ponto de fusão da substância em exame. Introduza, então, o capilar preso ao termômetro com um fio de platina ou um anel de borracha, ou por simples adesão de ambos, no líquido do banho, ficando a substância no capilar na altura do bulbo do termômetro e este totalmente coberto pelo banho e a 2 cm do fundo do recipiente. Continue o aquecimento de modo a ter um grau de aumento de temperatura por minuto. A leitura é direta. Denomina-se início de fusão quando o sólido inicia a transformação para o estado líquido e final quando se torna inteiramente líquido. Estas duas temperaturas dão o intervalo de fusão da substância. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 16-17. 007/IV Ponto de fusão – Substâncias não facilmente reduzíveis a pó Procedimento – O material é cuidadosamente fundido na temperatura mais baixa possível e introduzido numa altura de 10 mm no capilar aberto. Deixe o capilar a 0°C por duas horas ou a 10°C por 24 horas. Prenda o capilar ao termômetro e proceda como indicado em 006/IV, verificando se o nível da substância está a 10 mm abaixo do nível do banho. Aqueça como indicado em 006/IV, até 50°C abaixo do ponto esperado e, depois, numa velocidade de meio grau por minuto. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 17-18. 92 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais 008/IV Ponto de fusão com aparelho elétrico Procedimento – Para a determinação do ponto de fusão pelo método do capilar, são necessários alguns miligramas de amostra. A determinação de frações dessa quantidade poderá ser efetuada com um aparelho provido de uma câmara metálica aquecida eletricamente, adaptada a um microscópio para a observação da fusão. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 18. 009/IV Ponto de congelamento Para as finalidades deste livro, ponto de congelamento de um líquido ou de um sólido fundido é a mais elevada temperatura em que o mesmo se solidifica. Material Aparelho – Um tubo de ensaio de aproximadamente 2 cm de diâmetro por 10 cm de comprimento mantido, mediante uma rolha de cortiça perfurada, num tubo de aproximadamente 3 cm de diâmetro por 12 cm de comprimento e um termômetro calibrado. Procedimento – Salvo indicações especiais, coloque cerca de 10 mL de líquido ou 10 g de sólido fundido no tubo de ensaio seco. Esfrie o conjunto dos dois tubos em água ou numa mistura refrigerante apropriada, de modo que a temperatura do líquido alcance cerca de 5°C abaixo do ponto de congelamento indicado. Com o termômetro, agite suavemente o líquido até que ele comece a solidificar. O congelamento pode ser induzido, adicionando-se ao líquido pequenos cristais da substância ou atritando-se as paredes internas do tubo, com o termômetro. Tome como ponto de congelamento a temperatura mais elevada observada durante a solidificação e mantida constante por cerca de um minuto. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.18. IAL - 93 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 010/IV Índice de refração O índice de refração de uma substância pura é uma constante, mantidas as condições de temperatura e pressão e, como tal, pode ser usado como meio de identificação da mesma. Em análise de alimentos, embora não se tratem de substâncias puras no estrito sentido, em certos casos, como o de óleos, gorduras e óleos essenciais, o índice de refração apresenta variação muito pequena e é então usado para uma avaliação do produto. O índice de refração da água a 20°C é 1,333. A presença de sólidos solúveis na água resulta numa alteração do índice de refração. É possível determinar a quantidade de soluto pelo conhecimento do índice de refração da solução aquosa. Esta propriedade é utilizada para determinar a concentração de sólidos solúveis em soluções aquosas de açúcar. As Tabelas 3, 4 e 5 auxiliam na calibração dos equipamentos com escala de índice de refração e graus Brix para a determinação de sólidos solúveis. A medida do índice de refração pode ser feita diretamente em aparelhos como: refratômetro de Abbé ou refratômetro de imersão que possuem pequeno intervalo de leitura, mas grande precisão. Esses equipamentos devem ser previamente calibrados com água. Tabela 3 – Variação do índice de refração da água com a temperatura Temperatura ºC Índice de refração Temperatura ºC Índice de refração 15 1,3334 21 1,3329 16 1,3333 22 1,3328 17 1,3332 23 1,3327 18 1,3332 24 1,3326 19 1,3331 25 1,3325 20 1,3330 - - 94 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Tabela 4 – Índices de refração de soluções de sacarose a 20ºC (% peso no ar) Índice de refração 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 1,33 - - - 0,000 0,697 1,393 2,085 2,774 3,459 4,140 1,34 4,818 5,492 6,163 6,831 7,495 8,155 8,812 9,466 10,117 10,765 1,35 11,409 12,050 12,687 13,322 13,953 14,582 15,207 15,830 16,449 17,065 1,36 17,679 18,289 18,897 19,502 20,104 20,704 21,300 21,894 22,485 23,074 1,37 23,660 24,243 24,824 25,407 25,987 26,565 27,140 27,713 28,282 28,849 1,38 29,413 29,975 30,534 31,090 31,644 32,195 32,743 33,289 33,832 34,373 1,39 34,912 35,448 35,982 36,513 37,042 37,568 38,092 38,614 39,134 39,651 1,40 40,166 40,679 41,190 41,698 42,204 42,708 43,210 43,710 44,208 44,704 1,41 45,197 45,688 46,176 46,663 47,147 47,630 48,110 48,588 49,064 49,539 1,42 50,011 50,481 50,949 51,416 51,880 52,343 52,804 53,263 53,720 54,176 1,43 54,629 55,091 55,550 56,008 56,464 56,918 57,371 57,822 58,271 58,719 1,44 59,165 59,609 60,051 60,493 60,932 61,370 61,807 62,241 62,675 63,107 1,45 63,537 63,966 64,394 64,820 65,245 65,669 66,091 66,512 66,931 67,349 1,46 67,766 68,182 68,596 69,009 69,421 69,832 70,242 70,650 71,058 71,464 1,47 71,869 72,273 72,676 73,078 73,479 73,879 74,278 74,675 75,072 75,469 1,48 75,864 76,258 76,651 77,044 77,435 77,826 78,216 78,605 78,994 79,381 1,49 79,768 80,154 80,540 80,925 - - - - - - IAL - 95 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Subtraia da porcentagem de sacarose 10 0,50 0,54 0,58 0,61 0,64 0,66 0,68 0,70 0,72 0,73 0,74 0,75 0,76 0,78 0,79 11 0,46 0,49 0,53 0,55 0,58 0,60 0,62 0,64 0,65 0,66 0,67 0,68 0,69 0,70 0,71 12 0,42 0,45 0,48 0,50 0,52 0,54 0,56 0,57 0,58 0,59 0,60 0,61 0,61 0,63 0,63 13 0,37 0,40 0,42 0,44 0,46 0,48 0,49 0,50 0,51 0,52 0,53 0,54 0,54 0,55 0,55 14 0,33 0,35 0,37 0,39 0,40 0,41 0,42 0,43 0,44 0,45 0,45 0,46 0,46 0,47 0,48 15 0,27 0,29 0,31 0,33 0,34 0,34 0,35 0,36 0,37 0,37 0,38 0,39 0,39 0,40 0,40 16 0,22 0,24 0,25 0,26 0,27 0,28 0,28 0,29 0,30 0,30 0,30 0,31 0,31 0,32 0,32 17 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,21 0,21 0,22 0,22 0,23 0,23 0,23 0,23 0,24 0,24 18 0,12 0,13 0,13 0,14 0,14 0,14 0,14 0,15 0,15 0,15 0,15 0,16 0,16 0,16 0,16 19 0,06 0,06 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 Adicione à porcentagem de sacarose °C 21 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 22 0,13 0,13 0,14 0,14 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 23 0,19 0,20 0,21 0,22 0,22 0,23 0,23 0,23 0,23 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 24 0,26 0,27 0,28 0,29 0,30 0,30 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,32 0,32 0,32 0,32 25 0,33 0,35 0,36 0,37 0,38 0,38 0,39 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 26 0,40 0,42 0,43 0,44 0,45 0,46 0,47 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 27 0,48 0,50 0,52 0,53 0,54 0,55 0,55 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 0,56 28 0,56 0,57 0,60 0,61 0,62 0,63 0,63 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 0,64 29 0,64 0,66 0,68 0,69 0,71 0,72 0,72 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 0,73 30 0,72 0,74 0,77 0,78 0,79 0,80 0,80 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 0,81 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Conteúdo de sacarose em porcentagem Tabela 5 – Correção de temperatura para soluções de sacarose 96 - IAL Temp. °C Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 18-21. 011/IV Densidade A determinação da densidade é, geralmente, feita em análise de alimentos que se apresentam no estado líquido. Pode ser medida por vários aparelhos, sendo os seguintes os mais usados: picnômetros e densímetros convencionais e digitais. Os picnômetros dão resultados precisos e são construídos e graduados de modo a permitir a pesagem de volumes exatamente iguais de líquidos, a uma dada temperatura. Da relação destes pesos e volumes resulta a densidade dos mesmos à temperatura da determinação. Usando água como líquido de referência, tem-se a densidade relativa à água ou peso específico. Os densímetros, quase sempre de forma cilíndrica com um bulbo central terminando em haste fina e graduada, são construídos de modo que o ponto de afloramento indique, sobre a escala, a densidade do líquido no qual está imerso o aparelho. Existem vários tipos, com valores diversos, em função da sensibilidade exigida para sua aplicação. A leitura deve ser feita sempre abaixo do menisco. As diferentes escalas usadas pelos densímetros podem dar a leitura direta da densidade ou graus de uma escala arbitrária como: Brix, Gay-Lussac, Baumé, Quevenne, correspondentes aos sacarômetros, alcoômetros e lactodensímetros, há tanto tempo utilizados em bromatologia. Os graus Brix referem-se à porcentagem em peso de sacarose em solução a 20°C. Os graus Gay-Lussac referem-se à porcentagem em volume de álcool em água. Os graus Baumé foram obtidos de modo empírico: para líquidos mais densos que a água, o zero da escala corresponde à água a 4°C e o grau 15 a uma solução de 15 g de cloreto de sódio em 85 g de água. Para os líquidos menos densos que a água, o zero da escala foi obtido com uma solução de 10 g de cloreto de sódio em 90 g de água e o grau 10, com água. Os lactodensímetros são, especialmente, calibrados de modo a abranger as variações de densidade de 1,025 a 1,035, mas apenas os 2 últimos algarismos são marcados na escala e, portanto, as leituras são de (25 a 35)°Quevenne. Procedimento – Dependendo do tipo do alimento, proceda conforme descrito no capítulo correspondente deste livro. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 21. IAL - 97 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 012/IV Perda por dessecação (umidade) – Secagem direta em estufa a 105ºC Todos os alimentos, qualquer que seja o método de industrialização a que tenham sido submetidos, contêm água em maior ou menor proporção. Geralmente a umidade representa a água contida no alimento, que pode ser classificada em: umidade de superfície, que refere-se à água livre ou presente na superfície externa do alimento, facilmente evaporada e umidade adsorvida, referente à água ligada, encontrada no interior do alimento, sem combinar-se quimicamente com o mesmo. A umidade corresponde à perda em peso sofrida pelo produto quando aquecido em condições nas quais a água é removida. Na realidade, não é somente a água a ser removida, mas outras substâncias que se volatilizam nessas condições. O resíduo obtido no aquecimento direto é chamado de resíduo seco. O aquecimento direto da amostra a 105°C é o processo mais usual. Amostras de alimentos que se decompõem ou iniciam transformações a esta temperatura, devem ser aquecidas em estufas a vácuo, onde se reduz a pressão e se mantém a temperatura de 70°C. Nos casos em que outras substâncias voláteis estão presentes, a determinação de umidade real deve ser feita por processo de destilação com líquidos imiscíveis. Outros processos usados são baseados em reações que se dão em presença de água. Dentre estes, o método de Karl Fischer é baseado na redução de iodo pelo dióxido de enxofre, na presença de água. Assim, a reação entre a água e a solução de dióxido de enxofre, iodo e reagente orgânico faz-se em aparelho especial que exclui a influência da umidade do ar e fornece condições para uma titulação cujo ponto final seja bem determinado. Em alimentos de composição padronizada, certas medidas físicas, como índice de refração, densidade etc., fornecem uma avaliação da umidade de modo rápido, mediante o uso de tabelas ou gráficos já estabelecidos. Material Estufa, balança analítica, dessecador com sílica gel, cápsula de porcelana ou de metal de 8,5 cm de diâmetro, pinça e espátula de metal. Procedimento – Pese de 2 a 10 g da amostra em cápsula de porcelana ou de metal, previamente tarada. Aqueça durante 3 horas. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita a operação de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo 98 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais N = n° de gramas de umidade (perda de massa em g) P = n° de gramas da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 21-22. 013/IV Perda por dessecação (umidade) – Secagem em estufa a vácuo Material Estufa a vácuo, bomba de vácuo, balança analítica, espátula de metal, pinça de metal, dessecador com sílica gel e cápsula de porcelana ou de platina de 8,5 cm de diâmetro. Procedimento – Pese de 2 a 10 g da amostra em cápsula, previamente tarada, e aqueça durante 6 horas em estufa a vácuo a 70°C, sob pressão reduzida ≤ 100 mm de mercúrio (13,3 kPa) . Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita a operação de aquecimento e resfriamento até peso constante. Nota: podem ser utilizadas cápsulas de outros metais resistentes ao calor desde que as cinzas obtidas não sejam empregadas para posterior análise de metais. Cálculo N = nº de gramas de umidade (perda de massa em g) P = nº de gramas da amostra Referência bibliográica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 926.12) Arlington: A.O.A.C., 1996, chapter 33. p. 5. 014/IV Perda por dessecação (umidade) – Determinação pelo método de Karl Fischer A determinação de umidade por Karl Fischer é baseada na reação quantitativa da água com uma solução anidra de dióxido de enxofre e iodo, na presença de uma base orgânica (imidazol) em IAL - 99 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital metanol, que adiciona os íons hidrogênio formados. Com este reagente podem ser determinadas pequenas quantidades de água. Embora o método não seja universalmente aplicável, as limitações de dosagens diretas podem ser contornadas pelo tratamento preliminar adequado da amostra. Na presença de água, o dióxido de enxofre é oxidado pelo iodo e o ponto final da reação é determinado por bi-amperometria (dead stop). Quando não houver mais água na amostra, um excesso de iodo livre agirá como despolarizador, causando aumento na corrente. O método limita-se aos casos em que a amostra a ser analisada não reaja com os componentes do reagente de Karl Fischer ou com o iodeto de hidrogênio formado durante a reação com a água. Os seguintes compostos interferem na titulação: oxidantes como cromatos/dicromatos, sais de cobre (II) e de ferro (III), óxidos superiores e peróxidos; redutores como: tiossulfatos, sais de estanho (II) e sulfitos; compostos capazes de formar água com os componentes do reagente de Karl Fischer, como por exemplo, óxidos básicos e sais de oxiácidos fracos; aldeídos, porque formam bissulfito; cetonas, porque reagem com o metanol para produzir cetal. Material Titulador de Karl Fischer, agitador magnético, eletrodo duplo de platina e microsseringa de 25 µL. Reagentes Reagente de Karl Fischer, isento de piridina Metanol com no máximo 0,005% de água Tartarato de sódio dihidratado (padrão volumétrico para padronização do reagente de Karl Fischer, contendo 15,66 ± 0,05% H2O) Procedimento – O reagente de Karl Fischer deve ser padronizado no início de uma série de ensaios, de duas formas, utilizando água ou tartarato de sódio dihidratado como padrões, conforme descrito abaixo. Padronização do reagente de Karl Fischer com água – Coloque uma quantidade de metanol na cela de titulação suficiente para cobrir os eletrodos. Para eliminar a água contida no solvente, pré-titule o metanol com o reagente de Karl Fischer, sob agitação, até o ponto final, seguindo as instruções do manual do aparelho. Em seguida, com o auxílio de uma 100 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais microsseringa, pese exatamente, por diferença, cerca de 20 mg (20 µL) de água; introduza a água na cela e realize a titulação. Padronização do Reagente de Karl Fischer com tartarato de sódio dihidratado – Coloque uma quantidade de metanol na cela de titulação suficiente para cobrir os eletrodos. Para eliminar a água contida no solvente, pré-titule o metanol com o reagente de Karl Fischer, sob agitação, até o ponto final, seguindo as instruções do manual do aparelho. Em seguida, pese exatamente, por diferença, cerca de 200 mg de tartarato de sódio dihidratado; introduza na cela e realize a titulação. Determinação de umidade na amostra – Caso a cela de titulação esteja cheia, esvazie o recipiente. Os procedimentos de descarte dos resíduos deverão ser efetuados de acordo com os procedimentos de biossegurança. Coloque uma quantidade de metanol na cela de titulação suficiente para cobrir os eletrodos. Para eliminar a água contida no solvente, pré-titule o metanol com o reagente de Karl Fischer, sob agitação, até o ponto final. Em seguida, pese com precisão, por diferença uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 10 a 80 mg de água; introduza a amostra na cela e realize a titulação. No caso de amostras não solúveis em metanol, escolha um solvente (ou uma mistura de solventes) adequado, que deverá ser previamente titulado com o reagente de Karl Fischer para eliminar a água. Cálculos m = massa do tartarato de sódio dihidratado V = volume do reagente de Karl Fischer gasto na titulação m = massa de água V = volume do reagente de Karl Fischer gasto na titulação (em mL) Cálculo do teor de umidade na amostra F = fator do reagente de Karl Fischer (em mg H2O/mL do reagente de Karl Fischer) V = volume do reagente de Karl Fischer gasto na titulação (mL) m = massa da amostra (mg) IAL - 101 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 23-5. MENDHAM, J.; DENNEY, R.C.; BARNES, J.D.; THOMAS, H.J.K. VOGEL. Análise Química Quantitativa. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos Editora S/A, 2002. p. 254-255. COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX. Food Chemicals Codex. 4th ed. Washington D.C.: National Academic Press, 1996. p 742-754. 015/IV Resíduo seco Nos produtos líquidos ou de alto teor de umidade, costuma-se considerar o resíduo seco (sólidos totais) obtido para a avaliação dos sólidos existentes no produto. Material Pipeta de 10 mL, cápsula de platina ou de porcelana de 8,5 cm de diâmetro, estufa, dessecador com sílica gel, banho-maria, espátula e pinça de metal. Procedimento – Transfira, com auxílio de uma pipeta, 10 mL de amostra, se a mesma for líquida, ou pese 10 g, se a amostra for sólida, para uma cápsula previamente aquecida a 105°C por 2 horas ou a 70ºC por 6 horas, sob pressão reduzida ≤ 100 mm de mercúrio (13,3 kPa), resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Evapore em banho-maria. Aqueça em estufa a 105°C por 2 horas ou a 70ºC por 6 horas, sob pressão reduzida ≤ 100 mm de mercúrio (13,3 kPa). Esfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento por 30 minutos e resfriamento até peso constante. Nota: podem ser utilizadas cápsulas de outros metais resistentes ao calor desde que as cinzas obtidas não sejam empregadas para posterior análise de metais. Cálculo N = nº de g de resíduo seco A = nº de mL da amostra (ou nº de gramas da amostra) 102 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Como alternativa, o resíduo seco pode ser calculado subtraindo-se de 100 g da amostra o número de g de “umidade por cento”. Considere a diferença como o nº de g do “resíduo seco por cento”. Cálculo 100 - A = resíduo seco por cento m/m A = nº de g de umidade por cento Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 25. 016/IV Acidez A determinação de acidez pode fornecer um dado valioso na apreciação do estado de conservação de um produto alimentício. Um processo de decomposição,seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre a concentração dos íons de hidrogênio. Os métodos de determinação da acidez podem ser os que avaliam a acidez titulável ou fornecem a concentração de íons de hidrogênio livres, por meio do pH. Os métodos que avaliam a acidez titulável resumem-se em titular com soluções de álcali padrão a acidez do produto ou de soluções aquosas ou alcoólicas do produto e, em certos casos, os ácidos graxos obtidos dos lipídios. Pode ser expressa em mL de solução molar por cento ou em gramas do componente ácido principal. Material Proveta de 50 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL, bureta de 25 mL, balança analítica, espátula metálica e pipetas volumétricas de 1 e 10 mL. Reagentes Solução fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 0,1 M ou 0,01 M Procedimento – Pese de 1 a 5 g ou pipete de 1 a 10 mL da amostra, transfira para um frasco Erlenmeyer de 125 mL com o auxílio de 50 mL de água. Adicione de 2 a 4 gotas da solução fenolftaleína e titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 ou 0,01 M, até coloração rósea. IAL - 103 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: no caso de amostras coloridas ou turvas, para a determinação do ponto de viragem, utilize método potenciométrico. Cálculo V = nº de mL da solução de hidróxido de sódio 0,1 ou 0,01 M gasto na titulação f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 ou 0,01 M P = nº de g da amostra usado na titulação c = correção para solução de NaOH 1 M, 10 para solução NaOH 0,1 M e 100 para solução NaOH 0,01 M. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 25-26. 017/IV Determinação do pH Os processos que avaliam o pH são colorimétricos ou eletrométricos. Os primeiros usam certos indicadores que produzem ou alteram sua coloração em determinadas concentrações de íons de hidrogênio. São processos de aplicação limitada, pois as medidas são aproximadas e não se aplicam às soluções intensamente coloridas ou turvas, bem como às soluções coloidais que podem absorver o indicador, falseando os resultados. Nos processos eletrométricos empregam-se aparelhos que são potenciômetros especialmente adaptados e permitem uma determinação direta, simples e precisa do pH. Material Béqueres de 50 e 150 mL, proveta de 100 mL, pHmetro, balança analítica, espátula de metal e agitador magnético. Reagentes Soluções-tampão de pH 4, 7 e 10 Procedimento – Pese 10 g da amostra em um béquer e dilua com auxílio de 100 mL de água. Agite o conteúdo até que as partículas, caso hajam, fiquem uniformemente suspensas. 104 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Determine o pH, com o aparelho previamente calibrado, operando-o de acordo com as instruções do manual do fabricante. Nota: no caso de amostras líquidas, determine o pH diretamente. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 27. 018/IV Resíduo por incineração -- Cinzas Resíduo por incineração ou cinzas é o nome dado ao resíduo obtido por aquecimento de um produto em temperatura próxima a (550-570)°C. Nem sempre este resíduo representa toda a substância inorgânica presente na amostra, pois alguns sais podem sofrer redução ou volatilização nesse aquecimento. Geralmente, as cinzas são obtidas por ignição de quantidade conhecida da amostra. Algumas amostras contendo sais de metais alcalinos que retêm proporções variáveis de dióxido de carbono nas condições da incineração são tratadas, inicialmente, com solução diluída de ácido sulfúrico e, após secagem do excesso do reagente, aquecidas e pesadas. O resíduo é, então, denominado “cinzas sulfatizadas”. Muitas vezes, é vantajoso combinar a determinação direta de umidade e a determinação de cinzas, incinerando o resíduo obtido na determinação de umidade. A determinação de cinzas insolúveis em ácido, geralmente ácido clorídrico a 10% v/v, dá uma avaliação da sílica (areia) existente na amostra. Alcalinidade das cinzas é outra determinação auxiliar no conhecimento da composição das cinzas. Uma análise global da composição das cinzas nos diferentes alimentos, além de trabalhosa, não é de interesse igual ao da determinação de certos componentes, conforme a natureza do produto. Outros dados interessantes para a avaliação do produto podem ser obtidos no tratamento das cinzas com água ou ácidos e verificação de relações de solúveis e insolúveis. Um baixo conteúdo de cinzas solúveis em água é indício que o material sofreu extração prévia. Material Cápsula de porcelana ou platina de 50 mL, mufla, banho-maria, dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel, chapa elétrica, balança analítica, espátula e pinça de metal. Procedimento – Pese 5 a 10 g da amostra em uma cápsula, previamente aquecida em mufla a 550°C, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Caso a amostra seja IAL - 105 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital líquida, evapore em banho-maria. Seque em chapa elétrica, carbonize em temperatura baixa e incinere em mufla a 550ºC, até eliminação completa do carvão. Em caso de borbulhamento, adicione inicialmente algumas gotas de óleo vegetal para auxiliar o processo de carbonização. As cinzas devem ficar brancas ou ligeiramente acinzentadas. Em caso contrário, esfrie, adicione 0,5 mL de água, seque e incinere novamente. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Nota: podem ser utilizadas cápsulas de outros metais resistentes ao calor desde que as cinzas obtidas não sejam empregadas para posterior análise de metais. Cálculo N = nº de g de cinzas P = nº de g da amostra Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 27-28. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 900.02). Arlington: A.O.A.C., 1996 chapter 44. p. 3. 019/IV Cinzas sulfatizadas A sulfatização das cinzas reduz perdas por volatilização, pois transforma substâncias voláteis em sulfatos mais fixos. Neste caso, a composição das cinzas não depende tanto da temperatura de calcinação. Material Cápsula de platina ou de porcelana de 50 mL, banho-maria, estufa e dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel e mufla. Reagente Ácido sulfúrico a 10%, v/v 106 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Procedimento – Pese 5 g da amostra em cápsula de platina ou de porcelana previamente aquecida em mufla a 550°C, resfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese. Adicione 5 mL de ácido sulfúrico a 10% v/v. Seque em banho-maria. Carbonize em temperatura baixa e incinere em mufla a 550°C. Resfrie. Adicione de 2 a 3 mL de ácido sulfúrico a 10% v/v. Seque em banho-maria e novamente incinere a 550°C. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Nota: podem ser utilizadas cápsulas de outros metais resistentes ao calor desde que as cinzas obtidas não sejam empregadas para posterior análise de metais. Cálculo N = nº de g de cinzas sulfatizadas P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 28. 020/IV Cinzas insolúveis em água Material Proveta de 50 mL, funil de vidro de 5 cm de diâmetro, estufa, mufla, bastão de vidro, dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel e chapa elétrica. Procedimento – Adicione 30 mL de água à cápsula contendo as cinzas obtidas segundo a técnica indicada em 018/IV. Agite com um bastão de vidro. Aqueça por 15 minutos em banho-maria. Filtre em papel de filtro de cinzas conhecidas. Lave a cápsula, o filtro e o bastão de vidro com 100 mL de água quente. Receba o filtrado e as águas de lavagem em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Reserve para a determinação 023/IV. Transfira o resíduo com o papel de filtro para a mesma cápsula em que foi feita a incineração. Seque em estufa a 105°C. Carbonize em chapa elétrica. Incinere em mufla a 550°C. Esfrie em dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel. Pese. Repita as operações de aquecimento (30 minutos na mufla) e resfriamento (1 hora no dessecador) até peso constante. Reserve o resíduo para a determinação de alcalinidade das cinzas insolúveis em água. IAL - 107 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo N = nº de g de cinzas insolúveis em água P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 29. 021/IV Cinzas solúveis em água Procedimento – Subtraia do nº de g de cinzas por cento obtido em 018/IV o nº de g de cinzas insolúveis por cento obtido em 020/IV. Considere a diferença como cinzas solúveis em água por cento. 022/IV Alcalinidade das cinzas insolúveis em água Material Proveta de 50 mL, béquer de 250 mL, chapa elétrica e 2 buretas de 25 mL. Reagentes Ácido clorídrico 0,1 M Indicador alaranjado de metila (metilorange) Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Procedimento – Transfira o papel de filtro com o resíduo obtido em 020/IV para um béquer de 250 mL. Adicione 20 mL de água e 15 mL de ácido clorídrico 0,1 M. Aqueça à ebulição em chapa elétrica. Esfrie e adicione duas gotas de indicador alaranjado de metila. Titule o excesso de ácido clorídrico com solução de hidróxido de sódio 0,1 M até o desaparecimento da coloração alaranjada (a solução deverá ficar amarela). Cálculo 108 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais V = diferença entre o nº de mL de ácido clorídrico 0,1 M adicionado e o nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 30. 023/IV Alcalinidade das cinzas solúveis em água Procedimento – Adicione duas gotas do indicador alaranjado de metila à solução obtida em 020/IV. Titule com ácido clorídrico 0,1 M até coloração alaranjada. Cálculo V = nº de mL de ácido clorídrico 0,1 M gasto na titulação f = fator do ácido clorídrico 0,1 M P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 30-31. 024/IV Cinzas insolúveis em ácido clorídrico a 10% v/v Material Proveta de 20 mL, papel de filtro de cinzas conhecidas, mufla, dessecador com sílica gel, balança analítica, chapa elétrica, papel indicador de pH e bastão de vidro. Reagente Acido clorídrico a 10% v/v Procedimento – Adicione às cinzas obtidas em 018/IV, 20 mL de ácido clorídrico a 10% v/v. IAL - 109 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Agite com bastão de vidro. Filtre em papel de filtro. Lave a cápsula e o filtro com água quente até não dar mais reação ácida. Transfira o papel de filtro contendo o resíduo para a mesma cápsula em que foi feita a incineração. Seque em estufa a 105°C por uma hora. Carbonize o papel cuidadosamente, incinere em mufla a 550°C. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = nº de g de cinzas insolúveis em ácido clorídrico a 10% P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 31. 025/IV Cinzas solúveis em ácido clorídrico a 10% v/v Procedimento – Subtraia do nº de g de cinzas por cento (018/IV) o nº de g de cinzas insolúveis em ácido clorídrico a 10% v/v (024/IV). Considere a diferença como cinzas solúveis em ácido clorídrico a 10% v/v, por cento m/m Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 31 026/IV Sulfatos pelo método gravimétrico Material Proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, pipeta de 50 mL, béquer de 250 mL, cadinho de porcelana, mufla, dessecador com cloreto de cálcio anidro ou sílica gel, papel de filtro com cinzas conhecidas, bastão de vidro e bico Bünsen. Reagentes Ácido clorídrico (1+1) Solução de cloreto de bário a 5% m/v 110 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Procedimento – Dissolva as cinzas obtidas em 018/IV com ácido clorídrico (1+1). Adicione 20 mL de água. Filtre. Lave a cápsula e o filtro com 50 mL de água. Receba o filtrado e as águas de lavagem em um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com água e transfira, com auxílio de uma pipeta, 50 mL do filtrado para um béquer de 250 mL. Aqueça à ebulição. Adicione às gotas, uma solução aquecida de cloreto de bário a 5% até completa precipitação. Aqueça em banho-maria por 1 hora. Deixe em repouso por 12 horas. Filtre em papel de filtro de cinzas conhecidas. Lave o filtro até que 2 mL de filtrado não dêem reação de íon cloreto. Transfira o papel de filtro com o precipitado para um cadinho de porcelana previamente aquecido em mufla a 550°C por 1 hora, resfriado em dessecador com cloreto de cálcio anidro até a temperatura ambiente e pesado. Carbonize em bico de Bünsen com chama baixa. Aqueça em mufla a 550°C. Resfrie e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = nº de g de sulfato de bário P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 34-35. 027/IV Sulfatos por titulação com EDTA Material Pipetas de 5 e 25 mL, proveta e bureta de 25 mL. Reagentes Acido clorídrico Álcool Cloreto de bário 0,1 M EDTA (sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético) 0,1 M Hidróxido de amônio Metanol IAL - 111 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução de púrpura de ftaleína – Pese 0,1 g púrpura de ftaleína, adicione água e hidróxido de amônio até dissolução do sal e complete o volume até 100 mL com água. Procedimento – Acidule fracamente a solução contendo até 0,2 g de íon sulfato, com ácido clorídrico e aqueça até ebulição. Adicione 25 mL de cloreto de bário 0,1 M, aqueça novamente até ebulição e deixe em banho-maria cerca de 15 minutos. Esfrie a solução e adicione igual volume de metanol ou álcool e 5 mL de solução de hidróxido de amônio. Junte 2-3 gotas de solução de púrpura de ftaleína e titule o excesso de bário com solução de EDTA 0,1 M até viragem do violeta ao verde-amarelado. Cálculo V = nº de mL da solução de EDTA gasto na titulação P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 35-36. 028/IV Cloretos por volumetria Os cloretos são precipitados na forma de cloreto de prata, em pH levemente alcalino em presença de cromato de potássio, como indicador. O ponto final da titulação é visualizado pela formação de um precipitado vermelho-tijolo de cromato de prata. Material Cápsulas de porcelana de 50 a 100 mL, mufla, proveta de 50 mL, bureta de 25 mL, balança analítica, espátula, bastão de vidro, dessecador com sílica gel, chapa elétrica, balões volumétricos de 100, 200 ou 500 mL, funil de vidro, frasco Erlenmeyer de 125 mL e pipeta volumétrica de 10 mL. Reagentes Bicarbonato de sódio Carbonato de cálcio Solução de cromato de potássio a 10% m/v 112 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Solução de hidróxido de sódio a 10% m/v Solução de nitrato de prata 0,1 M Procedimento – Pese 5 g da amostra em uma cápsula de porcelana. Carbonize em chapa elétrica. Incinere em mufla a 550°C. Esfrie. Adicione 30 mL de água quente. Agite com bastão de vidro. Transfira a solução com auxílio de um funil para um balão volumétrico de 100 mL. Lave a cápsula, o bastão de vidro e o funil com mais duas porções de 30 mL de água quente. Transfira a solução e as águas de lavagem para o balão volumétrico. Esfrie, complete o volume do balão e agite. Filtre se necessário. Transfira, com auxilio de uma pipeta, uma alíquota de 10 mL para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 2 gotas da solução de cromato de potássio a 10%, como indicador. Titule com solução de nitrato de prata 0,1 M, até o aparecimento de uma coloração vermelho-tijolo. Notas Caso o pH da solução esteja ácido, neutralize com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, de bicarbonato de sódio ou carbonato de cálcio, até pH entre 6,5 e 9,0. Se for usado o bicarbonato de sódio ou carbonato de cálcio, aqueça a solução em banho-maria até não haver mais desprendimento de dióxido de carbono, antes de completar o volume do balão. Nos produtos contendo quantidades maiores de cloretos, após a obtenção das cinzas e sua dissolução, conforme a técnica acima, transfira para um balão volumétrico de 200 ou 500 mL, lavando a cápsula e o funil com água e complete o volume. Transfira, com auxílio de uma pipeta, 10 mL da solução para um frasco Erlenmeyer de 125 mL e continue seguindo as indicações da técnica. Cálculo V = nº de mL da solução de nitrato de prata 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de nitrato de prata 0,1 M P = nº de g da amostra na alíquota utilizada para a titulação. Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 36-37. OHLWEILER, O. A. Química Analítica Quantitativa. 3. ed., Rio de Janeiro, RJ: Livro Técnico e Científico Editora Ltda, v. 2, 1981. p. 121-122. IAL - 113 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 029/IV Cloretos por potenciometria O cloreto pode ser determinado potenciometricamente, desde que se disponha de potenciômetro e eletrodo indicador de prata. O método baseia-se na precipitação do íon cloreto com nitrato de prata e dispensa o indicador cromato de potássio. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 37. 030/IV Fosfatos por titulação Fósforo, na forma de íons fosfato, ou não, é dos mais importantes constituintes minerais presentes em cereais, carnes, leite e frutas. A determinação de fósforo é, geralmente, feita na forma de íon fosfato, pela precipitação de fosfomolibdato de amônio que é dissolvido em solução alcalina de concentração conhecida, cujo excesso é titulado. Os processos colorimétricos são empregados quando a quantidade de fósforo é pequena. O que distingue os métodos é o uso de diferentes agentes redutores. Material Cápsula de porcelana de 100 mL, proveta de 100 mL, bastão de vidro, mufla, béquer de 400 mL, 2 buretas de 50 mL e bico de Bünsen. Reagentes Ácido clorídrico (1+2) Hidróxido de amônio (1+1) Nitrato de amônio Ácido nítrico (1+1) Solução de hidróxido de sódio 0,2 M Indicador fenolftaleína Ácido clorídrico 0,2 M Solução de acetato de magnésio (A) – Pese 2 g de acetato de magnésio Mg(C2H3O2).4H2O, adicione 25 mL de água e coloque álcool até completar 500 mL. Solução de ácido molíbdico (B) – Pese 100 g de ácido molíbdico H2MoO4.H2O, adicione 144 mL de hidróxido de amônio e complete com 1148 mL de água. 114 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Solução de molibdato de amônio – Misture lentamente as soluções A e B e deixe em repouso por 48 horas. Filtre antes de usar. Procedimento – Pese 5 g da amostra em uma cápsula de porcelana de 100 mL. Adicione 10 mL da solução de acetato de magnésio. Evapore até a secagem em banho-maria. Carbonize em bico de Bünsen. Incinere em mufla a 550°C. Esfrie. Dissolva as cinzas com ácido clorídrico (1+2). Transfira para um béquer de 400 mL, com auxílio de 80 mL de água. Alcalinize com hidróxido de amônio (1+1). Adicione 10 g de nitrato de amônio. Acidule com ácido nítrico (1+1). Adicione solução de molibdato de amônio até completa precipitação. Aqueça por uma hora em banho de água a (40-45)°C, agitando freqüentemente com um bastão de vidro. Esfrie, filtre e lave o béquer, o bastão de vidro e o filtro com água até que o filtrado não tenha reação ácida. Transfira o papel de filtro com o precipitado para o mesmo béquer em que foi feita a precipitação. Dissolva o precipitado em solução de hidróxido de sódio 0,2 M, medido em uma bureta. Adicione duas gotas do indicador fenolftaleína. Titule o excesso de hidróxido de sódio com ácido clorídrico 0,2 M. Cálculo V = diferença entre o nº de mL de solução de hidróxido 0,2 M adicionado e o nº de mL de ácido clorídrico 0,2 M gasto na titulação. P = nº de g da amostra Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3 ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 32-3. 031/IV Fosfatos por espectrofotometria Material Balões volumétricos de 100, 250, 500 e 1000 mL, pipetas de 25 e 50 mL, proveta e espectrofotômetro ou fotocolorímetro. Reagentes Solução de vanado-molibdato de amônio – Dissolva 20 g molibdato de amônio (NH4)6Mo7O24.4H2O e 1 g de vanadato de amônio - NH4VO3, separadamente, em IAL - 115 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital cerca de 300 mL de água quente e filtre, se necessário. Misture as duas soluções, adicione 140 mL de ácido nítrico e dilua para um litro. Este reativo é estável por três meses. Solução-estoque de fosfato – Pese 0,9587 g de fosfato ácido de potássio, seco a 105°C e complete o volume a 500 mL com água. Solução-padrão de fosfato – Pipete 50 mL da solução-estoque de fosfato e complete o volume a 250 mL com água. Um mL desta solução corresponde a 0,2 mg de P2O5. Procedimento – Dissolva as cinzas obtidas de 5 g da amostra em ácido clorídrico (1+2), transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Pipete uma alíquota (que deve ser proporcional à quantidade de fosfato presente na amostra) em um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 25 mL do reagente vanado-molibdato de amônio e complete o volume com água até 100 mL. Homogeneíze e espere 10 minutos para fazer a leitura a 420 nm. Determine a quantidade de fosfato correspondente, usando a curvapadrão previamente estabelecida ou o valor da absortividade. Curva-padrão – Em uma série de balões volumétricos de 100 mL, meça volumes de soluçãopadrão contendo valores de 5 a 6,2 mg de P2O5. Quando for usado um espectrofotômetro, utilize volumes de solução-padrão de fosfato contendo de 0,2 a 2,0 mg de P2O5. Adicione 25 mL do reagente vanado-molibdato de amônio a cada balão. Complete o volume com água. A temperatura da água mais o reagente deve ser 20°C. Homogeneíze e espere 10 minutos. Faça leitura a 420 nm, usando como branco 25 mL de vanado-molibdato de amônio, completando com água até 100 mL. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 33-34. Lipídios Os lipídios são compostos orgânicos altamente energéticos, contêm ácidos graxos essenciais ao organismo e atuam como transportadores das vitaminas lipossolúveis. Os lipídios são substâncias insolúveis em água, solúveis em solventes orgânicos, tais como éter, clorofórmio e acetona, dentre outros. Estes são classificados em: simples (óleos e gorduras), compostos (fosfolipídios, ceras etc.) e derivados ( ácidos graxos, esteróis). Os óleos e gorduras diferem entre si apenas na sua aparência física, sendo que à temperatura ambiente os óleos apresentam aspecto líquido e as gorduras, pastoso ou sólido. 116 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais A determinação de lipídios em alimentos é feita, na maioria dos casos, pela extração com solventes, por exemplo, éter. Quase sempre se torna mais simples fazer uma extração contínua em aparelho do tipo Soxhlet, seguida da remoção por evaporação ou destilação do solvente empregado. O resíduo obtido não é constituído unicamente por lipídios, mas por todos os compostos que, nas condições da determinação, possam ser extraídos pelo solvente. Estes conjuntos incluem os ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos, as lecitinas, as ceras, os carotenóides, a clorofila e outros pigmentos, além dos esteróis, fosfatídios, vitaminas A e D, óleos essenciais etc., mas em quantidades relativamente pequenas, que não chegam a representar uma diferença significativa na determinação. Nos produtos em que estas concentrações se tornam maiores, a determinação terá a denominação mais adequada de extrato etéreo. Uma extração completa se torna difícil em produtos contendo alta proporção de açúcares, de proteínas e umidade. Em certos casos, podem ser aplicados outros métodos na determinação dos lipídios, tais como: a extração com solvente a frio (método de Bligh-Dyer ou Folch), hidrólise ácida (método de Gerber ou Stoldt- Weibull) ou alcalina (método Rose-Gotllieb-Mojonnier). 032/IV Lipídios ou extrato etéreo – Extração direta em Soxhlet Material Aparelho extrator de Soxhlet, bateria de aquecimento com refrigerador de bolas, balança analítica, estufa, cartucho de Soxhlet ou papel de filtro de 12 cm de diâmetro, balão de fundo chato de 250 a 300 mL com boca esmerilhada, lã desengordurada, algodão, espátula e dessecador com sílica gel. Reagente Éter Procedimento – Pese 2 a 5 g da amostra em cartucho de Soxhlet ou em papel de filtro e amarre com fio de lã previamente desengordurado. No caso de amostras líquidas, pipete o volume desejado, esgote em uma porção de algodão sobre um papel de filtro duplo e coloque para secar em uma estufa a 105°C por uma hora. Transfira o cartucho ou o papel de filtro amarrado para o aparelho extrator tipo Soxhlet. Acople o extrator ao balão de fundo chato previamente tarado a 105°C. Adicione éter em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio. Adapte a um refrigerador de bolas. Mantenha, sob aquecimento em chapa elétrica, à extração contínua por 8 (quatro a cinco gotas por segundo) ou 16 horas (duas a três gotas por segundo). Retire o cartucho ou o papel de filtro amarrado, destile o éter e transfira o balão com o resíduo extraído para uma estufa a 105°C, mantendo por cerca de uma hora. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese e repita as operações de aquecimenIAL - 117 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital to por 30 minutos na estufa e resfriamento até peso constante (no máximo 2 h). Cálculo N = nº de gramas de lipídios P = nº de gramas da amostra Nota: no caso de produtos contendo alta proporção de carboidratos, pese a amostra sob papel de filtro e lave com cinco porções de 20 mL de água. Coloque em estufa a 105°C por uma hora para secagem e proceda a extração conforme acima descrito. Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 42-43. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.39,C). Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 33. p. 10-12 033/IV Lipídios ou extrato etéreo com hidrólise ácida prévia – Método A Material Aparelho extrator de Soxhlet, bateria de aquecimento com refrigerador de bolas, espátula, pinça, balança analítica, estufa, cartucho de Soxhlet ou papel de filtro de 12 cm de diâmetro, balão de fundo chato de (250-300) mL com boca esmerilhada, frasco Erlenmeyer de 250 mL com boca esmerilhada, condensador longo, vidro de relógio e papel indicador de pH. Reagentes Éter de petróleo Ácido clorídrico 3 M Areia diatomácea Procedimento – Pese 10 g da amostra homogeneizada. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL com boca esmerilhada. Adicione 100 mL de ácido clorídrico 3 M. Acople 118 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais o frasco Erlenmeyer em condensador longo, sob aquecimento. Mantenha por 1 hora em ebulição. Decorrido o tempo, deixe esfriar. Adicione uma pequena quantidade de auxiliar de filtração (areia diatomácea). Filtre utilizando duas folhas de papel de filtro. Lave o resíduo com água até neutralizar o filtrado, fazendo o teste com papel indicador de pH. Despreze o filtrado. Deposite o papel de filtro com o resíduo sobre um vidro de relógio e leve a estufa à 105°C para secagem. Após seco, faça um cartucho com os papéis, usando o externo para envolver o que contém a amostra. Transfira o cartucho para o aparelho extrator tipo Soxhlet. Acople o extrator ao balão de fundo chato, previamente tarado a 105°C. Adicione éter de petróleo em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio. Acople em um refrigerador de bolas. Mantenha, sob aquecimento em chapa elétrica, a extração por 8 horas. Retire o cartucho e destile o éter. Transfira o balão com o resíduo extraído para uma estufa a 105°C, mantendo por cerca de uma hora. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento por 30 minutos na estufa e resfriamento até peso constante. Nota: na expectativa de um alto teor de gordura na amostra a ser analisada, proceda a extração prévia com éter de petróleo, para a completa remoção da fração lipídica. Cálculo N = nº de gramas de lipídios P = nº de gramas da amostra Referência bibliográica U.K. FEEDING STUFFS (SAMPLING AND ANALYSIS) REGULATIONS. The determination of oil in feeding stuffs nº 1119. 1982, appendix I. p. 9-11. 034/IV Lipídios ou extrato etéreo com hidrólise ácida prévia – Método B Material Balança analítica, aparelho extrator de Soxhlet, bateria de aquecimento com refrigerador de bolas, chapa elétrica, estufa, espátula, béqueres de 100, 250 e 500 mL, proveta de 100 mL, pérolas de vidro ou cacos de porcelana, vidro de relógio, frasco Erlenmeyer de 500 mL, funil de vidro, papel de filtro, cartucho de Soxhlet, papel indicador de pH, balão de fundo chato com boca esmerilhada de 300 mL, pinça e dessecador com sílica gel. IAL - 119 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Ácido clorídrico Éter petróleo Solução de nitrato de prata 0,1 M Solução de HCl 4 M (1:2) – Dilua 100 mL do ácido clorídrico com 200 mL de água e misture. Procedimento – Pese 5 a 10 g da amostra em um béquer de 100 mL. Transfira para um béquer de 500 mL, usando 100 mL de água quente. Adicione, com cuidado 60 mL de ácido clorídrico e algumas pérolas de vidro ou cacos de porcelana. Cubra o béquer com um vidro de relógio, coloque em uma chapa elétrica e aqueça até a ebulição, mantendo durante 30 minutos. Adicione 160 mL de água quente sobre a solução da amostra, lavando o vidro de relógio. Filtre a solução em papel de filtro previamente umedecido. Lave várias vezes o béquer e o resíduo do papel de filtro, cuidadosamente com água quente, até que o filtrado exiba reação neutra (teste com papel indicador de pH) ou ausência de cloreto (utilize solução de nitrato de prata 0,1 M). Coloque o papel de filtro contendo o resíduo sobre um outro papel de filtro seco em um vidro de relógio e leve à estufa a 105°C para a secagem. Após a secagem, faça um cartucho com os papéis, usando o externo para envolver o que contém a amostra. Transfira o cartucho para o aparelho extrator tipo Soxhlet. Acople o extrator ao balão de fundo chato, previamente tarado a 105°C. Adicione éter de petróleo em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio. Acople em um refrigerador de bolas. Mantenha, sob aquecimento em chapa elétrica, a extração por 4 horas. Retire o cartucho e destile o éter. Transfira o balão com o resíduo extraído para uma estufa a 105°C, mantendo por cerca de uma hora. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento por 30 minutos na estufa e resfriamento até peso constante. Nota: no caso da hidrólise ácida pode-se optar, alternativamente, pelo seguinte procedimento: pese diretamente a amostra em um béquer de 250 mL, adicione 50 mL de solução de ácido clorídrico 4 M e continue como descrito acima a partir de “algumas pérolas de vidro”. Cálculo N = n° de g de lipídios P = n° de g da amostra 120 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referência bibliográica INTERNATIONAL STARDARD ORGANIZATION. ISO 1443: Meat and meat products - determination of total fat content. 1973. 035/IV Extrato alcoólico É um tipo de extração em que o solvente empregado é o álcool. O resíduo obtido é chamado de extrato alcoólico o qual, nos produtos ricos em óleos voláteis, essências etc., representa um dado precioso na avaliação destes últimos. Como toda extração com solventes, ela poderá ser feita diretamente por simples percolação ou em aparelhos de extração contínua. Material Béqueres de 50 e 100 mL, balão volumétrico de 100 mL, proveta de 100 mL, funil de 5 cm de diâmetro, papel de filtro, frasco Erlenmeyer de 125 mL, pipeta de 50 mL, estufa, dessecador com sílica gel, balança analítica, banho-maria, espátula e pinça. Reagente Álcool Procedimento – Pese 2 g da amostra em um béquer de 50 mL. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de 80 mL de álcool. Agite, com intervalos de 30 minutos, por 4 horas. Deixe em repouso por 16 horas. Complete o volume com álcool. Filtre em papel de filtro seco. Receba o filtrado em um frasco Erlenmeyer. Transfira, com auxílio de uma pipeta, 50 mL do filtrado para um béquer de 100 mL, previamente tarado. Coloque o béquer em banho-maria até completa evaporação do solvente. Aqueça em estufa a 105°C por 1 hora, resfrie em dessecador à temperatura ambiente e pese. Repita a operação até peso constante. Cálculo P = nº de g da amostra contido na alíquota usada para a secagem N = nº de g de extrato alcoólico fixo a 105°C IAL - 121 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 43-44. Protídios A determinação de protídios baseia-se na determinação de nitrogênio, geralmente feita pelo processo de digestão Kjeldahl. Este método, idealizado em 1883, tem sofrido numerosas modificações e adaptações, porém sempre se baseia em três etapas: digestão, destilação e titulação. A matéria orgânica é decomposta e o nitrogênio existente é finalmente transformado em amônia. Sendo o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o fator empírico 6,25 para transformar o número de g de nitrogênio encontrado em número de g de protídios. Em alguns casos, emprega-se um fator diferenciado de 6,25, conforme descrito na Tabela 6. Amostras contendo nitratos podem perdê-los durante a digestão. Nestes casos, deve-se adicionar ácido salicílico ou fenol (cerca de 1 g), os quais retêm os nitratos, como nitro-derivados. Procede-se então à digestão. Digestão – A matéria orgânica existente na amostra é decomposta com ácido sulfúrico e um catalisador, onde o nitrogênio é transformado em sal amoniacal. Destilação – A amônia é liberada do sal amoniacal pela reação com hidróxido e recebida numa solução ácida de volume e concentração conhecidos. Titulação – Determina-se a quantidade de nitrogênio presente na amostra titulando-se o excesso do ácido utilizado na destilação com hidróxido. Tabela 6 – Fatores de conversão de nitrogênio total em proteína Alimento Farinha de centeio Farinha de trigo Macarrão Cevada Aveia Amendoim Soja Arroz Amêndoas 122 - IAL Fator 5,83 5,83 5,70 5,83 5,83 5,46 6,25 5,95 5,18 Alimento Castanha do Pará Avelã Coco Outras nozes Leite e derivados Margarina Gelatina Outros alimentos - Fator 5,46 5,30 5,30 5,30 6,38 6,38 5,55 6,25 - Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais 036/IV Protídios – Método de Kjeldahl clássico Material Balança analítica, frascos de Kjeldahl de 500 a 800 mL, chapa elétrica ou manta aquecedora, balão de destilação, frasco Erlenmeyer de 500 mL, bureta de 25 mL, espátula, papel de seda, dedal e pipeta graduada de 25 mL ou pipetador automático. Reagentes Ácido sulfúrico Ácido sulfúrico 0,05 M Sulfato de cobre Sulfato de potássio Dióxido de titânio Solução fenolftaleína Vermelho de metila a 1% m/v Zinco em pó Hidróxido de sódio a 30% m/v Hidróxido de sódio 0,1 M Mistura catalítica – Dióxido de titânio anidro, sulfato de cobre anidro e sulfato de potássio anidro, na proporção 0,3:0,3:6. Procedimento – Pese 1 g da amostra em papel de seda. Transfira para o balão de Kjeldahl (papel+amostra). Adicione 25 mL de ácido sulfúrico e cerca de 6 g da mistura catalítica. Leve ao aquecimento em chapa elétrica, na capela, até a solução se tornar azul-esverdeada e livre de material não digerido (pontos pretos). Aqueça por mais uma hora. Deixe esfriar. Caso o laboratório não disponha de sistema automático de destilação, transfira quantitativamente o material do balão para o frasco de destilação. Adicione 10 gotas do indicador fenolftaleína e 1 g de zinco em pó (para ajudar a clivagem das moléculas grandes de protídios). Ligue imediatamente o balão ao conjunto de destilação. Mergulhe a extremidade afilada do refrigerante em 25 mL de ácido sulfúrico 0,05 M, contido em frasco Erlenmeyer de 500 mL com 3 gotas do indicador vermelho de metila. Adicione ao frasco que contém a amostra digerida, por meio de um funil com torneira, solução de hidróxido de sódio a 30% até garantir um ligeiro excesso de base. Aqueça à ebulição e destile até obter cerca de (250-300) mL do destilado. Titule o excesso de ácido sulfúrico 0,05 M com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, usando vermelho de metila. IAL - 123 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo V = diferença entre o nº de mL de ácido sulfúrico 0,05 M e o nº de mL de hidróxido de sódio 0,1 M gastos na titulação P = nº de g da amostra f = fator de conversão (conforme Tabela 6) Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 44-45. FAO/WHO. FAO Nutrition Meetings Report Series, 52. Energy and protein requiriments. Geneva, 1973. (Technical Report Series, n. 522). SOUTHGATE, D.A.T. The relationship between food composition and available energy. Rome: Joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation on Energy and Protein Requirements. 1981. 037/IV Protídios – Método de Kjeldahl modificado Material Balança analítica, frasco de Kjeldahl de 500 a 800 mL, chapa elétrica ou manta aquecedora, balão de destilação, frasco Erlenmeyer de 500 mL, buretas de 25 mL, espátula, papel de seda, pipeta graduada de 25 mL ou pipetador automático. Reagentes Ácido sulfúrico Ácido sulfúrico 0,05 M Ácido bórico 0,033 M Sulfato de cobre Sulfato de potássio Dióxido de titânio Solução de fenolftaleína Vermelho de metila a 1% m/v Hidróxido de sódio a 30% m/v 124 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Procedimento – Para a digestão da amostra, proceda conforme descrito em 036/IV. Na destilação, proceda também como em 036/IV, substituindo o ácido sulfúrico 0,05 M no frasco Erlenmeyer onde será recolhida a amônia formada, por ácido bórico 0,033 M, que não reage diretamente, servindo apenas como suporte para adsorsão da amônia. Titule diretamente a solução de hidróxido de amônio com a solução de ácido sulfúrico 0,05 M, utilizando o mesmo indicador do método 036/IV. Nota: alternativamente, poderá ser utilizada uma solução de ácido clorídrico 0,1 M em substituição ao ácido sulfúrico 0,05 M. Cálculo V = volume de ácido sulfúrico 0,05 M gasto na titulação P = nº de g da amostra f = fator de conversão (conforme Tabela 6) Referência bibliográica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 991.20). Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 33. p. 10-12. Glicídios Neste grupo de compostos, que são hidratos de carbono, têm-se os mais variados tipos de substâncias, desde os monossacarídios, representados pela glicose, os dissacarídios, dos quais os mais freqüentes em alimentos são a sacarose e a lactose, até os polissacarídios, como amido e celulose. Qualquer que seja o produto a ser analisado, é inicialmente necessária a obtenção de uma solução dos glicídios presentes, livres de substâncias que possam interferir no processo escolhido para a sua determinação. Para isso, usam-se soluções de “clarificadores” (creme alumina, solução neutra de acetato de chumbo, solução básica de acetato de chumbo, ácido fosfotúngstico) as quais precipitam as substâncias interferentes. Os métodos de determinação de glicídios estão baseados nas propriedades físicas das suas soluções ou no poder redutor dos glicídios mais simples (aos quais se pode chegar por hidrólise, no caso dos mais complexos). Os métodos de redução resumem-se em pesar ou titular a quantidade de óxido de Cu I precipitado de uma solução de íons de Cu II por um volume conhecido da solução de glicídios ou medir o volume da solução de glicídios necessário para reduzir completamente um volume conhecido da solução de cobre II. Os resulIAL - 125 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital tados são calculados mediante fatores e, geralmente, as determinações de glicídios redutores são calculadas em glicose e as dos não-redutores em sacarose. A hidrólise dos não-redutores é feita, previamente, por meio de ácido ou enzimas. 038/IV Glicídios redutores em glicose Material Balança analítica, espátula de metal, béquer de 100 mL, proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, funil de vidro, balão de fundo chato de 250 mL, pipetas volumétricas de 5 e 10 mL ou bureta automática de 10 mL, buretas de 10 e 25 mL e chapa elétrica. Reagentes Hidróxido de sódio a 40% m/v Carbonato de sódio anidro Ferrocianeto de potássio a 6% m/v Acetato de zinco a 12% m/v Solução saturada de acetato neutro de chumbo Sulfato de sódio anidro Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese 2 a 5 g da amostra em um béquer de 100 mL. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL com o auxílio de água. Qualquer que seja a característica da amostra (a, b ou c), proceda como a seguir. Complete o volume e agite. Filtre se necessário em papel de filtro seco e receba filtrado em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transfira o filtrado para a bureta. Coloque num balão de fundo chato de 250 mL, com auxílio de pipetas de 10 mL, cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionando 40 mL de água. Aqueça até ebulição. Adicione, às gotas, a solução da bureta sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá ficar um resíduo vermelho de Cu2O). Notas a) Em caso de amostras com alto teor de proteína: adicione 5 mL de ferrocianeto de potássio a 6% e 5 mL de acetato de zinco a 12%. Complete o volume com água, agite e deixe em repouso por 15 minutos. Filtre em papel de filtro seco e receba o filtrado em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Verifique o pH da solução. Caso esteja ácido, com pH abaixo de 6, coloque algumas gotas de hidróxido de sódio a 40% ou carbonato de sódio anidro até que a solução se torne alcalina, com pH próximo de 9,0 e filtre novamente. Transfira o filtrado para uma bureta. 126 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais b) Em caso de amostras com coloração intensa: clarifique a amostra adicionando solução saturada de acetato neutro de chumbo, até não haver mais precipitação (cerca de 1,5 mL). Complete o volume com água. Filtre em papel de filtro seco e receba o filtrado em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione sulfato de sódio anidro, até precipitar o excesso de chumbo. Filtre em papel de filtro seco e receba o filtrado em outro frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transfira o filtrado para uma bureta. c) Em caso de amostras com alto teor de lipídios: adicione à amostra pesada, 50 mL de água e aqueça em banho-maria por 5 minutos. Transfira a solução à quente para um balão volumétrico de 100 mL. Esfrie, complete o volume e agite. Filtre em papel de filtro seco e receba o filtrado em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transfira o filtrado para uma bureta. Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra a = nº de g de glicose correspondente a 10 mL das soluções de Fehling P = massa da amostra em g V = nº de mL da solução da amostra gasto na titulação . Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 4950. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 958.06). Arlington: A.O.A.C.. 1995, chapter 39. p. 21. 039/IV Glicídios não-redutores em sacarose Material Balança analítica, espátula de metal, banho-maria, béquer de 100 mL, proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, funil de vidro, balão de fundo chato de 250 mL, pipetas volumétricas de 10 e 20 mL, bureta automática de 10 mL, buretas de 10 e 25 mL e chapa elétrica. IAL - 127 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio a 40% m/v Carbonato de sódio anidro Ferrocianeto de potássio a 6% m/v Acetato de zinco a 12% m/v Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Transfira, com auxílio de uma pipeta, 20 mL de filtrado obtido em glicídios redutores em glicose (038/IV), para um balão volumétrico de 100 mL ou pese de 2 a 5 g da amostra e transfira para um balão volumétrico de 100 mL com auxílio de água. Caso a amostra contenha alto teor de lipídios, proceda como em 038/IV, no item c. Acidule fortemente com ácido clorídrico (cerca de 1 mL). Coloque em banho-maria a (100 ± 2)°C por 30 a 45 minutos. Esfrie e neutralize com carbonato de sódio anidro ou solução de hidróxido de sódio a 40%, com auxílio de papel indicador. Caso a amostra contenha alto teor de proteína, proceda como em 038/IV, item a. Complete o volume com água e agite. Filtre se necessário em papel de filtro seco e receba o filtrado em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transfira o filtrado para a bureta. Coloque num balão de fundo chato de 250 mL, com auxílio de pipetas de 10 mL, cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionando 40 mL de água. Aqueça até ebulição. Adicione, às gotas, a solução da bureta sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá ficar um resíduo vermelho de Cu2O). Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra a = nº de g de glicose correspondente a 10 mL das soluções de Fehling P = massa da amostra em g ou nº de g da amostra usado na inversão V = nº de mL da solução da amostra gasto na titulação B = nº de g de glicose por cento obtido em glicídios redutores, em glicose Nota: na titulação, quando se tornar difícil observar o desaparecimento da cor azul, adicione ao balão, próximo ao ponto final, 1 mL da solução de azul de metileno a 0,02%, como indicador interno. Continue a titulação até completo descoramento da solução. 128 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 50-51. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 958.06). Arlington: A.O.A.C.. 1995, chapter 39. p. 21. 040/IV Glicídios totais em glicose Material Balança analítica, chapa de aquecimento com refrigerador de refluxo, chapa elétrica, béquer de 100 mL, espátula de metal, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, frasco Erlenmeyer de 300 mL, balão volumétrico de 250 mL, balão de fundo chato de 250 mL, funil de vidro, bureta de 25 mL, pipeta graduada de 5 mL e pipeta volumétrica de 10 mL. Reagentes Ácido clorídrico Hidróxido de sódio 40% m/v Carbonato de sódio anidro Ferrocianeto de potássio a 6% m/v Acetato de zinco a 12% m/v Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese 2 a 5 g da amostra e desengordure conforme 032/IV, no caso de produtos com teor de lipídios inferior a 5%, não há necessidade de extração prévia da gordura da amostra. Transfira, quantitativamente, a amostra para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, com o auxílio de água. Adicione 5 mL de ácido clorídrico. Coloque em chapa de aquecimento e adapte o refrigerador de refluxo ao frasco. Deixe em ebulição por 3 horas a contar a partir do início da ebulição. Espere esfriar a solução e neutralize com hidróxido de sódio a 40%, com auxílio de papel indicador. Transfira, quantitativamente, para um balão volumétrico de 250 mL, com auxílio de água. Caso a amostra contenha alto teor de proteína, proceda como em 038/IV, item a. Complete o volume com água e agite. Filtre, se necessário, em papel de filtro seco para um frasco Erlenmeyer de 300 mL. Transfira o filtrado para uma bureta de 25 mL. Coloque num balão de fundo chato de 250 mL, com pipetas de 10 mL, cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionando 40 mL de água. IAL - 129 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Aqueça até ebulição. Adicione, às gotas, a solução da bureta sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá ficar um resíduo vermelho de Cu2O). Cálculo A= nº de mL da solução de P g da amostra a= nº de g de glicose correspondente a 10 mL das soluções de Fehling P= massa da amostra em g V= nº de mL da solução da amostra gasto na titulação Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 49-50. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 958.06). Arlington: A.O.A.C.. 1995, chapter 39. p. 21. 041/IV Glicídios por cromatografia descendente em papel – Prova qualitativa Os métodos cromatográficos, aplicáveis a pequenas quantidades de amostra, são os mais úteis para identificação de glicídios. A cromatografia em papel, usando solventes e reveladores apropriados, permite não só a identificação como a determinação quantitativa, eluindo-se as manchas do papel e determinando colorimetricamente a concentração dos glicídios correspondentes. Pode-se correr um cromatograma com solvente apropriado e, uma vez revelado, identificar os glicídios, comparando os valores de Rf com os dos padrões usados paralelamente à amostra. Material Balança analítica, estufa, papel para cromatografia Whatman nº 1, pipetas de 1 e 5 mL, capilares de vidro, cuba cromatográfica com cânula, atomizador, béquer de 250 mL, funil de vidro e frasco Erlenmeyer de 100 mL. 130 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Reagentes Soluções-padrão a 2% dos açúcares a serem identificados n-Propanol Acetato de etila Solução de anilina a 4% em álcool Solução de difenilamina a 4% em metanol Ácido fosfórico Fase móvel – n-propanol - acetato de etila - água (65:10:25). Solução reveladora – Em um frasco Erlenmeyer, prepare a mistura de solução de anilina a 4% em álcool (5 mL), solução de difenilamina a 4% em metanol (5 mL) e ácido fosfórico (1 mL). Procedimento – Pese cerca de 10 g da amostra em um béquer de 250 mL e dissolva com aproximadamente 100 mL de água, mantendo em contato por no mínimo duas horas. Filtre em papel de filtro, recolhendo o filtrado em béquer de 250 mL. Reserve o filtrado para aplicar no papel para cromatografia. Corte o papel Whatman nº 1 com largura de 15 cm e comprimento de 57 cm. Faça uma linha com grafite ao longo da largura do papel, a 6 cm da base. Marque seis pontos com a distância mínima de 3 cm uns dos outros. Aplique, utilizando capilar de vidro, duas gotas das soluções-padrão de açúcares e quatro gotas do filtrado da amostra nos pontos marcados do papel cromatográfico. Coloque a fase móvel numa cânula de vidro, tampe a cuba e mantenha no mínimo uma hora para saturação da mesma. Coloque o papel, adequadamente, com a extremidade em que foram aplicados os padrões e a amostra na cânula. Fixe o papel na cânula, usando um bastão de vidro como apoio. Corra o cromatograma descendentemente por cerca de 12 horas, retire o papel e deixe secar ao ar em uma capela. Aplique o revelador sobre toda a superfície do papel, com auxílio de atomizador. Seque o papel em estufa a (100 - 105)°C, até o aparecimento de manchas características quanto à cor e respectivos Rf. Compare os valores dos Rf dos padrões com os Rf dos componentes da amostra. Cálculo Dc = distância percorrida pelo componente da amostra ou padrão Ds = distância percorrida pela fase móvel. IAL - 131 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográica MORAES, R.M. Carboidratos em alimentos - Manual Técnico, Campinas, SP: Ed. ITAL. 1987. 042/IV Glicídios por cromatografia circular em papel – Prova qualitativa Aplica-se na análise qualitativa dos açúcares presentes nos alimentos (glicose, frutose, maltose, sacarose, além de outros açúcares) utilizando-se a técnica de cromatografia circular em papel em comparação com soluções-padrão de açúcares. A cromatografia em papel é uma técnica de separação baseada no deslocamento diferencial de solutos, arrastados por uma fase móvel e retidos seletivamente por uma fase estacionária líquida (água), contida no papel. Material Balança analítica, estufa, capela para substâncias voláteis, papel para cromatografia Whatman nº 1, pipetas de 1 e 5 mL, capilares de vidro, cuba cromatográfica de (52 x 52) cm, atomizador, béquer de 250 mL, papel de filtro, funil de vidro, frasco Erlenmeyer de 100 mL, proveta com tampa de 100 mL e placas de Petri. Reagentes Soluções-padrão a 2% dos açúcares a serem identificados n-Propanol Acetato de etila Solução de anilina a 4% em álcool Solução de difenilamina a 4% em metanol Ácido fosfórico Fase móvel – Prepare em uma proveta de 100 mL uma mistura de n-propanol - acetato de etila - água (65:10:25). Solução reveladora – Em um frasco Erlenmeyer de 20 mL prepare a mistura de 5 mL da solução de anilina, 5 mL de difenilamina e 1 mL de ácido fosfórico. Procedimento – Pese (10 - 20) g da amostra em béquer de 250 mL, dissolva com cerca de 100 mL de água, mantendo em contato por no mínimo 2 horas. Filtre, recolhendo o filtrado em béquer de 250 mL e reserve, para aplicar no papel para cromatografia. Corte o papel para cromatografia Whatman nº 1, em quadrado de 50 cm de cada lado. Trace com grafite duas diagonais entre os vértices do quadrado e duas entre os lados (todas cruzando 132 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais pelo centro do papel). Marque com lápis um ponto em cada diagonal a 2 cm do centro do papel. Aplique, utilizando capilar de vidro, duas gotas das soluções-padrão e 4-6 gotas do filtrado da amostra. Coloque a fase móvel nas placas de Petri posicionadas no centro e nos quatro vértices da cuba cromatográfica, tampe com uma placa de vidro e deixe saturar por cerca de uma hora. Coloque o papel sobre as placas de Petri, conectando o centro do papel com o solvente da placa central por meio de uma “vassourinha de papel”. Corra o cromatograma circular por cerca de 12 horas (até o solvente atingir as laterais do papel) e retire o papel, marque a frente do solvente e deixe secar ao ar numa capela. Aplique o revelador sobre toda a superfície do papel, com auxílio de atomizador, mantendo-o pendurado em um varal na capela e enrole em um grande cartucho (cerca de 10 cm de diâmetro). Leve a estufa a 105°C até o aparecimento de manchas características quanto a cor e respectivos Rf. Compare os valores dos Rf dos padrões com os Rf do componente da amostra que permite a sua identificação. Cálculo Dc = distância percorrida pelo componente da amostra, a partir do ponto de aplicação da amostra Ds = distância percorrida pela fase móvel, do ponto de aplicação da amostra até a frente marcada. Referências bibliográicas MORAES, R.M. Carboidratos em alimentos - Manual Técnico, Campinas, SP: Ed. ITAL. 1987. COLLINS, C.H.; BRAGA.G.L.; BONATO, P.S. Introdução cromatográficos, Campinas, SP: Ed. UNICAMP, 1993, p. 29-43. a métodos 043/IV Amido Material Cápsulas de porcelana, provetas de 20 e de 100 mL, balões volumétricos de 100 e de 500 mL, béquer de 400 mL, balão de titulação, bureta de 25 mL, pipetas de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, autoclave, banho-maria e funil de vidro. IAL - 133 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Éter Álcool a 70% e a 95% Carbonato de cálcio Solução de acetato neutro de chumbo saturada Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Acido clorídrico Solução de hidróxido de sódio a 10% Carvão ativo Procedimento – Pese 5 g da amostra em uma cápsula de porcelana. Trate, sucessivamente, com três porções de 20 mL de éter. Agite e decante. Transfira o material desengordurado para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, com o auxílio de 100 mL de álcool a 70%. Agite e aqueça em banho-maria a (83-87)°C, por 1 hora, usando um pequeno funil no gargalo do frasco para condensar os vapores. Esfrie, adicione 50 mL de álcool e filtre em filtro seco ou centrifugue durante 15 minutos, a 1500 rpm. Lave o resíduo com 500 mL de álcool a 70%, reunindo as soluções de lavagem ao filtrado (o filtrado ou o sobrenadante pode ser usado para a determinação de glicídios redutores em glicose e em glicídios não redutores em sacarose, evaporando o álcool, dissolvendo o resíduo com água, transferindo para um balão volumétrico de 100 mL e titulando com soluções de Fehling conforme 038/IV e 039/IV). Transfira o resíduo juntamente com o papel de filtro para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com auxílio de 150 mL de água. Adicione 5 gotas de solução de hidróxido de sódio a 10%. Aqueça em autoclave a uma atmosfera por 1 hora. Esfrie e adicione 5 mL de ácido clorídrico (a solução deverá ficar fortemente ácida). Aqueça em autoclave por mais 30 minutos e neutralize com solução de hidróxido de sódio a 10%. Transfira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água. Adicione, se necessário, 0,5 g de carvão ativo. Agite e filtre em filtro seco. Nesta solução determine glicídios redutores por titulação pelo método 038/IV. Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra P = nº de g da amostra V = nº de mL da solução gasto na titulação a = nº de g de glicose correspondente a 10 mL das soluções de Fehling 134 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 53-54. Fibras Ao resíduo orgânico obtido em certas condições de extração, dá-se o nome de fibra. Os métodos de tratamento de extração da amostra variam e é de grande importância, para a comparação de resultados, seguir exatamente as condições específicas em cada um. O termo fibra alimentar foi proposto por Hipsely e definido por Trowell como sendo os componentes das paredes celulares vegetais incluídas na dieta humana que resistem à ação das secreções do trato gastrointestinal. Para a análise de alimentos de consumo humano, o conhecimento do teor fibra alimentar é mais adequado do que o de fibra bruta. Hoje a definição mais aceita, para fins analíticos, é a de Asp que define as fibras, considerando os aspectos fisiológicos, como polissacarídios (exceto amido) e lignina que não são digeridos pelo intestino delgado humano. As fibras podem ser classificadas de acordo com a sua solubilidade. As fibras solúveis são responsáveis pelo aumento da viscosidade do conteúdo gastrointestinal, retardando o esvaziamento e a difusão de nutrientes; incluem as gomas, mucilagens, a maioria das pectinas e algumas hemiceluloses. As fibras insolúveis diminuem o tempo de trânsito intestinal, aumentam o peso das fezes, tornam mais lenta a absorção da glicose e retardam a digestão do amido; incluem a celulose, lignina, hemicelulose e algumas pectinas. Embora em concentrações diferentes, a maioria dos alimentos contém uma combinação dos dois tipos de fibras: as solúveis, tendo como principais fontes alimentares as leguminosas e as frutas e as insolúveis que estão presentes nos grãos de cereais, no farelo de trigo, nas hortaliças e nas cascas de frutas. Durante muitos anos foi utilizada a determinação do teor de fibra ou o resíduo vegetal resultante de um tratamento não fisiológico, obtido pelo método de Henneberg, que consiste numa digestão ácida e outra alcalina num material previamente dessecado e desengordurado. Posteriormente, o procedimento foi simplificado utilizando-se apenas uma etapa de digestão. Estes métodos fornecem valores baixos devido à utilização de digestão muito drástica, levando à perda de alguns componentes, não sendo mais adequados para a análise de alimentos, podendo ser aplicados apenas para de rações animais. Hellenboon et al. (1975) desenvolveram o método enzimático-gravimétrico, que consiste em tratar o alimento com diversas enzimas fisiológicas, simulando as condições do intestino humano, permitindo separar e quantificar gravimetricamente o conteúdo total da fração fibra e/ou as frações solúveis e insolúveis. Este método foi posteriormente modificado por Asp et al (1983) e Prosky et al. (1984). IAL - 135 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 044/IV Fibra bruta Material Estufa, mufla, dessecador com sílica indicadora de umidade, frasco Erlenmeyer de 750 mL com boca esmerilhada, refrigerador de refluxo longo com boca inferior esmerilhada, papel tornassol, proveta de 100 mL, pipetas de 20 mL e cadinho de Gooch com camada de filtração. Reagentes Éter Álcool Areia diatomácea (agente filtrante) para preparação do cadinho Solução ácida – Em um béquer de 1000 mL misture 500 mL de ácido acético glacial, 450 mL de água, 50 mL de ácido nítrico e 20 g de ácido tricloracético. Procedimento – Pese 2 g da amostra, envolva em papel de filtro e amarre com lã. Faça extração contínua em aparelho de Soxhlet, usando éter como solvente. Aqueça em estufa para eliminar o resto de solvente. Transfira o resíduo para um frasco Erlenmeyer de 750 mL, com boca esmerilhada. Adicione 100 mL de solução ácida e 0,5 g de agente de filtração. Adapte o frasco Erlenmeyer a um refrigerante de refluxo por 40 minutos a partir do tempo em que a solução ácida foi adicionada, mantendo sob aquecimento. Agite, freqüentemente, a fim de evitar que gotas sequem na parede do frasco. Filtre em cadinho de Gooch previamente preparado com areia diatomácea e com auxílio de vácuo. Lave com água fervente até que a água de lavagem não tenha reação ácida. Lave com 20 mL de álcool e 20 mL de éter. Aqueça em estufa a 105°C, por 2 horas. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese e repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Incinere em mufla a 550°C. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese e repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. A perda de peso será igual à quantidade de fibra bruta. Cálculo N = nº de g de fibra P = nº de g da amostra 136 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 56. 045/IV Fibra alimentar total – Método enzimático-gravimétrico Material Estufa, mufla, banho-maria, banho-maria com bandeja agitadora, dessecador com sílica indicadora de umidade, cadinho de vidro com placa de vidro sinterizado (ASTM 40-60 µm), lã de vidro de fibra média, béquer de 250 mL, proveta de 250 mL, kitassato de 500 ou 1000 mL, trompa d’água e tamis de 32 mesh. Reagentes Extran a 2% Ácido clorídrico 0,561 M Ácido clorídrico 1 M Hidróxido de sódio 1 M Álcool a 95% Álcool a 78% Acetona α-amilase termorresistente Protease Amiloglicosidase MES – Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico TRIS – Tris(hidroximetil)aminometano Solução-tampão MES-TRIS 0,05 M – Pese 19,52 g de MES e 12,2 g de TRIS. Dissolva em 1,7 L de água. Ajuste o pH para 8,2, a 24°C, com NaOH 6 M e dilua para 2 L com água. Procedimentos Preparação da amostra – Dependendo das características da amostra com relação ao teor de umidade, gordura e açúcar, adota-se um procedimento diferente, visando facilitar a eficiência do tratamento enzimático. Alimentos com alto teor de umidade devem ser inicialmente secos em estufa a vácuo a 70°C, durante a noite, quantificando-se o teor de umidade para efeito do cálculo final da fibra alimentar. Alimentos com alto teor de açúcar devem ser tratados previamente com 100 mL de álcool a 85% por 30 min em banho-maria a 70°C com posterior filtração. O resíduo é lavado com álcool a 70% até atingir o volume de 500 mL. IAL - 137 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Após a evaporação do solvente, o teor de açúcar é quantificado conforme 038/IV e 039/IV. Alimentos com teores de lipídios acima de 5%, quando secos, devem ser desengordurados com éter, em aparelho de Soxhlet, quantificando-se o teor de gordura pelo mesmo motivo da determinação de umidade. Após o tratamento adequado, a amostra deve se moída ou triturada e passada por tamis de 32 mesh. Conserve-a em recipiente fechado até ser analisada. No momento da tomada da amostra para a análise da fibra, determine novamente o teor de umidade. Preparação dos cadinhos – Lave os cadinhos de vidro com placa de vidro sinterizado com porosidade nº 2 (Pyrex nº 32940, ASTM 40-60 µm) com extran a 2%, mantendo em banho por 24 horas, enxágüe com 6 porções de água utilizando vácuo, passe mais 3 porções de água no sentindo oposto ao da filtração, com a finalidade de remover qualquer resíduo retido na placa de vidro. Seque em estufa a 105°C. Transfira os cadinhos para dessecador mantendo-os à temperatura ambiente. Pese. Revista internamente os cadinhos com uma camada de cerca de 1 g de lã de vidro, tendo o cuidado de distribuir uniformemente no fundo e nas paredes (forma de concha). Lave a lã com uma porção de 50 mL de ácido clorídrico 0,5 M com auxílio de vácuo, lave com água até a neutralização. Seque em estufa a 105°C. Incinere em mufla a 525°C, no mínimo por cinco horas. Resfrie em dessecador e pese (P1 para a amostra e B1 para branco). Tratamento enzimático – Pese em béquer de 250 mL, em triplicata, cerca de 1 g da amostra tratada e que tenha passado por tamis de 32 mesh. O peso entre as triplicatas não deve diferir de 20 mg. Adicione 40 mL de solução-tampão MES-TRIS, pH 8,2, dispersando completamente a amostra. Adicione 50 µg de α-amilase termorresistente, agitando levemente. Tampe com papel alumínio e leve ao banho-maria a (95 - 100)°C, por 35 min com agitação contínua. Remova os béqueres do banho e resfrie até (60 ± 1)°C. Adicione 100 µL de solução de protease preparada no momento do uso (50 mg/mL em tampão MES-TRIS), cubra com papel alumínio e leve ao banho-maria a (60 ± 1)°C com agitação por 30 minutos. Remova o papel alumínio dos béqueres e adicione 5 mL de ácido clorídrico 0,561 M, com agitação. Mantenha a temperatura a (60 ± 1)°C e ajuste o pH entre 4,0 - 4,7, com adição de solução de hidróxido de sódio 1 M e/ou ácido clorídrico 1 M. Adicione 300 µL de solução de amiloglicosidase. Cubra com papel alumínio e leve ao banho-maria a (60 ± 1)°C, por 30 minutos, com agitação contínua. Notas Paralelo ao procedimento da amostra, processe pelo menos dois cadinhos em branco (sem amostra). É fundamental, para fins de cálculo, conhecer a massa de lã de vidro utilizada no revestimento do cadinho. O vácuo utilizado nas filtrações deve ser moderado, sendo suficiente o produzido pela trompa d’água. 138 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Utilize luvas e máscara de proteção durante a manipulação da lã de vidro. Fibra alimentar total – Meça o volume do hidrolisado obtido no tratamento enzimático. Adicione álcool 95% a 60°C, medido após aquecimento, na proporção de 4:1 do volume do hidrolisado. Cubra os béqueres com papel alumínio e deixe a mistura em repouso, à temperatura ambiente, por 1 hora, para a precipitação da fração fibra solúvel. Posicione o cadinho, previamente preparado e pesado, num kitassato acoplado a uma trompa de vácuo. Passe pelos cadinhos uma porção de 15 mL de álcool a 78%, para redistribuir a lã de vidro. Filtre quantitativamente a solução alcoólica contendo o resíduo da hidrólise, cuidando para que a solução não ultrapasse o nível da lã de vidro durante a filtração. Lave o resíduo com duas porções de 15 mL de álcool a 95% e duas porções de 15 mL de acetona. Seque os cadinhos contendo o resíduo em estufa a 105°C, durante uma noite. Resfrie em dessecador e pese (P2 para a amostra e B2 para o branco). Após a pesagem, determine o teor de proteína em um dos cadinhos da amostra e em um do branco. Determine o teor de cinzas nos outros dois cadinhos da amostra e em um do branco. Cálculo RT = resíduo total da amostra = (P2- P1) BT = resíduo total do branco = (B2- B1) - Pb- Cb C = cinzas da amostra m = massa da tomada da amostra P = teor de proteína 046/IV Fibra alimentar solúvel e insolúvel – Método enzimático-gravimétrico Procedimento – Execute como a análise da fibra alimentar total, com relação a preparação da amostra, dos cadinhos e a hidrólise enzimática. Concluída a etapa da hidrólise, filtre quantitativamente a solução contendo o resíduo, cuidando para que não ultrapasse a lã de vidro. Lave o béquer e o resíduo com duas porções de 10 mL de água a 70°C, recolhendo a água de lavagem junto com o filtrado da hidrólise. Reserve o filtrado em béquer de 250 mL. A fração fibra insolúvel fica retida no cadinho e a solúvel no filtrado. Lave o resíduo do cadinho contendo a fibra insolúvel com duas porções de 15 mL de álcool a 78%, duas porções de 15 mL de álcool a 95% e duas porções de 15 mL de acetona. Seque os cadinhos em estufa a 105°C, durante uma noite. Resfrie os cadinhos em dessecador e pese (P2 para a amostra e B2 para o branco). Utilize um dos cadinhos da amostra e um do branco para determinar o teor de proteína do resíduo insolúvel e dois cadinhos da amostra e um do branco para determinar o teor de cinzas do resíduo insolúvel. Calcule a fração fibra insolúvel procedendo da mesma forma que para fibra total. Retome o béquer com IAL - 139 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital o filtrado após a hidrólise. Meça o volume. Adicione álcool 95% a 60°C (medido após aquecimento) na proporção de 4:1 do volume do filtrado. Cubra o béquer com papel alumínio e mantenha a mistura em repouso por 1 hora à temperatura ambiente, para a precipitação da fração fibra solúvel. Filtre a solução alcoólica em cadinhos previamente tarados. Proceda à lavagem, secagem e pesagem, como na fração fibra insolúvel. Determine os teores de proteína e cinza da mesma forma que na fração fibra solúvel. Calcule a fração fibra solúvel procedendo da mesma forma que para fibra total. Referência bibliográica LEE, S.C.; PROSKY, L.; DEVRIES, J.W. Determination of total, soluble and insoluble dietary fiber in foods. Enzymatic-gravimetric method, MES-TRIS buffer: collaborative study. J. Assoc. Off. Chem. Int., v. 75, p. 395-416, 1992. 047/IV Pectinas – Prova qualitativa Um certo número de substâncias relacionadas ao ácido péctico (C17H24O16) recebe esta designação. Pectinas são componentes de muitas frutas; na presença de açúcares e ácidos, apresentam tendência a formar um gel, de onde a sua grande importância nos produtos feitos de frutas. Os métodos de determinação de pectinas se baseiam na sua extração por água quente seguida por precipitação com álcool e, após purificação, pesagem na forma de pectato de cálcio ou ácido livre. Procedimento – Adicione a 30 g da amostra, em um béquer, 200 mL de água e misture bem. Aqueça, ligeiramente, em banho-maria. Filtre se necessário. Adicione a uma alíquota do filtrado uma solução de permanganato de potássio a 0,25%. Aqueça até ebulição. Uma cor intensa com fluorescência esverdeada é indicação da presença de pectinas. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 59. 048/IV Pectinas – Determinação por gravimetria Material Balão volumétrico de 200 mL, béquer de 400 mL, pipeta graduada de 5 mL, proveta de 200 mL e cadinho de Gooch. 140 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Reagentes Sacarose Ácido sulfúrico 0,5 M Álcool a 95% Solução de hidróxido de sódio a 10% Ácido clorídrico (1+9) Preparo da solução da amostra a) Geléias e xaropes – Pese 30 g da amostra em um béquer de 200 mL. Adicione 100 mL de água e aqueça ligeiramente. Esfrie. Transfira para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Se necessário, filtre em filtro seco. b) Frutas frescas, doces de massa e conservas – Homogeneíze a amostra em um liqüidificador, se necessário, o mais rapidamente possível. Pese 30 g da amostra em um béquer de 200 mL. Adicione 80 mL de água e aqueça até ebulição por 1 hora, recolocando, de tempo em tempo, o volume de água evaporado. Esfrie e transfira para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Procedimento – Transfira 200 mL da solução da amostra, preparada segundo (a ou b), para um béquer de 400 mL. Adicione de 8 a 12 g de sacarose, se a amostra não contiver açúcar. Evapore em banho-maria até cerca de 25 mL. Esfrie. Adicione 3 mL de ácido sulfúrico 0,5 M e adicione, lentamente, agitando sempre, 200 mL de álcool. Deixe em repouso por 10 horas e filtre. Lave o filtro com 50 mL de álcool a 95%. Transfira o precipitado para o mesmo béquer em que foi feita a evaporação, com o auxílio de um jato de água quente. Evapore até reduzir a 40 mL. Esfrie. Adicione 5 mL de solução de hidróxido de sódio a 10% e 5 mL de água. (Se depois da adição da solução de hidróxido de sódio a solução contiver substâncias insolúveis, repita a análise, usando uma quantidade menor da solução da amostra). Deixe em repouso por 15 minutos. Adicione 40 mL de ácido clorídrico (1+9). Ferva por 15 minutos. Filtre rapidamente. Lave o béquer e o filtro com água quente. Transfira o precipitado para um béquer de 200 mL, com auxílio de um jato de água quente. Lave bem o papel de filtro com água quente. Complete com água o volume de 40 mL. Esfrie. Adicione 5 mL de solução de hidróxido de sódio a 10% e 5 mL de água. Deixe em repouso por 15 minutos. Adicione 49 mL de água e 10 mL de ácido clorídrico (1+9). Ferva por 5 minutos. Filtre em cadinho de Gooch que foi previamente aquecido por 30 minutos em mufla a 550°C e resfriado até a temperatura ambiente em dessecador com cloreto de cálcio anidro, pesado. Lave o cadinho de Gooch com água quente e depois com álcool a 95%. Aqueça por 1 hora em estufa a 100°C. Resfrie até temperatura ambiente em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento I (30 minutos na estufa) e resfriamento até peso constante. IAL - 141 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição Aqueça por 30 minutos em mufla a 550°C. Resfrie e pese. Repita as operações de aquecimento (30 minutos na mufla) e resfriamento até peso constante. A perda de peso dará a quantidade de ácido péctico. Cálculo N = nº de g de ácido péctico P = nº de g da amostra usado na precipitação Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 5961. 049/IV Dióxido de enxofre – Prova qualitativa O dióxido de enxofre pode ser usado nos alimentos como conservador isolado ou na forma de seus sais de sódio, potássio ou cálcio, mas nas análises sempre é calculado na forma de SO2 livre. Tem ação inibidora no crescimento de fungos, fermentos e bactérias aeróbias e previne o escurecimento enzimático de frutas e vegetais. Mantém a vitamina C, mas inativa a vitamina B1. Material Frasco Erlenmeyer de 125 mL, tubo em U, tubo de ensaio, proveta de 10 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Acetato de cobre Ácido clorídrico Pedra de mármore Solução de iodo com cloreto de bário – Dissolva 3 g de iodo em uma solução de 3 g de iodeto de potássio em 50 mL de água. Adicione 2 g de cloreto de bário e complete com água o volume até 100 mL. 142 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Procedimento – Pese 5 g da amostra em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 0,1 g de acetato de cobre, um pequeno pedaço de mármore e 10 mL de ácido clorídrico. Feche imediatamente com uma rolha contendo um tubo recurvado cuja extremidade mergulhe em 0,5 mL de solução iódica de cloreto de bário. Deixe o ácido agir sobre o mármore por 10 minutos. Aqueça até ebulição. Observe a solução na extremidade do tubo. Em presença do dióxido de enxofre ela descora e se forma um precipitado branco de sulfato de bário. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 86-87. 050/IV Dióxido de enxofre – Método quantitativo de Monier- Williams Material Manta aquecedora, cilindro de nitrogênio e aparelho segundo a Figura 1. Figura 1 – Aparelho para determinação de SO2 Reagentes Água oxigenada a 3%, recém-preparada com água destilada e deionizada Ácido clorídrico Hidróxido de sódio 0,05 M Vermelho de metila a 0,2% m/v ou azul de bromofenol a 0,4% m/v IAL - 143 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese 50 g da amostra e transfira para o balão de reação do aparelho. Adicione 350 mL de água e 20 mL de ácido clorídrico. Transfira 15 mL e 5 mL de água oxigenada a 3%, respectivamente, para os frascos A e B, que devem estar mergulhados em banho de água gelada. Abra o torpedo de nitrogênio e faça passar corrente de nitrogênio a razão de 10 bolhas por minuto no balão de reação e aqueça-o de modo a manter a ebulição durante 120 minutos e não aumentar o número de bolhas por minuto. Desligue. Transfira a solução do frasco B para o frasco A, lavando com 10 mL de água bidestilada e deionizada. Adicione três gotas do indicador e titule com a solução de hidróxido de sódio 0,05 M. Titule um branco de 20 mL de água oxigenada nas mesmas condições. Notas Alternativamente, pode-se usar, em substituição ao ácido clorídrico, uma solução aquosa de ácido fosfórico 1:1, v/v. Para amostras com baixa concentração de sulfito, recomenda-se a titulação por via potenciométrica. Cálculo B = nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,05 M gasto na prova em branco A = nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,05 M gasto na titulação da amostra M = molaridade da solução de hidróxido de sódio P = nº de g da amostra f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,05 M Referências bibliográicas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 88-89. FAZIO, T.; WARNER, C. A. Review of sulphites in foods: analytical Methodology and reported findings. Food Addit. Contam., Basingstoke, v. 7, n. 4, p. 433-454, 1990. 051/IV Corantes artificiais orgânicos – Prova qualitativa O método é aplicável a amostras de alimentos coloridos artificialmente e baseia-se na separação dos corantes por cromatografia ascendente em papel. 144 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Material Banho-maria, capela para solventes, lã natural branca de 20 cm, régua de 20 cm, papel Whatman nº 1 (20 x 20 cm), béquer de 25 e 200 mL, bastão de vidro, capilar de vidro e cuba de vidro (21 x 21 x 10) cm. Reagentes Ácido clorídrico Hidróxido de amônio Padrões de corantes orgânicos artificiais a 0,1% m/v Procedimento – Para a extração dos corantes, coloque em um béquer de 200 mL aproximadamente 30 a 50 g da amostra, 100 mL de água e cerca de 20 cm de um fio de lã natural branca e misture bem. Acrescente algumas gotas de HCl (± 0,5 mL) e coloque em banho-maria fervente até que o corante fique impregnado na lã. Lave a lã com água corrente. Coloque em um béquer de 25 mL e adicione algumas gotas de hidróxido de amônio (± 0,5 mL). Em seguida, adicione 10 mL de água e coloque em banho-maria até que a solução adquira uma coloração igual à da lã. Retire a lã e reduza o volume do líquido à metade, por evaporação. Para a identificação dos corantes extraídos, aplique a amostra e as soluções dos padrões de corantes, com auxilio de capilar, no papel de cromatografia Whatman n. 1 e escolha o solvente mais adequado seguindo o procedimento descrito no método 086/IV. Compare o aparecimento das manchas da amostra quanto à cor e aos fatores de resolução (Rf), com os respectivos padrões de corantes orgânicos artificiais. Notas Para se obter um produto mais puro, caso seja necessário, faça dupla extração dos corantes com o fio de lã. Corantes naturais poderão tingir o fio no primeiro tratamento, mas a coloração não é removida pela solução de hidróxido de amônio. Referência bibliográica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 106-108. IAL - 145 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 052/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa Material Extrator de Soxhlet, espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, balões volumétricos de 100 mL, béqueres de 150 e 200 mL e funil de Büchner. Reagentes Metanol com 5% de hidróxido de amônio Álcool com 5% de hidróxido de amônio Solução de acetato de amônio 0,02 M e pH = 5,6 Balas de goma, balas duras, gomas de mascar, pós para sobremesa e pós para refresco Procedimento – Pese com precisão cerca de 7 g de balas ou gomas de mascar devidamente trituradas ou picadas, 5 g de pós para sobremesas ou 3 g de pós para refresco em um béquer de 150 mL, adicione 30 mL de metanol amoniacal e agite com auxílio de bastão de vidro. Deixe decantar e transfira o líquido colorido para um balão volumétrico de 100 mL, filtrando em papel de filtro. Repita a extração com mais duas porções de 30 mL de metanol amoniacal ou até que a amostra fique incolor. Caso as bordas do papel de filtro adquirem a coloração da amostra, recorte e junte ao resíduo da amostra no béquer. Repita a extração com metanol amoniacal. Complete o volume com a mesma solução. Centrifugue, se necessário. Leia a absorbância em espectrofotômetro no(s) comprimento(s) de onda do(s) corante(s) identificado(s) como em 051/IV, usando como branco a solução de metanol amoniacal. Sorvetes e iogurtes Procedimento – Pese com precisão cerca de 10 g de amostra em um béquer de 150 mL, adicione 30 mL de álcool contendo 5% de hidróxido de amônio. Agite e deixe em repouso em geladeira por quatro horas aproximadamente. Após a decantação do líquido colorido, filtre em funil de Büchner, recolhendo o filtrado em um balão volumétrico de 50 mL. Transfira o resíduo para o mesmo béquer e repita a extração com mais 15 mL de álcool amoniacal, até que a amostra fique incolor. Complete o volume. Se a solução ficar turva, coloque o balão em geladeira por três horas aproximadamente. Retire, espere estabilizar à temperatura ambiente e filtre em papel de filtro. Leia a absorbância em espectrofotômetro no(s) comprimento(s) de onda do(s) corante(s) identificado(s) como em 051/IV usando como branco a solução de álcool amoniacal. 146 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Xarope de groselha Procedimento – Pese com precisão cerca de 5 g de amostra e dilua a 100 mL em balão volumétrico com solução de acetato de amônio 0,02 M. Leia a absorbância em espectrofotômetro no(s) comprimentos de onda do(s) corante(s) identificado(s) usando como branco a solução de acetato de amônio. Cálculos a) Amostra com um só corante: calcule o teor usando o valor de te, segundo a Tabela 7. do respectivo coran- Tabela 7 – Características espectrofotométricas dos corantes artificiais Corante Amarelo crepúsculo Azul brilhante Azul indigotina Bordeaux S Eritrosina Tartrazina Vermelho sólido E Vermelho 40 Ponceau 4R (nm) 481 630 610 519 524 426 505 505 507 564,1 1840,0 449,3 436,0 1130,0 536,0 447,9 536,0 442,5 b) Amostra com dois corantes cujas absorções máximas são bem distantes entre si: faça as leituras das absorbâncias nos dois comprimentos de onda respectivos na mesma solução. Como os corantes absorvem em regiões distintas, a absorção de um não interfere na absorção do outro. Calcule o teor de corante usando o valor de de cada corante. c) Amostra com dois corantes cujas absorções máximas são bem próximas uma da outra: faça as leituras das absorbâncias nos comprimentos de onda de cada corante na mesma solução. Como as regiões de absorções máximas são bem próximas, a absorção de um dos corantes interfere na absorção do outro. Em amostras contendo tartrazina e amarelo crepúsculo, como por exemplo ao fazer a leitura a 426 nm, na realidade, estamos considerando a absorção da tartrazina mais a do amarelocrepúsculo; a 481 nm, estamos considerando a absorção do amarelo-crepúsculo mais a da tartrazina. O que ocorre é a aditividade das absorbâncias. Para a devida correção, estabelecemos valores de a 426 nm e a 481 nm com o padrão do corante tartrazina com 96,36% de pureza IAL - 147 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (no mínimo) e com o padrão do corante amarelo-crepúsculo com 90,29 % de pureza (no mínimo), conforme Tabela 8. Tabela 8 – Características espectrofotométricas dos corantes artificiais Corante Tartrazina Tartrazina Amarelo-crepúsculo Amarelo-crepúsculo (nm) 426 481 426 481 535 170 221 592 Substituindo esses valores de na equação de Lambert-Beer, (A=abc), a concentração do corante é obtida com a resolução do sistema de equação com duas incógnitas. A426nm = 535x + 221y A481nm = 170x + 592y x = concentração do corante tartrazina y = concentração do corante amarelo-crepúsculo A426= absorbância da solução a 426 nm A481 = absorbância da solução a 481 nm Referência bibliográica TAKAHASHI, M.Y.; YABIKU, H.Y.; MARSIGLIA, D.A.P. Determinação quantitativa de corantes artificiais em alimentos. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 48, (1/2) p. 7-15, 1988. 053/IV Determinação da composição de ácidos graxos saturados e insaturados por cromatografia em fase gasosa Os lipídios da amostra a ser analisada são submetidos à reações de transesterificação ou hidrólise e esterificação; os ésteres metílicos de ácidos graxos formados são determinados por cromatografia em fase gasosa utilizando como padrão interno metiltridecanoato. O método permite uma separação quantitativa de misturas de ésteres metílicos de ácidos graxos saturados e insaturados, inclusive dos ácidos graxos trans, dependendo da coluna, condições cromatográficas e dos padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos empregados. A quantificação é feita baseada nas relações de área de cada ácido graxo com a área do padrão interno, utilizando os fatores de correção de resposta do detector de ionização de chama (DIC) e de conversão de ésteres metílicos de ácidos graxos para ácido graxo. 148 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Como uma alternativa, o cálculo da concentração dos ácidos graxos saturados e insaturados, pode ser feito por normalização de área, calculando os fatores de correção de resposta para cada ácido graxo no detector de ionização de chama. As porcentagens em massa obtidas para cada éster metílico de ácido graxo são multiplicadas pelo teor de lipídios da amostra e por fatores de conversão de gordura para ácidos graxos, variáveis conforme o tipo de alimento. Este procedimento de cálculo aplica-se principalmente aos alimentos cujos lipídios extraídos sejam predominantemente de um dos tipos de alimentos cujos fatores de conversão foram estabelecidos. Os lipídios dos alimentos (gordurosos) são essencialmente ésteres de ácidos graxos e glicerol com pequenas quantidades de outros componentes como: fosfolipídios, glicolipídios, esteróis e outros compostos extraídos com solventes orgânicos. Deve-se adotar, preferencialmente, o método de cálculo com padrão interno. Material Cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, integrador ou computador, coluna cromatográfica capilar de sílica fundida com fases estacionárias de ciano propil siloxano, exemplo: SP2340 de 60 m, SP2560 de 100 m, CP-Sil 88, 50 ou 100 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme 0,25 µm, sistema de injeção com divisão de amostra; balança analítica; agitador do tipo vortex; seringa de capacidade máxima 10 µL, graduada em 0,1 µL; balão volumétrico de 25 e 100 mL; flaconete (vial) de 1,5 mL; pipeta volumétrica de 5 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Mistura de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos variando de C4 a C24. Padrão interno C13 (metiltridecanoato) n- Hexano grau CLAE Gás de arraste para DIC: hidrogênio Gases auxiliares para DIC: nitrogênio/ar super seco (livre de hidrocarbonetos). Solução-padrão de mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos – Dilua com n-hexano o conteúdo da ampola (contendo 100 mg da mistura de padrões de FAMEs) em balão volumétrico de 25 mL. Distribua em vials de 1,5 mL e armazene em freezer. Esta solução será utilizada para identificar os ésteres metílicos de ácidos graxos e determinar os fatores de correção de cada componente. Solução-padrão interno (C13:0) – Pese, com precisão, cerca de 250 mg de metiltridecanoato em balão volumétrico de 100 mL, dissolva e complete o volume com n-hexano. Transfira para um frasco âmbar e armazene em geladeira (validade 1 semana) ou em freezer (validade 1 ano). Procedimento – Extraia os lipídios da amostra pelo método mais apropriado para a análise de ácidos graxos. Verifique, nos capítulos deste livro, dependendo do tipo de amostra, qual é o melhor método de extração. Prepare os ésteres metílicos de ácidos graxos como descritos IAL - 149 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital nos procedimentos 054/IV, 055/IV e 056/IV. Condições de operação do cromatógrafo gasoso com detector de ionização de chama e condições otimizadas para colunas com fases estacionárias de ciano propil siloxano (exemplo: SP2560, 100 m); programação da temperatura da coluna: 45°C por 4 min, primeira rampa de 13°C/min até 175°C (27 min), segunda rampa de 4°C/min até 215°C (35 min), temperatura do injetor 220°C, temperatura do detector 220°C, razão de divisão da amostra 1:50. Cálculo dos fatores de correção de reposta no DIC: Cálculo experimental: Injete, em triplicata, 1 µL da solução-padrão de ésteres metílicos de ácidos graxos. Identifique cada pico e determine os fatores de correção (K’ ) individuais com relação ao éster metílico do ácido tridecanóico (C13:0), utilizando a equação abaixo: MAGi = porcentagem do ácido graxo na mistura de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos AC13:0 = média das áreas do pico do éster metílico do C13:0 MC13:0 = porcentagem do éster metílico do C13:0 na mistura de padrões AAGi = média das áreas do ácido graxo na mistura de padrões Cálculo teórico: KAgi = fator de resposta para o ácido graxo “i” MAgi = massa molecular do éster metílico de ácido graxo “i” n Agi = número de átomos de carbono do éster metílico do ácidos graxo “i” Ac = massa atômica do carbono (12,01) Pesos atômicos utilizados no cálculo: Carbono =12,01; Hidrogênio = 1,0079; Oxigênio =15,994. Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relação ao C13:0: t 150 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais K’AGit= fator relativo de correção, para o ácido graxo “i” K C13 = fator de resposta do DIC para o C13:0 K AGi = fator de resposta do DIC para o ácido graxo “i” Nota: recomenda-se, nos cálculos, a utilização dos fatores teóricos de resposta do DIC. Determinação da concentração de ácidos graxos na amostra – Injete 1 µL da amostra no cromatógrafo a gás, utilizando microsseringa de 10 µL. Identifique os picos por comparação com os tempos de retenção dos padrões de ésteres metílicos com os componentes separados da amostra. Determine a concentração de cada ácido graxo, utilizando a equação abaixo. Cálculo com padrão interno MPI = massa do padrão interno (C13:0) adicionada na amostra AAGi = área do ácido graxo no cromatograma da amostra K’AGi = fator de correção de cada ácido graxo com relação ao C13:0 (teórico ou experimental) FCAG = fator de conversão de éster metílico de ácido graxo (Tabela 9) L = teor de lipídios em gramas por 100 g de amostra M = massa da amostra API = área do padrão interno (C13:0) no cromatograma da amostra Tabela 9 - Fatores de conversão de éster metílico de ácido graxo para ácido graxo Ácido graxo Fator de conversão FCAG C 4:0 (ácido butírico) C 6:0 (ácido capróico) C 8:0 (ácido caprílico) C10:0 (ácido cáprico) C11:0 (ácido undecanóico) C12:0 (ácido láurico) C13:0 (ácido tridecanóico) C14:0 (ácido mirístico) C14:1 (ácido miristoleico) C15:0 (ácido pentadecanóico) C15:1 (ácido pentadecenóico) 0,863 0,892 0,911 0,925 0,930 0,935 0,939 0,942 0,942 0,945 0,945 IAL - 151 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ácido graxo C16:1 (ácido palmitoleico) C17:0 (ácido margárico) C17:1 (ácido heptadecenóico) C18:0 (ácido esteárico) C18:1 cis (ácido oléico) C18:1 trans (ácido elaídico) C18:2 cis (ácido linoleico) C18:2 trans (ácido linolelaídico) C18:3 cis (ácido linolênico) C18:3 trans (ácido linolênico trans) C20:0 (ácido araquídico) C20:1 (ácido gadoleico) C20:2 cis (ácido eicosadienóico) C20:3 n3 (ácido eicosatrienóico n3) C20:3 n6 (ácido eicosatrienóico n6) C20:4 (ácido araquidônico) C20:5 (ácido eicosapentaenóico) C21:0 (ácido heneicosanóico) C22:0 (ácido behênico) C22:1 (ácido erúcico) C22:2 (ácido docosadienóico) C22:6 (ácido docosahexaenóico) C23:0 (ácido tricosanóico) C24:0 (ácido lignocérico) C24:1 (ácido nervônico) Fator de conversão FCAG 0,948 0,951 0,950 0,953 0,953 0,953 0,952 0,952 0,952 0,952 0,957 0,957 0,957 0,956 0,956 0,956 0,956 0,959 0,960 0,960 0,960 0,959 0,962 0,963 0,963 Cálculo com fatores de conversão: ’ ConcAGi= concentração do ácido graxo em gramas por 100 g da amostra %AAGi = porcentagem de área do ácido graxo no cromatograma da amostra K’ AGi = fator de correção de resposta de cada ácido graxo com relação ao C13:0 (teórico ou experimental) FCv = fator de conversão de gordura para os ácidos graxos L = teor de lipídios na amostra em gramas por 100 g da amostra 152 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Fatores (FCv) para alguns alimentos: FCv = 0,956 – óleos, gorduras e sementes oleaginosas FCv = 0,945 – produtos lácteos FCv = 0,830 – ovos FCv = 0,800 – frutas e vegetais FCv = 0,953 – carne gorda bovina, suína e ovina FCv = 0,916 – carne magra bovina e ovina FCv = 0,910 – carne magra suína FCv = 0,945 – carne de frango FCv = 0,900 – carne gorda de peixe FCv = 0,700 – carne magra de peixe Cálculo Expresse a concentração dos ácidos graxos saturados, monoinsaturados e polinsaturados, em gramas por 100 g de amostra, utilizando o cálculo abaixo: Nota: Caso os ácidos graxos trans estejam presentes, expressar como: Referências bibliográicas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 996.06). Arlington: A.O.A.C. 16th ed. Chapter 41, p. 18 -18 B. (Supplement March, 1997). ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 996.01). Arlington: A.O.A.C. 17th ed., 2000. AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Oicial Methods and th. Recommended Practices of the American Oil Chemits’ Society. 4 ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-66). IAL - 153 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Oicial methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th. ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatography). INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids. ISO 5508-1990E - 09-15. HOLLAND, B. et al. in: The composition of foods. Mc cance and Widdowson’s 16th ed., Cambridge, UK, 2002. p. 7-10. AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemits’ Society. 5th. ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1999 (A.O.C.S. Official Method Ce-1f 96). 054/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 1 Este método refere-se à preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir dos ésteres de ácidos graxos e glicerol de óleos e gorduras por reação de transesterificação. Os ésteres metílicos obtidos serão posteriormente analisados por cromatografia em fase gasosa. Aplica-se à preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos com 8 ou mais átomos de carbono a partir de óleos e gorduras de origem animal ou vegetal (inclusive os lipídios extraídos dos alimentos). O material insaponificável não é extraído e, se presente em grandes quantidades, poderá interferir na análise. Amostras que apresentem ácidos contendo os seguintes grupos na molécula: epoxi, hidroperóxidos, ciclopropenil e ciclopropil, não poderão ser preparadas por este método, pois poderá ocorrer destruição parcial ou completa de tais grupos. Material Bateria de Sebelin, balança analítica, frasco de transesterificação de 200 mL com junta esmerilhada 24/40, pérolas de vidro e pipetas volumétricas de 2 a 5 mL. Reagentes Solução saturada de cloreto de sódio n-Hexano grau cromatográfico 154 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Solução de ácido sulfúrico a 2% (v/v) em metanol grau cromatográfico) Nota: todos os padrões devem ter pureza superior a 99% e devem ser substituídos a cada seis meses. Procedimento – Pese cerca de 25 mg da amostra (óleo ou gordura vegetal ou animal) e transfira para o frasco de transesterificação (Figura 2). Adicione 3 mL de n-hexano (ou de 2 a 5 mL da solução do padrão interno), 15 mL de solução de ácido sulfúrico a 2% (v/v) em metanol e algumas pérolas de vidro. Aqueça em refluxo durante uma hora. Resfrie e adicione 40 mL de solução saturada de cloreto de sódio. Agite por um minuto. Adicione mais solução saturada de cloreto de sódio saturada até que a fase orgânica, onde estão dissolvidos os ésteres metílicos, atinja a parte afunilada do frasco. Espere até que as fases (aquosa e orgânica) se separem nitidamente. Utilize a fase superior para a análise por cromatografia em fase gasosa. Analise os ésteres metílicos o mais rápido possível para evitar a perda dos mais voláteis. Nota: caso não seja possível a análise imediata daqueles compostos, guarde em geladeira, sob atmosfera de nitrogênio, por no máximo 24 horas. Para estocagem por tempo prolongado, guarde em congelador sob atmosfera de nitrogênio em ampola de vidro selada. Figura 2 – Frasco de transesterificação Referências bibliográicas AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official Methods and ecommended Practices of the American Oil Chemits’ Society. 4 th. ed.Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-66). THE INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO IAL - 155 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 15304:2002 (E): animal and vegetables fats and oils – Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetables fats and oils – Gas chromatographic method. 2nd. ed. Switzerland, 2002. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 266. BADOLATO, E.S.G.; ALMEIDA, M.E.W. Pesquisa por cromatografia em fase gasosa da adulteração do chocolate. Rev. Inst. Adolfo Lutz. v. 37, p. 47-56, 1977. 055/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 2 Este método refere-se a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir dos ésteres de ácidos graxos e glicerol de óleos e gorduras, por reação de transesterificação, em meio básico e a frio. Os ésteres metílicos obtidos serão posteriormente analisados por cromatografia em fase gasosa. Este é um método apropriado para a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos com 4 ou mais átomos de carbono, a partir de óleos e gorduras de origem vegetal ou animal (inclusive os lipídios extraídos dos alimentos), que apresentem índice de acidez em ácido oléico inferior a 4,0. A metodologia é rápida e adequada à preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos mais voláteis, pois a reação ocorre a frio. Material Centrífuga ou agitador de tubos tipo vortex, pipeta automática de 20 a 200 µL, balança analítica, tubos de centrífuga de 20 mL com tampa, balão volumétrico de 100 mL e pipetas volumétricas de 2 a 5 mL. Reagentes Solução de hidróxido de potássio 2 M em metanol (grau cromatográfico). Solução saturada de cloreto de sódio. n-Hexano grau cromatográfico. Procedimento – Pese cerca de 100 mg da amostra em tubo de centrífuga de 20 mL com tampa. Adicione 2 mL de n-hexano (ou de 2 a 5 mL da solução do padrão interno) e em seguida 0,2 mL de solução metanólica de KOH 2 M. Feche o tubo e agite no vortex (ou centrífuga) por 30 segundos. Adicione 3 mL de solução saturada de cloreto de sódio. Deixe separar as fases e utilize a fase superior para a análise por cromatografia em fase gasosa. Analise os ésteres metílicos o mais rápido possível, para evitar a perda dos ésteres mais voláteis. Nota: veja a nota do procedimento 054/IV 156 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Referências bibliográicas AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemits’ Society. 4th. ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ch 1-91). THE INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO 15304:2002(E): animal and vegetables fats and oils – Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetables fats and oils – Gas chromatographic method. 2. ed. Switzerland, 2002. IUPAC Standard Methods for Analysis of Oils, Fats and Derivates. Blackwell Scientific Publications 7th Edition (1987); IUPAC Methodot 2:301; Report of IUPAC Working Group WG 2/87. 056/IV Preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos – Método 3 Este método refere-se a preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos a partir dos ésteres de ácidos graxos e glicerol de óleos e gorduras, por reação de hidrólise e esterificação. Os ésteres metílicos obtidos serão posteriormente analisados por cromatografia em fase gasosa. Aplica-se à preparação de ésteres metílicos de ácidos graxos com 8 ou mais átomos de carbono, a partir de óleos e gorduras de origem vegetal ou animal, inclusive os de origem marinha. Material Agitador de tubo tipo vortex, banho-maria, balança analítica, tubos de centrifuga de 30 mL com tampa, balão volumétrico de 100 mL, pipeta automática de 20 a 200 µL e pipetas volumétricas de 2 a 5 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,5 M em metanol (grau cromatográfico) Solução saturada de cloreto de sódio n-Hexano grau cromatográfico Solução esterificante – Pese 10 g de NH4Cl e adicione 300 mL de metanol seguido de 15 mL de H2SO4, adicionado em pequenas porções com agitação. Procedimento – Pese entre 30 e 100 mg do óleo ou gordura em tubo de centríIAL - 157 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital fuga de 30 mL com tampa. Adicione 3 mL de n-hexano para solubilizar a amostra (ou de 2 a 5 mL da solução de padrão-interno). Adicione 4 mL de solução 0,5 M de NaOH. Feche bem o tubo e aqueça em banho de água com temperatura entre (65 - 70)°C até dissolver os glóbulos de gordura e a solução ficar transparente (3 - 5) min. Esfrie o tubo sob água corrente. Adicione 5 mL da solução esterificante, feche e agite o tubo por 30 segundos. Aqueça em banho de água com temperatura entre 65 e 70°C por 5 min. Esfrie o tubo sob água corrente o mais rápido possível. Adicione 4 mL de solução saturada de NaCl. Agite vigorosamente por 30 segundos em agitador tipo vortex. Adicione 3 mL de n-hexano. Agite vigorosamente por 30 segundos no vortex. Deixe separar as fases e utilize a fase superior para a análise por cromatografia em fase gasosa. Analise os ésteres metílicos o mais rápido possível, para evitar a perda dos mais voláteis. Nota: veja a nota do procedimento 054/IV Referências bibliográicas THE INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO 15304:2002(E): animal and vegetables fats and oils – Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetables fats and oils – Gas chromatographic method. 2. ed., Switzerland, 2002. HARTMAN. L.; LAGO, R.C.A. Rapid preparation of fatty acid methyl esters from lipids. Lab. Prac., v. 22, p. 475-476, 1973. MAIA, E.L.; RODRIGUES-AMAYA, D.B.R. Avaliação de um método simples e econômico para metilação de ácidos graxos com lipídios de diversas espécies de peixes. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 53(1/2), p. 27-35, 1993. 057/IV Pesquisa de compostos voláteis por cromatografia em fase gasosa com detector de massas e técnica de headspace Este método aplica-se a amostras de alimentos, bebidas e águas, que apresentem características sensoriais alteradas (odor). Os compostos voláteis das amostras, extraídos pela técnica de headspace, são injetados no cromatógrafo gasoso e seus componentes são separados de acordo com a afinidade destes com a fase estacionária da coluna cromatográfica; posteriormente, os compostos separados são fragmentados por impacto de elétrons, no detector de massas, e os respectivos espectros de massas gerados são comparados com aqueles presentes nas bibliotecas de espectros de massas dos aparelhos ou disponíveis na literatura. As identificações são feitas por similaridade, e, quando disponíveis, padrões de substâncias puras são analisados em paralelo para confirmação dos resultados. 158 - IAL Capítulo IV - Procedimentos e Determinações Gerais Material Cromatógrafo gasoso com detector de massas e auto-amostrador de headspace acoplado, recravador de tubos, estufa com temperatura controlada (até 150°C) e flaconetes ou vials de 20 mL com septo de material inerte (teflon). Procedimento Preparação da amostra – Transfira uma quantidade da amostra, previamente homogeneizada, para um vial de 20 mL, de modo a ocupar aproximadamente 1/3 do seu volume. Lacre o vial e adapte ao auto-injetor. Programação das condições do auto-amostrador – Auto-injetor de headspace, temperatura do vial: (90-110)°C, temperatura da seringa: (90-10)°C, tempo de aquecimento do vial: 15 min, volume injetado: 0,8 mL. Nota: o volume injetado pode ser diminuído ou aumentado, dependendo da concentração da amostra. Programação das condições do cromatógrafo – Temperatura da coluna 30°C por 5 min, rampa de aquecimento 5°C até 160°C por 5 min, tempo de equilíbrio para estabilização das condições do aparelho 1 min, temperatura do injetor 230°C, temperatura do detector 240ºC, coluna Carbowax 20 M (ou outra fase própria para análise dos componentes da amostra problema), comprimento da coluna: 30, 50 ou 60 m, diâmetro interno 0,25 mm, espessura do filme 0,25 µm, pressão da coluna 40 kPa, fluxo 0,8 mL/ min, velocidade linear: 33,2 m/s, razão de divisão da amostra variável de acordo com a concentração da amostra. Nota: pode-se utilizar outros tipos de coluna, com diferentes fases estacionárias; porém, as condições analíticas devem ser alteradas de acordo com as especificações das mesmas. Programação das condições do detector de massas – Intervalo de massa: Razão massa/ carga 35 a 350, corte do solvente 0,50 min, início da aquisição 0,60 min, ganho do detector (1,3 - 1,5) kV, energia do filamento 70 eV, forma de aquisição varredura (SCAN) ou monitoramento de um íon (SIM). Este último modo aumenta a sensibilidade da análise. Análise da Amostra – Injete a amostra de acordo com as condições programadas. O monitor exibirá o cromatograma e os respectivos espectros de massas de cada pico eluído. Após o término da corrida, analise cada pico separadamente e correlacione com o seu espectro de massas. A partir da obtenção de cada espectro de massas, realize a pesquisa individual nas bibliotecas NIST 62 e NIST 12 IAL - 159 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (ou outras disponíveis). As identificações são feitas por similaridade, baseadas na comparação com os espectros de massas presentes nas bibliotecas citadas. Notas Ao invés de se trabalhar com auto-amostrador, é possível, também, fazer a injeção manual. Aqueça a amostra previamente em estufa a 90°C por 15 min, em vial lacrado, ou outro frasco de vidro. Injete a fração volátil da amostra, utilizando uma seringa de vidro com capacidade de 2 mL, própria para gases. É necessário fazer a análise de brancos precedente à da amostra, a fim de se descartar possíveis interferentes. Em paralelo à analise da amostra, submeta uma amostra-padrão do material em análise às mesmas condições analíticas da amostra, com a finalidade de efetuar a comparação dos resultados de ambas. Quando disponíveis, injete padrões das substâncias puras encontradas na amostra para confirmação dos resultados. Referências bibliográficas AMSTALDEN, L. C.; LEITE, F.; MENEZES, H.C. Identificação de voláteis de café através de cromatografia gasosa de alta resolução/espectrometria de massas empregando um amostrador automático de “headspace”. Ciênc. e Tecn. Aliment., Campinas, v. 21(1), p.123-128, 2001. GOBATO, E.A.A.F.; LANÇAS, F.M. Comparação entre injeção na coluna (“on-column”) e “headspace” dinâmico na determinação de benzeno, tolueno e xilenos (BTX) em amostras de água. Química Nova, v. 24(2), p. 176-179, 2001. KOLB. B.; ETTRE, L. S. Static headspace - gas chromatography theory and practice. N.Y.: Ed. Wiley-VCH, 1997. 298 p. WARNER, K.; ELSON, T. AOCS collaborative study on sensory and volatile compound analyses of vegetable oils. J. Am. Oil Chem. Soc., v. 73 (2), p. 157-166, 1996. Colaboradores Alice Momoyo Sakuma; Carmen Sílvia Kira; Cláudio de Flora; Cristiane Bonaldi Cano; Deise Aparecida Pinatti Marsiglia; Maria de Fátima Henriques Carvalho; Márcia Regina Pennacino do Amaral Mello; Maria Lima Garbelotti; Miriam Solange Fernandes Caruso; Neus Sadocco Pascuet; Odair Zenebon; Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues e Sabria Aued Pimentel 160 - IAL CAPÍTULO V ADITIVOS IAL - 161 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 162 - IAL Capítulo V - Aditivos V ADITIVOS om o desenvolvimento tecnológico, é grande e variado o número de substâncias químicas empregadas no decorrer de todo o processo de produção de alimentos. Dentre estas substâncias, destacam-se os aditivos, que podem apresentar grandes vantagens para melhorar os alimentos do ponto de vista tecnológico, desde que seu uso seja seguro. Para isto, é necessário verificar se obedecem às normas de identidade e pureza estabelecidas pela FAO/OMS ou pelo Food Chemicals Codex, exigidos pela legislação brasileira, sendo portanto este controle feito antes da adição ao alimento. C Toda a legislação a respeito de aditivos é positiva e dinâmica, isto é, são agrupadas em listas as substâncias cujo uso é permitido, os alimentos em que podem ser usadas e os limites máximos no produto final, sendo estas listas revisadas e acrescidas com novas substâncias sempre que necessário. A partir de 1997, houve muitas alterações na legislação de aditivos alimentares, a fim de compatibilizar a legislação nacional com o estabelecido nas resoluções harmonizadas no Mercosul, a começar com a Portaria no 540 da SVS/MS de 27/10/1997, que aprova o regulamento técnico de aditivos alimentares e os define como “qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais durante a fabricação, processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento, armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento. Ao agregar-se, poderá resultar que o próprio aditivo ou seus derivados se convertam em um componente de tal alimento. Esta definição não inclui os contaminantes ou substâncias nutritivas que sejam incorporadas ao alimento para manter ou melhorar suas propriedades nutricionais.” Esta Portaria também altera a classificação dos aditivos alimentares, aumentando de 11 para 23 classes funcionais. IAL - 163 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A seguir, são comentadas algumas classes de aditivos, cujas definições foram extraídas da Portaria n° 540/97. Acidulantes/Reguladores de acidez Substâncias que aumentam a acidez ou conferem um sabor ácido aos alimentos, dentre estas são de maior emprego os ácidos orgânicos, tais como: o ácido cítrico, tartárico, láctico, fumárico e málico; além do ácido fosfórico, que é inorgânico. Estes ácidos também podem ser utilizados como reguladores de acidez, substâncias que alteram ou controlam a acidez ou a alcalinidade dos alimentos. Antioxidantes Substâncias que retardam o aparecimento de alterações oxidativas nos alimentos. Geralmente são utilizados os galatos (propila, octila ou duodecila), ácido ascórbico e seus isômeros, butil-hidroxianisol (BHA) e butil-hidroxitolueno (BHT), isoladamente ou em mistura, pois apresentam melhores resultados quando juntos (efeito sinérgico). Aromatizantes Substâncias o u mistura de substâncias com propriedades aromáticas e/ou sápidas, capazes de conferir ou reforçar o aroma e/ou sabor dos alimentos. Segundo a Resolução RDC n° 2 da ANVISA, de 15 de janeiro de 2007, os aromatizantes apresentam duas classificações: aromas naturais e sintéticos. As misturas de aromas, os aromas de reação ou de transformação e os de fumaça poderão ser considerados naturais ou sintéticos, de acordo com a natureza de suas matérias-primas ou processos de elaboração. Eles podem ser comercializados na forma sólida (pós, granulados ou tabletes), líquida (soluções ou emulsões) ou pastosa. No caso dos aromas em pó, além dos ensaios descritos neste capítulo, determinamse os resíduos mineral fixo e o insolúvel em HCl (1+9), para se verificar a presença do dióxido de silício (anti-umectante). Conservadores Antigamente, os alimentos eram conservados com ácidos, sal, açúcar e fumaça de madeira. Nos dias de hoje, é grande o número de conservadores químicos empregados em alimentos. Tais aditivos impedem ou retardam as alterações dos alimentos provocadas por microorganismos ou enzimas. Entre os de maior emprego estão: dióxido de enxofre, ácido benzóico, ácido sórbico, ácido propiônico, na forma livre, ou de sais de sódio ou potássio e nitritos e nitratos de sódio e de potássio. 164 - IAL Capítulo V - Aditivos Corantes Substâncias que conferem, intensificam ou restauram a cor de um alimento. Os corantes artificiais são substâncias orgânicas de síntese cuja estrutura molecular difere dos corantes encontrados na natureza. São produtos cuja capacidade de conferir grande intensidade de cor e estabilidade supera a dos corantes naturais. Em 1999, foram introduzidos na legislação brasileira os seguintes corantes artificiais: azul patente, verde sólido e azorrubina, que passam a fazer parte deste capítulo. Apesar das dificuldades encontradas na aplicação dos corantes naturais nos alimentos, devido ao seu baixo poder tintorial, alto custo e instabilidade, atualmente seu emprego vem crescendo de forma significativa no ramo alimentício, pela preocupação dos consumidores com o uso de substâncias artificiais em alimentos. Edulcorantes Substâncias diferentes dos açúcares que conferem sabor doce aos alimentos. Seu emprego justifica-se nos produtos destinados a consumidores que necessitam de restrição calórica em suas dietas, bem como para aqueles portadores de diabetes. Atualmente, a técnica mais utilizada para separação, identificação e quantificação dos edulcorantes é a cromatografia líquida de alta eficiência. Os edulcorantes mais empregados hoje em dia são: sacarina, ciclamato, aspartame, acesulfame-K e esteviosídio. Gomas: são polissacarídios de alto peso molecular e, desde que atendam aos padrões de identidade e pureza exigidos para uso em alimentos, são consideradas GRAS pelo FDA. Devido à sua afinidade pela água, desempenham papel importante na maioria dos alimentos, sendo de amplo uso na indústria, como espessantes, geleificantes, estabilizantes e emulsificantes. Espessantes Substâncias que aumentam a viscosidade dos alimentos. Eles são usados para controlar a consistência de alimentos líquidos e semilíquidos. Geleificantes Substâncias que conferem textura pela formação de um gel. IAL - 165 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Estabilizantes Substâncias que tornam possível a manutenção de uma dispersão uniforme de duas ou mais substâncias imiscíveis em um alimento. Emulsificantes Substâncias que propiciam a formação ou manutenção de uma mistura uniforme de duas ou mais fases imiscíveis no alimento. Estes podem ser naturais ou sintéticos. Neste capítulo, são destacados alguns acidulantes, reguladores de acidez, antioxidantes, aromatizantes, conservadores, corantes naturais e artificiais, edulcorantes, espessantes, geleificantes, estabilizantes, emulsionantes; além dos bromatos, cujo uso não é permitido na legislação brasileira, da determinação de teobromina e cafeína em produtos a base de cacau e dos contaminantes arsênio, fluoreto e benzo(a)pireno, um hidrocarboneto policíclico aromático (HPA), formado principalmente em processos de combustão incompleta de matérias orgânicas, que se encontra na natureza como contaminante de solo, ar, água e alimentos. Como atualmente são permitidos, no Brasil, mais de 300 aditivos, é descrita, a seguir, a análise apenas dos aditivos, puros ou presentes em uma formulação, mais utilizados nos alimentos. Os métodos podem sofrer algumas alterações em função da formulação do produto. A determinação dos aditivos nos alimentos é tratada nos respectivos capítulos deste livro. 058/IV Acidulantes – Identificação de ácido cítrico, láctico e tartárico por cromatografia em papel. Os ácidos orgânicos podem ser identificados por cromatografia em papel. Na análise dos ácidos orgânicos, este método permite identificar, simultaneamente, a presença dos ácidos cítrico, tartárico e láctico em amostras de aditivos alimentares. Material Balança analítica, papel Whatman nº 1 (20 x 20) cm, balão volumétrico de 100 mL, béquer de 100 mL, cuba cromatográfica com tampa, frasco Erlenmeyer de 300 mL, provetas de 50 e 100 mL e seringas de 5 µL. 166 - IAL Capítulo V - Aditivos Reagentes Hidróxido de amônio Álcool Azul de timol Ácido clorídrico Soluções-padrão – Pese 1 g de ácido cítrico, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Repita o mesmo procedimento para os ácidos tartárico e láctico. Solvente para a fase móvel com revelador – Misture 35 mL de álcool, 13 mL de água e 2 mL de hidróxido de amônio e adicione 50 mg de azul de timol. Se necessário, prepare um volume maior mantendo as mesmas proporções. Guarde em frasco de vidro com tampa. Procedimento – Em um béquer de 100 mL, dissolva a amostra com pouca água. Aplique, em pontos eqüidistantes e a 2 cm da borda inferior no papel de cromatografia, 5 µL da solução-teste e 5 µL de cada uma das soluções-padrão. Desenvolva o cromatograma, em cuba saturada com a fase móvel contendo revelador, até a frente do solvente atingir dois centímetros antes da borda superior do papel. As manchas amarelas sob o fundo azul do papel indicam a presença dos ácidos. Colocando o papel em atmosfera de vapores de ácido clorídrico, o fundo azul do papel torna-se vermelho. Marque, imediatamente, o contorno das manchas com lápis. A identificação deve ser feita por comparação dos Rf das manchas obtidas com os das soluções-padrão. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 78-79. 059/IV Acidulantes – Identificação de ácido cítrico Este ensaio permite a identificação do ácido cítrico puro e baseia-se numa reação colorida com piridina e anidrido acético. Material Béqueres de 5 e 25 mL, pipetas graduadas de 1, 5 e 20 mL e bastão de vidro. IAL - 167 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Piridina Anidrido acético Procedimento – Dissolva alguns mg de ácido cítrico em 1 mL de água, transfira para um béquer contendo 15 mL de piridina e agite. Acrescente 5 mL de anidrido acético e agite novamente. A solução deve ficar avermelhada. Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX.Food Chemicals Codex. 4. ed. Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 753. 060/IV Acidulantes – Quantificação de ácido cítrico Material Balança analítica, frascos Erlenmeyer de 125 mL, proveta graduada de 50 mL e bureta de 50 mL. Reagentes Solução aquosa de hidróxido de sódio 1 M Solução de fenolftaleína 1% m/v – Pese 1 g de fenolftaleína, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com álcool. Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 3 g da amostra e dissolva em 40 mL de água. Adicione algumas gotas de solução de fenolftaleína e titule com NaOH 1 M. Cálculo Cada mL de NaOH 1M é equivalente a 64,04 mg de C6H8O7. Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX. Food Chemicals Codex. 4. ed. Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 102 e 753. 168 - IAL Capítulo V - Aditivos 061/IV Antioxidantes – Titulação de ácido ascórbico e isômeros com solução de iodo O ácido ascórbico pode ser adicionado aos alimentos com a função de antioxidante ou melhorador de farinha. Também é empregado nos sais de cura para reduzir a possibilidade de formação de N-nitrosaminas, pela ação bloqueadora na reação de nitrosação de nitrito. Este método é aplicado para misturas de aditivos, desde que não contenham nitrito ou outras substâncias redutoras, pois reagem com o iodo. 2 Ácido ascórbico Ácido dehidroascórbico Material Balança analítica, béquer de 100 mL, balão volumétrico de 100 mL, proveta de 25 mL, bureta de 25 mL e frasco Erlenmeyer de 250 mL. Reagentes Solução de ácido sulfúrico M Solução de iodo 0,05 M Solução de amido a 1% m/v Procedimento – Pese uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 0,2 g de ácido ascórbico e dissolva em uma solução de 100 mL de água, recentemente fervida e resfriada, e adicione 25 mL de ácido sulfúrico M. Titule a solução imediatamente com iodo 0,05 M, adicionando amido a 1% próximo ao ponto final da titulação. IAL - 169 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo V = volume de I2 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de I2 0,1 M P = massa da amostra em g Nota: cada mL de iodo 0,1 M é equivalente a 8,806 mg de ácido ascórbico ou ácido eritórbico (C6H8O6), 9,905 mg de ascorbato de sódio (C6H7NaO6) e 10,81 mg de eritorbato de sódio monohidratado (C6H7NaO6.H2O). Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX. Food Chemicals Codex. 4. ed. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. p. 33,34,134,354 e 362. 062/IV Antioxidantes – Determinação de ácido ascórbico e isômeros pelo método de Tillman’s Este método, aplicado para misturas de aditivos que apresentem baixa concentração de ácido ascórbico e não contenham nitrito em sua formulação, fundamenta-se na redução de 2,6-diclorofenol indofenol por uma solução de ácido ascórbico. 170 - IAL Capítulo V - Aditivos Procedimento – Siga a determinação conforme método 365/IV. 063/IV Antioxidantes – Titulação de ácido ascórbico e isômeros com solução de iodo na presença de polisorbato 80 O polisorbato 80, componente comum nos produtos para panificação, interfere na determinação do teor de ácido ascórbico pelo método de iodimetria. Assim, quando ambos estiverem presentes, é necessário fazer a extração do polisorbato antes da determinação do ácido ascórbico. Pode-se também dosá-lo diretamente por técnica polarográfica, sem necessidade de extração. Material Balança analítica, balança semi-analítica, béquer de 100 mL, provetas de 25 e 50 mL, funil de separação tipo pêra de 250 mL, funil e papel de filtro, bureta de 10 mL e frasco Erlenmeyer de 250 mL. Reagentes Solução aquosa de iodo 0,05 M Cloreto de sódio Butanol Solução aquosa de HCl 3 M saturada com NaCl – Adicione NaCl sólido à solução HCl 3 M até haver precipitação, ou, alternativamente, dilua 1:1 uma solução de HCl 6 M com solução aquosa saturada de NaCl. Procedimento – Pese, com precisão, uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 50 mg de ácido ascórbico. Adicione 2 g de cloreto de sódio e dissolva a mistura em 50 mL de água com agitação. Filtre, se necessário. Transfira o filtrado para um funil de separação. Adicione ao funil 25 mL de HCl 3 M, saturado com NaCl, e 25 mL de butanol. Agite a mistura por 2 minutos, deixe separar as fases, e recolha a camada aquosa inferior, filtrando-a para o frasco Erlenmeyer. Titule com iodo usando amido a 1% como indicador. Cada mL de iodo 0,05 M equivale a 8,806 mg de ácido ascórbico ou de ácido eritórbico, 9,905 mg de ascorbato de sódio e 10,81 mg de eritorbato de sódio monohidratado. IAL - 171 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculos V = mL de iodo 0,2 M gasto na titulação f = fator da solução de iodo 0,2 M P = massa da amostra em g Referência bibliográfica DESSOUKY, Y. M.; HUSSEIN, F. T.; ISMAEL S. A. Determination of ascorbic acid in the presence of polysorbate 80 Pharmazie, v.28 (11-12), p. 791-792. 1973. 064/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico por redução da solução de Fehling Este método é aplicado para a identificação de ácido ascórbico, ácido eritórbico, ascorbato de sódio e eritorbato de sódio em amostras puras ou em misturas de aditivos que não apresentem outras substâncias redutoras. Material Balança analítica, banho-maria, tubo de ensaio, béquer de 10 mL e balão volumétrico de 50 mL. Reagente Soluções tituladas A e B de Fehling (Apêndice I) Procedimento – Pese uma quantidade de amostra de maneira que a concentração final de ácido ascórbico esteja em torno de 2%. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre se necessário. Adicione a solução de Fehling. 172 - IAL Capítulo V - Aditivos Na presença de ácido ascórbico, o tartarato cúprico alcalino é reduzido lentamente a 25°C, porém mais rapidamente sob aquecimento. Referências bibliográficas COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX Food Chemicals Codex. 4. ed. Washington D. C.: National Academic Press. 1996. p. 34. FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editora S.A., 1977. p. 83. 065/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico por redução da solução de Tillmans Material Balança analítica, balão volumétrico de 100 mL, tubo de ensaio, béquer de 10 mL e pipetas de 1 e 2 mL. Reagente Solução de Tillmans descrita no método 365/IV. Procedimento – Pese uma quantidade de amostra de maneira que a concentração final de ácido ascórbico esteja em torno de 1%. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre se necessário. Pipete 2 mL desta solução no tubo de ensaio e adicione 1 mL da solução de Tillmans, que deverá descorar-se imediatamente. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análises de Alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 394-395. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 15th, Arlington: A.O.A.C., 1990, chapter 45, p. 1058-1059. IAL - 173 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 066/IV Antioxidantes – Identificação de ácido ascórbico pela reação com bicarbonato de sódio e sulfato ferroso Material Balança analítica, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, proveta de 100 mL, tubo de ensaio, béqueres de 10 mL e pipetas graduadas de 5 mL. Reagentes Ácido sulfúrico Bicarbonato de sódio Sulfato ferroso Solução aquosa de ácido sulfúrico a 10% v/v Procedimento – Pese uma quantidade de amostra de maneira que a concentração final de ácido ascórbico esteja em torno de 1%. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre se necessário. Pipete 4 mL desta solução em um tubo de ensaio. Adicione 0,1 g de bicarbonato de sódio e cerca de 0,02 g de sulfato ferroso. Agite e deixe repousar. A solução deverá produzir coloração violeta-escura que desaparece após a adição de 5 mL de ácido sulfúrico a 10%. Referências bibliográficas FARMACOPÉIA DOS ESTADOS UNIDOS DO BRASIL. 2. ed. São Paulo: Indústria Gráfica Siqueira S.A., 1959. p. 45-46. FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editora S.A., 1977. p. 82-83. 067/IV Antioxidantes – Determinação de butil-hidroxianisol (BHA) A solubilidade em álcool a 72% de quase todos os antioxidantes mais comumente utilizados, favorece a análise dos mesmos. Após a extração dos antioxidantes, podem ser feitas provas qualitativas envolvendo reações para a identificação ou cromatografia em camada delgada. O butil-hidroxianisol pode ser identificado em amostras de gorduras ou aditivos formulados contendo este antioxidante após a extração com álcool a 72% e posterior confirmação por meio de reação colorimétrica com 2,6-dicloroquinona cloroimida (reagente de Gibbs) e bórax. A reação do BHA, 174 - IAL Capítulo V - Aditivos após extração com álcool a 72%, com 2,6-dicloroquinonacloroimida em presença de bórax, forma um composto azul cuja concentração é medida porespectrofotometria 620 nm, usando curva-padrão. Material Balança analítica, balança semi-analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béqueres de (25 e 100) mL, bastão de vidro, funil de separação tipo pêra de 250 mL, provetas graduadas de 25, 50, 100 e 500 mL, balões volumétricos de 100, 200 e 500 mL, pipeta graduada de 2 mL e pipetas volumétricas de (1 a 12) mL. Reagentes Éter de petróleo (60-100)°C Álcool absoluto Bórax 2,6-Dicloroquinonacloroimida Padrão analítico de 3-BHA ou uma mistura conhecida dos dois isômeros 3-BHA e 2-BHA Solução de álcool a 72% v/v – Adicione 360 mL de álcool em um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água. Solução de bórax a 2% m/v – Pese 2 g de bórax – Na2B4O7.10H2O, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução de 2,6-dicloroquinonacloroimida (reagente de Gibbs) – Pese 0,01 g de 2,6dicloro-quinonacloroimida (C6H2ONCl3), transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com álcool absoluto. Prepare a solução no dia do uso. Procedimento – Dissolva 10 g da amostra em 50 mL de éter de petróleo e transfira quantitativamente para um funil de separação. Adicione 25 mL de álcool a 72% e agite. Separe a camada alcoólica e extraia mais duas vezes com 60 mL de álcool. Reúna os extratos alcoólicos e complete o volume até 200 mL com álcool a 72%. Adicione a uma IAL - 175 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital alíquota de 12 mL desta solução, 2 mL de uma solução de 2,6-dicloroquinonacloroimida a 0,01% e 2 mL de uma solução de bórax a 2% e agite. Meça a coloração desenvolvida em espectrofotômetro a 620 nm e determine a quantidade de BHA correspondente usando a curva-padrão previamente estabelecida. Curva-padrão – Pese, com precisão, 0,1 g de BHA e dissolva em álcool a 72%. Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL, completando o volume. Retire 1 mL desta solução, transfira para outro balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com o mesmo solvente. Tome alíquotas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mL desta última solução em béqueres de 25 mL e adicione, respectivamente, 11, 10, 9, 8, 7, 6 e 5 mL de álcool a 72%, totalizando 12 mL em todos eles. Adicione 2 mL de solução de 2,6-dicloroquinonacloroimida a 0,01% em álcool absoluto e 2 mL de solução de bórax a 2%. Homogeneíze. Meça a coloração desenvolvida em espectrofotômetro a 620 nm usando como branco uma mistura constituída de 12 mL de álcool a 72% e os dois reagentes acima mencionados. Construa a curva-padrão. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análises de Alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 85. JOSEPHY, P.D.; VAN DAMME, A. Reaction of Gibbs reagent with para-substituted phenols. Anal. Chem. v. 56, p. 813-814.,1984. MAHON, J.H.; CHAPMAN, R.Q. Butylated Hydroxianisole in lard and shortening. Anal. Chem. v. 23, n.8, p. 1120-1123, 1951. 068/IV Antioxidantes – Identificação de butil-hidroxianisol (BHA) Basea-se na reação do BHA com 2,6-dicloroquinonacloroimida em presença de bórax, após extração com álcool a 72%, para formar um composto azul. Material Balança semi-analítica, béqueres de 25 e 100 mL, balão volumétrico de 100 mL, provetas graduadas de 50 e 100 mL, funil de separação tipo pêra de 250 mL e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Éter de petróleo (60-100)°C Álcool Bórax 176 - IAL Capítulo V - Aditivos 2,6-Dicloroquinonacloroimida Álcool a 72% v/v Solução de bórax a 2% m/v Procedimento – Dissolva 20 g da amostra em 50 mL de éter de petróleo. Extraia em funil de separação com três porções de 30 mL de álcool a 72%. Reúna os extratos alcoólicos em balão volumétrico de 100 mL e complete com álcool a 72%. Adicione 1 mL de solução de bórax a 2% e alguns cristais de 2,6-dicloroquinonacloroimida a 5 mL de extrato alcoólico obtido no item anterior. Uma coloração azul indicará a presença de BHA. Referência bibliográfica JOSEPHY, P.D.; VAN DAMME, A. Reaction of Gibbs reagent with para-substituted phenols. Anal. Chem. v. 56, p. 813-814, 1984. 069/IV Antioxidantes – Determinação de butil hidroxitolueno (BHT) O princípio deste método baseia-se na reação do BHT, após extração da amostra, com o-dianisidina e nitrito de sódio e na medida espectrofotométrica do composto vermelho-alaranjado formado. O BHT é melhor extraído por destilação com arraste de vapor e o destilado é utilizado na reação colorimétrica. Material Balança analítica, balança semi-analítica, espectrofotômetro UV/VIS, manta aquecedora elétrica, regulador de temperatura, suporte, garra, mufa, tubo de látex para condensador, bastão de vidro, funil de separação tipo pêra de 250 mL, provetas graduadas de 50 e 100 mL, condensador tipo reto, com junta esmerilhada 24/40, balões volumétricos de 100 e 250 mL, béqueres de 50, 100 e 250 mL, pipetas graduadas de 2 e 5 mL e pipeta volumétrica de 25 mL. Reagentes Clorofórmio Nitrito de sódio o-Dianisidina (C14H16N2O2) Metanol Carvão Ácido clorídrico 1 M Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) Padrão analítico de BHT IAL - 177 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão de BHT a 0,05% m/v – Pese 0,05 g de BHT, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com metanol. Solução de nitrito de sódio a 0,3% m/v – Pese 0,3 g de nitrito de sódio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Esta solução é estável, pelo menos, por duas semanas a 4ºC Solução de o-dianisidina – Pese 250 mg de o-dianisidina (C14H16N2O2) e dissolva com 50 mL de metanol. Adicione 100 mg de carvão. Agite por cinco minutos e filtre. Adicione a 40 mL do filtrado, 60 mL de ácido clorídrico 1 M. Prepare diariamente, e guarde ao abrigo da luz. Solução de cloreto de magnésio – Pese 100 g de cloreto de magnésio e dissolva em 50 mL de água. Procedimento – Monte o aparelho para destilação por arraste de vapor. Pese exatamente 5 g da amostra e transfira para o frasco Erlenmeyer junto com 15 mL da solução de cloreto de magnésio. Adapte as juntas conectoras e destile com arraste de vapor à razão de 4 mL por minuto. Recolha de 100 a 125 mL do destilado em um balão volumétrico de 250 mL, completando o volume com metanol. A uma alíquota de 25 mL, adicione 2 mL da solução de nitrito de sódio e 5 mL da solução de o-dianisidina Após 10 minutos, extraia a fração colorida com 10 mL de clorofórmio. Meça espectrofotometricamente a 520 nm e determine a concentração de BHT, utilizando uma curva de calibração previamente construída. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análises de Alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 85-86. 070/IV Antioxidantes – Identificação de butil hidroxitolueno (BHT) Material Balança semi-analítica, manta aquecedora, regulador de temperatura, suporte, garra e mufa, tubo de látex para condensador, balão de fundo redondo com junta esmerilhada 45/50 e capacidade para 5 L, tubo de vidro de 1,4 m de comprimento e 1,2 cm de diâmetro, juntas conectoras para frasco Erlenmeyer com presilha, frasco Erlenmeyer com junta esmerilhada 29/32 e capacidade 500 mL, condensador tipo reto, com junta esmerilhada 24/40, balão volumétrico de 100 mL, provetas graduadas de (50 e 100) mL, béqueres de (50, 100 e 250) mL e pipetas graduadas de (2 e 5) mL. 178 - IAL Capítulo V - Aditivos Reagentes Clorofórmio Nitrito de sódio o-Dianisidina (C14H16N2O2) Metanol Carvão Ácido clorídrico Cloreto de magnésio (MgCl2.6H2O) Padrão analítico de BHT Solução de nitrito de sódio a 0,3% m/v, conforme 069/IV Solução de o-dianisidina, conforme 069/IV Solução de cloreto de magnésio, conforme 069/IV Procedimento – Monte o aparelho para destilação por arraste de vapor. Pese 5 g da amostra, transfira para o frasco Erlenmeyer junto com 15 mL da solução de cloreto de magnésio. Adapte as juntas conectoras e destile com arraste de vapor à razão de 4 mL por minuto. Recolha de 100 a 125 mL do destilado em um béquer de 250 mL. Concentre, em banhomaria, o destilado até 50 mL. A uma alíquota de 25 mL, adicione 5 mL de solução de o-dianisidina e 2 mL de solução de nitrito de sódio. Na presença de BHT, deverá formar uma coloração vermelho-alaranjada em até 10 minutos. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 85-86. 071/IV Antioxidantes – Identificação de galatos Este ensaio permite a identificação dos galatos em misturas de aditivos e baseia-se na extração dos galatos (propila, octila ou duodecila) com álcool a 72% e reação com hidróxido de amônio . Material Balança semi-analítica, béqueres de 10 e 100 mL, proveta graduada de 50 mL, funil de separação de 125 mL, balões volumétricos de 100 e 500 mL e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Éter de petróleo IAL - 179 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Álcool Hidróxido de amônio Solução de álcool a 72% v/v – Misture 360 mL de álcool e 140 mL de água. Procedimento – Dissolva 20 g de amostra em 50 mL de éter de petróleo. Extraia em funil de separação com álcool a 72% (30 mL por três vezes). Reúna os extratos em balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com álcool a 72%. Adicione 0,5 mL de hidróxido de amônio a 5 mL do extrato alcoólico. Uma coloração rósea indicará a presença de galatos. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 82. 072/IV Aromatizantes – Identificação e quantificação A identificação e a quantificação dos componentes do aroma (aldeídos, ésteres, cetonas, etc.) são efetuadas por cromatografia em fase gasosa, usando detector de ionização de chama (FID). Material Balança analítica, cromatógrafo a gás, coluna Carbowax 20 M ou equivalente, detector de ionização de chama (FID), balões volumétricos de 10 mL, pipetas graduadas de 2 mL e microsseringa de 10 µL. Reagentes Álcool Padrões analíticos de aldeídos, ésteres, cetonas, etc. Solução-padrão – Com auxílio de uma pipeta, pese cerca de 100 mg dos padrões diretamente em balões volumétricos de 10 mL e complete o volume com álcool. Condições cromatográficas – Temperatura do injetor: 230°C, temperatura do detector: 250°C, programação de aquecimento da coluna: de (70 - 210)°C, 8°C/min, razão de splitter 1:100. Procedimento – Para aromas líquidos, pese diretamente em balão volumétrico de 10 mL, com auxílio de uma pipeta, uma quantidade da amostra de modo que a concentração do 180 - IAL Capítulo V - Aditivos analito estudado seja próxima a do padrão e em torno de 1%. Complete o volume com álcool. Para aromas em pó, pese uma quantidade da amostra cuja concentração do analito estudado seja próxima a do padrão. Transfira, com álcool, para um balão volumétrico de 10 mL e complete o volume. Filtre, se necessário. Injete 1 µL da amostra e dos padrões no cromatógrafo e calcule a porcentagem dos analitos estudados por meio das áreas obtidas nos cromatogramas. Cálculo Cp = concentração do padrão Ca = concentração da amostra Ap = área do padrão Aa = área da amostra Referências bibliográficas ARCTANDER, S. Perfum and flavor chemicals (aroma chemicals) v. 1-2. New Jersey, U.S.A.: publicado pelo autor, 1969. Flavor and Fragrance Materials. Wheaton, USA: Allured Publishing Corporation, 1993. 073/IV Aromatizantes – Teor alcoólico a 20°C A quantificação do teor alcoólico, quando presente, em aromas líquidos é determinado conforme o método 0217/IV. 074/IV Aromatizantes – Identificação de óleos essenciais Os óleos essenciais, quando presentes nos aromas, podem ser identificados por cromatografia em camada delgada ou quantificados com o uso do balão volumétrico tipo Cássia. Quando puros, devem ser feitas as seguintes determinações físico-químicas: índice de refração a 20°C, densidade relativa a (20/20)°C e rotação óptica a 20°C. Os valores obtidos são comparados com os da literatura. Os aromas líquidos podem ser analisados diretamente ou após a separação dos óleos essenciais com solução saturada de cloreto de sódio, enquanto que os em pó devem ser previamente extraídos. Para amostras em pó, extraia com uma pequena quantidade de álcool ou éter. IAL - 181 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Placas de sílica gel 60 G (20 x 20)cm, estufa, câmara ultravioleta, cuba cromatográfica com tampa, frasco Erlenmeyer de 250 mL e provetas de 10 e 100 mL. Reagentes Ciclohexano Acetato de etila Ácido acético Ácido sulfúrico Padrões analíticos de óleos essenciais Fase móvel – Ciclohexano-acetato de etila-ácido acético (90:10:1). Revelador – Solução aquosa de ácido sulfúrico a 10% (v/v). Procedimento – Sature a cuba de vidro com a mistura de solventes da fase móvel. Coloque, com auxílio de um capilar, a amostra e os padrões em pontos diferentes da placa de sílica gel, preparada para cromatografia ascendente. Deixe secar. Coloque na cuba cromatográfica com o solvente e deixe correr até uns 2 cm da extremidade superior da placa. Retire e deixe secar ao ar. Vaporize com o revelador. Seque em estufa a 105°C por alguns minutos tomando o cuidado de não deixar carbonizar a placa. Compare o cromatograma da amostra com o dos padrões. Antes de revelar a placa, observe o cromatograma sob luz ultravioleta. 075/IV Aromatizantes – Quantificação dos óleos essenciais Material Pipeta volumétrica de 10 mLe balão volumétrico tipo Cássia (110 mL de capacidade e gargalo graduado de 10 mL, subdividido em 0,1 mL). Reagentes Cloreto de sódio Solução saturada de cloreto de sódio – Adicione cloreto de sódio em 1000 mL de água até saturar a solução. Procedimento – Pipete 10 mL da amostra, transfira para um balão volumétrico tipo Cássia e complete o volume com solução saturada de cloreto de sódio. 182 - IAL Capítulo V - Aditivos O volume do óleo essencial separado (obtido na escala graduada do gargalo do balão) corresponde ao teor em porcentagem do óleo na amostra. 076/IV Aromatizantes – Rotação óptica a 20°C Material Polarímetro Procedimento – Transfira a amostra para um tubo de 1 dm de um polarímetro. Ajuste a temperatura da amostra a 20°C. Faça a determinação da rotação óptica com luz monocromática (lâmpada de sódio). Efetue no mínimo 5 leituras e calcule a média aritmética. Cálculo L = leitura no polarímetro C = comprimento do tubo em dm D = densidade da amostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP. 1985. p. 419. FENAROLI, G. Sostanze Aromatiche Naturali. Milano, Italy: Editore Ulrico Hopepli, v. 1:, 1963. 1004 p. 077/IV Aromatizantes – Índice de refração a 20°C Material Refratômetro Procedimento – Faça circular uma corrente de água através do refratômetro de modo a manter a temperatura constante. Esta temperatura não deverá diferir da referência de + 2°C. IAL - 183 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Antes de colocar o óleo essencial no instrumento, o mesmo deve estar à temperatura na qual a medida será efetuada. Coloque 2 gotas da amostra entre os prismas. Feche os prismas, focalize e corrija o índice de refração obtido pela leitura da escala, conforme o cálculo a seguir. Cálculo = índice de refração à temperatura de trabalho t’ = temperatura de trabalho t = 20°C Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP. 3. ed., 1985. p. 420. FENAROLI, G. Sostanze Aromatiche Naturali. Milano, Italy: Editore Ulrico Hopepli, v. 1, 1963. 1004 p. 078/IV Aromatizantes – Densidade relativa a (20/20)°C Material Termômetro, picnômetro (ou densímetro digital) e dessecador. Procedimento – Tare um picnômetro, previamente seco em estufa a 100°C. Encha-o com água, a 20°C e pese. Seque o picnômetro em estufa e coloque nele a amostra, a 20°C e pese. Cálculo A = massa do conjunto picnômetro e amostra menos a tara do picnômetro B = massa do conjunto picnômetro e água menos a tara do picnômetro 184 - IAL Capítulo V - Aditivos Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP. 3. ed., 1985. p. 421. FENAROLI, G. Sostanze Aromatiche Naturali. Milano, Italy: Editore Ulrico Hopepli, v. 1, 1963. 1004 p. 079/IV Aromatizantes – Vanilina e correlatos Pesquisa em aromas contendo: vanilina, etil vanilina, maltol, etil maltol, heliotropina, cumarina, dihidrocumarina, etc. Material Papel Whatman nº 1, (20x20) cm, câmara ultravioleta, cuba cromatográfica com tampa, funil de separação de 250 mL, béqueres de 50 mL, balões volumétricos de 100 mL e microsseringa. Reagentes Isobutanol Hidróxido de amônio Padrões analíticos de vanilina, etil vanilina, maltol, etil maltol, heliotropina, cumarina, dihidrocumarina Solução-padrão – Prepare soluções a 1% de vanilina, etil vanilina, maltol, etil maltol, heliotropina, cumarina, dihidrocumarina, em álcool. Fase móvel – Isobutanol (100 mL) e hidróxido de amônio a 2% (60 mL). Agite em funil de separação. Decante. A camada alcoólica (superior) é utilizada para correr o cromatograma. A camada aquosa (inferior) é utilizada para saturar a câmara. Procedimento – Coloque a camada alcoólica da fase móvel na cuba cromatográfica. Distribua a camada aquosa da fase móvel em dois béqueres pequenos e coloque-os dentro da cuba, um em cada extremidade. Para amostras em pó, extraia com uma pequena quantidade de álcool ou éter e filtre. As amostras líquidas não necessitam de preparação. Aplique, com auxílio de um capilar, a amostra e os padrões em pontos diferentes do papel Whatman nº 1, preparado para cromatografia ascendente. Deixe secar. Coloque-o na cuba cromatográfica contendo a fase móvel e deixe correr até 2 cm da extremidade superior do papel. Retire e deixe secar ao ar. Observe sob luz ultravioleta e marque as manchas obtidas. Compare com as dos padrões. IAL - 185 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP. 3. ed., 1985. p. 427-428. 080/IV Conservadores – Determinação espectrofotométrica simultânea de nitrito e nitrato Esse método aplica-se às formulações simples de aditivos contendo nitritos, nitratos e cloreto de sódio. A razão das absorbâncias de uma solução aquosa de nitrito a 355 nm e a 302 nm é 2,5. O nitrato não absorve a 355 nm mas tem uma banda característica a 302 nm. A absorbância do nitrato pode ser calculada dividindo-se a absorbância do nitrito a 355 nm por 2,5 e subtraindo-se o quociente do total da absorbância a 302 nm. Em cubeta de 1 cm, o limite de detecção para nitrito é 0,02 mg/mL e 0,09 mg/mL para nitrato. O pH da solução não deve estar abaixo de 5 (o nitrito forma ácido nitroso, com uma absorbância máxima a 357 nm). Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béqueres de 25 mL e balões volumétricos de 100 mL. Reagente Padrões analíticos de nitrato de sódio e nitrito de sódio Procedimento – Pese 20 g da amostra, com precisão até mg. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 302 ou 355 nm, utilizando água como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 302 e 355 nm e calcule como descrito a seguir. Determine o teor de nitrito na amostra utilizando o valor da absorbância a 355 nm e a curva-padrão do nitrito. Para o nitrato, divida o valor desta absorbância por 2,5 e subtraia do valor da absorbância a 302 nm. Calcule a concentração de nitrato na amostra utilizando o valor de absorbância resultante desta subtração e a curva-padrão do nitrato. Curva-padrão do nitrito – Prepare, em uma série de balões volumétricos de 100 mL, diferentes concentrações de nitrito (0,025 - 0,2)g/100 mL e meça a absorbância destas soluções a 355 nm. 186 - IAL Capítulo V - Aditivos Curva-padrão do nitrato – Prepare, em uma série de balões volumétricos de 100 mL, diferentes concentrações de nitrato (0,1 - 1)g/100 mL e meça a absorbância destas soluções a 302 nm. Cálculos 1. Em nitrito: C = concentração de nitrito de sódio encontrada na curva-padrão a 355 nm P = massa da amostra 2. Em nitrato: C = concentração de nitrato de sódio obtido na leitura de Ac na curva-padrão P = massa da amostra Ac = absorbância corrigida Referências bibliográficas LARA, W.H.; TAKAHASHI, M. Determinação espectofotométrica de nitritos e nitratos em sais de cura. Rev. Inst. Adolfo Lutz, São Paulo, v. 52, p. 35-39, 1974. WETTERS, J.M.; UGLUM, K.L. Direct spectrophotometric simultaneous determination of nitritre and nitrate in the ultraviolet. Anal. Chem., v. 42. p. 355-340, 1970. 081/IV Conservadores – Determinação de nitrato após redução em coluna de cádmio e de nitrito Este método aplica-se à amostras de aditivos que possuem na sua formulação compostos que interferem na análise direta dos nitritos e nitratos por espectrofotometria no ultravioleta conforme 080/IV. A análise dos nitritos e nitratos é feita por espectrofotometria no visível, após redução dos nitratos em coluna de cádmio, conforme os métodos 283/IV e 284/IV. IAL - 187 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 082/IV Conservadores – Determinação de propionatos Os sais de cálcio e sódio do ácido propiônico têm ação antimicrobiana, sendo efetivos no controle de bolores em farinhas e certos produtos de confeitaria. Os métodos para a sua determinação envolvem primeiro a extração, que geralmente é feita por destilação por arraste a vapor, seguida da separação e identificação do ácido propiônico junto aos demais ácidos que podem ser co-extraídos. Nesta etapa, pode-se utilizar as técnicas de cromatografia em fase gasosa, em camada delgada ou em papel. Material Banho-maria, aparelho completo para destilação por arraste a vapor, pipetas de 1, 2 e 5 mL, frasco Erlenmeyer de 200 mL, papel Whatman nº 1 (20 x 20) cm, microsseringa, vaporizador, pHmetro, béqueres de 100, 200, 400 e 600 mL, provetas de 10, 50, 100 e 500 mL e cuba cromatográfica com tampa. Reagentes Ácido sulfúrico Ácido fosfotúngstico Sulfato de magnésio Hidróxido de sódio Papel indicador vermelho congo Hidróxido de amônio terc-Butanol n-Butanol Indicadores vermelho de metila e azul de bromotimol Formol Álcool Ácido propiônico Solução aquosa de ácido fosfotúngstico a 20% – Em um frasco Erlenmeyer de 200 mL, pese 20 g de ácido fosfotúngstico e dilua com 80 mL de água. Misture bem. Guarde em frasco de vidro com tampa. Solução-padrão – Neutralize, com hidróxido de sódio 1 M, 1 mL de ácido propiônico e dilua até 100 mL. Use 4 mL desta solução para uma destilação igual à da amostra, recolhendo 200 mL do destilado, neutralizando e secando nas mesmas condições descritas. Fase móvel – terc-butanol-n-butanol-hidróxido de amônio (1:1:1). Revelador – Misture 200 mg de vermelho de metila, 200 mg de azul de bromoti188 - IAL Capítulo V - Aditivos mol, 100 mL de formol e 400 mL de álcool e ajuste o pH a 5,2 com hidróxido de sódio 0,1 M. Procedimento – Transfira 20 g da amostra para um frasco de destilação, com auxílio de 50 mL de água. Adicione 10 mL de ácido sulfúrico 0,5 M, agite e adicione 10 mL de ácido fosfotúngstico a 20% e agite novamente, por rotação, o frasco e adicione 40 g de sulfato de magnésio. Agite. A mistura deve ser ácida quando se usa papel vermelho-congo; caso não seja, adicione ácido sulfúrico (1+1). Aqueça o frasco contendo a amostra antes de conectar no aparelho de destilação por arraste a vapor. Destile 200 mL em 35-40 minutos, recolha o destilado em béquer de 400 mL, contendo 2 mL de solução de hidróxido de sódio 1 M. Evapore em banho-maria até secagem. Dissolva o resíduo em 2 mL de água. Deixe saturando na cuba de vidro o solvente: terc-butanol-n-butanol-hidróxido de amônio na proporção (1:1:1). Coloque 2 µL da solução da amostra e do padrão em pontos diferentes do papel Whatman nº 1, preparado para cromatografia ascendente. Deixe secar. Coloque-o na cuba cromatográfica contendo o solvente e deixe correr até aproximadamente 2 cm da extremidade superior do papel (5 horas). Retire e deixe secar ao ar. Vaporize com o revelador. Coloque o papel em atmosfera de amoníaco por alguns instantes. As manchas vermelhas correspondem aos ácidos voláteis. Como não são estáveis, marque logo que apareçam com lápis. Compare as manchas correspondentes à amostra e ao padrão. O mesmo Rf mostrará a presença do propionato na amostra e, se a intensidade da mancha for mais fraca que a do padrão, estará abaixo de 0,2% m/m. Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists 16th, Arlington: A.O.A.C., 1996. chapter 47, p. 19 (method 970.36). 083/IV Conservadores – Identificação de ácido sórbico e sorbatos O ácido sórbico e seus sais de sódio, potássio e cálcio têm ação mais efetiva sobre fermentos e fungos do que em bactérias e agem melhor em meio ácido. Podem ser identificados em formulações de aditivos ou em alimentos após adequada extração. Eles são convertidos em ácido sórbico após acidulação e são extraídos das amostras por destilação com arraste de vapor d’água e posteriormente identificados por cromatografia em papel ou com ácido tiobarbitúrico. IAL - 189 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, balança semi-analítica, banho-maria, espectrofotômetro UV/VIS, estufa, manta aquecedora, regulador de temperatura, suporte, garra, mufa, tubo de látex para condensador, béqueres de 100 e 400 mL, balão de fundo redondo com junta esmerilhada 45/50 e com capacidade para 5 L, tubo de vidro de 1,40 m de comprimento e 1,2 cm de diâmetro, juntas conectoras para frasco Erlenmeyer com presilha, frasco Erlenmeyer com junta esmerilhada 29/32 com capacidade para 500 mL, condensador tipo reto com junta esmerilhada 24/40, funil de separação tipo pêra de 250 mL, pipeta graduada de 2 mL, provetas graduadas de 25 e 200 mL, balões volumétricos de 1000, 500 e 100 mL e tubo capilar de vidro. Reagentes Cloreto de sódio Ácido fosfórico Sulfato de magnésio Hidróxido de sódio Éter Ácido sulfúrico Ácido sórbico Propanol Acetato de etila Hidróxido de amônio Solução de ácido sórbico 0,001% m/v – Pese 0,001 g de ácido sórbico (C6H8O2) e dissolva em água suficiente para 100 mL em balão volumétrico. Solução de hidróxido de sódio 1 M – Dissolva 4 g de hidróxido de sódio com água em um béquer de 100 mL, esfrie, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Solução de ácido sulfúrico 0,005 M – Dissolva 0,3 mL de ácido sulfúrico em água, esfrie, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume. Solução saturada de cloreto de sódio – Adicione cloreto de sódio em 1000 mL de água até saturar a solução. Procedimento – Monte o aparelho para destilação por arraste de vapor. Pese 5 g da amostra ou meça 5 mL, se a amostra for líquida. Transfira para o frasco Erlenmeyer de 500 mL com 200 mL de solução saturada de cloreto de sódio. Acidule com 2 mL de ácido fosfórico. Adicione 7,5 g de sulfato de magnésio. Destile cerca de 350 mL, com arraste de vapor d’água para um béquer de 400 mL contendo 10 mL de hidróxido de sódio 1 M, inclinando o béquer de modo a manter a extremidade do condensador imersa na solução alcalina. Evapore o destilado em banho-maria até reduzir o volume a 100 mL. Esfrie. Transfira para um funil de separação, acidule e extraia com 4 porções de éter. Reúna os extratos e evapore 190 - IAL Capítulo V - Aditivos o éter sem levar à secura. Dissolva o resíduo em 0,5 mL de água. Acidule a solução aquosa com ácido sulfúrico 0,005 M e aplique com capilar em papel cromatográfico Whatman nº 4 ou equivalente, paralelamente com o padrão de ácido sórbico a 0,001%. Coloque em cuba cromatográfica previamente saturada com o solvente propanol-acetato de etilahidróxido de amônio-água (3:1:1:1) e deixe correr até ± 2 cm da extremidade superior do papel. Retire e seque a 60°C. Observe o cromatograma em câmara com luz ultravioleta (± 255 nm). Compare as manchas da amostra e do padrão. A identificação do ácido sórbico, após a extração por arraste de vapor, também pode ser realizada como descrito no método colorimétrico 085/IV, utilizando o ácido tiobarbitúrico. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP. 3. ed., 1985. p. 103. 084/IV Conservadores – Determinação de ácido sórbico e sorbatos por espectrofotometria no UV O ácido sórbico e seus sais podem ser quantificados em alimentos ou formulações de aditivos após sua extração. Este método baseia-se na extração do ácido sórbico ou de seus sais, convertidos em ácido sórbico após acidificação, por destilação com arraste de vapor e posterior leitura espectrofotométrica a 254 nm. Material Balança analítica, balança semi-analítica, banho-maria, espectrofotômetro UV/VIS, estufa, manta aquecedora, regulador de temperatura, suporte, garra, mufa, tubo de látex para condensador, pHmetro, pipetador automático de 100 a 1000 µL e de 1 a 5 mL com as respectivas ponteiras, papel de filtro qualitativo, béqueres de 25, 100 e 400 mL, balão de fundo redondo com junta esmerilhada 45/50 e com capacidade para 5 L, tubo de vidro de 1,4 m de comprimento e 1,2 cm de diâmetro, juntas conectoras para frasco Erlenmeyer com presilha, frasco Erlenmeyer com junta esmerilhada 29/32 e com capacidade para 500 mL, condensador tipo reto com junta esmerilhada 24/40, pipeta graduada de 2 mL e balões volumétricos de 500 e 1000 mL. Reagentes Cloreto de sódio Ácido fosfórico IAL - 191 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) Hidróxido de sódio Ácido sulfúrico Ácido sórbico (C6H8O2) Solução de ácido sulfúrico 0,005 M – Dissolva 0,3 mL de ácido sulfúrico em água, esfrie, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume. Procedimento – Proceda como no método 083/IV, até: “inclinando o béquer de modo a manter a extremidade do condensador imersa na solução alcalina”. Dissolva o resíduo da destilação, obtido no item anterior, com água até 500 mL, acidulando com ácido sulfúrico 0,005 M, a fim de obter pH 5,9. Ajuste o zero do espectrofotômetro a 254 nm, utilizando como branco água acidulada com ácido sulfúrico 0,005 M até pH igual a 5,9, em cubeta de 1 cm de caminho óptico. Meça a absorbância da amostra a 254 nm. Cálculo = 2200, ou uma curva-padrão construída com Calcule a concentração usando o valor soluções-padrão de ácido sórbico (ou sorbato de potássio). Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 103. 085/IV Conservadores – Determinação de ácido sórbico por espectrofotometria no visível Este método baseia-se na extração do ácido sórbico ou de seus sais, convertidos em ácido sórbico, com clorofórmio na reação colorimétrica com ácido tiobarbitúrico e posterior leitura espectrofotométrica a 530 nm. Material Balança analítica, banho-maria, espectrofotômetro UV/VIS, suporte, garra, mufa, parafilme, papel de filtro qualitativo, funil de separação, tipo pêra, de 250 mL, balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10, 25 mL, funil para filtração, tubo de ensaio, pipetador automático de 100 a 200 µL e de 1 a 5 mL com as respectivas ponteiras, béqueres de 25, 100 e 400 mL e provetas graduadas de 25, 50 e 200 mL. 192 - IAL Capítulo V - Aditivos Reagentes Clorofórmio Sulfato de sódio anidro Ácido sórbico Ácido clorídrico Dicromato de potássio Bicarbonato de sódio Ácido sulfúrico Solução-padrão – Pese, com precisão, cerca de 100 mg de ácido sórbico, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL completando o volume com água . Esta solução tem concentração de 100 µg/mL. Retire 1 mL desta solução e leve para um balão volumétrico de 50 mL, completando o volume. Esta solução tem concentração de 2 µg/mL. Retire 5 mL da solução a 100 µg/mL e leve para um balão volumétrico de 100 mL, completando o volume. Esta solução tem concentração de 5 µg/mL. Solução de ácido clorídrico (1:1) – Dissolva 25 mL de ácido clorídrico em 25 mL de água. Solução de bicarbonato de sódio 0,5 M – Dissolva 4,2 g de bicarbonato de sódio em água, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução de dicromato de potássio – Pese 0,49 g de dicromato de potássio e dissolva em balão volumétrico de 1000 mL, com aproximadamente 500 mL de água. Adicione 8 mL de ácido sulfúrico e complete o volume com água. Solução de ácido tiobarbitúrico a 0,5% m/v – Dissolva 0,5 g de ácido tiobarbitúrico em água, aquecendo em banho-maria para dissolver, esfrie, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Prepare na hora de usar. Procedimento – Pese , com precisão, 5 g da amostra (triture no liqüidificador, se necessário), transfira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com água. Filtre se necessário, e pipete 10 mL do filtrado para um funil de separação de 250 mL e extraia, por agitação durante 1 minuto, com duas porções de 40 mL de clorofórmio (pode-se aumentar para 4 extrações de 25 mL, se necessário). Recolha a fase clorofórmica em balão volumétrico de 100 mL ou outro de volume adequado, passando por um funil com sulfato de sódio anidro. Complete o volume com clorofórmio. Pipete 25 mL desta solução para um funil de separação de 250 mL e extraia com 15 mL de solução de bicarbonato de sódio 0,5 M, agitando durante 1 minuto, despreze a fase clorofórmica e transfira quantitativamente a fase aquosa para um balão volumétrico de 25 mL (pode-se aumentar para 4 extrações de 20 mL, se necessário; IAL - 193 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital nesse caso, receba o extratos em um balão volumétrico de 100 mL). Adicione ácido clorídrico 1:1 cuidadosamente até que a solução fique ácida e complete o volume com água. Pipete 2 mL para um tubo de ensaio contendo 2 mL de solução sulfúrica de dicromato de potássio. Cubra os tubos com parafilme e coloque-os em um banho de água fervente, por 5 minutos. Retire-os e, imediatamente, adicione 2 mL de solução de ácido tiobarbitúrico, cobrindo-os novamente com parafilme. Coloque os tubos de ensaio novamente em um banho de água fervente, durante 10 minutos. Retire os tubos e deixe esfriar. Faça um branco usando 2 mL de água em lugar da amostra. Leia a absorbância a 530 nm e compare com uma curvapadrão obtida nas mesmas condições da análise. Curva-padrão – Retire com pipetador automático, porções de 0,5; 1; 1,5 e 2 mL da soluçãopadrão a 2 µg/mL para 4 tubos de ensaio e adicione 1,5; 1; 0,5 e 0 mL de água, respectivamente. Estas soluções contêm 1, 2, 3 e 4 µg de ácido sórbico, pela ordem. Retire, com pipetador automático, porções de 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8 e 2 mL da solução a 5 µg/mL para 6 tubos de ensaio e adicione 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2 e 0 mL de água respectivamente. Estas soluções contêm 5, 6, 7, 8, 9 e 10 µg de ácido sórbico, pela ordem. Proceda a determinação como descrito acima. Construa o gráfico absorbância x µg ácido sórbico/6 mL solução. Nota: após a extração do analito, pode-se também fazer a quantificação por meio de leitura direta a 254 nm da solução aquosa final, utilizando como branco uma solução de bicarbonato de sódio. Outro modo de determinar o ácido sórbico seria a extração deste por arraste de vapor (como descrito no método 083/IV), recolhendo o destilado e levando este a um volume definido, se necessário e proceda a determinação como descrito acima. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 103. 086/IV Corantes artificiais – Identificação por cromatografia em papel Material Balança analítica, papel Whatman nº 1, cuba cromatográfica, balão volumétrico de 100 mL e capilares de vidro. Reagentes Citrato de sódio Hidróxido de amônio 194 - IAL Capítulo V - Aditivos n-Butanol Álcool Soluções-padrão – Prepare as soluções aquosas de padrões dos corantes a 1% m/v. Fase móvel (Solvente A) – Pese 2 g de citrato de sódio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL, adicione 20 mL de hidróxido de amônio e complete o volume com água. Fase móvel (Solvente B) – n-butanol-álcool-água-hidróxido de amônio (50:25:25:10). Procedimento – Prepare soluções aquosas das amostras a 1%. Sobre uma folha de papel Whatman nº 1, a 2 cm da extremidade, em pontos distantes 2 cm uns dos outros, aplique com um tubo capilar as soluções das amostras e dos respectivos padrões dos corantes. Desenvolva o cromatograma com o solvente A ou B. O valor de Rf e a coloração da mancha devem ser idênticos aos do padrão. A visualização da mancha também pode ser feita à luz ultravioleta, onde tem-se melhor nitidez dos contornos e, em certos casos, de algumas manchas que não foram vistas no exame direto. Nota: os cromatogramas feitos com os solventes A e B não levam sempre ao mesmo resultado. Alguns corantes mudam inteiramente os valores de Rf de um para outro solvente e outros se mostram mais puros em solvente A que em solvente B. O cromatograma com solvente A é o mais usado por ser mais rápido, apesar dos contornos das manchas não serem muito precisos. Outros solventes também podem ser usados como mostra a Tabela 1. Tabela 1 – Rf e absorbância máxima de alguns corantes artificiais permitidos em alimentos Corante Classe Bordeaux S ou Amaranto Azo Eritrosina Xanteno Amarelo crepúsculo A Rf no solvente B C D E F Abs. Máx.(nm) 0,62 0,27 0,29 0,14 0,19 0,11 520 (em meio ácido) 0,21 0,52 0,61 1,00 0,58 0,47 525 (em meio ácido) Azo 0,73 0,72 0,46 0,28 0,45 0,40 480 (em meio ácido) Tartrazina Pirazolona 0,91 0,41 0,28 0,12 0,17 0,09 430 (em meio ácido) Indigotina Indigóide 0,52 0,27 0,25 0,14 0,20 0,30 285 e 615 (em meio ácido) A = Hidróxido de amônio-água (1: 99) B = Cloreto de sódio a 2% em álcool a 50% IAL - 195 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital C = Isobutanol-álcool-água (1:2:1) D = n-Butanol-água-ácido acético glacial (20:12:5) E = Isobutanol-álcool-água (3:2:2) e 1 mL de hidróxido de amônio para 99 mL da mistura anterior F = Solução de 80 g de fenol em 20 mL de água Referência bibliográfica GAUTIER, J.A.; MALANGEAU, P. Mises au Point de Chimie Analytique Organique – Pharmaceutique et Bromatologique. 13. ed., Paris: Masson & Cie., 1964. p. 70, 71, 91. 087/IV Corantes artificiais – Identificação por espectrofotometria Material Balança analítica, pHmetro, espectrofotômetro UV/VIS, balão volumétrico de 100 mL , pipeta de 1 mL e balão de 2 L. Reagentes Ácido acético Acetato de amônio 0,02 M (pH 5,6) – Pese 3,08 g de acetato de amônio e transfira para balão volumétrico de 2 L, dilua com água, acerte o pH da solução para 5,6 com ácido acético e complete o volume com água. Procedimento – Pese 0,1 g da amostra e dilua a 100 mL com uma solução de acetato de amônio 0,02 M (pH 5,6). Pipete 1 mL desta solução e dilua a 100 mL com a solução de acetato de amônio 0,02 M. Controle o pH da solução para 5,6. Trace o espectro do corante no intervalo de 200 a 600 nm. Os máximos e mínimos de absorção são bem definidos, podendo variar de 2 a 3 nm. Compare com os espectros obtidos nas mesmas condições para os corantes-padrão. Referência bibliográfica JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identification tests, test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p. 114 ( FNP5/rev.2). 088/IV Corantes artificiais – Quantificação por espectrofotometria Material Balança analítica, pHmetro, espectrofotômetro UV/VIS, balões volumétricos de 100, 200 196 - IAL Capítulo V - Aditivos e 1000 mL, pipetas volumétricas de 1 e 10 mL e frasco Erlenmeyer de 250 mL. Reagentes Ácido acético Acetato de amônio 0,02 M Acetato de amônio 0,02M (pH 5,6) – Pese 3,08 g de acetato de amônio e transfira para balão volumétrico de 2 L, dilua com água, acerte o pH da solução para 5,6 com ácido acético e complete o volume com água. Procedimento – Para os corantes amarelo-crepúsculo, tartrazina, indigotina, bordeaux S, eritrosina, ponceau 4R, vermelho 40 e azorrubina, prepare soluções a 0,001% em acetato de amônio 0,02 M (pH 5,6). Para os corantes azul-brilhante e azul-patente, prepare uma solução a 0,0005% em acetato de amônio 0,02 M (pH 5,6). Para o corante verde-sólido FCF, pese com precisão, de 50 a 75 mg do corante, transfira para um balão volumétrico de 1 L, dissolva e complete o volume com água. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância no comprimento de máxima absorção do corante a ser medido, utilizando a solução de acetato de amônio como branco e cubetas de 1 cm. Meça no comprimento de onda de absorção máxima no visível, indicado na Tabela 2, a absorbância das soluções de corantes. Para o corante verde sólido FCF, pipete 10 mL da solução anterior para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, contendo 90 mL de acetato de amônio 0,04 M, misture bem e faça a leitura a 625 nm. Calcule a concentração de cada corante utilizando o valor da absortividade ). ( Cálculos A = absorbância da solução da amostra C = concentração da solução da amostra (g/100 mL) Para o verde-sólido FCF: A = absorbância da solução da amostra a = absortividade P = peso da amostra em g IAL - 197 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 2 - Características espectrofotométricas de alguns corantes Corantes Amarelo-crepúsculo Tartrazina Azul-brilhante Indigotina Azul-patente V Verde-sólido FCF Bordeaux S ou amaranto Eritrosina Ponceau 4R ou N cocina Vermelho 40 Azorrubina ou carmoisina INS * Colour Index no máximo do visível Absorção máxima no visível (nm) 110 102 133 132 131 143 123 127 124 129 122 15985 19140 42900 73015 42051 42053 16185 45430 16255 16035 14720 564,1 536,6 1640,0 449,3 2089 ** 436,0 1130,0 442,5 536,0 518,6 481 426 630 610 640 625 519 524 507 505 515 *Sistema Internacional de Numeração **Para o verde-sólido FCF, a absortividade é de 0,156 mg/L/cm. Referências bibliográficas COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX Food Chemicals Codex. 4. ed., Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 142, 773. GAUTIER, J.A.; MALANGEAU, P. Mises au Point de Chimie Analytique Organique – Pharmaceutique et Bromatologique. 13. ed., Paris: Masson & Cie., 1964. p. 70, 71, 91. 089/IV Corantes artificiais – Quantificação por titulação com cloreto de titânio A porcentagem de corante puro pode muitas vezes ser determinada pela titulação com cloreto de titânio, usando-se uma solução-tampão adequada. Na maioria dos casos, a própria amostra serve como indicador, visto que no ponto final ocorre a descoloração da solução. Se a amostra contiver uma mistura de dois ou três corantes, é necessária uma separação por cromatografia antes de se efetuar a titulação. Material Balança analítica, aparelho de Kipp para gerar de CO2 e H2 , agitador, balão de 2000 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, provetas de 25 e 50 mL e bureta de 50 mL. 198 - IAL Capítulo V - Aditivos Reagentes Solução de tricloreto de titânio 0,1 M – Misture 200 mL de solução de tricloreto de titânio comercial a 15% com 150 mL de ácido clorídrico. Ferva a mistura durante 2 minutos e resfrie em água fria. Adicione água até completar 2000 mL. Misture bem e borbulhe CO2 ou N2 na solução por uma hora. Antes de padronizar, mantenha a solução sob atmosfera de hidrogênio por pelo menos 16 horas usando um aparelho gerador Kipp. Padronização da solução de tricloreto de titânio – Transfira 3 g de sulfato duplo de ferro e amônio para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Introduza uma corrente de gás carbônico. Adicione 50 mL de água recentemente fervida e 25 mL de ácido sulfúrico 5 M. Adicione, rapidamente, com auxílio de uma bureta, 30 mL de solução de dicromato de potássio 0,0167 M (não interrompa a corrente de CO2). Transfira a solução de tricloreto de titânio para uma bureta e coloque rapidamente no frasco Erlenmeyer até pouco acima do ponto de viragem. Adicione rapidamente 5 mL de tiocianato de amônio a 20% e complete a titulação até que desapareça a coloração vermelha e a solução permaneça verde. Efetue uma determinação em branco com 3 g de sulfato duplo de ferro e amônio, utilizando as mesmas quantidades de água, ácido e solução de tiocianato de amônio e passe uma corrente contínua de gás carbônico na solução. Cálculo A = mL da solução de dicromato de potássio 0,0167 M adicionado f = fator da solução de dicromato de potássio 0,0167 M adicionado V = mL (corrigido) da solução de tricloreto de titânio gasto na titulação Procedimento – O aparelho para determinação do teor de corante por titulação com TiCl3 (Figura 1) consiste de um frasco de estocagem (A) do titulante TiCl3 mantido sob atmosfera de hidrogênio, produzido por uma aparelho gerador de Kipp, um frasco Erlenmeyer (B), equipado com uma fonte de CO2 ou N2, para manter a atmosfera inerte, onde a reação se realizará; um agitador e uma bureta (C). Pese a quantidade da amostra de acordo com a Tabela 3. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, com auxílio de 150 mL de água. Adicione 10 g de citrato de sódio ou 15 g de bitartarato de sódio (Tabela 3). Titule com a solução-padrão de cloreto de titânio sem interromper a corrente de CO2 e o aquecimento. IAL - 199 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 1 – Aparelho para determinação do teor de corante por titulação com TiCl3 Cálculo A = mL (corrigido) de solução-padrão de cloreto de titânio gasto na titulação D = peso (em g) do corante equivalente a 1 mL da solução-padrão de cloreto de titânio 0,1 M ( Tabela 3) f = fator da solução-padrão de cloreto de titânio 0,1 M P = peso da amostra 200 - IAL Capítulo V - Aditivos Tabela 3 - Titulação com cloreto de titânio Corante Amarelo-crepúsculo Tartrazina Bordeaux S ou amaranto Ponceau 4R Vermelho 40 Azorrubina Azul-brilhante Indigotina Azul-patente V Verde-sólido FCF nº de g do corante Massa em g da Adicionar equivalente a 1 mL amostra a ser 15 - 10 g * da solução-padrão usada na titulação de TiCl3 0,1 M 0,5 – 0,6 0,6 – 0,7 0,7 – 0,8 0,7 – 0,8 0,5 – 0,6 0,5 – 0,6 1,8 – 1,9 1,0 – 1,1 1,3 – 1,4 1,9 – 2,0 Citrato Bitartarato Citrato Citrato Bitartarato Bitartarato Bitartarato Bitartarato Bitartarato Bitartarato 0,01131 0,01356 0,01511 0,01578 0,01241 0,01256 0,03965 0,02332 0,02898 0,04045 *15 g, se for bitartarato ou 10 g, se for citrato. Referências bibliográficas COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX Food Chemicals Codex. 4th ed., Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 142, 773-774. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identification tests, test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p. 116-118. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Associatio of Official Analytical Chemists. 16th, Arlington: A.O.A.C., 1996, chapter 46. p. 10, 11 (method 950.61). JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Compendium of food addittive specifications. Rome, 1992, p. 37, 71, 176, 219, 639, 783, 1051, 1141, 1463, 1483. 090/IV Corantes artificiais – Determinação de eritrosina por gravimetria O procedimento gravimétrico simples permite somente a determinação da eritrosina na matéria-prima do corante puro. IAL - 201 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, estufa, béquer de 400 mL, pipeta de 5 mL, placa filtrante. provetas de 10 e 50 mL, dessecador com sílica gel ou cloreto de cálcio anidro e bastão de vidro. Reagentes Ácido nítrico (1+19) Ácido nítrico (1+179) Procedimento – Estabilize a temperatura da estufa para 135°C. Pese 0,25 g da amostra e transfira com auxílio de 100 mL de água para um béquer de 400 mL. Adicione 5 mL de ácido nítrico (1 + 19), agite com um bastão de vidro, filtre em placa filtrante previamente aquecida em estufa a 135°C, resfriada em dessecador e pesada. Lave o béquer e a placa com 50 mL de ácido nítrico (1 + 179) e depois com 10 mL de água, evitando que o precipitado seque. Seque, aqueça em estufa a 135°C, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = g da substância precipitada P = g da amostra Referência Bibliográfica JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Compendium of Food Additive Specifications. Rome , 1992. p. 573. 091/IV Corantes artificiais – Determinação de substâncias insolúveis em água Material Estufa, balança analítica, béquer de 250 mL, proveta de 200 mL, placa filtrante e dessecador com sílica gel ou cloreto de cálcio anidro. Procedimento – Estabilize a temperatura da estufa para 135°C. Pese 5 g da amostra, transfira para um béquer de 250 mL, com auxílio de 200 mL de água quente (80-90)°C. Agite para dissolver o corante e deixe esfriar a solução à temperatura ambiente. Filtre a solução através 202 - IAL Capítulo V - Aditivos de uma placa filtrante (porosidade 4), previamente aquecida a 135°C, por 1 hora, resfriada em dessecador e pesada. Lave com água fria até as águas de lavagem se tornarem incolores. Seque o filtro com o resíduo, aqueça em estufa a 135°C, resfrie em dessecador e pese. Cálculo N = nº de g de substâncias insolúveis em água P = nº de g da amostra Referência bibliográfica JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identifications tests, test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p. 132. 092/IV Corantes artificiais – Determinação de substâncias voláteis a 135°C Material Estufa, balança analítica, pesa-filtro com tampa e dessecador com sílica gel ou cloreto de cálcio anidro Procedimento – Estabilize a temperatura da estufa para 135°C. Pese 5 g da amostra em um pesa-filtro com tampa esmerilhada, previamente aquecido em estufa a 135°C, por 1 hora, resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e pesado. Aqueça a 135°C, por 12 horas. Resfrie em dessecador até à temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = perda de peso em g P = nº g da amostra Referência bibliográfica JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identifications tests, IAL - 203 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p. 131-132. 093/IV Corantes artificiais – Determinação de sulfatos Material Mufla, balança analítica, papel de filtro, frasco Erlenmeyer de 250 mL, proveta de 100 mL, balão volumétrico de 200 mL, pipeta de 100 mL, béquer de 600 mL, proveta de 300 mL, pipeta graduada de 20 mL, pipeta graduada de 2 mL e cadinho de porcelana. Reagentes Cloreto de sódio isento de sulfatos Solução saturada de cloreto de sódio Ácido clorídrico Solução de cloreto de bário 0,125 M Procedimento – Estabilize a temperatura da mufla para 500°C. Pese 5 g da amostra e transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, com auxílio de 100 mL de água. Aqueça em banho-maria, adicione 35 g de cloreto de sódio, isento de sulfatos, tampe o frasco Erlenmeyer e agite em intervalos freqüentes, durante 1 hora. Esfrie, transfira com auxílio de solução saturada de cloreto de sódio para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume. Agite, deixe em repouso por algumas horas. Filtre a solução através de papel de filtro seco e transfira 100 mL do filtrado, com auxílio de uma pipeta, para um béquer de 600 mL, dilua até 300 mL com água e acidule com ácido clorídrico, adicionando 1 mL em excesso. Aqueça a solução até ebulição e adicione um excesso de solução de cloreto de bário 0,125 M, gota a gota, com agitação. Deixe repousar a mistura sobre uma placa quente durante 4 horas ou deixe por uma noite à temperatura ambiente. Separe por filtração o sulfato de bário, lave com água quente e calcine o papel de filtro com o resíduo em um cadinho previamente aquecido em mufla a 500°C, resfriado em um dessecador até a temperatura ambiente e pesado. Leve o cadinho com a substância à mufla a 500°C, por uma hora. Resfrie em dessecador e pese. Cálculo 204 - IAL Capítulo V - Aditivos N = nº de g de sulfato de bário S = nº de g da amostra usado na precipitação Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 410. 094/IV Corantes artificiais – Determinação de cloretos Material Potenciômetro, eletrodo Ag+/AgCl, balança analítica, béquer de 400 mL, proveta de 200 mL, pipeta graduada de 1 mL e bureta de 25 mL. Reagentes Nitrato de prata 0,1 M Ácido nítrico Procedimento – Pese 0,5 g da amostra. Transfira para um béquer de 400 mL, com auxílio de 200 mL de água. Adicione 1 mL de ácido nítrico. Titule com solução de nitrato de prata 0,1 M. Cálculo V = nº de mL de solução de nitrato de prata 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de nitrato de prata 0,1 M P = nº de g da amostra Referência bibliográfica JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identifications tests, test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p. 129. IAL - 205 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 095/IV Corantes artificiais – Determinação de corantes subsidiários Corantes subsidiários são definidos como aqueles corantes que são os subprodutos do processo de fabricação do corante principal. Qualquer outro corante, que não o principal e seus subsidiários, são considerados adulterantes cuja presença é usualmente detectada em cromatogramas usados para determinar corantes subsidiários. Os corantes subsidiários são separados do corante principal por cromatografia ascendente em papel. Material Balança analítica, papel Whatman nº 1, sílica gel, balão volumétrico de 100 mL, cuba cromatográfica e microsseringas de 5 ou 10 µL. Reagentes Hidróxido de amônio Citrato trissódico n-Butanol Álcool 2-Butanona Acetona Ácido acético glacial Acetonitrila Álcool isoamílico Metil etil cetona Fases móveis: 1. água-amônia-citrato trissódico (95:5:2) 2. n-butanol-água-álcool-hidróxido de amônio (600:264:135:6) 3. 2-butanona-acetona-água (7:3:3) 4. 2-butanona-acetona-água-hidróxido de amônio (700:300:300:2) 5. 2-butanona-acetona-água-hidróxido de amônio (700:160:300:2) 6. n-butanol-ácido acético glacial-água (4:1:5). Agite por 2 minutos, deixe separar as camadas e use a camada superior como fase móvel 7. acetonitrila-álcool isoamílico-metil etil cetona-água-hidróxido de amônio (50:50:15:10:5) Procedimento – Prepare soluções aquosas das amostras a 1% m/v. Dilua em água de acordo com o limite legal permitido para cada corante. Sobre uma folha de papel Whatman nº 1 ou sobre a placa de sílica gel no caso do corante verde sólido, aplique, com uma microsseringa, 2 µL das soluções de corantes a 1% e as respectivas soluções diluídas, conforme o limite 206 - IAL Capítulo V - Aditivos legal estabelecido para corantes subsidiários. Desenvolva o cromatograma com o solvente apropriado para cada corante, conforme Tabela 4. Tabela 4 – Altura ou tempo necessário para o desenvolvimento de corantes em respectivas fases móveis Fase móvel Altura ou tempo Vermelho 40 4 17 cm Bordeaux S (Amaranto) 3 17 cm Azul-brilhante 4 20 h Eritrosina 5 17 cm Verde-sólido 7 CCD - sílica gel até o topo da placa Azul-indigotina 3 17 cm Amarelo-tartrazina 4 12 cm Amarelo-crepúsculo 4 17 cm Azorrubina (carmoisina) 4 17 cm Corante Azul-patente 2 17 cm Ponceau 4R 3 17 cm A mancha do corante subsidiário da solução a 1% deve ser menor do que a mancha principal da solução diluída. Referências bibliográficas JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identification tests, test solutions and other reference materials. Rome, 1991. p.122. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES. Guide to specifications for general notices, general analytical techniques, identification tests, test solutions and other reference materials . Rome , 1992. p. 37, 71, 176, 219, 641, 785, 1051, 1141, 1463, 1482. 096/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de amarelo-crepúsculo e bordeaux S Este método espectrofotométrico é aplicado para determinação das misturas dos corantes artificiais: amarelo-crepúsculo e bordeaux S e baseia-se na aditividade das absorbâncias dos corantes. IAL - 207 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, pHmetro, espectrofotômetro UV/VIS, balão volumétrico de 100 mL, balão volumétrico de 2000 mL e pipetas volumétricas. Reagentes Ácido acético Acetato de amônio 0,02 M – Pese 3,08 g de acetato de amônio e transfira para balão volumétrico de 2000 mL, dilua com água, acerte o pH da solução para 5,6 com ácido acético e complete o volume com água. Procedimento – Pese uma quantidade adequada da amostra e faça as diluições necessárias em acetato de amônio 0,02 M, de forma a obter leitura nos comprimentos de onda desejados. A solução final deverá estar em balão volumétrico de 100 mL. Para amostras contendo amarelo crepúsculo e bordeaux S, faça a leitura em 481 nm e 519 nm (As leituras nestes comprimentos de onda correspondem à absorção do amarelo crepúsculo mais a absorção do bordeaux S). Tabela 5 – Valores de de onda 481 e 519 nm Corante Amarelo-crepúsculo Amarelo-crepúsculo Bordeaux S Bordeaux S dos corantes amarelo-crepúsculo e bordeaux S, nos comprimentos λ (nm) 481 519 481 519 533,3 325,0 291,3 438,2 Cálculo Utilize o valor de obtidos para estes corantes nos comprimentos de onda de 481 nm e 519 nm na equação de Lambert-Beer (Tabela 5). 208 - IAL Capítulo V - Aditivos Referência bibliográfica YABIKU, H. Y.; MARTINS, M. S.; BRUM, A. M. S. Determinação quantitativa de misturas de corantes artificiais. Boletim do Instituto Adolfo Lutz, ano 6, n. 1, p. 14-19, 1996. 097/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de indigotina e bordeaux S Procedimento – Para amostras contendo indigotina e bordeaux S, faça as leituras das absorbâncias em 519 nm e 610 nm. (A leitura a 519 nm, corresponderá à absorção do corante indigotina mais a do bordeaux S e a 610 nm somente a do corante indigotina). Tabela 6 – Valores de onda 519 e 610 nm Corante Bordeaux S Bordeaux S Indigotina Indigotina dos corantes bordeaux S e indigotina, nos comprimentos de λ (nm) 519 610 519 610 438,2 -----060,0 447,4 Cálculo Utilize os valores de obtidos para estes corantes nos comprimentos de onda de 519 nm e 610 nm na equação de Lambert Beer. IAL - 209 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica YABIKU, H. Y.; MARTINS, M. S.; BRUM, A .M. S. Determinação quantitativa de misturas de corantes artificiais. Boletim do Instituto Adolfo Lutz, ano 6, n. 1, p. 14-19, 1996. 098/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina, bordeaux S e indigotina Procedimento – Para amostras contendo tartrazina, bordeaux S e indigotina, faça a leitura em 426, 519 e 610 nm. Em 426 nm, ocorre a absorção da tartrazina mais bordeaux S, em 519 nm a absorção do bordeaux mais indigotina e em 610 nm somente a absorção da indigotina. Tabela 7 – Valores de dos corantes tartrazina, bordeaux S e indigotina, nos comprimentos de onda 426, 510 e 519 nm Corante λ (nm) Tartrazina Tartrazina Tartrazina Bordeaux S Bordeaux S Bordeaux S Indigotina Indigotina Indigotina 426 519 610 426 519 610 426 519 610 534,1 ------100,0 438,2 ------060,0 447,4 Cálculo Utilize os valores de obtidos para estes corantes nos comprimentos de onda de 426, 519 e 610 nm na equação de Lambert Beer (Tabela 7). 210 - IAL Capítulo V - Aditivos Referência bibliográfica YABIKU, H. Y.; MARTINS, M. S.; BRUM, A. M. S. Determinação quantitativa de misturas de corantes artificiais. Boletim do Instituto Adolfo Lutz, ano 6, n. 1, p. 14-19, 1996. 099/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina, indigotina e azul brilhante Procedimento – Para misturas contendo tartrazina, indigotina e azul-brilhante, faça as leituras da absorbância em 426, 610 e 630 nm. No comprimento de onda 426 nm, ocorre a absorção dos corantes tartrazina e azul-brilhante, em 610 nm a absorção da indigotina e azul-brilhante e em 630, a da indigotina e do azul-brilhante. dos corantes tartrazina, indigotina e azul brilhante, nos Tabela 8 – Valores de comprimentos de onda 426, 610 e 630 nm. Corante λ (nm) Tartrazina Tartrazina Tartrazina Indigotina Indigotina Indigotina Azul-brilhante Azul-brilhante Azul-brilhante 426 610 630 426 610 630 426 610 630 534,1 -----------447,4 357,3 062,9 1016,8 1652,0 Cálculo Utilize o valor de obtido para estes corantes nos comprimentos de onda de 426, 610 e 630 nm na equação de Lambert-Beer. IAL - 211 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica YABIKU, H. Y.; MARTINS, M. S.; BRUM, A .M. S. Determinação quantitativa de misturas de corantes artificiais. Boletim do Instituto Adolfo Lutz, ano 6, n. 1, p. 14-19, 1996. 100/IV Corantes artificiais – Determinação quantitativa de misturas de tartrazina e amarelo crepúsculo Procedimento – Para amostras contendo tatrazina e amarelo-crepúsculo, faça a leitura em 426 e 481 nm, pois nestes comprimentos de onda ocorre a absorção dos dois corantes. Tabela 9 – Valores de de onda 426 e 481 nm. Corante Tartrazina Tartrazina Amarelo-crepúsculo Amarelo-crepúsculo dos corantes tartrazina e amarelo-crepúsculo, nos comprimentos λ (nm) 426 481 426 481 535 170 221 592 Cálculo Utilize os valores de obtidos para estes corantes nos comprimentos de onda de 426 e 481 nm na equação de Lambert-Beer. Referência bibliográfica TAKAHASHI, M. Y.; YABIKU, H.Y.; MARSIGLIA, D.A.P. Determinação quantitativa de corantes artificiais em alimentos. São Paulo, Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 48, p. 7-15, 1988. 212 - IAL Capítulo V - Aditivos 101/IV Teobromina e cafeína – Determinação por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de teobromina e cafeína em cacau, produtos de chocolate e aromas à base de cacau. A técnica utilizada é a cromatografia líquida de alta eficiência, que separa e quantifica a teobromina e a cafeína. Estes dois alcalóides são separados em uma coluna de fase reversa (C18), eluídos com a fase móvel metanol-ácido acético-água e detectados por absorção na região do ultravioleta a 280 nm. Material Balança analítica, centrífuga, tubos de c entrífuga de 50 mL, banho-maria, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector DAD ou ultravioleta, coluna analítica de octadecilsilano, 8 mm x 10 cm, 5 µm (Lichrospher 100 RP-18 ou equivalente), integrador, papel de filtro, nitrogênio para evaporação do solvente, balões volumétricos de 100, 200 e 1000 mL, funil de vidro, provetas de 50 mL, béqueres de 50 e 250 mL, bastões de vidro, frascos Erlenmeyer de 250 mL, pipetas volumétricas de 5 mL, pedras de ebulição e sistema de filtração de fase móvel (Millipore ou equivalente). Reagentes Ácido acético grau CLAE Metanol grau CLAE Água ultra-pura Padrões analíticos de teobromina e cafeína Éter de petróleo (40-60)°C Acetato de zinco Ácido acético 0,1 M Ferrocianeto de potássio Solução de Carrez I – Dissolva 219 g de acetato de zinco em aproximadamente 500 mL de água ultra-pura e 30 mL de ácido acético 0,1 M. Transfira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Solução de Carrez II – Dissolva 106 g de ferrocianeto de potássio em aproximadamente 500 mL de água ultra-pura, transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Fase móvel – Misture 200 mL de metanol, 790 mL de água e 10 mL de ácido acético. Homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. IAL - 213 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão de teobromina (250 µg/mL) – Pese, com precisão, 50 mg de teobromina, dissolva em água e aqueça, se necessário. Transfira a solução para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de trabalho de teobromina – Transfira 5 mL da solução-padrão de teobromina em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre com filtros de 0,45 µm. Solução-padrão de cafeína (500 µg/mL) – Pese com precisão, aproximadamente 100 mg de cafeína, dissolva em água. Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de trabalho de cafeína – Transfira 5 mL da solução-padrão de cafeína para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre com filtros de 0,45 µm. Procedimento – Pese, com precisão, em um tubo de centrífuga de 50 mL, cerca de 0,5 g de amostra de cacau ou 1 g, se for aroma à base de cacau, ou 3 g, se forem produtos de chocolate (biscoitos, bolos, sorvetes, bebidas lácteas, alimentos achocolatados, etc). Extraia a gordura adicionando 30 mL de éter de petróleo. Agite por 2 minutos. Centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos e decante o solvente. Repita esta extração com mais 30 mL de éter de petróleo. Evapore o solvente residual (pode-se usar uma corrente de nitrogênio ou um banho de água quente dentro de uma capela).Transfira quantitativamente, o resíduo com auxílio de água quente para um frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo várias pedras de ebulição. Adicione água até um volume aproximado de 50 mL. Aqueça 20 minutos a 100°C. Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Esfrie e adicione 5 mL de cada uma das soluções de Carrez I e Carrez II, complete o volume com água e homogeneíze. Filtre descartando os primeiros 20 mL. Use o filtrado para a análise cromatográfica, filtrando-o previamente com filtros de 0,45 µm. Ajuste o comprimento de onda do detector para 280 nm , o fluxo da fase móvel para 1 mL/min e a temperatura do forno a 35°C. Injete 20 µL das soluções-padrão de trabalho de teobromina e cafeína no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicada de cada padrão para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 20 µL da amostra em triplicata. Cálculo Calcule o teor de teobromina e cafeína na amostra analisada por meio das áreas dos picos obtidos nos cromatogramas. 214 - IAL Capítulo V - Aditivos Cp = concentração do padrão de teobromina Ca = concentração da amostra Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Cp = concentração do padrão de cafeína Ca = concentração da amostra Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Referência bibliográfica YABIKU, H. Y.; KIMURA, I. A. Determinação de teobromina e cafeína em cacau e produtos de chocolate por cromatografia líquida de alta eficiência. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 56(1), p. 59-64, 1996. 102/IV Corantes naturais – Identificação de antocianinas de cascas de uva Dentre os corantes naturais, as antocianinas (ou enocianinas) são obtidas a partir dos extratos de cascas de uva. São solúveis em água e pertencem à classe de compostos contendo uma estrutura básica de 15 átomos de carbono, conhecidos coletivamente como flavonóides. Apresentam-se na forma de líquido, pó ou pasta de cor vermelho-púrpura com odor característico. Material Balança analítica, béqueres de 25 mL, proveta graduada de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL. Reagentes Hidróxido de sódio Solução de hidróxido de sódio – Pese 4,3 g de NaOH, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. IAL - 215 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese 0,1 g de amostra, adicione 50 mL de água e agite. Filtre, se necessário e adicione solução de hidróxido de sódio. A cor vermelha-púrpura torna-se azul ou verde-escura. Nota: outra maneira para identificar antocianinas em cascas de uva é o aparecimento de um máximo de absorção a 525 nm, na varredura espectrofotométrica na região do visível de uma solução preparada de acordo com o procedimento 0103/IV. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade, 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.612: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 103/IV Corantes naturais – Determinação da intensidade de cor em enocianinas por espectrofotometria Material Balança analítica, pHmetro, espectrofotômetro UV/VIS, béqueres de 100 mL, provetas graduadas de 50 e 100 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL. Reagentes Ácido cítrico Fosfato de sódio dibásico Solução-tampão de ácido cítrico/fosfato de sódio dibásico, pH 3 – Misture 79,45 mL de ácido cítrico 0,1 M e 20,55 mL de fosfato de sódio dibásico 0,2 M e ajuste o pH a 3 com uma ou outra solução. A solução 0,1 M de ácido cítrico dihidratado contém 21,01 g/L de C6H8O7.2H2O. A solução 0,2 M de fosfato de sódio dibásico contém 28,40 g/L de Na2HPO4 ou 35,6 g/L de Na2HPO4.2H2O. Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,1 g de amostra e adicione a solução-tampão pH 3 até completar 100 mL. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 525 nm, utilizando a solução-tampão como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância (A) da amostra a 525 nm. Caso a absorbância não esteja entre 0,2 e 0,7, reajuste a massa inicial. 216 - IAL Capítulo V - Aditivos Cálculo A = absorbância a 525 nm P= massa da amostra em g Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.613: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 104/IV Corantes naturais – Identificação de carmim de cochonilha O corante carmim de cochonilha é a laca de alumínio ou cálcio-alumínio obtido a partir do extrato aquoso dos corpos dessecados das fêmeas de insetos Dactylopius coccus costa (Coccus cacti L). Seu principal constituinte é o ácido carmínico (ácido 7-beta-d-gluco piranosil-3,5,6,8-tetra-hidroxi-1-metil-9,10-dioxo-antraceno-2-carboxílico), o qual pode ser comercializado na forma de solução (corante natural ácido carmínico) ou na forma de laca de alumínio ou cálcio-alumínio (corante natural carmim de cochonilha). O corante carmim de cochonilha apresenta-se na forma de pó friável, de coloração vermelha ou vermelha-escura ou solução de coloração vermelha-violácea. O carmim deve apresentar no mínimo 42% de ácido carmínico, calculado em base seca. Material Chapa elétrica, béqueres de 25 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, pipeta graduada de 1 mL, funil de separação, pipeta graduada de 5 mL e proveta graduada de 500 mL. Reagentes Hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio Cristais de ditionito de sódio - Na2S2O4 Ácido sulfúrico Ácido clorídrico Álcool amílico Éter de petróleo IAL - 217 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Acetato de uranila Solução aquosa de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio a 10% Solução aquosa de ácido clorídrico a 10% v/v – Dilua 266 mL de HCl com água em um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume. Solução aquosa de acetato de uranila a 5% m/v – Pese 5 g de acetato de uranila, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Procedimentos 1. Alcalinize levemente uma dispersão aquosa da amostra pela adição de uma gota de solução de hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio a 10%. Forma-se uma coloração violeta. 2. A adição de pequena quantidade de cristais de ditionito de sódio às soluções da amostra, em meio ácido, neutro ou alcalino, não descora a solução. 3. Leve à secura, em banho-maria, uma pequena quantidade da amostra em cápsula de porcelana. Esfrie totalmente e trate o resíduo seco com uma ou duas gotas de ácido sulfúrico concentrado. Não se observa alteração da cor. 4.Transfira uma dispersão aquosa da amostra para um funil de separação, cuja capacidade seja três vezes o volume da dispersão. Adicione 1/3 do volume (correspondente ao da dispersão) de solução de ácido clorídrico a 10% v/v e agite. Adicione álcool amílico de maneira a dobrar o volume do conteúdo do funil de separação e agite. Deixe separar e despreze a fase aquosa (inferior). Lave a fase amílica 2 a 4 vezes com água para eliminar resíduos de ácido clorídrico. Dilua a fase amílica com igual volume de éter de petróleo e agite. Adicione uma pequena quantidade de água (cerca de 1/6 do volume total). Adicione gota a gota solução de acetato de uranila a 5%, agitando após cada adição. Forma-se uma coloração verdeesmeralda característica, na fase inferior. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.616: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 218 - IAL Capítulo V - Aditivos 105/IV Corantes naturais – Determinação de ácido carmínico em carmim de cochonilha Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béqueres de 100 mL, proveta graduada de 100 mL, balões volumétricos de 200 e 500 mL e pipeta volumétrica de 10 mL. Reagentes Ácido clorídrico 2 M Procedimento – Dissolva 100 mg do corante carmim em 30 mL de ácido clorídrico 2 M em ebulição. Resfrie e transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL, complete o volume com água e homogeneíze. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 494 nm, utilizando uma solução de ácido clorídrico 2 M como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 494 nm. Cálculo A = absorbância da amostra a 494 nm 0,139 = absorbância do ác. carmínico numa solução contendo 100 mg/1000 mL. Referências bibliográficas SUBCOMMITTEE ON CODEX SPECIFICATIONS ET AL. Second Supplement to the Food Chemicals Codex, 2nd ed., Washington D. C.: National Academy of Sciences, 1975. p.18-20. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.617: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 106/IV Corantes naturais – Identificação de cúrcuma A cúrcuma ou açafrão das Índias, é o rizoma da Cúrcuma longa L. dessecado e pulverizado. Apresenta coloração amarelo-castanho ou amarelo-castanho-escura e tem como IAL - 219 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital princípio ativo principal a curcumina (um corante amarelo-alaranjado) cujo teor geralmente varia de 1 a 5% nos produtos vendidos comercialmente. Material Placa de toque, pipeta graduada de 5 mL, béquer de 25 mL., banho-maria, papel de filtro, funil de vidro, tubo de ensaio, béquer de 125 mL, proveta graduada de 50 mL e bastão de vidro. Reagentes Ácido sulfúrico Álcool Ácido bórico Ácidos oxálico Ácido acético Procedimentos 1. Acidifique levemente a amostra em pó, com ácido sulfúrico: aparece uma coloração vermelha-intensa. 2. A adição de álcool na amostra em pó, extrai o corante amarelo. 3. Extraia algumas gramas da amostra com 20 mL de ácido acético em um béquer de 125 mL. Agite com um bastão de vidro. Filtre para um tubo de ensaio e coloque em banho fervente, por alguns minutos. Uma coloração vermelha indica a presença de cúrcuma. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. TAKAHASHI, M. Y.; INOMATA, E.I.; YABIKU, H. Y.; GIANNATTASIO, C.M.P. Beta-caroteno, urucum e cúrcuma em massas alimentícias vitaminadas com ovos. Rev. do Inst. Adolfo Lutz, 50(1/2), p. 257-260, 1990. 107/IV Corantes naturais – Determinação do teor de curcumina na cúrcuma Material Balança analítica, chapa elétrica, espectrofotômetro UV/VIS, balão de extração com fundo chato de 100 mL e junta esmerilhada, condensador de bolas de 30 a 40 cm com junta esmerilhada, béquer de 25 mL, balões volumétricos de 100 e 250 mL, pipeta volumétrica de 220 - IAL Capítulo V - Aditivos 20 mL e proveta graduada de 50 mL. Reagente Álcool Procedimentos – Pese, com precisão, cerca de 0,1 g de cúrcuma em pó e passe com auxílio de álcool para um frasco de extração. Adicione cerca de 30 mL de álcool e refluxe por duas horas e meia. Esfrie o frasco e filtre quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com álcool. Pipete 20 mL deste extrato para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 425 nm, utilizando álcool como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 425 nm. Cálculo Calcule o teor de curcumina usando o valor de absortividade = 1607. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.624: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 108/IV Corantes naturais – Identificação de curcumina A curcumina em pó é obtida por extração dos rizomas da Cúrcuma longa L. com solventes e posterior purificação do extrato por cristalização. Possui coloração de alaranjada à amarela e deve conter no mínimo 90% de pureza. É insolúvel em água e em éter e solúvel em álcool e ácido acético glacial. Material Pipetas graduadas de 10 mL, béquer de 25 mL e bastão de vidro. Reagentes Álcool IAL - 221 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ácido sulfúrico Procedimento Dissolva a amostra em álcool e observe a cor amarela e a fluorescência esverdeada. Adicione ácido sulfúrico e verifique a formação de intensa coloração carmesim. Referência bibliográfica TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. 109/IV Corantes naturais – Identificação de curcumina por cromatografia em camada delgada Material Balança analítica, placas de celulose microcristalina de 0,1 mm, câmara ultravioleta, cuba de vidro para cromatografia, provetas graduadas de 100 mL, pipeta graduada de 1 mL e béquer de 5 mL. Reagentes Álcool a 95% 3-Metil-1-butanol Hidróxido de amônio Fase móvel: 3-metil-1-butanol:álcool:água:hidróxido de amônio (4:4:2:1). Procedimento – Sature a cuba de vidro com a fase móvel. Pese 0,01 g da amostra e adicione 1 mL de álcool a 95%. Aplique 5 µL da solução da amostra na placa de celulose microcristalina de 0,1 mm. Coloque a placa na cuba de vidro e deixe correr cerca de 15 cm. Examine à luz do dia e sob luz ultravioleta: três manchas amarelas aparecem entre Rf 0,2 e 0,4, à luz do dia e manchas com Rf cerca de 0,6 e 0,8 aparecem sob luz ultravioleta; todas as manchas apresentam distintas fluorescências amarelas sob luz ultravioleta. 222 - IAL Capítulo V - Aditivos Referência bibliográfica TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. 110/IV Corantes naturais – Determinação do teor de curcumina Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, balões volumétricos de 100 e 200 mL, pipeta volumétrica de 1 mL, béquer de 10 mL. Reagente Álcool Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,08 g da amostra, transfira para um balão volumétrico de 200 mL, com auxílio de álcool, agite para dissolver e complete o volume com o mesmo solvente. Pipete 1 mL para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com álcool. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 425 nm, utilizando álcool como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 425 nm. Cálculo Calcule o teor de matéria corante total na amostra, usando o valor de absortividade = 1607. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.624: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 111/IV Corantes naturais – Identificação de urucum lipossolúvel Extratos de urucum são os produtos oleosos (urucum lipossolúvel) ou alcalinos (urucum hidrossolúvel) obtidos por remoção da camada externa das sementes da árvore de urucum (Bixa orellana L). Também pode-se encontrar o pigmento bruto na forma de pó, de IAL - 223 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital coloração vermelha-escura, obtido pela extração mecânica das sementes. O extrato de urucum lipossolúvel, de cor vermelha a castanho-avermelhada, contém diversos componentes coloridos, sendo o principal a bixina. Material Coluna de vidro de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura, béqueres de 150 mL, provetas de 10 mL, pipetas de 5 mLe espectrofotômetro UV/VIS. Reagentes Ácido sulfúrico Ciclohexano Clorofórmio, desidratado com carbonato de potássio anidro Alumina para coluna cromatográfica Tricloreto de antimônio Sulfato de sódio anidro Lã de vidro Reativo de Carr-Price – Pese 25 g de tricloreto de antimônio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com clorofórmio. Deixe em repouso por um dia, em frasco bem fechado e em geladeira. O frasco não deve ser aberto enquanto a solução estiver gelada. Procedimento – Dissolva uma quantidade da amostra em ciclohexano de modo a se obter uma coloração semelhante à de uma solução de dicromato de potássio a 0,1%. Prepare uma coluna de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura com emulsão de alumina em ciclohexano e tampão de lã de vidro na extremidade afilada da coluna de vidro. Escoe lentamente o solvente. Passe pela coluna a solução da amostra obtida anteriormente. Lave 3 vezes com 10 mL de ciclohexano sem deixar secar a coluna. A bixina é fortemente adsorvida pela alumina na parte superior da coluna e forma uma zona vermelho-alaranjada brilhante (o que a diferencia da crocetina). Uma zona de cor amarela-pálida migra através da coluna e é eliminada na lavagem com ciclohexano. Elua a coluna três vezes com 5 mL de clorofórmio. A zona da bixina adsorvida não é eluída em ciclohexano, éter de petróleo, clorofórmio, acetona, álcool e metanol (com os dois últimos solventes, a cor passa à laranja). Quando a última porção for eluída, adicione 1 mL do reativo de Carr-Price. A bixina adsorvida torna-se imediatamente azul-esverdeada, diferente da crocetina que ficaria vermelha. Notas O extrato de urucum lipossolúvel é insolúvel em água e pouco solúvel em álcool. Os extratos de urucum reagem em ácido sulfúrico dando coloração azulada devida à bixina. 224 - IAL Capítulo V - Aditivos O extrato de urucum lipossolúvel diluido com clorofórmio apresenta absorbância máxima a 439, 470 e 501 nm. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.631: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 112/IV Corantes naturais – Determinação do teor de bixina Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béquer de 25 mL, balões volumétricos de 100 mL, pipeta volumétrica de 10 mL. Reagente Clorofórmio Procedimento – Pese, com precisão, a quantidade de mg da amostra que pode ser encontrada pela fórmula: m = 0,153, dividida pela porcentagem de bixina esperada, transfira para um balão volumétrico de 100 mL com clorofórmio e complete o volume. Transfira 10 mL desta solução para outro balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com clorofórmio. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância, a 470 nm, utilizando clorofórmio como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 470 nm. Cálculo Calcule o teor de carotenóides totais expresso em bixina usando o valor de absortividade = 2826. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. IAL - 225 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.632: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 113/IV Corantes naturais – Identificação do urucum hidrossolúvel O extrato de urucum hidrossolúvel, de coloração castanho-avermelhada a castanho, contém como componente colorido principal a norbixina, produto de hidrólise da bixina, na forma de sal de sódio ou potássio. Material Coluna de vidro de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura, béqueres de 150 mL, provetas de 10 e 100 mL, pipetas de 5 mL, funil de separação de 250 mL, balão volumétrico de 1000 mL e espectrofotômetro UV/VIS. Reagentes Ácido sulfúrico Ciclohexano Clorofórmio, desidratado com carbonato de potássio anidro Alumina para coluna cromatográfica Tricloreto de antimônio Sulfato de sódio anidro Lã de vidro Ácido sulfúrico 1 M Reativo de Carr-Price Procedimento – Transfira 2 mL ou 2 g da amostra para um funil de separação de 250 mL. Adicione ácido sulfúrico 1 M suficiente para se obter uma reação fortemente ácida (a norbixina é separada como precipitado vermelho). Adicione 50 mL de ciclohexano e agite fortemente. Após a separação das fases, descarte a aquosa e lave a fase ciclohexânica com água até eliminação do ácido. Centrifugue a emulsão que se forma, por 10 min, a 2500 rpm. Decante a solução límpida de norbixina e seque sobre sulfato de sódio anidro. Prepare uma coluna de 1 cm de diâmetro e 8 a 10 cm de altura com emulsão de alumina em ciclohexano e tampão de lã de vidro na extremidade afilada da coluna de vidro. Escoe lentamente o solvente. Adicione 3 a 5 mL da solução obtida anteriormente no topo da coluna de alumina e proceda como descrito em 0111/IV. A norbixina forma uma zona vermelho-alaranjada na superfície da coluna e dá a mesma reação com reativo de Carr-Price da bixina. 226 - IAL Capítulo V - Aditivos Notas O extrato de urucum hidrossolúvel é pouco solúvel em álcool. Os extratos de urucum reagem com ácido sulfúrico dando coloração azul-esverdeada devido à norbixina. O extrato de urucum hidrossolúvel diluído com água apresenta absorbância máxima a 453 e 483 nm. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.634: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 114/IV Corantes naturais – Determinação do teor de norbixina Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béqueres de 25 mL, balões volumétricos de 100, 500 e 1000 mL e pipeta volumétrica de 1 mL. Reagentes Hidróxido de potássio Solução aquosa de hidróxido de potássio a 0,5% – Pese 5 g de hidróxido de potássio e transfira para um balão volumétrico de 1000 mL. Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,1 g do corante em pó, transfira para um balão volumétrico de 500 mL com Hidróxido de potássio 0,5% e complete o volume. Pipete 1 mL desta solução para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume comHidróxido de potássio 0,5%. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 453 nm, utilizando a solução de Hidróxido de potássio 0,5% como branco e cubetas de 1 cm. Leia em espectrofotômetro a 453 nm. Cálculo Calcule o teor de carotenóides totais expresso em norbixina usando o valor de absortividade = 3473. IAL - 227 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: para expressar o resultado em bixina, deve-se multiplicar o teor de norbixina encontrado pelo fator 1,037. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. YABIKU, H. Y.; TAKAHASHI, M. Y. Determinação de bixina em sementes de urucum: estudo colaborativo. Rev. do Inst. Adolfo Lutz, 52(1/2), p. 31-36, 1992. 115/IV Corantes naturais – Identificação de corante caramelo Este método se aplica à misturas de aditivos e à bebidas. Material Balança analítica, béquer de 100 mL, funil, papel de filtro, proveta graduada de 10 mL, proveta graduada de 50 mL com tampa de vidro esmerilhada, tubo de ensaio e pipetas graduadas de 2 e 5 mL. Reagentes Óxido de magnésio Acetato neutro de chumbo Mistura de álcool butílico-éter de petróleo (1:5) Resorcina a 5% em ácido clorídrico, preparada no dia do uso Procedimento – Adicione 1 g de acetato neutro de chumbo e 0,5 g de óxido de magnésio a 50 mL da amostra, evaporando antes o álcool quando for o caso. Agite bem. Filtre, recolha de 30 a 35 mL do filtrado em uma proveta com tampa de vidro esmerilhada. Adicione 10 mL da mistura álcool-éter. Agite com cuidado (abrindo vez por outra o frasco) durante 5 minutos. Deixe em repouso. Retire, com uma pipeta, 5 mL da camada etérea para um tubo de ensaio. Adicione 2 mL de solução de resorcina, de tal modo que escorra pelas paredes do tubo até o fundo. Na presença de caramelo, na zona de contato das duas camadas forma-se um anel vermelho. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: 228 - IAL Capítulo V - Aditivos Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 114. 116/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação da intensidade de cor O corante caramelo obtido pelo processo amônio é composto por substâncias resultantes do tratamento térmico de carboidratos, em presença de hidróxido de amônio, por tecnologia adequada. Apresenta-se na forma de líquido denso de cor marrom-escura a preta, tendo odor característico de açúcar queimado e sabor amargo. São solúveis em água, soluções diluídas de álcool, ácidos minerais, soluções de hidróxido de sódio e insolúveis em álcool absoluto, acetona, éter de petróleo e clorofórmio. A intensidade de cor é definida como a absorbância de uma solução a 0,1% m/v, a 610 nm em cubeta de 1 cm, calculada sobre o conteúdo de sólidos. Para o corante caramelo processo amônio, esta intensidade de cor deve estar entre 0,08 e 0,36. Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, centrífuga, béquer de 50 mL e balões volumétricos de 100 mL. Procedimento – Pese 100 mg a amostra em béquer de 50 mL, dissolva em água e transfira para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume e homogeneíze. Se a solução ficar turva, centrifugue. A solução não pode ser filtrada. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância, a 610 nm, utilizando água como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da solução a 610 nm. Cálculo A610 = absorbância de solução da amostra a 610 nm. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.660-13.661: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. IAL - 229 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 117/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação de sólidos Material Estufa a vácuo, mufla, peneiras de malha n° 40 e 60 mesh, béquer de 250 mL, cápsula de porcelana. Reagentes Ácido clorídrico Areia pura de quartzo – Utilize areia pura de quartzo que passe através de uma peneira de malha nº 40 mesh e fique retida na peneira de nº 60. Esta areia é preparada pela digestão com ácido clorídrico (por exemplo, a 10%) e em seguida lavada até ficar livre de ácido, seca e calcinada em mufla a 600°C por 4 horas. Procedimento – Misture 30 g de areia preparada com (1,5 - 2,0)g do corante caramelo e seque até peso constante a 60°C sob 50 mm/Hg de pressão. Registre a massa final da areia mais corante caramelo. Cálculo Pf = massa final da areia + caramelo Pa = massa da areia Pc = massa do caramelo Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.660: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 230 - IAL Capítulo V - Aditivos 118/IV Corante caramelo processo amônio – Determinação do 4-metilimidazol (MEI) Material Estufa, cuba cromatográfica com tampa, placas de vidro para cromatografia (20 x 20)cm, balões volumétricos de 10, 100 e 1000 mL, provetas graduadas de 100 mL, nebulizador, funil de separação de 125 mL, pipetas volumétricas de 5, 25 e 50 mL, béqueres de 10 e 25 mL, lã de vidro e rotavapor. Reagentes Sílica gel GF 254 Celite 545 Hidróxido de sódio Clorofórmio Álcool Metanol Ácido sulfúrico Bicarbonato de sódio Éter Nitrito de sódio Ácido sulfanílico Ácido clorídrico Carbonato de sódio Padrão analítico de 4-metilimidazol Ácido sulfúrico 0,025 M Soluções-padrão – Prepare soluções aquosas de 4-metilimidazol contendo 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 e 800 mg/Kg. Hidróxido de sódio 2 M – Pese 90 g de hidróxido de sódio e transfira para um frasco com rolha de borracha com auxílio de 1000 mL de água isenta de gás carbônico. Adicione, gota a gota, solução saturada de hidróxido de bário até não se formar mais precipitado e agite. Conserve o frasco fechado em repouso durante 12 horas. Decante e transfira o líquido claro para o frasco de polietileno. Conserve protegido contra o gás carbônico do ar. Solução de bicarbonato de sódio a 8% m/v – Pese 8 g de bicarbonato de sódio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução de nitrito de sódio a 0,5% m/v – Pese 0,5 g de nitrito de sódio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. IAL - 231 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ácido sulfanílico a 0,5% em ácido clorídrico a 2% m/v – Pese 0,5 g de ácido sulfanílico, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução aquosa de ácido clorídrico a 2% v/v. Solução de carbonato de sódio a 20% m/v – Pese 20 g de carbonato de sódio, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Preparação das placas – Prepare placas de vidro com uma mistura de sílica gel GF 254 e duas partes de solução aquosa de bicarbonato de sódio a 8%. Seque as placas ao ar livre e coloque-as em estufa a 120°C, durante 2 horas. Deixe saturando na cuba de vidro com o solvente: éter-clorofórmio-metanol (80:20:20). Revelador – Misture, imediatamente antes de usar, uma parte da solução de nitrito de sódio a 0,5% e uma parte de solução de ácido sulfanílico a 0,5% em ácido clorídrico a 2%. Extração em coluna de Celite 545 – Coloque um tampão de lã de vidro no fundo de uma coluna cromatográfica de (25 x 250)mm, com torneira de teflon. Sobre a mesma, coloque uma mistura de 3 g de Celite e 2 mL de hidróxido de sódio 2 M. A coluna deve ficar firme e uniformemente compactada. Pese 10 g de corante caramelo num béquer e adicione 6 mL de solução aquosa de carbonato de sódio a 20%, misturando bem. Adicione 10 g de Celite, homogeneizando bem. Coloque todo o conteúdo sobre o empacotamento da coluna. Limpe o béquer com um grama de Celite e transfira para a coluna. Coloque um tampão de lã de vidro no topo da mesma. A coluna deve estar firmemente compactada, sem rachaduras. Elua a coluna com uma mistura de clorofórmio-álcool (80:20) v/v, com uma vazão de aproximadamente 5 mL/min até obter 125 mL do eluído. Se necessário, use vácuo nesta operação. Transfira o eluído para um funil de separação de 125 mL e extraia com 25 mL de ácido sulfurico 0,025 M e depois com mais 5 mL. Transfira os extratos obtidos para o frasco de um rotavapor e concentre até 5 mL aproximadamente. Controle a temperatura do banho para que não exceda 55°C. A parte final da concentração deve ser cuidadosamente controlada a fim de que não haja carbonização. Transfira o concentrado para um balão volumétrico de 10 mL, lavando o frasco com várias porções de 1 mL de água e complete o volume. Na hora de aplicar sobre a placa, trate a solução obtida com pequenas porções de carbonato de sódio sólido até que não dê mais efervescência e a solução esteja alcalina (pH 9). Procedimento – Aplique, sobre a placa, 2 µL das soluções-padrão de 4-metilimidazol contendo 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 e 800 mg/kg. Desenvolva o cromatograma com a mistura éter-clorofórmio-metanol (80:20:20) até que o solvente tenha atingido aproximadamente 15 cm. Retire a placa, seque à temperatura ambiente e borrife com o revelador. Compare a intensidade da cor da mancha amarela-alaranjada obtida com as manchas dos padrões de concentração conhecida. As manchas permanecem estáveis por 30 min, clareando em seguida. 232 - IAL Capítulo V - Aditivos Cálculo Quando o limite de 4-metilimidazol é expresso baseando-se na equivalência de cor, a concentração é primeiramente calculada sobre o conteúdo de sólidos Cs, usando-se a fórmula: C1 = quantidade de impureza (MEI) encontrada no produto Cs = conteúdo de sólidos A seguir, calcule o teor de 4-metilimidazol baseado na equivalência de cor: IC = intensidade de cor Cs = conteúdo de sólidos O teor de 4-metilimidazol é expresso em termos de um corante caramelo (processos à base de amônio) cuja absorbância é igual a 0,1. Referências sbibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITTIVES Compendium of Food Additive Specifications. Rome, 1992. p. 346, 349. 119/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação da intensidade de cor O corante caramelo processo sulfito/amônio é composto de substâncias obtidas a partir do tratamento térmico de carboidratos, em presença de catalisador químico constituído da mistura de hidróxido de amônio e dióxido de enxofre, por tecnologia adequada. Apresenta-se na forma de pó ou líquido denso de cor marrom-escura a preta, tendo odor característico de açúcar queimado e sabor amargo.Para o corante caramelo processo sulfitoamônio, esta intensidade de cor deve estar entre 0,1 e 0,6. Procedimento – Siga o mesmo procedimento descrito em 116/IV. IAL - 233 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.66013.661: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 120/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação de sólidos Procedimento – Siga o mesmo procedimento descrito em 117/IV. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.660: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 121/IV Corante caramelo processo sulfito/amônio – Determinação do 4-metilimidazol (MEI) Procedimento – Siga o mesmo procedimento descrito em 0118/IV. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES. Compendium of Food Additive Specifications. Rome, 1992. p. 346, 349. 122/IV Corantes naturais – Identificação de beta-caroteno Beta-caroteno idêntico ao natural é um carotenóide obtido por síntese química. 0,6 µg de beta-caroteno correspondem a uma unidade internacional de vitamina A. Apresentase na forma de pós (cristais vermelhos ou pó cristalino) ou suspensão. Pode ser adicionado de antioxidantes permitidos. Os cristais são insolúveis em água, praticamente insolúveis em álcool e metanol, mas pouco solúveis em óleo vegetal. 234 - IAL Capítulo V - Aditivos Material Espectrofotômetro UV/VIS, aparelho medidor de ponto de fusão, béqueres de 25 mL Reagentes Éter de petróleo Álcool Procedimentos 1. O espectro de absorção da solução da amostra, em éter de petróleo, apresenta picos de absorção máximo em 475, 448 e 450 nm. Em álcool, apresenta absorções em 475, 449 e 427 nm. 2. O intervalo de fusão da amostra varia entre (178-184)oC, com decomposição. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.669: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 123/IV Carotenóides lipossolúveis (preparações a 30%) – Determinação do teor de beta-caroteno Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béquer de 25 mL, balões volumétricos de 100 mL e pipeta volumétrica de 20 mL. Reagente Éter de petróleo Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 50 mg da amostra, dissolva em éter de petróleo, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com o mesmo solvente. Transfira uma alíquota de 20 mL para outro balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância, a IAL - 235 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 448 nm, utilizando éter de petróleo como branco e cubetas de 1 cm. Meça a absorbância da amostra a 448 nm. Nota: Os ensaios devem ser feitos com a maior rapidez possível, evitando exposição demasiada ao ar e à luz. Utilize vidraria de baixa permeabilidade aos raios actínicos. Cálculo Calcule a porcentagem de beta-caroteno usando = 2592. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.670: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 124/IV Carotenóides hidromiscíveis (preparações com 10%) – Determinação do teor de beta-caroteno Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, béquer de 50 mL, funil de separação de 250 mL, pipeta volumétrica de 20 mL, balões volumétricos de 100 e 500 mL, provetas de 100 e 200 mL e frasco Erlenmeyer de 250 mL. Reagentes Éter de petróleo Acetona Sulfato de sódio anidro Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 70 mg de amostra, transfira para um balão volumétrico de 500 mL com auxílio de água, disperse totalmente e complete o volume. Transfira uma alíquota de 20 mL para um funil de separação, adicione 80 mL de acetona e agite por 5 min. Adicione 60 mL de éter de petróleo, seguido de água para auxiliar a transferência do pigmento para a fase de éter. Após a separação das fases, descarte a fase inferior. Lave 3 vezes com aproximadamente 150 mL de água. Recolha em frasco Erlenmeyer contendo sulfato de sódio anidro para retirar gotas de água. Transfira para um balão volumétrico 236 - IAL Capítulo V - Aditivos de 100 mL e complete o volume com éter de petróleo. Ajuste o zero do espectrofotômetro em unidades de absorbância a 448 nm, utilizando éter de petróleo como branco. Meça a absorbância da amostra em cubeta de 1 cm, a 448 nm. Nota: os ensaios devem ser realizados com a maior rapidez possível, evitando exposição demasiada ao ar e à luz. Utilize vidraria de baixa permeabilidade aos raios actinicos. Cálculo Calcule a porcentagem de beta-caroteno usando = 2592. Referências bibliográficas TAKAHASHI, M. Y. (coord.). Monografias de corantes naturais para fins alimentícios: padrões de identidade e qualidade. 2. ed., São Paulo, 1987. 114 p. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13.671: Coletânea de normas de corantes naturais para fins alimentícios. São Paulo, 1996. 125/IV Edulcorantes – Determinação de acesulfame-K por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de acesulfame-K em adoçantes. Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de ultravioleta, coluna analítica Lichrospher 100 RP-18 (5µm) ou equivalente, integrador, balões volumétricos de 100, 200 e 1000 mL, pipeta de 5 mL, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm, bomba de vácuo, sistema de filtração da fase móvel e seringa de vidro de 5 mL. Reagentes Metanol grau CLAE Hidrogenosulfato de tetrabutil amônio - C16H37NO4S Água ultra-pura Solução–padrão estoque de acesulfame-K – Pese, com precisão, 100 mg de acesulfame-K e transfira para balão volumétrico de 200 mL. Dissolva o acesulfame-K em água e complete o volume. Solução-padrão de trabalho do acesulfame-K – Pipete 5 mL da solução-estoque para balão IAL - 237 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes de injetar no cromatógrafo. Fase móvel: metanol-solução aquosa de hidrogênio sulfato de tetrabutilamônio 0,01M (35:65) – Pese 3,3954 g de hidrogênio sulfato de tetrabutil amônio e transfira para um balão volumétrico de 1000 mL. Misture 650 mL da solução com 350 mL de metanol, homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Procedimento – Pese uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 2,5 mg de acesulfame-K. Dissolva em água e transfira para balão volumétrico de 100 mL, completando o volume com água. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes de injetar no cromatógrafo. Ajuste o comprimento de onda do detector para 227 nm e o fluxo da fase móvel para 0,6 mL/min. Injete 5 µL da solução-padrão de trabalho no cromatógrafo, ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicata para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser superior a 2%. Injete 5 µL da amostra em triplicata. Cálculo Calcule o teor de acesulfame-K na amostra analisada por meio das áreas dos picos obtidos nos cromatogramas. Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa= área do pico da amostra Ap =área do pico do padrão Referência bibliográfica H.GROPIETSCH and H.HACHENBERG, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 171:41-43, 1980. 126/IV Edulcorantes – Determinação de aspartame por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de aspartame, em adoçantes e refrigerantes. 238 - IAL Capítulo V - Aditivos Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector ultravioleta, coluna analítica Lichrospher 100 RP-18 (5 µm) ou equivalente, integrador, balões volumétricos de 100 e 200 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, béquer de 10 mL, provetas de 50 e 100 mL, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm, bomba de vácuo, pHmetro, sistema de filtração da fase movel e seringa de vidro de 5 mL. Reagentes Acetonitrila grau CLAE Água ultra-pura Fosfato de potássio monobásico Ácido fosfórico Metanol Solução-estoque de aspartame – Pese, com precisão, aproximadamente 140 mg de aspartame, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e dissolva em metanol ou água com auxílio do ultra-som, e complete o volume com metanol ou água. O padrão deve ser preparado mensalmente. Solução-padrão de trabalho de aspartame – Pipete 10 mL da solução-estoque e dilua com água para um balão volumétrico de 100 mL. Prepare no dia de uso. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes injetar no cromatógrafo. Fase móvel: tampão fosfato pH 3,5-acetonitrila (9:1) – Pese 3,3913 g de fosfato de potássio monobásico e transfira para balão volumétrico de 2000 mL, dilua em água e acerte o pH para 3,5 com ácido fosfórico, homogeneíze e complete o volume. Misture 1800 mL desta solução-tampão com 200 mL de acetonitrila. Homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Procedimento – Ajuste o comprimento de onda do detector para 214 nm e o fluxo da fase móvel para 1,5 mL/min. Refrigerantes – Degaseifique em ultra-som e passe em membranas filtrantes de 0,45 µm. Dilua, em água se necessário. Adoçante líquido e em pó – Pese uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 14 mg de aspartame, transfira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre em membranas filtrantes de 0,45 µm. Injete 5 µL da solução–padrão de trabalho no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a IAL - 239 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital operação em triplicata para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 5 µL da amostra em triplicata. Cálculo Calcule o teor de edulcorante na amostra analisada por meio das áreas dos picos obtidas nos cromatogramas. Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Nota: este método também pode ser aplicado para a determinação de ácidos benzóico e sórbico em bebidas, alterando o comprimento de onda para 234 nm e o fluxo para 2,0 mL/min Neste caso, pese 100 mg dos ácidos benzóico e sórbico para o preparo da solução-padrão estoque e pipete 5 mL desta solução para um balão volumétrico de 100 mL e dilua até o volume com água (solução-padrão de trabalho). Referências bibliográficas ABREU, R.W.,; OLIVEIRA, I.R.; ZENEBON, O. Quantificação de aspartame por cromatografia líquida de alta resolução (CLAR) em pós para o preparo de sobremesas. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 53(1/2), p. 77-80, 1993. TYLER, T. A. Liquid Chromatographic Determination of Sodium Saccharin, Caffeine, Aspartame and Sodium Benzoate in Cola Beverages. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 67(4), p. 745-47, 1984. 127/IV Edulcorantes – Determinação de ciclamatos Faça a determinação conforme o método 258/IV. 128/IV Edulcorantes – Determinação de esteviosídeo por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de esteviosídeo em adoçantes. 240 - IAL Capítulo V - Aditivos Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de ultravioleta, coluna analítica Lichrospher 100 RP – 18 (5 µm) ou equivalente, integrador, ultra-som, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, pipeta de 10 mL, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm, bomba de vácuo, seringa de vidro de 5 mL e sistema de filtração de fase móvel. Reagentes Metanol grau CLAE Hidróxido de sódio Água ultra-pura Solução-padrão estoque de esteviosídio – Pese, com precisão, 200 mg de esteviosídeo e transfira para balão volumétrico de 100 mL. Dissolva em água no ultra-som e complete o volume. Prepare o padrão todo mês. Solução-padrão de trabalho de esteviosídeo – Pipete 10 mL da solução-estoque para balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Prepare no dia do uso. Fase móvel: metanol-solução aquosa de hidróxido de sódio 5 mM (65:35) – Pese 0,1125 g de hidróxido de sódio e transfira para balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água. Misture 350 mL desta solução com 650 mL de metanol, homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Procedimento – Pese uma quantidade de amostra que contenha, aproximadamente, 20 mg de esteviosídeo. Dissolva em água, transfira para balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Ajuste o comprimento de onda do detector para 210 nm e o fluxo para 1,0 mL/min.Filtre em membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm. Injete 10 µL da solução-padrão de trabalho no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicata para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 10 µL da amostra em triplicata. Cálculo Calcule o teor de esteviosídeo na amostra analisada por intermédio das áreas dos picos obtidos nos cromatogramas. IAL - 241 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Referência bibliográfica ALVAREZ, M.; KUSUMOTO, I.T. Análise quantitativa dos glicosídeos edulcorantes da Stevia rebaudiana e dos seus produtos de hidrólise através da cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Arq. Biol. Tecnol. 30 (2), p. 337-348, 1987. 129/IV Edulcorantes – Determinação de polióis (manitol e sorbitol) por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de manitol e sorbitol em adoçantes. Estes edulcorantes são separados em uma coluna de divinil estireno amina, eluídos com água e detectados por diferença dos índices de refração. Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de índice de refração, coluna analítica Bio-Rad Aminex HPX-87C – 4,0 x 250 mm ou equivalente, integrador, béquer de 10 mL, balão volumétrico de 50 mL, bastão de vidro, funil de vidro, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm, bomba de vácuo, sistema de filtração da fase móvel e seringa de vidro de 5 mL. Reagentes água ultra-pura Solução-padrão de trabalho de manitol ou sorbitol – Inicialmente, coloque aproximadamente 300 mg de sorbitol em dessecador com sílica por 24 horas. Utilize um pesa-filtro contendo cloreto de cálcio anidro no interior da balança analítica por 15 minutos antes de pesar o sorbitol. Para o manitol, seque-o a 105°C por 4 horas. Pese, com precisão, em um béquer de 10 mL, 0,24 g de sorbitol ou manitol. Transfira para balão volumétrico de 50 mL, dissolva em água e complete o volume. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes de injetar no cromatógrafo. Fase móvel – Água ultra-pura Procedimento – Ajuste a temperatura da coluna para 65°C e o fluxo da fase móvel para 0,4 242 - IAL Capítulo V - Aditivos mL/min, estabilize o detector de índice de refração. Pese uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 0,24 g de sorbitol ou de manitol. Dissolva em água e transfira para balão volumétrico de 50 mL, completando o volume. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes de injetar no cromatógrafo. Injete 5 µL da solução-padrão de trabalho no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicata para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 5 µL da amostra em triplicata. Cálculo Calcule o teor de poliol na amostra analisada por meio das áreas dos picos obtidos nos cromatogramas. Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX. Food Chemicals Codex. 4. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1996. p. 773-774. 130/IV Edulcorantes – Determinação de sacarina por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação de sacarina em adoçantes. Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector ultravioleta, coluna analítica Lichrospher 100 RP-18 (5 µm) ou equivalente, integrador, pipeta volumétrica de 10 mL, béquer de 10 mL, balões volumétricos de 200, 250 e 2000mL , provetas de 50 e 100 mL, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm, bomba de vácuo, sistema de filtração da fase móvel e seringa de vidro de 5 mL. IAL - 243 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Acetonitrila grau CLAE Água ultra-pura Fosfato de potássio monobásico Ácido fosfórico Solução-padrão estoque de sacarina – Pese, com precisão, 100 mg de sacarina transfira para balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de trabalho de sacarina – Pipete 4 mL da solução-estoque e dilua com água para balão volumétrico de 200 mL. Filtre através de membranas filtrantes de 0,45 µm, antes de injetar no cromatógrafo. Fase móvel: tampão fosfato pH 3,5-acetonitrila (9:1) – Pese 3,3913 g de fosfato de potássio monobásico e transfira para balão volumétrico de 2000 mL, dilua em água e acerte o pH para 3,5 com ácido fosfórico, homogeneíze e complete o volume. Misture 1800 mL da solução-tampão com 200 mL de acetonitrila, homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Procedimento – Ajuste o comprimento de onda do detector para 214 nm e o fluxo da fase móvel para 0,4 mL/min. Pese uma quantidade de amostra que contenha aproximadamente 1,6 mg de sacarina. Dissolva em água e transfira para balão volumétrico de 200 mL. Filtre em membranas filtrantes de 0,45 µm. Injete 5 µL da solução-padrão de trabalho no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicata para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 5 µL da amostra em triplicata. Cálculo Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão 244 - IAL Capítulo V - Aditivos Referência bibliográfica ABREU, R.W., OLIVEIRA, I.R.; ZENEBON, O. Quantificação de aspartame por cromatografia líquida de alta resolução (CLAR) em pós para o preparo de sobremesas. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 53 (1/2), p. 77-80, 1993. 131/IV Edulcorantes – Determinação de sucralose por cromatografia líquida de alta eficiência Este método é aplicado para a determinação da sucralose pura e em adoçantes. Material Balança analítica, cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector de índice de refração, coluna analítica (Lichrospher 100 RP-18 ou equivalente), integrador, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm de diâmetro de poro ou equivalente, filtros descartáveis de 0,45 µm de diâmetro de poro ou equivalente, bomba de vácuo para filtração da fase móvel, balões volumétricos de 25 e 1000 mL, proveta de 200 mL, seringas de vidro de 5 mL, sistema de filtração de fase móvel (Millipore ou equivalente). Reagentes Acetonitrila grau CLAE Água ultra pura Padrão analítico de sucralose Fase móvel – Adicione 150 mL de acetonitrila a 850 mL de água. Homogeneíze, filtre através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Solução-padrão – Pese, com precisão, 100 mg de sucralose em um balão volumétrico de 100 mL. Dissolva e complete o volume com a fase móvel. Filtre com filtros de 0,45 µm. Procedimento – Pese uma quantidade da amostra que contenha aproximadamente 100 mg de sucralose. Transfira para balão volumétrico de 100 mL, dissolva e complete o volume com a fase móvel. Filtre com filtros de 0,45 µm. Ajuste o fluxo da fase móvel para que o tempo de retenção da sucralose esteja em torno de 9 minutos (geralmente 1,5 mL/min). Trabalhe em temperatura ambiente. Injete 20 µL do padrão no cromatógrafo ajustado às condições experimentais estabelecidas. Efetue a operação em triplicada para verificar a repetitividade. A diferença não deve ser maior que 2%. Injete 20 µL da amostra em triplicata. IAL - 245 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo Calcule o teor de edulcorante na amostra analisada por meio das áreas dos picos obtidos nos cromatogramas. Cp = concentração do padrão em mg/mL Ca = concentração da amostra em mg/mL Aa = área do pico da amostra Ap = área do pico do padrão Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX Food Chemicals Codex. 4. ed; Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 398-399. 132/IV Espessantes – Extração de gomas em alimentos As gomas podem ser identificadas em formulações de aditivos ou em alimentos nos quais é permitido seu uso, com reações características e diferentes reagentes. Material Balança semi-analítica, centrífuga, banho-maria, provetas graduadas de 50, 100 e 200 mL, pipeta graduada de 1 mL, béqueres de 100, 250 e 500 mL, balão volumétrico de 100 mL, tubo de centrífuga e vidro de relógio. Reagentes Dioxano Álcool Éter Ácido tricloroacético Cloreto de sódio Solução de ácido tricloroacético a 50% m/v – Dissolva 50 g de ácido tricloroacético em água suficiente para 100 mL. Solução aquosa saturada de cloreto de sódio – Utilize o sobrenadante. 246 - IAL Capítulo V - Aditivos Procedimento – Pese 50 g da amostra. Adicione 150 mL de dioxano, coloque em tubo de centrifuga e extraia usando centrifugação a 1800 rpm para separar o solvente. Extraia novamente o resíduo com 30 mL de éter, agitando vigorosamente. Decante o éter. Seque o resíduo em banho-maria. Adicione 50 mL de água a 80°C. Agite vigorosamente a fim de dispersar o resíduo. Adicione 20 mL de ácido tricloroacético a 50%. Agite. Centrifugue a 1200 rpm, durante 10 minutos. Decante a solução através de papel de filtro para outro tubo de centrifugação. Adicione 100 mL de álcool e 1 mL da solução saturada de cloreto de sódio. Deixe em repouso durante a noite. Havendo formação de precipitado, há presença de goma. Decante. Purifique o precipitado dissolvendo novamente em 30 mL de água a 80°C e reprecipite com álcool e solução saturada de cloreto de sódio. Decante, despreze o álcool e redissolva o precipitado em água a 80°C, resfrie, e use esta solução para as reações de identificação. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 121. 133/IV Espessantes – Extração de gomas em formulações de aditivos Material Balança semi-analítica, banho-maria, provetas graduadas de 50, 100 e 200 mL, pipeta graduada de 1 mL, béquer de 500 mL e vidro de relógio. Reagentes Álcool Cloreto de sódio Solução aquosa saturada de cloreto de sódio – Utilize o sobrenadante. Procedimento – Pese 10 g da amostra, aumentando ou diminuindo essa quantidade se o teor de goma for menor ou maior que 1% e dissolva em 100 mL de água a 80°C em um béquer de 500 mL. Adicione, com agitação, 1 mL de solução saturada de cloreto de sódio e 300 mL de álcool. Se houver precipitação, indica a presença de gomas. Deixe em repouso durante a noite, cobrindo o béquer com vidro de relógio. Decante. Purifique o precipitado redissolvendo em 100 mL de água a 80°C, e reprecipitando com álcool e solução saturada de cloreto de sódio como anteriormente. Decante, despreze a fase alcoólica, redissolva o precipitado em água a 80°C, resfrie, e use esta solução para as reações de identificação. IAL - 247 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 134/IV Espessantes – Identificação de goma guar Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de bórax a 4% m/v Solução de ácido tânico a 10% m/m Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 0132/IV ou 0133/IV ou a 5 mL de uma solução a 0,5 % m/v da goma, adicione 2 mL de solução de bórax. A formação de um gel confirma a presença de goma guar. 2. Adicione 2 mL de solução de ácido tânico a 10% m/v e visualize a formação de um precipitado. Referências bibliográficas GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, São Paulo, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 135/IV Espessantes – Identificação de goma carragena (musgo irlandês) Material Balança semi-analítica, estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1 e 5 mL, balão volumétrico de 100 mL e proveta de 100 mL. Reagentes Cloreto de bário Azul de metileno Solução aquosa saturada de cloreto de bário – Utilize o sobrenadante. Solução aquosa de azul de metileno a 0,5% m/v. 248 - IAL Capítulo V - Aditivos Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 0132/IV ou 0133/IV ou a 5 mL de uma solução a 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução saturada de cloreto de bário. Há a formação de um precipitado branco gelatinoso. 2. Adicione algumas gotas de azul de metileno a 0,5%.m/v. A precipitação de fibras coloridas de púrpura indica a presença de goma carragena. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS. Food Chemicals Codex. 3. ed; Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 74. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press. 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 136/IV Espessantes – Identificação de goma arábica (acácia) Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Sub-acetato de chumbo Indicador vermelho congo Solução aquosa de sub-acetato de chumbo – Triture 14 g de monóxido de chumbo com 10 mL de água, transfira para um frasco lavando com mais 10 mL de água. Dissolva 22 g de acetato de chumbo em 70 mL de água e adicione esta solução na mistura de monóxido de chumbo. Agite vigorosamente por cinco minutos. Guarde esta mistura durante sete dias, agitando freqüentemente. Filtre para um balão volumétrico de 100 mL, lave o filtrado com água, esfrie e complete o volume com água recentemente fervida. Dilua 3,25 mL desta solução em 100 mL de água recentemente fervida. Solução aquosa de indicador vermelho congo a 0,5% m/v. IAL - 249 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução a 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de sub-acetato de chumbo. Forma-se um precipitado branco floculento. 2. Adicione algumas gotas de solução de vermelho congo. Forma-se um precipitado fino azul-escuro. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 7, 561. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 137/IV Espessantes – Identificação de alginato de sódio Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Ácido sulfúrico Cloreto de cálcio Solução de acido sulfúrico 4 M Solução de cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) a 7,5% m/v Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL da solução de cloreto de cálcio. Forma-se um gel levemente branco. 2. Adicione 2 mL de solução de ácido sulfúrico. Forma-se um gel. 250 - IAL Capítulo V - Aditivos Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 274. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13 ,n. 1, p. 21-24, 2003. 138/IV Espessantes – Identificação de goma Konjak Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de bórax a 4% m/v Solução de hidróxido de potássio a 10% m/v Procedimentos 1. Em um tubo de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/ IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de bórax a 4% m/v. Forma-se um precipitado. 2. Adicione 2 mL de solução de hidróxido de potássio. Forma-se um gel rígido. Referências bibliográficas GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. IAL - 251 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 139/IV Espessantes – Identificação de agar-agar Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de sub-acetato de chumbo, triture 14 g de monóxido de chumbo com 10 mL de água, transfira para um frasco, lavando com mais 10 mL de água. Dissolva 22 g de acetato de chumbo em 70 mL de água e adicione esta solução na mistura de óxido de chumbo. Agite vigorosamente por 5 minutos. Guarde esta mistura durante 7 dias, agitando freqüentemente. Filtre, para um balão volumétrico de 100 mL, lave o filtrado com água, esfrie e complete o volume com água recentemente fervida. Dilua 3,25 mL desta solução em 100 mL de água recentemente fervida. Solução de indicador vermelho congo a 0,5% m/v. Solução de azul de metileno a 1 % m/v Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de solução de sub-acetato de chumbo. Forma-se um precipitado floculento com gel. 2. Adicione algumas gotas de solução de indicador vermelho-congo. Forma-se um precipitado fino azul-escuro. 3. Adicione algumas gotas de solução de azul de metileno a 1% m/v. Forma-se um precipitado de cor púrpura. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 74, 561. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. 252 - IAL Capítulo V - Aditivos Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 140/IV Espessantes – Identificação de goma jataí Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de bórax a 4% m/v Solução de acetato de chumbo a 20% m/v – Dissolva o sal em água, aqueça até a ebulição, esfrie e utilize a solução sobrenadante. Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 0132/IV ou 0133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de solução de bórax. Forma-se um gel. 2. Adicione 2 mL de solução de acetato de chumbo. Forma-se um precipitado floculento branco. Referências bibliográficas GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 141/IV Espessantes – Identificação de carboximetilcelulose Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. IAL - 253 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução aquosa de sulfato cúprico a 12,5% m/v Solução aquosa de acetato de chumbo a 20% m/v – Dissolva o sal em água, aqueça até a ebulição, esfrie e utilize a solução sobrenadante. Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de sulfato cúprico. Forma-se um precipitado branco-azulado. 2. Adicione 2 mL de solução de acetato de chumbo. Forma-se um gel floculento. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 280. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A.; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 142/IV Espessantes – Identificação de pectina Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de cloreto de cálcio a 7,5% m/v Solução de acetato de chumbo a 20% m/v – Dissolva o sal em água, aqueça até a ebulição, esfrie e utilize a solução sobrenadante. 254 - IAL Capítulo V - Aditivos Solução saturada de cloreto de bário – Utilize o sobrenadante. Solução de sulfato cúprico a 12,5% m/v Procedimentos 1. Em um tubo de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 132/ IV ou 133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de acetato de chumbo. Forma-se um gel. 2. Adicione 2 mL de solução de cloreto de cálcio. Forma-se um gel. 3. Adicione 2 mL de solução saturada de cloreto de bário. Formam-se partículas floculentas em suspensão. 4. Adicione 2 mL de solução de sulfato cúprico a 12,5% m/v. Formam-se partículas brancas em suspensão. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 280. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, A. I.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 143/IV Espessantes – Identificação de goma xantana Material Estante para tubos de ensaio, tubos de ensaio e pipetas graduadas de 1 e 5 mL. Reagentes Solução de sub-acetato de chumbo – Triture 14 g de monóxido de chumbo com 10 mL de água, transfira para um frasco, lavando com mais 10 mL de água. Dissolva 22 g de IAL - 255 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital acetato de chumbo em 70 mL de água e adicione esta solução na mistura de óxido de chumbo. Agite vigorosamente por 5 minutos. Guarde esta mistura durante 7 dias, agitando freqüentemente. Filtre, para um balão volumétrico de 100 mL, lave o filtrado com água, esfrie e complete o volume com água recentemente fervida. Dilua 3,25 mL desta solução em 100 mL de água recentemente fervida. Solução aquosa de acetato de chumbo a 20% m/v – Dissolva o sal em água, aqueça até a ebulição, esfrie e utilize a solução sobrenadante. Procedimentos 1. Em tubos de ensaio contendo aproximadamente 10 mL do extrato obtido em 0132/IV ou 0133/IV ou a 5 mL de uma solução 0,5% m/v da goma, adicione 2 mL de solução de acetato de chumbo. Forma-se um gel floculento. 2. Adicione 2 mL de solução de sub-acetato de chumbo. Forma-se um gel. Referências bibliográficas COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 3. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 7, 561. GLICKSMAN, M. Gum Technology in the Food Industry. New York: Academic Press, 1969. 590 p. KIMURA, I.A.; ALABURDA, J.; MARTINS, M.S.; DIAS, N.A; MICHELATO, S.R. Análise de gomas em aditivos alimentares. Bol. Inst. Adolfo Lutz, ano 13, n. 1, p. 21-24, 2003. 144/IV Estabilizantes – Determinação de fosfatos, em P2O5, por gravimetria Em amostras de aditivos contendo tripolifosfatos, hexametafosfatos, pirofosfatos, etc., pode-se fazer a determinação do teor de fósforo (em P2O5) por meio de técnica gravimétrica ou colorimétrica (espectrofotometria na região do visível). Quando o teor de P2O5 for superior a 50%, recomenda-se utilizar o método gravimétrico. Material Balança analítica, balança semi-analítica, chapa elétrica, bomba para filtração a vácuo, estufa, béqueres de 250, 400 e 600 mL, funil de vidro, provetas graduadas de 50, 100 e 250 mL, vidro de relógio, balões volumétricos de 500 e 1000 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, pipetas volumétricas de 5, 256 - IAL Capítulo V - Aditivos 20 e 25 mL, cadinho filtrante de vidro com capacidade de 30 mL e porosidade fina (n°4) e kitassato de 500 mL. Reagentes Ácido nítrico Molibdato de sódio Ácido cítrico Quinolina sintética Acetona Solução de Quimociac – Dissolva 70 g de molibdato de sódio (Na2MoO4.2H2O) em 150 mL de água (solução A). Dissolva 60 g de ácido cítrico numa mistura de 85 mL de ácido nítrico e 150 mL de água e deixe esfriar (solução B). Gradualmente, adicione a solução A na solução B, com agitação, para produzir a solução C. Dissolva 5 mL de quinolina sintética numa mistura de 35 mL de ácido nítrico e 100 mL de água (solução D). Gradualmente, adicione a solução D na solução C, misture bem e deixe em repouso uma noite. Filtre a mistura recolhendo em um balão volumétrico de 1000 mL, adicione 280 mL de acetona no filtrado, complete o volume e homogeneíze. Guarde em frasco de polietileno. Procedimento – Pese, com precisão, 800 mg da amostra num béquer de 400 mL. Adicione 100 mL de água e 25 mL de ácido nítrico e tampe com um vidro de relógio. Ferva por 10 minutos numa chapa elétrica. Lave o vidro de relógio recolhendo a água de lavagem no béquer e esfrie a solução até a temperatura ambiente. Transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 500 mL, complete o volume com água e homogeneíze. Transfira uma alíquota de 20 mL num frasco Erlenmeyer de 500 mL, adicione 100 mL de água e aqueça até a ebulição. Adicione, com agitação, 50 mL de solução de Quimociac, cubra com vidro de relógio e ferva por 1 minuto dentro de uma capela. Esfrie até a temperatura ambiente, agitando de vez em quando, durante o resfriamento. Filtre em um cadinho de vidro de placa porosa nº 4, previamente tarado a 225°C, e lave o precipitado com 5 porções de 25 mL de água. Seque na estufa a 225°C por 30 minutos, esfrie e pese. Cálculo Cada mg de precipitado obtido é equivalente a 32,074 µg de P2O5. Referência bibliográfica COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS. Food Chemicals Codex. 3. ed., IAL - 257 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Washington D.C.: National Academic Press, 1981. p. 370. 145/IV Estabilizantes – Determinação de fosfatos, em P2O5, por espectrofotometria Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, banho de areia, béqueres de 50 e 400 mL, tubos de ensaio, balões volumétricos de 10, 100, 250, 500 e 1000 mL, pipeta graduada de 5 mL e pipetas volumétricas de 5 e 50 mL. Reagentes Fosfato ácido de potássio Molibdato de amônio Vanadato de amônio Ácido nítrico Ácido sulfúrico Solução-padrão de fosfato – Dissolva 0,9587 g de fosfato ácido de potássio (KH2PO4), previamente seco em estufa a 105°C por 1 hora, em água e transfira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume. Transfira 50 mL para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com água (1 mL desta solução contém 0,2 mg de P2O5). Reagente e vanado-molibdato de amônio – Dissolva, separadamente, 20 g de molibdato de amônio, (NH4)6Mo7O24.4H2O, em água quente e 1 g de vanadato de amônio (NH4VO3) também em água quente, filtrando se necessário. Misture as soluções, acidifique com 140 mL de ácido nítrico e dilua para 1 litro. Procedimento – Em um tubo de ensaio, pese uma quantidade de amostra cuja concentração final de P2O5 esteja dentro dos valores da curva-padrão. Adicione 4 gotas de ácido sulfúrico e 2 mL de ácido nítrico. Faça um branco dos reagentes. Aqueça em banho de areia até completa carbonização da amostra. Faça as diluições necessárias e transfira uma alíquota para um balão volumétrico de 10 mL. Adicione 2,5 mL de vanado-molibdado de amônio em cada balão, complete o volume com água e espere 10 minutos. Ajuste o zero do espectrofotômetro, em unidades de absorbância a 420 nm, utilizando um branco contendo 2,5 mL de vanado-molibdato de amônio em 10 mL de água e cubetas de 1 cm. Determine a absorbância a 420 nm usando o branco dos reagentes e determine a quantidade de P2O5 correspondente, utilizando a curva-padrão previamente estabelecida. 258 - IAL Capítulo V - Aditivos Preparação da curva-padrão – Coloque em uma série de balões volumétricos de 10 mL, volumes da solução-padrão equivalente aos valores entre 0,02 e 0,4 mg de P2O5 em 10 mL. Adicione 2,5 mL de vanado-molibdato de amônio em cada balão, complete o volume com água e espere 10 minutos. Determine a absorbância a 420 nm usando o branco dos reagentes à temperatura ambiente. Construa o gráfico concentração de fosfato em mg/10 mL x absorbância. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p 33. 146/IV Estabilizantes – Determinação de fluoretos em fosfatos por potenciometria O método destina-se à determinação de fluoretos em fosfatos utilizados como aditivos para alimentos, por potenciometria direta, utilizando eletrodo seletivo de íon fluoreto. O método baseia-se na destilação prévia do íon fluoreto na amostra, para eliminar a matriz interferente, e posterior determinação deste íon por potenciometria direta, com eletrodo seletivo de fluoreto. Alguns cátions como Al3+, Fe3+, Si4+ e outros polivalentes interferem na determinação de fluoretos, uma vez que formam complexos. O grau de complexação depende da constante de formação do complexo, da concentração do agente complexante, da concentração total do íon fluoreto, do pH e da força iônica total da solução. Os ânions, de maneira geral, não interferem na resposta do eletrodo seletivo de fluoreto, com exceção do íon hidroxila. Alguns ânions, como CO32- ou PO43-, não interferem diretamente na leitura do eletrodo, porém aumentam a concentração de OHdo meio, tornando assim necessária a destilação da amostra. O pH da solução de leitura também é um parâmetro importante e deve estar entre 5,0 e 5,5, pois abaixo desse valor ocorre a formação de HF não dissociado e do íon HF2 e, acima desse pH, ocorre a interferência devido ao íon OH . Por esse motivo, é necessário adicionar tanto aos padrões quanto às amostras, no momento da determinação potenciométrica de fluoretos, uma alíquota adequada de uma solução de TISAB, a fim de manter a força iônica elevada, o íon fluoreto livre em solução e o pH da solução ajustado. Material Analisador de íons (potenciômetro para uso com eletrodo seletivo), eletrodo seletivo de fluoreto combinado, agitador magnético, balança analítica, manta elétrica aquecedora, termômetro, suportes, garras, condensador de Liebig, balão de fundo redondo de 125 mL com saída lateral (para destilação), alonga para destilação, funil de separação tipo pêra de 125 mL com haste alongada, balões volumétricos de 1000, 200, 100 e 50 mL, pipetas voIAL - 259 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital lumétricas, béqueres de polietileno. Limpeza da vidraria – Para evitar contaminação da amostra e diminuir o valor do branco, o balão de destilação deve passar pelo seguinte procedimento de limpeza: lave com solução de hidróxido de sódio a 10%, a quente e enxágüe com água destilada e deionizada. Coloque no balão 15 a 20 mL de ácido sulfúrico (1:2) e aqueça até o desprendimento de fumaça (usar a capela). Esfrie, descarte o ácido, trate o balão novamente com solução de hidróxido de sódio a 10% e enxágüe bem com água. Reagentes Ácido sulfúrico Solução de hidróxido de sódio a 10% m/v Ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N’N’-tetracético - C14H22N2O8.H2O (Titriplex IV) Solução-padrão estoque de fluoreto 100 mg/L – Pese 221 mg de fluoreto de sódio anidro, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Estoque esta solução em frasco de polietileno. Solução-padrão estoque intermediária de fluoreto 10 mg/L – Prepare, a partir da soluçãopadrão estoque, diluindo com água destilada e desmineralizada. Estoque em frasco de polietileno. Solução de TISAB – Pese 58 g de cloreto de sódio, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL, adicione 57 mL de ácido acético glacial, 4 g de titriplex IV, ajuste o pH desta solução a 5,0-5,5 com solução de hidróxido de sódio 5 M e complete o volume com água. Nota: a água utilizada para o preparo de todas as soluções deve ser destilada e deionizada. Procedimento – Transfira 8 g da amostra previamente homogeneizada, 10 mL de ácido sulfúrico concentrado, 30 mL de água e algumas pérolas de vidro para um balão de destilação conectado a um condensador de Liebig. Na boca do balão adapte uma rolha pela qual se introduz um funil de separação (com haste alongada para que o gotejamento seja lento e próximo à solução) e um termômetro, o qual deve estar mergulhado na solução. Coloque o balão na manta de aquecimento para fazer a destilação e recolha o destilado em frasco plástico. Durante a destilação, quando a temperatura atingir 140°C, adicione água lentamente através do funil de separação para manter a temperatura entre 130 e 140°C. Destile durante 3 horas contadas a partir do momento em que a temperatura atingiu 140°C, ou até que o volume do destilado esteja próximo de 200 mL. Transfira o destilado quantitativamente para balão volumétrico de 200 mL, complete o volume com 260 - IAL Capítulo V - Aditivos água e em seguida transfira para um frasco de polietileno. Ajuste o aparelho analisador de íons e, calcule o slope do eletrodo, conforme o recomendado no manual do fabricante. Em balão volumétrico de 50 mL, pipete uma alíquota adequada da amostra (de tal forma que a leitura esteja compreendida na curva-padrão) e 15 mL de TISAB. Complete o volume com água desmineralizada. Transfira para béqueres de polietileno. Faça a leitura da concentração, mantendo as mesmas condições experimentais da curva-padrão. Teste do eletrodo (cálculo do slope) – Calcule o slope da maneira recomendada no manual do eletrodo. O slope (tangente de curva log [ F- ] x E), corresponde à variação do potencial (E) quando a concentração do fluoreto varia 10 vezes. Curva-padrão – Pipete, em balões volumétricos de 50 mL, alíquotas adequadas da solução-padrão estoque de fluoreto. As concentrações podem variar de acordo com a sensibilidade e a faixa linear de trabalho do equipamento. A cada balão adicione 15 mL de TISAB e complete o volume com água deionizada. Transfira as soluçõespadrão para béqueres de polietileno e faça a leitura da concentração, sob agitação não turbulenta. Notas As soluções-padrão devem ser preparadas no momento da leitura. Lave o eletrodo com água entre cada leitura e enxágüe-o com a próxima solução a ser lida. Cálculo c = concentração de fluoretos na solução de leitura, em mg/L V = volume do destilado, em mL V1 = volume do balão de leitura, em mL V2 = alíquota da amostra utilizada para leitura, em mL m = massa da amostra, em g Limite de quantificação do equipamento = 0,1 mg/L Limite de quantificação do método = 5 mg/kg (levando em consideração a diluição da amostra) Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th, Arlington: A.O.A.C., 1996, chapter 9. p. 11-15. IAL - 261 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital COMMITEE ON CODEX SPECIFICATIONS Food Chemicals Codex. 4. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1996. p. 758-760. 147/IV Estabilizantes – Determinação de mono e diglicerídios e glicerol livre Os mono e diglicerídios são formados por uma mistura de mono, di e triésteres de glicerol com ácidos graxos comestíveis. Este método determina somente o teor de monoéster, podendo ser utilizado em produtos puros ou em formulações. Quando estiver em mistura com gomas estas devem ser separadas por filtração antes da etapa da extração. O princípio do método analítico para determinação de mono e diglicerídios e glicerol livre está baseado nas seguintes reações químicas: O \\ H2C-O-C-C17H35 | H-C-OH + | H2C-OH H5IO6 → O \\ H2C-O-C-C17H35 H | \ H-C=O + C=O + HIO3 + 3H2O / H monoestearato de glicerila (extrato orgânico) H2 C-OH | H-C-OH | H2C-OH + H / 2 H5IO6 → C=O \ H H \ + C=O + 2 HIO3 + 6 H2O | C=O H glicerol (extrato aquoso) Na titulação acontecem as seguintes reações: H5IO6 + HIO3 + 12KI + 12CH3COOH → 7I2 + 9H2O + 12CH3COOK (amostra) H5IO6 + 7KI + 7 CH3COOH → 4I2 + 6 H2O + 7 CH3COOK (branco) 2Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2NaI (titulação) 262 - IAL Capítulo V - Aditivos Material Balança analítica, balança semi-analítica, banho-maria, papel de filtro (se necessário), béquer de 50 mL, bastão de vidro, proveta de 50 mL, funil de separação tipo pêra de 250 mL, pipetas graduadas de 5, 10 e 20 mL, pipetas volumétricas de 25 ou 50 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa, bureta de 25 ou 50 mL e funil de vidro, se necessário. Reagentes Tiossulfato de sódio Acetato de etila Sulfato de sódio Ácido acético glacial Ácido periódico H5IO6 Iodeto de potássio Amido Solução de Na2S2O3 0,4 M Solução de amido 0,5% m/v Solução de sulfato de sódio a 10% m/v – Dissolva 100 g de Na2SO4 em água suficiente para 1000 mL. Solução de ácido acético e periódico – Dissolva 11 g de ácido periódico em 200 mL de água e complete o volume para 1000 mL com ácido acético. Solução de iodeto de potássio a 25% m/v – Dissolva 25 g de KI em água suficiente para 100 mL. Procedimento -- Pese, com precisão, em um béquer de 50 mL, certa quantidade de amostra calculada de acordo com a seguinte fórmula: massa de amostra = 30/% de monoéster esperado na amostra. Dissolva a amostra com pequenos volumes de acetato de etila, triturando-a após cada adição com bastão de vidro. Transfira cada um dos volumes do sobrenadante para um funil de separação, filtrando se necessário, até a dissolução total dos monoglicerídios em 50 mL do solvente. Extraia com três porções de 15 mL de Na2SO4 a 10% agitando vigorosamente após cada adição e colete o extrato aquoso, da camada inferior do funil de separação, em um frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa. Receba o extrato em acetato de etila da camada superior, em outro frasco Erlenmeyer. Lave o funil de separação IAL - 263 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital com duas porções de 5 mL de ácido acético, recebendo-as no frasco Erlenmeyer com o extrato em acetato de etila. Prepare uma prova em branco com 50 mL de acetato de etila e 10 mL de ácido acético em um terceiro frasco Erlenmeyer. Adicione 50 mL de solução de ácido acético-periódico nos três frascos Erlenmeyer, tampe-os, agite-os bem e coloque-os em banho-maria por 45 minutos no escuro, em temperatura não superior a 50°C. Após este tempo, retire os respectivos frascos do banho-maria, adicione 10 mL de solução de KI a 25% em cada um e titule-os com solução de Na2S2O3 0,4 M, usando amido como indicador. Nota: no caso de se usar 25 mL de solução de ácido acético-periódico e titular com bureta de 25 mL, utilize metade da massa calculada acima. Cálculo Nota: utilize os fatores 2,68 e 2,99, para expressar o resultado, respectivamente, em α-monoacetato de glicerila e α-monoestearato de sorbitana Nota: utilize os fatores 1,52 e 1,21, para expressar o resultado, respectivamente, em propilenoglicol livre e sorbitol livre B= mL de Na2S2O3 0,4 M, gastos na prova em branco. A= mL de Na2S2O3 0,4 M, gastos na titulação da amostra f = fator da solução de Na2S2O3 0,4 M P= massa da amostra Referência bibliográfica CRAM, D.J.; HAMMOND, G.S. Organic Chemistry, Mc Graw-Hill Book Company Inc. 1964. p. 546-547. 148/IV Realçador de sabor – Identificação de glutamato de sódio Material Pipeta de 1 mL, proveta de 50 mL, béquer de 100 mL, banho-maria, balança analítica e balão volumétrico de 100 mL. 264 - IAL Capítulo V - Aditivos Reagentes Ninidrina (tricetohidrindeno hidratado) – Dissolva 200 mg de tricetohidrindeno hidratado (C9H4O3 H2O) em água até 100 mL. Prepare a solução no dia do uso. Acetato de sódio Procedimento – A 1 mL da solução aquosa da amostra diluída em 1:30 (em glutamato de sódio), adicione 1 mL de ninidrina e 100 mg de acetato de sódio e aqueça em banho-maria por 10 min. Uma intensa cor violeta azulada é formada. Referência bibliográfica COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX. Food Chemicals Codex. 4. ed., Washington D.C.: National Academic Press, 1996. p. 260. 149/IV Identificação de bromatos pelo método direto O bromato é identificado direta ou indiretamente em preparados para produtos de panificação, melhoradores de farinha ou outras formulações de aditivos para panificação. Material Balança semi-analítica, agitador magnético, barra magnética, rotavapor, placas para cromatografia em camada delgada de sílica gel 60G, papel de filtro qualitativo, béqueres de 100, 250 e 1000 mL, bastão de vidro, funil de vidro, provetas de 25, 50 e 200 mL, tubo capilar de vidro para cromatografia, cuba de vidro para cromatografia e pulverizador. Reagentes Butanol Propanol Álcool Orto-tolidina Sulfato de zinco Ácido clorídrico Hidróxido de sódio Bromato de potássio Solução de bromato de potássio a 1% m/v. IAL - 265 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução de orto-tolidina a 0,02% em álcool Solução de ácido clorídrico em álcool na proporção 25:65 Solução de sulfato de zinco 20 g/L. Solução de hidróxido de sódio 0,4 M Antiespumante: por exemplo, dimetil silicone Procedimento - Para amostras sólidas ou em pastas, siga o procedimento: transfira 200 mL da solução de sulfato de zinco 20 g/L para um béquer de 1000 mL. Agite em agitador magnético com velocidade constante. Adicione aproximadamente 50 g da amostra, mantendo a agitação. Adicione 50 mL da solução de hidróxido de sódio 0,4 M. Continue agitando por mais 15 minutos. Filtre em papel de filtro qualitativo. Concentre o filtrado em rotavapor com temperatura não superior a 70°C. Adicione, se necessário, uma gota de antiespumante ao filtrado. Reduza até um volume inferior a 50 mL. Aplique o concentrado, paralelamente ao padrão, em placa de camada delgada de sílica gel 60 G, numa cuba previamente saturada com a fase móvel butanol-propanol-água na proporção de 1:3:1. Revele o cromatograma seqüencialmente com a solução de o-tolidina a 0,02% e ácido clorídrico em álcool na proporção de 25:65. Na presença de bromato aparecerá uma mancha amarela em Rf 0,64, aproximadamente. Para amostras líquidas, aplique diretamente na placa de camada delgada e proceda como descrito acima. Referência bibliográfica YABIKU, H.Y.; KIMURA, I.A.; DIAS, N. A.; MARSIGLIA, D.A.P.; ZENEBON, O. Bromato de potássio em farinha de trigo e melhoradores de panificação. Bol. Inst. Adolfo Lutz, São Paulo, ano 6, n. 1, p. 4-6, 1996. 150/IV Identificação de bromatos pelo método indireto com o reativo fucsina-bissulfito Após a incineração da amostra, é realizada a identificação do brometo formado pela decomposição térmica do bromato. Material Balança semi-analítica, mufla, cápsula de porcelana, béquer de 50 mL, bastão de vidro, pipetas graduadas de 1 e 5 mL e agitador magnético com barra magnética Reagentes Água oxigenada Ácido sulfúrico Fucsina 266 - IAL Capítulo V - Aditivos Ácido sulfúrico 10% m/v Água oxigenada 30% m/v Solução de brometo de potássio a 1% m/v Solução descorada de fucsina a 0,1% m/v – Dissolva 0,1 g de fucsina em pequenas porções de água, triturando-a com bastão de vidro, até atingir 100 mL. Adicione, com agitação, bissulfito de sódio em pó até descorar totalmente a solução. Caso a solução não descore totalmente, filtre em papel de filtro contendo carvão ativado. Procedimento – Incinere, aproximadamente, 50 g de amostra em uma cápsula de porcelana em mufla a 550°C. Dissolva as cinzas obtidas em volume de ácido sulfúrico a 10% m/v suficiente para sua dissolução, agitando com bastão de vidro. Filtre, se necessário. Em seguida, adicione 2 mL de água oxigenada a 30% e 3 mL do reativo fucsina-bissulfito. Agite e aguarde aproximadamente 5 minutos. O aparecimento de coloração lilás persistente, que pode aparecer em até 24 horas, indica a presença de brometos formados pela decomposição térmica do bromato. Faça paralelamente uma prova em branco com água e uma prova com o padrão de brometo de potássio a 1%. Referência bibliográfica YABIKU, H.Y.; KIMURA, I.A.; DIAS, N. A.; MARSIGLIA, D.A.P.; ZENEBON, O. Bromato de potássio em farinha de trigo e melhoradores de panificação. Bol. Inst. Adolfo Lutz, São Paulo, ano 6, n. 1, p. 4-6, 1996. 151/IV Identificação de bromatos por método indireto com fluoresceína Material Balança semi-analítica, mufla, estufa, cápsula de porcelana, placas para cromatografia em camada delgada de sílica gel 60 G, papel de filtro qualitativo, béqueres de 100 e 250 mL, bastão de vidro, funil de vidro, provetas de 25, 50 e 200 mL, tubo capilar de vidro para cromatografia, cuba de vidro para cromatografia e pulverizador. Reagentes Fase móvel: butanol-acetona-hidróxido de amônio (1:3:1) Solução de ácido acético glacial- água oxigenada a 30% (10:1), recém preparada Solução-padrão de brometo de potássio a 1% m/v Solução alcoólica de fluoresceína a 0,01% m/v – Dissolva 0,01g de fluoresceína em álcool a 50% até completar 100 mL. IAL - 267 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Incinere, aproximadamente, 50 g da amostra em uma cápsula de porcelana. Dissolva as cinzas em 10 mL de água. Filtre ou transfira o sobrenadante para outra cápsula de porcelana, reservando alguns mL para a cromatografia em camada delgada. Adicione uma gota de solução de fluoresceína a 0,01%, seguida de uma gota da mistura de ácido acético glacial em água oxigenada e evapore em banho-maria até à secura. Faça, paralelamente, uma prova em branco utilizando água. O aparecimento de uma coloração rósea persistente pode indicar a presença de brometos. Para confirmação, aplique a porção restante do sobrenadante em placa de camada delgada de sílica gel 60 G com a fase móvel butanol-acetona-hidróxido de amônio (1:3:1), correndo paralelamente o padrão de brometo de potássio a 1%. Revele com a mistura de partes iguais das soluções de fluoresceína a 0,01% e ácido acético em água oxigenada. Coloque em estufa a 105°C, até o aparecimento de manchas. Na presença de brometo aparecerá uma mancha rósea em Rf aproximado de 0,65, a qual pode aparecer em até 24 horas. Referência bibliográfica YABIKU, H.Y.; KIMURA, I.A.; DIAS, N. A.; MARSIGLIA, D.A.P.; ZENEBON, O. Bromato de potássio em farinha de trigo e melhoradores de panificação. Bol. Inst. Adolfo Lutz, São Paulo, ano 6, n. 1, p. 4-6, 1996. 152/IV Determinação de arsênio em aditivos O método baseia-se, fundamentalmente, na liberação de arsina (um gás de odor desagradável extremamente venenoso) a qual é absorvida em uma solução de dietilditiocarbamato de prata, formando um complexo de cor vermelha, cuja intensidade pode ser estimada a olho nu ou espectrofotometricamente. As reações envolvidas são: As+5 + Sn+2 → As+3 + Sn+4 (redução do As+5 → As+3) Zn0 + 2H+ → Zn+2 + H2→ (produção de H2 com adição de zinco metálico) 2 As+3 + 3 H2 →2 AsH3 (formação de arsina) AsH3 + 6 (C2H5)2NCSSAg → 6 Ag + 3 (C2H5)2NCSSH + [(C2H5)2NCSS]3As (complexo vermelho) Os metais ou sais de metais, a seguir mencionados, interferem na liberação da arsina: cromo, cobalto, cobre, mercúrio, molibdênio, níquel, paládio e prata. O antimônio, que forma a estibina, (SbH3) é o elemento que pode produzir interferência positiva, porque dá cor com o dietilditiocarbamato de prata. A estibina forma um complexo que tem máximo de absorção a 510 nm; entre 535 e 540 nm, a absorbância deste 268 - IAL Capítulo V - Aditivos complexo é diminuída de tal maneira que os resultados de dosagem do arsênio não são alterados de uma maneira significativa. Por outro lado, o antimônio é igualmente tóxico e indesejável. Material Algodão hidrófilo, balança semi-analítica, aparelho para determinação de arsênio, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada 24/40, béqueres de 10, 50, 150 e 600 mL, provetas graduadas de 100 mL, provetas graduadas de 100 mL com tampa, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 3, 5 e 10 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL e frasco Kjeldahl de 800 mL. Reagentes Ácido sulfúrico Água oxigenada a 30% Ácido clorídrico Cloreto estanoso Iodeto de potássio Acetato de chumbo Piridina Dietilditiocarbamato de prata Trióxido de arsênio Hidróxido de sódio Zinco granulado isento de arsênio IAL - 269 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 2 - Aparelho para determinação de arsênio Solução-padrão estoque de arsênio – Pese, com precisão, 0,132 g de trióxido de arsênio finamente pulverizado e seco. Dissolva em 5 mL de solução (1:5) de NaOH. Neutralize a solução com ácido sulfúrico a 10% e adicione um excesso de 10 mL. Transfira para um balão volumétrico de 1 L e complete o volume com água recentemente fervida. Solução-padrão de trabalho de arsênio – No dia do uso, pipete 10 mL da solução-padrão estoque de arsênio para um balão volumétrico de 1000 mL, adicione 10 mL de ácido sulfúrico a 10% e complete o volume com água recentemente fervida. Esta solução contém 1 µg de arsênio por mL. Conserve-a por até três dias. Solução de dietilditiocarbamato de prata 0,5% em piridina – Pese 0,5 g de AgSCSN(C2H5)2 270 - IAL Capítulo V - Aditivos em um balão âmbar de 100 mL. Adicione piridina para dissolver e complete o volume. Conserve esta solução até um mês, em frasco âmbar. Solução de ácido sulfúrico a 10% m/v – Dilua, com as precauções habituais, 57 mL de ácido sulfúrico a 1000 mL com água. Solução de cloreto estanoso em ácido clorídrico - Dissolva 40 g de SnCl2.2H2O em 100 mL de ácido clorídrico concentrado. Conserve esta solução até três meses, em frasco de vidro. Solução de iodeto de potássio a 15% m/v - Dissolva 15 g de iodeto de potássio em 100 mL de água. Algodão contendo acetato de chumbo – Embeba o algodão hidrófilo em uma solução saturada de acetato de chumbo. Extraia o excesso de solução e seque sobre vidro à temperatura ambiente. Procedimento – Instale o aparelho conforme a Figura 2. Introduza no tubo de absorção, com auxílio de pinça, três tampões de algodão nesta ordem: um hidrófilo, um embebido em solução saturada de acetato de chumbo e outro hidrófilo. Dependendo da natureza da amostra, siga um dos seguintes procedimentos: no caso de substâncias orgânicas que, em meio clorídrico turvam, existe a necessidade da mineralização por via úmida; em caso contrário (por ex. ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, citrato de cálcio, etc), a mineralização não é necessária. Em presença de sais de ferro (por ex. pirofosfato de ferro, citrato férrico amoniacal, sacarato de ferro, etc) adicione 1 g de ácido ascórbico à solução de dosagem. O ácido ascórbico reduz e complexa o ferro que interfere na liberação da arsina. Para matérias-primas solúveis em meio clorídrico, calcule a massa necessária para comparação com um padrão conhecido de arsênio e dissolva de maneira a se obter sempre um volume final de (35 + 2) mL. Mineralização por via úmida – Numa proveta com tampa, adicione 30 mL de água oxigenada e 7 mL de ácido sulfúrico. Homogeneíze e deixe em repouso uma noite. Pese a massa de amostra necessária (Nota 3) e transfira para o frasco Kjeldahl com auxílio da mistura: água oxigenada/ácido sulfúrico. Aqueça até que toda a água oxigenada seja consumida (agite, de vez em quando). Esfrie. Caso a solução ainda esteja escura, adicione mais água oxigenada e aqueça novamente. Quando houver forte desprendimento de fumaças brancas (SO3) e a solução não mais escurecer, a mineralização está terminada. Lave 3 vezes o frasco Kjeldahl com água, aquecendo até reduzir o volume a mais ou menos 5 mL após cada adição (caso a solução escureça novamente, adicione mais água oxigenada, aqueça e lave novamente com água (três vezes). Esfrie o frasco e transfira a solução para um frasco Erlenmeyer de 500 mL IAL - 271 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de boca esmerilhada. Lave as paredes do frasco Kjedahl e transfira para o frasco Erlenmeyer com auxílio de água suficiente para completar o volume para 35 mL. Adicione, nesta ordem, nos frascos Erlenmeyer: 10 mL de ácido clorídrico, 2 mL da solução de KI e 0,5 mL da solução de cloreto estanoso. Conecte os tubos de absorção, agite e deixe repousar por 30 minutos à temperatura ambiente. Pipete 3 mL da solução de dietilditiocarbamato de prata em piridina nos tubos de absorção (parte superior). Após os 30 minutos, introduza 4 g de zinco granulado nos frascos Erlenmeyer, conecte rapidamente os tubos de absorção nestes frascos, agite e deixe a reação ocorrer durante 45 minutos à temperatura ambiente, compreendida entre 25°C e 35°C, com agitações casuais de 10 minutos. A liberação de hidrogênio deve ser regular e suficiente sem ser excessiva (a adição de uma pequena quantidade de isopropanol no frasco Enlermeyer pode melhorar e uniformizar a liberação do gás). Após os 45 minutos, compare a intensidade de coloração nos tubos de absorção da amostra, branco e padrão. A reação segue a Lei de Beer de 0 a 10 µg de arsênio. É possível estabelecer uma curva-padrão para um comprimento de onda máximo determinado entre 535 e 540 nm, com um espectrofotômetro ou colorímetro, usando a solução de dietiliditiocarbamato de prata em piridina como branco. Como a intensidade de coloração é muito instável, é importante que se faça a medida em temperatura constante, não inferior a (25 + 2)°C e logo após os 45 minutos, tanto para as amostras como para os padrões. Repetitividade: para comparação visual com os padrões desenvolvidos conjuntamente com os testes, o limite visual de detecção é de 0,2 mg/kg. Em trabalhos com espectrofotômetro, a diferença entre os resultados de duas determinações executadas simultaneamente, pelo mesmo analista, não deve ser maior que 0,2 µg. Nota 1 : é necessário fazer, conjuntamente com as determinações, uma prova em branco (com os reagentes) e um padrão de concentração conhecida: prepare, simultaneamente, padrões de 1, 2, 3, etc, µg de arsênio por pipetagem de 1, 2, 3, etc., mL da solução padrão de 1 µg/mL e dilua a aproximadamente 35 mL de água. Nota 2: em presença de íon férricos, o KI é oxidado com liberação de iodo. Adicione um excesso de cloreto estanoso para uma redução completa. A liberação de hidrogênio da reação é neste caso catalisada e acelerada. Nota 3: exemplo de cálculo da massa de amostra a ser pesada: sabe-se por norma que o corante artificial pode conter no máximo 1 µg de As por g de corante. Na dosagem comparativa usa-se um padrão de 3 µg de Arsênio. Desta maneira, a fórmula que fornece a massa de amostra a ser pesada será: 272 - IAL Capítulo V - Aditivos ma = massa da amostra a ser pesada pa = padrão para comparação n = limite de arsênio estabelecido na especificação de cada matéria-prima Referências bibliográficas YABIKU, H. Y.; DIAS, N. A.; MARTINS, M.S. Estudo comparativo de métodos usuais para determinação de arsênio. São Paulo, Rev. Inst. Adolfo Lutz, 49(1), p. 51-55, 1989. BABKO, A. K.; PILIPENKO, A. T. Photometric analysis. Methods of determining non-metals. Moscow: Mir Publishers. 1976. 374 p. COMMITTEE ON FOOD CHEMICALS CODEX Food Chemicals Codex. 4. ed., Washington D. C.: National Academic Press, 1996. p. 755-757. 153/IV Determinação de benzo(a)pireno em aromas de fumaça e alimentos defumados Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) representam um importante grupo de compostos químicos, muitos dos quais têm elevado potencial carcinógenico, dentre estas substâncias, destaca-se o benzo(a)pireno , por ter sido o primeiro hidrocarboneto a ser identificado e reconhecido como carcinógeno, e ser considerado um indicador da presença de outros do grupo. São formados principalmente devido à combustão incompleta, à altas temperaturas, de matérias orgânicas e estão distribuídos no meio ambiente em baixas concentrações; podem ser encontrados em plantas terrestres e aquáticas, solos, sedimentos, águas e na atmosfera. A contaminação nos alimentos é normalmente resultado da defumação, contaminação dos solos, poluição do ar e da água, processos de cozimento ou preparação de alimentos e dos aditivos alimentares. Este método se aplica à determinação de benzo(a) pireno em aromas de fumaça e alguns alimentos defumados, tais como: bacon, presunto, lingüiça, lombo, peru, chester, costela de boi, etc. Baseia-se na extração do benzo(a)pireno, posterior separação e quantificação por CLAE em fase reversa, usando uma coluna analítica de octadecilsilano (C18) e detector de fluorescência. Material Cromatógrafo líquido de alta eficiência, coluna analítica de 4,0 mm x 12,5 cm, Lichrosphere 100 RP-18 (5 µm) ou equivalente, detector de fluorescência, processador e registrador/ integrador de dados, balança analítica, processador de carnes ou equivalente, manta de aquecimento de 500 mL, rotavapor, membranas filtrantes descartáveis de 0,45 µm de diâmetro de poro, filtros descartáveis de 0,45 µm de diâmetro de poro, torpedo de nitrogênio, IAL - 273 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital pipetador automático de 100 a 1000 µL com respectiva ponteira, pipetador automático de 1000 e 5000 µL com respectiva ponteira, condensador de bola com junta esmerilhada 24/40, comprimento de 400 mm, funis de separação de 125, 250 e 500 mL com torneiras de teflon, balão de fundo chato de 250 mL com junta esmerilhada 24/40, coluna de vidro de 22 cm de comprimento, com reservatório para 60 mL e torneira de teflon, funil de vidro, frascos de vidro tipo pêra de 400 mL com junta esmerilhada 24/40, funil de Büchner, frasco concentrador graduado de 10 mL com tampa, seringas de 5 mL, balões volumétricos de 10, 50 e 100 mL e pipetas volumétricas. Reagentes Água ultra-pura Álcool Metanol grau CLAE Acetonitrila grau CLAE 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoretano (TCTFE) grau CLAE Dimetilsulfóxido (DMSO) grau espectrofotométrico Ciclohexano grau CLAE Óxido de alumínio 90, tamanho de partícula 70-230 mesh Sílica gel 60 , tamanho de partícula 70-230 mesh Hidróxido de potássio Solução-estoque – Dissolva 1 mg de benzo(a)pireno (BaP) em 10 mL de ciclohexano e deixe em ultra-som por 15 minutos. Solução-intermediária – Pipete 0,5 mL da solução-estoque, leve para um balão de 50 mL e complete o volume com acetonitrila-metanol (1:1). Solução de trabalho – Pipete 4 mL da solução intermediária e leve para um balão de 100 mL, completando o volume com acetonitrila-metanol (1:1). Concentração final de benzo(a) pireno: 0,04 µg/mL. Alumina desativada – Determine a perda aparente de peso da alumina, por aquecimento ao rubro com bico de Bünsen de 10 g de alumina em cápsula de porcelana ou platina tarada. Cubra a cápsula imediatamente e coloque em dessecador para esfriar, depois pese (as pesagens devem ser feitas rapidamente, pois a alumina adsorve imediatamente a água atmosférica). Calcule o conteúdo de água. Descarte a alumina que tenha sido aquecida. Adicione suficiente quantidade de água para molhar a alumina, desde que para o total de água adicionado, se considere 10% do peso final da alumina desativada. Agite vigorosamente a alumina por 15 minutos e guarde em vidro âmbar por no mínimo 4 horas antes do uso. 274 - IAL Capítulo V - Aditivos Cálculo Y = quantidade de água presente na alumina X = quantidade de água a ser adicionada na alumina M = massa de alumina inicial Sílica gel desativada – Aqueça porções de sílica gel em frasco Erlenmeyer tarado a 160°C por 16 horas e aqueça também a tampa já tarada em um béquer. Remova o frasco Erlenmeyer da estufa, tampe imediatamente e esfrie em dessecador. Pese o frasco para determinar o peso da sílica gel seca. Adicione quantidade suficiente de água à sílica gel, desde que a soma das adições não ultrapasse 15% do peso final da sílica gel desativada. Imediatamente tampe o frasco e agite vigorosamente por 15 minutos. Aguarde 4 horas ou mais antes do uso. Cálculo X = quantidade de água a ser adicionada na sílica; M = massa de sílica inicial. Preparação da coluna cromatográfica – Adicione na coluna de vidro, contendo lã de vidro na extremidade inferior, 5 g de sílica gel desativada (contendo 15% de água), 5 g de alumina desativada (contendo 10% de água) e 10 g de sulfato de sódio, nesta ordem, batendo levemente durante cada adição. Lave a coluna com 50 mL de TCTFE. Pare o fluxo quando o nível do líquido alcançar o topo da camada de sulfato de sódio Recuperação da coluna cromatográfica – Teste antes do uso. Prepare 2 colunas como descrito acima (uma coluna para o branco e uma para a recuperação). Adicione 40 mL de TCTFE à uma coluna e à outra adicione 40 mL de TCTFE contaminado com 2 mL de uma solução de benzo(a)pireno (BaP) 0,25 µg/mL. Deixe o solvente percolar as colunas e colete separadamente os eluatos em frascos tipo pêra de 400 mL. Repita a eluição da coluna com duas porções de 25 mL de TCTFE. Deixe cada eluente escoar até o topo da camada de sulfato de sódio antes das próximas adições. Concentre as soluções eluídas de TCTFE a 5 mL em um rotavapor com banho-maria a 30°C. Transfira os concentrados para um frasco concentrador graduado de 10 mL, com pipetador automático ou pipeta tipo Pasteur. Lave cada frasco tipo pêra com 3 porções de 1 mL de TCTFE e transfira para o frasco concentrador respectivo. ColoIAL - 275 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital que os frascos em um banho-maria a 30°C e concentre as soluções à secura sob leve fluxo de nitrogênio. Adicione 2 mL de acetonitrila-metanol (1:1) e leve ao ultra-som por 3 minutos. Filtre a solução em membranas de 0,45 µm. Submeta à cromatografia líquida de alta eficiência. Os cromatogramas dos solventes devem estar livres de picos interferentes e a recuperação para o benzo(a)pireno (BaP) deve ser maior que 90%. Fase móvel Solvente A: acetonitrila-metanol (1:1) Solvente B: água Filtre os solventes A e B através de membranas de 0,45 µm e degaseifique. Solventes para extração – Água saturada com TCTFE e água saturada com ciclohexano. Em um funil de separação, sature a água com o solvente específico em excesso, agite e descarte a fase orgânica. Procedimento – Ajuste o detector de fluorescência para os seguintes comprimentos de onda: λex = 295 nm e λem = 405 nm. Ajuste a proporção da fase móvel para 80% do solvente A e 20% do solvente B, o fluxo para 1 mL/min e a temperatura para 35°C. Programe o gradiente da fase móvel como descrito abaixo: Tabela 10 – Programação do gradiente da fase móvel Tempo (min) 0 20 40 45 65 % Solvente A (acetonitrila-metanol 1:1) 80 100 100 80 80 % Solvente B (água) 20 0 0 20 20 Triture a amostra e dissolva 25 g em 500 mL e m um balão de fundo redondo para ebulição, com algumas pérolas de vidro. Adicione 100 mL de álcool e 4 g de hidróxido de potássio. Coloque o frasco na manta de aquecimento, adapte o condensador de bolas e deixe digerindo por 2 horas. Deixe esfriar à temperatura ambiente. Coloque lã de vidro em um funil e umedeça com álcool, passe a solução fria através da lã de vidro e recolha o filtrado em um funil de separação de 500 mL. Faça lavagens seqüenciais com 90 mL de água saturada com TCTFE, 40 mL de TCTFE e 50 mL de álcool, recolha as soluções no funil de separação de 500 mL. Feche o funil e então inverta e abra a torneira enquanto agita suavemente o conteúdo por al276 - IAL Capítulo V - Aditivos guns segundos para escape. Feche a torneira e extraia agitando o funil por 2 minutos. Deixe as camadas separarem e então escoe a camada de TCTFE através da coluna cromatográfica (como preparada anteriormente). Repita as extrações com 2 porções de 40 mL de TCTFE. Deixe cada extrato percolar a coluna e colete aproximadamente 300 mL em um frasco tipo pêra. Quando o terceiro extrato atingir o topo da camada de sulfato de sódio, adicione 50 mL de TCTFE para lavagem da coluna e colete este eluído no frasco. Adicione 10 mL de DMSO à solução no frasco e evapore o TCTFE em um rotavapor com banho a 30°C, deixando o DMSO. Transfira quantitativamente o concentrado de DMSO para um funil de separação de 125 mL, usando 5 mL de DMSO em pequenas porções. Lave o frasco com 50 mL e adicione as lavagens ao funil. Agite o funil para extração por 2 minutos. Depois que as fases se separarem, descarte a camada inferior para um funil de separação de 250 mL contendo 25 mL de ciclohexano e 90 mL de água saturada com ciclohexano. Repita a extração de ciclohexano no funil de 125 mL com duas alíquotas de 15 mL de DMSO. Adicione os extratos de DMSO ao funil de 250 mL, agite vigorosamente por 2 minutos para extração. Depois da separação das fases, transfira a camada inferior para outro funil de 250 mL contendo 25 mL de ciclohexano e agite por 2 minutos para extração. Depois da separação das fases, descarte a camada inferior, aquosa. Combine os dois extratos de ciclohexano no primeiro funil de 250 mL. Lave o segundo funil de 250 mL com duas alíquotas de 10 mL de ciclohexano e adicione as lavagens ao primeiro funil de 250 mL. Lave a solução, duas vezes, com suave agitação por 15 segundos com 100 mL de água saturada com ciclohexano. Descarte a camada aquosa depois de cada lavagem. Coloque 10 g de alumina desativada (10% de água) seguida por 50 g de Na2SO4 em um funil de Büchner de 60 mL. Lave com 50 mL de ciclohexano e descarte. Passe os extratos combinados de ciclohexano do funil de separação, através do funil de Büchner para um frasco tipo pêra de 400 mL. Lave o funil de separação com duas alíquotas de 25 mL de ciclohexano, e passe cada uma através do funil de Büchner para o frasco. Use um rotavapor com banho-maria a 40°C, até reduzir o volume para cerca de (2-5) mL. Transfira o conteúdo quantitativamente para o frasco concentrador usando um pipetador automático ou pipeta tipo Pasteur, utilizando 5 mL ou menos de ciclohexano para lavagem. Leve o conteúdo do tubo à secura em banho-maria a 30°C sob uma suave corrente de nitrogênio. Leve para 2 mL com acetonitrila-metanol (1:1) e deixe no ultra-som por 3 minutos. Filtre o extrato para um flaconete de 2 mL. Injete 20 µL do extrato de amostra ou da solução-padrão na coluna Lichrosphere 100 RP-18 (5 µm) ou equivalente e inicie a programação de gradiente de fase móvel. Entre as injeções, lave o loop de amostra. Compare os tempos de retenção do pico observado com o padrão de benzo(a)pireno cromatografado sob as mesmas condições. Injete o padrão a cada 3 amostras. Calcule a quantidade de benzo(a)pireno no extrato de amostra pelo procedimento de padrão externo. Cálculo IAL - 277 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Aa = área do pico da amostra de benzo(a)pireno no extrato da amostra Ap = área do pico de padrão externo de benzo(a)pireno Mp = massa de padrão externo de benzo(a)pireno na injeção Finalize o cálculo, levando em consideração as diluições efetuadas e o peso inicial de amostra. Referências bibliográficas YABIKU, H.Y.; MARTINS, M.S.; TAKAHASHI, M.Y. Levels of benzo(a)pyrene and other polycyclic aromatic hydrocarbons in liquid smoke flavour and some smoked foods. Food Addit. and Contam., v. 10(4), p. 399-405, 1984. JOE Jr, F.L.; SALEMME, J.; FAZIO, T. Liquid chromatographic of trace residues of polynuclear aromatic hydrocarbons in smoked foods J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 67(6), p. 1076-1082, 1982. Colaboradores: Iracema de A. Tamura; Maristela Satou Martins e Nelson Aranha Dias. 278 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial CAPÍTULO VI ANÁLISE SENSORIAL IAL - 279 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 280 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial VI ANÁLISE SENSORIAL análise sensorial é realizada em função das respostas transmitidas pelos indivíduos às várias sensações que se originam de reações fisiológicas e são resultantes de certos estímulos, gerando a interpretação das propriedades intrínsecas aos produtos. Para isto é preciso que haja entre as partes, indivíduos e produtos, contato e interação. O estímulo é medido por processos físicos e químicos e as sensações por efeitos psicológicos. As sensações produzidas podem dimensionar a intensidade, extensão, duração, qualidade, gosto ou desgosto em relação ao produto avaliado. Nesta avaliação, os indivíduos, por meio dos próprios órgãos sensórios, numa percepção somato-sensorial, utilizam os sentidos da visão, olfato, audição, tato e gosto. A Visão No olho humano, ocorre um fenômeno complexo se um sinal luminoso incide sobre a capa fotossensível, a retina, provocando impulsos elétricos que, conduzidos pelo nervo óptico ao cérebro, geram a sensação visual que é, então, percebida e interpretada. O olho, como órgão fotorreceptor, percebe a luz, o brilho, as cores, as formas, os movimentos e o espaço. As cores são percebidas pelo indivíduo fisiologicamente normal quando a energia radiante da região visível do espectro (380 a 760) nm atinge a retina. As características da cor são, essencialmente, o tom ou matiz, a saturação ou grau de pureza e a luminosidade ou brilho. Na avaliação da acuidade visual de indivíduos, alguns testes podem ser aplicados como, por exemplo, o de Munsell - Farnsworth 100 Hue Test (GretagMacbeth, 1997). Olfato A mucosa do nariz humano possui milhares de receptores nervosos e o bulbo olfativo está ligado no cérebro a um “banco de dados” capaz de armazenar, em nível psíquico, os odores sentidos pelo indivíduo durante toda a vida. Na percepção do odor, as substâncias IAL - 281 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital desprendidas e aspiradas são solubilizadas pela secreção aquosa que recobre as terminações ciliadas, entrando em contato com os receptores nervosos e produzindo impulsos elétricos. Estes, quando chegam ao cérebro, geram informações que, comparadas aos padrões conhecidos por ele se encaixam como num sistema de “chave-fechadura”. Em média, o ser humano pode distinguir de 2000 a 4000 impressões olfativas distintas. Para avaliar o poder de discriminação, certas substâncias químicas comuns ou raras podem ser apresentadas ao indivíduo para reconhecimento e identificação, como por exemplo: acético, alcoólico, amoníaco, sulfídrico, pinho, lenhoso, cítrico, caramelo, mentol, eugenol, etc. Audição O ouvido humano tem a função de converter uma fraca onda mecânica no ar em estímulos nervosos que são decodificados e interpretados por uma parte do cérebro, o córtex auditivo, de forma a reconhecer diferentes ruídos. Para avaliar a capacidade de discriminação de indivíduos, algumas características peculiares dos produtos podem ser empregadas utilizando simultaneamente os sentidos da audição e tato, como por exemplo: a dureza do pé-de-moleque, a crocância do biscoito ou da batata frita, a mordida da maçã ou da azeitona e o grau de efervescência da bebida carbonatada, cujos sons ou ruídos são reconhecidos pela quebra e mordida entre os dentes e o borbulhar do alimento. Tato É toda sensibilidade cutânea humana. É o reconhecimento da forma e estado dos corpos por meio do contato direto com a pele. Ao tocar o alimento com as mãos ou com a boca, o indivíduo facilmente avalia sua textura, mais do que quando utiliza a visão e a audição. A textura, considerada como o grau da dureza, é definida como a força requerida para romper uma substância entre os dentes molares (sólidos) ou entre a língua e o palato (semi-sólidos). Para avaliar o poder de discriminação dos indivíduos, podem ser apresentados para reconhecimento alguns produtos de diferentes graus de dureza, como, por exemplo: a amêndoa (dura), a azeitona (firme), o requeijão (mole), etc. Gosto Na boca, a língua é o maior órgão sensório e está recoberta por uma membrana cuja superfície contém as papilas, onde se localizam as células gustativas ou botões gustativos e os corpúsculos de Krause, com as sensações táteis. O mecanismo de transmissão da sensação gustativa se ativa quando estimulado por substâncias químicas solúveis que se difundem pelos poros e alcançam as células receptoras que estão conectadas, de forma única ou conjuntamente com outras, a uma fibra nervosa que transmite a sensação ao cére282 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial bro. A sensibilidade não se limita apenas à língua, pois outras regiões também respondem aos estímulos, como o palato duro, amídalas, epiglote, mucosa dos lábios, as bochechas e superfície inferior da boca. A percepção mais conhecida envolve quatro gostos primários: doce, salgado, ácido e amargo, sendo citado também o umami. Algumas soluções químicas em concentrações diferentes são utilizadas para avaliar o poder de discriminação pelo reconhecimento, como por exemplo: a sacarose, 5,76 g/L (doce); o cloreto de sódio, 1,19 g/L (salgado); a cafeína, 0,195 g/L (amargo); o ácido cítrico, 0,43 g/L (ácido); o glutamato monossódico, 0,595 g/L (umami) e o sulfato heptahidratado de ferro II, 0,00475 g/L (metálico) (ISO/DIS 3972/1979). O espectro de gostos também pode incluir a presença de gostos secundários (alcalino e metálico) e os elementos sensíveis à química comum (adstringente, refrescante, ardente, quente e frio). As sensações denominadas “picantes” também definidas como “ardentes” ou “pungentes”, não são consideradas estímulos puros, pois se percebe em toda a língua e garganta. Preparo e apresentação de amostras Os procedimentos de preparo e apresentação de amostras são etapas críticas e devem ser padronizados segundo o tipo, a espécie ou a variedade de produto. Basicamente, recomendam-se os seguintes procedimentos: • Amostra representativa e, se necessário, acompanhada da amostra de referência ou padrão, similar, de mesma procedência, marca e/ou fabricante, que possa servir como comparação. Sempre na quantidade suficiente para análise e, se for o caso, com medidas de massa ou peso e volumes bem definidos. • Modo de preparo adequado da amostra e, de preferência, conforme a orientação do fabricante nos rótulos. Durante o preparo, determinadas variações físicas devem ser controladas com utilização de cronômetros, termômetros ou termopares. Prepare todas as amostras de forma idêntica, estimando tempos mínimos e máximos de espera até a apresentação. Para todas as unidades de amostras, a porção, a quantidade, o formato e o tamanho (espessura) devem ser controlados segundo as características do produto. • Amostras servidas em recipientes próprios ou os comumente utilizados nas refeições de indivíduos, como, por exemplo, recipientes de vidro, porcelana ou plásticos descartáveis. Se necessário, sirva em bandejas de cor branca ou neutra. Utilize talheres compatíveis, descartáveis ou não, guardanapos, toalhas absorventes e vasilhames para o descarte de resíduos. Todos os recipientes devem estar bem limpos, secos e livres de odores estranhos. IAL - 283 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital • Antes da apresentação da amostra veriique e controle a temperatura, sendo um importante fator de variação na percepção do odor e do sabor. Melhor avaliar a amostra na temperatura em que é normalmente consumida. Um grande número de produtos pode ser avaliado em sua temperatura ambiente. O Quadro 1 indica algumas faixas de temperaturas usualmente empregadas na avaliação sensorial de alimentos. • As condições ambientais devem ser controladas antes da análise sensorial levando em consideração a utilização de cabines individuais, o grau de luminosidade, temperatura climatizada adequada, ausência de ruídos e odores estranhos. Quadro 1 – Faixas de temperaturas indicadas para avaliação do odor e sabor em alguns produtos alimentícios Produto Água Alimentos preparados quentes Bebida carbonatada Café Cerveja Chá Leite Licores destilados Manteiga e margarina Maionese Óleos comestíveis Pão Sopa Sorvete Vinho Temperatura (ºC) 20 – 22 35 – 45 06 – 10 68 – 71 04 – 05 68 – 71 07 – 10 20 – 22 20 – 22 20 – 22 40 – 43 20 – 22 68 – 71 10 – 12 20 – 22 ou gelado Fonte: Instituto Adolfo Lutz (Baseado em ELLIS, 1961). Formação da equipe sensorial Uma equipe sensorial efetiva deve ser formada a partir de critérios específicos que podem influir na percepção do indivíduo que avalia um produto, como os fatores ligados à fisiologia (receptores sensoriais, sistema nervoso), psicologia (relação estímulo-resposta) e sociologia (idade, sexo, etnia, hábitos alimentares, grau de instrução). Na escolha de indivíduos que irão compor a equipe sensorial, alguns requisitos devem ser considerados, tais como: 284 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial • O indivíduo deve estar ciente de que a participação nos testes é espontânea e voluntária. Verifique se cada membro da equipe tem interesse, disponibilidade, pontualidade, tranqüilidade e vontade de avaliar grande parte das categorias de produtos nos dias marcados para teste, seleção e treinamento previamente agendados. • Veriique se o candidato revela boa forma de expressão, habilidade verbal e vocabulário próprio que possa definir e descrever adequadamente os atributos sensoriais. Deve-se evitar qualquer tipo de comunicação com os colegas durante os testes, pois a resposta de cada um é própria, independente e de responsabilidade exclusiva. • O candidato deve apresentar boas condições de saúde, ausência de gripes e alergias, comunicando quando houver doenças como diabetes, hipercolesterolemia ou qualquer outra. Evite o indivíduo que use aparelho dentário corretivo, pois os dentes têm papel importante na avaliação sensorial. Evite os fumantes, caso contrário, alerte a não fumar pelo menos uma hora antes dos testes. • Avalie a acuidade sensorial e o poder de discriminação para cores, textura, odores e gostos primários. Fique atento nos casos de ocorrência de anomalias nos órgãos da visão, olfato, audição e paladar. A faixa etária recomendável situa-se entre 18 a 50 anos, pois, após esta idade o indivíduo pode revelar certa dessensibilização dos órgãos sensores. • Oriente o julgador a não fazer uso de cosméticos e perfumes fortes e a não consumir alimentos muito picantes nos dias marcados para os testes. Os medicamentos também podem influenciar na sensibilidade do gosto do indivíduo. Características sensoriais Método subjetivo utilizado para avaliar as características sensoriais de alimentos, bebidas e água. Este método considera as opiniões de indivíduos na interpretação de efeitos do estímulo sensorial, simples ou múltiplos, segundo as impressões percebidas pelos órgãos sensórios (visão, olfato, gosto, tato e audição) que irão gerar as interpretações e descrições das propriedades intrínsecas aos produtos. A forma de definir atributos sensoriais é descrever os componentes relativos às propriedades dos produtos, como os seguintes: Aparência – Refere-se às propriedades visíveis como o aspecto, cor, transparência, brilho, opacidade, forma, tamanho, consistência, espessura, grau de efervescência ou carbonatação e as características de superfície. A cor, propriedade capaz de provocar estimulação da retina por raios luminosos de comprimentos de onda variáveis, tem sua percepção limitada à fonte de luz, devendo ser avaliada com iluminação adequada como, por exemplo, a luz IAL - 285 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital do dia, natural ou artificial. Na avaliação, geralmente, são utilizadas cabines especiais de controle visual de cores. Ela também é definida com maior coerência e uniformidade, por meio de quadros cromáticos, discos ou dicionários de cor. Na avaliação da aparência e cor, um quadro com expressões usuais e comuns poderá auxiliar na sua melhor denominação (Quadro 2). Odor e aroma – O odor é perceptível pelo órgão olfativo quando certas substâncias voláteis são aspiradas e o aroma, via retronasal durante a degustação. O julgador deve aproximar a amostra da narina e dar cheiradas curtas, evitando longas inalações que cansem o olfato pela adaptação. O cansaço olfativo pode ser amenizado se for cheirada a pele do próprio pulso ou por outro aroma que neutralize o anterior. Nesta avaliação, pode-se fazer comparações com padrões de referência conhecidos, que serão identificados e descritos pelos seus odores ou aromas peculiares. No Quadro 3 são citados alguns termos usuais e comuns para produtos alimentícios. Textura oral e manual – Refere-se às propriedades reológicas e estruturais (geométricas e de superfície) dos produtos. Geralmente é percebida por três ou quatro sentidos: os receptores mecânicos, táteis e, eventualmente, os visuais e auditivos. Relaciona-se com a sensibilidade térmica e cinestésica. A avaliação da textura é mais complexa nos alimentos sólidos, como nos ensaios de corte, compressão, relaxação, penetração, cisalhamento, dobramento, etc. O julgador deve utilizar a pele da mão, da face e/ou da boca (cavidade bucal e dentes). Quando avaliado pela boca pode ser definido como sensação bucal, utilizando-se também termos como: adstringente, metálico, quente, frio, etc. Algumas sensações são também nasais, como: pungente, refrescante, etc. Uma listagem de termos próprios pode ser utilizada para melhor definição das propriedades de textura (Quadro 2). Sabor e gosto – É considerada como uma experiência mista, mas unitária de sensações olfativas, gustativas e táteis percebidas durante a degustação. O sabor é percebido, principalmente, através dos sentidos do gosto e olfato, também influenciado pelos efeitos táteis, térmicos, dolorosos e/ou cinestésicos. O julgador deve tomar uma certa quantidade da amostra, sem excessos, e proceder à deglutição, tomando o cuidado em evitar a fadiga sensorial. Entre uma amostra e outra é aconselhável lavagem da cavidade oral com água filtrada ou a neutralização do paladar ingerindo-se uma maçã, pão ou biscoito tipo cream craker. O julgador deve evitar sensações fortes de gostos pelo menos 30 minutos antes do teste, não deve apresentar nenhuma indisposição no organismo. Alguns termos usuais e comuns para o sabor estão descritos no Quadro 3. 286 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial Quadro 2 – Atributos de aparência, textura e cor comuns a produtos alimentícios Aparência / Textura Abaulada Aderente Adsorvida Afilada Aglomerada Alongada Amanteigada Amassada Amolecida Aquosa Áspera Avariada Bastão Bastonete Barra Borbulhante Borrachenta Brilhosa Butirosa Calcinada Caldo Caramelada Coagulada Cobertura Cominuída Compacta Comprimida Com cortes Com depósito Com fragmentos Com furos Com partículas Com polpa Com precipitado Com riscas Congelada Consistente Cozida Creme Cremosa Cristal Cristalino Cristalizada Crocante Crosta Crua Drágea Deformada Derretida Dessecada Desintegrada Depositada Dura Efervescente Elástica Embolorada Entremeada Esfarelenta Esférica Esmigalhada Espessa Espumante Exsudato Fatiada Fermentada Fibrosa Filete Fina Firme Floco Floculosa Fluido Fresca Friável Fundida Gasosa Gaseificada Gelatinosa Gomosa Gordurosa Grão Granulada Granulosa Grossa Grumosa Grudenta Heterogênea Homogênea Íntegra Irregular Lâmina Limo Limosa Líquida Límpida Macia Cor* Manchada Massa Maturada Mofada Moída Mole Oleosa Ondulada Pasta Pastilha Pastosa Pegajosa Película Pó Porosa Polpa Precipitada Prensada Pulverulenta Quebradiça Rachada Rala Recheada Recheio Repicada Resíduo Ressecada Resistente Retalhada Rija Rodela Seca Sedimentada Semidura Semente Sólida Solta Suculenta Tenra Translúcida Transparente Tolete Turva Uniforme Úmida Untuosa Viscosa Xarope Acromática Alaranjada Alaranjado-claro Alaranjado-escuro Amarela Amarelo-alaranjado Amarelo-âmbar Amarelo-claro Amarelo-cinzento Amarelo-escuro Amarelo-esverdeado Amarelo-fosco Amarelo-ouro Amarelo-pálido Amarelo-palha Amarelo-pardacento Amarelo-torrado Âmbar Âmbar-escuro Argentada Azul Azul-celeste Azul-claro Azul-escuro Azul-esverdeada Azul-marinho Azul-piscina Azul-turquesa Bege Branca Branco-de-giz Branco-amarelado Branco-marfim Branco-pérola Branco-sujo Brilhante Brilho-metálico Castanha Cinza Cinzenta Cor opaca Cor uniforme Cor pálida Creme Dourada Incolor Marrom Marrom-amarelado Marrom-avermelhado Marrom-acinzentado Marrom-claro Marrom-escuro Marrom-esverdeado Rosada Rósea Róseo-avermelhado Róseo-claro Róseo-escuro Róseo-purpúreo Róseo-violáceo Ocre Parda Pardacenta Perolada Prateada Preta Roxa Verde Verde-abacate Verde-acinzentado Verde-amarelado Verde-azulado Verde-bandeira Verde-claro Verde-escuro Verde-esmeralda Verde-folha Verde-garrafa Verde-mar Verde-musgo Verde-oliva Verde-piscina Vermelha Vermelho-alaranjado Vermelho-arroxeado Vermelho-cereja Vermelho-pardacento Vermelho-rosado Vermelho-rubro Vermelho-violáceo Vinho Violeta Violeta-avermelhado Violeta-azulado Violeta-claro Violeta-escuro Fonte: Instituto Adolfo Lutz (Baseado em MELO, 1946). IAL - 287 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital * Relativa à tonalidade, luminosidade e saturação ou pureza. A cor pode ser primária (como: azul, vermelho e amarelo); secundária (misturas proporcionais das cores primárias, como: vermelho + amarelo = laranja; amarelo + azul = verde; azul + vermelho = violeta) e terciárias (misturas proporcionais das cores primárias e secundárias, como: branco + azul = azul claro; preto + branco = cinza; verde + amarelo = verdeamarelado; laranja + azul = marrom; branco + azul + vermelho = lilás; amarelo + vermelho + pouco preto = bege; verde forte + alaranjado + preto = verde azeitona; violeta + vermelho + preto = vinho, etc.) Nota: as definições dos atributos citados podem ser encontradas na literatura, por intermédio de um glossário de termos empregados em análise sensorial. Exemplos: consistente = propriedade de fluxo detectada pela estimulação dos receptores mecânicos e táteis, especialmente na cavidade oral, e que varia com a textura do produto; cristalino = relativo à forma e orientação das partículas ou cristais de um produto, como o açúcar cristal; crocante = produto duro que ao ser quebrado produz som característico, como da batata frita “chips”; efervescente = aquele que desprende gás carbônico na superfície, observado em bebidas gaseificadas ou carbonatadas; esfarelenta = que esfarela ou desintegra, como o bolo-de-fubá; fibrosa = propriedade da textura em relação à percepção da forma e presença de partículas, como fibras do palmito e manga espada; gomosa = relativa à energia necessária para desintegrar um produto semi-sólido a fim de que possa ser ingerido, resultado de um fraco grau de dureza e alto grau de coesão, como flocos de aveia bem cozidos. Líquido, ralo, untuoso, viscoso = propriedade de resistência ao escoamento, como a água (baixa), leite (média-baixa), creme de leite (média), cuja correspondência pode ser a viscosidade; macio, firme, dura = relativa à força necessária para obter dada deformação, penetração e/ou cizalhamento, como o queijo cremoso (macio-baixa resistência); azeitona (firme-média resistência); bala (dura-alta resistência); translúcida = aquela substância que permite a passagem da luz, mas não permite a distinção de uma imagem distinta; transparente = aquela substância que permite a passagem da luz e o aparecimento de uma imagem nítida. 288 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial Quadro 3 – Atributos de odor e sabor comuns a alguns produtos alimentícios Odor e Sabor Ácido Acre Acético Achocolatado Açucarado Adamascado Adoçado Adocicado Adiposo Adstringente Adulterado Afumado Agradável Agre Agridoce Aguado Alcalino Alcoólico Aliáceo Alterado Amargo Amargoso Amanteigado Amendoado Amiláceo Amoniacal Anormal Ardente Ardido Apimentado Aromático Atípico Artificial Azedo Azeitonado Balsâmico Benzênico Bouquet Butírico Cacau Café-com-leite Cafeinado Caramelado Característico Cáustico Carbonatado Condimentado Cúprico Defumado Desagradável Desodorante Diluído Doce Enfumaçado Enjoativo Envelhecido Estragado Estranho Etéreo Fermentado Ferruginoso Fétido Floral Frutado Frutoso Gorduroso Graxo Impróprio Impuro Inadequado Inodoro Irritante Insípido Insosso Insuportável Horrível Láctico Leve Licoroso Maresia Maturado Medicinal Melado Mentolado Metálico Mofado Natural Normal Nauseante Odorífico Picante Penetrante Perfumado Próprio Pungente Putrefato Pútrido Rançoso Refrescante Remanescente Repulsivo Salgado Salino Sápido Saponáceo Suave Sulfuroso Oxidado Queimado Velho Fonte: Instituto Adolfo Lutz (Baseado em MELO, 1946). Nota: as definições dos atributos citados podem ser encontradas na literatura, por meio de um glossário de termos empregados em análise sensorial. Exemplos: acre = odor e sabor picante, irritante e áspero, como o do alho, fósforo e solução de ácido fórmico a 90% (p/v); agre = qualifica a sensação gustativa com predomínio ácido, onde alguns fatores que contribuem para esta sensação se relacionam a um processo de fermentação (acético ou láctico); adstringente = sensação produzida pela contração da mucosa da boca, como por uma solução aquosa diluída de alguns taninos, como do caqui ou banana verde; alcalino = sensação escorregadia devido à alcalinidade, como solução de bicarbonato de sódio; azedo = sensação complexa olfativa e/ ou gustativa, geralmente devido à presença de ácidos orgânicos. Entretanto não pode ser usado como sinônimo de gosto primário ácido e pode ter algumas vezes, uma conotação hedônica negativa. Bouquet = conjunto de caracteres olfativos específicos de um produto, como vinho, licores; cúprico = com sabor de cobre, áspero e penetrante; estranho = aquele odor ou sabor não característico do produto; inodoro = qualifica um produto que não tem odor; insosso = ou “flat”, produto que não atinge nível sensorial adequado, como sem sal, IAL - 289 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital sem tempero; metálico = sensação de metal na mucosa da boca; pungente = sensação de dor causada, por exemplo, ao cheirar uma solução de ácido acético (2-5%); sápido = qualifica um produto que produz sabor. O contrário é insípido = falta de sabor, ou que possui aroma e sabor típicos, mas em níveis inferiores ao que poderia conter o produto (sinônimo de insosso). 154/IV Análise das características sensoriais Procedimento – Para análise das características sensoriais, o julgador deve expressar suas impressões em relação aos atributos sensoriais e descrevê-los utilizando vocabulário próprio, conforme modelo na Ficha 1. A reunião de julgadores se dá em torno de uma mesa redonda confortável, com as condições ambientais controladas, tais como: iluminação, temperatura, ausência de sons ou ruídos e livre de odores estranhos. Durante o teste, o julgador deve omitir-se de conversas paralelas. Depois, inicia-se uma conversação, na qual, por consenso, são definidos os termos ou componentes perceptíveis que melhor definem cada um dos atributos sensoriais e, conseqüentemente, a conclusão do resultado de análise. Recomenda-se que o número de julgadores selecionados seja no mínimo 3, de preferência número ímpar, para que, se houver divergência de opiniões, possa haver desempate, prevalecendo o resultado consensual da maioria. Ficha 1 – Modelo para teste de características sensoriais Amostra: Julgador: Data: Aparência Odor e aroma Textura Sensação bucal Sabor e gosto Comentários Testes discriminativos Os testes sensoriais discriminativos ou de diferença são considerados métodos objetivos utilizados em análise sensorial de alimentos, bebidas e água, com os efeitos das opiniões dos indivíduos minimizados. Medem atributos específicos pela discriminação simples, in290 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial dicando por comparações, se existem ou não diferenças estatísticas entre amostras. Exigem cuidados na padronização do preparo e apresentação das amostras e na formação da equipe sensorial. Todas as amostras devem ser codificadas com números aleatórios de três dígitos, casualizadas e apresentadas à equipe pré-selecionada e treinada. Os testes devem ser conduzidos em cabines individualizadas com controle das condições ambientais, tais como: iluminação, temperatura, ausência de sons ou ruídos e livre de odores estranhos. Os testes discriminativos ou de diferença mais empregados em análise sensorial são o triangular, duo-trio, ordenação, comparação pareada e comparação múltipla ou diferença do controle. 155/IV Testes discriminativos – Teste triangular Procedimento – O teste triangular detecta pequenas diferenças entre amostras. São apresentadas simultaneamente três amostras codificadas, sendo duas iguais e uma diferente. Cabe ao julgador identificar a amostra diferente (Ficha 2). A escolha é forçada. A probabilidade de acertos é p = 1/3. A interpretação do resultado se baseia no número total de julgamentos versus o número de julgamentos corretos (Quadro 4). Se o número de julgamentos corretos for maior ou igual ao valor tabelado (Tabela 1), conclui-se que existe diferença significativa entre as amostras no nível de probabilidade correspondente. O número de julgadores selecionados deve ser de 20 a 40, embora apenas 12 possam ser utilizados quando as diferenças entre amostras são razoavelmente grandes. As amostras devem ser apresentadas casualizadas em igual número de vezes nas permutações distintas: AAB, BAA, ABA, ABB, BBA e BAB. Ficha 2 – Modelo para teste triangular Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codificadas, sendo duas iguais e uma diferente. Identifique com um círculo a amostra diferente. __________ __________ __________ Comentários: Fonte: ABNT, NBR 12995, 1993. IAL - 291 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Quadro 4 – Modelo de casualização e resultado do teste triangular Amostra: Nº de codificação: Nº (A) _______/_______ * Correta (C) Errada (E). p = nº de julgadores 292 - IAL Ordem de apresentação Nome do julgador 1 2 3 4 5 6 7 p nº de julgamentos totais nº de julgamentos corretos Valor tabelado (nível de probabilidade) (B) _______/_______ A B A A B B A A A B B B A A B A A B A B B Resposta do Comentários julgador* (C) ou (E) Capítulo VI - Análise sensorial Tabela 1 – Teste triangular (unilateral, p = 1/3). Número mínimo de julgamentos corretos para estabelecer significância a vários níveis de probabilidade. Nº total de julgamentos 5% 4% 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 60 70 80 90 100 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 9 10 10 11 11 12 12 12 13 13 14 14 15 15 15 16 16 17 17 17 18 18 19 19 19 20 20 20 21 21 22 22 22 23 23 27 31 35 38 42 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 11 12 12 13 13 14 14 14 15 15 16 16 16 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 22 22 22 23 23 24 27 31 35 39 43 Níveis de probabilidade ( α ) 3% 2% 1% 0,5% 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 10 11 11 12 12 13 13 13 14 14 15 15 16 16 16 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 22 22 22 23 23 24 24 28 32 36 40 43 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 13 14 14 15 15 16 16 16 17 17 18 18 19 19 19 20 20 21 21 21 22 22 23 23 23 24 24 25 29 33 36 40 44 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 15 16 16 17 17 18 18 18 19 19 20 20 21 21 21 22 22 23 23 24 24 24 25 25 26 30 34 38 42 45 5 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 17 18 18 19 19 20 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24 24 25 25 26 26 26 31 35 39 43 47 0,1% 7 8 8 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 27 28 28 33 37 41 45 49 Fonte: ABNT, NBR 12995, 1993. IAL - 293 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 156/IV Testes discriminativos – Teste duo-trio Procedimento – O teste duo-trio detecta diferença sensorial entre uma amostra e um padrão (P). São apresentados simultaneamente o padrão e duas amostras codificadas, sendo uma delas idêntica ao padrão. Cabe ao julgador identificar a amostra igual ao padrão (Ficha 3). A escolha é forçada. A probabilidade de acertos é de 50% (p = 1/2). A interpretação do resultado se baseia no número total de julgamentos versus o número de julgamentos corretos (Quadro 5). Se o número de julgamentos corretos for maior ou igual ao valor tabelado (Tabela 2), conclui-se que existe diferença significativa entre as amostras no nível de probabilidade correspondente. O número de julgadores deve ser no mínimo de sete julgadores especialistas ou no mínimo de 15 julgadores selecionados. As amostras podem ser apresentadas casualizadas nas permutações: AB, BA (para P = A) e AB, BA (para P = B). Ficha 3 – Modelo para teste duo-trio Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo uma amostra padrão (P) e duas amostras codificadas. Uma das amostras codificadas é igual ao padrão, faça um círculo nesta amostra. __________ __________ Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13169, 1994. Quadro 5 – Modelo de casualização e resultado do teste duo-trio Amostra: nº de codificação: (P = A) (A)______/ (B)______ (P = B) (A)______/ (B)_____ Nº Nome do julgador Ordem de apresentação 1 2 3 4 5 6 p nº de julgamentos totais nº de julgamentos corretos Valor tabelado (nível de probabilidade) * Correta (C) 294 - IAL Errada (E) p = nº de julgadores A B A B A B B A B A B A P = padrão Resposta do julgador* (C) ou (E) Comentários Capítulo VI - Análise sensorial Tabela 2 – Teste duo-trio (unilateral p = 1/2). Número mínimo de julgamentos corretos para estabelecer significância a vários níveis de probabilidade. Nº total de julgamentos 5% 4% Níveis de probabilidade (α) 3% 2% 1% 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 50 60 70 80 90 100 7 7 8 9 9 10 10 11 12 12 13 13 14 15 15 16 16 17 18 18 19 19 20 20 21 22 22 23 23 24 24 25 26 26 27 27 28 28 29 30 30 31 32 37 43 48 54 59 7 7 8 9 9 10 11 11 12 12 13 14 14 15 15 16 17 17 18 18 19 20 20 21 21 22 23 23 24 24 25 25 26 27 27 28 28 29 29 30 30 31 32 38 43 49 54 60 7 8 8 9 10 10 11 11 12 13 13 14 15 15 16 16 17 18 18 19 19 20 21 21 22 22 23 23 24 25 25 26 26 27 27 28 29 29 30 30 31 31 33 38 44 49 55 60 7 8 8 9 10 10 11 12 12 13 14 14 15 16 16 17 17 18 19 19 20 20 21 22 22 23 23 24 25 25 26 26 27 27 28 29 29 30 30 31 31 32 34 39 45 50 56 61 7 8 9 10 10 11 12 12 13 14 14 15 15 16 17 17 18 19 19 20 20 21 22 22 23 24 24 25 25 26 26 27 28 28 29 29 30 31 31 32 32 33 34 40 46 51 57 63 0,5% 0,1% 8 9 10 11 11 12 13 13 14 15 15 16 17 17 18 19 19 20 20 21 22 22 23 24 24 25 25 26 27 27 28 28 29 30 30 31 31 32 33 33 34 35 41 47 52 58 64 10 11 12 13 13 14 15 16 16 17 18 18 19 20 20 21 22 22 23 24 24 25 26 26 27 27 28 29 29 30 30 31 32 32 33 34 34 35 36 37 43 49 55 61 66 Fonte: ABNT, NBR 13169, 1994. IAL - 295 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 157/IV Testes discriminativos – Teste de ordenação Procedimento – O teste de ordenação avalia três ou mais amostras, simultaneamente, ordenando-as em relação à intensidade de um atributo específico ou de sua preferência. Não quantifica o grau da diferença ou preferência entre amostras. Este teste pode ser aplicado para pré-seleção entre grande número de amostras. Uma série de três ou mais amostras codificadas aleatorizadas é apresentada ao julgador para que ordene em ordem crescente ou decrescente da intensidade do atributo específico ou mais preferido (Ficha 4). O resultado é dado pela soma das ordens obtidas dos julgadores a cada uma das amostras (Quadro 6). A avaliação estatística deve ser feita pelo teste de Friedman utilizando a tabela de Newell e MacFarlane para verificar se há ou não diferença significativa entre amostras. Se a diferença entre as somas das ordens for maior ou igual ao valor tabelado, conclui-se que existe diferença significativa entre as amostras ao nível de significância correspondente. O número de julgadores deve ser no mínimo de cinco especialistas ou 15 julgadores selecionados. Para o teste de preferência em laboratório, utilizam-se 30 ou mais julgadores e, para o teste de consumidor, 100 ou mais. As amostras devem ser apresentadas de forma balanceada ou casualizada. Ficha 4 – Modelo para teste de ordenação Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo quatro amostras codificadas. Avalie cada uma, colocando-as em ordem crescente da intensidade do atributo específico. ________ primeira Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13170 / 1994. 296 - IAL ________ segunda ________ terceira ________ quarta Capítulo VI - Análise sensorial Quadro 6 – Modelo de casualização e tabulação de resultado do teste de ordenação Amostra: nº de codificação: (A)______ (B)______ (C)______ (D)______ nº Nome do julgador 1 2 3 4 5 4 5 6 7 p Tipos de amostras ou tratamentos Soma das ordens nº de julgamentos (p) nº de amostras ou tratamentos (t) Valor tabelado (nível de significância) Ordem de apresentação A B C D A C B D B A D C B C A D C D B A C A D B D B A C D C B A A B C D (A) Σ (A) (B) Σ(B) (C) Σ(C) Comentários (D) Σ(D) Teste de Friedman – Com o número de amostras ou tratamentos avaliados (t) e o número de julgamentos (p) obtidos, utiliza-se a tabela de Newel e MacFarlane (Tabelas 3 ou 4, respectivamente, para os níveis de significância de 5% e 1%), para obter a diferença crítica entre os totais de ordenação. Se as diferenças entre as soma das ordens de duas amostras (Quadro 7) diferirem por um valor maior ou igual ao valor tabelado (crítico), existe diferença significativa entre elas ao nível testado. Quadro 7 – Módulos de diferenças entre somas das ordens de amostras Amostras Somatória total Diferenças versus A Diferenças versus B Diferenças versus C (A) Σ (A) - (B) Σ (B) Σ (A) - Σ (B) - (C) Σ (C) Σ (A) - Σ(C) Σ (B) - Σ(C) - (D) Σ(D) Σ (A) - Σ(D) Σ(B) - Σ (D) Σ (C) - Σ(D) Nota: para saber quais amostras diferem entre si, primeiro coloque-as em ordem crescente da somatória total e, depois, dê letras diferentes para as que diferirem por um número maior ou igual ao valor tabelado e letras iguais para as que não diferirem entre si. IAL - 297 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 3 – Valores críticos para comparação com os módulos das diferenças entre as somas das ordens do teste de ordenação, a 5% de significância Nº de julgamentos 3 4 5 8 11 6 9 12 7 10 13 8 10 14 9 10 15 10 11 15 11 11 16 12 12 17 13 12 18 14 13 18 15 13 19 16 14 19 17 14 20 18 15 20 19 15 21 20 15 21 21 16 22 22 16 22 23 16 23 24 17 23 25 17 24 26 17 24 27 18 25 28 18 25 29 18 26 30 19 26 31 19 27 32 19 27 33 20 27 34 20 28 35 20 28 36 20 29 37 21 29 38 21 29 39 21 30 40 21 30 41 22 31 42 22 31 43 22 31 44 22 32 45 23 32 46 23 32 47 23 33 48 23 33 49 24 33 50 24 34 55 25 35 60 26 37 65 27 38 70 28 40 75 29 41 80 30 42 85 31 44 90 32 45 100 34 47 Fonte: ABNT – NBR 13170, 1994. 298 - IAL nº de amostras ou tratamentos 5 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 24 25 26 26 27 28 28 29 30 30 31 32 32 33 33 34 34 35 36 36 37 37 38 38 39 39 40 40 41 41 41 42 42 43 43 44 46 48 50 52 53 55 57 58 61 6 17 19 20 22 23 24 25 27 28 29 30 31 32 32 33 34 35 36 37 37 38 39 40 40 41 42 42 43 44 44 45 46 46 47 48 48 49 49 50 51 51 52 52 53 53 54 56 59 61 64 66 68 70 72 76 7 21 22 24 26 27 29 30 32 33 34 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 46 47 48 49 50 51 51 52 53 54 55 55 56 57 57 58 59 60 60 61 62 62 63 64 64 67 70 73 76 79 81 84 86 91 8 24 26 28 30 32 34 35 37 39 40 42 42 44 45 46 47 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 63 64 65 66 67 68 69 69 70 71 72 72 73 74 75 78 82 85 88 91 94 97 100 105 9 27 30 32 34 36 38 40 42 44 46 47 49 50 51 53 54 56 57 58 59 61 62 63 64 65 66 67 68 70 71 72 73 74 75 76 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 85 90 94 97 101 105 108 111 114 121 10 30 34 36 38 41 43 45 48 50 52 53 55 56 59 60 61 63 64 65 67 68 70 71 72 73 75 76 77 78 79 81 82 83 84 85 86 87 89 89 90 91 92 93 94 95 95 101 105 110 114 118 122 125 129 136 11 34 37 40 43 46 48 51 53 55 57 59 61 63 65 66 68 70 71 73 74 76 77 79 80 82 83 85 85 87 89 90 91 92 94 95 96 97 98 99 101 102 103 104 105 106 107 112 117 122 127 131 136 140 144 151 12 37 42 44 47 50 53 56 58 61 63 66 67 69 71 73 75 77 79 80 82 84 85 87 89 90 92 93 95 96 98 99 100 102 103 105 106 107 109 110 111 112 114 115 116 117 118 124 130 135 140 145 150 154 159 167 Capítulo VI - Análise Sensorial Tabela 4 – Valores críticos para comparação com os módulos das diferenças entre as somas das ordens do teste de ordenação, a 1% de significância Nº de julgamentos nº de amostras ou tratamentos 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5 9 13 6 10 14 7 11 15 8 12 16 9 13 17 10 13 18 11 14 19 12 15 20 13 15 21 14 16 22 15 16 22 16 17 23 17 17 24 18 18 25 19 18 25 20 19 26 21 19 27 22 20 27 23 20 28 24 21 28 25 21 29 26 22 29 27 22 30 28 22 31 29 23 31 30 23 32 31 23 32 32 24 33 33 24 33 34 25 34 35 25 34 36 25 35 37 26 35 38 26 36 39 26 36 40 27 36 41 27 37 42 27 37 43 28 38 44 28 38 45 28 39 46 28 39 48 29 40 50 30 41 60 32 45 70 35 48 80 37 51 100 42 57 Fonte: ABNT, NBR 13170, 1994 3 16 18 19 21 22 23 24 26 27 28 28 30 31 31 32 33 34 35 35 36 37 38 38 39 40 40 41 42 42 43 44 44 45 45 46 47 47 48 48 49 49 50 51 52 57 61 66 73 19 21 23 25 27 28 30 31 32 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 48 49 50 51 52 52 53 54 55 55 56 57 57 58 59 60 60 61 62 63 60 75 80 89 23 25 28 30 32 33 35 37 38 40 41 43 44 45 46 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 66 67 68 69 70 70 71 72 74 75 82 89 95 106 26 29 32 34 36 38 40 42 44 46 48 49 51 52 54 55 56 58 59 60 62 63 64 65 66 67 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 82 83 85 87 95 103 110 123 30 33 36 39 41 44 46 48 50 52 54 56 58 60 61 63 64 66 67 69 70 71 73 74 75 77 78 79 80 82 83 84 85 86 87 88 90 91 92 93 94 95 97 99 108 117 125 140 33 37 40 43 46 49 51 54 56 58 60 63 65 67 69 70 72 74 75 77 79 80 82 83 85 86 87 89 90 92 93 94 95 97 98 99 100 102 103 104 105 106 109 111 121 131 140 157 37 41 45 48 51 54 57 60 62 65 67 70 72 74 76 78 80 82 84 85 87 89 91 92 94 95 97 99 100 102 103 105 106 107 109 110 112 113 114 115 117 118 121 123 135 146 156 174 41 45 49 53 56 59 63 66 68 71 74 77 79 81 84 86 88 90 92 94 96 98 100 101 103 105 107 108 110 112 113 115 117 118 120 121 123 124 126 127 128 130 133 135 148 160 171 191 IAL - 299 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 158/IV Testes discriminativos – Teste de comparação pareada Procedimento – O teste de comparação pareada pode ser direcional, detectando pequenas diferenças entre amostras quanto a um atributo específico ou estabelecendo a existência de uma preferência. Pode ser aplicado para selecionar e treinar julgadores. Duas amostras são apresentadas simultaneamente. Cabe ao julgador identificar a amostra codificada que apresenta o atributo específico diferente (Ficha 5) ou a amostra preferida. Ao julgador deve-se fazer uma pergunta específica relevante, referindo-se à diferença, diferença direcional ou preferência. Perguntas sobre diferença e preferência não devem ser combinadas. A escolha é forçada. A probabilidade de acertos é de 50% (p = 1/2). A interpretação do resultado se baseia no número de julgamentos totais versus o número de julgamentos corretos. Se o número de julgamentos corretos for maior ou igual ao valor tabelado (Tabela 5, unilateral e bilateral) conclui-se que existe diferença significativa entre as amostras ao nível de probabilidade correspondente (Quadro 8). O teste unilateral é utilizado quando a priori se sabe que existe diferença entre amostras, mas, deseja saber se esta diferença é perceptível sensorialmente. O teste bilateral é empregado quando não se sabe se existe diferença entre amostras ou na avaliação da preferência. O número de julgadores selecionados deve ser no mínimo 15, porém com equipe altamente treinada pode-se trabalhar com 8 a 9 julgadores. Ao julgador deve ser fornecido um ou mais pares de amostras codificadas, apresentadas em ordem balanceada ou ao acaso nas permutações AB e BA. Ficha 5 – Modelo para teste de comparação pareada Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo duas amostras codificadas. Uma amostra codificada é mais intensa no atributo (especificar). Identifique-a com um círculo. __________ Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13088, 1994. 300 - IAL __________ Quadro 8 – Modelo de casualização e resultado para comparação pareada Amostra: nº de codificação: nº (A) _______ Nome do julgador 1 (B) _______ Ordem de apresentação A B 2 B A 3 A B 4 B A 5 A B 6 B A Resposta do julgador* (C) ou (E) Comentários p nº de julgamentos totais (p) nº de julgamentos corretos Valor tabelado (nível de probabilidade) * Correta (C) Errada (E) p = nº de julgadores ou julgamentos Tabela 5 – Teste de comparação pareada. Número mínimo de julgamentos corretos para estabelecer significância em vários níveis de probabilidade. nº total de julgamentos 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Níveis de probabilidade (α) Bilateral (p=1/2), preferência Unilateral (p=1/2), diferença 5% 1% 0,1% 5% 1% 0,1% 5 6 6 7 7 7 8 8 7 8 8 9 8 9 9 10 9 10 10 10 11 11 9 10 11 10 11 12 10 11 12 11 12 13 10 12 13 12 13 14 11 12 13 12 13 14 12 13 14 13 14 15 12 14 15 13 15 16 13 14 16 14 15 17 13 15 16 15 16 17 14 15 17 15 17 18 15 16 18 16 17 19 15 17 18 17 18 19 16 17 19 17 19 20 16 18 20 18 19 21 17 19 20 18 20 21 18 19 21 19 20 22 18 20 22 20 21 23 19 20 22 20 22 23 19 21 23 21 22 24 20 22 24 21 23 25 20 22 24 IAL - 301 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Níveis de probabilidade (α) nº total de Bilateral (p=1/2), preferência Unilateral (p=1/2), diferença julgamentos 5% 1% 0,1% 5% 1% 0,1% 31 22 24 25 21 23 25 32 23 24 26 22 24 26 33 23 25 27 22 24 26 34 24 25 27 23 25 27 35 24 26 28 23 25 27 36 25 27 29 24 26 28 37 25 27 29 24 26 29 38 26 28 30 25 27 29 39 27 28 31 26 28 30 40 27 29 31 26 28 30 41 28 30 32 27 29 31 42 28 30 32 27 29 32 43 29 31 33 28 30 32 44 29 31 34 28 31 33 45 30 32 34 29 31 34 46 31 33 35 30 32 34 47 31 33 36 30 32 35 48 32 34 36 31 33 36 49 32 34 37 31 34 36 50 33 35 37 32 34 37 60 39 41 44 37 40 43 70 44 47 50 43 46 49 80 50 52 56 48 51 55 90 55 58 61 54 57 61 100 61 64 67 59 63 66 Fonte: ABNT, NBR 13088, 1994 159/IV Testes discriminativos – Teste de comparação múltipla Procedimento – O teste de comparação múltipla ou diferença-do-controle avalia, simultaneamente, uma ou mais amostras quanto a um atributo específico, determinando a diferença e o grau da diferença em relação a um controle (C). Apresenta-se o controle (C), a amostra-controle codificada e uma ou mais amostras-teste codificadas. Cabe ao julgador avaliar e dar valores às amostras-teste codificadas em comparação ao controle através da escala de grau de diferença (Ficha 6) que poderá ser verbal, numérica ou mista. Para análise dos dados faça correspondência entre os valores verbais e numéricos. Deve-se comunicar ao julgador que uma das amostras pode ser igual ao controle. A interpretação do resultado (Quadro 9) é realizada por meio da análise de variância (Quadro 10 – Tabela 6) e teste de comparação múltipla de médias. Quando o interesse é comparar amostra-teste com a amostra-controle, o teste apropriado é o de Dunnett, unilateral ou bilateral (Tabelas 7 ou 8). O número de julgadores deve ser no mínimo 7 especialistas ou, 15 treinados. As amostras são geralmente apresentadas em delineamento experimental de blocos completos balanceados ou casualizados. 302 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial Ficha 6 – Modelo para teste de comparação múltipla ou diferença-do-controle Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo uma amostra controle (C) e três amostras codificadas. Compare cada uma com o controle quanto ao atributo (especificar). Expresse o valor da diferença utilizando a escala abaixo: 1 nenhuma 2 ligeira 3 moderada 4 muita 5 extrema valor _______ _______ _______ _______ _______ _______ Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13526, 1995. Quadro 9 – Modelo de casualização e resultados do teste de comparação múltipla ou diferença-do-controle Amostra: nº de codificação: (A = controle codificado) _____ nº Nome do julgador 1 2 3 4 5 6 p Soma de valores por amostra Soma de valores por julgador Média dos valores por amostra nº de julgadores ou julgamentos (p) nº de amostras ou tratamentos (n) nº de observações (N = n x p) (B) _____ (C) _____ Ordem de apresentação A B C A C B B C A B A C C A B C B A Σ am (A) Σ julg (1) Σ am (B) Σ julg (2) Σ am (C) Σ julg (3) Σ am(A)/p Σ am(B)/p Σ am(C)/p Comentários Σ total am Σ total julg IAL - 303 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Análise de Variância – Utilizando as fórmulas a seguir, realize a ANOVA tomando como orientação o Quadro 10. Cálculos FC = (Σ total am ou julg)2 / N N=nxp SQ am = {[Σ am (A)] 2 + [Σ am (B)] 2 + [Σ am (C)] 2 /p} - FC SQ julg = {[Σjulg (1)] 2 +[Σjulg (2)] 2 +[Σ julg (3)] 2 /n} - FC SQ tot = Σ (cada valor atribuído às amostras pelos julgadores) 2 - FC SQ res = SQ tot - (SQ am + SQ julg) Quadro 10 – Modelo para análise de variância (ANOVA) FV Amostra Julgador Resíduo Total GL (n – 1) (p – 1) (N – 1) – (n – 1) – (p – 1) SQ SQ am SQ julg SQ res (N – 1) SQ tot QM SQ am / n – 1 SQ julg / p – 1 SQ res / N – n – p + 1 Fc QMam / QMres QMjulg / QMres - - - FV = fontes de variação; GL = graus de liberdade; SQ = soma dos quadrados; QM = quadrado médio; Fo = valor observado de estatística “F” de Snedecor (Tabela 6); Fc = valor calculado. Nota: se Fcam for maior que Fo, existe diferença significativa (p<0,05) entre pelo menos duas amostras codificadas. Diferença mínima significativa (DMS) pelo teste de Dunnett – Para verificar qual amostrateste difere da amostra-controle (C) ao nível de significância de 5%, utilize a fórmula: QM res = quadrado médio do resíduo n = número de repetições de cada amostra (número de julgadores) d = valor crítico para teste unilateral ou bilateral de Dunnett (Tabela 7 ou 8) As amostras que diferirem do controle codificado por uma diferença maior ou igual ao valor de DMS, são consideradas significativamente diferentes do controle ao nível de significância de 5%. Utilize o teste de Dunnett unilateral (Tabela 7) quando a priori sabe-se 304 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial que existe diferença entre amostras, ou bilateral (Tabela 8) quando não se sabe se existe diferença entre amostras. Tabela 6 – Valores de F para o nível de erro α = 5%, segundo número de graus de liberdade de n1 e n2 n2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 40 60 120 1 6,61 5,99 5,59 5,32 5,12 4,96 4,84 4,75 4,67 4,60 4,54 4,49 4,45 4,41 4,38 4,35 4,32 4,30 4,28 4,26 4,24 4,23 4,21 4,20 4,18 4,17 4,08 4,00 3,92 2 5,79 5,14 4,74 4,46 4,26 4,10 3,98 3,89 3,81 3,74 3,68 3,63 3,59 3,55 3,52 3,49 3,47 3,44 3,42 3,40 3,39 3,37 3,35 3,34 3,33 3,32 3,23 3,15 3,07 3 5,41 4,76 4,35 4,07 3,86 3,71 3,59 3,49 3,41 3,34 3,29 3,24 3,20 3,16 3,13 3,10 3,07 3,05 3,03 3,01 2,99 2,98 2,96 2,95 2,93 2,92 2,84 2,76 2,68 4 5,19 4,53 4,12 3,84 3,63 3,48 3,36 3,26 3,18 3,11 3,06 3,01 2,96 2,93 2,90 2,87 2,84 2,82 2,80 2,78 2,76 2,74 2,73 2,71 2,70 2,69 2,61 2,53 2,45 5 5,05 4,39 3,97 3,69 3,48 3,33 3,20 3,11 3,03 2,96 2,90 2,85 2,81 2,77 2,74 2,71 2,68 2,66 2,64 2,62 2,60 2,59 2,57 2,56 2,55 2,53 2,45 2,37 2,29 n1 6 4,95 4,28 3,87 3,58 3,37 3,22 3,09 3,00 2,92 2,85 2,79 2,74 2,70 2,66 2,63 2,60 2,57 2,55 2,53 2,51 2,49 2,47 2,46 2,45 2,43 2,42 2,34 2,25 2,17 7 4,88 4,21 3,79 3,50 3,29 3,14 3,01 2,91 2,83 2,76 2,71 2,66 2,61 2,58 2,54 2,51 2,49 2,46 2,44 2,42 2,40 2,39 2,37 2,36 2,35 2,33 2,25 2,17 2,09 8 4,82 4,15 3,73 3,44 3,23 3,07 2,95 2,85 2,77 2,70 2,64 2,59 2,55 2,51 2,48 2,45 2,42 2,40 2,37 2,36 2,34 2,32 2,31 2,29 2,28 2,27 2,18 2,10 2,02 9 4,77 4,10 3,68 3,39 3,18 3,02 2,90 2,80 2,71 2,65 2,59 2,54 2,49 2,46 2,42 2,39 2,37 2,34 2,32 2,30 2,28 2,27 2,25 2,24 2,22 2,21 2,12 2,04 1,96 10 4,74 4,06 3,64 3,35 3,14 2,98 2,85 2,75 2,67 2,60 2,54 2,49 2,45 2,41 2,38 2,35 2,32 2,30 2,27 2,25 2,24 2,22 2,20 2,19 2,18 2,16 2,08 1,99 1,91 11 4,70 4,03 3,60 3,31 3,10 2,94 2,82 2,72 2,63 2,56 2,51 2,45 2,41 2,37 2,34 2,31 2,28 2,26 2,24 2,22 2,20 2,18 2,16 2,15 2,14 2,12 2,04 1,95 1,86 Fonte: ABNT, NBR 13526, 1995. n1 = graus de liberdade da causa de variação (amostra); n2 = graus de liberdade do resíduo. IAL - 305 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 7 – Valores de d para teste de Dunnett, unilateral, nível de erro α = 5%, segundo o número de tratamentos P excluindo o controle, e o número de graus de liberdade do resíduo n1 n1 1 2 5 2,02 2,44 6 1,94 2,34 7 1,89 2,27 8 1,86 2,22 9 1,83 2,18 10 1,81 2,15 11 1,80 2,13 12 1,78 2,11 13 1,77 2,09 14 1,76 2,08 15 1,75 2,07 16 1,75 2,06 17 1,74 2,05 18 1,73 2,04 19 1,73 2,03 20 1,72 2,03 24 1,71 2,01 30 1,70 1,99 40 1,68 1,97 60 1,67 1,95 120 1,66 1,93 Fonte: ABNT, NBR 13526, 1995. 3 2,68 2,56 2,48 2,42 2,37 2,34 2,31 2,29 2,27 2,25 2,24 2,23 2,22 2,21 2,20 2,19 2,17 2,15 2,13 2,10 2,08 4 2,85 2,71 2,62 2,55 2,50 2,47 2,44 2,41 2,39 2,37 2,36 2,34 2,33 2,32 2,31 2,30 2,28 2,25 2,23 2,21 2,18 P 5 2,98 2,83 2,73 2,66 2,60 2,56 2,53 2,50 2,48 2,46 2,44 2,43 2,42 2,41 2,40 2,39 2,36 2,33 2,31 2,28 2,26 6 3,08 2,92 2,82 2,74 2,68 2,64 2,60 2,58 2,55 2,53 2,51 2,50 2,49 2,48 2,47 2,46 2,43 2,40 2,37 2,35 2,32 7 3,16 3,00 2,89 2,81 2,75 2,70 2,67 2,64 2,61 2,59 2,57 2,56 2,54 2,53 2,52 2,51 2,48 2,45 2,42 2,39 2,37 8 3,24 3,07 2,95 2,87 2,81 2,76 2,72 2,69 2,66 2,64 2,62 2,61 2,59 2,58 2,57 2,56 2,53 2,50 2,47 2,44 2,41 9 3,30 3,12 3,01 2,92 2,86 2,81 2,77 2,74 2,71 2,69 2,67 2,65 2,64 2,62 2,61 2,60 2,57 2,54 2,51 2,48 2,45 Tabela 8 – Valores de d para teste de Dunnett, bilateral, nível de erro α = 5%, segundo o número de tratamentos P excluindo o controle, e o número de graus de liberdade do resíduo n1 n1 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 306 - IAL 1 2,57 2,45 2,36 2,31 2,26 2,23 2,20 2,18 2,16 2,14 2,13 2 3,03 2,86 2,75 2,67 2,61 2,57 2,53 2,50 2,48 2,46 2,44 3 3,29 3,10 2,97 2,88 2,81 2,76 2,72 2,68 2,65 2,63 2,61 4 3,48 3,26 3,12 3,02 2,95 2,89 2,84 2,81 2,78 2,75 2,73 P 5 3,62 3,39 3,24 3,13 3,05 2,99 2,94 2,90 2,87 2,84 2,82 6 3,73 3,49 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98 2,94 2,91 2,89 7 3,82 3,57 3,41 3,29 3,20 3,14 3,08 3,04 3,00 2,97 2,95 8 3,90 3,64 3,47 3,35 3,26 3,19 3,14 3,09 3,06 3,02 3,00 9 3,97 3,71 3,53 3,41 3,32 3,24 3,19 3,14 3,10 3,07 3,04 16 2,12 2,42 n1 1 2 17 2,11 2,41 18 2,10 2,40 19 2,09 2,39 20 2,09 2,38 24 2,06 2,35 30 2,04 2,32 40 2,02 2,29 60 2,00 2,27 120 1,98 2,24 Fonte: ABNT, NBR 13526, 1995. 2,59 2,71 3 2,58 2,56 2,55 2,54 2,51 2,47 2,44 2,41 2,38 4 2,69 2,68 2,66 2,65 2,61 2,58 2,54 2,51 2,47 2,80 P 5 2,78 2,76 2,75 2,73 2,70 2,66 2,62 2,58 2,55 2,87 2,92 2,97 3,02 6 2,85 2,83 2,81 2,80 2,76 2,72 2,68 2,64 2,60 7 2,90 2,89 2,87 2,86 2,81 2,77 2,73 2,69 2,65 8 2,95 2,94 2,92 2,90 2,86 2,82 2,77 2,73 2,69 9 3,00 2,98 2,96 2,95 2,90 2,86 2,81 2,77 2,73 160/IV Testes com escalas Procedimento – Os testes usando escalas indicam o tipo ou a intensidade de uma resposta sensorial. As escalas são classificadas em quatro classes: nominal, ordinal, intervalo e de proporção. A escala nominal especifica somente classes ou categorias, as quais não possuem nenhuma relação quantitativa entre si como, por exemplo, a escala de classificação da bebida de café. A escala ordinal especifica as categorias como uma série ordenada, porém sem expressar o tamanho da diferença entre elas, sendo utilizada nos testes de ordenação. A escala de intervalo assume igualdade de distância (intervalos) entre pontos (categorias) da escala e origem arbitrária. Estas escalas são ancoradas em vários pontos, geralmente nas extremidades e às vezes no meio da escala, com termos que indicam a magnitude da resposta. Costumam variar de 5 a 15 pontos (5-15) cm nas escalas não estruturadas). São utilizadas nas avaliações de atributos específicos, nos testes de perfil de textura, na análise descritiva quantitativa (ADQ) e nos testes de preferência e aceitação (escala hedônica e de atitude). A escala hedônica é uma escala de intervalo que expressa o grau de gostar ou desgostar de uma amostra pelo consumidor. As escalas de intervalo se classificam em estruturada e não estruturada e em unipolar e bipolar. Na escala estruturada (numérica e/ou verbal) os intervalos são associados a números e/ou termos descritivos. Na escala não estruturada, linear ou gráfica, a linha é demarcada por expressões quantitativas nas extremidades ou distantes destas (0,5-1,25) cm. A escala unipolar apresenta extremidade zero enquanto que a bipolar revela descrições opostas nas duas extremidades. A escala de proporção envolve a livre atribuição de números pelos julgadores para indicar as proporções das intensidades sensoriais em relação a uma amostra de referência, fornecendo a relação de proporção entre o estímulo e a resposta. É utilizada no teste de estimativa da magnitude. Nos testes de escala, as amostras codificadas e aleatorizadas são apresentadas simultaneamente ou não ao julgador para que avalie o atributo específico utilizando uma escala pré-definida (Ficha 7). Os resultados obtidos são avaliados estatisticamente segundo o objetivo proposto. GeIAL - 307 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital ralmente, é realizada análise de variância (Quadro 10) e testes de comparação de médias como, por exemplo, de Tukey (Tabela 9), Ducan ou SNK (Student-Newman-Keuls), com nível de significância pré-fixado. Escolha o delineamento experimental estatístico segundo o objetivo. Pode-se optar pelo delineamento experimental de blocos completos casualizados ou blocos incompletos, se o número de amostras for grande e/ou o atributo revelar intenso grau de fadiga sensorial. Outros delineamentos experimentais também conhecidos podem ser empregados. No delineamento de blocos completos casualizados todos os tratamentos são casualizados dentro de cada bloco. Cada provador avalia todas as amostras, em uma só sessão de teste. Blocos incompletos casualizados é o delineamento onde os blocos não contêm todos os tratamentos. Ficha 7 – Modelo de escala estruturada de 7 pontos (numérica, verbal, bipolar) Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codificadas. Avalie cada uma segundo a intensidade de dureza (atributo de textura), utilizando a escala abaixo: (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Muito duro Duro Levemente duro Nem duro nem mole Levemente mole Mole Muito mole ________ ( ) ________ ( ) ________ ( ) Comentários: Fonte: ABNT, NBR 14141, 1998. Tabela 9 – Valores de q para teste de Tukey, nível de erro α = 5%, segundo o número de tratamentos P e graus de liberdade do resíduo n 1 n1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 308 - IAL P 2 17,97 6,08 4,50 3,93 3,64 3,46 3,34 3,26 3,20 3 26,98 8,33 5,91 5,04 4,60 4,34 4,16 4,04 3,95 4 32,82 9,80 6,82 5,76 5,22 4,90 4,68 4,53 4,41 5 37,08 10,88 7,50 6,29 5,67 5,30 5,06 4,89 4,76 6 40,41 11,74 8,04 6,71 6,03 5,63 5,35 5,17 5,02 7 43,12 12,44 8,48 7,05 6,33 5,90 5,61 5,40 5,24 8 45,40 13,03 8,85 7,35 6,58 6,12 5,82 5,60 5,43 9 47,36 13,54 9,18 7,60 6,80 6,32 6,00 5,77 5,59 10 49,07 13,99 9,45 7,83 6,99 6,49 6,16 5,92 5,74 15 55,36 15,65 10,53 8,66 7,72 7,14 6,76 6,48 6,28 Capítulo VI - Análise Sensorial n1 2 3 10 3,15 3,88 11 3,11 3,82 12 3,08 3,77 13 3,06 3,73 14 3,03 3,70 15 3,01 3,67 16 3,00 3,65 17 2,98 3,63 18 2,97 3,61 19 2,96 3,59 20 2,95 3,58 24 2,92 3,53 30 2,89 3,49 40 2,80 3,44 60 2,83 3,40 120 2,80 3,36 ∞ 2,77 3,31 Fonte: DA SILVA (1998). P 4 4,33 4,26 4,20 4,15 4,11 4,08 4,05 4,02 4,00 3,98 3,96 3,90 3,85 3,79 3,74 3,68 3,63 5 4,65 4,57 4,51 4,45 4,41 4,37 4,33 4,30 4,28 4,25 4,23 4,17 4,10 4,04 3,98 3,92 3,86 6 4,91 4,82 4,75 4,69 4,64 4,59 4,56 4,52 4,49 4,47 4,45 4,37 4,30 4,23 4,16 4,10 4,03 7 5,12 5,03 4,95 4,88 4,83 4,78 4,74 4,70 4,67 4,65 4,62 4,54 4,46 4,39 4,31 4,24 4,17 8 5,30 5,20 5,12 5,05 4,99 4,94 4,90 4,86 4,82 4,79 4,77 4,68 4,60 4,52 4,44 4,36 4,29 9 5,46 5,35 5,27 5,19 5,13 5,08 5,03 4,99 4,96 4,92 4,90 4,81 4,72 4,63 4,55 4,47 4,39 10 5,60 5,49 5,39 5,32 5,25 5,20 5,15 5,11 5,07 5,04 5,01 4,92 4,82 4,73 4,65 4,56 4,47 15 6,11 5,98 5,88 5,79 5,71 5,65 5,59 5,54 5,50 5,46 5,43 5,32 5,21 5,11 5,00 4,90 4,80 Nota: diferença mínima significativa, DMS, utilizando o teste de Tukey QMres = quadrado médio do resíduo n = número de julgamentos por tratamento q = valor crítico tabelado a nº de tratamentos e graus de liberdade do resíduo Testes sensoriais descritivos Métodos utilizados em análise sensorial de alimentos, bebidas e água. Descrevem os componentes ou parâmetros sensoriais e medem a intensidade em que são percebidos. Alguns dos componentes mais empregados em testes descritivos são os observados no Quadro 11 que se referem à aparência, odor e aroma, textura oral e manual, sensações táteis e superficiais, sabor e gosto. Geralmente, a equipe sensorial define previamente os termos relativos às propriedades mais relevantes do produto e sua seqüência de avaliação. Na análise descritiva o provador também avalia, através de uma escala, o grau de intensidade com que cada atributo está presente. Os julgadores devem ser treinados a usar a escala de forma consistente em relação à equipe e às amostras, durante todo período de avaliação. Exige-se cuidado na padronização do preparo e apresentação de amostras e na formação da equipe sensorial. As amostras devem ser codificadas com números de três dígitos aleatórios, casualizadas e apresentadas à equipe treinada e selecionada. As técnicas descritivas mais utilizadas são o do perfil de sabor, perfil de textura, a análise descritiva quantitativa (ADQ) e o de tempointensidade. As técnicas descritivas de espectro e de perfil livre também têm sido utilizadas. IAL - 309 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Quadro 11 – Parâmetros ou componentes sensoriais utilizados em análise descritiva Aparência Odor e aroma Tamanho e forma: dimensão, geometria. Textura superficial: maciez, aspereza. Interação entre partículas e fragmentos: viscosidade, aglomerado, partícula solta. Cor: matiz, croma, uniformidade, profundidade, brilho. Sensações olfativas: floral, frutado, pútrido, baunilha. Sensações nasais: frescor, quente, pungente. Textura manual Mecânicos de reação à força e pressão: dureza e firmeza; força de compressão ou extensão ou tensão; elasticidade, volta à posição ou forma original após compressão. Geométricos e/ou tamanho, forma e orientação das partículas: áspero, arenoso, floculoso, frisado, nervuras ou com listas. Presença e absorção de umidade: seco, dessecado, oleoso, untuoso, embebido. Textura oral Mecânicos de reação à força e pressão: firmeza; viscosidade; deformação; fraturabilidade. Geométricos e/ou tamanho, forma e orientação das partículas: arenoso; granuloso, fibroso, floculoso. Umidade e gordura e/ou presença e absorção de água, óleo e gordura: aguado ou úmido, suculento, ensopado, untuoso ou besuntado. Sensações táteis e superficiais Mecânicos de reação à força e pressão: densidade, espessura ou grossura, lisa ou escorregadiça, elasticidade ou expandida, distendida, espalhada, estendida. Umidade, gordura e/ou presença de absorção de água, óleo ou gordura: aguado ou umedecido, ensopado, oleoso, untuoso ou besuntado, seco ou secura ou dessecado. Geométricos e/ou tamanho, forma e orientação das partículas táteis após contato: arenoso, floculoso, espumoso ou escumoso. De aparência, mudanças visuais durante o uso do produto: polido ou lustroso, brancura ou pálido, macilento ou emaciado, pontiagudo. Sabor e gosto Sensações olfativas: floral, frutado, cacau ou chocolate, pútrido, rançoso. Sensações gustativas: doce, salgado, ácido, amargo, umami. Sensações orais: frio, quente, adstringente, metálico, queimado. Fonte: MEILGAARD et al. 1991 161/IV Testes descritivos – Perfil de sabor Procedimento – Pelo método perfil de sabor (Arthur D. Little, 1940 em Meilgaard et al, 1987) pode ser realizada descrição completa do odor e aroma, do sabor e das sensações bucais residuais perceptíveis pelos julgadores, determinando graus de diferenças entre amostras ou suas misturas e impressão global do produto. Os julgadores, com a ajuda do líder definem os atributos e os materiais de referência. É empregada escala constante de categoria. Sempre se avalia a amplitude do aroma e sabor, definida como a intensidade geral, ou seja, o primeiro impacto causado pelo aroma ou sabor. Embora os julgamentos sejam individuais, após cada avaliação, o líder da equipe discute com seus membros os valores de intensidade dados a cada atributo. O perfil de aroma e sabor de cada amostra é construído por consen310 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial so. Os resultados são expressos de forma tabular ou gráfica. Em geral não são conduzidas análises estatísticas dos dados obtidos. A equipe é composta por número de quatro a seis julgadores treinados. Estes devem manifestar interesse e potencial para trabalhar em grupo, habilidade para identificar e para discriminar as intensidades de gostos e odores. 162/IV Testes descritivos – Perfil de textura Procedimento – O método Perfil de Textura (Brandt, 1963; Civille e Szczesniak, 1973; Civille e Liska, 1975 em Meilgaard et al, 1987) pode fornecer uma descrição completa da textura, segundo parâmetros mecânicos, geométricos, de gordura e umidade, com definição do grau em que estão presentes e da ordem com que são percebidos desde a primeira mordida até a mastigação e fases finais de deglutição. Com base nas avaliações são utilizadas classificações e definições dos termos de textura, bem como referências de intensidade descritos na literatura. Todos os termos descritivos são definidos com o objetivo de reduzir a variabilidade entre julgadores. Dependendo da escala utilizada, o tratamento dos dados pode ser obtido por consenso da equipe em cada atributo ou análise estatística pela análise de variância (ANOVA), análise m ultivariada (MANOVA) e análise de componentes principais (ACP). A apresentação dos resultados pode ser tabular ou gráfica. O número de julgadores pode variar de 6 a 10 e são inicialmente selecionados com base no interesse, disponibilidade e atitude, por entrevista. Os julgadores são treinados em definição de textura, procedimento de avaliação e nas escalas de referência, sendo então selecionados pela habilidade de discriminação em atributos de textura. 163/IV Testes descritivos – Análise descritiva quantitativa Procedimento – O método da Análise descritiva quantitativa (ADQ) desenvolvida por STONE et al. (1974) é muito utilizado para traçar, de forma a mais completa possível, o perfil sensorial quanto aos atributos de aparência, odor, textura e sabor. O método identifica os atributos e os quantifica na ordem de ocorrência. Primeiramente, os atributos são decompostos pela equipe sensorial que busca os termos descritores, seus significados, materiais de referências adequados e a melhor seqüência de avaliação. Para isto, é muito empregado o método de rede de MOSKOWITZ (1983), onde o julgador descreve as similaridades e diferenças entre pares de amostras (Ficha 8). Os termos gerados são listados por consenso (Ficha 9) permanecendo os citados em maior número de vezes para compor a ficha (Ficha 10). As escalas não estruturadas, de (9-15) cm, são mais empregadas. Os dados obtidos, normalmente, são submetidos à análise de variância (fontes de variação: julgador (J), tratamento (T), interação (J*T) e resíduo). Podem ser utilizados outros tratamentos estatísticos, como técnicas de análise multivariada, de acordo com os objetivos do teste. Diferenças entre tratamentos devem ser analisadas utilizando-se testes de comparação de médias, tais como de Tukey (Tabela 9), de Ducan ou SNK (Student-Newman-Keuls). A ADQ pode ser representada por gráfico aranha e por análise de componentes principais (ACP), onde a primeira sugere similaridades e diferenças entre as amostras e a segunda aponta relações existentes entre IAL - 311 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital elas, evidenciando o que mais as caracterizam. Recomenda-se que o número de julgadores selecionados seja entre 8 e 25 julgadores treinados. Avalie o desempenho de cada julgador por testes com duas ou mais amostras diferentes, em pelos menos três repetições. O critério de seleção é para os julgadores que discriminam amostras com probabilidade (p) menor ou igual a 0,50 pela ANOVA. Pode haver o retreinamento dos julgadores selecionados. Vários delineamentos experimentais estatísticos são recomendados, podendo-se optar pelo de blocos completos casualizados ou blocos incompletos casualizados, conforme o caso; estes são os mais freqüentemente utilizados. Ficha 8 – Modelo de ficha para o método de rede Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo duas amostras codificadas. Avalie cada uma quanto aos atributos abaixo apontando suas similaridades e diferenças. Códigos das amostras: ________ / ________ Similaridades Aparência: Odor: Textura: Sabor: 312 - IAL Diferenças Capítulo VI - Análise sensorial Ficha 9 – Modelo para listagem consensual de atributos e número de vezes em que foram citados pelo método de rede Termos descritivos ou descritores - Atributos Aparência: 1: 2: n: Odor: 1: 2: n: 1: 2: n: 1: 2: n: Textura: Sabor: Número de vezes Ficha 10 – Modelo de escala não estruturada para análise descritiva quantitativa Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codificadas. Avalie cada uma segundo a intensidade do atributo específico, assinalando com um traço vertical as escalas abaixo: Aparência: Atributo 1 _|______________________________________|_ Fraco Forte Atributo 2 _|______________________________________|_ Fraco Forte Odor: Atributo 3 _ |______________________________________|_ Fraco Forte Atributo 4 _|______________________________________|_ Fraco Forte Textura: Atributo 5 _|______________________________________|_ Pouca Muita Atributo 6 _|______________________________________|_ Fraco Forte Sabor: Atributo 7 _ |______________________________________|_ Fraco Forte Atributo 8 _|______________________________________|_ Ausente Forte Comentário: Fonte: ABNT, NBR 14140, 1998. IAL - 313 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Testes afetivos Método utilizado em análise sensorial de alimentos, bebidas e água. O julgador expressa seu estado emocional ou reação afetiva ao escolher um produto pelo outro. É a forma usual de se medir a opinião de um grande número de consumidores com respeito as suas preferências, gostos e opiniões. As escalas mais empregadas são: de intensidade, a hedônica, do ideal e de atitude ou de intenção. Os julgadores não precisam ser treinados bastando ser consumidores freqüentes do produto em avaliação. Os testes afetivos em função do local de aplicação podem ser de laboratório, localização central e uso doméstico. Basicamente, os testes afetivos podem ser classificados em duas categorias: de preferência (escolha) e de aceitação (categoria). 164/IV Testes afetivos – Testes de preferência Procedimento – O indivíduo manifesta sua preferência em relação ao produto que lhe é oferecido. As escalas mais utilizadas são de ordenação-preferência e comparação pareada. No teste de ordenação-preferência (Ficha 11) uma série de amostras é apresentada para que seja ordenada de acordo com a preferência do julgador. Na comparação pareada (Ficha 12) são apresentados pares de amostras para serem comparadas pelo julgador em relação a sua preferência. Ficha 11 – Modelo para teste ordenação-preferência Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codiicadas, avalie cada uma na ordem crescente de sua preferência. ________ (1) (menos preferida) Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13170, 1994. 314 - IAL ________ (2) ________ (3) (mais preferida) Capítulo VI - Análise sensorial Ficha 12 – Modelo para teste pareado-preferência Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo duas amostras codificadas, identifique com um círculo a sua amostra preferida. __________ __________ Comentários: Fonte: ABNT, NBR 13088, 1994. 165/IV Testes afetivos – Testes de aceitação por escala hedônica Procedimento – Com o teste da escala hedônica, o indivíduo expressa o grau de gostar ou de desgostar de um determinado produto, de forma globalizada ou em relação a um atributo específico. As escalas mais utilizadas são as de 7 e 9 pontos, que contêm os termos definidos situados, por exemplo, entre “gostei muitíssimo” e “desgostei muitíssimo” contendo um ponto intermediário com o termo “nem gostei; nem desgostei”. É importante que as escalas possuam número balanceado de categorias para gosto e desgosto. As amostras codificadas com algarismos de três dígitos e aleatorizadas são apresentadas ao julgador para avaliar o quanto gosta ou desgosta de cada uma delas através da escala previamente definida (Ficha 13). Sua preferência é obtida por inferência. Os dados coletados podem ser avaliados estatisticamente pela análise de variância, ANOVA (Quadro 10) e comparação das médias de pares de amostras pelo teste de Tukey (Tabela 9). Se for empregada escala hedônica com comparação a um padrão de referência, será utilizado o teste de Dunnett. Recomenda-se que o número de julgadores seja entre 50 e 100. O delineamento experimental a ser utilizado deve ser previamente escolhido, podendo-se optar pelo de blocos completos balanceados ou casualizados ou blocos incompletos casualizados, conforme a situação. IAL - 315 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ficha 13 – Modelo de escala hedônica (estruturada verbal, numérica, bipolar, nove pontos). Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo quatro amostras codificadas. Avalie globalmente cada uma segundo o grau de gostar ou desgostar, utilizando a escala abaixo. ( 9 ) gostei extremamente ( 8 ) gostei moderadamente ( 7 ) gostei regularmente ( 6 ) gostei ligeiramente ( 5 ) não gostei, nem desgostei ( 4 ) desgostei ligeiramente ( 3 ) desgostei regularmente ( 2 ) desgostei moderadamente ( 1 ) desgostei extremamente _______ ( ) _______ ( ) _______ ( ) _______ ( ) Comentários: Fonte: ABNT, NBR 14141, 1998. 166/IV Testes afetivos – Testes de aceitação por escala do ideal Procedimento – Na escala do ideal o indivíduo expressa o quão ideal o produto está em relação à intensidade de um atributo específico. Geralmente, a escala possui de 3 a 5 pontos, podendo conter termos opostos como, por exemplo, “muito fraco” a “muito forte” e no centro da escala o termo “ideal”, de tal forma que tenha números iguais de categorias de ambos os lados. São apresentadas ao julgador amostras codificadas e aleatorizadas para indicar o quão ideal está certo produto em relação a termos pré-definidos (Ficha 14). Geralmente, os dados obtidos são avaliados na forma de porcentagem de julgamentos, podendo ser utilizado um limite de 70% de respostas para o termo “ideal”. O resultado também pode ser avaliado elaborando-se um gráfico de freqüências das respostas através de histogramas ou comparando-se a distribuição das respostas das amostras avaliadas com uma amostra-padrão pelo teste Qui-quadrado ou por regressão linear simples. Recomenda-se que o número de julgadores selecionados esteja entre 50 e 100. O delineamento experimental deverá ser previamente definido, podendo-se optar pelo de blocos completos balanceados ou casualizados ou blocos incompletos casualizados, conforme a situação. 316 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial Ficha 14 – Modelo de escala do ideal (estruturada verbal, numérica, cinco pontos) Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codificadas. Indique o quão ideal está cada amostra em relação à ....., utilizando a escala abaixo. ( 1 ) muito fraca ( 2 ) fraca ( 3 ) ideal _______ ( ) ( 4 ) forte _______ ( ) ( 5 ) muito forte _______ ( ) Comentários: Fonte: ABNT, NBR 14141, 1998. 167/IV Testes afetivos –Testes de escala de atitude ou de intenção Procedimento – Por meio das escalas de atitude ou de intenção, o indivíduo expressa sua vontade em consumir, adquirir ou comprar, um produto que lhe é oferecido. As escalas mais utilizadas são as verbais de 5 a 7 pontos. As amostras codificadas e aleatorizadas podem ser apresentadas seqüencialmente ao julgador para serem avaliadas através da escala pré-definida (Ficha 15). Os termos definidos podem se situar, por exemplo, entre “provavelmente compraria” a “provavelmente não compraria” e, no ponto intermediário “talvez compraria, talvez não compraria”. É importante que a escala possua número balanceado de categorias entre o ponto intermediário e os extremos. Os dados são avaliados pelas freqüências através dos gráficos de histogramas. Recomenda-se que o número de julgadores esteja entre 50 a 100. O delineamento experimental deverá ser previamente definido, podendo-se optar pelo de blocos completos balanceados ou casualizados ou blocos incompletos casualizados, conforme a situação. IAL - 317 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ficha 15 – Modelo de escala de atitude ou de intenção (estruturada verbal, numérica, bipolar, sete pontos) Amostra: Julgador: Data: Você está recebendo três amostras codificadas. Avalie cada uma segundo a sua intenção de consumo, utilizando a escala abaixo. (7) Comeria sempre (6) Comeria muito freqüentemente (5) Comeria freqüentemente (4) Comeria ocasionalmente (3) Comeria raramente (2) Comeria muito raramente (1) Nunca comeria _______ ( ) _______ ( ) _______ ( ) Comentários: Fonte: ABNT, NBR 14141, 1998. Referências bibliográficas ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 12806: Análise sensorial de alimentos e bebidas. Terminologia. Rio de Janeiro, 1993. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 12994: Métodos de análise sensorial dos alimentos e bebidas. Rio de Janeiro, 1993. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 12995: Teste triangular em análise sensorial de alimentos e bebidas. Rio de Janeiro, 1993. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13088: Teste de comparação pareada em análise sensorial de alimentos e bebidas. Rio de Janeiro, 1994. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13169: Teste duo-trio em análise sensorial. Rio de Janeiro, 1994. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13170: Teste de ordenação em análise sensorial. Rio de Janeiro, 1994. 318 - IAL Capítulo VI - Análise sensorial ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 13526: Teste de comparação múltipla em análise sensorial de alimentos e bebidas. Rio de Janeiro, 1995. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 14140: Alimentos e bebidas. Análise Sensorial. Teste de análise descritiva quantitativa (ADQ). Rio de Janeiro, 1998. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 14141: Escalas utilizadas em análise sensorial de alimentos e bebidas. Rio de Janeiro, 1998. BRANDT, M.A.; SKINNER, E.Z.; COLEMAN, J.A. Texture profile method. J. Food. Sci. v. 28, p. 404-409, 1963. BODYFELT, F.W.; TOBIAS, J.; TROUT, G.M. The sensory evaluation of dairy products. 1st ed., New York/USA: AVI Book, 1988, 598 p. CAUL, J.F. he proile method of lavour analysis. Advances in food research. v. 7, p. 1-40, 1957. DA SILVA, M. A. A. P. Análise sensorial e instrumental de alimentos. Apostila de Disciplina. FEA/UNICAMP, Campinas, SP, 1998. ELLIS, B. H. A guide book for sensory testing. Continental Can Co., Chicago, III., 1961, 55 p. FARIA, E.V.; MORI, E.E.M.; YOTSUYANAGI, K. Técnicas de análise sensorial. Apostila de Curso. LAFISE/ITAL, Campinas, SP, 2000, 103 p. GRETAGMACBETH (USA). FM Test: Quick Guide to Operation – Munsell Color. New York /USA, 1997. 31 p. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO/DIS 3972/1979. Sensory analysis: method of investigating sensitivity of taste. Geneva: ISO 1990, 5 p. LARMOND, E. Laboratory methods for sensory evaluation of food. Agriculture Canadá, 1987, 73 p. MEILGAARD, M.; CIVILLE, G. V.; CARR, B. T. Sensory Evaluation Techniques. 1 ed., Flórida: CRC Press, 1987. IAL - 319 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital MEILGAARD, M.; CIVILLE, G.V.; CARR, B.T. Sensory Evaluation Techniques. 2 ed., Flórida: CRC press, 1991. 354 p. MELO, M.S. Caracteres Organolépticos de Alimentos e Bebidas. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 6, n. 1, p. 77-95, 1946. MOSKOWITTZ, H.R. Product Testing and Sensory Evaluation of Foods. Marketing and R & D Appproaches, Food and Nutrition Press, Inc. Westport, 1983. 605 p. SANCHO, J.; BOTA, E.; DE CASTRO, J.J. Introducción al análisis sensorial de los alimentos. 1 ed., Barcelona: Universitat de Barcelona, 1999. 336 p. SHALLENBERGER, R.S. Taste Chemistry. 1 ed., Cambridge/ USA: Chapman & Hall, 1993. 613 p. STONE, H.; SIDEL, J.; OLIVER, S.; WOOLSEY, A; SINGLETON, R.C. Sensory evaluation by quantitative descriptive analysis. Food Technol., v. 28, n. 11, p. 24-34, 1974. Colaboradores Maria Auxiliadora de Brito Rodas e Jussara Carvalho de Moura Della Torre 320 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos CAPÍTULO VII AÇÚCARES E PRODUTOS CORRELATOS IAL - 321 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 322 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos VII AÇÚCARES E PRODUTOS CORRELATOS N este capítulo são abordados os métodos de análise para produtos com alto teor de açúcar, tais como: açúcares reinado, cristal e mascavo, rapadura, melaço, xaropes de diversos tipos e mel. Com relação ao poder adoçante dos diferentes açúcares, não existem aparelhos especíicos para a sua determinação. Para a comparação desta propriedade, recorre-se a provas sensoriais. O poder adoçante relativo de alguns açúcares e a sua rotação especíica estão descritos na Tabela 1. Tabela 1 – Poder adoçante de alguns açúcares e sua rotação especíica Açúcar Poder adoçante relativo Rotação específica [ α ]D Lactose 16 + 52,5º Rainose 22 + 104,0º Galactose 32 + 80,2º Raminose 32 + 8,3º Maltose 32 + 137,0º Xilose 40 + 18,8º Dextrose 74 + 52,5º Sacarose 100 + 66,5º Açúcar invertido 130 - Frutose 173 - 92,3º IAL - 323 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital O açúcar, sem outra designação especíica, é a sacarose obtida da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) ou da beterraba (Beta vulgaris). De acordo com a tecnologia empregada, o açúcar é obtido em diferentes tipos e graus de pureza. As determinações para açúcar compreendem: sacarose por desvio polarimétrico direto, umidade, cor ICUMSA, cinzas (018/IV) e, eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII) e dióxido de enxofre (050/IV). As análises de glicose anidra e outros açúcares em pó mais usuais são as de glicídios redutores, glicídios não redutores, cinzas (018/IV) e, eventualmente minerais e metais pesados (cap. XXIII). A determinação quantitativa dos açúcares redutores pode ser efetuada por diferentes procedimentos, sendo o método de redução das soluções de Fehling o mais empregado. Xarope, sem outra especiicação, consiste de uma solução de açúcar em água, contendo aproximadamente dois terços de seu peso em sacarose ou de outros tipos de açúcares tais como: maltose, frutose ou glicose. Melaço é o líquido que se obtém como resíduo de fabricação do açúcar cristalizado, do melado ou da reinação do açúcar bruto. A análise de xaropes de diversos tipos de açúcares e melaço inclui as seguintes determinações: glicídios redutores, glicídios não redutores, graus Brix, umidade, cinzas (018/IV) e, eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII). Rapadura é o produto sólido obtido pela concentração a quente do caldo de cana (Saccharum officinarum). Na análise de rapadura, as determinações incluem: glicídios redutores em glicose, glicídios não redutores em sacarose, umidade (012/IV), cinzas (018/IV) e, eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII). O mel consiste basicamente de diferentes açúcares, predominantemente de frutose e glicose. Contém em menor proporção uma mistura complexa de outros carboidratos, enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, minerais e pólen. As determinações usuais em mel incluem, entre outras, umidade, acidez total, açúcares redutores, sacarose aparente, cinzas (018/IV), sólidos insolúveis em água, hidroximetilfurfural (HMF), atividade diastásica e as diferentes reações que podem fornecer indicações 324 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos sobre a adulteração do mel: reações de Lund, Fiehe e de Lugol. 168/IV Preparação da amostra de açúcares para análise No caso de amostras em torrões ou grânulos grandes, faça uma homogeneização quebrando no almofariz com o auxílio de um pistilo. Para xaropes densos, aqueça a amostra a (40 ± 1)°C, em banho-maria e esfrie à temperatura ambiente, antes de realizar os ensaios. Mel líquido – Se a amostra estiver livre de cristalização, homogeneíze a amostra cuidadosamente, antes das pesagens. Tome cuidado com possíveis bolhas de ar que possam se formar prejudicando algumas determinações. Mel cristalizado – Coloque a amostra em um recipiente fechado em banho-maria a (40 ± 1)ºC até 20 minutos, agitando ocasionalmente. Resfrie à temperatura ambiente antes de pesar. Não aqueça o mel que será utilizado para a determinação da atividade diastásica e do hidroximetilfurfural. Se estiverem presentes matérias estranhas, tais como: cera de abelha, partículas de favos, etc, iltre através de gaze e coloque num funil aquecido na estufa. 169/IV Açúcares – Sacarose por desvio polarimétrico direto Este método é aplicável a açúcares. A polarização é a porcentagem em massa da sacarose aparente contida em uma solução açucarada, determinada pelo desvio da luz polarizada ao atravessar esta solução. As rotações na escala são designadas como graus sacarimétricos (ºS) ou desvio polarimétrico [α]D20º. De acordo com a International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis (ICUMSA), uma solução normal de sacarose quimicamente pura corresponde a 100ºS, sendo a base de calibração do sacarímetro. 100ºS correspondem a um desvio polarimétrico de (34,620 ± 0,002)ºC, a 20ºC, no λ = 589,2 nm (lâmpada de sódio). Material Polarímetro com leitura em escala em graus sacarimétricos (ºS) ou desvio polarimétrico (αD20), tubo de vidro para polarímetro (200 ± 0,03) mm, termômetro, béquer de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, proveta de 50 mL, bastão de vidro, funil de vidro de tamanho pequeno, papel de iltro qualitativo e vidro de relógio. IAL - 325 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Creme de alumina Acetato básico de chumbo Procedimento – Pese, com precisão, (26,000±0,002)g da amostra totalmente homogeneizada em um béquer de 50 mL. Transira para um balão volumétrico de 100 mL, com o auxílio de 50 mL de água. Complete o volume com água a 20ºC. Enxugue a haste do balão volumétrico com papel de iltro e agite. Filtre e cubra o funil com vidro de relógio ao iniciar a iltração. Despreze os primeiros 25 mL do iltrado. Ajuste o polarímetro, conforme o manual do equipamento. Lave o tubo polarimétrico com o próprio iltrado e preencha com a mesma solução, evitando formação de bolhas no seu interior. Proceda a leitura com a luz monocromática de sódio (λ= 589,2 nm) em % de sacarose ou desvio polarimétrico, à temperatura constante de (20 ± 0,5)ºC. Nota: para soluções mais escuras, emprega-se creme de alumina ou acetato de chumbo seco. No caso deste último, adicione pequena quantidade do sal seco à solução de açúcar após ter completado o volume e misture. Repita, se necessário, as adições do sal até completar a precipitação e observe se a solução está sendo clariicada, tomando o cuidado de não se adicionar excesso do referido sal. Cálculo L = leitura no polarímetro [α]D20º Nota: se a leitura for realizada à temperatura de (20 ± 0,5)ºC não é necessária fazer correção da polarização. Caso contrário, deve ser feita a correção utilizando a expressão abaixo. P20 = polarização corrigida a 20ºC Pt = polarização lida à temperatura do ensaio t= temperatura da solução Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of 326 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed. Arlington: A.O.A.C., (method 925.46) 1995. chapter 44. p. 4. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 8869: Açúcar reinado - determinação de polarização. Rio de Janeiro, 1985. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 157. 170/IV Açúcares – Determinação da cor ICUMSA Este método é usado para a determinação da cor em açúcares, podendo ser aplicado em todos os açúcares brancos cristalizados ou em pó. Baseia-se na determinação da absorbância da solução açucarada, no comprimento de onda de 420 nm. A solução é preparada e iltrada para eliminar a turbidez. A cor ICUMSA é expressa em unidades ICUMSA. Material Espectrofotômetro UV/VIS, suporte para a cubeta de 5 a 10 cm de caminho óptico, refratômetro com escala em graus Brix, balança analítica, pHmetro, agitador magnético e barra magnética, banho de ultra-som, conjunto de iltração para membranas de 47 mm de polissulfona, bomba de vácuo, membranas iltrantes de ibra de vidro tipo AP25 e membrana hidrofílica (HA) tipo triton-free de (0,45 μm) e ambas com diâmetro de 47 mm, espátula metálica, frasco Erlenmeyer de 250 mL, cubetas de quartzo de 5 cm e 10 cm de percurso óptico, proveta graduada de 100 mL, bastão de vidro e béqueres de 100 e 250 mL. Reagentes Solução de trietanolamina 0,1 M – Pese, com precisão, 7,460 g de trietanolamina e transira com água para um balão volumétrico de 500 mL. Complete o volume com água. Solução de ácido clorídrico 0,1 M – Pipete, cuidadosamente, 8,9 mL de ácido clorídrico para um balão volumétrico de 1000 mL, contendo cerca de 750 mL de água. Complete o volume com água. Solução-tampão trietanolamina/ácido clorídrico (tampão TEA/HCl ) – Transira 500 mL da solução de trietanolamina para um béquer de 1000 mL. Ajuste o pH para 7, colocando cerca de 420 mL da solução de ácido clorídrico para um volume inal de 920 mL de soluçãoIAL - 327 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital tampão TEA/HCl. Prepare a solução-tampão um dia antes de usar e guarde em refrigerador. Estabilize a solução à temperatura ambiente antes de usar. Meça o pH e ajuste para 7, se necessário, com solução de ácido clorídrico. Esta solução é estável por 2 dias, se mantida em refrigerador a aproximadamente 4ºC. Procedimento – Ligue, para estabilizar, o pHmetro e faça os ajustes para a operação. Calibre com as soluções-tampão 7 e 4 ou 7 e 10, de acordo com as instruções do fabricante. Circule água à temperatura constante pelo refratômetro, preferivelmente a 20ºC, por tempo suiciente para equilibrar a temperatura do prisma e da amostra e mantenha a água circulando durante a leitura, observando se a temperatura permanece constante. Ligue e ajuste o espectrofotômetro conforme as instruções do fabricante, para leituras da absorbância a 420 nm. Pese (50 ± 0,5) g da amostra em um béquer de 250 mL. Adicione (50 ± 0,1) g, ou (50 ± 0,1) mL da solução-tampão TEA/HCl e agite no agitador magnético até a dissolução do açúcar. Filtre a solução sob vácuo através das duas membranas, sendo a membrana de vidro sobreposta à de HA. Transira o iltrado para um béquer e coloque no banho de ultra-som por 3 minutos. Meça o grau Brix no refratômetro e corrija a temperatura a 20ºC (Tabela 2) e em seguida multiplique o valor do Brix corrigido a 20ºC pelo fator de correção 0,989. Obtenha a concentração da sacarose (g/mL) conforme descrito na Tabela 2. Faça a leitura da absorbância da solução a 420 nm, empregando-se a cubeta de 10 cm para açúcar reinado e de 5 cm para o açúcar cristal. A escolha da cubeta deve ser tal que a leitura da transmitância da solução esteja dentro da faixa de (25 - 75) %. Utilize como branco a solução-tampão TEA/HCl. A diferença absoluta entre dois resultados em duplicata de açúcares com valor de cor ICUMSA abaixo de 50 UI, não deve ser maior que 3 UI. Para açúcares com valor de cor ICUMSA acima de 50 UI, a diferença absoluta entre dois resultados em duplicata, não deve ser maior que 7 UI. Cálculo A = absorbância da solução a 420 nm b = espessura da cubeta em cm c = concentração da solução em g/mL 328 - IAL Capítulo VII - Açúcares e podutos correlatos Tabela 2 – Concentração de sacarose (g/mL) em função do grau Brix a 20ºC % Grau Brix 41 Concentração em g/mL ,0 ,1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 0,4845 0,4855 0,4872 0,4886 0,4900 0,4914 0,4928 0,4942 0,4956 0,4970 42 0,4985 0,4999 0,5013 0,5027 0,5041 0,5055 0,5069 0,5083 0,5097 0,5111 43 0,5126 0,5140 0,5154 0,5168 0,5182 0,5197 0,5211 0,5225 0,5239 0,5254 44 0,5268 0,5282 0,5297 0,5311 0,5325 0,5340 0,5354 0,5368 0,5383 0,5397 45 0,5411 0,5426 0,5440 0,5455 0,5469 0,5484 0,5498 0,5513 0,5527 0,5542 46 0,5556 0,5571 0,5585 0,5600 0,5615 0,5629 0,5644 0,5658 0,5673 0,5688 47 0,5702 0,5717 0,5732 0,5746 0,5761 0,5776 0,5790 0,5805 0,5820 0,5835 48 0,5850 0,5864 0,5879 0,5894 0,5909 0,5924 0,5939 0,5953 0,5968 0,5983 49 0,5998 0,6013 0,6028 0,6043 0,6058 0,6073 0,6088 0,6103 0,6118 0,6133 50 0,6148 0,6163 0,6178 0,6193 0,6208 0,6223 0,6238 0,6254 0,6269 0,6284 51 0,6299 0,6314 0,6329 0,6345 0,6360 0,6375 0,6390 0,6406 0,6421 0,6436 52 0,6451 0,6467 0,6482 0,6497 0,6513 0,6528 0,6543 0,6559 0,6574 0,6590 53 0,6603 0,6621 0,6638 0,6651 0,6667 0,6682 0,6698 0,6713 0,6729 0,6745 54 0,6760 0,6776 0,6791 0,6807 0,6823 0,6838 0,6854 0,6869 0,6885 0,6901 55 0,6916 0,6932 0,6948 0,6954 0,6979 0,6995 0,7011 0,7027 0,7043 0,7058 56 0,7074 0,7090 0,7106 0,7122 0,7138 0,7154 0,7169 0,7185 0,7211 0,7217 57 0,7233 0,7249 0,7265 0,7281 0,7297 0,7313 0,7329 0,7345 0,7362 0,7378 58 0,7394 0,7410 0,7426 0,7442 0,7458 0,7474 0,7491 0,7507 0,7523 0,7539 59 0,7556 0,7572 0,7588 0,7604 0,7621 0,7637 0,7653 0,7670 0,7686 0,7702 60 0,7719 0,7735 0,7752 0,7768 0,7784 0,7801 0,7817 0,7834 0,7850 0,7867 Referências bibliográficas ICUMSA. Methods Book – Method GS2/3-9. he determination of white sugar solution colour – Official, 1994. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 9724: Açúcar – Determinação da cor ICUMSA. Rio de Janeiro, 1987. 171/IV Açúcares – Determinação da umidade por secagem à pressão atmosférica Este método é aplicável para os diversos tipos de açúcares, inclusive rapadura. Baseiase na determinação da perda de massa por secagem em condições especificadas de temperatura e tempo. IAL - 329 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, estufa, termômetro, espátula de metal, dessecador com sílica gel e cápsula de níquel, platina ou de alumínio com fundo chato e tampa. Procedimento – Pese de 5 a 10 g da amostra totalmente homogeneizada em uma cápsula de fundo chato com tampa, previamente tarada. Seque em estufa durante 2 horas a (105±2)°C. Remova a cápsula da estufa, cubra, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de secagem por 30 minutos e de resfriamento até que o peso entre duas secagens tenha uma diferença ≤ 2 mg. Cálculo N = perda de massa em g P = massa da amostra em g Referências bibliográficas ICUMSA. Methods Book – Method GS2/1/3-15. Determination of sugar moisture by loss on drying official. 1994. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 8870: Açúcar Cristal e refinado, perda por secagem. Rio de Janeiro, 1985. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th. ed. Arlington: A.O.A.C., (method 925.45 B) 1995. chapter 44. p.2. 172/IV Açúcares – Determinação de anidrido sulfuroso pelo método modificado de Monier-Williams Procedimento – Pese (50 ± 1) g de açúcar homogeneizado e transfira para o balão de destilação e proceda conforme descrito no método 050/IV. 173/IV Méis – Determinação da umidade por refratometria Aplicável na determinação de umidade em mel e também em xaropes e baseia-se no método refratométrico de Chataway, revisado por Wedmore, onde utiliza a medida de índice de refração da amostra para ser convertida em porcentagem de umidade. 330 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos Material Refratômetro de Abbé ou digital, com escala que permita estimar pelo menos 0,0005 n, banho-maria, espátula metálica, algodão hidrofílico e frasco de vidro de capacidade de 10 mL com tampa. Procedimento – Circule água à temperatura constante pelo aparelho, preferivelmente a 20°C, por tempo suiciente para equilibrar a temperatura do prisma e da amostra e mantenha a água circulando durante a leitura, observando se a temperatura permanece constante. Amostras líquidas – Transira 3 a 4 gotas da amostra para o prisma do refratômetro. Faça a leitura do índice de refração a 20°C. Se a determinação tiver sido feita a uma temperatura diferente de 20°C, corrija a leitura do índice de refração para a temperatura padrão de 20°C, de acordo com a nota de rodapé da tabela. Obtenha a porcentagem de umidade segundo a Tabela 3. Amostras cristalizadas – Transira uma pequena porção para um frasco com tampa, feche bem o frasco e coloque no banho-maria à temperatura de (50 ± 0,2)°C para que todos os cristais sejam dissolvidos. Esfrie à temperatura ambiente. Em seguida proceda conforme as amostras líquidas. Tabela 3 – Relação entre o índice de refração e a porcentagem de água dos méis Índice de refração a 20ºC Umidade % Índice de refração a 20ºC Umidade % Índice de refração a 20ºC Umidade % Índice de refração a 20ºC Umidade % 1,5044 13,0 1,4961 16,2 1,4880 19,4 1,4800 22,6 1,5038 13,2 1,4956 16,4 1,4875 19,6 1,4795 22,8 1,5033 13,4 1,4951 16,6 1,4870 19,8 1,4790 23,0 1,5028 13,6 1,4946 16,8 1,4865 20,0 1,4785 23,2 1,5023 13,8 1,4940 17,0 1,4860 20,2 1,4780 23,4 1,5018 14,0 1,4935 17,2 1,4855 20,4 1,4775 23,6 1,5012 14,2 1,4930 17,4 1,4850 20,6 1,4770 23,8 1,5007 14,4 1,4925 17,6 1,4845 20,8 1,4765 24,0 1,5002 14,6 1,4920 17,8 1,4840 21,0 1,4760 24,2 1,4997 14,8 1,4915 18,0 1,4835 21,2 1,4755 24,4 1,4992 15,0 1,4910 18,2 1,4830 21,4 1,4750 24,6 1,4987 15,2 1,4905 18,4 1,4825 21,6 1,4745 24,8 1,4982 15,4 1,4900 18,6 1,4820 21,8 1,4740 25,0 1,4976 15,6 1,4895 18,8 1,4815 22,0 - - 1,4971 15,8 1,4890 19,0 1,4810 22,2 - - 1,4966 16,0 1,4885 19,2 1,4805 22,4 - IAL - 331 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: na correção do índice de refração para temperatura diferente de 20°C: • Adicione 0,00023 ao índice de refração para cada grau acima de 20°C, antes de usar a Tabela 3. • Subtraia 0,00023 do índice de refração para cada grau abaixo de 20°C, antes de usar a Tabela 3. Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th. ed. Arlington: A.O.A.C., (method 969.38 B) 1995. chapter 44. p.20-21. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION. Apidologie, Paris: Issue Spec. 1997. p.1113. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 160. 174/IV Méis – Determinação da acidez livre, lactônica e total Este método baseia-se na determinação da acidez livre, lactônica e total. A acidez livre é a medida obtida da titulação com hidróxido de sódio até o ponto de equivalência. A acidez lactônica é obtida pela adição de um excesso de hidróxido de sódio que é titulado com ácido clorídrico. A acidez total é obtida pela somatória entre acidez livre e lactônica. Material pHmetro, agitador magnético e barra magnética, balança analítica, espátula metálica, béqueres de 50 e 250 mL e bureta de 25 mL. Reagentes Solução padronizada de hidróxido de sódio 0,05 N Solução de ácido clorídrico 0,05 N Soluções-tampão pH 4 e 7 Procedimento – Ligue e faça a calibração do pHmetro conforme as instruções do fabricante, com as soluções tampão 4 e 7. Pese 10 g da amostra em um béquer de 250 mL e dissolva 332 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos com 75 mL de água. Agite com agitador magnético. Mergulhe o eletrodo na solução e anote o pH. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,05 N até pH 8,5 e anote o volume (V). Imediatamente, adicione nesta solução 10 mL de solução de hidróxido de sódio 0,05 N e, sem demora, titule com solução de ácido clorídrico 0,05 N até o pH 8,30 (Va). Titule 75 mL de água com hidróxido de sódio 0,05 N (Vb) até pH 8,5. Cálculos Acidez livre V = n.º de mL da solução de NaOH 0,05 N gasto na titulação Vb = n.º de mL de solução de NaOH 0,05 N gasto na titulação para o branco f = fator da solução de NaOH 0,05 N P = massa da amostra em g Acidez lactônica Va= nº de mL de solução de HCl 0,05 N gasto na titulação f’ = fator da solução de HCl 0,05 N P = massa da amostra em g Acidez total em milequivalentes por kg = acidez livre + lactônica Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed. Arlington: A.O.A.C., (mothod 962.19) 1995. chapter 44. p. 31. 175/IV Méis – Determinação de hidroximetilfurfural Material Espectrofotômetro UV/VIS, cubeta de quartzo de 1 cm, balança analítica, banho de ultraIAL - 333 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital som, espátula metálica, papel de iltro qualitativo, béqueres de 25 e 50 mL, balão volumétrico de 50 mL, pipetas volumétricas de 0,5 e 5 mL, tubos de ensaio de tamanho médio, proveta de 25 mL, funil de vidro de tamanho médio e bastão de vidro. Reagentes Solução de Carrez I – Dissolva 15 g de ferrocianeto de potássio - K4 [ Fe (CN)6 ] . 3H2O em água e complete para 100 mL. Solução de Carrez II – Dissolva 30 g de acetato de zinco – Zn (CH3COO)2 . 2H2O em água e complete para 100 mL. Solução de bissulito de sódio - NaHSO3 a 0,2% m/v – Dissolva 0,20 g de bissulito de sódio em água e dilua a 100 mL. Se necessário, dilua 1+1 com a solução de referência. Procedimento – Ligue e ajuste o espectrofotômetro conforme as instruções do fabricante, para leituras das absorbâncias a 284 e 336 nm. Pese, com precisão, cerca de 5 g do mel em um béquer de 50 mL e transira, no máximo, com 25 mL de água para um balão volumétrico de 50 mL. Adicione 0,5 mL de solução de Carrez I e misture. Adicione 0,5 mL de solução de Carrez II e misture. Se necessário, adicione uma gota de álcool para suprimir a espuma. Complete o volume com água. Filtre, descartando os primeiros 10 mL do iltrado. Pipete 5 mL para cada um dos dois tubos de ensaio. Adicione 5 mL de água em um dos tubos (amostra) e 5 mL de solução de bissulito de sódio 0,2% no outro (referência). Misture bem em banho de ultra-som por 3 minutos e determine a absorbância da amostra a 284 e 336 nm em cubeta de 1 cm. Se a absorbância for maior que 0,6, dilua a solução de amostra com água e a solução de referência com solução de bissulito de sódio 0,10%, na mesma proporção e corrija a absorbância para a diluição. Nota: não aqueça o mel antes desta determinação. Cálculos A284 = leitura da absorbância a 284 nm A336 = leitura da absorbância a 336 nm P = massa da amostra em g 5 = massa nominal da amostra 149,7 = (126/16830) x (1000/10) x (1000/5) 334 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos 126 = peso molecular do HMF 16830 =absortividade molar do HMF a 284 nm 1000 = conversão de g para mg 10 = diluição de 5 g de mel para 50 mL 1000 = conversão de g para kg Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed. Arlington: A.O.A.C., (method 980.23), 1995. chapter 44. p. 26. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION Apidologie, Paris: Issue Spec., 1997. p. 25-27. 176/IV Méis – Determinação de açúcares redutores pelo método A É aplicável na determinação de açúcares redutores em mel, calculados como açúcar invertido (glicose + frutose) e baseia-se no método modiicado de Lane & Eynon. Material Balança analítica, banho-maria, chapa elétrica, espátula metálica, balão de fundo chato de 250 mL, balões volumétricos de 100, 200, 250, 500 e 1000 mL, pipetas volumétricas de 5 e 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, buretas de 10 e 25 mL e funil pequeno. Reagentes Solução de azul de metileno a 0,2 % m/v -- Dissolva 2 g de azul de metileno em água e dilua a 1 L. Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio 1 M Solução-padrão de açúcar invertido (10 g/L) – Pese com precisão 9,5 g de sacarose e transira para um balão de 1000 mL. Adicione 5 mL de ácido clorídrico e dilua com água até cerca de 100 mL. Mantenha esta solução acidiicada por vários dias (aproximadamente 7 dias de 12 a 15ºC ou 3 dias de 20 a 25ºC). Complete o volume com água. A solução ácida de açúcar IAL - 335 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital invertido a 1% permanece estável por vários meses. Pipete 50 mL da solução ácida para um balão volumétrico de 250 mL. Imediatamente antes de usar e diluir, neutralize com solução de hidróxido de sódio 1 M. Complete o volume com água, para obter a concentração de 2 g/L. Soluções de Fehling modiicadas por Soxhlet - Solução A – Dissolva 69,28 g de sulfato de cobre - CuSO4 . 5H2O - com água em um balão volumétrico de 1 L. Complete o volume com água. Solução B - Dissolva 346 g de tartarato duplo de sódio e potássio K Na (C4 H4 O6). 4 H2O e 100 g de hidróxido de sódio com água em um balão volumétrico de 1L. Complete o volume e iltre em papel de iltro qualitativo. Padronização – Pipete 5 mL da solução A e 5 mL da solução B para um balão de fundo chato de 250 mL. Adicione, com uma bureta de 25 mL, solução-padrão de açúcar invertido, cerca de 0,5 a 1 mL a menos do volume total necessário para reduzir todo o cobre. Aqueça a solução até a ebulição. Mantenha em ebulição moderada por 2 minutos. Sem remover da chapa elétrica, adicione 1 mL da solução de azul de metileno. Complete a titulação, dentro de um tempo total de ebulição de 3 minutos, adicionando gota a gota a solução de açúcar invertido, até a descoloração do indicador. Após a redução completa do cobre, o azul de metileno é reduzido a um composto incolor e a solução retorna à coloração que tinha antes da adição do indicador. Na padronização, as soluções de Fehling deverão reagir completamente com 0,05 g de açúcar invertido, que corresponde a 25 mL da solução-padrão de açúcar invertido (2 g/L). Procedimento – Pese cerca de 2 g da amostra homogeneizada de mel em um béquer de 25 mL. Dissolva com água e transira para um balão volumétrico de 200 mL. Complete o volume com água. Pipete 50 mL da solução para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Pipete 5 mL da solução A e 5 mL da solução B para um balão de fundo chato de 250 mL. Adicione 7 mL de água. Na bureta de 25 mL, coloque a solução de mel diluída e adicione 15 mL no balão de fundo chato. Aqueça a solução e mantenha em ebulição moderada por 2 minutos. Adicione 1 mL de solução de azul de metileno enquanto ainda em ebulição e complete a titulação, dentro de um tempo total de ebulição de 3 minutos, adicionando gota a gota a solução diluída de mel até a descoloração do indicador. O volume total para completar a titulação deve ser de 35 mL (soma da solução de Fehling A e B, amostra diluída de mel e água). Anote o volume gasto da solução de mel (V mL). Repita a titulação, usando 5 mL de cada solução de Fehling, (25 - V mL) de água e adicione com uma bureta o volume da solução diluída de mel gasto na titulação preliminar menos 1,5 mL. Aqueça a solução até a ebulição. Adicione 1 mL de solução de azul de metileno e complete a titulação, dentro de 3 minutos, adicionando gota a gota a solução diluída de mel até a descoloração do indicador. As titulações em duplicata devem concordar dentro de 0,1 mL. 336 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos Cálculo P = massa de amostra em g V = nº de mL da solução diluída da amostra gasto na titulação Referências bibliográficas CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. CAC/VOL III, Suppl. 2. ed. 1. Rome: FAO/WHO, 1989. p. 7-13. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION. Apidologie, Paris: Issue Spec., 1997. p. 38-41. 177/IV Méis – Determinação de açúcares redutores pelo método B Procedimento -- Pese 2 g de amostra de mel homogeneizada e proceda conforme a técnica descrita nos glicídios redutores em glicose (038/IV). 178/IV Méis – Determinação de sacarose aparente pelo método A Baseia-se na determinação dos açúcares, após a inversão por hidrólise ácida, pelo método modiicado de Lane & Eyon. Material Balança analítica, banho-maria, chapa elétrica, espátula metálica, papel indicador universal de pH, balão de fundo chato de 250 mL, balão volumétrico de 100 mL, pipetas volumétricas de 2, 10 e 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, buretas de 10 e 25 mL e funil pequeno. Reagentes Solução-padrão de açúcar invertido (10 g/L) Soluções de Fehling, modiicadas por Soxhlet Solução de azul de metileno 0,2 % m/v Solução de ácido clorídrico 5 M Solução de hidróxido de sódio 5 M IAL - 337 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pipete 50 mL da solução de mel obtida na determinação de açúcares redutores 176/IV para um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 25 mL de água. Aqueça a 65 ºC em banho-maria. Remova o frasco do banho e adicione 10 mL de solução de ácido clorídrico. Deixe a solução resfriar naturalmente até a temperatura ambiente. Neutralize com solução de hidróxido de sódio, usando papel indicador de pH. Complete o volume com água. Proceda como em 176/IV. Cálculo P = massa da amostra em g V1 = n.º de mL da solução diluída da amostra gasto na titulação C = n.º de g de açúcar invertido por cento, obtido antes da inversão, açúcares redutores Referências bibliográficas CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. CAC/VOL III, Suppl. 2. ed. 1. Rome: FAO/WHO, 1989, p. 9-13. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION. Apidologie, Paris: Issue Spec., 1997. p. 38-41. 179/IV Méis – Determinação de sacarose aparente pelo método B Procedimento - Pese 2 g de amostra de mel homogeneizado e proceda conforme a técnica descrita no método 039/IV. 180/IV Méis – Determinação de sólidos insolúveis em água por gravimetria Material Balança analítica, estufa, bomba de vácuo, chapa elétrica, termômetro, dessecador com sílica gel, espátula metálica, béquer de 150 mL, cadinho de vidro (15-40 μm), kitassato de 1000 mL e alonga de iltração. 338 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos Reagentes Solução alcoólica de loroglucina a 1% m/v Ácido sulfúrico Procedimento – Pese cerca de 20 g da amostra homogeneizada de mel. Dissolva em quantidade adequada de água a 80 ºC e misture bem. Filtre sob vácuo através de um cadinho de vidro previamente tarado a (135 ± 2)ºC e lave com água a 80ºC. Recolha parte do iltrado em um tubo de ensaio e adicione algumas gotas da solução de loroglucina e de ácido sulfúrico (se houver a formação de névoa esbranquiçada existe ainda açúcar). Continue a lavagem com água a 80°C até que o iltrado esteja livre de açúcares. Seque o cadinho a 135ºC por 1 hora, resfrie e pese. Retorne para a estufa a 135ºC em um intervalo de 30 min até que o peso constante seja atingido. Cálculo N = massa seca de sólidos insolúveis em g P = massa da amostra em g Referências bibliográficas CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. CAC/VOL III, Suppl. 2. ed. 1. Rome: FAO/WHO, 1989, p.14-15. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION. Apidologie, Paris: Issue Spec., 1997. p. 51-52 181/IV Méis – Determinação da atividade diastásica Material Espectrofotômetro UV/VIS, cubeta 1 cm, balança analítica, banho de ultra-som, pHmetro, espátula metálica, termômetro, cronômetro, banho-maria, frasco Erlenmeyer de 250 mL, balões volumétricos de 100 e 500 mL, proveta graduada de 50 mL, béquer de 50 mL, pipetas volumétricas de 5, 10 e 20 mL. IAL - 339 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Acetato de sódio Ácido acético Solução de amido – Pese, com precisão, 2 g de amido solúvel anidro (próprio para a determinação de poder diastásico) e misture com 90 mL de água em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Rapidamente, leve à ebulição, agitando a solução tanto quanto possível. Reduza o aquecimento e mantenha em ebulição moderada por 3 minutos, cubra, e deixe resfriar até a temperatura ambiente. Transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução-estoque de iodo – Dissolva 8,8 g de iodo ressublimado em (30 - 40) mL de água contendo 22 g de iodeto de potássio e dilua para 1000 mL com água. Solução de iodo a 0,00035 M – Dissolva 20 g de iodeto de potássio e 5 mL da soluçãoestoque de iodo em água e dilua para 500 mL. Prepare uma nova solução a cada dois dias. Solução-tampão de acetato pH 5,3 (1,59 M) – Dissolva 87 g de acetato de sódio em 400 mL de água, adicione cerca de 10,5 mL de ácido acético, transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água. Ajuste o pH para 5,3, usando o pHmetro, com acetato de sódio ou ácido acético, se necessário. Solução de cloreto de sódio 0,5 M – Dissolva 14,5 g de cloreto de sódio em água, transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água. Padronização da solução de amido – Pipete 5 mL da solução de amido para um béquer contendo 10 mL de água e misture bem. Pipete 1 mL desta solução para várias provetas de 50 mL, contendo 10 mL da solução de iodo 0,00035 M. Misture bem e determine o volume de água necessário para a diluição da solução de amido, para se obter uma leitura de absorbância de 0,760 ± 0,02, a 660 nm, utilizando um branco com água. Repita a padronização a cada nova preparação da solução de amido. Procedimento – Ligue e ajuste o espectrofotômetro conforme as instruções do fabricante, para leituras da absorbância a 660 nm. Ligue para estabilizar o pHmetro e faça os ajustes para a operação. Calibre o pHmetro com as soluções tampão 7 e 4. Pese cerca de 10 g de amostra de mel em um béquer de 50 mL e dissolva com 15 mL de água, adicione 5 mL da solução-tampão e transira para um balão volumétrico de 50 mL, contendo 3 mL da solução de cloreto de sódio 0,5 M e complete o volume com água. É importante que o mel seja tamponado antes da adição da solução de cloreto de sódio. Pipete 5 mL da solução de amido num tubo contendo 10 mL desta solução de mel tamponada e coloque em banho de água a (40 ± 1)ºC por 15 minutos, agite essa solução periodicamente. Em intervalos 340 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos de 5 minutos, pipete alíquotas de 1 mL desta solução e adicione rapidamente 10 mL de solução de iodo diluída 0,00035 M, em uma proveta de 50 mL. Misture e dilua com água, se necessário, conforme descrito na padronização do amido. Determine a absorbância a 660 nm. Continue tomando alíquotas de 1 mL em intervalos de 5 minutos, até obter um valor de absorbância menor que 0,235. Nota: não aqueça o mel antes desta determinação. Construa a curva-padrão da absorbância versus o tempo em minutos. Trace uma linha reta, para determinar o tempo (tx) em que a reação alcançou a absorbância de 0,235. Divida 300 pelo tempo (tx) minutos para obter a atividade diastásica (AD). O resultado é expresso em unidades de Gothe ou Schade por grama de mel. Cálculo tx= o tempo da reação em minutos Referências bibliográficas BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria nº 001, de 24 de março de 1980, Secretaria de inspeção de Produto Animal. Diário Oficial, Brasília, 28 de mar. de 1980. Seção I, p. 5561-5572. Aprova as Normas Higiênico-sanitárias e Técnicas para Mel, Cera de Abelhas e Derivados... CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. CAC/VOL III, Suppl. 2. ed. 1. Rome: FAO/WHO, 1989, p. 17-21. BOGDANOV, S.; MARTIN, P.; LULLMAN, C. HARMONISED METHODS OF THE EUROPEAN HONEY COMMISSION. Apidologie, Paris: Issue Spec., 1997, p. 31-34. 182/IV Méis – Reação de Lund A reação de Lund é aplicável em amostra de mel e indica a presença de albuminóides. Sua ausência indica fraude. Material Balança analítica, espátula metálica, proveta de (50 ± 0,1) mL com tampa, béquer de 25 mL, pipeta volumétrica de 5 mL, funil pequeno e bastão de vidro. IAL - 341 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução de ácido tânico a 0,5% m/v -- Dissolva 0,5 g de ácido tânico em 100 mL de água. Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 2 g da amostra. Transira para uma proveta de 50 mL, com tampa, com o auxílio de 20 mL de água. Adicione 5 mL de solução de ácido tânico 0,5%. Adicione água até completar o volume de 40 mL. Agite para misturar totalmente. Deixe em repouso por 24 horas. Na presença de mel puro, será formado um precipitado no fundo da proveta no intervalo de 0,6 a 3,0 mL. Na presença de mel adulterado, não haverá formação de precipitado ou excederá o volume máximo do referido intervalo. Referências bibliográficas BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria nº 001, de 24 de março de 1980, Secretaria de Inspeção de Produto Animal. Diário Oficial, Brasília, 28 de mar. de 1980. Seção I, p. 5561-5572. Aprova as Normas Higiênico-sanitárias e Técnicas para Mel, Cera de Abelhas e Derivados... INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 163. 183/IV Méis – Reação de Fiehe A reação de Fiehe com resorcina em meio ácido pode indicar a presença de substâncias produzidas durante o superaquecimento de mel ou a adição de xaropes de açúcares. Material Balança analítica, espátula metálica, provetas de 10 e 50 mL, béquer de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, bastão de vidro e tubo de ensaio pequeno. Reagentes Éter Solução clorídrica de resorcina - Dissolva 0,5 g de resorcina em 50 mL de ácido clorídrico. Esta solução deverá ser recém-preparada. Procedimento - Pese 5 g de amostra em um béquer de 50 mL. Adicione 5 mL de éter e agite vigorosamente. Transira a camada etérea para um tubo de ensaio e adicione 0,5 mL de solução clorídrica de resorcina e deixe em repouso por 10 minutos. Na presença de glicose comercial ou de mel superaquecido, aparecerá uma coloração vermelha intensa, indicando a fraude. 342 - IAL Capítulo VII - Açúcares e produtos correlatos Referências Bibliográficas BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria nº 001, de 24 de março de 1980, Secretaria de Inspeção de Produto Animal. Diário Oficial, Brasília, 28 de mar. de 1980. Seção I, p. 5561-72. Aprova as Normas Higiênico-sanitárias e Técnicas para Mel, Cera de Abelhas e Derivados... INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3ª ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 164. 0184/IV Méis – Reação de Lugol A reação com solução de Lugol pesquisa a presença de amido e dextrinas no mel. Material Balança analítica, banho-maria, espátula metálica, proveta de 50 mL, béquer de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL e bastão de vidro. Reagentes Solução de Lugol - Dissolva 1 g de iodo ressublimado em 10 mL de água contendo 3 g de iodeto de potássio e dilua para 50 mL com água e armazene a solução em frasco âmbar. Procedimento – Pese 10 g da amostra em um béquer de 50 mL. Adicione 20 mL de água e agite. Deixe no banho-maria fervente por 1 hora e em seguida resfrie à temperatura ambiente. Adicione 0,5 mL da solução de Lugol. Na presença de glicose comercial ou xaropes de açúcar, a solução icará colorida de marrom-avermelhada a azul. A intensidade da cor depende da qualidade e da quantidade das dextrinas ou amido, presentes na amostra fraudada. Faça a mesma prova para um mel puro para comparação. Referências bibliográficas BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria nº 001, de 24 de março de 1980, Secretaria de Inspeção de Produto Animal. Diário Oficial, Brasília, 28 de mar. de 1980. Seção I, p. 5561-72. Aprova as Normas Higiênico-sanitárias e Técnicas para Mel, Cera de Abelhas e Derivados... INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3ª ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 165. Colaboradores Cristiane Bonaldi Cano; Letícia Araújo Farah Nagato e Maria Cristina Duran IAL - 343 Capítulo VIII - Águas CAPÍTULO VIII ÁGUAS IAL - 345 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 346 - IAL Capítulo VIII - Águas VIII ÁGUAS água é importante para a manutenção da vida e a sua sanidade e utilização racional são de impacto para a economia e preservação da saúde da coletividade. A água para o consumo humano é aquela cujos parâmetros microbiológicos, físico-químicos e radioativos atendem aos padrões de potabilidade e não oferecem risco à saúde da população. Essas águas são captadas de mananciais supericiais. A De acordo com a origem e tratamento recebido, as características das águas potáveis variam, sendo de grande importância o conjunto de determinações físico-químicas, a seguir descritas, que avaliam essas propriedades. Esses referidos ensaios são destinados à veriicação da qualidade de águas provenientes de poços, minas, água mineral e de abastecimento público. 185/IV Determinação de dureza A dureza total é deinida como a soma das concentrações de cálcio e magnésio, ambas expressas como carbonato de cálcio, em miligramas por litro. O ácido etilenodiaminotetracético e seus sais sódicos (EDTA) formam complexos quelados solúveis com certos cátions metálicos. Uma solução contendo íons de cálcio e magnésio, com uma pequena quantidade do indicador negro de eriocromo T, em pH (10,0±0,1) torna-se púrpura. Titulando-se essa solução com EDTA, cálcio e magnésio serão quelados e uma viragem de cor púrpura a azul indicará o ponto inal. Material Pipeta de 50 mL (ou balão volumétrico), pipeta de 2 mL, frasco Erlenmeyer de (250 e 500) mL, buretas de (10 e 25) mL e balões volumétricos de 250 e 1000 mL. IAL - 347 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução-padrão de cálcio – Transira, para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, 1 g de carbonato de cálcio previamente aquecido a 105°C por 15 horas. Adicione, por meio de um funil, ácido clorídrico diluído a 50%, aos poucos, até dissolver todo o carbonato. Adicione 200 mL de água. Aqueça até ebulição para eliminar todo gás carbônico. Esfrie, adicione duas gotas do indicador vermelho de metila e ajuste para cor alaranjada, adicionando hidróxido de amõnio 3 M ou ácido clorídrico 50%.Transira a solução para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Um mL desta solução equivale a 1 mg de carbonato de cálcio. Solução-tampão – Dissolva 16,9 g de cloreto de amônio em 143 mL de hidróxido de amônio. Adicione 1,25 g do sal Mg-EDTA e dilua para 250 mL com água destilada. Nota: Se o sal Mg-EDTA não for disponível, alternativamente, dissolva 1,179 g de EDTA dissódico e 780 mg de sulfato de magnésio (MgSO₄7H₂O) ou 644 mg de cloreto de magnésio (MgCl₂.6H₂O) em 50 mL de água destilada. Adicione à esta solução 16,9 g de cloreto de amõnio e 143 mL de hidróxido de amônio concentrado com agitação e dilua para 250 mL com água destilada. Solução indicadora – Misture, em almofariz, 0,5 g de negro de eriocromo T - sal sódico do ácido 1-(1-hidroxi-2-naftilazo)-5-nitro-2-naftol-4-sulfônico) - com 100 g de cloreto de sódio. Conserve em frasco com rolha esmerilhada. Solução de EDTA 0,01 M – Dissolva 3,72 g do sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético dihidratado em água bidestilada e deionizada e complete a 1000 mL. Padronização – Transfira 50 mL de água destilada e deionizada para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 mL da solução-tampão e 0,05 g do indicador negro de eriocromo T. Adicione 20 mL da solução-padrão de cálcio. Titule com a solução de EDTA até viragem da cor púrpura para azul. Calcule a massa de CaCO3 eqüivalente a 1 mL da solução de EDTA. Procedimento – Transfira 50 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 1 mL da solução-tampão e pequena porção (0,05 g) do indicador negro de eriocromo T. Titule com a solução de EDTA 0,01 M até que a coloração púrpura passe a azul. Cálculo v = nº de mL de solução de EDTA gasto na titulação A= mg de CaCO3 eqüivalente a 1 mL da solução de EDTA 0,01 M 348 - IAL Capítulo VIII - Águas V = n° de mL da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 307-308. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 2, p. 2-37. 186/IV Determinação de dureza de carbonatos e de não-carbonatos Quando a dureza é numericamente maior que a soma da alcalinidade de carbonato e de bicarbonato, a quantidade de dureza equivalente à alcalinidade total é denominada “dureza de carbonatos”; a quantidade de dureza em excesso à anterior é denominada “dureza de não-carbonatos”. D ≤ A - Dureza de carbonatos = D D > A - Dureza de carbonatos = A A = alcalinidade de carbonatos + alcalinidade de bicarbonatos D = dureza total Calcule a dureza de não-carbonatos subtraindo a dureza de carbonato da dureza total. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 309. 187/IV Determinação da alcalinidade total por método volumétrico com indicador visual A alcalinidade total de uma solução é, geralmente, devida aos íons hidroxila, carbonato e bicarbonato dissolvidos na água e a soma das concentrações desses íons é expressa em carbonato de cálcio. O conteúdo de cloro residual não deve ser superior a 1,8 mg/L, pois pode destruir o indicador colorimétrico; esse excesso de cloro pode ser eliminado pela adição de solução de tiossulfato de sódio (1 litro de água com concentração de cloro de 1,8 mg/L IAL - 349 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital necessita de 1 mL de solução de tiossulfato de sódio contendo 3,2 g/L). A alcalinidade total é determinada por titulação da amostra de água com solução padronizada de ácido, com pontos inais estabelecidos em pH 4,5 e 8,3. As medidas podem ser realizadas por volumetria, com emprego de indicadores ácido-base. As reações que se processam são: H3O+ + OH- ↔ 2H2O CO3-2 + H3O+ ↔ HCO3- + H2O HCO3- + H3O+ ↔ H2CO3 + H2O Material Pipeta volumétrica de 50 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, pipetas, frascos Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL, pesa-iltro, balança analítica e frasco conta-gotas. Reagentes Solução-padrão de carbonato de sódio 0,025 M Solução-padrão de ácido sulfúrico 0,05 M ou clorídrico 0,1 M – Dilua em um balão volumétrico de 1000 mL, 3 mL de ácido sulfúrico ou 8,3 mL de ácido clorídrico e complete o volume com água. Coloque a solução ácida na bureta e padronize, por titulação, com 40 mL de solução de carbonato de sódio 0,025 M. Padronização da solução de ácido sulfúrico 0,05 M ou ácido clorídrico 0,1 M, utilizando indicador visual – Em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 40 mL de solução-padrão de carbonato de sódio e 60 mL de água bidestilada e deionizada. Coloque na bureta o ácido a ser padronizado (H2SO4 0,05 M ou HCl 0,1 M). Adicione duas gotas de indicador fenolftaleína e acrescente lentamente o ácido até viragem de cor rósea a incolor (formação de HCO3-). A seguir, adicione 2 gotas de indicador verde de bromocresol ou da mistura de verde de bromocresol e vermelho de metila. Continue a titulação até viragem de cor azul para verde (ou verde para amarela, no caso de mistura de indicadores). Nota: 1 mL da solução ácida = 5 mg de CaCO3 Indicador verde de bromocresol – Pese 100 mg do indicador verde de bromocresol (sal sódico), transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Indicador verde de bromocresol-vermelho de metila – Dissolva 100 mg de verde de bromocresol (sal sódico) e 20 mg de vermelho de metila (sal sódico) em 100 mL de água, ou 350 - IAL Capítulo VIII - Águas alternativamente, em 100 mL de álcool a 95% ou álcool isopropílico. Solução de fenolftaleína – Pese 1 g de fenolftaleína, transira para um balão volumétrico de 100 mL, dissolva com álcool a 95% e complete o volume. Solução de tiossulfato de sódio – Pese 3,2 g de tiossulfato de sódio, transira para um balão volumétrico de 1000 mL, dissolva com água destilada e deionizada e complete o volume . Solução de ácido sulfúrico 0,005 M ou de ácido clorídrico 0,01 M – Transira 100 mL da solução de ácido sulfúrico 0,05 M ou 100 mL da solução de ácido clorídrico 0,1 M para um balão de 1000 mL. Complete o volume com água bidestilada e deionizada. Procedimento – Transira 50 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 gotas da solução indicadora de fenolftaleína. Se aparecer cor, hidróxidos ou carbonatos estão presentes, e então titule esta solução, sob agitação constante, com solução padronizada 0,005 M de ácido sulfúrico ou 0,01 M de ácido clorídrico até o desaparecimento da cor rósea. Anote o volume gasto na bureta (alcalinidade referente a íons hidroxila livres). Adicione 2 gotas do indicador verde de bromocresol (ou da mistura dos indicadores verde de bromocresol e vermelho de metila) à solução incolor acima obtida. Titule com solução de ácido sulfúrico 0,005 M (ou ácido clorídrico 0,01 M), até a mudança da cor azul para verde (ou de verde para amarelada, no caso da mistura dos indicadores). Leia na bureta o volume total de ácido gasto (alcalinidade total). Cálculo v = volume do ácido sulfúrico (ou clorídrico) gasto, em L M = molaridade da solução de ácido Va = volume da amostra de água, em L Nota: a alcalinidade referente a íons hidroxila livres (F) e total (AT) pode ser usada para se calcular a alcalinidade em termos de hidróxido, carbonato e bicarbonato. A realização deste cálculo é feita utilizando a tabela 1. Tabela 1 – Cálculo de alcalinidade da água Alcalinidade (em mg/L como CaCO3) Resultado da titulação Hidróxidos Carbonatos Bicarbonatos F=0 0 0 AT IAL - 351 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital F < ½ AT 0 2F AT – 2 F F = ½ AT 0 2F 0 F > ½ AT 2 F – AT 2 (AT – F) 0 F = AT AT 0 0 F = alcalinidade fenolftaleína, AT = alcalinidade total Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 2, p. 25-28. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo:IMESP, 1985. p. 307-310. 188/IV Determinação de amônia por método potenciométrico A presença de amônia nas águas de superfície pode ser resultante da desaminação de compostos orgânicos que contêm nitrogênio por atividade microbiológica ou pela hidrólise da uréia. Pode também ter origem durante o tratamento da água, para formar resíduo combinado de cloro (cloraminas). O método potenciométrico é aplicado para a determinação de amônia em águas de superfícies, domésticas e de resíduos industriais. Interferem nesta metodologia altas concentrações de íons dissolvidos, porém a cor e turbidez não são interferentes. O eletrodo seletivo para amônia possui uma membrana hidrofóbica gás-permeável, para separar a amostra da solução interna do eletrodo (cloreto de amônio). Obtém-se NH3 aquosa quando, na solução contendo a mistura de NH3 e NH4+, por mudança de pH com base forte (aproximadamente 11), os íons NH4+ se convertem em NH3 aquosa. Material Potenciômetro, eletrodo seletivo, agitador magnético, balança analítica, béqueres de 150 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL e pipetas volumétricas. 352 - IAL Capítulo VIII - Águas Reagentes Cloreto de amônio Hidróxido de sódio Tiossulfato de sódio Tetraborato de sódio Solução-estoque de cloreto de amônio – Pese 3,819 g de cloreto de amônio, seco a 105°C por duas horas. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada, livre de amônia. Transira 10 mL desta solução para balão volumétrico de 1000 mL. Complete o volume (cada mL desta solução contém 1 mg de N ou 1,22 mg de NH3). Soluções-padrão de cloreto de amônio – Prepare, a partir de diluições de uma soluçãoestoque de cloreto de amônio com água, uma série de soluções de concentrações 0,1; 1, 10 e 100 mg/L de NH3. Curva-padrão – Transira 100 mL de cada solução-padrão para béqueres de 150 mL. Mergulhe o eletrodo no padrão de mais baixa concentração e agite lentamente (para minimizar as perdas de NH3) com um agitador magnético. Mantenha a agitação à temperatura de 25°C e adicione aproximadamente 1 mL de NaOH 10 M para elevar o pH até 11. O eletrodo deve permanecer na solução até que a leitura, em milivolts, permaneça estável. Não adicione NaOH antes de imergir o eletrodo na solução. Repita o procedimento para todas as soluçõespadrão, aguardando estabilização das leituras. Construa a curva: concentração de amônia, em mg/L versus potencial, em milivolts, utilizando papel semi-logarítimico. Procedimento – Transira 100 mL da amostra de água para um béquer de 150 mL e proceda como na curva-padrão. A partir da leitura obtida para amostra, interpole a concentração de NH3, na curva-padrão previamente construída. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p. 78-79. 189/IV Determinação de amônia por método espectrofotométrico Este método utiliza o reagente de Nessler que reage, quando adicionado a uma solução diluída de amônia, formando um composto de cor amarelada, o qual pode locular após IAL - 353 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital certo tempo. A determinação espectrofotométrica deve ser efetuada antes que isto ocorra. Material Espectrofotômetro UV/VIS, sistema de destilação, balança analítica, balões volumétricos de 50 e 1000 mL e pipetas volumétricas de 1, 2 e 10 mL. Reagentes Cloreto de amônio Carbonato de sódio Hidróxido de sódio Iodeto de mercúrio II Iodeto de potássio Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) Monohidrogenofosfato de potássio (K2HPO4.3H2O) Água bidestilada e deionizada, livre de amônia para preparo de reagentes Reagente de Nessler: solução A – Pese 100 g de iodeto de mercúrio II e 70 g de iodeto de potássio, transira para um balão volumétrico de 200 mL, dissolva e complete o volume com água destilada e deionizada; solução B – Pese 160 g de hidróxido de sódio e dissolva com 500 mL de água destilada e deionizada. Resfrie à temperatura ambiente. Adicione vagarosamente e sob agitação, a solução A à solução B e dilua para 1000 mL com água bidestilada e deionizada. Manuseie a solução na penumbra e armazene-a em frasco plástico rígido ao abrigo da luz. Solução-tampão de fosfato de potássio – Pese 14,3 g de dihidrogenofosfatode potássio e 90,15 g de monohidrogenofosfato de potássio. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Esta solução deverá apresentar pH (7,4 ± 0,2). Conira com medida potenciométrica. Caso não coincida o valor com o mencionado, acerte, via potenciométrica, pela adição de um dos sais sólidos mencionados, sob agitação. Solução-padrão de cloreto de amônio – Pese 0,0785 g de cloreto de amônio e transira para um balão volumétrico de 1000 mL, completando o volume com água bidestilada e deionizada. Esta solução tem concentração equivalente a 25 mg de NH3/L. 354 - IAL Capítulo VIII - Águas Procedimento Teste qualitativo – Transira 50 mL da amostra de água para uma cápsula de porcelana e adicione 1 mL do reagente de Nessler, sem agitação. Aguarde 10 minutos e observe o desenvolvimento de coloração amarela, comparando-a com um branco com água bidestilada e deionizada. Se houver aparecimento de cor amarela, proceda a destilação da amostra. Destilação da amostra – Transira, para o sistema de destilação, 50 mL de solução saturada de carbonato de sódio e 500 mL de água destilada. Destile aproximadamente 300 mL e despreze. Continue a destilação, recolha 50 mL de destilado e adicione 1 mL de reagente de Nessler. A coloração amarela indica resultado positivo. Continue a destilação até que o teste seja negativo. Esfrie o sistema e substitua o volume restante do balão por 500 mL da amostra. Adicione 10 mL da solução-tampão de fosfato de potássio. Proceda a destilação de modo que o tubo de saída do destilado ique imerso na solução coletora (50 mL de ácido sulfúrico 0,02 M) contida em um Erlenmeyer de 250 mL. A velocidade de destilaçao deverá ser de 6 a 10 mL/min. Colete aproximadamente 180 mL do destilado, transira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume. Transira 50 mL do destilado para balão volumétrico, adicione 1 mL de reagente de Nessler e homogeneíze. Deixe em repouso por 10 minutos e meça a coloração desenvolvida, em espectrofotômetro a 425 nm e determine a quantidade de amônia correspondente, usando a curva-padrão previamente estabelecida. Curva-padrão – A partir de diluições da solução-padrão de cloreto de amônio, prepare uma série de soluções de concentrações de 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg de NH3/L, transferindo, respectivamente, 1, 2, 3, e 4 mL da solução-mãe para balões volumétricos de 50 mL e completando o volume com água destilada e deionizada. Adicione a cada balão 1 mL de reagente de Nessler e homogeneíze. Deixe em repouso por 10 minutos e meça a coloração desenvolvida, em espectrofotômetro, a 425 nm. Construa a curva-padrão. Cálculo Determine a concentração de amônia utilizando a curva-padrão estabelecida com soluçõespadrão de cloreto de amônio. Multiplique o resultado por 0,5, pois foi tomada uma alíquota de 50 mL de um volume de 250 mL contendo 200 mL de distilado de 500 mL da amostra. Nota: para expressar o resultado em nitrogênio amoniacal, o procedimento será o mesmo, bastando multiplicar o resultado obtido para amônia por 14/17 (ou 0,824). IAL - 355 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER ,ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p. 75-76. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo:IMESP, 1985. p. 313-315. 190/IV Determinação de cloreto Íons cloreto podem ser encontrados em águas provenientes de depósitos minerais e de fontes poluídas, tais como esgotos e resíduos industriais. Em solução com pH entre 6,0 e 7,5, íons cromato são usados para indicar o ponto inal da titulação de íons cloreto com íons prata. O cloreto de prata é precipitado quantitativamente antes do cromato de prata, de cor vermelha. Material Banho-maria, estufa, dessecador, balança analítica, cápsula de porcelana de 150 mL, buretas de 10 e 25 mL, bastão de vidro, balões volumétricos de 50 e 1000 mL, pipetas volumétricas de 25 e 50 mL e bureta de 25 mL. Reagentes Cromato de potássio Cloreto de sódio Nitrato de prata Solução-padrão de nitrato de prata 0,0282 M – Pese 4,7909 g de nitrato de prata, transira para um balão volumétrico de 1000 mL, dissolva e complete o volume com água destilada e deionizada. Indicador cromato de potássio 10% m/v – Pese 5 g de cromato de potássio, transira para um balão volumétrico de 50 mL, dissolva e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução-padrão de cloreto de sódio – Aqueça o cloreto de sódio em estufa a 200°C, por três 356 - IAL Capítulo VIII - Águas horas. Resfrie em dessecador, pese 1,6484 g do sal e dilua a 1000 mL, em balão volumétrico, com água destilada e deionizada. Um mL desta solução corresponde a 1 mg de íon cloreto. Transira 25 mL de solução de cloreto de sódio para o interior da cápsula de porcelana de 150 mL. Adicione 4 gotas de indicador de cromato de potássio. Adicione o nitrato de prata pela bureta de 25 mL, lentamente, sob agitação até o aparecimento de um precipitado levemente avermelhado. Anote o volume gasto e calcule a molaridade da solução de nitrato de prata, usando a fórmula: M = molaridade da solução de nitrato de prata v = volume da solução de cloreto de sódio v1 = volume da solução de nitrato de prata Procedimento – Pipete 50 mL da amostra para uma cápsula de porcelana de 150 mL. Aqueça em banho-maria até reduzir o volume a aproximadamente 20 mL. Adicione 4 gotas do indicador cromato de potássio. Titule com a solução de nitrato de prata em bureta de 10 mL até o aparecimento de uma coloração avermelhada. Nota: íons brometo e iodeto interferem nessa reação. Cálculo M = molaridade do nitrato de prata v = volume de nitrato de prata gasto na titulação va = volume da amostra, em mL Referências bibliográficas THEROUX, F.R.; ELDRIDGE, E.F.; MALLMANN, W.R. Laboratory Manual for Chemical and Bacterial Analysis of Water and Sewage. 3.ed. London: McGraw-Hill Book Company, 1943. p. 15,68,164. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed.. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p.48-50. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo:IMESP, 1985. p. 320-321. IAL - 357 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 191/V Determinação da cor pelo método de comparação óptica por via instrumental A presença de cor na água pode ser devida ao seu conteúdo de íons metálicos (geralmente ferro e manganês), plâncton, resíduo industrial, húmus e outros materiais orgânicos e poderá ser expressa como “aparente” ou como “verdadeira”. A aparente é originária dos materiais dissolvidos e em suspensão. Por sedimentação ou centrifugação dos materiais em suspensão, pode-se determinar a cor verdadeira. Se a cor aparente é a dos materiais em suspensão, pode-se determinar a cor verdadeira. Se a cor aparente é a que se quer determinar, proceda à análise da amostra sem submetê-la à separação de materiais em suspensão (não iltrada). A cor é determinada por comparação visual entre a amostra e soluções coloridas de concentrações conhecidas. A comparação poderá ser feita por via instrumental, com discos coloridos especiais. Material Aparelho comparador visual munido de disco padrão de cor; tubos de cristal próprios para a leitura ou tubos de Nessler de 50 mL, peças de cristal homogêneo e plunger. Reagentes Solução-padrão de cor – Pese 1,246 g de hexacloroplatinato de potássio (K2PtCI6), 1 g de cloreto cobaltoso CoCI2.6H2O e meça 100 mL de ácido clorídrico. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Esta solução-estoque apresenta cor equivalente a 500 unidades internacionais. Prepare padrões contendo cores de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, e 70 unidades, diluindo 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 6,0 e 7,0 mL da solução-padrão estoque em balões volumétricos de 50 mL. Proteja estes padrões contra a evaporação e a contaminação quando não estiverem sendo usados. Procedimento – Encha um dos tubos com água bidestilada e deionizada, de modo a não formar bolhas. Mergulhe o plunger no interior do tubo de água de modo a homogeneizar o conteúdo da coluna. Proceda analogamente com o segundo tubo, utilizando agora a amostra cuja cor se quer determinar. Leve os tubos ao comparador visual, colocando-os corretamente em cada presilha do aparelho. Gire o disco até que a cor da amostra coincida com a cor apresentada no disco padrão. Faça a leitura da escala. O resultado é expresso em uH (unidade de Hazen). Nota: Caso deseje medir a cor verdadeira, faça a decantação e, se necessário, centrifugue previamente uma porção da amostra (como opção, pode-se efetuar iltração com papel quantitativo para precipitados inos). 358 - IAL Capítulo VIII - Águas Referências Bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 2, p. 1-3. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo:IMESP, 1985. p. 322-323. 192/IV Determinação de ferro Os compostos de ferro, muito abundantes na natureza, são integrantes da composição química do solo, das rochas e da matéria vegetal. Em condições redutoras, o ferro existe no estado ferroso. Em águas expostas ao ar ou em condições oxidantes, os íons ferrosos são oxidados ao estado férrico, o qual se hidrolisa formando hidróxido de ferro III insolúvel. O ferro ocorre em solução aquosa, em estado coloidal que pode ser peptizado por matéria orgânica, em complexos inorgânicos ou orgânicos ou em partículas em suspensão. Material Espectrofotômetro UV/VIS, chapa elétrica, pHmetro, balança analítica, béqueres de 100, 250, 500, 1000 e 2000 mL, balões volumétricos de 50, 100 e 1000 mL, barra magnética, buretas de 10 mL e 25 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, funil de haste longa, lã de vidro, pipetas volumétricas de 5, 25 e 50 mL, pipetas graduadas de 5 mL, proveta de 100 mL e vidro de relógio. Nota: recomenda-se não usar espátula metálica Reagentes Acetato de sódio Ácido acético glacial Ácido clorídrico Ácido fosfórico Ácido sulfúrico 1,10-Fenantrolina Cloreto de hidroxilamina Oxalato de sódio Permanganato de potássio Sulfato ferroso amoniacal IAL - 359 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Zinco em pó Ácido sulfúrico 0,4 M Solução de permanganato de potássio 0,02 M Ácido clorídrico a 50% Ácido sulfúrico a 50% (para padronização do KMnO4). Solução-padrão de ferro II – Pese 7 g de sulfato de amônio e ferro Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O, dissolva em 50 mL de água bidestilada e deionizada, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e adicione 5 mL de ácido sulfúrico. Complete o volume com água destilada e deionizada e homogeneíze. Esta solução contém cerca de 1 g de ferro. Pipete 25 mL da soluçãoestoque em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 70 mL de água bidestilada e deionizada, 0,1 g de zinco em pó. Ferva lentamente, até dissolver todo o zinco, agitando o frasco Erlenmeyer, de tempos em tempos, com movimentos circulares. Se a solução icar turva, adicione, lentamente, solução de ácido sulfúrico 1 M até a turvação desaparecer. Esfrie, cobrindo o frasco Erlenmeyer com vidro de relógio. Adicione 1 mL de ácido fosfórico e titule imediatamente com solução-padrão de permanganato de potássio 0,02 M até cor levemente rosada. A solução original deve estar com concentração ao redor de 0,0178 M em íons de Fe II. Nota: quando disponível, poderá ser usada a solução-padrão 1000 mg/kg (em Fe) para espectrometria de absorção atômica. Reagente cloreto de hidroxilamônio (cloridrato de hidroxilamina) – Pese 10 g de cloreto de hidroxilamônio NH2OH.HCl, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução-tampão de acetato de sódio – Dissolva 250 g de acetato de sódio em 150 mL de água destilada e deionizada em béquer de 1000 mL. Mergulhe um eletrodo de vidro combinado previamente calibrado, conectado a pHmetro, uma barra magnética e, sob agitação, adicione lentamente 500 mL de ácido acético glacial. Após homogeneização, sob agitação constante, continue adicionando o ácido acético até o pH icar entre 4,4 e 5,0. Complete o volume a 1000 mL com água bidestilada e deionizada. Transira para frasco de vidro e guarde em geladeira, para se evitar a formação de fungos. Retire da geladeira, uma hora antes do uso, quantidades suicientes recolhidas em béqueres ou frascos pequenos de polietileno e mantidas à temperatura ambiente. Solução-reagente – Pese 1 g de 1,10-fenantrolina monoidratada C12H8N2.H2O, transira para um balão volumétrico de 1000 mL com 100 mL de água bidestilada e deionizada, adicione duas gotas de HCl, dissolva sob agitação e complete o volume com água bidestilada e deionizada. 360 - IAL Capítulo VIII - Águas Curva-padrão – Pipete 1 mL da solução-estoque com pipeta volumétrica em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Esta solução contém 10 mg de Fe ou o conirmado pela padronização. Seguindo o mesmo tratamento dado às amostras, abaixo descrito, prepare soluções-padrão de ferro contendo 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mg/L de ferro, a partir da solução-estoque de 10 mg/L. Com bureta de 10 mL, adicione quantidades de 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mL em balão volumétrico de 50 mL. Complete o volume com água bidestilada e deionizada e transira para um béquer de 250 mL. Adicione 4 mL de HCl a 50% e 1 mL de solução de NH2OH.HCl. Ferva até que o volume se reduza a 15 ou 20 mL. Esfrie à temperatura ambiente. Adicione 10 mL do tampão de acetato de sódio, 2 mL de solução de 1,10-fenantrolina. Transira para outro balão volumétrico de 50 mL, lavando as paredes do béquer e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Homogeneíze e deixe em repouso por 10 a 15 minutos, para o completo desenvolvimento da cor. Meça a absorbância em espectrofotômetro, utilizando comprimento de onda igual a 510 nm. Construa o gráico de absorbância em função da concentração da solução-padrão de ferro (em mg Fe/L). Procedimento – Agite bem a amostra e transira 50 mL para um béquer de 250 mL. Adicione 4 mL de HCl 50% (v/v) e 1 mL de solução de cloreto de hidroxilamônio10% (m/v). Ferva até que o volume se reduza a 15 ou 20 mL. Esfrie à temperatura ambiente. Adicione 5 mL de tampão acetato e 2 mL de solução de fenantrolina. Transira para um balão volumétrico de 50 mL, lavando as paredes do béquer e complete o volume com água destilada e deionizada. Homogeneíze e deixe em repouso por 10 a 15 minutos, para o completo desenvolvimento da cor. Acerte o “zero” do equipamento com a prova em branco. Meça a absorbância da amostra analisada. Nota: quando o teor de ferro na amostra for superior a 1 mg/L, dilua, cuidadosamente, uma alíquota da amostra original até 50 mL e proceda de maneira análoga à descrita no procedimento. Jamais dilua a solução colorida inal. Cálculo Obtenha a concentração da amostra diretamente da curva-padrão. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 3, p. 68-70. IAL - 361 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 319-320. 193/IV Determinação de fluoreto pelo método colorimétrico O íon luoreto em águas pode ocorrer naturalmente ou proveniente do processo de luoretação, o qual consiste na adição controlada de compostos de lúor na água de abastecimento público. Quando presente em concentrações adequadas, o lúor produz efeitos benéicos, promovendo a redução da incidência de cáries dentais, porém pode originar a luorose quando em concentrações acima das recomendadas. Entre os métodos analíticos sugeridos para a determinação do íon luoreto em águas, o método potenciométrico com eletrodo íon seletivo é o mais indicado, mas podese também usar o colorimétrico com o reagente de SPADNS. Ambos estão sujeitos a erros devido à interferência de outros íons presentes. A im de eliminar estas interferências, pode ser necessária a destilação prévia da amostra; no caso de águas potáveis, onde a concentração destes íons interferentes é pequena, a destilação da amostra, normalmente, não é necessária. Tabela 2 – Concentração limite das substâncias que causam interferência na determinação do íon luoreto Substância ou parâmetro alcalinidade (CaCO3) alumínio cloreto cloro cor e turbidez ferro hexametafosfato fosfato sulfato Método potenciométrico mg/L tipo de erro 7000 + 3 20000 5000 - 200 50000 50000 50000 - - Método colorimétrico mg/L tipo de erro 5000 0,1* 7000 + remoção com arsenito de sódio remoção por destilação 10 1,0 + 16 + 200 - (*) para leitura imediata, a tolerância aumenta com o tempo: após 2 h, 3 mg/L; depois de 4 h, 30 mg/L O método colorimétrico utilizando como reagente o SPADNS tem uma faixa analítica de 0 a 1,40 mg/L com desenvolvimento de cor virtualmente instantânea. A determinação da concentração do íon luoreto é feita por meio da medida de absorbância da amostra. Este método baseia-se na reação entre o luoreto e o composto colorido formado entre o zircônio . 362 - IAL Capítulo VIII - Águas e o SPADNS. O luoreto reage com este composto resultando em um complexo sem cor (ZrF6-2) e liberando o ligante orgânico. Com o aumento da concentração de luoreto, ocorre um decréscimo na intensidade da cor da solução. Algumas interferências podem ser eliminadas pelo uso de reagentes especíicos, como o arsenito de sódio para eliminação de cloro ou o aumento do tempo de repouso da amostra após a adição do reagente analítico, no caso especíico do alumínio. Para as demais interferências, tais como: hexametafosfato (1 mg/L), fosfato (16 mg/L) e sulfato (200 mg/L), é necessária a destilação prévia da amostra. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balões volumétricos de 50, 100, 500 e 1000 mL, bureta de 10 mL, pipetas volumétricas de 5, 10 e 50 mL e proveta de 10 mL. Reagentes Fluoreto de sódio anidro Sal trissódico do ácido 4,5-di-hidróxido-3-(para-sulfo-fenil-azo)- 2,7-naftileno-dissulfônico – SPADNS Oxicloreto de zircônio octahidratado Ácido clorídrico Arsenito de sódio Solução-padrão de luoreto 100 mg/L – Pese 221 mg de luoreto de sódio anidro, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete com água bidestilada e deionizada. Armazene esta solução (1 mL = 0,1 mg F-) em frasco plástico (polipropileno). Dilua 100 mL da solução-estoque de luoreto a 1000 mL com água destilada e deionizada, (1 mL = 0,01 mg F-). A partir desta solução, prepare uma série de padrões de luoreto com concentrações no intervalo de 0,05 a 1,4 mg F-/L, com volume inal de 100 mL. Solução de SPADNS – Pese 958 mg de SPADNS, transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete com água destilada e deionizada. Esta solução é estável por um ano, se protegida da luz direta. Solução de oxicloreto de zircônio – Pese 133 mg de oxicloreto de zircônio, ZrOCl2. 8H2O e transira para um balão volumétrico de 500 mL, aproximadamente 25 mL de água bidestilada e deionizada e 350 mL de ácido clorídrico. Complete o volume com água destilada e deionizada. Solução mistura SPADNS-oxicloreto de zircônio – Misture volumes iguais das soluções de SPADNS e de oxicloreto de zircônio. Armazene em frasco âmbar, protegido da luz. A solução é estável por 2 anos. IAL - 363 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução de referência – Misture 10 mL da solução de SPADNS e 100 mL de água bidestilada e deionizada. Adicione 10 mL ácido clorídrico diluído (7 mL de ácido clorídrico mais 3 mL de água bidestilada e deionizada). A solução resultante é utilizada para estabelecer o ponto de referência (zero) de absorbância do instrumento. Esta solução é estável por um ano. Solução de arsenito de sódio 0,5% (m/v) – Pese 5 g de arsenito de sódio, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Procedimento – Ajuste o equipamento para comprimento de onda igual a 570 nm. Determine o ponto de referência (zero) do espectrofotômetro a partir da solução de referência. Se a amostra contiver cloro residual, o mesmo deve ser eliminado pela adição de solução de arsenito de sódio. Meça 50 mL da amostra de água a ser analisada. Adicione 1 mL de arsenito de sódio a 0,5% (se a amostra contiver cloro residual), agite e espere 1 minuto. Adicione 5 mL da solução SPADNS e 5 mL da solução de oxicloreto de zircônio, ou 10 mL do reagente SPADNS-oxicloreto de zircônio, e misture bem. Leia as absorbâncias das amostras a 570 nm. Se o valor de absorbância da amostra não estiver dentro do intervalo da curva-padrão, repita o procedimento usando uma amostra diluída. Curva-padrão – Meça porções de 50 mL de soluções-padrão de concentrações no intervalo de 0,05 a 1,4 mg F-/L. Adicione a cada uma, 5 mL de solução SPADNS e 5 mL de oxicloreto de zircônio, ou 10 mL do reagente SPADNS-oxicloreto de zircônio e misture. Faça as leituras de absorbância de cada uma das soluções-padrão na mesma temperatura em que serão lidas as amostras. Construa o gráico de absorbância em função da concentração de luoreto. Deve-se obter uma reta com coeiciente angular negativo. Nota: prepare uma nova curva-padrão sempre que alguma das soluções reagentes seja refeita. Cálculo Determine a concentração de luoreto diretamente da curva-padrão. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 325326. 364 - IAL Capítulo VIII - Águas 194/IV Determinação de fluoreto pelo método potenciométrico O método potenciométrico com eletrodo de íon seletivo de luoreto é adequado para concentrações de íon luoreto acima de 0,2 mg/L. A adição de solução-tampão elimina algumas interferências e, nestes casos, evita-se a destilação prévia. As vantagens deste método são: alta seletividade, simplicidade e rapidez. O eletrodo de luoreto é um sensor íon-seletivo. O elemento principal do eletrodo de luoreto, basicamente, é um monocristal de luoreto de lantânio, através do qual se estabelece um potencial entre a solução de luoreto interna do eletrodo e a solução cuja concentração do referido íon pretende-se determinar. O cristal entra em contato com a amostra em uma face e uma solução interna de referência com a outra face. A cela eletrolítica pode ser representada por: Ag/AgCl, Cl- (0,3M), F- (0,001M)/LaF3 / amostra/ eletrodo de referência O eletrodo de íon luoreto pode ser usado com um eletrodo de referência de calomelano em qualquer pHmetro com precisão de 0,1 mV (milivolt). A atividade do íon depende da força iônica total, do pH e das espécies complexantes de íon luoreto na solução. A adição de um tampão adequado permite manter a força iônica uniforme e constante, ajustar o pH e liberar o íon luoreto dos complexos existentes. Material Potenciômetro com eletrodos de referência e de íon seletivo de luoreto, agitador magnético com barras magnéticas revestidas com teflon, balões volumétricos de 50, 100 e 1000 mL, béquer de plástico de 100 mL e pipetas volumétricas de 5, 10 e 50 mL. Reagentes Fluoreto de sódio anidro Ácido 1,2-ciclohexilenodinitrilotetracético (CDTA) Hidróxido de sódio Solução-padrão de luoreto 1000 mg/L – Pese 2,21 g de luoreto de sódio anidro, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Armazene a solução em frasco plástico. A partir de diluições adequadas da soluçãoestoque, prepare soluções-padrão de trabalho. Tampão TISSAB (T3) – Num béquer de 2000 mL, coloque, sob agitação, 500 mL de água deionizada e 18 g de CDTA . Adicione, gota a gota, uma solução de NaOH a 40% até dissolução do sal e, em seguida, 300 g de citrato de sódio dihidratado e 58 g de NaCl . Após a IAL - 365 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital dissolução dos sais, transira para um balão volumétrico de 1000 mL, acerte o pH em torno de 6,0 (± 0,2) e complete o volume com água destilada e deionizada. Conirme, novamente, o pH. Armazene em frasco plástico, sob refrigeração. Procedimento – Meça 50 mL da amostra e transira para um béquer de plástico de 100 mL. Adicione, com pipeta volumétrica, 5 mL da solução-tampão T3. Coloque uma barra magnética no béquer e homogeneíze sob agitação magnética. Com o potenciômetro e os eletrodos calibrados, proceda à leitura das amostras. Faça as leituras das amostras utilizando agitação magnética constante e velocidade similar à que foi utilizada para a leitura dos padrões. Curva-padrão – Nos casos em que o equipamento permite a calibração em leituras automáticas em concentração direta, construa a curva interna de calibração, seguindo as instruções expressas no manual do aparelho. Quando o equipamento não permite a calibração em leituras automáticas em concentração, proceda às leituras em milivolts, utilizando soluções padrão de 0,2 a 2 mg/L de luoreto. Construa uma curva milivolts x [F-] em papel monolog. O coeiciente angular da reta (slope), deve estar entre -54 a -60 mV/[F-]. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods fort he Examination of Water and Wastewater, 19th Ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 4, p. 61-62. 195/IV Determinação de nitrato pelo método espectrofotométrico na região do ultravioleta O íon nitrato geralmente ocorre em pequenas quantidades nas águas supericiais, mas atinge elevadas concentrações em algumas águas subterrâneas. Este método baseia-se na leitura direta da absorbância da amostra de água, com adição de ácido clorídrico 1,0 M, para águas de abastecimento e mineral. A região do espectro eletrônico em que são feitas as medidas de absorbância é muito sujeita a interferências espectrais. Assim, este ensaio somente é aplicável em águas com baixo conteúdo em matéria orgânica (águas naturais não contaminadas e águas de abastecimento público). O uso do ácido clorídrico é para previnir a interferência de concentrações de hidróxido ou carbonato acima de 1000 mg CaCO3/L. Interferentes: máteria orgânica dissolvida, surfactantes, NO-2 e Cr 6+ , íons inorgânicos não encontrados em águas naturais, tais como cloreto e clorato. 366 - IAL Capítulo VIII - Águas Método I - Determinação de nitrato na região do ultravioleta a 205 nm O método baseia-se na leitura direta da absorbância da amostra de água, com adição de ácido clorídrico 1,0 M, em espectrofotômetro a 205 nm, para águas de abastecimento e mineral. Material Estufa, espectrofotômetro UV/VIS, balões volumétricos de 100 e 1000 mL e pipetas volumétricas de 1, 2, 4, 5 e 7 mL. Reagentes Nitrato de potássio Nitrato de sódio Ácido clorídrico Solução ácido clorídrico 1 M – Meça, em proveta de 100 mL, 85 mL de ácido clorídrico e transira para um balão volumétrico de 1000 mL , completando o volume com água destilada e deionizada. Solução-estoque de nitrato a 100 mg/L – Pese 0,1631 g de nitrato de potássio, seco a 105°C ou 0,1371 g de nitrato de sódio, seco a 105°C, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Procedimento – Transira quantitativamente a amostra de água para um balão volumétrico seco de 100 mL. Adicione 1 mL de ácido clorídrico 1,0 M e homogeneíze. Leia a absorbância a 205 nm. Determine a quantidade de nitrogênio nítrico correspondente, usando a curva-padrão previamente estabelecida. Curva-padrão – A partir da solução-padrão estoque, prepare a curva-padrão transferindo alíquotas de 1, 2, 3, 4, 5, e 7 mL da solução para balão volumétrico de 100 mL, completando o volume com água destilada e deionizada. Adicione em cada balão volumétrico 1 mL de HCl 1,0 M e homogeneíze. Proceda à leitura a 205 nm, obtendo-se soluções de 1, 2, 3, 4, 5 e 7 mg/L de nitrato. Nota: obtendo-se leitura de absorbância acima de 1, dilua a amostra original como descrito acima e faça uma nova leitura. IAL - 367 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p. 85-86. Método II - Determinação de nitrato na região do ultravioleta a 220 nm e 275 nm Este método baseia-se na leitura direta da absorbância da amostra de água, com adição de ácido clorídrico 1 M, em espectrofotômetro a 220 e 275 nm Material Espectrofotômetro UV/VIS, balões volumétricos de 50 e 1000 mL, pipetas volumétricas de 5,10,15,20 e 25 mL Reagentes Nitrato de potássio ou nitrato de sódio, com pureza mínima de 99% Solução de ácido clorídrico 1 M - veja método I Solução-estoque de nitrato 100 mg/L - veja método I Solução-padrão intermediária de nitrato 10 mg/L Procedimento - Transira, quantativamente, a amostra de água para um balão volumétrico de 50 mL. Adicione 1 mL de ácido clorídrico 1 M e homogeneíze. Leia a absorbância a 220 nm e 275 nm. Determine a quantidade de nitrogênio nítrico correspondente, usando a curvapadrão previamente estabelecida. Curva-padrão - A partir da solução-padrão intermediária, prepare a curva-padrão transferindo alíquotas de 5, 10, 15, 20 e 25 mL da solução-padrão de nitrato 10 mg/L para balões volumétricos de 50 mL, completando o volume com água destilada e deionizada. Adicione a cada balão volumétrico 1 mL de HCl 1 M e homogeneíze. As soluções preparadas apresentarão concentrações de 1, 2, 3, 4 e 5 mg NO-3 /L, respectivamente, Medidas espectrofotométricas - Leia a absorbância no comprimento de onda 220 nm para relacionar com a concentração de nitrato e a 275 nm para determinar a interferência devida à matéria orgânica dissolvida. 368 - IAL Capítulo VIII - Águas Cálculo Para amostras e padrões, multiplique por 2 a leitura de absorbância em 275 nm e subtraia pela absorbância obtida em 220 nm. Usando também as absorbâncias corrigidas (Acorrigida = A220 - 2xA275), obtenha as concentrações das amostras diretamente a partir da curva-padrão (A x concentração). Se a concentração de nitrato da amostra for maior que 5 mg/L, proceda a diluição da amostra original com água destilada e deionizada, adicione 1 mL de HCl a 50 mL da amostra diluída e repita a leitura. Neste caso, o resultado deverá ser multiplicado pelo fator da diluição. Nota: se o valor da correção ( 2xA275) for maior que 10% do valor da leitura da absorbância em 220 nm, este método não poderá ser utilizado. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p. 85-86. 196/IV Determinação de nitrato pelo método espectrofotométrico com desenvolvimento de cor O método baseia-se na reação de íons nitrato com ácido fenol dissulfônico e posterior alcalinização com hidróxido de sódio, obtendo-se um composto amarelo. Este composto é o sal sódico do ácido pícrico formado pela nitração do fenol, cuja coloração é medida em espectrofotômetro. C6 H3 (OH)(SO3 H)2 + 3 HNO3 ↔ C6H2 (OH)(NO2 )3 + 2 H2 SO4 + H2O C6H2 (OH)(NO2 )3 + NaOH ↔ C6H2(NO2 )3ONa + H2O Os íons cloreto interferem no processo porque formam HCl com o excesso de H2SO4 contido na mistura ácido fenol dissulfônico/ácido sulfúrico e o HCl reage com o HNO3 formado: 6 HCl + 2HNO3 ↔ 2 NO + 4 H2O + 3 Cl2 IAL - 369 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Acima da concentração de 5x10-4 M, os íons cloreto podem ser precipitados com Ag2 SO4 e separados previamente. Abaixo dessa concentração a interferência permanece, com diminuição da concentração de nitrato medida, mas com efeito signiicativo baixo, pois a tolerância legal de nitrato em águas é da ordem de 10 mg/L. Material Espectrofotômetro UV/VIS, banho-maria, balança analítica, placa aquecedora, béquer de 100 mL, balões volumétricos de 50, 100, 500 e 1000 mL, pipeta graduada de 10 mL, pipetas volumétricas de 10 e 50 mL, bureta de 25 mL, cápsula de porcelana de 150 mL e bastão de vidro. Reagentes Nitrato de potássio Nitrato de sódio Ácido sulfúrico Fenol Hidróxido de sódio Sulfato de prata Sulfato de alumínio e potássio Hidróxido de amônio Solução-padrão estoque de nitrato a 100 mg/L – Pese 0,1631 g de nitrato de potássio, seco a 105°C ou 0,1371 g de nitrato de sódio, seco a 105°C. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL, dissolva e complete o volume com água destilada e deionizada. Nota: 1 mL desta solução corresponde a 0,1 mg de nitrato. Solução de ácido fenoldissulfônico – Pese 25 g de fenol e transira para um béquer com 225 mL de ácido sulfúrico. Aqueça em placa aquecedora a 100°C por duas horas, em capela. Resfrie, transira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com ácido sulfúrico. Solução hidróxido de sódio a 50% m/v – Pese 50 g de hidróxido de sódio, transira para um balão de 100 mL, dissolva e complete o volume com água destilada e deionizada. Transira a solução para um frasco limpo de plástico. Solução de sulfato de prata (para amostras com cloretos) – Pese 0,4397 g de sulfato de prata, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. 370 - IAL Capítulo VIII - Águas Nota: 1 mL desta solução reage com 1 mg de íons cloreto. Creme de alumina (para amostras turvas) – Prepare uma solução saturada de sulfato duplo de alumínio e potássio. Alcalinize com hidróxido de amônio até pH 10. Agite e deixe o precipitado sedimentar. Lave com água por decantação até que a água de lavagem não dê reação para sulfatos. Decante o líquido sobrenadante. Procedimento – Transira 50 mL da amostra para uma cápsula de porcelana de 150 mL. Evapore até a secura, em banho-maria. Adicione 1 mL da solução de ácido fenoldissulfônico. Misture, com um bastão de vidro, o ácido e o resíduo eventualmente presente nas paredes da cápsula. Lave com pequena porção (10 mL) de água destilada e deionizada e adicione 3 a 5 mL de solução de hidróxido de sódio a 50% sob agitação, até obter uma cor amarela estável. Transira para um balão volumétrico de 50 mL, lavando a cápsula (quando a tonalidade amarela for muito intensa, faça diluições maiores, a partir da amostra original). Complete o volume com água bidestilada e deionizada, iltre se necessário, homogeneíze, aguarde 15 minutos e meça a absorbância em espectrofotômetro, a 410 nm, utilizando como branco água destilada e deionizada, preparado nas mesmas condições da amostra. Determine a quantidade de nitrato correspondente, usando a curva-padrão previamente estabelecida. notas Se a amostra contiver cloretos acima de 30 mg/L, precipite-os em pH 1 (acidule com ácido sulfúrico), usando uma alíquota conveniente de solução de sulfato de prata. Quando a amostra se apresentar excessivamente turva, clariique-a com uma ponta de espátula de solução de creme de alumina. Curva-padrão – A partir da solução-estoque, prepare soluções-padrão de nitrato no intervalo de 0 a 7 mg NO3-/L. Com bureta de 25 mL, adicione quantidades de 0 (branco), 1, 2, 3, 4, 5, e 7 mL, respectivamente, em cápsulas de 150 mL. Evapore até a secura em banho-maria. Adicione em cada uma das cápsulas, 1 mL da solução de ácido fenoldissulfônico, misture bem com bastão de vidro a mistura e o eventual resíduo nas paredes das cápsulas. Lave com pequena porção (cerca de 10 mL) de água destilada e deionizada e adicione 5 mL de solução de hidróxido de sódio a 50%. Misture bem com bastão de vidro até obter cor amarela estável. Transira para um balão volumétrico de 100 mL, lavando as cápsulas e os bastões com água destilada e deionizada. Complete o volume, agite bem, aguarde 15 minutos e meça a absorbância em espectrofotômetro, utilizando comprimento de onda de 410 nm. Construa o gráico de absorbância em função da concentração da solução-padrão de nitrato (em mg NO3-/L). IAL - 371 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo Determine a quantidade de nitrogênio nítrico (NO3-) correspondente, usando a curva-padrão pré-estabelecida. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS, ASSOCIATION WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 11th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1960, p. 175. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS, ASSOCIATION WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 4, p. 85-86. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 317-319. 197/IV Determinação de nitrito pelo método espectrofotométrico com desenvolvimento de cor O íon nitrito corresponde a um estágio intermediário de oxidação do nitrogênio. Forma-se tanto pela oxidação da amônia como pela redução do nitrato. Tais oxidações e reduções podem ocorrer em estações de tratamento de esgotos, em sistemas de distribuição de água e em águas naturais. O nitrito pode ainda ser proveniente de aditivos inibidores da corrosão em instalações industriais. O íon nitrito (NO2-) é determinado por meio da formação de uma cor vermelho-púrpura produzida em pH (2,0 - 2,5) pela reação de diazotação da sulfanilamida com dihidrocloreto de N-(1-naftil)etilenodiamina. Na estocagem da amostra de água para a determinação de íons nitrito, nunca use ácido para a sua preservação. A determinação deve ser efetuada na amostra recém-coletada, de modo a prevenir a conversão bacteriana de NO2- para NO3- ou NH3. Para tempos de espera de 1 a 2 dias, conserve a 4°C. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, estufa, pesa-iltro, balões volumétricos de 50, 250 e 1000 mL, bureta de 10 mL, bastões de vidro, béquer de 100 mL, dessecador, pipetas volumétricas de 2 e 50 mL e pipetas graduadas de 10 mL. 372 - IAL Capítulo VIII - Águas Reagentes Nitrito de sódio com pureza mínima de 99%, armazenado em dessecador Nitrito de potássio com pureza mínima de 99%, armazenado em dessecador Ácido fosfórico Sulfanilamida Dihidrocloreto de N-(1-naftil)etilenodiamina Oxalato de sódio anidro, grau padrão primário Ácido sulfúrico Permanganato de potássio Solução-padrão de íons nitrito (100 mg/L) – Em um béquer de 100 mL, pese exatamente 0,15 g de nitrito de sódio ou 0,1848 g de nitrito de potássio puros, previamente secos por 2 horas em estufa a 105°C e resfriados em dessecador por uma hora. Transira, cuidadosamente, para um balão volumétrico de 1000 mL com água bidestilada e deionizada e complete o volume. Homogeneíze. Nota: utilize sempre solução recém-preparada. Esta solução tem validade de 30 dias, desde que mantida sob refrigeração. Solução de oxalato de sódio 0,025 M – Dissolva 3,350 g de oxalato de sódio em água destilada e deonizada, transira para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume. Solução de permanganato de potássio 0,01 M – Dissolva 1,6 g de permanganato de potássio em 1 litro de água destilada e deionizada. Armazene a solução em um frasco âmbar (rolha de vidro), por uma semana. Cuidadosamente, de modo a não ressuspender o sedimento, decante ou pipete o sobrenadante para outro frasco âmbar (rolha de vidro). Padronize esta solução, freqüentemente, pelo seguinte procedimento (em triplicata): em Erlenmeyer de 250 mL, pese 0,200 g de oxalato de sódio anidro, adicione 100 mL de água destilada e deionizada e agite até dissolver o sal. Adicione 10 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 1:1 e aqueça a 90-95º C. Titule, sob agitação e rapidamente, com a solução de permanganto de potássio preparada até que uma leve colaração rósea persista por, no mínimo, 1 minuto. Durante a titulação, não permita que a temperatura ique abaixo de 85º C (se necessário, aqueça o Erlenmeyer durante a titulaçao). Faça um branco com água destilada e ácido sulfúrico (1:1). A molaridade da solução de KMnO₄ é calculada por meio da média de três titulações a partir da seguinte equação: IAL - 373 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital M= Molaridade da solução de KMnO₄ m= Massa de Na₂C₂O₄ Va= volume da solução de KMnO₄ gasto na titulação do oxalato de sódio, em mL vb= volume da solução de KMnO₄ gasto na titulação do branco, em mL Padronização da solução de nitrito – Pipe, na ordem, em um Erlenmeyer de boca esmerilhada com tampa: 50 mL de solução de KMnO₄ 0,01 M, 5 mL de H₂SO₄ concentrado e 50 mL da solução de nitrito a ser padronizada (quando da adição da solução de nitrito, submerja a ponta da pipeta dentro da solução acidulada de KMnO₄). Com o frasco tampado, agite suavemente e aqueça a (70-80)º C em placa aquecedora. Faça a descoloração da solução pela adição de porções de 10 mL de solução-padrão de 0,025 M de Na₂C₂O₄. Titule o excesso de Na₂C₂O₄ adicionado com solução 0,01 M de KMnO₄ até o surgimento de coloração rósea fraca e persistente. Conduza uma titulação do branco (50 mL de água destilada e deionizada). Calcule a concentração da solução de nitrito por meio da seguinte equação: A= mg NO₂ – N/mL na solução estoque de NaNO₂ ou KNO₂ B= molaridade da solução de KMnO₄ C= volume total em mL da solução de KMnO₄ D= molaridade da solução de Na₂C₂O₄ E= volume total em mL da solução de Na₂C₂O₄ F= volume em mL da solução de NaNO₂ ou KNO₂ Reagente de N-(1-naftil)etilenodiamina – Em balão volumétrico de 250 mL, adicione um pouco de água destilada e deionizada, 25 mL de ácido fosfórico a 85%, 2,5 g de sulfanilamida e dissolva completamente. Adicione 0,25g de N-(1-naftil)etilenodiamina, e homogeneíze para dissolver completamente. Complete o volume com água destilada e deionizada. Homogeneíze novamente. Nota: guarde a solução em frasco escuro, sob refrigeração. A solução tem validade de 1 mês. Procedimento – Transfira 50 mL da amostra para um balão volumétrico, adicione 2 mL do reagente de cor e faça um branco nas mesmas condições da amostra, utilizando água destilada e deionizada. Aguarde de 30 a 45 minutos. Meça a absorbância da coloração vermelha desenvolvida a 543 nm, em espectrofotômetro. Curva-padrão – Pipete 10 mL da solução-estoque num balão volumétrico de 100 mL, e complete o volume com água destilada e deionizada (1 mL desta solução de NaNO2 contém 0,1 mg de NO2-). A partir desta solução de uso, prepare uma série de soluções de concentrações no intervalo de 0,0 a 0,5 mg/L em nitrito. Com bureta de 10 mL, adicione quantidades 374 - IAL Capítulo VIII - Águas de 0,0, 1, 2, 3, 4 e 5 mL em balão volumétrico de 100 mL, complete o volume com água destilada e deionizada e adicione 4 mL do reagente de cor. Aguarde de 30 a 45 minutos. Meça a absorbância em espectrofotômetro, utilizando comprimento de onda igual a 543 nm. Construa o gráico de absorbância em função da concentração da solução-padrão de nitrito (em mg NO2-/L). Nota: prepare a curva-padrão a cada troca da solução reagente de cor. Cálculo Determine a quantidade de íons nitrito correspondente, usando a curva-padrão, previamente estabelecida. Nota: caso a cor apresente intensidade acima daquela de concentrações usadas para a curvapadrão, repita o procedimento, diluindo a amostra, ou utilize balões volumétricos de maior volume para a leitura inal, e considere as diluições no cálculo inal. Deverá ser respeitada a faixa de aplicabilidade do método. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p.83-84. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 316-317. 198/IV Determinação de nitrogênio albuminóide O nitrogênio albuminóide origina-se de grupos amino de proteínas, polipeptídios ou aminoácidos. Estes materiais são constituintes importantes da poluição orgânica na fonte. Após a destilação do nitrogênio amoniacal, a adição de uma solução alcalina de permanganato de potássio produz desprendimento de amônia adicional, que corresponde ao nitrogênio albuminóide. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, estufa, sistema de destilação, proveta de 50 mL balões volumétricos de 50 e 100 mL e pipeta de 1 mL. IAL - 375 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Permanganato de potássio Hidróxido de sódio Solução-padrão estoque de cloreto de amônio – Pese, com precisão, 3,141 g de cloreto de amônio, previamente seco a 105°C. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Cada mL desta solução contém 1 mg de NH3. Soluções-padrão de cloreto de amônio – Prepare, a partir de diluições de uma soluçãoestoque de cloreto de amônio com água, uma série de soluções de concentrações 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/L de NH3. Solução alcalina de permanganato de potássio – Pese 16 g de permanganato de potássio, transira para um béquer de 3000 mL, acrescente 1200 mL de água bidestilada e deionizada (fervida por 10 minutos). Adicione 800 mL de solução de NaOH a 36%, clariicada por decantação. Adicione água destilada e deionizada até completar 2500 mL. Aqueça até reduzir o volume a 2000 mL. Guarde a solução em frasco plástico rígido e ao abrigo da luz. Determine, numa prova em branco, o nitrogênio amoniacal correspondente a 50 mL da solução e use este resultado para as correções nas determinações. Reagente de Nessler: Solução A – Pese 100 g de iodeto de mercúrio II, 70 g de iodeto de potássio, transira para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução B – Pese 160 g de hidróxido de sódio, transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Resfrie à temperatura ambiente. Adicione vagarosamente e sob agitação, a solução A à solução B e dilua para 1000 mL com água destilada e deionizada. Manuseie a solução na penumbra e armazene em frasco plástico rígido ao abrigo da luz. Procedimento – Ao resíduo da destilação resultante da determinação de amônia (ou nitrogênio amoniacal) conforme método 189/IV, adicione 50 mL da solução alcalina de permanganato de potássio. Adapte novamente o balão ao sistema refrigerante e destile. Receba 100 mL do destilado em um balão volumétrico. Transira 50 mL para um balão volumétrico, adicione 1 mL do reagente de Nessler, homogeneíze, meça a coloração amarela desenvolvida, segundo procedimento descrito em 189/IV e determine a quantidade correspondente de nitrogênio albuminóide. Cálculo Determine a concentração de nitrogênio albuminóide utilizando a curva-padrão pré-esta376 - IAL Capítulo VIII - Águas belecida com soluções-padrão de cloreto de amônio. Multiplique o resultado pelo fator 0,2, correspondente à alíquota de 50 mL tomada de um balão volumétrico de 100 mL contendo o destilado de 500 mL da amostra. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 315-316. 199/IV Determinação do oxigênio consumido em meio ácido A determinação de oxigênio consumido indica a quantidade de substâncias oxidáveis presentes na água. No método analítico proposto, a amostra é oxidada com íons permanganato em meio ácido. Após a adição de excesso de íons oxalato, titula-se novamente com solução de permanganato. Material Banho-maria, balança analítica, pipeta volumétrica de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, pipeta volumétrica de 5 mL, buretas de 10 e 25 mL, balão volumétrico de 1000 mL e béquer de 200 mL. Reagentes Permanganato de potássio Ácido sulfúrico Oxalato de sódio Solução de permanganato de potássio a 0,0025 M – Pese 4 g de permanganato de potássio e dilua com aproximadamente 1100 mL de água destilada e deionizada. Aqueça a solução até reduzir o volume a aproximadamente 1000 mL. Esfrie à temperatura ambiente. Filtre, a vácuo, em placa de porcelana porosa, previamente puriicada com ácido sulfúrico e exaustivamente lavada com água destilada e deionizada. Recolha o iltrado em balão volumétrico de 1000 mL, complete cuidadosamente o volume com água destilada e deionizada. Deixe a solução em repouso por uma semana, em frasco âmbar e dilua 100 mL desta solução com água destilada e deionizada, completando o volume até 1000 mL em balão volumétrico. Padronização – Pese quantitativamente massas de oxalato de sódio, em torno de 0,01 g, secas em estufa a 100°C por duas horas. Transira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 200 mL de água destilada e deionizada e 5 mL de ácido sulfúrico a 25% v/v. Leve ao banho-maria e aqueça entre (60–70)°C. Titule com a solução de permanganato de potássio IAL - 377 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital até a primeira coloração rósea. Nota: nas primeiras gotas há uma viragem aparente; retorne então ao banho-maria até a descoloração completa e prossiga normalmente a titulação. Faça ao menos duas provas e calcule a molaridade média. Cálculo 2 MnO4- + 16 H+ + 5 C2O4-- ↔ 2 Mn++ + 10 CO2 + 8 H2O m = massa de oxalato de sódio empregada, em gramas v = volume da solução de KMnO4 gasto na titulação, em L Solução aquosa de ácido sulfúrico 25% v/v – Dilua 25 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e deionizada, lentamente, deixando esfriar e completando o volume até 100 mL. Solução de oxalato de sódio 0,00625 M – Pese 8,375 g de oxalato de sódio, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Transira 100 mL desta solução para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com a mesma água. Procedimento – Transira 100 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 300 mL. Adicione 5 mL de ácido sulfúrico a 25% v/v. Adicione, com uma bureta, 5 mL de permanganato de potássio 0,0025 M. Aqueça em banho-maria por 30 minutos. Havendo descoloração da solução, adicione mais 10 mL da solução de permanganato. Caso descore novamente, repita o teste com a amostra diluída a 100 mL. Adicione, com uma bureta, uma quantidade de oxalato de sódio 0,00625 M exatamente igual a do total da solução de permanganato de potássio empregada. Leve ao banho-maria até descorar. Titule com solução de permanganato de potássio até coloração rósea. Cálculo O oxigênio consumido pela amostra (em mg/L) corresponde exatamente ao no de mL de permanganato de potássio 0,0025 M gasto na titulação da amostra. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for 378 - IAL Capítulo VIII - Águas the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p.100 -101. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 311-313. 200/IV Determinação de sódio e potássio Os íons de sódio estão presentes nas águas naturais, em concentrações que podem variar de menos de 1 mg/L a mais de 500 mg/L. Os íons de potássio também podem ocorrer naturalmente nas águas, sendo que sua concentração raramente excede 20 mg/L. Quantidades traços de íons sódio e potássio podem ser determinadas por fotometria de emissão de chama sendo que o sódio emite luz no comprimento de onda de 589 nm e o potássio no comprimento de onda de 766,5 nm. A amostra é aspirada e dispersa numa chama de gás na forma de spray e a excitação é conduzida sob condições controladas e reprodutíveis. A linha espectral de interesse é isolada com o uso de iltros ou sistema óptico adequado. A intensidade da luz a 589 nm e a 766,5 nm é proporcional à concentração de íons sódio ou de potássio na amostra. Material Fotômetro de chama com iltros para sódio e potássio ou sistema óptico equivalente, bomba de vácuo, dessecador, estufa, balança analítica, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, béquer de 50 mL e pipeta volumétrica de 10 mL. Reagentes Solução-padrão estoque de íons sódio – Pese 2,5421 g de cloreto de sódio, seco em estufa a 200°C por 3 horas e resfriado à temperatura ambiente, em dessecador. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Nota: 1 mL desta solução corresponde a 1 mg de íons sódio. Solução-padrão estoque de íons potássio – Pese 1,9067 g de cloreto de potássio, seco em estufa a 200°C por 3 horas e resfriado à temperatura ambiente, em dessecador, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. IAL - 379 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: 1mL desta solução corresponde a 1 mg de íons potássio. Soluções-padrão de íons sódio/potássio – A partir da solução-padrão estoque, prepare uma solução de concentração intermediária, diluindo 10 mL para um volume inal de 100 mL com água destilada e deionizada. Use volumes adequados desta solução de concentração intermediária para preparar soluções-padrão na faixa de 0,1 a 10 mg de sódio/L ou de 0,1 a 10 mg de íons potássio/L, utilizando sempre água bidestilada e deionizada. Nota: 1 mL corresponde a 0,1 mg de íons Na ou de K. Procedimento – Ajuste o comprimento de onda para 589 nm para íons sódio ou a 766,5 nm para íons potássio ou coloque os iltros adequados para a determinação de sódio e potássio (ou siga as instruções do fabricante para o ajuste do aparelho). Zere a escala de medida com água destilada e deionizada. Agite bem a amostra e transira cerca de 40 mL para um béquer seco e limpo. Com o fotômetro já calibrado e zerado, faça a leitura das amostras. Sempre cheque o zero da escala do aparelho com água bidestilada e deionizada, entre as medidas. Curva-padrão – Conirme o zero da escala do aparelho com água destilada e deionizada. Faça a leitura das soluções-padrão, iniciando com a solução mais diluída. Após a leitura de cada amostra, cheque o zero da escala do aparelho com água destilada e deionizada. Repita a operação de leitura com os padrões de calibração, o número de vezes necessário para garantir que o valor médio obtido para a solução-padrão seja coniável e reprodutível. Construa o gráico de intensidade de emissão em função da concentração de íons sódio (mg Na/L) ou de íons potássio (mg K/L). Cálculo A partir da curva-padrão e dos resultados obtidos para cada amostra, determine o valor da concentração de íons sódio (mg Na/L) ou de íons potássio (mg K/L) nas amostras analisadas. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 3, p.83, 96-98. 201/IV Determinação do pH A uma dada temperatura, a acidez ou a alcalinidade de uma solução é indicada pelo valor do pH ou pela atividade do íon hidrogênio. O pH é deinido como o co-logarítmo 380 - IAL Capítulo VIII - Águas da atividade do íon hidrogênio (- log aH+); para soluções diluídas, a atividade do íon H+ é praticamente igual à concentração molar e expressa a acidez do meio. O valor do pH para água pura, a 25°C, é igual a 7. Como resultado da presença de ácidos ou bases e também da hidrólise de sais dissolvidos, o valor do pH pode apresentar valores abaixo de 7 (meio ácido) ou acima de 7 (meio básico). Para efeitos práticos em análises de água, basta determinar o pH até segunda casa decimal. A medida do pH baseia-se na determinação da atividade dos íons hidrogênio por meio da medida potenciométrica usando um eletrodo de vidro e um de referência ou um eletrodo de vidro combinado. A força eletromotriz medida com o sistema do eletrodo de vidro combinado varia linearmente com o pH. O instrumento de medida de pH é, incluindo o eletrodo combinado, calibrado com soluções-tampão de pH conhecido. Material pHmetro com compensador de temperatura, eletrodo de vidro combinado, agitador magnético com barra magnética, béqueres de 50 e 150 mL, balão volumétrico de 500 mL, cápsula de porcelana e dessecador com agente dessecante. Reagentes Solução-tampão – Podem ser adquiridas, no comércio, soluções-tampão certiicadas. Em geral são fornecidas em três valores de pH: 4, 7 e 10 (ou próximo destes). Essas soluções também podem ser preparadas no laboratório. A calibração do aparelho com o uso de eletrodo de vidro combinado deve ser efetuada como indicado no manual do aparelho. Solução-tampão de biftalato pH 4 (25°C) – Pese 5,06 g de biftalato ácido de potássio, previamente seco a 110°C por 2 horas. Dissolva em água destilada e deionizada, transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume. Solução-tampão de fosfato pH 6,86 (25°C) – Seque, separadamente, cerca de 2,5 g de fosfato diácido de potássio e de fosfato ácido dissódico por duas horas a (110–130)°C e deixe esfriar em dessecador. Pese 1,694 g de fosfato diácido de potássio e 1,767 g de fosfato ácido dissódico e dissolva em água destilada e deionizada. Transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução-tampão de borato pH 9,18 (25°C) – Pese 1,9 g de borato de sódio decahidratado; dissolva em água destilada e deionizada. Transira para um balão volumétrico de 500 mL com água destilada e deionizada. IAL - 381 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: as soluções-tampão acima mencionadas devem ser mantidas em geladeira a cerca de 4°C, a im de se evitar contaminação por fungos. Pelo menos uma hora antes do uso das mesmas, retire dos frascos de solução-estoque cerca de 20-30 mL que são transferidos a béqueres de 50 mL limpos e secos, de diâmetro suiciente para mergulhar o eletrodo de vidro combinado em seu interior. Lave o béquer com alguns mL do tampão, preencha com a solução, feche imediatamente e deixe sobre a bancada por uma hora pelo menos, para que a temperatura da solução atinja a temperatura ambiente. Após o uso no ensaio, descarte a solução. Procedimento – Lave o eletrodo de vidro com água destilada e deionizada. Seque delicadamente com papel absorvente ino. Coloque o eletrodo na solução-tampão de fosfato preparada (béquer de 50 mL) com agitação suave e constante. Leia a temperatura da solução e veriique o valor do pH do tampão para esta temperatura (tabela 3). Retire o eletrodo da solução e lave com água destilada e deionizada. Veriique a linearidade do eletrodo com o segundo tampão. Para efeito de ajuste de aparelhagem, escolha o tampão de biftalato se as amostras apresentarem pH < 7 ou o tampão de borato se apresentarem pH > 7. Proceda de maneira semelhante ao descrito para tampão de fosfato. As amostras não requerem nenhuma preparação especial. Transira cerca de 50 mL de amostra para um béquer de 100 mL. Lave o eletrodo e o compensador de temperatura com água bidestilada e deionizada, seque suavemente e coloque-os dentro do béquer com a amostra com agitação laminar. Espere a leitura icar constante e anote o valor de pH da amostra Tabela 3 – Valores de pH de soluções-tampão em relação à temperatura da solução t (°C) 15 20 25 30 35 Biftalato de potássioo 3,999 4,002 4,008 4,015 4,024 Valores de pH de soluções-tampão padrão Fosfato diácido de potássio e fosfato ácido dissódico (1:1) 6,900 6,881 6,865 6,853 6,844 Borato de sódio 9,276 9,225 9,180 9,139 9,102 38 40 4,030 4,035 6,840 6,838 9,081 9,068 Fonte: MIDGLEY, D.; TORRANCE, K. Potenciometric water analysis. 2nd ed. New York: Hohb Wiley & Sons, 1991. p. 168. 382 - IAL Capítulo VIII - Águas Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1995. chapter 4, p. 65-69. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 310. 202/IV Determinação de sólidos totais secos a (103-105)°C Os termos sólidos, sólidos suspensos e sólidos dissolvidos vêm substituir os antigos termos resíduo não iltrável e resíduo iltrável. O termo sólido se refere à matéria suspensa ou dissolvida na água. A designação de sólidos totais é aplicada para o resíduo material deixado no recipiente após a evaporação de uma amostra de água e a subseqüente secagem completa a uma temperatura deinida, normalmente 105°C. Os sólidos totais incluem: sólidos totais suspensos, que é a porção dos sólidos totais retidos por um iltro de porosidade igual a 2,0 μm, e sólidos totais dissolvidos, que é a porção que passa através do iltro. Os sólidos dissolvidos ou em suspensão, diferenciam-se em ixos e voláteis. “Sólidos ixos” é o termo aplicado ao produto da calcinação do resíduo total, da matéria suspensa ou dissolvida, por um tempo especiico a uma determinada temperatura, por exemplo: 2 horas e 500°C. A perda de peso durante a calcinação é denominada “sólidos voláteis”. As determinações de sólidos ixos e voláteis não distinguem precisamente entre a matéria orgânica e a inorgânica, pois a perda por calcinação não é exclusiva de material orgânico, podendo ocorrer a decomposição ou volatilização de alguns sais minerais. Sólidos totais são matérias suspensas ou dissolvidas presentes numa amostra de água. Este termo é aplicado ao resíduo de material deixado no recipiente após a evaporação de uma amostra e sua subseqüente secagem completa a uma temperatura deinida. Os sólidos totais são determinados pela veriicação da massa do resíduo de uma amostra de água, após evaporação e secagem até peso constante, a (103-105)°C. Material Banho-maria, estufa, balança analítica, pinça metálica, cápsula de porcelana ou platina, balão volumétrico ou pipeta volumétrica de 100 mL e dessecador com sílica-gel. Procedimento – Aqueça, em uma estufa, uma cápsula limpa de platina ou porcelana a (103105)°C, por no mínimo 3 horas. Retire da estufa, transferindo para um dessecador, até a IAL - 383 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital temperatura ambiente e pese. Meça 100 mL da amostra de água não iltrada em um balão volumétrico e transira quantitativamente para a cápsula já pesada. Evapore até secagem em um banho-maria ou numa chapa de aquecimento, evitando que a amostra entre em ebulição. Coloque a cápsula em uma estufa a (103 - 105)°C por 3 horas. Transira a cápsula para um dessecador, deixando atingir o equilíbrio térmico com o ambiente e pese. Repita as operações até obter peso constante ou até que a diferença de peso seja menor do que 4% da medida anterior. As determinações devem ser feitas em duplicata e os resultados devem concordar em 5% entre as medidas. Cálculo A = massa (resíduo seco + cápsula) mg B = massa da cápsula mg v = volume da amostra em L Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 304. 203/IV Determinação de sólidos dissolvidos, secos a 180°C, pelo método gravimétrico Os sólidos totais dissolvidos são os materiais que passam através de um iltro sinterizado padrão e que posteriormente são evaporados e secos à uma determinada temperatura por um determinado período de tempo. A amostra de água é iltrada em iltro de vidro de porosidade igual a 2 μm, ou através de papel de iltro quantitativo para precipitados inos, evaporada e seca em estufa a 180°C, até peso constante. O aumento de peso do recipiente utilizado para a realização da evaporação corresponde aos sólidos totais dissolvidos. Material Banho-maria ou chapa aquecedora, estufa, balança analítica, pinça metálica, agitador magnético com barra magnética, bomba de vácuo ou trompa de vácuo, cápsulas de porcelana ou platina, balão volumétrico de 100 mL, dessecador com sílica-gel e sistema de iltração a vácuo com iltro de vidro sinterizado de porosidade de 2 μm. Procedimento – Monte o sistema de iltração, aplique vácuo e lave o iltro com três volumes sucessivos de 20 mL de água destilada e deionizada. Continue a sucção para remover todos os traços de água. Descarte as águas de lavagem. Agite a amostra com agitador magnético, transira quantitativamente 100 mL da amostra medida em balão volumétrico e iltre sob 384 - IAL Capítulo VIII - Águas vácuo. Lave com três volumes de 10 mL de água destilada e deionizada, esperando a completa drenagem entre as lavagens e continue a sucção por cerca de 3 minutos após a iltração. A amostra iltrada mais os três volumes de 10 mL de água destilada e deionizada compõem a amostra para a análise. Aqueça, em estufa, uma cápsula limpa de platina ou porcelana a (180 ± 2)°C, por 3 horas. Retire da estufa e coloque em um dessecador para esfriar, deixando atingir o equilíbrio térmico com o ambiente. Pese e coloque a amostra de água iltrada juntamente com as três porções de 10 mL de água destilada e deionizada utilizadas na lavagem do iltro, em uma cápsula de porcelana ou platina, previamente pesada. Evapore até secagem em banho-maria ou em uma chapa aquecedora evitando que a amostra entre em ebulição. Coloque a cápsula em uma estufa a (180 ± 2)°C por 3 horas. Transira a cápsula para um dessecador, deixando atingir o equilíbrio térmico com o ambiente onde se encontra a balança e pese. Repita as operações dos itens anteriores até obter peso constante ou até que a diferença de peso seja menor do que 4% da medida anterior. As determinações devem ser feitas em duplicata e os resultados devem concordar dentro de 5% entre suas medidas. Cálculo A = peso (resíduo seco + cápsula) mg B = peso da cápsula mg v = volume da amostra, em mL 204/IV Determinação de sólidos dissolvidos, secos a 180°C, pelo método condutivimétrico A condutivida de elétrica proporciona uma indicação da quantidade de sólidos totais dissolvidos presentes em uma amostra de água. Seu valor depende da concentração e do grau de dissociação dos íons, bem como da temperatura e da velocidade de migração dos íons no campo elétrico. A cela de condutividade não é seletiva, mede a soma total das concentrações dos eletrólitos dissolvidos na solução. Nenhuma conclusão pode ser fornecida sobre o tipo de íons presentes. O valor da concentração dos sólidos totais dissolvidos é estimado a partir de um eletrólito padrão como NaCl ou KCl. Material Condutivímetro com cela de condutividade, compensador de temperatura, béquer de 150 mL e termômetro (na ausência de compensador de temperatura). IAL - 385 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução-padrão de NaCl 1000 mg/L – Pese 1000 mg de cloreto de sódio seco a 200°C por 3 horas e resfriado em dessecador, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Procedimento – Calibre o equipamento com solução-padrão de cloreto de sódio. Em um béquer de 150 mL, coloque cerca de 100 mL de amostra de água homogeneizada. Insira a cela de condutividade na amostra, agite-a verticalmente para eliminar as bolhas de ar que possam estar presentes. Deixe a cela imersa e em repouso até o aparelho estabilizar-se. Faça a leitura, lave a cela com água deionizada antes e depois de cada leitura. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 2, p. 53,55. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 304-305. 205/IV Determinação da turbidez pelo método nefelométrico A turbidez é a expressão usada para descrever a propriedade óptica referente ao espalhamento e a absorção da luz quando esta passa através de uma amostra. Esta propriedade é uma característica decorrente da presença de materiais suspensos, tais como areia, poeira, matéria orgânica e inorgânica, plâncton e organismos microscópicos. A presença destes sólidos suspensos, inamente divididos e geralmente em estado coloidal, impede a passagem da luz através da amostra de água. A correlação da turbidez com a concentração de matéria suspensa é difícil porque o tamanho, a forma e o índice de refração das partículas também afetam a propriedade de espalhamento da luz. A turbidez pode ser determinada para qualquer amostra livre de detritos e sedimentos, usando-se uma escala arbitrária em unidades de turbidez. O método compara a intensidade de luz espalhada pela amostra com a de uma amostra-padrão de referência, sob condições deinidas. A nefelometria envolve a medida da luz espalhada numa direção especíica, normalmente a 90° da trajetória do raio incidente. O polímero de formazina é usado como suspensão-padrão de referência de turbidez. As paredes da cubeta contendo a amostra, assim como as janelas sujas do equipamento, a presença de bolhas de ar na amostra e vibrações que possam perturbar a superfície da amostra, fornecem resultados falsos. A “cor verdadeira”, que é a cor da água devido às substâncias dissolvidas que absorvem luz, causa medidas menores de turbidez. 386 - IAL Capítulo VIII - Águas Material Turbidímetro, balança analítica, cubetas de vidro, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, pipetas volumétricas de 5 e 10 mL, sistema de iltração completo e iltro de membrana com porosidade 0,2 μm. Reagentes Água livre de turbidez – Passe água através de uma membrana de iltro de porosidade igual a 0,2 μm. O iltro de membrana convencional usado para exames bacteriológicos não é satisfatório. Lave o frasco coletor duas vezes com a água iltrada e descarte os próximos 200 mL. O método é satisfatório para se medir turbidez até 0,02 UT. Suspensão-estoque de turbidez: Solução I – Pese 1000 mg de sulfato de hidrazina, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução II – Pese 10 g de hexametilenotetramina, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Em um balão volumétrico de 100 mL, misture 5 mL da solução I e 5 mL da solução II. Deixe em repouso por 24 horas a (25 ± 3)°C. Complete o volume com água destilada e deionizada e misture. A turbidez desta solução é de 400 UT (unidades de turbidez). Nota: prepare as soluções e suspensão, mensalmente. Suspensão-padrão de turbidez 40 UT Com uma pipeta volumétrica, transira 10 mL da suspensão-padrão de polímero de formazina (400 UT) para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com água destilada e deionizada livre de turbidez e misture. Prepare esta suspensão semanalmente. Suspensão-padrão de turbidez menor que 40 UT A partir da suspensão-padrão de turbidez de 40 UT, utilizando-se pipeta e balão volumétrico de 100 mL, prepare diariamente soluções diluídas de acordo com a necessidade (Tabela 4). Nota: alternativamente, use padrões disponíveis no comércio, tais como estireno-divinilbenzeno ou outros que sejam equivalentes à suspensão de polímero de formazina, recentemente preparada. IAL - 387 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 4 – Dados referentes ao preparo de suspensões diluídas de turbidez (em balões volumétricos de 100 mL) Padrão de turbidez UT requerido 0,05 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 4,0 6,0 10 20 30 40 Volume de suspensão necessário ( mL) Suspensão de 2 UT Suspensão de 40 UT utilizada utilizada 2,5 5,0 25 50 75 100 - 10 15 25 50 75 100 Volume de água livre de turbidez (mL) 97,5 95 75 50 25 0 90 85 75 50 25 0 Procedimento – Agite a amostra, procurando evitar a formação de bolhas antes da realização da medida de turbidez. Deixe repousar para eliminar as bolhas de ar e transira uma quantidade de amostra para a cubeta do turbidímetro. Quando possível, coloque a cubeta com a amostra num banho de ultra-som por 1 a 2 segundos, para eliminar qualquer bolha de ar. Dilua as amostras com 1 ou mais volumes de água livre de turbidez até que a turbidez das amostras se enquadre na faixa de 30 a 40 UT. Limpe bem as paredes da cubeta contendo a amostra e coloque-a no turbidímetro. Leia a turbidez diretamente na escala do aparelho ou a partir de uma curva-padrão adequada. Curva-padrão – Nos instrumentos pré-calibrados, veriique a escala de calibração com o uso de padrões apropriados. Leia ao menos um padrão em cada faixa de leitura disponível no aparelho utilizado. Na ausência de uma escala pré-calibrada, prepare curvas de calibração para cada faixa de leitura do instrumento com as suspensões-padrão de turbidez listadas na Tabela 4. Essas suspensões-padrão não devem ser agitadas. Cálculo Determine a turbidez, com a curva-padrão previamente estabelecida. 388 - IAL Capítulo VIII - Águas Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 2, p. 8,11. 206/IV Determinação da turbidez pelo método turbidimétrico Material Turbidímetro Hellige Procedimento – Escolha a faixa de turbidez apropriada e selecione o iltro adequado a esta posição. Limpe e seque cuidadosamente a cela do turbidímetro de altura própria para a faixa de turbidez escolhida. Encha a cela até a marca com a amostra. Limpe o plunger e mergulhe no líquido que preenche a cela, cuidadosamente para evitar bolhas. Limpe o exterior da cela e coloque na plataforma espelhada. Feche a porta do aparelho e ligue a luz. Balanceie imediatamente a intensidade da luz do feixe central com a intensidade do fundo. Leia a escala graduada sobre o disco do botão quando o brilho dos dois campos estiver balanceado. Determine a turbidez da amostra, por meio do gráico apropriado à faixa de operação utilizada. Nota: estes gráicos acompanham o aparelho e variam segundo a turbidez da amostra, o iltro utilizado e a altura da cela. Curva-padrão – Ao se trocar a lâmpada do aparelho, é necessária uma nova calibração e a elaboração de um novo gráico para cada faixa de turbidez. A solução-padrão para a construção da curva consiste de um “kit de calibração de turbidez”, contendo 500 mL de uma suspensão-padrão estoque de sílica (SiO2) equivalente a 200 mg/L e papéis de gráico em branco impressos especialmente para trabalhar com as cinco faixas de turbidez. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER, ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: American Public Health Association,1995. chapter 2, p. 8, 11. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Méodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 303-304. IAL - 389 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 207/IV Determinação de resíduos de pesticidas e bifenilas policloradas pelo método multiresíduo Este método determina resíduos de pesticidas e PCBs em água, referentes aos princípios ativos constantes da Tabela 5. O método baseia-se na extração dos referidos princípios ativos na amostra de água com uma mistura dos solventes diclorometano e n-hexano e cuja detecção e quantiicação são realizadas por cromatograia em fase gasosa com os detectores de captura de elétrons (ECD) e fotométrico de chama (FPD) ou seletivo de nitrogênio e fósforo (NPD). Tabela 5 – Distribuição de pesticidas e bifenilas policloradas-PCBs (a) Pesticidas Aldrin Lambda-cialotrina Cipermetrina DDT total (op’DDT, pp’DDT, op’DDE, pp’DDE, op’DDD, pp’DDD) Dieldrin Deltametrina Dodecacloro Endrin (a) Endosulfam(alfa, beta e sulfato de endosulfam) HCH total (alfa, beta e gama) Heptacloro Heptacloro epóxido Hexaclorobenzeno BifenilasPolicloradas-PCBs congêneres PCB 28 PCB 52 PCB 101 390 - IAL (b) Pesticidas Azinfós etílico Azinfós metílico Carbofenotiona Clorfenvinfós Clorpirifós-etílico Clorpirifós-metílico Diazinona Diclorvos (b) Dimetoato Dissulfotona Etiona Etoprofós Etrinfós Fenamifós Fentiona Fentoato Folpete Forato Malationa Capítulo VIII - Águas PCB138 PCB153 PCB180 - Metamidofós Metidationa Mevinfós Ometoato Parationa-etílica Parationa-metílica Pirimifós-etílico Pirimifós-metílico Profenofós Pirazofós Terbufós Triazofós (a) Cromatograia a gás com detector de captura de elétrons (ECD). (b) Cromatograia a gás com detector fotométrico de chama (FPD) ou de nitrogênio e fósforo (NPD). Material Cromatógrafo a gás com detectores de captura de elétrons (ECD) e fotométrico de chama (FPD) ou de nitrogênio e fósforo (NPD), capela de exaustão para solventes, rotavapor, estufa, aparelho extrator de Soxhlet, funis de separação de 2000 mL, balões volumétricos de diferentes capacidades, pipetas volumétricas de diferentes capacidades, pipetas Pasteur, frasco Erlenmeyer com tampa, tubos graduados de 10 mL com tampa, funis analíticos, provetas 100 e 1000 mL, béqueres de 2000 mL, coluna cromatográica de vidro de 15 mm de diâmetro por 30 cm de altura com torneira de teflon e reservatório de 300 mL, tubo de vidro com tampa e batoque de teflon, vials de vidro com tampas e septos de teflon para injetor automático Reagentes n-Hexano, grau resíduo Isoctano, grau resíduo Algodão tratado Sulfato de sódio anidro granulado, grau resíduo Cloreto de sódio Água tratada – Transira 1000 mL de água destilada para um funil de separação de 2000 mL e extraia três vezes com 60 mL da mistura de diclorometano:n-hexano (1:1). Despreze a fase IAL - 391 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital orgânica e armazene a água. Sílica gel 60, 70-230 mesh Nota: Faça, previamente, brancos de cada r eagente para certiicar-se de que não possuem interferentes para a análise. Solução-padrão dos princípios ativos – Pese 0,010 g de cada padrão analítico em béquer de 10 mL e transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com isoctano. Transira para um frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Os frascos devem conter uma etiqueta com dados de procedência, identidade, concentração, estabilidade, data de preparação, prazo de validade e temperatura de armazenamento. Faça diluições necessárias com n-hexano em 5 níveis (1/2 LQ, 1 LQ, 2 LQ, 5 LQ e 10 LQ) para veriicação da faixa de linearidade do detector e construção da curva-padrão. Nota: LQ – Limite de quantiicação: menor concentração do analito na amostra que pode ser quantiicada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Diclorometano:n-hexano (1:4) – Transira 200 mL de diclorometano para balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Diclorometano:n-hexano (1:1) – Transira 500 mL de diclorometano para balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Sílica gel ativada – Calcine quantidade suiciente de sílica gel 60-70-230 mesh a 450°C durante 4 horas. Deixe em dessecador até temperatura ambiente. Armazene em frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Ative a sílica gel calcinada por 5 horas a 135°C de 2 em 2 dias. Armazene-a em dessecador. Sílica gel desativada a 10% – Pese 13,5 g de sílica gel ativada em frasco Erlenmeyer com tampa. Adicione 1,5 g de água tratada. Homogeneíze. Solução saturada de cloreto de sódio – Em um béquer de 100 mL, adicione água e cloreto de sódio até que a solução ique saturada. Transira para frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Algodão tratado – Coloque, em frasco de Soxhlet, algodão e extraia com 200 mL de nhexano, no mínimo por cinco horas. Coloque em béquer e seque em estufa. Armazene em frasco de vidro com tampa. 392 - IAL Capítulo VIII - Águas Procedimento Extração – Transira 1000 mL da amostra homogeneizada para um funil de separação de 2000 mL. Extraia com 60 mL da mistura diclorometano:n-hexano (1:4) para análise dos pesticidas do item (a) da Tabela 5, exceto lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, sulfato de endosulfam e/ou com 60 mL da mistura diclorometano:n-hexano (1:1) para análise dos pesticidas: lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, sulfato de endosulfam e todos os pesticidas do item (b) da Tabela 5. Quando analisar todos os pesticidas da Tabela 5, extraia com 60 mL da mistura diclorometano:n-hexano (1:1). Adicione, aproximadamente, 10 mL de solução saturada de cloreto de sódio. Tampe o funil. Inverta e abra a torneira para o escape de vapores de solventes. Agite. Deixe em repouso para separação das fases. Recolha a fase aquosa em béquer de 2000 mL. Passe a fase orgânica sobre sulfato de sódio anidro granulado através de um funil com algodão tratado e recolha em balão de fundo chato de 300 mL. Transira a fase aquosa para funil de separação e extraia, como descrito, mais duas vezes. Os extratos recolhidos são evaporados em rotavapor até quase à secura. Adicione, aproximadamente, 5 mL de n-hexano e concentre novamente para eliminar o diclorometano. Transira, quantitativamente, para tubo de vidro graduado com uma pipeta Pasteur. Complete o volume a 5 mL com n-hexano, lavando as paredes do balão. Injete nos respectivos cromatógrafos. Puriicação – Quando o extrato não estiver limpo, isto é, com muitos interferentes, puriique-o em coluna cromatográica com 15 g de sílica gel desativada a 10% com água, eluíndo com 200 mL da mistura de diclorometano:n-hexano (1:4) e com 200 mL da mistura diclorometano:n-hexano (1:1). Recolha o eluído em balão de fundo chato de boca esmerilhada de 300 mL e concentre em rotavapor. Adicione, aproximadamente, 5 mL de n-hexano e concentre novamente para eliminar o diclorometano. Transira, quantitativamente, para tubo de vidro graduado com uma pipeta Pasteur. Complete o volume a 5 mL com n-hexano, lavando as paredes do balão.Transira uma alíquota para um vial e injete nos respectivos cromatógrafos. Análise da amostra-testemunha e estudos de recuperação – Realize análise da testemunha e estudos de recuperação com cinco repetições em pelo menos dois níveis: 1LQ e 10 LQ. Condições cromatográicas para a análise dos princípios ativos dos pesticidas do item (a) da Tabela 5: Cromatógrafo a gás, com detector de captura de eletrons (ECD), equipado com workstation. Coluna capilar – fase estacionária 5% de fenilmetil siloxano (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm de ilme) Temperatura do detector – 320°C Temperatura do forno: 60°C (1 min), (60-220)°C (10°C/min), (220-280)°C IAL - 393 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (3°C/min), 280°C (17 min) - tempo: 60 min. Fluxo do gás de arraste-nitrogênio - 1 mL/min. Temperatura do injetor - 240°C Modo de injeção - splitless Condições cromatográicas para a análise dos princípios ativos dos pesticidas do item (b) da Tabela 5: Cromatógrafo a gás, com dector fotométrico de chama (FPD) ou de nitrogênio e fósforo (NPD) Coluna megabore - fase estacionária 5% de fenilmetil siloxano (30 m x 0,53 mm x 2,65 μm de ilme) Temperatura do detector - 280°C Temperatura do forno: (50 - 150)°C (30°C/min), (150 - 240)°C (10°C/min). Fluxo do gás de arraste - nitrogênio – 18 mL/min. Fluxo de Hidrogênio -75 mL/min . Fluxo de ar sintético -100 mL/min. Temperatura do injetor - 240°C Modo de injeção - splitless Curva-padrão – Injete as soluções de trabalho com diferentes concentrações por duas ou três vezes ou até que haja repetitividade dos cromatogramas. Construa a curva-padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Determinação – A análise qualitativa é feita por padronização externa, por meio de comparação do tempo de retenção dos respectivos princípios ativos e a conirmação em coluna de diferente polaridade ou por detector seletivo de massa. Cálculo A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão com padronização externa, por comparação de área, levando em consideração o fator de diluição e a quantidade da amostra. O resultado deve ser expresso em μg do princípio ativo por litro de amostra (μg/L). Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKSASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Method for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington D.C.: A.P.H.A., 1995. chapter 6, p. 114-128. (com modiicações). STEIWANDTER, H. Contributions to sílica gel application in pesticide residue analysis. III. An on-line method for extracting and isolating chlorinated hidrocarbon pesticides and 394 - IAL Capítulo VIII - Águas polychlorinated biphenyls (PCBs) from milk and dairy products. Fresenius Z. Anal. Chem., v. 312, p. 342-345, 1982. 208/IV Determinação de arsênio total por espectrometria de absorção atômica com gerador de hidretos Este método é aplicável à determinação de arsênio total em água para o consumo humano. O arsênio está na forma de arsenato (As5+) e, no caso de poço profundo, algum arsenito (As3+) pode estar presente. Espécies metiladas (ácidos monometilarsônico e dimetilarsínico) raramente estão presentes em águas de consumo. O arsênio orgânico é oxidado a arsênio inorgânico com K2S2O8/HCl sob aquecimento e este é pré-reduzido a As3+ com KI/HCl. O As3+ é transformado em AsH3 com NaBH4, no gerador de hidretos e depois é reduzido ao estado elementar em cela de quartzo aquecida a 900oC e determinado por espectrometria de absorção atômica. Material Espectrômetro de absorção atômica acoplado a sistema de geração de hidretos com injeção em luxo, chapa aquecedora, lâmpada de catodo oco ou de descarga sem eletrodo de arsênio, balões volumétricos, pipetadores automáticos com volumes ajustáveis, pipetas volumétricas e béqueres Reagentes Ácido clorídrico para análise de traços de metais Nota: antes de usar o ácido, borbulhe um gás inerte (por exemplo, argônio ou nitrogênio) ao frasco do reagente por aproximadamente três horas, para eliminar o Cl2 dissolvido, pois interfere na reação, oxidando o hidreto formado. Ácido nítrico para análise de traços de metais. Solução de iodeto de potássio a 10% m/v . Solução de ácido L(+)-ácido ascórbico a 10% m/v. Solução de perssulfato de potássio a 4%. Solução-padrão estoque de arsênio para absorção atômica - 1 000 mg/L, com certiicado de análise e incerteza associada. IAL - 395 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução de boridreto de sódio a 0,5% m/v em NaOH a 0,5% m/v – Pese 0,5 g de NaHB4 e dissolva em 100 mL de solução a 0,5% de NaOH. Solução-padrão estoque intermediária de arsênio 10 mg/L – Pipete 1 mL da solução-padrão estoque (1000 mg/L) em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução de ácido nítrico a 2%. Solução-padrão intermediária de arsênio 50 μg/L – Pipete 0,5 mL da solução-padrão estoque intermediária de arsênio 10 mg/L em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Prepare no dia do ensaio. Notas Conserve todas as soluções-padrão estoque em frascos de polietileno. Utilize água destilada e deionizada para preparar todos os reagentes. Procedimento Otimize os parâmetros instrumentais segundo o manual de instruções do fabricante. Colete as amostras de água em frasco de polietileno contendo ácido nítrico, de forma que a concentração inal do ácido seja 0,2% e estoque sob refrigeração até a análise. Se a amostra estiver límpida, faça a pré-redução e a determinação. Se amostra contiver particulados ou matéria orgânica é necessário que ela seja previamente digerida antes da pré-redução. Curva-padrão – Prepare as soluções-padrão de trabalho a partir da solução-padrão intermediária de 50 μg/L com 5 pontos, compreendendo a faixa linear de trabalho para o elemento. É recomendável que um dos pontos da curva-padrão seja o limite máximo estabelecido pela legislação. Faça o branco da curva-padrão. Em seguida, proceda à pré-redução. Pré-redução das soluções-padrão de trabalho – Aos balões contendo os padrões, adicione alíquotas de HCl, da solução de KI e da solução de ácido ascórbico, de tal maneira que as concentrações desses reagentes na solução inal sejam: 10%, 0,5% e 0,5%, respectivamente. Aguarde uma hora, complete o volume dos balões com água destilada e deionizada e efetue a determinação. Prepare as soluções-padrão no dia do ensaio. Digestão da amostra – Pipete uma alíquota de 25 mL da amostra previamente acidiicada (pH<2) com HNO3 em béquer de 150 mL, adicione 8 mL de K2S2O8 e aqueça a 95°C, em banho-maria, até que o volume seja reduzido a aproximadamente 10 mL. Adicione 12,5 mL de HCl, tampe o béquer com vidro de relógio e continue o aquecimento a 95°C por cerca de uma hora. Descubra o béquer e faça a redução do volume até aproximadamente 10 mL. Transira para um balão volumétrico de 25 mL com água destilada e deionizada e proceda à pré-redução. 396 - IAL Capítulo VIII - Águas Pré-redução da amostra – Em balão volumétrico, pipete um volume adequado da amostra original ou a amostra digerida, conforme o caso, de tal maneira que a leitura esteja na faixa linear da curva-padrão e execute o mesmo procedimento da pré-redução das soluções-padrão de trabalho. Determinação – Depois de determinar a curva-padrão pela leitura das soluções-padrão previamente preparadas, faça a leitura das amostras. Analise um ponto intermediário da curvapadrão após a leitura de dez amostras para veriicar se o equipamento está mantendo a calibração. Se a leitura tiver uma variação maior que a estabelecida pelo laboratório, faça a recalibração. Nota: caso a leitura da amostra ique fora da faixa linear da curva-padrão, não dilua a amostra. Tome uma alíquota menor e reinicie a análise a partir da digestão ou da pré-redução, de acordo com o tipo de amostra. Cálculo L = leitura no equipamento, em μg/L v1 = volume do balão utilizado na pré-redução, em mL v2 = volume de amostra utilizada na pré-redução, em mL Referência bibliográfica NYGAARD, D. D.; LOWRY, J.H. Sample digestion procedures for simultaneous determination of arsenic, antimony, and selenium by Inductively Coupled Argon Plasma Emission Spectrometry with Hydride Generation. Anal. Chem. v. 54, p. 803-807, 1982. 209/IV Determinação de metais totais por espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado Este método é aplicável à determinação de metais totais (prata, alumínio, bário, cálcio, cobre, cromo, ferro, potássio, magnésio, manganês, sódio, fósforo e zinco) em água para consumo humano. Os metais são determinados usando a técnica de espectrometria de emissão atômica por plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP OES). IAL - 397 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Espectrômetro de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP OES), balões volumétricos, pipetadores automáticos com volumes ajustáveis, pipetas volumétricas, béquer, frascos de polietileno. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Soluções-padrão estoque monoelementares de 1000 mg/L de: alumínio, prata, bário, cromo, cobre e manganês para análise espectrométrica, com certiicado de análise e incerteza associada. Soluções-padrão estoque monoelementares de 10000 mg/L de: cálcio, ferro, fósforo, magnésio, potássio, sódio e zinco para análise espectrométrica, com certiicado de análise e incerteza associada. Nota: a solução-padrão de prata deve ser preparada separadamente da solução-padrão multielementar, pois este metal forma precipitado com haletos. Recomenda-se que as soluções para a construção da curva-padrão da prata sejam preparadas no dia do ensaio. Procedimento Otimize os parâmetros instrumentais segundo o manual de instruções do fabricante. Curva-padrão – Prepare as soluções-padrão multi-elementares de trabalho para a construção da curva-padrão com seis pontos, incluindo o branco, a partir de uma solução-padrão intermediária, levando em consideração a sensibilidade do equipamento e a faixa linear de trabalho para cada elemento. As soluções são preparadas em ácido nítrico a 0,2% v/v e conservadas em frascos de polietileno. É recomendável que o ponto intermediário da curva-padrão compreenda o limite estabelecido pela legislação, para cada elemento. Determinação – Zere o equipamento com solução de ácido nítrico a 0,2% v/v. Estabeleça as curvas-padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão não linear. Veriique a calibração após analisar um número de amostras, utilizando uma das soluções-padrão da curva. Se a leitura apresentar uma variação maior que a estabelecida pelo laboratório, deve-se recalibrar. Se necessário, dilua a amostra para que a leitura ique inserida na faixa linear da curva-padrão. A diluição também deve ser feita com ácido nítrico a 0,2% v/v. 398 - IAL Capítulo VIII - Águas Cálculo Como o metal é determinado diretamente na amostra de água, o valor lido no equipamento é o próprio valor da concentração, a não ser que alguma diluição ou pré-concentração tenha sido necessária. Nesse caso, deve-se dividir ou multiplicar o valor da leitura obtida pelo fator de diluição ou da pré-concentração. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: A.P.H.A., 1995. chapter 3, p. 5, 34-39. 210/IV Determinação de metais totais por espectrometria de absorção atômica com chama O método é aplicável à determinação de bário, cálcio, cádmio, chumbo, cromo, cobre, ferro, magnésio, manganês, sódio, potássio e zinco em águas, com exceção de água de eluentes e água do mar. Íons de metais em água podem ser determinados diretamente por espectrometria de absorção atômica com chama, dependendo da concentração do elemento na amostra. Para a determinação de alguns elementos é necessária a pré-concentração da amostra. Material Espectrômetro de absorção atômica com chama equipado com corretor de background e lâmpada de catodo oco do elemento a ser determinado, chapa aquecedora, balões volumétricos, pipetador automático com volume ajustável e béqueres. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Soluções-padrão estoque de 1000 mg/L dos seguintes elementos: bário, cálcio, cádmio, chumbo, cromo, cobre, ferro, magnésio, manganês, sódio, potássio e zinco para uso em absorção atômica, com certiicado de análise e incerteza associada. Procedimento Opere o equipamento de acordo com o manual de instruções do fabricante. Ajuste o queimador, a chama e a nebulização para obtenção de máxima absorbância, utilizando IAL - 399 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital uma solução-padrão da curva. Para a determinação de elementos tais como: bário, cádmio, chumbo, cromo e manganês, devido à baixa sensibilidade da técnica, é necessário pré-concentrar a amostra. Os outros elementos também podem ser lidos nessa solução da amostra pré-concentrada. As amostras de água que apresentam resíduo devem ser digeridas conforme o procedimento da digestão/pré-concentração. Os elementos: cobre, ferro e zinco podem ser lidos diretamente na solução original da amostra ou, então, na solução da amostra pré-concentrada. Digestão/pré-concentração da amostra – Colete a amostra conforme procedimento recomendado no cap. III e transira 250 mL da amostra homogeneizada para um béquer ou outro volume dependendo da concentração esperada do analito e do limite de detecção do método. Adicione 5 mL de ácido nítrico. Leve à ebulição lenta e evapore sobre chapa aquecedora até o volume aproximado de 10 mL ou antes que a precipitação ocorra. Adicione 2 mL de ácido nítrico e cubra com vidro de relógio para reluxar sobre as paredes do béquer. Continue aquecendo até que a solução ique clara e límpida. Se necessário, repita a adição de ácido nítrico. Reduza o volume ao mínimo, sem deixar secar a amostra durante o tratamento. Transira, quantitativamente, para um balão volumétrico de 25 mL com água destilada e deionizada. Faça a determinação dos metais nessa solução. Prepare a amostra em triplicata e o branco dos reagentes, submetido às mesmas condições de análise. Para a determinação de íons sódio e potássio, adicione um outro metal alcalino para evitar a interferência de ionização na chama. No caso da determinação de íons de potássio, adicione solução de cloreto de sódio à amostra, ao branco e às soluções-padrão de tal forma que a concentração inal seja 0,1% em íon sódio. Na determinação de íons sódio, adicione solução de cloreto de potássio para que a concentração inal seja 0,1% em íon potássio. As soluções de cloretos de sódio e de potássio podem ser substituídas por solução de césio de tal forma que a concentração inal em césio seja 0,1%. Para a determinação de íons cálcio e magnésio, adicione à amostra, ao branco e às soluções-padrão uma solução de íons lantânio, de tal forma que a concentração inal seja 1% em lantânio. Curva-padrão – Prepare as soluções-padrão da curva a partir da solução-padrão estoque, levando em consideração a sensibilidade do equipamento e a faixa linear de trabalho para cada elemento. As soluções-padrão de trabalho devem ser preparadas em ácido nítrico a 0,2% e conservadas em frascos de polietileno. Zere o equipamento com o branco e faça a leitura das absorbâncias das soluções-padrão. Estabeleça as curvas-padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão linear. Em seguida, faça a leitura das amostras. Se necessário, dilua a solução da amostra 400 - IAL Capítulo VIII - Águas para que a leitura da absorbância ique inserida na faixa linear da curva-padrão. Cálculo A partir da curva-padrão, obtenha a absortividade (coeiciente angular da curva absorbância versus concentração) para cada elemento. Aa = absorbância da amostra Ab = absorbância do branco da amostra A = absortividade, obtida a partir da curva-padrão v = volume do balão no qual a amostra foi transferida após dissolução, em mL d = fator de diluição da amostra, quando necessária v1 = volume da amostra original, em mL m = massa da amostra original, em g Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods Association Of Official Analytical Chemists. Arlington: AOAC, (method 973.53), 16th ed., chapter 11, 1995 p. 19. PERKIN ELMER. Analytical methods for atomic absorption spectroscopy. Norwalk, U.S.A, 1996. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS, ASSOCIATION WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: APHA, 1995, chapter 3, p. 3-9, 13-15. 211/IV Determinação de mercúrio total por espectrometria de absorção atômica com gerador de vapor frio Este método é aplicável à determinação de mercúrio total em água. O mercúrio orgânico é oxidado a mercúrio inorgânico com a mistura de KMnO4 /K2S2O8 com aquecimento e reduzido ao estado elementar com cloreto estanoso. O mercúrio é determinado por espectrometria de absorção atômica com gerador de vapor frio, utilizandose sistema de injeção em luxo e amalgamador. IAL - 401 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Espectrômetro de absorção atômica acoplado ao gerador de vapor frio com sistema de injeção em luxo e amalgamador, chapa aquecedora, lâmpada de catodo oco ou de descarga sem eletrodo de mercúrio, balões volumétricos, pipetadores automáticos com volumes ajustáveis, pipetas volumétricas e béqueres. Reagentes Ácido nítrico isento de mercúrio Ácido sulfúrico isento de mercúrio Ácido clorídrico isento de mercúrio Ácido clorídrico 5% v/v Permanganato de potássio isento de mercúrio Solução-padrão estoque de mercúrio 1000 mg/L com certiicado de análise e incerteza associada. Solução-padrão estoque intermediária 10 mg/L de mercúrio – Pipete 1 mL da soluçãopadrão estoque 1000 mg/L em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução contendo os ácidos ácido sulfúrico a 2% e nítrico a 2%. Solução-padrão intermediária de trabalho de mercúrio 50 μg/L – Pipete 0,5 mL da solução-padrão intermediária (10 mg/L) em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico e nítrico a 2%. Prepare no dia do ensaio. Solução de cloreto estanoso a 5% em HCl 5% – Pese 5 g de SnCl2 em béquer, adicione 5 mL de HCl e aqueça para dissolver o cloreto estanoso. Adicione água destilada e deionizada até completar 100 mL, com agitação constante. Solução de permanganato de potássio a 5% m/v – Pese 5 g de KMnO4 em béquer, dissolva em 100 mL de água destilada e deionizada. Guarde em frasco protegido da luz. Solução de persulfato de potássio a 5% m/v – Pese 5 g de K2S2O8 em béquer e dissolva em 100 mL de água destilada e deionizada. Solução de cloridrato de hidroxilamina a 5% m/v – Pese 5 g de NH2OHCl e dissolva em 100 mL de água destilada e deionizada. Nota: Armazene todas as soluções-padrão estoque em frascos de polietileno. 402 - IAL Capítulo VIII - Águas Procedimento Os parâmetros instrumentais devem ser otimizados segundo o manual de instruções do fabricante. As amostras de água devem ser coletadas em frasco de polietileno contendo ácido nítrico e cloreto de sódio, de forma que a concentração inal, tanto de NaCl quanto de HNO3, sejam 2% e estocadas sob refrigeração até a análise. Se a amostra apresentar particulados ou matéria orgânica é necessário que seja digerida. Digestão da amostra – Pipete uma alíquota de 25 mL da amostra em béquer de 150 mL. Lentamente, adicione 1,3 mL de H2SO4 e 0,6 mL de HNO3 e misture. Adicione 3,5 mL de KMnO4 a 5% e aguarde por cerca de 15 minutos. Adicione 2 mL de K2S2O8 e aqueça a 95°C em banho-maria por 2 horas e resfrie. Se necessário, elimine o excesso de permanganato com algumas gotas de solução de hidroxilamina a 5%. Transira para um balão volumétrico de 25 mL com água destilada e deionizada. Se a amostra estiver límpida, faça a leitura diretamente sem digestão prévia. Curva-padrão A partir da solução-padrão intermediária de trabalho de mercúrio (50 μg/L), prepare 6 concentrações para a curva compreendendo a faixa linear de trabalho, de acordo com a sensibilidade do equipamento. As soluções-padrão são preparadas em meio ácido sulfúrico a 2% e nítrico a 2%. Estas soluções-padrão devem ser preparadas no dia do ensaio. Nota: é recomendável que um dos pontos da curva-padrão seja o limite estabelecido pela legislação. Determinação – Zere o equipamento com solução de H2SO4/HNO3 a 2% e faça a leitura das soluções-padrão. Depois de completar a calibração, as amostras podem ser analisadas. Se necessário, dilua as amostras para que as leituras iquem compreendidas na faixa linear da curva-padrão. Veriique a calibração, analisando um ponto intermediário da curva-padrão. Se a leitura tiver uma variação maior que a estabelecida pelo laboratório, recalibre. IAL - 403 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo Como o metal é determinado diretamente na água coletada, o valor lido no equipamento é o próprio valor da concentração, a não ser que alguma diluição tenha sido necessária. Nesse caso, deve-se multiplicar o valor da leitura obtida pela diluição efetuada. Referência bibliográfica AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. Washington, DC: APHA, 1995, chapter 3, p. 18-19. 212/IV Determinação de metais totais por espectrometria de absorção atômica com forno de grafite Este método é aplicável à determinação de metais totais (antimônio, cádmio, chumbo, cromo e alumínio), em níveis de traços (μg/L) em águas para consumo. Os metais são determinados usando a técnica de espectrometria de absorção atômica com forno de graite (ETAAS). Material Espectrômetro de absorção atômica com forno de graite e corretor de fundo (Background), lâmpadas de catodo oco ou de descarga sem eletrodo do elemento a ser analisado, balões volumétricos, pipetadores automáticos com volumes ajustáveis, pipetas volumétricas, béqueres e balões volumétricos de polimetilpenteno ou polipropileno para a determinação de íons alumínio. Reagentes Ácido nítrico para a análise de traços de metais Soluções-padrão estoque de 1000 mg/L de: alumínio, antimônio, cádmio, chumbo e cromo para uso em absorção atômica com certiicado de análise e incerteza associada. Soluções de modificadores químicos: a) Mistura de dihidrogenofosfato de amônio a 0,5% m/v e nitrato de magnésio a 0,03% m/v, para as determinações de chumbo e cádmio – Pese cerca de 0,5 g de NH4H2PO4 e 404 - IAL 0,052 g de Mg(NO3)2.6H2O em béqueres. Dissolva os sais com água destilada e deionizada e transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. b) Solução de nitrato de magnésio a 0,15% m/v, para as determinações de antimônio, alumínio e cromo – Pese cerca de 0,259 g de Mg(NO3)2.6H2O em um béquer. Dissolva com água destilada e deionizada e transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Procedimento - Os parâmetros instrumentais devem ser otimizados segundo o manual de instruções do fabricante. Zere o equipamento com solução de ácido nítrico 0,2% v/v. Estabeleça a curva-padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão linear. Recalibre após o número de leituras deinido pelo laboratório. Caso necessário, dilua a amostra para que a leitura ique inserida na faixa linear da curva-padrão. Curva-padrão – Prepare as soluções-padrão de trabalho para a curva com seis pontos a partir da uma solução-padrão intermediária, levando em consideração a sensibilidade do equipamento e a faixa linear de trabalho para o elemento. As soluções são preparadas em ácido nítrico a 0,2% v/v, no dia do ensaio. Nota: é recomendável que a curva-padrão compreenda o limite estabelecido pela legislação Cálculo Como o metal é determinado diretamente na água coletada, o valor lido no equipamento é o próprio valor da concentração, a não ser que alguma diluição tenha sido necessária. Neste caso, deve-se multiplicar o valor da leitura obtida pelo fator da diluição. Referências bibliográficas AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th ed. Washington, DC: APHA, 1995, chapter 3, p. 22-27. PERKIN ELMER. The THGA Graphite Furnace: Techniques and Recommended Conditions for Atomic Spectroscopy. Norwalk, U.S.A., 1991. 213/IV Identificação de cianeto – Prova de Pertusi-Gastaldi IAL - 405 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Pipetas graduadas de 1 mL e placa de toque. Reagentes Solução de acetato de cobre 30% m/v Solução saturada de acetato de benzidina em ácido acético a 10% m/v Procedimento – Em uma placa de toque, coloque uma gota de acetato de cobre a 30% m/v, cinco gotas da solução saturada de acetato de benzidina em ácido acético a 10% e 0,5 mL da amostra. Em presença de íons cianeto, aparecerá uma coloração azul característica. Nota: os oxidantes e os ânions que complexam com o cobre (I) também reagem nesta prova. São interferentes: iodetos, sulfetos, etc Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3.ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 327-328. 214/IV Determinação de sulfatos Material Béquer de 400 mL, balões volumétricos de 500 e 1000 mL, pipetas volujmétricas de 1, 2 e 5 mL, proveta de 10 mL, iltro, iltro de papel Whatman nº 40, cápsula de porcelana de 250 mL, bico de Bünsen, banho-maria e mula. Reagentes Solução de ácido clorídrico (1+1) Indicador metilorange Solução de cloreto de bário – Dissolva 100 g de cloreto de bário em água bidestilada e deionizada. Complete o volume até 1000 mL com água bidestilada e deionizada. Filtre a solução antes de usar. Nota: 1 mL desta solução precipita aproximadamente 40 mg de íon sulfato. 406 - IAL Solução de nitrato de prata – Pese 8,5 g de nitrato de prata, transira para um balão de 500 mL, adicione 0,5 mL de ácido nítrico e complete o volume com água bidestilada e deionizada. Procedimento Preparação da amostra – Se a amostra contiver sílica em concentração superior a 25 mg/L, remova-a evaporando a amostra em banho-maria, até próximo da secura. Junte 1 mL de solução de ácido clorídrico (1+1), gire a cápsula para que o ácido entre em contato com o resíduo contido nos lados internos da cápsula e continue a evaporação até a secura. Adicione 20 mL de água bidestilada e deionizada e reserve. Se a amostra contiver matéria orgânica, evapore e leve diretamente ao bico de Bünsen, junte 2 mL de água bidestilada e deionizada e 1 mL de solução de ácido clorídrico (1+1). Evapore novamente até secura, em banho-maria, junte 2 mL de água quente e iltre. Lave a sílica insolubilizada com várias porções de água bidestilada e deionizada quente e reserve. Se a amostra for turva, clariique-a por decantação ou iltração. Em se tratando de águas contendo íons sulfato em concentração menor que 200 mg/L, o volume da amostra usado para esta determinação não deve exceder 150 mL. Determinação de íons sulfato – Transira, 200 mL da amostra para um béquer de 400 mL. Evapore até aproximadamente 20 mL. Ajuste o pH para 4,4, com adição de ácido clorídrico (1+1), usando metilorange como indicador. Adicione mais 1 mL de solução ácido clorídrico (1+1). Aqueça a solução até a ebulição, agitando suavemente. Adicione solução de cloreto de bário, quente, até que a precipitação esteja completa. Junte mais 2 mL da solução de cloreto de bário. Deixe o precipitado digerir em banho-maria a (80–90)°C, preferivelmente durante a noite, porém nunca menos que 2 horas. Junte pedaços de papel de iltro Whatman nº 40 ao precipitado contido no béquer. Filtre em papel Whatman nº 40, lave o precipitado no iltro com porções de água bidestilada e deionizada quente até que as águas de lavagem estejam livres de íon cloreto. Faça o teste com solução de nitrato de prata. Seque o papel de iltro em estufa 105°C e transira para uma cápsula de porcelana de 250 mL tarada, previamente aquecida em mula a 550°C, durante uma hora. Esfrie em dessecador e pese. Cálculo N x 5 x 1000 = mg de sulfato de bário por 1000 mL da amostra N = massa, em gramas, do resíduo. IAL - 407 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3.ed. São Paulo: IMESP, 1985, p.329-330. Colaboradores Maria Anita Scorsafava; Jaim Lichtig; Berenice Mandel Brígido; Cristina Eico Yokosawa; Francisco Lopes Dias Jr.; Isaura Akemi Okada; Joel Batista da Silva; Liliana Brancacio Bacetti; Maria Cristina Duran; Maria de Lourdes Burini Arine; Maria do Rosário Vigeta Lopes; Roberto Carlos Fernandes Barsotti; Rute Dal Col; Tereza Atsuko Kussumi; Valéria Pereira da Silva Freitas; Paulo Tiglea; Alice Momoyo Ata Sakuma; Carmen Silvia Kira; Franca Durante de Maio; Heloísa Helena Barretto de Toledo; Janete Alaburda; Kátia Regina Marton de Freitas Martins; Linda Nishihara; Maria de Fátima Henriques Carvalho; Maria de Lourdes Paixão da Silva; Marina Miyuki Okada; Rosângela Aguilar da Silva; Sônia Otero Bio Rocha; Teresa Marilene Bronharo e Vera Regina Rossi Lemes 408 - IAL Capítulo VIII - Águas CAPÍTULO IX BEBIDAS ALCOÓLICAS IAL - 409 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 410 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas IX BEBIDAS ALCOÓLICAS stão incluídos neste capítulo os métodos de análise para: aguardentes de cana, de melaço, de frutas, arac, bagaceira, conhaque, pisco, rum, tequila, tiquira e uísques. As determinações efetuadas nas bebidas alcoólicas destilo-retiicadas são as mesmas que se fazem nas alcoólicas fermento-destiladas. As determinações usuais efetuadas nestes produtos são, entre outras, densidade, grau alcoólico, extrato seco (ou resíduo seco), glicídios totais, cinzas, acidez total, acidez volátil, metanol, componentes secundários: ésteres, aldeídos, furfural e álcoois superiores, além de carbamato de etila ou uretana, cobre e outros contaminantes inorgânicos (cap. XXIII). E 215/IV Bebidas fermento-destiladas – Densidade relativa a 20°C/20ºC com picnômetro A densidade em relação à água pura é uma ferramenta utilizada para determinar a % de álcool em soluções hidroalcoólicas, a uma dada temperatura. Pode ser medida por vários aparelhos, sendo os seguintes os mais usados: picnômetro, densímetro de leitura direta e hidrômetro calibrado. O método com picnômetro consiste na medida da massa de um volume conhecido de líquido num recipiente denominado picnômetro. O mesmo é calibrado em relação à massa da água pura a 20 ºC. Da relação destas massas e volumes resulta a densidade relativa à água. IAL - 411 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, termômetro, dessecador e picnômetros de 25, 50 ou 100 mL Reagentes Álcool Éter Procedimento – Lave o picnômetro, enxágüe com álcool e, posteriormente, com éter. Deixe secar naturalmente e pese. Encha o picnômetro com água a 20°C e pese. Lave e seque o picnômetro e proceda da mesma forma com a amostra. Cálculo m am = massa do picnômetro com a amostra m p = massa do picnômetro vazio m H O = massa do picnômetro com a água 2 Nota: a densidade relativa a 20°C é expressa no mínimo com quatro casas decimais. Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 945.06) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 2. 216/IV Bebidas fermento-destiladas – Densidade relativa a 20°C/20°C com densímetro de leitura direta A densidade a 20°C é determinada pela medida da freqüência da oscilação do tubo em U do densímetro preenchido com a amostra, comparada com as freqüências de oscilação quando preenchido com água pura ou com padrões determinados. Material Densímetro automático digital de leitura direta com injetor automático, opcional, e seringas de 10 a 15 mL. 412 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Procedimento – Proceda a calibração do equipamento conforme as instruções do fabricante, utilizando água como referência, ixando a temperatura a (20 + 0,01)°C. Certiique-se que o tubo em U esteja completamente cheio com água, sem a presença de bolhas. Retire a água, seque o tubo e injete a amostra livre de qualquer partícula no densímetro (iltre, se necessário). Veriique se não há formação de bolhas e faça a leitura direta da densidade. Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 982.10) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 4-5. 217/IV Bebidas fermento-destiladas – Álcool em volume a 20°C ou grau alcoólico real Este método é aplicável para a determinação da porcentagem de álcool em volume a 20°C em bebidas alcoólicas. A graduação alcoólica (% em volume) é obtida pela tabela de conversão da densidade relativa a 20°C/20°C determinada no destilado alcoólico da amostra. Algumas amostras não requerem destilação, como, por exemplo, bebidas destiladas, destilo-retiicadas e misturas água-álcool. Material Conjunto de destilação (ou equipamento destilador por arraste de vapor), chapa de aquecimento, termômetro, balão volumétrico de 100 ou 250 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, condensador de serpentina ou de Liebig (maior ou igual a 40 cm de comprimento), conexão com bola de segurança e junta esmerilhada, funil e pérolas de vidro. Procedimento – Ajuste a temperatura da amostra a 20°C e meça 100 ou 250 mL em um balão volumétrico. Transira a amostra para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, lave o balão volumétrico com água, aproximadamente 4 vezes e junte ao conteúdo do frasco Erlenmeyer. Conecte o frasco de destilação ao condensador, intercalando uma conexão intermediária com bola de segurança, aqueça e destile. Alternativamente, transira a amostra para o conjunto de destilação e proceda conforme as instruções de uso do equipamento. Amostras que contenham açúcar, como aguardente de cana adoçada e aguardente composta, precisam ser destiladas. Bebidas fermento-destiladas e retiicadas como aguardentes, uísques, vodca e gim não têm necessidade de serem destiladas para a determinação de graduação alcoólica. Recolha o destilado no balão volumétrico de 100 ou 250 mL, anteriormente usado, já contendo 10 mL de água e imerso em banho de água e gelo. Destile cerca de ¾ do volume IAL - 413 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital inicial. Adicione água até quase completar o volume. Ajuste a temperatura a 20°C, mergulhando o balão volumétrico em banho de água e gelo. Complete o volume com água a 20°C e agite. Determine a densidade relativa do destilado a 20°C, com o uso de picnômetro ou densímetro digital automático ou outro aparelho como hidrômetro ou densímetro calibrado. Obtenha a graduação alcoólica do destilado alcoólico a 20°C utilizando a Tabela 1, referente à conversão de densidade em porcentagem de álcool em volume. O resultado será expresso em % de álcool em volume. TABELA 1 – Porcentagem de álcool em volume a 20°C (% v/v) correspondente à densidade relativa D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 1,00000 0,0 0,99632 2,5 0,99281 5,0 0,98956 7,5 0,99985 0,1 0,99618 2,6 0,99268 5,1 0,98944 7,6 0,99970 0,2 0,99603 2,7 0,99255 5,2 0,98931 7,7 0,99955 0,3 0,99589 2,8 0,99241 5,3 0,98919 7,8 0,99939 0,4 0,99574 2,9 0,99228 5,4 0,98906 7,9 0,99924 0,5 0,99560 3,0 0,99215 5,5 0,98893 8,0 0,99910 0,6 0,99546 3,1 0,99201 5,6 0,98881 8,1 0,99895 0,7 0,99531 3,2 0,99188 5,7 0,98869 8,2 0,99880 0,8 0,99517 3,3 0,99174 5,8 0,98857 8,3 0,99866 0,9 0,99503 3,4 0,99161 5,9 0,98845 8,4 0,99851 1,0 0,99489 3,5 0,99148 6,0 0,98833 8,5 0,99836 1,1 0,99475 3,6 0,99135 6,1 0,98820 8,6 0,99821 1,2 0,99461 3,7 0,99122 6,2 0,98807 8,7 0,99807 1,3 0,99447 3,8 0,99109 6,3 0,98794 8,8 0,99792 1,4 0,99433 3,9 0,99096 6,4 0,98782 8,9 0,99777 1,5 0,99419 4,0 0,99083 6,5 0,98770 9,0 0,99763 1,6 0,99405 4,1 0,99070 6,6 0,98758 9,1 0,99748 1,7 0,99391 4,2 0,99057 6,7 0,98746 9,2 0,99733 1,8 0,99377 4,3 0,99045 6,8 0,98734 9,3 0,99719 1,9 0,99363 4,4 0,99032 6,9 0,98722 9,4 0,99704 2,0 0,99349 4,5 0,99020 7,0 0,98710 9,5 0,99689 2,1 0,99336 4,6 0,99007 7,1 0,98698 9,6 0,99675 2,2 0,99322 4,7 0,98994 7,2 0,98686 9,7 0,99661 2,3 0,99308 4,8 0,98981 7,3 0,98674 9,8 0,99646 2,4 0,99295 4,9 0,98969 7,4 0,98662 9,9 414 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 0,98650 10,0 0,98239 13,5 0,97851 17,0 0,97478 20,5 0,98637 10,1 0,98227 13,6 0,97840 17,1 0,97467 20,6 0,98626 10,2 0,98216 13,7 0,97829 17,2 0,97456 20,7 0,98614 10,3 0,98204 13,8 0,97818 17,3 0,97445 20,8 0,98602 10,4 0,98193 13,9 0,97807 17,4 0,97435 20,9 0,98590 10,5 0,98182 14,0 0,97797 17,5 0,97424 21,0 0,98578 10,6 0,98171 14,1 0,97786 17,6 0,97414 21,1 0,98566 10,7 0,98159 14,2 0,97775 17,7 0,97404 21,2 0,98554 10,8 0,98148 14,3 0,97764 17,8 0,97393 21,3 0,98542 10,9 0,98137 14,4 0,97754 17,9 0,97382 21,4 0,98530 11,0 0,98126 14,5 0,97743 18,0 0,97371 21,5 0,98518 11,1 0,98115 14,6 0,97732 18,1 0,97360 21,6 0,98506 11,2 0,98103 14,7 0,97721 18,2 0,97350 21,7 0,98494 11,3 0,98092 14,8 0,97711 18,3 0,97339 21,8 0,98482 11,4 0,98081 14,9 0,97700 18,4 0,97328 21,9 0,98470 11,5 0,98070 15,0 0,97690 18,5 0,97317 22,0 0,98459 11,6 0,98058 15,1 0,97679 18,6 0,97306 22,1 0,98447 11,7 0,98047 15,2 0,97668 18,7 0,97295 22,2 0,98435 11,8 0,98036 15,3 0,97657 18,8 0,97285 22,3 0,98424 11,9 0,98025 15,4 0,97646 18,9 0,97274 22,4 0,98412 12,0 0,98014 15,5 0,97636 19,0 0,97263 22,5 0,98400 12,1 0,98003 15,6 0,97626 19,1 0,97252 22,6 0,98388 12,2 0,97992 15,7 0,97616 19,2 0,97241 22,7 0,98377 12,3 0,97981 15,8 0,97605 19,3 0,97230 22,8 0,98365 12,4 0,97970 15,9 0,97595 19,4 0,97219 22,9 0,98354 12,5 0,97959 16,0 0,97584 19,5 0,97208 23,0 0,98342 12,6 0,97948 16,1 0,97574 19,6 0,97197 23,1 0,98330 12,7 0,97937 16,2 0,97563 19,7 0,97185 23,2 0,98318 12,8 0,97926 16,3 0,97553 19,8 0,97174 23,3 0,98307 12,9 0,97915 16,4 0,97542 19,9 0,97163 23,4 0,98296 13,0 0,97905 16,5 0,97531 20,0 0,97152 23,5 0,98285 13,1 0,97894 16,6 0,97521 20,1 0,97141 23,6 0,98274 13,2 0,97883 16,7 0,97511 20,2 0,97130 23,7 0,98263 13,3 0,97872 16,8 0,97500 20,3 0,97118 23,8 0,98251 13,4 0,97862 16,9 0,97489 20,4 0,97107 23,9 IAL - 415 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 0,97096 24,0 0,96695 27,5 0,96270 31,0 0,95802 34,5 0,97084 24,1 0,96683 27,6 0,96257 31,1 0,95788 34,6 0,97073 24,2 0,96671 27,7 0,96244 31,2 0,95774 34,7 0,97062 24,3 0,96660 27,8 0,96231 31,3 0,95759 34,8 0,97051 24,4 0,96648 27,9 0,96218 31,4 0,95745 34,9 0,97040 24,5 0,96636 28,0 0,96206 31,5 0,95731 35,0 0,97028 24,6 0,96624 28,1 0,96193 31,6 0,95717 35,1 0,97017 24,7 0,96612 28,2 0,96180 31,7 0,95702 35,2 0,97006 24,8 0,96601 28,3 0,96167 31,8 0,95688 35,3 0,96994 24,9 0,96588 28,4 0,96154 31,9 0,95673 35,4 0,96984 25,0 0,96576 28,5 0,96141 32,0 0,95659 35,5 0,96974 25,1 0,96565 28,6 0,96128 32,1 0,95645 35,6 0,96961 25,2 0,96553 28,7 0,96115 32,2 0,95630 35,7 0,96950 25,3 0,96541 28,8 0,96101 32,3 0,95616 35,8 0,96938 25,4 0,96529 28,9 0,96088 32,4 0,95601 35,9 0,96927 25,5 0,96517 29,0 0,96075 32,5 0,95587 36,0 0,96916 25,6 0,96505 29,1 0,96062 32,6 0,95572 36,1 0,96904 25,7 0,96493 29,2 0,96049 32,7 0,95558 36,2 0,96893 25,8 0,96480 29,3 0,96035 32,8 0,95543 36,3 0,96881 25,9 0,96468 29,4 0,96022 32,9 0,95528 36,4 0,96870 26,0 0,96456 29,5 0,96009 33,0 0,95513 36,5 0,96858 26,1 0,96444 29,6 0,95995 33,1 0,95499 36,6 0,96847 26,2 0,96432 29,7 0,95982 33,2 0,95484 36,7 0,96835 26,3 0,96419 29,8 0,95968 33,3 0,95469 36,8 0,96824 26,4 0,96407 29,9 0,95955 33,4 0,95455 36,9 0,96812 26,5 0,96395 30,0 0,95941 33,5 0,95440 37,0 0,96800 26,6 0,96383 30,1 0,95927 33,6 0,95425 37,1 0,96789 26,7 0,96370 30,2 0,95914 33,7 0,95410 37,2 0,96777 26,8 0,96357 30,3 0,95900 33,8 0,95394 37,3 0,96766 26,9 0,96345 30,4 0,95887 33,9 0,95379 37,4 0,96754 27,0 0,96333 30,5 0,95873 34,0 0,95364 37,5 0,96742 27,1 0,96320 30,6 0,95859 34,1 0,95349 37,6 0,96730 27,2 0,96308 30,7 0,95845 34,2 0,95334 37,7 0,96719 27,3 0,96295 30,8 0,95830 34,3 0,95318 37,8 0,96707 27,4 0,96283 30,9 0,95816 34,4 0,95303 37,9 416 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 0,95288 38,0 0,94728 41,5 0,94124 45,0 0,93472 48,5 0,95272 38,1 0,94711 41,6 0,94106 45,1 0,93453 48,6 0,95257 38,2 0,94695 41,7 0,94088 45,2 0,93434 48,7 0,95241 38,3 0,94678 41,8 0,94070 45,3 0,93414 48,8 0,95226 38,4 0,94662 41,9 0,94052 45,4 0,93395 48,9 0,95210 38,5 0,94645 42,0 0,94034 45,5 0,93376 49,0 0,95194 38,6 0,94628 42,1 0,94015 45,6 0,93357 49,1 0,95179 38,7 0,94611 42,2 0,93997 45,7 0,93337 49,2 0,95163 38,8 0,94594 42,3 0,93979 45,8 0,93318 49,3 0,95148 38,9 0,94577 42,4 0,93961 45,9 0,93298 49,4 0,95132 39,0 0,94560 42,5 0,93943 46,0 0,93279 49,5 0,95116 39,1 0,94543 42,6 0,93924 46,1 0,93260 49,6 0,95100 39,2 0,94526 42,7 0,93906 46,2 0,93240 49,7 0,95084 39,3 0,94509 42,8 0,93887 46,3 0,93221 49,8 0,95068 39,4 0,94492 42,9 0,93869 46,4 0,93201 49,9 0,95052 39,5 0,94475 43,0 0,93850 46,5 0,93182 50,0 0,95037 39,6 0,94458 43,1 0,93831 46,6 0,93162 50,1 0,95021 39,7 0,94440 43,2 0,93813 46,7 0,93142 50,2 0,95005 39,8 0,94423 43,3 0,93794 46,8 0,93122 50,3 0,94989 39,9 0,94405 43,4 0,93776 46,9 0,93102 50,4 0,94973 40,0 0,94388 43,5 0,93757 47,0 0,93082 50,5 0,94957 40,1 0,94371 43,6 0,93738 47,1 0,93063 50,6 0,94941 40,2 0,94353 43,7 0,93719 47,2 0,93043 50,7 0,94924 40,3 0,94336 43,8 0,93701 47,3 0,93023 50,8 0,94908 40,4 0,94318 43,9 0,93682 47,4 0,93003 50,9 0,94892 40,5 0,94301 44,0 0,93663 47,5 0,92983 51,0 0,94876 40,6 0,94283 44,1 0,93644 47,6 0,92963 51,1 0,94860 40,7 0,94266 44,2 0,93625 47,7 0,92943 51,2 0,94843 40,8 0,94248 44,3 0,93606 47,8 0,92922 51,3 0,94827 40,9 0,94230 44,4 0,93587 47,9 0,92902 51,4 0,94811 41,0 0,94213 44,5 0,93568 48,0 0,92882 51,5 0,94794 41,1 0,94195 44,6 0,93549 48,1 0,92862 51,6 0,94778 41,2 0,94177 44,7 0,93530 48,2 0,92842 51,7 0,94761 41,3 0,94159 44,8 0,93510 48,3 0,92821 51,8 0,94745 41,4 0,94142 44,9 0,93491 48,4 0,92801 51,9 IAL - 417 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 0,92781 52,0 0,92057 55,5 0,91300 59,0 0,90507 62,5 0,92761 52,1 0,92036 55,6 0,91278 59,1 0,90484 62,6 0,92740 52,2 0,92015 55,7 0,91255 59,2 0,90461 62,7 0,92720 52,3 0,91993 55,8 0,91233 59,3 0,90438 62,8 0,92700 52,4 0,91972 55,9 0,91210 59,4 0,90415 62,9 0,92679 52,5 0,91951 56,0 0,91188 59,5 0,90392 63,0 0,92659 52,6 0,91930 56,1 0,91166 59,6 0,90369 63,1 0,92639 52,7 0,91908 56,2 0,91143 59,7 0,90346 63,2 0,92619 52,8 0,91887 56,3 0,91121 59,8 0,90323 63,3 0,92598 52,9 0,91865 56,4 0,91098 59,9 0,90300 63,4 0,92578 53,0 0,91844 56,5 0,91076 60,0 0,90276 63,5 0,92557 53,1 0,91823 56,6 0,91053 60,1 0,90253 63,6 0,92536 53,2 0,91801 56,7 0,91031 60,2 0,90230 63,7 0,92516 53,3 0,91780 56,8 0,91008 60,3 0,90207 63,8 0,92496 53,4 0,91758 56,9 0,90986 60,4 0,90184 63,9 0,92475 53,5 0,91737 57,0 0,90963 60,5 0,90161 64,0 0,92454 53,6 0,91715 57,1 0,90941 60,6 0,90137 64,1 0,92434 53,7 0,91694 57,2 0,90918 60,7 0,90114 64,2 0,92413 53,8 0,91672 57,3 0,90896 60,8 0,90091 64,3 0,92393 53,9 0,91651 57,4 0,90873 60,9 0,90067 64,4 0,92372 54,0 0,91629 57,5 0,90851 61,0 0,90043 64,5 0,92351 54,1 0,91607 57,6 0,90828 61,1 0,90020 64,6 0,92330 54,2 0,91586 57,7 0,90805 61,2 0,89997 64,7 0,92309 54,3 0,91564 57,8 0,90782 61,3 0,89973 64,8 0,92288 54,4 0,91543 57,9 0,90759 61,4 0,89950 64,9 0,92267 54,5 0,91521 58,0 0,90736 61,5 0,89926 65,0 0,92247 54,6 0,91499 58,1 0,90714 61,6 0,89902 65,1 0,92226 54,7 0,91477 58,2 0,90691 61,7 0,89879 65,2 0,92205 54,8 0,91455 58,3 0,90666 61,8 0,89855 65,3 0,92184 54,9 0,91433 58,4 0,90645 61,9 0,89831 65,4 0,92163 55,0 0,91410 58,5 0,90622 62,0 0,89807 65,5 0,92142 55,1 0,91388 58,6 0,90599 62,1 0,89784 65,6 0,92121 55,2 0,91366 58,7 0,90576 62,2 0,89760 65,7 0,92099 55,3 0,91344 58,8 0,90553 62,3 0,89736 65,8 0,92078 55,4 0,91322 58,9 0,90530 62,4 0,89713 65,9 418 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v D 20°C/20°C % v/v 0,89689 66,0 0,89401 67,2 0,89109 68,4 0,88814 69,6 0,89665 66,1 0,89376 67,3 0,89085 68,5 0,88789 69,7 0,89641 66,2 0,89352 67,4 0,89061 68,6 0,88765 69,8 0,89617 66,3 0,89328 67,5 0,89036 68,7 0,88740 69,9 0,89593 66,4 0,89304 67,6 0,89012 68,8 0,88715 70,0 0,89569 66,5 0,89280 67,7 0,88987 68,9 0,87437 75,0 0,89545 66,6 0,89255 67,8 0,88963 69,0 0,86082 80,0 0,89521 66,7 0,89231 67,9 0,88938 69,1 0,84639 85,0 0,89497 66,8 0,89207 68,0 0,88913 69,2 0,83071 90,0 0,89473 66,9 0,89183 68,1 0,88889 69,3 0,81288 95,0 0,89449 67,0 0,89158 68,2 0,88864 69,4 0,79074 100,0 0,89425 67,1 0,89134 68,3 0,88839 69,5 - - Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 942.06) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 2-3. BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. 218/IV Bebidas fermento-destiladas – Extrato seco ou resíduo seco Este método é aplicado à amostras de bebidas alcoólicas e baseia-se na pesagem do resíduo após a evaporação da água e álcool por aquecimento. Material Banho-maria, estufa, cápsula metálica de fundo chato de 25 ou 50 mL ou cápsula de porcelana, dessecador, pipeta volumétrica de 20 ou 25 mL. Procedimento – Pipete 20 ou 25 mL da amostra para uma cápsula, previamente seca em estufa, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Evapore lentamente em banho-maria até a secura. Seque em estufa (100 ± 5)°C por 30 min. Resfrie em dessecador por 30 min e pese. IAL - 419 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo N = massa de resíduo seco em g (massa da cápsula com o extrato menos a tara da cápsula) V = volume da amostra em mL Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.47) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 6. BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. 219IV Bebidas fermento-destiladas – Glicídios totais, em sacarose É aplicado em bebidas alcoólicas destiladas que contenham açúcar adicionado, por exemplo, aguardente de cana adoçada. Material Chapa de aquecimento, banho-maria, balança analítica, balão volumétrico de 100 mL, cápsula de porcelana de 100 ou 200 mL, funil, pipeta volumétrica de 50 mL, balão de fundo chato de 250 mL e bureta de 25 mL. Reagentes Ácido clorídrico Carbonato de sódio anidro Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Transira com o auxílio de uma pipeta, 50 mL da amostra para uma cápsula de porcelana de 200 mL. Evapore em banho-maria até eliminar todo o álcool. Esfrie. Transira para um balão volumétrico de 100 mL, lavando a cápsula com 40 mL de água. Adicione 0,5 mL de HCI. Aqueça em banho-maria por 20 minutos. Esfrie. Neutralize com carbonato de sódio. Complete o volume com água. Nesta solução, determine glicídios totais, conforme a técnica descrita em 040/IV. 420 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. V. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3ª ed. São Paulo. 1985. p. 344. 220/IV Bebidas fermento-destiladas – Componentes secundários O destilado alcoólico pode ser considerado como uma solução de álcool e água, contendo pequenas quantidades de componentes secundários menores que 1% e que variam conforme a composição de cada tipo de bebida alcoólica. Os componentes secundários não-álcool, ou substâncias voláteis não-álcool ou coeiciente de congêneres, constituem a soma de acidez volátil, aldeídos, ésteres, álcoois superiores expressos pela somatória dos mesmos, e furfural; todos expressos em mg/100 mL de álcool anidro. A análise por cromatograia a gás é empregada para a determinação dos congêneres voláteis não-álcool. Métodos alternativos que utilizam técnicas de espectrofotometria e titulação ainda são citados na literatura. 221/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de acidez total Este método baseia-se na titulação de neutralização dos ácidos com solução padronizada de álcali, com o uso de indicador fenolftaleína ou com o pHmetro até o ponto de eqüivalência. A acidez total é expressa em g de ácido acético por 100 mL de amostra. Material pHmetro, agitador magnético, barra magnética, béquer de 250 ou 500 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, pipeta volumétrica de 50 ou 100 mL, bureta de 10 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M (ou 0,05 M) padronizada Solução de fenolftaleína Procedimento – Transira 50 ou 100 mL da amostra, para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione 0,5 mL do indicador fenolftaleína. Titule com solução de hidróxido de sódio até coloração rósea ou transira a amostra para um béquer e titule com solução de hidróxido de sódio até ponto de viragem pH 8,2 - 8,4, utilizando o pHmetro. IAL - 421 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo n = volume gasto na titulação da solução de hidróxido de sódio, em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio PM = peso molecular do ácido acético (60g) V = volume tomado da amostra, em mL Nota: para amostras com baixo valor de acidez (bebidas destilo-retiicadas e álcool etílico) utilize solução de hidróxido de sódio em menor concentração (0,01 M). Referência bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n° 76, de 27 de nov 86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03-12-86. Seção I, p. 18.152-18173. 222/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de acidez fixa A acidez ixa é obtida por evaporação da amostra seguida de uma titulação dos ácidos residuais com álcali. Material Banho-maria, pHmetro, agitador magnético, barra magnética, cápsula de porcelana de 50 ou 100 mL, pipeta volumétrica de 50 ou 100 mL, béquer de 250 ou 500 mL ou frasco Erlenmeyer de 250 ou 500 mL, bureta de 10 mL e pipeta graduada de 1 mL . Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 ou 0,05 M padronizada Solução de fenolftaleína Procedimento – Pipete 50 mL da amostra para a cápsula de porcelana e evapore em banho-maria. Adicione água cuidadosamente pelas paredes da cápsula, lavando o resíduo e continue a evaporação até quase total secura. Transira esse resíduo com 100 mL de água para um frasco Erlenmeyer ou béquer e titule com solução de hidróxido de sódio, como descrito na determinação de acidez total 221/IV. 422 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Cálculo n = volume gasto na titulação da solução de hidróxido de sódio, em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio PM = peso molecular do ácido acético (60 g) V = volume tomado da amostra, em mL Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 346. 223/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de ácidos voláteis por diferença O cálculo da acidez volátil é feito por diferença entre a acidez total e a acidez ixa. O resultado é expresso em g de ácido acético por 100 mL de amostra, em g ou mg de ácido acético por 100 mL de álcool anidro. Cálculos At - Af = ácidos voláteis, em g de ácido acético por 100 mL de amostra At = ácidos totais Af = ácidos ixos Av = ácidos voláteis G = graduação alcoólica Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 349-350. BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria nº 76, de 27 de nov 86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03-12-86. Seção l, p. 18152-18173. IAL - 423 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 224/IV Bebidas fermento-destiladas – Ésteres totais Este método é aplicável em bebidas alcoólicas destiladas. Baseia-se na saponiicação dos ésteres com hidróxido de sódio. Material Chapa elétrica de aquecimento, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, pipeta volumétrica de 100 mL, buretas de 10 ou de 25 mL, condensador de reluxo (de Graham com 60 cm de altura). Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 N Solução de ácido sulfúrico 0,1 N Solução de fenolftaleína Procedimento – Pipete 100 mL do destilado da amostra para um frasco Erlenmeyer de 500 mL e neutralize com solução de hidróxido de sódio usando como indicador a fenolftaleína. Adicione, exatamente, um excesso de 10 mL de solução de hidróxido de sódio. Adapte o frasco a um condensador de reluxo. Deixe em reluxo por 1 hora em banho-maria (ou chapa elétrica) ou substitua o reluxo por vedação do frasco e permaneça em repouso por 12 horas. No caso da coloração rósea desaparecer, esfrie, adicione mais 10 mL de hidróxido de sódio e deixe em reluxo por mais 30 minutos. Resfrie rapidamente e adicione 10 mL ácido sulfúrico ou 20 mL, se houve adição de mais solução de hidróxido de sódio. Titule o excesso de ácido sulfúrico com solução de hidróxido de sódio, até a coloração rósea. Cálculos Os ésteres são expressos em mg de acetato de etila por 100 mL da amostra ou em mg de acetato de etila por 100 mL de álcool anidro. B = volume de solução de hidróxido de sódio adicionado (10 ou 20 mL) mais volume de hidróxido de sódio gasto na titulação, multiplicado pelo fator da solução. C = volume em mL de ácido sulfúrico adicionado, multiplicado pelo respectivo fator da solução N = normalidade das soluções (0,1 N) V = volume da amostra usado na titulação, em mL PM = peso molecular do acetato de etila = 88 g 424 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Para expressar o resultado em mg por 100 mL de álcool anidro: E = mg de ésteres em acetato de etila por 100 mL de amostra G = graduação alcoólica da amostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 350. BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria nº 76, de 27 de nov de 86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3-12-86. Seção l, p.18152-18173. 225/IV Bebidas fermento-destiladas – Aldeídos totais Este método é aplicável para bebidas destiladas e se baseia na reação de bissulito com aldeídos da amostra, formando compostos bissulfíticos. O excesso de bissulito é titulado com solução de iodo na presença de amido. A reação é reversível e pode liberar o composto carbonílico, sob a ação de ácidos ou de bases. Após a adição de uma solução alcalina, o bissulito que estava ligado ao aldeído é liberado e dosado com a solução de iodo. Material Balanças analítica e semi-analítica, agitador magnético, pHmetro, buretas de 10 mL e 25 mL, pipetas volumétricas de 5, 10 e 50 mL, balão volumétrico de 1000 mL e frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa. Reagentes Solução diluída de ácido clorídrico Solução de iodo 0,025 M Solução de amido a 1% m/v Solução diluída de hidróxido de sódio Solução A – Pese 15 g de metabissulito de potássio (K2S2O5) e dissolva em um balão volumétrico de 1000 mL com água e 70 mL de ácido clorídrico. Complete o volume. Solução B – Pese 200 g de fosfato trissódico (Na3PO4.12H2O) e 4,5 g de EDTA (etileno IAL - 425 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital diaminotetracetato dissódico). Dissolva em balão volumétrico de 1000 mL com água e complete o volume. Solução C – Meça 250 mL de ácido clorídrico. Dilua em água a 1000 mL em um balão volumétrico. Solução D – Pese 100 g de ácido bórico e 170 g de hidróxido de sódio. Dissolva os reagentes em água e dilua a 1000 mL em um balão volumétrico. Procedimento – Coloque 300 mL de água e 10 mL da solução A em um frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa. Pipete 50 mL do destilado da amostra e adicione à solução do frasco. Feche o frasco, agite e deixe em repouso por 15 minutos. Adicione 10 mL da solução B. O pH deve estar entre 7,0 e 7,2. Caso contrário, ajuste adicionando solução de ácido clorídrico ou de hidróxido de sódio diluida à solução A e comece a análise novamente usando nova tomada de amostra. Feche o frasco, agite e deixe em repouso por 15 minutos. Acrescente 10 mL da solução C (quando for feita análise em série, faça a determinação completa da primeira amostra antes de adicionar ácido na próxima) e 4 mL de solução de amido. Agite e adicione, com auxílio de uma bureta, solução de iodo 0,025 M até viragem para azul, sem excesso. Junte 10 mL da solução D e titule imediatamente o SO2 liberado com solução de iodo 0,025 M até o aparecimento de cor azulada, agitando lentamente. O pH da solução inal deve estar entre 8,8 e 9,5. Se necessário ajuste, adicionando solução de ácido clorídrico ou de hidróxido de sódio à solução D e reinicie a análise com nova tomada de amostra. Cálculos Os aldeídos são expressos em mg de aldeído acético por 100 mL da amostra ou em mg de aldeído acético por 100 mL de álcool anidro. n = volume gasto da solução de iodo, em mL M = molaridade da solução de iodo PM = peso molecular do aldeído acético = 44 g V = volume de amostra, em mL Para expressar o resultado em mg por 100 mL de álcool anidro: 426 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas A = mg de aldeído acético por 100 mL de amostra G = graduação alcoólica da amostra Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 972.08) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 10. 226/IV Bebidas fermento-destiladas – Furfural O método de Hewitt´s tem sido comumente aplicado para a determinação de furfural em bebidas alcoólicas destiladas e é baseado no desenvolvimento de coloração rósea, pela reação do furfural e anilina em meio ácido. A determinação de furfural é feita com o destilado da amostra corrigido a 50% de álcool em volume. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, cubeta de 10 mm, termômetro, tubos de ensaio 15 x 150 mm, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1 e 5 mL e balões volumétricos de 100 e 1 000 mL. Reagentes Furfural Anilina pura (redestilada) Álcool Solução de álcool a 50% Ácido acético glacial Solução de álcool a 90% Solução-padrão de furfural (C4H3O.CHO) – Pese exatamente 1 g de furfural redestilado e diluído a 100 mL com álcool em um balão volumétrico de 100 mL. Dilua 1 mL desta solução a 1000 mL com solução de álcool a 50% em um balão volumétrico (0,01 mg/mL). Curva-padrão – Pipete para tubos de ensaio 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mL da solução-padrão de furfural (0,01 mg/mL). Dilua em solução de álcool a 50% até o volume de 10 mL. Faça um branco com 10 mL de solução de álcool a 50%. Adicione em cada tubo 4 gotas de anilina e 1 mL de ácido acético glacial. Agite e coloque em banho de água a 15°C por 15 minutos. Faça a leitura das absorbâncias no espectrofotômetro, a 520 nm. Construa a curva-padrão, colocando IAL - 427 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital nas abscissas mg de furfural por 100 mL e nas ordenadas as leituras obtidas em absorbância. Procedimento – Corrija a graduação do destilado da amostra de modo a obter uma graduação alcoólica de 50% (v/v), conforme a tabela 2 (volume de álcool etílico a 90% v/v a adicionar para obtenção de uma solução com graduação alcoólica de 50% v/v), ou conforme a Tabela 3 (volume de água a ser adicionado para obtenção de uma solução com graduação alcoólica de 50% v/v). Pipete 10 mL da solução da amostra cuja graduação alcoólica já tenha sido corrigida a 50% para um tubo de ensaio, como na preparação da curva-padrão. Prepare o branco, utilizando álcool a 50%. Faça a leitura da absorbância da amostra a 520 mm. Nota: para obtenção da solução de álcool a 90% v/v, utilize a Tabela 4. Cálculo Furfural é expresso em mg por 100 mL de álcool anidro pela fórmula: A = concentração de furfural obtida pela curva-padrão Vf = volume inal a 20°C da amostra destilada e ajustada a 50%, obtido na Tabela 2 ou 3 G = grau alcoólico da amostra 428 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas ABELA 2 – Volume de álcool etílico a 90 % v/v a adicionar em 100 mL do destilado para obtenção de uma graduação alcoólica de 50 % (v/v) Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura 30,0 47,7 145,9 33,1 40,5 139,1 30,1 47,5 145,7 33,2 40,2 138,8 30,2 47,3 145,5 33,3 40,0 138,6 30,3 47,1 145,3 33,1 40,5 139,1 30,4 46,8 145,0 33,2 40,2 138,8 30,5 46,6 144,8 33,3 40,0 138,6 30,6 46,4 144,6 33,1 40,5 139,1 30,7 46,2 144,4 33,2 40,2 138,8 30,8 45,9 144,2 33,3 40,0 138,6 30,9 45,6 143,9 33,4 39,8 138,4 31,0 45,4 143,7 33,5 39,6 138,1 31,1 45,2 143,5 33,6 39,3 137,9 31,2 45,0 143,3 33,7 39,1 137,7 31,3 44,7 143,0 33,8 38,9 137,5 31,4 44,5 142,8 33,9 38,7 137,3 31,5 44,3 142,6 34,0 38,4 137,0 31,6 44,0 142,3 34,1 38,1 136,8 31,7 43,8 142,1 34,2 37,9 136,6 31,8 43,6 141,9 34,3 37,7 136,4 31,9 43,4 141,7 34,4 37,5 136,2 32,0 43,1 141,5 34,5 37,2 135,9 32,1 42,9 141,2 34,6 37,0 135,7 32,2 42,7 141,0 34,7 36,7 135,5 32,3 42,5 140,8 34,8 36,5 135,3 32,4 42,2 140,6 34,9 36,3 135,1 32,5 42,0 140,4 35,0 36,0 134,7 32,6 41,7 140,2 35,1 35,7 134,5 32,7 41,5 140,0 35,2 35,5 134,3 32,8 41,2 139,8 35,3 35,3 134,1 32,9 40,9 139,5 35,4 35,0 133,8 33,0 40,7 139,3 35,5 34,8 133,6 IAL - 429 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura 35,6 34,6 133,4 39,0 26,5 125,6 35,7 34,3 133,2 39,1 26,3 125,4 35,8 34,0 132,9 39,2 26,1 125,2 35,9 33,8 132,7 39,3 25,8 124,9 36,0 33,6 132,5 39,4 25,6 124,7 36,1 33,4 132,3 39,5 25,3 124,5 36,2 33,1 132,0 39,6 25,1 124,3 36,3 32,9 131,8 39,7 24,8 124,0 36,4 32,7 131,6 39,8 24,6 123,0 36,5 32,4 131,4 39,9 24,3 123,5 36,6 32,2 131,2 40,0 24,1 123,4 36,7 32,0 131,0 40,1 23,9 123,1 36,8 31,7 130,7 40,2 23,7 122,9 36,9 31,5 130,5 40,3 23,5 122,7 37,0 31,3 130,3 40,4 23,3 122,5 37,1 31,0 130,0 40,5 23,0 122,3 37,2 30,7 129,8 40,6 22,8 122,1 37,3 30,5 129,6 40,7 22,5 121,8 37,4 30,3 129,4 40,8 22,2 121,5 37,5 30,0 129,1 40,9 22,0 121,3 37,6 29,8 128,9 41,0 21,8 121,1 37,7 29,5 128,6 41,1 21,5 120,8 37,8 29,3 128,4 41,2 21,3 120,6 37,9 29,1 128,2 41,3 21,0 120,3 38,0 28,9 128,0 41,4 20,7 120,1 38,1 28,7 127,8 41,5 20,5 119,9 38,2 28,5 127,6 41,6 20,3 119,7 38,3 28,3 127,4 41,7 20,0 119,4 38,4 28,0 127,1 41,8 19,8 119,2 38,5 27,8 126,9 41,9 19,5 118,9 38,6 27,5 126,6 42,0 19,3 118,7 38,7 27,2 126,3 42,1 19,0 118,4 38,8 27,0 126,1 42,2 18,7 118,2 38,9 26,8 125,9 42,3 18,5 118,0 430 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura 42,4 18,3 117,8 45,8 10,1 109,8 42,5 18,1 117,6 45,9 9,9 109,6 42,6 17,9 117,4 46,0 9,7 109,4 42,7 17,7 117,2 46,1 9,4 109,1 42,8 17,4 116,9 46,2 9,1 108,8 42,9 17,2 116,7 46,3 8,9 108,6 43,0 16,9 116,4 46,4 8,7 108,4 43,1 16,7 116,2 46,5 8,5 108,2 43,2 16,5 116,0 46,6 8,2 107,9 43,3 16,2 115,7 46,7 7,9 107,7 43,4 15,9 115,5 46,8 7,7 107,5 43,5 15,7 115,2 46,9 7,5 107,3 43,6 15,5 115,0 47,0 7,3 107,1 43,7 15,2 114,7 47,1 7,1 106,9 43,8 14,9 114,5 47,2 6,8 106,6 43,9 14,7 114,3 47,3 6,6 106,4 44,0 14,5 114,1 47,4 6,4 106,2 44,1 14,2 113,8 47,5 6,1 105,9 44,2 13,9 113,5 47,6 5,9 105,7 44,3 13,7 113,3 47,7 5,7 105,5 44,4 13,5 113,1 47,8 5,4 105,2 44,5 13,3 112,9 47,9 5,1 104,9 44,6 13,1 112,7 48,0 4,9 104,7 44,7 12,8 112,4 48,1 4,6 104,4 44,8 12,6 112,2 48,2 4,4 104,2 44,9 12,4 112,0 48,3 4,1 103,9 45,0 12,1 111,8 48,4 3,9 103,7 45,1 11,9 111,6 48,5 3,6 103,5 45,2 11,7 111,4 48,6 3,3 103,2 45,3 11,4 111,1 48,7 3,1 103,0 45,4 11,1 110,8 48,8 2,8 102,7 45,5 10,9 110,6 48,9 2,6 102,5 45,6 10,7 110,4 49,0 2,4 102,3 45,7 10,4 110,1 49,1 2,1 102,0 IAL - 431 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de álcool 90º a adicionar Volume da mistura 49,2 1,9 101,8 49,6 0,9 100,9 49,3 1,7 101,6 49,7 0,7 100,7 49,4 1,5 101,4 49,8 0,4 100,4 49,5 1,2 101,2 49,9 0,2 100,2 TABELA 3 – Volume de água a ser adicionado a 100 mL de uma solução alcoólica para obtenção de uma graduação alcoólica de 50 % v/v Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura 50,1 0,21 100,2 52,4 4,96 104,7 50,2 0,41 100,4 52,5 5,16 104,9 50,3 0,62 100,6 52,6 5,37 105,1 50,4 0,82 100,8 52,7 5,58 105,3 50,5 1,03 101,0 52,8 5,79 105,5 50,6 1,24 101,1 52,9 5,99 105,7 50,7 1,44 101,3 53,0 6,20 105,9 50,8 1,65 101,5 53,1 6,41 106,1 50,9 1,85 101,7 53,2 6,62 106,3 51,0 2,06 101,9 53,3 6,82 106,5 51,1 2,27 102,1 53,4 7,03 106,7 51,2 2,47 102,3 53,5 7,24 106,9 51,3 2,68 102,5 53,6 7,45 107,1 51,4 2,89 102,7 53,7 7,66 107,3 51,5 3,09 102,9 53,8 7,86 107,5 51,6 3,30 103,1 53,9 8,07 107,7 51,7 3,51 103,3 54,0 8,28 107,9 51,8 3,72 103,5 54,1 8,49 108,1 51,9 3,92 103,7 54,2 8,70 108,3 52,0 4,13 103,9 54,3 8,90 108,5 52,1 4,34 104,1 54,4 9,11 108,7 52,2 4,54 104,3 54,5 9,32 108,9 52,3 4,75 104,5 54,6 9,53 109,1 432 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura 54,7 9,74 109,3 58,1 16,81 116,1 54,8 9,94 109,5 58,2 17,02 116,3 54,9 10,13 109,7 58,3 17,22 116,5 55,0 10,37 109,9 58,4 17,43 116,7 55,1 10,78 110,1 58,5 17,64 116,9 55,2 10,86 110,3 58,6 17,85 117,1 55,3 10,98 110,5 58,7 18,06 117,3 55,4 11,19 110,7 58,8 18,26 117,5 55,5 11,40 110,9 58,9 18,47 117,7 55,6 11,61 111,1 59,0 18,68 117,9 55,7 11,81 111,3 59,1 18,89 118,1 55,8 12,02 111,5 59,2 19,10 118,3 55,9 12,23 111,7 59,3 19,30 118,5 56,0 12,44 111,9 59,4 19,51 118,7 56,1 12,65 112,1 59,5 19,72 118,9 56,2 12,85 112,3 59,6 19,93 119,1 56,3 13,06 112,5 59,7 20,14 119,3 56,4 13,27 112,7 59,8 20,34 119,5 56,5 13,48 112,9 59,9 20,55 119,7 56,6 13,69 113,1 60,0 20,76 119,9 56,7 13,90 113,3 60,1 20,97 120,1 56,8 14,10 113,5 60,2 21,18 120,3 56,9 14,31 113,7 60,3 21,39 120,5 57,0 14,52 113,9 60,4 21,60 120,7 57,1 14,73 114,1 60,5 21,80 120,9 57,2 14,94 114,3 60,6 22,01 121,1 57,3 15,14 114,5 60,7 22,22 121,3 57,4 15,35 114,7 60,8 22,43 121,5 57,5 15,56 114,9 60,9 22,64 121,7 57,6 15,77 115,1 61,0 22,85 121,9 57,7 15,98 115,3 61,1 23,06 122,1 57,8 16,18 115,5 61,2 23,27 122,3 57,9 16,39 115,7 61,3 23,48 122,5 58,0 16,60 115,9 61,4 23,69 122,7 IAL - 433 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura 61,5 23,90 122,9 64,9 31,02 129,7 61,6 24,11 123,1 65,0 31,23 129,9 61,7 24,32 123,3 65,1 31,44 130,1 61,8 24,53 123,5 65,2 31,63 130,3 61,9 24,74 123,7 65,3 31,86 130,5 62,0 24,95 123,9 65,4 32,07 130,7 62,1 25,16 124,1 65,5 32,28 130,9 62,2 25,37 124,3 65,6 32,49 131,1 62,3 25,58 124,5 65,7 32,70 131,3 62,4 25,79 124,7 65,8 32,91 131,5 62,5 25,99 124,9 65,9 33,12 131,7 62,6 26,20 125,1 66,0 33,33 131,9 62,7 26,41 125,3 66,1 33,54 132,1 62,8 26,62 125,5 66,2 33,75 132,3 62,9 26,83 125,7 66,3 33,96 132,5 63,0 27,04 125,9 66,4 34,17 132,7 63,1 27,25 126,1 66,5 34,38 132,9 63,2 27,46 126,3 66,6 34,60 133,1 63,3 27,67 126,5 66,7 34,81 133,3 63,4 27,88 126,7 66,8 35,02 133,5 63,5 28,09 126,9 66,9 35,23 133,7 63,6 28,30 127,1 67,0 35,44 133,9 63,7 28,51 127,3 67,1 35,65 134,1 63,8 28,72 127,5 67,2 35,86 134,3 63,9 28,93 127,7 67,3 36,07 134,5 64,0 29,14 127,9 67,4 36,28 134,7 64,1 29,35 128,1 67,5 36,49 134,9 64,2 29,56 128,3 67,6 36,71 135,1 64,3 29,77 128,5 67,7 36,92 135,3 64,4 29,98 128,7 67,8 37,13 135,5 64,5 30,18 128,9 67,9 37,34 135,7 64,6 30,39 129,1 68,0 37,55 135,9 64,7 30,60 129,3 68,1 37,76 136,1 64,8 30,81 129,5 68,2 37,97 136,3 434 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura Graduação alcoólica mL de água a adicionar Volume da mistura 68,3 38,18 136,5 71,7 45,37 143,3 68,4 38,39 136,7 71,8 45,58 143,5 68,5 38,60 136,9 71,9 45,79 143,7 68,6 38,82 137,1 72,0 46,00 143,9 68,7 39,03 137,3 72,1 46,21 144,1 68,8 39,24 137,5 72,2 46,43 144,3 68,9 39,45 137,7 72,3 46,64 144,5 69,0 39,66 137,9 72,4 46,85 144,7 69,1 39,87 138,1 72,5 47,06 144,9 69,2 40,08 138,3 72,6 47,28 145,1 69,3 40,30 138,5 72,7 47,49 145,3 69,4 40,51 138,7 72,8 47,70 145,5 69,5 40,72 138,9 72,9 47,92 145,7 69,6 40,93 139,1 73,0 48,13 145,9 69,7 41,14 139,3 73,1 48,34 146,1 69,8 41,36 139,5 73,2 48,55 146,3 69,9 41,57 139,7 73,3 48,77 146,5 70,0 41,78 139,9 73,4 48,98 146,7 70,1 41,99 140,1 73,5 49,19 146,9 70,2 42,20 140,3 73,6 49,40 147,1 70,3 42,41 140,5 73,7 49,61 147,3 70,4 42,62 140,7 73,8 49,83 147,5 70,5 42,83 140,9 73,9 50,04 147,7 70,6 43,05 141,1 74,0 50,25 147,9 70,7 43,26 141,3 74,1 50,46 148,1 70,8 43,47 141,5 74,2 50,68 148,3 70,9 43,68 141,7 74,3 50,89 148,5 71,0 43,89 141,9 74,4 51,10 148,7 71,1 44,10 142,1 74,5 51,31 148,9 71,2 44,31 142,3 74,6 51,53 149,1 71,3 44,52 142,5 74,7 51,74 149,3 71,4 44,73 142,7 74,8 51,95 149,5 71,5 44,94 142,9 74,9 52,17 149,7 71,6 45,16 143,1 75,0 52,38 149,9 IAL - 435 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital TABELA 4 – Volume de água a adicionar a 100 mL de álcool de 90,5 a 100 % em volume para obtenção de álcool a 90 % v/v Grau Alcoólico Real % em volume Volume de água a adicionar (mL) 100,0 13,2 99,5 12,5 99,0 11,8 98,5 11,1 98,0 10,4 97,5 9,7 97,0 9,0 96,5 8,3 96,0 7,7 95,5 7,0 95,0 6,4 94,5 5,7 94,0 5,1 93,5 4,4 93,0 3,8 92,5 3,1 92,0 2,5 91,5 1,8 91,0 1,2 90,5 0,5 Referência bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria nº 76, de 27 de nov de 86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3-12-86. Seção I. p. 18152-18174. 227/IV Bebidas fermento-destiladas – Metanol Este método é aplicável em bebidas alcoólicas e se baseia numa reação de oxidação do metanol pelo permanganato de potássio, formando formaldeído, que reage com o sal do ácido cromotrópico, conferindo cor. Material Banho-maria, espectrofotômetro UV/VIS, termômetro, cubeta de 10 mm, pipetas volumétricas de 1, 2, e 5 mL, pipeta graduada de 10 mL e balões volumétricos de 50 e 100 mL. 436 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Reagentes Ácido sulfúrico Álcool grau espectrofotométrico Metanol grau espectrofotométrico Isopropanol grau espectrofotométrico Sulito de sódio ou bissulito de sódio Solução de permanganato de potássio a 3% em solução de acido fosfórico a 15% – Pipete 15 mL de ácido fosfórico (85%, d = 1,69) e dilua com água, acrescente 3 g de KMnO4 e complete o volume a 100 mL num balão volumétrico. Solução do sal dissódico dihidratado do ácido cromotrópico (C10H6 Na2O8S2.2H2O) a 5% – Dissolva 5 g do sal em 100 mL de água. Se a solução não estiver clara, iltre. A solução deve ser preparada semanalmente. O sal ou o ácido podem ser usados. Puriicação do ácido cromotrópico – Se a leitura da absorbân cia do branco for maior que 0,05, puriique o reagente dissolvendo 10 g de ácido cromotrópico ou seu sal sódico em 25 mL de água. Adicione 2 mL de ácido sulfúrico à solução aquosa de sal para a conversão para ácido livre. Adicione 50 mL de metanol. Aqueça até a ebulição, e iltre. Adicione 100 mL de isopropanol para precipitar o ácido cromotrópico livre (adicione mais isopropanol para aumentar o rendimento do ácido puriicado). Preparação da amostra – Utilize o destilado da amostra, o qual foi obtido para a determinação da graduação alcoólica e dilua para uma concentração de álcool etílico de 5 a 6% em volume. Prepare um branco de álcool etílico a 5,5%. Uma solução padrão contendo 0,025% de metanol em solução de álcool etílico a 5,5% deve ser preparada (v/v). Se a concentração de metanol (em volume) na amostra for maior ou igual a 0,05%, dilua aproximadamente à concentração de 0,025% de metanol com álcool etílico a 5,5% (v/v). Para amostras que contenham concentração de metanol menor ou igual a 0,05% utilize uma quantidade maior de amostra e destile novamente, recolhendo o destilado em um balão de menor volume do que o inicial, de modo a realizar uma concentração da mesma. Procedimento – Pipete 2 mL da solução de permanganato de potássio para um balão volumétrico de 50 mL. Resfrie em banho de gelo. Adicione 1 mL da solução da amostra diluída e deixe por 30 minutos em banho de gelo. Descore com um pouco de bissulito de sódio e adicione 1 mL da solução de ácido cromotrópico. Adicione lentamente 15 mL de ácido sulfúrico com agitação e coloque em banho de água quente (60-75°C) por 15 minutos. Resfrie e complete o volume com água à temperatura ambiente. Faça a leitura da absorbância IAL - 437 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital a 575 nm contra um branco de álcool a 5,5% tratado da mesma forma que a amostra. Trate a solução-padrão de 0,025% de metanol (em álcool a 5,5%) da mesma maneira que a amostra e faça a leitura da absorbância Ap. A diferença entre as temperaturas do padrão e da amostra não deve ser maior que 1°C, pois a temperatura afeta a leitura da absorbância. Se a cor da amostra for muito intensa, dilua com o branco preparado como acima, até no máximo três vezes. Cálculo A = absorbância da amostra f = fator de diluição da amostra Ap = absorbância da solução padrão G = graduação alcoólica Referência bibliográfica: ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 958.04) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 26. p. 15. 228/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de metanol e componentes secundários Este método é utilizado para determinar as concentrações de metanol e componentes secundários em bebidas alcoólicas por cromatograia em fase gasosa. As bebidas alcoólicas destiladas como aguardente, whisky, conhaque, vodca, rum e tequila, não requerem destilação prévia, entretanto, as que apresentarem resíduo seco superior a 0,4 g/100 mL devem ser destiladas antes de serem analisadas. Material Balança analítica, cromatógrafo a gás com controle de programação de temperatura de coluna, provido de detector de ionização de chama (FID). Colunas cromatográicas que podem ser utilizadas nesta análise: coluna empacotada: fase estacionária: 1) Carbowax 20M 5% ou similar; suporte: Carbopack B, 80/120 mesh; comprimento: 2 m; diâmetro interno: 2 mm; coluna capilar de sílica fundida: fase estacionária Carbowax ou similar; comprimento: 60 m; diâmetro interno: 0,25 mm; espessura do ilme: 0,25 μm.: 2) Coluna megabore: fase es438 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas tacionária Carbowax ou similar, comprimento 30 m, diâmetro interno 0,53 mm; ou qualquer outra coluna que permita a separação dos compostos de interesse com satisfatórias eiciência e resolução. Gases de arraste: nitrogênio (pureza 99,999% para coluna empacotada) e hidrogênio (pureza 99,999% para colunas capilar e megabore). Gases auxiliares para FID: hidrogênio (pureza 99,999%), nitrogênio (pureza 99,999%) e ar sintético (pureza 99,999%).Microsseringa de 10 μL, graduada em 0,1 μL, pipetas graduadas de 1 e 10 mL, balões volumétricos de 10 e 100 mL, proveta de 100 mL e funil. Reagentes Álcool absoluto Acetaldeído Metanol Acetato de etila n-Propanol Isobutanol n-Butanol 2-Metilbutanol 3-Metilbutanol 3-Pentanol (padrão interno) Nota: o álcool absoluto e todos os padrões devem ter grau cromatográico. Acetaldeído deve ser estocado no escuro à temperatura de freezer e os demais devem ser estocados sob refrigeração. Solução-padrão estoque A – Tare um balão volumétrico de 100 mL e adicione 20 a 40 mL de álcool etílico absoluto. Pese cada padrão individualmente, conforme tabela abaixo. Complete o volume com álcool e pese. Agite a mistura para homogeneizar. Anote as massas de cada padrão adicionado e a massa total da solução. Padrão acetaldeído metanol acetato de etila n-propanol isobutanol n-butanol 2-metilbutanol 3-metilbutanol V (mL) 0,8 2,0 2,0 1,5 2,5 0,5 1,0 2,5 IAL - 439 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão interno estoque B – Pese 2,5 mL de 3-pentanol em um balão volumétrico de 100 mL tarado, contendo 20 a 40 mL de álcool. Complete com álcool e pese. Agite para homogeneizar. Anote as massas do frasco vazio, do padrão interno e da solução total. Solução de álcool etílico a 40% v/v – Transira 40 mL de álcool para uma proveta ou balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de trabalho C – Transira 1 mL da solução A e 1 mL da solução B para um balão volumétrico de 100 mL tarado, contendo 20 a 40 mL de álcool etílico a 40% v/v. Pese após cada adição. Complete o volume com álcool a 40% e agite para homogeneizar. Anote as massas do frasco vazio, de cada solução adicionada e da solução total. Solução D – Prepare esta solução utilizando a solução-padrão estoque A. Pipete 1 mL da solução A para um balão volumétrico de 100 mL tarado, contendo 20 a 40 mL de álcool a 40% v/v e pese. Complete o volume com álcool a 40% v/v e pese. Agite. Anote as massas do frasco vazio, da solução A e da solução total. Solução-padrão interno de trabalho E – Pipete 10 mL da solução-padrão interno estoque - B para um balão volumétrico de 100 mL tarado, contendo 20 a 40 mL de álcool a 40% v/v e pese. Complete o volume com álcool a 40% v/v e pese novamente. Agite vigorosamente para homogeneizar. Anote as massas do frasco vazio, da solução adicionada e da solução total. Todas as soluções devem ser estocadas à temperatura de 4 a 8°C. As soluções C e E devem ser preparadas mensalmente, as soluções A e B a cada 6 meses, e a solução D deve ser preparada sempre que houver interesse em checar os resultados. Os rótulos dos frascos devem conter informações quanto à identiicação das soluções e as datas de preparação. Procedimento Preparação da amostra: pese em um balão volumétrico de 10 mL, tarado, 9 mL da amostra; em seguida, adicione 1 mL da solução-padrão interno de trabalho (E) e pese. Agite. Anote as respectivas massas. Solução D adicionada de padrão interno (de controle de qualidade de trabalho): pese em um balão volumétrico de 10 mL, tarado, 9 mL da solução D; em seguida, adicione 1 mL da solução de padrão interno de trabalho (E) e pese. Agite. Anote as respectivas massas. Análise cromatográfica Condições de operação do cromatógrafo a gás: a) coluna empacotada: Programação da temperatura do forno: temperatura inicial: 70°C por 4min; 6°C por min 440 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas até 118°C (por 1 min); 5°C por min até 160°C (por 10 min). Temperatura do injetor: 200°C Temperatura do detector: 250°C Vazão do Gás de arraste (N2): 30 mL/ min Vazão do H2 (chama): 20 mL/ min Vazão do Ar: 175 mL/ min b) coluna capilar: Programação da temperatura do forno: temperatura inicial: 40°C por 4 min; 15°C por min até 60ºC (por 5 min); 30°C por min até 170°C (por 10 min). Temperatura do injetor: 200°C Temperatura do detector: 250°C Vazão do Gás de arraste (H2): 1 mL/ min Vazão do H2 (chama): 20 mL/ min Vazão do Ar: 175mL/ min Vazão do N2 (make-up): 25 a 30 mL/min Razão de divisão: 1:100 split Injete 1,0 μL da solução-padrão de trabalho C no cromatógrafo e identiique os picos dos componentes pelos respectivos tempos de retenção. Repita a injeção no mínimo quatro vezes. Amostra – Injete 1 μL da solução da amostra e identiique os picos dos componentes secundários, seguindo exatamente as mesmas condições. Repita a injeção no mínimo quatro vezes. Quando houver interesse, injete 1 μL da solução de controle de qualidade de trabalho D (adicionada de padrão interno). Cálculos Cálculo utilizando software que acompanha o cromatógrafo: siga as instruções do manual do equipamento para cálculos com padronização interna. Cálculos manuais: cálculo dos fatores de correção. Os fatores de correção são obtidos a partir dos cromatogramas gerados pela solução-padrão de trabalho - C para cada componente secundário. IAL - 441 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital API = área do pico do padrão interno do cromatograma da solução C Acomp = área do pico de cada composto do cromatograma da solução C CPI = concentração do padrão interno (mg/100 g) na solução C Ccomp = concentração do composto (mg/100 g) na solução C A concentração de cada composto é calculada a partir do cromatograma da amostra e é expressa em mg por 100 g: AcompA APIA FCcomp CPIA = área do pico do composto do cromatograma da amostra = área do pico do padrão interno do cromatograma da amostra = fator de correção do composto obtido a partir da solução C = concentração do padrão interno na solução da amostra (mg por 100 g) Cálculo da concentração de cada composto, expressa em mg por 100 mL de álcool anidro: C = concentração do composto (mg/100 mL de álcool anidro) Ccomp = concentração do composto, expressa em mg/100 g dabs = densidade absoluta da amostra G = graduação alcoólica da amostra, em % v/v Referências bibliográficas MARTIN, G.E.; BURGGRAFF, J.M.; DYER, R.H.; BUSCEMI. P.C. Gas-liquid chromatography determination of congeners in alcohol products, Journal of the A.O.A.C., v. 64, p. 186-190, 1981. NAGATO, L.A.F.; DURAN, M.C.; CARUSO, M.S.F.; BARSOTTI, R.C.F.; BADOLATO, E.S.G. Monitoramento da autenticidade de amostras de bebidas alcoólicas enviadas ao Instituto Adolfo Lutz em São Paulo. Rev. Ciênc. Tecnol. Alimentos, Campinas, v. 21, n.1, p. 39-42, 2001. 442 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas 229/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de carbamato de etila ou uretana por cromatografia a gás e detecção por espectrometria de massa Este método é utilizado para a determinação de carbamato de etila em bebidas destiladas. A identiicação é feita pela comparação dos tempos de retenção dos picos da amostra e do padrão, injetados nas mesmas condições, além da veriicação da presença dos íons de razão massa/carga 74 e 89. A quantiicação de carbamato de etila em amostras de bebidas destiladas é feita pelo método de monitoramento seletivo de íons (SIM) para o fragmento de massa m/e 62, calculando-se a concentração de carbamato de etila pelo método de padronização interna, sendo o carbamato de n-propila empregado como padrão interno. Material Balança analítica, cromatógrafo a gás acoplado ao detetor de massa (analisador de massa quadrupolo), gás de arraste hélio (pureza 99,999%), nitrogênio comum para secagem, pipetas de 0,1, 0,2 e 0,5 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, e 5 mL, vials de 1 ou 2 mL com fundo cônico, balões volumétricos de 50 e 100 mL e frascos de vidro ou balões volumétricos de 25 mL. Reagentes Metanol - grau cromatográico Carbamato de etila - pureza 99% Carbamato de n-propila (padrão interno) - pureza 99% Metanol grau cromatográico Soluções-padrão de carbamato de etila e de n-propila – Prepare, em metanol, soluções de carbamato de etila e de n-propila, no mínimo, em três concentrações (100, 300 e 500 μg/ kg) de carbamato de etila e concentração ao redor de 300 μg/kg para o carbamato de npropila (padrão-interno) Procedimento – Pese aproximadamente 20 g de amostra e adicione solução-padrão interno de carbamato de n-propila na concentração aproximada de 300 μg/kg em relação à massa de amostra e agite. Pipete 0,2 mL desta solução para um frasco de vidro (vial) e evapore cuidadosamente com nitrogênio comum em banho de água à temperatura de 35°C, não deixando secar totalmente. Adicione 0,2 mL de metanol ao frasco e homogeneíze. Este mesmo procedimento é aplicado para as soluções-padrão. Injete 1 μL das soluções-padrão no cromatógrafo, modo splitless, monitoramento do íon 62/SIM e 1 μL das soluções da amostra, no mínimo, em triplicata. IAL - 443 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Condições de operação do cromatógrafo a gás acoplado ao detector de massa – coluna capilar DBwax - 30 m x 0,25 mm (J&W Scientiic), espessura do ilme 0,25 μm; programação da temperatura da coluna: de 50 a 90°C a 30°C/min, estável por 3 min, de 90 a 147°C a 5°C/min e até 220°C a 20°C/min, icando nesta temperatura por 5 min. Tempo total da corrida de 25 min; gás de arraste hélio - 50 kPa; temperatura do injetor a 220°C; temperatura da interface a 250ºC; fonte de íons a 250°C; sistema de ionização: impacto de elétrons a 70 eV; analisador de massa quadrupolo; injeção sem divisão da amostra de 1 min (splitless); tempo de espera de corrida do cromatograma para ser ligado o detector de massa de 9 min. Cálculo A quantiicação de carbamato de etila em amostras de bebidas destiladas é feita pelo método de monitoramento seletivo de íons (SIM) para o fragmento de massa m/e 62, calculando-se a concentração de carbamato de etila pelo método de padronização interna, sendo o carbamato de n-propila empregado como padrão interno. Referência bibliográfica NAGATO, L. A. F., SILVA, O. A., YONAMINE, M., PENTEADO, M. De V. C. Quantitation of ethyl carbamate (EC) by gas chromatography and mass spectrometric detection in distilled spirits. Alimentaria, Madrid, n. 311, p. 31-36, 2000. 230/IV Bebidas fermento-destiladas – Determinação de cobre Este método aplica-se à determinação de cobre em bebidas fermento-destiladas, utilizando-se a técnica de espectrometria de absorção atômica, pelo método de adição de padrão. Material Espectrômetro de absorção atômica, balões volumétricos de 50 e 200 mL e pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL Reagentes Solução de álcool a 8% Solução padrão de cobre a 1000 mg/L 444 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Solução-Padrão de cobre a 5 mg/L – Pipete 1 mL da solução-padrão de cobre 1000 mg/L em um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Procedimento – Preparação da curva padrão: em 4 balões volumétricos de 50 mL contendo 10 mL da amostra em cada um, adicione, respectivamente, alíquotas de 2, 5, e 10 mL da solução-padrão de 5 mg/L de cobre, sendo que, em um dos balões não adicione a solução padrão. Complete o volume com água. A concentração inal de cobre em cada balão será, respectivamente, 0; 0,2; 0,5; e 1 mg/L. Zere o equipamento com a solução de álcool etílico a 8% em água. Leia a absorbância destas soluções em 324,8 nm, usando chama oxidante ar/acetileno. Construa um gráico de absorbância x concentração. Prolongue a reta de modo a cortar o eixo das abscissas. O ponto de intersecção na abscissa corresponde à concentração de cobre na amostra diluída (Figura 1). Multiplique este valor por 5 para obter a concentração de cobre na amostra (mg de Cu/L). Caso o equipamento apresente recurso de programação para o método de adição de padrão, utilize-o para estabelecer a curva de calibração. Consulte o manual do equipamento para efetuar a programação. Figura 1 - Cálculo da concentração de cobre. Referência Bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 967.08) Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 26. p. 6-7. Bebidas fermentadas Estão incluídos neste capítulo os vinhos de mesa, vinhos espumantes, licorosos, compostos, fermentado de cana, fermentado de frutas, hidromel, iltrado doce, mistela, jeropiga, saquê, sidra e cerveja. Com exceção desta última, todas as outras bebidas alcoólicas fermentadas são analisadas, em alguns aspectos, da mesma maneira que o vinho. Na análise destes produtos, as determinações usuais são, entre outras, exame preliminar, densidade IAL - 445 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital relativa, álcool em volume, pH, acidez total, volátil, acidez ixa, extrato seco, açúcares redutores em glicose, açúcares não redutores em sacarose, sulfatos, extrato seco reduzido, relação álcool em peso/extrato seco reduzido, cinzas (018/IV), alcalinidade das cinzas, cloretos, dióxido de enxofre, taninos, metanol, corantes artiiciais (051/IV), minerais e contaminantes inorgânicos (cap. XXIII). Vinhos 231IV Bebidas fermentadas – Exame preliminar de vinhos O exame físico da amostra, antes e no momento da abertura da embalagem, é importante especialmente no caso dos vinhos e seus derivados, pois estes são susceptíveis à modiicações provenientes de causas diversas. Procedimento – Antes da abertura da embalagem, observe: aparência - se o produto apresenta o aspecto límpido ou turvo, se há presença de depósito ou não; cor - se o produto apresenta tonalidade própria ou imprópria; condições da embalagem - estado da embalagem, vazamentos e sistema de vedação; formação de gás. No momento da abertura da embalagem, veriique: aparência - se apresenta carbonatação conforme a característica do produto ou se há presença de gás devido a alguma anormalidade; odor - se típico (vinoso), estranho ou alterado (acético); sabor - caso seja necessário por degustação, avalie se o produto é seco, doce, próprio, estranho ou alterado (acético). Referência Bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. 232/IV Bebidas fermentadas – Preparação da amostra de vinhos Determine imediatamente, após a abertura da embalagem, os compostos que são sujeitos à alteração, tais como álcool e ácidos voláteis. Filtre, se necessário. Nos casos de bebidas gaseiicadas, elimine o CO2, utilizando um agitador magnético ou banho de ultrasom. 233/IV Vinhos -– Álcool em volume ou grau alcoólico Este método aplica-se a amostras de bebidas fermentadas. Baseia-se na destilação do álcool da amostra e posterior quantiicação pela medida da densidade relativa do destilado a 20°C. 446 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Material Conjunto de destilação ou equipamento destilador por arraste de vapor, chapa aquecedora, condensador de serpentina 40 cm, conexão com bola de segurança, balão volumétrico de 100 mL, funil, bastão de vidro, pérolas de vidro e termômetro. Procedimento: Ajuste a temperatura da amostra a 20oC e meça 100 mL em um balão volumétrico. Transira para o recipiente do aparelho destilador (adicione pérolas de vidro) ou para o borbulhador do aparelho de arraste a vapor, com auxílio do bastão de vidro. Lave o balão volumétrico 4 vezes com água destilada e destile a amostra. Recolha o destilado no próprio balão volumétrico inicialmente usado, em pelo menos ¾ do volume tomado de amostra. Complete o volume com água destilada. Determine a densidade relativa à 20ºC/20ºC e obtenha a graduação alcoólica a partir da Tabela 1. Se necessário, especialmente nos vinhos novos, adicione uma pequena quantidade de material anti-espumante, para prevenir a formação de espuma durante a destilação. No caso de vinhos que contenham uma quantidade elevada de ácido acético, neutralize exatamente com solução de hidróxido de sódio 0,1 N (volume calculado a partir da determinação de acidez), antes de proceder à destilação. A neutralização é desnecessária em vinhos que apresentam sabor e odor normais. Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.57) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 28. p. 1. BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. 234/IV Vinhos – Álcool em peso Aplicável para se determinar a porcentagem de álcool em peso em bebidas alcoólicas fermentadas. Considera-se como álcool em peso, por 100 mL, o resultado da multiplicação da graduação alcoólica em volume, por 0,79 (densidade aproximada do álcool absoluto a 20oC). IAL - 447 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo A x 0,79 = Álcool em peso por cento m/v A = nº de mL de álcool em volume por cento Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 366. 235/IV Vinhos – Acidez total Este método basea-se na titulação de neutralização dos ácidos com solução padronizada de álcali, com uso de indicador fenoftaleína para soluções claras de vinho e outras bebidas álcoolicas fermentadas ou com o pHmetro para soluções escuras. Material pHmetro, agitador magnético, barra magnética, pipeta volumétrica de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, béquer de 250 mL, bureta de 10 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 N ou 0,05 N Solução de fenolftaleína Procedimento - Pipete 10 mL da amostra descarbonatada em um frasco Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL de água. Adicione 0,5 mL de fenoftaleína e titule com solução de hidróxido de sódio padronizada, até coloração rósea persistente ou transira a amostra para um béquer e titule até o ponto de viragem (pH 8,2-8,4), utilizando o pHmetro. Cálculo n = volume em mL de solução de hidróxido de sódio gasto na titulação f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio N = normalidade da solução de hidróxido de sódio V = volume da amostra 448 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Nota: a unidade de acidez é expressa em meq/L, para atender a legislação brasileira. Referências bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p.361. 236/IV Vinhos – Acidez volátil Método utilizado para determinar a acidez volátil titulável de vinhos e outras bebidas fermentadas por volumetria, após a destilação por arraste de vapor. Material Chapa elétrica de aquecimento, pipeta volumétrica de 10 mL, aparelho de destilação de Cazenave-Ferré ou conjunto similar, gerador de vapor, frascos Erlenmeyer de 250 e 500 mL, refrigerante de Liebig ou de serpentina, bureta de 10 mL e pipeta de 1 mL. Reagentes – Os mesmos indicados no método 235/IV – acidez total. Procedimento – Transira, com pipeta volumétrica, 10 mL da amostra no borbulador e 250 mL de água isenta de CO2 no aparelho gerador de vapor de Cazenave-Ferré ou transira a amostra para um conjunto similar de destilação por arraste de vapor. Conecte o condensador. Aqueça o aparelho de Cazenave-Ferré em chapa elétrica e leve à ebulição com a torneira de vapor aberta, a im de eliminar o ar do conjunto e, eventualmente, o gás carbônico da água destilada. Em seguida, feche a torneira, para que o vapor de água borbulhe na amostra arrastando os ácidos voláteis. Recolha no mínimo 100 mL do destilado em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, contendo 20 mL de água destilada. Adicione 1 mL de solução de indicador fenolftaleína. Titule rapidamente com solução de hidróxido de sódio padronizada, até coloração rósea persistente por 30 s. Cálculo – Usar fórmula do método 235/IV Nota: faça a correção da acidez volátil para amostras com anidrido sulfuroso. Referências bibliográicas – indicadas no método 235/IV 237/IV Vinhos – Acidez fixa Este método é aplicável a vinhos e outras bebidas fermentadas. A acidez ixa é expressa, em meq/L, pela diferença entre a acidez total e a acidez volátil. IAL - 449 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo At - Av = acidez ixa, em meq/L At = acidez total, em meq/L Av = acidez volátil, em meq/L Referências Bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de novembro de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03 de dez. 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz . v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 361. 238/IV Vinhos - Extrato seco Método A - aplicável a vinhos secos e outras bebidas fermentadas com extrato seco menor que 3 g/100 mL. O método avalia o resíduo seco (sólidos totais) da bebida, por evaporação e secagem em estufa. Material Cápsula de metal com fundo chato, com aproximadamente 8,5 cm de diâmetro, estufa, banho-maria, balança analítica, pipeta volumétrica de 20 ou 25 mL, dessecador e temômetro. Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta, 20 ou 25 mL da amostra para uma cápsula metálica de fundo chato, previamente aquecida em estufa a (100 ± 5)ºC, por uma hora, resfriada em dessecador e pesada. Evapore em banho-maria fervente até que o resíduo esteja aparentemente seco, ou até uma consistência xaroposa. Aqueça o resíduo em estufa a (100 ± 5)ºC, por 1 hora. Resfrie em dessecador e pese. Repita as operações em estufa e dessecador até peso constante. Cálculo N = massa, em g de resíduo v = volume da amostra, em mL Referências Bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 361. 450 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 920.62) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 28. p. 4. Método B – este método é aplicável a vinhos doces e outras bebidas fermentadas cujo conteúdo de extrato seco seja de (3 - 6)g/100 mL. Em amostras doces, o resultado de extrato seco pelo método gravimétrico, por secagem da amostra, pode apresentar erros, devido à alta temperatura utilizada e conseqüentemente queima do resíduo. O método avalia indiretamente o extrato seco pela medida da densidade relativa da amostra e do destilado alcoólico. O extrato seco total por litro é obtido mediante a fórmula de Tabarié. Material Balança analítica e picnômetro Procedimento – determine a densidade relativa a 20°C/20ºC diretamente da amostra de vinho. Determine a densidade relativa do destilado da amostra a 20°C/20°C (obtida na análise do grau alcoólico). Cálculo De = dvc - dd + 1,0000 De = densidade relativa a 20°C/20°C do vinho sem álcool dvc = densidade relativa a 20°C/20ºC do vinho corrigida em função da acidez volátil dd = densidade relativa a 20°C/20ºC do destilado alcoólico do vinho Nota: antes de fazer o cálculo acima, a densidade da amostra deve ser corrigida em função da acidez volátil segundo a fórmula: dvc = dv - (0,0000086 x A) A = acidez volátil, em meq/L dv = densidade relativa a 20/20ºC do vinho Como resultado de De (até a terceira casa decimal), faça a leitura do extrato seco total (g/L) correspondente na Tabela 5. Some a este resultado o valor que corresponde à quarta casa decimal da densidade, descrito na Tabela de Ajuste. IAL - 451 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital TABELA 5 – Teor do extrato seco total (g/L) a partir da densidade relativa a 20ºC da mostra sem álcool (De) Densidade até a 2a. casa decimal 3ª casa decimal da densidade 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Gramas de extrato por litro 1,00 0 2,6 5,1 7,7 10,3 12,9 15,4 18,0 20,6 23,2 1,01 25,8 28,4 31,0 33,6 36,2 38,8 41,3 43,9 46,5 49,1 1,02 51,7 54,3 56,9 59,5 62,1 64,7 67,3 69,9 72,5 75,1 1,03 77,7 80,3 82,9 85,5 88,1 90,7 93,3 95,9 98,5 101,1 1,04 103,7 106,3 109,9 111,6 114,2 116,8 119,4 122,0 124,6 127,2 1,05 129,8 132,4 135,0 137,6 140,3 142,9 145,5 148,1 150,7 153,3 1,06 155,9 158,6 161,2 163,8 166,4 169,0 171,6 174,3 176,9 179,5 1,07 182,1 184,8 187,4 190,0 192,6 195,2 197,8 200,5 203,1 205,8 1,08 208,4 211,0 213,6 216,2 218,9 221,5 224,1 226,8 229,4 232,0 1,09 234,7 237,3 239,9 242,5 245,2 247,8 250,4 253,1 255,7 258,4 1,10 261,0 263,6 266,3 268,9 271,5 274,2 276,8 279,5 282,1 284,8 1,11 287,4 290,0 292,7 295,3 298,0 300,6 303,3 305,9 308,6 311,2 1,12 313,9 316,5 319,2 321,8 324,5 327,1 329,8 332,4 335,1 337,8 1,13 340,4 343,0 345,7 348,3 351,0 353,7 356,3 359,0 361,6 364,3 1,14 366,9 369,6 372,3 375,0 377,6 380,3 382,9 385,6 388,3 390,9 1,15 393,6 396,2 398,9 401,6 404,3 406,9 409,6 412,3 415,0 417,6 1,16 420,3 423,0 425,7 428,3 431,0 433,7 436,4 439,0 441,7 444,4 1,17 447,1 449,8 452,4 455,2 457,8 460,5 463,2 465,9 468,6 471,3 1,18 473,9 476,6 479,3 482,0 484,4 487,4 490,1 492,8 495,5 498,2 1,19 500,9 503,5 506,2 508,9 511,6 514,3 517,0 519,7 522,4 525,1 1,20 527,8 - - - - - - - - - TABELA DE AJUSTE 4ª casa decimal da densidade Gramas de extrato/L 4ª casa decimal da densidade Gramas de extrato/L 4ª casa decimal da densidade Gramas de extrato/L 1 0,3 4 1,0 7 1,8 2 0,5 5 1,3 8 2,1 3 0,8 6 1,6 9 2,3 452 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Referência Bibliográfica OFFICE INTERNATIONAL DE LA VIGNE ET DU VIN. Recueil des methodes internationales d’analyse des vins et des môuts, Paris: O.I.V., 1990. 85-89. 239/IV Bebidas fermentadas – Açúcares redutores em glicose Este método volumétrico, aplicável a bebidas fermentadas, envolve a redução completa de um volume conhecido da solução de cobre (Solução de Fehling) por um volume de solução clariicada de açúcares redutores. Material Banho-maria, pipeta volumétrica de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, béquer de 150 mL, balão de fundo chato de 250 mL, chapa aquecedora, funil, papel de iltro e bureta de 10 ou 25 mL Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução saturada de acetato neutro de chumbo Soluções A e B de Fehling tituladas (Apêndice I) Oxalato de potássio ou de sódio, anidros Carvão ativo Procedimento –Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 50 mL da amostra para um béquer de 150 mL (para amostras com alto teor de açúcares, tome alíquotas menores). Neutralize exatamente com solução de hidróxido de sódio 0,1 M (o volume para a neutralização é calculado do resultado da acidez total). Evapore em banho-maria até eliminar todo o álcool. Resfrie e transira com água para um balão volumétrico de 100 mL. Se necessário, adicione 1 mL da solução de acetato neutro de chumbo o suiciente para clariicar. Pode ser usada uma pequena quantidade de carvão ativo, para amostras escuras, suiciente para clarear a amostra. Misture, complete o volume com água e iltre, desprezando os primeiros mL do iltrado. Adicione ao iltrado oxalato de potássio ou de sódio anidros para precipitar o excesso de chumbo. Misture e iltre, descartando os primeiros mL iltrados e proceda conforme o método 038/IV. Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3 ed. São Paulo: IMESP 1985. p. 364. IAL - 453 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 240/IV Bebidas fermentadas – Açúcares não redutores, em sacarose Material Banho-maria, chapa aquecedora, pipeta volumétrica de 25 ou 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, bureta de 10 ou 25 mL, balão de fundo chato de 250 mL, funil e papel de iltro. Reagentes Carbonato de sódio anidro Ácido clorídrico Solução saturada de acetato neutro de chumbo Soluções A e B de Fehling tituladas (Apêndice I) Carvão ativo Oxalato de potássio ou de sódio Procedimento – Pipete 25 ou 50 mL da amostra em um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 1 mL de ácido clorídrico e aqueça em banho-maria por 1 hora aproximadamente, para hidrólise ácida da sacarose. Se necessário, clariique a amostra e proceda conforme o método 240/IV. Continue a determinação dos açúcares não redutores, em sacarose, seguindo a técnica indicada em glicídios não redutores em sacarose (039/IV). Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 364. 241/IV Bebidas fermentadas – Sulfatos pelo método aproximativo de Marty Este método semi-quantitativo é aplicável a vinhos e outras bebidas fermentadas. O método estima o conteúdo de sulfatos, por intermédio do tratamento da amostra com quantidades conhecidas de cloreto de bário. O precipitado de sulfato de bário formado é então separado por iltração. No iltrado, os sulfatos ou o cloreto de bário residuais são precipitados com a adição de cloreto de bário e ácido sulfúrico, respectivamente. Material Banho-maria, papel de iltro, tubos de ensaio, pipeta volumétrica de 10 mL, pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL e funil. Reagentes Ácido clorídrico 454 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Licor de Marty: 2,804 g BaCl2.2H2O + 10 mL HCl, diluídos a 1000 mL com água Solução de cloreto de bário a 10% m/v Solução de ácido sulfúrico 0,5 M Procedimento – Pipete 10 mL da amostra em 3 tubos de ensaio (A, B e C) e aqueça em banho-maria fervente durante 30 minutos para eliminação do ácido acético. Adicione no tubo de ensaio A, 3,5 mL, no tubo B, 5 mL e no tubo C, 7,5 mL do Licor de Marty. Agite e leve ao banho-maria em ebulição durante 5 minutos, resfrie e iltre. Divida o líquido iltrado de cada tubo em 2 volumes iguais nos tubos: a e a’, b e b’, c e c’. Adicione num dos tubos 1mL da solução de cloreto de bário a 10% e, no outro, 1 mL de solução de ácido sulfúrico 0,5 M. Cálculo Observe os tubos de ensaio da seguinte forma: TUBOS a A a’ b B b’ c C c’ Turvo com H2SO4 Límpido com BaCl2 Límpido com H2SO4 Turvo com BaCl2 Turvo com H2SO4 Límpido comBaCl2 Límpido com H2SO4 Turvo com BaCl2 Turvo com H2SO4 Límpido com BaCl2 Límpido com H2SO4 Turvo com BaCl2 K2SO4 (g/L) Menos de 0,7 Mais de 0,7 Menos de 1,0 Mais de 1,0 Menos de 1,5 Mais de 1,5 Referências bibliográficas BRASIL, Leis,Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 364365. IAL - 455 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 242/IV Bebidas fermentadas – Extrato seco reduzido Este cálculo é aplicado para vinhos de mesa tintos e brancos. O extrato seco reduzido é obtido pelo valor do extrato seco total diminuído dos açúcares totais que excedem 1 g/L e do sulfato de potássio que exceda 1 g/L. Cálculo ES – (A – 1) – (S – 1) = extrato seco reduzido, em g/L ES = extrato seco total (g/L) A = açúcares totais, em g/L S = sulfatos totais em g/L (despreze esse termo, quando o teor de sulfatos for menor que 1 g/L) Referência Bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos, etc. Portaria nº 76 de 26 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez de 1986. Seção I, p. 18152-18173. 243/IV Vinhos – Relação entre álcool em peso e extrato seco reduzido Este cálculo é aplicado para vinhos de mesa, tintos e brancos. A relação álcool em peso/extrato seco reduzido é obtida pela divisão do valor de álcool em peso pelo teor de extrato seco reduzido. Cálculo G = graduação alcoólica da amostra de vinho de mesa, em % v/v ESR = extrato seco reduzido em g/L Referência Bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos, etc. Portaria nº 76 de 26 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez de 1986. Seção I, p. 18152-18173. 244/IV Bebidas fermentadas – Metanol Este método é realizado por cromatograia a gás utilizando padrão interno. É aplicável tanto à amostras de bebidas fermentadas como outros tipos de bebidas alcoólicas. Procedimento – Destile a amostra volumetricamente ou utilize a amostra destilada obtida 456 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas do procedimento de análise de grau alcoólico. Pese e adicione a solução de padrão interno e proceda como na determinação de metanol e componentes secundários, por cromatograia gasosa (228/IV). Cervejas A análise de cerveja inclui, entre outras, as determinações da densidade, grau alcoólico, acidez, teor de gás carbônico, extrato real, extrato aparente e extrato primitivo. 245/IV Cervejas – Preparação da amostra Todas as determinações são realizadas na amostra descarbonatada. Para remover o CO2 transira a amostra para um béquer de 500 mL e agite com um bastão ou banho de ultra-som. Mantenha a temperatura da cerveja a (20-25)ºC. Se necessário, remova algum material em suspensão iltrando a cerveja descarbonatda através de um iltro seco. 246/IV Cervejas – Álcool em volume a 20ºC Este método é utilizado para determinar o teor de álcool em volume em amostras de cerveja. A graduação alcoólica é obtida pela Tabela 6, de conversão da densidade relativa da amostra destilada. Material Conjunto de destilação, chapa de aquecimento, termômetro, balança analítica, balão volumétrico de 100 mL, funil de vidro e pérolas de vidro. Procedimento – Transira 100 mL da amostra para o conjunto de destilação; se necessário, adicione 1 ou 2 gotas de material antiespumante, para prevenir a formação de espuma durante a destilação. Recolha o destilado em um balão volumétrico de 100 mL, contendo 10 mL de água. Destile até aproximadamente ¾ do volume inicial, complete o volume com água e homogeneíze bem. Determine a densidade relativa desta solução a 20ºC pelo picnômetro ou pelo densímetro digital automático. Utilize a Tabela 1 para a conversão em porcentagem de álcool em volume. Referência Bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p.18152-18173. IAL - 457 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 247/IV Cervejas – Álcool em peso Este método é utilizado para determinar o teor de álcool em peso em amostras de cerveja. A graduação alcoólica é obtida a partir da conversão da densidade relativa da amostra destilada em porcentagem de álcool em peso, por meio de tabela. Procedimento – Converta o valor da densidade relativa obtida em 247/IV, em peso, utilizando a Tabela 6. TABELA 6 – Conversão da densidade relativa a 20ºC/20ºC em porcentagem de álcool em peso Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % 1,00000 0,00 0,99777 1,20 0,99561 2,40 0,99354 3,60 0,99991 0,05 0,99768 1,25 0,99553 2,45 0,99346 3,65 0,99981 0,10 0,99759 1,30 0,99544 2,50 0,99337 3,70 0,99972 0,15 0,99750 1,35 0,99535 2,55 0,99329 3,75 0,99963 0,20 0,99741 1,40 0,99526 2,60 0,99320 3,80 0,99953 0,25 0,99732 1,45 0,99517 2,65 0,99312 3,85 0,99944 0,30 0,99723 1,50 0,99509 2,70 0,99303 3,90 0,99935 0,35 0,99714 1,55 0,99500 2,75 0,99295 3,95 0,99925 0,40 0,99705 1,60 0,99491 2,80 0,99286 4,00 0,99916 0,45 0,99695 1,65 0,99482 2,85 0,99278 4,05 0,99907 0,50 0,99686 1,70 0,99473 2,90 0,99270 4,10 0,99897 0,55 0,99676 1,75 0,99464 2,95 0,99262 4,15 0,99888 0,60 0,99668 1,80 0,99456 3,00 0,99253 4,20 0,99879 0,65 0,99659 1,85 0,99447 3,05 0,99245 4,25 0,99869 0,70 0,99650 1,90 0,99439 3,10 0,99237 4,30 0,99860 0,75 0,99641 1,95 0,99430 3,15 0,99229 4,35 0,99851 0,80 0,99632 2,00 0,99422 3,20 0,99221 4,40 0,99841 0,85 0,99623 2,05 0,99413 3,25 0,99212 4,45 0,99832 0,90 0,99614 2,10 0,99405 3,30 0,99204 4,50 0,99823 0,95 0,99606 2,15 0,99396 3,35 0,99196 4,55 0,99813 1,00 0,99597 2,20 0,99388 3,40 0,99188 4,60 0,99804 1,05 0,99588 2,25 0,99379 3,45 0,99179 4,65 0,99795 1,10 0,99579 2,30 0,99371 3,50 0,99171 4,70 0,99786 1,15 0,99570 2,35 0,99362 3,55 0,99163 4,75 458 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % Densidade Relativa Álcool % 0,99155 4,80 0,99018 5,65 0,98884 6,50 0,98762 7,30 0,99147 4,85 0,99010 5,70 0,98877 6,55 0,98755 7,35 0,99138 4,90 0,99002 5,75 0,98869 6,60 0,98747 7,40 0,99130 4,95 0,98994 5,80 0,98861 6,65 0,98740 7,45 0,99122 5,00 0,98986 5,85 0,98854 6,70 0,98732 7,50 0,99114 5,05 0,98978 5,90 0,98846 6,75 0,98725 7,55 0,99106 5,10 0,98970 5,95 0,98838 6,80 0,98717 7,60 0,99098 5,15 0,98962 6,00 0,98830 6,85 0,98710 7,65 0,99090 5,20 0,98954 6,05 0,98823 6,90 0,98702 7,70 0,99082 5,25 0,98946 6,10 0,98815 6,95 0,98695 7,75 0,99074 5,30 0,98938 6,15 0,98807 7,00 0,98687 7,80 0,99066 5,35 0,98931 6,20 0,98800 7,05 0,98680 7,85 0,99058 5,40 0,98923 6,25 0,98792 7,10 0,98672 7,90 0,99050 5,45 0,98915 6,30 0,98785 7,15 0,98664 7,95 0,99042 5,50 0,98908 6,35 0,98777 7,20 0,98657 8,00 0,99034 5,55 0,98900 6,40 0,98770 7,25 - - 0,99026 5,60 0,98892 6,45 - - - - Referências Bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 368-370. 248/IV Cervejas – Extrato real pelo método 1 A determinação do extrato real por este método está baseada na pesagem do resíduo seco de um certo volume de amostra submetido à evaporação. Material Balança analítica, banho-maria, estufa ou estufa a vácuo, cápsula de níquel de 7 cm de diâmetro e 2 cm de altura e pipeta volumétrica de 20 mL Procedimento – Transira, com auxílio de uma pipeta, 20 mL de amostra descarbonatada, para uma cápsula de níquel previamente aquecida em estufa a (100 ± 5)ºC por 1 hora, IAL - 459 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital resfriada em dessecador e pesada. Aqueça em banho-maria até a secagem. Leve à estufa a (100 ± 5)ºC por 1 hora, resfrie à temperatura ambiente em dessecador e pese. Cálculo 100 x P = extrato real % m/v V P = massa do resíduo, em g V = volume da amostra, em mL Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 371-372. 249/IV Cervejas – Extrato real pelo método 2 Nste método, a porcentagem de extrato real é obtida pela conversão do valor da densidade relativa do resíduo de destilação, com auxílio da Tabela 7. Material Balança analítica, destilador, picnômetro, balão volumétrico de 100 mL, balão de destilação de 500 mL e funil de vidro Procedimento – Este ensaio pode ser realizado utilizando-se o resíduo da destilação de 100 mL de amostra devidamente pesado. Transira o resíduo para um balão volumétrico de 100 mL com água e acerte para a mesma massa inicial. Determine a densidade relativa a 20ºC /20ºC utilizando picnômetro ou densímetro automático digital. Converta o valor da densidade relativa para extrato real utilizando a Tabela 7. 460 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas TABELA 7 – Conversão da densidade relativa a 20ºC/20 ºC em porcentagem de extrato Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução 1,00000 0,00 1,00605 1,55 1,01213 3,10 1,00020 0,05 1,00624 1,60 1,01233 3,15 1,00039 0,10 1,00644 1,65 1,01253 3,20 1,00059 0,15 1,00663 1,70 1,01273 3,25 1,00078 0,20 1,00683 1,75 1,01292 3,30 1,00098 0,25 1,00702 1,80 1,01312 3,35 1,00117 0,30 1,00722 1,85 1,01332 3,40 1,00137 0,35 1,00742 1,90 1,01352 3,45 1,00156 0,40 1,00761 1,95 1,01371 3,50 1,00176 0,45 1,00781 2,00 1,01391 3,55 1,00195 0,50 1,00799 2,05 1,01411 3,60 1,00214 0,55 1,00820 2,10 1,01431 3,65 1,00234 0,60 1,00840 2,15 1,00451 3,70 1,00254 0,65 1,00859 2,20 1,01471 3,75 1,00273 0,70 1,00879 2,25 1,01490 3,80 1,00293 0,75 1,00897 2,30 1,01510 3,85 1,00312 0,80 1,00918 2,35 1,01530 3,90 1,00332 0,85 1,00938 2,40 1,01550 3,95 1,00351 0,90 1,00957 2,45 1,01570 4,00 1,00371 0,95 1,00977 2,50 1,01590 4,05 1,00390 1,00 1,00997 2,55 1,01609 4,10 1,00410 1,05 1,01016 2,60 1,01629 4,15 1,00429 1,10 1,01036 2,65 1,01649 4,20 1,00449 1,15 1,01056 2,70 1,01669 4,25 1,00468 1,20 1,01075 2,75 1,01689 4,30 1,00488 1,25 1,01095 2,80 1,01709 4,35 1,00507 1,30 1,01115 2,85 1,01729 4,40 1,00527 1,35 1,01134 2,90 1,01749 4,45 1,00546 1,40 1,01154 2,95 1,01769 4,50 1,00566 1,45 1,01174 3,00 1,01789 4,55 1,00585 1,50 1,01194 3,05 1,01808 4,60 IAL - 461 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução 1,01828 4,65 1,02511 6,35 1,03201 8,05 1,01848 4,70 1,02531 6,40 1,03221 8,10 1,01868 4,75 1,02551 6,45 1,03242 8,15 1,01888 4,80 1,02571 6,50 1,03262 8,20 1,01908 4,85 1,02592 6,55 1,03263 8,25 1,01928 4,90 1,02612 6,60 1,03283 8,30 1,01948 4,95 1,02632 6,65 1,03324 8,35 1,01969 5,00 1,02652 6,70 1,03344 8,40 1,01988 5,05 1,02672 6,75 1,03365 8,45 1,02008 5,10 1,02693 6,80 1,03385 8,50 1,02028 5,15 1,02713 6,85 1,03406 8,55 1,02048 5,20 1,02733 6,90 1,03426 8,60 1,02068 5,25 1,02753 6,95 1,03447 8,65 1,02088 5,30 1,02774 7,00 1,03467 8,70 1,02108 5,35 1,02794 7,05 1,03488 8,75 1,02128 5,40 1,02814 7,10 1,03503 8,80 1,02148 5,45 1,02835 7,15 1,03529 8,85 1,02169 5,50 1,02855 7,20 1,03549 8,90 1,02189 5,55 1,02875 7,25 1,03570 8,95 1,02209 5,60 1,02896 7,30 1,03591 9,00 1,02229 5,65 1,02916 7,35 1,03611 9,05 1,02249 5,70 1,02936 7,40 1,03632 9,10 1,02269 5,75 1,02956 7,45 1,03652 9,15 1,02289 5,80 1,02977 7,50 1,03673 9,20 1,02309 5,85 1,02997 7,55 1,03693 9,25 1,02329 5,90 1,03018 7,60 1,03714 9,30 1,02349 5,95 1,03038 7,65 1,03735 9,35 1,02370 6,00 1,03058 7,70 1,03755 9,40 1,02390 6,05 1,03079 7,75 1,03776 9,45 1,02410 6,10 1,03099 7,80 1,03796 9,50 1,02430 6,15 1,03119 7,85 1,03817 9,55 1,02450 6,20 1,03140 7,90 1,03838 9,60 1,02470 6,25 1,03160 7,95 1,03858 9,65 1,02490 6,30 1,03181 8,00 1,03879 9,70 462 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20/20ºC g Extrato em 100 g de solução Densidade Relativa a 20ºC/20ºC g Extrato em 100 g de solução 1,03909 9,75 1,03941 9,85 1,03982 9,95 1,03929 9,80 1,03962 9,90 1,04003 10,00 Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 945.09) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 27. p. 4. BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 3 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 372 250/IV Cervejas – Extrato aparente Este método é utilizado para determinar o extrato aparente em amostras de cerveja. Esta determinação baseia-se na conversão do valor de densidade relativa diretamente da amostra em % de extrato aparente, por intermédio da Tabela 7. Material Balança analítica, picnômetro, frasco Erlenmeyer de 100 mL e funil de vidro Procedimento iltre aproximadamente 100 mL de amostra descarbonatada e determine a densidade relativa a 20/20ºC do iltrado. Converta o valor da densidade relativa em extrato aparente utilizando a Tabela 7. Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 945.09) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 27. p. 4. BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 375. IAL - 463 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 251/IV Cervejas – Extrato primitivo ou original Este método é utilizado para determinar o extrato primitivo em amostras de cerveja. O extrato primitivo é obtido por meio de cálculo envolvendo os valores de teor alcoólico e extrato real segundo a fórmula de Balling. Cálculo Calcule o extrato primitivo segundo a seguinte fórmula e considere o resultado até a primeira casa decimal: P =% de álcool em peso Er =% de extrato real Referências Bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria nº 76 de 27 de nov de 1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03 de dez 1986. Seção I, p. 18152-18173. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 935.20) Gaithersburg: A.O.A.C., 2005, Revision 1, 2006, chapter 27. p. 4. Bebidas alcoólicas por mistura Estão incluídos neste ítem: licor, bebida alcóolica mista ou coquetel, batida, aperitivos e amargos (bitter, fernet, ferroquina) e aguardente composta. A análise destes produtos inclui as seguintes determinações: álcool em volume, densidade, resíduo seco, glicídios totais em sacarose, acidez total, cinzas, componentes secundáros, metanol, pesquisa de corantes orgânicos artiiciais, cobre e eventualmente contaminantes inorgânicos. Essas determinações já estão descritas nos métodos de análise para bebidas alcóolicas destiladas e de determinações gerais. Colaboradores Letícia Araújo Farah Nagato; Miriam Solange Fernandes Caruso; Maria Cristina Duran; Maria de Fátima Henriques Carvalho e Cristiane Bonaldi Cano 464 - IAL Capítulo IX - Bebidas Alcoólicas CAPÍTULO X BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS IAL - 465 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 466 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas X BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS E ste capítulo descreve os métodos para análise de refrigerantes, refrescos, bebidas dietéticas e de baixa caloria, preparados sólidos para refrescos, xaropes, repositores hidroeletrolíticos e energéticos. As determinações realizadas para refrigerantes, refrescos e bebidas dietéticas e de baixa caloria são: dióxido de carbono (em refrigerantes), acidez total, pH, densidade (011/IV), resíduo seco, glicídios totais em sacarose, cinzas (018/IV), corantes orgânicos artiiciais, cafeína, tanino, quinina, sacarina, ciclamato e outros edulcorantes, ácido benzóico e outros aditivos. No caso de refrigerantes, dose primeiramente o teor de CO2 conforme 252//IV e descarbonate a amostra com agitador magnético ou ultra-som, antes de qualquer determinação. Os preparados sólidos para refrescos incluem as seguintes determinações: substâncias voláteis a 105ºC (012/IV), acidez total, glicídios totais em sacarose, cinzas (018/IV), corantes orgânicos artiiciais, cafeína, sacarina, ciclamato e outros aditivos. No caso dos xaropes, devem ser realizadas as seguintes determinações: graus Brix, acidez total, pH, glicídios redutores em glicose, glicídios não redutores em sacarose, cinzas (018/IV) e corantes orgânicos artiiciais. Os repositores hidroeletrolíticos e energéticos incluem as seguintes determinações: resíduo seco a 105ºC, acidez titulável, pH, glicídios redutores em glicose, glicídios não redutores em sacarose, cinzas (018/IV), corantes orgânicos artiiciais e outros aditivos, minerais (cap. XXIII) e vitaminas (cap. XIX). IAL - 467 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 252/IV Determinação de dióxido de carbono em refrigerantes Este método é aplicável à amostras de bebidas gaseiicadas e baseia-se na medida da pressão gasosa versus a temperatura. Material Termômetro, aparelho dosador de volume de CO2 com adaptador, manômetro com agulha de aço inoxidável ou equipamento dosador de gás carbônico de leitura digital direta. Procedimento – Calibre o manômetro conforme as instruções do fabricante. Coloque o adaptador na garrafa ajustando-o devidamente sobre a tampa metálica, a im de evitar vazamento. Regule o anel perfurado pelo qual passará a agulha de aço inoxidável, de modo a permitir sua passagem sem muita resistência ou folga. Golpeie o manômetro fazendo com que a agulha de aço inoxidável perfure e atravesse a tampa metálica. Abra a válvula de fuga ou escape, localizada na parte inferior do manômetro, até que a agulha retorne ao zero, fechando-a imediatamente. Agite vigorosamente com movimentos verticais até que não haja mais variação do valor indicado no manômetro. Normalmente, cerca de 6 a 10 movimentos são suicientes para essa operação. Faça a leitura da pressão. Retire a tampa metálica e determine a temperatura da bebida. Com os valores de pressão e temperatura determinados, use a tabela fornecida pelo fabricante do manômetro e determine o volume do gás na bebida testada. Com o equipamento dosador de gás carbônico, leia diretamente a porcentagem em volume de gás carbônico. Referência bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria no 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3-12-86. Seção I, p. 18152-18173. Métodos analíticos. 253/IV Determinação da acidez total Material pHmetro, agitador magnético, barra magnética, balança analítica, béquer de 250 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, bureta de 10 ou 25 mL, proveta de 100 mL. Reagentes Soluções-tampão pH = 4,0 e 7,0 Solução de hidróxido de sódio 0,1 M 468 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas Procedimento – Calibre o pHmetro usando as duas soluções-tampão, conforme as instruções do fabricante. Para refrigerantes e refrescos, pipete 10 mL da amostra em um béquer e adicione 100 mL de água. Mergulhe o eletrodo na solução e titule com hidróxido de sódio 0,1 M até pH 8,2-8,4. Para amostras sólidas, pese aproximadamente 1 g e para xaropes, cerca de 5 g. Cálculo V = volume gasto de hidróxido de sódio 0,1 M f = fator de correção do hidróxido de sódio 0,1 M M = molaridade da solução de hidróxido de sódio 0,1 M A = volume da amostra em mL ou massa em g Nota: para expressar o resultado em % do ácido orgânico correspondente, proceda como descrito no método de determinação de ácidos orgânicos (312IV). Referências Bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria no 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 3-12-86. Seção I, p. 18152-18173. Métodos analíticos. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, p. 332. 1985. 254/IV Determinação de cafeína por método espectrofotométrico Este método é aplicável a refrigerantes e refrescos que contenham cafeína (trimetilxantina), natural ou adicionada, e baseia-se na extração com clorofórmio em meio alcalino e determinação por espectrofotometria na região do ultravioleta. Material Espectrofotômetro UV/VIS, cubeta de quartzo de 10 mm, balança analítica, algodão hidróilo, funil de separação de 250 mL, béquer de 100 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5, 10 e 20 mL, proveta de 50 mL e balões volumétricos de 50 e 100 mL. IAL - 469 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Cafeína com pureza mínima de 99% Clorofórmio, grau espectrofotométrico Solução redutora – Pese 5 g de sulito de sódio e 5 g de tiocianato de potássio, dissolva em água e dilua a 10 mL em balão volumétrico. Solução de hidróxido de sódio a 25% m/v Solução de permanganato de potássio a 1,5% m/v Solução de ácido fosfórico -- Dilua 15 mL de ácido fosfórico (d=1,69g/cm3) em 85 mL de água Sulfato de sódio anidro Solução-padrão de cafeína – Pese 100 mg de cafeína, dissolva e dilua em clorofórmio num balão volumétrico de 100 mL. Pipete 10 mL da solução-estoque de cafeína e dilua a 100 mL com clorofórmio. Esta solução contém 0,1 mg de cafeína por mL de clorofórmio. Procedimento – Pipete de 20 a 50 mL da amostra descarbonatada para um funil de separação. Junte 10 mL da solução de permanganato de potássio a 1,5 % e agite. Após 5 minutos, junte 20 mL da solução redutora com agitação contínua. Adicione 2 mL da solução de ácido fosfórico e agite. Adicione 2 mL da solução de hidróxido de sódio a 25 % e agite. Extraia a cafeína com três porções de 30 mL de clorofórmio. Após a separação, retire a camada inferior e iltre-a em sulfato de sódio anidro e algodão e recolha os iltrados em um mesmo balão volumétrico de 100 mL. Lave a haste do funil de separação e o iltro com porções de 2 mL de clorofórmio, após cada extração. Complete o volume com clorofórmio. Determine a absorbância a 276 nm, usando clorofórmio como branco. Para amostras com alto teor de cafeína, faça uma diluição pipetando uma alíquota de 10 mL para balão volumétrico de 50 mL, complete o volume com clorofórmio e faça a leitura da absorbância a 276 nm. Curva-padrão – Pipete 1, 2, 3, 4, 5 e 6 mL da solução-padrão de cafeína para balões volumétricos de 50 mL e complete o volume com clorofórmio. Estas soluções contêm, respectivamente, 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 e 1,2 mg de cafeína por 100 mL de clorofórmio. Determine a absorbância dessas soluções a 276 nm, usando clorofórmio como branco. Trace a curvapadrão, registrando os valores de absorbância nas ordenadas e as concentrações de cafeína em mg/100 mL de clorofórmio nas abcissas. 470 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas Cálculo Calcule a concentração de cafeína na amostra usando a curva-padrão. C = concentração de cafeína na amostra correspondente à leitura da curva-padrão A = volume da amostra, em mL f = fator de diluição para o caso de amostra com alto teor de cafeína. Referência Bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 962.13) Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 29. p. 3. 255/IV Determinação de tanino Este método é aplicável a refrigerantes e refrescos e envolve a redução do reagente Folin-Dennis, em meio básico, pelo tanino presente na amostra, produzindo uma coloração azul intensa que é medida na região do visível. O resultado é expresso em ácido tânico. Material Espectrofotômetro UV/VIS, cubeta de 10 mm, balança analítica, lã de vidro, chapa de aquecimento, balões volumétricos de 100, 500 e 1000 mL, balão de 1000 mL com junta esmerilhada, condensador de reluxo, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5 e 10 mL e proveta de 50 mL. Reagentes Reagente Folin-Dennis – Adicione 100 g de tungstato de sódio hidratado, 20 g de ácido fosfomolíbdico e 50 mL de ácido fosfórico em 750 mL de água. Reluxe por 2 horas, esfrie e dilua para 1000 mL em um balão volumétrico. Solução saturada de carbonato de sódio – Pese 35 g de carbonato de sódio anidro e dissolva em 100 mL de água a (70-80)ºC, resfrie por uma noite e semeie a solução super-saturada com cristal de carbonato de sódio decahidratado (Na2CO3.10H2O). Após a cristalização, iltre através de lã de vidro. IAL - 471 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão recém-preparada de ácido tânico – Dissolva 100 mg de ácido tânico em um balão volumétrico de 1000 mL com água. Esta solução tem uma concentração de 0,1 mg de ácido tânico por mL. Procedimento – Pipete 5 mL da amostra para um balão volumétrico de 100 mL contendo 75 mL de água. Adicione 5 mL do reagente Folin-Dennis,10 mL da solução saturada de carbonato de sódio e complete com água. A solução deve ser iltrada no caso de turvação. Agite bem e faça a leitura a 760 nm após 30 minutos, usando um branco preparado da mesma forma com água em lugar da amostra. Preparação da curva-padrão – Pipete alíquotas de 1 a 10 mL de solução-padrão de ácido tânico em balões volumétricos de 100 mL, contendo 75 mL de água. Adicione 5 mL do reagente Folin-Dennis, 10 mL da solução saturada de carbonato de sódio e complete com água. Agite bem e faça a leitura após 30 minutos a 760 nm, contra o branco. Trace a curvapadrão, registrando os valores de absorbância nas ordenadas e as concentrações de ácido tânico em mg/100 mL, nas abcissas. Cálculo C = concentração de ácido tânico na amostra correspondente à leitura da curva-padrão. A = volume da amostra em mL. Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 952.03) Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 29. p. 16-17. BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n° 76 de 27-11-1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03-12-1986. Seção I, p.18152-18173. Métodos Analíticos. 472 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas 256/IV Determinação de quinina pelo método espetrofotométrico Baeia-se na determinação espectrofotométrica da quinina, em meio ácido, na região do ultravioleta e é aplicável à análise de água tônica Material Espectrofotômetro UV/VIS, cubeta de quartzo de 10 mm, banho-maria, balão volumétrico de 100 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5 e 25 mL. Reagentes Solução de ácido clorídrico 0,1 M Solução de hidróxido de sódio 0,5 M Solução-padrão de cloridrato de quinina – Dissolva 100 mg de cloridrato de quinina anidro em 10 mL de HCl 0,1 M ou 100 mg de cloridrato de quinina em 20 mL de NaOH a 0,5 M e complete o volume com água a 100 mL (1 mg de cloridrato de quinina equivale a 0,817 mg de quinina anidra). Procedimento – Pipete 25 mL da amostra descarbonatada em balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução de HCI 0,1 M. Determine a absorbância da amostra a 347,5 nm, usando a solução de HCI 0,1 M como branco. Preparação da curva-padrão – Pipete alíquotas de 1, 2, 3, 4 e 5 mL da solução-padrão em balões volumétricos de 100 mL. Complete os volumes com solução de HCl 0,1 M. Leia as absorbâncias dos padrões a 347,5 nm, usando solução de HCl 0,1 M como branco. Construa um gráico da absorbância versus concentração de cloridrato de quinina em mg/100 mL. Cálculo C = concentração de cloridrato de quinina na amostra correspondente à leitura na curvapadrão A = volume da amostra em mL. IAL - 473 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência Bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n° 76 de 27-11-1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03-12-1986.Seção I, p.18152-18173. Métodos Analíticos. 257/IV Determinação de acessulfame-K, sacarina e aspartame, ácidos benzóico e sórbico e cafeína por cromatografia líquida de alta eficiência Aplicável às amostras de refrigerante dietético ou de baixa caloria. Material Cromatógrafo a líquido de alta eiciência (CLAE) equipado com detector UV/VIS, coluna ODS em fase reversa (tamanho de 15 x 4,5 cm com 5 μ de partículas), injetor manual com capacidade de 20 μL (ou automático), software para controlar o equipamento e efetuar a análise dos dados, equipamento para obtenção de água ultra-pura (tipo Milli-Q), banho de ultra-som, membrana de iltração Hv com diâmetro de 47 cm com porosidade de 0,45 μ, unidade iltrante do tipo Millex com poro de 0,45 μ, potenciômetro com escala graduada em ≤ 0,1 unidades de pH, agitador magnético, barra magnética, balança analítica, balões volumétricos de 10, 25, 50 e 100 mL, funil, bastão de vidro, conjunto de iltração de solventes, seringa de 50 μL, vials de 1 e 2 mL, pipetas volumétricas de 5 e 10 mL, frascos de 1000 mL para armazenamento e descarte de fase móvel e béqueres de 100, 500 mL e 1000 mL. Reagentes Sacarina com pureza miníma de 95% Acessulfame-K com pureza miníma de 95% Cafeína com pureza miníma de 95% Ácido benzóico com pureza miníma de 95% Ácido sórbico com pureza miníma de 95% Aspartame com pureza miníma de 95% Ácido fosfórico Fosfato dibásico de potássio Acetonitrila grau cromatográico Metanol grau cromatográico Soluções-padrão estoque a 0,1 g/100 mL – Para os padrões de sacarina, acessulfame-K, cafeína e ácido sórbico, pese 0,1 g , dissolva com água ultra-pura e complete o volume de 100 mL com o mesmo solvente. Para o aspartame e o ácido benzóico, pese 0,1 g, dissolva em 40 mL de metanol e complete o volume de 100 mL com água ultra-pura. 474 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas Solução-padrão de trabalho – Pipete 5 mL de cada uma das soluções-padrão estoque para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água ultra-pura. Filtre em unidade iltrante (tipo Millex com poros 0,45 μ) em vials de 2 mL. Desgaseiique no ultrasom. Solução-tampão – Dissolva fosfato dibásico de potássio em 1 litro de água ultra-pura (Milli-Q) na concentração de 0,03 M e acerte o pH para 5 com uma solução a 10% de ácido fosfórico. Quando o refrigerante contiver cafeína e ácido benzóico, acerte o pH desta solução para 4,8, para uma melhor separação na coluna cromatográica. Fase móvel – Misture 900 mL de solução-tampão de fosfato 0,03 M com 100 mL de acetonitrila. Utilize o agitador magnético para uma melhor homogeinização. Filtre a fase móvel em membrana Hv. Procedimento – Ajuste o cromatógrafo às condições do método conforme as instruções do fabricante, passando a fase móvel primeiramente. Vazão de luxo de 1,0 mL/min; temperatura ambiente, volume de injeção 20 μL, comprimento de onda: λ 230 nm (para o aspartame utilize λ 214 nm). Injete a solução-padrão e as soluções diluídas da amostra, no mínimo, em triplicata. Quantiique as áreas dos picos dos analitos. Notas: Alternativamente à quantiicação por padronização externa, pode-se usar também a curva-padrão. Os padrões podem ser injetados numa única solução, ou separadamente, conforme a melhor conveniência. Cálculo Aa = área do pico do analito da amostra Cp = concentração do analito na solução dos padrões Ap = área do pico do analito na solução dos padrões Fd = fator de diluição da amostra Referências bibliográficas TYLER, T. A. Liquid chromatographic determination of sodium saccharin, caffeine, aspartame and sodium benzoate in cola beverages. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 67, n. 4, p. 745-747, 1984. IAL - 475 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital LAWRENCE, J. F.; CHARBONNEAU, C. F. Determination of seven artiicial sweeteners in diet food preparations by reverse-phase liquid chromatography with absorbance detection. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 71, n. 5, p. 934-937, 1988. NAGATO, L. A. F.; CANO, C. B.; BARSOTTI, R. C. F. Efeito do pH na análise simultânea de edulcorantes, conservadores e cafeína por cromatograia líquida em refrigerantes dietéticos e de baixa caloria. Anais do IV Brazilian Meeting on Chemistry of Food and Beverages, Campinas, p. 56, 2002. 258/IV Determinação de ciclohexilsulfamato (sais de ciclamato) em bebidas dietéticas e de baixa caloria pelo método gravimétrico O método é aplicável às soluções aquosas e bebidas carbonatadas límpidas e baseia-se na formação de precipitado de sulfato de bário, que é separado, incinerado e quantiicado por gravimetria. Material Estufa, mula, bomba de vácuo, banho-maria, cadinho de Gooch, balança analítica, dessecador, ibra de óxido de alumínio ou papel de ibra de vidro, alonga de vidro para conexão do cadinho de Gooch, béquer de 250 mL, kitassato de 500 mL, pipeta volumétrica de 100 mL, vidro de relógio e pipeta graduada de 10 mL e bastão de vidro. Reagentes Ácido clorídrico Solução de cloreto de bário a 10% m/v Solução de nitrito de sódio a 10% m/v Procedimento – Pipete 100 mL ou um volume de amostra que contenha de 10 a 300 mg de ciclamato de sódio ou de cálcio. Adicione 10 mL de HCl e 10 mL de solução de BaCl2 a 10%. Agite e deixe em repouso por 30 minutos. Se houver formação de precipitado, iltre e lave com água. Ao iltrado ou à solução límpida, adicione 10 mL de solução de NaNO2 a 10%. Agite, cubra com um vidro de relógio e aqueça em banho-maria por pelo menos duas horas. Agite em intervalos de meia hora. Remova do banho-maria e deixe em repouso por uma noite. Filtre o precipitado em cadinho de Gooch, contendo ibra de óxido de alumínio ou papel de ibra de vidro, previamente tarado em mula, lave e seque em estufa a 100ºC. Incinere em mula a 550ºC. Resfrie em dessecador, pese o precipitado de sulfato de bário e determine a quantidade de ciclamato presente na amostra. 476 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas Cálculo N = massa de sulfato de bário, em g A = volume da amostra em mL Calcule o teor de ciclamato conforme os valores a seguir: Massa do sulfato de bário (%) x 0,8621 = ciclamato de sódio por cento m/v Massa do sulfato de bário (%) x 0,9266 = ciclamato de cálcio.2 H2O por cento m/v Massa do sulfato de bário (%) x 0,7679 = ácido ciclâmico por cento m/v Referência Bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 957.10) Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 29. p. 44. 259/IV Determinação do resíduo seco pelo método gravimétrico Procedimento – Pipete 10 mL da amostra homogeneizada e descarbonatada, em cápsula tarada. Leve a cápsula ao banho-maria fervente e evapore até a secura. Coloque em estufa a 105 ºC, por meia hora aproximadamente, e proceda como descrito no método 015/IV. Referências bibliográficas BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n° 76 de 27-11-1986, do Ministério da Agricultura. Diário Oicial, Brasília, 03-12-1986.Seção I, p.18152-18173. Métodos Analíticos. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 333. 260/IV Determinação de glicídios redutores em glicose Procedimento – Pipete 10 mL da amostra homogeneizada num balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água e proceda conforme 038/IV. IAL - 477 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 333. 261/IV Determinação de glicídios não redutores em sacarose Procedimento – Pipete 10 mL da amostra homogeneizada e descarbonatada em um balão volumétrico de 100 mL. Para amostras de pós para refrescos e xaropes artiiciais, pese de 1 a 3 g, conforme a concentração de açúcares na amostra. Coloque o balão com a amostra em banho-maria por 1 hora e proceda conforme 039/IV. Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 334. 262/IV Corantes orgânicos artificiais – Análise qualitativa Material Banho-maria, capela de segurança para solventes, lã branca pura (20 cm), régua de 20 cm, papel Whatman nº 1 (20 x 20) cm, béqueres de 25 e 100 mL, bastão de vidro, capilar de vidro e cuba de vidro (21 x 21 x 10) cm. Reagentes Ácido clorídrico Hidróxido de amônio Padrões de corantes orgânicos artiiciais a 0,1 % m/v Procedimento – Pipete 10 mL ou pese 10 g da amostra homogeneizada em um béquer de 100 mL; no caso de amostras em pó, dissolva 10 g em 20 mL de água, adicione o pedaço de lã pura e misture bem. Acrescente 0,5 mL de ácido clorídrico e coloque o béquer em banhomaria fervente. Quando o corante artiicial da amostra icar impregnado na lã, retire e lave-a com água corrente. Coloque-a em um béquer de 25 mL e adicione 0,5 mL de hidróxido de 478 - IAL Capítulo X - Bebidas Não Alcoólicas amônio. Em seguida, adicione 10 mL de água e coloque em banho-maria até que a solução adquira uma coloração igual à da lã. Retire a lã e reduza o líquido à metade por evaporação. Aplique, com capilar, as soluções dos padrões de corantes e a solução da amostra assim obtida, no papel de cromatograia, e coloque-o na cuba com o solvente mais adequado para a separação dos corantes, seguindo o procedimento descrito no método 086/IV. Compare o aparecimento das manchas da amostra quanto à cor e aos fatores de resolução (Rf ) com os respectivos padrões de corantes orgânicos artiiciais. Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 406. Colaboradores Cristiane Bonaldi Cano, Leticia Araujo Farah Nagato, Miriam Solange Fernandes Caruso e Maria Cristina Duran IAL - 479 Capítulo XI - Cacau e Chocolate CAPÍTULO XI CACAU E CHOCOLATE IAL - 481 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 482 - IAL Capítulo XI - Cacau e Chocolate XI CACAU E CHOCOLATE Cacau O s principais componentes do cacau são: açúcares, amido, lipídios (manteiga de cacau), protídios, teobromina, cafeína, taninos, corantes naturais (antocianinas) e substâncias inorgânicas (sais de potássio e fósforo). As principais determinações a serem realizadas no cacau são: umidade (012/IV), cinzas (018/IV), glicidios redutores em glicose (038/IV), glicídios não-redutores em sacarose (039/IV), lipídios (032/IV), protídios (036/IV) ou (037/IV), ibra alimentar (045/IV e 046/IV) e teobromina (101/IV). Chocolate e produtos à base de chocolate Chocolates são produtos à base de cacau contendo açúcar, aromatizantes, estabilizantes e conservadores. As determinações mais usuais são: umidade (012/IV), cinzas (018/IV), glicídios redutores em glicose (038/IV), glicídios não-redutores em sacarose (039/IV), ibra alimentar (045/IV e 046/IV), lipídios (032/IV) e protídios (036/IV ou 037/IV), além da análise cromatográica em fase gasosa dos lipídios extraídos, para a pesquisa de gorduras estranhas à manteiga de cacau. Nesta classe de produtos estão incluídos os bombons, pós ou misturas achocolatadas e doces variados, cujo principal componente é o cacau. As determinações mais usuais incluem aquelas relacionadas para os chocolates, além da pesquisa de corantes artiiciais (051/IV) que podem estar presentes. 263/IV Determinação de lipídios com hidrólise prévia Este método refere-se à determinação dos lipídios em produtos à base de chocolate com alto teor de sacarose, tais como: chocolate em pó, mistura achocolatada e bombons. O princípio do método baseia-se na hidrólise prévia da amostra, extração e IAL - 483 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital quantiicação do resíduo obtido após a remoção do solvente. Material Chapa elétrica, balança analítica, estufa, dessecador, frasco Erlenmeyer de 250 mL com boca esmerilhada 24/40, balão de fundo chato de 250 mL com boca esmerilhada 24/40, vidro de relógio, funil, pérolas de vidro ou cacos de porcelana, bastão de vidro, extrator Soxhlet, condensador de reluxo longo com extremidade inferior 24/40, condensador de reluxo de bolas adaptável ao Soxhlet, cartucho de extração, papel de iltro e algodão. Reagentes Solução de ácido clorídrico 3 M Éter de petróleo Areia diatomácia Procedimento – Pese 10 g de amostra previamente homogeneizada. Transira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL com boca esmerilhada 24/40. Adicione 100 mL da solução de ácido clorídrico 3 M e algumas pérolas de vidro ou cacos de porcelana. Leve a reluxo por cerca de uma hora sob aquecimento. Resfrie e adicione (1-2) g de areia diatomácia (auxiliar de iltração). Filtre em papel de iltro duplo, previamente umedecido. Lave o resíduo com água fria até a obtenção de um iltrado neutro. Observe se o iltrado não apresenta vestígios de óleos ou gorduras. Coloque o papel de iltro duplo contendo o resíduo sobre o vidro de relógio e leve à estufa a 50ºC por uma hora. Transira para um cartucho de extração, cobrindo-o com um chumaço de algodão. Tare um balão de fundo chato de 250 mL e acople ao extrator. Coloque o cartucho no extrator de Soxhlet, adicione éter de petróleo e mantenha sob extração contínua e aquecimento por seis horas. Retire o cartucho e remova o solvente por destilação. Seque o resíduo e mantenha o balão com o extrato em estufa a 105ºC por cerca de duas horas. Esfrie em dessecador e pese. Repita as operações de secagem e pesagem até peso constante. Cálculo N = nº de g de lipídios extraídos P = nº de g da amostra 484 - IAL Capítulo XI - Cacau e Chocolate Referência bibliográfica U.K. FEEDING STUFFS (SAMPLING AND ANALYSIS) REGULATIONS. he determination of oil in feeding stuffs nº 1119. 1982, appendix I. p. 9-11. 264/IV Pesquisa de gorduras estranhas em chocolate A composição dos lipídios do chocolate pode indicar a adição de gorduras estranhas à manteiga de cacau. A alteração na composição de ácidos graxos ou a presença de determinados ácidos graxos, ausentes na manteiga de cacau, pode evidenciar uma adulteração. Por exemplo, a presença de ácidos graxos trans pode indicar adição de gordura vegetal parcialmente hidrogenada ao chocolate. Por este método, parte dos lipídios da amostra extraídos pelo método de Soxhlet são transformados em ésteres metílicos de ácidos graxos, preparados conforme os métodos 054/IV, 055/IV ou 056/IV, separados e quantiicados por cromatograia em fase gasosa. Material Seringa de capacidade máxima de 10 μL, graduada em 0,1 μL, balões volumétricos de 25 e 100 mL, laconete (vial) de 1,5 mL, balança analítica, agitador do tipo vortex, cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama, integrador ou computador, sistema de injeção do tipo split, coluna capilar de sílica fundida com fases estacionárias de ciano propil siloxana ou equivalente (por ex: SP2340 com 60 m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do ilme de 0,25 μm, CP-Sil 88 com (50-100) m de comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do ilme de 0,20 μm). Reagentes Mistura de padrões de ésteres metílicos de ácidos graxos variando de C4 a C24 – Dilua, com n-hexano, o conteúdo da ampola contendo 100 mg da mistura de padrões, em balão volumétrico de 25 mL. Distribua em vials de 1,5 mL e armazene em freezer. Esta solução será utilizada para identiicar os ésteres metílicos de ácidos graxos. Determine os fatores de correção da resposta de cada componente no detector de ionização de chama. n-Hexano, grau CLAE Gás de arraste para DIC: hidrogênio (pureza 99,999%) Gases auxiliares para DIC: nitrogênio (pureza 99,999%) e ar seco (livre de hidrocarbonetos). IAL - 485 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Extraia os lipídios da amostra de chocolate. Prepare os ésteres metílicos de acordo com um dos métodos 054/IV, 055/IV ou 056/IV. Estabeleça as seguintes condições cromatográicas: gás de arraste hidrogênio, velocidade linear entre (15 - 25) mL/min; programação da temperatura da coluna 60ºC (2 minutos), 1ª rampa de 15ºC/min até 135ºC (1 minuto), 2ª rampa de 3ºC/min até 215ºC (5 minutos); temperatura do injetor 220ºC; temperatura do detector 220ºC, razão de divisão da amostra 1:50. Analise uma mistura de padrões de referência de ésteres metílicos de ácidos graxos de composição conhecida nas mesmas condições empregadas na análise da amostra e determine o tempo de retenção (ou distância de retenção) para cada éster metílico. Faça a identiicação por comparação dos tempos de retenção da amostra e dos padrões. Cálculo Calcule a porcentagem de área de cada componente, em relação à soma das áreas de todos os picos. O resultado será expresso como porcentagem de ésteres metílicos (método de normalização de área ou normalização de área corrigida 343/IV). Veriique se há gorduras estranhas no chocolate comparando o peril cromatográico de ácidos graxos com o da manteiga de cacau. AAgi = área do pico correspondente ao componente ∑A = soma das áreas de todos os picos Referências bibliográficas AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists´ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-66: Preparation of methyl esters of long chain fatty acids). AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists´ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatography). AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists´ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 486 - IAL Capítulo XI - Cacau e Chocolate 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1d-91: Determination of fatty acids in edible oils and fats by capillary GLC). AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4thed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1997 (A.O.C.S. Official Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in hydrogenated and refined oils and fats by capillary GLC). INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 177-178. Colaboradores Deise Aparecida Pinatti Marsiglia, Maria Lima Garbelotti, Cláudio de Flora e Sabria Aued Pimentel IAL - 487 Capítulo XII - Café, Chá e Derivados CAPÍTULO XII CAFÉ, CHÁ E DERIVADOS IAL - 489 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 490 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados XII CAFÉ, CHÁ E DERIVADOS C afé é o nome dado às sementes de diferentes variedades de Coffea (C. arábica, C. robusta). Quando apenas livres do endosperma, os grãos constituem o chamado café verde. Seus constituintes mais importantes são: óleos, celulose, água e açúcares redutores. Quando seus grãos são torrados, os açúcares sofrem caramelização, a umidade diminui e desenvolve-se o odor característico de café. A análise do café inclui as determinações de umidade por Karl Fisher (014/IV), cinzas (018/IV), cinzas insolúveis em ácido clorídrico (024/IV), extrato etéreo (032/IV), extrato aquoso e cafeína. Como avaliação preliminar do teor de umidade, pode-se recorrer à determinação por aquecimento direto a 105°C (012/IV). Eventualmente, para ins de informação nutricional, as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios, carboidratos por diferença e minerais (cap. XXIII), podem ser realizadas na infusão do café, preparada conforme indicações na embalagem. 265/IV Café – Extrato aquoso A determinação do extrato aquoso indica a quantidade de extrato solúvel do café e representa um dado valioso, principalmente quando temos misturas de outras substâncias no café. O método é aplicável à amostras em pó provenientes de café em grãos torrados e café torrado e moído. O método consiste de uma extração a quente (ebulição) com água. IAL - 491 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, chapa de aquecimento com refrigerador de reluxo, estufa, dessecador com sílica gel, espátula, pinça, béqueres de 50 e 100 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, frasco Erlenmeyer de 500 mL, balão volumétrico de 500 mL, funil de vidro de 10 cm e pipeta volumétrica de 50 mL. Procedimento – Pese 2 g da amostra em béquer de 50 mL. Transira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada com auxilio de 200 mL de água quente. Adapte o refrigerador de reluxo ao frasco e deixe em ebulição por uma hora. Transira a solução ainda quente para um balão volumétrico de 500 mL. Lave o frasco com 100 mL de água quente e transira esta água para o balão. Resfrie o balão e complete o volume com água. Filtre para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Pipete 50 mL do iltrado e transira para um béquer de 100 mL, previamente tarado em estufa a 105°C. Evapore em banho-maria até a secagem. Aqueça em estufa a 105°C por uma hora, resfrie em dessecador e pese. Cálculo N = nº de g do extrato aquoso P= nº de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOFLO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed. 1985. p. 190. 266/IV Café – Determinação de cafeína pelo método espectrofotométrico A cafeína pode ser determinada por vários métodos, sendo comum a todos eles a necessidade de uma extração e puriicação inicial. A partir desta extração, a dosagem poderá ser feita por espectrofotometria na região ultravioleta ou por cromatograia líquida de alta resolução. Os métodos espectrofotométricos baseados na absorção característica da cafeína a 274 nm são os mais recomendáveis para a rotina. A etapa precedente à quantiicação é realizada por extração ácida, ou seja, pela carbonização seletiva da matéria orgânica da amostra com ácido sulfúrico para a liberação da cafeína, seguida de sua extração com clorofórmio. A cafeína extraída é quantiicada por espectrofotometria na região ultravioleta a 274 nm. 492 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados Material Balança analítica, estufa, banho-maria, rotavapor, espectrofotômetro UV/VIS, dessecador com sílica gel, espátula, pinça, béquer de 100 mL, pipeta graduada de 5 mL, funil de separação de 500 mL, funis de vidro de 7 e 10 cm, balão de fundo chato de 300 mL com junta esmerilhada, balões volumétricos de 100 e 1000 mL e bureta de 10 mL. Reagentes Ácido sulfúrico Clorofórmio Cafeína anidra Procedimento - Pese 1 g de amostra em béquer de 100 mL. Adicione cuidadosamente, evitando a formação de grumos, com auxilio de um bastão de vidro, 4 mL de ácido sulfúrico. Homogeneíze. Aqueça em banho-maria por 15 minutos, agitando ocasionalmente. Adicione, com cuidado, 50 mL de água quente. Aqueça em banho-maria por mais 15 minutos. Filtre a quente para um funil de separação de 500 mL através de papel de iltro umedecido com água. Lave o béquer e o iltro com 3 porções de 10 mL de água quente acidulada com o ácido sulfúrico. Receba o iltrado e as águas de lavagem no funil de separação. Deixe o iltrado esfriar. Adicione 30 mL de clorofórmio e agite por dois minutos. Espere separar as camadas. Decante a camada do clorofórmio (inferior) através de papel de iltro umedecido com clorofórmio, para um balão de fundo chato de 300 mL. Repita a extração com mais três porções de 30 mL de clorofórmio. Evapore o extrato de clorofórmio obtido, em rotavapor. Dissolva o resíduo com água quente, iltrando para um balão volumétrico de 1000 mL. Deixe esfriar. Complete o volume com água e homogeneíze. Meça a absorbância a 274 nm, em espectrofotômetro. Determine a quantidade de cafeína correspondente, usando curvapadrão previamente estabelecida. Nota: no caso de café torrado e moído descafeinado, a diluição inal será para um balão volumétrico de 200 mL. Curva-padrão – Seque a cafeína em estufa a 105°C durante uma hora. Resfrie em dessecador. Prepare uma solução-estoque de cafeína com 10 mg/100 mL de água. Com auxílio de bureta de 10 mL, transira alíquotas de 2, 3, 5, 7, 8, 10 e 15 mL para balões volumétricos de 100 mL. Complete o volume com água e homogeneíze. Meça a absorbância a 274 nm, usando um branco de água para calibração do espectrofotômetro. Com os valores obtidos, construa a curva-padrão por regressão linear dos valores de absorbância obtidos (eixo y) e das concentrações de cafeína (eixo x) expressa em mg/100 mL. Utilize nos cálculos os valores dos coeicientes linear e angular da reta (absortividade considerando o caminho óptico da cubeta de 1 cm). IAL - 493 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo A = absorbância da amostra b = coeiciente linear da reta obtida na curva-padrão a = absortividade (coeiciente angular da reta obtida na curva-padrão) v = volume em mL da diluição do resíduo de cafeína P = massa da amostra em g Referências Bibliográficas CORTES, F.F. Nota sobre um novo processo de doseamento de cafeína no café. Rev. Soc. Bras. Quim., v. 4, p. 105, 1933 (Nota prévia). INSTITUTO ADOFLO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IMESP. 3.ed 1985. p. 190192. Infusão do café A infusão do café consiste na bebida preparada a partir do pó de café torrado e moído em água fervente seguida de iltração, cujas proporções seguem geralmente as instruções de modo de preparo descritas na embalagem. A análise da infusão do café iltrado inclui as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios, descritos neste capítulo, carboidratos por diferença e eventualmente minerais (cap. XXIII). Nota: na infusão, o teor de nitrogênio procedente da cafeína não é signiicativo, podendo não ser descontado do teor de nitrogênio total, para ins do cálculo do teor de proteína. 267/IV Infusão do café – Determinação do resíduo seco Procedimento – Prepare a infusão aquosa do café conforme modo de preparo descrito na embalagem. Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL da infusão para uma cápsula de porcelana, previamente tarada em estufa e proceda como em 015/IV. 494 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados 268/IV Infusão do café – Determinação de cinzas Procedimento - Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL da infusão para uma cápsula de porcelana, previamente tarada em mula a 550°C e proceda como em 018/ IV. 269IV Infusão do café – Determinação de lipídios Material Estufa, rotavapor, dessecador com sílica gel, pinça, pipeta volumétrica de 50 mL, funil de separação de 500 mL, proveta de 100 mL, funis de vidro de 7 e 10 cm e balão de fundo chato de 300 mL com boca esmerilhada. Reagentes Clorofórnio Metanol Sulfato de sódio anidro Procedimento – Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 50 mL da infusão para um funil de separação de 500 mL. Adicione 100 mL de clorofórmio e 100 mL de metanol. Agite o funil de separação por cinco minutos. Espere separar as camadas. Decante a camada do clorofórmio (inferior) e iltre através de papel de iltro contendo sulfato de sódio anidro, para um balão de fundo chato com boca esmerilhada de 300 mL tarado a 105°C. Lave o papel de iltro com clorofórmio. Evapore o solvente num rotavapor e proceda como em 353/IV. 270IV Infusão do café – Determinação de protídios Procedimento – Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL da infusão diretamente para o balão de Kjeldahl e proceda como em 036/IV ou 037/IV. Café solúvel Café solúvel ou extrato de café desidratado é o produto obtido da desidratação ou secagem apropriada do extrato aquoso do café (Coffea arábica e outras espécies do gênero Coffea) torrado e moído, apresentando-se na forma de pó ou granulado. O produto tende a ser higroscópico, devendo ser mantido em recipiente hermeticamente fechado. IAL - 495 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A análise do café solúvel inclui as determinações de umidade por Karl Fischer (014/ IV) ou como avaliação preliminar, por aquecimento direto a vácuo a 70°C (013/IV), cinzas (018/IV), pH, cafeína e glicídios redutores e não redutores em glicose, descritos neste capítulo. Caso seja necessário para ins de informação nutricional, podem ser realizadas as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios, carboidratos por diferença e eventualmente minerais (cap. XXIII), no café solúvel preparado conforme indicações da embalagem. 271/IV Café solúvel – Determinação do pH Procedimento – Prepare uma solução aquosa a 2% m/v da amostra de café solúvel e proceda como em 017/IV. 272/IV Café solúvel – Determinação de cafeína Procedimento – Pese 0,5 g da amostra e proceda como em 266/IV para cafeína em café torrado e moído. No caso do café solúvel descafeinado, faça a diluição do resíduo do extrato clorofórmico para um balão de 200 mL. 273/IV Café solúvel – Determinação de glicídios redutores e não redutores em glicose Os métodos de determinação de glicídios estão baseados nas propriedades físicas das suas soluções ou no poder redutor dos glicídios mais simples. O método gravimétrico resume-se em pesar uma quantidade de óxido de cobre I precipitado de uma solução de cobre II por um volume conhecido da solução de glicídios redutores. O peso do precipitado (Cu2O) é convertido em glicose de acordo com a Tabela 1. Material Balança analítica, chapa de aquecimento com refrigerador de reluxo, chapa elétrica, estufa, bomba de vácuo, dessecador com sílica gel, espátula, pinça, béquer de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada, frasco Erlenmeyer de 300 mL, balão volumétrico de 250 mL, balão de fundo chato de 250 mL, funil de vidro de 10 cm, bureta de 25 mL, pipeta graduada de 5 mL, pipeta volumétrica de 25 mL, proveta de 100 mL, cadinho de vidro com placa porosa nº 4 e kitassato. 496 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados Reagentes Ácido clorídrico Hidróxido de sódio a 40% m/v Ferrocianeto de potássio a 6% m/v Acetato de zinco a 12% m/v Soluções de Fehling A e B (Apêndice I) Procedimento - Pese 2 g de amostra em béquer de 100 mL. Transira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com junta esmerilhada com auxílio de 100 mL de água. Adicione 5 mL de ácido clorídrico. Coloque em chapa de aquecimento e adapte o refrigerador de reluxo ao frasco e deixe em ebulição por três horas. Espere esfriar a solução e adicione hidróxido de sódio a 40%, elevando o pH próximo de 6,5, acompanhando com auxílio de papel indicador. Transira quantativamente para balão volumétrico de 250 mL com auxilio de água. Adicione 5 mL de ferrocianeto de potássio a 6% e 5 mL de acetato de zinco a 12%. Complete o volume, agite, deixe 15 minutos em repouso e iltre. Veriique o pH e, se necessário, adicione mais algumas gotas de hidróxido de sódio a 40%, até que a solução se torne alcalina, com pH próximo de 9 e iltre novamente a solução. Em um balão de fundo chato de 250 mL, adicione 25 mL da solução de Fehling A e 25 mL da solução de Fehling B e 30 mL de água. Leve para aquecer na chapa elétrica até entrar em ebulição. Adicione 20 mL do iltrado por intermédio de uma bureta. Deixe em ebulição por dois minutos, para formar o precipitado de óxido de cobre I. A solução deve permanecer azul demonstrando que os reagentes estão em excesso em relação à quantidade de glicose presente na amostra. Filtre a solução quente através de cadinho de placa porosa nº 4, tarado em estufa a 105°C acoplado ao kitassato, com auxílio de bomba de vácuo. Lave o balão com água quente, até completa remoção do precipitado. Caso o resíduo de óxido de cobre I (Cu2O) ique retido nas paredes do balão, coloque algumas pérolas de vidro ou cacos de porcelana e deixe ferver com um pouco de água, agitando vigorosamente em movimento circular. Filtre para o cadinho, tomando cuidado para não verter as pérolas de vidro ou cacos de porcelana no cadinho. Seque o cadinho em estufa a 105°C durante uma hora, esfrie em dessecador e pese. Cálculo Veriique, na Tabela 1 de conversão, a quantidade de glicose em mg correspondente à massa obtida de óxido de cobre I em mg. Caso não encontre o valor exato, faça uma regra de três. IAL - 497 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A = volume em mL da solução de P g da amostra a = massa de glicose em g obtida na Tabela 1 P = massa da amostra em g V = volume em mL da solução da amostra usado na titulação Tabela 1 – Conversão de mg de óxido de cobre I em mg de glicose Cu2O Glicose 11.3 4.6 12.4 5.1 13.5 5.6 14.6 6.0 15.8 6.5 16.9 7.0 18.0 7.5 19.1 8.0 20.3 8.5 21.4 8.9 22.5 9.4 23.6 9.9 Cu2O Glicose 24.8 10.4 25.9 10.9 27.0 11.4 28.1 11.9 29.3 12.3 30.4 12.8 31.5 13.3 32.6 13.8 33.8 14.3 34.9 14.8 36.0 15.3 37.2 15.7 Cu2O Glicose 38.3 16.2 39.4 16.7 40.5 17.2 41.7 17.7 42.8 18.2 43.9 18.7 45.0 19.2 46.2 19.7 47.3 20.1 48.4 20.6 49.5 21.1 50.7 21.6 Cu2O Glicose 51.8 22.1 52.9 26.6 54.0 23.1 55.2 23.6 56.3 24.1 57.4 24.6 58.5 25.1 59.7 25.6 60.8 26.1 61.9 26.5 63.0 27.0 64.2 27.5 Cu2O Glicose 65.3 28.0 66.4 28.5 67.6 29.0 68.7 29.5 69.8 30.0 70.9 30.5 72.1 31.0 73.2 31.5 74.3 32.0 75.4 32.5 76.6 33.0 77.7 33.5 Cu2O Glicose 78.8 34.0 79.9 34.5 81.1 35.0 82.2 35.5 83.3 36.0 84.4 36.5 85.6 37.0 86.7 37.5 87.8 38.0 88.9 38.5 90.1 39.0 91.2 39.5 Cu2O Glicose 92.3 40.0 93.4 40.5 94.6 41.0 95.7 41.5 96.8 42.0 97.9 42.5 99.1 43.0 100.2 43.5 101.3 44.0 102.5 44.5 103.6 45.0 104.7 45.5 Cu2O Glicose 105.8 46.0 107.0 46.5 108.1 47.0 109.2 47.5 110.3 48.0 111.5 48.5 112.6 49.0 113.7 49.5 114.8 50.0 116.0 50.6 117.1 51.1 118.2 51.6 Cu2O Glicose 119.3 52.1 120.5 52.6 121.6 53.1 122.7 53.6 123.8 54.1 125.0 54.6 126.1 55.1 127.2 55.6 128.3 56.1 129.5 56.7 130.6 57.2 131.7 57.7 Cu2O Glicose 132.8 58.2 134.0 58.7 135.1 59.2 136.2 59.7 137.4 60.2 138.5 60.7 139.6 61.3 140.7 61.8 141.9 62.3 143.0 62.8 144.1 63.3 145.2 63.8 Cu2O Glicose 146.4 64.3 147.5 64.9 148.6 65.4 149.7 65.9 150.9 66.4 152.0 66.9 153.1 67.4 154.2 68.0 155.4 68.5 156.5 69.0 157.6 69.5 158.7 70.0 Cu2O Glicose 159.9 70.5 161.0 71.1 162.1 71.6 163.2 72.1 164.4 72.6 165.5 73.1 166.6 73.7 167.8 74.2 168.9 74.7 170.0 75.2 171.1 75.7 172.3 76.3 Cu2O Glicose 173.4 76.8 174.5 77.3 175.6 77.8 176.8 78.3 177.9 78.9 179.0 79.4 180.1 79.9 181.3 80.4 182.4 81.0 183.5 81.5 184.6 82.0 185.8 82.5 Cu2O Glicose 186.9 83.1 188.0 83.6 189.1 84.1 190.3 84.6 191.4 85.2 192.5 85.7 193.6 86.2 194.8 86.7 195.9 87.3 197.0 87.8 198.1 88.3 199.3 88.9 Cu2O Glicose 200.4 89.4 201.5 89.9 202.7 90.4 203.8 91.0 204.9 91.5 206.0 92.0 207.2 92.6 208.3 93.1 209.4 93.6 210.5 94.2 211.7 94.7 212.8 95.2 Cu2O Glicose 213.9 95.7 215.0 96.3 216.2 96.8 217.3 97.3 218.4 97.9 219.5 98.4 220.7 98.9 221.8 99.5 222.9 100.0 224.0 100.5 225.2 101.1 226.3 101.6 498 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados Cu2O Glicose 227.4 102.2 228.5 102.7 229.7 103.2 230.8 103.8 231.9 104.3 233.0 1104.8 234.2 105.4 235.3 105.9 236.4 106.5 237.6 107.0 238.7 107.5 239.8 108.1 Cu2O Glicose 240.9 108.6 242.1 109.2 243.1 109.7 244.3 110.2 245.4 110.8 246.6 111.3 247.7 111.9 248.8 112.4 249.9 112.9 251.1 113.5 252.2 114.0 253.3 114.6 Cu2O Glicose 254.4 115.1 255.6 115.7 256.7 116.2 257.8 116.7 258.9 117.3 260.1 117.8 261.2 118.4 262.3 118.9 263.4 119.5 264.6 120.0 265.7 120.6 266.8 121.1 Cu2O Glicose 268.0 121.7 269.1 122.2 270.2 122.7 271.3 123.3 272.5 123.8 273.6 124.4 274.7 124.9 275.8 125.5 277.0 126.0 278.1 126.6 279.2 127.1 280.3 127.7 Cu2O Glicose 281.5 128.2 282.6 128.8 283.7 129.3 284.8 129.9 286.0 130.4 287.1 131.0 288.2 131.6 289.3 132.1 290.5 132.7 291.6 133.2 292.7 133.8 293.8 134.3 Cu2O Glicose 295.0 134.9 296.1 135.4 297.2 136.0 298.3 136.5 299.5 137.1 300.6 137.7 301.7 138.2 302.9 138.8 304.0 139.3 305.1 139.9 306.2 140.4 307.4 141.0 Cu2O Glicose 308.5 141.6 309.6 142.1 310.7 142.7 311.9 143.2 313.0 143.8 314.1 144.4 315.2 144.9 316.4 145.5 317.5 146.0 318.0 6146.6 319.7 147.2 320.9 147.7 Cu2O Glicose 322.0 148.3 323.1 148.8 324.2 149.4 325.4 150.0 326.5 150.5 327.6 151.1 328.7 151.7 329.9 152.2 331.0 152.8 332.1 153.4 333.3 153.9 334.4 154.5 Cu2O Glicose 335.5 155.1 336.6 155.6 337.8 156.2 338.9 156.8 340.0 157.3 341.1 157.9 342.3 158.5 343.4 159.0 344.5 159.6 345.6 160.2 346.8 160.7 347.9 161.3 Cu2O Glicose 349.0 161.9 350.1 162.5 351.3 163.0 352.4 163.6 353.5 164.2 354.6 164.7 355.8 165.3 356.9 165.9 358.0 0166.5 359.1 167.0 360.3 167.6 361.4 168.2 Cu2O Glicose 362.5 168.8 363.6 169.3 364.8 169.9 365.9 170.5 367.0 171.1 368.2 171.6 369.3 172.2 370.4 172.8 371.5 173.4 372.7 173.9 373.8 174.5 374.9 175.1 Cu2O Glicose 376.0 175.7 377.2 176.3 378.3 176.8 379.4 177.4 380.5 178.0 381.7 178.6 382.8 179.2 383.9 179.7 385.0 180.3 386.2 180.9 387.3 181.5 388.4 182.1 Cu2O Glicose 389.5 182.7 390.7 183.2 391.8 183.8 392.9 184.4 394.0 185.0 395.2 185.6 396.3 186.2 397.4 186.8 398.5 187.3 399.7 187.9 400.8 188.5 401.9 189.1 Cu2O Glicose 403.1 189.7 404.2 190.3 405.3 190.9 406.4 191.5 407.6 192.0 408.7 192.6 409.8 193.2 410.9 193.8 412.0 1194.4 413.2 195.0 414.3 195.6 415.4 196.2 Cu2O Glicose 416.6 196.8 417.7 197.4 418.8 198.0 419.9 198.5 421.1 199.1 422.2 199.7 423.3 200.3 424.4 200.9 425.6 201.5 426.7 202.1 427.8 202.7 428.9 203.3 Cu2O Glicose 430.1 203.9 431.2 204.5 432.3 205.1 433.5 205.7 434.6 206.3 435.7 206.9 436.8 207.5 438.0 208.1 439.1 208.7 440.0 2209.3 441.0 3209.9 442.5 210.5 Cu2O Glicose 443.6 211.1 444.7 211.7 445.8 212.3 447.0 212.9 448.1 213.5 449.2 214.1 450.3 214.7 451.5 215.3 452.6 215.9 453.7 216.5 454.8 217.1 456.0 217.8 Cu2O Glicose 457.1 218.4 458.2 219.0 459.3 219.6 460.5 220.2 461.6 220.8 462.7 221.4 463.0 8222.0 465.0 222.6 466.1 223.3 467.2 223.9 468.4 224.5 469.5 225.1 Cu2O Glicose 470.6 225.7 471.7 226.3 472.9 227.0 474.0 227.6 475.1 228.2 476.2 228.8 477.4 229.5 478.5 230.1 479.6 230.7 480.7 231.4 481.9 232.0 483.0 232.7 Cu2O Glicose 484.1 233.3 485.2 234.0 486.4 234.7 487.5 235.3 488.6 236.1 489.7 236.9 Fonte: A.O.A.C. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists – 1995 – Appendix C, p. 57-65 IAL - 499 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. (method 44.115) 16 th ed. Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 44. p. 8. Café solúvel preparado O café solúvel preparado consiste na bebida preparada a partir do café solúvel (em pó ou granulado) dissolvido em água, cujas proporções seguem geralmente as instruções de modo de preparo descritas na embalagem. A análise do café solúvel preparado inclui as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios, carboidratos por diferença e eventualmente minerais (cap. XXIII). A determinação de resíduo seco deve ser realizada na bebida preparada conforme indicações na embalagem e as demais determinações no produto tal qual se apresenta (pó ou granulado), sendo que os resultados devem ser convertidos para a bebida preparada, considerando a proporção entre água e café solúvel indicados para a porção, na rotulagem. 274/IV Café solúvel preparado – Determinação do resíduo seco Procedimento – Prepare a solução aquosa de café solúvel, cujas proporções seguem as instruções de modo de preparo descrito na embalagem. Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL da solução para uma cápsula de porcelana, previamente tarada e proceda como em 015/IV. Chá Chá é o produto constituído de partes de vegetais, inteiras, fragmentadas ou moídas, obtido por processo tecnológico apropriado à cada espécie, utilizado exclusivamente na preparação de bebida alimentícia por infusão ou decocção em água potável, não podendo ter inalidade farmacoterapêutica. A análise do chá inclui entre as principais determinações, umidade por aquecimento direto a 105°C (012/IV), cinzas (018/IV), cinzas insolúveis em ácido clorídrico (024/IV), extrato aquoso (265/IV), cafeína (266/IV) e óleos essenciais (503/IV). 500 - IAL Capítulo XII - Café, Chá e Derivados Caso seja necessário para ins de informação nutricional, podem ser realizadas na infusão do chá as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios e descritos neste capítulo, carboidratos por diferença e, eventualmete, minerais (cap. XXIII). Infusão do chá A infusão do chá consiste na bebida preparada a partir da decocção do chá em água fervente, seguida de iltração, conforme as instruções de modo de preparo descritas na embalagem. As determinações realizadas na infusão do chá, seguem os mesmos procedimentos descritos para infusão de café. Mate Erva mate ou simplesmente mate é o produto constituído pelas folhas e ramos das variedades de Ilex paraguariensis, na forma inteira ou moída, obtido por tecnologia apropriada. Quando as folhas são secas e tostadas, constituem o mate queimado ou simplesmente mate e quando não são denominadas mate verde. As determinações usuais entre outras incluem: umidade por aquecimento direto a 105°C (012/IV), cinzas (018/IV), cinzas insolúveis em ácido clorídrico (024/ IV),extrato aquoso (265/IV) e cafeína (266/IV). Caso seja necessário para ins de informação nutricional, podem ser realizadas na infusão do mate as determinações de resíduo seco, cinzas, lipídios, protídios, carboidratos por diferença e eventualmente minerais (cap. XXIII). 275/IV Mate – Determinação de cafeína Procedimento – Pese 2 g da amostra e proceda como em determinação de cafeína em café torrado e moído (266/IV). Infusão do mate A infusão do mate consiste na bebida preparada a partir do mate em água fervente seguida de iltração, conforme as instruções de modo de preparo descritas na embalagem. As determinações realizadas na infusão do mate seguem os mesmos procedimentos descritos para infusão do café. Mate solúvel IAL - 501 Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos CAPÍTULO XIII CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS IAL - 503 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 504 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos XIII CARNES E PRODUTOS CÁRNEOS Carnes enominam-se carnes as partes musculares comestíveis das diferentes espécies de animais de açougue, manipuladas em condições higiênicas e provenientes de animais que ao abate se apresentam em boas condições de saúde, certiicados por médico veterinário responsável pelo serviço de inspeção. As carnes frescas ou in natura deverão ser entregues ao consumo conservadas sob refrigeração, sendo avaliadas quanto à sua segurança higiênico-sanitária, classiicação, presença de conservadores, características físico-químicas, microscópicas, microbiológicas e sensoriais. D A composição da carne depende da espécie animal, raça, sexo, maturidade, regime alimentar e localização anatômica do músculo, entre outras características. Em geral, a carne contém aproximadamente 75% de seu peso em água (com variação de 65 a 80%). As proteínas representam 19% (com variação de 16 a 22%) e são um dos componentes mais importantes no aspecto nutricional. As substâncias nitrogenadas não protéicas (ATP, ADP, IMP, NAD, NADP, creatina, aminoácidos livres etc.) totalizam 1,5%. O conteúdo lipídico da carne é muito variável, entre 1,5 e 13%. O teor de carboidratos é baixo, variando de 0,5 a 1,3% do peso. Além disso, as carnes contêm numerosos compostos inorgânicos que, somados, totalizam 1%. As determinações de umidade (012/IV), proteínas (036/IV ou 037/IV), carboidratos (041/IV), cinzas (018/IV), gorduras (032/IV), gorduras saturadas (053/ IV), sódio (cap. XXIII) e colesterol são procedentes em estudos nutricionais, composição para formulações e rotulagem. Eventualmente, pode tornar-se pertinente determinar o valor de pH (017/IV), a presença de aditivos como: fosfatos (031/IV), corantes artiiciais (051/IV) e nitritos, bem como a presença de resíduos de pesticidas (cap. XX), hormônios e antibióticos, a pesquisa de substâncias anti-oxidantes, IAL - 505 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital como sulitos, utilizados para mascarar processos de alteração que a carne sofre durante a estocagem (deterioração) e de contaminantes inorgânicos como arsênio, estanho e chumbo (cap. XXIII). As carnes e seus derivados estão sujeitos a alterações por reações químicas, físicas e microbiológicas. As alterações físicas e químicas decorrem principalmente da modiicação e/ou degradação de proteínas e lipídios, que é provocada tanto pela ação de agentes naturais, por exemplo, o oxigênio, como por enzimas hidrolíticas endógenas naturalmente presentes na carne e ainda por outras substâncias (enzimas, peptídios, aminas etc.) produzidas por microrganismos. A decomposição dos aminoácidos sulfurados da carne, com desprendimento de compostos de enxofre, poderá ser avaliada qualitativamente pela reação de Éber para gás sulfídrico (004/IV). A reação de Éber para amônia (005/IV) poderá ser utilizada para evidenciar o início das alterações deteriorativas das carnes. Além da ação enzimática, a deterioração também pode resultar de reações oxidativas, como, por exemplo, a oxidação lipídica, que é uma alteração dependente da disponibilidade de oxigênio, da temperatura de armazenamento e da composição do músculo, evidenciada qualitativamente pela reação de Kreis (279/IV). As condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos processadores, manipuladores, distribuidores e comerciais também são fatores de destaque na determinação da aceitabilidade das carnes, pois estas oferecem condições favoráveis para o crescimento de bactérias, sendo importantes tanto as deteriorativas como as patogênicas, que podem chegar ao produto pela inadequada manipulação. Portanto, todos esses aspectos poderão comprometer as características sensoriais, assim como a qualidade nutricional e microbiológica das carnes. Preparo da Amostra Retire porções de várias regiões da peça, sem grandes vasos, ossos, peles, tecidos adiposos e aponevroses, tendo, entretanto, o cuidado de não descaracterizar a amostragem. Homogeneíze passando o material três vezes em moedor de carne, utilizando disco de 3 mm de diâmetro. Misture bem após cada moagem. Alternativamente, utilize um processador de alimentos para o preparo da amostra. Particular atenção deve ser dada a certos tipos e/ou cortes de carne, para assegurar distribuição uniforme de gordura e tecido conjuntivo na moagem, sempre objetivando que a amostragem represente realmente a peça inicial ou amostra recebida. A cada intervalo, reincorpore com auxílio de espátula a gordura aderida à superfície do equipamento e o tecido conjuntivo preso nas facas. Utilize amostra representativa com peso de 200 g. Coloque a amostra em frasco hermeticamente fechado. De preferência, comece imediatamente todas as determinações. Se houver alguma interrupção, mantenha a amostra sob refrigeração para inibir a decomposição. Guarde a 5°C por até 24 h ou congele a amostra a -18°C. No momento da pesagem, ho506 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos mogeneíze reincorporando a possível separação de líquido, gelatina ou gordura. Características Sensoriais O exame sensorial da aparência, textura, odor e sabor é de grande importância, pois são essas características as que mais se alteram no início da deterioração das carnes. Aparência – Própria de cada espécie, uniforme, sem acúmulo sangüíneo, sem corpos estranhos e sem presença de limo na superfície. A gordura deve ser de uma tonalidade que varia de branca a amarela e não deve apresentar pontos hemorrágicos. A cor das carnes deve ser uniforme, sem manchas escuras ou claras, variando nas espécies bovina e bubalina, do vermelho-escuro ou pardacento ao vermelho-cereja ou claro; na espécie suína, a superfície de corte deverá apresentar-se com uma aparência marmórea (em diferentes níveis ou intensidades), sem lacidez e não exsudativa, apresentando matizes de vermelhorosado-escuro (carne suína escura, irme e seca – Tipo DFD) ou vermelho-róseo (carne suína fresca) a róseo-pálido ou esbranquiçado (carne suína pálida, mole e exsudativa – Tipo PSE). Nos eqüinos e muares, seu tom é vermelho-escuro, enquanto nas aves varia de amarelo-avermelhado ao amarelo-esbranquiçado. Essas colorações podem também ser relacionadas ao frescor e ao tempo de exposição do corte ao ambiente, pois à medida que o corte envelhece há escurecimento da superfície, que se torna progressivamente escura ou acinzentada, podendo apresentar iridicência ou colorações esverdeada e azulada, pela ação de microrganismos. Textura – A textura da carne normalmente é irme, compacta, elástica e ligeiramente úmida. A gordura deve mostrar-se irme ao tato. No início da putrefação, a superfície torna-se viscosa ou limosa e a carne perde a irmeza. Odor – As carnes frescas devem apresentar um odor suave, agradável e característico de cada espécie, tornando-se amoniacal, sulfídrico e depois pútrido, quando em estado de deterioração. A gordura também deve ter odor suave e característico, sendo indicativos de alteração os odores modiicados ou o odor a ranço. O odor da carne suína tende a ser mais intenso em animais inteiros (odor espermático), sendo mais perceptível quando a carne é aquecida (276/IV), o que facilita o desprendimento e, portanto, a percepção dos odores impróprios ou alterados. Sabor – Suave e característico, próprio de cada espécie. O sabor varia consideravelmente segundo a espécie, raça, idade e regime alimentar do animal. Um complexo conjunto de substâncias químicas é responsável pelo sabor da carne. IAL - 507 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 276/IV Prova de cocção A prova de cocção auxilia na determinação das alterações das características sensoriais de aparência, odor, textura e sabor, sendo utilizada para carne fresca, carne cozida e produtos cárneos. O aquecimento da amostra facilita o desprendimento de vapores e, portanto, a percepção de odores impróprios ou alterados. Fundamenta-se na observação das modiicações de textura, odor e sabor ocorridas nos alimentos em início de decomposição, ressaltadas quando a amostra é submetida ao aquecimento. Material Bico de Bünsen, chapa aquecedora ou banho-maria, balança semi-analítica, béquer de 250 mL e vidro de relógio. Procedimento – Utilize amostra moída devidamente homogeneizada. Em um béquer de 250 mL, coloque aproximadamente 20 g de amostra, cubra com água e tampe com vidro de relógio. Aqueça até o início dos primeiros vapores, destampe e perceba o odor dos vapores produzidos. O odor amoniacal ou sulfídrico é facilmente identiicado. Ferva por mais 5 minutos e observe as características da carne e do caldo. O sabor deve ser próprio e a textura irme. Referência bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II – Métodos físicos e químicos. Brasília (DF), 1981. cap. I, p. 2. 277/IV Prova para sulfito com verde de malaquita Baseia-se na mudança de cor do corante orgânico verde de malaquita na presença de anidrido sulfuroso e de sulitos. Material Balança semi-analítica, espátula, cápsula de porcelana e pipeta graduada de 1 mL. Reagente Solução de verde malaquita a 0,02% m/v 508 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Procedimento – Pese 3,5 g da amostra em cápsula de porcelana. Acrescente 0,5 mL da solução de verde malaquita. Misture com o auxílio de espátula por 1 a 2 minutos. A presença de sulito na amostra descora a solução de verde malaquita. Na ausência de sulito, a amostra adquire uma coloração verde azulada. Nota: esta reação também é positiva para outros agentes redutores. No caso de positividade realize teste conirmatório (049/IV) ou (050/IV). Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 268-269. 278/IV Prova para nitritos Nitritos de sódio ou de potássio são conservadores usados em produtos cárneos. Estão relacionados com a obtenção de cor e sabor e com as atividades antioxidante e antimicrobiana, contudo, proibidos em carnes frescas e congeladas. Demonstrou-se que os nitritos reagem com certas aminas formando as nitrosaminas, substâncias potencialmente cancerígenas. No organismo infantil, os nitritos interagem com a hemoglobina afetando o transporte de oxigênio, resultando em condição patológica denominada metemoglobinemia. A determinação qualitativa da presença dos nitritos em carnes frescas ou congeladas é feita pela reação de Griess-Ilosvay. Baseia-se na reação de diazotação dos nitritos com ácido sulfanílico e copulação com cloridrato de alfa-naftilamina em meio ácido, formando o ácido alfa-naftilamino-pazobenzeno-p-sulfônico, de coloração rósea. Material Tubos de ensaio de 25 mL, papel de iltro qualitativo e pipetas graduadas de 1 e 10 mL. Reagentes Solução de ácido sulfanílico – Pese 0,5 g de ácido sulfanílico e dissolva em 150 mL de solução aquosa de ácido acético (1+4). Solução de cloridrato de alfa-naftilamina – Dissolva 0,4 g de cloridrato de alfa-naftilamina em 150 mL de ácido acético (1+4). Se não dissolver bem, aqueça, deixe em repouso e decante ou iltre em algodão. IAL - 509 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Faça um macerado da amostra com água e iltre. Em um tubo de ensaio, pipete 10 mL do iltrado, adicione 1 mL da solução de ácido sulfanílico e agite. Adicione 1 mL de cloridrato de alfa-naftilamina e agite fortemente. Em presença de nitritos, haverá formação de coloração rósea mais ou menos intensa, dependendo da quantidade de nitrito que foi adicionada. Nota: amostras que possuem nitrito em excesso produzem com o reativo de Griess-IIosvay uma coloração vermelha fugaz, que passa a amarela-parda como se fosse prova negativa. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.100-101. BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II – Métodos físicos e químicos. Brasília (DF),1981. cap. I, p. 5-6. Produtos cárneos Os produtos cárneos são preparados com carnes de animais de açougue, sadios e abatidos sob inspeção sanitária, ou outros tecidos animais comestíveis, submetidos a processos tecnológicos adequados, crus ou cozidos. Os produtos são classiicados segundo a forma, o tamanho, o sistema de acondicionamento, o processo ou a técnica de fabricação e condimentação. As características sensoriais de aparência devem ser próprias e a superfície deve apresentar-se com características típicas para cada produto. Modiicações como superfície úmida, limosa, sebosa, pegajosa ou viscosa indicam alteração. O invólucro não deve estar daniicado. O produto deve traduzir a utilização de tecnologia adequada para a sua elaboração. A coloração deve ser uniforme e característica, rósea no produto curado cozido e avermelhada no curado cru, sem manchas ou alterações (esverdeada ou pardacenta) da cor característica. A consistência deve ser própria, com maior ou menor irmeza conforme o tipo de produto. O odor e o sabor devem ser característicos e a parte gordurosa não deve apresentar-se com odor ou sabor a ranço. As determinações usuais são, entre outras, pH (017/IV), umidade (012/ IV), proteínas (036/IV ou 037/IV), carboidratos (041/IV), cinzas (018/IV), gorduras (032/ IV), gorduras saturadas (053/IV), colesterol, sódio (cap. XXIII), cloretos em cloreto de sódio (028/IV ou 029/IV), corantes artiiciais (051/IV), reação de Éber para amônia (005/ IV), prova de rancidez nas partes gordurosas, amido, hidroxiprolina, prova para formaldeído, conservadores nitritos e nitratos e proteínas de soja. 279/IV Reação de Kreis 510 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos A prova para ranço na gordura pela reação de Kreis é válida para produtos cárneos e partes gordurosas de carnes. Rancidez é o nome que se dá às alterações no odor e no sabor dos óleos e gorduras. A loroglucina reage em meio ácido com os produtos de oxidação dos triglicerídios, resultando em composto de condensação de coloração rósea ou vermelha, cuja intensidade é proporcional à oxidação. Material Rotavapor, balança semi-analítica, papel de iltro, frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada e tampa, balão de fundo chato de 300 mL com boca esmerilhada, proveta de 150 mL, proveta de 50 mL com boca esmerilhada e tampa, pipeta de 5 mL, funil e papel de iltro qualitativo. Reagentes Éter Ácido clorídrico Solução de loroglucina em éter a 0,1% m/v Procedimento – Separe cerca de 30 g das partes gordurosas da carne ou 100 g do produto cárneo previamente triturado. Transira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione de 100 a 150 mL de éter e deixe em contato, ao abrigo da luz e calor, por uma noite. Filtre a mistura através de papel de iltro para um balão de fundo chato de 300 mL. Evapore o iltrado em rotavapor sob vácuo à temperatura máxima de 40oC. Transira, com auxílio de uma pipeta, 5 mL da gordura fundida (resíduo do balão) para uma proveta de 50 mL. Adicione 5 mL de ácido clorídrico, tampe e agite por 30 segundos. Adicione 5 mL de solução de loroglucina, tampe e agite novamente por 30 segundos. Deixe em repouso por 10 minutos. Na presença de ranço, a camada inferior apresentará uma coloração rósea ou vermelha. Nota: se a intensidade da coloração for fraca, compare a camada inferior com uma solução de permanganato de potássio a 0,0012% (3,8 mL de uma solução 0,002 M diluída para 100 mL). Se a intensidade for a mesma, ou inferior, pode-se deixar de levar em consideração o resultado, contanto que as características sensoriais do produto sejam satisfatórias. IAL - 511 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 260. 280/IV Prova para formaldeído O formaldeído é considerado uma substância conservante de material biológico. Sua adição é proibida em alimentos. A loroglucina reage com o formaldeído em meio alcalino produzindo o derivado hidroximetilado, de coloração salmão fugaz. Material Balança semi-analítica, aquecedor elétrico, condensador de Liebig, balão de Kjeldahl de 600 mL, proveta de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 200 mL, tubos de ensaio, pipetas graduadas de 1, 2 e 5 mL. Reagentes Solução de ácido fosfórico a 20% v/v Solução de loroglucina (C6H6O3) a 1% m/v Solução de hidróxido de sódio a 10% m/v Procedimento – Pese cerca de 10 g da amostra, previamente triturada e homogeneizada em béquer. Transira para balão de Kjeldahl com auxílio de 80 mL de solução de ácido fosfórico a 20%. Ligue o balão ao conjunto de destilação de Liebig. Aqueça até ebulição e destile cerca de 40 mL em frasco Erlenmeyer de 200 mL. Coloque em tubo de ensaio 5 mL do destilado, adicione 1 mL da solução de loroglucina a 1% e 2 mL da solução de hidróxido de sódio a 10%. Na presença de formaldeído, aparecerá a coloração salmão fugaz e na sua ausência, a cor violeta. Observe a cor imediatamente após a adição dos reagentes. Nota: esta metodologia não se aplica a produtos com características de ranço e produtos defumados. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 271272. 512 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos 281/IV Determinação espectrofotométrica de amido A adição de amido é permitida em algumas classes de salsichas, mortadelas e outros produtos cárneos, respeitados os limites estabelecidos pela legislação vigente, especíicos para cada classe de produto. Além do amido, que é um extensor utilizado para reduzir custos do produto inal e auxiliar na retenção de água, outros ingredientes são empregados na elaboração, tais como: carne, sangue, vísceras comestíveis, gordura, proteínas de soja, aditivos e condimentos. Alguns deles estão presentes em grandes quantidades, podendo acarretar interferência na extração e dosagem do amido; outros contêm teores consideráveis de açúcares simples e de amido em sua composição, superestimando o valor real. O método baseia-se na determinação espectrofotométrica a 500 nm do composto colorido formado pela reação entre os reativos de Somogyi-Nelson e a glicose proveniente da hidrólise do amido. Com o objetivo de minimizar interferências (gorduras, proteínas e açúcares simples) e aumentar a eiciência das determinações, procede-se a uma extração prévia da amostra com éter de petróleo e álcool, para posterior hidrólise ácida e clariicação com reagentes Carrez. Esse método, assim como o de Fehling, baseia-se na redução do cátion Cu++ a Cu+, e na oxidação do açúcar a ácido orgânico. O Cu+ é complexado com arsenomolibdato (reativo de Nelson), que possui um agente cromóforo, originando um complexo estável de coloração azul. A intensidade dessa coloração é proporcional à quantidade de açúcares redutores. Material Espectrofotômetro UV/VIS, centrífuga, balança analítica, estufa, chapa de aquecimento com aparelho de reluxo acoplado, papel indicador de pH, banho-maria, dessecador, papel de iltro, termômetro, béqueres de 500 e 1000 mL, balões volumétricos de 100, 250 e 1000 mL, tubos de centrífuga de 15 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipeta volumétrica de 1 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada, tubos de Folin-Wu de 25 mL (Figura 1), cubeta de vidro com caminho óptico de 10 mm, bureta de 10 mL e proveta de 25 mL. Figura 1 –Tubo de Folin-Wu de 25 mL. IAL - 513 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Álcool Éter de petróleo Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio 40% m/v Ácido sulfúrico (D = 1,84 g/mL) Reativo A – Dissolva 25 g de carbonato de sódio, 25 g de tartarato duplo de sódio e potássio, 20 g de bicarbonato de sódio e 200 g de sulfato de sódio anidro em 800 mL de água. Transira para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Reativo B – Dissolva, em água, 15 g de sulfato de cobre penta-hidratado. Transira para um balão volumétrico de 100 mL. Adicione duas gotas de ácido sulfúrico (D = 1,84 g/mL) e complete o volume com água. Reativo de Somogyi ou reativo cúprico – Adicione 1 mL do reativo B a 25 mL do reativo A em proveta no momento da análise. Reativo de Nelson – Dissolva 25 g de molibdato de amônio em 450 mL de água. Adicione 21 mL de ácido sulfúrico e agite. Adicione 2 g de arseniato de sódio hepta-hidratado, dissolvido em 25 mL de água. Deixe em banho a 37oC, por um período de 24 a 48 h. Solução de acetato de zinco di-hidratado a 12% m/v – Pese 120 g de Zn(CH3COO)2.2H2O, dissolva em 30 mL de ácido acético glacial e 600 mL de água. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 6% m/v – Pese 60 g de K4Fe(CN)6.3H2O e dissolva em 800 mL de água. Transira para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de glicose a 250 μg/mL – Seque uma quantidade arbitrária de glicose anidra em estufa a 80ºC, por 2h. Deixe esfriar em dessecador. Pese 250 mg, transira quantitativamente para balão de 1000 mL com água, complete o volume e homogeneíze. A concentração dessa solução-estoque é 250 mg/L ou 250 μg/mL. Procedimento – Pese 1 g da amostra homogeneizada, em tubo de centrífuga. Adicione 10 mL de solução álcool-éter de petróleo (1:3), agite com a ajuda de uma ina haste de ferro e centrifugue a 2500 rpm, por 5 minutos. Despreze o sobrenadante e repita o 514 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos procedimento anterior. Adicione 10 mL de álcool a 80% v/v a 80oC ao resíduo, agite com ina haste de ferro e centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos. Despreze o sobrenadante e repita a extração alcoólica. Seque o resíduo em estufa a 70oC, por 20 minutos. Transira o resíduo obtido no tubo de centrífuga, com auxílio de 100 mL de água, para um frasco Erlenmeyer de 500 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de ácido clorídrico. Hidrolise em reluxo por 90 minutos. Esfrie e neutralize o hidrolisado com solução de hidróxido de sódio a 40% até pH ± 7 (volume gasto aproximado 6 mL), veriicando com papel indicador de pH. Transira para um balão volumétrico de 250 mL e clariique adicionando 5 mL de solução de acetato de zinco e 5 mL de solução de ferrocianeto de potássio (reagentes Carrez). Complete o volume, tampe e agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente varias vezes nesse período. Filtre para um frasco Erlenmeyer e reprecipite com hidróxido de sódio a 40% até pH ± 11 (gasto aproximado 0, 5 mL). Filtre, transira 1 mL do iltrado para tubo de Folin-Wu e adicione 1 mL de reativo de Somogyi ou reativo cúprico, deixe imerso em banho-maria fervente por 20 minutos. (Veriique se após 20 minutos de fervura a tonalidade azulada permanece nos tubos; caso contrário, dilua a amostra e proceda novamente à reação com reativo cúprico.) Esfrie, adicione 1 mL de reativo de Nelson e complete o volume com água até a primeira marca do tubo de Folin-Wu (12,5 mL) e homogeneíze. Proceda às leituras de absorbância das soluções contra o branco de reagentes, no comprimento de onda 500 nm. Nota: caso as soluções estejam concentradas, isto é, a absorbância obtida ultrapasse o maior valor da curva-padrão, dilua a amostra e repita a reação colorimétrica com os reativos de Somogyi-Nelson, ou repita a reação completando o volume para a segunda marca do tubo de Folin-Wu (25 mL). Neste caso, o resultado inal (% de amido) deverá ser duplicado. Curva-padrão – Transira alíquotas de 0 (branco); 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 mL da soluçãopadrão estoque de glicose para tubos de Folin-Wu. Adicione 1 mL de reativo de Somogyi ou reativo cúprico, deixe imerso em banho-maria fervente por 20 minutos. Esfrie, adicione 1 mL de reativo de Nelson, complete o volume com água até a primeira marca do tubo de Folin-Wu (12,5 mL) e homogeneíze. Proceda às leituras de absorbância das soluções contra o branco, no comprimento de onda 500 nm. Proceda à regressão linear dos valores de absorbância obtidos (eixo y) e das concentrações de glicose de 4, 8, 12, 16 e 20 μg/mL (eixo x). Utilize nos cálculos os valores dos coeicientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho óptico da cubeta de 1 cm). Cálculos IAL - 515 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Glicose (%) x 0,9 = amido por cento m/m A = absorbância da amostra b = coeiciente linear da curva-padrão de glicose a = absortividade (coeiciente angular da curva-padrão de glicose) p = massa (g) da amostra 0,3125 = fator de diluição 0,9 = fator de conversão de glicose para amido Referência bibliográfica AUED, S.; CARVALHO; J. B. de; T AVARES, M.; ZANELATTO, A. M.; BACETTI, L. B. Determinação de amido em salsichas: comparação entre os métodos de Fehling e de Somogyi-Nelson e avaliação de metodologia para extração do amido. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 50, n. 1/2, p. 251-256, 1990. 282/IV Determinação espectrofotométrica de hidroxiprolina Método de referência para determinação do aminoácido hidroxiprolina em carnes e produtos cárneos, expresso em % m/m. A hidroxiprolina é quantitativamente determinada como medida das proteínas colágenas de carnes e produtos cárneos. O tecido conjuntivo colagenoso contém 12,5% de hidroxiprolina quando o fator 6,25 (conversão nitrogênio para proteína) é utilizado, ou 14% quando o fator é 5,55. A amostra é hidrolisada com solução de ácido clorídrico em constante ebulição sob reluxo, a solução é iltrada e diluída. A hidroxiprolina é oxidada com cloramina T. A cor vermelha púrpura que se desenvolve após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído é medida espectrofotometricamente a 558 nm. Material Processador de alimentos, chapa elétrica equipada com condensador resfriado com água para reluxo, balança analítica, banho-maria com temperatura termostaticamente controlada a (60 ± 0,5)oC, espectrofotômetro UV/VIS, cubeta de vidro de caminho óptico de 10 mm, papel de iltro qualitativo de diâmetro 12,5 cm, pHmetro, frascos Erlenmeyer com boca esmerilhada de 100, 250 e 500 mL, tubos de ensaio com tampa de 10 mL, balões volumétricos de 50, 100, 500 e 1000 mL e pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10 e 20 mL. 516 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Reagentes Ácido clorídrico 6 M – Misture volumes iguais de HCl e água. Solução-padrão estoque de hidroxiprolina a 600 μg/mL – Dissolva 60 mg de hidroxiprolina em água. Transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. A solução é estável cerca de 2 meses a 4oC. Opção: dissolva 120 mg em balão de 200 mL e complete o volume com água. Solução-padrão intermediária de hidroxiprolina a 6 μg/mL – Pipete 5 mL da soluçãoestoque em balão volumétrico de 500 mL. Complete o volume com água. Prepare a solução no dia de seu uso. Solução-padrão de trabalho de hidroxiprolina – Pipete 5, 10, 20 e 30 mL da solução intermediária em balão volumétrico de 50 mL. Complete o volume com água. Essas soluçõespadrão de trabalho revelam concentrações de hidroxiprolina de 0,6; 1,2; 2,4 e 3,6 μg/mL, respectivamente. Prepare as soluções no dia de seu uso. Solução-tampão (pH 6) – Dissolva 30 g de ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7.H2O), 15 g de hidróxido de sódio e 90 g de acetato de sódio tri-hidratado (CH3COONa⋅3H2O) em cerca de 500 mL de água. Transira a solução para balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 290 mL de 1-propanol. Determine o pH e ajuste, se necessário, com ácido ou base. Complete o volume. A solução é estável por cerca de 2 meses a 4oC e em frasco escuro. Solução oxidante – Dissolva 1,41 g do reagente cloramina T em 100 mL da solução tampão pH 6. A solução é estável 1 semana a 4oC, em frasco escuro. Reagente de cor – Dissolva 10 g de 4-dimetilaminobenzaldeído em 35 mL de ácido perclórico a 60% m/m. Adicione vagarosamente, com agitação, 65 mL de 2-propanol. Prepare a solução no dia de seu uso. Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 4 g da amostra em duplicata em frascos Erlenmeyer de 250 ou 500 mL. A amostra não deve aderir às paredes laterais. Adicione 30 mL de HCl 6 M e algumas pérolas de vidro (ou cacos de porcelana) a cada frasco. Aqueça à fervura branda por 8 horas sob reluxo. Transira quantitativamente o hidrolisado para balão volumétrico de 500 mL com água. Complete o volume e agite. Filtre a solução através de papel de iltro, em frasco Erlenmeyer de 500 mL. O iltrado é estável ao menos por 2 semanas a 4oC. Dilua o iltrado com água em balão volumétrico, de modo IAL - 517 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital que a concentração de hidroxiprolina da diluição inal esteja na faixa de 0,6 a 3,6 μg/mL. A diluição de 5 mL do iltrado para 50 mL é usualmente satisfatória. Pipete 2 mL da diluição inal de cada amostra em tubos de ensaio. A cada tubo, adicione 1 mL da solução oxidante. Agite os tubos e deixe por (20 ± 2) minutos à temperatura ambiente. Adicione 1 mL do reagente de cor e misture vigorosamente. Feche cada tubo com tampa ou papel alumínio. Imediatamente, coloque os tubos em banho de água a (60 ± 0,5)oC por exatamente 15 minutos. Resfrie os tubos em água corrente por 3 minutos. Meça a absorbância das soluções contra o branco de reagentes a (558 ± 2) nm. Curva-padrão – Prepare a curva-padrão para cada série de medições. Transira 2 mL de água (branco) e 2 mL de cada solução-padrão de trabalho aos tubos de ensaio e proceda à adição da solução oxidante e do reagente de cor conforme procedimento da amostra. Construa a curva com absorbância no eixo y e concentrações de hidroxiprolina 0,3; 0,6; 1,2 e 1,8 μg/mL no eixo x. Calcule os coeicientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho óptico da cubeta de 1 cm). Cálculos A = absorbância do iltrado da amostra diluída 10 vezes (5 mL em 50 mL) b = coeiciente linear da reta obtida na curva-padrão a = absortividade, coeiciente angular da reta obtida na curva-padrão p = peso da amostra (g) H x 8 = tecido colagenoso (B) em g/100 g Nota: tecido conjuntivo colagenoso contém 12,5% de hidroxiprolina se o fator de conversão de nitrogênio para proteína for de 6,25. % proteína total = teor de nitrogênio da amostra em g/100 g x 6,25 Notas O cálculo é diferente em alguns países, com base nos diferentes fatores de conversão de nitrogênio e de hidroxiprolina. O limite de quantiicação do método é de 0,030 μg/mL de hidroxiprolina na alíquota de análise (com desvio-padrão relativo de 6,5%) e de 0,0075 g/100 g de hidroxiprolina na amostra (Della Torre et al. 2004). 518 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 990.26). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 39. p.13-5. DELLA TORRE, LICHTIG. J.; BERAQUET, N.J. Validação do método espectrofométrico para quantiicação do aminoácido hidroxiprolina em conservas de carne. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 63(1), 2004 (no prelo). 283/IV Determinação espectrofotométrica de nitritos Baseia-se nas reações de diazotação de nitritos com ácido sulfanílico e copulação com cloridrato de alfa-naftilamina em meio ácido, formando o ácido alfa-naftilamino-pazobenzeno-p-sulfônico de coloração rósea. O produto resultante é determinado espectrofotometricamente a 540 nm. Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, banho-maria, balão volumétrico âmbar de 50 mL, balões volumétricos de 100, 200, 250 e 1000 mL, provetas de 25 e 50 mL, béqueres de 100 e 200 mL, frasco Erlenmeyer de 250 ou de 500 mL, funil, papel de iltro qualitativo, pipeta graduada de 5 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 e 20 mL. Reagentes Utilize preferencialmente água deionizada isenta de nitritos e/ou nitratos no preparo dos reagentes e na realização da análise. Solução de tetraborato de sódio deca-hidratado a 5% m/v – Dissolva 50 g de Na2B4O7.10H2O em água e complete o volume até 1000 mL. Solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 15% m/v – Dissolva 150 g de K4Fe(CN)6.3H2O em água e complete o volume até 1000 mL. Solução de acetato de zinco diidratado a 30% m/v ou sulfato de zinco hepta-hidratado a 30% m/v – Dissolva 300 g de Zn(CH3COO)2.2H2O em 30 mL de ácido acético glacial e 500 mL de água (aqueça brandamente, se necessário) e complete o volume até 1000 mL. Alternativamente, dissolva 300 g de ZnSO4.7H2O em água e complete o volume até 1000 mL. IAL - 519 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v – Dissolva 1,25 g de C6H8N2O2 em 250 mL de solução de ácido clorídrico (1+1). Aqueça brandamente, se necessário. A solução é estável por 1 a 2 meses. Reagente NED a 0,5% m/v – Dissolva 0,5 g de cloreto de alfa-naftiletilenodiamina (C12H16Cl2N2) em 100 mL de água. Aqueça brandamente, se necessário. Estoque em frasco âmbar sob refrigeração. A solução é estável por uma semana e deverá ser desprezada quando apresentar alteração da coloração. Solução-padrão de nitrito de sódio (NaNO2) a 0,2 g/L – Pese 200 mg de nitrito de sódio, previamente seco por 1 hora a 105°C, dissolva em água e dilua para 1000 mL. Essa solução-padrão estoque é estável por 2 semanas, se mantida a 4°C. Solução-padrão de trabalho a 8 μg/mL – Pipete 10 mL da solução-padrão estoque de nitrito de sódio em um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com água. Procedimento – Pese 10 g de amostra triturada e homogeneizada em um béquer de 200 mL. Adicione 5 mL de solução de tetraborato de sódio, misture com bastão de vidro e acrescente cerca de 50 mL de água quente (80oC). Deixe em banho-maria por 15 minutos, agitando freqüentemente com a baqueta. Proceda da mesma forma com um branco de reagentes sem a adição da amostra. Com auxílio do bastão de vidro e de um funil, transira o conteúdo quantitativamente para balão volumétrico de 200 mL. Lave bem o béquer com aproximadamente 50 mL de água. Deixe esfriar e adicione 5 mL de solução de ferrocianeto de potássio e 5 mL de solução de acetato de zinco (ou como alternativa, sulfato de zinco). Agite por rotação após a adição de cada reagente e complete o volume com água. Agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente várias vezes nesse período. Filtre em papel de iltro qualitativo para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Pipete 10 mL do branco de reagentes e das amostras, respectivamente, para balões volumétricos âmbar de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfanilamida, deixe reagir por 5 minutos e adicione 3 mL de reagente NED, agitando após cada adição. Complete o volume com água e homogeneíze. Deixe em repouso por 15 minutos e faça a leitura da absorbância a 540 nm contra o branco de reagentes. Curva-padrão – Pipete alíquotas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mL da solução-padrão de trabalho de nitrito de sódio (8 μg/mL) para balões volumétricos de 50 mL. Adicione, a cada um, 5 mL de reagente sulfanilamida, misture por rotação e após 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED. Complete o volume e homogeneíze. Deixe a cor desenvolver por 15 minutos e determine a absorbância a 540 nm contra branco de reagentes. Construa a curva com os valores de absorbância no eixo y e de concentração de nitrito de sódio 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80; 0,96 e 1,12 μg/mL no eixo x. Calcule os coeicientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho óptico da cubeta de 1 cm). 520 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Cálculo A = absorbância da amostra b = coeiciente linear da reta obtida na curva-padrão a = absortividade (coeiciente angular da reta obtida na curva-padrão) p = massa da amostra em gramas 1000 = fator de diluição Nota: o limite de quantiicação do método é de 0,032 μg/mL de NaNO2 (ou 0,021 μg/ mL de NO2-) na alíquota de análise, com desvio padrão relativo de 3,7% (TAKEMOTO et al., 1999). Referências bibliográficas BRASIL. Instrução Normativa n. 20, de 21 jul. 1999. Secretaria de Defesa Agropecuária, do Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Oicializa os Métodos Analíticos Físicoquímicos para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes – Sal e Salmoura. Diário Oficial, Brasília (DF), n.173, 9 set. 1999. Seção 1, p.30-31. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 97-98. TAKEMOTO, E.; DELLA TORRE, J. C. de M.; LICHTIG, J. Nitrato em espinafre: validações de métodos colorimétricos. In: III SIMPÓSIO LATINO AMERICANO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS (SLACA), 1999. Resumos... Campinas: FEA-UNICAMP, 1999. p. 5. 284/IV Determinação espectrofotométrica de nitratos O nitrato é reduzido a nitrito em coluna de cádmio metálico em meio alcalino. A reação baseia-se na diazotação dos nitritos com ácido sulfanílico e copulação com cloridrato de alfa-naftilamina em meio ácido, formando o ácido alfa-naftilamino-p-azobenzeno-p-sulfônico de coloração rósea. O produto resultante é determinado espectrofotometricamente a 540 nm. Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, banho-maria, coluna de cádmio, balões volumétricos âmbar de 50 mL, balões volumétricos de 100, 200, 250 e 1000 mL, provetas IAL - 521 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de 25 e 50 mL, béqueres de 100 e 200 mL, frasco Erlenmeyer de 250 ou de 500 mL, funil, papel de iltro qualitativo, pipeta graduada de 5 mL e pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10 e 20 mL. Reagentes Utilize preferencialmente água deionizada isenta de nitritos e/ou nitratos no preparo dos reagentes e na realização da análise. Solução de tetraborato de sódio deca-hidratado a 5% m/v – Dissolva 50 g de Na2B4O7.10H2O em água e complete o volume até 1000 mL. Solução de ferrocianeto de potássio tri-hidratado a 15% m/v – Dissolva 150 g de K4Fe(CN)6.3H2O em água e complete o volume até 1000 mL. Solução de acetato de zinco di-hidratado a 30% m/v ou sulfato de zinco hepta-hidratado a 30% m/v – Dissolva 300 g de Zn(CH3COO)2.2H2O em 30 mL de ácido acético glacial e 500 mL de água (aqueça brandamente se necessário), complete o volume até 1000 mL. Alternativamente, dissolva 300 g de ZnSO4.7H2O em água e complete o volume até 1000 mL. Solução de EDTA a 5% m/v – Pese 5 g de C10H14N2Na2O8.2H2O, dissolva com água e complete o volume de 100 mL. Guarde em frasco de polietileno. Reagente sulfanilamida a 0,5% m/v – Dissolva 1,25 g de C6H8N2O2 em 250 mL de solução de ácido clorídrico (1+1). Aqueça brandamente se necessário. A solução é estável por 1 a 2 meses. Reagente NED a 0,5% m/v – Dissolva 0,5 g de cloreto de alfa-naftiletilenodiamina (C12H16Cl2N2) em 100 mL de água. Aqueça brandamente, se necessário. Estoque em frasco âmbar sob refrigeração. A solução deve ser desprezada quando apresentar alteração da coloração (estável por uma semana). Solução-tampão pH (9,6-9,7) – Dilua 20 mL de ácido clorídrico em 700 mL de água. Adicione 50 mL de hidróxido de amônio. Veriique o pH e ajuste para (9,6-9,7) com HCl ou NH4OH, se necessário. Complete o volume até 1000 mL e misture. Solução-tampão pH (9,6-9,7) diluída (1+9) – Dilua 100 mL da solução-tampão pH (9,6-9,7) em balão de 1000 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de nitrito de sódio (NaNO2) a 200 mg/L – Pese 200 mg de nitrito de 522 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos sódio, previamente seco por 1 hora a 105°C, dissolva em água e dilua para 1000 mL. Essa solução-padrão estoque é estável ao menos por 2 semanas, se mantida a 4°C. Solução-padrão de trabalho a 8 μg/mL – Transira 10 mL da solução-padrão estoque para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de nitrato de sódio (NaNO3) – Desseque o nitrato de sódio por 1 hora a 105°C. Pese, com precisão, 0,1 g e dissolva em água. Adicione 50 mL da solução-tampão pH (9,6-9,7) e complete para balão de 100 mL com água. Essa solução-padrão é estável ao menos por duas semanas, se mantida a 4°C. Solução-padrão de trabalho de nitrato de sódio a 10 μg/mL – Dilua 1 mL em balão de 100 mL com água. A solução-padrão de nitrato de sódio de trabalho deve ser preparada no momento da análise. Preparação da coluna de cádmio (Figura 2) – Estire um tubo de vidro de 1,5 cm de diâmetro e 15 cm de altura (coluna). Compacte um pequeno chumaço de lã de vidro na extremidade ailada da coluna, acrescente uma camada de 1 cm de areia tratada. Preparação do cádmio esponjoso: prepare 500 mL de solução de sulfato de cádmio a 20%. Adicione 5 barras de zinco metálico, deixando-as totalmente imersas na solução. À medida que o cádmio esponjoso for se depositando nas barras, retire utilizando bastão de vidro ou material plástico e transira para um béquer contendo água em quantidade suiciente para cobrir todo o cádmio. Transira aproximadamente 200 mL de água e o cádmio para um copo de liquidiicador (de material plástico ou vidro), homogeneíze e em seguida passe em peneira mesh 20 ou 40, recolhendo em outro béquer, mantendo o cádmio sempre coberto com água. O cádmio triturado e peneirado é posto a decantar completamente. Remova a água sobrenadante e inicie o tratamento do resíduo (cádmio esponjoso) da seguinte maneira: cubra todo o cádmio com ácido clorídrico 2 M; deixe em contato (repouso) por 2 minutos, remova o ácido clorídrico sobrenadante; lave o cádmio com água até pH neutro; adicione ácido clorídrico 0,1 M até cobrir todo o cádmio, deixe em repouso por 15 minutos e remova o ácido clorídrico sobrenadante; lave o cádmio com água até pH neutro; decante e remova a água sobrenadante, adicione solução-tampão pH (9,6-9,7) (1+9) deixando em contato por, no mínimo, 15 minutos. Decorrido esse tempo, o cádmio está pronto para ser compactado na coluna de vidro previamente preparada com lã de vidro e areia na extremidade. Transira o cádmio em pequenas porções com o auxílio de água, evitando sua exposição ao ar, até atingir uma altura de 10 cm. Adapte ao topo da coluna um funil de separação de 100 mL, com haste de 10 mm de diâmetro e 25 cm de comprimento com uma rolha de silicone, prevenindo a entrada de ar na coluna. Dessa forma, permite-se o controle do luxo. Mantenha a coluna sempre com água. IAL - 523 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 2.– Funil de separação acoplado à coluna de cádmio. Regeneração ou ativação da coluna – A atividade da coluna de cádmio decresce depois de 24 horas, quando este é mantido em água. Regenere a coluna no começo de cada dia de utilização e após duas (uma duplicata) reduções (passagens) de amostras. Passe as soluções na coluna com luxo de 10 mL/min respeitando a seguinte ordem: 25 mL de ácido clorídrico 0,1 M, 50 mL de água e 25 mL de solução-tampão diluída (1+9). Procedimento – Pese 10 g de amostra triturada e homogeneizada em béquer de 200 mL. Adicione 5 mL de solução de tetraborato de sódio, misture com baqueta de vidro e acrescente cerca de 50 mL de água quente (80oC). Deixe em banho-maria por 15 minutos, agitando freqüentemente com a baqueta. Proceda da mesma forma para o branco de reagentes sem a adição da amostra. Com auxílio da baqueta e de um funil, transira o conteúdo quantitativamente para balão volumétrico de 200 mL. Lave bem o béquer com aproximadamente 50 mL de água. Deixe esfriar e adicione 5 mL de solução de ferrocianeto de potássio e 5 mL de solução de acetato de zinco (ou como alternativa, sulfato de zinco). Agite por rotação após a adição de cada reagente e complete o volume com água. Agite com vigor. Deixe em repouso por 15 minutos, agitando vigorosamente várias vezes nesse período. Filtre em papel de iltro qualitativo para frasco Erlenmeyer de 250 mL. Transira uma alíquota de 20 mL do iltrado (primeiramente do branco de reagentes e na seqüência, as amostras) para béquer de 100 mL. Adicione 5 mL da solução-tampão pH (9,6-9,7). Se turvar, adicione 2 mL de solução de EDTA 5%. Passe pela coluna de cádmio a um luxo que não exceda 6 mL/minuto, recolhendo diretamente em balão volumétrico de 100 mL. Lave as paredes do béquer no mínimo três vezes consecutivas com aproximadamente 15 mL de água, passando seqüencialmente pela coluna de cádmio. Continue a passagem de água pela coluna até completar o volume de 100 mL no balão volumétrico. Pipete 10 mL (do branco de reagentes e das amostras), respectivamente, para balões volumétricos de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfanilamida, agite por rotação, após 5 minutos adicione 3 mL de reagente NED, complete o volume com água, misture e deixe desenvolver a cor por 15 minutos. 524 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Determine a absorbância a 540 nm contra o branco de reagentes (passado pela coluna). O resultado refere-se ao teor de nitrito de sódio total. Desconte o valor de nitrito de sódio presente na amostra (reação colorimétrica do iltrado antes de passá-lo pela coluna de cádmio). Eiciência ou controle da capacidade redutora da coluna – A eiciência da coluna pode ser testada passando solução-padrão de nitrato de sódio e determinando a quantidade de nitrito formado. Misture, em um béquer de 100 mL, uma alíquota de 20 mL da soluçãopadrão de trabalho de nitrato de sódio (10 μg/mL) e 5 mL da solução-tampão pH (9,69,7). Passe pela coluna de cádmio a um luxo que não exceda 6 mL/minuto, recolhendo diretamente em balão volumétrico de 100 mL. Lave as paredes do béquer no mínimo três vezes consecutivas com aproximadamente 15 mL de água, passando seqüencialmente pela coluna de cádmio. Continue a passagem de água pela coluna até completar o volume de 100 mL no balão volumétrico. Pipete 10 mL para um balão volumétrico de 50 mL. Adicione 5 mL de reagente sulfamilamida, agite por rotação; após 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED e complete o volume com água. Após 15 minutos faça a leitura a 540 nm contra o branco de reagentes (passado pela coluna). Se a recuperação for inferior a 90%, isto é, a concentração de nitrato calculado menor que 90% do valor teórico esperado, regenere a coluna de cádmio. Curva-padrão de nitrito de sódio – Pipete alíquotas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 mL da soluçãopadrão de trabalho de nitrito de sódio (8 μg/mL) para balões volumétricos de 50 mL. Adicione, a cada um, 5 mL de reagente sulfanilamida, misture por rotação e, após 5 minutos, adicione 3 mL de reagente NED. Complete o volume e homogeneíze. Deixe desenvolver a cor por 15 minutos e determine a absorbância a 540 nm contra o branco de reagentes. Construa a curva com os valores de absorbância no eixo y e de concentração de nitrito de sódio 0,16; 0,32; 0,48; 0,64; 0,80; 0,96 e 1,12 μg/mL no eixo x. Calcule os coeicientes linear e angular da reta (absortividade, considerando o caminho óptico da cubeta de 1 cm). Cálculos Nitrato de sódio (em NaNO2) = nitrito de sódio total - nitrito de sódio Nitrato de sódio (em NaNO3) = (nitrito de sódio total - nitrito de sódio) x 1,231 A = absorbância da amostra b = coeiciente linear da curva padrão de nitrito de sódio IAL - 525 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital a = absortividade, coeiciente angular da curva-padrão de nitrito de sódio p = massa da amostra em g 5000 = fator de diluição da amostra para cálculo do nitrito de sódio total 1,231 = fator de conversão de nitritos em nitratos 1000 = fator de diluição da amostra para cálculo do nitrito de sódio A = absorbância do padrão nitrato de sódio b = coeiciente linear da curva-padrão de nitrito de sódio a = absortividade, coeiciente angular da curva-padrão de nitrito de sódio p = massa nitrato de sódio padrão em g 30,8 = fator (diluição e conversão NaNO3 / NaNO2) Nota: o limite de quantiicação do método é de 0,032 μg/mL de NaNO2 (ou 0,021 μg/ mL de NO2-) na alíquota de análise, com desvio padrão relativo de 3,7% (TAKEMOTO et al., 1999). Referências bibliográficas BRASIL. Instrução Normativa n. 20, de 21 jul. 1999. Secretaria de Defesa Agropecuária, do Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Oicializa os Métodos Analíticos FísicoQuímicos para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes – Sal e Salmoura. Diário Oficial, Brasília (DF), n.173, 9 set. 1999. Seção 1, p.30. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3.ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 98100. TAKEMOTO, E.; DELLA TORRE, J. C. de M.; LICHTIG, J. Nitrato em espinafre: validações de métodos colorimétricos. In: III SIMPÓSIO LATINO AMERICANO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS (SLACA), 1999. Resumos... Campinas: FEA-Unicamp, 1999. p.5. 285IV Determinação de proteínas de soja pelo método ELISA As proteínas de soja são ingredientes utilizados na elaboração de alimentos como fonte protéica e como extensor em produtos cárneos. As amostras de produtos cárneos 526 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos crus ou processados termicamente são maceradas e extraídas com solventes orgânicos. O resíduo desta extração, denominado pó de acetona, é solubilizado a quente em solução aquosa de uréia. Após diluição, as proteínas de soja renaturadas são analisadas pelo método ELISA, utilizando anticorpos comercialmente disponíveis. Na quantiicação de proteínas de soja, o método ELISA é um imuno-ensaio competitivo indireto em que o analito proteína de soja (antígeno) reage com volume ixo de anticorpo anti-proteína de soja (antissoro produzido em coelho) em excesso. O anticorpo não reagente é determinado pela ligação em placa de imunoensaio previamente sensibilizada com o antígeno. O anticorpo capturado é determinado pela adição de um segundo anticorpo (produzido em cabra para globulinas de soro de coelho) ligado covalentemente a uma enzima (conjugado). A reação é evidenciada pelo desenvolvimento de cor com a adição de substrato. Etapas de lavagem são incorporadas após cada estágio de interação, para remover material não reagente (Figura 3). A amostra é geralmente analisada em diluições seriadas na razão 3. A resposta é comparada a uma curva-padrão de proteína de soja. O ELISA é semi-quantitativo na determinação de proteínas de soja em produtos cárneos crus e processados termicamente, podendo ser quantitativo quando o teor de protídios da proteína de soja adicionado é conhecido e, especialmente, se a proteína de soja (texturizada, concentrada ou isolada) está disponível para calibração. Material Lavadora e leitora de placas de ELISA; pipeta digital de 8 ou 12 canais, pipetas monocanais de (5-50) μL, (50 -200) μL e (100 -1000) μL com ponteiras, reservatórios de reagentes para cada solução; triturador de amostras, homogeneizador Ultra-Turrax ou Diax 900 (Heidolph) ou equivalente; papel de iltro Whatman n° 541; tubos de vidro pirex graduados de 10 mL com tampas de plástico; banho-maria; placas de imunoensaio de poliestireno fundo chato de 96 cavidades (equivalente Nunc Maxisorp 442404); microtubos plásticos de 1 mL com tiras de tampas e suporte (8 x 12 ileiras) para diluição serial e pré-incubação; caixas plásticas com tampa para colocar placas de ELISA; balões volumétricos de 10, 25 e 50 mL; funil de vidro de 7 cm; almofariz; balança analítica; pHmetro; estufa; cronômetro e papel gráico semi-log (linear/4 ciclos log). Reagentes Acetona Uréia 2-Mercaptoetanol Azida sódica (NaN3) IAL - 527 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Advertência: a azida sódica é material tóxico. Evite contato com a pele e os olhos e impeça a aspiração do pó. Clorofórmio-metanol – 2:1 (v/v). Álcool-água (acidiicado) – 80+20 (v/v), acidiicado com 2 gotas de HCl/L. Tampão Tris-HCl a 0,25 M – Pese 30,3 g de tris (hidroximetil) amino metano em um litro de água e ajuste ao pH 8,6 com HCl. Proteina de soja padrão – Utilize como padrão, o concentrado de proteína de soja (Loders CroKlaan B.V., Holanda) ou pó de acetona de soja (equivalente Sigma S7756) ou isolado protéico de soja Supro 500E (Protein Technologies International, USA) na preparação da solução de sensibilização. Solução de sensibilização (50 vezes concentrada) – Misture, em balão volumétrico de 50 mL, 4,5 mL de Na2CO3 0,2 M, 8 mL de NaHCO3 0,2 M, 625 μL da soluçãopadrão de proteína de soja preparada no item procedimento (b) e água até completar o volume. Mantenha esta solução-padrão a (2-8)°C por 16 horas. Nota: o valor 625 μL da solução-padrão foi calculado para corresponder a 2,5 mg de proteína de soja no pó de acetona, uma vez que a solução-padrão descrita no item (b) do procedimento contém 100 mg/25 mL. Solução de sensibilização de trabalho – Misture, em um balão volumétrico de 50 mL, 4,5 mL Na2CO3 0,2 M, 8 mL NaHCO3 0,2 M e água para completar o volume. Homogeneíze e retire 1 mL desta solução, repondo o volume da solução com 1 mL da solução de sensibilização 50 vezes concentrada. Solução-tampão salina de fosfato TFS pH 7,1 – Misture, em um balão volumétrico de 1000 mL, 85 g de NaCl, 10,7 g de Na2HPO4, 3,9 g de NaH2PO4.2H2O, 5 g de NaN3 e água até completar o volume para 1000 mL. Solução-tampão de trabalho TFST– Misture 100 mL da solução-tampão TFS, 1,5 mL de Tween 20 e 900 mL de água. Soluções imunorreagentes Solução anticorpo-positivo – Dilua, em um balão volumétrico de 50 mL, B μL de antissoro de coelho para proteína de soja (equivalente Sigma-Aldrich S-2519), conservado a -20°C, e complete o volume com solução-tampão TFST. 528 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Solução anticorpo-negativo – Em um balão volumétrico de 50 mL, pipete B μL de soro normal de coelho e complete o volume com solução-tampão TFST. Solução conjugado – Em um balão volumétrico de 25 mL, pipete C μL de IgG anticoelho produzido em cabra conjugado à fosfatase alcalina (equivalente Sigma-Aldrich A-7539), conservado a (2 – 8)°C e complete o volume com solução-tampão TFST. Nota: as quantidades de anticorpo e conjugado que devem ser adicionadas, dependem das propriedades dos imunorreagentes recebidos. Calcule B e C como descrito no item padronização. Solução-substrato de fosfatase em meio tampão – Misture, em um balão volumétrico de 25 mL, 2,25 mL de Na2CO3 0,2 M, 4 mL de NaHCO3 0,2 M, 25 μL MgCl2.6H2O 0,5 M, 25 mg p-nitrofenil fosfato (5 tabletes de 5 mg cada, equivalente Sigma 104-105, guarde no escuro a temperatura menor que 0oC) e complete o volume com água. Padronização (A) Anticorpo-positivo e anticorpo-negativo – Teste novos lotes nas placas ELISA sensibilizadas e lavadas (itens (c) e (d) do procedimento). Prepare séries de diluições (no intervalo 100 - 100000) de anticorpo positivo (ileiras A-D) e anticorpo negativo (ileiras E-H) em TFST, pré-incube sem proteína de soja, e então proceda como descrito nos itens (h) e (k) do procedimento. Use a curva de diluição do antissoro para obter o título do anticorpo positivo. Calcule o valor B, isto é, se o título for 1 em 3000, então B = 2 x (1/3000) x 50000 μL = cerca de 30 μL. Teste também o anticorpo em produto cárneo padrão contendo concentração conhecida de proteína de soja e também contra materiais com potencial para reações cruzadas. (B) Conjugado – Teste novos lotes de conjugado sobre uma placa ELISA (sensibilizada e lavada, itens (c) e (d) do procedimento). Prepare anticorpo positivo como para BP (item (f ) do procedimento) e pré-incube essa solução com TFST separadamente (item (g) do procedimento). Incube na placa (item (h) do procedimento) nas ileiras A-D (anticorpo positivo) e ileiras E-H (TFST). Use conjugado a várias diluições (ou seja, no intervalo 500-5000) no item (i) do procedimento e então siga (j) e (k). Calcule o valor de C (ou seja, C=15) de tal forma que o conjugado positivo seja > 1,000 e conjugado negativo < 0,050. (C) Placa ELISA – Teste lotes de placas para avaliar a variabilidade entre placas. A placa padrão em protocolo utiliza, nas determinações, somente as cavidades (B – G) (2-11) em razão de uma possível variação das cavidades externas. IAL - 529 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimentos (a) Preparação do pó de acetona – Pese, separadamente, 20 g da proteína de soja padrão e 20g da amostra previamente triturada e macere (no Ultra-Turrax ou Diax 900) com solventes orgânicos, iltrando o resíduo a cada estágio para re-extração, na seguinte seqüência: 200 mL clorofórmio-metanol (3 vezes), 200 mL álcool acidiicado (3 vezes) e 200 mL acetona (3 vezes). Seque o resíduo ao ar, de um dia para o outro, e homogeneíze em almofariz; o produto inal denomina-se pó de acetona. Proceda a análise da proteína total pelo método Kjeldahl (N x 6,25), utilizando o resultado para calcular a massa da amostra de pó de acetona do item (b) do procedimento. (b) Solubilização de amostras e padrão – Pese, separadamente, em tubos pirex graduados de 10 mL, o pó de acetona da proteína de soja padrão (97-103 mg de proteína) e o pó de acetona de cada amostra de produto cárneo (95-105 mg de proteína). Adicione a cada um dos tubos na ordem: 2 mL de tampão Tris-HCl, 6 g de uréia, 2 mL de água, 200 μL de 2-mercaptoetanol e água para 10 mL. Tampe, misture e aqueça imergindo até o nível de 10 mL em banho de água fervente por (60 ± 1) min. Resfrie por (3 - 5) minutos e transira quantitativamente para um balão volumétrico de 25 mL com água, assegurando a ressolubilização da uréia cristalizada. Mantenha as soluções de amostras e padrão por 16 h a (2 - 8)oC. A solução-padrão de proteína de soja está pronta para ser utilizada no item reagentes (solução de sensibilização) e no item procedimento (e). As soluções de amostras serão utilizadas no item (e) do procedimento. (c) Sensibilização das placas ELISA – Utilizando pipeta multicanal, transira 200 μL de solução de sensibilização de trabalho (item reagente) a cada cavidade na placa de ELISA. Coloque a placa tampada em caixa plástica, feche e incube a 37oC por (16 ± 1) hora. (d) Lavagem e estocagem das placas ELISA – Lave as placas de ELISA utilizando um procedimento padronizado. Com um sistema automático de lavagem estabeleça um ciclo de 5 vezes, em que cada ileira de cavidades é sucessivamente esvaziada e enchida com TFST por 5 vezes e inalmente as cavidades são esvaziadas. Segundo o procedimento de lavagem manual, a primeira ileira é esvaziada e enchida com TFST por 5 vezes antes de inalmente ser esvaziada; a seqüência é repetida para as ileiras sucessivas. Um ciclo de lavagem de 10 vezes inclui primeiramente uma lavagem de 5 vezes, seguida por um segundo ciclo de mais 5 lavagens. Se a placa ELISA sensibilizada não for utilizada imediatamente, remova a placa da estufa no inal das 16 horas e lave 5 vezes. Uma lavagem eiciente é parte essencial do método. A placa lavada pode ser enxugada e estocada. Use tecido absorvente para secar os lados da placa, inverta a placa para remover algum líquido remanescente nas cavidades, e então seque a parte de cima da placa. Idealmente, a superfície interna das cavidades incluindo a base deve permanecer intocada durante o processo de lavagem e secagem. Coloque a placa tampada com a parte de cima voltada para baixo em caixa plástica, feche e estoque em freezer (-20oC). 530 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos (e) Diluição serial das soluções de amostras e padrão – Assegure a ambientação da temperatura das soluções de amostras e padrão solubilizadas (procedimento b), retirando da refrigeração com (45 - 60) minutos de antecedência. Transira alíquotas de 750 μL de cada uma dessas soluções a balões volumétricos de 10 mL, dilua ao volume com TFST e misture por repetidas inversões. Encha com microtubos o suporte (8x12) e pipete 600 μL das soluções de amostras e padrões diluídos, cada um dentro do seu tubo correspondente, como deinido na Tabela 1 (padrão S1 em triplicata e amostras T1-Z1 em duplicata). A Tabela 1 ilustra o modelo padrão de tubos que corresponde às cavidades na placa de ELISA. Todos os outros tubos devem receber 400 μL de TFST; faça essa transferência utilizando pipeta multicanal (duas porções de 200 μL). Conduza a diluição serial de cada amostra, em duplicata, pelo uso de pipeta multicanal para misturar alíquotas de 600 μL (recolha 200 μL e reponha 3 vezes) e, então, transira 200 μL ao tubo adjacente que já contém 400 μL de TFST. Misture como descrito e repita a diluição, descartando a alíquota de 200 μL do último tubo. Desta mistura resulta uma diluição serial 1:3; normalmente use soluções de amostra não diluída, 3 vezes diluídas e 9 vezes diluídas para o ensaio quando o teor de proteína de soja na amostra é desconhecido ou baixo (0 - 11 g de proteína/100 g de proteína total). Escolha maiores diluições se os teores são altos (3, 9, 27 vezes se 11- 33 g/100 g; 9, 27, 81 vezes para 33 -100 g/100 g), ou quando o ELISA já tenha demonstrado que as soluções de amostras são muitas concentradas. Dilua as soluções-padrão similarmente, preparando para o ensaio 7 diluições seriais (de solução não diluída a diluição de 729 vezes, cada uma em triplicata). Tabela 1 – Modelo padrão recomendado para os microtubos (pré-incubação) e cavidades correspondentes na placa de ELISA, no ensaio com 7 amostras*. Linhas Colunas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BS S1 S1 S1 00 00 00 00 00 00 00 00 B BS S2 S2 S2 T1 U1 V1 W1 X1 Y1 Z1 00 C BS S3 S3 S3 T2 U2 V2 W2 X2 Y2 Z2 00 D BC S4 S4 S4 T3 U3 V3 W3 X3 Y3 Z3 00 E BC S5 S5 S5 T1 U1 V1 W1 X1 Y1 Z1 00 F BC S6 S6 S6 T2 U2 V2 W2 X2 Y2 Z2 00 G BP S7 S7 S7 T3 U3 V3 W3 X3 Y3 Z3 00 H BP BP BN BN BN 00 00 00 00 00 00 00 * As 96 posições estão arranjadas em 12 colunas (1-12) e 8 linhas (A-H). Cada amostra é analisada a 3 diluições (em duplicata); padrão a 7 diluições (em triplicata), e 4 brancos em triplicata. BS, branco substrato; BC, branco conjugado; BP, branco anticorpo positivo; BN, branco anticorpo negativo; 00, não usado; S1-S7, padrão (1-7 indica 7 diluições seriais); T-Z, 7 amostras (1-3 indica 3 diluições seriais). IAL - 531 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (f ) Brancos – Quatro tipos de brancos são usados, cada um em triplicata: substrato (BS), conjugado (BC), anticorpo positivo (BP) e anticorpo negativo (BN). Adicione 400 μL de TFST a todos eles. Aos tubos BS e BC, acrescente 2 porções de 200 μL de TFST; aos tubos BP, solução de anticorpo positivo (2 x 200 μL); e, aos tubos BN, a solução de anticorpo negativo (2 x 200 μL). Idealmente, as leituras inais de absorbância (k) correspondentes a esses brancos devem apresentar os seguintes valores: BS < 0,010; BC < 0,050; BP > 1,000; BN > 0,200. (g) Pré-incubação com soro anti-proteína de soja – Utilizando pipeta multicanal, adicione solução de anticorpo positivo (2 x 200 μL) aos tubos de amostras e padrões. Coloque TFST (2 x 200 μL) nos tubos externos restantes (00 na Tabela 1). Feche cuidadosamente com as tiras plásticas que vedam os microtubos. Inverta o suporte de microtubos três ou mais vezes para misturar e coloque na estufa a 37oC por (30 ± 1) minutos. (h) Etapa anticorpo – Nos últimos 10 min da etapa de pré-incubação (g), lave a placa de ELISA já à temperatura ambiente, cerca de (45 - 60) minutos, utilizando um ciclo de 5 vezes. Remova o suporte de microtubos da estufa no tempo estipulado e inverta 3 vezes para misturar. Retire cuidadosamente as tiras plásticas vedadoras. Utilizando pipeta multicanal, transira alíquotas de 200 μL de cada solução para as cavidades na placa de ELISA na posição correspondente (Tabela 1). Coloque a placa tampada na caixa plástica, feche e incube a (120 ± 2) min a 37oC. (i) Etapa conjugado – Remova a placa ELISA da estufa, lave 10 vezes e enxugue como em (d). Adicione 200 μL de TFST na cavidade do branco substrato (BS). Com auxílio da multicanal adicione solução de conjugado a todas as outras cavidades (exceto BS) na mesma ordem de adição utilizada na etapa do anticorpo (h). Coloque a placa tampada na caixa plástica, feche e incube a (120 ± 2) minutos a 37oC. (j) Etapa substrato – Remova a placa da estufa, lave 10 vezes e enxugue. Utilizando multicanal, adicione 200 μL da solução de substrato a cada cavidade da placa na mesma ordem da etapa (h). Então, coloque a placa tampada na caixa plástica, feche e incube por (30 ± 0,25) minutos a 37oC. (k) Reação enzimática e medição da cor – Remova a placa ELISA da estufa e com ajuda da multicanal adicione alíquotas de 50 μL de solução de 0,2 M de NaOH a todas as cavidades da placa, na mesma ordem da etapa do anticorpo. Proceda à leitura da absorbância a (405 410) nm da solução de cada cavidade, usando leitora de ELISA ou equivalente; essa leitura deve ser realizada entre 5 e 60 minutos após a adição da solução de NaOH. 532 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Cálculos Para cada placa, construa uma curva-padrão (Figura 4) do log da concentração de proteína de soja padrão como pó de acetona (N x 6,25) nas 7 diluições seriais versus a correspondente absorbância (média de 3 leituras). Calcule a concentração de proteína total (N x 6,25) em cada diluição de cada solução de amostra. De cada média de absorbância, leia na curva a concentração de proteína de soja correspondente em cada diluição da amostra. Calcule a massa de proteína de soja por 100 g de proteína total para as 3 diluições correspondentes a cada amostra de pó de acetona. Se todos os 3 valores corresponderem à porção central da curva de calibração (isto é, S2 a S6), utilize a média como resultado inal. As absorbâncias muito baixas implicam que as soluções utilizadas estavam muito concentradas e um maior número de diluições seriais deve ser utilizado para um segundo procedimento de ELISA. Os resultados também podem ser calculados em termos de massa de proteína de soja por 100 g de amostra como recebida ou em termos de peso do ingrediente de soja (proteínas isoladas contêm 88% de proteína, concentradas 68% e texturizadas 50%, base seca, teores mínimos estabelecidos pela legislação vigente) por 100 g de amostra como recebida. Note que as três maneiras de deinir os teores de soja na amostra são diferentes e devem ser consideradas com cuidado. IAL - 533 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 3 – Procedimento esquemático ilustrando as etapas individuais do método ELISA para determinação de proteína de soja. 534 - IAL Capítulo XIII - Carnes e Produtos Cárneos Figura 4 – Curva-padrão evidenciando a relação entre absorbância e concentração de proteína de soja da solução padrão pelo método ELISA. O limite de quantiicação do método é de 0,41 μg/mL de proteína de soja na alíquota de análise (com desvio-padrão relativo de 2,4%) e de 0,14 g/100 g de proteína de soja na amostra. A curvapadrão abrange de 0,41 μg/mL a 300 μg/mL de proteína de soja, limite superior com desvio padrão relativo de 5,8% (DELLA TORRE et al., 2003). Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists (method 988.10). Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 39. p. 16-19. DELLA TORRE; J. C. M.; BARBOSA, S.F.C.; FERRACIOLI, V. R.; ZENEBON, O.; LICHTIG, J.; BERAQUET, N. J. Quantitative determination of comercial soy proteins in emulsion -type meat products by official ELISA procedure. In: 49th INTERNATIONAL CONGRESS OF MEAT SCIENCE AND TECHNOLOGY – ICoMST, 2003. Proceedings… Campinas: CTC-ITAL, 2003. p. 405-406. Colaboradores Jussara Carvalho de Moura Della Torre, Regina S. Minazzi Rodrigues, Emy Takemoto, Sônia França Correia Barbosa e Jaim Lichtig IAL - 535 Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos CAPÍTULO XIV EMBALAGENS E EQUIPAMENTOS EM CONTATO COM ALIMENTOS IAL - 537 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 538 - IAL XIV EMBALAGENS E EQUIPAMENTOS EM CONTATO COM ALIMENTOS qualidade dos produtos alimentícios depende diretamente de fatores de natureza química, física e biológica, que atuam sobre o alimento durante o período de tempo entre sua produção e seu consumo, que é denominado vida-de-prateleira do alimento. Neste contexto, a embalagem é de importância fundamental. A Uma das principais funções da embalagem é entregar ao consumidor um alimento com o mesmo nível de qualidade dos produtos frescos ou recém-preparados, devido à sua capacidade de protegê-los contra agentes deteriorantes, infectantes e sujidades. Ela atua como uma barreira física de proteção para o produto contra o contato direto com o meio ambiente, evitando contaminações, manuseio inadequado, falta de higiene e perda das características próprias do produto. Uma boa embalagem deve também ser resistente ao produto nela contido durante o processamento e/ou armazenamento, não cedendo elementos de sua composição ao alimento, sejam estes nocivos ou não ao homem ou ao próprio alimento. O critério usado para garantir a segurança de produtos alimentícios embalados está relacionado com as interações embalagem/produto durante o período de tempo anterior ao uso inal pelo consumidor. À medida que os alimentos embalados passaram a ter uma maior importância na dieta de grande parte das populações, a ênfase dada aos problemas toxicológicos advindos da interação da embalagem com o alimento foi aumentada. Na s quatro últimas décadas, a comunidade cientíica internacional tem voltado IAL - 539 Métodos Físico-Químicos para AnáliseCapítulo de Alimentos 4ª Edição XIV -- Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 1ª Edição Digital sua atenção para os aspectos toxicológicos decorrentes da utilização de materiais de síntese química em embalagens de alimentos, surgindo a necessidade de estabelecer uma legislação especíica para controlar estes produtos. A embalagem pode contaminar o alimento por meio da cessão de elementos de sua composição como monômeros, aditivos, corantes, tintas de impressão e vernizes, entre outros. A migração de componentes da embalagem pode ser tão pequena que não se observará resposta biológica nos organismos expostos a curto prazo. Entretanto, após longos períodos de ingestão de alimentos contaminados, manifestações tóxicas sutis e de difícil detecção poderão ocorrer. A maioria dos testes efetuados em embalagens para alimentos são denominados provas de cessão ou testes de migração. Provas de cessão ou testes de migração são determinações cuja inalidade é avaliar a quantidade de substâncias passíveis de migrar da embalagem para o alimento. A importância destas determinações prende-se ao fato de que estes migrantes, além de potencialmente tóxicos ao homem, podem alterar as características do alimento. Na medida do possível, estas provas tentam simular as condições a que tanto a embalagem quanto o alimento serão submetidas, em função do tipo de alimento, tempo de contato e temperatura. Estes ensaios deveriam ser feitos colocando-se a embalagem em contato com o alimento que se pretende embalar. Entretanto, isto se torna impraticável, uma vez que a concentração de migrantes é normalmente baixa e a complexidade química da maioria dos alimentos iria interferir em sua dosagem. Devido a esta impossibilidade, recorreu-se ao uso de solventes simulantes de alimentos, que tentam reproduzir o pH, o teor de gordura dos alimentos e sua eventual graduação alcoólica. Os estudos de migração devem avaliar de forma qualitativa e quantitativa a substância química que migrou da embalagem para o alimento. As embalagens que têm interesse do ponto de vista de saúde pública são as primárias, isto é, aquelas que tem contato direto com o alimento, podendo interagir com ele. 540 - IAL Terminologia Embalagem para alimentos – Artigo que está em contato direto com alimentos, destinado a contê-los, desde sua fabricação até sua entrega ao consumidor, com a inalidade de protegê-los de agentes externos, de alterações e de contaminações, assim como de adulterações. Equipamento para alimentos – Artigo em contato direto com alimentos, que se utiliza durante a elaboração, fracionamento, armazenamento, comercialização e consumo de alimentos. Estão incluídos nesta classiicação: recipientes, máquinas, correias transportadoras, tubulações, aparelhagens, acessórios, válvulas, utensílios e similares. Revestimento – Substância ou produto aplicado sobre a superfície de embalagens ou equipamentos para alimentos com a inalidade de protegê-los e prolongar sua vida útil. Migração – Transferência de componentes do material em contato com alimentos para estes produtos, devido a fenômenos físico-químicos. Migração total ou global – Quantidade de componentes transferida dos materiais em contato com alimentos ou seus simulantes, nas condições usuais de emprego, elaboração e armazenamento ou nas condições equivalentes de ensaio. Migração específica – Quantidade de um componente não polimérico particular de interesse toxicológico transferida dos materiais em contato com alimentos para os alimentos ou seus simulantes, nas condições equivalentes de ensaio. Limite de migração total ou global – Quantidade máxima admissível de componentes de material em contato com alimentos transferida aos simulantes sob as condições de ensaio. Limite de migração específica – Quantidade máxima admissível de um componente especíico do material em contato com alimentos transferida aos simulantes nas condições de ensaio. Limite de composição – Quantidade máxima permitida de um componente particular de interesse toxicológico no material em contato com alimentos. Simulante – Produto que imita o comportamento de um grupo de alimentos que IAL - 541 Métodos Físico-Químicos para AnáliseCapítulo de Alimentos 4ª Edição XIV -- Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 1ª Edição Digital tem características semelhantes. Vidros – Materiais sólidos que possuem uma estrutura atômica molecular não cristalina obtidos, de modo geral, pelo resfriamento de uma massa fundida em condições controladas que impeçam sua cristalização. Podem ser incolores ou coloridos. São identiicados os seguintes tipos de vidro: • Vidro borossilicato • Vidro sódio-cálcico • Cristal (com teor mínimo de 10% de um ou mais dos seguintes metais: chumbo, bário, potássio, zinco, expressos como óxido). Esmaltes vitrificados – Materiais vítreos que correspondem à deinição anterior e que se utilizam como revestimento de embalagens e equipamentos de cerâmica porosa, vermelha ou branca, de vidro ou de metal (como porcelana, louça e artigos esmaltados ou vitriicados em geral), com a inalidade de impermeabilizar, proteger ou decorar. Embalagens de vidro retornáveis – Embalagens que podem ser utilizadas várias vezes, somente para conter alimentos, sofrendo um processo industrial de higienização, antes de cada reutilização. ção. Embalagens de vidro não retornáveis – Embalagens de vidro de uma única utiliza- Embalagens metálicas – Embalagens compostas exclusivamente de materiais metálicos ferrosos ou não ferrosos; de materiais ferrosos ou não ferrosos revestidos exclusivamente com revestimentos metálicos; de materiais ferrosos ou não ferrosos apresentando ou não revestimentos metálicos e revestidos em uma ou em ambas as faces por revestimentos poliméricos ou submetidas a uma operação de lubriicação. Embalagens celulósicas – São embalagens elaboradas ou revestidas com papel ou cartão, ou compostas por vários tipos de materiais, desde que a face em contato com alimento seja celulósica, inclusive aquelas que são revestidas ou tratadas supericialmente com parainas, resinas poliméricas e outras. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 91, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 13 de junho de 2001. Seção 1, p.60-61.Critérios gerais para embalagens e equipamentos em contato com alimentos. 286/IV Embalagens e equipamentos – Classificação dos alimentos Do ponto de vista de interação com as embalagens e equipamentos plásticos, os 542 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos alimentos são classiicados da seguinte forma: Tipo I – Alimentos aquosos não ácidos (pH superior a 5) Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: água, infusões de café e chá; cervejas ; leite desnatado; sucos de frutas não ácidas; bebidas contendo menos de 5% de álcool; mel; sorvetes sem substâncias gordurosas; geléias de frutas não ácidas; ovos sem casca etc. Tipo II – Alimentos aquosos ácidos (pH inferior ou igual a 5) Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: sucos de frutas ácidas; geléias de frutas ácidas; doces de frutas cítricas; tomates, extratos e concentrados de tomate; sorvetes de frutas ácidas; leites fermentados, inclusive os que contêm frutas; molhos; vinagre etc. Tipo III – a. Alimentos aquosos não ácidos contendo óleo ou gordura b. Alimentos aquosos ácidos contendo óleo ou gordura Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: carnes frescas de animais e de aves gordurosas; presunto e semelhantes; carnes enlatadas; pastas de carne e outras conservas de carne; embutidos de carnes frescas, curados, defumados, cozidos; peixes gordurosos e derivados; leite integral; maionese; sorvetes ricos em gordura; óleos e gorduras emulsionados; bebidas a base de cacau etc. Tipo IV – Alimentos oleosos ou gordurosos Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: óleos; gorduras; manteiga; margarina; chocolates etc. Tipo V – Alimentos alcoólicos (conteúdo em álcool superior a 5% v/v) Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: vinhos; licores; aguardentes; cervejas e sidras e outras bebidas contendo mais que 5% de álcool; alimentos conservados em meio alcoólico etc. Tipo VI – Alimentos sólidos secos ou de ação extrativa pouco signiicativa. Exemplos de alimentos enquadrados neste tipo: cereais; cereais inlados; farinhas; massas alimentícias; pães; biscoitos e outros produtos forneados não gordurosos; hortaliças e outros vegetais frescos; frutas secas; leite em pó; café em grão ou em pó, especiarias; caldos para sopas desidratados; sal etc. IAL - 543 Métodos Físico-Químicos para AnáliseCapítulo de Alimentos 4ª Edição XIV -- Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 1ª Edição Digital Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 287/IV Embalagens e equipamentos – Seleção dos simulantes de alimentos Com a inalidade de realizar os ensaios de migração em embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos, são deinidos os seguintes simulantes de alimentos: • Simulante A – Água • Simulante B – Solução de ácido acético a 3% (v/v) em água • Simulante C – Solução de álcool em água a 15% ou na concentração mais próxima da real de uso. • Simulante D – Óleo de oliva reinado; n-heptano Nota: o n-heptano é indicado como simulante alternativo. O comportamento do n-heptano como solvente simulante de alimentos oleosos está sendo questionado. A tendência geral é o uso de óleos vegetais (azeite de oliva, óleo de girassol ou soja), pois os mesmos são excelentes simulantes de alimentos oleosos, apesar do método correspondente ser mais complexo que o anterior. Tabela 1 – Tipos de alimentos e seus respectivos simulantes Alimento Simulante Tipo I A Tipo II B Tipo III a A,D Tipo III b B,D Tipo IV D Tipo V C Tipo VI Nenhum, ou ocasionalmente A,B,C ou D, dependendo do tipo de alimento 544 - IAL Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21- 34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 288/IV Embalagens e equipamentos – Condições dos ensaios de migração a) Nos ensaios de migração, o contato dos materiais de embalagem com os simulantes, nas condições de tempo e temperatura selecionados de acordo com a Tabela 2, será realizado de maneira a reproduzir as condições normais ou previsíveis de elaboração, fracionamento, armazenamento, distribuição, comercialização e consumo do alimento. b) Se uma embalagem ou equipamento é utilizado sucessivamente em várias condições de contato da Tabela 2, os ensaios de migração serão realizados submetendo-se as amostras sucessivamente a estas condições de teste, usando-se o mesmo simulante. c) Para um determinado tempo de contato, se o material passa nos ensaios de migração a uma determinada temperatura, não é necessário efetuar o teste a uma temperatura mais baixa. d) Para uma determinada temperatura de contato, se o material passa nos ensaios de migração a um determinado tempo de contato, não é necessário efetuar o teste a um tempo menor. e) Sempre que as condições de temperatura e tempo de contato não se enquadrem nas condições impostas na Tabela 2, deverão ser seguidas as condições que se aproximem das reais de uso. f) Para manter as amostras às temperaturas selecionadas, podem ser utilizados, dependendo do caso, congelador, refrigerador, banho-maria, estufa, autoclave ou forno de microondas. g) elaboração – Condições que se veriicam em períodos relativamente curtos, tais como: pasteurização, esterilização, acondicionamento a quente etc. h) armazenamento – Contato prolongado durante o armazenamento à temperatura ambiente ou de refrigeração. IAL - 545 Métodos Físico-Químicos para AnáliseCapítulo de Alimentos 4ª Edição XIV -- Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 1ª Edição Digital i) consumo – Aquecimento do alimento na própria embalagem antes da ingestão; utilização de utensílios domésticos de plástico em contato com alimentos. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 289/IV Embalagens plásticas – Preparo das amostras Procedimento – Sempre que possível, utilize uma área fácil de calcular (retângulo, círculo, cilindro etc.). Prepare um número de amostras tal que a superfície de contato esteja em torno de 600 cm2. Lave as amostras primeiramente em jato de água corrente e depois com água. Seque as amostras. Devido à grande diversiicação de materiais empregados para a fabricação de embalagens, cada um deles deverá ter um tratamento prévio especial, conforme descrito abaixo: a) Embalagem final (rígida, semi-rígida ou flexível) – Coloque o simulante à temperatura selecionada. Cubra ou lacre o recipiente e deixe à temperatura de teste durante o tempo indicado. b) Material plástico genérico (filme flexível, corpos rígidos, revestimentos poliméricos etc.) – Prepare amostras com uma superfície de contato de aproximadamente 600 cm2 (somatória de todas as superfícies postas em contato). Coloque em um béquer com um volume de simulante de tal forma que a relação área de material em contato/volume ique compreendida entre (2 e 0,5) cm2/mL, na temperatura selecionada; cubra o béquer com um vidro de relógio ou similar e deixe em contato na temperatura de ensaio pelo tempo indicado. c) Elementos de vedação (tampas, rolhas, guarnições e outros objetos de área pequena (por exemplo: palitos de pirulito, colheres para sorvetes etc., de um único uso) – Coloque2 um número suiciente (n) de amostras de modo que a área seja em torno de 600 cm em um béquer com um volume simulante de tal forma que a relação área de amostras/ volume de simulante esteja compreendida entre (2 e 0,5) cm2/mL, à temperatura selecionada. Cubra o béquer e deixe à temperatura de ensaio durante o tempo indicado. d) Filme composto semi-rígido – Corte um retângulo do ilme no tamanho de (15 x 20) cm. Construa com ele uma caixa. Lave a caixa com um jato de água corrente e, depois com água. Seque. Coloque o solvente simulante adequado e cubra com placa de vidro. Na impossibilidade de construir uma caixa, corte um quadrado de (8 x 8) cm do material, lave com jato de água corrente e, depois, com água. Seque. Coloque o solvente simulante em um copo de vidro com a borda recoberta por ita vedante. Cubra esse copo com a amostra cortada na forma de um quadrado de (8 x 8) cm e adapte esse conjunto ao dispositivo especial descrito na igura 1. Faça um branco substituindo a 546 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos amostra por placa de vidro, para veriicar se houve migração dos elementos da ita de vedação para o solvente. Figura 1 – Dispositivo para análise de uma face da embalagem e) Materiais e artigos compostos por duas ou mais camadas plásticas – Neste caso o teste é realizado de tal modo que o simulante ique em contato somente com as partes da amostra que durante seu uso real estejam em contato direto com os alimentos. Coloque o solvente simulante em um copo de vidro com a borda recoberta por ita vedante. Cubra esse copo com a amostra cortada na forma de um quadrado de (8 x 8) cm e adapte esse conjunto ao dispositivo especial descrito na Figura 1. Faça um branco substituindo a amostra por placa de vidro, para veriicar se houve migração dos elementos da ita de vedação para o solvente. f) Equipamentos destinados a entrar em contato com alimentos (utensílios, partes de maquinaria etc.) – Proceda de acordo com a, b, ou c, dependendo das condições reais de uso. Nota: quando o material a ser analisado for um verniz ou esmalte sintético, este deve ser aplicado para seu ensaio sobre placas de vidro esmerilhado. IAL - 547 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tabela 2 – Condições de ensaio CONDIÇÕES DE CONTATO NO USO REAL CONDIÇÕES DE ENSAIO Simulante A Simulante B Simulante C Água Ácido acético a 3% Álcool a 15% Simulante D Heptano ** Azeite de oliva * A. Conservação (contato prolongado, t > 24 h) T < 5°C 5°C/10 dias 5°C/10 dias 5°C/10 dias 5°C/30 min 5°C/10 dias 5°C < T < 40°C 40°C/10 dias 40°C/10 dias 40°C /10 dias 20°C/30 min 40°C/10 dias 20°C/15 min 40°C/24 h 20°C/15 min 40°C/2 h 40°C/15 min 80°C/2 h B. Contato breve (2 h < t < 24 h) à temperatura ambiente 40°C/24 h 40°C/24 h 40°C/24 h C. Contato momentâneo (t < 2 h) à temperatura ambiente 40°C/2 h 40°C/2 h 40°C/2 h D. Elaboração 40°C < T < 80°C 80°C/2 h 80°C/2 h 80°C/2h 80°C < T < 100°C 100°C/30 min 100°C/30 min – 50°C/15 min 100°C/30 min T > 100°C 120°C/30 min 120°C/30 min – 60°C/15 min 120°C/30 min * Os resultados obtidos com azeite de oliva devem ser divididos pelos fatores de redução especiicados de acordo com a Tabela 2 (Classiicação dos alimentos em função dos simulantes), constante no anexo I da Resolução 105 da ANVISA. ** Os resultados obtidos com n-heptano devem ser divididos por 5. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 290/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração total com simulantes aquosos e n-heptano No Brasil e nos outros Estados-Parte do Mercosul, o limite máximo permitido de 548 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos migração total ou global é de 8 mg/dm2 ou 50 mg/kg. Material Béqueres, vidros de relógio, provetas, dessecadores com cloreto de cálcio anidro, cápsulas de porcelana, banho-maria, estufa com temperatura regulável e refrigerador. Solventes Conforme o tipo de alimento a ser embalado, utilize o solvente correspondente descrito na Tabela 1. Procedimento – Após preparação das amostras de acordo com o indicado em 289/IV, acondicione as mesmas conforme Tabela 2. Em todos os casos, efetue uma prova em branco, com um volume igual do simulante utilizado na prova original. Transcorrido o tempo dos ensaios de migração, retire as amostras do béquer nos casos (b), (c) e (d), ou verta o simulante em um béquer no caso (a) e (d). Retire as amostras, lave e escorra com o mesmo simulante utilizado, que se incorpora ao simulante do teste. Após os ensaios de migração, o simulante não deve apresentar coloração visível nem odores estranhos. Evapore o simulante até reduzi-lo a um volume menor. Transira quantitativamente para uma cápsula tarada e prossiga com a evaporação em banho-maria e em seguida em estufa a (100 ± 5)°C até a secura. Resfrie a cápsula em dessecador e repita a operação até peso constante. Proceda da mesma maneira para a prova em branco e subtraia o peso do resíduo obtido anteriormente do da prova em branco, obtendo-se assim o resíduo seco do ensaio de migração, que será usado no cálculo da migração total. IAL - 549 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculos No caso de embalagens e equipamentos com capacidade superior ou igual a 250 mL, calcule a migração total (Q) com a fórmula: R = massa do resíduo seco em mg A = área total de contato da amostra com simulante, em dm² S/V = relação área/massa de água correspondente ao volume de contato real entre o material plástico e o alimento, em dm²/kg de água Quando o ensaio de migração é efetuado em material plástico genérico e não na embalagem inal, utilize a relação S/V real. Caso não se conheça esta relação, pode ser usada uma relação S/V = 6 dm²/L. Quando nos testes se usa a embalagem inal, então A = S e a fórmula se reduz a: R = massa do resíduo seco, em mg V = massa de água correspondente ao volume da embalagem em kg A migração (Q’) pode ser expressa também em mg/dm², mediante a fórmula: R = massa do resíduo seco, em mg A = área total de contato da amostra com o simulante em dm² No caso do ensaio de migração das amostras referentes ao item 289/IV (c), a migração Q é calculada de acordo com a fórmula: R = massa do resíduo seco, em mg N = número de amostras analisadas V = massa de água correspondente ao volume do recipiente no qual serão usados os elementos de vedação ou outros objetos, em kg. 550 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos Notas No caso de n-heptano, o volume do mesmo deverá ser reduzido em destilador rotatório, com a recuperação deste solvente. As últimas porções são transferidas para uma cápsula tarada e prossegue-se como descrito anteriormente. As tolerâncias analíticas são as seguintes: 5 mg/kg ou 0,8 mg/dm², nos ensaios de migração total, dependendo da forma de expressão dos resultados. Quando uma embalagem ou equipamento se destina a entrar em contato repetidas vezes com alimentos, com exceção das embalagens retornáveis que são objeto de uma norma especíica, os ensaios de migração deverão ser efetuados três vezes sobre uma mesma amostra, usando-se a cada vez quantidades novas de simulante. A aprovação deste tipo de embalagem ou equipamento dependerá do nível de migração total determinado no terceiro ensaio de migração. O resultado inal será o nível obtido na terceira prova, porém nos três ensaios o limite de migração total não poderá ser excedido. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 291/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração total com n-heptano após extração com clorofórmio No caso do simulante utilizado ser n-heptano, o valor do resíduo seco deve ser dividido por 5. Se o valor da migração global correspondente for superior ao limite estabelecido, submete-se o resíduo seco a uma extração com clorofórmio. Procedimento – Adicione ao resíduo seco, na mesma cápsula, 50 mL de clorofórmio. Aqueça cuidadosamente e iltre em papel Whatman nº 41. Lave o papel de iltro com o mesmo solvente e recolha o iltrado em uma cápsula tarada. Evapore o solvente e seque em estufa a (100 ± 5)°C. Resfrie em dessecador e pese o novo resíduo seco. Este resultado deve ser dividido por 5 para ser usado no cálculo inal. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oficial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21- 34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. IAL - 551 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 292/IV Embalagens plásticas – Determinação de metais em corantes e pigmentos Este método se aplica à determinação de metais em corantes e pigmentos em embalagens e equipamentos plásticos. Nos extratos, são determinados os metais utilizando-se a espectrometria de absorção atômica de acordo com o detalhado a seguir: chumbo, selênio, cádmio e zinco (com chama de ar-acetileno); bário: com chama nitroso-acetileno; mercúrio: com vapor frio; arsênio: com geração de hidretos. Material Béqueres, funis, balões volumétricos de 50 mL, provetas, balança analítica e espectrômetro de absorção atômica e mesa agitadora. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 1 M para arsênio Solução de ácido nítrico 1 M para chumbo Solução de ácido clorídrico 0,1 M para bário, cádmio, zinco, mercúrio e selênio Procedimento – Pese 2 g de amostra em um béquer de 150 mL. Adicione 30 mL das soluções de extração descritas em reagentes, dependendo do metal a ser analisado. Agite em mesa agitadora durante duas horas à temperatura ambiente. Deixe decantar por uma hora e iltre utilizando papel de iltro umedecido com 2 mL da solução de mesma concentração utilizada para a extração, recolhendo o iltrado em um balão volumétrico de 50 mL. Complete o volume com as soluções de extração. Nos extratos, determine os metais utilizando a espectrometria de absorção atômica. Nota: poderão ser usados métodos colorimétricos recomendados pela Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C.), quando o laboratório não dispuser de espectrômetro de absorção atômica. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oficial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 552 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 293/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração de corantes e pigmentos Procedimento – Compare visualmente, com os brancos respectivos, os extratos obtidos nos ensaios de migração total das embalagens e equipamentos plásticos coloridos, realizados com os simulantes correspondentes, nas temperaturas e tempos de contato detalhados na Tabela 2. Nestas condições, não devem existir diferenças veriicadas visualmente entre a coloração do extrato e do seu branco. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21- 34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. 294/IV Embalagens plásticas – Determinação da migração específica de metais e outros elementos Sempre que a formulação da embalagem apresentar metais e outros elementos com limites de migração constantes na legislação deve-se realizar este ensaio. Procedimento – Determine as concentrações de metais e outros elementos em extratos obtidos como os descritos nos ensaios de migração total das embalagens e equipamentos plásticos coloridos, realizados com os simulantes correspondentes nas temperaturas e tempos de contato detalhados na Tabela 2. A determinação é efetuada por espectrometria de absorção atômica ou, alternativamente, pelas técnicas colorimétricas recomendadas pela Association of Official Analytical Chemists (A.O.A.C.). Os elementos a determinar nos extratos acima mencionados são: antimônio (Sb), arsênio (As), bário (Ba), boro (B), cádmio (Cd), chumbo (Pb), cobre (Cu), cromo (Cr), estanho (Sn), lúor (F), mercúrio (Hg), prata (Ag) e zinco (Zn). Esses elementos não devem migrar em quantidades superiores aos limites estabelecidos na legislação vigente correspondente a contaminantes em alimentos. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 105, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de maio de 1999, Seção I, p. 21-34. Disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. IAL - 553 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 295/IV Embalagens de vidro e cerâmica – Determinação da migração global Este método se aplica a embalagens e equipamentos de vidro ou cerâmica esmaltada ou vitriicada que entram em contato direto com alimentos durante sua produção, elaboração, fracionamento, armazenamento, distribuição, comercialização e consumo. As embalagens e equipamentos a que se refere este método estão destinados a entrar em contato com alimentos por períodos prolongados ou breves e repetidos. Engloba as embalagens assim como os equipamentos de uso industrial e utensílios empregados para uso doméstico. Podem ser utilizadas, para contato com alimentos, as embalagens e equipamentos fabricados somente com os seguintes tipos de vidro: borossilicato, sódio-cálcico e cristal. Os limites de migração total estabelecido são: 50 mg de resíduo/kg de água ou 8 mg/dm2. As tolerâncias analíticas são: 5 mg/kg de água ou 0,8 mg/dm2. Material Proveta, placas de Petri ou vidros de relógio, autoclave, banho-maria, cápsula de platina com capacidade de 100 mL, estufa, balança analítica e dessecador. Reagente Detergente comercial Procedimento Preparação das amostras – Os objetos submetidos a ensaio devem estar limpos e isentos de gordura. Devem ser lavados com uma solução diluída e morna de um detergente comercial, devendo ser enxaguados a seguir com água corrente e depois pelo menos duas vezes com água, ou imersos em água, em repouso, durante pelo menos 30 minutos. O número de amostras deve ser tal que a quantidade de líquido simulante não seja inferior a 250 mL. Em todos os casos devem ser realizadas provas em branco, com uma quantidade de água igual à empregada no ensaio. Determinação da migração global – Coloque em cada um dos objetos um volume de água correspondente a 90% de sua capacidade e anote o volume usado. Cubra as amostras com uma placa de Petri ou um vidro de relógio. Estes materiais devem ser submetidos, pelo menos 3 vezes, a uma hora de autoclavagem a (121 ± 1)°C. Coloque as amostras em uma autoclave nas seguintes condições: • 20 minutos para atingir 100°C • 10 minutos para que o vapor lua livremente • 2 minutos para atingir 121°C • 30 minutos estabilizados em 121°C • 42 ± 4 minutos para resfriamento • 15 minutos de esfriamento no ar 554 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos Retire as amostras da autoclave e coloque em um banho de água a 80°C, esfriado com água corrente durante (10-20) minutos, até alcançar a temperatura ambiente. Transira o conteúdo dos recipientes em teste, fração por fração, para uma cápsula de platina com capacidade aproximada de 100 mL, previamente seca em estufa a 150°C e pesada em balança analítica. Evapore o conteúdo das cápsulas em banho-maria até a secura. Depois da evaporação, coloque as cápsulas durante 1 hora em estufa a (150 ± 5)°C. Esfrie as cápsulas em dessecador e pese novamente em balança analítica. O resultado da pesagem menos a correspondente prova em branco é o resíduo seco. Cálculos O resultado, denominado migração total, pode ser expresso de acordo com as seguintes equações: R = massa do resíduo seco em mg S = área da amostra de vidro ensaiada em dm² V = massa de água correspondente ao volume da embalagem em kg Q = migração total, em mg/kg de água Q’= migração total em mg/dm² Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. – Portaria Nº 27, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de março de 1996, Seção I, p. 4691-4692. Embalagens e equipamentos de vidro e cerâmica destinados a entrar em contato com alimentos. 296/IV Embalagens de vidro e cerâmica – Determinação da migração específica de metais pesados O ensaio de migração especíica de metais pesados se aplica também aos objetos de vidro decorados na superfície de contato com os alimentos. Estes ensaios devem ser efetuados com proteção da luz. Os limites de migração especíica de metais pesados são estabelecidos de acordo com as seguintes categorias: Categoria 1: objetos que não possam ser preenchidos e objetos que possam ser preenchidos, cuja profundidade interna entre o ponto mais baixo e o ponto mais horizontal que passa pela borda superior seja inferior ou igual a 25 mm: • chumbo: 0,8 mg/dm² • cádmio: 0,07 mg/dm² IAL - 555 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Categoria 2: todos os demais objetos que possam ser preenchidos: • chumbo: 4,0 mg/kg • cádmio: 0,3 mg/kg Categoria 3: utensílios de cozinha, embalagens e recipientes de armazenamento que tenham capacidade superior a 3 litros: • chumbo: 1,3 mg/kg • cádmio: 0,1 mg/kg Material Estufa, proveta, vidro de relógio, termômetro e espectrômetro de absorção atômica. Reagente Ácido acético a 4% v/v Procedimento Preparação das amostras – Limpe e desengordure os objetos submetidos ao ensaio com uma solução diluída e morna de um detergente comercial. Enxágüe a seguir com bastante água corrente e depois com água destilada ou desmineralizada. Despreze as águas de enxaguadura e inverta os recipientes sobre um tecido limpo e não felpudo. Determinação da migração especíica – Coloque os recipientes vazios durante 45 minutos em uma estufa a (80 ± 2)°C. Coloque solução de ácido acético a 4%, previamente aquecido a 80°C, até 90% da capacidade do recipiente. Anote o volume de ácido usado e cubra com vidro de relógio. Deixe os recipientes em estufa, regulada a (80 ± 2)°C durante (120 ± 2) minutos. Retire os recipientes da estufa e leve à temperatura ambiente o mais rápido possível, protegendo-os da luz. Determinação da migração de chumbo e cádmio – Utilize a espectrofotometria de absorção atômica para determinar as quantidades de metais liberadas pela amostra, expressando os resultados em mg/kg ou em mg/dm² de área de amostra em contato com o líquido de ensaio, efetuando uma prova em branco em paralelo. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 27, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 20 de março de 1996, Seção I, p. 4691- 4692. Embalagens e equipamentos de vidro e cerâmica destinados a entrar em contato com alimentos. 556 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos 297/IV Embalagens metálicas – Determinação da migração global Este método se aplica às embalagens, tampas e equipamentos elaborados com materiais metálicos, revestidos ou não, que entram em contato com alimentos e suas matérias-primas durante sua produção, elaboração, transporte, distribuição e armazenamento. Os limites de migração total estabelecidos são 50 mg/kg ou 8 mg/dm2, de acordo com a forma de expressão dos resultados. As tolerâncias analíticas são as seguintes: 5 mg/ kg ou 0,8 mg/dm2, de acordo com a forma de expressão dos resultados. Material Provetas de 50 mL, cápsulas de porcelana, banho-maria, funil, papel de iltro quantitativo, estufa, balança analítica e dessecador. Reagentes Solventes simulantes como descrito na Tabela 1 Clorofórmio Procedimento – O procedimento de ensaio é o mesmo descrito em 286/IV, 287/IV, 288/IV, 289IV e 290/IV, com a ressalva que o verniz ou esmalte deve ser aplicado sobre o substrato metálico para o qual se destina. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 20, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 26 de março de 2007, Seção I, p.55-56. Disposições sobre embalagens e equipamentos metálicos em contato com alimentos. 298/IV Embalagens metálicas – Resíduo solúvel em clorofórmio corrigido Caso o resultado encontrado no ensaio de migração total seja superior ao limite estabelecido, efetue a extração com clorofórmio para correção por migração de metais. Procedimento – Adicione 50 mL de clorofórmio ao resíduo proveniente do ensaio de migração total e aqueça em banho-maria até completa dissolução. Esfrie e iltre em papel de iltro quantitativo em uma cápsula tarada, evaporando completamente. Seque em estufa e pese, repetindo o procedimento até massa constante. Paralelamente efetue um ensaio em branco, para obter a massa do resíduo corrigido (R´). Cálculo Quando o ensaio de migração for efetuado com material metálico genérico, deve-se utiIAL - 557 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital lizar a seguinte fórmula: R´ = massa do resíduo corrigido em mg A = área total da amostra em contato com o simulante em dm2 S/V = relação área / massa de água correspondente ao volume de contato real do material e o alimento em dm2/kg de água Quando o ensaio de migração for efetuado com a embalagem inal ou com tampas, então A = S e a fórmula se reduz a: R´= massa do resíduo corrigido em mg V = massa de água correspondente ao volume de embalagem em kg. 2 A migração (Q´) pode também ser expressa em mg/dm , mediante a seguinte fórmula: R´= massa do resíduo corrigido em mg 2 A = área total de contato entre a amostra e o simulante em dm Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 20, da Agência Nacional de de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 26 de março de 2007, Seção I, p.55- 56. Disposições sobre embalagens e equipamentos metálicos em contato com alimentos. 299/IV Embalagens metálicas – Resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco Este método se aplica para vernizes que contenham óxido de zinco, se a migração total excede os limites estabelecidos. O método se baseia na determinação gravimétrica do resíduo solúvel. Material Mula ou maçarico tipo Meker, cápsula de platina, balança analítica e dessecador. Procedimento – Calcine o resíduo obtido em cápsula de platina por aquecimento em maçarico tipo Meker ou mula à temperatura equivalente para destruir a matéria orgânica. Deixe ao rubro por aproximadamente 1 minuto. Esfrie ao ar durante 3 minutos, e coloque em dessecador durante 30 minutos e pese com precisão de 0,1 mg. Esta cinza 558 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos é analisada para determinação de zinco de acordo com o método da A.O.A.C. ou outro equivalente. Cálculo Expresse o conteúdo de zinco na cinza como oleato de zinco, e subtraia a quantidade de resíduo solúvel em clorofórmio ( R´), para obter o valor de resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco (R”). Este R” substitui o R´ nas equações anteriores. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 20, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oficial, Brasília, 26 de março de 2007, Seção I, p.55-56. Disposições sobre embalagens e equipamentos metálicos em contato com alimentos. 300/IV Embalagens metálicas – Determinação da migração específica de metais em embalagens de folhas de flandres Material Banho-maria termostatizado ou autoclave, espectrômetro de absorção atômica, estufa e béqueres. Reagentes Solução aquosa contendo 3% de cloreto de sódio, 10% de sacarose e 1% de ácido tartárico. Solução aquosa de álcool a 8% contendo 0,5% de ácido tartárico. Procedimento – Para a realização dos ensaios de migração especíica de metais, os alimentos são classiicados e ixados os respectivos simulantes da seguinte forma: Tipo A – Alimentos aquosos ácidos e não ácidos, esterilizados na embalagem por ação do calor, que podem conter sal e/ou açúcar e incluir emulsões óleo/água, ou baixo teor de gordura. Estes produtos devem ser ensaiados com uma solução aquosa contendo 3% de cloreto de sódio, 10% de sacarose e 1% de ácido tartárico, com a qual se completa o volume da embalagem. Deve-se manter a embalagem fechada, contendo a solução, em banho de água por 2 horas a 100°C ou em autoclave durante 30 minutos a 120°C. Tipo B – Alimentos de composição similar aos do tipo A, que não sofram tratamento térmico. Estes alimentos devem ser ensaiados com o mesmo simulante que os do tipo A, IAL - 559 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital mantendo as embalagens durante 24 horas a 80°C. Tipo C – Alimentos (bebidas) com conteúdo de álcool superior a 4%. Estes produtos devem ser ensaiados com solução aquosa de álcool a 8%, contendo 0,5% de ácido tartárico, mantendo-se a embalagem durante 48 horas a 40°C. Notas Em todos os casos, o espaço livre bruto de embalagem no ensaio não deve ser superior a (6-7)% de seu volume total. O fecho hermético deve ser feito depois do acondicionamento, com a solução aquecida a 80°C. No caso de ensaio de tampas para embalagens de vidro, deve-se adotar o mesmo procedimento, utilizando-se a embalagem correspondente em posição invertida, de modo a permitir o contato do material em ensaio com o simulante. Quando se tratar de alimentos tipo A, as condições de extração devem ser em banho de água por duas horas a 100°C. Para equipamentos metálicos devem ser empregadas as condições reais de uso. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 20, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 26 de março de 2007, Seção I, p.55- 56. Disposições sobre embalagens e equipamentos metálicos em contato com alimentos. 301/IV Embalagens celulósicas – Determinação da migração global Esta metodologia se aplica a embalagens e equipamentos celulósicos destinados a entrar em contato com alimentos e matérias-primas para alimentos, inclusive aqueles materiais celulósicos revestidos ou tratados supericialmente com parainas, resinas poliméricas e outros. Aplica-se também às embalagens e equipamentos de uso doméstico, elaborados ou revestidos com papel e cartão, ou embalagens compostas por vários tipos de materiais, sempre que a face em contato com alimentos seja celulósica. Excluem-se aquelas embalagens e equipamentos celulósicos destinados a entrar em contato com alimentos que necessariamente são descascados para seu consumo (por exemplo: frutas cítricas, nozes com cascas, cocos, abacaxis, melões etc.) sempre e quando se assegure que não modiiquem as características organoléticas do alimento e não cedam substâncias prejudiciais para a saúde. Não se aplica a embalagens secundárias fabricadas com papel, 560 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos cartão ou cartolina, sempre que se assegure que não entrem em contato com alimentos. Este método se baseia na quantiicação gravimétrica do resíduo total extraído do material celulósico após contato com simulantes de alimentos, sob condições reais de emprego do material. O limite de migração total para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos, com as correções indicadas, é de 8 mg/dm2. Material Frascos Erlenmeyer, cápsula de platina ou de vidro borosilicato, estufa, béqueres, chapa de aquecimento, balança analítica, dessecador, congelador, refrigerador, banho-maria e autoclave ou forno de microondas. Reagentes Água destilada e desmineralizada n-Heptano Solução aquosa de ácido acético a 3% v/v Solução alcoólica a 15% v/v ou na concentração mais próxima do alimento, preparada a partir de álcool diluído com água destilada e desmineralizada. Clorofórmio Notas Veriique o descrito em 287/IV. As análises devem ser efetuadas em quadruplicata, acompanhadas pela análise de um branco. Para os ensaios de migração devem ser utilizados os simulantes descritos na Tabela 1, exceto o simulante D que será o n-heptano. O contato dos materiais celulósicos com os simulantes, nas condições de tempo e temperatura selecionadas na Tabela 3, será realizado de maneira a que reproduza as condições normais e previsíveis de uso na elaboração, fracionamento, armazenamento, distribuição, comercialização e consumo dos alimentos. Procedimento – Coloque o simulante escolhido em uma relação de 0,3 mL/cm2 de superfície analisada, na temperatura selecionada segundo a Tabela 3, cubra ou feche o recipiente e deixe na temperatura de ensaio pelo tempo indicado. No inal do período de contato, deixe atingir a temperatura ambiente, junte o solvente de cada uma das embalagens ou equipamentos utilizados em cada ensaio em um frasco Erlenmeyer ou béquer limpo. Lave as amostras com uma pequena quantidade de solvente limpo e agregue os líquidos de lavagem ao recipiente Evapore o solvente até aproximadamente 100 mL e transira para uma cápsula tarada de platina ou vidro borossilicato. Lave o frasco Erlenmeyer ou béquer três vezes com pequenas porções do solvente utilizado, agregando os líquidos de lavagem à cápsula. Evapore o conteúdo da cápsula até poucos mL, evitando IAL - 561 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital perdas, em uma chapa de aquecimento. Os últimos mL devem ser evaporados em estufa a 105°C. Esfrie a cápsula em dessecador por 30 minutos e pese o resíduo com precisão de 0,1 mg. Cálculo Calcule a migração total em mg/dm² de superfície da embalagem analisada segundo o cálculo do procedimento 290/IV. Quando a migração total exceder o limite estabelecido, prosseguir com a extração do resíduo solúvel em clorofórmio, segundo o procedimento 291/IV . Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9-14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 302/IV Embalagens celulósicas – Extração em materiais com pigmentos minerais Sempre que a embalagem, equipamento ou material não permitir a realização da extração segundo 301/IV, no caso de materiais sem impressão e sem revestimento com pigmentos minerais (sem coating), realizar a extração segundo este método. Material Banho-maria termostatizado, com temperatura variando de [(20-50)±1]ºC, com capacidade para que um béquer de 800 mL ique parcialmente submerso, balança analítica, pinças, chapas de aquecimento, estufa, mula, clipes para papel nº 2, béquer de 800 mL com vidro de relógio, cápsula de 250 mL, cinco telas quadradas de pelo menos 40 cm2 cada uma, de aço inoxidável nº 316, suporte para conter várias amostras e arame capaz de sustentar o sistema de ixação das amostras. Reagentes Solventes simulantes como descrito na Tabela 1. Procedimento – Para cada um dos ensaios de extração, corte precisamente oito amostras quadradas, iguais às telas, de 40 cm2, no mínimo. Monte cuidadosamente as oito amostras e as telas metálicas em forma de sanduíche, de modo a que o lado de contato com o alimento de cada amostra ique sempre em contato com a tela, como descrito: tela, amostra, amostra, tela, amostra, amostra, tela, etc. Prenda o sanduíche cuidadosamente com um clipe de papel nº 2, deixando um espaço suiciente no topo para poder atravessar 562 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos o arame. Coloque todo o conjunto em um béquer de 800 mL, contendo 100 mL do solvente simulante apropriado, em um banho-maria com a temperatura desejada, cubra com um vidro de relógio e deixe o tempo necessário. Depois do acondicionamento, usando as pinças, cuidadosamente, retire o sanduíche, prenda no suporte e deixe escorrendo sobre o próprio solvente simulante utilizado no teste. Quando o solvente já tiver escorrido, transira o mesmo para uma cápsula de 250 mL tarada. Lave o béquer de 800 mL três vezes usando não mais que 50 mL do solvente utilizado no ensaio. Cálculo Determine o resíduo não volátil total extraído como descrito no cálculo do procedimento 290/IV. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9-14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 303/IV Embalagens celulósicas – Extração em materiais revestidos ou tratados superficialmente com parafinas e/ou laminados Material Dispositivo que permita a ixação da amostra de forma que o contato com o simulante seja apenas no lado de interesse, como por exemplo a Figura 1, ou a cela descrita no Official Methods of Analysis Official Analytical Chemists, 13th ed. (1980) Sec. 21010 - 21015, copos de vidro com borda recoberta por uma ita de teflon, béqueres. Reagentes Solvente simulante como descrito na Tabela 1 Procedimento – Corte a amostra nas dimensões compatíveis com os dispositivos empregados. O número de amostras para cada determinação deve ter uma área total de contato de pelo menos 600 cm2. Coloque os solventes simulantes em um número adequado de copos de vidro com borda recoberta por ita teflon, de modo que no total se utilize um volume de 100 mL e se mantenha a relação área/volume em cada um dos copos. Coloque a amostra sobre o copo e adapte o conjunto no dispositivo IAL - 563 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de ixação (Figura 1). Inverta o dispositivo para que haja contato do solvente com a amostra. Faça um branco substituindo a amostra por placa de vidro para veriicar se houve migração dos elementos da ita de vedação para o solvente. Deixe em contato pelo tempo e temperatura estipulados na Tabela 3. Inverta o dispositivo para a posição normal e deixe transcorrer o tempo necessário. Retire as amostras e junte as alíquotas de solvente em um béquer tarado. Lave os copos de vidro com não mais de 20 mL por copo com o solvente utilizado no teste. Evapore o solvente em chapa de aquecimento até aproximadamente 5 mL, que devem ser totalmente evaporados em uma estufa a aproximadamente 105°C. Esfrie o béquer em dessecador por 30 minutos e pese o resíduo em uma balança analítica. Subtraia o peso obtido no teste do branco obtendo um resíduo total (R). O peso do branco deve ser < 1,0 mg/100 mL e < 30% do peso do resíduo total. Cálculo Calcule a migração total em mg/cm2 de amostra, de acordo com o descrito no procedimento 290/IV. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9-14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 304/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio Quando a migração total exceder o limite estabelecido no procedimento 290/IV, prossiga com a extração do resíduo solúvel em clorofórmio. Material Provetas, cápsulas de platina ou porcelana, funil de vidro, papel de iltro Whatman nº 41, béqueres, chapa de aquecimento, estufa, balança analítica e dessecador. Reagente Clorofórmio Procedimento – Adicione 50 mL de clorofórmio ao resíduo total (R) obtido no procedimento 301/IV. Aqueça cuidadosamente e iltre em papel de iltro Whatman nº 41 (ou 564 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos equivalente) utilizando um funil de vidro. Colete o iltrado em uma cápsula de porcelana ou platina limpa e tarada. Lave o béquer e o papel de iltro com uma segunda porção de clorofórmio e junte ao iltrado original. Evapore até poucos mL em uma chapa de aquecimento. Os últimos mL devem ser evaporados em uma estufa a 105°C. Esfrie a cápsula em dessecador por 30 minutos e pese com precisão de 0,1 mg para obter o resíduo solúvel em clorofórmio (R’). Este resíduo R’ deve substituir o R nas equações descritas em 306/IV. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9 a 14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 305/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco Quando a migração total calculada com o resíduo solúvel em clorofórmio (R’) exceder o limite estabelecido, proceda a correção para o zinco. O método se baseia na análise gravimétrica para determinação de zinco. Material Cápsula de platina, mula ou bico tipo Meker, dessecador e balança analítica. Procedimento – Calcine o resíduo solúvel em clorofórmio obtido em cápsula de platina por aquecimento em bico tipo Meker ou em mula à temperatura equivalente para destruir a matéria orgânica. Deixe ao rubro por aproximadamente um minuto. Esfrie ao ar durante 3 minutos e posteriormente em dessecador por 30 minutos. Pese e determine o teor de zinco na cinza de acordo com o método A.O.A.C. ou outro equivalente. Cálculo Expresse o conteúdo de zinco na cinza, como oleato de zinco e subtraia esta quantidade do resíduo solúvel em clorofórmio (R’), para obter o valor do resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para zinco (R’’) Este R’’ substitui o R’ nas equações apresentadas em 306/IV. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9-14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 306/IV Embalagens celulósicas – Determinação do resíduo solúvel em clorofórmio corrigido para ceras, vaselinas e óleos minerais. IAL - 565 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A correção para ceras, vaselinas e óleos minerais é necessária no caso em que estas substâncias façam parte da composição da amostra. Material Coluna cromatográica padrão de 100 mm de diâmetro interno por 60 cm ou bureta padrão de 50 mL com diâmetro interno de (10-11) mm com uma válvula reguladora de vidro, resina de perluorcarbono ou equivalente. A coluna (ou bureta) pode ser opcionalmente equipada com disco de vidro sinterizado e o topo da coluna pode ser opcionalmente ajustado com reserva de 100 mL de solvente, lã de vidro ina, areia ina, proveta, béquer, estufa, chapa de aquecimento, dessecador, balança analítica, pipetas e balões volumétricos. Reagentes n-Heptano Sulfato de sódio anidro Óxido de alumínio grau cromatográico de (80-200) mesh Procedimento Preparação da coluna – Coloque uma pequena porção de lã de vidro ina no fundo da coluna (ou bureta), se esta não estiver equipada com disco de vidro sinterizado. Coloque uma camada de (15-20) mm de areia ina. Meça 15 mm de óxido de alumínio grau cromatográico de (80-200) mesh num cilindro graduado (para medir, bata cuidadosamente o cilindro para acomodar o óxido de alumínio). Transira o óxido de alumínio para a coluna cromatográica, batendo levemente durante e depois da transferência. Coloque sobre a camada de óxido de alumínio uma camada de (10-15) mm de sulfato de sódio anidro e no topo coloque uma porção de lã de vidro, de (6-10) mm. Adicione 25 mL de heptano na coluna com a válvula reguladora aberta para permitir que o heptano passe através da coluna até o nível do líquido atingir o topo da coluna e então feche a válvula. Procedimento para o resíduo solúvel em clorofórmio pesando 0,5 g ou menos – Dissolva o resíduo solúvel em clorofórmio obtido no procedimento 304/IV, adicionando 20 mL de heptano e agitando se necessário. Aqueça cuidadosamente a té dissolver o resíduo. O heptano pode ser adicionado até 50 mL para auxiliar a dissolução do resíduo. Esfrie até a temperatura ambiente (se a solução se tornar turva, usar o procedimento descrito em 305/IV). Transira o heptano para a coluna. Enxágüe o frasco com 10 mL de heptano e adicione à coluna. Deixe o líquido passar pela coluna, gotejando em torno de 2 mL/min e colete a amostra eluída em béquer limpo e tarado. Quando o nível do líquido alcançar o topo da coluna, feche a válvula reguladora temporariamente. Enxágüe o frasco que continha a amostra com (10-15) mL de heptano e adicione à coluna. Elua a coluna com mais heptano, coletando no total aproximadamente 100 mL de solvente. Evapore em chapa de aquecimento o heptano eluído da coluna até aproximadamente 5 mL. Seque o restante 566 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos em estufa a 105°C por 30 minutos. Esfrie o frasco em dessecador por 30 minutos e pese o resíduo com precisão de 0,1 mg. Cálculo Subtraia o peso obtido do peso do resíduo solúvel em clorofórmio (R’) para obter o resíduo corrigido para cera, vaselina e óleos minerais (RR’). Este RR’ substitui o R’ nas equações apresentadas em 306/IV. Procedimento para o resíduo solúvel em clorofórmio pesando mais que 0,5 g – Dissolva o resíduo solúvel em clorofórmio seguindo o mesmo procedimento descrito para o resíduo solúvel em clorofórmio pesando 0,5 g ou menos usando uma maior quantidade de heptano. Transira a solução de heptano para um balão volumétrico de tamanho apropriado e ajuste o volume com adição de heptano (exemplo: balão volumétrico de 250 mL para 2,5 g de resíduo). Pipete uma alíquota de 50 mL calculada para conter (0,1-0,5) g de resíduo solúvel em clorofórmio e analise cromatograicamente como descrito no procedimento para o resíduo solúvel em clorofórmio pesando 0,5 g ou menos. Neste caso, o resíduo seco pesado de heptano deve ser multiplicado pelo fator de diluição para obter o peso do resíduo de cera, vaselina e óleo mineral a ser subtraído do peso do resíduo solúvel em clorofórmio (R’) para obter a correção de resíduo solúvel em clorofórmio para cera, vaselina e óleo mineral (RR’). Este RR’ substitui R’ na equação apresentada em 306/IV. No caso do extrato solúvel em clorofórmio que contenha ceras de alto ponto de fusão (ponto de fusão maior que 77°C), pode ser necessária uma diluição da solução de heptano, em que uma alíquota de 50 mL possa conter somente (0,1-0,2) g de resíduo solúvel em clorofórmio. Cálculos No caso do solvente simulante utilizado ser água, soluções de ácido acético ou soluções alcoólicas, a migração total é calculada de acordo com a seguinte fórmula: R = massa do resíduo total em mg S = superfície de amostra testada em cm² No caso do solvente simulante utilizado ser n-heptano, a migração total é calculada da seguinte maneira: R = massa do resíduo total, em mg IAL - 567 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital S = superfície da amostra testada, em cm² F = 5, que corresponde ao fator de correção devido à relação de maior extração do nheptano quando comparada com a extração, nas mesmas condições, de um alimento oleoso ou gorduroso Nota: R’, R’’ e RR’ substituem R na equação quando for necessário. Tabela 3 – Condições para os ensaios de migração CONDIÇÕES DE CONTATO REAL DE USO CONDIÇÕES DE ENSAIO Simulante A Simulante B Simulante C Ácido Acético Álcool a 15% a 3% (m/v) (v/v) A . Contato prolongado t >24h Água Simulante D n-heptano* T< 5ºC 20°C/48 h 20°C/48 h 20ºC/48 h 20°C/30 min 5°C<T< 40°C 50°C/24 h 50°C/24 h 50°C/24 h 20°C/30 min 40°C/24 h 40°C/24 h 20°C/15 min B. Contato breve ( 2h < t < 24 h) à temperatura ambiente 40°C/24 h C. Contato momentâneo (t < 2 h) à temperatura ambiente 40°C/2 h 40°C/2 h 40°C/2 h 20°C/15 min 65°C/2h 40°C/30 min D. Elaboração 40°C<T≤80ºC 65ºC/2 h 65°C/2 h 80°C<T≤100°C 100°C/30 min 100°C/30 min – 50°C/30 min T>100°C 120°C/2 h 120°C/2 h – 65°C/2 h – 50°C/15 min E. Envasado a quente T>70°C à T de ebulição e esfriar a 38°C à T de ebulição e esfriar a 38°C *No caso de material celulósico revestido com paraina não é necessário o ensaio de migração total com o simulante n-heptano. 568 - IAL Capítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Portaria Nº 177, da Secretaria de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 08 de março de 1999, Seção I, p. 9-14. Disposições gerais para embalagens e equipamentos celulósicos em contato com alimentos. 307/IV Embalagens elastoméricas – Determinação de ditiocarbamatos, tiouramas e xantogenatos As embalagens, equipamentos e acessórios elaborados com material elastomérico devem ser analisadas da mesma forma que as embalagens plásticas, atendendo aos ensaios de migração total e especíica, utilizando-se os mesmos solventes simulantes e a mesma tabela de temperatura e tempo de contato. Uma análise adicional importante é a determinação especíica de agentes de vulcanização (ditiocarbamatos, tiouramas e xantogenatos), devido à sua toxicidade. Material Pipeta de 100 mL, béquer de 400 mL, trompa de vácuo, balão volumétrico de 25 mL, manta aquecedora, proveta de 10 mL, espectrofotômetro UV/VIS e aparelhagem montada como segue: balão de 3 gargalos, ligado, em série, a 2 retentores. Num dos gargalos é inserido um tubo de vidro para passagem de ar, no central, um funil de separação para alimentação e, no outro, um refrigerante ligado, com um tubo em U, a um retentor contendo, sobre esferas de vidro, 10 mL de solução de hidróxido de sódio a 6,5% (para retenção de eventual gás sulfídrico formado). O retentor é ligado inalmente a um outro, munido de válvula de recolhimento, contendo, sobre esferas de vidro, 15 mL de reagente colorimétrico. Neste último retentor é aplicado um pequeno vácuo que permite um luxo constante de ar (Figura 2). Figura 2 – Aparelho para a determinação de sulfeto de carbono IAL - 569 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução de hidróxido de sódio a 6,5% Cloreto estanoso Ácido clorídrico a 37% Sulfeto de carbono Reagente colorimétrico – Pese 12 mg de acetato de cobre monoidratado e 25 g de dietanolamina, transira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Procedimento – Coloque no balão de três gargalos 100 mL da solução proveniente da prova de cessão. Adicione 2 g de cloreto estanoso e aplique o vácuo. Aqueça o balão por meio de uma manta aquecedora. Paralelamente, leve à ebulição um béquer contendo uma solução de ácido clorídrico diluído (25 mL de ácido clorídrico a 37% em 200 mL de água). Coloque por meio de um funil de separação no balão. Recolha o sulfeto de carbono desenvolvido, após ter passado pelo retentor contendo solução de hidróxido de sódio a 6,5%, no segundo retentor, sobre o reagente colorimétrico. Interrompa o vácuo e o aquecimento após 45 minutos. Recolha o líquido amarelo, através da válvula, em balão volumétrico de 25 mL. Lave o retentor com 5 mL de álcool. Complete o volume com álcool. Faça a leitura em espectrofotômetro a 435 nm, em cela de um cm de caminho ótico. Como branco, utilize uma solução preparada com 25 mL de reagente colorimétrico e 10 mL de álcool. Como referência, use uma curva-padrão de sulfeto de carbono. Expresse os resultados em sulfeto de carbono. Curva-padrão de sulfeto de carbono – Prepare soluções contendo, em 10 mL, quantidades de sulfeto de carbono compreendidas entre (0-0,5) mg. Adicione a cada uma delas 15 mL de reagente colorimétrico e efetue, após 15 minutos, leitura no espectrofotômetro a 435 nm, em cela de 1 cm de caminho ótico. Faça um branco com 10 mL de álcool e 15 mL de reagente colorimétrico. Construa um gráico no qual igure, na abcissa, a quantidade de sulfeto de carbono e, na ordenada, os respectivos valores de absorbância. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos etc. - Resolução Nº 123, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Diário Oicial, Brasília, 26 de junho de 2001. Disposições gerais para embalagens e equipamentos elastoméricos em contato com alimentos. Colaboradores Lúcia Tieco Fukushima Murata, Maria Cecília Depieri Nunes, Maria Rosa da Silva de Alcântara, Neus Sadocco Pascuet e Paulo Eduardo Masselli Bernardo. 570 - IAL CapítuloCapítulo XIV - Embalagens e Equipamentos em Contato com Alimentos XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas CAPÍTULO XV CONSERVAS VEGETAIS, FRUTAS E PRODUTOS DE FRUTAS IAL - 571 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 572 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas XV CONSERVAS VEGETAIS, FRUTAS E PRODUTOS DE FRUTAS Conservas vegetais stão incluídos neste capítulo as conservas de hortaliças (verduras, legumes, raízes, tubérculos e rizomas), de cogumelo, os picles e extratos e purês de tomate. Hortaliça é a planta herbácea, da qual uma ou mais partes são utilizadas como alimento, na sua forma natural. Entende-se por hortaliça, tubérculos, raízes, rizomas, bulbos, talos, brotos, folhas, inflorescências, pecíolos, frutos, sementes e cogumelos comestíveis cultivados. Hortaliça em conserva é o produto preparado com as partes comestíveis das hortaliças, envasadas praticamente cruas, reidratadas ou précozidas, imersas ou não em líquido de cobertura apropriado, submetidas a adequado processamento tecnológico antes ou depois de fechadas hermeticamente nos recipientes utilizados a fim de evitar a sua alteração. Muitas vezes, nestes produtos, é determinado o porcentual de sólidos drenados em relação ao peso total conforme o método 003/ IV. No caso do palmito, pimentão e alcachofra, deve ser determinado o pH (017/IV), para atender ao regulamento técnico específico e a pesquisa de ácido cítrico (059/IV). Na parte sólida, moída e homogeneizada, são determinadas cinzas (018/IV) e cloretos (028/IV) ou (029/IV). E Verdura é a parte geralmente verde das hortaliças, utilizada como alimento no seu estado natural. Legume é o fruto ou a semente de diferentes espécies de plantas, principalmente das leguminosas, utilizado como alimento. Raiz, tubérculo e rizoma são partes subterrâneas desenvolvidas de determinadas plantas, utilizadas como alimento, por exemplo: tubérculo (batata), rizoma (araruta), raiz (cenoura). IAL - 573 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Extrato de tomate é o produto resultante da concentração da polpa de frutos maduros e sãos do tomateiro (Solanum lycopersicum) por processo tecnológico adequado. Será classificado como purê de tomate se apresentar um teor de substância seca menos cloreto de sódio, de no mínimo 9% m/m e como extrato de tomate, de no mínimo 18% m/m. Nesses produtos, são determinados o resíduo seco de acordo com o método 015/IV, usando preferencialmente estufa a vácuo a 70°C, cinzas conforme 018/IV e pesquisados os corantes artificiais como em 051/IV. Eventualmente, determina-se a sacarose conforme o método 039/IV. Nos cogumelos em conserva é efetuada a determinação de dióxido de enxofre pelo método 050/IV. Picles é o produto preparado com as partes comestíveis de frutas e hortaliças, com ou sem casca, submetidos ou não a processo fermentativo natural. No mesmo é determinada a acidez, expressa em ácido acético, eventualmente, o teor de cloretos conforme o método 028/IV ou 029/IV e sólidos solúveis como em 015/IV. Preparo das amostras de conservas vegetais Hortaliças em conserva e picles – Os caroços e as sementes devem ser removidos sem partilos. Homogeneíze a amostra com trituradores, com qualquer equipamento mecânico adequado ou em almofariz. As amostras enviadas em embalagens grandes devem ser homogeneizadas e retiradas algumas porções para trituração. Palmito, pimentão e alcachofra em conserva – Utilize para a determinação do pH e pesquisa do ácido cítrico, o líquido de cobertura do produto separado por drenagem, conforme descrito em 003/IV. Extrato, purê e polpa de tomate – Homogeneíze totalmente a amostra por agitação. Frutas e derivados Também são abordados neste capítulo os produtos de frutas, tais como: frutas secas, cristalizadas e glaceadas, liofilizadas, doces de frutas em calda e compotas, geléias de frutas, doces em massa, sucos de frutas, polpas, néctares e coco e seus derivados (água de coco, leite de coco). Algumas das definições contidas na legislação específica estão descritas abaixo: Frutas secas – Produtos obtidos pela perda parcial da água das frutas, inteiras ou em pedaços, por processos tecnológicos adequados. 574 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Frutas liofilizadas - produtos obtidos pela desidratação quase completa das frutas, inteiras ou em pedaços, pelo processo de liofilização. Frutas cristalizadas e glaceadas – Produtos preparados com frutas, nas quais se substitui parte da água de constituição por açúcar, com tecnologia adequada, recobrindo-as ou não com uma camada de sacarose. As determinações realizadas em frutas secas, liofilizadas e cristalizadas incluem: umidade, acidez titulável, acidez em ácidos orgânicos, glicídios redutores em glicose (038/IV), glicídios não redutores em sacarose (039/IV) cinzas (018/IV), fibra alimentar (045/IV e 046/IV) dióxido de enxofre (050/IV), minerais e metais pesados (cap. XXIII). Geléias de frutas – Produtos preparados a partir de frutas e/ou sucos, misturados com açúcar, com adição de pectina, ácidos e outros ingredientes permitidos, podendo apresentar frutas inteiras, partes e/ou pedaços sob variadas formas. Esta mistura será convenientemente processada até se obter uma concentração e consistência semi-sólida adequadas. As determinações usuais neste produto são: sólidos totais, sólidos solúveis em graus Brix, sólidos insolúveis em água, pH, acidez titulável, acidez em ácidos orgânicos, glicídios redutores em glicose (038/IV), glicídios não redutores em sacarose (039/IV), cinzas (018/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), fibra alimentar (045/IV e 046/IV), corantes orgânicos artificiais (051/IV), além da pesquisa de outros aditivos e, eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII). Doces em massa ou pasta – Produtos resultantes do processamento das partes comestíveis desintegradas de vegetais, com açúcar e outros ingredientes e aditivos permitidos, até se obter uma concentração e consistência adequadas. Na análise destes produtos, as determinações usuais são: sólidos totais, sólidos solúveis em graus Brix, sólidos insolúveis em água , pH (017/IV), acidez titulável, acidez em ácidos orgânicos, glicídios redutores em glicose (038/IV), glicídios não redutores em sacarose (039/IV), cinzas (018/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), lipídios (para produtos que contenham este nutriente) (032/IV, 033/IV ou 034/IV), fibra alimentar (045/IV e 046/IV), corantes orgânicos artificiais (051/IV) e, eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII). Frutas em conserva – Produtos preparados com frutas frescas, congeladas ou previamente preservadas, inteiras ou em pedaços, envasadas praticamente cruas ou pré-cozidas, imersas ou não em líquido de cobertura ou calda, podendo conter opcionalmente outros ingredientes e, finalmente, submetidos a tratamento adequado. Nestes produtos as análises usuais incluem, no líquido de cobertura: sólidos solúveis em graus Brix, pH IAL - 575 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (017/IV), acidez titulável, acidez em ácidos orgânicos, glicídios redutores em glicose (038/IV), glicídios não redutores em sacarose (039/IV), cinzas (018/IV), fibra alimentar (na parte sólida) (045/IV e 046/IV), corantes orgânicos artificiais (051/IV), peso drenado (003/IV), e eventualmente, minerais e metais pesados (cap. XXIII). Sucos de frutas – Líquidos límpidos ou turvos, não fermentados, extraídos das frutas sãs e maduras, por processo tecnológico adequado, que garanta sua composição essencial. Néctares de frutas – Produtos não fermentados, não gaseificados, destinados ao consumo direto, obtidos pela dissolução em água potável de partes comestíveis de frutas sãs e maduras ou de sucos e polpas, adicionados de ácidos e de açúcares. Polpas congeladas de frutas – Produtos extraídos das frutas sãs e maduras, por processos tecnológicos adequados e conservados à temperatura de congelamento. Água de coco – Bebida obtida da parte líquida do fruto do coqueiro (Cocos nucifera L.) por meio de processo tecnológico adequado. As determinações usuais na análise de sucos de frutas integrais e concentrados, néctares, polpas e água de coco são: sólidos solúveis em graus Brix, relação Brix/acidez (para sucos integrais), pH (017/IV), acidez titulável, acidez em ácidos orgânicos, glicídios redutores em glicose (038/IV) glicídios não redutores em sacarose (039/IV), cinzas (018/IV), dióxido de enxofre (050/IV), corantes orgânicos artificiais (051/IV), eventualmente, conservadores (cap. V), vitamina C (365/IV ou 366/IV), minerais e metais pesados (cap. XXIII). Coco ralado – Produto obtido do endosperma do fruto do coqueiro (Cocos nucifera L.), por processo tecnológico adequado, podendo ser parcialmente desengordurado ou não. A análise do coco inclui as determinações de umidade (012/IV) lipídios (032/IV ou 034/ IV), acidez titulável, glicídios redutores em glicose e glicídios não redutores em sacarose descritos neste capítulo. Podem ser realizadas também as determinações de cinzas (018/ IV), proteínas (036/IV ou 037/IV), fibra alimentar (045/IV e 046/IV), carboidratos por diferença, gorduras saturadas (053/IV) e, eventualmente, minerais (cap. XXIII). Leite de coco – Emulsão aquosa procedente do endosperma de cocos maduros e sãos. As análises do leite de coco incluem as determinações de umidade (013/IV), acidez titulável, lipídios, glicídios redutores em glicose e glicídios não redutores em sacarose descritos neste capítulo. Podem ser realizadas também as determinações de cinzas (018/IV), proteínas (036/IV ou 037/IV), fibra alimentar (045/IV e 046/IV), carboidratos por diferença, gorduras saturadas (053/IV) e, eventualmente, minerais (cap. XXIII). 576 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Preparo das amostras de produtos de frutas Sucos, néctares de frutas e água de coco – Homogeneíze totalmente a amostra por agitação. Geléias, doce em massa ou pasta e frutas cristalizadas – Homogeneíze totalmente a amostra no multiprocessador. Frutas secas e liofilizadas – Os caroços e sementes devem ser removidos sem parti-los. Homogeneíze a amostra em multiprocessador ou com qualquer equipamento mecânico adequado ou em almofariz. Complete a operação o mais rápido possível, para evitar ganho de umidade. No caso de frutas secas, processe três vezes em moedor, misturando completamente após cada trituração. As amostras enviadas em embalagens grandes devem ser misturadas e retiradas algumas porções para trituração. Frutas em conserva – Utilize para a análise o líquido de cobertura do produto separado por drenagem conforme descrito na técnica de sólidos drenados em relação ao peso total. Polpas de frutas congeladas – Descongele a amostra até à temperatura ambiente. Homogeneíze totalmente as amostras em liqüidificador. O descongelamento deve ser o mais rápido possível, sem alterar ou degradar as características do produto, pois algumas frutas se oxidam rapidamente e suas cores devem ser observadas enquanto ainda congeladas. Mantenha sempre as amostras em refrigerador depois de abertas. Coco ralado – Homogeneíze totalmente a amostra, com auxilio de uma espátula. Leite de coco em emulsão – Cada garrafa antes de ser aberta deve ser colocada em banho-maria termostatizado a 40°C durante 20 minutos. Posteriormente, após agitação manual, transfere-se o conteúdo da garrafa para um béquer de 300 mL, que deve ser mantido a 40°C e sob agitação, com auxilio de um agitador magnético provido de aquecimento por cerca de 10 minutos. 308/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação do peso das frutas drenadas É aplicável em frutas em conserva que contenham líquido de cobertura. Baseia-se na determinação do peso das frutas em relação ao peso total e é realizada por drenagem. IAL - 577 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Tamis no 8, balança semi-analítica, béquer de 800 mL, espátula metálica e bastão de vidro. Procedimento – Abra a embalagem do produto e pese. Transfira o conteúdo total da amostra para tamis n° 8. Inverta cuidadosamente as frutas que ficarem com suas cavidades para cima. Produtos de frutas mais macias devem ser drenados através de tamis inclinado, sem outra manipulação. Drene por dois minutos. Pese o recipiente vazio. Coloque no recipíente o produto sólido e pese novamente. Cálculo P2 = massa do recipiente e da parte sólida em g P1 = massa do recipiente vazio em g Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.180. 309/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da umidade em frutas secas em estufa a vácuo Este método também é aplicável em frutas desidratadas e cristalizadas. Baseia-se na perda de massa por secagem sob pressão reduzida à temperatura de 70°C. Material Balança analítica, estufa a vácuo, espátula de metal, dessecador com sílica gel e cápsula de níquel, platina ou alumínio de aproximadamente 8,5 cm de diâmetro, de fundo chato com tampa. Procedimento – Espalhe uniformemente de (5-10) g da amostra homogeneizada, em cápsula metálica com tampa, previamente tarada e pese. Seque por 6 horas a (70 ± 2)°C sob pressão reduzida, ≤ 100 mm Hg (13,3 kPa), sem tampa. Recoloque a tampa, res578 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas frie a cápsula em dessecador e pese. As determinações em duplicata devem concordar dentro de 0,2%. Cálculo N = perda de peso em g P = massa da amostra em g Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 934.06). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 37. p. 4. 310/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável por volumetria com indicador Este método é aplicável em soluções claras ou levemente coloridas nos diversos tipos de produtos de frutas. O método baseia-se na titulação com hidróxido de sódio até o ponto de viragem com o indicador fenolftaleína. Material Balança analítica, espátula metálica, pisseta plástica, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL, pipetas volumétricas de 10 e 20 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução de fenolftaleína Procedimento – Pese (5-10) g ou pipete de (10-20) mL da amostra homogeneizada em frasco Erlenmeyer, dilua com aproximadamente 100 mL de água e adicione 0,3 mL de solução de fenolftaleína para cada 100 mL da solução a ser titulada. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 M sob agitação constante, até coloração rósea persistente por 30 segundos. IAL - 579 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo V = n° de mL da solução de hidróxido de sódio gasto na titulação f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio P = massa da amostra em g ou volume pipetado em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 942.15 A). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 37. p. 10. INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.183. 311/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável por volumetria potenciométrica Este método é aplicável em soluções escuras ou fortemente coloridas. O método baseia-se na titulação potenciométrica da amostra com solução de hidróxido de sódio onde se determina o ponto de equivalência pela medida do pH da solução. Material pHmetro, balança analítica, agitador magnético, espátula metálica, bureta de 25 mL, pipetas volumétricas de 10 e 20 mL e béquer de 300 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Soluções-tampão de pH 4, 7 e 10. Procedimento – Calibre o potenciômetro com as soluções-tampão de 7 e 4 ou 7 e 10 de acordo com as instruções do fabricante. Pese (5-10) g ou pipete de (10 -20) mL da amostra homogeneizada em um béquer de 300 mL, dilua com 100 mL de água, agite moderadamente e mergulhe o eletrodo na solução. Titule com a solução de hidróxido de sódio 0,1 M até uma faixa de pH (8,2-8,4). Calcule conforme 317/IV. 580 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 942.15 B). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 37. p. 11. BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n o 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03-12-86. Seção I, p. 18152-18173. 312/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação da acidez titulável em ácido orgânico Este método é aplicável aos diversos produtos de frutas pela determinação da acidez, expressa em g de ácido orgânico por cento, considerando o respectivo ácido predominante na amostra, ou conforme determina o padrão de identidade e qualidade do produto analisado. Cálculo V = volume da solução de hidróxido de sódio gasto na titulação em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio P = massa da amostra em g ou volume pipetado em mL PM = peso molecular do ácido correspondente em g n = número de hidrogênios ionizáveis (Tabela 1) F = fator de correção da solução de hidróxido de sódio Tabela 1 – Número de H+ dos ácidos orgânicos Ácidos orgânicos ácido cítrico ácido tartárico ácido málico ácido láctico ácido acético PM (g) 192 150 134 90 60 n 3 2 2 1 1 Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.183. IAL - 581 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria no 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03-12-86. Seção I, p. 18152-18173. 313/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação de sólidos totais Aplicável a diversos tipos de produtos cuja concentração de açúcares é elevada, como geléia, doce em massa, doces cremosos nos quais precise ser evitada a decomposição da amostra. Baseia-se na perda de massa por secagem sob pressão reduzida a 70°C. Material Balança analítica, estufa a vácuo, espátula de metal, dessecador com sílica gel, cápsula de níquel, platina ou de alumínio, aproximadamente 8,5 cm de diâmetro e de fundo chato com tampa. Procedimento – Espalhe uniformemente de (5-10) g da amostra homogeneizada, em cápsula metálica com tampa, previamente tarada e pese. Seque por 6 horas a (70 ± 2)°C, sob pressão reduzida ≤ 100 mm Hg (13,3 kPa) sem tampa. Recoloque a tampa, resfrie a cápsula em dessecador e pese. As determinações em duplicata devem concordar dentro de 0,2%. Cálculo N = massa de matéria seca em g P = massa da amostra em g Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 920.151). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 37. p. 5. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.183. 582 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas 314/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação de sólidos insolúveis em água É aplicável aos diversos tipos de produtos de frutas. O método baseia-se na determinação de matérias insolúveis em água, filtradas sob condições específicas. O resultado é expresso em porcentagem de massa em g. Material Balança analítica, dessecador, espátula metálica, bomba de vácuo, funil de Büchner, papel de filtro qualitativo de 12,5 cm de diâmetro (Whatman n°4 ou equivalente), estufa, béqueres de 100 e 400 mL, bastão de vidro, Kitassato de 1000 mL e vidro de relógio ou placa de Petri. Procedimento – Para a filtração em Büchner, prepare o meio filtrante consistindo de papel de filtro. Lave o meio filtrante com água quente e seque por uma hora a (105 ± 2)°C, em placa de Petri aberta ou vidro de relógio. Resfrie o conteúdo, tampado, por uma hora em dessecador e pese. Pese de (25-50) g da amostra homogeneizada em um béquer. Transfira para um béquer de 400 mL e dilua até a marca de 200 mL com água quente, misture e ferva moderadamente por (15-20) minutos, substituindo ocasionalmente a água evaporada. Filtre no papel preparado sob vácuo no funil de Büchner e mantenha com porções de amostra. Lave com cerca de 800 mL de água quente. Remova o excesso de água do meio filtrante por sucção no Büchner. Transfira o meio filtrante com todos os sólidos insolúveis em água para a placa de Petri ou vidro de relógio, seque por uma hora a (105 ± 2)°C e resfrie por uma hora em dessecador e pese. Cálculo N = n° de gramas do resíduo P = massa da amostra em g Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.184. 315/IV Frutas e produtos de frutas – Determinação de sólidos solúveis por refratometria Aplicável em amostras de produtos de frutas com ou sem a presença de sólidos insolúveis. A determinação de sólidos solúveis pode ser estimada pela medida de seu índice de refração por comparação com tabelas de referência. IAL - 583 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Refratômetro de Abbé, com escala graduada de Brix, em pelo menos 0,5%, banho termostatizado com circulação de água (20 ± 0,2)ºC (opcional), algodão, espátula metálica, bastão de vidro e béquer de 25 mL. Reagente Álcool Procedimento – Ajuste o refratômetro para a leitura de n em 1,3330 com água a 20°C, de acordo com as instruções do fabricante. Transfira de 3 a 4 gotas da amostra homogeneizada para o prisma do refratômetro. Circule água à temperatura constante pelo equipamento, de preferência a 20°C, no tempo suficiente para equilibrar a temperatura do prisma e da amostra e mantenha a água circulando durante a leitura, observando se a temperatura permanece constante. Após um minuto, leia diretamente na escala os graus Brix. Se a determinação for realizada à temperatura ambiente, diferente de 20°C, corrija a leitura em relação à temperatura segundo a Tabela 2. Se as partículas sólidas da amostra prejudicarem a nitidez da leitura, filtre em papel de filtro ou em pedaço de algodão. Tabela 2 – Correção para obter o valor real do grau Brix em relação à temperatura Temperatura ºC Subtraia da leitura obtida Temperatura ºC Adicione à leitura obtida - - 21 0,08 - - 22 0,16 13 0,54 23 0,24 14 0,46 24 0,32 15 0,39 25 0,40 16 0,31 26 0,48 17 0,23 27 0,56 18 0,16 28 0,64 19 0,08 29 0,73 20 0,00 30 0,81 Nota: para sucos de frutas cítricas, corrija o Brix obtido, em relação à acidez da amostra calculada em ácido cítrico, a partir da concentração de 1%, conforme a Tabela 3. 584 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Tabela 3 – Correção do valor dos graus Brix em relação ao ácido cítrico contido na amostra Ácido cítrico anidro (porcentagem em massa) Adicione ao valor da leitura em graus Brix 1,0 0,20 1,2 0,24 1,4 0,28 1,6 0,32 1,8 0,36 2,0 0,39 2,2 0,43 2,4 0,47 2,6 0,51 2,8 0,54 3,0 0,58 3,2 0,62 3,4 0,66 3,6 0,70 3,8 0,74 4,0 0,78 4,2 0,81 4,4 0,85 4,6 0,89 4,8 0,93 5,0 0,97 Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p.181-182. BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria no 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03-12-86. Seção I, p. 18152-18173. IAL - 585 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 316/IV Frutas e produtos de frutas – Relação Brix/acidez total para sucos É aplicada para sucos de frutas integrais e polpas de frutas. Este método baseia-se no calculo da relação Brix por acidez expressa em ácido orgânico. Esta relação é utilizada como uma indicação do grau de maturação da matéria prima. Cálculo Referência bibliográfica BRASIL, Leis, Decretos, etc. - Portaria no 76 de 27-11-86, do Ministério da Agricultura. Diário Oficial, Brasília, 03-12-86. Seção I, p. 18152-18173. 317/IV Coco ralado – Determinação da acidez titulável É aplicável para amostras de coco ralado e leite de coco. Material Balança analítica, espátula metálica, pisseta plástica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, bureta de 10 mL e pipeta graduada de 1 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 N Solução de fenolftaleína Procedimento – Pese 5 g de amostra homogeneizada em frasco Erlenmeyer, dilua com aproximadamente 50 mL de água, tampe o frasco e deixe em contato por 30 minutos. Adicione 4 gotas de fenolftaleína. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 N, sob agitação constante, até coloração rósea persistente por 30 segundos. 586 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Cálculo v = nº de mL da solução de hidróxido de sódio 0,1 N gasto na titulação f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 N P = nº de g da amostra Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 25-26. 318/IV Coco ralado – Determinação de glicídios redutores em glicose Material Balança analítica, chapa de aquecimento, espátula de metal, béquer de 100 mL, pisseta plástica, funil de vidro de 7 cm, proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL, balão de fundo chato de 250 mL, pipetador automático de 5 mL ou pipeta graduada de 5 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, bureta de 10 mL e papel indicador de pH. Reagentes Solução de acetato de zinco a 12% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 6% m/v Solução de hidróxido de sódio a 40% m/v Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese 2 g da amostra homogeneizada em béquer de 100 mL. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de 50 mL de água. Deixe em contato por 30 minutos. Adicione 5 mL da solução de acetato de zinco e 5 mL de ferrocianeto de potássio, agitando brandamente o balão após cada adição. Complete o volume com água, agite e deixe em repouso por 15 minutos. Filtre em papel de filtro seco para o frasco Erlenmeyer. Verifique o pH da solução. Caso esteja ácido, adicione algumas gotas de hidróxido de sódio até que a solução se torne alcalina, pH próximo IAL - 587 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de 9 e filtre novamente para outro frasco Erlenmeyer. Transfira o filtrado para a bureta. Coloque num balão de fundo chato de 250 mL, com auxílio de pipetas de 10 mL, cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionando 40 mL de água. Aqueça até ebulição. Adicione, às gotas, a solução da bureta sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá ficar um resíduo vermelho de óxido de cobre I - Cu2O). Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra a = nº de g de glicose correspondente a 10 mL da solução de Fehling P = massa da amostra em g v = nº de mL da solução da amostra gasto na titulação Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 958.06). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 39. p. 21. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 49-50. 319/IV Coco ralado – Determinação de glicídios não redutores em sacarose Material Balança analítica, chapa de aquecimento, banho-maria, espátula de metal, béquer de 100 mL, pisseta plástica, funil de vidro de 7 cm, proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL, balão de fundo chato de 250 mL, pipetador automático de 5 mL ou pipeta graduada de 5 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, bureta de 10 mL e papel indicador de pH. Reagentes Ácido clorídrico Solução de acetato de zinco a 12% m/v 588 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas Solução de ferrocianeto de potássio a 6% m/v Solução de hidróxido de sódio a 40% m/v Soluções de Fehling A e B tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese 2 g da amostra homogeneizada em béquer de 100 mL. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de 50 mL de água. Adicione 1 mL de ácido clorídrico. Deixe em banho-maria por 30 minutos. Esfrie o balão. Adicione hidróxido de sódio para elevar o pH próximo de 6,5 com auxílio de papel indicador. Adicione 5 mL de acetato de zinco e 5 mL de ferrocianeto de potássio, agitando brandamente o balão após cada adição. Complete o volume com água, agite e deixe em repouso por 15 minutos. Filtre em papel de filtro seco para o frasco Erlenmeyer. Verifique o pH da solução e adicione mais algumas gotas de hidróxido de sódio até que a solução se torne alcalina, com pH próximo de 9 e filtre novamente para outro frasco Erlenmeyer. Transfira o filtrado para a bureta. Coloque num balão de fundo chato de 250 mL, com auxílio de pipetas de 10 mL, cada uma das soluções de Fehling A e B, adicionando 40 mL de água. Aqueça até ebulição. Adicione, às gotas, a solução da bureta sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá ficar um resíduo vermelho de óxido de cobre I - Cu2O). Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra a = nº de g de glicose correspondente a 10 mL da solução de Fehling P = massa da amostra em g v = nº de mL da solução da amostra gasto na titulação B = nº de g de glicose por cento, obtido em glicídios redutores em 323/IV Referências Bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, (method 958.06). Arlington: A.O.A.C.,1995. chapter 39. p. 21. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 50-51. IAL - 589 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 320/IV Leite de coco – Determinação da acidez titulável Procedimento – Pipete 5 mL da amostra homogeneizada e proceda conforme 317/IV. Nota: no caso do leite de coco, a acidez deve ser expressa em v/v. Se for necessário expressar a acidez em v/m, coloque o nº de g correspondente ao volume pipetado da amostra. Referência Bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 25-26. 321/IV Leite de coco – Determinação de lipídios pelo método de Soxhlet Material Pipeta automática ou volumétrica de 5 mL, papel de filtro 12 cm, algodão e estufa. Procedimento – Pipete 5 mL da amostra e esgote o volume em uma porção de algodão sobre um papel de filtro duplo. Coloque para secar em estufa a 105°C durante uma hora, faça o cartucho e proceda conforme 032/IV. 322/IV Leite de coco – Determinação de lipídios pelo método de Gerber Material Butirômetro especial para creme (escala de 0 a 40%), pipeta automática ou volumétrica de 5 mL, pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL, termômetro de (0-100)°C, termocentrífuga de Gerber ou centrífuga de Gerber e banho-maria. Reagentes Ácido sulfúrico Álcool isoamílico Procedimento – Em um butirômetro de creme, transfira 2 mL de água e 7 mL de ácido sulfúrico. Adicione, lentamente, 5 mL da amostra, evitando que se queime ao contato com o ácido. Junte 1 mL de álcool isoamílico. Estas adições devem ser feitas 590 - IAL Capítulo XV - Conservas Vegetais, Frutas e Produtos de Frutas sem molhar internamente o gargalo do butirômetro, se isto acontecer, limpe cuidadosamente com papel absorvente. Complete o volume do butirômetro com água até próximo ao gargalo. Arrolhe o butirômetro, envolva-o em uma flanela e agite até completa dissolução. Centrifugue a (1200 ± 100) rpm durante 15 minutos, quando for usada a termocentrífuga. No caso de usar a centrífuga de Gerber, centrifugue por 5 minutos a 1200 rpm, leve para um banho-maria a (63 ± 2)°C por 2 a 3 minutos com a rolha para baixo, centrifugue novamente a 1200 rpm por mais 15 minutos. Retire o butirômetro da termocentrífuga ou da centrífuga de Gerber na posição vertical (rolha para baixo). Maneje a rolha colocando a camada amarelo-clara transparente (lipídios) dentro da haste graduada do butirômetro. O valor obtido na escala corresponde diretamente a porcentagem de lipídios, sendo realizada a leitura no menisco inferior. Referência bibliográfica SILVA, P.H.F.; PEREIRA, D.B.C.; OLIVEIRA, L.L.; COSTA JUNIOR, C.G. Físico - Química do Leite e Derivados Métodos Analíticos. Juiz de Fora: Oficina de Impressão Gráfica e Editora Ltda, 1997. p. 77-79. 323/IV Leite de coco – Determinação de glicídios redutores em glicose Procedimento – Pipete 5 mL de amostra homogeneizada e proceda conforme 038/IV 324/IV Leite de coco – Determinação de glicídios não redutores em sacarose Procedimento – Pipete 5 mL de amostra homogeneizada e proceda conforme 039/IV. Colaboradores Cristiane Bonaldi Cano, Letícia Araújo Farah Nagato, Márcia Regina Pennacino do Amaral Mello, Maria Cristina Duran e Mário Tavares IAL - 591 Capítulo XVI - Óleos e Gorduras CAPÍTULO XVI ÓLEOS E GORDURAS IAL - 593 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 594 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras XVI ÓLEOS E GORDURAS s determinações feitas na análise de óleos e gorduras são geralmente as dos chamados índices, que são expressões de suas propriedades físicas ou químicas dos mesmos e não as porcentagens dos seus constituintes. Assim, são determinados os índices de iodo, saponiicação, peróxidos e as constantes físicas como o ponto de fusão e o índice de refração. São estes índices que, juntamente com as reações características, servem para identiicação e avaliação da maioria dos óleos e gorduras, sendo o resultado da análise baseado neste conjunto de dados. A Os métodos de cromatograia em fase gasosa são, desde há muito tempo, aplicados para o conhecimento da composição dos ácidos graxos destes compostos. 325/IV Determinação da acidez A determinação da acidez pode fornecer um dado importante na avaliação do estado de conservação do óleo. Um processo de decomposição, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre a concentração dos íons hidrogênio. A decomposição dos glicerídios é acelerada por aquecimento e pela luz, sendo a rancidez quase sempre acompanhada pela formação de ácidos graxos livres. Estes são freqüentemente expressos em termos de índice de acidez, podendo sê-lo também em mL de solução normal por cento ou em g do componente ácido principal, geralmente o ácido oléico. Os regulamentos técnicos costumam adotar esta última forma de expressão da acidez. O índice de acidez é deinido como o número de mg de hidróxido de potássio necessário para neutralizar um grama da amostra. O método é aplicável a óleos brutos e reinados, vegetais e animais, e gorduras animais. Os métodos que avaliam a acidez titulável resumem-se em titular, com soluções de álcali-padrão, a acidez do produto ou soluções aquosas/alcoólicas do produto, assim como os ácidos graxos obtidos dos lipídios. IAL - 595 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, proveta de 50 mL e bureta de 10 mL. Reagentes Solução de éter-álcool (2:1) neutra Solução fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 0,1 M ou 0,01 M Procedimento – As amostras devem estar bem homogêneas e completamente líquidas. Pese 2 g da amostra em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 25 mL de solução de éter-álcool (2:1) neutra. Adicione duas gotas do indicador fenolftaleína. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 M ou 0,01 M até o aparecimento da coloração rósea, a qual deverá persistir por 30 segundos. Cálculos v = nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de hidróxido de sódio P = nº de g da amostra Notas Para converter o índice de acidez em solução molar, divida o resultado por 1,78. Para expressar o índice de acidez como acidez em ácido oléico, divida o resultado por 1,99. Para transformar a acidez em ácido oléico em acidez em solução normal, divida o resultado por 3,55. No caso de produtos com baixo teor de ácidos graxos, por exemplo, óleos e gorduras reinados, use solução de NaOH 0,01 M para a titulação. 596 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1.: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 245-246. 326/IV Determinação do índice de peróxido Este método determina todas as substâncias, em termos de miliequivalentes de peróxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potássio nas condições do teste. Estas substâncias são geralmente consideradas como peróxidos ou outros produtos similares resultantes da oxidação da gordura. É aplicável a todos os óleos e gorduras normais, incluindo margarina e creme vegetal, porém é suceptível e portanto qualquer variação no procedimento do teste pode alterar o resultado da análise. Material Balança analítica, frasco Erlenmeyer de 125 ou 250 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, bureta de 10 mL com sub-divisões de 0,05 mL. Reagentes Ácido acético Clorofórmio Solução de tiossulfato de sódio 0,1 N ou 0,01 N Amido solúvel Iodeto de potássio Solução de ácido acético-clorofórmio (3:2) v/v Solução saturada de iodeto de potássio – Pese 30 g de iodeto de potássio e adicione 21 mL de água. Conserve a solução em frasco âmbar e utilize no mesmo dia da sua preparação. Solução de amido 1% m/v Procedimentos Óleos e gorduras normais – Pese (5 ± 0,05) g da amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (ou 125 mL) . Adicione 30 mL da solução ácido acético-clorofórmio 3:2 e agiIAL - 597 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital te até a dissolução da amostra. Adicione 0,5 mL da solução saturada de KI e deixe em repouso ao abrigo da luz por exatamente um minuto. Acrescente 30 mL de água e titule com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N ou 0,01 N, com constante agitação. Continue a titulação até que a coloração amarela tenha quase desaparecida. Adicione 0,5 mL de solução de amido indicadora e continue a titulação até o completo desaparecimento da coloração azul. Prepare uma prova em branco, nas mesmas condições e titule. Margarina e creme vegetal – Funda a amostra, com constante agitação, em placa aquecedora ou em estufa a (60-70)°C. Evite aquecimento excessivo, particularmente prolongado à temperatura acima de 40ºC. Uma vez completamente fundida, remova a amostra da placa até que a camada aquosa se separe. Decante o óleo e iltre em papel Whatman nº 4 ou equivalente. A amostra deve estar clara e brilhante. Proceda a determinação conforme o descrito para óleos e gorduras normais. Nota: se o volume gasto na titulação da amostra for menor que 0,5 mL, usando solução de tiossulfato de sódio 0,1 N, repita a determinação com solução 0,01 N. No caso do branco, o volume gasto não deve exceder a 0,1 mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 N. Cálculo A = nº de mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulação da amostra B = nº de mL da solução de tiossulfato de sódio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulação do branco N = normalidade da solução de tiossulfato de sódio f = fator da solução de tiossulfato de sódio. P = nº de g da amostra Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, AOCS, 1990. [AOCS Oicial method Cd 8-53]. 327/IV Determinação do índice de refração O índice de refração é característico para cada tipo de óleo, dentro de certos limites. Está relacionado com o grau de saturação das ligações, mas é afetado por outros fatores tais como: teor de ácidos graxos livres, oxidação e tratamento térmico. Este método é aplicável a todos os óleos normais e gorduras líquidas. 598 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Material Refratômetro de Abbé equipado com escala-padrão e algodão. Reagente Éter de petróleo ou outro solvente. Procedimento Ajuste da aparelhagem – Ajuste previamente o refratômetro de Abbé com água. Faça circular uma corrente de água a 40°C pelo aparelho. Deixe estabilizar a temperatura. Ajuste a 40°C para óleos e a 60°C para amostras com ponto de fusão mais alto. A temperatura do refratômetro deve ser controlada a ± 0,1°C e, para isto, é preferível usar banho de água controlado termostaticamente e com circulação de água. O instrumento é calibrado seguindo as instruções do fabricante, com líquido de pureza e índice de refração conhecidos ou, em alguns casos, é satisfatório usar um prisma de vidro de índice de refração teórico de 1,333 à 20 °C. Se o refratômetro for equipado com um compensador, uma lâmpada elétrica como a de vapor de sódio, torna-se necessária. Tratamento da amostra – Funda a amostra, caso não esteja líquida. Filtre para remover quaisquer impurezas e traços de umidade. A amostra deve estar completamente seca. Certiique-se que os prismas estejam limpos e completamente secos e então coloque no prisma inferior algumas gotas da amostra. Feche os prismas e trave irmemente. Deixe por 1 a 2 minutos até que a amostra atinja a temperatura do aparelho. Ajuste o instrumento e a luz para obter a leitura mais distinta possível e, então, determine o índice de refração. A leitura na escala dará diretamente o índice de refração absoluto a 40°C, com quatro casas decimais. Realize pelo menos três leituras e calcule a média. A variação das leituras deve ser igual a 0,0002. Limpe os prismas entre as leituras com algodão umedecido com solvente e deixe secar. Cálculo para correção da temperatura R’+ K (T’- T) = R R = leitura à temperatura T (°C) R’= leitura à temperatura T’ (°C) T = temperatura padrão (°C) T’ = temperatura na qual a leitura de R’ foi feita (°C) K = 0,000365 para gorduras e 0,0003885 para óleos IAL - 599 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 247. AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Oicial method Cc 7-25]. 328/IV Determinação do índice de saponificação O índice de saponiicação é a quantidade de álcali necessário para saponiicar uma quantidade deinida de amostra. Este método é aplicável a todos os óleos e gorduras e expressa o número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para saponiicar um grama de amostra. Material Frascos Erlenmeyer de 250 mL, condensador de água e banho-maria ou chapa aquecedora com controle de temperatura. Reagentes Solução de ácido clorídrico 0,5 M Hidróxido de potássio Solução de fenolftaleína Álcool Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 4% m/v Procedimento – Funda a amostra, se não estiver completamente líquida. Filtre em papel de iltro para remover impurezas e traços de umidade. A amostra deve estar completamente seca. Pese uma quantidade de amostra, de tal modo que sua titulação corresponda de 45 a 55% da titulação do branco. Esta massa normalmente é de (4-5) g. Adicione 50 mL da solução alcoólica de KOH. Prepare um branco e proceda ao andamento analítico, simultaneamente com a amostra. Conecte o condensador e deixe ferver suavemente até a completa saponiicação da amostra (aproximadamente uma hora, para amostras normais). Após o resfriamento do frasco, lave a parte interna do condensador com um pouco de água. Desconecte do condensador, adicione 1 mL do indicador e titule com a solução 600 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras de ácido clorídrico 0,5 M até o desaparecimento da cor rósea. Cálculo A = volume gasto na titulação da amostra B = volume gasto na titulação do branco f = fator da solução de HCl 0,5 M P = nº de g da amostra Nota: algumas amostras são mais difíceis de serem saponiicadas, requerendo mais de 1 hora de saponiicação. Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA. A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Oicial method Cd 3-25]. 329/IV Determinação do índice de iodo pelo método de Wijs O índice de iodo de um óleo ou gordura é a medida do seu grau de insaturação e é expresso em termos do número de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra (% iodo absorvido). O método de Wijs é aplicável a todos os óleos e gorduras normais que não contenham ligações duplas conjugadas. Cada óleo possui um intervalo característico do valor do índice de iodo. A ixação do iodo ou de outros halogênios se dá nas ligações etilênicas dos ácidos graxos. Material Balança analítica, agitador magnético, estufa, cronômetro, papel de iltro qualitativo, frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipetas volumétricas de 2, 5, 20 e 25 mL e bureta de 50 mL. Reagentes Ácido clorídrico Iodo Tetracloreto de carbono IAL - 601 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Tiossulfato de sódio (Na2S2O3.5H2O) Amido solúvel Iodeto de potássio Solução de Wijs Solução de iodeto de potássio a 15% m/v Solução de indicador de amido a 1% m/v. Solução de tiossulfato de sódio a 0,1 M Procedimento – Funda a amostra, caso não esteja no estado líquido (a temperatura da fusão não deverá exceder o ponto de fusão da amostra em 10oC). Filtre através de papel de iltro para remover algumas impurezas sólidas e traços de umidade. Pese aproximadamente 0,25 g em frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa e adicione 10 mL de tetracloreto de carbono. Transira com auxílio de bureta, 25 mL de solução de Wijs no frasco Erlenmeyer que contém a amostra. Tampe e agite cuidadosamente com movimento de rotação, assegurando perfeita homogeneização. Deixe em repouso ao abrigo da luz e à temperatura ambiente, por 30 minutos. Adicione 10 mL da solução de iodeto de potássio a 15% e 100 mL de água recentemente fervida e fria. Titule com solução tiossulfato de sódio 0,1 M até o aparecimento de uma fraca coloração amarela. Adicione 1 a 2 mL de solução indicadora de amido 1% e continue a titulação até o completo desaparecimento da cor azul. Prepare uma determinação em branco e proceda da mesma maneira que a amostra. Cálculo M = molaridade da solução de Na2S2O3 VB = mL gasto na titulação do branco VA = mL gasto na titulação da amostra P = nº g da amostra Notas Quando o índice de iodo for determinado em material contendo sistemas de duplas ligações conjugadas, o resultado não é uma medida do total de insaturação, mas um valor empírico indicativo da sua quantidade na molécula. Por ser de difícil preparação, recomenda-se a aquisição no comércio do reagente de Wijs. Armazene as soluções de Wijs em frasco âmbar, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e da umidade. Devido à toxicidade, o tetracloreto de carbono está sendo substituído por ciclohexano. Se o óleo apresentar um índice de iodo superior a 100, como por exemplo, os óleos de origem marinha, o tempo de reação com a solução de Wijs deverá ser maior que 30 minutos. 602 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1 – 25]. 330/IV Determinação do índice de iodo por cálculo O índice de iodo determinado por cálculo aplica-se à análise de triglicerídios e de ácidos graxos livres e seus produtos hidrogenados. Este método determina o índice de iodo de óleos comestíveis diretamente da composição de ácidos graxos insaturados obtidos a partir da análise por cromatograia em fase gasosa. Procedimento – Determine a composição de ácidos graxos da amostra a ser analisada por cromatograia em fase gasosa (344/IV). Cálculos (% ácido palmitoléico x 0,950) + (% ácido oléico x 0,860) + (% ácido linoléico x 1,732) + (% ácido linolênico x 2,616) + (% ácido gadoléico x 0,785) + (% ácido erúcico x 0,723) = índice de iodo dos triglicerídios (% ácido palmitoléico x 0,990) + (% ácido oléico x 0,8986) + (% ácido linoléico x 1,810) + ( % ácido linolênico x 2,735) + (ácido gadoléico x 0,8175) + (% ácido erúcico x 0,7497) = indice de iodo dos ácidos graxos livres Nota: para óleos com conteúdo de matéria insaponiicável superior a 0,5% (ex.: óleos de peixe), o resultado tende a ser inferior ao determinado pelo método de Wijs. Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1995. [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1c-85]. 331/IV Determinação do índice de Bellier Na análise dos óleos, a determinação do índice de Bellier é utilizada para a identiIAL - 603 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital icação do azeite de oliva. Material Chapa aquecedora, termômetro com divisões de décimos de grau, pipetas de 2, 5 e 50 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL e refrigerante de reluxo. Reagentes Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 8% m/v Ácido acético (1+3) Álcool a 70% v/v Procedimento – Transira lentamente, com o auxílio de uma pipeta, 1 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL da solução alcoólica de hidróxido de potássio a 8%. Adapte ao frasco Erlenmeyer um refrigerante de reluxo. Aqueça em chapa aqquecedora por 10 minutos. Esfrie até (25-30)°C. Adicione 50 mL de álcool a 70%. Agite e adicione 1,5 mL de ácido acético (1+3). Agite e adapte ao frasco um termômetro de 50oC, dividido em décimos de grau, de maneira que o bulbo do termômetro mergulhe no líquido. Se houver turvação, aqueça lentamente até cerca de 10oC acima do índice suposto. Resfrie o frasco, gradualmente e agitando sempre em um banho de água da seguinte maneira: mergulhe sucessivamente o frasco durante 10 segundos, retire e agite por 10 a 20 segundos. A temperatura deve baixar lentamente.Tome, como índice de Bellier, a temperatura na qual nota-se o início da turvação. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3ª ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 255. 332/IV Determinação do ponto de fusão Os óleos e gorduras naturais, de origem vegetal e animal, são misturas de glicerídios e de outras substâncias e consistem de inúmeros componentes. Estas substâncias não exibem um ponto de fusão deinido e nem preciso. Portanto, o termo “ponto de fusão” não implica nas mesmas características das substâncias puras de natureza deinitivamente cristalina. As gorduras passam por um estágio de amolecimento gradual antes de se tornarem completamente liquefeitas. O ponto de fusão deve ser deinido por condições especíicas do método pelo qual é determinado e, neste caso, é a temperatura na qual a amostra torna-se perfeitamente clara e líquida. O método do tubo capilar é aplicável para 604 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras todas as gorduras animais e vegetais normais. Material Aparelho para determinação do ponto de fusão, tubos de ponto de fusão, tubos capilares de vidro, termômetro com a especiicação da A.O.C.S. : H 6-40 ou 7-45, béquer de 600 mL, papel de iltro e funil de vidro. Procedimento – Funda a amostra e iltre em papel de iltro para remover qualquer impureza e resíduo inal de mistura. A amostra deve estar absolutamente seca. Mergulhe completamente pelo menos 3 tubos capilares limpos na amostra liquefeita, de maneira que a gordura ique a uma altura de 10 mm. Funda o inal do tubo (onde a amostra está localizada) numa chama pequena, mas não queime a gordura. Coloque os tubos num béquer e deixe em refrigerador entre (4 - 10)°C durante 16 horas. Remova os tubos do refrigerador e prenda-os com uma rolha de borracha ou de qualquer outra maneira ao termômetro, de modo que as extremidades inferiores dos tubos de fusão estejam no fundo junto com o bulbo de mercúrio do termômetro. Mergulhe o termômetro num béquer de 600 mL, contendo água até a metade de seu volume. O fundo do termômetro deve estar imerso a 30 mm na água. Ajuste a temperatura inicial do banho de (8 - 10)°C abaixo do ponto de fusão da amostra no início do teste. Agite o banho de água com um pequeno luxo de ar ou com outros métodos adequados e forneça calor de maneira que aumente a temperatura na faixa de 0,5°C por minuto. As gorduras passam normalmente por um estágio de opalescência antes da completa fusão. O aquecimento é contínuo até que os tubos estejam completamente claros. Observe a temperatura na qual cada tubo se torna claro e calcule a média de todos os tubos. Esta deve estar dentro de 0,5°C. Considere esta média como o ponto de fusão. Nota: as amostras devem estar completamente liquefeitas quando os tubos forem colocados no refrigerador. É uma boa prática passar o fundo dos tubos que contêm a amostra momentaneamente por uma chama, antes de serem levados ao refrigerador. Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists’Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Oicial method Cc 1-25]. 333/IV Reação de Kreis Chama-se rancidez a alteração no odor e sabor dos óleos e gorduras, provocada pela IAL - 605 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital ação do ar (rancidez oxidativa) ou de microrganismos (rancidez cetônica). O método é válido para óleos normais e gorduras líquidas. A loroglucina reage em meio ácido com os triglicerídios oxidados, dando uma coloração rósea ou vermelha, cuja intensidade aumenta com a deterioração devido, provavelmente, à presença de aldeído malônico ou de aldeído epidrínico. Material Pipeta de 5 mL, provetas de 10 mL e proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Reagentes Ácido clorídrico Solução de loroglucina em éter a 0,1% m/v Procedimento –Transira, com auxílio de uma pipeta, 5 mL de substância fundida para uma proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de ácido clorídrico e agite por 30 segundos. Adicione 5 mL de uma solução de loroglucina a 0,1% em éter. Agite novamente por 30 segundos e deixe em repouso por 10 minutos. Na presença de substâncias rançosas, a camada inferior apresentará uma coloração rósea ou vermelha. Nota: se a intensidade da coloração for fraca, compare a camada inferior com uma quantidade análoga de solução de permanganato de potássio a 0,0012% (transira 3,8 mL de uma solução 0,01 M para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água). Se a intensidade for a mesma ou inferior, o resultado pode deixar de ser levado em consideração, caso os caracteres sensoriais do produto forem satisfatórios. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 260. 334/IV Determinação da umidade e matéria volátil A determinação da umidade e matéria volátil é um dos parâmetros legais para a avaliação da qualidade de óleos e gorduras, sendo realizada por aquecimento direto a 105°C. Procedimento – Faça a determinação conforme método 012/IV alterando os intervalos 606 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras de tempo de pesagem de três para uma hora, até peso constante. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p .22. 335/IV Determinação de impurezas insolúveis em éter Este método, aplicável para todos os tipos de gorduras e óleos, determina sujidades e/ou outras substâncias estranhas insolúveis em éter de petróleo. Material Banho-maria, estufa, dessecador, proveta de 50 mL e cadinho de Gooch. Reagente Éter de petróleo Procedimento – Use o resíduo resultante da determinação da umidade e matéria volátil. Adicione 50 mL de éter de petróleo no resíduo e aqueça em banho-maria para dissolver a gordura. Filtre em cadinho de Gooch com ajuda de vácuo. Lave com cinco porções de 10 mL de éter de petróleo a quente, permitindo que cada porção escoe primeiro para depois adicionar a outra porção. Lave completamente com éter de petróleo. Seque o cadinho e aqueça até peso constante em estufa a (101 ± 1)°C. Esfrie em dessecador até a temperatura ambiente e pese. Cálculo p = massa das impurezas insolúveis no éter de petróleo P = massa da amostra seca Referências bibliográficas AMERICAN OIL CHEMISTS` SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1996. [A.O.C.S. Oicial method Ca 3a-46]. IAL - 607 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 262. 336/IV Determinação de resíduo por incineração (cinzas) Este método determina o resíduo remanescente depois de incineração sob condições especíicas de teste. Aplicável para gorduras animais e óleos vegetais e marinhos. Fundamenta-se na perda de peso que ocorre quando o produto é incinerado a 550°C, com destruição da matéria orgânica sem apreciável decomposição dos constituintes do resíduo mineral ou perda por volatilização. Material Cápsula de porcelana de 50 mL ou cápsula de platina de 100 mL, bico de Bünsen, tela de amianto, tripé, balança analítica, mula, papel de iltro e dessecador. Procedimento – Coloque o papel de iltro contendo os insolúveis totais em éter obtido conforme 335/IV em uma cápsula de porcelana de 50 mL ou cápsula de platina de 100 mL, previamente aquecida em mula a 550°C por 1 hora, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Carbonize em bico de Bünsen com chama baixa. Incinere em mula a 550°C. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Nota: a combustão da amostra deve ser feita em capela, com exaustão forçada. Cálculo p = nº de g de resíduo P = nº g da amostra Referências bibliográficas AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists`Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 608 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras 1990. [A.O.C.S. Oicial method Ca 11-55] INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 263. 337/IV Determinação da densidade relativa Este método determina a razão da massa da amostra em relação à da água por unidade de volume a 25°C e é aplicável a todos os óleos e gorduras líquidas. Material Picnômetro com junta esmerilhada de 50 mL, banho-maria mantido à temperatura de (25 ± 0,1)°C e termômetro com subdivisão de 0,1°C. Procedimento – Funda a amostra, iltre com papel de iltro para remover as impurezas e traços de umidade. Aqueça à temperatura de (20-23)°C. Encha o recipiente do picnômetro, adicionando a amostra cuidadosamente pelas paredes para prevenir a formação de bolhas de ar. Tampe e coloque em banho-maria na temperatura de (25 ± 0,1)°C. Conserve o conjunto imerso na água e espere atingir a temperatura acima especiicada por 30 minutos. Remova com cuidado o óleo que tenha escorrido pela lateral do recipiente. Retire do banho e seque, evitando o manuseio excessivo. Pese e calcule a densidade. Cálculo A = massa do recipiente contendo óleo B = massa do recipiente vazio C = massa da água à temperatura de 25ºC Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS´ SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Oicial method Cc 10a-25]. 338/IV Teste do frio IAL - 609 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Este método mede a resistência da amostra à cristalização e é comumente usado também como índice de “winterização” e veriicação da remoção da estearina no processo. É aplicável a todos os óleos vegetais normais, reinados e em gordura animal isenta de umidade. Material Banho-maria a 25°C, banho de gelo a 0°C, frasco especial para óleo de 115 mL, funil e papel de iltro. Procedimento – Filtre uma quantidade suiciente da amostra (200-300) mL diretamente com papel de iltro. Aqueça a porção iltrada. Agite a amostra continuamente durante o aquecimento e remova do calor quando a temperatura atingir 130°C. Abasteça um frasco especial para óleo completamente até o gargalo com a amostra e tampe hermeticamente. Coloque o frasco num banho de água a 25°C e vede o banho com paraina. Mergulhe o frasco contendo a amostra em banho de gelo, de modo que o conjunto ique coberto com água e gelo. Reabasteça com gelo freqüentemente, se necessário, para manter o banho solidamente empacotado, caso contrário, a temperatura poderá subir acima de 0°C. É essencial que a temperatura do banho se mantenha a 0°C. Ao inal de cinco horas e meia, remova o frasco do banho e examine rigorosamente os cristais de gordura ou turvação formada. Não confundir cristais com pequenas bolhas de ar. Para o teste ser positivo, a amostra precisa estar completamente clara, límpida e brilhante. Notas A inalidade do tratamento a quente é remover traços de impurezas, umidade e destruir algum núcleo de cristais. Recomenda-se utilizar um fundo preto iluminado para melhor visualização do resultado do teste, devendo a amostra icar a uma distância de 2 metros. Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended pracctices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Oicial method Ce 11-53]. 339/IV Determinação de matéria insaponificável 610 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Matéria insaponiicável inclui aquelas substâncias que freqüentemente se encontram dissolvidas nas gorduras e óleos e que não podem ser saponiicadas por tratamento usual com soda, mas são solúveis em solventes normais para gorduras e óleos. Incluem-se neste grupo de componentes, álcoois alifáticos de alto peso molecular, esteróis, pigmentos e hidrocarbonetos. O método é aplicável para gorduras e óleos animais e vegetais, não sendo adequado para gorduras e óleos contendo quantidade excessiva de matéria insaponiicável, como os óleos marinhos. Este método também não é aplicável para alimentos com elevado teor de gordura. Material Extrator de gordura de capacidade de 200 mL com tampa de vidro, frascos Erlenmeyer ou Soxhlet de 100 a 200 mL, funil de separação de 500 mL, sifão de vidro e balança analítica. Reagentes Álcool a 95% v/v Álcool a 10% v/v Solução de hidróxido de potássio a 50% m/v Éter de petróleo Solução de hidróxido de sódio 0,02 M Solução de fenolftaleína Procedimento – Pese cerca de 5 g de amostra bem misturada em um frasco Erlenmeyer ou Soxhlet. Adicione 30 mL de álcool a 95% e 5 mL de KOH a 50%. Aqueça e deixe em reluxo por 1 hora ou até completa saponiicação. Transira para o funil de separação, ainda quente, usando um total de 40 mL de álcool 95%. Complete a transferência com água quente e depois fria até um volume total de 80 mL. Lave ainda o frasco com um volume de 5 mL de éter de petróleo e transira para o funil. Esfrie até à temperatura ambiente e adicione 50 mL de éter de petróleo. Insira a tampa e agite vigorosamente por um minuto até o total clareamento das duas camadas. Use sifão de vidro para remover completamente a camada superior sem incluir qualquer porção da camada inferior. Receba as frações de éter de petróleo em um funil de separação de 500 mL. Repita a extração pelo menos seis vezes, usando porções de 50 mL de éter de petróleo, agitando vigorosamente em cada extração. Lave os extratos combinados no funil de separação três vezes, usando 25 mL de álcool a 10%, agitando vigorosamente e retirando a camada alcoólica depois de cada extração. Evite remover qualquer parte da camada de éter de petróleo. Transira o extrato de éter de petróleo para um béquer tarado e evapore até a secagem em banho de água. Depois de IAL - 611 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital todo o solvente ter sido evaporado, complete a secagem em estufa a vácuo à temperatura de (75-80)ºC e pressão interna de 200 mm de Hg. Esfrie em dessecador e pese. Depois da pesagem, dissolva o resíduo em 50 mL de álcool a 95% a 50 ºC previamente neutralizado contendo fenolftaleína como indicador. Titule com NaOH 0,02 M até o ponto de viragem. Corrija a massa do resíduo para ácidos graxos livres contidos, usando a seguinte relação: 1 mL de 0,02 M de NaOH é equivalente a 0,0056 g de ácido oléico. Faça um branco sem a presença de óleo ou gordura e proceda da mesma maneira que a amostra. Cálculo A = massa do resíduo obtido após secagem a vácuo B = massa de ácido graxo determinado por titulação C = massa do branco. P = nº de gramas da amostra Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA,. A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Oicial method Ca 6a-40]. 340/IV Prova de Halphen-Gastaldi Esta prova é considerada especíica para a presença de estruturas ciclopropênicas contidas no ácido estercúlico ou ácidos de estruturas similares. Detecta, qualitativamente, a presença de óleo de semente de algodão em óleos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipeta de 5 mL, tubo de ensaio, banho-maria e proveta de 10 mL. Reagentes Solução de enxofre em sulfeto de carbono a 1% m/v Piridina. Procedimento – Transira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio. Adicione 5 mL de 612 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras uma solução de enxofre em sulfeto de carbono a 1% e uma gota de piridina. Adapte ao tubo de ensaio um tubo de segurança. Mergulhe o tubo em banho-maria durante 15 minutos. Recolha o sulfeto de carbono destilado em um béquer com água. Na presença de óleo de semente de algodão, aparecerá uma coloração vermelha ou vermelho-cereja. A intensidade de cor depende da quantidade de óleo de semente de algodão presente. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 264-265. 341/IV Prova de Holde Este método detecta, qualitativamente, a presença de óleo de amendoim em óleos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipetas de 1 e 5 mL, tubo de ensaio graduado e bico de Bünsen. Reagentes Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 3,3% (álcool a 90%) m/v Álcool Procedimento – Transira 0,65 mL da amostra para um tubo de ensaio graduado. Adicione 5 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 3,3% (álcool a 90%). Aqueça até a ebulição e saponiique durante dois minutos. Esfrie e adicione uma quantidade de álcool a 90% equivalente ao evaporado. Coloque em banho a 18°C, por 10 minutos. Na presença de óleo de amendoim, aparecerá uma turvação ou um precipitado gelatinoso, dependendo da quantidade de óleo de amendoim presente. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 265 IAL - 613 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 342/IV Prova de Villavecchia-Fabris Este método detecta, qualitativamente, a presença de óleo de sésamo (gergelim) em óleos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipetas de 1 e 5 mL, proveta de 10 mL e tubo de ensaio. Reagentes Solução alcoólica de furfural puriicado a 1% (álcool a 95%) m/v Ácido clorídrico Procedimento – Transira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio (se a amostra for muito espessa, adicione 5 mL de éter de petróleo). Adicione 0,2 mL da solução alcoólica de furfural a 1% (álcool a 95%) e 5 mL de ácido clorídrico. Agite o tubo durante 30 segundos. Deixe em repouso até separação das camadas. Na presença de óleo de sésamo (gergelim), a camada ácida apresentará uma coloração vermelha persistente. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3 ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 265. 343/IV Determinação da extinção específica por absorção na região do ultravioleta. Este método descreve o procedimento para o exame espectrofotométrico de azeite de oliva e outros óleos e gorduras na região do ultravioleta. A análise espectrofotométrica na região do ultravioleta pode fornecer informações sobre a qualidade de um óleo, seu estado de conservação e alterações causadas pelo processamento. A absorção em 232 e 270 nm, comprimentos de onda especiicados no método, é devida à presença de sistemas dienos e trienos conjugados, respectivamente. Estes compostos são formados por oxidação e/ou reino do óleo. Azeites de oliva virgem de boa qualidade e armazenados sob condições adequadas contêm poucos produtos de oxidação os quais absorvem próximo a 232 nm. Em alguns casos particulares, azeites de oliva virgem alterados podem exibir características espectrais próximas dos óleos reinados. 614 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Neste método, o óleo ou gordura em questão é dissolvido em solvente apropriado e a extinção da solução é determinada nos comprimentos de onda especiicados, usando como referência o solvente puro. Estas absorções são expressas como extinções especíicas (a absorbância de uma solução a 1% do óleo no solvente especiicado, numa espessura de 1 cm), convencionalmente indicadas por K. Material Espectrofotômetro UV/VIS com leituras individuais para cada comprimento de onda, cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm, balões volumétricos de 25 mL, colunas de vidro cromatográicas com comprimento de 450 mm, diâmetro interno de 35 mm, provida de tubo de descarga com 10 mm de diâmetro aproximadamente e mula. Reagentes Ciclohexano ou isoctano, grau espectrofotométrico Alumina básica Hexano, grau cromatográico Azeite de oliva virgem Óleo de amendoim reinado Preparação da alumina – Coloque alumina, previamente dessecada em mula a (380 400)oC por 3 horas, em um frasco hermeticamente fechado. Adicione água na proporção de 5 mL para 100 g de alumina. Feche o frasco de imediato e agite repetidamente. Deixe em repouso por pelo menos 12 horas antes de usar. Veriicação da atividade da alumina – Prepare a coluna cromatográica com 30 g de alumina. Passe através da coluna uma mistura consistindo de 95% de azeite de oliva virgem (k < 0,18 a 268 nm) e 5% de óleo de amendoim reinado (k > 4 a 268 nm). Se após a passagem através da coluna a mistura apresentar uma extinção especíica maior que 0,11 a 268 nm, a alumina é aceitável. Caso contrário, o nível de hidratação deve ser aumentado. Procedimento – A amostra a ser analisada deve estar perfeitamente homogênea e livre de impurezas. Óleos líquidos à temperatura ambiente devem ser iltrados através de papel de iltro à temperatura de aproximadamente 30°C. Gorduras sólidas devem ser homogeneizadas e iltradas à temperatura não superior a 10°C acima do ponto de fusão. Pese aproximadamente 0,25 g da amostra em um balão volumétrico de 25 mL. Dissolva e complete o volume com ciclohexano ou isoctano e homogeneíze (solução A). A solução resultante IAL - 615 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital deve ser perfeitamente límpida. Se ocorrer opalescência ou turbidez, iltre rapidamente através de papel de iltro. Transira 5 mL desta solução e dilua a 25 mL com o ciclohexano ou isoctano em balão volumétrico (solução B). Encha uma cubeta com a solução A e meça a absorbância a 270 nm, usando o mesmo solvente como referência, em espectrofotômetro previamente calibrado. Procedendo da mesma maneira, meça a absorbância da solução B a 232 nm. Os valores de absorbância obtidos devem estar compreendidos na faixa de 0,1 a 0,8. Quando o valor obtido da extinção especíica a 270 nm for superior ao limite máximo legal estabelecido para a classiicação do azeite, torna-se necessária a puriicação por coluna cromatográica com alumina ativada, como segue: transira 30 g de alumina previamente ativada em suspensão com hexano para coluna cromatográica. Remova o excesso de hexano deixando o nível do solvente a 1 cm da alumina. Dissolva 10 g de óleo em 100 mL de hexano homogeneizado e livre de impurezas, conforme já descrito neste procedimento e passe esta solução pela coluna. Colete o eluato e evapore todo o solvente sob vácuo e proceda como descrito anteriormente. Cálculo Kλ = extinção especíica no comprimento de onda λ Aλ = absorbância medida no comprimento de onda λ c =concentração da solução em g/100 mL l = caminho óptico da cubeta em cm Nota: a análise espectrofotométrica do azeite de oliva inclui a determinação da variação da extinção especíica: ΔK = Extinção especíica no comprimento de onda para a máxima absorção em torno de 270 nm Referência bibliográfica AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists ’Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Oicial method Ch 5-91]. 616 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras 344/IV Análise por cromatografia em fase gasosa dos ésteres metílicos de ácidos graxos A determinação da composição de ácidos graxos a partir da análise dos ésteres metílicos auxilia no estudo de fraudes e na avaliação do conteúdo nutricional de óleos e gorduras de origem vegetal ou animal. Por este método, os ésteres metílicos de ácidos graxos são separados, identiicados e quantiicados por cromatograia em fase gasosa. O método é aplicável para a determinação de ésteres metílicos de ácidos graxos contendo de 4 a 24 átomos de carbono, obtidos a partir de ácidos graxos de óleos e gorduras. Material Cromatógrafo a gás com sistema de injeção para coluna capilar (com capacidade de divisão da amostra) e coluna empacotada (com o menor volume morto possível), forno com variação máxima de 1ºC para colunas empacotadas, 0,1ºC para colunas capilares e com temperatura programável (fundamental para análise de ésteres metílicos de ácidos graxos com menos de 16 átomos de carbono na molécula); detector de ionização de chama (DIC); seringa de 10 μL graduada em 0,1 μL e registrador ou integrador ou computador. Coluna empacotada A coluna deve ser construída com um material inerte às substâncias que serão analisadas, isto é, vidro ou aço inox. Deve possuir comprimento de (1-3) m e diâmetro interno de (2-4) mm. Suporte de empacotamento – São empregadas, normalmente, terras diatomáceas que sofreram lavagem ácida e silanização. O tamanho das partículas deve estar compreendido na faixa de (60-120) e (125-250) mesh, sendo que a variação entre elas não deve ser superior a 25 μm. Fase estacionária – Pode ser empregado um líquido viscoso polar de poliésteres, isto é, polisuccinato de dietileno glicol (DEGS), polisuccinato de butanediol, poliadipato de etileno glicol. A fase estacionária deve corresponder de (5-20)% do empacotamento da coluna. Condicionamento de uma coluna nova – Desconecte a coluna do lado do detector e gradativamente aqueça o forno a aproximadamente 10ºC acima da temperatura de operação, sempre passando o gás de arraste. Mantenha esta temperatura, passando pela coluna o gás de arraste com luxo de (20 - 60) mL/min por aproximadamente 16 horas e por mais 2 horas a 20ºC acima da temperatura de operação. Cuidado para não exceder a IAL - 617 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital temperatura máxima recomendada pelo fabricante. Coluna capilar Tubo – O tubo da coluna é feito de material inerte, normalmente sílica fundida. O diâmetro interno pode variar de (0,2-0,8) mm. A superfície interna do tubo sofre um tratamento apropriado, antes de ser depositada a fase estacionária. O comprimento da coluna varia normalmente de (25 - 100) m. Fase estacionária – As fases estacionárias são ilmes de polietileno glicol, polisuccinato de butanediol, ciano propil siloxanos, entre outras. A espessura do ilme pode variar de (0,1 - 0,25) μm. Instalação e condicionamento da coluna – Tome os devidos cuidados na instalação das colunas nos fornos, ajustando as conecções para evitar vazamento dos gases ou quebra da coluna e reduzindo os espaços mortos. Condicione a coluna sempre passando o gás de arraste e programe o aquecimento da temperatura do forno a 3ºC/min a partir da temperatura ambiente até 10ºC abaixo da temperatura de decomposição da fase estacionária (veriique as recomendações do fabricante). Mantenha esta temperatura por 1 hora até estabilizar a linha de base. Reagentes Gás de arraste para DIC: hidrogênio (coluna capilar), nitrogênio, hélio ou argônio (pureza 99,999%). Gases auxiliares para o DIC: nitrogênio, hidrogênio (pureza 99,999 %) e ar super seco (livre de hidrocarbonetos). n-Hexano grau cromatográico. Padrões de referência: mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos ou padrões individuais de ésteres metílicos (ampolas seladas com mg dos padrões) ou um óleo de composição conhecida, de preferência similar ao óleo ou gordura a ser analisado. Soluções-padrão de referência – Dissolva o conteúdo da ampola (mg) dos padrões de referência em n-hexano e transira para um balão volumétrico de 100 mL ou de outro volume apropriado. Complete o volume com o mesmo solvente. Procedimentos Condições otimizadas de operação – Para coluna empacotada, considere as seguintes variáveis: tamanho e diâmetro interno da coluna, temperatura da coluna, luxo do gás de arraste [proporção ideal: nitrogênio, hidrogênio e ar sintético 1:1:10 (exemplo: N2 (gás de arraste) 30 mL/min, H2 30 mL/min e ar sintético 300 mL/min)], resolução requerida, 618 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras tamanho da amostra para análise. O tamanho da amostra escolhido deve situar-se dentro da faixa linear de resposta do detector. Para coluna capilar considere as mesmas variáveis citadas para a coluna empacotada. A eiciência (número de pratos teóricos) obtida para cada componente separado por uma coluna capilar deve ser ao redor de 100000 ou no mínimo 3000 pratos por metro de coluna. Dependendo do tipo de amostra e da coluna disponível deve-se otimizar as condições de análise para se obter a melhor eiciência e resolução dos componentes. Para a análise de ésteres metílicos de ácidos graxos de óleos vegetais, recomenda-se, por exemplo,as condições do método Method Ce 1h-05 ou a descrita abaixo: Coluna de fase estacionária ciano propil siloxona de 50 a 100 m, com 0,25 μm de espessura do ilme e 0,25 mm de diâmetro interno. Gás de arraste, hidrogênio, velocidade linear entre (15 - 25)mL/min, razão de divisão da amostra 1:50. Exemplo: coluna de 50 m Temperatura programada da coluna de 80 a 220ºC, sendo a velocidade de aquecimento de 5ºC por minuto. Mantenha a 220ºC por 10 minutos. Temperatura do injetor: 230ºC Temperatura do detector: 240ºC Determinação da eiciência e resolução – Analise uma mistura de ésteres metílicos dos ácidos esteárico e oléico com proporções equivalentes dos dois compostos. Calcule o número de pratos teóricos n (eiciência) e a resolução pelas fórmulas: dR1 = distância de retenção, medida em mm, do início da injeção ao máximo do pico do metil estearato. w1 e w2 = larguras dos picos do metil estearato e oleato, respectivamente Δ = distância entre os máximos dos picos do metil estearato e metil oleato As condições de análise que devem ser escolhidas são as que produzirem: n = 3000 pratos teóricos por metro de coluna (no mínimo) para o estearato de metila R = 1,25 (no mínimo) IAL - 619 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: deve-se trabalhar com temperatura do forno da coluna programável na análise de amostras contendo ácidos graxos com pesos moleculares muito diferentes. Diversos equipamentos possuem softwares que calculam os parâmetros de desempenho da coluna, auxiliando na seleção rápida da melhor condição de análise. Determinação dos ésteres metílicos – Prepare a amostra como descrito em um dos procedimentos a seguir: 054/IV, 055/IV ou 056/IV. Injete no cromatógrafo de 0,1 a 2 μL da solução de ésteres metílicos de ácidos graxos de padrões puros ou obtidas conforme descrito acima. Analise a mistura de padrões de referência de ésteres metílicos de ácidos graxos de composição conhecida nas mesmas condições empregadas na análise da amostra e determine o tempo de retenção (ou distância de retenção) para cada éster metílico. Construa o gráico do logaritmo do tempo de retenção em função do número de átomos de carbono dos ácidos graxos. Em condições isotérmicas de análise, o gráico para ésteres de séries homólogas e cadeia linear, deve ser uma reta. As retas são praticamente paralelas para diferentes séries homólogas. Empregando-se os gráicos obtidos como descrito acima, pode-se identiicar um éster de ácido graxo de uma série homóloga por interpolação. Na prática utiliza-se o cálculo de ECN, isto é, número equivalente de carbono, para identiicação de ácidos graxos de uma série homóloga. Os valores de ECN são calculados a partir dos valores dos tempos de retenção dos compostos. Agi = ácido graxo a ser identiicado n e n+i = número de átomos de carbono de padrões homólogos de cadeia reta, eluídos antes e depois do ácido graxo a ser identiicado. t’Agi = tAgi - t0 t’Agi = tempo de retenção corrigido tAgi = tempo de retenção da substância a ser identiicada t0 = tempo de retenção de uma substância não retida. (Ex: butano, pentano em colunas polares). t’Agn + t’Agn+i = tempos de retenção corrigidos de padrões homólogos de cadeia reta, eluídos antes e depois do ácido graxo a ser identiicado. (“i”normalmente é igual a múltiplos de 2) 620 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Com determinada programação de temperatura (aumento linear de temperatura) a equação é simpliicada para: Cálculos Normalização Exceto em casos excepcionais, assuma que todos os componentes da amostra estejam representados no cromatograma. Desta forma a soma das áreas de todos os picos representará 100% dos constituintes (eluição total). Se o equipamento incluir um computador ou integrador, utilize seus recursos para o cálculo. Caso contrário, determine a área de cada pico multiplicando a altura pela largura na meia altura. Quando necessário, considere as várias atenuações utilizadas durante o registro dos cromatogramas. De uma maneira geral, quando não estão presentes quantidades signiicativas de componentes com menos de 12 átomos de carbono, calcule a porcentagem de área do pico correspondente ao constituinte, em relação à soma das áreas de todos os picos. O resultado será expresso como porcentagem de área do componente (éster metílico). AAgi = área do pico correspondente ao componente “i” Σ A = soma das áreas de todos os picos. Normalização com fatores de correção Os fatores de correção da resposta do detector são determinados quando estão presentes na amostra ácidos graxos com menos de 12 átomos de carbono e/ou ácidos graxos com grupos secundários ou, ainda, quando se utiliza um detector de condutividade térmica. Estes fatores devem ser usados para converter as porcentagens de área dos picos em porcentagem de massa dos componentes. Determine os fatores de correção com a ajuda de um cromatograma obtido da análise da mistura de padrões de ésteres metílicos, de composição conhecida, nas mesmas condições de análise da amostra. IAL - 621 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Para a mistura padrão: Agi MAgi = massa do componente “i” na mistura padrão. ΣM = massa total dos vários componentes na mistura padrão Do cromatograma da mistura padrão, calcule: Agi AAgi = área do pico correspondente ao componente “i” Σ A = soma da área de todos os picos. Agi Agi Geralmente os fatores de correção são calculados com relação ao KC16 (éster metílico do ácido palmítico). Assim os fatores relativos são: Agi Expresse o resultado em % de massa (m/m) do componente (éster metílico): Agi Agi Agi Agi Pode ser feito o cálculo teórico dos fatores de correção do detector de ionização de chama (DIC): 622 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras KAgi = fator de resposta para o ácido graxo “i” M Agi = massa molecular do éster metílico de ácido graxo “i” n Agi = número de átomos de carbono do éster metílico do ácidos graxo “i” Ac = massa atômica do carbono (12,01) Pesos atômicos utilizados no cálculo: Carbono = 12,01; Hidrogênio = 1,0079; Oxigênio = 15,994. Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relação ao C16:0: C K’Ag i = fator relativo de correção, para o ácido graxo “i” K C16 = fator de resposta do DIC para o C16:0 KAgi = fator de resposta do DIC para o ácido graxo “i” A determinação dos fatores de correção de resposta do DIC é especialmente importante para os ácidos graxos de baixo peso molecular (C4:0; C6:0), como por exemplo, para os derivados de gordura de leite e para os de alto peso molecular, como os de óleos de peixe, pois nestes casos os fatores relativos desviam de forma considerável da unidade. Cálculo com padrão interno (PI) Empregue o método de padronização interna para determinar o valor absoluto de um ácido graxo na amostra ou na quantiicação de ácidos graxos com baixo peso molecular (4 a 6 átomos de carbono) juntamente com ácidos graxos de alto peso molecular (16 a 24 átomos de carbono) na mesma amostra. Ésteres metílicos de ácidos graxos com número ímpar de carbonos são freqüentemente usados como padrão interno (Ex: C5:0; C11:0; C13:0; C19:0 ou C23:0). Expresse o resultado em % de massa do componente (éster metílico): IAL - 623 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital M = massa em miligramas da amostra API = área do PI MPI = massa em miligramas do PI AAGi = área correspondente ao componente i KAgi = fator de correção da resposta do DIC para o ácido graxo i (relativo a KC16) KPI = fator de correção da resposta do DIC para o PI (relativo a KC16) Nota: quando o resultado for expresso em gramas de ácidos graxos por 100 g de óleo, deve-se multiplicar pelo fator 0,956. Referências bibliográficas AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Oicial Method Ce 2-66: Preparation of methyl esters of long chain fatty acids). AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Oicial Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatography). AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Oicial Method Ce 1d-91 Determination of fatty acids in edible oils and fats by capillary GLC). AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists’ Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1997 (A.O.C.S. Oicial Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in hydrogenated and reined oils and fats by capillary GLC). INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: Animal and vegetable fats and oils – Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids. ISO 5508. 1990E INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1 Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 266. 624 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras 345/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência Este método quantiica tocoferóis (alfa, beta, gama e delta) e tocotrienóis em óleos vegetais ou gorduras. Baseia-se na dissolução da amostra em solvente orgânico e injeção direta em cromatógrafo a líquido para a separação e quantiicação dos tocoferóis e tocotrienóis. Material Sistema de cromatograia a líquido de alta eiciência (CLAE) composto de: bomba de alta pressão, dispositivo para injeção da amostra, detector de luorescência ajustado para os comprimentos de onda de 290 nm de excitação e 330 nm de emissão (na indisponibilidade de detector de luorescência, utilize o de UV ajustado em 292 nm), coluna analítica de CLAE (250mm x 4mm) empacotada com micropartículas de sílica de 5 μm, pré-coluna de sílica; espectrofotômetro UV/VIS; rotavapor; balões volumétricos âmbar de 25, 50 e 100 mL; pipetas volumétricas de 10 mL e pipetas automáticas (20 a 200 μL e 200 a 1000 μL). Reagentes Padrões de α, β, γ, δ - tocoferóis de alta pureza (superior a 95%). Metanol. n-Hexano. Isopropanol Fase móvel para CLAE – Hexano - isopropanol (99,5:0,5). Nitrogênio seco Nota: todos os solventes devem ser grau CLAE Solução-padrão estoque de α-tocoferol – Pese cerca de 10 mg do padrão em um balão volumétrico âmbar 100 mL e complete o volume com n-hexano. Pipete 10 mL desta solução para um frasco âmbar e remova o solvente num rotavapor. A temperatura não deve exceder a 40oC. Retire o frasco e remova o solvente residual com nitrogênio. Adicione 10 mL de metanol, com pipeta volumétrica, e agite para dissolver o tocoferol. Meça a absorbância desta solução a 292 nm e calcule a concentração (como μg/mL de α-tocoferol) dividindo-se o valor da absorbância lida por 0,0076. IAL - 625 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Soluções-padrão estoque de β, γ, δ-tocoferóis – Prepare a solução-estoque para cada um dos padrões de β, γ, δ-tocoferol e proceda como descrito para a solução-padrão de α-tocoferol. Meça a absorbância de cada uma das soluções nos comprimentos de onda indicados abaixo e utilize os respectivos fatores para o cálculo da concentração e pureza. 296 nm β-tocoferol = 0,0089 298 nm γ-tocoferol = 0,0091 298 nm δ-tocoferol = 0,0087 Notas Os fatores citados são derivados dos valores da absorção especíica dos tocoferóis nos respectivos comprimentos de onda. Estoque as soluções-padrão em frasco de vidro âmbar, ao abrigo da luz e sob refrigeração pelo período de uma semana. Solução de trabalho de mistura de tocoferóis – Combine volumes apropriados das soluções-padrão estoque para obter soluções de trabalho com concentrações dos tocoferóis entre 1 e 5 μg/mL. Escolha no mínimo cinco pontos para a curva de calibração. Utilize n-hexano nas diluições. Nota: Quando utilizar detector UV prepare uma solução mais concentrada dos padrões. Procedimentos Otimização dos parâmetros analíticos – Condicione a coluna, se necessário. Ajuste o luxo da fase móvel [n-hexano/isopropanol (99,5:0,5 v/v)] em 1 mL/min e deixe pelo menos 30 min. Injete cerca de 20 μL da mistura dos padrões de tocoferóis e, se necessário, ajuste a proporção de isopropanol da fase móvel e o luxo. O luxo da fase móvel adequado deve estar entre (0,7 - 1,5)mL/min. O tempo de retenção do α-tocoferol não deve ser menor que 5 minutos. O Fator de resolução (R) para o β e γ-tocoferol não deve ser menor que 1,0. Fator de resolução (R) é calculado por: Rd1 = distância de retenção do γ-tocoferol Rd2 = distância de retenção do β-tocoferol W1 = largura da base do pico do γ-tocoferol W2 = largura da base do pico do β-tocoferol 626 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras Preparação da amostra – A amostra líquida de óleo deve ser homogeneizada (não iltre). Para amostra sólida, transira uma certa quantidade representativa (não menos que 10% do peso total da amostra) para um béquer e homogeneíze cuidadosamente. Faça a fusão em um banho-maria onde a temperatura não exceda a 40oC. O preparo da amostra deve ser feito na ausência de luz. Pese com precisão, entre 0,2 e 0,5 g da amostra de óleo e transira para um balão volumétrico de 25 mL com n-hexano. Agite para dissolver e complete o volume com o mesmo solvente. Quando utilizar um detector de luorescência, podem ser necessárias algumas diluições para a obtenção de um cromatograma adequado. A amostra deve estar protegida da luz durante os procedimentos de preparo e deve ser analisada no mesmo dia. Determinação de tocoferóis na amostra – Injete 20 μL da amostra e identiique os tocoferóis (e tocotrienóis) presentes por comparação com os tempos de retenção dos padrões. Registre as áreas dos picos dos tocoferóis e dos tocotrienóis. Faça duas determinações sucessivas para cada tocoferol, usando alíquotas-teste preparadas recentemente. O resultado inal deve ser a média de duas determinações obedecendo a exigência da repetitividade (vide resultados estatísticos do estudo colaborativo do método IUPAC 2432). Curva de calibração – Injete cerca de 20 μL das soluções de mistura dos padrões de tocoferóis. Repita a injeção e veriique se os cromatogramas obtidos são reprodutíveis. Construa as curvas de calibração pelo método de padronização externa. Cálculos A quantiicação dos tocoferóis é feita por padronização externa. Os teores dos tocoferóis são calculados a partir de curvas de calibração construídas pelos softwares dos equipamentos ou em planilhas de cálculo (ex: excel). Para a construção da curva utilize no mínimo cinco pontos, isto é, no mínimo cinco níveis de concentração de cada padrão. As curvas obtidas relacionam a concentração dos padrões e a resposta do detector (área). O teor de α-tocoferol presente em uma amostra, em μg/g, é dado por: C = concentração do padrão de α-tocoferol (μg/mL) A = medida da área do pico obtido pelo padrão de α-tocoferol a = medida do área do pico obtida pela amostra de α-tocoferol m = massa da amostra D = fator da diluição Os teores de β, γ e δ-tocoferóis da amostra são calculados como o procedimento anterior usando os dados do cromatograma do correspondente padrão de tocoferol. IAL - 627 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: os tocotrienóis contidos na amostra podem ser estimados usando os valores de C e A para o correspondente tocoferol. De acordo com a literatura a intensidade da luorescência para os tocoferóis é a mesma do correspondente tocotrienol e a absorbância no UV é similar. Referência bibliográfica INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892, 346/IV Determinação de tocoferóis e tocotrienóis por cromatografia líquida de alta eficiência em produtos processados contendo ésteres de tocoferóis. Produtos processados contendo ésteres de tocoferóis, como por exemplo, margarinas, são saponiicados e a matéria insaponiicável obtida é dissolvida em solvente orgânico e injetada em cromatógrafo a líquido para a separação e quantiicação dos tocoferóis e tocotrienóis. Material Balança analítica, banho-maria, rotavapor, balões âmbar de fundo chato de 50 e 100 mL com boca esmerilhada, funis de separação âmbar de 250 mL, iltros de vidro, provetas de 10 e 50 mL, papel de iltro e balão volumétrico de 50 mL. Reagentes Álcool aproximadamente 95% Ácool absoluto a 99% Pirogalol Solução de KOH a 60% m/v Éter etílico livre de peróxidos (contendo 0,1% m/m de pirogalol) HCl 0,01 M Sulfato de sódio anidro Procedimento – Pese cerca de 2 g da amostra em balão de fundo chato âmbar de 100 mL. Adicione aproximadamente 8 mL de álcool 95%, para dissolver completamente a amostra. Agite levemente o frasco. Adicione 100 mg de pirogalol e agite para dissolver. Puriique com nitrogênio, adicione 4 mL de solução aquosa de KOH 60%. Passe nitrogênio e 628 - IAL Capítulo XVI - Óleos e Gorduras tampe o frasco. Coloque o frasco em um banho-maria à temperatura de 26°C e agite vigorosamente por 10 minutos. Todas as operações devem ser realizadas na ausência de luz direta (use frascos de vidro âmbar ou os envolvam com papel alumínio). Adicione 50 mL de água ao frasco e transira o conteúdo quantitativamente para um funil de separação de 250 mL. Lave o frasco com 50 mL de éter etílico livre de peróxidos e transira as “lavagens” para o funil. Agite vigorosamente o funil de separação por 1 minuto, abrindo a tampa ocasionalmente para liberar a pressão formada. Deixe em repouso para que ocorra a separação das camadas. Retire a camada aquosa (camada inferior). Faça mais quatro extrações da camada aquosa com 30 mL de éter etílico isento de peróxidos e combine os extratos etéreos em outro funil de separação. Lave o extrato etéreo combinado com 50 mL de água (agitando cuidadosamente para evitar formação de emulsão) e a seguir com 30 mL de HCl 0,01 M. Separe as fases. Despreze a fase aquosa. Filtre a fração etérea passando por cerca de 3 g de Na2SO4 anidro, com a ajuda de um funil e papel de iltro. Colete o iltrado em balão de fundo chato âmbar para adaptar em um rotavapor. Remova o éter sob pressão reduzida, não excedendo a temperatura de 40°C. Se o resíduo líquido permanecer no frasco, adicione álcool absoluto 99% e evapore até à secura. Lave as paredes do frasco com n-hexano e transira o conteúdo quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL. Complete o volume. Dilua adequadamente a amostra e proceda conforme 345/IV. Referência bibliográfica INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892, 1988. Colaboradores Emy Takemoto, Mário Tavares, Miriam Solange Fernandes Caruso, Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues e Sabria Aued Pimentel IAL - 629 Capítulo XVII - Ovos e Produtos de Ovos CAPÍTULO XVII OVOS E PRODUTOS DE OVOS IAL - 631 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 632 - IAL Capítulo XVII - Ovos e Produtos de Ovos XVII OVOS E PRODUTOS DE OVOS vos, sem outra designação, são ovos de galinha, entregues ao consumo e, como tal, devem ser inspecionados em relação à classiicação e às suas características. A composição média em peso consiste de 57 por cento de clara, 32 por cento de gema e 11 por cento de casca. A análise de cada uma das duas partes (clara e gema) abrange as determinações de água, lipídios, nitrogênio, cinzas, fósforo em fosfato de sódio, colesterol, lecitina, pH e densidade, dando idéia da composição das mesmas. Do ponto de vista de controle, é interessante a análise eletroforética das proteínas que diferencia ovos de origem diversa (pata, galinha, etc.) O Ovo desidratado Na análise deste produto, além das determinações de umidade (012/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), cinzas (018/IV), fosfatos (031/IV), colesterol (421/IV), é importante examinar a solubilidade, arsênio e chumbo (cap. XXIII). 347/IV Prova de solubilidade Material Tubo de centrífuga de 25 mL, centrífuga, estufa e dessecador com sílica gel. Procedimento – Pese 1 g da amostra em um tubo de centrífuga previamente aquecido em estufa a 100ºC, resfriado em dessecador e pesado. Adicione 10 mL de água. Homogeneíze bem. Deixe em repouso por três horas. Aqueça em banho de água a 50ºC por meia hora. Centrifugue e decante. Aqueça o tubo com o resíduo em estufa a 70ºC, resfrie em dessecador e pese. IAL - 633 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo N = diferença entre o nº de g da amostra e o nº de g do resíduo P = nº de g da amostra Maionese A análise de maionese inclui, entre outras, as determinações de umidade (012/IV), acidez titulável (016/IV), colesterol (421/IV), amido (043/IV), cinzas (018/IV), cloretos em cloreto de sódio (028/IV ou 029/IV), e o exame dos aditivos: corantes, conservadores e emulsiicantes (cap. V). Uma extração do óleo presente no produto poderá ser feita com éter, de uma alíquota da amostra misturada a um excesso de sulfato de sódio anidro. Uma vez obtido o óleo, por remoção do solvente, pode-se determinar o índice de iodo, índice de saponiicação, e fazer a prova de rancidez, seguindo as técnicas usadas na análise de óleos (cap. XVI). Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: I MESP, 3. ed., 1985. p. 279. 348/IV Determinação dos sólidos da gema do ovo A dosagem de sólidos da gema do ovo em maionese é difícil; neste caso, determina-se o fósforo orgânico, extraindo-se a amostra com um solvente orgânico. Material Balão de fundo chato, condensador de vidro para reluxo, iltro de vidro, papel de iltro, cápsula de porcelana, banho-maria, mula e balão volumétrico de 100 mL. Reagente Metanol Solução de ácido clorídrico (1+2) 634 - IAL Capítulo XVII - Ovos e Produtos de Ovos Procedimento – Pese 5 g da amostra em um balão de fundo chato. Reluxe durante seis horas com metanol. Filtre. Lave o iltro com pequenas porções de metanol. Recolha os iltrados em cápsula de porcelana e evapore em banho-maria. Incinere em mula a 550ºC. Dissolva as cinzas em ácido clorídrico (1+2), transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Determine os fosfatos, em anidrido fosfórico, por espectrofotometria, conforme (031/IV). Cálculo A x 56 = sólidos da gema do ovo, por cento m/m A = fosfatos, em anidrido fosfórico, calculados como em 031/IV. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 278-280. Colaborador Odair Zenebon IAL - 635 Capítulo XVIII - Pescado e Derivados CAPÍTULO XVIII PESCADO E DERIVADOS IAL - 637 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 638 - IAL Capítulo XVIII - Pescado e Derivados XVIII PESCADO E DERIVADOS escado é todo animal que vive normalmente em água doce ou salgada e que serve para alimentação. Pescado fresco é aquele que não sofreu qualquer processo de conservação, exceto pelo resfriamento, e que mantém seus caracteres sensoriais essenciais inalterados. O pescado será designado pela espécie animal a que pertence ou pelo seu nome comum, por exemplo: sardinha, tainha, camarão, siri, polvo, lula, marisco. Várias são as determinações que podem avaliar o grau de conservação do produto, como a eletrométrica do pH, a de bases voláteis totais e a de histamina por espectrofluorimetria, alem da reação de Éber para gás sulfídrico. Outras determinações relacionam-se à composição química do pescado, como a de lipídios totais. P 349/IV Reação de Éber para gás sulfídrico A decomposição bacteriana dos aminoácidos sulfurados da carne de pescado libera enxofre, o qual em meio ácido transforma-se em gás sulfídrico (H2S). A reação de Éber é indicada para avaliar o estado de conservação do pescado fresco e de produtos relacionados em geral, como o pescado curado. Fundamenta-se na combinação do gás sulfídrico com solução de acetato de chumbo, produzindo enegrecimento do papel de filtro previamente tratado com a referida solução-reagente. Esta prova não se aplica no caso de produtos condimentados e em conservas de pescado que foram processadas em alta temperatura e baixa pressão. Para a realização da reação de Éber para gás sulfídrico, proceda como em 004/IV. IAL - 639 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 350/IV Determinação do pH A determinação de acidez pode fornecer um dado valioso na apreciação do estado de conservação de pescados e derivados. Um processo de decomposição, seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre o pH. A medida do pH em pescado e derivados é um dado indicativo do estado de conservação, entretanto para a avaliação mais segura torna-se também necessária a realização das análises microbiológica, química e sensorial. Para a determinação eletrométrica do pH de pescados, proceda como em 017/IV. 351/IV Determinação de bases voláteis totais A deterioração do pescado estocado sob refrigeração é devida à ação enzimática e bacteriana e resulta na produção de vários compostos, sendo os mais freqüentes: trimetilamina, dimetilamina, amônia e ácidos voláteis. A porcentagem de bases voláteis pode ser uma indicação do grau de conservação do pescado, dependendo da espécie. Normalmente, para espécies como cações, raias, siris, o valor de BVT é elevado sem que, necessariamente, estejam deterioradas. Neste método, a amônia e as aminas voláteis são destiladas por arraste de vapor, em meio levemente alcalino e quantificadas por volumetria de neutralização. Material Vidro de relógio, balão de Kjeldahl de 800 mL, proveta de 300 mL, condensador de Liebig, frasco Erlenmeyer de 500 mL e bureta de 15 mL. Reagentes Ácido sulfúrico 0,05 M Hidróxido de sódio 0,1 M Óxido de magnésio Silicone antiespumante Solução alcoólica de vermelho de metila a 0,2% m/v Procedimento – Prepare a amostra do peixe, tirando as espinhas e vísceras. Moa a carne e homogeneíze. Pese de 5 a 10 g da amostra (para camarões, siris e cação, pese 5 g e, para outras espécies de pescados pese 10 g), transfira para um balão de destilação de Kjeldahl, junte 300 mL de água, 1 a 2 g de óxido de magnésio e umas gotas de silicone antiespumante. Ligue o balão ao conjunto de destilação. Mergulhe a extremidade afunilada do condensador em 15 mL de ácido sulfúrico 0,05 M contido no frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione três gotas do indicador vermelho de metila, aqueça até ebulição e destile por 25 minutos. Titule o excesso de ácido sulfúrico 0,05 M com solução de 640 - IAL Capítulo XVIII - Pescado e Derivados hidróxido de sódio 0,1 M, até viragem do indicador da cor vermelha para amarela. Cálculo V = diferença entre o nº de mL de ácido sulfúrico 0,05 M adicionado e o nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação. P = nº de g da amostra. Nota: o resultado deverá ser expresso em mg por cento. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP. 1985. p. 274-275. 352/IV Determinação de histamina por espectrofluorimetria Entre as aminas biogênicas encontradas nos alimentos, a histamina destaca-se por poder causar intoxicações alimentares, especialmente veiculadas em peixes da família Scombridae, como o atum. O principal meio de sua formação é por atividade bacteriana. A enzima histidina descarboxilase de determinadas bactérias age sobre o aminoácido histidina encontrado em espécies de peixes de carne escura, formando a histamina. O nível de histamina nos alimentos é proporcional à quantidade formada nos tecidos do pescado, a qual está relacionada à concentração de bactérias descarboxiladoras da histidina. O método fluorimétrico baseia-se na reação da histamina com o o-ftalaldeído (OPT), formando um composto fluorescente. A homogeneização e extração da substância no produto são feitas com metanol, a purificação por resina de troca iônica e o acoplamento com OPT é efetuado em meio alcalino, adicionando-se ácido fosfórico. A determinação fluorimétrica é feita com excitação a 350 nm e emissão a 444 nm. Material Espectrofotômetro de fluorescência, agitador mecânico, pipetas volumétricas de (1 - 5) mL, frasco Erlenmeyer de polipropileno de 100 mL, balão volumétrico de polipropileno de 100 mL, balão volumétrico de 50 mL, banho-maria, multiprocessador, IAL - 641 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital papel de filtro, tubo cromatográfico de polipropileno de (200 x 7) mm, com controle de escoamento à razão de 3 mL/minuto, ajustando a altura da coluna ao tubo de saída. Este tubo deverá ser preparado da seguinte forma: coloque lã de vidro no tubo cromatográfico de modo a vedar a base e logo a seguir adicione a resina de troca iônica (pasta semifluída), formando uma camada de 8 cm. Adicione água e conserve-a sempre acima do nível da resina. Nota: nunca regenere a resina na coluna, quando for necessário melhor usar um béquer; sempre lave a coluna com 10 mL de água antes da aplicação de cada amostra. Reagentes Resina de troca iônica (Bio-Rad AG 1-X8, 50-100 mesh ou Dowex 1-X8, 50-100 mesh) – Essa resina deverá ser convertida para a forma alcalina, adicionando-se em um béquer, 15 mL de hidróxido de sódio 2 M/grama de resina. Agite vagarosamente com uma bastão de vidro e deixe descansar por 30 minutos. Decante a parte líquida. Lave a resina com água, filtre e lave novamente. Preencha o tubo com a resina já convertida. Prepare a resina semanalmente e mantenha em água. Solução de ácido fosfórico 1,78 M – Dilua 243,6 mL de ácido fosfórico para 1 L de água. Padronize 500 mL do ácido com solução de hidróxido de sódio 1 M, usando fenolftaleína como indicador. Ajuste a concentração, se necessário. Solução de aldeido dicarboxi-o-ftálico (OPT) a 0,1% em metanol – Dissolva 100 mg de OPT em metanol e complete o volume em balão volumétrico de 100 mL com metanol. A validade desta solução é de uma semana, quando conservada em frasco âmbar sob refrigeração. Soluções de hidróxido de sódio 1 M e 2 M. Solução-padrão estoque de histamina 1 mg/mL – Pese, com precisão, 169,1 mg de histamina.2HCl (98% de pureza) e dissolva em 100 mL de ácido clorídrico 0,1 M. A validade desta solução é de uma semana sob refrigeração. Solução-padrão intermediária de histamina 10 µg/mL – Transfira 1 mL da soluçãopadrão estoque de histamina para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com ácido clorídrico 0,1 M. A validade desta solução é de uma semana sob refrigeração. Soluções-padrão de histamina em diferentes concentrações – A partir da solução interme642 - IAL Capítulo XVIII - Pescado e Derivados diária de histamina a 10 μg/mL, prepare soluções contendo respectivamente 0,5 μg/5 mL, 1 μg/5 mL e 1,5 μg/5 mL , diluindo respectivamente 1, 2 e 3 mL da solução intermediária com 100 mL de ácido clorídrico 0,1 M. A validade destas soluções é de um dia. Procedimento Preparação da amostra – Para amostras de peixes congelados, deixe à temperatura ambiente e drene o líquido. Limpe, retirando escamas, espinha, cauda, cabeça, nadadeiras e vísceras. No caso de peixes pequenos (menores de 15 cm), use de cinco a dez unidades e para os grandes, três unidades. Corte os peixes transversalmente, subdividindo-os em partes de aproximadamente 2,5 cm. Moa em processador e homogeneíze a massa obtida da carne do pescado. Pese 10 g da amostra, adicione 50 mL de metanol e homogeneíze em agitador mecânico por dois minutos. Transfira para um balão volumétrico de polipropileno de 100 mL, lavando com metanol e aqueça a 60ºC, por 15 minutos, em banho-maria. Esfrie à temperatura ambiente, complete o volume com metanol e filtre através de papel de filtro utilizando funil de polipropileno. Esta solução poderá ser conservada na geladeira por várias semanas. Passe (4 – 5)mL de água na coluna e descarte o eluato. Com uma pipeta volumétrica adicione 1 mL do extrato da amostra seguido da adição de (4 - 5)mL de água. Imediatamente ao início do escoamento do líquido pela coluna, colete o filtrado em um balão volumétrico de 50 mL contendo 5 mL de HCl 1 M. Lave a coluna várias vezes com água até perfazer 35 mL do filtrado total coletado, complete o volume para 50 mL e conserve em geladeira. Pipete 5 mL do filtrado em um frasco Erlenmeyer de 50 mL, adicione 10 mL de HCl 0,1 M e agite. Pipete 3 mL de NaOH 1 M, agite, adicione 1 mL do reagente OPT e agite (é importante agitar ao menos uma vez durante a reação com OPT). Após 4 minutos, adicione 3 mL de ácido fosfórico 1,78 M, homogeneíze a solução e meça a fluorescência com excitação a 350 nm e emissão a 444 nm. Zere, previamente, o aparelho com água. Prepare o branco da mesma maneira, usando 5 mL de HCL 0,1 M no lugar da solução da amostra e faça a leitura no prazo de uma hora e meia. Curva-padrão – Pipete, em duplicata, 5 mL de cada solução-padrão em um frasco Erlenmeyer de polipropileno de 50 mL, adicione 10 mL de HCl 0,1 M, agite, 3 mL de NaOH 1 M, agite e 1 mL do reagente OPT, agite. Acrescente, após 4 minutos, 3 mL de ácido fosfórico 1,78 M, homogeneíze cada solução e faça as leituras das fluorescências obtidas. Prepare o branco usando 5 mL de HCl 0,1 M no lugar da solução-padrão. Zere o aparelho com água. A leitura deve ser feita no prazo de uma hora e meia, com IAL - 643 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital excitação de 350 nm e emissão de 444 nm. A curva deve ser construída em μg histamina por 5 mL de alíquota, corrigindo os valores do branco. Cálculo Is = fluorecência da amostra b = coeficiente linear da reta obtida na curva-padrão P = massa da amostra em g a = coeficiente angular da reta obtida da curva-padrão 1000 = fator de diluição (amostra diluída em balão de 100 mL e alíquota de 1 mL em balão volumétrico de 50 mL) Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association Official of Analytical Chemists International. 17th ed. Arlington: A.O.A.C. Int., 2000. Chapter 35 (method 977.13). 353/IV Determinação de lipídios totais pelo método de Bligh-Dyer modificado A fração gordurosa do pescado é constituída de uma mistura complexa de lipídios neutros (triglicerídios), lipídios polares (fosfolipídios) e componentes menores (esteróis, ácidos graxos livres, etc.). Os métodos clássicos para a extração de gordura de alimentos, como o de Soxhlet, que usa hexano, éter etílico ou de petróleo, não são adequados para o pescado. Assim sendo, foram testados outros métodos, como os de Bligh-Dyer e de Folch, que empregam clorofórmio, metanol e água, e têm sido recomendados por serem exatos e reprodutíveis para a determinação de lipídios totais em alimentos com alto teor de água, como os peixes. Material Capela química, balança analítica, béquer de 500 mL, agitador mecânico, estufa, rotavapor, dessecador, funil de vidro, funil de separação de 500 mL, balão de fundo chato com boca esmerilhada de 300 mL e papel de filtro. 644 - IAL Capítulo XVIII - Pescado e Derivados Reagentes Clorofórmio Metanol Sulfato de sódio anidro Procedimento – Pese 50 g da amostra homogeneizada e transfira para um béquer de 500 mL. Adicione 50 mL de clorofórmio e 100 mL de metanol. Adicione novamente 50 mL de clorofórmio e 50 mL de água. Agite, com o auxílio de um agitador mecânico, por 15 minutos, em capela química. Filtre o material homogeneizado, utilizando funil de vidro com papel de filtro contendo sulfato de sódio anidro, para um funil de separação de 500 mL. Após completa separação e clarificação, recolha a camada de clorofórmio (inferior) em balão de fundo chato com boca esmerilhada de 300 mL, previamente tarado. Evapore num rotavapor até a completa remoção do solvente. Transfira o balão para uma estufa a 105°C por 1 hora. Esfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo P = massa da amostra em g N = (massa do balão + massa óleo) - massa do balão Notas Teste o funil de separação com clorofórmio, antes de usar, para assegurar que não haja vazamento. Para a análise dos ácidos graxos na gordura extraída, não utilize a estufa para a secagem. Após a remoção do solvente no rotavapor, complete a secagem com nitrogênio seco. Referência bibliográfica BLIGH, E.G.; DYER, W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol, v. 37, n. 8, p. 911-917, 1959. IAL - 645 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 354/IV Determinação de lipídios totais pelo método de Folch Material Balança analítica, blender, chapa de aquecimento, estufa, funil de separação de 500 mL, balão volumétrico de 250 mL, funil de vidro, provetas de 100 e 200 mL, béquer de 50 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, dessecador com sílica seca e papel de filtro comum. Reagentes Solução de clorofórmio-metanol 2:1 v/v Solução de cloreto de potássio a 0,74% m/v Sulfato de sódio anidro Clorofórmio Procedimento – Pese (10,0 ± 0,5) g de amostra homogeneizada no copo do blender. Adicione 200 mL de clorofórmio-metanol (2:1) e bata por 3 minutos no blender. Filtre, cuidadosamente, para o funil de separação, usando papel de filtro comum. Re-extraia com 100 mL de clorofórmio-metanol (2:1). Filtre novamente. Lave o copo e a tampa com clorofórmio (± 30 mL) e transfira diretamente para o funil. Adicione, ao funil de separação, 66 mL de KCl a 0,74%. Agite por 1 minuto e deixe separar as fases. Filtre a fase de clorofórmio (fase inferior) para um balão volumétrico de 250 mL, usando sulfato de sódio anidro no papel de filtro. Lave o funil de separação e o papel de filtro com clorofórmio. Complete o volume com clorofórmio e transfira uma alíquota de 10 mL para um béquer de 50 mL tarado. Seque em chapa de aquecimento a 60oC. Seque em estufa a 100oC por 30 minutos, esfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Nota: teste o funil de separação com clorofórmio, antes de usar, para assegurar que não haja vazamento. Cálculo P = nº de g da amostra na alíquota p1 = massa do béquer p2 = massa do béquer mais óleo 646 - IAL Capítulo XVIII - Pescado e Derivados Referência bibliográfica FOLCH, J.; LEES, M.; STANLEY, G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem., v. 226, p. 497509,1957. Conservas de pescado Conserva de pescado é o produto preparado com pescado limpo, cru, cozido ou curado, adicionado de outras substâncias alimentícias e submetido a processos físicos e químicos apropriados a cada espécie. As conservas de pescado serão designadas pela espécie de pescado a que pertencem e o modo de apresentação. Na análise das conservas de pescado faz-se uso de todas as análises já descritas para pescado, além destas, outras como umidade (012/IV), amido (043/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), cinzas (018/IV) e cloretos (028/IV ou 029/IV). Nas conservas de pescado em óleos, podem ainda ser realizadas, a reação de Kreis (333/IV), a acidez em ácido oléico (325/IV) e a identificação do óleo de cobertura por cromatografia em fase gasosa (344/IV). Colaboradores Mário Tavares e Rosymaura Baena Moreno IAL - 647 Capítulo XIX - Vitaminas CAPÍTULO XIX VITAMINAS IAL - 649 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 650 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas XIX VITAMINAS 355/IV Determinação de carotenóides em produtos naturais Os carotenóides, pró-vitamina A, amplamente distribuídos nos vegetais e animais, representam um grupo de pigmentos naturais lipossolúveis com tonalidades que variam do amarelo ao vermelho. Na sua maioria, estes pigmentos são tetraterpenos constituídos por oito unidades de isopreno (C5H8), com duplas ligações conjugadas que compõem o sistema cromóforo. As principais fontes de carotenóides no reino vegetal são: cenouras, frutas e verduras. Nos alimentos, além de contribuírem com a cor, alguns pigmentos carotenóides atuam como pró-vitamina A. Os principais carotenóides (α e β carotenos), precursores da vitamina A em produtos naturais, são determinados por cromatograia em coluna e por espectrofotometria UV/VIS. O método apresentado baseia-se na extração com solventes orgânicos, saponiicação e separação dos carotenóides por cromatograia em coluna. Os carotenóides alfa e beta são identiicados pela posição relativa dos pigmentos na coluna e pelos espectros de absorção na região UV/VIS. Material Balança analítica, rotavapor, cilindro de nitrogênio, trompa d’água, lã de vidro, liqüidiicador com copo de vidro (ou agitador mecânico), espectrofotômetro UV/ VIS, papel de alumínio, papel de iltro, coluna cromatográica de vidro de (2,5 x 50) cm de altura ou 2 x 25 cm, kitassatos de 500 e 250 mL, frascos Erlenmeyer com tampa de 500, 250, 100 e 50 mL, béqueres de 250 e 100 mL, bastão de vidro, funil de vidro, balões volumétricos de 50 e 100 mL, funil de separação com torneira de teflon de 500 mL, funil de Büchner e proveta 100 mL. IAL - 651 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Óxido de magnésio para cromatograia em coluna Celite Éter de petróleo com faixa de destilação (30-60)°C Hidróxido de potássio Metanol Acetona Sulfato de sódio anidro Solução de hidróxido de potássio a 10% m/v – Pese 10 g de hidróxido de potássio, dissolva em metanol e complete a 100 mL. Fase estacionária – Pese o óxido de magnésio e a celite na proporção (1:2). Transira para um frasco fechado. Agite bem para homogeneizar, antes do empacotamento da coluna cromatográica. Procedimento – Adapte a coluna a um kitassato de 500 mL, coloque um pouco de lã de vidro na parte inferior da coluna e adicione aos poucos a mistura preparada com óxido de magnésio-celite (1:1), com auxílio da trompa d′água, até aproximadamente 10 a 15 cm. O empacotamento deve icar uniforme, sem sulcos ou falhas e não muito compactado. Triture e homogeneíze 500 g da amostra e pese aproximadamente 10 g. Extraia os pigmentos com acetona resfriada com auxílio do liqüidiicador ou agitador mecânico. Filtre através de um funil de Büchner. Repita esta operação até o resíduo icar incolor. Junte todos os extratos de acetona contendo os carotenóides e armazene sob a proteção da luz. Coloque 100 mL de éter de petróleo no funil de separação. Adicione, aos poucos, a solução de acetona contendo os pigmentos extraídos, acrescentando água após cada adição. Agite, e após a separação das duas fases, descarte a camada aquosa com acetona (inferior). Repita esta operação lentamente, evitando emulsões, até a eliminação da acetona. Os pigmentos são transferidos para a fase etérea. Lave mais quatro ou cinco vezes a fase etérea para eliminar totalmente algum resíduo de acetona. Recolha a fase etérea em um frasco Erlenmeyer com tampa de 500 mL e guarde para a saponiicação, protegendo da luz. Saponiique os pigmentos com adição de uma solução de KOH a 10% em metanol na proporção de 1:1 em relação ao volume do extrato de éter de petróleo. Agite e deixe esta mistura em repouso por aproximadamente 12 horas à temperatura ambiente. Elimine os resíduos de KOH com sucessivas lavagens com água em funil de separação. Adicione pequena porção de sulfato de sódio anidro para retirar a água residual da amostra. Cromatograia em coluna – Evapore a solução anterior em rotavapor, até aproximada652 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas mente 20 mL à temperatura de 35°C ou sob corrente de nitrogênio. Na coluna, previamente compactada e conectada à trompa d’água, adicione éter de petróleo para umedecê-la evitando ressecamento. Junte a amostra e observe as separações das frações de carotenóides. Continue adicionando éter de petróleo até a nítida separação das frações, atingindo assim o im da coluna. A 1a fração separada é o α-caroteno, de cor amarela clara, podendo também ser separada com o uso de uma solução de 2% de acetona em éter de petróleo. A 2a fração separada é o β-caroteno, de cor alaranjada, podendo também ser separada com o uso de uma solução a 5% de acetona em éter de petróleo Essas duas frações são as que possuem maior atividade de vitamina A e de maior interesse. Recolha, separadamente, as frações. Se na separação for utilizada acetona, ela deverá ser retirada com sucessivas lavagens com água no funil de separação. Adicione pequena porção de sulfato de sódio anidro. As fases etéreas são evaporadas, completadas a um determinado volume com solvente e as absorbâncias lidas no espectrofotômetro UV/VIS. Na 1a fase, o α- caroteno é identiicado e quantiicado por espectrofotometria na região do visível, cujo espectro característico apresenta três picos máximos de absorção, respectivamente em: 421, 443 e 472 nm. Na 2a fase etérea, o β-caroteno é identiicado e quantiicado por espectrofotometria na região do visível, cujo espectro característico apresenta três picos máximos de absorção em: 425, 448 e 475 nm. Cálculo A = absorbância máxima obtida no espectro de absorção V = volume do solvente no qual se encontra dissolvido o carotenóide (mL) P = massa da amostra integral (g) Nota: a absortividade do α-caroteno em éter de petróleo no λ = 444 nm corresponde a 2800 e a do β-caroteno no λ = 453 nm corresponde a 2592. Referências bibliográficas DAVIES, B.H. Carotenoids. In: GOODWIN, T.W. Chemistry and biochemistry of plants pigments. 2. ed., v. 2, London: Academic Press, 1976. p. 38-165. RODRIGUES, R.S.M. Carotenóides com atividade pró-vitamínica A de hortaliças IAL - 653 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital folhosas e suas alterações com o cozimento. 1988. 140 f. Tese (Mestre em Ciência dos Alimentos) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; RAYMUNDO, L.C.; LEE, T.C.; SIMPSON, K.L.; CHICHESTER, C.O. Carotenoid pigment changes in ripening Momordica charantia fruits. Ann. Bot., London, v. 40, p. 615-624. 1976. RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. A guide to caratenoid analysis in foods. Washington, D.C.: ILSI Press International Life Sciences Institute, 1999. 64 p. 356/IV Determinação de ß-caroteno em massas alimentícias Os carotenóides são importantes do ponto de vista nutricional, porque alguns deles, além da função de corante, podem converter-se em vitamina A. O ß-caroteno e o ß-apo-8carotenal são os que demonstram maior atividade provitamínica A. Nas massas alimentícias brasileiras, tais como, o macarrão, cujo conteúdo natural de carotenóides é insuiciente, tecnicamente é recomendável adicionar ß-caroteno. Há muitos anos, os fabricantes brasileiros de massas alimentícias vêm utilizando esta prática como alternativa para o enriquecimento com ovos. O método analítico apresentado consiste na extração do ß-caroteno com solvente orgânico, remoção dos ácidos graxos e outros interferentes por saponiicação, identiicação e quantiicação por espectrofotometria de absorção na região UV/VIS. Material Liqüidiicador, balança analítica, chapa elétrica com agitador, cilindro de nitrogênio, espectrofotômetro UV/VIS, papel de iltro, papel de alumínio, balão de fundo chato com junta esmerilhada 24/40 de 250 ou 300 mL, condensador de bola, funis de separação de cor âmbar com torneira de teflon de 250 e 500 mL, béqueres de 25, 250, 400 e 500 mL, balões volumétricos de 50 e 100 mL, funil de vidro e bastão de vidro. Reagentes Álcool isento de aldeídos e peróxidos Glicerina Éter de petróleo com faixa de destilação (30-60)°C Sulfato de sódio anidro Solução de hidróxido de potássio a 30% m/v – Pese 30 g de hidróxido de potássio, dissolva em água destilada e complete o volume a 100 mL. 654 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% m/v - Pese 1 g de fenolftaleína, dissolva em álcool e complete o volume a 100 mL. Procedimento – Pese 5 g de amostra, previamente triturada e homogeneizada, em um balão de fundo chato com junta esmerilhada 24/40 de 250 mL ou de 300 mL. Coloque 10 mL de glicerina e agite. Adicione 50 mL de álcool isento de aldeídos e peróxidos, 10 mL de hidróxido de potássio a 30% e aqueça em reluxo, mais ou menos a 40°C, por 30 minutos. Esfrie e transira a solução para um funil de separação de 250 mL e extraia o ß-caroteno com duas porções consecutivas de 25 mL de éter de petróleo. Reúna os extratos etéreos em um segundo funil de separação de 500 mL e lave com porções de 50 mL de água, agitando suavemente até que a fase aquosa não dê coloração rósea, pela adição de algumas gotas da solução indicadora de fenolftaleína. Filtre em funil de vidro contendo sulfato de sódio anidro para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com éter de petróleo. Determine a absorbância em espectrofotômetro a 450 nm, usando éter de petróleo como branco. Nota: se outras substâncias estiverem presentes na amostra, passíveis de extração com o ß-caroteno, há necessidade de separá-las por cromatograia em papel, utilizando uma alíquota do extrato etéreo e uma solução de acetona a 2% em éter de petróleo como fase móvel. O ß-caroteno migra com o solvente apresentando um Rf maior que as demais substâncias interferentes. Cálculo A = absorbância a 450 nm obtida no espectro de absorção C = quantidade da amostra em 100 mL de éter de petróleo. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz, v.1, Métodos químicos e físicos de alimentos. 3. ed., São Paulo: IMESP, p. 382-383. 1985. LA ASSOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE VITAMINAS, INC. Métodos de Análisis de Vitaminas. Tradução de M.ª Soledad G. Chamarro y Cláudio Fernández Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 91-114. Titulo original: Methods of Vitamin Assay. IAL - 655 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital PEREIRA,M.R. Beta-caroteno em macarrão fortiicado e avaliação da metodologia analítica. 1997. 95 f. Tese (Mestre em Ciência da Nutrição) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas - SP. 357/IV Determinação de vitamina A em alimentos A vitamina A, além de ser essencial na manutenção do crescimento normal das células e na diferenciação dos tecidos epitelial e ósseo, também está relacionada com a isiologia da visão. Sua deiciência pode causar xeroftalmia (cegueira noturna). Há indicação de que esta vitamina inluencie elementos especíicos do sistema imune. Por outro lado, convém salientar que quantidades excessivas têm efeito tóxico no organismo. No estado natural, esta vitamina é encontrada somente nos animais, sendo isolada da fração insaponiicável de lipídios. A fonte mais rica de vitamina A é o fígado de peixes, sendo que determinados tecidos podem conter quantidades signiicativas. Basicamente, a molécula de vitamina A é um álcool, o retinol, que está presente nos alimentos e tecidos como ésteres combinados com ácidos graxos de cadeia longa, como o ácido palmítico. Este método baseia-se na medida da coloração azul instável, resultante da reação da vitamina A com o tricloreto de antimônio (reagente Carr Price) e é válido para a determinação de vitamina A em alimentos, enriquecidos ou não, rações e misturas vitamínicas (premix). Não é aplicável para produtos contendo pró-vitamina A (carotenos). A análise compreende as seguintes etapas: conversão dos ésteres de vitamina A à forma alcoólica correspondente por saponiicação, extração e determinação colorimétrica. Material Colorímetro com faixa de leitura de 500 a 700 nm, cilindro de nitrogênio, placa aquecedora com agitador, tubos de colorímetro, balança analítica, balão com boca esmerilhada de 250 mL, condensador de reluxo, balões volumétricos de cor âmbar de 50 e de 100 mL, funis de separação de cor âmbar de 250 e de 500 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 5 e 10 mL, funis de vidro de 5 cm de diâmetro e bastão de vidro. Reagentes Álcool isento de aldeídos e peróxidos Álcool Glicerina Éter de petróleo (30-60)°C Anidrido acético Sulfato de sódio anidro Clorofórmio Solução de hidróxido de potássio 30% m/v. Solução de fenolftaleína 656 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Ácido clorídrico, álcool comercial ou clorofórmio comercial – Para descontaminação da vidraria que entrou em contato com reagente Carr-Price. Solução-padrão de vitamina A – Pese certa quantidade do padrão retinol necessária para preparar uma solução que contenha de 8 a 15 unidades internacionais (UI) de vitamina A, em álcool isopropílico. Na disponibilidade do padrão de acetato de vitamina A, pese com precisão 0,1 g e saponiique de acordo com o procedimento abaixo descrito. Extraia o saponiicado com três alíquotas de éter de petróleo, respectivamente de 40, 30 e 30 mL e lave com água para eliminar o excesso de hidróxido de potássio, veriicando pela reação negativa com fenolftaleína. Colete as fases em balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com éter de petróleo. Pipete uma alíquota de volume conhecido e evapore sob corrente de nitrogênio. Dissolva o resíduo em quantidade suiciente de álcool isopropílico para se obter concentração inal entre 8 e 15 UI de vitamina A por mL. Nota: prepare esta solução sempre no dia da análise. Reagente de Carr-Price – Dissolva 25 g de tricloreto de antimônio com clorofórmio e transira para um balão volumétrico de 100 mL, completando o volume com o mesmo solvente. Deixe esta solução em repouso de um dia para outro, em frasco de cor âmbar, bem fechado e sob refrigeração. Este reagente é estável por dois meses. Procedimento Preparação da amostra – Para alimentos secos e misturas vitamínicas (premix), colete de 600 a 800 g do total da amostra. Armazene em frasco bem fechado, em local seco e escuro e no período máximo de uma semana. As amostras líquidas devem ser conservadas sob refrigeração à temperatura até 8°C. Antes de iniciar a análise, deixe a amostra à temperatura ambiente e homogeneíze bem. Margarina, manteiga e creme vegetal devem ser armazenadas em refrigerador. Não exponha a amostra à luz e ao calor. Antes de iniciar a análise amoleça a amostra, corte-a e tome pequenas partes ao acaso. Não misture e nem agite a amostra, pois isto causará a separação da água, que é um processo irreversível. Para guardá-la, embrulhe sem homogeneizar e refrigere. Saponificação da amostra – Adicione, diretamente em um balão de boca esmerilhada de 250 mL, uma quantidade de amostra que contenha até 50 UI de vitamina A. Adicione 10 mL de glicerina e agite. Adicione 50 mL de álcool e 10 mL de solução aquosa de hidróxido de potássio a 30%. Aqueça em placa aquecedora, sob reluxo e com agitação por 30 minutos. Esfrie e transira a solução para o funil de separação âmbar de 250 mL. Extraia a vitamina A com duas porções de éter de petróleo, respectivamente, 30 e 20 mL ou, se necessário, com três porções, respectivamente, 40, 30 e 20 mL. Transira os extratos IAL - 657 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital etéreos para um segundo funil de separação âmbar de 500 mL e lave com porções de 50 mL de água, agitando suavemente, até que a fase aquosa não apresente mais reação alcalina pela adição de 2-3 gotas de fenolftaleína. Filtre com sulfato de sódio anidro para um balão volumétrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com éter de petróleo (solução A). Ajuste o colorímetro ou o espectrofotômetro para 100% de transmitância ou zero de absorbância a 620 nm, usando água na cubeta ou no tubo do colorímetro. Transira uma alíquota da solução A correspondente a 10-50 UI de vitamina A para um tubo do colorímetro e evapore sob nitrogênio até secagem. Dissolva o resíduo da evaporação com 3 mL de clorofórmio, adicione 4 gotas de anidrido acético e 7 mL do reagente de CarrPrice. No período de até 15 segundos após a adição do reagente Carr-Price, meça a 620 nm a absorbância da coloração desenvolvida, usando a água como referência. Curva-padrão – Transira, individualmente, cinco alíquotas da solução-padrão, contendo concentrações de 10 a 50 UI de vitamina A com incrementos de 10 UI para um tubo do colorímetro e siga como em procedimento da amostra. Com os dados obtidos construa uma curva-padrão. Cálculo Determine a quantidade de vitamina A correspondente, utilizando a curva-padrão previamente estabelecida. Use a tabela abaixo para a conversão de UI em μg de vitamina A e derivados e de beta-caroteno. 1 UI de vitamina A 0,3 μg de acetato de vitamina A 1 UI de vitamina A 0,54 μg de palmitato de vitamina A 1 UI de vitamina A 1,8 μg de beta-caroteno 1 μg de palmitato de vitamina A 0,55 μg de acetato de vitamina A 1 UI de vitamina A 0,3 μg de equivalente em retinol (ER)* *1 equivalente em retinol (ER) = 1 μg de retinol 358/IV Determinação de vitamina A em matéria-prima Este método baseia-se na determinação da vitamina A por espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta. Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, cubetas de quartzo, placa aquecedora com agitador magnético, cilindro de nitrogênio, balões volumétricos cor âmbar de 100 mL, balão redondo de 250 mL com fundo chato e boca esmerilhada adaptável a um refrigerante para reluxo, condensador de reluxo, pipetas graduadas e volumétricas de vários 658 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas volumes, funis de vidro de 5 cm de diâmetro e bastão de vidro. Reagentes Glicerina Solução de hidróxido de potássio 30% m/v Álcool isento de aldeídos e peróxidos Éter de petróleo (30-60)°C Solução de fenolftaleína Sulfato de sódio anidro Álcool isopropílico Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,1 g da amostra e saponiique como descrito no procedimento 357/IV. Extraia com três porções, respectivamente, 40, 30 e 30 mL de éter de petróleo e lave os extratos etéreos com água até que a água da lavagem não apresente reação alcalina com 2-3 gotas de fenolftaleína. Filtre em iltro com sulfato de sódio anidro e transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com éter de petróleo. Retire uma alíquota de volume conhecido desta solução e evapore sob nitrogênio. Dissolva o resíduo em quantidade suiciente de álcool isopropílico para se obter uma solução com concentração de 8 a 15 UI de vitamina A por mL. Determine a absorbância a 325 nm, que é o comprimento de onda de máxima absorção da vitamina A e também a 310 e 334 nm, para efetuar a correção de outras substâncias que possam interferir na determinação. Utilize álcool isopropílico como branco. Cálculos A = Absorbância L = espessura da cubeta em cm C = quantidade da amostra em gramas contida em 1000 mL da solução em isopropanol 5700 = fator de conversão de unidades espectrofotométricas em gravimétricas 0,3 = fator de conversão de g em UI Referências bibliográficas CARR, F.H.; PRICE, E.A. Colour reactions attributed to vitamin A. Biochem. J., v. 20, p. 497-501. 1926. IAL - 659 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital INSTITUTO ADOLFO LUTZ, Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, p. 381-382, 1985. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1045-1047 (method 924.29). BALL, G.M.F. Fat-soluble vitamin assays in food analysis A Comprehensive Review. London: Elsevier Applied Science, 1988. 326 p. 359/IV Determinação de vitamina B1 em alimentos A vitamina B1, também conhecida como tiamina, é encontrada em alimentos naturais e em outros materiais biológicos. As leveduras, os germes de cereais e as nozes são ricos em vitamina B1. Este método fundamenta-se na quantiicação da luorescência produzida em condições padronizadas, do composto tiocromo que é originário da oxidação da tiamina com solução alcalina de ferricianeto de potássio. Nos produtos naturais, a extração da vitamina B1 somente é possível após a hidrólise ácida e enzimática, que transforma a forma combinada da vitamina em tiamina livre. Material Espectrofotômetro de luorescência, estufa, banho-maria, liqüidiicador, papel de iltro qualitativo, papel indicador de pH, funil de separação tipo pêra de 125 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, tubos de ensaio de 20 cm, balões volumétricos de 25, 100, 200 e 1000 mL, provetas de 100 e 200 mL, béqueres de 25, 50, 100 e 200 mL, funil de vidro, pesa-iltro de 25 mL com tampa e dessecador com sílica gel. Reagentes Vitamina B1 padrão Álcool metílico Álcool isobutílico Sulfato de sódio anidro Álcool (isento de aldeídos e peróxidos) – Trate o álcool com zinco e hidróxido de sódio e destile. Solução de ferricianeto de potássio a 1% m/v Solução de hidróxido de sódio a 30% m/v Solução de ácido sulfúrico 0,05 M Solução de acetato de sódio – Em um béquer de 100 mL, pese 34,5 g de acetato de sódio e dissolva em aproximadamente 50 mL de água. Transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. 660 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Solução de diastase – Pese, com precisão, 0,3 g de diastase e complete o volume de 5 mL com solução de acetato de sódio. Solução-padrão de vitamina B1 (5 μg/mL) – Pese, com precisão, cerca de 50 mg de vitamina B1, previamente seca em estufa a 110°C, durante 2 horas até peso constante. Faça diluições sucessivas de modo que a última solução contenha cerca de 5 μg de vitamina B1 por mL. Conserve em geladeira. Procedimentos Produtos enriquecidos – Prepare as soluções dos produtos a analisar de modo que a solução inal contenha (2,5-5) μg de vitamina B1 por mL. Adicione 10 mL de solução de ácido sulfúrico 0,05 M para melhor dissolução. Complete o volume com água. Selecione dois funis de separação: A, para análise e P, para o padrão. Adicione, seqüencialmente: 10 mL de água aos funis A e P, 2 mL de álcool metílico aos funis A e P, 1 mL da solução da amostra ao funil A, 1 mL da solução-padrão ao funil P, 1 mL da solução de ferricianeto de potássio a 1% aos funis A e P e 1 ml da solução de hidróxido de sódio a 30% aos funis A e P. Agite levemente e espere dois minutos. Extraia o tiocromo formado, adicionando 10 mL de álcool isobutílico em cada funil. Agite fortemente cerca de um minuto e meio e deixe em repouso durante um a dois minutos. Elimine a camada aquosa. Passe a camada alcoólica para tubos de ensaio limpos, secos e marcados A e P. Coloque cerca de 200 mg de sulfato de sódio anidro em cada tubo de ensaio. Pipete 5 mL para balões volumétricos de 25 mL, limpos e secos (A e P). Pipete 5 mL de álcool isobutílico para balão volumétrico de 25 mL, limpo e seco e marcado B (branco). Complete o volume e homogeneíze com álcool destilado, livre de aldeídos e substâncias luorescentes. Leia em espectrofotômetro de luorescência, ajustando o 100% da escala com a solução-padrão de 5 μg/mL de vitamina B1 ou conforme especiicações do fabricante do aparelho e o zero com o branco. Use luz de excitação de 365 nm e de emissão de 435 nm. Produtos naturais – Pese uma quantidade suiciente da amostra ou meça um volume, tal que a solução inal contenha até 5 μg de vitamina B1 por mL. Transira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 150 mL de solução de ácido sulfúrico 0,05 M (para amostra de levedura, adicione água), misture, deixe em banho-maria em ebulição durante 30 minutos e agite de vez em quando. Retire do banho-maria e deixe esfriar à temperatura ambiente. Adicione 5 mL da suspensão de diastase preparada recentemente, ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com a solução de acetato de sódio. Incube a amostra a (45-50)°C em banho-maria, durante duas horas. Esfrie à temperatura ambiente e transira para um balão volumétrico de 100 ou 200 mL e complete o volume com ácido sulfúrico 0,05 M (para amostra de levedura, complete com água). Agite, iltre e recolha em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Em seguida, proceda com em produtos enriquecidos. Nota: a vitamina B1 é sensível à luz, portanto evite a claridade durante a análise. Determine, periodicamente, o teor da vitamina B1 padrão. IAL - 661 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo La = leitura da amostra P = n°de μ/mL do padrão A = n° de mL da solução de M g ou mL da amostra M = massa ou volume da amostra ou, simpliicando: Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 383-385. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1045-1047 (method 924.29). STROHECKER, R.; HENNING, H. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D. Libman. 1 ed. Germany: Verlag Chemie GMBH, 1966. p. 65-90. Titulo Original: Vitamin-Bestimmungen, Er probte Methoden. LA ASSOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE VITAMINAS, INC. Métodos de Análisis de Vitaminas. Tradução de M.ª Soledad G. Chamarro y Cláudio Fernández Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 115-135. Titulo original: Methods of Vitamin Assay. 360/IV Determinação da vitamina B12 em matéria-prima Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS com registrador, termômetro, béqueres de 10, 25 e 50 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5 e 10 mL, balões volumétricos de 25, 50, 100, 200 e 1000 mL, dessecador com sílica gel e pesa-iltro com tampa de 25 mL. 662 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Reagentes Vitamina B12 padrão Sílica gel com indicador de umidade Procedimento – Dilua, em água, uma quantidade da amostra de maneira que a concentração de vitamina B12 esteja na faixa de concentração de (20-40) μg/mL. Faça a leitura da absorbância no espectrofotômetro UV/VIS nos comprimentos de onda: 361 nm (se o princípio ativo for cianocobalamina), 351 nm (hidroxicobalamina) e 550 nm (mistura das vitaminas: B1, B6 e B12). Notas A vitamina B12 (cianocobalamina) deverá conter, no mínimo, 96% de pureza e no máximo 100,5%, calculado em relação à matéria seca. O método não é aplicável para mistura de vitamina B12 com vitamina B2, pois há interferência da cor amarela da vitamina B2. Cálculos Mistura de vitaminas (leitura em 550 nm): Apenas cianocobalamina (leitura em 361 nm): Apenas hidroxicobalamina (leitura em 351 nm): IAL - 663 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editoria S.A., 1997. p. 198-200. STROHECKER, R.; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p.151-172. Título Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden. THE MERCK INDEX. 8. ed. Rahway, U.S.A.: MERCK & CO., 1968. p. 97, 547, 1112-1113. KUTSKY R.J. Handbook of Vitamins e Hormones. Paris: Van Nostrand Reinhold Company.1973. p. 62-70. 361/IV Doseamento microbiológico de vitamina B12 Material Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, placas de Petri estéreis, pipetas de 1, 5, 10 e 25 mL, pipetas micrométricas, bastões de vidro, béqueres de 10, 20, 30, 50, 100, 200, 250 e 500 mL, termômetro, tubos de ensaio para meios de cultura, frascos Erlenmeyer de 30, 50, 100, 250 e 500 mL, pinça anatômica reta, discos de papel para dosagem de antibiótico, papel de pH, almofariz com pistilo e papel de iltro. Reagentes Solução salina – Pese 20 g de cloreto de amônio, 4 g de nitrato de amônio, 8 g de sulfato de sódio, 4 g de fosfato de potássio monobásico, 12 g de fosfato de potássio dibásico e 0,823 g de sulfato de magnésio. Adicione 1000 mL de água. Aqueça até a dissolução dos sais. Distribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121°C, durante 20 minutos. Solução-tampão de fosfato (pH=3) – Pese 9,7 g de fosfato de potássio monobásico e transira para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 50 mL de solução de ácido fosfórico a 1% e complete o volume com água. Solução-padrão estoque de vitamina B12 – Pese 100 mg de vitamina B12, previamente dessecada. Transira para um balão volumétrico de 100 mL. Ajuste o volume com a soluçãotampão de fosfato. Dilua esta solução adequadamente de tal modo que a concentração da vitamina seja aproximadamente 50 μg/mL. Determine a concentração de vitamina B12 por meio da leitura da absorbância a 361 nm, utilizando a relação: 1 μg/mL de vitamina B12 = Absorbância 0,0207 664 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Microorganismos: Escherichia coli 313-3, Mutantie ou 113 ATCC Meio para manutenção do germe – Pese 5 g de agar, 1,5 g de peptona, 0,375 g de extrato de carne, 0,75 g de extrato de levedura, 1 g de hidrolizado de caseína, 0,25 g de glicose e adicione 250 mL de água. Aqueça a mistura até a dissolução e iltre. Distribua em tubos de ensaio e autoclave a 121°C, por 15 minutos. Deixe solidiicar com os tubos inclinados. Meio para doseamento – Pese 6 g de glicose, 15 g de agar e adicione 1000 mL de água. Aqueça a mistura até dissolução. Distribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121ºC, durante 15 minutos. Procedimento – Prepare duas soluções da amostra de tal modo que a mais concentrada tenha no máximo 1 μg/mL e a menos concentrada, no mínimo, 0,5 μg/mL de vitamina B12. Utilize a solução-tampão de fosfato como diluente. Repique o microrganismo assepticamente nos tubos contendo o meio de manutenção do germe. Incube por 24 horas a 37°C. Lave o tubo onde houve crescimento intenso de microrganismos com 5 mL de água estéril para obter uma suspensão do germe que apresente leitura espectrofotométrica de 10% de transmitância no comprimento de onda 650 nm. Auxilie a retirada do germe com alça de níquel-cromo até descolamento total das colônias. Funda o meio de doseamento e adicione a solução salina na proporção de 1:3 de meio. Esfrie este meio até a temperatura de (48-50)°C e inocule com a suspensão do germe. Para cada 100 mL de meio preparado, inocule 2 mL de suspensão. Homogeneíze bem e distribua em placas de Petri estéreis (10 a 15 mL por placa). Deixe solidiicar. Prepare duas soluções-padrão de vitamina B12 a partir da solução-padrão estoque de vitamina B12 de concentrações rigorosamente determinadas, semelhantes às concentrações das amostras. Com o auxílio de uma pinça anatômica reta, coloque quatro discos de papel para dosagem de antibiótico na placa preparada e marcada, sendo o primeiro disco na posição do eixo inferior, outro no eixo superior, um à direita e outro à esquerda. Com uma pinça anatômica reta, molhe o disco de papel na solução-padrão de concentração baixa (aproximadamente, 0,5 μg/ mL), eliminando o excesso de líquido com duas batidas rápidas sobre a borda do béquer com a solução. Coloque os discos em todas as placas, na posição inferior do eixo. Em seguida, faça o mesmo procedimento com a solução-padrão de concentração mais alta (aproximadamente 1 μg/mL) na posição superior do eixo. Em seguida, proceda de forma semelhante com a amostra de concentração mais baixa (aproximadamente 0,5 μg/mL). Repita o processo com as soluções das amostras nos discos à direita e à esquerda. Deixe em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente antes de incubar a 37°C, por 24 horas. Após o período de incubação, faça a leitura no aparelho medidor de halos. IAL - 665 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo Os cálculos devem ser efetuados, relacionando-se o tamanho dos halos formados nos discos para análise de antibióticos dos padrões com os halos dos discos das amostras e suas respectivas concentrações. Aa = média das leituras da amostra de maior concentração Pa = média das leituras do padrão de maior concentração Ab = média das leituras da amostra de menor concentração Pb = média das leituras do padrão de menor concentração Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed. 1985. p. 401-404. 362/IV Determinação de vitamina B2 em alimentos A Ribolavina ou vitamina B2 é um pigmento amarelo-esverdeado amplamente distribuído nas células vegetais e animais. Este método é aplicado para cereais e alimentos enriquecidos. A ribolavina apresenta luorescência amarelo-esverdeada sob luz ultravioleta. Num intervalo de pH 3-5, a luorescência depende exclusivamente da concentração de ribolavina. Esta vitamina, por ser de decomposição muito fácil à luz, não é usada como padrão. Usa-se uma solução de luoresceína que apresente maior estabilidade à luz e, dependendo da diluição, sua luorescência é semelhante à da vitamina B2, com um fator de correção. 666 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Material Espectrofotômetro de luorescência, banho-maria, balança analítica, papel de iltro qualitativo, liqüidiicador ou blender, papel indicador de pH, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, béqueres de 25, 100, 200, 250 e 500 mL, provetas de 50, 100 e 200 mL, funil de vidro e pesa-iltro de 25 mL com tampa. Reagentes Ribolavina padrão Fluoresceína Ditionito de sódio Sílica gel com indicador de umidade Ácido acético glacial Solução de hidróxido de sódio a 30% m/v Solução de ácido sulfúrico 0,05 M Solução de ácido acético a 5% v/v Solução de acetato de sódio – Pese 34,5 g de acetato de sódio e dissolva em água. Transira para balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução de diastase – Para a análise de cada amostra, pese 0,3 g de diastase e complete com 5 mL da solução aquosa de acetato de sódio. Solução de Ribolavina (A) – Pese 25 mg de Vitamina B2, previamente seca em estufa 110°C durante 2 horas. Transira para um balão volumétrico de 1000 mL com ajuda de 750 mL de água, adicione 1,4 mL de ácido acético glacial, agite e coloque em banho-maria a 50°C até dissolução completa. Complete o volume com água. Guarde em geladeira. (1 mL desta solução contém 25 μg de vitamina B2 ). Solução-estoque de luoresceína (B) – Pese 50 mg de luoresceína, transira para um balão volumétrico de 1000 mL com ajuda de 250 mL de água. Adicione 2 mL de solução de hidróxido de sódio a 30%, caso a luoresceína não seja solúvel. Complete o volume com água. Guarde em geladeira. (1 mL dessa solução contém 50 μg de luoresceína). Solução de trabalho de luoresceína (C) – Faça diluições da solução (B) em um balão volumétrico e complete o volume com água, de modo a obter uma solução aproximadamente 0,15 μg de luoresceína por mL. Fator de correção da solução de trabalho de luoresceína – Determine o fator de correção da luoresceína, fazendo algumas diluições de vitamina B2 (solução A), da seguinte maIAL - 667 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital neira: pipete 4 mL da solução A e dilua até 100 mL com água. Pipete 10 mL desta nova solução para um balão volumétrico de 100 mL e complete com água (solução D). Um mL desta solução contém 0,1 μg de vitamina B2. Ajuste o zero do espectrofotômetro de luorescência usando água e o 100 do aparelho com solução de luoresceína de trabalho (C). Faça a leitura da solução da vitamina B2 (solução D), usando a luz de excitação de 440 nm e de emissão de 530 nm. Calcule o fator de correção usando a fórmula: L = leitura da ribolavina. Procedimento Produtos enriquecidos – Pese uma quantidade suiciente da amostra para obter, na solução inal, no máximo 0,1 μg de vitamina B2 por mL. Adicione 10 mL de solução de ácido acético a 5%, aqueça em banho-maria entre (40-50)°C durante 15 minutos. Esfrie e complete o volume com a solução de ácido acético a 5%. Determine a luorescência desta solução em espectrofotômetro de luorescência, usando luz de excitação de 430 nm e de emissão de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a solução de trabalho de luoresceína e o zero com água. Após a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sódio para a destruição da vitamina B2. Leia novamente no espectrofotômetro de luorescência. Considere como leitura da amostra (La), a diferença entre estas duas leituras. Alimentos naturais – Pese uma quantidade suiciente da amostra, tal que a solução inal tenha 0,1 μg de vitamina B2 por mL. Transira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 150 mL de ácido sulfúrico 0,05 M (para amostra de levedura, use água). Misture e deixe em banho-maria à temperatura de ebulição, durante 30 minutos, agitando de vez em quando. Deixe esfriar à temperatura ambiente e adicione 5 mL de suspensão de diastase preparada recentemente. Ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com solução de acetato de sódio e incube a (40–50)°C em banho-maria, durante duas horas. Retire e esfrie à temperatura ambiente, transira para balão de 100 ou 200 mL e complete o volume com ácido sulfúrico 0,05 M (para levedura, complete com água). Filtre em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Faça diluição com solução aquosa de ácido acético a 5% de tal modo que a solução inal tenha no máximo 0,1 μg de vitamina B2 por mL. Determine a luorescência desta solução em espectrofotômetro usando a luz de excitação 440 nm e emissão de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a solução de trabalho de luoresceína e o zero com água. Após a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sódio, 668 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas para a destruição da vitamina B2. Leia novamente no espectrofotômetro de luorescência. Considere como leitura da amostra (La), a diferença entre estas duas leituras. Nota: a vitamina B2 é sensível à luz, evite claridade durante a análise. Cálculo La = leitura da amostra F = fator da luoresceína A = diluição da amostra M = massa ou volume da mostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v1, Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo., 1985. p. 357-385. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1053-1054 (method 924.29). LA ASSOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE VITAMINAS, INC. Métodos de Análisis de Vitaminas. Tradução de M.ª Soledad G. Chamarro y Cláudio Fernández Heredia. 3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 137-157. Titulo original: Methods of Vitamin Assay. STROHECKER, R; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p. 68-122. Título Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden. 363/IV Determinação de vitamina B6 em matéria-prima A Vitamina B6 é encontrada em grande número de alimentos de origem animal e vegetal. Na maioria das vezes, está associada às proteínas e ao amido; raras vezes na forma livre. A vitamina B6 pode ser encontrada em três formas: piridoxina, piridoxal e piridoxamina. Os métodos de análise não são especíicos para nenhuma das formas e o resultado em conjunto é expresso como Vitamina B6. IAL - 669 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Balança analítica, pesa-iltro, frasco Erlenmeyer de 250 mL, funil de vidro, proveta graduada de 50 mL, pipeta volumétrica de 5 mL, banho-maria, bureta de 25 mL, dessecador e bastão de vidro. Reagentes Ácido perclórico 0,1 M Solução de acetato de mercúrio 6% m/v Ácido acético glacial Violeta cristal Sílica gel com indicador de umidade Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,4 g da amostra da matéria prima e transira quantitativamente para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Dissolva com 40 mL de ácido acético e 5 mL de acetato de mercúrio a 6% em ácido acético. Se necessário, aqueça em banho-maria até completar a dissolução. Resfrie e titule com ácido perclórico 0,1 M, usando como indicador violeta cristal. Faça um branco com procedimento idêntico ao exposto, mas sem a amostra. Cálculo Calcule o teor em porcentagem de vitamina B6 na matéria prima analisada, considerando que cada mL de HClO4 gasto na titulação equivale a 20,56 mg de vitamina B6 (C8H11NO3. HCl). Nota: nas matérias primas, o teor de vitamina B6 deverá ser no mínimo 98% e no máximo 100,5%, após dessecação em estufa a vácuo com sílica gel indicadora de umidade. Referência bibliográfica FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editora S.A., 1977. p. 323. 364/IV Determinação de vitamina C com iodato de potássio Este método é aplicado para a determinação de vitamina C ou ácido L-ascórbico, em alimentos in natura ou enriquecidos, quando a quantidade da referida vitamina for maior que 5 mg e baseia-se na oxidação do ácido ascórbico pelo iodato de potássio. 670 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Tabela de Conversão 1,0 g de ácido ascórbico 1,214 g de ascorbato de sódio 1,0 g de ascorbato de sódio 0,889 g de ácido ascórbico 1,0 UI (Unidade Internacional) 0,05 mg de ácido ascórbico Material Papel de iltro qualitativo, dessecador, estufa, balança analítica, béqueres de 50 e 250 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, pipetas graduadas de 1 e 10 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, buretas de 10 e 25 mL, balões volumétricos de 100 e 1000 mL, funil de vidro, bastão de vidro e proveta de 50 mL. Reagentes Solução de ácido sulfúrico a 20% v/v Solução de iodeto de potássio a 10%, m/v Solução de amido a 1%, m/v Solução de iodato de potássio 0,02 M – Seque 5 g de iodato de potássio em estufa a 110oC e esfrie. Pese 3,5668 g, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete com água (1 mL iodato de potássio 0,02 M = 8,806 mg de ácido ascórbico). Solução-padrão de iodato de potássio 0,002 M – Pipete 10 mL da solução de iodato de potássio 0,02 M e dilua até 100 mL com água em balão volumétrico (1 mL de iodato de potássio 0,002 M equivale a 0,8806 mg de ácido ascórbico). Procedimento – Homogeneíze a amostra e pese uma quantidade que contenha ao redor de 5 mg de ácido ascórbico. Transira para um frasco Erlenmeyer de 300 mL com auxilio de aproximadamente 50 mL de água. Adicione 10 mL de solução de ácido sulfúrico a 20%. Homogeneíze e, se necessário, iltre para outro frasco Erlenmeyer, lavando o iltro com água e logo após com 10 mL da solução de ácido sulfúrico a 20%. Adicione 1 mL da solução de iodeto de potássio a 10% e 1 mL da solução de amido a 1%. Titule com solução de iodato de potássio até coloração azul. Dependendo da quantidade de vitamina C contida na amostra, utilize solução de iodato de potássio 0,02 M ou 0,002 M. Analise sempre a amostra em duplicata e faça uma prova em branco. Cálculo V = volume de iodato gasto na titulação IAL - 671 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital F = 8,806 ou 0,8806, respectivamente para KIO3 0,02 M ou 0,002 M P = n° de g ou mL da amostra Referências bibliográficas FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editora S.A., 1977. p. 82-83. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1 Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 393. 365/IV Determinação de vitamina C pelo método de Tillmans Este método é usado para amostras com baixo teor de vitamina C, por exemplo, sucos de frutas. Baseia-se na redução do corante sal sódico de 2,6-diclorofenol indofenol por uma solução ácida de vitamina C. Material Microbureta, dessecador, balança analítica, papel de iltro, pipetas volumétricas de 1, 4 e 10 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, provetas de 50,100, 200 e 500 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, balões volumétricos de 100 e 200 mL, funil de vidro e bastão de vidro. Reagentes Ácido ascórbico Sal sódico do 2,6-diclorofenol indofenol Solução índigo carmim a 0,5% Solução ácida – Dissolva 15 g de ácido metafosfórico em 40 mL de ácido acético. Adicione 450 mL de água, agite e iltre. Solução-padrão de vitamina C – Pese 100 mg de vitamina C, previamente dessecada, dissolva em 100 mL de solução ácida em balão volumétrico. Dilua 10 vezes com a mesma solução ácida. Solução de Tillmans – Dissolva 42 mg de bicarbonato de sódio em 50 mL de água. Adicione 50 mg de 2,6-diclorofenol indofenol. Agite até a dissolução do corante. Dilua até 200 mL com água em balão volumétrico e iltre. Padronização da solução de Tillmans – Em um frasco Erlenmeyer de 250 mL, pipete 4 mL da solução diluída da vitamina C e 6 mL da solução ácida. Adicione 50 mL de água e 672 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas titule com solução de Tillmans até obter uma coloração ligeiramente rosada e estável por 15 segundos. Faça um branco, substituindo a solução de vitamina C por solução ácida e desconte no cálculo do fator. Calcule o fator (F) da solução de Tillmans conforme a relação: Nota: armazene a solução de Tillmans em frasco escuro e na geladeira. Toda vez que usar, padronize com solução recém-preparada de vitamina C. Procedimento Polpas e Sucos de Frutas – Esprema a polpa da fruta e iltre através de tecido ino, limpo e seco ou em papel de iltro. Utilize, no mínimo, 10 mL do iltrado e adicione igual volume de solução ácida. Agite, iltre e titule uma alíquota de 10 mL do iltrado conforme descrito na padronização da solução de Tillmans. Faça um branco constituído de 10 mL da solução ácida e com volume de água igual ao da solução do corante gasto na titulação da amostra e titule. Os íons Fe2+, Sn 2+ e Cu2+ presentes na amostra a ser analisada, interferem neste método. Nestes casos, previamente à determinação da vitamina C veriique a presença dos interferentes, procedendo como descrito: adicione duas gotas da solução de azul de metileno 0,05% a 10 mL da mistura 1:1 constituída da amostra de suco e do reagente ácido. O desaparecimento da cor do azul de metileno em 5 a 10 segundos indica a presença das substâncias interferentes. Pode-se também veriicar a presença dos íons interferentes, adicionando-se a 10 mL da amostra o mesmo volume da solução de HCl (1+3) e cinco gotas de índigo carmim a 0,05%. O desaparecimento da cor em 5-10 segundos indica a presença de substâncias redutoras. Cálculo V = volume da solução de Tillmans gasto na titulação F = fator da solução de Tillmans A = mL da amostra utilizada IAL - 673 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Métodos Químicos e Físicos para Análises de Alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 394-395. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1058-1059 (method 967.21). 366/IV Determinação espectrofotométrica de vitamina C por redução de íons cúpricos Este método é aplicável para a quantiicação de ácido ascórbico (vitamina C), em baixas concentrações em alimentos pigmentados, naturais e industrializados. Material Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de 1 cm de espessura, liqüidiicador, agitador mecânico, balança analítica, béqueres de 50 e 100 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, provetas de 50 e 100 mL, balões volumétricos de 50 e 100 mL, funil de vidro, provetas de 25 e 50 mL com tampa, frasco Erlenmeyer de 250 mL com tampa e frasco Erlenmeyer de 25 mL. Reagentes Acetato de sódio 2,2’-Biquinoleína (cuproína) Tolueno Álcool isoamílico Ácido sulfúrico Ácido ascórbico padrão Uréia Clorofórmio Álcool Acetato de cobre (II) mono-hidratado Solução de ácido metafosfórico a 5% m/v Solução A (Branco) – Pipete 2 mL da solução de ácido metafosfórico a 5%, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. 674 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Solução-tampão de acetato de sódio e ácido acético 1 M, pH = 4,6 com 1,5% de uréia – Pese 13,6 g de acetato de sódio (no caso de se usar o acetato de sódio anidro, pese 8,2 g) e dissolva em 100 mL de água (solução I). Meça 6 mL de ácido acético, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água (solução II). Misture as soluções I e II, adicione 3 g de uréia e meça o pH. Solução 2,2’-biquinoleína (cuproína) a 0,4% em tolueno m/v. Solução de acetato de cobre (II) a 0,075% em álcool isoamílico m/v Reagente de complexação (Solução C) – Transira 95 mL da solução de acetato de cobre II 0,075% em álcool isoamílico para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com 5 mL de solução de cuproína 0,4% em tolueno. Esta solução deverá ser recém-preparada. Solução de ácido sulfúrico 0,05 M. Solução-padrão I de ácido ascórbico a 1 mg/mL – Pese 0,1 g de ácido ascórbico padrão e dissolva em um balão de 100 mL com água. Solução-padrão II a 20 μg/mL – Transira 2 mL da solução de ácido ascórbico de concentração de 1 mg/mL (Padrão I) para um balão volumétrico de 100 mL e adicione 2 mL da solução de ácido metafosfórico a 5% e complete o volume com água. Nota: proteja as soluções de ácido ascórbico da luz. Procedimentos Amostras líquidas – Pese 50 g da amostra, transira para um liqüidiicador e adicione 100 mL da solução de ácido metafosfórico a 5%. Agite, na velocidade máxima durante 1 a 3 minutos. Dependendo da concentração de vitamina C na amostra, transira 5 a 20 g do extrato para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Agite e retire uma alíquota de 30 mL da solução e descarte. Adicione ao balão 5 mL de clorofórmio e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem. Amostras sólidas – Pese de uma a quatro gramas da amostra e transira para um frasco Erlenmeyer juntamente com 10 mL da solução de ácido metafosfórico a 5% e 10 mL de ácido sulfúrico 0,05 M. Agite, em agitador mecânico, por 30 minutos. Transira 10 g do homogeneizado para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com água. Agite e retire 10 mL da solução e descarte. Adicione 5 mL de clorofórmio ao balão e agite durante 1 minuto. Deixe em repouso para que as camadas se separem. Pipete 5 mL da camada aquosa límpida para os tubos de reação (provetas de 25 mL com tampa). Adicione 1 mL da solução-tampão e 5 mL da solução complexante. Agite fortemente durante 90 IAL - 675 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital segundos e deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (álcool isoamílico) e transira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de álcool e agite levemente. Prepare um branco, pipetando 5 mL da solução A diretamente no tubo de reação e prossiga como o tratamento da amostra. Leia as absorbâncias das amostras a 545 nm, usando o branco como referência. Nota: todos os solventes utilizados na preparação das soluções devem ser de alto grau de pureza, pois os contaminantes de caráter redutor interferem na reação. Curva-padrão – Pipete, diretamente, nos tubos de reação (ou provetas de 25 mL com tampa), alíquotas de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 mL da solução-padrão II correspondente, respectivamente, a 10, 20, 30, 40 e 50 μg de ácido ascórbico e complete até 5 mL com a solução A. Adicione 1 mL da solução-tampão e 5 mL da solução complexante. Agite fortemente durante 90 segundos. Deixe as camadas se separarem. Retire 3 mL da parte superior (álcool isoamílico) e transira para um frasco Erlenmeyer de 25 mL. Adicione 0,5 mL de álcool. Agite suavemente. Repita o mesmo procedimento com o branco constituído de 5 mL da solução A e sem a adição dos padrões. Faça a leitura das absorbâncias a 545 nm, usando o branco como referência. Construa a curva-padrão. Cálculo A = μg de vitamina C determinada na curva-padrão B = gramas de amostra contida nos 5 mL do tubo de reação Referências bibliográficas BADOLATO, M.I.C.B.; SABINO, M; LAMARDO, L.C.A.; ANTUNES, J.L.F. Estudo comparativo de métodos analíticos para determinação de ácido ascórbico em sucos de frutas naturais e industrializados.Ciênc.Tecnol. Aliment.,Campinas, v. 16. n. 3, p. 206-210, 1996. CONTRERAS-GUZMÁN, E.; STRONG III,F.C.; GUERNELLI, O. Determinação de ácido ascórbico (vitamina C), por redução de ions cúpricos. Química Nova, v. 7, n. 2, p. 60-64, 1984. 676 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas 367/IV Determinação de vitamina E (tocoferóis totais) A vitamina E é essencialmente uma vitamina lipossolúvel e age como antioxidante na estabilização de lipídios insaturados. Esta vitamina inclui oito compostos que ocorrem naturalmente e estão distribuídos em duas classes designadas como tocoferóis e tocotrienóis com diferentes atividades biológicas. O d-α-tocoferol (5,7,8-trimetiltocol) apresenta a maior atividade biológica e é a forma mais disponível de vitamina E em alimentos. As melhores fontes de vitamina E são os óleos de sementes vegetais, tais como: soja, milho, girassol, nozes, grãos integrais e o gérmen de trigo. Muitos alimentos são adicionados de vitamina E, por exemplo, margarinas, molhos para salada, entre outros. Nos alimentos naturais, este método determina tocoferóis totais e nos enriquecidos, o α-tocoferol. Baseia-se na redução de íons ferro (III) e posterior quelação do ferro (II) com α-α′-dipiridila para determinação de tocoferóis e tocotrienóis. Alguns cuidados devem ser tomados nesta análise, tais como: usar solventes puros e sem contaminação com oxidantes e redutores, observar rigorosamente o tempo de reação e evitar a exposição à luz. Previamente à reação colorimétrica, a amostra deve ser saponiicada para eliminar os lipídios presentes, liberar os tocoferóis e hidrolisar os ésteres de tocoferóis. Material Espectrofotômetro UV/VIS ou colorímetro (400 a 600 nm) e respectivos tubos, cubetas de vidro (se usar espectrofotômetro), placa aquecedora com agitadores magnéticos, balança analítica, cronômetro, cilindro de nitrogênio, balão de 250 mL com boca esmerilhada adaptável a um refrigerante de reluxo, condensador de reluxo, funis de separação âmbar de 250 e 500 mL, funis de vidro com 5 cm de diâmetro, balões volumétricos âmbar de 25, 50 ou 100 mL, provetas de 50 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, bastões de vidro e papel de iltro Whatman nº 4. Reagentes Álcool, isento de substâncias oxidantes Éter de petróleo (30-60)°C Solução alcoólica de cloreto de ferro III a 0,25% m/v (recém-preparada) Solução alcoólica de α-α‘-dipiridila a 0,6% m/v Solução de EDTA a 0,35% m/v Solução de fenolftaleína Ácido pirogálico Hidróxido de potássio em lentilhas Sulfato de sódio anidro dl-α-Tocoferol Álcool absoluto IAL - 677 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão de dl-α-tocoferol – Pese 100 mg de dl-α-tocoferol, transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com álcool absoluto. Retire uma alíquota e dilua em álcool absoluto para se obter uma concentração de 80 μg/ mL. Conserve esta solução sob refrigeração a 5°C. Determine a absorbância a 292 nm (máxima absorção) e calcule a concentração de vitamina E com a fórmula: A = Absorbância P = massa em gramas da amostra em 100 mL de etanol Solução alcoólica de cloreto de ferro III 0,25% m/v Solução alcoólica de α-α′dipiridila 0,6% m/v. Armazene esta solução em frasco âmbar ou opaco, a 5°C. Procedimentos Alimentos sólidos, rações e premix devem ser homogeneizados e armazenados em local com baixa umidade e sob a proteção da luz. A amostras líquidas devem ser conservadas sob refrigeração à temperatura menor que 8°C, em frasco hermético. Antes de iniciar a análise, deixe estabilizar à temperatura ambiente. As gorduras necessitam de aquecimento prévio e homogeneização, antes da retirada da amostra para análise. Saponificação da amostra – Pese diretamente em um balão de 250 mL com boca esmerilhada, uma quantidade de amostra que contenha de 1 a 10 mg de vitamina E. Adicione 50 mL de álcool e 100 mg de ácido pirogálico. Aqueça com reluxo em placa aquecedora, sob agitação, por 20 minutos. Após 1 minuto de aquecimento, adicione, pelo condensador, 1 g de pastilhas de hidróxido de potássio (uma pastilha por vez). Depois de 20 minutos de reluxo, esfrie em banho de gelo e lave o aparelho de reluxo com pequenas quantidades de água. Transira a amostra saponiicada quantitativamente para um funil de separação âmbar de 250 mL e extraia a vitamina E com duas porções consecutivas de 30 e 20 mL ou três de 40, 30 e 20 mL. Transira quantitativamente com água, os extratos etéreos para um funil de separação de cor âmbar de 500 mL. Lave os extratos etéreos com alíquotas de 50 mL de água, agitando suavemente, até que a fase aquosa não apresente mais coloração rósea pela adição de algumas gotas de solução alcoólica de fenolftaleína. Filtre, em funil contendo sulfato de sódio anidro, para balão volumétrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com éter de petróleo. Evapore até a secura, sob nitrogênio, o solvente 678 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas de um volume do extrato etéreo que contenha entre 10 e 100 μg de vitamina E. Dissolva o resíduo em 7 mL de álcool, ao abrigo da luz. Adicione 1 mL de α-α′-dipiridila e 1 mL de solução de cloreto de ferro III. Cronometre 2 minutos e 30 segundos e adicione 1 mL da solução de EDTA. Espere mais 2 minutos e 30 segundos e determine a absorbância a 520 nm. Acerte previamente o 100% de transmitância do aparelho com um branco preparado com os referidos reagentes e nas mesmas proporções. Determine a quantidade de vitamina E correspondente, usando a curva-padrão. Curva-padrão – Pipete, em tubos do colorímetro, volumes da solução-padrão de α-tocoferol que contenham em cada tubo, aproximadamente de 20-100 μg de α-tocoferol, em incrementos crescentes de 20 μg. Adicione a cada tubo 1 mL da solução alcoólica de α-α′dipiridila e uma quantidade de álcool tal que atinja o volume total da mistura de 7 mL. Proteja os tubos da luz e adicione em cada um deles 1 mL da solução de cloreto de ferro III. Espere 2 minutos e 30 segundos e leia a absorbância no colorímetro ou no espectrofotômetro, utilizando o comprimento de onda 520 nm. Acerte o 100% da transmitância do aparelho com o branco. Cálculo Determine a quantidade de vitamina E correspondente usando a curva-padrão estabelecida. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Métodos Químicos e Físicos para Análises de Alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 395-396. 368/IV Determinação de vitamina E em matéria-prima Material Espectrofotômetro UV/VIS, placa aquecedora com agitação, balança analítica, cilindro de nitrogênio, balão de 250 mL com boca esmerilhada adaptável a um refrigerante de reluxo, condensador de reluxo, funis de separação âmbar de 250 e 500 mL, funis de vidro com 5 cm de diâmetro, balões volumétricos âmbar de 25, 50 ou 100 mL, provetas de 50 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL e papel de iltro Whatman n° 1. Reagentes Álcool isento de substâncias oxidantes Éter de petróleo (30-60)°C IAL - 679 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Hidróxido de potássio em lentilhas Sulfato de sódio anidro Procedimento – Pese 0,1 g da amostra e saponiique conforme descrito no método 367/ IV. Extraia a vitamina com três porções consecutivas de 40, 30 e 30 mL de éter de petróleo. Lave os extratos com água até reação incolor pela adição de algumas gotas do indicador fenolftaleína. Filtre, em funil com papel de iltro contendo sulfato de sódio anidro, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com éter de petróleo. Tome uma alíquota e evapore o éter de petróleo sob nitrogênio. Dissolva o resíduo em álcool e transira quantitativamente para um balão volumétrico e complete o volume com o mesmo solvente. Determine a absorbância da amostra no comprimento de onda 292 ou 289 nm, conforme o máximo de absorção no espectro obtido. Cálculos Para absorbância máxima a 292 nm: Para absorbância máxima a 289 nm: L = leitura da absorbância P = massa em gramas da amostra Referências bibliográficas BALL, G.M.F. Fat-soluble assays in food analysis. A Comprehensive Review. London: Elsevier Applied Science. 1988. 326 p. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1071-1074 (method 971.30). 369/IV Determinação de niacina e nicotinamida A niacina, também denominada de ácido nicotínico, vitamina PP ou vitamina B3, é uma das vitaminas importantes do complexo B para a nutrição humana e animal. A 680 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas niacina faz parte de duas coenzimas conhecidas, a coenzima I e a coenzima II, que são essenciais para um grande número de sistemas enzimáticos. A nicotinamida, amida do ácido nicotínico, também é biologicamente ativa. Essas vitaminas são encontradas em carnes, pescados, leveduras e cereais. Nos produtos naturais, a niacina está ligada a outros compostos químicos, havendo a necessidade de ser liberada por hidrólise química ou enzimática, antes da determinação analítica. Este método baseia-se na reação entre a niacina e o bromocianogênio (CNBr) , resultando um composto pirinídio que em contato com o ácido sulfanílico, forma um complexo amarelo com máximo de absorção em 450 ou 470 nm. Material Autoclave, chapa elétrica, espectrofotômetro ou colorímetro, balança analítica, frascos Erlenmeyer de 50 e 250 mL com tampa, pipetas de 1, 2, 5, 10 e 20 mL, balões volumétricos de 50, 100 e 200 mL, béqueres de 250 e 400 mL, bastão de vidro e almofariz com pistilo. Reagentes Ácido nicotínico padrão Hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4. 7 H2O) Diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) Cianeto de potássio Solução saturada de bromo Ácido sulfanílico Hidróxido de amônio Ácido clorídrico Ácido sulfúrico Álcool Hidróxido de sódio Hidróxido de cálcio Sulfato de amônio Solução de ácido sulfúrico 0,05 M Solução de cianeto de potássio a 5% m/v Solução-estoque de ácido nicotínico – Dissolva 50 mg de ácido nicotínico, padrão de referência, previamente seco e guardado no escuro em dessecador sobre pentóxido de fósforo, em álcool a 25% e dilua até 500 mL. Guarde em geladeira. 1 mL desta solução contém 100 μg de ácido nicotínico. IAL - 681 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-padrão I de ácido nicotínico a 10 μg /mL – Separe uma pequena porção da solução-estoque e deixe atingir a temperatura ambiente. Dilua 10 mL desta solução até 100 mL com água. Solução-padrão II de ácido nicotínico a 4 μg /mL – Transira uma pequena porção da solução-estoque e deixe atingir a temperatura ambiente. Dilua 2 mL desta solução até 50 mL com água. Solução de hidróxido de amônio diluída – Dilua 5 mL de NH4OH a 250 mL com água. Solução de ácido clorídrico diluído – Dilua 1 mL de ácido clorídrico em 5 mL de água. Solução-tampão de fosfato (pH = 8) – Dissolva 60 g de hidrogenofosfato de sódio e 10 g de diidrogenofosfato de potássio em água morna e dilua até 200 mL. Solução saturada de bromo – Misture, em capela química, 25 g de bromo com 284 mL de água fria. Agite e use no dia seguinte. Guarde a solução na geladeira. Solução de bromocianogênio a 10% – Coloque aproximadamente 30 mL da solução saturada de bromo em um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Junte, gota a gota, com uma bureta, solução de cianeto de potássio a 5% até desaparecimento da cor amarela. Prepare esta solução em capela química. Notas Alternativamente, aqueça 370 mL de água a 40°C e adicione 40 g de bromocianogênio (disponível comercialmente). Agite até dissolver, esfrie e dilua a 400 mL. Guarde em refrigerador com a informação sobre a toxicidade deste reagente. O cianeto de potássio e o bromocianogênio são reagentes extremamente tóxicos; trabalhe na capela, com luvas e máscara. Solução de ácido sulfanílico a 10% – Adicione hidróxido de amônio em porções de 1 mL a uma mistura de 20 g de ácido sulfanílico e 170 mL de água, até que o ácido sulfanílico se dissolva. Ajuste o pH a 4,5 com ácido clorídrico 1+5, usando papel indicador universal de pH. Dilua a 200 mL com água. A solução deverá icar quase incolor. Use esta solução em preparações farmacêuticas, rações e alimentos não cereais. Solução de ácido sulfanílico a 55% – Adicione 27 mL de água e 27 mL de amônia a 55 g de ácido sulfanílico. Agite até dissolução, amornando se necessário. Ajuste o pH a 7 com 682 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas algumas gotas de amônia ou de ácido clorídrico 5 M, usando papel indicador universal e dilua até 100 mL. Guarde no escuro. Use esta solução em produtos cereais (trigo, milho, arroz, aveia). Procedimento – Ajuste o colorímetro/espectrofotômetro para 100% de transmitância e/ ou zero de absorbância a 450 nm para preparados farmacêuticos, rações e alimentos não cereais ou 470 nm para produtos cereais, usando um branco preparado simultaneamente com os reagentes nas mesmas proporções das amostras. Rações e alimentos não cereais – Pese ao redor de 28,35 g da amostra em frasco Erlenmeyer, adicione 200 mL de ácido sulfúrico 0,05 M. Misture e aqueça durante 30 minutos, em autoclave a 15 libras de pressão. Esfrie, ajuste o pH a 4,5 com hidróxido de sódio 10 M, usando como indicador verde de bromocresol, dilua até 250 mL com água e iltre. Pese 17 g de sulfato de amônio e transira para um balão volumétrico de 50 mL, pipete uma alíquota de 40 mL da solução da amostra, dilua até a marca com água e agite vigorosamente. Filtre, misture bem e use uma alíquota de 1 mL para desenvolvimento da cor. Em caso de amostras contendo 16 mg de ácido nicotínico por 454 g, a solução inal contém 3,2 μg de ácido nicotínico por mL. Pipete uma alíquota de 40 mL da soluçãopadrão II de ácido nicotínico (4 μg/mL) sobre 17 g de sulfato de amônio em um balão volumétrico de 50 mL e dilua com água. Este padrão contém 3,2 μg/mL. Proceda a reação como para alimentos não cereais e rações. Produtos cereais (aveia, milho, trigo, arroz) – Faça um branco dos reagentes e cinco diluições da solução-padrão I como descrito a seguir: coloque 1,5 g de hidróxido de cálcio em seis frascos Erlenmeyer de 250 mL, pipete respectivamente, 0, 5, 10, 15, 20 e 25 mL da solução padrão I (10 μg/mL). Pese, cuidadosamente cerca de 2,5 g da amostra contendo aproximadamente 100 μg de ácido nicotínico e transira para outro frasco contendo 1,5 g de hidróxido de cálcio. Adicione água em todos os frascos em torno de 90 mL, autoclave durante 2 horas sob pressão de 15 libras. Misture bem enquanto ainda quente. Esfrie, transira para balões volumétricos de 100 mL e dilua. Se necessário, guarde em geladeira por alguns dias. Transira aproximadamente 50 mL do sobrenadante de cada balão para tubos de centrífuga, coloque em banho de gelo por 15 minutos ou em geladeira por 2 horas. Centrifugue durante 15 minutos e pipete 20 mL do sobrenadante de cada tubo para tubos de centrífuga contendo 8 g de sulfato de amônio e 2 mL de solução-tampão de fosfato. Agite para dissolver e aqueça a (55-60)°C. Centrifugue por mais cinco minutos. Filtre em papel de iltro qualitativo, reiltrando, se necessário, até obter solução incolor. Proceda a reação como o descrito para produtos cereais. IAL - 683 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento analítico para alimentos não cereais e rações – Adicione à solução de ácido sulfanílico, solução de bromocianogênio, em capela, com buretas ou pipetas automáticas. O cianeto de potássio e o bromocianogênio são reagentes extremamente tóxicos. Trabalhe na capela, com luvas e máscara. Use a solução-padrão II de ácido nicotínico (4 μg/mL) e prepare os tubos como segue: Branco do padrão Solução-padrão 1,0 mL da solução-padrão 1,0 mL da solução-padrão 5,0 mL de água 5,0 mL de bromocianogênio 0,5 mL de hidr. de amônio diluído 0,5 mL de hidr. de amônio diluído 2,0 mL de ácido sulfanílico a 10% 2,0 mL de ácido sulfanílico a 10% 0,5 mL de ac. clorídrico diluído 0,5 mL de água Branco da amostra Solução da amostra 1,0 mL da solução da amostra 1,0 mL da solução da amostra 5,0 mL de água 5,0 mL de bromocianogênio 0,5 mL de hidr. de amônio diluído 0,5 mL de hidr. de amônio diluído 2,0 mL de ácido sulfanílico a 10% 2,0 mL de ácido sulfanílico a 10% 0,5 mL de ac. clorídrico diluído 0,5 mL água Prepare, separadamente, um branco para cada amostra. Pipete a solução-padrão e a solução da amostra para os respectivos tubos (no caso do branco do padrão ou do branco da amostra, adicione água). Adicione todas as soluções subseqüentes num só tubo e faça a leitura da cor antes de passar para o outro tubo, começando com o branco padrão e a solução-padrão; agite o tubo no vortex para homogeneizar o líquido, adicione ácido sulfanílico e agite novamente. Imediatamente adicione 0,5 mL de ácido clorídrico diluído e misture. Coloque no colorímetro e, com o branco, ajuste o zero de absorção do aparelho, usando o comprimento de onda 450 nm, dentro de aproximadamente 30 segundos após a adição da solução de ácido sulfanílico. Leia imediatamente a absorbância da soluçãopadrão no comprimento de onda de 450 nm (a cor alcança o máximo de intensidade em 1 minuto e, após a adição do ácido sulfanílico, permanece no máximo por 2 minutos). A seguir, leia a absorbância de cada amostra com o respectivo branco, usando este para ixar o zero de absorção do aparelho. A concentração de ácido nicotínico é proporcional à absorção, se o padrão e a solução da amostra tiverem aproximadamente a mesma concentração. 684 - IAL Capítulo XIX - Vitaminas Procedimento analítico para cereais – Selecione um tubo adicional para o branco do padrão, para cada série de determinações, mas não adicione bromocianogênio. Prepare os tubos da seguinte maneira: Branco dos reagentes 5 mL de água (em tubos em pé no banho de gelo) 10 mL de bromocianogênio e vedando o tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de ácido sulfanílico a 55% Branco do padrão 5 mL de solução-padrão 10 mL de água Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de ácido sulfanílico a 55% Branco da amostra 5 mL de solução da amostra 10 mL de água Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de ácido sulfanílico a 55% Solução-padrão Solução da amostra 5 mL de padrão 10 mL de bromocianogênio e vedando tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de ácido sulfanílico a 55% 5 mL de solução da amostra 10 mL de bromocianogênio e vedando tubo Aguarde 30 min. em banho de gelo 1 mL de ácido sulfanílico a 55% Com o comprimento de onda a 470 nm, ixe a 100% de transmitância, com o branco dos padrões e leia a transmitância dos outros tubos, de 12 a 15 minutos após a adição do ácido sulfanílico. Lance em gráico a absorção dos padrões, menos a do branco dos reagentes, contra a concentração do ácido nicotínico, em μg/mL. Neste gráico, determine a concentração correspondente à absorbância da amostra, tendo esta leitura sido feita após a ixação dos 100% de transmitância do aparelho com o branco da amostra. IAL - 685 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz: v. 1, Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 397-401. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1054-1057 (method 961.14). STROHECKER, R.; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p. 189-201. Título Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden. Colaboradores Myrna Sabino, Leda C. A. Lamardo, Everaldo de Cerqueira, Sandra A. Navas e Emiko I. Inomata 686 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas CAPÍTULO XX RESÍDUOS DE PESTICIDAS IAL - 687 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 688 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas XX RESÍDUOS DE PESTICIDAS esticidas ou agrotóxicos e ains são deinidos no Decreto nº 4074, de 04 de janeiro de 2002, do Ministério da Agricultura como: produtos e agentes de processos físicos, químicos e biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneiciamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de lorestas, nativas ou plantadas e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja inalidade seja alterar a composição da lora ou da fauna, a im de preservá-la da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento. Podem ser classiicados quanto à sua ação como inseticidas, fungicidas, herbicidas, raticidas, acaricidas e outros e quanto ao grupo químico a que pertencem como organoclorados, organofosforados, carbamatos, ditiocarbamatos, piretróides e outros. P Cronologicamente, segundo seu aparecimento e desenvolvimento, os pesticidas podem ser classiicados de acordo com uma sucessão de gerações, sendo que na primeira geração temos os inorgânicos, orgânicos vegetais, minerais e na segunda geração, os orgânicos sintéticos: organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretróides. Na terceira geração, temos os microbianos e os feromônios sexuais, na quarta, temos os hormônios juvenis e na quinta, os anti-hormônios vegetais e microrganismos. Do ponto de vista toxicológico, os pesticidas podem ser classiicados em extremamente, altamente, moderadamente ou pouco tóxicos, de acordo com a dose letal (DL50) oral e dérmica para ratos e outros indicadores relacionados a danos na córnea, lesões na pele e concentração letal inalatória (CL50) para ratos, segundo a Portaria nº 3 do Ministério da Saúde, de 16 de janeiro de 1992. IAL - 689 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Durante o registro de pesticidas, são estabelecidos os limites máximos de resíduos, conhecidos como LMR. A resolução n° 165, de 29 de agosto de 2003, do Ministério da Saúde, contém os índices das monograias dos ingredientes ativos dos agrotóxicos com emprego autorizado, com os respectivos LMR para cada binômio pesticida/cultura. As atualizações são publicadas pela ANVISA/MS. O uso de pesticidas em lavouras cujos produtos são destinados ao consumo humano ou animal pode conduzir a resíduos após a colheita. Os alimentos ainda podem conter resíduos remanescentes de utilização durante o armazenamento e transporte. Por outro lado, os pesticidas podem se mover do local de aplicação e se transportar para outro lugar no meio ambiente e podem ser transferidos para a cadeia alimentar. A capacidade de um pesticida persistir por um certo período de tempo pode ser desejável e tem sido reconhecido como importante em algumas situações para o controle bem sucedido de pestes e doenças. Todavia, a presença de resíduos de pesticidas nos alimentos e no meio ambiente preocupa o consumidor e as autoridades competentes, já que pode oferecer riscos para a saúde humana e ambiental. A população rural corre risco de exposição aguda, se não forem tomados os devidos cuidados na aplicação dos produtos e o consumidor pode estar sob risco de exposição crônica a pesticidas se estiver ingerindo alimentos contendo resíduos de pesticidas acima dos LMR. Devido à possibilidade da presença de vários pesticidas ou seus metabólitos, ou outros componentes contaminantes sejam de origem sintética ou natural, torna-se impossível especiicar um único procedimento analítico que determine satisfatoriamente o resíduo de um pesticida particular em qualquer substrato. É necessário usar um procedimento validado para a situação ou adaptar e validar um procedimento aceitável para circunstâncias particulares envolvidas, tais como a natureza da amostra e do resíduo e as interferências a serem encontradas. Além disso, algum método de conirmação da identiicação do resíduo do pesticida é necessário como, a utilização de fase estacionária de diferente polaridade ou detector seletivo de massa. Os sistemas de análise de multi-detecção, baseados no uso da cromatograia a gás, cromatograia a líquido de alta eiciência com detectores especíicos, têm a grande vantagem de proporcionarem evidências de identidade e meios de medir um ou mais pesticidas de uma ampla gama de resíduos. O controle de resíduos de pesticidas em alimentos é necessário, tanto para a proteção direta do consumidor como em relação à aceitabilidade da mercadoria no comércio. Seus resultados podem ser usados para introduzir medidas corretivas de prevenção de risco à saúde. 690 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Devido ao grande número de métodos, apresentamos nesse capítulo os principais, incluindo os multi-resíduos. 370/IV Método multi-resíduo para determinação de pesticidas em frutas e vegetais As amostras são trituradas em blender e homogeneizadas e os pesticidas são extraídos com acetona e uma mistura de diclorometano e n-hexano. A determinação é feita por cromatograia a gás com detectores de captura de elétrons, fotométrico de chama ou de nitrogênio e fósforo e cromatograia a líquido de alta eiciência com detector ultravioleta ou luorescência ou CG/MS. A determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais está distribuída conforme a Tabela 1. Tabela 1 -- Distribuição de pesticidas para inalidade analítica (a) Aldrin Aletrina Azoxistrobina Bifentrina Bioaletrina Captana Clorotalonil Cilutrina Lambda-cialotrina Cipermetrina DDT total (op’DDT, pp’DDT, op’ DDE pp’DDE, op’DDD, pp’DDD) Deltametrina Dicofol Dieldrin Dodecacloro Endosulfam (alfa, beta e sulfato) Endrin Esfenvalerato Fenpropatrina Fenvalerato HCH total (alfa, beta, gama) (b) Acefato Azinfós-etílico Azinfós-metílico Carbofenotiona Clorfenvinfós Clorpirifós Clorpirifós-metilico Diazinona Diclorvos Dimetoato (c) Aldicarbe Carbaril Carbendazim Carbofurano Tiabendazol Disulfotona Etiona Etoprofós Etrinfós Fenamifós Fenitrotiona Fentiona Fentoato Folpete Forato Fosfamidona IAL - 691 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital (a) Heptacloro Heptacloro epóxido Hexaclorobenzeno Imazalil Iprodiona Permetrina Procimidona Procloraz Propargito Tetradifona Triluralina Vinclozolina (b) Malationa Metamidofós Metidationa Mevinfós Ometoato Parationa-etílica Parationa-metílica Pirimifós-etílico Pirimifós-metílico Profenofós Pirazofós Terbufós Triazofós Triclorfom (c) a) Cromatograia a gás com detector de captura de elétrons (ECD). b) Cromatograia a gás com detector fotométrico de chama (FPD) ou de nitrogênio e fósforo (NPD). c) Cromatograia a líquido de alta eiciência com detector UV ou luorescência. Material Cromatógrafo a gás com detectores: ECD, FPD ou NPD, cromatógrafo a líquido de alta eiciência com detector UV ou luorescência, capela de exaustão para solventes, centrífuga, rotavapor, blender, balança analítica, balança semi-analítica, estufa, refrigerador, freezer, bomba de vácuo, ultra-turrax, sistema de puriicação de água para CLAE, balões volumétricos de diferentes capacidades, balões de fundo chato de 125 e 300 mL com boca esmerilhada 24/40, frascos de nalgene, pipetas volumétricas de diferentes capacidades, pipetas graduadas de diferentes capacidades, pipetas Pasteur, funis de Büchner, kitassatos, funis analíticos, béqueres, provetas, tubos graduados com tampa de 10 mL, seringas hipodérmicas de vidro de 5 mL, frascos de vidro com tampa de 100 mL com tampa e batoque de teflon, tubos graduados com tampa e septo de teflon para injetor automático, coluna de extração em fase sólida (SPE-diol de 500 mg, 3 mL) e coluna de extração em fase sólida (SPE-silica amino propil de 500 mg, 3 mL). Reagentes Acetona grau resíduo Acetonitrila para CLAE 692 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Água puriicada para CLAE Diclorometano grau resíduo Dihidrogenofosfato de Potássio Ácido fosfórico Algodão tratado n-Hexano grau resíduo Álcool metílico para CLAE Hidróxido de sódio Isooctano Padrões analíticos de pesticidas de alta pureza com certiicado Tolueno grau resíduo Nota: faça, previamente, brancos de cada reagente para certiicar-se de que não possuem interferentes para a análise. Soluções-padrão estoque – Pese, com precisão, 0,01 g (ou conforme requerido pelo método), do padrão de pesticida em pesa-iltro ou béquer de 10 mL. Dissolva com uma pequena quantidade de isooctano (padrões de pesticidas item a e b da Tabela 1), acetonitrila (aldicarbe, carbofurano e carbaril) ou álcool metílico (carbendazim e tiabendazol). Transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com isooctano, acetonitrila ou álcool metílico, conforme a classe do princípio ativo preparado. Transira para frasco de vidro com tampa e batoque de telon. Todo frasco deve conter uma etiqueta com dados de procedência, identidade, concentração, estabilidade, data de preparação, prazo de validade, temperatura de armazenamento. Armazene em freezer. Esta é a solução a partir da qual serão preparadas as soluçõespadrão intermediárias. Soluções-padrão intermediárias – A partir da solução-padrão estoque, prepare misturas de padrões de pesticidas e pipete 0,1 mL, 0,2 mL ou a quantidade necessária para obter a concentração desejada de cada princípio ativo, para um balão volumétrico de 10 mL. Complete o volume com n-hexano (pesticidas do item a e b da Tabela 1) ou acetonitrila (aldicarbe, carbaril, carbofurano) ou álcool metílico (carbendazim e tiabendazol). Transira para um frasco, cole etiqueta e armazene em refrigerador. Soluções-padrão de trabalho – A partir das soluções intermediárias, pipete 0,1 mL e/ou a quantidade necessária para obter a concentração desejada, para um balão volumétrico de 10 mL. Adicione solvente apropriado e complete o volume. Transira para um frasco de armazenamento, cole etiqueta e guarde em congelador. Para os pesticidas dos itens a e b da Tabela 1, as diluições são feitas com n-hexano. Para aldicarbe, carbofurano, carbaril, carbendazim e tiabendazol, as diluições são feitas na fase móvel. A concentração deve ser adequada à faixa de linearidade do detector do cromatógrafo e metodologia utilizada. Prepare as soluções de trabalho em cinco níveis de concentração (1/2 LQ, 1 LQ, 2 LQ, 5 LQ, 10 LQ) para a construção da curvapadrão. IAL - 693 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Nota: Limite de quantiicação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantiicada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Diclorometano-n-hexano 1:1 (v:v) – Transira 500 mL de diclorometano para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com n-hexano. Fase móvel para análise de resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril – Água puriicada para CLAE e acetonitrila 65:35 (v:v) – Transira 350 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água puriicada para CLAE. Fase móvel para análise de resíduos de carbendazim e tiabendazol (solução de KH2PO4 a 0,1% e álcool metílico 30:70) – Transira 300 mL da solução KH2PO4 a 0,1% para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com álcool metílico. Misture bem, homogeneíze em ultra-som e iltre em membrana de 0,45 μm Isoctano-tolueno 9:1(v/v) – Transira 90 mL de isoctano para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com tolueno. Solução KH2PO4 0,1% – Pese 1 g de KH2PO4 em béquer de 10 mL e dissolva com água puriicada para CLAE. Transira quantitativamente para um balão volumétrico de 1000 mL, lavando o béquer com pequenas quantidades de água puriicada para CLAE. Tratamento do algodão – Coloque, em frasco de Soxhlet, o algodão e extraia com 200 mL de n-hexano por pelo menos cinco horas. Coloque em béquer e seque em estufa. Armazene em frasco de vidro com tampa. Procedimentos A seleção das partes de um material vegetal que devem ser analisadas depende do objetivo da análise e da natureza de amostra. Deve-se amostrar o produto de acordo com as normas do Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission. Preparação da amostra Materiais moídos, grãos e pequenas frutas – Simples mistura. Frutas, legumes e outros produtos vegetais – A redução das amostras deve ser realizada por corte manual. Quarteie antes de misturar. Pique, triture, moa em liqüidiicador com copo de vidro ou aço inox. 694 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Verduras – Retire as folhas aleatoriamente. Porções selecionadas – Quarteie e misture a quantidade total das porções selecionadas a im de obter um material homogêneo. Coloque aproximadamente 1 kg em frasco de vidro com tampa de vidro ou com batoque de telon. Armazene em geladeira para análise imediata ou em freezer caso não seja realizada imediatamente. Extração – Pese 30 g da amostra em frasco de nalgene. Adicione 30 mL de acetona e agite no ultra-turrax por 30 segundos. Adicione 60 mL de uma mistura de diclorometano-n-hexano 1:1 (v/v) e agite novamente em ultra-turrax por 30 segundos. Centrifugue por 20 minutos ou iltre em funil de vidro com algodão tratado para uma proveta de 100 mL. Para analisar resíduos de pesticidas do item a da Tabela 1, prossiga a partir do extrato orgânico como indicado no item 1. Para analisar os resíduos de pesticidas do item b da Tabela 1 prosiga como indicado no item 2. Para analisar resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril prossiga como indicado no item 3. Para analisar resíduos de carbendazim e tiabendazol prossiga como indicado no item 4. 1. Resíduos dos pesticidas do item a – Pipete 0,2 mL do extrato orgânico para vial. Concentre até quase à secura, ressuspendendo em n-hexano, completando o volume a 1 mL. Injete 2 μL em cromatógrafo a gás. 2. Resíduos dos pesticidas do item b – Pipete 5 mL do extrato orgânico para um tubo graduado. Concentre até quase à secura e ressuspenda em isoctano-tolueno 9:1 (v/v), a 1 mL. Injete 2 μL em cromatógrafo a gás. 3. Resíduos de aldicarbe, carbofurano e carbaril – Do extrato, transira uma alíquota de 10 mL para um balão de 25 mL, concentre em rotavapor até quase à secura e ressuspenda em diclometano, completando o volume a 2 mL. Condicione uma coluna de extração em fase sólida (SPE– sílica aminopropil de 500 mg, 3 mL).Transira a amostra. Elua com 4 mL de diclorometano com 1% de álcool metílico em tubo de vidro. Concentre à secura e ressuspenda na fase móvel. Filtre em membrana de 0,45 μm através de uma seringa de vidro de 5 mL. Recolha em tubo de vidro com tampa. Transira para o vial e injete 40 μL em cromatógrafo a líquido de alta eiciência. 4. Resíduos de carbendazim e tiabendazol – Do extrato, transira uma alíquota de 10 mL para um balão de 25 mL e concentre em rotavapor até quase a secura e ressuspenda em álcool metílico, completando o volume a 2 mL. Condicione uma coluna de extração em fase sólida (SPE – diol de 500 mg, 3 mL) com 5 mL de álcool metílico. Transira a amostra. Lave com 2 mL de álcool metílico e descarte o eluato. Elua com 4 mL da solução de H3PO4 0,1 M/L e recolha em tubo de vidro. Adicione 100 μL de NaOH 1 M/L. Filtre em membrana de 0,45 μm através de uma seringa de vidro de 5 mL. Recolha em tubo de vidro com tampa. Transira para o vial e injete 40 μL em cromatógrafo a líquido de alta eiciência. IAL - 695 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize a análise em triplicata da testemunha e estudos de recuperações com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ. Condições cromatográficas Pesticidas do item a: cromatógrafo a gás, com ECD, equipado com workstation, coluna capilar, fase estacionária: 5% de fenil metil siloxano (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm de ilme), temperatura do detector: 320°C, temperatura do forno: 60°C (1 min), (60 - 220)°C (10°C/min), (220 - 280)°C (3°C/min.), 280°C (17 min) – tempo total: 60 min, luxo do gás de arraste: nitrogênio: 1 mL/min, temperatura do injetor: 240oC, modo de injeção: splitless. Pesticidas do item b: cromatógrafo a gás, com FPD, coluna megabore: fase estacionária: 5% de fenil metil siloxano (30 m x 0,53 mm x 2,65 μm de ilme), temperatura do detector: 280°C, temperatura do forno: (50 - 150)°C (30°C/min), (150 - 240)°C (10°C/min), luxo do gás de arraste: nitrogênio: 18 mL/min, luxo de hidrogênio: 75 mL/min, luxo de ar sintético: 100 mL/min, temperatura do injetor: 240oC, modo de injeção: splitless. Aldicarbe, carbofurano e carbaril: cromatógrafo a líquido de alta eiciência, detector de UV (λ : 195 nm-aldicarbe e carbofurano e 210 nm - carbaril), coluna: aço inox, 125 mm x 4 mm, fase estacionária; Spherisorb ODS-2,5 μm, fase móvel: água puriicada para CLAE-acetonitrila 65:35 v:v, luxo da fase móvel: 0,75 mL/min, temperatura: 30°C. Carbendazim e tiabendazol: cromatógrafo a líquido de alta eficiência, detector de UV (λ : 285 nm), coluna: aço inox, 125 mm x 4 mm, fase estacionária: Spherisorb ODS-2,5 μm, fase móvel: solução de KH 2PO 4 a 0,1% álcool metílico 30:70 v:v, fluxo da fase móvel: 0,60 mL/min, temperatura: 25°C. Curva-padrão – Injete as soluções de trabalho com no mínimo cinco diferentes concentrações por duas ou três vezes ou até que haja repetitibilidade dos cromatogramas. Construa a curva–padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Quantificação – A quantiicação dos pesticidas do item a é feita por cromatograia a gás com detector de captura de elétrons e a dos pesticidas do item b por cromatograia a gás com detector fotométrico de chama (FPD) ou detector de nitrogênio e fósforo. Aldicarbe, carbofurano, carbaril, carbendazim e tiabendazol são quantiicados por cromatograia a líquido de alta eiciência com detector ultravioleta ou de luorescência. A análise qualitativa é feita por padronização externa, por meio da comparação do tempo de retenção dos respectivos princípios ativos e a conirmação em coluna de diferente polaridade ou por detector seletivo de massa. 696 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Cálculo A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão, por comparação de área, levando em consideração o fator de diluição e a quantidade de amostra. O resultado deve ser expresso em miligrama do princípio ativo por quilograma da amostra (mg/Kg). Figura1 - Esquema do método multi-resíduo para determinação de resíduos de pesticidas em frutas e vegetais IAL - 697 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas ANALYTICAL METHODS FOR PESTICIDE RESIDUES IN FOODSTUFFS, 6th ed. Inspectorate for Health Protection, Ministry of Public Health, Welfare and Sports, he Hague/Rijswijk, he Netherlands, 1996 (Part 1 – Multiresidue methods) HIEMSTRA, M.; JOOSTEN J.A.; KOK, A. Fully automated Automated solid-phase extraction clean-up and on-line liquid chromatographic determination of benzimidazole fungicides in fruit and vegetables. J. A.O.A.C. Int., p. 78, 1267-1274,1995. KOK, A. AND ; HIEMSTRA, M. Optimization, automation, and validation of the solid-phase extraction clean-up and on-line liquid chromatographic determination of Nmethylcarbamate pesticides in fruits and vegetables. J. A.O.A.C. Int., 75, 1063-1074, 1992. JOINT FAO/WHO FOOD STANDARDS PROGRAMME CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. Portion of commodities to wich Codex Maximum Residue Limits apply and which is analyzed, v .2, Section 4, p. 391-404,1993. 371/IV Método multirresíduo para determinação de pesticidas e bifenilas policloradas em produtos gordurosos Este método aplica-se à determinação de resíduos dos pesticidas: lambdacialotrina, cipermetrina, DDT total (op’DDT, pp’DDT, pp’DDE, pp’DDD), dieldrin, deltametrina, endosulfam total (alfa, beta e sulfato de endosulfan), endrin, HCH total (alfa, beta e gama HCH), heptacloro, heptacloro epóxido, hexaclorobenzeno, mirex, bifenilas policloradas policloradas (PCBs congêneres: 28, 52, 101, 138, 153, 180) em produtos gordurosos como: leite, ovo, manteiga, carnes (frango, peixe), etc. Os pesticidas são extraídos com uma mistura de solventes, a puriicação é feita em uma única etapa em coluna de sílica gel e a determinação qualitativa e quantitativa é feita por cromatograia a gás com detector de captura de elétrons. Material Cromatógrafo a gás com detector de captura de elétrons, rotavapor, estufa, mula, aparelho de Soxhlet, balões volumétricos de diferentes capacidades, pipetas volumétricas, pipetas Pasteur, coluna cromatográica de vidro de 15 mm de diâmetro por 30 cm de altura, com reservatório de 300 mL e torneira de teflon, provetas de diferentes capacidades, balões de fundo chato de 300 mL com boca esmerilhada, tubos graduados de 10 mL, dessecador, frasco Erlenmeyer com tampa, almofariz com pistilo, vials de vidro com tampa e septos de telon para injetor automático. 698 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Reagentes n-Hexano grau resíduo Diclorometano grau residuo Sulfato de sódio anidro granulado grau resíduo Sílica Gel 60, 70-230 mesh Nota: faça previamente um branco de cada reagente para certiicar-se de que não possuem interferentes para a análise. Solução-padrão – Pese, com precisão, 0,010 g de cada padrão analítico em béquer, transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com isoctano. Transira para frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Todo frasco deve conter uma etiqueta com dados de procedência, identidade, concentração, estabilidade, data de preparação, prazo de validade e temperatura de armazenamento. Prepare soluções intermediárias com n-hexano. Faça diluições necessárias com n-hexano em cinco níveis (1/2 LQ, 1 LQ, 2 LQ, 5 LQ e 10 LQ) para construção da curva-padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Nota: Limite de quantiicação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantiicada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Diclorometano-n-hexano 1:4 (v/v) – Transira 200 mL de diclorometano para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Diclorometano-n-hexano 1:1 (v/v) – Transira 500 mL de diclorometano para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione n-hexano. Misture bem e complete o volume com n-hexano. Sílica gel ativada – Calcine quantidade suiciente de sílica gel a 450°C durante 4 horas. Deixe em dessecador até temperatura ambiente. Armazene em frasco de vidro com tampa e batoque de teflon. Ative a sílica gel calcinada por 5 horas a 135°C de dois em dois dias. Armazene em dessecador. Sílica gel desativada a 10% – Pese 13,5 g de sílica gel ativada em frasco Erlenmeyer com tampa. Adicione 1,5 g de água tratada e homogeneíze. Água tratada – Transira água para um funil de separação de 1000 mL e extraia três vezes com 60 mL da mistura diclorometano-n-hexano 1:1 v/v. Despreze a fase orgânica e armazene a água. Algodão tratado – Coloque, em frasco de Soxhlet, o algodão e extraia com 200 mL de n-hexano por pelo menos cinco horas. Coloque em béquer e seque em estufa. Armazene em frasco de vidro com tampa. IAL - 699 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Preparação da Amostra Leite – Homogeneíze a amostra, pese 10 g, transira para um almofariz contendo 15 g de sílica gel calcinada e macere até resultar em pó. Ovos – Homogeneíze a amostra (claras e gemas). Pese 5 g desta mistura e 5 g de água tratada, transira para um almofariz contendo 15 g de sílica gel calcinada e macere até resultar em pó. Manteiga, carnes e outros produtos gordurosos – Homogeneíze a amostra, extraia a gordura por reluxo em Soxhlet com 200 mL de n-hexano. Pese 2 g de gordura e dilua com nhexano em balão volumétrico de 25 mL. Procedimento – Transira para uma coluna cromatográica 15 g de sílica gel desativada a 10%. Adicione aproximadamente 1 g de sulfato de sódio anidro e posteriormente a mistura com a sílica de leite ou ovo ou uma alíquota de 5 mL da solução de gordura diluída, equivalente a 0,4 g. Empacote muito bem. Elua com 200 mL da mistura de n-hexano-diclorometano na proporção de 4:1 (v/v) e em seguida, com 200 mL da mistura de n-hexano-diclorometano na proporção de 1:1 (v/v). Recolha os dois eluatos em balões de fundo chato de 350 mL e concentre em rotavapor à 40ºC, até quase a secura. Adicione aproximadamente 5 mL de n-hexano e concentre novamente até que todo o diclorometano seja evaporado. Transira quantitativamente para um tubo graduado, completando o volume para 5 mL com n-hexano. Identiique e quantiique em cromatógrafo a gás com detector de captura de elétrons. Condições cromatográficas – Cromatógrafo a gás com ECD equipado com workstation, coluna capilar (30 m x 0,32 mm x 0,25 μm de ilme) : fase estacionária: 5% de fenil metil siloxano, temperatura do detector: 320°C, temperatura do forno: 60°C (1min ); (60220)°C (10°C/min.), 220-280°C (3°C/min), 280°C (17 min) – tempo total: 60 min.; luxo do gás de arraste: nitrogênio: 1 mL/min, temperatura do injetor: 240°C, modo de injeção: splitless. Curva-padrão – Injete as soluções de trabalho com diferentes concentrações por duas ou três vezes ou até que haja repetitibilidade dos cromatogramas. Construa a curva-padrão dentro da faixa de linearidade do detector. Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize análise da testemunha e estudos de recuperações com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ. 700 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Cálculo A análise quantitativa é feita por meio da curva-padrão com padronização externa, por comparação de área, levando em consideração o fator de diluição e quantidade de amostra. A análise qualitativa é feita por padronização externa, por meio da comparação do tempo de retenção dos princípios ativos e a conirmação em coluna de diferente polaridade ou por detector seletivo de massa. O resultado deve ser expresso em miligramas do princípio ativo por quilograma da amostra (mg/Kg). Referência bibliográfica STEIWANDTER, H. – Contributions to sílica gel application in pesticide residue analysis. III. An on-line method for extracting and isolating chlorinated hidrocarbon pesticides and polychlorinated biphenyls (PCBs) from milk and dairy products. Fresenius Z. Anal. Chem., 312: 342-345, 1982. 372/IV Método para determinação de ditiocarbamatos em frutas e vegetais Este método aplica-se à determinação de resíduos de ditiocarbamatos em frutas e vegetais. Consiste na decomposição de ditiocarbamatos em meio de solução de cloreto estanoso e ácido clorídrico, gerando o CS2, que, após puriicação, é coletado em uma solução de acetato de cobre e dietanolamina. Dois complexos cúpricos [cúprico-N-Nbis(2-hidroxietil)] são formados e medidos em conjunto por espectrofotometria na região de absorção no visível, no comprimento de onda de 435 nm, usando como referência um branco dos reagentes. Material Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de 1 cm; balança analítica; balança semi-analítica; manta de aquecimento para balão de 1000 mL com 3 bocas; sistema de puriicação de água; aparelho de destilação e decomposição constituído de: um balão de 1000 mL com 3 bocas, um destilador, um funil de separação, condensador, tubos lavadores de gases e conexões apropriadas (Figura 1); pipetas volumétricas de diferentes capacidades, balões volumétricos de diferentes capacidades, béqueres e provetas. Reagentes Álcool Dissulfeto de carbono com alto teor de pureza (D = 1,266 g/mL) Hidróxido de sódio Ácido clorídrico Acetato de chumbo Acetato de cobre Dietanolamina IAL - 701 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cloreto estanoso di-hidratado Lactose Mancozebe - padrão analítico certiicado Nitrogênio comum Água destilada e desmineralizada Nota: faça previamente brancos de cada reagente para certiicar-se de que não possuem interferentes na análise. Solução R1 - acetato de chumbo – Dissolva 30 g de acetato de chumbo em água com aquecimento. Esfrie e transira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução R2 - acetato de cobre – Dissolva 0,4 g de acetato de cobre mono-hidratado [Cu(CH3COO)2.H2O] em 200 mL de álcool etílico com leve aquecimento. Esfrie e transira para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Solução R3 – Dilua 25 mL da solução R2 em um balão volumétrico de 100 mL com álcool. Solução R4 - reagente de cor – Adicione 100 mL de álcool, 30 mL da solução R3 e 25 g de dietanolamina em balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool. Solução R5 - cloreto estanoso – Dissolva 40 g de cloreto estanoso dihidratado (SnCl2. 2H2O) em ácido clorídrico e transira para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com ácido clorídrico. Solução R6 – Transira cuidadosamente 20 mL da solução R5 e 20 mL de ácido clorídrico concentrado para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Solução R7 - Hidróxido de sódio – Pese 10 g de hidróxido de sódio e dissolva em água. Transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Solução-padrão em lactose para estudos de recuperação – Pese, em balão de rotavapor, quantidade suiciente de padrão para a realização das recuperações, adicione lactose, de maneira a obter a concentração desejada. Misture com cuidado até perfeita homogeneização, girando o balão durante 4 horas em rotavapor. Solução-padrão mãe CL1 – Em um balão de 50 mL contendo 40 mL de álcool, pese 1 mL de dissulfeto de carbono (D = 1,266 g/mL) e complete o volume com álcool. 702 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Solução-padrão intermediária CL2 – Dilua 5 mL da solução CL1 em um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com álcool . Solução-padrão intermediária CL3 – Transira 5 mL da solução CL2 para um balão volumétrico de 250 mL e complete o volume com álcool, obtendo-se assim uma concentração de 50,64 μg/mL de dissulfeto de carbono. Soluções-padrão de trabalho – Em um balão volumétrico de 25 mL, contendo 15 mL da solução R4 (reagente de cor), pipete 0,2; 0,4; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 mL da solução-padrão intermediária CL3 e complete o volume com álcool etílico, resultando, respectivamente, nas concentrações de 0,4; 0,8; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 14,0 e 16,0 μg, CS2 por mL. Solução-branco de reagentes – Transira 15 mL da solução R4 para um balão volumétrico de 25 mL e complete o volume com álcool. Procedimento – Quarteie e corte a amostra em pedaços pequenos. Homogeneíze e armazene em frasco de vidro com tampa, no freezer. Monte o aparelho de destilação e decomposição, conforme Figura 1. Transira 300 g da amostra para o frasco com três bocas do conjunto de destilação. Conecte o condensador na boca central e nas laterais, o tubo de nitrogênio e o funil de separação contendo 240 mL da solução R6. No condensador (boca central do balão de 3 bocas) conecte, em seqüência, três tubos lavadores de gases, adicionando a cada tubo respectivamente: 10 mL da solução R1, 10 mL da solução R7 e 15 mL da solução R3. Abra o luxo de nitrogênio brandamente. Aqueça o frasco rapidamente até a ebulição por 60 minutos. Após o término, desligue o luxo de nitrogênio e desconecte o terceiro tubo. Transira para um balão volumétrico de 25 mL, completando o volume com álcool. Meça a absorbância a 435 nm em espectrofotômetro, contra o branco de reagentes. Análise da testemunha e estudos de recuperação – Para cada matriz a ser analisada, realize análise da testemunha e estudos de recuperação com 5 repetições em pelo menos dois níveis: 1 LQ e 10 LQ. Nota: Limite de quantiicação (LQ) – Menor concentração do analito na amostra que pode ser quantiicada com precisão e exatidão aceitáveis, sob determinadas condições experimentais adotadas. Curva-padrão – Meça a absorbância de todas as soluções de trabalho em espectrofotômetro, a 435 nm contra o branco de reagentes. Trace a curva absorbância versus concentração de CS2. IAL - 703 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 1 – Aparelho de destilação e decomposição para determinação de ditiocarbamatos em frutas e vegetais. Cálculo O resíduo, em mg/kg, de CS2 é calculado por padronização externa com a curva de calibração, levando em consideração o fator de diluição e a quantidade de amostra. Fatores de conversão do CS2 para alguns ditiocarbamatos: Ditiocarbamatos Mancozebe Manebe Zinebe Tiram Fator de conversão 1,776 1,742 1,810 1,578 O resultado deve ser expresso em miligramas do princípio ativo ou de CS2 por quilograma da amostra (mg/Kg). 704 - IAL Capítulo XX - Resíduos de Pesticidas Referências bibliográficas KEPPEL, G.E. Modiication of the carbon dissulide evolution method for dithiocarbamate residues. J. Assoc. Of. Anal. Chem. v. 52, p. 162-169, 1969. KEPPEL, G.E. Collaborative study of the determination of dithiocarbamate residues by a modiied carbon dissulide evolution method. J. Assoc. Of. Anal. Chem. v. 54, p. 528-532, 1971. THEIR H.; ZEUMER, H. editors. Multiresidue method SIS. Ditiocarbamate and thiuram disulide fungicides photometric determination. In: Manual of Pesticide Residue Analysis. Deutsche. Forschungsgemeinschaft, Pesticides Comm. Weinhein; Verlag, 1987. v. 1 p. 353-360. Colaboradores Heloísa Helena Barretto de Toledo, Sônia Bio Rocha, Tereza Atsuko Kussumi e Vera Regina Rossi Lemes IAL - 705 Capítulo XXI - Fermentos CAPÍTULO XXI FERMENTOS IAL - 707 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 708 - IAL Capítulo XXI - Fermentos XXI FERMENTOS Fermentos biológicos O s fermentos biológicos são preparações à base de leveduras de uso tecnológico, capazes de produzir fermentação em massas. Do ponto de vista analítico, são de interesse as determinações de umidade (012/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), cinzas ou resíduo mineral ixo (018/IV), amido e poder fermentativo. 373/IV Fermentos biológicos – Determinação de amido Material Béquer de 100 mL, proveta de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, autoclave, balão volumétrico de 200 mL e bastão de vidro. Reagentes Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio a 10% m/v Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese 5 g da amostra em um béquer de 100 mL. Adicione 50 mL de água. Homogeneíze com um bastão de vidro e iltre. Lave o béquer e o bastão. Lave bem o resíduo a im de retirar todos os solúveis em água. Transira o papel de iltro com o resíduo para um frasco Erlenmeyer de 300 mL com auxílio de 150 mL de água. IAL - 709 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Adicione 5 mL de ácido clorídrico. A solução deverá icar fortemente ácida. Aqueça em autoclave a 1 atm por uma hora. Neutralize com solução de hidróxido de sódio a 10%. Transira para um balão volumétrico de 200 mL. Complete o volume com água e titule com soluções de Fehling, seguindo a técnica descrita em 043/IV. Cálculo A = n° de mL da solução P da amostra a = n° de g de glicose correspondente a 10 mL das soluções de Fehling P = n° de g da amostra V = n° de mL gasto da solução Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 139-140. 374/IV Fermentos biológicos – Poder fermentativo Este método destina-se a medir a capacidade de produção de CO2 de fermentos biológicos nas CNTP e baseia-se na liberação do CO2 pela Saccharomyces cerevisae na presença de sacarose (substrato), num sistema fechado. Material Banho-maria, balança analítica, aparelho de Hayduck-Nagel adaptado (Figura 1), frasco Erlenmeyer de 1000 mL, béqueres de 10 e 50 mL e proveta de 500 mL. 710 - IAL Capítulo XXI - Fermentos Figura 1 - Aparelho de Hayduck-Nagel adaptado Reagentes Solução de sacarose a 10% m/v Fosfato ácido de potássio - K2HPO4 Fosfato ácido de amônio - (NH4)2HPO4 Sulfato de magnésio - MgSO4 Sulfato de cálcio - CaSO4 Gasolina Procedimento – No aparelho de Hayduck-Nagel, coloque 2 mL de gasolina no tubo de segurança C, acrescente água até nivelar a escala, utilizando a torneira F. Feche as torneiras E e F. Pese 10 g da amostra, 2 g de fosfato ácido de potássio, 1 g de fosfato ácido de amônio, 0,25 g de sulfato de magnésio e 0,2 g de sulfato de cálcio. Transira para o frasco Erlenmeyer de 1000 mL a amostra e os reagentes. Adicione 400 mL da solução de sacarose a 10%. Adapte o frasco Erlenmeyer imediatamente ao aparelho de Hayduck-Nagel, mergulhando-o em banho-maria a 30°C. A partir deste momento, marque duas horas de reação. Anote a temperatura e a pressão atmosférica ambiente. Inicie as leituras assim que houver a formação de CO2, indicado pela presença de espuma. Efetue a medida do volume de gás produzido abrindo a torneira E e mantendo fechada a torneira F. Leia o deslocamento da coluna de água no tubo C. Feche a torneira A, abra a torneira B e acrescente água até nivelar a escala. Repita a operação de leitura até completar duas horas. IAL - 711 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo P1= pressão atmosférica nas CNTP (760 mm Hg) T1= temperatura absoluta (273°K) P2= pressão atmosférica ambiente T2= temperatura ambiente (°K) V2= volume medido no experimento Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 139-141. Fermentos Químicos Fermento químico é o produto constituído de uma substância ou mistura de substâncias químicas que, pela inluência do calor e/ou umidade, produz desprendimento gasoso capaz de expandir massas elaboradas com farinhas ou féculas, aumentando o volume e a porosidade. O parâmetro mais importante a ser avaliado nos fermentos químicos é o dióxido de carbono total, que pode ser determinado por método gasométrico ou gravimétrico. 375/IV Fermentos químicos – Determinação de CO2 total pelo método gasométrico 1 O método baseia-se na medida do volume de dióxido de carbono total produzido pela amostra devido à adição de ácido. Material Aparelho de Chittick composto de: balão de 250 mL, com fundo redondo e boca larga, munido de rolha de borracha com 2 orifícios (A); tubo em U (B) munido com uma torneira (C); tubo medidor de gás, graduado em mL, com traço zero colocado a 25 cm abaixo da extremidade superior; o intervalo graduado abrange 25 divisões acima de zero, até 200 abaixo de zero (D); bulbo nivelador de 300 mL de capacidade (E) e bureta de 25 mL com ponta curva e alongada (F). 712 - IAL Capítulo XXI - Fermentos Figura 2 – Aparelho de Chittick Reagentes Ácido sulfúrico (1+5) ou ácido clorídrico (1+2) Solução de deslocamento – Pese 100 g de cloreto de sódio e dissolva em 350 mL de água. Adicione 1 g de bicarbonato de sódio e 2 mL de indicador alaranjado de metila a 0,5%. Agite e adicione, às gotas, ácido sulfúrico (1+5) ou ácido clorídrico (1+2) até coloração rósea. Agite até que todo o dióxido de carbono tenha sido desprendido. Procedimento – No aparelho de Chittick, ligue a bureta F ao balão A por um dos orifícios da rolha de borracha. Ligue o tubo em U ao balão A por meio de um tubo de vidro, tendo como intermediário um tubo de borracha, a im de permitir que o balão A possa ser agitado. Ligue o bulbo nivelador ao medidor de gás por meio de um tubo longo de borracha. Pese de (1 - 2) g da amostra de fermento químico ou 10 g da farinha de trigo com fermento no balão A seco. Adapte o balão ao aparelho, abra a torneira C e feche a torneira F. Coloque a solução de deslocamento no bulbo E e ajuste o nível do tubo D a 10 mL acima do traço zero, manejando o bulbo nivelador. Estes 10 mL são praticamente iguais ao volume de ácido a ser usado na decomposição. Deixe o aparelho em repouso por cerca de 5 minutos, para igualar a pressão e a temperatura interna do aparelho às IAL - 713 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital condições ambientais. Feche a torneira C. Abaixe um pouco o bulbo E para que reduza a pressão dentro do aparelho e o nível no tubo D esteja a 10 mL acima do zero. Veriique se não há vazamento pelas conexões. Adicione, lentamente ao balão A, 10 mL de ácido sulfúrico (1+5) contido na bureta F. Deixe cerca de 2 min em repouso e agite o balão A vigorosamente. Deixe o aparelho em repouso por 5 minutos. Leia o volume de CO2 produzido no tubo D. Anote a temperatura e a pressão ambiente. Cálculo P = pressão ambiente em mm de mercúrio V = n° de mL de dióxido de carbono desprendido T = temperatura ambiente em graus Kelvin A = massa da amostra, em gramas Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 147-149. 376/IV Fermentos químicos – Determinação de CO2 total pelo método gasométrico 2 Material Aparelho de Schroedter, balança analítica e proveta de 50 mL. Figura 3 - Aparelho de Schroedter 714 - IAL Capítulo XXII - Sal CAPÍTULO XXII SAL IAL - 717 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 718 - IAL Capítulo XXII - Sal XXII SAL sal para o consumo humano pode ser avaliado por meio do exame físico-químico que além de determinar seu principal componente, o cloreto de sódio, inclui a determinação de umidade, substâncias insolúveis em água, sulfatos, cálcio e magnésio. A concentração de íons cálcio, magnésio e sulfatos é indicativa da qualidade do sal; quanto menor seus teores, mais puro será o sal. Um sal reinado deve conter no máximo 0,07% de cálcio, 0,5% de magnésio e 0,21% de sulfatos. O cloreto de sódio puro não é higroscópico. O que torna o sal úmido é a presença do cloreto de magnésio, cloreto de cálcio e sulfatos de magnésio e cálcio. O No exame microscópico é tolerada a presença de areia e fragmentos de conchas até o limite dos insolúveis estabelecidos em seu padrão de identidade e qualidade. O exame microbiológico não é signiicativo, uma vez que o sal é por excelência um conservador natural. Assim, na análise de sal, as determinações usuais são: granulometria, a perda por dessecação (umidade), substâncias insolúveis em água, cloretos, turbidez, cálcio, magnésio e sulfatos. Há muitos anos o sal é utilizado como veículo para garantir o suprimento adequado de iodo à população, que deve ser obrigatoriamente adicionado na proporção estabelecida pelo Ministério da Saúde. No Brasil, essa adição é normalmente realizada utilizando-se o iodato de potássio. Essa prática visa minimizar a ocorrência de distúrbios causados pela deiciência de iodo, entre eles, o bócio. Desta forma, a determinação do iodo no sal destinado ao consumo humano é prática rotineira. IAL - 719 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital As determinações analíticas necessárias para comprovação do padrão de identidade e qualidade do sal podem, eventualmente, incluir pesquisa de outros contaminantes, orgânicos ou minerais, estranhos à sua composição normal. 377/IV Determinação da granulometria Este é um paradigma importante no que se refere à classiicação do sal. O sal grosso não tem especiicações granulométricas, enquanto que os demais tipos de sal (peneirado, triturado, moído, reinado) são classiicados conforme especiicações estabelecidas por legislação. Material Tamis n° 4 (4,76 mm de abertura), para sal peneirado; tamis n° 7 (2,83 mm de abertura), para sal triturado; tamis n° 18 (1,00 mm de abertura), para sal moído; tamis n° 20 (0,84 mm de abertura) e tamis n°140 (0,105 mm de abertura), para sal reinado e balança semianalítica. Procedimento – Pese 1000 g da amostra e passe pelo tamis próprio para cada tipo de sal. Pese os cristais retidos no tamis. Cálculo N = n° de g da amostra retida no tamis P = n° de g da amostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 284. ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 5734: peneiras para ensaio com telas de tecido metálico. Rio de Janeiro, 1989. 720 - IAL Capítulo XXII - Sal Preparo da amostra Para as determinações analíticas do sal faz-se necessária a homogeneização da amostra, passando-a por tamis n° 4. Se necessário, triture os cristais retidos pelo tamis e misture novamente à amostra. Homogeneíze e transira para um frasco com rolha esmerilhada. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 285. 378/IV Determinação da umidade É um indicador da pureza do sal, já que este produto tem, em sua composição, sais higroscópicos de magnésio e de cálcio. Um sal reinado deve ser submetido a um processo adequado de secagem para a sua avaliação. Procedimento – Deverá ser seguida a técnica indicada em 012/IV, usando 5 g da amostra e estufa a 150°C. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 284. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p. 186-194. 379/IV Determinação de insolúveis totais em água Esta determinação avalia o teor de impurezas totais, como partículas de carvão, areia, fragmentos de conchas e outras, que não tenham sido eliminadas totalmente pela reinação. Quanto menor o seu teor, melhor a qualidade do sal. IAL - 721 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Béqueres de 150 e 600 mL, proveta de 500 mL, cadinho de Gooch de 30 mL previamente preparado com camada de ibra de óxido de alumínio, bomba de vácuo, frasco Kitassato com alonga e anel de borracha, estufa, dessecador contendo sílica gel, mula e balança analítica. Procedimento – Pese 50 g da amostra em um béquer de 150 mL e transira para um outro de 600 mL, com auxílio de 300 mL de água. Agite até dissolver. Filtre em cadinho de Gooch com camada de ibra de óxido de alumínio (previamente aquecido em mula a 550°C, resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e pesado). Lave o béquer e o cadinho com água, com porções de 20 mL, até que o iltrado não mostre mais opalescência ao adicionar-se uma gota de solução de nitrato de prata 0,1 M. Aqueça o cadinho de Gooch com o resíduo em estufa a 105°C por 2 horas. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento por 30 minutos na estufa e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de insolúveis totais em água P = n° de g da amostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 284. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p.186-194. 722 - IAL Capítulo XXII - Sal 380/IV Determinação de insolúveis inorgânicos em água Esta determinação avalia o teor das impurezas inorgânicas do sal, para veriicação de sua qualidade. Material Balança analítica, mula, cadinho de Gooch e dessecador com sílica gel Procedimento – Coloque o cadinho de Gooch com os insolúveis totais em água, obtidos em 379IV, na mula a 550ºC, por 30 minutos. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de insolúveis inorgânicos em água P = n° de g da amostra 381/IV Determinação de cloretos em cloreto de sódio Este é um parâmetro físico-químico muito importante numa análise de sal, pois o teor encontrado é classiicatório para o produto. Quando a análise é rotineira, o cloreto de sódio pode ser dosado diretamente pelo método argentométrico de Mohr, conhecido por sua exatidão e rapidez. Material Balão volumétrico de 500 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, proveta de 50 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL e balança analítica. Reagentes Solução de cromato de potássio a 10% m/v Solução de nitrato de prata 0,1 M Procedimento – Pese 5 g da amostra, transira para um balão volumétrico de 500 mL, com auxílio de 200 mL de água, deixe em repouso no mínimo 2 horas, complete o volume e agite. Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL dessa solução para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 50 mL de água e 2 gotas de solução de cromato de potássio a 10%. Titule com solução de nitrato de prata 0,1 M. IAL - 723 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo V = n° de mL de solução de nitrato de prata 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de nitrato de prata 0,1 M P = n° de g da amostra usado na titulação Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 286. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p. 186-194. 382/IV Determinação de iodo adicionado na forma de iodeto O sal, para consumo humano, deverá conter uma pequena quantidade de iodo, em forma de iodeto ou iodato, para a prevenção do bócio. O método para dosagem de iodo no sal fundamenta-se na titulação volumétrica do iodo liberado, após a acidiicação da amostra adicionada de iodeto de potássio, com solução de tiossulfato de sódio 0,005 M e usando solução de amido como indicador. O amido reage com o iodo liberado nas reações de óxidoredução envolvidas, formando um complexo de cor azul que é descolorido pela adição de solução de tiossulfato de sódio. Deve-se dosar o iodo no sal, no mínimo, em duplicata; a diferença de leitura nas duas titulações não deve ser maior que 0,1 mL. Material Béquer de 600 mL, pipeta de 1 mL e bureta de 10 mL. Reagentes Ácido fosfórico a 85% Ácido salicílico Iodeto de potássio Solução de alaranjado de metila em água fria a 0,01% m/v 724 - IAL Capítulo XXII - Sal Solução de tiossulfato de sódio 0,005 M Água de bromo – Junte 25 g (ampola) de bromo a 700 mL de água fria, preparado em capela. Conserve em geladeira e em frasco escuro. Solução de amido a 1%, recém-preparada – Pese 1 g de amido, dissolva em 100 mL de água, ferva e esfrie à temperatura ambiente. Procedimento – Pese 10 g da amostra e transira para um béquer de 600 mL, com auxílio de 400 mL de água bidestilada. Agite até dissolver. Neutralize com ácido fosfórico a 85%, usando como indicador solução de alaranjado de metila. Acrescente mais 1 mL de ácido fosfórico a 85%. Adicione 1 mL de água de bromo. Aqueça até ebulição reduzindo o volume da solução à metade. Adicione, enquanto quente, alguns cristais de ácido salicílico. Esfrie. Adicione 1 mL de ácido fosfórico a 85% e cerca de 0,1 g de iodeto de potássio. Titule com solução de tiossulfato de sódio 0,005 M, usando solução de amido a 1%, como indicador. Cálculo V = mL da solução de tiossulfato de sódio 0,005 M gasto na titulação f = fator da solução de tiossulfato de sódio 0,005 M P = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 287. 383/IV Determinação de iodo adicionado na forma de iodato Material Béquer de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, proveta de 250 mL, pipeta de 5 mL, bureta de 10 mL e balança analítica. Reagentes Solução de ácido sulfúrico 0,5 M IAL - 725 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Iodeto de potássio Solução de tiossulfato de sódio 0,005 M Solução de amido a 1%, recém-preparada – Dissolva 1 g de amido em 100 mL de água, ferva e esfrie à temperatura ambiente. Procedimento – Pese 10 g da amostra e transira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, com auxílio de 200 mL de água bidestilada. Agite até a dissolução. Adicione 5 mL de solução de ácido sulfúrico 0,5 M. Adicione cerca de 0,1 g de iodeto de potássio, 2 mL de solução de amido a 1%, como indicador, e titule o iodo liberado com solução de tiossulfato de sódio 0,005 M, usando uma bureta de 10 mL. Notas A quantidade de ácido sulfúrico indicada é necessária para reduzir o pH da solução a 1,5 2,0, para que ocorra a reação. Dependendo da composição do sal, alguns aditivos podem interferir nessa redução de pH, sendo que, nesses casos é necessária a adição de maior quantidade do ácido sulfúrico para se atingir a faixa de pH desejada. A presença do amido, logo no início da titulação, pode interferir no ponto inal, principalmente se o sal contiver muito iodo; nesse caso, recomenda-se iniciar a titulação com tiossulfato de sódio sem a adição do indicador. Assim que a solução torna-se amarelo-clara, adicione o amido como indicador. Cálculo V = mL da solução de tiossulfato de sódio 0,005 M gasto na titulação f = fator da solução de tiossulfato de sódio 0,005 M P = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 288. 384/IV Determinação da turbidez Trata-se de uma medida indicativa da qualidade do sal e de sua classiicação. Avalia o teor de sólidos em suspensão. Se o sal, moído ou reinado, tiver um conteúdo considerável de impurezas, orgânicas e inorgânicas, indica que não foi beneiciado adequadamente. Esta 726 - IAL Capítulo XXII - Sal determinação não se aplica no caso do sal que contiver antiumectantes insolúveis em água. Material Béquer de 100 mL, balão volumétrico de 100 mL, espectrofotômetro UV/VIS e balança analítica. Procedimento – Pese 25 g do sal em béquer de 100 mL e transira para um balão volumétrico de 100 mL, com água. Agite para facilitar a dissolução e complete o volume. Agite. Deixe em repouso por 12 horas. Agite e, em seguida, faça a leitura do grau de turbidez usando medida espectrofotométrica a 610 nm. Interprete os resultados conforme tabela abaixo: Porcentagem de transmitância 96 - 100 91 - 95 85 - 90 Turbidez 25° 50° 100° Característica do sal correspondente reinado grosso ou moído sal muito sujo Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 289. 385/IV Determinação de cálcio por permanganometria Material Béquer de 400 mL, proveta de 50 mL, funil de 5 cm de diâmetro, papel de iltro, bureta de 25 mL, pipeta de 1 mL, balança semi-analítica e balança analítica. Reagentes Ácido acético glacial Solução de oxalato de amônio a 5% m/v Ácido sulfúrico (1+4) Solução de permanganato de potássio 0,02 M Procedimento – Pese 5 g da amostra e transira para um béquer de 400 mL, com auxílio de 50 mL de água. Adicione 1 mL de ácido acético glacial. Aqueça até a ebulição. Adicione lentamente, agitando sempre, 25 mL de solução de oxalato de amônio a 5%. Deixe em repouso por 2 horas. Filtre. Receba o iltrado em um béquer de 400 mL. Lave até que o iltrado não contenha íon oxalato. Transira o papel de iltro com o precipitado para o béquer onde foi feita a precipitação, reservando as águas de lavagem para a dosagem de magnésio. IAL - 727 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Dissolva o precipitado com 20 mL de ácido sulfúrico (1+4). Adicione 50 mL de água. Titule a quente com solução de permanganato de potássio 0,02 M até coloração rósea. Cálculos Em cálcio: Em óxido de cálcio: V = n° de mL da solução de permanganato de potássio 0,02 M gasto na titulação f = fator da solução de permanganato de potássio 0,02 M P = n° de g da amostra usado na precipitação Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 289. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p.186-194. 386/IV Determinação de cálcio por titulação com EDTA Material Balão volumétrico de 500 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, proveta de 50 mL, pipeta de 5 mL e bureta de 10 mL. 728 - IAL Capítulo XXII - Sal Reagentes Solução de hidróxido de sódio a 20% m/v Calcon a 1% com sulfato de sódio m/m Propionato de cálcio Solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4% m/v Solução-tampão de pH =10 – Em um balão volumétrico de 1000 mL, dissolva 67,5 g de cloreto de amônio em água destilada, adicione 570 mL de hidróxido de amônio (D = 0,88) e complete o volume com água. Solução de sal dissódico de EDTA 0,1 M – Pese 37,21 g de C10H14N2Na2O8.2H2O, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Solução-padrão de propionato de cálcio – Seque o propionato de cálcio em estufa a 105°C por 6 horas. Pese exatamente 1 g, transira para um balão volumétrico de 100 mL, com auxílio de água e complete o volume. Transira com uma bureta, 10 mL desta solução para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Junte 50 mL de água, 1 mL de solução-tampão pH 10 e 0,5 mL de solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4%. Titule a solução de EDTA até coloração azul. Cálculo do fator da solução de EDTA: f = fator da solução de EDTA v= n° de mL de solução de EDTA gasto na titulação Notas Conserve a solução em frasco plástico e não use sem veriicar o título, se a solução tiver sido preparada há mais de um mês. Como alternativa, pode-se usar o carbonato de cálcio como solução-padrão (Apêndice I). Solução de sal dissódico de EDTA 0,01 M – Transira 100 mL da solução padronizada de EDTA 0,1 M para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Procedimento – Pese 50 g da amostra em um béquer e transira para um balão volumétrico de 500 mL, com o auxílio de 300 mL de água. Deixe em repouso por 12 horas e complete IAL - 729 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital o volume (solução-estoque A). Transira 10 mL desta solução para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Junte 50 mL de água e 5 mL de solução de hidróxido de sódio a 20%. Adicione, aos poucos para não formar grumos, calcon a 1% com sulfato de sódio até coloração rósea nítida (aproximadamente 0,1 g) e titule com solução de sal dissódico de EDTA 0,01 M até coloração azul nítida. Cálculo v x f x 0,04008 = cálcio por cento m/m v = n° de mL de solução de EDTA 0,01 M gasto na titulação f = fator da solução de EDTA Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 290291. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p. 186-194. 387/IV Determinação de magnésio por precipitação Material Proveta de 50 mL, cadinho de Gooch com camada de ibra de óxido de alumínio, bomba de vácuo, frasco Kitassato, bastão de vidro e béquer de 50 mL. Reagentes Hidróxido de amônio (1+1) Solução de fosfato de sódio a 3% m/v Hidróxido de amônio (1+3) Procedimento – Concentre, em banho-maria, o iltrado reservado na dosagem de cálcio obtido conforme 386/IV, até o volume de 200 mL. Alcalinize com hidróxido de amônio (1+1). Adicione 10 mL de uma solução de fosfato de sódio a 3%. Friccione as paredes do béquer com um bastão de vidro. Deixe em repouso por 24 horas. Decante o sobrenadante. 730 - IAL Capítulo XXII - Sal Lave o precipitado e o béquer com 50 mL de hidróxido de amônio (1+3) e iltre em cadinho de Gooch com camada de ibra de óxido de alumínio, previamente aquecido em mula a 550°C por uma hora, resfriado em dessecador e pesado. Seque em estufa a 105°C. Aqueça em mula a 550°C, por uma hora. Resfrie em dessecador. Pese. Repita as operações de aquecimento (meia hora em mula) e resfriamento em dessecador até peso constante. Cálculos Em magnésio: Em sulfato de magnésio anidro: N = n° de g do resíduo calcinado a 550°C (pirofosfato de magnésio) P = n° de g de amostra usado na precipitação Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 292. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p.186-194. 388/IV Determinação de magnésio por titulação com EDTA Material Frasco Erlenmeyer de 250 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, pipeta graduada de 10 mL, proveta de 25 mL, pipeta graduada de 1 mL e bureta de 10 mL. IAL - 731 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Solução de EDTA 0,01 M conforme 386/IV Solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4% m/v Solução tampão pH 10, conforme 386/IV Procedimento – Transira 10 mL da solução estoque A obtida conforme 386/IV para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Junte 25 mL de água e 10 mL de solução-tampão de pH=10. Adicione 0,5 mL de solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4%. Titule com EDTA 0,01 M até viragem do indicador, de vermelho para azul nítido. Cálculo (v´ - v) x f x 0,02431 = magnésio por cento m/m v´ = n° de mL de solução de EDTA 0,01 M gasto na titulação correspondente ao Ca2+ + Mg2+ f = fator da solução de EDTA v = n° de mL de solução de EDTA 0,01 M gasto na titulação do cálcio, determinado conforme 386/IV. Referências bibliográficas AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercial Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p. 186-194. 389/IV Determinação de sulfatos por precipitação Material Béquer de 250 mL, proveta de 50 mL, funil de 5 cm de diâmetro, cadinho de Gooch com camada de ibra de óxido de alumínio, bomba de vácuo e frasco Kitassato com alonga e anel de borracha. 732 - IAL Capítulo XXII - Sal Reagentes Ácido clorídrico (D = 1,19) Solução de cloreto de bário a 10% m/v Procedimento – Pese 10 g da amostra e transira para um béquer de 250mL, com auxílio de 100 mL de água. Aqueça até a ebulição e adicione, lentamente, 1 mL de ácido clorídrico. Ferva. Adicione, gota a gota, 10 mL da solução de cloreto de bário a 10%. Aqueça em banho-maria por 1 hora. Deixe em repouso por 12 horas. Decante. Lave o precipitado, iltrando em cadinho de Gooch com camada de ibra de óxido de alumínio, previamente aquecido em estufa a 120°C, por uma hora, resfriado em dessecador e pesado. Lave até que todo íon cloreto tenha sido eliminado (teste adicionando-se no iltrado uma gota de nitrato de prata 0,1 M até não apresentar opalescência). Aqueça em estufa a 120°C, por 1 hora, resfrie no dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo Em íon sulfato: Em sulfato de sódio N = n° de g de sulfato de bário P = n° de g da amostra usado na precipitação A = n° de g de sulfato de magnésio anidro por cento Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 293. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. IAL - 733 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital RAFOLS, J.M. Development of Analytical Methods for Commercia Sodium Chloride. In: THIRD SYMPOSIUM ON SALT. NORTHERN OHIO GEOLOGICAL SOC., 1970. p. 186-194. 390/IV Determinação de sulfatos por titulação com EDTA Material Pipetas de 1, 5, 10 e 25 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL e balança analítica. Reagentes Ácido clorídrico a 10% v/v Solução-tampão, pH = 10, descrito conforme em 386/IV Solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4% Solução de cloreto de magnésio 0,1 M – Dissolva 20,33 g de cloreto de magnésio MgCl2.6H2O em água, num balão volumétrico de 1000 mL. Complete o volume. Determine o fator com EDTA 0,1 M, usando 25 mL dessa solução medidos com bureta e proceda como em 388/IV na dosagem de magnésio, substituindo o EDTA 0,01 M por EDTA 0,1 M. Solução de cloreto de bário 0,01 M – Dissolva 1,225 g de cloreto de bário com água, em balão volumétrico de 500 mL e complete o volume. Determine o fator com EDTA 0,1 M, transferindo 25 mL de solução de cloreto de bário com auxílio de uma bureta para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 25 mL de água, 20 mL de EDTA 0,1 M, 10 mL de solução-tampão pH = 10 e 0,5 mL da solução alcoólica de negro de eriocromo T. Titule com a solução de cloreto de magnésio 0,1 M até a viragem de azul para violeta. Cálculo do fator da solução de cloreto de bário: A = n° de mL de EDTA 0,1 M usado B = n° de mL de cloreto de magnésio 0,1 M gasto na titulação C = n° de mL de cloreto de bário usado, dividido por 10 f1 = fator da solução de EDTA 0,1 M f2 = fator da solução de cloreto de magnésio 0,1 M 734 - IAL Capítulo XXII - Sal Procedimento – Transira, exatamente, 10 mL da solução-estoque A obtida conforme em 386/IV, com auxílio de pipeta volumétrica, para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 25 mL de água e 5 gotas de ácido clorídrico a 10%. Aqueça até ebulição e adicione, exatamente, com auxílio de uma bureta, 10 mL da solução de cloreto de bário 0,01 M. Mantenha em ebulição por 1 ou 2 minutos, ou até veriicar a formação de precipitado, resfrie e adicione 10 mL de solução-tampão pH =10 e 0,5 mL da solução alcoólica de negro de eriocromo T a 0,4%. Titule com EDTA 0,1 M até a viragem do indicador para coloração azul nítida. Nota: próximo ao ponto de viragem, após adicionar cada gota da solução da bureta, agite bem antes de prosseguir a titulação, pois a viragem do indicador pode demorar um pouco. Cálculo v´ = n° de mL da solução de EDTA 0,01 M gasto na titulação de Ca e do Mg f = fator da solução de EDTA 0,01 M b = fator da solução de cloreto de bário 0,01 M T = n° total de mL da solução de EDTA 0,1 M gasto na titulação Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 294. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. 391/IV Determinação da composição provável Para a determinação da composição provável, o teor de cloreto de sódio é determinado subtraindo-se as porcentagens de umidade, insolúveis e outros sais de 100%. Procedimento Calcule os demais sais presentes, da seguinte maneira: • converta todo íon sulfato em sulfato de cálcio; se houver excesso de íon cálcio, calcule como cloreto de cálcio; IAL - 735 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital • se houver excesso de íon sulfato, calcule todo íon cálcio como sulfato de cálcio e o excesso de íon sulfato, como sulfato de magnésio; se ainda restar íon sulfato, converta-o em sulfato de sódio; • se houver excesso de íon magnésio, calcule como cloreto de magnésio; • o teor de cloreto de sódio é obtido por diferença. Como resultado, podemos ter sais com pelo menos três composições diferentes: 1°caso – sal com excesso de magnésio (CaSO4 , MgSO4 e MgCl2) 2°caso – sal com excesso de cálcio (CaSO4, CaCl2 e MgCl2 ) 3° caso – sal com excesso de sulfato ( CaSO4, MgSO4, e Na2SO4 ) 1º caso – com excesso de magnésio I – Umidade II – Insolúveis III – Ca2+ IV – Mg2+ V – SO VI – SO combinado ao Ca2+ = III x 2,3967 VII – Teor de CaSO4 = III + VI VIII – SO restante = V - VI IX – Mg2+ combinado com o SO = VIII x 0,2531 X – teor de MgSO4 = VIII x 1,2531 XI – Mg2+ restante = IV - IX XII – Teor de MgCl2 = XI x 3,9206 2° caso – excesso de cálcio I – Umidade II – Insolúveis III – Ca2+ IV – Mg2+ V – SO VI – Ca2+ combinado com o SO VII – Teor de CaSO4 = V + VI VIII – Ca2+ restante = III - VI 736 - IAL = V x 0,4172 Capítulo XXII - Sal IX – Teor de CaCl2 = VIII x 2,7689 X – Teor de MgCl2 = IV x 3,9206 3° caso – excesso de sulfato I – Umidade II – Insolúveis III – Ca2+ IV – Mg2+ V – SO VI – SO combinado ao Ca2+ = III x 2,3967 VII – Teor de CaSO4 = III + VI VIII – SO restante = V – VI IX – SO combinado ao Mg2+ = IV x 3,9515 X – Teor de MgSO4 = IV x 4,9514 XI – SO restante = VIII - IX XII – Teor de Na2SO4 = XI x 1,4786 Nota: os fatores numéricos apresentados nos cálculos foram obtidos pela relação entre os pesos moleculares das espécies químicas envolvidas. Cálculos Aplique o cálculo “a”, “b” ou “c”, dependendo da composição encontrada. a) 100 – (I + II + VII + X + XII) = cloreto de sódio por cento m/m I – umidade por cento m/m II – substâncias insolúveis em água por cento m/m VII – sulfato de cálcio por cento m/m X – sulfato de magnésio por cento m/m XII – cloreto de magnésio por cento m/m b) 100 – (I + II + VII + IX + X) = cloreto de sódio por cento m/m I – umidade por cento m/m II – substâncias insolúveis em água por cento m/m VII – CaSO4 por cento m/m IX – CaCl2 por cento m/m X – MgCl2 por cento m/m c)100 – (I + II + VII + X + XII) = cloreto de sódio por cento m/m IAL - 737 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital I = Umidade por cento m/m II = Substâncias insolúveis em água por cento m/m VII = CaSO4 por cento m/m X = MgSO4 por cento m/m XII = Na2SO4 por cento m/m Nota: Calcule o teor de cloreto de sódio na substância seca. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 295. AMERICAN SOCIETY for TESTING and MATERIALS. E 534-86: standard test methods for chemical analysis of sodium chloride. Philadelphia: A.S.T.M., 1986. 0387/IV Sal hipossódico O sal hipossódico é o produto elaborado a partir da mistura de cloreto de sódio com outros sais, geralmente cloreto de potássio, de modo que a mistura inal mantenha as características sensoriais semelhantes as do sal, fornecendo no máximo 50% do teor de sódio contido na mesma quantidade de cloreto de sódio. Estes sais destinam-se a dietas com restrição de sódio. Nesse tipo de sal são importantes as determinações dos teores de sódio e potássio conforme 394/IV e 395/IV, bem como a determinação de iodo conforme 382/IV ou 383/ IV. Colaboradores Neusa Vitória Valério Silveira e Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues 738 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos CAPÍTULO XXIII MINERAIS E CONTAMINANTES INORGÂNICOS IAL - 739 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 740 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos XXIII MINERAIS E CONTAMINANTES INORGÂNICOS determinação de minerais e contaminantes inorgânicos em alimentos pode ser realizada por diferentes técnicas analíticas. Pode-se citar, entre elas, volumetria com indicadores visuais ou potenciométricos, voltametria de redissolução anódica e técnicas espectrométricas como: espectrofotometria ultravioleta-visível, espectrometria de absorção atômica com chama, com forno de graite, com vapor frio e com gerador de hidretos e espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado com detecção óptica ou acoplado a espectrômetro de massa. A escolha da técnica analítica depende principalmente do elemento a ser analisado e do nível de sua concentração na amostra, além do número de amostras a serem analisadas, da quantidade de amostra disponível, do tipo de preparo da amostra, do custo envolvido, do tempo disponível para emissão do resultado e também, além da exatidão e precisão requeridas, da disponibilidade do equipamento e de pessoal treinado. Para a determinação de contaminantes e minerais em alimentos, é necessário tornar os analitos disponíveis em solução por meio da mineralização prévia da amostra e posterior dissolução dos resíduos com ácidos minerais. A destruição da matéria orgânica (mineralização e digestão) é geralmente considerada como a etapa crítica da análise, podendo levar a erros no resultado inal, devido principalmente à contaminação da amostra ou à perda do analito por adsorção ou volatilização. A Tratamento da amostra A digestão da amostra pode ser realizada por via seca (carbonização em bico de Bünsen), seguida de calcinação em mula com temperatura variando de (400-550)°C (dependendo do elemento), ou por via úmida, utilizando-se misturas oxidantes como ácido nítrico, sulfúrico, perclórico, peridrol, entre outros. O tratamento da amostra por via úmida é geralmente realizado empregando-se como fonte de aquecimento uma chapa IAL - 741 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital aquecedora (método tradicional), mas pode-se também utilizar, entre outras, um sistema de microondas aberto ou fechado. A principal vantagem da via seca, em relação à úmida, é que permite digerir maior quantidade de amostra, o que possibilita a sua utilização na análise de contaminantes inorgânicos em alimentos por técnicas menos sensíveis como espectrometria de absorção atômica com chama - FAAS e espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado - ICP OES. Suas principais desvantagens devem-se ao fato de que o aquecimento excessivo pode levar à perda do analito por volatilização e/ou tornar certos compostos metálicos insolúveis. Já a via úmida não apresenta essas desvantagens, porém há limitação com relação à quantidade de amostra, por utilizar grandes quantidades de oxidantes, acarretando maior custo além do alto risco de contaminação da amostra pelos reagentes e de exigir maiores cuidados por parte do analista. Quanto à utilização de microondas, sua principal vantagem deve-se ao fato de ser um método rápido, porém permite somente o tratamento de pequenas quantidades de amostra sendo, por esse motivo, mais utilizado na análise de contaminantes inorgânicos em alimentos por técnicas mais sensíveis, como espectrometria de absorção atômica com forno de graite ET-AAS ou espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado a espectrômetro de massa ICP-MS. Os critérios utilizados para a escolha do método de digestão da amostra são: tipo e quantidade de amostra, natureza e concentração do analito na amostra, volatilidade do analito e tipo de técnica analítica para detecção. 393/IV Digestão da amostra Via Seca Material Balança analítica, cápsula de porcelana, mula, estufa, bico de Bünsen, tela de amianto, pipeta volumétrica, chapa aquecedora e balões volumétricos de 10 ou 25 mL. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais. Procedimento – Em cápsula de porcelana, pese ou pipete uma quantidade adequada da amostra previamente homogeneizada, de tal maneira que a leitura do elemento na solução da amostra digerida esteja compreendida na faixa linear da curva-padrão. Caso o alimento seja líquido, coloque a cápsula em estufa a 105°C até secar completamente. Queime a amostra em bico de Bünsen com tela de amianto até cessar o desprendimento 742 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos de fumaça, tomando cuidado para evitar respingos e que a amostra se incendeie. Coloque a cápsula na mula e aqueça gradualmente até (400-450)ºC. Para as determinações de Fe, Ca, Mg, Na, K, Mn, Cr e Cu, a temperatura da mula poderá ser até 550ºC, deixando nessa temperatura por um período de quatro horas. Retire da mula e deixe esfriar. Umedeça as cinzas com água desmineralizada e adicione 1 mL de HNO3. Aqueça até a secura em chapa aquecedora. Retorne para a mula (400-450)ºC quantas vezes forem necessárias, repetindo a adição de ácido, até a completa mineralização da amostra, ou seja, até a obtenção de cinzas claras, isentas de carvão. Dissolva as cinzas utilizando o ácido indicado de acordo com a técnica analítica usada para a determinação, de tal maneira que a concentração inal de ácido seja a mesma que a das soluções-padrão. Aqueça, se necessário, e transira quantitativamente com água destilada e deionizada para balão volumétrico de 10 ou 25 mL ou um outro volume de acordo com a sensibilidade da técnica analítica a ser usada para a determinação dos elementos. Prepare as amostras em triplicata e um branco dos reagentes em paralelo. Via úmida (hidrólise com HCl) Esta técnica de digestão é aplicável em amostras de leite e produtos lácteos, arroz, feijão, pães e biscoitos, para a posterior determinação de analitos por espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio indutivamente acoplado. Material Balança analítica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, chapa aquecedora, pipeta volumétrica, funis, balão volumétrico de 25 mL, papel de iltro e vidro de relógio ou ilme de PVC. Reagentes Ácido clorídrico para análise de traços e metais Água destilada e deionizada Procedimento - Em frasco de Erlenmeyer de 125 mL, pese ou pipete uma quantidade adequada de amostra previamente homogeneizada, de tal maneira que a leitura do elemento na solução de amostra digerida esteja compreendida na faixa linear da curva-padrão. Caso a amostra seja sólida, adicione um pouco de água para dissolver o pó. Adicione 5 mL de ácido clorídrico 1:1 (v/v). Coloque o frasco Erlenmeyer sobre chapa aquecedora a (100-150)ºC, cobrindo com vidro de relógio ou ilme PVC, agitando ocasionalmente e mantendo o reluxo por 2 horas. Filtre a solução, ainda quente, diretamente para um balão volumétrico de 25 mL. Complete o volume com água após a solução ter atingido IAL - 743 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital a temperatura ambiente. Caso a solução não seja lida no dia, transira-a para um frasco de polietileno. Prepare as amostras em triplicata e um branco dos reagentes em paralelo. Nota: para amostras de arroz e de feijão é recomendável que o contato da amostra com o ácido seja mantido em repouso durante a noite. Aqueça em chapa aquecedora por 3 horas. Referências bibliográficas KIRA, C.S. Estudo da composição mineral e dos elementos-traço essenciais em amostras de leite e produtos lácteos por espectrometria de emissão atômica com plasma induzido e análise por ativação com nêutrons. Dissertação (mestrado) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo, 2002. OKADA, I.A. Determinação simultânea de nutrientes inorgânicos em alimentos: desenvolvimento de metodologia analítica e avaliação de seus níveis em amostras de arroz e feijão in natura. Dissertação (mestrado) – Coordenação dos Instituto de Pesquisa da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, São Paulo, 2003. 394/IV Determinação de minerais por espectrometria de absorção atômica com chama O método apresentado refere-se à quantiicação dos minerais: ferro, cobre, cálcio, magnésio, zinco, manganês, sódio e potássio em alimentos. Baseia-se na determinação por espectrometria de absorção atômica com chama dos referidos minerais em uma amostra representativa do alimento, previamente digerida. Material Espectrômetro de absorção atômica com chama equipado com corretor de background, lâmpada do elemento a ser determinado, mula, chapa aquecedora, balança analítica, estufa, balões volumétricos, cápsulas de porcelana e pipetador automático com volume ajustável. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Ácido clorídrico para análise de traços de metais Soluções-padrão estoque, de 1000 mg/L dos seguintes elementos: Fe, Ca, Mg, Zn, Cu, 744 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos Mn, Na e K para absorção atômica, com certiicado de análise e incerteza associada. Solução-padrão estoque intermediária de 100 mg/L do elemento a ser analisado – Pipete 10 mL da solução-padrão de 1000 mg/L do elemento a ser analisado em balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com solução ácida. Mantenha as soluções-padrão em frascos de polietileno. Solução de lantânio 1% (m/v) – Pese 11,7 g de La2O3 e adicione água destilada e deionizada suiciente para umedecer o óxido. Acrescente lentamente, 50 mL de HCl (cuidado: reação exotérmica) para dissolver o óxido. Transira para balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Esta solução é estável por seis meses. Solução de césio 10% (m/v) – Pese 12,7 g de CsCl e dissolva em água destilada e deionizada. Transira, com água, para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume e agite. Esta solução é estável por seis meses. Procedimentos Ajuste do equipamento – Opere o equipamento de acordo com o manual de instruções do fabricante. Ajuste o queimador, a chama e a nebulização para obtenção de máxima absorbância, utilizando uma solução-padrão utilizada na curva-padrão. Curva-padrão – Pipete, em balões volumétricos, alíquotas adequadas da solução-padrão estoque intermediária do elemento a ser analisado. As concentrações, para cada elemento, variam de acordo com a sensibilidade e a faixa linear de trabalho do equipamento. As soluções-padrão devem ser preparadas de tal forma que contenham os reagentes em concentrações similares às adicionadas nas amostras. Transira as soluções para frascos de polietileno. Preparação da amostra – O pré-tratamento e a digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente, e a temperatura da mula deverá ser, no máximo, 550oC. Dissolva as cinzas com uma alíquota adequada de ácido clorídrico concentrado, de modo que a concentração inal do ácido no balão volumétrico seja 10%. Aqueça, se necessário, para melhor dissolução. Transira com água destilada e deionizada para um balão volumétrico e complete o volume. No caso de digestão por via úmida, iltre, se necessário, recolhendo o iltrado no balão volumétrico e o volume completado com água destilada e deionizada. Prepare a amostra em triplicata e um branco dos reagentes, em paralelo. Determinação de Ca e Mg – Pipete, em balões volumétricos, alíquotas da amostra, do branco dos reagentes e dos padrões e adicione solução de LaCl3, de tal forma que a concentração inal seja 0,1% em La m/v. Zere o equipamento com o branco e faça a leitura das absorbâncias das soluções-padrão. Construa a curva-padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão linear e utilize o coeiciente angular da reta (absortividade) IAL - 745 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital para os cálculos. Alternativamente, o equipamento poderá ser programado para estabelecer a curva-padrão e fornecer leitura das amostras diretamente em concentração. Faça a leitura das amostras. Se necessário, dilua uma nova alíquota da amostra para que a leitura de absorbância ique compreendida na faixa linear da curva-padrão e adicione solução de cloreto de lantânio de tal forma que a concentração inal seja 0,1% em lantânio m/v. Determinação de Na e K – O sódio interfere na análise de potássio e vice-versa. Para evitar esse tipo de interferência, deve-se adicionar um supressor de ionização que, no caso da análise de sódio, é o potássio e vice-versa para o potássio. Para a determinação de Na e K na mesma solução, adicione em cada solução-padrão, branco e amostra, solução de césio a 10% m/v, como supressor de ionização, de tal forma que a concentração de Cs na amostra e nas soluções-padrão seja de 0,5% m/v. Zere o equipamento com o branco e faça a leitura das absorbâncias das soluções-padrão. Estabeleça a curva-padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão linear e utilize o coeiciente angular da reta (absortividade) para os cálculos. Alternativamente, o equipamento poderá ser programado para estabelecer a curva-padrão e fornecer leituras das amostras diretamente em concentração. Em seguida, faça a leitura das amostras. Se necessário, dilua uma nova alíquota da solução da amostra com adição do supressor de ionização para que a leitura de absorbância ique compreendida na faixa linear da curvapadrão e calcule a concentração de acordo com a equação a seguir: Cálculo Aa = absorbância da amostra Ab = absorbância do branco da amostra a = absortividade, calculada a partir da curva de calibração V1 = volume do balão no qual a amostra foi transferida após dissolução d = fator de diluição da amostra v = volume da amostra, em mL m = massa da amostra, em g Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Anaytical Chemists. 16th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1995, Chapter 50, p. 14. (method 985.35). 746 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos 395/IV Determinação de minerais por espectrometria de emissão atômica por plasma de argônio indutivamente acoplado Este método é aplicado para a determinação de cálcio, cromo, cobre, ferro, potássio, magnésio, manganês, sódio, fósforo e zinco em alimentos por espectrometria de emissão atômica por plasma de argônio acoplado indutivamente (ICP OES), nas amostras previamente mineralizadas por via úmida conforme 393/IV. Material Espectrômetro de emissão atômica por plasma de argônio acoplado indutivamente (ICP OES), mula, balança analítica, estufa, chapa aquecedora, pipetadores automáticos com volumes ajustáveis, frascos de polietileno, cápsulas de porcelana e balões volumétricos. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Ácido clorídrico para análise de traços de metais Solução-padrão estoque de 1000 mg/L ou 10000 mg/L dos elementos a serem analisados, com certiicado análise e incerteza associada. Procedimentos Ajuste do equipamento – Os parâmetros instrumentais devem ser otimizados segundo o manual de instruções do fabricante. Preparação da amostra – A digestão da amostra segue o procedimento 393/IV. Dissolva as cinzas resultantes da digestão da amostra com ácido clorídrico concentrado, de tal modo que a concentração inal de HCl seja 10% v/v. Aqueça, se necessário, para melhor dissolução. Transira quantitativamente com água destilada e deionizada para balão volumétrico. Alternativamente para alguns alimentos pode-se proceder a digestão da amostra por via úmida. Curva-padrão – Prepare as soluções-padrão de trabalho multi-elementar, a partir da solução-padrão estoque, com no mínimo seis pontos, levando em consideração a sensibilidade do equipamento e a faixa linear de trabalho para cada elemento. As soluções são preparadas em meio de ácido clorídrico a 10% v/v. Determinação – Zere o equipamento com solução de HCl 10%. Estabeleça a curvaIAL - 747 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital padrão para cada elemento a ser determinado usando regressão linear. Faça a leitura das amostras e veriique a calibração após analisar 20 amostras, utilizando uma das soluções da curva-padrão. Caso a leitura apresente uma variação maior que a estabelecida pelo laboratório, recalibre. Se necessário, dilua a solução da amostra para que a leitura ique compreendida na faixa linear da curva-padrão. Cálculo L x b x d = concentração do elemento na amostra, em mg/kg ou mg/L m (ou v) L = leitura da amostra, em mg/L b = volume do balão para o qual a cinza da amostra foi transferida, em mL d = fator de diluição da amostra (caso necessário) m = massa da amostra, em g v = volume da amostra, em mL Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS – Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed., v. 1, Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 3. p. 4. (method 985.01). 396/IV Determinação de cálcio por volumetria com EDTA O método refere-se à determinação de cálcio em presença de magnésio. Baseia-se na mineralização da amostra e determinação de cálcio por titulação complexométrica com EDTA (sal dissódico do ácido etilenodiamino tetracético), usando uma mistura de ácido calconcarboxílico, alaranjado de metila e cloreto de sódio, como indicador. Material Mula, estufa, balança analítica, chapa aquecedora, cápsula de porcelana, balões volumétrios, frascos Erlenmeyer de 125 mL, bureta e almofariz com pistilo. Reagentes Solução-padrão de EDTA 0,01 M – Pese exatamente 3,722 g de EDTA (C10H14N2Na2O8.2H2O). Dissolva e transira quantitativamente para balão volumétrico 748 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos de 1000 mL, com água destilada e deionizada. Complete o volume com água e agite. Transira para um frasco de polietileno. Determine a molaridade da solução seguindo a técnica descrita no apêndice I. Indicador – Pese 0,5 g de indicador ácido calcon carboxílico, 0,25 g de alaranjado de metila e 49,25 g de cloreto de sódio. Triture os três reagentes em almofariz e guarde em frasco âmbar. Hidróxido de sódio ou de potássio Ácido clorídrico para análise de traços de metais Ácido nítrico para análise de traços de metais Procedimento Preparação da amostra – O pré-tratamento e a digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente. Dissolva as cinzas com uma alíquota adequada de ácido clorídrico concentrado, de modo que a concentração inal de ácido no balão seja 10% v/v. Aqueça, se necessário, para melhor dissolução. Transira com água destilada e deionizada para balão volumétrico e complete o volume. Determinação - Pipete, em um frasco Erlenmeyer de 125 mL, uma alíquota da solução da amostra previamente mineralizada que contenha cerca de 5 mg de cálcio e adicione 50 mL de água. Ajuste o pH da solução para a faixa de pH de (12-14), adicionando pastilhas de hidróxido de sódio ou de potássio. Adicione a mistura do indicador até que a solução adquira a coloração vinho. Titule com a solução de EDTA 0,01 M, agitando vigorosamente ou utilizando agitador magnético, até que a coloração da solução da amostra mude para cor verde persistente. Titule um branco preparado da mesma forma, com todos os reagentes utilizados na amostra. Calcule a concentração de cálcio, usando a fórmula a seguir. Cálculo VA = volume de EDTA gasto na tilulação da amostra, em mL VB = volume de EDTA gasto na titulação do branco, em mL Vb = volume do balão volumétrico para o qual a amostra foi transferida, em mL Va = alíquota da amostra usada na titulação, em mL IAL - 749 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital m = massa da amostra, em g M = molaridade do EDTA Referência bibliográfica E. MERCK AG. Métodos complexométricos de valoración con Titriplex. 3 ed. Darmstadt, Alemanha. p. 25. 397/IV Determinação espectrofotométrica de ferro com α-α’-dipiridila O método é aplicável a alimentos naturais e enriquecidos, e baseia-se na complexação do ferro (II) com α-α’-dipiridila e determinação por espectrofotometria na região do visível. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, mula, estufa, chapa aquecedora, balões volumétricos, cápsulas de porcelana, pipetas volumétricas e béqueres. Reagentes Ácido clorídrico para análise de traços de metais Ácido nítrico para análise de traços de metais Solução de α-α‘-dipiridila 0,1% – Dissolva 0,1 g de α-α‘-dipiridila em água destilada e deionizada e dilua a 100 mL. Este reagente é estável por várias semanas, se for mantido em local fresco e escuro. Solução-tampão acetato/ácido acético – Dissolva em água destilada e deionizada 8,3 g de acetato de sódio com baixo teor de ferro, previamente seco a 100ºC em estufa. Adicione 12 mL de ácido acético e dilua a 100 mL. Solução-padrão estoque de ferro (1000 mg/L) – Dissolva 3,512 g de sulfato de ferro II e amônio hexahidratado [Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O] em água destilada e deionizada. Adicione 2 gotas de HCl concentrado. Transira para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume. Nota: alternativamente, poderá ser utilizada solução-padrão de 1000 mg/L de Fe para espectrofotometria de absorção atômica. Solução-padrão intermediária de ferro (0,01 mg/mL) – Pipete 1 mL da solução- estoque 750 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos de ferro para um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 2 mL de HCl e complete o volume com água destilada e deionizada. Solução de cloridrato de hidroxilamina a 10% (m/v) – Dissolva 10 g de H2NOH.HCl em água destilada e deionizada e dilua a 100 mL. Procedimentos Ajuste do equipamento – Ajuste o espectrofotômetro UV/VIS conforme as instruções do fabricante, para leitura em 510 nm. Preparação da amostra – A quantidade de amostra a ser digerida deve ser proporcional à quantidade de ferro presente no alimento. O pré-tratamento e digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente. Dissolva as cinzas em 0,5 mL de ácido clorídrico. Aqueça, se necessário, para melhor dissolução. Transira com água destilada e deionizada para balão volumétrico de 25 mL e complete o volume. Prepare um branco da amostra. Curva-padrão – Em uma série de béqueres de 150 mL, pipete alíquotas de 1, 2, 5 e 10 mL da solução-padrão intermediária de Fe de 0,01 mg/mL, correspondentes às concentrações de 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 mg de ferro. Adicione 1 mL de solução de cloridrato de hidroxilamina a 10% m/v . Aqueça até a ebulição, durante 10 minutos. Esfrie e transira esta solução para um balão volumétrico de 50 mL. Adicione 5 mL de solução-tampão de acetato/ácido acético e 2 mL de α-α‘-dipiridila, a 0,1%. Complete o volume com água destilada e deionizada. Homogeneíze a solução. Prepare um branco da mesma forma, usando uma alíquota da solução de ácido clorídrico a 2% (essa alíquota deve ser igual à maior alíquota do padrão usado). Zere o equipamento com o branco e faça a leitura de absorbância das soluções-padrão em espectrofotômetro a 510 nm. Construa a curvapadrão, usando a regressão linear e calcule o coeiciente angular. Determinação – Pipete volume adequado da solução de amostra (de acordo com a quantidade de ferro na amostra ) para um béquer de 150 mL. Continue como em curva-padrão a partir de “...1 mL de solução de cloridrato de hidroxilamina a 10 % ...”. Prepare um branco da mesma forma com todos os reagentes usados na amostra. Espere 10 minutos para completar o desenvolvimento da cor vermelha. Leia a absorbância do branco e da amostra. Determine a quantidade de ferro, usando a fórmula a seguir. Cálculo IAL - 751 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A = absorbância da amostra A0 = absorbância do branco da amostra V = volume do balão onde foram transferidas as cinzas, em mL m = massa da amostra, em g a = coeiciente angular da curva-padrão V1 = volume da alíquota da amostra usada na reação, em mL Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1995, Chapter 32. p. 3-4. (method 944.02). 398/IV Determinação de fósforo por espectrofotometria na região do visível O método é aplicável à determinação de fósforo em alimentos. Baseia-se na complexação do fósforo com vanado-molibdato de amônio e determinação por espectrofotometria na região do visível. Material Espectrofotômetro UV/VIS, balança analítica, mula, estufa, chapa aquecedora, balões volumétricos, cápsulas de porcelana, pipetas volumétricas, provetas e béqueres. Reagentes Ácido clorídrico para análise de traços de metais Ácido nítrico para análise de traços de metais Solução-padrão estoque de fósforo (2,0 mg de P por mL) – Pese exatamente 4,3937 g de fosfato ácido de potássio (KH2PO4), seco a 105ºC em estufa por aproximadamente 2 horas. Transira quantitativamente para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Estoque sob refrigeração. Solução-padrão de trabalho de fósforo (0,1 mg de P por mL) – Pipete 5 mL da solução752 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos padrão estoque de fósforo em um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água destilada e deionizada. Prepare esta solução no dia do ensaio. Solução de vanado-molibdato de amônio – Pese, separadamente, 20 g de molibdato de amônio [(NH4)6 Mo7O24.4H2O] e 1 g de vanadato de amônio (NH4VO3). Dissolva cada sal em cerca de 300 mL de água quente e iltre, se necessário. Misture as duas soluções. Adicione 140 mL de HNO3 concentrado e complete o volume a 1000 mL com água destilada e deionizada. Nota: o reagente é estável, se acondiconado em frasco de polietileno. Quando estocado em frasco de vidro pode formar precipitado; neste caso, descarte o reagente. Procedimento Ajuste do equipamento – O espectrofotômetro UV/VIS deve ser ajustado conforme o manual de instruções do fabricante para leitura em 420 nm. Preparação da amostra - A quantidade de amostra a ser digerida deve ser proporcional à quantidade de fosfato presente no alimento. O pré-tratamento e a digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente. Dissolva as cinzas em 10 mL de ácido clorídrico e 1 a 2 mL de HNO3 concentrado. Leve à ebulição, por cerca de cinco minutos, em chapa quente para hidrolisar os polifosfatos. Resfrie e transira com água destilada e deionizada para balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Prepare um branco da amostra. Curva-padrão – Em uma série de balões volumétricos de 50 mL, pipete volumes da soluçãopadrão de trabalho contendo de 0,2 a 1,5 mg de fósforo (essas alíquotas podem variar de acordo com a sensibilidade e a faixa linear de trabalho do equipamento). Adicione 10 mL do reagente vanado-molibdato de amônio em cada balão. Complete o volume com água destilada e deionizada. Homogeneíze e espere 10 minutos para fazer a leitura. Prepare um branco dos reagentes da mesma forma. Zere o equipamento com o branco dos reagentes e leia a absorbância dos padrões. Faça a regressão linear e calcule coeiciente angular da curva. Determinação – Em um balão volumétrico de 50 mL, pipete uma alíquota adequada da amostra, de tal forma que a leitura da absorbância esteja compreendida na faixa linear da curva-padrão. Adicione 10 mL do reagente vanado-molibdato de amônio e complete o volume com água destilada e deionizada. Homogeneíze e espere 10 minutos para fazer a leitura. Calcule a quantidade de fósforo usando a fórmula a seguir. Cálculo IAL - 753 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A = absorbância da amostra A0 = absorbância do branco da amostra V = volume do balão onde foram transferidas as cinzas, em mL m = massa da amostra, em g v = volume da amostra em mL a = coeiciente angular da curva-padrão V1 = volume da alíquota da amostra usada na reação em mL Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 39. p. 4. (method 969.31). ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 50. p. 12. (method 986.24). 399/IV Determinação de chumbo por espectrometria de absorção atômica com chama Após a mineralização da amostra por via seca, o chumbo é concentrado por complexação com pirrolidina ditiocarbamato de amônio (APDC), extraído com metilisobutilcetona e quantiicado por espectrometria de absorção atômica com chama. Material Espectrômetro de absorção atômica com chama equipado com corretor de background, utilizando nebulizador de pérola de impacto e lâmpada de chumbo, mula, chapa aquecedora, balança analítica, estufa, balões volumétricos de 10, 50 e 100 mL, cápsulas de porcelana, pipetas automáticas com volume ajustável de 0,5 a 5 mL e pipetas automáticas com volume ajustável de 100 a 1000 μL. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Ácido clorídrico para análise de traços de metais MIBC (metilisobutilcetona) saturada com água – Abra o frasco contendo 1000 mL do solvente, adicione água destilada e deionizada até preencher o seu volume total. Agite. 754 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos Solução aquosa de APDC (pirrolidina ditiocarbamato de amônio) a 2% m/v – Dissolva 2 g de APDC em 100 mL de água destilada e deionizada. Esta solução deve ser preparada no dia do ensaio. Solução aquosa de ácido cítrico a 10% m/v – Dissolva 10 g de ácido cítrico em 100 mL de água destilada e deionizada. Esta solução deve ser preparada no dia do ensaio. Solução alcoólica de verde de bromocresol a 0,1% m/v – Dissolva 0,1 g de verde de bromocresol em 100 mL de álcool. Solução de hidróxido de amônio (1:1) v/v Solução de ácido nitríco 10% v/v Solução-padrão estoque de chumbo de 1000 mg/L Solução-padrão estoque intermediária de chumbo de 40 mg/L – Pipete 4 mL da soluçãopadrão de 1000 mg/L em balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com solução de HNO3 a 2% v/v. Solução-padrão de trabalho de chumbo de 0,8 mg/L – Pipete 2 mL da solução intermediária de chumbo, em balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com água destilada e deionizada. Esta solução deve ser preparada no dia do ensaio. Procedimento Preparação da amostra – O pré-tratamento e a digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente. Dissolva as cinzas com alíquota adequada de ácido clorídrico concentrado de modo que a concentração inal de ácido no balão seja 10%. Aqueça, se necessário, para melhor dissolução. Transira com água destilada e deionizada para balão volumétrico e complete o volume. Complexação e extração do chumbo – Em um balão volumétrico de 50 mL, pipete 5 mL da amostra dissolvida. Se necessário, utilize outra alíquota de modo que a leitura da absorbância ique dentro da faixa linear da curva-padrão. Adicione 1 mL da solução de ácido cítrico a 10% m/v e 3 gotas da solução do indicador verde de bromocresol. Neutralize com solução aquosa de NH4OH (1:1), até que a coloração da solução mude para azul (pH=5,4). Se ocorrer a formação de um precipitado devido ao excesso de NH4OH, dissolva com a adição de algumas gotas de HNO3 a 10% v/v. Adicione 2 mL de solução de APDC a 2% m/v e agite. Acrescente 2 mL de MIBC, agite o balão por cerca de 2 min e 30 s e adicione água destilada e deionizada até que a fase orgânica atinja a parte superior do gargalo do balão. Prepare o branco com todos os reagentes usados. Curva-padrão – Pipete em balões volumétricos de 50 mL, em triplicata, 0,25, 0,5, 1,0; IAL - 755 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 1,5; 2,0 e 2,5 mL da solução-padrão de trabalho de chumbo de 0,8 mg/L, correspondentes às concentrações inais de 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 mg/L. Ajuste do equipamento – Ajuste o espectrômetro de absorção atômica de acordo com o manual de instruções do fabricante, usando o comprimento de onda 283,3 nm e chama oxidante de ar/acetileno. Ajuste a chama e a nebulização para obtenção de máxima absorbância, utilizando a solução-padrão de chumbo de 0,8 mg/L. Complexação e extração dos padrões (curva-padrão) – Complexe e extraia as soluçõespadrão seguindo o procedimento da amostra. Prepare e extraia também um padrão de 0,8 mg/L, pipetando em balão de 50 mL, 400 μL do padrão de chumbo de 40 mg/L e extraia em 20 mL de MIBC. Esse padrão servirá para o ajuste do equipamento. Determinação – Zere o equipamento com o MIBC e faça a leitura das absorbâncias do branco e dos padrões. Estabeleça a curva-padrão usando regressão linear e calcule o coeiciente angular. Faça a leitura das amostras e calcule a concentração de chumbo usando a fórmula a seguir. Cálculo Aa = absorbância da amostra Ab = absorbância do branco da calibração a = absortividade, obtida a partir da curva-padrão V = volume do solvente orgânico, em mL V1 = volume do balão para o qual foi transferida a amostra, em mL V2 = volume da alíquota da amostra utilizada para a extração, em mL m = massa da amostra, em g Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed., v. 1: Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 9. p. 16. (method 973.35). 400/IV Determinação de cádmio por espectrometria de absorção atômica com chama O método é aplicável na determinação de cádmio em alimentos. A matéria orgânica é destruída por via seca, a cinza obtida é dissolvida em ácido clorídrico e o cádmio é determinado utilizando a técnica da espectrometria de absorção atômica com chama. Material 756 - IAL Capítulo XXIII - Minerais e Contaminantes Inorgânicos Espectrômetro de absorção atômica com chama equipado com corretor de background e lâmpada de catodo oco de cádmio, mula, chapa aquecedora, balança analítica, balões volumétricos de 10 e 100 mL, cápsulas de porcelana, pipeta automática com volume ajustável de 0,5 a 5,0 mL e pipeta automática com volume ajustável de 100 a 1000 μL. Reagentes Ácido nítrico para análise de traços de metais Ácido clorídrico para análise de traços de metais Solução-padrão estoque de cádmio de 1000 mg/L Solução-padrão estoque intermediária de cádmio de 100 mg/L - Pipete 10 mL da solução-padrão de 1000 mg/L em um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com solução de HNO3 a 2%. Procedimento Preparação da amostra – O pré-tratamento e digestão da amostra seguem os procedimentos de tratamento da amostra e do método 393/IV, respectivamente. Dissolva as cinzas em ácido clorídrico, de modo que, no volume inal do balão, a concentração inal de ácido seja 10 %. Aqueça se necessário e transira com água destilada e deionizada para balão volumétrico. Complete o volume. Curva-padrão – Em balões volumétricos de 100 mL, pipete (0,2; 0,5; 1 e 2) mL da solução-padrão intermediária de cádmio (que correspondem às concentrações inais de (0,2; 0,5; 1 e 2) mg/L e complete o balão com HCl 10%. Ajuste do equipamento – Ajuste o equipamento de acordo com o manual de instruções do fabricante usando como comprimento de onda 228,8 nm e chama oxidante de ar/ acetlileno. Ajuste a nebulização para obtenção de máxima absorbância, utilizando um dos padrões da curva-padrão. Determinação – Zere o equipamento com o branco, faça as leituras dos padrões, construa a curva-padrão e calcule o coeiciente angular. Faça a leitura das amostra e calcule a concentração usando a fórmula a seguir: Cálculo Aa = absorbância da amostra IAL - 757 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ab = absorbância do branco da amostra a = absortividade V = volume do balão no qual foi transferida a amostra, em mL m = massa da amostra, em g Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th ed., v. 1: Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 9. p. 16. (method 973.35). Colaboradores Alice Momoyo Sakuma, Carmen Silvia Kira, Franca Durante de Maio, Isaura Akemi Okada, Márcia Liane Buzzo, Maria Cristina Duran e Maria de Fátima Henriques Carvalho 758 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas CAPÍTULO XXIV MICOTOXINAS IAL - 759 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 760 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas XXIV MICOTOXINAS D evido aos graves problemas que as micotoxinas acarretam, muitos países têm estabelecido medidas para o seu controle nos alimentos destinados ao consumo humano e animal. Cada vez maior é o número de países que importam e exportam grandes quantidades de alimentos, e isto leva a novos desaios para a indústria alimentícia e para os órgãos reguladores responsáveis pelo cumprimento das normas relativas à inocuidade dos alimentos comercializados e à proteção dos consumidores. Micotoxinas são metabólitos tóxicos produzidos por alguns fungos denominados de fungos toxigênicos, sendo os principais representantes os dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Entre as principais micotoxinas de interesse na área de alimentos citamos: alatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumonisinas entre outras. As alatoxinas são as que apresentam maior importância sob o ponto de vista toxicológico. As micotoxinas são produzidas somente quando certas condições ambientais, tais como temperatura e umidade, além das características bioquímicas dos produtos que servem como substrato, são propícias para a sua produção. Outro fator muito importante na produção das micotoxinas é a integridade física do cereal. A contaminação poderá ocorrer mesmo em material armazenado, porque lesões mecânicas ou provocadas por insetos ou durante o processamento, tornam os cereais muito susceptíveis à proliferação de fungos. Em quase todas as matérias-primas destinadas a gêneros alimentícios, tais como: arroz, milho, feijão, trigo, cevada, soja, castanha-do-pará, nozes, amendoim, café, sorgo, semente de algodão, frutas, presunto, queijo, leite e até vinho, já foram detectados um ou mais tipos de micotoxinas. IAL - 761 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Por se tratar de importante problema de saúde pública, à análise de micotoxinas devem ser empregados métodos que proporcionem credibilidade e coniabilidade aos resultados analíticos emitidos pelo laboratório. Riscos no manuseio de micotoxinas A micotoxina pura na forma de cristal (sal), especialmente as alatoxinas, pela sua natureza eletrostática, tende a se dispersar na área do laboratório. Precauções especiais são necessárias para se evitar a contaminação do ar, bancadas, paredes e frascos. Recomenda-se lavar o local contaminado com solução de hipoclorito de sódio a 5% e acetona. Durante o manuseio das micotoxinas, torna-se necessário o uso de luvas e máscaras. O preparo de soluções-padrão a partir de micotoxinas na forma cristalina deve ser realizado em capela de exaustão de vapores orgânicos. Descontamine o material utilizado no laboratório com solução de hipoclorito de sódio a 5% e acetona antes de ser descartado. As micotoxinas e a amostragem O processo de amostragem, prévio à atividade laboratorial, é responsável pelo sucesso ou fracasso de uma informação analítica. Excetuando os líquidos, os outros produtos têm uma distribuição heterogênea quando contaminados. Sabe-se que as alatoxinas em um lote de amendoim podem estar concentradas em até 0,5% dos grãos e que alguns deles podem estar contaminados com teores excessivamente elevados. Até mesmo a distribuição destas micotoxinas em um único grão de amendoim não é uniforme e pode estar concentrada em uma pequena área supericial do grão. O conhecimento ou o estabelecimento prévio dos riscos envolvidos na amostragem, que é a etapa determinante na variação dos resultados analíticos, torna-se essencial para que todo processo de análise não seja invalidado e, na maioria das vezes, gerando resultados sem qualquer signiicado analítico. Considerando as alatoxinas como exemplo, por serem as mais estudadas, o erro de amostragem tem sido demonstrado ser grande. Os grãos individuais de amendoim podem conter esta micotoxina em até 1000000 ng/g, caroços de algodão mais do que 5000000 ng/g e grãos de milho até 400000 ng/g. Estes extremos na concentração de alatoxinas em unidades individuais do produto explica a grande variabilidade nos resultados de um lote em particular e a extensão do erro na amostragem. A literatura descreve vários planos de amostragem que, para aplicação em análises iscais torna-se inviável, mas como sugestão indicamos algumas referências, para análise de micotoxinas que integram a Resolução-RDC nº 274, de 15/10/2002, publicada no DOU em 16/10/2002 e de uma que consta da Diretiva da Comissão Européia: 1-Directive 98/53/EC 2-FAO Foods and Nutrition Paper, 55, Rome, 1993. 3-Norma FIL-IDF 50 B, 1985. Métodos de amostragem para leite e produtos lácteos. 762 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas 4-Norma ISO 950, 1979. Amostragem de cereais em grãos. 5-Waltking, A.E. Amostragem e preparação de amostras de manteiga de amendoim para análise de alatoxinas. J.A.O.A.C. 63:103-106, 1980. 401/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por cromatografia em camada delgada Este método baseia-se na extração com solvente orgânico, limpeza com celite e partição liquido-liquido, extração com clorofórmio, separação por cromatograia em camada delgada (CCD), quantiicação visual por comparação com padrão e conirmação por derivatização com ácido triluoroacético. O limite de quantiicação do método é 0,3 μg/L. Material Agitador mecânico horizontal, balança semi-analítica, banho-maria ou rotavapor, cabine com lâmpada UV onda longa (λ = 366 nm), capela de exaustão para solventes orgânicos, espectrofotômetro UV/VIS, bastão de vidro, balão volumétrico, béquer de 500 mL, cuba cromatográica, frasco Erlenmeyer de 500 mL, frasco âmbar de 5 mL, funil, funil de separação de 1000 mL, proveta de 100 mL, pipeta de 10 mL, microsseringas de 10, 25 e 100 μL, papel de iltro qualitativo e cromatofolha ou cromatoplaca de sílica gel G sem indicador de luorescência (20 x 20) cm. Reagentes Acetona Acetonitrila Ácido sulfúrico (1:3) Benzeno Celite Cloreto de sódio Clorofórmio Hexano Isopropanol Metanol Nitrogênio Alatoxina M1 padrão Sulfato de sódio anidro Tolueno Ácido triluoroacético – TFA Solução TFA – Misture ácido triluoroacético e hexano na proporção de 1:3 v/v Procedimento Preparação e veridicação de soluções-padrão – Proceda conforme 403/IV IAL - 763 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Preparação da amostra – Agite 75 mL de leite com 300 mL de metanol e 25 g de celite em frasco Erlenmeyer, por 30 minutos, em agitador mecânico horizontal. Filtre em papel de iltro, recolha a fase metanólica em funil de separação e adicione 225 mL de solução de cloreto de sódio a 4% m/v. Acrescente 100 mL de hexano e agite por 3 minutos. Recolha a fase metanólica e descarte a fase hexânica. Repita esta operação mais duas vezes. Adicione 100 mL de clorofórmio na fase metanólica e agite por três minutos e recolha o clorofórmio. Repita esta operação mais duas vezes. Junte as porções de clorofórmio em um funil de separação e adicione 300 mL de solução de cloreto de sódio a 4%. Agite e iltre a fase clorofórmica em papel de iltro com sulfato de sódio anidro. Recolha o clorofórmio, evapore até próximo à secura e transira, quantitativamente com clorofórmio, para um frasco âmbar. Evapore o conteúdo do frasco âmbar sob corrente de nitrogênio até resíduo e proceda à separação e quantiicação. Separação – Ressuspenda a AFM1 com 100 μL de tolueno-acetonitrila (9:1). Aplique, sobre a placa cromatográica, 20 μL deste extrato e também pontos de 1 a 5 μL de solução-padrão de AFM1 a 0,2 μg/mL. Desenvolva a placa em fase móvel de clorofórmioacetona-isopropanol (87:10:3). Seque a placa na temperatura ambiente e visualize sob luz UV ( =366 nm). Quantiicação – Compare a intensidade de luorescência da mancha da alatoxina M1 da amostra com as do padrão e os seus respectivos Rf, determinando qual mancha do padrão corresponde à da amostra. Se a intensidade da luorescência da amostra for maior ou menor que a dos padrões, dilua ou concentre e recromatografe. Conirmação – Para a conirmação da AFM1 é utilizado o ácido triluoroacético (TFA) conforme 402/IV. Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.12 th ed., Arlington: A.O.A.C., 1975, Chapter 26. p. 476 (method 26.084). ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.16 th ed., Arlington: A.O.A.C., 1995, Chapter 49. p. 3-4, 30-31, 34-35 (methods 970.44, 971.22, 980.21, 986.16). 402/IV Determinação de aflatoxina M1 em leite por CCD ou CLAE após separação em coluna de imunoafinidade Os mamíferos que ingerem alimentos contaminados com AFB1 e AFB2 secretam, em seu leite, produtos tóxicos resultantes da bioativação, conhecidos como micotoxinas do leite ou AFM1 e AFM2. 764 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Alatoxina M1 parece estar associada à fração protéica do leite (caseína), estando assim presente não somente nos tipos luido ou em pó como também em seus produtos derivados. Este método é aplicado para determinação de Alatoxina M1 em amostras de leite. O limite de quantiicação (LQ) do método é 0,02 μg/L. Material Cabine com lâmpada UV onda longa (λ =366 nm), capela de exaustão para solventes orgânicos, centrífuga, cromatógrafo líquido de alta eiciência, espectrofotômetro UV/VIS, suporte coletor de amostra a vácuo (Manifold), balão volumétrico, cuba cromatográica, frasco âmbar de10 mL, microsseringas de 10, 50, 100 e 500 μL, cromatofolhas ou cromatoplacas de sílica gel G sem indicador de luorescência (20 x 20) cm, proveta de 100 mL, seringas de vidro de 10 e 20 mL, tubo para centrífuga de polipropileno de 50 mL e vials para injetor automático de 1 mL. Reagentes Ácido acético glacial Ácido triluoroacético Acetona Acetonitrila, grau CLAE Ácido sulfúrico (1:3) Benzeno Clorofórmio Coluna de imunoainidade para AFM1 Coluna fase reversa (C18) para CLAE (25 x 0,4) cm Isopropanol Metanol, grau CLAE Nitrogênio Padrão de Alatoxina M1 Tolueno Solução-padrão de AFM1 – Proceda conforme 403/IV Procedimento Preparação e tratamento da amostra por CCD – Centrifugue 100 mL de leite por 15 minutos a 3000 rpm. Remova o sobrenadante e aqueça a (30-37)oC. Transira o leite centrifugado para uma seringa acoplada à coluna de imunoainidade, e passe a amostra lentamente pela coluna com o luxo de (2-3) mL/min sob pressão constante. Após passar IAL - 765 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital todo o volume, lave com 40 mL de água deionizada. Elimine toda a água residual da coluna e elua com 2,5 mL da solução de acetonitrila-metanol (3:2), retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e, em seguida, com 2,5 mL de metanol, invertendo suavemente o luxo por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra em um frasco âmbar. Evapore o extrato eluído sob corrente de nitrogênio. Separação por cromatograia em camada delgada, quantiicação e conirmação – Ressuspenda a AFM1 com 150 μL de tolueno-acetonitrila (90:10). Aplique, sobre a placa cromatográica, 50 μL do extrato da amostra e também 1 a 7 μL da solução-padrão de AFM1 a 0,2 μg/mL. Desenvolva a placa em clorofórmio-acetona-isopropanol (87:10:3). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento do solvente e deixe secar naturalmente ao ar. Sob luz UV (λ=366 nm), localize as manchas luorescentes indicativas da presença de AFM1. Manchas luorescentes com o mesmo Rf e mesma tonalidade do padrão indicam resultados positivos presuntivos. Efetue a quantiicação por comparação visual da intensidade de luorescência da mancha suspeita com a do padrão. Se a intensidade de luorescência da mancha da amostra for maior ou menor que a dos padrões, dilua ou concentre a amostra e recromatografe. Pulverize a placa com H2SO4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV longa. A luorescência da AFM1 muda de azul para amarelo, indicando a presença da referida micotoxina. Para a conirmação da AFM1 é utilizado o ácido triluoroacético (TFA). Reação com ácido triluoroacético-hexano (1+3) – Divida uma placa verticalmente em duas regiões e em cada uma delas cromatografe dois pontos da amostra e dois do padrão. Em uma das regiões sobreponha 1 μL da solução de TFA em um dos pontos da amostra e em um dos padrões. Aqueça a placa por 10 minutos a (35 - 40)°C e desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona (85+15). Examine a placa sob lâmpada UV longa. A AFM1 com TFA aparecerá em 1/3 do Rf da alatoxina original. Preparação e/ou tratamento da amostra por CLAE – Centrifugue 50 mL de leite por 15 minutos a 3000 rpm. Remova o sobrenadante e aqueça a (30-37)oC. Transira o leite centrifugado para uma seringa acoplada à coluna de imunoainidade e passe a amostra lentamente pela coluna, luxo de (2-3) mL/min sob pressão constante. Após passar todo o volume, lave com 10 mL de água. Elimine toda a água residual da coluna e elua com 1,25 mL da solução de acetonitrila-metanol (3:2), retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e em seguida 1,25 mL de metanol, invertendo o luxo suavemente por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra eluída em um frasco âmbar. Evapore a amostra eluída sob corrente de nitrogênio até resíduo para o procedimento de separação e quantiicação. 766 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Separação por CLAE, quantiicação e conirmação – Ressuspenda a AFM1 com 500 μL da mistura de ácido acético 1%-acetonitrila-metanol (40:35:25) e injete 20 μL desta solução na coluna cromatográica. A fase móvel utilizada é ácido acético 2%-acetonitrilametanol (40:35:25) por 10 minutos, luxo de 1,0 mL/min; detector de luorescência com comprimentos de onda de excitação de 360 nm e de emissão de 430 nm. A temperatura da coluna é de 35°C. O tempo de retenção da AFM1 é de aproximadamente 3,1 minutos. É importante a injeção do padrão de AFM1 antes do início da análise, veriicando o tempo de retenção e a resposta com a curva de calibração construída. Cálculo Para o cálculo da concentração de AFM1 é necessária a integração do pico e a comparação do valor encontrado com a curva de calibração construída (o equipamento já fornece) ou de acordo com seguinte fórmula: H = altura do pico da amostra H’ = altura do pico do padrão C’ = concentração do padrão (ng/μL) VI’ = volume injetado do padrão VI = volume injetado da amostra V = total do volume inal da amostra (μL) W = volume de leite representado no inal do extrato (mL) Referências bibliográficas APPLEBAUM, R.S.; BRACKETT, R.E.; WISEMAN, D.W.; MARTH, E.H. Alatoxin: toxicity to dairy cattle and ocurrence in milk and milk products – a review. J. Food Prot., v. 45, n. 8, p. 752-777, 1982. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.16 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1995, chapter 49. p. 3-4, 30-31, 34-35 (methods 970.44, 971.22, 980.21, 986.16). BARNES, J.M. Alatoxins as health hazard. J. Appl. Bacteriol. v. 33, p. 285-298, 1970. IAL - 767 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital DRAGACCI, S.; GROSSO, F., GILBERT, J. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxin M1 in Liquid Milk: Collaborative Study. Journal of A.O.A.C. International, v. 84, n. 2, p. 437-443, 2001. GALVANO, F.; GALOFARO, V.; GALVANO, G. Occurrence and stability of Aflatoxin M1 in milk and milk products: a worldwide review. J. Food Prot., v. 59, n. 10, p. 1079-1090, 1996. 403/IV Determinação de aflatoxinas por cromatografia em camada delgada Este método é aplicado para a determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em sementes oleaginosas, cereais e seus produtos e também em rações. As aflatoxinas são extraídas com clorofórmio e com posterior remoção de interferentes por partição líquida com metanol-água-hexano. Os componentes são determinados pela comparação da intensidade de fluorescência das amostras com a dos padrões por cromatografia em camada delgada. O método pode alcançar um limite de detecção de 2,0 µg/kg (ppb) e limite de quantificação de 3,0 µg/kg (ppb). Material Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico, gabinete com lâmpada ultravioleta de 15 watts e comprimento de onda 366 nm, balança analítica, balança semi-analítica, agitador mecânico, banho-maria com temperatura controlada ou rotavapor, estufa, banho ultra-som, cilindro de nitrogênio, moinho ou liquidificador, peneiras de 20 mesh, capela para solventes orgânicos, béqueres de 10 e 25 mL, frascos Erlenmeyer de 25 mL e de 250 ou 300 mL, provetas 50 e 100 mL, bastão de vidro, funil de vidro, papel de filtro Whatman n° 4 ou equivalente, funil de separação de 250 ou 500 mL com torneira de teflon, pipeta graduada 10 mL, microsseringas de 10, 25 e 500 µL, cuba cromatográfica de vidro para placas de (20 x 20) cm, pulverizador para placas cromatográficas, balões volumétricos de 50 e 2000 mL, pipetas volumétricas de 1 e 25 mL e cromatoplacas ou cromatofolhas (20 x20) cm de sílica gel G sem indicador de fluorescência Reagentes Metanol Clorofórmio Hexano Acetonitrila Benzeno 768 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Tolueno Acetato de etila Ácido fórmico Acetona Hhylo-super cel, tipo celite ou equivalente Solução de NaCl ou KCl 4% m/v Ácido sulfúrico Ácido triluoroacético (TFA) Solução de TFA-hexano (1:3), recém-preparada Sistema de solventes para desenvolvimento da cromatograia em camada delgada: Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) Acetona-clorofórmio (10:90) Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (60:30:10) Clorofórmio-acetona-isopropanol (85:12,5:2,5) Benzeno-metanol-ácido acético (90:5:5) Solução aquosa de ácido sulfúrico (1+3) Soluções-padrão de alatoxinas – Dissolva os padrões de B1, B2, G1 e G2 com volumes adequados da mistura benzeno-acetonitrila (98:2), para que se obtenha concentrações aproximadas de (1,0 a 2,5) μg/mL. Solução de ácido sulfúrico 0,009 M – Pipete 1 mL de ácido sulfúrico, transira para um balão de 2000 mL e complete o volume com água . Solução A (K2Cr2O7 0,25 mM) – Pese aproximadamente 78 mg de dicromato de potássio previamente dessecado e dissolva em 1000 mL de ácido sulfúrico 0,009 M. Solução B (K2Cr2O7 0,125 mM) – Pipete 25 mL da Solução A, transira para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Solução C (K2Cr2O7 0,0625 mM) – Pipete 25 mL da Solução B, transira para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Procedimento Avaliação de desempenho do espectrofotômetro – Leia as absorbâncias das soluções A, B e C a 350 nm, usando como branco a solução de ácido sulfúrico 0,009 M. IAL - 769 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo do fator de correção do espectrofotômetro: A*= absorbâncias das soluções A, B e C, calculadas separadamente C = concentração das soluções A, B e C em mM CF = fator de correção O intervalo de aceitabilidade do CF: 1,05 > CF > 0,95 Nota: se o valor de CF estiver fora dos padrões, cheque novamente o método; se o valor persistir, o aparelho está descalibrado e necessita de reparo técnico. Veriicação da concentração dos padrões de micotoxinas – Após a dissolução dos padrões em seus respectivos solventes, leia as absorbâncias nos comprimentos de onda de máxima absorção (Tabela 1) e determine a concentração usando a seguinte fórmula: A = absorbância CF = fator de correção do aparelho PM = peso molecular da micotoxina (Tabela 1) ε = absortividade molar da micotoxina (Tabela 1) 770 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Tabela 1 – Propriedades físico-químicas de algumas micotoxinas Solventes* Comprimento de onda (λ) nm Absortividade Molar (ε) Alatoxina B1 1 2 3 4 5 360 350 350 345 350 21800 19800 20600 20300 19100 Alatoxina B2 1 2 362 350 24000 20900 314 Alatoxina G1 1 2 362 350 17700 17100 328 Alatoxina G2 1 2 362 350 19300 18200 330 Alatoxina M1 6 350 18815 328 Micotoxinas Solvente 1 Solvente 2 Solvente 3 Solvente 4 Solvente 5 Solvente 6 = = = = = = Peso molecular 312 metanol benzeno-acetonitrila (98:2) clorofórmio heptano tolueno benzeno-acetonitrila (9:1) Notas Recomenda-se a substituição do solvente contendo benzeno por um outro menos tóxico. A veriicação dos padrões deve ser efetuada de acordo com a periodicidade do uso. Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, a im de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar liqüidiicador, moinho ou moedor de carne. Passe a amostra pela peneira de 20 mesh. Homogeneíze novamente e retire uma sub-amostra de 30 g. Extração e puriicação – Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e transira para um frasco Erlenmeyer. Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60oC para facilitar a penetração do solvente orgânico nos tecidos hidrofílicos. Homogeneíze com bastão de vidro. Adicione 100 mL de clorofórmio, tampe o frasco com algodão e agite manualmente por 30 segundos. Prossiga esta operação com agitador mecânico por mais 30 IAL - 771 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital minutos. Filtre o extrato clorofórmico em funil de vidro com papel de iltro qualitativo. No caso de amostra de amendoim ou derivados, adicione pequena quantidade de celite ao funil para acelerar a iltração. Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer e evapore em banho-maria a 80oC até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado. Ressuspenda o resíduo com 50 mL de metanol, transira quantitativamente para o funil de separação, adicione 50 mL da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gorduras e os demais interferentes com três porções de 50 mL de hexano. Descarte a fração com hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco Erlenmeyer. Transira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e extraia as alatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de separação suavemente por três minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a inferior (clorofórmio) em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Repita a operação com mais 50 mL de clorofórmio. Recolha o total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banhomaria a 80oC ou rotavapor a (50-60)°C. O resíduo deve ser transferido quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL e evaporado sob corrente de nitrogênio. Para efetuar a cromatograia em camada delgada, dissolva o resíduo em clorofórmio em quantidade adequada, normalmente entre 200 a 500 μL e utilize banho de ultra-som por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das alatoxinas. Triagem das micotoxinas por cromatograia em camada delgada – Aplique em placa de sílica gel, 5 a 10 μL da amostra e alguns pontos de cada padrão, separadamente, fazendo sobrepor no segundo ponto do padrão 5 μL da amostra. Desenvolva o cromatograma em cuba previamente preparada para garantir a saturação com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento do solvente e seque. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo. Amostras suspeitas de conterem alatoxinas devem ser quantiicadas e conirmadas separadamente. Quantiicação – Aplique, nas placas 1, 3, 5, 7 μL dos padrões e 5 e 10 μL de cada amostra. Desenvolva as placas em clorofórmio-acetona (90:10) ou em tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Compare a intensidade da luorescência da mancha da micotoxina da amostra com a dos padrões e determine qual das manchas da amostra corresponde a do padrão. Se a intensidade da luorescência da mancha de menor volume utilizado da solução de amostra for maior do que a do padrão, dilua a amostra e recromatografe. Conirmação da identidade das alatoxinas – Realize a cromatograia bi-dimensional, utilizando a fase 1: clorofórmio-acetona-hexano (85:15:20) ou clorofórmio-acetona (90:10) e a fase 2: tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) e faça o teste químico com ácido sulfúrico (1+3) e reação com ácido triluoroacético, descrito a seguir: 772 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas a) teste químico – Pulverize a placa com solução aquosa de H2SO4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV (comprimento de onda longo). A luorescência das alatoxinas muda de azul (AFB) ou verde (AFG) para amarelo. Este teste somente conirma a ausência de alatoxinas. b) reação com TFA (ácido triluoroacético) – Divida uma placa verticalmente em duas regiões e em cada um delas cromatografe dois pontos de amostra e dois de padrões. Em uma das regiões, sobreponha 1 μL de solução de TFA em um dos pontos da amostra e em um dos pontos do padrão. Aqueça a placa por 10 minutos a (35-40)oC e desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona (85+15) ou clorofórmio-acetona-isopropanol (85:12,5:2,5). Examine a placa sob lâmpada UV de comprimento de onda longo. A alatoxina com TFA forma um hemi-acetal cujo Rf é 1/3 do Rf da alatoxina original. Utilizando-se TFA, a alatoxina B1 transformar-se-à em alatoxina B2a e a alatoxina G1 em G2a. Este teste é decisivo para conirmação da identidade das alatoxinas B1 e G1. Cálculo S = μL de micotoxina padrão, de luorescência igual à da amostra Y = concentração-padrão da micotoxina em μg/mL V = μL de solvente requerido para diluir o extrato inal Z = μL da mancha do extrato da amostra que deu intensidade de luorescência igual à do padrão. W = gramas de amostra contidas no extrato inal. Notas O material contaminado deve ser tratado com hipoclorito de sódio a 5% e acetona, antes de ser descartado e lavado. Enxágüe bem todo material para que não ique nenhum resíduo do oxidante utilizado. Como alternativa, deixe o material contaminado por um período mínimo de 30 minutos em uma solução de hidróxido de sódio a 5%. As alatoxinas são hepatotóxicas e carcinogênicas; portanto a análise deve ser realizada em capela de exaustão apropriada, com máscara e luvas de borracha. Ao triturar ou moer as amostras, use máscara apropriada para não inalar o pó. Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990, chapter 49. p. 1184-1199. IAL - 773 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1, Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 2a ed. São Paulo: IMESP, 1976. p. 323-325. PRZYBYLSKI, W. Formation of alatoxin derivatives on thin-layer chromatographic plates. J. Assoc. Off. Analyt. Chem., v. 58, p. 163-164, 1975. VELASCO, J. Replacement of benzene as a solvent for alatoxin standards. J. Am. Oil Chem. Soc., p. 938A-940A, 1981. STACK, M.E.; POHLAND, A.E. Colaborative study of a method for chemical conirmation of the identity of alatoxin. J. Assoc. Off. Analy. Chem., v. 58, p. 110113, 1975. 404/IV Determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 por CCD após separação em coluna de imunoafinidade O objetivo do método refere-se à determinação das alatoxinas B1, B2, G1 e G2 em milho, amendoim e produtos derivados. As alatoxinas são extraídas com solução aquosa de metanol e puriicadas em uma coluna de imunoainidade, onde anticorpos monoclonais especíicos ligam-se aos antígenos, as alatoxinas, sendo posteriormente eluídas, cromatografadas em placas de sílica gel e visualizadas as luorescências sob luz ultravioleta. O limite de quantiicação (LQ) do método é 2 μg/kg. Material Liqüidiicador, provetas, balança semi-analítica, coluna de imunoainidade para alatoxinas, funil, manifold, béqueres, frasco âmbar, papel de iltro Whatman no 4, seringas de vidro de 10 mL, pipeta de 2 mL, cromatoplacas, microsseringas e cuba cromatográica. Reagentes Metanol Metanol, grau CLAE Cloreto de sódio Procedimento Preparação da amostra – Pese 50 g da amostra previamente triturada, e 4 g de NaCl, e 774 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas transira para o copo do liqüidiicador juntamente com 250 mL de uma solução de metanol-água deionizada (60:40). Triture por 1 minuto em alta velocidade. Ao término deste tempo, adicione 250 mL de água deionizada. Misture e iltre aproximadamente (25 a 50) mL em papel de iltro Whatman no 4. Transira 10 mL do iltrado para a seringa de vidro acoplada à coluna de imunoainidade sobre o manifold. Na coluna de imunoainidade, passe a amostra em um luxo de 2 a 3 mL por minuto, lave com 20 mL de água deionizada e elimine toda a água residual da coluna. Elua as alatoxinas passando 2 mL de metanol e colete em frasco âmbar. Evapore até à secura sob corrente de nitrogênio. Cromatograia em camada delgada – Ressuspenda o resíduo em clorofórmio ou toluenoacetonitrila (9:1) em quantidade adequada, normalmente 100 μL e utilize banho de ultra-som por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das alatoxinas. Aplique, em cromatofolha ou cromatoplaca de sílica gel, 10 μL da amostra, duas vezes. Sobre a 2ª mancha do extrato, aplique uma quantidade adequada dos padrões (B1+B2+G1+G2). Na mesma placa aplique: 1, 3, 5 e 7 μL de padrão de alatoxinas. Desenvolva o cromatograma em cuba cromatográica previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1) ou clorofórmio-acetona (9:1). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar naturalmente ao ar. Sob luz UV de comprimento de onda longa, localize as manchas luorescentes com o mesmo Rf e mesma tonalidade do padrão. As amostras suspeitas de conterem alatoxinas devem ser quantiicadas e conirmadas. Quantiicação – Para a quantiicação de alatoxinas, separe-as previamente desenvolvendo as placas em clorofórmio-acetona (9:1) ou tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1). Compare a intensidade da luorescência da mancha da amostra com a do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a uma dos padrões. Se a intensidade da luorescência da mancha de menor volume de amostra for maior que a do padrão, faça a diluição necessária e recromatografe. Teste conirmatório da presença de alatoxinas – Poderá ser realizado pelas seguintes técnicas: a) reação com ácido sulfúrico – Pulverize a placa com H2SO4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV. A luorescência da alatoxina muda de azul (AFB1) ou verde (AFG1) para amarelo. Este teste somente conirma a ausência de alatoxinas nas amostras que não mudarem para a cor amarela. b) reação com TFA (ácido triluoroacético) – Marque uma placa verticalmente, dividindo-a em duas regiões e em cada uma delas cromatografe dois pontos de amostra e dois de padrão. Em uma das regiões, sobreponha 1 μL de TFA em um dos ponIAL - 775 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital tos da amostra e em um dos pontos dos padrões. Aqueça a placa por 10 minutos a (35-40)°C e desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona (85:15). Examine a placa sob a lâmpada UV. A mancha da alatoxina com TFA apresentará Rf igual a 1/3 do Rf original. Referências bibliográficas R-BIOPHARM RHÔNE LTD. OCHRAPREP®: Quantitative Detection of Ochratoxin A. 5 p. INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER. Laboratory Decontamination and Destruction of Alatoxins B1, B2, G1, G2 in Laboratory Wastes. Lyon: WHO, 1989. (IARC n. 37). FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Sampling plans for aflatoxins and analysis in peanuts and corn. Rome: FAO, 1993 (FAO Food and Nutrition Paper, 55). ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990, Chapter 49, p. 1184-1199. 405/IV Determinação de desoxinivalenol Os tricotecenos são micotoxinas que afetam o maior número das funções biológicas dos animais contaminados: sistema nervoso, aparelho digestivo, regiões produtoras de componentes sangüíneos e pele. A intoxicação pela referida micotoxina é caracterizada por vômito, inlamação, hemorragia, recusa alimentar, diarréia, aborto, mudanças hematológicas, angina necrótica, desordens nervosas e destruição da medula óssea. O princípio do método baseia-se na extração da micotoxina com mistura de solventes, puriicação em uma coluna de carvão, eluição, cromatograia em cromatoplacas de sílica gel G, derivatização com AlCl3 e visualização do composto luorescente formado. Material Frascos Erlenmeyer de 10, 25, 50 e 500 mL, provetas de 50, 100 e 200 mL, pipeta, funil de vidro, funil de separação, coluna cromatográica, placa de vidro, lâmpada UV, microsseringa, bomba de vácuo e kitassato de 125 mL. 776 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Reagentes Padrão de desoxinivalenol (DON) Acetonitrila Clorofórmio Acetona Isopropanol Tricloreto de alumínio Alumina ativada Carvão ativo Celite Sílica gel G 60 Hexano Solução de AlCl3 a 15% m/v – Pese 15 g de tricloreto de alumínio. Transira para um balão volumétrico de 100 mL, dissolva e dilua ao volume com a mistura de etanol-água (1:1). Solução-padrão de DON – Dissolva o padrão em acetato de etila tal que a concentração inal seja aproximadamente 100 μg/mL. Procedimento Veriicação da concentração da solução-padrão de DON – Faça a leitura da absorbância no espectrofotômetro UV/VIS a 260 nm e calcule a concentração de DON conforme fórmula abaixo: A = absorbância PM = peso molecular do padrão f = fator de correção do aparelho ε = absortividade molar do DON em acetato de etila (1410) Preparação da amostra – Pese 50 g de amostra moída. Adicione 200 mL da mistura de acetonitrila-água (84:16) e deixe em contato com agitação mecânica por 30 minutos. Filtre e transira 20 mL do iltrado para funil de separação. Extraia a gordura com hexano três vezes com 50 mL (o hexano ica na parte superior). Reserve o extrato e passe pela coluna cromatográica. IAL - 777 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Preparação da coluna cromatográica – Coloque lã de vidro na parte inferior da coluna, em quantidade suiciente para bloquear a fase estacionária. Pese e homogeneíze em um frasco Erlenmeyer de 25 mL, a mistura de 0,7 g de carvão ativo, 0,5 g de alumina e 0,3 g de celite. Coloque esta mistura aos poucos, na coluna cromatográica com ajuda da bomba de vácuo. Lave a coluna com 10 mL da solução de acetonitrila-água (84:16) e descarte o solvente de lavagem. Passe os 20 mL do iltrado na coluna e lave com 10 mL de solução de acetonitrila-água (84:16) e recolha o extrato em frasco Erlenmeyer de 50 mL. Evapore em banho-maria até secagem. Elua, em frasco Erlenmeyer de 10 mL, com ± 5 mL de acetato de etila e evapore em banho-maria sob corrente de nitrogênio. Elua o resíduo com 200 μL de uma mistura de clorofórmio-acetonitrila (4:1). Aplique na cromatoplaca de sílica gel G sem indicador de luorescência, 10, 20, 30 μL da amostra e 5 e 10 μL do padrão. Desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona-isopropanol (80:10:10). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar naturalmente ao ar. Pulverize com solução de AlCl3 a 15%. Aqueça em estufa a 120°C durante 7 minutos e observe sob luz UV longa. Quantiicação – Compare a intensidade da luorescência da mancha de desoxinivalenol da amostra com as do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a uma das do padrão. Se a intensidade da luorescência da mancha correspondente ao menor volume aplicado de amostra for maior que a do padrão, a amostra deverá ser diluída convenientemente e recromatografada. Cálculo S = μL da solução-padrão de micotoxina com mancha com luorescência igual à da amostra Y = concentração da micotoxina padrão em μg/mL usada na cromatograia V = μL do solvente requerido para diluir o extrato inal Z = μL do extrato da amostra com mancha de intensidade da luorescência igual a do padrão W = gramas de amostra contida no extrato inal. Referências bilbiográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: 778 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas A.O.A.C., 1990, Chapter 49. p. 1205. (method 986.17). SABINO, M.; ICHIKAWA, A.H.; INOMATA, E.I.; LAMARDO, L.C.A. Determinação de deoxinivalenol em trigo e milho em grão por cromatograia em camada delgada. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 49. n. 2. p.155-159, 1989. TRUCKSESS, M.W.; NESHEIM, S.; EPPLEY, R.M. hin layer chromatographic determination of deoxynivalenol in wheat and corn. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 67. p. 403, 1984. 406/IV Determinação de fumonisina B por CCD ou CLAE, após separação em coluna de imunoafinidade Fumonisina B1 é produzida principalmente por Fusarium moniliforme e este método é aplicável para a determinação desta toxina em milho e produtos derivados, utilizando coluna de imunoainidade, onde anticorpos monoclonais especíicos ligam-se aos antígenos, as fumonisinas, sendo posteriormente eluídos e separados pelas técnicas: cromatograia em camada delgada (LQ: 1 mg/kg) ou por cromatograia liquida de alta eiciência (LQ=0,78 mg/kg). Material Balança analítica, balança semi-analítica, provetas, liqüidiicador, funil, papel de microibra, coluna de imunoainidade para fumonisina, cromatógrafo líquido de alta eiciência, frasco âmbar, placa cromatográica de fase reversa (RP 18), microsseringas, manifold e coluna cromatográica de fase reversa C18. Reagentes Metanol Cloreto de sódio Bicarbonato de sódio Tween 20 Acetonitrila, grau CLAE Cloreto de potássio 4% m/v Ácido bórico Ácido acético glacial Fluorescamine o-Ftaldialdeído (OPA) 2-Mercaptoetanol Hidróxido de sódio IAL - 779 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Solução-tampão borato de sódio 1 M – Pese 3,8 g de tetraborato de sódio, transira para um balão volumétrico de 100 mL, dissolva e complete o volume com água deionizada e corrija o pH para 10,4 com hidróxido de sódio 0,1 M. Solução de luorescamine 0,04% – Dissolva 2 mg de luorescamine em 5 mL de acetonitrila Reagente de derivatização (OPA) – Pese 40 mg de o-ftaldialdeído e dissolva em 1 mL de metanol e dilua com 5 mL da solução-tampão. Adicione 50 μL de 2-mercaptoetanol e misture. Estoque este reagente em um frasco âmbar vedado com papel alumínio sob temperatura de (5-15)oC. Nestas condições, o reagente de derivatização é estável por uma semana. Solução de hidróxido de sódio 0,1 M – Dissolva 2 g de hidróxido de sódio em 500 mL de água deionizada. Solução de ácido bórico 0,01 M – Misture 30,92 mg de ácido bórico em 50 mL de água deionizada. Solução de cloreto de potássio 4% m/v – Dissolva 20 g de cloreto de potássio em 500 mL de água deionizada. Solução de extração – Misture 8 volumes de metanol com 2 volumes de água deionizada. Solução de diluição – Dissolva 12,5 g de cloreto de sódio, 2,5 g de bicarbonato de sódio e 0,05 mL de Tween 20 em 500 mL de água deionizada. Solução de ressuspensão – Misture 1 volume de acetonitrila com 1 volume de água. Fase móvel para CCD – Misture 7,5 volumes de metanol com 2,5 volumes de cloreto de potássio a 4%. Solução-padrão de FB1 (50 μg/mL) – Dissolva 0,1 mg de fumonisina B1 em 100 mL da solução de acetonitrila-água (1:1). Procedimento – Pese 25 g da amostra triturada e tamisada (20 mesh). Transira para o copo de um liqüidiicador ou similar, adicione 2,5 g de cloreto de sódio e 50 mL da mistura metanol-água (8:2). Passe 10 mL do iltrado pela coluna de imunoainidade, com luxo de aproximadamente 3 mL/minuto. Lave a coluna com 10 mL de solução de diluição, seguido por 10 mL de água deionizada. A FB1 deve então ser eluída da coluna 780 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas com 2 mL de solução de extração em frasco âmbar com capacidade de 4 mL. Evapore o eluato sob corrente de nitrogênio comum, podendo utilizar um banho-maria aquecido até 60°C. Armazene o resíduo à temperatura inferior a 4°C até o momento de se efetuar a cromatograia. Cromatograia em camada delgada – Ressuspenda o resíduo da amostra com 100 μL de acetonitrila-água (1:1), agite durante 1 minuto. Aplique, na cromatoplaca de fase reversa, 10 μL deste extrato e também 2, 3, 5, 7 e 10 μL do padrão. Desenvolva a placa em solução de metanol-KCl 4% (7,5:2,5). Remova a placa, após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar à temperatura ambiente ou com corrente de ar aquecido. Nebulize a cromatoplaca com solução-tampão e, em seguida, pela solução de luorescamine. Espere 1 minuto e nebulize com a solução de ácido bórico-acetonitrila. Seque e observe sob luz UV longa. A FB1 pode ser identiicada pela presença de pontos amarelo-esverdeados com Rf aproximadamente 0,57. Para quantiicar, compare a intensidade da luorescência da mancha da amostra com a do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a uma das do padrão. Se a intensidade da luorescência da mancha de menor volume da amostra for maior do que a do padrão, a amostra deve ser diluída e recromatografada. CLAE - Ressuspenda o resíduo da amostra com 800 μL de acetonitrila-água (1:1) e, segundos antes da injeção, adicione 200 μL de solução de OPA, completando assim 1 mL de solvente. Injete 20 μL desta solução na coluna cromatográica (fase reversa C18). A fase móvel utilizada é ácido acético 1%-acetonitrila (50:50) por 15 minutos, luxo de 0,8 mL/min, detector de luorescência com comprimentos de onda de excitação de 335 nm e de emissão de 440 nm. A temperatura da coluna é 25oC. O tempo de retenção da FB1 é de aproximadamente 8,1 minutos. Nota: é importante que a injeção do padrão de FB1 seja antes do início da análise, veriicando o tempo de retenção e a resposta com a curva-padrão construída. Cálculo Para o cálculo da concentração de FB1 é necessária a integração do pico e a comparação do valor encontrado com a curva-padrão construída ou fornecida pelo equipamento ou de acordo com seguinte fórmula: H e H’ = alturas dos picos da amostra e do padrão C’ = concentração do padrão (ng/μL) IAL - 781 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital VI’ e VI = volumes injetados do padrão e da amostra V = total do volume inal da amostra (μL) W = quantidade de amostra representado no inal do extrato (g) Referências bibliográficas CAMARGOS, S.M. Fumonisinas em cultivares de milho no Estado de São Paulo: inluência das características do cultivar e das condições climáticas. 2000. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade de Campinas, Campinas. SYDENHAM, E.W. et al. Fumonisin contamination of commercial corn-based human foodtuffs. J. Agric. Food Chem. v. 39, p. 2014-2018, 1991. SYDENHAM, E.W. et al. Liquid chromatographic determination of fumonisins B1, B2 and B3 in corn: A.O.A.C. - IUPAC collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. v. 79, n. 3, p. 688-696, 1996. 407/IV Determinação de aflatoxinas, ocratoxina A e zearalenona por cromatografia em camada delgada O método é aplicado para a determinação simultânea de aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ocratoxina A e zearalenona em diversos alimentos. O limite de quantificação do método é 2,0 µg/kg. Material Espectrofotômetro UV/VIS, lâmpada ultravioleta de 15 Watt com comprimentos de onda curto e longo, balança analítica, balança semi-analítica, liqüidificador, moinho, banho-maria com temperatura controlada, estufa, banho de ultra-som, peneira de 20 mesh, cilindro de nitrogênio comum, capela com exaustão para vapores orgânicos, béqueres de 100 e 500 mL, frascos Erlenmeyer de 25 e 50 mL, provetas de 10, 50, 100, 200 e 300 mL, bastão de vidro, funil de vidro, papel de filtro qualitativo com filtração rápida, funil de separação de 500 mL com torneira de teflon, micro-seringas de 10, 50 e 500 µL, cuba cromatográfica para placas de (20 x 20) cm e pulverizador, balões volumétricos de (50 e 2000) mL e pipetas volumétricas de (1 e 25) mL Reagentes Álcool Metanol Clorofórmio Cromatofolhas ou cromatoplacas de sílica gel G 60 de (20 x 20) cm e 0,25 mm de espessura Hyflo-supercel , celite ou equivalente Solução de KCl ou NaCl 4% m/v 782 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Solução de sulfato cúprico a 10% m/v (clariicante) Solução de sulfato de amônio a 30% m/v (clariicante) Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (60:40:10) Acetona-clorofórmio (1:9) Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1) Hexano-acetato de etila-clorofórmio-ácido fórmico (35:25:25:10) Benzeno-metanol-ácido acético (90:5:5) Solução de cloreto de alumínio – Pese 20 g de AlCl3.6H2O, transira para um balão volumétrico de 100 mL, dissolva em álcool a 74% e complete o volume com o mesmo solvente. Solução de ácido triluoroacético (TFA) com hexano 1:3, recém-preparada. Solução aquosa de ácido sulfúrico (1+3) Hidróxido de amônio Triluoreto de boro a 14% m/v, em metanol Soluções-padrão de alatoxinas B1, B2, G1 e G2 – Prepare soluções com concentrações aproximadas a 1 μg/mL, utilizando os solventes da tabela 1. Solução-padrão de ocratoxina A – Prepare uma solução de concentração aproximada de 1 μg/mL, utilizando solventes da Tabela 1. Solução-padrão de zearalenona – Prepare uma solução de concentração aproximada de 70 μg/mL, utilizando solventes da Tabela 1. Solução de ácido sulfúrico 0,009 M – Pipete 1 mL de ácido sulfúrico e transira para balão de 2000 mL e complete o volume com água. Solução A (solução de dicromato de potássio 0,25 mM) – Pese aproximadamente 78 mg de dicromato de potássio previamente dessecado e dissolva em 1000 mL de ácido sulfúrico 0,009 M. Solução B – Pipete 25 mL da solução A e transira para um balão de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Solução C – Pipete 25 mL da solução B e transira para balão de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M. IAL - 783 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento Avaliação do desempenho do espectrofotômetro - Leia as absorbâncias das soluções A, B e C a 350 nm, usando como branco a solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Calcule, separadamente, a absortividade molar de cada uma das soluções e o fator de correção do espectrofotômetro, A* = Absorbância das soluções A, B e C, calculadas separadamente C = concentração das soluções A, B e C em mM CF = fator de correção do espectrofotômetro O intervalo de aceitabilidade do CF: 1,05 > CF > 0,95 Nota: se o valor de CF estiver fora dos padrões de aceitabilidade, teste novamente o método. Se o valor persistir, o aparelho está descalibrado e necessita de reparo técnico. Veriicação da concentração dos padrões de micotoxinas – Após a dissolução dos padrões em seus respectivos solventes, leia as absorbâncias nos comprimentos de onda de máxima absorção e determine a concentração, usando os dados da Tabela 2 e a seguinte fórmula: A = absorbância CF = fator de correção do aparelho PM = peso molecular da micotoxina ε = absortividade molar da micotoxina 784 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Tabela 2 – Propriedades físico-químicas de algumas micotoxinas Solvente* Comprimento de onda (λ) nm Absortividade Molar (ε) Peso Molecular Alatoxina B1 1 2 5 6 7 360 350 350 350 345 21800 19800 20600 19100 20300 312 Alatoxina B2 1 2 362 350 24000 20900 314 Alatoxina G1 1 2 362 350 17700 17100 328 Alatoxina G2 1 2 362 350 19300 18200 330 Zearalenona 4 1 317 314 6060 6000 318 Ocratoxina A 3 333 5550 403 Patulina 8 275 14600 154 Micotoxinas Solvente 1 Solvente 2 Solvente 3 Solvente 4 Solvente 5 Solvente 6 Solvente 7 Solvente 8 = = = = = = = = metanol benzeno-acetonitrila (98+2) benzeno-ácido acético (99+1) benzeno clorofórmio tolueno heptano álcool Nota: recomenda-se a substituição do solvente contendo benzeno por um outro menos tóxico. Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, a im de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar liqüidiicador, moinho ou moedor de carne. Passe por peneira de 20 mesh. Misture e homogeneíze novamente. Extração e puriicação – Pese 50 gramas da amostra previamente moída e homogeneíze em liqüidiicador com 270 mL de metanol e 30 mL de KCl ou NaCl a 4%, por 5 minutos. Filtre e transira 150 mL do iltrado para béquer de 500 mL. Adicione 150 mL do clariicante e 50 mL de celite. Agite com bastão de vidro e iltre novamente. Recolha IAL - 785 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 150 mL do iltrado e transira para um funil de separação de 500 mL contendo 150 mL de água. Adicione ao funil de separação 20 mL de clorofórmio e extraia as micotoxinas agitando o funil de separação suavemente por 3 minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a fase inferior (clorofórmica) em frasco apropriado. Repita a operação com mais 20 mL de clorofórmio. Reúna as alíquotas e retire 20 mL. Evapore o extrato em banhomaria a 80oC sob nitrogênio comum e dissolva o resíduo em um banho ultra-som com 500 μL de clorofórmio por 30 segundos. Nota: para feijão, arroz e amendoim, use como clariicante a solução de sulfato cúprico a 10% e para milho e mandioca, a solução de sulfato de amônio a 30%. Triagem das micotoxinas por cromatograia em camada delgada – Aplique duas vezes na placa cromatográica, 5 μL do extrato da amostra. Sobre a segunda alíquota aplique uma quantidade adequada de padrões. Na mesma placa aplique 1, 2, 3, 4 e 5 μL de padrões. Desenvolva o cromatograma em cuba, previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (60+40+10). Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento e deixe secar. Observe o cromatograma sob luz UV longa para alatoxinas e ocratoxina A. Pulverize a placa com solução de AlCl3, seque por 5 minutos a 110oC e observe sob lâmpada UV longa a possível presença de zearalenona. Amostras suspeitas de conterem micotoxinas devem ser quantiicadas e conirmadas separadamente. Quantiicação – Aplique, separadamente para cada micotoxina, volumes correspondentes a 3, 5, 7 e 10 μL do extrato da amostra e do padrão. Para quantiicação de alatoxinas desenvolva as placas em acetona-clorofórmio (10: 90). Para a quantiicação de ocratoxina A, desenvolva as placas em tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Para quantiicação de zearalenona, desenvolva as placas em tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (60:40:10), seguida da pulverização com solução de AlCl3. Compare a intensidade de luorescência da mancha da micotoxina da amostra com as do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a uma das do padrão. Se a intensidade da luorescência da mancha de menor volume de amostra for maior que a do padrão, a amostra deverá ser diluída e recromatografada. Testes conirmatórios para alatoxinas – A conirmação da micotoxina analisada poderá ser realizada da seguinte maneira: a) reação com ácido sulfúrico – Pulverize a placa com H2SO4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV longa. A luorescência da alatoxina muda de azul (AFB) ou verde (AFG) para amarelo. Este teste somente conirma a ausência de alatoxinas. b) reação com TFA (ácido triluoroacético) – Marque uma placa, verticalmente, dividindo-a em duas regiões e em cada uma delas cromatografe dois pontos da amostra e dois do padrão Em uma das regiões sobreponha 1 μL da solução de TFA em um dos pontos da amostra e em um dos pontos dos padrões. Aqueça a placa por 10 minutos a (35-40)oC e desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona (85:15). Examine a placa sob lâm786 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas pada UV longa. A alatoxina com TFA aparecerá em 1/3 do Rf da alatoxina original. Testes conirmatórios para ocratoxina A: a) mudança da fase móvel para hexano-acetato de etila-ácido acético (10:30:10) b) reação química – Exponha a placa com a mancha suspeita de conter ocratoxina A ao vapor de amônia. A luorescência da ocratoxina A na luz UV longa passa de verde para azul brilhante com aumento da sua intensidade. c) derivatização com triluoreto de boro a 14% em metanol – Adicione 50 μL deste composto ao frasco com o resíduo seco da amostra. Leve a uma placa aquecedora a 65oC por 15 minutos. O resíduo do solvente deve ser removido usando nitrogênio. Redissolva em volume adequado de acetonitrila para a cromatograia. Aplique em uma placa, 10 μL do extrato original da amostra e 10 μL do extrato que reagiu com BF3. Desenvolva o cromatograma em benzeno-metanol-ácido acético (18:1:1) e examine a placa sob luz UV de comprimentos de onda longo e curto. O éster formado tem Rf mais elevado do que o da ocratoxina A, mas com a mesma luorescência. Cálculo S = μL de micotoxina padrão, de luorescência igual à da amostra Y = concentração da micotoxina padrão, em μg/mL usada na cromatograia V = μL de solvente requerido para diluir o extrato inal Z = μL da mancha do extrato da amostra, com intensidade de luorescência igual à do padrão. W = gramas de amostra contida no extrato inal. Nota: o material contaminado deve ser tratado com hipoclorito de sódio a 5% e acetona, antes de ser descartado e lavado. Enxágüe bem todo material para que não ique nenhum resíduo do oxidante utilizado. Como alternativa, deixe o material contaminado pelo período mínimo de 30 minutos em uma solução de hidróxido de sódio a 5%. Referências bibliográficas SOARES, L.M.V.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Screening and quantiication of ochratoxin A in corn, peanuts, beans, rice and cassava. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 68:1128-1130, 1985. IAL - 787 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital SOARES, L.M.V.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Survey of Alatoxins, Ochratoxin A, Zearalenone, and Sterigmatocystin in Some Brazilian Foods by using Multi-toxins thin-layer chromatograic Method. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 72, p. 22-26, 1989. HUNT, D.C.; ME CONNIE, B.R.; CROSBY N.T. Conirmation of ochratoxin A by chemical derivatisation and high-performance liquid chromatography. Analyst, v. 105, p. 89-90, 1980. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. Manual of food quantity control to training in mycotoxins analysis: FAO, 1990. (FAO Food and Nutrition Paper, 14/10). PZYBYLSKI, W. Formation of alatoxin derivatives on thin layer chromatographic plates. J. Assoc. Off. Anal. Chem, v. 58, n. 1. p. 163-164, 1975. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990, Chapter 49. p. 1184-1213. 408/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD e CLAE após separação por coluna de imunoafinidade – Método 1 A ocratoxina A é a micotoxina produzida por espécies fúngicas do gênero Penicillium e por várias espécies de Aspergillus. Destacamos Aspergillus ochraceus e Penicilium verrucosum como os principais responsáveis pela contaminação de alimentos armazenados em regiões de climas temperados, enquanto que, em países mais quentes, predominam outras espécies de Aspergillus. A principal matéria-prima alimentar que pode apresentar contaminação com ocratoxina A é o cereal. Os sucos de uva, vinhos tintos, cafés, cacau, frutas secas, entre outros produtos, também podem apresentar o mesmo problema. Limite de detecção (LD) por CCD = 3 μg/kg e LD por CLAE = 0,6 μg/kg. Esta toxina pode causar danos aos rins e fígado e é carcinogênica para alguns animais. Material Espectrofotômetro UV/VIS, gabinete com lâmpada UV (λ longo), liqüdiicador (blender), suporte coletor de amostra a vácuo (manifold), cromatógrafo líquido de alta eiciência com detector de luorescência, ultra-som, balança analítica, banho-maria, rota788 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas vapor, capela para solventes orgânicos, peneira de 20 mesh, balão volumétrico, béquer de 300 mL, cuba cromatográica, funil, frasco âmbar de 10 mL, microsseringas de (10, 25 e 100) μL, provetas de (100 e 200) mL, seringa de vidro de 10 mL, frasco de amostras para CLAE, coluna de imunoainidade especíica para ocratoxina A, cromatoplacas ou cromatofolhas de Sílica gel G sem indicador de luorescência (20 x 20) cm, papel de iltro comum e papel de iltro de ibra de vidro. Reagentes Padrão de ocratoxina A Acetato de etila Acetona Ácido acético Ácido fórmico Bicarbonato de sódio Cloreto de sódio Cloreto de potássio Clorofórmio Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) Fosfato dibásico de sódio (Na2HPO4) Metanol Padrão de ocratoxina A Tolueno Nota: todos os reagentes devem ser grau p.a. ou CLAE, quando for o caso Solução-padrão de ocratoxina A - Proceda conforme método 407/IV Solução-tampão fosfato (PBS) – Pese 0,2 g de KH2PO4 anidro, 1,1 g de Na2HPO4 anidro, 8 g de NaCl e 0,2 g de KCl, dissolva em água e complete o volume para 1000 mL. Procedimento Preparação da amostra – Pese 10 g da amostra, previamente moída e tamisada (20 mesh), e homogeneíze em liqüidiicador por 2 minutos com 200 mL de bicarbonato de sódio a 1%. Filtre em iltro de microibra, recolha 20 mL e adicione imediatamente 20 mL de solução-tampão fosfato (PBS). Transira o iltrado para uma seringa acoplada à coluna de imunoainidade e passe a amostra lentamente pela coluna com luxo de (2-3) mL/min, sob pressão constante. Após passar todo o volume, lave com 20 mL de água. Elimine IAL - 789 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital toda a água residual da coluna e elua com 2 mL da solução de metanol:ácido acético (98:2), retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e invertendo o luxo suavemente por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra eluída em um frasco âmbar. Evapore, sob corrente de nitrogênio, até resíduo e proceda a separação e a quantiicação, que pode ser por CCD ou CLAE. Cromatograia em camada delgada – Ressuspenda a OTA com 50 μL de tolueno-ácido acético (99:1). Aplique sobre a placa cromatográica de (20 x 20) cm, 20 μL deste extrato e também pontos de (1-5) μL de padrão de OTA de concentração de 1,01 μg/ mL. Desenvolva a cromatograia pelo método bi-drecional utilizando como fase móvel clorofórmio-acetona (90:10) na primeira etapa e tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) na segunda etapa. Caso a separação não seja satisfatória, desenvolva pelo método bi-dimensional utilizando as mesmas fases móveis. Seque a placa em temperatura ambiente e visualize sob luz UV (λ=366nm). Quantiicação – Para a quantiicação, compare a intensidade de luorescência da mancha da OTA da amostra com as do padrão, determinando qual mancha do padrão corresponde à da amostra. Se a intensidade de luorescência da mancha da amostra for maior ou menor que as dos padrões, dilua ou concentre amostra e recromatografe. Cálculo S = volume em μL de OTA padrão, de luorescência igual à da amostra Y = concentração da micotoxina padrão, em μg/mL usada na cromatograia V = volume em μL de solvente requerido para diluir o extrato inal Z = volume em μL do extrato da amostra que proporcionou intensidade de luorescência igual à do padrão W = gramas de amostra contida no extrato inal. Conirmação – Submeta a placa ao vapor de hidróxido de amônio por 5 minutos. No caso da presença de OTA, haverá uma intensiicação da coloração das manchas. Para uma melhor conirmação, utilize o BF3 para derivatização química. Cromatograia liquida de alta eiciência – Redissolva o resíduo com 200 μL de acetonitrila-metanol-ácidoacético 29:1 (35:35:30), homogeneize em ultra-som para dissolução total. Injete 20 μL deste extrato na coluna de fase reversa C18 com a fase móvel acetonitrila790 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas metanol-sol, ácido acético 29:1 (35:35:30) por 15 minutos, luxo de 0,8 mL/min, detetor de luorescência com comprimentos de onda de excitação de 332 nm e de emissão de 476 nm, temperatura da coluna 25°C. Utilize a integração do pico e compare com o valor da curva de calibração construída previamente ou de acordo com a seguinte formula: Cálculo H = altura do pico da amostra H’ = altura do pico do padrão C’ = concentração do padrão (ng/μL) VI´= volume injetado do padrão VI = volume injetado da amostra V = total do volume inal da amostra (μL) W = quantidade de amostra contida no inal do extrato (g) 409/IV Determinação de ocratoxina A em café verde por CCD e CLAE após separação por coluna de imunoafinidade - Método 2 O limite de detecção (LD) deste método, quando a ocratoxina A for quantiicada por CCD, é igual a 3 μg/kg e 0,6 μg/kg quando for por CLAE. Material Espectrofotômetro UV/VIS, gabinete com lâmpada UV (λ longo), liqüidiicador (blender), suporte coletor de amostra a vácuo (manifold), cromatógrafo líquido de alta eiciência com detector de luorescência, ultra-som, balança analítica, banho-maria, rotavapor, capela para solventes orgânicos, peneira de 20 mesh, balão volumétrico, béquer de 300 mL, cuba cromatográica, funil, frasco âmbar de 10 mL, microsseringas de 10, 25 e 100 μL, provetas de 100 e 200 mL, seringa de vidro de 10 mL, frasco de amostras para CLAE, coluna de imunoainidade especíica para ocratoxina A, cromatoplacas ou cromatofolhas de sílica-gel G sem indicador de luorescência (20 x 20) cm, papel de iltro comum e papel de iltro de ibra de vidro. IAL - 791 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Padrão de ocratoxina A Acetato de etila Acetona Ácido acético Ácido fórmico Bicarbonato de sódio Cloreto de sódio Cloreto de potássio Clorofórmio Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) Fosfato dibásico de sódio (Na2HPO4) Metanol Padrão de ocratoxina A Tolueno Nota: todos os reagentes devem ser grau p.a ou CLAE, quando for o caso. Solução-padrão de ocratoxina A - Proceda conforme o método 407IV. Solução-tampão fosfato (PBS) – Pese 0,2 g de KH2PO4 anidro, 1,1 g de Na2HPO4 anidro, 8 g de NaCl e 0,2 g de KCl, dissolva em água e complete o volume para 1000 mL com o mesmo solvente. Procedimento Preparação da amostra – Pese 25 g da amostra, previamente triturada e tamisada (20 mesh), e homogeneize no liqüidiicador por 5 minutos com 250 mL de solução metanol-bicarbonato de sódio 1% (70:30). Filtre em papel de iltro comum, recolha 50 mL e adicione imediatamente 200 mL de solução- tampão fosfato (PBS). Filtre até 50 mL em papel de ibra de vidro. Transira o iltrado para uma seringa acoplada à coluna de imunoainidade e passe a amostra lentamente pela coluna com o luxo de (2-3) mL/min, sob pressão constante. Após passar todo o volume, lave com 10 mL de PBS e em seguida com 10 mL de água. Elimine toda a água residual da coluna e elua com 2 mL da solução de metanol, retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e invertendo o luxo suavemente por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra eluída em um frasco âmbar. Evapore o eluato, sob corrente de nitrogênio, até resíduo para o procedimento de separação e quantiicação. Cromatograia em camada delgada – Ressuspenda a OTA com 50 μL de tolueno-ácido acético (99:1). Aplique sobre cromatofolha de sílica gel G (10 x 10) cm ou cromatoplaca 792 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas de sílica gel G (20x20) cm, 20 μL deste extrato e também pontos de (1-5) μL de padrão de OTA (1,01 μg/mL). Desenvolva a placa com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Seque a placa em temperatura ambiente e visualize sob luz UV (λ=366 nm). Eventualmente, pode ser utilizada cromatograia em camada delgada bi-dimensional, utilizando a fase clorofórmio-acetona (90:10) na 1ª direção e tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) na 2ª direção. Quantiicação – Para quantiicação, compare a intensidade de luorescência da mancha da OTA da amostra com as do padrão, determinando qual mancha do padrão corresponde à da amostra. Se a intensidade da luorescência da mancha da amostra for maior ou menor que as dos padrões, dilua ou concentre a amostra e recromatografe. Cálculo S = μL de micotoxina padrão de luorescência igual à da amostra Y = concentração da micotoxina padrão, em μg/mL usada na cromatograia V = μL de solvente requerido para diluir o extrato inal Z = μL do extrato da amostra que apresentou intensidade de luorescência igual à do padrão W = gramas de amostra contida no extrato inal. Conirmação – Submeta a placa ao vapor de hidróxido de amônio por 5 minutos. No caso da presença de OTA, haverá uma intensiicação da coloração das manchas. Para uma conirmação especíica, utilize derivatização com BF3. Cromatograia líquida de alta eiciência – Proceda conforme o método 408/IV. Nota: o material contaminado deve ser tratado com hipoclorito de sódio a 5% e acetona, antes de ser descartado e lavado. Enxágüe bem todo material, para que não ique nenhum resíduo do oxidante utilizado. Como alternativa, deixe o material contaminado por no mínimo 30 minutos em uma solução de hidróxido de sódio a 5%. Referências bibliográficas ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990, chapter 49. p. 1184. IAL - 793 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital NAKAJIMA, M. et al. Determination of ochratoxin A in coffee beans and coffee products by monoclonal antibody chromatography. Food Agric. Immunol., v. 2. p. 189195, 1990. PITET, A. et al. Liquid chromatographic determination of ochratoxin A in pure and adulterated soluble coffee using an immunoaffinity column cleanup procedure. J. Agric. Food Chem., v. 44. p. 3564-3569, 1996. 410/IV Determinação de ocratoxina A em café cru em grão por cromatografia em camada delgada O método descrito refere-se a determinação simultânea de Aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2), ocratoxina A e zearalenona em arroz, amendoim, feijão, milho, mandioca e, com algumas pequenas modificações, a determinação específica de ocratoxina A (OTA) em café cru em grão. A micotoxina é extraída com metanol e solução de KCl ou NaCl, seguida da remoção de interferentes pela precipitação com agente clarificante e partição com clorofórmio. A quantificação da OTA baseia-se na comparação da intensidade da fluorescência com um padrão, por cromatografia em camada delgada. Este método permite a detecção de 10 µg/kg (ppb) e quantificação de 30 µg/kg (ppb) de OTA. Material Espectrofotômetro UV/VIS, gabinete para duas lâmpadas ultravioletas (λ = 366 nm) de 15 watt cada uma, balança analítica, balança semi-analítica, liqüidificador, banho-maria com temperatura controlada ou rotavapor, estufa, ultra-som, moinho que reduza os grãos a partículas de (10 a 20) mesh, cilindro de nitrogênio comum, peneira de (10 a 20) mesh, capela para solventes orgânicos, béqueres de (30, 100 e 400) mL, frasco Erlenmeyer 50 mL, provetas (10, 50, 100, 200 e 300) mL, bastão de vidro, funil de vidro de 12 cm de diâmetro, papel de filtro qualitativo Whatman no 4 ou equivalente, funil de separação de 500 mL tipo pêra e com torneira de teflon, microsseringas de (10, 25 e 500) µL, cuba cromatográfica de vidro para placas de (20 x 20) cm, secador capaz de gerar ar com temperatura entre (4050)°C, cromatofolhas ou cromatoplacas de sílica-gel G sem indicador de fluorescência (20 x 20) cm, balões volumétricos de (50 e 2000) mL e pipetas volumétricas de (1 e 25) mL. Reagentes Metanol Clorofórmio 794 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Tolueno Acetato de etila Acetona Ácido fórmico Benzeno Hexano Ácido acético glacial Acetonitrila Hylo-super cel, celite 545 ou equivalente Solução de KCl a 4% ou NaCl a 4% Agente clariicante: solução de sulfato de amônio a 30% Sistemas de solventes para desenvolvimento da cromatograia em camada delgada: tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) ou ( 60:30:10) acetona-clorofórmio (10:90) tolueno-acetato de etila-clorofórmio-ácido fórmico (35:25:25:10) benzeno-metanol-ácido acético (90:5:5) hidróxido de amônio triluoreto de boro em metanol 14% (v/v) Solução de ácido sulfúrico 0,009 M – Pipete 1 mL de ácido sulfúrico e transira para balão de 2000 mL e complete com água. Solução A – Solução de dicromato de potássio 0,25 mM – Pese 78 mg de dicromato de potássio previamente dessecado e dissolva em 1000 mL de ácido sulfúrico 0,009 M . Solução B – Pipete 25 mL da solução A , transira para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M . Solução C – Pipete 25 mL da solução B, transira para balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Solução-padrão de OTA – Prepare a solução-padrão de ocratoxina A de forma a obter concentração aproximada de 1 μg/mL. Acrescente ao frasco, contendo OTA em pó, a mistura benzeno-ácido acético glacial (99:1) e transira quantitativamente para balão volumétrico de capacidade determinada, a im de que se obtenha solução de concentração cerca de 1 μg/mL. Proteja da luz, utilizando frasco de vidro âmbar ou envolvendo-o em papel de alumínio e conserve sob refrigeração (temperatura < 4°C). Para a calibração dos padrões de micotoxinas é necessário que o espectrofotômetro seja calibrado previamente, a im de se obter o fator de calibração do equipamento. IAL - 795 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento Avaliação do desempenho do espectrofotômetro – Leia as absorbâncias das soluções A, B e C a 350 nm, usando como branco a solução de ácido sulfúrico 0,009 M. Calcule a absortividade molar de cada uma das soluções (A, B e C). Cálculo do fator de correção do aparelho ε = absortividade molar A* = Absorbâncias das soluções A, B e C, calculadas separadamente C = Concentração das soluções A, B e C em mM ε= absortividade molar média CF = fator de correção Intervalo de aceitabilidade: 1,05 > CF > 0,95 Nota: se o valor de CF estiver fora dos padrões, cheque novamente o método. Se o valor persistir o aparelho está descalibrado e necessita de manutenção. Veriicação da concentração do padrão de ocratoxina A – Após dissolver o padrão de OTA com solução de benzeno-ácido acético (99:1), leia a absorbância em 333 nm e calcule a concentração. A = absorbância CF = fator de correção do aparelho PM = peso molecular da ocratoxina A = 403 ε = absortividade molar da ocratoxina A = 5550 796 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Notas Recomenda-se a substituição dos solventes contendo benzeno por um outro menos tóxico como metanol; neste caso, a absortividade molar é 6337 em 332 nm. A calibração do padrão deverá ser efetuada de acordo com a periodicidade do uso. Procedimento Preparação da amostra – Adote o mesmo plano de amostragem usado para análise de alatoxinas. No caso de amostras processadas, tome pelo menos 1 kg e triture até redução a partículas de (10 a 20) mesh. Conserve as amostras em sacos plásticos de polietileno duplo sob refrigeração. Extração e puriicação – Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e moída, e agite em liqüidiicador por 5 minutos juntamente com 180 mL de metanol e 20 mL de KCl ou NaCl a 4%. Filtre e transira 100 mL do iltrado para um béquer de 400 mL. Adicione 100 mL de (NH4)2SO4 a 30% e celite em quantidade suiciente para ocupar um béquer de 30 mL. Agite com bastão de vidro. Filtre, recolha 100 mL do iltrado e transira para um funil de separação de 500 mL com 100 mL de água. Adicione, ao funil de separação, 20 mL de clorofórmio e extraia a micotoxina agitando suavemente por 3 minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a fase inferior (clorofórmica) em frasco Erlenmeyer de 50 mL. Repita a operação acima com mais 20 mL de clorofórmio. Recolha a fase inferior juntamente com a da extração anterior. Deste volume total retire 20 mL de clorofórmio e evapore em banho-maria a 60oC, sob corrente de nitrogênio ou em rotavapor. Dissolva o resíduo em ultra-som com 200 μL de benzeno ou metanol, por 30 segundos para proceder a cromatograia em camada delgada. Triagem das micotoxinas por cromatograia em camada delgada – Cromatografe, em placa de sílica gel, 10 μL da amostra e dois pontos de padrão, separadamente, fazendo sobrepor, no segundo ponto do padrão, 5 μL da amostra. Desenvolva o cromatograma em cuba previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Remova a placa após de 12 cm de desenvolvimento, e deixe secar muito bem. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV longa (366 nm). Amostras suspeitas de conter ocratoxina A devem ser quantiicadas e conirmadas separadamente. Determinação – Cromatografe pontos de (1-5) μL do padrão de OTA e (5-10) μL da amostra, dissolvida em quantidade adequada de metanol. Para a quantiicação de ocratoxina A, desenvolva as placas em tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Compare a intensidade de luorescência das manchas da amostra com as do padrão. Se a intensidade de luorescência da mancha de menor volume de amostra for maior que a do padrão, a amostra IAL - 797 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital deverá ser diluída e novamente recromatografada. Conirmação – Para a veriicação da ausência de OTA, a placa deve ser exposta aos vapores de amônia da seguinte forma: coloque, numa cuba cromatográica, um béquer de 50 mL com hidróxido de amônio junto à placa já desenvolvida por cerca de 5 min, e novamente observe sob a luz UV. A não mudança da coloração da luorescência de verde-azulada (original da OTA) para azul brilhante indicará a ausência desta toxina. Entretanto, a mudança da coloração não é prova suiciente da presença da toxina, por isso são indicadas as outras técnicas: uso de padrão interno e/ou mudança de fase móvel e/ou derivatização química, no caso com BF3. a) padrão interno – Cromatografe, em placa de sílica gel, pontos com (5 a 10) μL da amostra e dois pontos com padrão, separadamente, fazendo sobrepor, no segundo ponto do padrão, de (5 -10) μL da amostra e evaporando o solvente com o auxílio de um secador. Desenvolva o cromatograma em cuba para cromatograia, previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento e deixe secar muito bem. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV longa (366 nm). Caso a mancha da amostra referente à ocratoxina A apresente-se compacta, recomenda-se usar esta técnica com diferentes fases móveis ,para que a ocratoxina A apresente tempo de retenção diferente das demais micotoxinas. b) mudança de fase móvel – Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) e hexanoacetato de etila-ácido acético ( 20:60:20) c) derivatização da ocratoxina A – Este procedimento é o mais conclusivo, pois há formação de seus respectivos ésteres metílicos. A partir do resíduo seco inal da análise, adicione 50 μL do triluoreto de boro em metanol a 14% (v/v) e aqueça a 65oC por 15 minutos. Ao inal deste período, remova qualquer reagente remanescente com nitrogênio e redissolva o resíduo com volume adequado de acetonitrila. Faça procedimento idêntico para o padrão. Proceda a cromatograia em camada delgada como já foi indicado, colocando pontos na placa tanto para a amostra derivatizada quanto para a não derivatizada e o mesmo procedimento para o padrão. Observe a placa após o desenvolvimento sob luz UV e visualize o éster metílico da ocratoxina A obtido a partir do padrão derivatizado. Cálculo S = μL de micotoxina padrão, de luorescência igual à da amostra Y = concentração da micotoxina padrão, em μg/mL usada na cromatograia V = μL de solvente requerido para diluir o extrato inal Z = μL da mancha do extrato da amostra que deu intensidade de 798 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas luorescência igual à do padrão. W = gramas de amostra contida no extrato inal. Nota: o material contaminado deve ser tratado com hipoclorito de sódio a 5% e acetona, antes de ser descartado e lavado. Enxágüe bem todo material para que não ique nenhum resíduo do oxidante utilizado. Como alternativa, deixe o material contaminado por no mínimo 30 minutos em uma solução de hidróxido de sódio a 5%. Referências bibliográficas GOLINSKI, P.; GRABARKIEWICZ-SZCZESNA, J. Chemical conirmatory tests for ochratoxin A, citrinin, penicillic acid, sterigmatocystin and zearalenone performed directly on thin layer chromatographic plates. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 67, p. 1108 -1110, 1984. HUNT, D.C.; MC CONNIE, B.R.; CROSBY, N.T. Conirmation of ochratoxin A by chemical derivatisation and high-performance liquid chromatography. Analyst, v. 105, p. 89-90, 1980. SOARES, L.M.V.; RODRIGUEZ AMAYA, D. B. Screening and quantitation of ochratoxin A in corn, peanuts, beans, rice and cassava. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 68, p. 1128-1130, 1985. SOARES, L.M.V.; RODRIGUEZ AMAYA, D. B. Survey of Alatoxins, Ochratoxin A, Zearalenone and Sterigmatocystin in Some Brazilian Foods by Using Multi-toxins hinLayer Chromatographic Method. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 72, p. 22-26, 1989. MILANEZ, T.V.; SABINO, M. Ocratoxina A em feijão comercializado no Estado de São Paulo e sua estabilidade no cozimento . Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 49, p. 131-135, 1989. MILANEZ, T.V.; SABINO, M.; LAMARDO, L.C.A. Comparison of two methods for the determination of ochratoxin A in green cofee beans. Rev. Microbiol., v. 26, n. 2, p. 79-82, 1995. 411/IV Determinação de patulina em suco de maçã Um dos maiores fungos produtores de patulina é o Penicillium expansum que freqüentemente causa o apodrecimento de um número grande de frutas. A maçã e o suco de maçã processado com frutos contaminados têm sido a maior fonte de patulina na dieta IAL - 799 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital humana. Esta micotoxina já foi detectada em frutas, hortaliças, cereais e também na ração animal. A contaminação mais freqüente é por Penicillium expansum, que se encontra em maçãs deterioradas; o grau de contaminação está relacionado com a deterioração dos frutos, icando a patulina limitada aos tecidos deteriorados. Este método é aplicável às análises de patulina em amostras de suco e concentrados de maçã, cujo limite de quantiicação (LQ) é igual a 25 μg/L. Material Provetas, funil de separação, funil, papel de iltro qualitativo, banho-maria ou rotavapor, microsseringas, cromatofolhas ou cromatoplacas de sílica gel G com indicador de luorescência, estufa, balão volumétrico, balança analítica. Reagentes Acetato de etila Sulfato de sódio anidro Clorofórmio Tolueno Ácido fórmico Acetona Metanol Álcool Solução-padrão de patulina – Dissolva o padrão em clorofórmio de maneira que a solução contenha 10 μg/mL. Determine a concentração do padrão utilizando o mesmo procedimento das outras micotoxinas conforme o método 407/IV. Transira 5 mL da solução-estoque para um balão volumétrico, evapore até resíduo sob nitrogênio e dissolva com 5 mL de álcool. Faça a leitura no espectrofotômetro em λ = 275 e proceda como para as outras micotoxinas. MBTH (Cloridrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona) a 0,5% – Pese 125 mg de MBHT.HCl.H2O, transira para um balão volumétrico de 25 mL e dissolva com água. Esta solução tem validade por 3 dias, quando conservada em geladeira. Procedimento – Meça 50 mL de amostra e transira para um funil de separação. A amostra deve ser analisada imediatamente após a abertura da embalagem. Adicione 50 mL de acetato de etila no funil e agite por 3 minutos. Recolha o acetato de etila em um frasco 800 - IAL Capítulo XXIV - Micotoxinas Erlenmeyer. Repita esta operação três vezes. Filtre os extratos em sulfato de sódio anidro. Lave o sulfato de sódio com 20 mL de acetato de etila. Evapore os extratos até quase secura, sob nitrogênio. Dissolva imediatamente o resíduo em 500 μL de clorofórmio. Aplique em cromatofolhas ou cromatoplacas, sem indicador de luorescência, respectivamente, 10 μL da amostra e volumes do padrão correspondentes às concentrações de (1-6) μg/mL. Desenvolva o cromatograma utilizando uma das fases móveis: tolueno-acetato de etilaácido fórmico 90% (5:4:1), clorofórmio-metanol (95:5) ou clorofórmio-acetona (9:1). Seque a placa e pulverize com MBTH a 0,5%. Coloque em estufa por 15 minutos a 130°C. A patulina é detectada na região do visível como uma mancha amarelada se a sua quantidade for maior ou igual a 0,05 μg e, no UV com uma luorescência amarelo-tijolo. Para a quantiicação, compare a intensidade de luorescência das manchas de patulina na amostra com as do padrão e determine qual delas corresponde à uma do padrão. Se a intensidade de luorescência da mancha de menor volume de amostra for maior do que a do padrão, a amostra deverá ser diluída e recromatografada. Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.15 th ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990, chapter 49. p. 1209, (method 974.18). Colaboradores Myrna Sabino, Leda C. A . Lamardo, Luzia Shundo, Sandra A. Navas e haïs Valéria Milanez IAL - 801 Capítulo XXV - Gelados Comestíveis CAPÍTULO XXV GELADOS COMESTÍVEIS IAL - 803 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 804 - IAL Capítulo XXV - Gelados Comestíveis XXV GELADOS COMESTÍVEIS E stão incluídos neste capítulo os métodos de análise para gelados comestíveis, pré-embalados ou não, prontos para o consumo, os preparados concentrados e as bases para o fabrico de gelados comestíveis. Os gelados comestíveis são produtos prontos para o consumo submetidos ao congelamento, obtidos a partir de uma emulsão de gorduras e proteínas, com ou sem adição de outros ingredientes, tais como: leite, água e açúcares. Incluem-se nesta classe, os sorvetes, os picolés e os produtos especiais gelados mistos. Preparados para gelados comestíveis são produtos líquidos que contenham todos os ingredientes necessários em quantidades tais que, quando submetidos ao congelamento, resultem em gelados comestíveis. Pós para o preparo de gelados comestíveis são os produtos constituidos por uma mistura de vários ingredientes e aditivos que, pela adição de água e/ou leite resultem em gelados comestíveis. Base para gelados comestíveis são produtos constituidos de estabilizantes e/ou emulsionantes e espessantes, podendo conter outros aditivos e ingredientes que, após adição de água e/ou leite, resultem em gelados comestíveis. Para os gelados comestíveis à base de leite, as determinações mais usuais são: sólidos totais (429/IV), glicídios redutores em lactose (432/IV), glicídios não redutores em sacarose (489/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), gorduras totais (032/IV), resíduos por IAL - 805 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital incineração (485/IV), corantes orgânicos artiiciais (051/IV), minerais (cap. XXIII) e, eventualmente, vitaminas (cap. XIX) e alguns aditivos (cap. V). No caso de preparados, pós e bases para gelados comestíveis, as determinações incluem: acidez (253/IV), resíduo por incineração (cinzas) (018/IV), glicídios totais em sacarose (039/IV), corantes orgânicos artiiciais (051/IV), minerais (cap. XXIII), e, eventualmente, alguns aditivos (cap. V). Para os pós para gelados comestíveis, também incluir substâncias voláteis (012/IV). Preparo da amostra A amostra deve ser, de preferência, analisada logo após seu recebimento; se não for possível, conserve em temperatura abaixo de -15°C. Corte duas ou três porções congeladas ao acaso e transira para o recipiente de um processador. Deixe a amostra em temperatura ambiente até se liqüefazer para depois ser homogeneizada. Se ocorrer a separação da gordura, descarte a amostra e repita, processando por tempo menor. Transira a amostra imediatamente para um frasco, feche bem e conserve sob refrigeração, para a realização das análises. Agite antes de utilizar. 412/IV Determinação de gordura pelo método de Rose-Gottlieb Neste método, a amostra é inicialmente tratada com hidróxido de amônio e álcool. O álcool precipita a proteína que se dissolve no hidróxido, facilitando a extração das gorduras com uma mistura de éteres. O resultado é expresso em porcentagem em massa de gordura. Material Balança analítica, béqueres de 50 e 150 mL, bastão de vidro, pipetas graduadas de 2 e de 10 mL, espátula, funil de separação de 250 mL, proveta de 25 mL, banho-maria, capela de exaustão, estufa ou estufa a vácuo e dessecador com sílica gel. Reagentes Álcool Hidróxido de amônio Éter Éter de petróleo (30-60)°C 806 - IAL Capítulo XXV - Gelados Comestíveis Procedimento – Pese de 4 a 5 g da amostra em béquer de 50 mL e dilua com 10 mL de água. Adicione 2 mL de hidróxido de amônio e misture. Aqueça em banho-maria por 20 minutos a 60°C e agite ocasionalmente. Transira, com pouca água, para um funil de separação. Resfrie. Faça uma prova em branco com os reagentes usados. Adicione 10 mL de álcool e agite bem. Adicione 25 mL de éter e agite por um minuto. Adicione 25 mL de éter de petróleo e repita a agitação. Deixe em repouso até a separação das fases. Decante a fase inferior diretamente para outro funil de separação. Transira a fase etérea para um béquer de 150 mL tarado. Repita a extração da fase aquosa, utilizando 15 mL de cada éter, por duas vezes. Reúna os extratos no béquer. Lave o funil de separação e a tampa com partes iguais dos éteres e junte aos extratos. Evapore completamente os solventes em banho-maria na capela. Seque o béquer contendo a gordura em estufa a (100 ± 1)°C ou a vácuo a (70-75)°C. Resfrie em dessecador e pese até peso constante. Prepare uma extração em branco, com 10 mL de água e os solventes utilizados no método.Corrija a massa obtida, levando em conta o resíduo obtido de um branco dos reagentes utilizados. Se a massa do branco for maior que 0,5 mg, substitua os reagentes. Cálculo N = n° de g de gordura P = n° de g da amostra Nota: alternativamente, esta determinação poderá ser efetuada conforme o método 486/IV. Referência bibliográfica ASSOCIATION OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of Association of Official Analytical Chemists, 16th ed. (method 952.06) Arlington: A.O.A.C., 1995. chapter 33. p. 5. Colaboradores Jacira Hiroko Saruwtari, Letícia Araújo Farah Nagato e Marilda Duarte IAL - 807 Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja CAPÍTULO XXVI CEREAIS, AMILÁCEOS E EXTRATO DE SOJA IAL - 809 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 810 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja XXVI CEREAIS, AMILÁCEOS E EXTRATO DE SOJA enericamente, os cereais são designados como plantas, principalmente da família das gramíneas, cultivadas para a produção de grãos utilizados para a alimentação humana e animal. Os amiláceos são os produtos derivados de cereais e de outros vegetais (por exemplo, tubérculos) e incluem as preparações à base de farinhas, os pães, as massas alimentícias e uma série de produtos similares. G A análise dos cereais inclui, entre outras, as determinações de umidade, cinzas, proteínas, lipídios, hidratos de carbono e ibra, segundo as técnicas descritas no cap. IV e sua identiicação pelas características microscópicas. A análise dos amiláceos pouco difere da análise dos cereais, incluindo algumas determinações especíicas referentes aos componentes e aditivos empregados na sua fabricação. Farinhas e produtos similares A composição das farinhas varia de acordo com a origem do grão e processos tecnológicos de sua fabricação. Especiicamente, as farinhas são identiicadas pelo exame microscópico. As análises de rotina incluem, entre outras, as determinações de umidade, acidez, protídios (036/IV ou 037/IV), ibra alimentar (045/IV e 046/IV), lipídios (032/IV) IAL - 811 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital e cinzas (018/IV). O teor de amido é calculado pela diferença centesimal da soma de umidade, cinzas, lipídios, protídios e ibra alimentar. Entre outras determinações, o teor glúten é de grande importância para avaliação das farinhas. 413/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de umidade a 130°C Os métodos utilizando aquecimento a 130°C, por 1 hora, 105°C, por 5 horas ou a menos de 100°C, a vácuo (25 mm de mercúrio), fornecem valores que representam a umidade livre, na temperatura de secagem, pois certa quantidade de água permanece retida, provavelmente ligada às proteínas. Os métodos de destilação e Karl Fischer produzem valores mais exatos do total de água existente. Este método mede a umidade livre do produto na temperatura de secagem e baseia-se na perda de substâncias voláteis pelo aquecimento. Material Balança analítica, dessecador, estufa e cápsula de porcelana. Procedimento – Pese, com precisão, aproximadamente 2 g da amostra em uma cápsula de porcelana previamente aquecida em estufa a 130°C, por uma hora, resfriada em dessecador até a temperatura ambiente e pesada. Aqueça em estufa a 130°C durante 1 hora. Resfrie em dessecador até a temperatura ambiente. Pese. Repita a operação de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de umidade P = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 125. 812 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja 414/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de umidade a 105°C Procedimento – Siga o método descrito em 012/IV Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 125-126. 415/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de acidez álcool-solúvel Este método destina-se à determinação da acidez titulável em farinhas e em todos cereais e amiláceos, por facilitar a dissolução das amostras e evitar a formação de grumos quando o solvente é somente a água. Material Balança analítica, papel de iltro, frasco Erlenmeyer de 125 mL, frasco Erlenmeyer de 125mL com tampa e boca esmerilhada, pesa-iltro de 25 mL, pipetas volumétricas de 20 e 50mL, bureta de 10 mL e funil de ± 5 cm de diâmetro. Reagentes Álcool Solução de fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 0,1 N ou 0,01 N Procedimento – Pese, com precisão, aproximadamente 2,5 g da amostra em um pesailtro de 25 mL. Transira para um frasco Erlenmeyer de 125 mL com tampa com o auxilio de 50 mL de álcool, medido com pipeta volumétrica. Agite o frasco algumas vezes e mantenha em repouso por 24 horas. Transira, com auxilio de uma pipeta volumétrica, 20 mL do sobrenadante para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione algumas gotas da solução de fenolftaleína e titule com hidróxido de sódio 0,1 N ou 0,01 N até coloração rósea persistente. Faça uma prova em branco, usando 20 mL do mesmo álcool. Cálculo V = n° de mL da solução de hidróxido de sódio gasto na titulação da amostra V’= n° de mL da solução de hidróxido de sódio gasto na titulação do branco IAL - 813 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,01N ou 0,1N P = nº de g da amostra usada na titulação c = fator de correção (10 para solução de hidróxido de sódio 0,1 N e 100 para solução de hidróxido de sódio 0,01 N) Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 127. 416/IV Determinação de acidez da gordura extraída de farinha de trigo Material Aparelho de Soxhlet, peneira de malha nº 40, estufa, balança analítica, pipeta volumétrica de 50 mL e pipeta graduada de 5 mL. Reagentes Éter de petróleo Solução de tolueno-álcool-fenolftaleína 0,02% – Adicione a um litro de tolueno, um litro de álcool e 0,4 g de fenolftaleína. Solução-padrão de hidróxido de potássio 0,0178 N, livre de carbonatos Solução de KMnO4 0,01% Solução de K2Cr2O7 0,5% Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 10 g da amostra previamente, seca a aproximadamente 100°C, homogeneizada e passada por uma peneira de malha n° 40. Extraia, em Soxhle, com éter de petróleo por cerca de 16 horas. Complete a evaporação do solvente em banho-maria. Dissolva o resíduo do balão de extração com 50 mL da solução de tolueno-álcool-fenolftaleína e titule com solução-padrão de hidróxido de potássio a 0,0178 N até cor rósea distinta. No caso da formação de emulsão durante a titulação, disperse-a pela adição de mais 50 mL da solução tolueno-álcool-fenolftaleína. O ponto de viragem do indicador deve ser igual à cor obtida pela mistura de 2,5 mL de KMnO4 a 0,01% em 50 mL de uma solução obtida pela adição de K2Cr2O7 a 0,5%, gota a gota, em 50 mL de água, até que a coloração ique igual à da solução original da amostra a ser titulada. Faça uma titulação em branco com 50 mL de solução tolueno-álcool-fenolfta814 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja leína e subtraia do valor da titulação da amostra. Expresse a acidez da gordura em mg de hidróxido de potássio necessários para neutralizar os ácidos graxos livres em 100 g da amostra em base seca. Cálculo 10 x (Vg – Vb) = acidez da gordura Vg = volume de solução-padrão de hidróxido de potássio a 0,0178 N gasto na titulação da amostra Vb = volume de solução-padrão de hidróxido de potássio a 0,0178 N gasto na titulação do branco Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 128-129 417/IV Farinhas e produtos similares – Determinação do pH Procedimento – Siga o método descrito em 017/IV. 418/IV Farinhas e produtos similares – Determinação de Glúten Os métodos para a dosagem do glúten em farinhas de trigo são todos mais ou menos semelhantes, havendo aparelhos que tornam a operação mais rápida. A dosagem baseia-se na insolubilidade do glúten na água e na propriedade que o mesmo possui de se aglomerar formando uma massa elástica quando manuseado sob uma corrente de água, que elimina os outros constituintes da farinha. O glúten assim obtido, contém globulina, glutenina e gliadina. Material Balança analítica, estufa, tamis de malha 100, dessecador, béquer de 100 mL, proveta de 50 mL, vidro de relógio e bastão de vidro. Reagentes Solução saturada de iodo Solução de cloreto de sódio a 5% m/v IAL - 815 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra em um béquer de 100 mL. Adicione 10 mL de solução aquosa de cloreto de sódio a 5%. Misture bem com auxílio de um bastão de vidro, até formar uma massa aglomerada compacta. Deixe em repouso por 30 minutos. Adicione água até cobri-la e deixe em repouso por mais 30 minutos. Lave o aglomerado com água corrente sobre um tamis de malha 100, apertando e amassando levemente com as mãos. Continue a lavar até que a água não adquira coloração azul, ao se adicionar uma gota da solução de iodo saturada. Reúna à massa, os fragmentos que eventualmente tenham passado pelo tamis. Transira para um vidro de relógio, previamente aquecido em estufa a 105°C, por uma hora e resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e pesado. Passe, se necessário, uma ina camada de vaselina sobre o vidro de relógio antes da pesagem, para evitar que a massa compacta ique grudada na superfície do vidro. Leve o vidro de relógio com a massa para estufa a 105°C, durante 5 horas. Resfrie em dessecador até temperatura ambiente e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de glúten seco P = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 132-133. 419/IV Pesquisa de bromato em massa fresca para pão (prova de triagem) Este método fundamenta-se na capacidade oxidante do bromato e também de outros ânions eventualmente presentes nas massas para pães, promovendo a conversão do íon iodeto a iodo. Material Balança analítica, estufa, capela para substâncias corrosivas, peneira malha 40, papel de iltro ou papel para cromatograia Whatman nº 1, suporte circular de vidro (plástico ou acrílico), almofariz com pistilo, provetas de vidro, balões volumétricos de 100 mL, atomizador e papel alumínio. 816 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja Reagentes Solução de iodeto de potássio – Dissolva 1 g de iodeto de potássio em 100 mL de água. Guarde esta solução em geladeira e use no máximo durante oito dias. Solução aquosa de ácido clorídrico (1+3) Solução de amido 1% m/v – Esta solução deverá ser preparada no momento do uso. Solução de trabalho de iodeto de potássio – Misture partes iguais das soluções de iodeto de potássio e de ácido clorídrico (1+3). Coloque algumas gotas de solução de amido a 1%. Procedimento – Distribua partes da massa fresca de pão em um pedaço de papel de alumínio de (30x30) cm. Seque em estufa a 50°C até completa evaporação da água presente na amostra e triture. Passe em peneira de malha 40 e armazene o pó ino obtido. Coloque uma folha de papel de iltro ou papel de cromatograia Whatman nº 1 circular de 11 cm de diâmetro sobre o suporte de vidro. Distribua o pó ino da amostra sobre o papel. Pulverize, com solução de trabalho de iodeto, a parte inferior do papel até o líquido atingir a amostra. A inexistência de pontos violáceos indica a ausência de agentes oxidantes e conseqüentemente, a de bromato na amostra. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 137. 420/IV Prova confirmatória de bromato por cromatografia em camada delgada pães. Este método é aplicado para a determinação de bromato em massas frescas para Material Balança analítica, estufa, agitador magnético, rotavapor acoplado à bomba de vácuo, béquer de 800 mL, proveta de 500 mL, funil de Büchner, placa cromatográica com sílica gel G 60 de (20x20) cm, cuba cromatográica, capilar ou microseringa de (10-50) μL, frasco Erlenmeyer de 50 mL e balão volumétrico de 100 mL. Reagentes Solução-padrão de brometo de potássio ou de sódio a 1% m/v Butanol IAL - 817 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Acetona Hidróxido de amônio Água oxigenada a 30% (peridrol) Solução de sulfato de zinco – Dissolva 20 g de ZnSO4.7H2O em um litro de água. Hidróxido de sódio 0,4 M – Dissolva 16 g de NaOH em um litro de água. Solução-padrão de bromato de potássio ou de sódio a 1% m/v – Dissolva 1 g de KBrO3 (ou NaBrO3) em 100 mL de água. Solução de luoresceína – Dissolva 10 mg de luoresceína em 100 mL de álcool a 50%. Fase móvel – Em uma proveta de 100 mL misture butanol, acetona e hidróxido de amônio na proporção de 1:3:1. Solução-reveladora – Prepare uma solução de ácido acético e peridrol na proporção de 10:1. Em um frasco Erlenmeyer de 50 mL, adicione quantidades iguais desta solução e da solução de luoresceína. Esta mistura deverá ser preparada no momento da revelação do cromatograma. Procedimento – Transira 200 mL da solução de sulfato de zinco para um béquer de 800mL. Agite vigorosamente com agitador magnético. Transira cerca de 50 g da amostra inamente pulverizada, em porções pequenas. Continue agitando por cinco minutos ou até que toda a farinha se disperse. Adicione 50 mL de NaOH 0,4 M, sob agitação contínua. Diminua a agitação e continue por mais cinco minutos. Filtre em funil de Büchner com papel de iltro. Reserve o iltrado e transira-o para um balão do rotavapor. Acople o balão ao rotavapor e evapore o líquido até aproximadamente 50 mL do extrato concentrado, mantendo a temperatura do banho-maria não superior a 50ºC. Ative a placa em estufa a 105ºC por uma hora. Trace colunas de 2cm de largura e marque um ponto no centro da coluna a 2 cm de altura da parte inferior da placa. Trace uma linha horizontal a 2 cm da parte superior da placa. Aplique, com auxílio de capilar ou microseringa, 5 μL do extrato concentrado em uma das colunas e 2 μL das soluções-padrão de bromato e de brometo em outras duas colunas. Coloque a fase móvel na cuba cromatográica, tampe com uma placa de vidro e deixe saturar por cerca de uma hora. Coloque a placa imergindo a parte inferior no solvente e corra o cromatograma até que o solvente atinja cerca 1cm da parte superior da placa. Retire a placa, marque a frente do solvente e deixe secar ao ar, na capela, e aplique a solução reveladora sobre toda a superfície da placa. Seque em estufa a 105°C até o aparecimento de manchas características de cor rósea. Determine os 818 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja respectivos Rf. A comparação dos valores dos Rf dos padrões com o do componente da amostra permite a sua identiicação. Cálculo Dc = distância percorrida pelo componente da amostra, a partir do ponto de aplicação da amostra Ds= distância percorrida pela fase móvel, do ponto de aplicação da amostra até a frente marcada Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 137-138. COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO. Introdução a métodos cromatográficos. Campinas, SP: ed. UNICAMP, 1993. p. 29-43. Pães, biscoitos, produtos de confeitaria e massas alimentícias Na análise das preparações a base de farinhas, as determinações de umidade (012/V), acidez (016/IV), lipídios (032/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), carboidratos (038/IV e 039/IV), cinzas (018/IV) e ibras (045/IV e 046/IV) são as mais gerais. Nestes produtos deve ser feita a pesquisa de corantes naturais e artiiciais, de acordo com (051/IV). Pães de leite devem ser examinados em relação à presença de lactose, o que poderá ser feito por cromatograia em papel (041/IV ou 042/IV). Nas massas alimentícias contendo ovos, deve ser feita a determinação de colesterol. Os aditivos e enriquecedores devem ser pesquisados ou determinados de acordo com as técnicas especíicas. 421/IV Colesterol em massas alimentícias A determinação do teor de colesterol destina-se ao controle do número de ovos utilizados na fabricação de massas alimentícias. O mesmo método pode ser também utilizado para determinar o teor de colesterol nos ovos in natura, pasteurizados ou em pó. O colesterol é extraído com solvente orgânico e após formação de complexo colorido, é medida a intensidade da cor por espectrofotometria de absorção na região do vísível. IAL - 819 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Chapa aquecedora com reluxo, balança analítica, banho-maria, espectrofotômetro UV/ IS, tamis de malha 20, extrator de Soxhlet, balão de 250 mL com boca esmerilhada 24/40, balões volumétricos de 50, 100 e 200 mL, pipeta volumétrica de 5 mL e tubo de ensaio com tampa envolto em material opaco (papel alumínio). Reagentes Clorofórmio Anidrido acético glacial Ácido acético Ácido sulfúrico Colesterol Solução-reagente – Misture 100 mL de ácido acético glacial, 110 mL de anidrido acético e 15 mL de ácido sulfúrico concentrado. Conserve em geladeira e use no período de uma semana. Procedimento – Pese, com precisão, aproximadamente 4g da amostra previamente moída e peneirada em tamis de 20 mesh. Leve a um cartucho de extração e mantenha em extração contínua em aparelho de Soxhlet com clorofórmio, durante 20 horas. Retire o cartucho. Reduza o volume do solvente do balão a cerca de 15 mL, destilando o solvente. Transira quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL com auxílio de clorofórmio. Transira 5 mL do extrato para um tubo de ensaio envolto em material opaco. Adicione 5 mL da mistura reagente. Tampe, agite e mantenha o tubo em banho-maria a 37°C, por 20 minutos. Faça a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 625 nm, utilizando cubetas de 1 cm de caminho óptico. Curva-padrão – Prepare uma solução-mãe utilizando 0,2 g de colesterol dissolvido em clorofórmio. Transira para balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com o mesmo solvente. A partir desta solução-mãe, prepare diferentes diluições, com alíquotas de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 mL em balões volumétricos de 100 mL e completando os volumes com clorofórmio. Transira 5 mL de cada uma das soluções para tubos de ensaio envoltos em material opaco. Adicione 5 mL da mistura reagente. Tampe os tubos, agite e mantenha em banho-maria a 37°C por 20 minutos. Leia a absorbância em espectrofotômetro a 625 nm. Trace a curva-padrão da absorbância versus concentração de colesterol. Cálculo 820 - IAL Capítulo XXVI - Cereais, Amiláceos e Extrato de Soja Determine o teor de colesterol usando a curva-padrão previamente estabelecida e faça o cálculo para determinar a porcentagem de colesterol na amostra analisada. Malte Malte é o produto da germinação e posterior dessecação do grão de cevada (Hordeum sativum) ou de outros cereais. Entre as determinações usuais, são mais importantes as determinações do extrato e da umidade (012/IV). Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 58-59. 422/IV Malte – Determinação do extrato Material Béqueres de 100 e 600 mL, moinho, proveta de 200 mL e funil de vidro de 20 cm de diâmetro. Procedimento – Pese 55 g da amostra em um béquer de 100 mL. Triture em moinho ajustado de modo a proporcionar um produto que, após passar por um tamis de 121 furos por cm2, deixe um resíduo de 9 a 11% do peso inicial. Transira a substância moída para um béquer de 600 mL previamente tarado. Retire as partículas aderentes ao moinho e coloque-as no béquer. Ajuste, imediatamente, o peso da amostra a 50 g, removendo o excesso. (Reserve este excesso em um frasco com rolha esmerilhada para a determinação da umidade). Adicione ao béquer 200 mL de água a 46°C. Misture bem com uma bastão de vidro, impedindo a formação de grumos. Lave cuidadosamente o bastão de vidro e as paredes do béquer com 10 mL de água. (Neste ponto da análise, anote o odor do malte). Coloque o béquer em um banho de água a 46°C. Adapte ao béquer um agitador e um termômetro. Agite e mantenha a temperatura a 45°C, por 30 minutos exatos. Eleve a temperatura de 1°C por minuto até atingir 70°C. Adicione 100 mL de água previamente aquecida a 70°C. Mantenha esta temperatura por 60 minutos. Esfrie à temperatura ambiente (o tempo de resfriamento deve estar compreendido entre 10 e 15 minutos). Interrompa a agitação. Retire o agitador e o termômetro e lave com água. Seque as paredes externas do béquer. Coloque imediatamente o béquer na balança e ajuste o peso do conteúdo a 450 g, pela adição de água. Agite bem com um bastão de vidro. Deixe em repouso por 10 minutos. Agite novamente e iltre, de uma só vez, em papel de iltro pregueado. IAL - 821 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cubra o funil com um vidro de relógio durante a iltração. Receba o iltrado em frasco seco, tendo voltado ao iltro os primeiros 100 mL. Agite o iltrado com um movimento de rotação. Determine a densidade, a 20°C, deste iltrado conforme (011/IV). Cálculo E = nº de g de sólidos por 100 g do extrato, correspondente à densidade A = nº de g de umidade por cento da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 171-172. Extrato de soja e bebida com extrato de soja Extrato de soja é o produto obtido a partir da emulsão aquosa resultante da hidratação dos grãos de soja convenientemente limpos, seguido de processamento tecnológico adequado, adicionado ou não de ingredientes opcionais, como por exemplo, gorduras ou óleos, açúcares, dextrinas ou amidos, aminoácidos, sais minerais e vitaminas; podendo ser submetido à desidratação, total ou parcial. O extrato de soja constitui fonte de proteínas e pode ser usado como alimento ou como ingrediente para elaboração de alimentos, como por exemplo, bebida com extrato de soja. As análises usuais para extrato de soja e bebida com extrato de soja incluem as determinações de: substâncias voláteis (483/IV) ou (484/IV), resíduo por incineração (cinzas) (018/IV), lipídios (486/IV), protídios (036/IV ou 037/IV), glicídios (040/IV) e ibra alimentar (045/IV - 046/IV). Colaboradores Cláudio de Flora, Deise Aparecida Pinatti Marsiglia, Irani Rodrigues de Oliveira, Leonídio Guilherme , Marcelo Vaz Leonardo, Marilda Duarte e Rejane W. de Abreu 822 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados CAPÍTULO XXVII LEITES E DERIVADOS IAL - 823 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 824 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados XXVII LEITES E DERIVADOS Leite fluido: in natura, pasteurizado e UHT ntende-se por leite, sem outra especiicação, o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite de outros animais deve denominar-se segundo a espécie de que proceda. Na pasteurização, devem ser ielmente observados os limites de temperatura e o tempo de aquecimento: (72-75)°C por (15-20) segundos. Na refrigeração subseqüente, a temperatura de saída do leite não deve ser superior a 4°C. Leite UHT é aquele homogeneizado e submetido durante (2-4) segundos a uma temperatura de (130-150)°C, mediante um processo térmico de luxo contínuo, imediatamente resfriado a uma temperatura inferior a 32°C e envasado sob condições assépticas em embalagens estéreis e hermeticamente fechadas. As principais determinações para este tipo de alimento são: acidez, estabilidade ao álcool a 68%, densidade, gordura, sólidos totais, extrato seco total e desengordurado, crioscopia e índice de refração do soro cúprico a 20°C. Para o leite pasteurizado, as provas de fosfatase e peroxidase deverão, também, ser efetuadas. Outras determinações como ácidos graxos, proteínas (036/ IV ou 037/IV), caseína, lactose, resíduo por incineração (cinzas) e pesquisa de conservadores, contribuem para a avaliação da qualidade do produto. E 423/IV Leites – Determinação de densidade a 15°C O leite é uma emulsão de gordura em água e sua densidade fornece informações sobre a quantidade de gordura nele contida. De maneira geral, um acréscimo de gordura provoca uma diminuição no valor da densidade. IAL - 825 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Termolactodensímetro de Quevenne ou Gerber, balança analítica, proveta de 250 mL, mula, dessecador com sílica-gel, placa de Petri, balão volumétrico de 1000 mL, espátula, bastão de vidro e papel absorvente. Reagente Solução de cloreto de sódio 44 g/L – Seque, em uma placa de Petri, cerca de 45 g de cloreto de sódio em mula a 300°C por duas horas e resfrie em dessecador. Pese exatamente 44 g e dissolva em balão volumétrico de 1000 mL. Esta solução terá a densidade de 1,030, a 20°C. Procedimento – Transira, para uma proveta de 250 mL, uma quantidade da amostra previamente homogeneizada e resfriada que permita introduzir o termolactodensímetro. A temperatura deverá variar de (10-20)°C. Introduza o termolactodensímetro lentamente, evitando mergulhá-lo além do ponto de aloramento e tendo o cuidado de não encostar nas paredes da proveta. Faça a leitura ao nível do leite, no menisco superior. Levante um pouco o termolactodensímetro e enxugue a haste com papel absorvente, de cima para baixo. Mergulhe novamente o termolactodensímetro até próximo do traço anteriormente observado. Espere que a coluna de mercúrio do termômetro e o densímetro se estabilizem. Proceda a leitura da densidade e da temperatura. Expresse a densidade a 15°C utilizando a Tabela 1. Os valores dos graus lactodensimétricos correspondem à 2ª, 3ª e 4ª casas decimais do valor da densidade. Para obter o valor da densidade corrigida a 15°C, basta colocar 1 à esquerda do valor do grau lactodensimétrico obtido na Tabela 1. Se os valores da densidade não estiverem contidos nesta tabela, faça a correção da leitura acrescentando 0,0002 para cada grau acima de 15°C ou diminuindo 0,0002 para cada grau abaixo de 15°C. Ex.: para leitura a 16°C com densidade igual a 1,0150, some a esta leitura 0,0002; para leitura a 12°C com densidade igual a 1,0150, subtraia 0,0006 desta leitura. Fator de correção do termolactodensímetro – Transira a solução de cloreto de sódio 44 g/L para uma proveta de 250 mL e introduza lentamente o termolactodensímetro, tendo o cuidado de não encostar nas paredes da proveta. Após a temperatura estabilizar a 20°C, anote a densidade. Calcule o fator de correção, que corresponde à diferença entre o valor teórico da densidade da solução de cloreto de sódio, que é igual a 1,030 e o da densidade lida no termolactodensímetro. Nota: o fator de correção deve ser sempre somado à densidade obtida na amostra analisada, lida no termolactodensímetro (densidade do leite a 15°C). 826 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Temperatura do leite (leitura) Graus Lactodensimétricos Tabela 1 – Correção da densidade do leite, segundo a temperatura 10°C 11°C 12°C 13°C 14°C 15°C 16°C 17°C 18°C 19°C 20°C Graus lactodensimétricos (correção) 195 189 190 191 192 193 195 196 198 200 202 204 200 193 194 195 196 198 200 201 203 205 207 209 205 198 199 200 201 203 205 207 209 211 213 215 210 203 204 205 206 208 210 212 214 216 218 220 215 208 209 210 211 213 215 217 219 221 223 225 220 213 214 215 216 218 220 222 224 226 228 230 225 218 219 220 221 223 225 227 229 231 233 235 230 223 224 225 226 228 230 232 234 236 238 240 235 228 229 230 231 233 235 237 239 241 243 245 240 233 234 235 236 238 240 242 244 246 248 250 245 238 239 240 241 243 245 247 249 251 253 255 250 242 243 245 246 248 250 252 254 256 258 260 255 247 248 250 251 253 255 257 259 261 264 266 260 252 253 255 256 258 260 262 264 266 269 271 265 257 258 260 261 263 265 267 269 271 274 277 270 262 263 265 266 268 270 272 274 276 279 282 275 267 268 270 271 273 275 277 279 281 284 287 280 271 272 274 276 278 280 282 284 286 289 292 285 276 277 279 281 283 285 287 289 291 294 297 290 281 282 284 286 288 290 292 294 296 299 302 295 286 287 289 291 293 295 297 299 301 304 307 300 290 292 294 296 298 300 302 304 306 309 312 305 295 297 299 301 303 305 307 309 312 315 318 310 300 302 304 306 308 310 312 314 317 320 323 315 305 307 309 311 313 315 317 319 322 325 328 320 310 312 314 316 318 320 322 324 327 330 333 325 315 317 319 321 323 325 327 329 332 335 338 330 320 322 324 326 328 330 332 334 337 340 343 335 325 327 329 331 333 335 337 339 342 345 348 340 329 331 333 335 338 340 342 344 347 350 353 IAL - 827 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referências bibliográficas FONSECA DA SILVA, P. H.; PEREIRA, D. B. C.; OLIVEIRA, L. L; COSTA-JÚNIOR, L. C. G. Físico-química do leite e derivados – Métodos analíticos. Juiz de Fora, Minas Gerais, 1997, p.25. INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 199-200. 424/IV Leites – Determinação do grau refratométrico do soro cúprico a 20°C O método baseia-se no princípio de que a adição de água ao leite dilui as substâncias dissolvidas em seu soro. Uma leitura abaixo de 37°Zeiss do soro cúprico a 20°C sugere adição de água ao leite. Material Refratômetro de imersão de Zeiss, frasco Erlenmeyer de 150 mL, proveta de 50 mL, pipeta volumétrica de 10 mL, funil de vidro e papel de iltro. Reagente Solução cúprica – Pese 7,25 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O), transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. A leitura desta solução, no refratômetro de imersão de Zeiss a 20°C, deverá ser de 36°Z. Procedimento – Transira para um dos copos do refratômetro de imersão de Zeiss uma quantidade correspondente a mais da metade da sua capacidade de água, recentemente fervida e resfriada. Mergulhe o prisma do refratômetro e prenda pelos grampos do respectivo suporte. Deixe nessa posição por 10 minutos, tendo o cuidado de manter o banho em uma temperatura constante. Ilumine o campo e ajuste a ocular. A porção superior do campo, de 0 a 15, aparecerá clara e nítida separada da camada inferior sombria. Faça a leitura e anote a temperatura da água. A leitura deve estar de acordo com a Tabela 2. Preparo e leitura da amostra – Transira, para um frasco Erlenmeyer de 150 mL, com o auxílio de uma pipeta, 10 mL da solução cúprica e adicione 40 mL da amostra. A adição da amostra deve ser aos poucos, com agitação. Deixe em repouso por 5 minutos. Filtre em papel de iltro. Despreze as primeiras gotas do iltrado, que deverá estar límpido. Receba o iltrado em um frasco Erlenmeyer de 150 mL, seco. Transira o iltrado para o copo do refratômetro de imersão de Zeiss, ajuste a temperatura do banho a 20°C, mergulhe o prisma do refratômetro e prenda pelos grampos do respectivo suporte. Mantenha a temperatura do banho a 20°C e faça a leitura. 828 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Tabela 2 – Controle no refratômetro de imersão de Zeiss Temperatura °C Leitura no aparelho 10,0 16,50 11,0 16,15 12,0 16,00 13,0 15,85 14,0 15,70 15,0 15,50 16,0 15,30 17,0 15,10 17,5 15,00 18,0 14,90 19,0 14,70 20,0 14,50 21,0 14,25 22,0 14,00 23,0 13,75 24,0 13,50 25,0 13,25 26,0 13,00 27,0 12,70 28,0 12,40 29,0 12,10 30,0 11,80 Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 201-202. 425/IV Leites – Determinação da adição de água por crioscopia eletrônica A crioscopia do leite corresponde à medida de seu ponto de congelamento, utilizando o crioscópio eletrônico. O valor desta medida varia em função da época do ano, região geográica e da raça e alimentação do gado. O grau crioscópico do leite fraudado com água tende a aproximar-se de 0°C, ponto de congelamento da água. A adição de IAL - 829 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital água ao leite não só reduz a qualidade do mesmo, como também pode ocasionar contaminação dependendo da qualidade da água adicionada, representando um risco à saúde do consumidor. Neste método, a amostra é rapidamente resfriada a alguns graus abaixo do seu ponto de congelamento, sob constante agitação. A vibração resultante ocasiona um desequilíbrio térmico no interior da amostra, fazendo com que a solução libere calor de fusão. A temperatura sobe até atingir o ponto de congelamento, permanecendo constante por algum tempo. Este tempo é denominado plateau, durante o qual se faz a leitura do ponto de congelamento. Material Crioscópio eletrônico, pipetas graduadas de 5 mL e papel absorvente. Reagentes Soluções-padrão de sacarose a 70 e 100 g/L Soluções-padrão de cloreto de sódio a 6,859 e 10,155 g/L Procedimento – Cada equipamento tem sua especiicação, por isto, siga as instruções do fabricante do aparelho, tais como, o tipo de banho refrigerante e o procedimento de calibração. As soluções para calibração geralmente utilizadas são as de cloreto de sódio e de sacarose, podendo ser utilizada também a água. A calibração do equipamento fornece uma referência coniável ao circuito eletrônico do crioscópio para que os resultados, dentro da faixa de calibração, sejam válidos. Adicione a solução refrigerante e calibre o equipamento usando duas soluções-padrão. Efetue três medições para cada amostra. Os resultados dos testes devem ser próximos, com uma tolerância de mais ou menos 0,002°C ou 0,002°H (Hortvet), conforme a especiicação do aparelho. Após cada leitura, lave cuidadosamente o sensor com água e seque com papel absorvente. Uma vez obtidas as três leituras, calcule a média aritmética. Nota: as concentrações das soluções-padrão devem seguir a especiicação do fabricante do equipamento. As mais usadas são: Cloreto de sódio 6,859 g/L a 20°C = - 0,408°C (- 0,422°H) Cloreto de sódio 10,155 g/L a 20°C = - 0,600°C (- 0,621°H) Sacarose 70 g/L a 20°C = -0,408°C (- 0,422°H) Sacarose 100 g/L a 20°C = -0,600°C (- 0,621°H) 830 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Cálculo O cálculo da estimativa de fraude por adição de água pode ser realizado por meio da fórmula abaixo: B = ponto de congelamento do leite autêntico (°C) T = ponto de congelamento da amostra (°C) Referências bibliográficas FONSECA DA SILVA, P. H.; PEREIRA, D. B. C.; OLIVEIRA, L. L; COSTAJÚNIOR, L.C.G. Físico-química do leite e derivados – Métodos analíticos. Juiz de Fora, Minas Gerais, 1997, p.31-35. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of dairy products.16th ed. Washington: APHA, 1992, p. 516-518. 426/IV Leites – Determinação da acidez em ácido láctico A acidez indica o estado de conservação do leite. Uma acidez alta é o resultado da acidiicação da lactose, provocada por microrganismos em multiplicação no leite. A acidez tende, portanto, a aumentar à medida que o leite vai envelhecendo. Material Pipeta volumétrica de 10 mL, béquer de 100 mL e bureta de 10 mL. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução de fenolftaleína a 1% Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL da amostra para um béquer de 100 mL (pipete previamente uma porção de leite e despreze-o). Adicione 5 gotas da solução de fenolftaleína. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, utilizando bureta de 10 mL, até o aparecimento de uma coloração rósea. IAL - 831 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo V = n° de mL da solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 M A = n° de mL da amostra 0,9 = fator de conversão para ácido láctico Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 203-204. 427/IV Leites – Determinação da acidez em graus Dornic Material Pipeta volumétrica de 10 mL, béquer de 100 mL e acidímetro de Dornic ou bureta de 10 mL. Reagentes Solução de Dornic (Hidróxido de sódio N/9) Solução de fenolftaleína a 1% Procedimento – Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL da amostra para um béquer de 100 mL. Adicione 5 gotas da solução de fenolftaleína. Titule com a solução de hidróxido de sódio N/9, utilizando bureta de 10 mL ou acidímetro de Dornic, até o aparecimento de uma coloração rósea. Faça a leitura e dê o resultado em graus Dornic. Nota: cada 0,1 mL da solução de hidróxido de sódio N/9 equivale a 1°D. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 203-204. 832 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados 428/IV Leites – Estabilidade ao etanol a 68% (teste do álcool) Este método objetiva estimar a estabilidade térmica do leite por meio da reação com solução alcoólica. A ocorrência de coagulação se dá por efeito da elevada acidez ou desequilíbrio salino, quando se promove a desestabilização das micelas do leite pelo álcool. Material Tubo de ensaio de 20 mL, suporte para tubos de ensaio e pipetas graduadas de 2 mL. Reagente Álcool a 68% v/v Procedimento – Adicione, em um tubo de ensaio, utilizando pipetas, 2 mL de leite e 2 mL de álcool a 68%, misture cuidadosamente e observe. Resultado Instável : coagulado Estável: sem coagulação Referência bibliográfica FONSECA DA SILVA, P. H.; PEREIRA, D. B. C.; OLIVEIRA, L. L; COSTAJÚNIOR, L.C.G. Físico-química do leite e derivados – Métodos analíticos. Juiz de Fora, Minas Gerais, 1997, p.21. 429/IV Leites – Determinação do extrato seco total (resíduo seco a 105°C) O extrato seco total ou resíduo seco é obtido após a evaporação da água e substâncias voláteis. Material Balança analítica, estufa, cápsula de porcelana, banho-maria, areia puriicada, dessecador com sílica-gel, pipeta volumétrica de 5 mL, bastões de vidro e pinça metálica. IAL - 833 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese, em uma cápsula, 10 g de areia puriicada e dois bastões de vidro apoiados na borda do recipiente. Seque em estufa a (103±2)°C por 2 horas, resfrie em dessecador e pese. Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 5 mL da amostra e misture bem com auxílio dos dois bastões. Seque em banho-maria fervente e deixe em estufa a (103 ± 2)°C por 1 hora. Resfrie em dessecador e pese. Retorne à estufa por 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo P = n° de g de resíduo seco A = n° de mL da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 204-205. 430/IV Leites – Determinação do extrato seco total por métodos indiretos Procedimento – Para veriicar o valor do extrato seco total pelo disco de Ackermann, faça coincidir as graduações dos círculos interno e médio, correspondentes à densidade e à gordura, respectivamente. A posição da lecha indicará, no círculo externo, o extrato seco total por cento m/v. Alternativamente, determine o extrato seco total por cento m/v, por meio da Tabela 3 ou pela fórmula de Fleishmann. Cálculo Calcule o resíduo seco por meio da fórmula de Fleishmann: G = nº de g de gordura por cento m/v D = densidade do leite a 15ºC Tabela 3 – Determinação do extrato seco total com relação à densidade a 15°C e à porcentagem de gordura 834 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Densidade a 15ºC 2,0 2,1 2,2 2,3 1,0260 1,0261 1,0262 1,0263 1,0264 1,0265 1,0266 1,0267 1,0268 1,0269 1,0270 1,0271 1,0272 1,0273 1,0274 1,0275 1,0276 1,0277 1,0278 1,0279 1,0280 1,0281 1,0282 1,0283 1,0284 1,0285 1,0286 1,0287 1,0288 1,0289 1,0290 1,0291 1,0292 1,0293 1,0294 1,0295 1,0296 1,0297 1,0298 1,0299 1,0300 1,0301 1,0302 1,0303 1,0304 1,0305 1,0306 1,0307 1,0308 1,0309 1,0310 1,0311 9,15 9,18 9,20 9,23 9,26 9,28 9,31 9,33 9,36 9,38 9,41 9,43 9,46 9,48 9,51 9,53 9,56 9,58 9,61 9,63 9,66 9,68 9,71 9,73 9,76 9,79 9,81 9,84 9,86 9,89 9,91 9,94 9,96 9,99 10,01 10,04 10,06 10,09 10,11 10,14 10,16 10,19 10,21 10,24 10,26 10,29 10,31 10,34 10,36 10,39 10,41 10,44 9,27 9,30 9,32 9,35 9,38 9,40 9,43 9,45 9,48 9,50 9,53 9,55 9,58 9,60 9,63 9,65 9,68 9,70 9,73 9,75 9,78 9,80 9,83 9,85 9,88 9,91 9,93 9,96 9,98 10,01 10,03 10,06 10,08 10,11 10,13 10,16 10,18 10,21 10,23 10,26 10,28 10,31 10,33 10,36 10,38 10,41 10,43 10,46 10,48 10,51 10,53 10,56 9,39 9,42 9,44 9,47 9,50 9,52 9,55 9,57 9,60 9,62 9,65 9,67 9,70 9,72 9,75 9,77 9,80 9,82 9,85 9,87 9,90 9,92 9,95 9,97 10,00 10,03 10,05 10,08 10,10 10,13 10,15 10,18 10,20 10,23 10,25 10,28 10,30 10,33 10,35 10,38 10,40 10,43 10,45 10,48 10,50 10,53 10,55 10,58 10,60 10,63 10,65 10,68 9,51 9,54 9,56 9,59 9,62 9,64 9,67 9,69 9,72 9,74 9,77 9,79 9,82 9,84 9,87 9,89 9,92 9,94 9,97 9,99 10,02 10,04 10,07 10,09 10,12 10,15 10,17 10,20 10,22 10,25 10,27 10,30 10,32 10,35 10,37 10,40 10,42 10,45 10,47 10,50 10,52 10,55 10,57 10,60 10,62 10,65 10,67 10,70 10,72 10,75 10,77 10,80 Porcentagem de gordura 2,4 2,5 2,6 Extrato seco total 9,63 9,75 9,87 9,66 9,78 9,90 9,68 9,80 9,92 9,71 9,83 9,95 9,74 9,86 9,98 9,76 9,88 10,00 9,79 9,91 10,03 9,81 9,93 10,05 9,84 9,96 10,08 9,86 9,98 10,10 9,89 10,01 10,13 9,91 10,03 10,15 9,94 10,06 10,18 9,96 10,08 10,20 9,99 10,11 10,23 10,01 10,13 10,25 10,04 10,16 10,28 10,06 10,18 10,30 10,09 10,21 10,33 10,11 10,23 10,35 10,14 10,26 10,38 10,16 10,28 10,40 10,19 10,31 10,43 10,21 10,33 10,45 10,24 10,36 10,48 10,27 10,39 10,51 10,29 10,41 10,53 10,32 10,44 10,56 10,34 10,46 10,58 10,37 10,49 10,61 10,39 10,51 10,63 10,42 10,54 10,66 10,44 10,56 10,68 10,47 10,59 10,71 10,49 10,61 10,73 10,52 10,64 10,76 10,54 10,66 10,78 10,57 10,69 10,81 10,59 10,71 10,83 10,62 10,74 10,86 10,64 10,76 10,88 10,67 10,79 10,91 10,69 10,81 10,93 10,72 10,84 10,96 10,74 10,86 10,98 10,77 10,89 11,01 10,79 10,91 11,03 10,82 10,94 11,06 10,84 10,96 11,08 10,87 10,99 11,11 10,89 11,01 11,13 10,92 11,04 11,16 2,7 2,8 2,9 3,0 9,99 10,02 10,04 10,07 10,10 10,12 10,15 10,17 10,20 10,22 10,25 10,27 10,30 10,32 10,35 10,37 10,40 10,42 10,45 10,47 10,50 10,52 10,55 10,57 10,60 10,63 10,65 10,68 10,70 10,73 10,75 10,78 10,80 10,83 10,85 10,88 10,90 10,93 10,95 10,98 11,00 11,03 11,05 11,08 11,10 11,13 11,15 11,18 11,20 11,23 11,25 11,28 10,11 10,14 10,16 10,19 10,22 10,24 10,27 10,29 10,32 10,34 10,37 10,39 10,42 10,44 10,47 10,49 10,52 10,54 10,57 10,59 10,62 10,64 10,67 10,69 10,72 10,75 10,77 10,80 10,82 10,85 10,87 10,90 10,92 10,95 10,97 11,00 11,02 11,05 11,07 11,10 11,12 11,15 11,17 11,20 11,22 11,25 11,27 11,30 11,32 11,35 11,37 11,40 10,23 10,26 10,28 10,31 10,34 10,36 10,39 10,41 10,43 10,46 10,49 10,51 10,54 10,56 10,59 10,61 10,64 10,66 10,69 10,71 10,74 10,76 10,79 10,81 10,84 10,87 10,89 10,92 10,94 10,97 10,99 11,02 11,04 11,07 11,09 11,12 11,14 11,17 11,19 11,22 11,24 11,27 11,29 11,32 11,34 11,37 11,39 11,42 11,44 11,47 11,49 11,52 10,35 10,38 10,40 10,43 10,46 10,48 10,51 10,53 10,56 10,58 10,61 10,63 10,66 10,68 10,71 10,73 10,76 10,78 10,81 10,83 10,86 10,88 10,91 10,93 10,96 10,99 11,01 11,04 11,06 11,09 11,11 11,14 11,16 11,19 11,21 11,24 11,26 11,29 11,31 11,34 11,36 11,39 11,41 11,44 11,46 11,49 11,51 11,54 11,56 11,59 11,61 11,64 IAL - 835 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Densidade a 15ºC 2,0 2,1 2,2 2,3 1,0312 1,0313 1,0314 1,0315 1,0316 1,0317 1,0318 1,0319 1,0320 1,0321 1,0322 1,0323 1,0324 1,0325 1,0326 1,0327 1,0328 1,0329 1,0330 1,0331 1,0332 1,0333 1,0334 1,0335 1,0336 1,0337 1,0338 1,0339 1,0340 1,0341 1,0342 1,0343 1,0344 1,0345 1,0346 1,0347 1,0348 1,0349 1,0350 10,46 10,49 10,51 10,54 10,56 10,59 10,61 10,64 10,66 10,69 10,71 10,74 10,76 10,79 10,81 10,84 10,86 10,89 10,91 10,94 10,96 10,99 11,01 11,04 11,06 11,09 11,11 11,14 11,16 11,19 11,21 11,24 11,26 11,29 11,31 11,34 11,36 11,39 11,41 10,58 10,61 10,63 10,66 10,68 10,71 10,73 10,76 10,78 10,81 10,83 10,86 10,88 10,91 10,93 10,96 10,98 11,01 11,03 11,06 11,08 11,11 11,13 11,16 11,18 11,21 11,23 11,26 11,28 11,31 11,33 11,36 11,38 11,41 11,43 11,46 11,48 11,51 11,53 10,70 10,73 10,75 10,78 10,80 10,83 10,85 10,88 10,90 10,93 10,95 10,98 11,00 11,03 11,05 11,08 11,10 11,13 11,15 11,18 11,20 11,23 11,25 11,28 11,30 11,33 11,35 11,38 11,40 11,43 11,45 11,48 11,50 11,53 11,55 11,58 11,60 11,63 11,65 10,82 10,85 10,87 10,90 10,92 10,95 10,97 11,00 11,02 11,05 11,07 11,10 11,12 11,15 11,17 11,20 11,22 11,25 11,27 11,30 11,32 11,35 11,37 11,40 11,42 11,45 11,47 11,50 11,52 11,55 11,57 11,60 11,62 11,65 11,67 11,70 11,72 11,75 11,77 836 - IAL Porcentagem de gordura 2,4 2,5 2,6 Extrato seco total 10,94 11,06 11,18 10,97 11,09 11,21 10,99 11,11 11,23 11,02 11,14 11,26 11,04 11,16 11,28 11,07 11,19 11,31 11,09 11,21 11,33 11,12 11,24 11,36 11,14 11,26 11,38 11,17 11,29 11,41 11,19 11,31 11,43 11,22 11,34 11,46 11,24 11,36 11,48 11,27 11,39 11,51 11,29 11,41 11,53 11,32 11,44 11,56 11,34 11,46 11,58 11,37 11,49 11,61 11,39 11,51 11,63 11,42 11,54 11,66 11,44 11,56 11,68 11,47 11,59 11,71 11,49 11,61 11,73 11,52 11,64 11,76 11,54 11,66 11,78 11,57 11,69 11,81 11,59 11,71 11,83 11,62 11,74 11,86 11,64 11,76 11,88 11,67 11,79 11,91 11,69 11,81 11,93 11,72 11,84 11,96 11,74 11,86 11,98 11,77 11,89 12,01 11,79 11,91 12,03 11,82 11,94 12,06 11,84 11,96 12,08 11,87 11,99 12,11 11,89 12,01 12,13 2,7 2,8 2,9 3,0 11,30 11,33 11,35 11,38 11,40 11,43 11,45 11,48 11,50 11,53 11,55 11,58 11,60 11,63 11,65 11,68 11,70 11,73 11,75 11,78 11,80 11,83 11,85 11,88 11,90 11,93 11,95 11,98 12,00 12,03 12,05 12,08 12,10 12,13 12,15 12,18 12,20 12,23 12,25 11,42 11,45 11,47 11,50 11,52 11,55 11,57 11,60 11,62 11,65 11,67 11,70 11,72 11,75 11,77 11,80 11,82 11,85 11,87 11,90 11,92 11,95 11,97 12,00 12,02 12,05 12,07 12,10 12,12 12,15 12,17 12,20 12,22 12,25 12,27 12,30 12,32 12,35 12,37 11,54 11,57 11,59 11,62 11,64 11,67 11,69 11,72 11,74 11,77 11,79 11,82 11,84 11,87 11,89 11,92 11,94 11,97 11,99 12,02 12,04 12,07 12,09 12,12 12,14 12,17 12,19 12,22 12,24 12,27 12,29 12,32 12,34 12,37 12,39 12,42 12,44 12,47 12,49 11,66 11,69 11,71 11,74 11,76 11,79 11,81 11,84 11,86 11,89 11,91 11,94 11,96 11,99 12,01 12,04 12,06 12,09 12,11 12,14 12,16 12,19 12,21 12,24 12,26 12,29 12,31 12,34 12,36 12,39 12,41 12,44 12,46 12,49 12,41 12,54 12,56 12,59 12,61 Capítulo XXVII - Leites e Derivados Densidade a 15ºC 3,0 3,1 3,2 3,3 1,0260 1,0261 1,0262 1,0263 1,0264 1,0265 1,0266 1,0267 1,0268 1,0269 1,0270 1,0271 1,0272 1,0273 1,0274 1,0275 1,0276 1,0277 1,0278 1,0279 1,0280 1,0281 1,0282 1,0283 1,0284 1,0285 1,0286 1,0287 1,0288 1,0289 1,0290 1,0291 1,0292 1,0293 1,0294 1,0295 1,0296 1,0297 1,0298 1,0299 1,0300 1,0301 1,0302 1,0303 1,0304 1,0305 1,0306 1,0307 1,0308 1,0309 1,0310 1,0311 1,0312 1,0313 10,35 10,38 10,40 10,43 10,46 10,48 10,51 10,53 10,56 10,58 10,61 10,63 10,66 10,68 10,71 10,73 10,76 10,78 10,81 10,83 10,86 10,88 10,91 10,93 10,96 10,99 11,01 11,04 11,06 11,09 11,11 11,14 11,16 11,19 11,21 11,24 11,26 11,29 11,31 11,34 11,36 11,39 11,41 11,44 11,46 11,49 11,51 11,54 11,56 11,59 11,61 11,64 11,66 11,69 10,47 10,50 10,52 10,55 10,58 10,60 10,63 10,65 10,68 10,70 10,73 10,75 10,78 10,80 10,83 10,85 10,88 10,90 10,93 10,95 10,98 11,00 11,03 11,05 11,08 11,11 11,13 11,16 11,18 11,21 11,23 11,26 11,28 11,31 11,33 11,36 11,38 11,41 11,43 11,46 11,48 11,51 11,53 11,56 11,58 11,61 11,63 11,66 11,68 11,71 11,73 11,76 11,78 11,81 10,59 10,62 10,64 10,67 10,70 10,72 10,75 10,77 10,80 10,82 10,85 10,87 10,90 10,92 10,95 10,97 11,00 11,02 11,05 11,07 11,10 11,12 11,15 11,17 11,20 11,23 11,25 11,28 11,30 11,33 11,35 11,38 11,40 11,43 11,45 11,48 11,50 11,53 11,55 11,58 11,60 11,63 11,65 11,68 11,70 11,73 11,75 11,78 11,80 11,83 11,85 11,88 11,90 11,93 10,71 10,74 10,76 10,79 10,82 10,84 10,87 10,89 10,92 10,94 10,97 10,99 11,02 11,04 11,07 11,09 11,12 11,14 11,17 11,19 11,22 11,24 11,27 11,29 11,32 11,35 11,37 11,40 11,42 11,45 11,47 11,50 11,52 11,55 11,57 11,60 11,62 11,65 11,67 11,70 11,72 11,75 11,77 11,80 11,82 11,85 11,87 11,90 11,92 11,95 11,97 12,00 12,02 12,05 Porcentagem de gordura 3,4 3,5 3,6 Extrato seco total 10,83 10,95 11,07 10,86 10,98 11,10 10,88 11,00 11,12 10,91 11,03 11,15 10,94 11,06 11,18 10,96 11,08 11,20 10,99 11,11 11,23 11,01 11,13 11,25 11,04 11,16 11,28 11,06 11,18 11,30 11,09 11,21 11,33 11,11 11,23 11,35 11,14 11,26 11,38 11,16 11,28 11,40 11,19 11,31 11,43 11,21 11,33 11,45 11,24 11,36 11,48 11,26 11,38 11,50 11,29 11,41 11,53 11,31 11,43 11,55 11,34 11,46 11,58 11,36 11,48 11,60 11,39 11,51 11,63 11,41 11,53 11,65 11,44 11,56 11,68 11,47 11,59 11,71 11,49 11,61 11,73 11,52 11,64 11,76 11,54 11,66 11,78 11,57 11,69 11,81 11,59 11,71 11,83 11,62 11,74 11,86 11,64 11,76 11,88 11,67 11,79 11,91 11,69 11,81 11,93 11,72 11,84 11,96 11,74 11,86 11,98 11,77 11,89 12,01 11,79 11,91 12,03 11,82 11,94 12,06 11,84 11,96 12,08 11,87 11,99 12,11 11,89 12,01 12,13 11,92 12,04 12,16 11,94 12,06 12,18 11,97 12,09 12,21 11,99 12,11 12,23 12,02 12,14 12,26 12,04 12,16 12,28 12,07 12,19 12,31 12,09 12,21 12,33 12,12 12,24 12,36 12,14 12,26 12,38 12,17 12,29 12,41 3,7 3,8 3,9 4,0 11,19 11,22 11,24 11,27 11,30 11,32 11,35 11,37 11,40 11,42 11,45 11,47 11,50 11,52 11,55 11,57 11,60 11,62 11,65 11,67 11,70 11,72 11,75 11,77 11,80 11,83 11,85 11,88 11,90 11,93 11,95 11,98 12,00 12,03 12,05 12,08 12,10 12,13 12,15 12,18 12,20 12,23 12,25 12,28 12,30 12,33 12,35 12,38 12,40 12,43 12,45 12,48 12,50 12,53 11,31 11,34 11,36 11,39 11,42 11,44 11,47 11,49 11,52 11,54 11,57 11,59 11,62 11,64 11,67 11,69 11,72 11,74 11,77 11,79 11,82 11,84 11,87 11,89 11,92 11,95 11,97 12,00 12,02 12,05 12,07 12,10 12,12 12,15 12,17 12,20 12,22 12,25 12,27 12,30 12,32 12,35 12,37 12,40 12,42 12,45 12,47 12,50 12,52 12,55 12,57 12,60 12,62 12,65 11,43 11,46 11,48 11,51 11,54 11,56 11,59 11,61 11,64 11,66 11,69 11,71 11,74 11,76 11,79 11,81 11,84 11,86 11,89 11,91 11,94 11,96 11,99 12,01 12,03 12,07 12,09 12,12 12,14 12,17 12,19 12,22 12,24 12,27 12,29 12,32 12,34 12,37 12,39 12,42 12,44 12,47 12,49 12,52 12,54 12,57 12,59 12,62 12,64 12,67 12,69 12,72 12,74 12,77 11,55 11,58 11,60 11,63 11,66 11,68 11,71 11,73 11,76 11,78 11,81 11,83 11,86 11,88 11,91 11,93 11,96 11,98 12,01 12,03 12,06 12,08 12,11 12,13 12,16 12,19 12,21 12,24 12,26 12,29 12,31 12,34 12,36 12,39 12,41 12,44 12,46 12,49 12,51 12,54 12,56 12,59 12,61 12,64 12,66 12,69 12,71 12,74 12,76 12,79 12,81 12,84 12,86 12,89 IAL - 837 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Densidade a 15ºC 3,0 3,1 3,2 3,3 1,0314 1,0315 1,0316 1,0317 1,0318 1,0319 1,0320 1,0321 1,0322 1,0323 1,0324 1,0325 1,0326 1,0327 1,0328 1,0329 1,0330 1,0331 1,0332 1,0333 1,0334 1,0335 1,0336 1,0337 1,0338 1,0339 1,0340 1,0341 1,0342 1,0343 1,0344 1,0345 1,0346 1,0347 1,0348 1,0349 1,0350 11,71 11,74 11,76 11,79 11,81 11,84 11,86 11,89 11,91 11,94 11,96 11,99 12,01 12,04 12,06 12,09 12,11 12,14 12,16 12,19 12,21 12,24 12,26 12,29 12,31 12,34 12,36 12,39 12,41 12,44 12,46 12,49 12,41 12,54 12,56 12,59 12,61 11,83 11,86 11,88 11,91 11,93 11,96 11,98 12,01 12,03 12,06 12,08 12,11 12,13 12,16 12,18 12,21 12,23 12,26 12,28 12,31 12,33 12,36 12,38 12,41 12,43 12,46 12,48 12,51 12,53 12,56 12,58 12,61 12,63 12,66 12,68 12,71 12,73 11,95 11,98 12,00 12,03 12,05 12,08 12,10 12,13 12,15 12,18 12,20 12,23 12,25 12,28 12,30 12,33 12,35 12,38 12,40 12,43 12,45 12,48 12,50 12,53 12,55 12,58 12,60 12,63 12,65 12,68 12,70 12,73 12,75 12,78 12,80 12,83 12,85 12,07 12,10 12,12 12,15 12,17 12,20 12,22 12,25 12,27 12,30 12,32 12,35 12,37 12,40 12,42 12,45 12,47 12,50 12,52 12,55 12,57 12,60 12,62 12,65 12,67 12,70 12,72 12,75 12,77 12,80 12,82 12,85 12,87 12,90 12,92 12,95 12,97 Porcentagem de gordura 3,4 3,5 3,6 Extrato seco total 12,19 12,31 12,43 12,22 12,34 12,46 12,24 12,36 12,48 12,27 12,39 12,51 12,29 12,41 12,53 12,32 12,44 12,56 12,34 12,46 12,58 12,37 12,49 12,61 12,39 12,51 12,63 12,42 12,54 12,66 12,44 12,56 12,68 12,47 12,59 12,71 12,49 12,61 12,73 12,52 12,64 12,76 12,54 12,66 12,78 12,57 12,69 12,81 12,59 12,71 12,83 12,62 12,74 12,86 12,64 12,76 12,88 12,67 12,79 12,91 12,69 12,81 12,93 12,72 12,84 12,96 12,74 12,86 12,98 12,77 12,89 13,01 12,79 12,91 13,03 12,82 12,94 13,06 12,84 12,96 13,08 12,87 12,99 13,11 12,89 13,01 13,13 12,92 13,04 13,16 12,94 13,06 13,18 12,97 13,09 13,21 12,99 13,11 13,23 13,02 13,14 13,26 13,04 13,16 13,28 13,07 13,19 13,31 13,09 13,21 13,33 3,7 3,8 3,9 4,0 12,55 12,58 12,60 12,63 12,65 12,68 12,70 12,73 12,75 12,78 12,80 12,83 12,85 12,88 12,90 12,93 12,95 12,98 13,00 13,03 13,05 13,08 13,10 13,13 13,15 13,18 13,20 13,23 13,25 13,28 13,30 13,33 13,35 13,38 13,40 13,43 13,45 12,67 12,70 12,72 12,75 12,77 12,80 12,82 12,85 12,87 12,90 12,92 12,95 12,97 13,00 13,02 13,05 13,07 13,10 13,12 13,15 13,17 13,20 13,22 13,25 13,27 13,30 13,32 13,35 13,37 13,40 13,42 13,45 13,47 13,50 13,52 13,55 13,57 12,79 12,82 12,84 12,87 12,89 12,92 12,94 12,97 12,99 13,02 13,04 13,07 13,09 13,12 13,14 13,17 13,19 13,22 13,24 13,27 13,29 13,32 13,34 13,37 13,39 13,42 13,44 13,47 13,49 13,52 13,54 13,57 13,59 13,62 13,64 13,67 13,69 12,91 12,94 12,96 12,99 13,01 13,04 13,06 13,09 13,11 13,14 13,16 13,19 13,21 13,24 13,26 13,29 13,31 13,34 13,36 13,39 13,41 13,44 13,46 13,49 13,51 13,54 13,56 13,59 13,61 13,64 13,66 13,69 13,71 13,74 13,76 13,79 13,81 Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 205. PAOLONE, L. Tabela para a determinação do resíduo seco (extrato seco) do leite. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v.17, n.1/2, p.59-70, 1957. 838 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados 431/IV Leites – Determinação do extrato seco desengordurado Procedimento – Calcule o extrato seco desengordurado por cento m/v, da seguinte forma: P-G = extrato seco desengordurado % m/v P = nº de g do extrato seco total m/v G = nº de g de gordura por cento m/v Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 205. 432/IV Leites – Determinação de glicídios redutores em lactose Material Balão volumétrico de 100 mL, pipetas volumétricas de 10 mL, pipeta graduada de 2 mL, frasco Erlenmeyer de 300 mL, funil de vidro, papel de iltro, balão de fundo chato de 300 mL, bureta de 25 mL, chapa aquecedora e garra de madeira. Reagentes Solução de sulfato de zinco a 30% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 15% m/v Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Procedimento – Transira, com auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL da amostra para um balão volumétrico de 100 mL, adicione 50 mL de água, 2 mL da solução de sulfato de zinco a 30% e 2 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15%, misturando bem após cada adição. Deixe sedimentar durante 5 minutos, complete o volume com água e agite. Filtre em papel de iltro, recebendo o iltrado, que deverá estar límpido, em um frasco Erlenmeyer de 300 mL. Em um balão de fundo chato de 300 mL, transira 10 mL de cada uma das soluções de Fehling e adicione 40 mL de água, aquecendo até a ebulição em chapa aquecedora. Transira o iltrado para uma bureta de 25 mL e adicione, às gotas, sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, utilizando garra de madeira, até que esta solução mude de coloração azul à incolor (no fundo do balão deverá icar um resíduo vermelho-tijolo). IAL - 839 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo 0,068 = nº de g de lactose que corresponde a 10 mL da solução de Fehling v = nº de mL da solução da amostra, gasto na titulação L = nº de mL da amostra V = nº de mL da diluição da amostra (100 mL) Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 206. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, 02/05/03, Brasilia, p. 15. 433/IV Leites – Determinação de gordura pelo método de Gerber O método mais empregado para a determinação de gordura no leite é o de Gerber, que baseia-se na quebra da emulsão do leite pela adição de ácido sulfúrico e álcool isoamílico, na centrifugação e posterior determinação da gordura. Esta determinação pode, ainda, ser feita em aparelhos automáticos. Material Lactobutirômetro de Gerber com respectiva rolha, balança semi-analítica, pipetadores automáticos de 10 e 1 mL, termômetro, pipeta volumétrica de 11 mL, termocentrífuga de Gerber ou centrífuga de Gerber, banho-maria, papel absorvente e luvas. Reagentes Ácido sulfúrico (D = 1,820 - 1,825) Álcool isoamílico (D = 0,815) Procedimento – Pese os lactobutirômetros com suas respectivas rolhas para veriicar se os mesmos estão com os pesos equivalentes. Transira, com o auxilio de um pipetador automático, 10 mL de ácido sulfúrico para o butirômetro. Adicione lentamente, com o auxílio de pipeta volumétrica, 11 mL da amostra, evitando que se queime ao contato com o ácido. Junte, com o auxilio de um pipetador automático, 1 mL de álcool isoamílico. 840 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Estas adições devem ser feitas sem molhar internamente o gargalo do butirômetro; se isto acontecer, limpe cuidadosamente com um papel absorvente. Arrolhe o butirômetro, pese, utilizando luvas, e agite até completa dissolução. Centrifugue a (1200 ± 100) rpm durante 15 minutos, quando for usada a termocentrífuga. No caso de usar a centrífuga de Gerber, centrifugue por 5 minutos, leve para um banho-maria a (63 ± 2)ºC, por 2 a 3 minutos, com a rolha para baixo. Retire o lactobutirômetro da termocentrífuga ou do banho na posição vertical (rolha para baixo). Manejando a rolha, coloque a camada amarela-clara, transparente (gordura), dentro da escala graduada do lactobutirômetro. O valor obtido na escala corresponde diretamente à porcentagem de gordura, cuja leitura deve ser feita no menisco inferior. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 207-208. 434/IV Leites – Extração de gordura para determinação de ácidos graxos Material Balança semi-analítica, espátula, béqueres de 250 e 600 mL, pipeta graduada de 5 mL, provetas de 100 e 200 mL, vidro de relógio, agitador magnético, barra magnética, capela de exaustão, papel de iltro e ita indicadora de pH (0-14). Reagentes Ácido clorídrico Éter anidro Sulfato de sódio anidro Procedimento – Transira, na capela, 100 mL da amostra para um béquer de 600 mL, adicione 200 mL de éter, sob agitação. Acerte o pH com ácido clorídrico até 2. Tampe o béquer com vidro de relógio. Agite por 1 hora utilizando o agitador magnético. Filtre com papel de iltro contendo sulfato de sódio anidro, receba o iltrado em um béquer de 250 mL e evapore, na capela, o solvente à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Faça a determinação dos ácidos graxos por cromatograia gasosa (053/IV). Referência bibliográfica FOX, P.F. Cheese: chemistry, physics and microbiology. v. 1: General aspects. 2nd ed., London: Chapman & Hall, 1999. p. 370. IAL - 841 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 435/IV Leites – Determinação de protídios Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 5 mL da amostra para um frasco de Kjeldahl de 300 mL e proceda conforme método 036/IV ou 037/IV, utilizando o fator 6,38 para conversão de nitrogênio em proteína. 436/IV Leites – Determinação de caseína Material Pipeta volumétrica de 10 mL, pipeta graduada de 1 mL, béqueres de 100 e 400 mL, provetas de 10 e 100 mL, termômetro, frasco de Kjeldahl de 300 mL, papel de iltro e funil de vidro. Reagente Solução saturada de sulfato duplo de alumínio e potássio Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL da amostra para um béquer de 100 mL. Adicione 40 mL de água a 50ºC e 1 mL de uma solução saturada de sulfato duplo de alumínio e potássio e agite. Filtre, utilizando papel de iltro e lave com 50 mL de água. Transira o papel de iltro com o resíduo para um frasco de Kjeldahl de 300 mL e determine a caseína neste resíduo, conforme o método 036/IV ou 037/IV, utilizando o fator 6,38 para a conversão de nitrogênio em proteína. Faça um branco com o papel de iltro. 437/IV Leites – Determinação do resíduo por incineração (cinzas) O resíduo por incineração (cinzas) do leite é constituído principalmente por óxidos de potássio, sódio, cálcio, magnésio, fósforo e por cloretos. Material Balança analítica, cápsula de porcelana, pipeta volumétrica de 20 mL, banho-maria, chapa aquecedora, mula, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL da amostra para uma cápsula de porcelana, previamente aquecida em mula a (550 ± 10)°C, por 2 horas, resfriada em dessecador e pesada. Evapore em banho-maria até a secagem. Carbo842 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados nize em chapa aquecedora na capela e incinere em mula a (550 ± 10)°C, pelo período aproximado de 4 horas. O resíduo deverá icar branco ou ligeiramente acinzentado, caso contrário, resfrie, adicione 0,5 mL de água, seque em banho-maria e incinere novamente. Resfrie em dessecador e pese. Cálculo P = n° de g de resíduo A = n°de mL da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 211-212. 438/IV Leites – Determinação da alcalinidade das cinzas em carbonato de sódio A presença de substâncias alcalinas adicionadas ao leite faz aumentar a alcalinidade das cinzas, que é determinada por via indireta fazendo-se reagir as cinzas com uma quantidade conhecida de solução ácida padronizada e titulando o excesso deste com uma solução alcalina de concentração conhecida. Material Erlenmeyer de 500 mL, bastão de vidro, proveta de 50 mL, buretas de 50 mL e chapa aquecedora Reagentes Solução de ácido clorídrico 0,1 M Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução de fenolftaleína a1% Solução de cloreto de cálcio a 40% m/v neutralizada com solução de ácido clorídrico 0,1 M e iltrada Procedimento – Transira, quantitativamente, as cinzas obtidas em 437/IV, para um Erlenmeyer de 500 mL, usando pequenas porções de água. Adicione, aos poucos, 50 mL IAL - 843 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de solução de ácido clorídrico 0,1 M e leve à ebulição moderada por 5 minutos. Resfrie e adicione 30 mL da solução de cloreto de cálcio a 40% e 5 gotas de solução de fenolftaleína. Deixe em repouso por 5 minutos e titule o excesso de ácido clorídrico com solução de hidróxido de sódio 0,1 M. A titulação deve ser bastante rápida até se obter turvação e coloração rósea. Cálculo V = diferença entre os volumes da solução de ácido clorídrico 0,1 M adicionado e da solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 M 0,053 = miliequivalentes/g de carbonato de sódio m = nº de mL da amostra Nota: valores normais para leite luido: (0,015-0,030)%.; valores superiores, sobretudo acima de 0,040%, caracterizam adição de substâncias alcalinas. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p.12. 439IV Leites – Determinação da alcalinidade das cinzas em solução normal Material Frasco Erlenmeyer de 250 mL, proveta de 50 mL, 2 buretas de 25 mL e banho-maria. Reagentes Ácido sulfúrico 0,1 N Hidróxido de sódio 0,1N Solução de fenolftaleína a 1% Procedimento – Transira, quantitativamente, as cinzas obtidas em 437/IV para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, com o auxílio de 30 mL de água. Adicione 20 mL de ácido sulfúrico 0,1 N e 5 gotas da solução de fenolftaleína (a solução deve ser incolor). Aqueça em banho-maria por 5 minutos. Titule, a quente, com uma solução de hidróxido 844 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados de sódio 0,1 N até coloração rósea. Cálculo V= diferença entre o nº de mL de ácido sulfúrico 0,1 N adicionado e o nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 N gasto na titulação A = nº de mL da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 212. 440/IV Leites – Determinação de cloretos em cloreto de sódio Os cloretos são precipitados sob a forma de cloreto de prata em pH levemente alcalino em presença de cromato de potássio como indicador. O ponto inal da titulação é visualizado pela formação do precipitado vermelho-tijolo de cromato de prata. Material Pipetas volumétricas de 10 e 20 mL, cápsula de porcelana, banho-maria, chapa aquecedora, capela de exaustão, mula, proveta de 50 mL, balão volumétrico de 100 mL, béquer de 200 mL, bureta de 10 mL, funil de vidro e papel de iltro. Reagentes Ácido nítrico Carbonato de cálcio Solução de cromato de potássio a 10% m/v Solução de nitrato de prata 0,1 M Procedimento – Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 10 mL da amostra para uma cápsula de porcelana. Evapore em banho-maria até a secagem. Carbonize em chapa elétrica na capela. Incinere em mula a (550 ± 10)ºC. As cinzas deverão icar brancas ou ligeiramente acinzentadas, caso contrário esfrie, adicione 0,5 mL de água, seque IAL - 845 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital em banho-maria e incinere novamente. Esfrie, adicione 50 mL de água e acidule com ácido nítrico. Transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água. Filtre em papel de iltro seco e receba o iltrado em um frasco seco. Transira, com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 20 mL do iltrado para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Neutralize com carbonato de cálcio e adicione mais 0,5 g. Adicione 5 gotas de uma solução de cromato de potássio a 10%. Titule com solução de nitrato de prata 0,1 M até o aparecimento de uma coloração vermelho-tijolo. Cálculo V = nº de mL da solução de nitrato de prata 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de nitrato de prata 0,1 M S = nº de mL da amostra contido na solução usada para a titulação Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 213. 441/IV Leites – Identificação de amido A prova veriica o desenvolvimento de coloração azulada após aquecimento e adição de solução iodo (solução de Lugol) à amostra, em presença de amido. O aquecimento promove a abertura da cadeia helicoidal da molécula do amido, permitindo a adsorção do iodo com o desenvolvimento da coloração caracteristica após resfriamento. Material Proveta de 10 mL, béquer de 50 mL e chapa aquecedora Reagente Solução de Lugol Procedimento – Meça 10 mL da amostra em uma proveta. Transira para um béquer e aqueça até ebulição em chapa aquecedora. Resfrie e adicione 2 gotas de solução de Lugol. 846 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Na presença de amido, aparecerá uma coloração azul. Notas Para leite em pó, reconstitua o produto antes de realizar a prova para amido. No caso de leite fermentado, doce de leite, leite condensado e queijo, pese 10 g da amostra, adicione 50 mL de água e misture. Aqueça até fervura, esfrie e realize a prova para amido. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 214. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p.7-8. 442/IV Leites – Identificação de sacarose com resorcina A resorcina em meio ácido condensa-se com as aldoses formando composto de coloração vermelha. Material Proveta de 20 mL, tubo de ensaio de 50 mL, béquer de 500 mL, chapa aquecedora, suportes para tubos de ensaios e banho-maria. Reagentes Ácido clorídrico Resorcina Procedimento – Meça 15 mL da amostra em uma proveta. Transira para um tubo de ensaio de 50 mL. Adicione 1 mL de ácido clorídrico e 0,1 g de resorcina. Agite e aqueça em banho-maria por 5 minutos. Na presença de sacarose, aparecerá uma coloração vermelha. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 217. IAL - 847 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 443/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com guaiacol Material Tubos de ensaio de 20 mL, pipetas graduadas de 2 mL e suporte para tubos de ensaios. Reagentes Solução alcoólica de guaiacol a 1% Leite cru Procedimento – Transira 10 mL da amostra para um tubo de ensaio de 20 mL. Adicione 2 mL de uma solução de guaiacol a 1% e 2 mL de leite cru. O aparecimento de uma cor salmão indicará a presença de peróxido de hidrogênio. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 218. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p.9. 444/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com pentóxido de vanádio O óxido de vanádio em meio ácido sulfúrico reage com o peróxido de hidrogênio formando o ácido ortoperoxivanádico de coloração rósea ou vermelha. Material Proveta de 10 mL e tubos de ensaio de 20 mL. Reagente Solução de óxido de vanádio (V2O5) – Pese 1 g de óxido de vanádio e adicione 100 mL de ácido sulfúrico a 6% v/v. Procedimento – Meça 10 mL da amostra em uma proveta e transira para um tubo de ensaio. Adicione de 10 a 20 gotas da solução de pentóxido de vanádio e agite. Na presença de peróxido de hidrogênio, aparecerá uma coloração rósea ou vermelha. Referência bibliográfica 848 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 219. 445/IV Leites – Identificação de peróxido de hidrogênio com iodeto Material Pipetas de 2 mL, tubos de ensaio de 20 mL, banho-maria e suporte para tubos ensaio. Reagentes Solução de ácido clorídrico a 1% v/v Solução de iodeto de potássio a 10% m/v Solução de amido a 1% m/v Procedimento – Em um tubo de ensaio, coloque 2 mL da amostra, 2 mL de solução de ácido clorídrico a 1% e 2 mL de solução de iodeto de potássio a 10%. Aqueça por um minuto em banho-maria, resfrie e adicione 2 mL de solução de amido. O desenvolvimento de uma coloração azul indica teste positivo. Nota: existe no mercado ita reativa própria para esta prova. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 219. 446/IV Leites – Identificação de formaldeído com floroglucina A loroglucina reage com o formaldeído, produzindo um derivado hidroximetilado de coloração salmão. Material Aparelho destilador, frasco de destilação, frasco Erlenmeyer de 200 mL, tubos de ensaio de 20 mL, proveta de 10 mL e suporte para tubos de ensaio. Reagentes Ácido fosfórico a 20% v/v Solução de loroglucina a 1% m/v Solução de hidróxido de sódio a 10% v/v Procedimento –Transira 50 mL da amostra para um frasco de destilação e adicione 80 mL de ácido fosfórico a 20%. Destile cerca de 40 mL, recolhendo em frasco Erlenmeyer IAL - 849 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de 200 mL. Transira 10 mL da amostra destilada para um tubo de ensaio, adicione 1 mL da solução de loroglucina a 1%, 2 mL de uma solução de hidróxido de sódio a 10% e agite. Na presença de formaldeído, aparecerá uma coloração salmão. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 219. 447/IV Leites – Identificação de formaldeído com cloreto férrico O formaldeído em meio ácido e na presença de íon férrico produz, por aquecimento, um complexo de coloração roxa. Material Proveta de 5 mL, tubos de ensaio de 20 mL, pipeta de 1 mL e suporte para tubos de ensaio. Reagentes Ácido sulfúrico (1+1) v/v Solução de cloreto férrico a 1% m/v Procedimento – Transira 5 mL da amostra destilada conforme o método 446/IV para um tubo de ensaio e adicione 1 mL da solução de ácido sulfúrico (1+1). Adicione uma gota da solução de cloreto férrico a 1% e aqueça até a ebulição. Na presença de formaldeído aparece uma coloração roxa. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 220. 448/IV Leites – Identificação de formaldeído com ácido cromotrópico O formaldeído aquecido com ácido cromotrópico em presença de ácido sulfúrico, origina um produto de condensação que, oxidado posteriormente, transforma-se em um composto p-quinoidal de coloração violeta. 850 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Material Tubos de ensaio de 20 mL, pipetas graduadas de 1 e 5 mL, balão volumétrico de 100 mL, béquer de 500 mL, chapa aquecedora, capela de exaustão e suporte para tubos de ensaio. Reagente Solução saturada de ácido cromotrópico – Pese 0,5 g de ácido cromotrópico e dissolva em 100 mL de ácido sulfúrico a 72%. Procedimento – Transira 1 mL da amostra destilada conforme o método 446/IV para um tubo de ensaio e adicione, na capela, 5 mL da solução de ácido cromotrópico, agite e aqueça em banho-maria por 15 minutos. Na presença de formaldeído, aparecerá uma coloração violeta. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 271. 449/IV Leites – Determinação de cloro e hipocloritos Este ensaio fundamenta-se na formação de iodo livre a partir da reação de iodeto de potássio com cloro livre ou hipoclorito. Material Tubos de ensaio de 25 mL, pipetas graduadas de 1 e 5 mL, proveta de 10 mL, banhomaria e suporte para tubos de ensaio. Reagentes Solução de iodeto de potássio a 7,5% m/v Ácido clorídrico (1+2) v/v Solução de amido a 1% m/v Procedimento – Em tubo de ensaio, transira 5 mL da amostra, adicione 0,5 mL de solução de iodeto de potássio a 7,5% e agite. O aparecimento da coloração amarela indica a presença de cloro livre. Para conirmar, adicione 1 mL de solução de amido a 1%. Deverá desenvolver coloração azul ou violeta; não havendo mudança de coloração, adicione 4 mL de ácido clorídrico (1+2), coloque em banho-maria a 80°C por 10 minutos. Resfrie em água corrente e observe a coloração do coagulado, que na presença de hipoclorito deverá ser amarela. Para conirmação, adicione 1 mL de solução de amido a 1%. Deverá desenvolver coloração azul ou violeta. Faça uma prova em branco com ácido clorídrico. IAL - 851 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Leite em pó e soro de leite em pó. In: _____. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: métodos físicos e químicos. Brasília, DF, 1981. v.II, cap. 14, p. 10-11. 450/IV Leites – Determinação de fosfatase A fosfatase alcalina é uma enzima hidrolítica natural do leite cru, sendo sensível às temperaturas de pasteurização. A medida da fosfatase residual é uma informação da eiciência da pasteurização. Agindo sobre o fenil fosfato dissódico, esta fosfatase libera fenol, proporcional à atividade da enzima, que reage com 2,6-dicloroquinonacloramida, produzindo o azul de indofenol, cuja intensidade de cor é medida por espectrofotometria. Material Espectrofotômetro UV/VIS, pipetas volumétricas de 0,5 e 5 mL e tubos de ensaio de (12x114) mm com diâmetro interno uniforme e banho-maria. Reagentes n-Butanol Solução de carbonato de sódio a 8% m/v Solução-tampão de carbonato – Pese 5,75 g de carbonato de sódio anidro, transira para um balão volumétrico de 500 mL, adicione 5,1 g de bicarbonato de sódio e 0,55 g de fenil fosfato dissódico (isento de fenol). Misture e complete o volume com água. Este reagente é estável por 1 semana. Solução precipitante – Pese 12,5 g de ácido tricloroacético em um béquer de 100 mL, adicione 25 mL de água, 25 mL de ácido clorídrico e misture. Solução de sulfato de cobre – Pese 0,25 g de sulfato de cobre penta-hidratado, transira para um balão volumétrico de 500 mL, adicione 25 g de hexametafosfato de sódio. Misture e complete o volume com água. Solução de CQC – Pese 0,1 g de 2,6-dicloroquinonacloramida em um béquer de 852 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados 100 mL, adicione 12,5 mL de álcool e misture. Coloque a solução em frasco contagotas âmbar. Este reagente é estável por 1 semana. Solução-tampão com catalisador – Pese 5,1 g de bicarbonato de sódio anidro, transira para um balão volumétrico de 500 mL e adicione 0,05 g de sulfato de cobre penta-hidratado. Misture e complete o volume com água. Solução-estoque de fenol – Pese 0,5 g de fenol, transira para um balão volumétrico de 500 mL. Misture e complete com água. Solução de fenol para análise a 4 μg/mL – Transira 2 mL da solução-estoque de fenol para um balão volumétrico de 500 mL e complete o volume com solução-tampão com catalisador. Procedimento – Em um tubo de ensaio, coloque 10 mL da solução-tampão de carbonato. Aqueça a 37°C por 5 minutos. Adicione 1 mL da amostra e aqueça a 37°C, por 1 hora. Remova do banho e adicione lentamente, pelas paredes, 1 mL da solução precipitante. Após alguns segundos, iltre para tubo calibrado de 5 mL, ou simplesmente colete em tubo 5 mL do iltrado. Adicione 1 mL da solução de sulfato de cobre. Pipete 5 mL da solução de carbonato de sódio a 8% aquecida e agite. Adicione duas gotas de solução CQC e inverta rapidamente o tubo. Espere o desenvolvimento da cor a 37°C, por 5 minutos. Coloque 5 mL de n-butanol, inverta o tubo por 5 vezes, deixe em repouso por 1 minuto e compare a cor com os padrões ou leia, a 650 nm, comparando posteriormente com a curva-padrão. Curva-padrão – Em seis tubos de ensaio, pipete respectivamente: 10; 9,5; 9; 8; 7 e 6 mL da solução-tampão com catalisador e, na mesma ordem, 0; 0,5; 1; 2; 3 e 4 mL de solução diluída de fenol. As concentrações nos tubos serão, respectivamente: 0, 4, 8, 12 e 16 μg de fenol por 10 mL. Adicione a cada tubo duas gotas de CQC, sob agitação e inverta uma vez os tubos. Incube a 37°C, durante 5 minutos. Adicione 5 mL de álcool butílico. Inverta 5 vezes os tubos para extrair a cor, feche com tampas de borracha e mantenha no refrigerador até o momento da leitura. Remova 3 mL da camada alcoólica e leia em espectrofotômetro UV/VIS a 650 nm. Notas Prepare sempre um controle positivo, um negativo e outro de interferentes. Controle negativo – Aqueça 5 mL de leite cru até temperatura interna de 85°C, por 1 minuto, com agitação. Este controle não deverá apresentar coloração azul. Controle positivo – Adicione 0,1 mL de leite cru a 100 mL de leite cru que tenha sido IAL - 853 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital fervido à temperatura interna de 85°C, por um minuto. Este controle deverá dar reação positiva (serve para testar os reagentes). Controle de interferentes – Quando a reação na amostra revelar presença de fenóis, deve ser feito um novo teste sem a adição do reagente solução-tampão de carbonato. Uma coloração azul indica presença de interferentes fenólicos. Existe no mercado kit para prova de fosfatase. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 221-223. 451/IV Leites – Prova de peroxidase A peroxidase é uma enzima presente no leite, que é destruída quando aquecido acima de 75°C, por mais de 20 segundos (temperatura e tempo limites para a pasteurização do leite). Este teste avalia se o processo de pasteurização foi eiciente. Material Tubos de ensaio de 20 mL, pipetas graduadas de 2 e 10 mL, banho-maria, capela de exaustão, termômetro e suporte para tubos de ensaio. Reagentes Solução de alcoólica guaiacol a 1% v/v Peróxido de hidrogênio a 3% Procedimento – Transira 10 mL da amostra para um tubo de ensaio de 20 mL, aqueça em banho-maria a (43 ± 2)°C por 5 minutos. Na capela, adicione 2 mL da solução de guaiacol pelas paredes do tubo e 3 gotas de peróxido de hidrogênio. O desenvolvimento de uma coloração salmão indica peroxidase positiva. 854 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 223-224. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p.9. Leite em pó Entende-se por leite em pó o produto obtido pela desidratação do leite integral, desnatado ou parcialmente desnatado, mediante processo tecnológico adequado. Este produto pode ser modiicado com adição ou supressão de nutrientes para atender às necessidades do consumidor, levando em conta a faixa etária e exigências nutricionais especíicas. As principais determinações para este tipo de alimento são: acidez em ácido láctico, substâncias voláteis, resíduo por incineração, alcalinidade das cinzas, gordura, ácidos graxos, protidíos, glicídios redutores em lactose, cromatograia de açúcares, prova de reconstituição e prova de rancidez conforme o método 333/IV. 452/IV Leite em pó – Prova de reconstituição Procedimento – Faça a reconstituição do produto conforme especiicação do fabricante e conserve em geladeira. Observe durante 12 horas se o produto se mantém como leite luido, isto é, estável sem precipitação. 453/IV Leite em pó – Determinação da acidez em ácido láctico Material Balança analítica, béquer de 100 mL, bastão de vidro, frasco Erlenmeyer de 125 mL, bureta de 10 mL e espátula. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução de fenolftaleína a 1% Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra em um béquer, transira quantitativamente para um frasco Erlenmeyer usando 35 mL de água (amostra de leite integral) ou 50 mL de água (amostra de leite desnatado). Adicione 5 gotas de solução de fenolftaIAL - 855 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital leína. Titule com uma solução de hidróxido de sódio 0,1 M, utilizando bureta de 10 mL, até o aparecimento de uma coloração rósea. Cálculo V = n° de mL da solução de hidróxido de sódio 0,1 M gastos na titulação f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 0,1 M A = nº de g da amostra 0,9 = fator de conversão para ácido láctico Referência bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Leite em pó e soro de leite em pó. In: _____. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes: métodos físicos e químicos. Brasília, DF, 1981. v.II, cap. 15, p. 4-5. 454/IV Leite em pó – Determinação de substâncias voláteis Material Balança analítica, espátula, estufa, cápsula de porcelana, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra em cápsula previamente tarada, seque em estufa a (93±2)°C, por uma hora, resfrie em dessecador e pese. Retorne à estufa por mais 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações até peso constante. Cálculo N = nº de g das substâncias voláteis A = nº de g da amostra 856 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 225. 455/IV Leite em pó – Determinação de resíduo por incineração (cinzas) Material Balança analítica, cápsula de porcelana, mula, dessecador com sílica-gel, chapa aquecedora, banho-maria, espátula, capela de exaustão e pinça de metal. Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra em uma cápsula de porcelana, previamente aquecida em mula a (550±10)°C, por 1 hora, resfriada em dessecador e pesada. Carbonize em chapa aquecedora na capela e incinere em mula a (550 ± 10)°C, por aproximadamente 4 horas. O resíduo deverá icar branco ou ligeiramente acinzentado, caso contrário, esfrie, adicione 0,5 mL de água, seque em banho-maria e incinere novamente. Resfrie em dessecador e pese. Cálculo N= n° de g de resíduo A = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 27. 456/IV Leite em pó – Determinação da alcalinidade das cinzas Procedimento – Proceda conforme o método 438/IV ou 439/IV utilizando o resíduo por incineração (cinzas). 457/IV Leite em pó – Determinação da gordura IAL - 857 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra e proceda conforme o método 486/IV. 458/IV Leite em pó – Extração de gordura para determinação de ácidos graxos Procedimento – Pese 10 g da amostra e proceda conforme o método 486/IV. 459/IV Leite em pó – Determinação de protídios Procedimento – Pese 0,5 g da amostra em papel de seda e proceda conforme o método 036/IV ou 037/IV. 460/IV Leite em pó - Determinação de glicídios redutores em lactose Procedimento – Pese 1 g da amostra e, com auxílio de 50 mL de água, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume. Proceda conforme o método 432/IV. 461/IV Leite em pó – Cromatografia de açúcares Material Balança semi-analítica, béquer de 100 mL, espátula, bastão de vidro, balão volumétrico de 100 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL, funil de vidro e papel de iltro. Reagentes Solução de sulfato de zinco a 30% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 15% m/v Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra em béquer. Transira quantitativamente com auxílio de 50 mL de água para um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 5 mL da solução de sulfato de zinco a 30% e 5 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% e misture. Deixe sedimentar durante 5 minutos, complete o volume com água e agite. Filtre em papel de iltro para um frasco Erlenmeyer de 125 mL, o iltrado deverá estar límpido. Proceda conforme o método 041/IV. Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p.15. 858 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Leite evaporado Entende-se como leite evaporado o produto obtido pela evaporação de grande parte da água existente no leite luido. Este produto tem sua análise baseada em determinações feitas na amostra diluída até reconstituição do leite. As determinações correspondem à mesmas efetuadas para o leite luido, com exceção das provas de peroxidase, fosfatase e estabilidade ao etanol. 462/IV Leite evaporado - Prova de reconstituição Procedimento – Faça a reconstituição do produto conforme especiicação do fabricante e proceda conforme o método 452/IV. Queijo Queijo é o produto fresco ou maturado que se obtém por separação parcial do soro do leite ou leite reconstituído (integral, parcial ou totalmente desnatado) ou de soros lácteos coagulados pela ação física do coalho, de enzimas e de bactérias especíicas, de ácidos orgânicos, isolados ou combinados, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem agregação de substâncias alimentícias, especiarias e/ou condimentos, aditivos especiicamente indicados, substâncias aromatizantes e matérias corantes. A análise dos queijos envolve, entre outras, as determinações de substâncias voláteis, protídios, gordura, acidez em ácido láctico, resíduo por incineração (cinzas) (485/IV), além da prova amido (441/ IV), corantes (051/IV), conservadores (468/IV), espessantes, principalmente em queijos fundidos, (132/IV - 143/IV) e reação de Kreis (333/IV). Preparo e conservação da amostra Procedimento – Remova, com uma faca, a crosta ou casca do queijo. Tome porções de diferentes pontos da amostra. Se o queijo for mole, homogeneíze em um gral e se for duro, rale e homogeneíze em um gral. Conserve a amostra em um frasco com rolha esmerilhada, em local arejado. Quando se tratar de queijo fresco ou de certos queijos maturados moles, perecíveis, conserve em geladeira. 463/IV Queijo - Determinação da acidez em ácido láctico Material Balança analítica, béquer de 100 mL, espátula, bastão de vidro, frasco Erlenmeyer de 250 mL, balão volumétrico de 100 mL, funil de vidro, papel de iltro e bureta de 10 mL. IAL - 859 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Reagentes Álcool a 95%, neutro Solução de fenolftaleína a 1% Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Procedimento – Pese aproximadamente 10 g da amostra e transira para um balão volumétrico de 100 mL com álcool a 95%, neutro. Complete o volume. Deixe em contato por 6 horas. Filtre e tome uma alíquota. Adicione 5 gotas da solução de fenolftaleína e titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, até coloração rósea. Cálculo V = n° de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 M A = n° de g da alíquota da amostra usado na titulação Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 232. 464/IV Queijo – Determinação de substâncias voláteis Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra e proceda conforme o método 483/IV ou 484/IV. 465/IV Queijo – Determinação de gordura utilizando butirômetro especial Material Balança analítica, balança semi-analítica, béquer de 100 mL, espátula, pipeta de 5 mL, banho-maria, butirômetro especial para queijo com respectiva rolha, pipetadores automáticos de 1 e 10 mL, papel absorvente, termômetro, termocentrífuga ou centrífuga de Gerber, capela de exaustão e luvas. 860 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Reagentes Ácido sulfúrico (D = 1,813 - 1,817) Álcool isoamílico (D = 0,815) Procedimento – Pese os butirômetros com suas respectivas rolhas para veriicar se os mesmos estão com os pesos equivalentes. Pese 3 g da amostra no copo do butirômetro e adapte ao mesmo. Adicione 5 mL de água a (30-40)°C, junte, lentamente, 10 mL de ácido sulfúrico, 1 mL de álcool isoamílico e água morna até completar o volume do tubo. Estas adições devem ser feitas sem molhar internamente o gargalo do butirômetro, se isto acontecer, limpe cuidadosamente com papel absorvente. Arrolhe o butirômetro, pese em temperatura ambiente e, usando luvas, agite, inverta o tubo e coloque em banho-maria a (63±2)°C, durante 15 minutos. Veriique se não restam partículas sólidas e centrifugue a (1200±100) rpm, durante 15 minutos. Leia a porcentagem de gordura diretamente na escala do butirômetro. Repita as operações de aquecimento e centrifugação, se necessário. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 233. 466/IV Queijo – Determinação de gordura utilizando butirômetro para leite Material Balança analítica, balança semi-analítica, espátula, béqueres de 25 e 1000 mL, bureta de 25 mL, butirômetro de Gerber para leite com respectiva rolha, pipetador automático de 1 mL, bastão de vidro, chapa elétrica, termômetro, banho maria, capela de exaustão, termocentrífuga ou centrífuga de Gerber, luvas e papel absorvente. Reagentes Ácido sulfúrico (D =1,50) Álcool isoamílico (D = 0,815) Procedimento – Pese os butirômetros com suas respectivas rolhas para veriicar se os mesmos estão com os pesos equivalentes. Pese aproximadamente 1 g da amostra em um béquer de 25 mL, adicione 5 mL de ácido sulfúrico (D = 1,5), contido em uma bureta. IAL - 861 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Aqueça em chapa aquecedora com temperatura aproximada de 250°C, agite até completa dissolução da amostra e transira para o butirômetro. Adicione porções de 5 mL até completar o volume de 20 mL, sempre aquecendo em chapa aquecedora. Adicione, com o auxílio de um pipetador automático, 1 mL de álcool isoamílico. Estas adições devem ser feitas sem molhar internamente o gargalho do butirômetro, se isto acontecer, limpe cuidadosamente com um papel absorvente. Arrolhe o butirômetro, pese em temperatura ambiente, e agite, usando luvas, até a completa homogeneização. Leve ao banho-maria a (63 ± 2)°C por 15 minutos, com a rolha para baixo. Centrifugue a (1200±100) rpm durante 15 minutos. Retire o butirômetro da termocentrífuga ou centrífuga de Gerber na posição vertical (rolha para baixo). Manejando a rolha, coloque a camada amarelo-clara, transparente (gordura), dentro da escala graduada do butirômetro. Faça leitura na escala do butirômetro. Cálculo V = valor lido na escala do butirômetro 11,33 = equivalente em peso de 11 mL de leite (a escala do butirômetro está graduada para 11 mL de leite) P = n° de gramas da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 233-234. 467/IV Queijo – Determinação de protídios Procedimento – Pese 0,5 g da amostra em papel de seda e proceda conforme método 036/IV ou 037/IV, considerando o fator 6,38 para a conversão nitrogênio em proteína. 468/IV Queijo – Determinação de ácido sórbico e sorbato Procedimento – Pese 10 g da amostra e proceda conforme método 085/IV. 469/IV Queijo – Reação de Kreis Procedimento – Proceda conforme método 279/IV. 862 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Coalho A matéria-prima básica da indústria do coalho é retirada do 4° estômago de bezerros lactentes, abatidos entre 1ª e 5ª semanas de vida. O coalho é a renina secretada pelas glândulas gástricas em forma de pró-renina, a qual é ativada pela acidez. A renina hidrolisa a caseína do leite transformando-a em pró-caseína solúvel que, em presença de íons cálcio, se converte em para-caseinato de cálcio, que é insolúvel e constitui o coágulo propriamente dito. 470/IV Coalho – Poder coagulante Material Balança analítica, espátula, béquer de 200 mL, pipeta volumétrica de 1 mL, balões volumétricos de 10 e 100 mL, termômetro, cronômetro e banho-maria. Reagente Solução de cloreto de sódio a 7% m/v Leite cru Procedimento Preparo da amostra – Para o coalho líquido, transira 1 mL da amostra para um balão volumétrico de 10 mL e complete o volume com solução de cloreto de sódio a 7%. Para o coalho em pó, pese 1 g da amostra, transira para um balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com solução de cloreto de sódio a 7%. Doseamento – Transira 100 mL do leite para um béquer de 200 mL. Aqueça em banhomaria termostatizado a 35°C. A temperatura do banho deverá ser rigorosamente controlada. Adicione 1 mL da amostra, previamente preparada, e marque com cronômetro o tempo exato em que o coalho foi adicionado ao leite. Mantenha o leite em constante agitação, sem retirá-lo do banho-maria, até que apareçam pequenos locos de leite coagulado na parede interna do béquer. Veriique o tempo gasto, para efeito de cálculo. Cálculo V = volume de leite usado na prova x 10 (no caso de coalho líquido) ou x 100 (no caso de coalho em pó) t = tempo, em segundos, gasto para coagular o volume de 100 mL de leite IAL - 863 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 229-230. Manteiga Manteiga é o produto gorduroso obtido do creme pasteurizado derivado exclusivamente do leite de vaca, com ou sem modiicação biológica. O principal componente da manteiga é a gordura do leite, sendo a parte não gordurosa constituída de água, traços de proteína, lactose e sais minerais. Pode ser adicionado de sal e corantes naturais. As análises usuais incluem as determinações de acidez em solução normal, substâncias voláteis, gordura, extrato seco desengordurado, acidez na gordura, cloretos (028/IV), corantes (051/ IV), índice de refração absoluto a 40°C, índice de iodo, índice de saponiicação e reação de Kreis (333/IV). 471/IV Manteiga – Determinação da acidez em solução normal Material Balança analitica, béqueres de 250 mL, espátula, termômetro, banho-maria, funil de vidro, papel de iltro e frasco Erlenmyer de 125 mL. Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula.Transira para um béquer, aproximadamente 50 g da amostra e aqueça até fusão em banho-maria a (40-45)°C. Separe a camada gordurosa e iltre para um béquer. Pese aproximadamente 2 g da amostra iltrada e proceda conforme o método 325/IV e cálculo conforme método 481/IV. Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 235. 472/IV Manteiga – Determinação de substâncias voláteis 864 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Este método fundamenta-se na solubilidade da gordura em éter e na insolubilidade da proteína, lactose e sais minerais, componentes normais da manteiga. Material Balança analítica, espátula, béquer de 250 mL, estufa, chapa aquecedora, vidro de relógio, papel absorvente e dessecador com sílica-gel. Procedimento Em um béquer de 250 mL, previamente tarado, pese aproximadamente 10 g da amostra. Aqueça em chapa elétrica e agite discretamente, em sentido circular, retirando ocasionalmente do aquecimento para se evitar a queima ou crepitação violenta da amostra. Para observar se houve eliminação dos voláteis, utilize um vidro de relógio sobre o béquer. O não aparecimento de vapores no vidro de relógio indica o término do procedimento. Um leve odor de queimado e um resíduo de cor castanha são também indicações do término do procedimento. Limpe o béquer com papel absorvente e coloque na estufa a (103 ± 2)°C por uma hora, resfrie em dessecador e pese. Retorne por mais 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = nº de g das substâncias voláteis P = nº de g de amostra Referência bibliográfica SILVA, H.F. et al. Físico-química do leite e derivados: métodos analíticos. Juiz de Fora: Of. Gráica de Impressão Gráica e Ed.,1997. p. 82. 473/IV Manteiga – Determinação de insolúveis em éter Material Balança analítica, bastão de vidro, capela de exaustão, proveta de 25 mL, pipeta graduada de 10 mL, frasco porta resíduos, estufa, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. Reagente Éter Procedimento – Ao béquer que contém o resíduo obtido conforme o método 472/IV, IAL - 865 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital adicione 25 mL de éter e homogeneíze com movimentos circulares. Se necessário, remova os resíduos aderidos na parede do béquer com um bastão de vidro, lave com éter e deixe sedimentar por 5 minutos aproximadamente. Após a sedimentação, descarte cuidadosamente a solução etérea. Faça mais 5 extrações. Limpe o béquer com um papel absorvente e coloque na estufa a (103 ± 2)°C por uma hora, resfrie em dessecador e pese. Retorne por mais 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° g de insolúveis P = n° g da amostra Referência Bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretária Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II-métodos físicos e químicos. Brasília (DF), 1981, XXI p. 1-3. 474/IV Manteiga – Determinação de gordura Procedimento – Determine as substâncias voláteis conforme o método 472/IV e os insolúveis em éter conforme 473/IV e calcule o valor da gordura. Cálculo 100 - (P + N) = gordura por cento m/m P = substâncias voláteis por cento m/m N = insolúveis em éter por cento m/m Referência Bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretária Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II-métodos físicos e químicos. Brasília (DF), 1981, XXI p. 1-3. 866 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados 475/IV Manteiga - Determinação do resíduo por incineração (cinzas) Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra em cápsula de porcelana, cubra com papel de iltro de cinzas conhecidas picado e proceda conforme método 485/IV. 476/IV Manteiga – Determinação de cloretos em cloreto de sódio Procedimento – Utilize o resíduo por incineração (cinzas) e proceda conforme método 028/IV ou 029/IV. 477/IV Manteiga – Determinação do índice de refração Material Béqueres de 250 mL, espátula, termômetro, banho-maria, funil de vidro e papel de iltro. Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula.Transira para um béquer, aproximadamente 20 g da amostra e aqueça até fusão em banho-maria a (40-45)°C. Separe a camada gordurosa e iltre para um béquer. Utilize a amostra iltrada e proceda conforme o método 327/IV. 478/IV Manteiga – Determinação do índice de iodo Material Béqueres de 250 mL, espátula, termômetro, banho-maria, funil de vidro e papel de iltro. Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula. Transira para um béquer, aproximadamente 20 g da amostra e aqueça até fusão em banho-maria a (40-45)°C. Separe a camada gordurosa e iltre para um béquer. Utilize a amostra iltrada e proceda conforme o método 329/IV. 479/IV Manteiga – Determinação do índice de saponificação Material Béqueres de 250 mL, espátula, termômetro, banho-maria, funil de vidro e papel de iltro. IAL - 867 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula. Transira para um béquer, aproximadamente 20 g da amostra e aqueça até fusão em banho-maria a (40 - 45)°C. Separe a camada gordurosa e iltre-a para um béquer Utilize a amostra iltrada e proceda conforme método 328/IV. 480/IV Manteiga – Reação de Kreis Material Béqueres de 250 mL, espátula, termômetro, banho-maria a (40-45)°C, funil de vidro e papel de iltro. Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula. Transira para um béquer, aproximadamente 50 g da amostra e aqueça até fusão em banho-maria a (40-45)°C. Separe a camada gordurosa e iltre. Utilize a amostra iltrada e proceda conforme o método 333/IV. Margarina Entende-se por margarina o produto obtido por processo de hidrogenação de óleos vegetais em emulsão estável com leite ou seus constituintes ou derivados e outros ingredientes, destinado à alimentação humana. A gordura láctea, quando presente, não deverá exceder a 3% m/m do teor de gordura total. A análise é semelhante à de manteiga, devendo ser incluída a determinação de vitamina A conforme o método 357/IV. Doce de Leite Entende-se por doce de leite o produto resultante da cocção de leite com açúcar, podendo ou não ser adicionado de outras substâncias alimentícias permitidas, até concentração conveniente e parcial caramelização. O produto é designado por doce de leite ou doce de leite seguida da substância adicionada que o caracteriza, como por exemplo, “doce de leite com amendoim”. O doce de leite é classiicado de acordo com a sua consistência em: cremoso ou em pasta e em tablete. Preparo e conservação da amostra Procedimento – Retire partes representativas da amostra (superfície, centro e lados). Misture totalmente com uma espátula. No caso de produtos com adições de frutas e/ou outro ingrediente, triture em gral, moinho e/ou homogeneíze em liqüidiicador. Conserve em frasco bem fechado. A amostra deve ser analisada preferencialmente logo após seu 868 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados recebimento, se não for possível, conserve em refrigerador ou conforme recomendação do fabricante. 481/IV Doce de leite – Determinação da acidez em solução normal Material Balança analítica, chapa aquecedora, béqueres de 150 e 250 mL, bureta de 10 mL, pipeta graduada de 1 mL, bastão de vidro, espátula e termômetro. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 N Solução de fenolftaleína a 1% Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra em béquer de 150 mL. Dissolva com 50 mL de água morna, temperatura aproximada de 50°C e misture com um bastão de vidro. Esfrie e adicione 5 gotas de solução de fenolftaleína. Titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 N, até coloração rósea. Cálculo V = nº de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 N gastos na titulação P = nº de g da amostra f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 N 482/IV Doce de leite – Determinação da acidez em ácido láctico Procedimento – Proceda de acordo com 453/IV. Cálculo V = nº de mL gastos de solução de hidróxido de sódio 0,1 M P = gramas de amostra utilizada no ensaio f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 M 0,9 = fator de conversão para o ácido láctico IAL - 869 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Referência bibliográfica BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretária Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II-métodos físicos e químicos. Brasília (DF), 1981, XVI p. 5-6. 483/IV Doce de leite – Determinação de substâncias voláteis Material Balança analítica, espátula, cápsula de porcelana, bastão de vidro, areia puriicada, banhomaria, estufa, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. Procedimento – Pese, em uma cápsula de porcelana, aproximadamente 10 g de areia puriicada e dois bastões de vidro apoiados na borda do recipiente. Seque em estufa a (103 ± 2)°C, por 2 horas, resfrie em dessecador e pese. Pese aproximadamente 3 g da amostra, misture com auxílio dos bastões de vidro. Seque em estufa a (103 ± 2)°C, por 3 horas, resfrie em dessecador e pese. Retorne à estufa por 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = nº de g de substâncias voláteis P = nº de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 22. 484/IV Doce de leite – Determinação de substâncias voláteis em estufa a vácuo Material Balança analítica, espátula, cápsula de porcelana, bastões de vidro, areia puriicada, banho-maria, estufa a vácuo, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. 870 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Procedimento – Pese, em uma cápsula de porcelana, aproximadamente 10 g de areia e dois bastões de vidro apoiados na borda do recipiente. Seque em estufa a (103 ± 2)°C por 2 horas, resfrie em dessecador e pese. Pese aproximadamente 3 g da amostra. Adicione 10 mL de água e misture com auxílio dos bastões de vidro. Evapore em banho-maria, seque em estufa a vácuo a (70 ± 2)ºC por 2 horas. Resfrie em dessecador e pese. Retorne à estufa por 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de substâncias voláteis P = n° de g da amostra Referências bibliográficas BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretária Nacional de Defesa Agropecuária. Laboratório Nacional de Referência Animal. Métodos analíticos oiciais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. II-métodos físicos e químicos. Brasília (DF), 1981, XVI p. 1. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 22. 485/IV Doce de leite - Determinação de resíduo por incineração (cinzas) Material Balança analítica, cápsula de porcelana, espátula, chapa elétrica, capela de exaustão, mula, dessecador com sílica-gel e pinça de metal. Procedimento – Pese aproximadamente 3 g da amostra em cápsula de porcelana, previamente aquecida em mula a (520 ± 10)ºC por 1 hora, resfrie em dessecador e pese. Calcine em chapa aquecedora na capela até completa carbonização ou eliminação de toda fumaça. Leve para mula na temperatura de (550 ± 10)ºC pelo período aproximado de 4 horas. As cinzas deverão icar brancas ou ligeiramente acinzentadas, caso contrário, resfrie, adicione 0,5 mL de água, seque em banho-maria e incinere novamente. Resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. IAL - 871 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo N = nº de g do resíduo P = nº de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 27. 486/IV Doce de leite – Determinação de gordura A gordura é determinada gravimetricamente, após a desnaturação das proteínas e carboidratos, utilizando ácido clorídrico sob aquecimento. O resíduo contendo a gordura é separado por iltração, seco e extraído com éter de petróleo. Material Balança analítica, espátula, béqueres de 100, 600 e 1000 mL, estufa, chapa aquecedora, bastão de vidro, pérolas de vidro ou cacos de porcelana, provetas de 100 mL, vidro de relógio, frasco Erlenmeyer de 500 mL, funil de vidro, papel de iltro, ita indicadora de pH de (0 - 14), balão de fundo chato com boca esmerilhada de 300 mL, aparelho extrator de Soxhlet, pinça de metal, dessecador com sílica-gel e capela de exaustão. Reagentes Ácido clorídrico Éter de petróleo (30 - 60)°C Solução de nitrato de prata 0,1 M Procedimento – Pese de 5 a 10 g da amostra, em béquer de 100 mL. Transira para um béquer de 600 mL usando 100 mL de água, se necessário, utilize água à temperatura entre (30 - 40)°C, misture com um bastão de vidro. Adicione 60 mL de ácido clorídrico, algumas pérolas de vidro ou cacos de porcelana e tampe o béquer com um vidro de relógio. Aqueça o conjunto em chapa aquecedora até a fervura, mantenha fervura durante 872 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados 30 minutos. À parte, aqueça aproximadamente 1000 mL de água até temperatura de (90 - 95)°C, adicione 100 mL desta água na solução da amostra ainda quente, lavando o vidro de relógio e iltre em papel de iltro previamente umidecido. Lave várias vezes o béquer e o resíduo do papel de iltro, cuidadosamente, com água quente até que o iltrado exiba reação neutra, (utilizando ita indicadora de pH) ou ausência de cloreto (utilizando solução de nitrato de prata 0,1 M). Coloque o resíduo sobre um vidro de relógio, contendo um papel de iltro seco, seque na estufa à temperatura de (103 ± 2)°C. Envolva em outro papel de iltro ou coloque em um dedal e transira para o aparelho extrator de Soxhlet. Acople um balão de fundo chato de 300 mL previamente aquecido em estufa a (103 ± 2)ºC por duas horas, resfriado e pesado ao aparelho extrator de Soxhlet. Extraia sob aquecimento, com aproximadamente 250 mL de éter de petróleo durante 4 horas. Retire o resíduo da extração e remova o solvente por destilação. Seque o balão contendo a gordura em estufa a (103 ± 2)°C por uma hora. Resfrie em dessecador e pese. Retorne à estufa por 30 minutos, resfrie em dessecador e pese. Repita as operações de aquecimento e resfriamento até peso constante. Cálculo N = n° de g de gordura P = n° de gramas da amostra Nota: a determinação de gordura poderá ser efetuada também conforme o método 412/IV. Referência bibliográfica ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the Association Official Analytical Chemists. v. 2, (method 963.15). 16th ed. Arlington: A.O.A.C., chapter 31, 1995. p. 10. 487/IV Doce de leite - Determinação de protídios Procedimento – Pese de 1 a 2 g da amostra, usando papel de seda e proceda conforme método 036/IV ou 037/IV. 488/IV – Doce de leite – Determinação de glicídios redutores em lactose Material Balança analítica, chapa aquecedora, béquer de 200 mL, balão volumétrico de 100 mL, IAL - 873 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital frasco Erlenmeyer de 300 mL, funil de vidro, papel de iltro, balão de fundo chato de 300 mL, pipetas graduadas de 2 mL, pipetas volumétricas de 10 mL, bureta de 25 mL, espátula, bastão de vidro e garra de madeira. Reagentes Solução de sulfato de zinco a 30% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 15% m/v Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese aproximadamente 2 g da amostra em béquer de 100 mL. Transira quantitativamente com auxílio de 50 mL de água e um bastão de vidro para um balão volumétrico de 100 mL. Adicione 2 mL da solução de sulfato de zinco a 30%, misture, adicione 2 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% e misture. Deixe sedimentar, durante 5 minutos, complete o volume do balão com água e agite. Filtre em papel de iltro para um frasco Erlenmeyer de 300 mL, o iltrado deverá estar límpido. Em balão de fundo chato de 300 mL, adicione 10 mL de cada uma das soluções de Fehling, 40 mL de água e aqueça até ebulição. Transira o iltrado para uma bureta de 25 mL e adicione, às gotas, sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá icar um resíduo vermelho-tijolo). Cálculo A = n° de mL de P g da amostra V = n° de mL da solução da amostra gasto na titulação P = n° de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 205-206. 489/IV Doce de leite – Determinação de glicídios não redutores em sacarose Material 874 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Balança analítica, chapa aquecedora, banho-maria, béquer de 100 mL, balão volumétrico de 250 mL, frascos Erlenmeyer de 300 e 500 mL, balão de fundo chato de 300 mL, funil de vidro, papel de iltro, ita indicadora de pH (0 -14), bureta de 25 mL, pipetas volumétricas de 10 mL, pipetas graduadas de 2 e 5 mL, bastão de vidro, espátula e garra de madeira. Reagentes Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio a 30% m/v Solução de sulfato de zinco a 30% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 15% m/v Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra em béquer de 100 mL. Transira quantitativamente com auxílio de 100 mL de água e um bastão de vidro para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Acidule com 2 mL de ácido clorídrico, aqueça em banho-maria fervente por 15 minutos e resfrie. Neutralize com solução de hidróxido de sódio a 30%, veriique utilizando ita indicadora de pH (0-14). Transira para um balão volumétrico de 250 mL. Adicione 5 mL da solução de sulfato de zinco a 30% e misture. Adicione 5 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% e misture. Deixe sedimentar, durante 5 minutos, complete o volume do balão com água, agite. Filtre em papel de iltro para um frasco Erlenmeyer de 300 mL, o iltrado deverá estar límpido. Em balão de fundo chato de 300 mL adicione 10 mL de cada uma das soluções de Fehling, 40 mL de água e aqueça até ebulição. Transira o iltrado para uma bureta de 25 mL e adicione, às gotas, sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá icar um resíduo vermelho tijolo). Cálculo A = n° de mL da solução de P g da amostra V = n° de mL da solução da amostra gastos na titulação P = n° g da amostra Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: MéIAL - 875 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital todos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 50-51. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa Nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p. 15. 490/IV Doce de leite – Determinação de glicídios não redutores em amido Material Balança analítica, chapa aquecedora, capela de exaustão, banho-maria, aparelho aquecedor com acoplamento de condensador para reluxo tipo Sebelin, béquer de 600 mL, balão volumétrico de 500 mL, frasco Erlenmeyer de 500 mL, frasco Erlenmeyer com boca esmerilhada 24/40 de 500 mL, balão de fundo chato de 300 mL, proveta de 200 mL, funil de vidro, papel de iltro , ita indicadora de pH (0-14), bureta de 25 mL, pipetas volumétricas de 5 mL, bastão de vidro, vidro de relógio, pipetas graduadas de 10 e 20 mL, espátula e garra de madeira. Reagentes Éter Álcool a 70% Álcool Ácido clorídrico Solução de hidróxido de sódio a 30% m/v Solução de sulfato de zinco a 30% m/v Solução de ferrocianeto de potássio a 15% m/v Soluções de Fehling tituladas (Apêndice I) Procedimento – Pese aproximadamente 20 g da amostra em um béquer de 150 mL. Desengordure a amostra tratando sucessivamente com 5 porções de 20 mL de éter, misture com bastão de vidro, deixe decantar e despreze as camadas etéreas. Transira o material desengordurado para um béquer de 600 mL, com auxílio de 5 porções de 40 mL de álcool a 70%. Misture vigorosamente com movimentos rotatórios. Coloque um vidro de relógio sobre o béquer. Aqueça em banho-maria a (85-87)°C por 1 hora, resfrie, adicione 150 mL de álcool e misture. Cubra com vidro de relógio e deixe decantar por 12 horas, (caso não decante, use centrifugação por 15 minutos a 1500 rpm). Após decantar, despreze o sobrenadante cuidadosamente. Filtre em papel de iltro seco para um frasco Erlenmeyer de 500 mL, lavando com 5 porções de 60 mL de álcool a 70%. Retire o funil de vidro com o papel de iltro contendo o resíduo e transira para outro frasco Erlenmeyer de 500 mL com 876 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados boca esmerilhada 24/40; com um bastão de vidro, fure com cuidado, o centro do papel de iltro, lavando com água e recolha no frasco Erlenmeyer. Acidule com 10 mL de ácido clorídrico e misture. Aqueça na chapa do aparelho tipo Sebelin, com acoplamento para reluxo, durante 3 horas e meia e resfrie. Neutralize com solução de hidróxido de sódio a 30%, veriique utilizando ita indicadora de pH (0-14). Transira para um balão volumétrico de 500 mL com auxílio de água, lavando bem o frasco Erlenmeyer. Adicione 20 mL da solução de sulfato de zinco a 30% e misture, adicione 20 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% e misture. Deixe sedimentar, durante 5 minutos, complete o volume do balão com água e agite. Filtre em papel de iltro para um frasco Erlenmeyer de 500 mL; o iltrado deverá estar límpido. Em balão de fundo chato de 300 mL, adicione 5 mL de cada uma das soluções de Fehling, 40 mL de água e aqueça até ebulição. Transira o iltrado para uma bureta de 25 mL e adicione, às gotas, sobre a solução do balão em ebulição, agitando sempre, até que esta solução passe de azul a incolor (no fundo do balão deverá icar um resíduo vermelho-tijolo). Cálculo A = nº de mL da solução de P g da amostra V = nº de mL da solução da amostra gastos na titulação P = nº de g da amostra 0,90 = fator de transformação de hexoses para amido. Referências bibliográficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 51 e 53-54. BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p. 15. 491/IV Doce de leite – Cromatografia de açúcares Procedimento – Proceda conforme o método 461/IV. Leite condensado Entende-se por leite condensado ou leite condensado com açúcar, o produto resultante da desidratação em condições próprias do leite adicionado de açúcar. As principais determinações realizadas para estes alimentos são: acidez em solução normal (481/IV), IAL - 877 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital acidez em ácido láctico (482/IV), substâncias voláteis (483/IV) ou (484/IV), resíduo por incineração (485/IV), gordura (486/IV), protídios (487/IV), glicídios redutores em lactose (488/IV), glicídios não redutores em sacarose (489/IV) e cromatograia de açúcares (491/IV). Leites fermentados São os produtos resultantes da fermentação do leite por fermentos lácticos próprios. Os fermentos lácticos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto inal durante seu prazo de validade. Poderá ser adicionado ou não de outros produtos lácteos, bem como de outras substâncias alimentícias recomendados pela tecnologia e que não interiram no processo de fermentação do leite pelos fermentos lácticos empregados. São exemplos de leites fermentados: iogurte, leite acidóilo, keir, kumys e coalhada. Procedimento – Retire parte representativa da amostra quando for líquida. Quando for cremosa ou pastosa, retire partes da superfície, centro e lados. Misture totalmente com uma espátula ou bastão de vidro. No caso de produtos com adições de frutas e/ou cereais e/ou outro ingrediente, triture em gral, moinho e/ou homogeneíze em liqüidiicador. Conserve em frasco bem fechado. A amostra deverá ser analisada preferencialmente logo após o recebimento, se não for possível, conserve-a em refrigerador. As principais determinações físico-químicas realizadas são: pH, acidez em ácido láctico, substâncias voláteis, extrato seco total, resíduo por incineração (cinzas), gordura, protídios, glicídios redutores em lactose, glicídios não redutores em sacarose e corantes. 492/IV Leites fermentados – Determinação do pH Procedimento – Proceda conforme método 017/IV. 493/IV Leites fermentados – Determinação da acidez em ácido láctico Material Balança analítica, potenciômetro, agitador magnético, béquer de 50 mL, bureta de 25 mL, pipeta graduada de 10 mL, bastão de vidro e espátula. Reagentes Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Solução de fenolftaleína a 1% 878 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Procedimento – Pipete 10 mL ou pese aproximadamente 10 g da amostra em um béquer de 50 mL. Adicione com pipeta graduada aproximadamente 10 mL de água isenta de gás carbônico e misture com bastão de vidro. Adicione 5 gotas da solução de fenolftaleína. Titule com uma solução de hidróxido de sódio 0,1 M, utilizando bureta de 25 mL, até o aparecimento de uma coloração rósea. No caso de produtos onde a coloração interfere na visualização do ponto de viragem da fenolftaleína, faça titulação potenciométrica. Para isto, mergulhe os eletrodos de pH e veriique se estão bem imersos. Titule, sob agitação, com solução de hidróxido de sódio 0,1 M, até pH 8,3. Cálculo V = n° de mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação P = n° g ou mL da amostra 0,9 = fator de conversão para o ácido láctico f = fator da solução de hidróxido de sódio 0,1 M Referência bibliográfica BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Normativa Nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p. 11. 494/IV Leites fermentados – Determinação de substâncias voláteis e extrato seco total Procedimento: Proceda conforme método 483/IV ou 484/IV. Cálculo N = n° de g das substâncias voláteis P = n°de g da amostra (100 - substâncias voláteis por cento m/m) = extrato seco total por cento m/m 495/IV Leites fermentados – Determinação do resíduo por incineração (cinzas) Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra e proceda conforme método 437/IV. 496/IV Leites fermentados – Determinação de gordura IAL - 879 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra e proceda conforme o método 486/IV. 497/IV Leites fermentados – Determinação de gordura com butirômetro de Gerber Material Balança analítica, chapa aquecedora, béquer de 100 mL, espátula, bastão de vidro, balão de volumétrico de 100 mL e termômetro. Procedimento – Pese exatamente 10 g da amostra em um béquer de 100 mL, dissolva com 30 mL de água a (40 - 50)°C com auxílio de um bastão de vidro, transira para um balão volumétrico de 100 mL, resfrie e complete o volume. Proceda conforme o método 433/IV. Cálculo V x 10 = gordura por cento m/v V = valor lido na escala do butirômetro Referência bibliográfica SILVA, P. H. F.et al. Físico-química do leite e derivados – Métodos Analíticos. Juiz de Fora: Minas Gerais. 1997. p. 154-155. 498/IV Leites fermentados – Determinação de protídios Procedimento – Pese de 1 a 2 g da amostra e proceda conforme o método 036/IV ou 037/IV. 499/IV Leites fermentados – Determinação de glicídios redutores em lactose Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra e proceda conforme o método 488/IV. 500/IV Leites fermentados – Determinação de glicídios não redutores em sacarose Procedimento – Pese aproximadamente 5 g da amostra e proceda conforme o método 489/IV. 880 - IAL Capítulo XXVII - Leites e Derivados Bebida Láctea Entende-se por bebida láctea o produto obtido a partir de leite ou leite reconstituído e/ou derivados de leite, reconstituídos ou não, fermentado ou não, com ou sem adição de outros ingredientes, onde a base láctea represente pelo menos 51% m/m do total de ingredientes do produto. As determinações são as mesmas do leite fermentado. Creme de Leite Entende-se por creme de leite o produto lácteo relativamente rico em gordura retirado do leite por procedimento tecnológico adequado, que se apresenta na forma de uma emulsão de gordura e água. É denominado “creme de leite” ou simplesmente “creme”, podendo indicar-se o conteúdo de gordura apresentado. Pode passar por processo de pasteurização, esterilização ou ultra-alta temperatura (UAT). As principais determinações são: substâncias voláteis (483/IV ou 484/IV), resíduo por incineração (475/IV), gorduras totais (466/IV), protídios (467/IV), glicídios redutores em lactose (488/IV) e reação de Kreis (279/IV). 501/IV Creme de leite – Determinação da acidez em ácido láctico Procedimento – Pese aproximadamente 10 g da amostra, adicione 50 mL de água e proceda conforme método 453/IV. Colaboração: Jacira Hiroko Saruwtari, Maria Auxiliadora de Brito Rodas e Marilda Duarte IAL - 881 Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres CAPÍTULO XXVIII CONDIMENTOS E VINAGRES IAL - 883 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 884 - IAL Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres XXVIII CONDIMENTOS E VINAGRES E stão incluídos neste capítulo os métodos de análise para especiarias ou condimentos vegetais simples, condimentos preparados e vinagres. Condimentos vegetais Estes produtos compreendem certas plantas ou parte delas, contendo substâncias aromáticas, sápidas, com ou sem valor nutritivo, empregados nos alimentos para modiicar o seu sabor. Neste tipo de produto é importante a identiicação da espécie e a veriicação de adulterações. Entre os tipos de adulteração, os mais encontrados são: a adição de partes da planta de origem que não possuem as qualidades essenciais do condimento e a adição de condimentos e elementos estranhos moídos, principalmente quando o condimento é apresentado sob a forma de pó. Estes elementos adulterantes podem ser identiicados pelo exame microscópico e a sua interferência nas características químicas por parâmetros químicos de qualidade, conforme estabelecidos em regulamento técnico especíico. A análise química destes produtos consiste nas determinações, entre outras, de substâncias voláteis (012/IV), cinzas (018/IV), cinzas insolúveis em ácido clorídrico a 10% (024/IV), extrato etéreo (032/IV), extrato alcoólico (035/IV) e teor de óleos essenciais. A análise microbiológica também é relevante no caso desses produtos, tendo em vista os procedimentos durante a colheita e pós-colheita a que estão sujeitos. IAL - 885 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Condimentos Preparados Nesta categoria, incluem-se vários produtos obtidos pela simples mistura de condimentos naturais ou elaborados, com ou sem adição de outras substâncias alimentícias, e apresentadas sob forma de pós, pastas, molhos, em emulsão ou suspensão. São exemplos: catchup, curry, mostarda preparada, maionese, molho inglês, molho shoyu, temperos prontos à base de alho e sal, entre outros. A análise destes produtos inclui, entre outras: as determinações de substâncias voláteis (012/IV), glicídios redutores, em glicose (038/IV), glicídios não-redutores, em sacarose (039/IV), amido (043/IV), cinzas (018/IV), extrato etéreo (032/IV), cloretos em cloreto de sódio (028/IV ou 029/IV), corantes artiiciais (051/IV) e acidez (016/IV), dependendo da composição do produto. Nota: no caso de condimentos com alto teor de cloreto de sódio, o extrato etéreo deverá ser efetuado com éter anidro. Tanto para condimentos simples como para os preparados, as determinações de substâncias voláteis, cinzas, lipídios, protídios, ibra alimentar, carboidratos por diferença e sódio são relevantes para ins de informação nutricional. Nesse sentido, a determinação de gorduras saturadas se faz necessária no caso de condimentos preparados contendo óleo ou gordura na sua composição, bem como acidez, para o cálculo do valor calórico, principalmente quando o condimento preparado contiver vinagre. Mostarda preparada – Na análise deste produto, além das determinações usuais citadas em condimentos preparados, faz-se também a determinação de isotiocianato de alila. 502/IV Condimentos – Determinação de isotiocianato de alila em mostarda preparada O isotiocianato de alila, composto responsável pelo odor e sabor pungente da mostarda, é o principal componente, em porcentagem, do óleo essencial desta especiaria. Material Frasco Erlenmeyer com boca esmerilhada de 250 mL, proveta de 100 mL, balões volumétricos de (50 e 100) mL, buretas de 25 mL e aparelhagem de vidro para a destilação simples. Reagentes Solução de hidróxido de amônio a 10% m/v Solução de nitrato de prata 0,1 M Ácido nítrico Solução de tiocianato de amônio 0,1 M 886 - IAL Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres Solução de sulfato de ferro III a 10% m/v Procedimento – Pese 5 g da amostra, adicione 100 mL de água e deixe em contato, em frasco fechado, durante 2 horas a 37°C. Destile a mistura, recebendo o destilado em 5 mL de solução de hidróxido de amônio a 10%, usando um adaptador que mergulhe na solução amoniacal. Completada a destilação, adicione 25 mL de solução de nitrato de prata 0,1 M e aqueça o frasco em banho de água a (80-85)°C, durante 30 minutos, com agitação freqüente. Esfrie, complete o volume a 100 mL e iltre. Meça 50 mL do iltrado, adicione 4 mL de ácido nítrico e titule com solução de tiocianato de amônio 0,1 M, usando como indicador algumas gotas de solução de sulfato de ferro III. Cálculo V = nº de mL gasto da solução de tiocianato de amônio 0,1 M P = nº de g da amostra Referência bibliográfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Métodos Químicos e Físicos para análise de alimentos. São Paulo: IMESP, 3. ed., 1985. p. 281-283. 503/IV Condimentos – Determinação de óleos essenciais Óleos essenciais são misturas complexas compostas por hidrocarbonetos de natureza terpênica e suas formas oxidadas, principalmente mono e sesquiterpenos e fenilalcanos, essencialmente, os fenilpropanos. São voláteis, odoríferos, imiscíveis ou muito pouco miscíveis com água, sendo arrastados pelo vapor d’água. São mais comuns em algumas famílias como por exemplo: Labiatae - hortelã, sálvia, alecrim; Umbelliferae erva-doce, funcho, anis; Lauraceae - canela; Zingeberaceae - gengibre; Myrtaceae - cravo da Índia; Piperaceae - pimentas, entre outras. São produzidos nos diferentes órgãos vegetais, estando contidos em estruturas especiais ou conjuntos celulares denominados aparelhos secretores. A determinação quantitativa do teor de óleos essenciais em condimentos vegetais faz-se regularmente em laboratório, pela execução de um procedimento simples de hidrodestilação (arraste a vapor) do vegetal, utilizando-se aparelhos de vidro, como o aparelho de Clevenger modiicado, conforme a igura a seguir: IAL - 887 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Figura 1 – Aparelho de Clevenger modiicado Material Aparelho de Clevenger (Figura 1), balão de fundo redondo com capacidade de 3000 mL com junta esmerilhada 24/40, manta aquecedora com termostato e condensador de bola. Procedimento – Pese 100 g da amostra e transira, com auxílio de um funil, para o balão de vidro; torna-se conveniente que a quantidade de amostra não exceda 1/3 do volume do balão. Adicione água quente (cerca da metade do volume do balão) e acople ao aparelho de Clevenger. Preencha com água a parte graduada do referido aparelho antes de iniciar a destilação. Aqueça e mantenha em ebulição por no mínimo 4 horas ou destile até que duas leituras consecutivas em intervalo de 1 hora não mostrem alteração no volume de óleo obtido. Esfrie e leia o volume destilado diretamente na parte graduada do tubo de Clevenger. Forma-se inicialmente uma emulsão que com o passar das horas se separa. 888 - IAL Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres Cálculo n= nº de mL de óleo essencial destilado P= massa em g da amostra de condimento vegetal Referências Bibliográficas FREITAS, P.C.P. et al. Óleos essenciais (obtenção, análise, aplicação e usos):apostila. São Paulo: USP/CECAE. 16 p. 1995. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association Official of Analytical Chemists, Arlington: A.O.A.C., 1995. Chapter 43, p.3. Vinagres Vinagre de vinho ou simplesmente vinagre é o produto obtido pela fermentação acética do vinho, apresentando uma acidez volátil mínima de 4 g/100 mL do produto, expressa em ácido acético, sendo os outros componentes proporcionais à matéria-prima usada em sua elaboração. De acordo com a matéria-prima que lhe deu origem, o vinagre será classiicado como vinagre de vinho tinto ou branco. Fermentado acético é o produto resultante da fermentação de frutas, cereais, outros vegetais, mel ou da mistura de vegetais e hidroalcoólica, devendo apresentar uma acidez volátil, expressa em ácido acético, de no mínimo 4 g/100 mL. O fermentado acético pode ter adição de condimentos, aromas, extratos vegetais e óleos essenciais. As características de vinagres estão deinidas nos padrões de identidade e qualidade estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Na análise destes produtos, as determinações usuais são, entre outras: exame preliminar, densidade relativa, acidez total, acidez volátil, acidez ixa, álcool em volume, pH (017/IV), extrato seco, glicídios redutores em glicose, sulfatos, extrato seco reduzido, cinzas, dióxido de enxofre (050/IV) e eventualmente corantes orgânicos artiiciais e contaminantes inorgânicos. 504/IV Acidez total em vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico IAL - 889 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Material Pipeta de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, béquer de 250 mL, bureta de 25 mL, pHmetro, agitador magnético e barra magnética. Reagentes Solução de fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 1 M Procedimento – Pipete 10 mL de amostra num frasco Erlenmeyer de 250 mL e proceda como no método 235/IV. Titule com solução de hidróxido de sódio 1 M, em presença da solução de fenolftaleína ou transira a amostra para um béquer e titule com solução de hidróxido de sódio, utilizando o pHmetro para atingir o ponto inal de viragem, principalmente para amostras escuras. Cálculo Vo = volume de solução de hidróxido de sódio gasto na titulação, em mL M = molaridade da solução de hidróxido de sódio PM = peso molecular do ácido acético n = número de hidrogênios ionizáveis do ácido acético V = volume da amostra em mL f = fator de correção da solução de hidróxido de sódio 505/IV Acidez volátil em vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico A acidez volátil é expressa em g de ácido acético por 100 mL e é determinada volumetricamente, após destilação da amostra por arraste de vapor. Material Pipeta de 10 mL, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL, balão volumétrico de 100 mL, aparelho gerador de vapor e pHmetro. 890 - IAL Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres Reagentes Solução de fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 1 M Procedimento – Transira 10 mL de amostra para o aparelho gerador de vapor e destile como descrito no método 236/IV. Recolha no mínimo 100 mL do destilado. Titule rapidamente com solução de hidróxido de sódio 1 M, até coloração rósea persistente por 30 segundos, utilizando a solução de fenolftaleína. Cálculo A acidez volátil é expressa em gramas de ácido acético por 100 mL da amostra como descrito no método 236/IV. Nota: a acidez ixa pode ser calculada como a diferença entra a acidez total e a volátil obtida por este método, podendo ser obtida também após a evaporação da amostra. 506/IV Acidez fixa em vinagres e fermentados acéticos pelo método volumétrico A acidez ixa é determinada no resíduo após a evaporação da amostra, por titulação com hidróxido de sódio e pode ser expressa em gramas de ácido acético por 100 mL. Material Pipetas de (10 e 20) mL, cápsula de porcelana, frasco Erlenmeyer de 250 mL, bureta de 25 mL e banho-maria. Reagentes Solução de fenolftaleína Solução de hidróxido de sódio 0,1 M Procedimento – Pipete (10 ou 20) mL da amostra em uma cápsula de porcelana e evapore o líquido lentamente em banho-maria fervente até secura. Transira com água para um frasco Erlenmeyer e titule com solução de hidróxido de sódio 0,1 M. Calcule o teor de acidez ixa e expresse o resultado em gramas de ácido acético por 100 mL. Nota: a acidez volátil pode ser calculada como a diferença entre a acidez total e a acidez ixa obtida por este método. IAL - 891 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 507/IV Vinagres e fermentados acéticos – Determinação de álcool em volume Material Termômetro, balão volumétrico de 100 mL e conjunto de destilação. Reagente Solução de hidróxido de sódio 5 M Procedimento – Ajuste a temperatura da amostra a 20°C, meça 100 mL em um balão volumétrico, transira quantitativamente para um conjunto de destilação, lavando com água, neutralize com hidróxido de sódio 5 M (o volume pode ser calculado a partir da determinação da acidez) e proceda como descrito no método 233/IV. Obtenha a densidade relativa do destilado e o teor alcoólico. 508/IV Vinagres e fermentados acéticos – Determinação do extrato seco total Este método avalia o extrato seco, por evaporação da amostra em banho-maria e secagem em estufa. O extrato seco total de fermentados acéticos é expresso em gramas por litro. Procedimento – Proceda como descrito no método 238/IV. 509/IV Vinagres – Determinação do extrato seco reduzido O extrato seco reduzido é obtido pelo valor do extrato seco total subtraído dos açúcares totais e dos sulfatos que excedam 1 g por litro. Cálculo Calcule o extrato seco reduzido como descrito no método 238/IV. Referências bibliográficas BRASIL. Leis, Decretos, etc. Instrução Nomativa nº 22, de 14/04/03, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Diário Oicial, Brasilia, 02/05/03, p. 18152-18173. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: 892 - IAL Capítulo XXVIII - Condimentos e Vinagres Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 297-301. Colaboradores Letícia Araújo Farah Nagato e Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues IAL - 893 Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química CAPÍTULO XXIX SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS DE QUÍMICA IAL - 895 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 896 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química XXIX SEGURANÇA EM LABORATÓRIOS DE QUÍMICA Introdução N a condução de um processo analítico em um laboratório de química há diversos fatores de risco, de naturezas diferentes, e é necessário que este processo seja estudado visando, além de resultados coniáveis, a segurança dos proissionais e do laboratório. É necessário que os analistas e auxiliares tenham conhecimentos bem fundamentados sobre a natureza dos reagentes químicos envolvidos no trabalho, dos riscos de manipulação e as formas seguras de lidar com eles. Da mesma forma, devem ter conhecimento dos riscos das instalações, aparelhos e utensílios necessários às suas funções, bem como de sua utilização correta e segura. Os proissionais devem ser conscientizados e capacitados a tomar providências corretas em caso de acidentes. Para que o trabalho em um laboratório seja seguro, vários fatores devem coexistir: instalações bem planejadas,manutenção rigorosa, quantidades necessárias de equipamentos de segurança, tanto individuais como coletivos e treinamentos para situações de rotina e de emergência. Ao se pensar em riscos em um laboratório de química, é comum associá-los aos reagentes que podem estar presentes, mas também devem ser avaliados aqueles causados por eletricidade, calor, materiais cortantes, agentes biológicos, radiações, poeiras, fumos, névoas, fumaças, gases, vapores, ruídos e riscos ergonômicos. Deve existir uma sinalização alertando sobre todos os riscos existentes. Também é necessário destacar que, além da segurança interna do laboratório, devem ser observadas as questões ambientais como um todo, evitando descartes irregulares de resíduos poluentes e tóxicos. IAL - 897 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Não cabe, dentro dos propósitos deste livro, inserir um manual completo de segurança em laboratórios; existem publicações, tanto em meio físico quanto eletrônico, que podem nortear a montagem de um sistema de segurança adequado a este campo de trabalho e às particularidades de cada laboratório. Mas é importante lembrar sobre esta necessidade e fornecer alguns dos elementos ou critérios que devem ser observados. É possível fazer uma associação entre um Sistema da Qualidade e um Sistema de Segurança. Assim, os métodos analíticos descritos neste livro podem ser transformados em Procedimentos Operacionais Padrão - POPs, em cada laboratório em que forem adotados. Estes procedimentos são usualmente escritos com mais detalhes, destacando cada passo do processo analítico e, de acordo com as normas da qualidade, devem ser rigorosamente seguidos. Estes POPs podem incluir características toxicológicas dos reagentes envolvidos no método, os cuidados para sua manipulação e outras questões relativas à segurança. Também é adequado que os laboratórios elaborem ou adotem manuais de segurança que incluam todas as questões não especíicas de cada metodologia. Em instituições de grande porte, é conveniente que exista alguma forma de organização interna que avalie constantemente a situação da segurança nos diversos laboratórios, como uma CIPA (Comissão Interna para Prevenção de Acidentes) ou um Núcleo, Comitê ou Comissão de Biossegurança. Esta organização interna também deve executar inspeções, tendo em vista que nem sempre situações de risco são bem detectadas pelas pessoas que trabalham no local. O trabalho desta organização interna deve, ainda, propor de soluções para os problemas existentes. Algumas regras de segurança A seguir estão enumeradas algumas regras gerais de segurança, às quais devem ser adicionadas aquelas necessárias a cada laboratório, de acordo com seu trabalho: 1. Ao manipular um reagente pela primeira vez, informar-se sobre a toxicidade e outros riscos que envolvam essa manipulação, consultando tabelas que existam na seção, rótulos, ichas de informações sobre produtos químicos e/ou literatura especializada. 2. Trabalhar sempre sob cabine de segurança química (capela), que é um sistema de proteção coletiva, ao realizar operações com produtos voláteis, ao trabalhar com substâncias de composição desconhecida e ou quando haja a possibilidade de formação de poeiras, névoas ou fumaça. 898 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química 3. Usar máscaras de proteção respiratória quando não for possível trabalhar com equipamento de proteção coletiva; neste caso, as máscaras devem ser adaptadas ao rosto do laboratorista e providas de iltro adequado ao risco. 4. Usar óculos de proteção e luvas, bem como outros equipamentos de proteção individual (E.P.I.) sempre que necessários. Veriicar, para cada tipo de substância, o tipo de luva a ser usado – luvas de procedimentos (látex) são inadequadas para o trabalho com substâncias químicas. 5. Usar o avental constantemente no trabalho, mas não é recomendável permanecer com ele fora do laboratório, especialmente durante as refeições. O avental indicado é o de algodão, grosso, com abertura frontal, preferencialmente com fecho de velcro, mangas compridas com punhos fechados também com velcro, sem bolsos na parte inferior e sem detalhes soltos que possam enroscar. 6. Evitar testar amostras por odor, mas quando isto for imprescindível, não colocá-las diretamente sob o nariz. 7. Nunca pipetar com a boca, nem mesmo água; usar aparelhos apropriados. 8. Rotular, identiicando e datando, todos os frascos de solução ou reagentes que preparar. 9. Tomar cuidados redobrados ao manipular substâncias químicas contidas em frascos sem identiicação. 10. No caso de reações das quais não se saiba totalmente o resultado, fazer uma experiência prévia, em pequena escala, na cabine de segurança química (capela). 11. Ao promover reações ou aquecimentos de materiais em tubo de ensaio, nunca dirigir a abertura deste contra si ou outro colega; dirigi-la para dentro da cabine de segurança química. 12. Para diluir um ácido, adicionar o ácido à água, nunca o contrário. 13. Nunca deixar sem atenção qualquer operação onde haja aquecimento ou possibilidade de reação violenta (e usar a capela). 14. Informar-se sobre a localização e maneira correta de utilizar equipamentos contra IAL - 899 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital incêndio, chuveiros de emergência, lavadores de olhos e outros equipamentos de emergência. 15. Nunca beber ou comer alimentos na área de trabalho do laboratório. 16. Nunca fumar na área de trabalho do laboratório, mesmo que não haja risco aparente. 17. Lubriicar todo material de vidro que deva ser inserido em uma rolha, a qual deve ter furo de diâmetro conveniente; as mãos devem estar protegidas por luvas apropriadas ou toalhas. 18. Nunca trabalhar no laboratório sem estar junto com outro funcionário; trabalhos perigosos necessitam de pelo menos duas pessoas. 19. Realizar todos os procedimentos conscientemente; evitar o “automatismo” e distrações. 20. Manter o laboratório arrumado, limpo e livre de materiais não pertinentes ao trabalho. 21. O chão não deve ser encerado ou escorregadio. 22. Deve existir um programa de controle de insetos e roedores. 23. Não deve ser admitida a permanência de crianças no laboratório. 24. A entrada de pessoas estranhas ao trabalho, quando necessária, somente deve ser permitida após advertências quanto a riscos existentes e precauções para evitá-los. 25. No caso de trabalhos com amostras (por exemplo, água) suspeitas de contaminação biológica, consultar um manual de segurança especíico para microbiologia, usar equipamentos de proteção adequados, descontaminar imediatamente a bancada e outros materiais na eventualidade de derramamento da amostra. 26. Ainda com relação à possibilidade de contaminação biológica, conduzir todo procedimento de modo a minimizar a formação de aerossóis. Por exemplo, não abrir a centrífuga em movimento ou logo após ter parado. 27. Descontaminar todo material com suspeita de contaminação biológica antes de ser desprezado ou reutilizado. Materiais contaminados que serão autoclavados ou incinerados devem ser colocados em recipientes resistentes e em bom estado; aventais contaminados também precisam ser desinfetados de forma apropriada. 900 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química 28. Acondicionar adequadamente vidrarias quebradas a serem descartadas, lavadas, se necessário, com cuidado, antes do descarte. 29. Na Instituição, um programa de Gerenciamento de Resíduos Químicos, torna-se necessário. 30. Qualquer acidente ou fator de risco, por menor que seja, deve ser comunicado ao responsável pelo laboratório e à organização interna para a segurança do trabalho. As recomendações sobre segurança devem se estender a pessoas que prestem serviços ao laboratório, como o pessoal de manutenção (interno ou externo), de limpeza, e assim por diante, por meio de um programa de capacitação adequado. As regras de segurança aqui expostas são as mais comuns. É conveniente analisar cada uma delas em função do trabalho do laboratório e de cada funcionário, e agregar regras não mencionadas aqui e que sejam necessárias. Antes de iniciar a rotina diária de trabalho, deve-se veriicar tudo o que vai ser realizado e o material necessário, fazendo-se, portanto, uma análise do procedimento funcional a ser tomado, facilitando as tarefas, evitando o trânsito cruzado e desnecessário com outros laboratoristas e também o manuseio excessivo com o material a ser trabalhado. O preparo da bancada é fundamental. Do ponto de vista gerencial, alguns fatores contribuem para o bom e seguro andamento do laboratório, tais como: - A elaboração de um luxograma de atividades para análises rotineiras Boa supervisão do laboratório Boa distribuição do espaço físico, evitando aglomerações Capacitação e conscientização do pessoal Instalação e manutenção de equipamentos de proteção coletiva Incentivo ao uso correto e constante dos equipamentos de proteção individual, sempre que necessário - Substituição, sempre que possível, de substâncias tóxicas ou cancerígenas - Inclusão da questão de qualidade e de segurança nas previsões e processos de compras, tanto para materiais de segurança, como para vidrarias e outros equipamentos. Noções de toxicologia, riscos e prevenções no manuseio de produtos químicos Uma substância é considerada tóxica se for capaz de afetar de forma adversa a IAL - 901 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital saúde de um organismo. Em termos de efeitos biológicos, podem ocorrer respostas locais como irritação de pele e mucosas, edema localizado devido a inlamação e, eventualmente, necrose. Podem haver reações chamadas sistêmicas, a partir da absorção da substância pelo organismo. Fazem parte dessas reações sintomas inespecíicos como náuseas, vômitos, diarréia, efeitos narcóticos como tontura, redução da atenção e da percepção, com perda de consciência e coma. Alguns agentes químicos podem agir de forma mais especíica por mecanismos como a asixia, por interferir no transporte do oxigênio, como o monóxido de carbono ou os agentes metemoglobinizantes, ou por bloquear a utilização do oxigênio no nível tecidual, como o fazem as substâncias cianogênicas (que possuem o íon CN-) e o gás sulfídrico (H2S). Por meio da inibição de enzimas vitais ao nosso organismo, algumas substâncias podem bloquear a produção de hemoglobina, produzindo anemia, interferir na condução nervosa, produzindo sintomas neurológicos, causar insuiciência renal e hepática, etc. Efeitos tóxicos lesando a molécula de DNA podem se manisfestar como teratogênese (deformidades em crianças nascidas de mães expostas a substâncias tóxicas), efeitos mutagênicos (mudanças de um gene em particular ou no conjunto de cromossomos) e efeitos carcinogênicos (aparecimento de câncer). Dependendo da substância, pode haver mais de um efeito biológico adverso. Algumas substâncias podem ser acumulativas no organismo, isto é, depois que são absorvidas e distribuídas ligam-se a algum tecido do corpo (como ossos, tecido adiposo, tecidos moles como cérebro, fígado, rins e coração) e são excretados apenas lenta ou parcialmente, enquanto outras não apresentam essa característica. Independente de ser ou não acumulativa, é possível ocorrer intoxicação aguda quando houver exposição a uma concentração elevada da substância, mesmo que por um espaço de tempo curto. Dependendo da natureza e da ação do agente tóxico, com exposições repetidas, mesmo em níveis de concentração baixos, podemos ter uma intoxicação crônica. Em alguns casos os efeitos são reversíveis, isto é, desaparecem ao cessar a exposição (com afastamento ou tratamento médico, ou ambos). Em outros, os efeitos podem ser irreversíveis, mesmo que não haja mais exposição e que a pessoa seja submetida a tratamento médico. Efeitos adversos tardios, isto é, ocorrendo bem depois da exposição ter cessado, como neuropatias, podem ocorrer em algumas situações de intoxicação aguda por altas doses. A absorção de substâncias tóxicas no organismo pode se dar por via cutânea, respiratória, ou digestiva. No trabalho de laboratório, a absorção dessas substâncias deve ser evitada totalmente ou minimizada pelo uso de equipamentos de proteção coletiva, como as capelas, aparelhos apropriados para pipetagem e uso de equipamentos de proteção individual (E.P.Is) adequados à situação de exposição avaliada, sempre que necessários, e pela eliminação dos hábitos de comer ou fumar no ambiente de trabalho. Antes de se lidar com determinado produto químico é conveniente buscar informações sobre a sua ação tóxica sobre o organismo. 902 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química Para facilitar o acesso a essas informações, as gerências e as organizações internas para a segurança do trabalho podem optar entre vários caminhos: - inclusão das informações necessárias, em termos de segurança, a cada procedimento operacional padrão; - confecção de rótulos especiais contendo essas informações, que seriam aderidos ao vidro de reagentes; - elaboração de cartazes, para cada laboratório, contendo as características dos reagentes mais usados; - elaboração de ichas de informações de segurança para cada reagente, tipo de amostra e resíduos, a serem arquivadas em local de fácil acesso aos laboratoristas ou aixadas nas paredes do laboratório. Estas ichas e informações adicionais também devem ser solicitadas aos fornecedores quando da compra de materiais. Também podem ser obtidas por meio eletrônico, como no sítio da Organização Mundial da Saúde com o Programa das Nações Unidas para o Meio Ambiente e a Organização Internacional do Trabalho, onde há o programa INTOX do IPCS (sigla em inglês para o Programa Internacional de Segurança Química, que tem como endereço http://www.intox.org/databank/databank/chemicals, bem como o sítio do National Institute for Occupational Safety and Health (E.U.A.), endereço http://www.cdc.gov/niosh/homepage. As informações devem incluir o modo de ação da substância, os cuidados de manipulação, armazenagem e as providências a serem tomadas em caso de acidentes, além da forma correta de descartar seus resíduos. É importante que o funcionário esteja permanentemente ciente dos riscos e cuidados ao manipular reagentes (assim como ao lidar com equipamentos). Deve ser instruído a, em caso de dúvidas, procurar previamente instruções com o chefe ou um representante da organização interna para a segurança do trabalho ou ainda em literaturas especializadas. Deve ser lembrado que todo funcionário tem direito ao acesso a essas informações, assim como aos equipamentos de segurança coletiva e individual, além do direito de recusa a trabalhos em situações que coloquem em risco a sua saúde. Nem sempre o risco imediato ao se manipular um reagente químico está na sua ação direta sobre o organismo e sim por outros tipos de riscos envolvendo as suas propriedades como, por exemplo, a possibilidade de ser inlamável, explosivo, reagir violentamente com a água, liberar gases tóxicos em contato com a água ou outras substâncias e assim por diante. Convém, portanto, que informações deste tipo sejam levantadas. Além dos cuidados com as substâncias usualmente presentes em diversos laboIAL - 903 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital ratórios, é necessário estudar os cuidados requeridos em casos especíicos, conforme a área de atuação. Assim, para a determinação de pesticidas, sejam organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretróides ou outros, é necessário lembrar que são altamente tóxicos e que podem ser absorvidos também por inalação e pela pele e, dessa forma, é preciso reunir informações de segurança especíicas para se lidar com eles. No caso de preparações enzimáticas concentradas, podem ocorrer reações alérgicas e deve ser evitado o seu contato com a pele ou por inalação, pois pode haver dispersão no ar na forma de aerossol ou pó; o trabalho deve ser conduzido em laboratório com equipamentos de segurança coletiva adequados, com exaustão e renovação de ar, e com luvas e vestimentas adequadas. As micotoxinas, por sua vez, como substâncias carcinogênicas naturais, apresentam alta toxicidade, também podem ser absorvidas por inalação e pela pele, e devem ser manipuladas em cabines de segurança química, com luvas e, quando possível, com o uso de câmaras (caixas transparentes), que possibilitem a manipulação com luvas ou braços mecânicos, principalmente se estiverem no estado sólido (cristalino), pois o seu efeito eletrostático possibilita a difusão do material pelo ambiente de trabalho; se ocorrerem derramamentos, a área deve ser tratada com solução de hipoclorito de sódio a 1% e, após cerca de dez minutos, com solução de acetona a 5%. O laboratório: projeto, construção e instalações O projeto de um laboratório é o primeiro ponto para o estabelecimento de condições seguras de trabalho, bem como da manutenção posterior dessas condições. Ele deve levar em consideração, dentro da área disponível, as inalidades do trabalho especíico do laboratório, as operações e o luxo das amostras, os riscos decorrentes desse trabalho, o seu volume, o número provável de funcionários entre outros. De preferência, o espaço deve ser projetado com folga para possíveis aumentos, tanto de trabalho como de pessoal. Isto determinará as posições de bancadas, cabines de segurança química, chuveiros de emergência e assim por diante. Se existirem corredores no interior do laboratório, ou entre laboratórios, estes devem ter largura apropriada, de pelo menos 1,5 m, que permitam a livre circulação de pessoas, inclusive transportando materiais. Mesmo que amplos, não devem acomodar equipamentos, em uso ou não, ou reagentes, ou qualquer tipo de material: a área de circulação deve ser mantida livre de obstáculos. Na sua construção e instalação, devem ser usados materiais não combustíveis e resistentes à ação de compostos químicos que farão parte da rotina do laboratório, como solventes, agentes corrosivos e outros. Estes materiais devem ser de boa qualidade e estar em conformidade com as respectivas normas técnicas, como as da ABNT ou normas internacionais. Devem existir, no mínimo, duas portas, de largura suiciente (de preferência duplas, pelo menos uma delas), em áreas diferentes, abrindo para o exterior, providas de visores. Colocar piso antiderrapante, resistente a agentes químicos e a choques mecânicos 904 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química e disposto de forma absolutamente regular, para evitar tropeções. Prever áreas isoladas, como área para armazenamento de reagentes (somente o necessário à execução dos trabalhos, sem estoques de longo prazo), áreas para equipamentos que liberem grandes quantidades de calor (uma sala para mulas), para lavagem de materiais, vestiários internos (ante-sala de laboratórios com ambiente controlado), área para trabalhos de escritório e assim por diante. Projetar as instalações elétricas com folgas para possíveis necessidades posteriores (expansões, reformas, novos equipamentos). As tomadas de 110 e 220 V devem ter formatos diferentes, incompatíveis, para que não ocorram casos em que aparelhos sejam ligados à tensão incorreta. Ligar todas as tomadas e aparelhos elétricos ao io terra. Aixar nas tomadas e interruptores etiquetas com códigos relacionando-os seus respectivos quadros de força e disjuntores. Localizar estes quadros de força na área externa ao laboratório, livre de materiais inlamáveis. Se necessário, devem ser usadas luminárias e interruptores à prova de faíscas. Prover o prédio de um sistema pára-raios eiciente. Manter uma iluminação artiicial com intensidade adequada e lâmpadas que forneçam radiação branca, em geral luorescentes, com proteções contra pó e vapores. As tubulações de água, gases sob pressão, ar comprimido, vapor, devem ser resistentes e feitas de material adequado ao luido que irão conter. A identiicação geralmente se dá por meio de cores convencionais (normatizadas pela NBR 6493, de outubro de 1994 – ABNT), e também instalar registros gerais e locais, em pontos de fácil acesso. A ventilação deve ser suiciente para impedir o acúmulo de fumos e vapores no interior dos laboratórios. Se necessário, instalar sistemas de ventilação e exaustão forçadas, com os cuidados para que o sistema de ventilação, se existente, não inlua no sistema de exaustão a ponto de comprometer a sua eiciência. Construir as bancadas de material não combustível, com altura adequada, funcionais do ponto de vista ergonômico e resistentes aos agentes químicos que farão parte da rotina de trabalho. De preferência, não ligadas às paredes, de modo que possuam duas saídas. Se existirem bancadas paralelas, que a distância entre elas seja suiciente para a circulação (cerca de 1,5 m) e para que o laboratorista tenha espaço para recuar em caso de uma ocorrência de perigo. Se o tipo de atividade a ser desenvolvida for executada com o laboratorista sentado, prever nichos sob a bancada onde ele possa acomodar as pernas, sentando-se de forma ergonomicamente correta. Especial atenção deve ser dedicada às cabines de segurança, que são extremamente importantes na prevenção de acidentes e especialmente na prevenção da exposição a agentes químicos. Nelas são realizados os trabalhos com desprendimento de calor, vapores, fumos, com risco de explosão ou aqueles cujas conseqüências não são bem IAL - 905 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital conhecidas previamente. O projeto da cabine de segurança e os seus acessórios precisam ser adequados aos trabalhos que serão realizados. Existem especiicidades que diferenciam uma cabine de segurança química para solventes de outra para agentes corrosivos, como ácidos, por exemplo. Se no laboratório forem realizados trabalhos com materiais biológicos (ou que representem risco de contaminação biológica), deverão existir também cabines de segurança de luxo laminar. A construção, instalação e manutenção das cabines de segurança devem ser coniadas a empresas competentes e idôneas, que assegurem a qualidade do material adquirido e do serviço prestado. A sua manutenção deve ser periódica e rigorosa. Um dos fatores de risco presentes em laboratórios é o ruído, proporcionado por cabines de segurança, sistemas de exaustão ou ventilação, centrífugas e outros aparelhos que proporcionam uma carga (que em geral vai aumentando com o tempo, pelo envelhecimento dos equipamentos) de ruído contínuo e fatigante. Ao contrário do calor, é difícil isolar áreas especíicas para o ruído. Tanto as empresas fornecedoras desses materiais como técnicos em segurança do trabalho devem ser consultados para diminuir esse fator de risco ao menor nível possível. Adequar o sistema de esgotos ao tipo de laboratório instalado, quanto ao seu dimensionamento e ao tipo de material utilizado na sua construção. Não descartar por esse meio solventes, substâncias tóxicas ou agressivas ao meio ambiente; neutralizar ácidos e bases previamente ou, no mínimo, deixá-los bem diluídos antes do descarte. Os encanamentos nas saídas de pias e cabine de segurança química e ralos devem ter sifões para evitar o retorno de eventuais gases tóxicos presentes no esgoto. Colocar estrategicamente e em quantidade suiciente os equipamentos de segurança (extintores, alarmes, chuveiro com lava-olhos). Os chuveiros com lavaolhos, por exemplo, posicionados junto às áreas com maior risco, devem ser testados periodicamente, de acordo com as recomendações do fabricante. Planejar o sistema de combate a incêndios de acordo com a estrutura e natureza de trabalho do laboratório. Lembrar que há vários tipos de extintores para diferentes origens e meios de propagação para o fogo (em geral, são mais usados em laboratórios os extintores de gás carbônico e os de pó químico seco) e diferentes sistemas ixos de combate ao fogo, como hidrantes e esguichos de teto que disparam com a presença de calor. O uso de mangueiras requer treinamento especíico e pode haver restrições à água como forma de combate a incêndios em laboratórios. Portanto, é conveniente consultar empresas especializadas e o Corpo de Bombeiros e, a partir de seus relatórios e recomendações, quanto ao tipo de instrumentos, suas quantidades e o posicionamento no laboratório e no prédio, planejar a montagem do sistema contra fogo, efetuar os treinamentos necessários e fazer um cronograma de manutenção. A presença de todos os dispositivos de combate a incêndio deve ser bem sinalizada e o acesso a eles deve estar permanentemente desimpedido. Na 906 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química Instituição, para suas diversas unidades, pode se necessário ou conveniente manter uma Brigada de Incêndio (consultar o Corpo de Bombeiros). Acondicionamento de produtos químicos em laboratórios Os reagentes não podem ser guardados de uma forma aleatória ou por ordem alfabética, pois, nesse caso, estarão sendo desrespeitadas incompatibilidades. Cada laboratório mantém acondicionados, de forma adequada, os reagentes químicos que lhe são necessários, em quantidades limitadas, que são renovadas periodicamente. O almoxarifado central, especialmente projetado para este im, com interruptores e lâmpadas que não provoquem faíscas, piso adequado e assim por diante, fornece o material para o laboratório. O transporte de material do almoxarifado ao laboratório é realizado por meio de carrinhos, pelo menos no que diz respeito a vidrarias e reagentes químicos, os quais devem estar contidos em caixas de papelão ou outro material que diminua a possibilidade de impactos que possam causar a quebra dos frascos. Uma vez no laboratório, os reagentes são guardados em armários adequados, com prateleiras ajustáveis para se obter o vão necessário e revestidas, quando for o caso, de material resistente ao ataque dos produtos químicos que vão ser guardados. Os frascos dos reagentes devem estar dispostos de modo a facilitar o acesso àqueles usados com maior freqüência, respeitadas as compatibilidades entre eles. Frascos pesados não são guardados em prateleiras altas. Solventes voláteis e inlamáveis são guardados em armários refrigerados ou com exaustão adequada e livres da possibilidade de ocorrência de faíscas. De preferência, os armários possuem uma altura que dispense o uso de escadas ou outros objetos para se alcançar os produtos armazenados. Se for necessário o acesso a prateleiras mais altas, fazê-lo de modo adequado, com uma escada de construção e dimensões apropriadas, mas essas prateleiras não podem conter reagentes ou outros materiais que ofereçam risco ao laboratorista. Na Tabela 1 são citadas, como exemplo, algumas incompatibilidades entre reagentes. Tabela 1 - Incompatibilidade entre reagentes Manter Acetileno Acetona Ácido Acético Manter Fora do contato com Cobre (inclusive tubos), lúor, bromo, iodo, cloro, prata, mercúrio e seus compostos Misturas de ácido sulfúrico e ácido nítrico concentrados Ácido crômico, ácido nítrico, ácido perclórico, compostos hidroxilados, etilenoglicol, peróxidos e permanganatos Incompatibilidade entre reagentes IAL - 907 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Ácido Crômico Ácido Fluorídrico Ácido Nítrico Ácido Oxálico Ácido Perclórico Ácido Sulfúrico Amônia anidra Anilina Bromo Carvão ativo Cianetos Cloratos Cloro Cobre Dióxido de cloro Fluor Hidrocarbonetos em geral Iodo Líquidos inlamáveis Mercúrio Metais alcalinos e alcalinoterrosos Nitrato de amônio Manter 908 - IAL Ácido acético, ácido nítrico, naftaleno, cânfora, glicerol, terebentina, álcool, líquidos inlamáveis em geral Amônia (gás ou solução aquosa) Ácido acético, ácido crômico, ácido cianídrico, cianeto, anilina, sulfeto de hidrogênio, acetona, álcool, líquidos inlamáveis, substâncias que sofrem reações de adição de nitrato facilmente Prata e mercúrio Anidrido acético, bismuto e suas ligas, álcool, papel, graxas e outras substâncias orgânicas Cloratos, percloratos, permanganatos, água Mercúrio, cloro, iodo, bromo, ácido luorídrico, hipoclorito de cálcio e halogênios Ácido nítrico, peróxido de hidrogênio Amônia, acetileno, butadieno, butano, propano, gás liquefeito de petróleo, hidrogênio, benzeno, terebentina, carbeto de sódio e metais inamente divididos Hipoclorito de cálcio e todos os agentes oxidantes Ácidos e Bases Sais de amônio, ácidos, metais em pó, enxofre, carvão, substâncias orgânicas ou combustíveis inamente divididas Amônia, acetileno, butadieno, butano, propano, gás liquefeito de petróleo, solventes derivados de petróleo, hidrogênio, benzeno, terebentina, carbeto de sódio e metais inamente divididos Acetileno, peróxido de hidrogênio Amônia, metano, fosina, sulfeto de hidrogênio Deve ser totalmente isolado Flúor, cloro, bromo, formol, ácido crômico, peróxido de sódio, peróxidos em geral Acetileno, amônia, hidrogênio Nitrato de amônio, ácido crômico, peróxidos, halogênios, ácido nítrico Acetileno, ácido fulmínico, amônia Água, tetracloreto de carbono e outros hidrocarbonetos clorados, dióxido de carbono, halogênios Ácidos, metais em pó, líquidos inlamáveis, cloratos, nitratos, enxofre, substâncias orgânicas ou combustíveis inamente divididas Incompatibilidade entre reagentes Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química Nitreto de sódio Oxigênio Pentóxido de fósforo Permanganatos Peróxido de hidrogênio Peróxido de sódio Potássio metálico Prata Sódio metálico Sulfeto de Hidrogênio Chumbo, cobre e outros metais Hidrogênio, líquidos, gases e sólidos inlamáveis, óleos, graxas Água Glicerol, etilenoglicol, ácido sulfúrico, benzaldeído Cromo, cobre, ferro e outros metais, inclusive seus sais, líquidos inlamáveis, materiais combustíveis, anilina e nitrometano Qualquer substância oxidável, como álcoois, ácido acético glacial, benzaldeído, dissulfeto de carbono, acetato de etila Água, tetracloreto de carbono e outros hidrocarbonetos clorados, dióxido de carbono, halogênios Acetileno, ácido oxálico, ácido tartárico, compostos de amônio Água, tetracloreto de carbono e outros hidrocarbonetos clorados, dióxido de carbono, halogênios Ácido nítrico fumegante, gases oxidantes Fonte: Grist, NR. Manual de Biossegurança para o Laboratório, 2. ed. São Paulo: Santos Livraria Editora. 1995. Nota: substâncias do lado esquerdo da tabela devem ser estocadas e manuseadas de forma a não poder acidentalmente contatar substâncias correspondentes no lado direito da coluna, sob condições não controladas, pois podem ocorrer reações violentas. De modo geral, substâncias que reajam entre si não devem ser armazenadas juntas como, por exemplo, ácidos e bases. É conveniente que cada laboratório construa a sua tabela de incompatibilidade entre reagentes, de acordo com os materiais que utiliza. Para tanto, podem ser usadas as ichas individuais de informações de segurança, tabelas similares à Tabela 1, bem como sítios eletrônicos que contenham informações de segurança para substâncias químicas, como os apontados no item Noções de toxicologia, riscos e prevenções no manuseio de produtos químicos. Fechar hermeticamente os frascos dos reagentes ao serem guardados. No caso de frascos com roscas, não aplicar muita força, o que diicultaria a abertura posterior dos mesmos. A água A água é uma substância que poucas vezes é encarada como uma fonte de perigo, mas também é um composto químico e, em algumas situações, provoca reações violentas ou apresenta propriedades que podem acarretar perigo. Assim, é necessário particularizar os casos em que seu emprego ou presença pode representar risco, principalmente quanto ao armazenamento de reagentes, seu uso, descarte e em certas emergências. IAL - 909 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Muitos produtos químicos reagem com água de forma violenta, gerando grande quantidade de calor. Assim, se água for adicionada ao ácido sulfúrico concentrado, o calor gerado será muito intenso, provocando o arremesso de água quente e ácido sulfúrico ainda concentrado (e também quente), podendo produzir graves queimaduras pela ação do calor e do poder corrosivo do ácido. Por causa disto, há a regra segundo a qual o ácido deve ser adicionado à água e nunca o contrário. A operação deve ser conduzida de forma cuidadosa; a massa maior de água absorve parte do calor gerado. Espera-se pelo resfriamento adequado para continuar a operação, vagarosamente. Em certos casos, podem ser usados banhos de gelo para haver resfriamento mais rápido, mas também é necessário cautela, para não haver rompimento do vidro pela variação rápida de temperatura. Determinados elementos no estado metálico como sódio, potássio, cálcio ou magnésio (quando aquecido) também reagem violentamente com a água, provocando grande desprendimento de calor e faíscas. Os produtos dessas reações são bases fortes, que são corrosivas. Outros produtos químicos reagem com a água produzindo compostos de toxicidade variável, muitas vezes na forma de vapor. É preciso atenção, quanto à presença de água, para o armazenamento, uso e descarte destes produtos, entre os quais estão os silanos (metildiclorossilano, triclorossilano etc.), fosfetos (de sódio, alumínio etc.), hipocloritos secos (de lítio, sódio, cálcio etc), cianetos (de sódio, potássio etc.), brometo de acetila, cloreto de acetila, brometo de alumínio anidro, cloreto de alumínio anidro, pentaluoreto de alumínio, oxicloreto de cromo, ácido luorsulfônico, pentacloreto de fósforo, tetracloreto de silício, cloreto de tionila, iodeto de acetila, magnesiodiamida, solução sulfonítrica (ácido sulfúrico + ácido nítrico), pentaluoreto de iodo, nitreto de lítio. Podem ser formados compostos como cloreto de hidrogênio, cloro, fosina, cianeto de hidrogênio, brometo de hidrogênio, luoreto de hidrogênio, iodeto de hidrogênio, dióxido de enxofre, amônia e dióxido de nitrogênio. É necessário também lembrar que a água é boa condutora de eletricidade. Assim, num princípio de incêndio em que estejam envolvidos aparelhos elétricos ou existam tomadas próximas, não é conveniente fazer uso da água. Outra situação de risco no uso da água em caso de incêndio é representado pela sua utilização para apagar fogo envolvendo um solvente orgânico, imiscível com eles. A água é mais densa que a maioria dos solventes orgânicos e, se usada de forma inadequada, pode espalhar o solvente e as chamas, diicultando o combate ao incêndio. Derramamento de produtos químicos Em acidentes desse tipo, além dos riscos de natureza física, envolvendo o peso do recipiente, material de fabricação e estilhaços com risco de cortes, há os de natureza química do produto espalhado no ambiente, ou seja, se esse produto é corrosivo, inlamável, tóxico, volátil, ou com outras características de risco. Existem materiais absor910 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química ventes disponíveis no mercado especíicos para esse im e que devem estar disponíveis no laboratório. Na sua ausência, ácidos e compostos químicos corrosivos podem ser tratados com bicarbonato de sódio ou soda cáustica, após prévia adição cuidadosa de água (diluição). Soluções alcalinas podem ser diluídas e neutralizadas com ácidos fracos. Se o material for inlamável, as chamas existentes (em bicos de Bünsen etc) devem ser extintas imediatamente, deve ser fechada a válvula de gás para a sala e desligados os aparelhos elétricos que possam ser fonte de faíscas. Caso existam vapores tóxicos, evacuar a sala. Providenciar a ventilação da sala. A retirada do material deve ser feita com o uso de E.P.Is. Se necessário, acionar os bombeiros. Cilindros de gás Em diversos laboratórios é necessário o uso de gases sob pressão (hidrogênio, acetileno, nitrogênio, hélio, entre outros). O fornecimento deve ser feito por uma empresa idônea e que ofereça assistência quanto a questões de uso e manutenção. Os cilindros devem ser fornecidos com o nome e a cor característica de cada gás, capacete de proteção do cilindro, dados de pureza, simbologia de risco e número da ONU. O ideal é que exista, fora do prédio, uma central de gases, à qual os laboratórios estejam ligados por meio de tubulações apropriadas, evitando a utilização de cilindros no interior do prédio. Tanto para a construção da central como para condições de armazenamento, as empresas especializadas fornecedoras devem ser consultadas, bem como sobre a compatibilidade entre gases (e outros materiais) que possam permanecer no mesmo local. Construir esta central em local amplo, ventilado e de fácil acesso, tanto para carga e descarga de cilindros como para situações de emergência. Os cilindros devem ser mantidos protegidos de ocorrências climáticas como sol e chuva (mas possibilitando plena ventilação do interior desta central – com portas de tela de arame, por exemplo). O acesso ao interior da central deve ser controlado e restrito aos laboratórios usuários do sistema, por meio de pessoal instruído sobre os procedimentos com cilindros e gases sob pressão e ao pessoal de manutenção. Quando esta central não estiver disponível, não armazenar os cilindros de gás no laboratório. O armazenamento deve ser feito em local razoavelmente amplo, seguro, fora de áreas de circulação, coberto, bem ventilado e, tal como no caso da central, com acesso controlado ao seu interior. Observar também as incompatibilidades para armazenamento e uso entre os gases . Além de cilindros contendo o mesmo gás, podem ser guardados juntos aqueles quimicamente inertes, como nitrogênio ou argônio. Gases combustíveis devem estar distantes dos oxidantes; manter a uma distância segura uns dos outros gases que possam reagir entre si, como hidrogênio e acetileno. Tanto para uso como para armazenagem, os cilindros não devem ser colocados IAL - 911 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital em contato com circuitos elétricos ou próximos a fontes de calor irradiante ou chama aberta Devem sempre permanecer em posição vertical, presos à parede com correntes ou cintas de material resistente. Quando da instalação de um cilindro (que deve ser feita com ferramentas adequadas), veriicar se não há ocorrência de vazamento, podendo o teste ser feito com mistura de água e metanol (com 10% de metanol), água e etanol ou com preparados à base de surfactantes disponíveis no mercado especiicamente para esse im. No caso de gases corrosivos, usar equipamentos de proteção individual. Não devem existir chamas ou cigarros acesos por perto. Além do bom estado geral dos cilindros, veriicar que eles estejam sempre limpos, secos e isentos de graxas. Não engraxar as válvulas e, se emperradas, contatar o fornecedor. Os cilindros devem permanecer em uso até alcançar uma pressão indicada pelo próprio fabricante (normalmente 1 a 2 Kgf/cm2), para evitar possíveis contaminações do recipiente por entrada de ar. Após o uso deve ser retirado do local de trabalho e encaminhado ao local de armazenagem. Para todas essas operações, devem ser solicitadas instruções mais detalhadas aos fabricantes. Quanto ao transporte entre o local de armazenagem e o de uso (e vice-versa), os cilindros devem ser conduzidos em carrinhos especíicos para esse im, de tamanho apropriado; deve ser mantido preso ao carrinho e com o capacete de proteção para a válvula. Descarte de materiais Os materiais a serem descartados por laboratórios de análise química de alimentos incluem: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. amostras de alimentos papel e sólidos inertes (inclusive amostras) papel contaminado quimicamente e reagentes sólidos (inclusive amostras) soluções isentas de solventes orgânicos solventes orgânicos em geral vidro quebrado e recipientes em geral materiais com possibilidade de contaminação microbiológica O descarte de materiais é muito preocupante num processo de análise química. As pessoas encarregadas dessa operação devem receber instruções rigorosas quanto a algumas normas de segurança, como o uso de E.P.I. (luvas e botas) e cuidados no manuseio de certos tipos de resíduos. Papéis e sólidos inertes são descartados como lixo comum, sem maiores preocupações. É obrigatório manter o lixo sempre tampado. Amostras de alimentos sólidos, ao serem descartadas, podem ser subdivididas em partes pequenas, com adição de um 912 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química produto que impeça seu consumo e cuja presença seja facilmente perceptível como, por exemplo, um detergente colorido. Alimentos líquidos, sem contaminação, podem ser diluídos e jogados na pia. Recipientes vazios de amostras ou materiais utilizados pelo laboratório necessitam de uma lavagem antes do descarte. Tanto os recipientes de vidro como material de vidro quebrado ou trincado não podem ser descartados em sacos para lixo comum. Esse tipo de material deve ser colocado em caixas de papelão especíicas para esse im, para evitar ferimentos nas pessoas encarregadas da coleta. É necessário diluir e neutralizar as soluções ácidas e básicas antes de serem despejadas em esgoto. Soluções aquosas salinas de natureza não tóxica e não agressiva ao meio ambiente também podem ser descartadas da mesma forma. Papel de iltro com material de baixa toxicidade pode sofrer uma lavagem estando ainda dentro do próprio funil e depois ser descartado com o lixo comum. Resíduos sólidos de reagentes químicos (também de baixa toxicidade) podem ser dissolvidos em quantidades relativamente grandes de água e a solução diluída, escoada pela pia, com a torneira aberta por alguns minutos. Para solventes orgânicos o ideal é tentar o seu reaproveitamento, depois de uma recuperação procedida internamente (com normas de segurança especíicas) ou por empresas especializadas. Quando esta recuperação não for possível ou conveniente, os solventes poderão ser coletados em recipientes adequados e icar numa central de armazenamento, e posteriormente enviados a uma empresa que possua instalações apropriadas para a sua destruição, de acordo com as normas ambientais (o mesmo vale para outros resíduos com potencial tóxico ou poluente). Se o destino for a incineração, não devem ser adicionados a esses recipientes, sem o conhecimento dessa empresa, solventes não inlamáveis, como o tetracloreto de carbono ou clorofórmio. A empresa responsável pelo transporte e destinação dos resíduos deverá orientar sobre os tipos de recipientes a serem utilizados e pelos tipos de compostos que podem ser colocados juntos em um mesmo recipiente. Deve ser dada atenção especial aos materiais para os quais existam restrições de caráter ambiental, em termos de sua destinação inal. Para tanto, devem ser consultadas empresas especializadas, a legislação municipal, estadual e federal e os órgãos de defesa ambiental. Materiais com risco de contaminação microbiológica devem ser recolhidos em sacos de lixo autoclaváveis e enviados para descontaminação ou esterilização por um processo físico como a autoclavagem, e somente depois podem ser descartados. Quando algum motivo impedir este procedimento, o material deve ser tratado com desinfetante à base de hipoclorito de sódio ou outro conveniente pelo tempo necessário e depois descartado. A descontaminação química pela ação de desinfetantes, como solução de hipoclorito de sódio, iodo e outros halogenados, etanol, álcalis, fenóis e sais quaternários de amônio, deve ser feita com o conhecimento de que tipo de microorganismos deve ser tratado e também em que ambiente. Para muitos desinfetantes, o pH, a carga de matéria orgânica e a concentração são fatores importantes para determinar a eiciência IAL - 913 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital do processo.Todo material biológico, assim como vidraria quebrada que tenha entrado em contato com o material biológico, deve ser descontaminado antes do descarte. Para estes tópicos, é importante ver recomendações a respeito em um Manual de Segurança para Laboratórios de Microbiologia ou consultar um proissional especializado. Cuidados com relação a alguns equipamentos Fazendo novamente a associação entre Qualidade e Segurança, assim como existem POPs de metodologias analíticas, devem existir POPs para a utilização de equipamentos, os quais podem incluir recomendações sobre o uso de EPIs e outros requisitos de segurança. Muflas Devem, preferencialmente, estar em uma sala isolada, destinada especiicamente para equipamentos geradores de calor, com sinalização adequada. O proissional deve fazer uso de equipamentos de proteção individual adequados (luvas de proteção térmica com cano longo e pinças longas de aço inoxidável). Quando uma amostra de matéria orgânica necessitar de destruição por via seca, somente deverá ser colocada em mula após prévia carbonização (com aquecimento gradual) em bico de Bunsen, feita em cabine de segurança química. Somente quando o aquecimento máximo com o bico não provocar mais desprendimento de fumos é que a amostra pode ser transferida para a mula. Caso contrário, poderão ocorrer a contaminação do ar do laboratório e a perda de amostra. Refrigeradores Devem ser usados os previstos especialmente para laboratório, eventualmente com motor fora do ambiente de trabalho para evitar faíscas que possam provocar a ignição de solventes inlamáveis e voláteis possivelmente presentes na sala ou dentro do próprio refrigerador. Mesmo que um refrigerador comum não seja utilizado para guardar esse tipo de solventes, deve icar razoavelmente protegido (afastado) da área do laboratório em que esse tipo de solvente possa ser ocasionalmente utilizado. Dessecadores, materiais dessecantes e uso de vácuo Entre os materiais dessecantes normalmente utilizados estão o ácido sulfúrico, o pentóxido de fósforo (que oferecem riscos, pois suas reações com água são acompanhadas de grande desprendimento de calor e provocam queimaduras graves ao contato 914 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química com a pele), cloreto de cálcio e sílica-gel. A sílica-gel com indicador de umidade (rosa quando hidratada, azul quando seca) é segura e, quando hidratada pelo uso, fácil de recuperar em uma estufa seca a 100 ºC, sendo portanto o agente dessecante mais recomendável, tanto para dessecadores como para estufas sem ar corrente. Ao se transferir uma amostra que tenha passado por processo de aquecimento para um dessecador, deve-se esperar algum tempo, suiciente para um certo resfriamento do cadinho, evitando o rompimento da placa de porcelana do dessecador. Após a colocação do cadinho, deixar aberto por tempo suiciente o orifício da tampa do dessecador, caso contrário a dilatação do ar devida ao aquecimento poderá expulsar violentamente a tampa do dessecador. Ao se usar vácuo o dessecador deve estar colocado dentro de uma caixa de tela metálica para evitar projeções de estilhaços em caso de explosão. Esta observação é válida para outros casos em que se use vácuo, como nas iltrações com uso de kitassato. Quando a aparelhagem for grande, como no caso de destilação, e não se dispuser de cabine de segurança química ou tela metálica de tamanho adequado, o laboratorista deve usar óculos de segurança e trabalhar com o máximo de prudência, evitando fazer vácuo (ou desfazê-lo) com rapidez. O processo deve ser lento para permitir a acomodação das paredes de vidro à nova relação de pressões interna/externa; o material de vidro deve ser de boa qualidade. No caso de estufas de vácuo com frente de vidro, embora este seja normalmente de resistência adequada, também deve ser adaptada uma tela metálica à face exterior; a retirada e a admissão de ar também não devem ser rápidas. Autoclaves Usadas para esterilização de materiais e culturas. Dada a sua inalidade e modo de operação, estes aparelhos devem ser constituídos de material resistente e providos de manômetros em perfeitas condições de funcionamento. A pressão interna e o calor são os principais fatores de risco. Antes de abrir a autoclave é necessário assegurar-se de que a mesma esteja resfriada convenientemente e o vapor tenha sido retirado; caso contrário, a violenta expansão do vapor, quando da retirada da tampa, poderá provocar ferimentos sérios ao operador e a perda do material. IAL - 915 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Centrífugas Veriicar se o balanceamento da carga está correto, evitando o risco de quebra de algum tubo dentro da centrífuga, o que acarretaria maior formação de aerosol e até mesmo de gotículas maiores. Os movimentos rápidos da superfície do líquido durante a centrifugação formam os aerosóis; portanto não se deve abrir a centrífuga logo após sua parada, nem enquanto estiver girando, mesmo devagar. Materiais de vidro Montagem de aparelhagens Freqüentemente é necessário montar uma aparelhagem com várias peças de vidro, como no caso de destilações. Preferencialmente, as peças devem ter terminais (conexões) esmerilhados e as ligações feitas diretamente. Em outros casos, as ligações são feitas por meio de rolhas ou tubos de borracha. Cada uma das peças, independente do material de que seja feita, deve ser cuidadosamente examinada antes de se proceder à montagem do aparelho. Não devem ser usadas peças trincadas, com qualquer tipo de issura, que permitam vazamentos ou que não proporcionem ajuste perfeito. Após a montagem, ajustar as peças de tal forma que nenhuma delas esteja sob tensão e convenientemente presas por garras distribuídas ao longo da aparelhagem, de modo que não necessitem suportar o peso umas das outras (evitar por outro lado, um número excessivo de garras). As garras devem estar irmemente presas a suportes seguros. Veriicar se as peças recurvadas não apresentam estrangulamentos internos. Vedar as conexões com paraina derretida, quando possível, aplicada com pincel. Quando for necessário cortar um tubo de vidro para ser aplicado à aparelhagem (ou outra inalidade qualquer) deve-se observar o procedimento a seguir. Com uma lima, de preferência triangular, abre-se um sulco, não muito profundo em uma parte pequena da volta do tubo (o sulco não deve dar a volta no tubo). Estando as mãos protegidas por luvas resistentes e os olhos por óculos de segurança, segura-se o tubo com a parte limada para fora do corpo; pressiona-se o tubo com os polegares no mesmo sentido, isto é, para fora do corpo. As pontas do tubo devem em seguida ser arredondadas em uma chama. Espera-se o tubo esfriar sozinho (o resfriamento rápido com água, por exemplo, quebrará o vidro). Se este tubo for inserido em uma rolha, esta deve ter furo de diâmetro conveniente e a operação de inserção deve ser feita com lubriicação e com movimento giratório lento. 916 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química Para a perfuração furação de rolhas, observar alguns pontos como: fazer o furo pela parte inferior, apoiando sobre a mesa a parte superior da rolha (de maior diâmetro); no caso de rolhas de borracha, escolher um furador de diâmetro ligeiramente maior que o tubo a ser inserido (após a retirada do furador, o furo da rolha contrai) e o furador pode ser lubriicado com vaselina, silicone ou um pouco de óleo para evitar que a rolha se molhe; no caso de rolhas de cortiça, o furador não deve ser molhado e pode-se reforçar a superfície externa da rolha com ita adesiva, irmemente presa, para evitar seu rompimento. Em qualquer caso, o furo deve ser feito em um único sentido (não furar de ambos os lados para fazer o encontro dos orifícios no meio). Não tentar aumentar o furo de uma rolha com um furador maior; é melhor pegar outra rolha e refazer a operação. Lavagem de vidrarias Ao término de um trabalho analítico, todas as peças e recipientes devem passar por um processo rigoroso de lavagem. O proissional que tiver realizado o trabalho de análise deve fazer uma lavagem preliminar do material antes de entregá-lo à pessoa responsável pela limpeza inal, evitando que ela se acidente pelo desconhecimento da natureza dos resíduos contidos nos frascos ou pela mistura com outros reagentes incompatíveis. Cada laboratório deve usar um processo de lavagem que lhe seja conveniente. Em geral, este processo utiliza detergente (inclusive os destinados especiicamente a laboratórios) ou sabão, tornando o material escorregadio e por isto recomenda-se usar luvas de borracha antiderrapantes para proteger as mãos de arestas cortantes e evitar irritações de pele pelo contato constante com produtos químicos e agentes de limpeza. Pode ser colocada uma placa de borracha (com abertura no centro) no fundo da pia para atenuar eventuais quedas das peças de vidro. Muitos laboratórios utilizam, além de detergentes especíicos para laboratórios, soluções sulfonítricas, soluções de ácido nítrico ou clorídrico, hidróxido de potássio em álcool e outras, no processo de lavagem. Estes materiais podem ser altamente corrosivos e reativos e seu contato com a pele pode gerar queimaduras. Dessa forma, sua preparação e uso devem ser feitos por pessoal treinado, com extremo cuidado. É necessário o uso de luvas de borracha, óculos de proteção (ou escudo facial), avental e botas de borracha. O frasco a ser limpo com estas soluções deve ser pré-lavado com detergente e água corrente e, se necessário, seco previamente. Pipetas podem ser colocadas em uma proveta de 1000 mL, apoiadas sobre uma esponja de espuma colocada no fundo da proveta para amortecer o impacto. Sua retirada pode ser feita com uma pinça cuja ponta seja revestida com ita veda-rosca ou tubo de borracha. O uso da solução sulfocrômica deve ser abandonado devido aos riscos a que expõe o laboratorista, bem como pelos riscos ambientais. Para a lavagem de vidrarias que tenham entrado em contato com micotoxinas, enxaguá-las com metanol (com os cuidados necessários também para a manipulação desta substância), retirar (armazenando para descarte posterior adequado), adicionando em seguida solução de hipoclorito de sódio a 1% e, após cerca de duas horas, solução IAL - 917 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de acetona a 5%. Aguardar trinta minutos, enxaguar e prosseguir com a lavagem usual, como para outras vidrarias. Nota final Para um sistema de segurança do trabalho são necessários muitos estudos especíicos que, conforme apontado ao longo deste texto, exigem consultas a publicações, entidades e proissionais especializados. O gerenciamento desse sistema exige, como no caso da qualidade, um trabalho permanente, para o qual este capítulo é apenas um breve roteiro que, lembramos, não deve ter a função de um manual de segurança. Revisão Arline Sydneia Abel Arcuri Bacharel em química e doutora em físico-química pela universidade de São Paulo USP, pesquisadora,diretora técnica da Fundação Jorge Duprat Figueiredo de segurança e medicina do trabalho - FUNDACENTRO Eduardo Mello De Capitani Médico, mestre em medicina e doutor em saúde coletiva pela universidade de Campinas – UNICAMP, especialista em saúde pública e medicina do trabalho, professor assistente do departamento de clínica médica da faculdade de ciências médicas da UNICAMP, coordenador do centro de controle de intoxicações, faculdade de ciências médicas do hospital das clínicas da UNICAMP. Mary Rosa Rodrigues de Marchi Professora assistente doutora, departamento de química analítica, instituto de química – UNESP Referências Bibliográficas ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA QUÍMICA (ABIQUIM) - Departamento técnico, comissão de transportes: Manual para atendimento de emergências com produtos perigosos, 3. ed. São Paulo, 1999. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS, Official Methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. Arlington: A.O.A.C., 16th , 1997. 918 - IAL Capítulo XXIX - Segurança em Laboratórios de Química CARVALHO, P.R. Boas práticas químicas em biossegurança.Rio de Janeiro: Editora Interciência Ltda., 1999. GRIST, N.R. Manual de biossegurança para o laboratório. 2. ed. São Paulo: Santos Livraria Editora, 1995. OLIVEIRA, W.P. Segurança em laboratórios químicos. 2. ed. Coleção SESI de Segurança do Trabalho, São Paulo, Serviço Social da Indústria, 1975. TIGLEA, P, SANTOS, C.C.M. Manual de biossegurança para laboratórios de química, Instituto Adolfo Lutz, Publicações Técnicas para Divulgação Interna, São Paulo, 1992. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Laboratory biosafety manual. Geneva: WHO, 1983. Colaborador Paulo Tiglea IAL - 919 APÊNDICE I SOLUÇÕES TITULADAS INDICADORES PAPEL REATIVO CLARIFICADORES IAL - 921 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 922 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores I SOLUÇÕES TITULADAS INDICADORES PAPEL REATIVO CLARIFICADORES ÁCIDO CLORÍDRICO Preparo de solução 1 M – Meça 90 mL de ácido clorídrico HCl (D = 1,19) em proveta e transira para um balão volumétrico com rolha esmerilhada. Adicione água até completar o volume de 1000 mL. Agite. Titulação Coloque cerca de 5 g de Na2CO3 em cadinho de porcelana de 50 mL. Comprima a substância contra as paredes do cadinho, com uma espátula. Aqueça a 270°C, durante uma hora. Tampe o cadinho e esfrie em dessecador contendo cloreto de cálcio anidro, durante uma hora. Transira rapidamente o Na2CO3, ainda quente, para um pesa-iltro. (O Na2CO3 é higroscópico, devendo ser manipulado rapidamente). Esfrie em dessecador. Pese o pesa-iltro tampado. Transira, para um frasco Erlenmeyer, cerca de 1,3 g de Na2CO3, pesados com precisão analítica. Pese novamente. A diferença entre as duas massas dará o nº de gramas de Na2CO3 a ser usado na titulação. Adicione ao frasco Erlenmeyer cerca de 75 mL de água e 2 gotas de alaranjado de metila a 0,1% , ou da mistura alaranjado de metila-índigo carmim (1 g de alaranjado de metila e 2,5 g de índigo carmim dissolvidos em 1000 mL de água e iltrados). Agite e titule. Cálculo do fator de correção (f) P = g de Na2CO3 usados na titulação V = mL de HCl gastos na titulação IAL - 923 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital M = Molaridade da solução Nota: f deve estar compreendido entre os valores 0,9 e 1,1. Em caso contrário, adicione água ou ácido e titule novamente. Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito no item acima, usando os valores das Tabelas 1 e 2. Para preparar soluções 0,01 M, tome 10 mL da solução 1 M e dilua o volume para 1000 mL. Tabela 1 – Volume de HCl (D = 1,19) necessário para a preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,01 0,02 0,10 0,50 1,00 mL de HCl* 0,9 1,8 9,0 45,0 90,0 * mL HCl/L solução = 90 x M Tabela 2 – Quantidade aproximada de Na2CO3 anidro, necessária para a titulação de 25 mL de ácido padrão Molaridade do ácido 0,1 0,5 1,0 g Na2CO3* 0,132 0,660 1,320 *g Na2CO3 = 0,053 x 25 x M ÁCIDO OXÁLICO Preparo de solução 0,5 M – Pese 63 g de ácido oxálico H2C2O4.2H2O em balança analítica (décimo de mg) e transira para um balão volumétrico, com rolha esmerilhada. Adicione água suiciente para 1000 mL de solução. Agite até dissolução total. 924 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores Titulação Transira, com o auxílio de pipeta volumétrica, 25 mL desta solução para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione 200 mL de água e, depois, 10 mL de H2SO4 (D = 1,84), lentamente, pelas paredes do frasco. Agite e conserve a temperatura entre 50–60°C, durante a titulação. Titule com solução de permanganato de potássio 0,2 M, até o aparecimento de coloração rósea persistente, durante 30 segundos. Cálculo do fator de correção (f) V = mL da solução de KMnO4 gastos na titulação F = fator de correção da solução KMnO4. v = mL da solução de ácido oxálico usado na titulação Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito no item acima, usando os valores da Tabela 3. Tabela 3 – Quantidade de H2C2O4.2H2O necessária para a preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,005 0,05 0,5 g H2C2O4.2H2O* 0,63 6,30 63,00 * g H2C2O4.2H2O/L solução = 126 x M ÁCIDO PERCLÓRICO Preparo de solução 0,1 M – Meça 8,2 mL de HClO4 a 72%, ou 11,4 mL de HClO4 a 60%, em proveta e junte cerca de 900 mL de ácido acético glacial. Adicione, então, cuidadosamente, em pequenas porções, anidrido acético suiciente para reagir com a água do HClO4, agitando após cada adição. São necessários 8,8 mL ou 14,8 mL de anidrido acético, conforme se tenha usado HClO4, a 72% ou a 60%. É melhor pequeno excesso de anidrido acético (1 - 2)% do que deiciência. Complete o volume a 1 L, com ácido acético glacial. Deixe em repouso durante uma noite para completar a reação entre a água do ácido perclórico e o anidrido acético. IAL - 925 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Titulação Titule com biftalato de potássio C6H4(CO2H) (CO2K), previamente seco em estufa a 105ºC durante uma hora e resfriado em dessecador. Pese, exatamente, cerca de 0,5106 g de biftalato e dissolva em 50 mL de ácido acético glacial. Junte 2 gotas de solução a 1% do indicador violeta genciana em ácido acético glacial e titule com a solução de HClO4, até mudança da coloração azul para verde-azulada (0,5106 g de biftalato de potássio correspondem a 25 mL de solução 0,1M de HClO4.) Nota: faça uma titulação em branco do ácido acético e desconte do volume de HClO4 gasto na titulação. Cálculo do fator de correção (f) P = massa de biftalato usado V = mL de solução de ácido perclórico gastos M = Molaridade da solução ÁCIDO SULFÚRICO Preparo de solução 0,5 M – Meça 30 mL de H2SO4 (D= 1,84) em proveta e transira cuidadosamente para balão volumétrico com rolha esmerilhada, contendo cerca de 500 mL de água. Dilua o volume a 1000 mL (cuidado!). Agite. Titulação Proceda usando a mesma técnica da titulação do ácido clorídrico., Cálculo do fator de correção (f) P = g de Na2CO3 usados na titulação V = mL de H2SO4 gastos na titulação M = molaridade da solução Preparo de soluções de outras molaridades 926 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores das Tabelas 4 e 5. Nota: para soluções 0,005 e 0,01 M, tome alíquotas da solução 0,5 M, respectivamente (10 e 20) mL, e dilua o volume para 1000 mL. Tabela 4 – Volume de H2SO4 (D = 1,84) necessário para preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,005 0,01 0,05 0,25 0,50 mL H2SO4 * 0,3 0,6 3,0 15,0 30,0 * H2SO4 /L solução = 60 x M Tabela 5 – Quantidade aproximada de Na2CO3, anidro, necessária para titulação de 25 mL de ácido padrão. Molaridade do ácido-padrão 0,05 0,25 0,50 g Na2CO3 * 0,132 0,662 1,320 *g Na2CO3 = 0,106 x 25 x M EDTA Preparo da solução – Pese 37,224 g do sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético C10H14N2Na2O8.2H2O, transira para um balão volumétrico, com auxílio de água e complete o volume a 1000 mL. Agite e transira para frasco de polietileno. Titulação Pese exatamente cerca de 400 mg de carbonato de cálcio e transira para um béquer de 400 mL. Adicione 50 mL de água e solução de ácido clorídrico (1+3) suiciente para dissolver todo o carbonato de cálcio. Dilua até 150 mL, com água, adicione 15 mL de solução de hidróxido de sódio 1 M e 30 mg de indicador azul de hidroxinaftol e titule com solução de EDTA, usando agitador magnético, até viragem de rosa para azul profundo. IAL - 927 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo HIDRÓXIDO DE BÁRIO Preparo de solução 0,5 M – Pese 180 g de Ba(OH)2. 8H2O. Transira para um balão volumétrico e dissolva em água, recentemente fervida (isenta de CO2) e resfriada a 25ºC, suiciente para 1000 mL . Deixe a solução em repouso durante dois dias ou até que todo o carbonato de bário se tenha depositado. Decante a solução e transira para o frasco de polietileno. Conserve protegida contra o CO2 do ar. Titulação Transira, com auxílio de uma pipeta, 25 mL de HCl 1 M para frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 gotas de solução de fenolftaleína. Adicione, gota a gota, com auxílio de bureta, a solução de Ba(OH)2 a ser titulada até o aparecimento de coloração rósea persistente. Cálculo do fator de correção (f) V = mL de HCl usados na titulação F = fator da solução de HCl v = mL de Ba(OH)2 gastos na titulação Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores da Tabela 6. Tabela 6 – Quantidade de Ba(OH)28H2O necessária para preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,005 0,050 0,50 * Ba(OH)2 . 8H2O/L solução = 360 x M 928 - IAL g Ba(OH)2.8H2O* 1,8 18,0 180,0 Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO Preparo de solução 1M – Pese 75 g de KOH e transira para frasco com rolha de borracha, com auxílio de 1000 mL de água isenta de gás carbônico. Adicione, gota a gota, solução saturada de hidróxido de bário até não se formar mais precipitado. Agite. Conserve o frasco fechado em repouso durante 12 horas. Decante e transira o líquido claro para frasco de polietileno. Conserve protegido do gás carbônico do ar. Titulação Transira, com auxílio de uma pipeta, 25 mL da solução a ser titulada para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 50 mL de água, isenta de gás carbônico, e 2 gotas do indicador vermelho de metila. Titule com ácido clorídrico da mesma molaridade, com auxílio de bureta, até mudança da coloração amarela para rósea. Cálculo do fator de correção (f ) V = mL HCl gastos na titulação F = fator de correção do ácido clorídrico v = mL de solução de KOH usados na titulação Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito no item acima, usando os valores da Tabela 7. Tabela 7 – Quantidade de KOH necessária para a preparação de 1000 mL da solução Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 KOH* 0,75 7,50 75,00 *g KOH/L solução = 75 x M IAL - 929 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital HIDRÓXIDO DE SÓDIO Preparo da solução 1 M – Pese 45 g de NaOH e transira para o frasco com rolha de borracha com auxílio de 1000 mL de água isenta de gás carbônico. Adicione, gota a gota, solução saturada de Ba(OH)2 até não se formar mais precipitado. Agite. Conserve o frasco fechado em repouso durante 12 horas. Decante e transira o líquido claro para o frasco de polietileno. Conserve protegido do gás carbônico do ar. Titulação com biftalato de potássio Pese, em balança analítica, cerca de 5 g de biftalato de potássio C6 H4 (CO2H) (CO2K), previamente seco em estufa a 105°C, durante 1 hora resfriado em dessecador. Dissolva em 75 mL de água isenta de gás carbônico. Junte 2 gotas de solução de fenolftaleína e titule com a solução de hidróxido de sódio, até o aparecimento de coloração rósea persistente. Cálculo de fator de correção (f) P = g de biftalato de potássio usado na titulação V = mL da solução de hidróxido de sódio gastos M = molaridade da solução Tabela 8 – Quantidade aproximada de C6 H4 (CO2 H) (CO2 K) necessária para a titulação de 25 mL de base padrão Molaridade de base padrão 0,01 0,10 1,00 g C6 H4 (CO2 H) (CO2 K)* 0,05 0,50 5,00 *g C6 H4 (CO2 H) (CO2 K)/L solução = 5,00 x M Titulação com ácido clorídrico padronizado Transira, com auxílio de uma pipeta, 25 mL da solução a ser titulada para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 50 mL de água, isenta de gás carbônico, e 2 gotas do indicador vermelho de metila. Titule com ácido clorídrico da mesma molaridade, com auxílio de bureta, até mudança da coloração amarela para rósea. Cálculo do fator de correção (f ) 930 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores V = mL de HCl gastos na titulação F = fator de correção do ácido clorídrico v = mL de solução de NaOH usados na titulação Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como em preparo da solução molar usando os valores da Tabela 9. Tabela 9 – Quantidade de NaOH necessária para a preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 g NaOH* 0,45 4,50 45,00 *g NaOH/L solução = 45 x M IODO Preparo de solução 0,5 M – Pese 200 g de KI, isento de iodato de potássio. Transira para um balão volumétrico escuro, com rolha esmerilhada, com auxílio de cerca de 40 mL de água. Pese cerca de 127 g de iodo ressublimado e transira para o frasco contendo KI. Complete o volume de 1000 mL com água. Agite até total dissolução do iodo. Conserve a solução em lugar frio com ausência de luz. Titulação Transira, para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, 25 mL da solução de iodo a ser titulado. Adicione 75 mL de água e, com auxílio de uma bureta, solução-padrão de tiossulfato de sódio da mesma molaridade, até coloração amarelo-clara. Junte 2 mL de solução de amido a 1% (a solução deve tornar-se azul) e complete a titulação lentamente até total descoramento. IAL - 931 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Cálculo do fator de correção (f) V = mL da solução de Na2S2O3 gastos na titulação F = fator da solução de Na2S2O3 v = mL da solução de iodo usados na titulação Preparo de solução de outras molaridades Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores da Tabela 10. Tabela 10 – Quantidade de iodo e de KI necessárias respectivamente para preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,005 0,05 0,50 g I2* 1,3 13,0 130,0 g KI** 2,0 20,0 200,0 *g I2/L solução = 130 x M x 0,5 **gKI/L solução = 200 x M x 0,5 NITRATO DE PRATA Preparo de solução 1 M – Pese 170 g de AgNO3 e transira para um balão volumétrico escuro, com rolha esmerilhada. Adicione água até completar o volume de 1000 mL e agite. Titulação Titule, de preferência, por via potenciométrica. Não dispondo de equipamento, proceda da maneira seguinte: Transira uma porção de NaCl para cadinho de porcelana de 50 mL. Comprima a substância nas paredes do cadinho e aqueça em mula, a 300ºC, por cerca de 2 horas. Resfrie em dessecador contendo cloreto de cálcio. Transira rapidamente para pesa-iltro (NaCI é higroscópico). Pese, em balança analítica, o pesa-iltro tampado e transira cerca de 1,45 g para cápsula de porcelana de 100 mL. Pese novamente. A diferença entre as duas pesagens dará o nº de g de cloreto de sódio a ser usado. Adicione à cápsula cerca de 25 mL de água e 1 mL de solução de cromato de potássio a 5%, como indicador. Goteje, então, a solução de AgNO3 a ser titulada, com auxílio de uma bureta, até o aparecimento de cor castanho-avermelhada. 932 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores Cálculo do fator de correção (f) P = g de NaCl usados na titulação V = mLde solução de AgNO3 gastos na titulação M = molaridade da solução Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores das Tabelas 11 e 12. Tabela 11 – Quantidade de AgNO3 necessária para preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 g AgNO3 * 1,7 17,0 170,0 *g AgNO3 /l solução = 170 x M Tabela 12 - Quantidade de NaCl necessária para titular 25 mL da solução de AgNO3 Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 g AgNO3 * 0,0145 0,1450 1,4500 *g NaCl/25 mL AgNO3 = 0,058 x 25 x M PERMANGANATO DE POTÁSSIO Preparo de solução 0,02 M – Pese 35 g de KMnO4 e transira para um béquer de 1500 mL. Adicione 1000 mL de água, cubra com um vidro de relógio e leve a ebulição. Deixe a solução em fervura suave durante cerca de 20 minutos. Esfrie à temperatura ambiente, deixe em repouso em frasco fechado por alguns dias, no escuro, e iltre através de cadinho de Gooch com placa porosa. Transira o iltrado para frasco escuro, com rolha esmerilhada. IAL - 933 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Titulação Transira 5 g de oxalato de sódio - Na2C2O4 para um cadinho de porcelana de 50 mL. Comprima a substância nas paredes do cadinho. Aqueça em estufa a 105°C, por 2 horas. Resfrie em dessecador com cloreto de cálcio. Pese em balança analítica, por diferença, cerca de 1,67 g de oxalato de sódio e transira para um frasco Erlenmeyer de 500 mL. Adicione cerca de 240 mL de água e depois, lentamente, pelas paredes do frasco, 12,5 mL de ácido sulfúrico (D = 1,84). Esfrie a 25ºC. Agite até dissolução total do oxalato. Adicione cerca de 90% da quantidade requerida da solução de permanganato de potássio a ser titulada, sob agitação. Aqueça a 60ºC, agite e complete a titulação adicionando a solução de permanganato até obter coloração rósea persistente, durante 30 segundos. Cálculo do fator de correção (f) P = nº de g de Na2C2O4 usado na titulação V = mL de solução de KMnO4 gastos na titulação M = molaridade da solução Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito no item acima, usando os valores das Tabelas 13 e 14. Nota: para preparar solução 0,02 M, tome 10 mL da solução 0,02 M e dilua a 100 mL, em um balão volumétrico, com água. Tabela 13 – Quantidade de KMnO4 necessária para preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,002 0,05 0,50 g KMnO4 * 0,32 3,20 32,00 *g KMnO4/ L solução = 160 x M Tabela 14 – Quantidade de Na2C2O4 necessária para titular 25 mL de solução de KMnO4 934 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores Molaridade KMnO4 0,005 0,050 0,50 g Na2C2O4 * 0,0167 0,1670 1,6700 *g Na2C2O4/L solução = 0,134 x 25 x M TIOCIANATO DE AMÔNIO Preparo da solução M – Pese 80 g de NH4SCN e transira para balão volumétrico âmbar, com rolha esmerilhada. Adicione água até completar o volume de 1000 mL e agite. Titulação Transira, para frasco Erlenmeyer, com auxílio de pipeta, 25 mL de solução-padrão de nitrato de prata 1 M. Adicione 5 mL de ácido nítrico 6 M e 1 mL de solução do indicador (solução a 40% de sulfato de ferro III e amônio em ácido nítrico a 1%, v/v). Adicione a solução de tiocianato a ser titulada, com auxílio de bureta, agitando vigorosamente, até o aparecimento de coloração castanha. Cálculo do fator de correção (f) V = mL da solução de AgNO3 usados na titulação F = fator de correção da solução de AgNO3 v = mL da solução de tiocianato gastos na titulação Preparo de soluções de outras molaridades Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores da Tabela 15. Tabela 15 – Quantidade de NH4SCN necessária para a preparação de 1000 mL de solução Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 g NH4SCN * 0,8 8,0 80,0 *g NH4SCN/L solução = 80 x M IAL - 935 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital TIOSSULFATO DE SÓDIO Preparo da solução 1 M – Pese 260 g de Na2S2O3.5H2O e transira para um balão volumétrico âmbar, com rolha esmerilhada, com auxílio de água previamente fervida e resfriada e complete o volume até 1000 mL, com a mesma água. Junte 0,01 g de HgI2 para estabilizar a solução. Titulação Transira 5 g de K2Cr2O7, inamente pulverizado, para um pesa-iltro. Aqueça em estufa a (140 - 150)ºC, durante 1 hora. Esfrie em dessecador. Pese, em balança analítica, 1,2 g do dicromato e transira para frasco Erlenmeyer de 500 mL, com rolha esmerilhada, contendo 100 mL de água fria, previamente fervida, 30 g de iodeto de potássio (isento de iodato) e 60 mL de ácido clorídrico (D = 1,19). Feche o frasco e agite. Deixe em repouso, em ausência de luz, durante 5 minutos. Lave a rolha e as paredes do frasco com água previamente fervida e resfriada. Titule o iodo liberado com a solução de tiossulfato de sódio a ser padronizada, agitando continuamente. Quando a coloração se tornar amarela-clara, junte 2 mL de solução de amido. A solução deve tornar-se azul. Continue adicionando a solução de tiossulfato, gota a gota, até a mudança de cor azul-esverdeada para verde-pálida. Cálculo do fator de correção (f) P = g de K2Cr2O7 usados na titulação V = mL de solução de Na2S2O3 gastos na titulação M = molaridade da solução Preparo de solução de outras molaridades Proceda como descrito nos itens acima, usando os valores da Tabela 16. Tabela 16 – Quantidades de Na2S2O3.5H2O e de K2Cr2O7 necessárias para preparar e titular, respectivamente, 1000 mL de solução. Molaridade aproximada 0,01 0,10 1,00 *g Na2S2O3.5H2O/L solução = 260 x M **g K2Cr2O7/L solução = 25 x 0,049 x M 936 - IAL g Na2S2O35H2O* 2,6 26,0 260,0 g K2Cr2O7** 0,012 0,120 1,200 Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores SOLUÇÃO DE DORNIC (NAOH 1/9 N) Preparo da solução – Pese 4,7 g de hidróxido de sódio e transira para um balão volumétrico com tampa de borracha, de 1000 mL, e complete o volume com água recentemente fervida (isenta de CO2) e resfriada. Titulação Pese, com precisão, 4,5382 g de biftalato de potássio, seco em estufa a 120°C, por uma hora e resfriado a temperatura ambiente em dessecador. Transira para um balão volumétrico de 200 mL e complete o volume com água. Transira, com uma bureta, 20 mL desta solução-padrão para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 2 gotas de solução de fenolftaleína e gota a gota, com auxílio de uma bureta, a solução de Dornic a ser titulada, até o aparecimento de coloração rósea persistente. Deverão ser gastos 20 mL da solução de Dornic para neutralizar os 20 mL da solução-padrão. SOLUÇÃO DE FEHLING Preparo das soluções: Solução A – Pese 34,639g de sulfato de cobre - CuSO4.5H20, transira para um balão volumétrico de 1000 mL e complete o volume com água. Solução B – Pese 173 g de tartarato de sódio e potássio - NaKC4H4O6.4H2O e dissolva em 250 mL de água. Adicione 250 mL de solução de NaOH a 20%, recém-preparada. Complete o volume até 1000 mL. Titulação Transira, para balão de titulação, 10 mL de cada uma das soluções, A e B. Adicione 40 mL de água. Aqueça até a ebulição e adicione, com auxílio de bureta, solução-padrão de glicose a 1%, m/v, mantendo a fervura, sob agitação, até a solução se tornar incolor (no fundo do balão deverá aparecer um resíduo avermelhado). Nota: a massa de glicose usada deverá ser conhecida até a 3ª casa decimal. Cálculo do fator (f ) das soluções (g de glicose correspondente a 10 mL de cada uma das soluções A e B). V x 0,01 = f IAL - 937 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital V = mL da solução de glicose gastos P = título da solução de glicose (g%) Nota: o valor de f deverá ser da ordem de 0,05 g. INDICADORES Alaranjado de metila a 0,1% Intervalo de viragem: pH 3,1 e 4,4, respectivamente, de vermelho (abaixo de 3,1) a amarelo (acima de 4,4). Preparo da solução – Pese 0,1 g de alaranjado de metila e dissolva em água suiciente para 100 mL de solução. Filtre, se necessário. Conserve a solução em frasco de rolha esmerilhada com conta-gotas. Fenolftaleína a 1% Intervalo de viragem: pH 8,2 a 9,8, respectivamente, de incolor a vermelho-arroxeado. Após 9,8 a coloração ica vermelha intensa ocorrendo modiicações na molécula do indicador. Preparo da solução – Pese cerca de 1 g de fenolftaleína e adicione álcool a 95%, suiciente para 100 mL. Filtre, se necessário. Conserve a solução em frasco escuro de rolha esmerilhada com conta-gotas. Solução de amido Preparo da solução – Agite 1 g de amido solúvel em 10 mL de água. Adicione a esta mistura 200 mL de água em ebulição, mantendo a fervura durante 2 minutos. Esfrie e conserve em geladeira. Vermelho congo a 0,5% Intervalo de viragem: pH 3,0 a 5,2, respectivamente, de violeta (abaixo de 3,0) a vermelho (acima de 5,2). Preparo da solução – Pese 0,5 g de vermelho-congo e dissolva em álcool a 10%, suiciente para 100 mL. Filtre, se necessário. Conserve a solução em frasco de rolha esmerilhada com conta-gotas. 938 - IAL Apêndice I - Soluções Tituladas Indicadores Papel Relativo Clariicadores Vermelho de metila a 0,2% Intervalo de viragem: pH 4,2 a 6,3, respectivamente, de vermelho (abaixo de 4,2) a amarelo (acima de 6,3). Preparo da solução – Pese 0,2 g de vermelho de metila e dissolva em álcool a 95%, suiciente para 100 mL. Filtre, se necessário. Conserve a solução em frasco de rolha esmerilhada com conta-gotas. PAPEL REATIVO Preparo do papel – Corte tiras de papel de iltro de 1 cm de largura e 5 cm de comprimento. Mergulhe as tiras em ácido clorídrico (1+3). Retire. Lave com água, até que 5 mL da água de lavagem não apresente reação ácida com 2 gotas de solução de vermelho de metila. Mergulhe as tiras em hidróxido de amônio (1+3). Retire. Lave com água até que 5 mL da água de lavagem não apresente coloração rósea com 2 gotas de solução de fenolftaleína. Seque as tiras espontaneamente. Embeba as tiras de papel de iltro, depois de secas, na solução do indicador. Seque as tiras espontaneamente, em atmosfera isenta de vapores ácidos ou alcalinos. Conserve em frasco escuro, com rolha esmerilhada. CLARIFICADORES Creme alumina Creme alumina é indicado para clariicar produtos de açúcar levemente coloridos. Pode ser usado, também, juntamente com acetato básico de chumbo. Neste caso, ele aumenta a ação clariicadora do chumbo e permite o uso de quantidades menores da solução de acetato básico de chumbo. Preparo da solução – Prepare uma solução saturada de sulfato duplo de alumínio e potássio. Alcalinize a solução com hidróxido de amônio. Agite. Deixe o precipitado sedimentar. Lave com água, por decantação, até que a água da lavagem dê reação muito leve para sulfatos, com solução de cloreto de bário a 10%. Decante o líquido sobrenadante. Conserve a suspensão do creme alumina em frasco com rolha esmerilhada. Solução de acetato básico de chumbo Preparo da solução – Pese 430 g de acetato de chumbo, neutro - Pb(C2H3O2)2.3H2O, adicione 130 g de litargírio - PbO recentemente ativado e complete o volume com água até 1000 mL. Aqueça e mantenha em ebulição por 30 minutos. Deixe a mistura esfriar e sedimentar. Separe o líquido sobrenadante por decantação e dilua com água recentemente fervida e fria até a densidade especíica da solução alcançar 1,25. IAL - 939 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Notas No preparo da solução, pode-se substituir a mistura de acetato neutro de chumbo e litargírio pelo acetato básico de chumbo. Use a quantidade mínima exigida na clariicação, pois há erros no desvio polarimétrico de açúcares causados por um excesso de solução de acetato básico de chumbo. Ative o litargírio aquecendo em mula a (650-670)ºC, por um período entre entre 2h e 30 min a 3 h. Solução de acetato neutro de chumbo Preparo da solução – Prepare uma solução saturada de Pb(C2H3O2)2.3H2O. Seu uso é especialmente indicado na polarimetria de açúcares redutores. Solução de nitrato básico de chumbo Preparo da solução – Misture volumes iguais de uma solução de hidróxido de sódio a 5% e de uma solução de nitrato de chumbo a 50%. Agite. Lave o precipitado por decantação. Adicione água até formar uma pasta. Conserve em frasco com rolha esmerilhada. AREIA PURIFICADA PARA A DETERMINAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS Preparo da areia – Pese 1 kg de areia, passe por peneira comum e em seguida por peneira ABNT nº 20 com abertura de 0,85 mm. Transira a areia peneirada para um béquer de 4000 mL, lave várias vezes com água de torneira para retirar os resíduos pequenos e leves. Após a retirada da maior parte do resíduo, adicione 1000 mL de ácido clorídrico (1:1), em capela química de exaustão. Antes de colocar o ácido, deixe uma camada de 4 cm de água no béquer com areia. Deixe em contato por 90 minutos, agite ocasionalmente com bastão de vidro de 1 cm de diâmetro, retire a solução ácida e lave 10 vezes com água de torneira, em capela. Lave com água até que não haja reação para cloreto (teste, colocando aproximadamente 20 mL de água de lavagem em béquer de 100 mL e adicione 5 gotas de solução de nitrato de prata). Escoe a água. Seque a areia em cápsula de porcelana a 105°C e em seguida aqueça a 900°C por 6 horas, em mula. Colaborador Jaim Lichtig 940 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica APÊNDICE II GUIA CITAC / EURACHEM GUIA PARA QUALIDADE EM QUÍMICA ANALÍTICA UMA ASSISTÊNCIA À ACREDITAÇÃO Preparado em conjunto pela CITAC (Cooperação sobre Rastreabilidade Internacional em Química Analítica) e EURACHEM (Enfoque para Química Analítica na Europa) Traduzido sob os auspícios da ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária em apoio com a UNESCO. IAL - 941 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 942 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica GUIA PARA QUALIDADE EM QUÍMICA ANALÍTICA UMA ASSISTÊNCIA À ACREDITAÇÃO Este documento foi produzido pelo Grupo de Trabalho conjunto, formado pela CITAC e EURACHEM, e se baseia em documentos anteriores, incluindo o CITAC Guia 1, publicado em 1995 e o Guia EURACHEM WELAC publicado em 1993. Esta edição, traduzida sob os auspícios da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e da UNESCO, aborda os novos requisitos da norma ISO/TEC 17025:1999 – “Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração”. Título original: “Guide to Quality in Analytical Chemistry - An Aid to Accreditation”, edition 2002. A tradução e revisão deste material foram produzidas no Contexto da Cooperação UNESCO/ANVISA: Galdino Guttmann Bicho – revisor Paulo Afonso Lopes da Silva – revisor Mariana Mieko Mandai – revisora Marco Antonio de Azevedo Martins – revisor Claudinei Oliveira Zima - revisor IAL - 943 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 944 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Publicado em 2002 Os direitos autorais desse guia são de propriedade das organizações representadas pela CITAC e EURACHEM. Esta edição foi publicada pela CITAC e EURACHEM. IAL - 945 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital GUIA PARA QUALIDADE EM QUÍMICA ANALÍTICA ÍNDICE Seção Título 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Metas e objetivos Introdução Deinição e Terminologia Acreditação Escopo A tarefa analítica Especiicação do requisito analítico Estratégia analítica Análises não rotineiras Pessoal Amostragem, manuseio e preparação das amostras Ambiente Equipamentos Reagentes Rastreabilidade Incerteza de medição Métodos/ procedimentos para ensaios e calibração Validação de metodologia Calibração Materiais de referência Controle de qualidade e ensaios de proiciência Computadores e sistemas controlados por computador Auditoria do laboratório e análise crítica Referências e Bibliografia Siglas Apêndices A B C 946 - IAL Auditoria de Qualidade – Áreas de Particular Importância em um Laboratório Químico Intervalos de Calibração e Veriicações de Desempenho Tabela de Comparação – ISO/IEC 17025:1999 x ISO/IEC Guia 25:1990 (ILAC G15:2001)IEC Guia 25:1990 (ILAC G15:2001) Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 1. METAS E OBJETIVOS 1.1 A meta deste guia é fornecer aos laboratórios diretrizes sobre a melhor prática para as operações analíticas por eles realizadas. O guia abrange análises qualitativa e quantitativa realizadas em bases rotineiras e não-rotineiras. Um guia em separado abrange trabalhos de pesquisa e desenvolvimento (Guia CITAC/EURACHEM Referência A1 na página 43). 1.2 O guia objetiva auxiliar aquelas pessoas implementando a garantia da qualidade em laboratórios. Para aqueles que trabalham com acreditação, certiicação ou outra conformidade com requisitos particulares da qualidade, ele irá ajudar a explicar o que esses requisitos signiicam. O guia também será útil para aqueles envolvidos na avaliação da qualidade de laboratórios analíticos, por comparação com esses requisitos de qualidade. Referências cruzadas às normas ISO/IEC 17025, ISO 9000 e aos requisitos das Boas Práticas de Laboratório (GLP) da OECD, são fornecidas. 1.3 Este documento foi desenvolvido a partir da anterior Guia 1 CITAC (que, por sua vez, foi baseada no Guia EURACHEM/WELAC), e atualizado para levar em conta novos materiais e desenvolvimentos, particularmente os novos requisitos da norma ISO/IEC 17025. 1.4 Esse guia foi produzido por um grupo de trabalho constituído por David Holcombe, LGC, RU; Bernard King, NARL, Austrália; Alan Squirrell, NATA, Austrália e Maire Walsh, Laboratório Estadual, Irlanda. Além disto, ao longo dos anos de elaboração deste guia e de suas versões anteriores, tem havido extensa contribuição por parte de um grande número de indivíduos e organizações, incluindo: CITAC, EURACHEM, EA, ILAC, A.O.A.C.I, IUPAC, CCQM, entre outros (consulte a lista de Acrônimos na página 58). 1.5 Este guia se concentra nas questões técnicas da garantia da qualidade (GQ), com ênfase naquelas áreas onde há a necessidade de uma interpretação particular para ensaios químicos ou medições relacionadas. Existe um número de aspectos adicionais de GQ, onde nenhuma orientação é dada, já que estes são integralmente focados em outros documentos, tal como a norma ISO/IEC 17025. Estes incluem: registros; relatórios; sistemas da qualidade; subcontratação; reclamações; requisitos do fornecedor; revisão de contratos; conidencialidade e manipulação de dados. IAL - 947 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 2. INTRODUÇÃO 2.1 O valor das medições químicas depende do nível de coniança que pode ser estabelecido nos resultados. De maneira crescente, a comunidade de analistas químicos está adotando princípios de GQ que, embora não garantindo realmente a qualidade dos dados produzidos, eleva a possibilidade deles serem bem fundamentados e se adequarem ao im pretendido. 2.2 Uma GQ apropriada pode permitir que um laboratório mostre que possui instalações e equipamentos adequados para execução de análises químicas e que o trabalho foi realizado por pessoal competente de uma maneira controlada, seguindo um método validado documentado. A GQ deve focar questões centrais que determinem resultados de qualidade, custos e oportunidades, e evitem desvio de energias para questões menos importantes. 2.3 Uma boa prática de GQ, incluindo seu reconhecimento formal por acreditação, certiicação etc., ajuda a garantir que os resultados sejam válidos e adequados aos ins propostos. Contudo, é importante que tanto os laboratórios quanto seus clientes entendam que a GQ não pode garantir que 100% dos resultados individuais sejam coniáveis. Existem duas razões para isto: 1. Lapsos/erros grosseiros podem ocorrer, quando, por exemplo, os resultados de duas amostras forem confundidos. Em um laboratório bem operado, a freqüência de lapsos será pequena, porém não igual à zero. 2. Erros aleatórios e sistemáticos também ocorrem, levando à incerteza no resultado medido. A probabilidade de um resultado se situar dentro da faixa de incerteza declarada depende do nível de coniança empregado, mas, novamente, mesmo em um laboratório bem organizado desvios nos resultados irão ocasionalmente ocorrer e, muito ocasionalmente, o desvio será grande. A tarefa da GQ é administrar a freqüência das falhas de qualidade. Quanto maior for o esforço empregado, menor será o número de falhas de qualidade que podem ser esperadas. É necessário equilibrar o custo da GQ com o benefício na redução das falhas de qualidade a um nível aceitável (diferente de zero). 2.4 Os princípios da GQ foram formalizados em uma variedade de normas ou protocolos publicados. Aqueles mais amplamente reconhecidos e usados em ensaios químicos incidem em três grupos e são aplicados de acordo com as necessidades individuais de um laboratório. Os três grupos são: 948 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 2.4.1 ISO/IEC 17025:1999: (Ref B1) Esta norma aborda a competência técnica de laboratórios para a realização de ensaios e calibrações especíicos, e é usada em todo o mundo por organismos de acreditação de laboratórios, como um requisito básico para a acreditação; 2.4.2 ISO 9001:2000: (Ref B2) e suas equivalentes nacionais e internacionais. Esta norma se refere principalmente à gestão da qualidade para instalações que realizam a produção ou prestam serviços, incluindo análises químicas; 2.4.3 Princípios de Boas Práticas de Laboratório (GLP) da OECD: 1998 (Ref B3) e suas equivalentes nacionais e setoriais. Estas diretrizes dizem respeito aos processos e condições organizacionais sob os quais estudos de laboratório, relativos a determinado trabalho regulamentar, são realizados. 2.5 Além disto, existem abordagens sobre Gestão da Qualidade Total (GQT) para GQ, que dão ênfase à melhoria contínua (a nova ISO 9001:2000 dá mais ênfase neste aspecto). O fundamental neste guia é o enfoque que, em nível técnico, a boa prática em GQ analítica independe do sistema formal de GQ adotado. 2.6 Um laboratório pode decidir criar seus próprios procedimentos de GQ, ou pode adotar um dos protocolos estabelecidos. Neste último caso, ele pode reivindicar conformidade informal com o protocolo ou, em condições ideais, pode ser submetido a uma avaliação independente por parte de uma entidade especializada oicial, com o objetivo de obter aprovação independente de seu sistema da qualidade. Tal avaliação/aprovação independente é variavelmente conhecida como acreditação, registro ou certiicação, dependendo de qual norma esteja sendo usada na avaliação. Em áreas especíicas de análise, a acreditação é algumas vezes obrigatória, porém, na maioria dos casos, o laboratório é livre para decidir que espécies de medidas de GQ ele deseja adotar. O caminho pela avaliação independente tem reconhecidas vantagens, particularmente onde os clientes do laboratório necessitem de evidência objetiva da competência técnica do laboratório. Para obter esclarecimentos sobre o termo “acreditação”, conforme usado neste guia, veja as seções 3.2 e 4 abaixo. 3. DEFINIÇÕES E TERMINOLOGIA Existe uma pluralidade de termos importantes usados em gestão da qualidade e avaliação de conformidade, cujo signiicado pode variar conforme o contexto em que eles forem usados. É importante compreender a distinção entre os diferentes termos. Alguns deles são aqui apresentados. A referência básica é a ISO Guia IAL - 949 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 2:1996 – Ref B4. Outros termos podem ser encontrados na ISO 9000:2000 – Ref B5 (Nota: ISO 8402:1994 – Qualidade – Vocabulário – foi retirada). 3.1 QUALIDADE: Grau em que um conjunto de características inerentes satisfaz requisitos (ISO 9000:2000). 3.2 ACREDITAÇÃO: ‘Procedimento pelo qual uma entidade autorizada concede reconhecimento formal de que uma organização ou pessoa é competente para realizar tarefas especíicas’ (ISO Guia 2-1996). 3.2.1 No contexto de um laboratório realizando medições, acreditação é o reconhecimento formal de que o laboratório é competente para executar calibrações ou ensaios especíicos, ou tipos especíicos de calibrações ou ensaios. O mecanismo pelo qual a acreditação é concedida está descrito abaixo na seção 4, e o documento dos principais requisitos é a norma ISO/IEC 17025:1999. 3.2.2 Acreditação é também usada no contexto das atividades baseadas na norma ISO 9000, para descrever o processo pelo qual uma organização nacional reconhece formalmente os organismos de certiicação como competentes para avaliar e certiicar organizações, como estando em conformidade com a série de normas ISO 9000 (“sistemas de gestão da qualidade”). 3.3 CERTIFICAÇÃO: ‘Procedimento pelo qual um organismo de terceira parte fornece garantia por escrito de que um produto, processo ou serviço está em conformidade com requisitos especiicados’ (ISO Guia 2:1996). A Certiicação (algumas vezes conhecida como registro) difere basicamente da acreditação na medida em que a competência técnica não é especiicamente focada. 3.4 GARANTIA DA QUALIDADE (GQ): GQ descreve as medidas globais que um laboratório utiliza para assegurar a qualidade de suas operações. Tipicamente estas podem incluir: Um sistema da qualidade Ambiente de laboratório adequado Pessoal instruído, treinado e habilitado Procedimentos e registros de treinamento Equipamento adequadamente conservado e calibrado Procedimentos para controle da qualidade Métodos documentados e validados 950 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Rastreabilidade e incerteza de medição Procedimentos de veriicação e divulgação Ações preventivas e corretivas Ensaios de proiciência Auditorias internas e procedimentos de análise crítica Procedimentos para reclamações Requisitos para reagentes, calibradores, padrões de medida e materiais de referência. 3.5 CONTROLE DA QUALIDADE (CQ): ‘As técnicas operacionais e atividades que são usadas para preencher os requisitos para qualidade. Procedimentos de controle da qualidade se aplicam para assegurar a qualidade de amostras especíicas ou lotes de amostras, e incluem: Análise de materiais de referência/padrões de medida Análise de amostras cegas Uso de amostras de controle da qualidade e gráicos de controle Análise de brancos Análise de amostras fortiicadas Análises em duplicata ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA Mais detalhes sobre controle da qualidade e ensaios de proiciência são apresentados na seção 21. 3.6 AUDITORIA E ANÁLISE CRÍTICA: Na prática, auditorias da qualidade adotam dois formatos. A auditoria realizada por uma entidade externa independente, como parte do processo de acreditação, é mais comumente conhecida como avaliação. “Auditorias da qualidade” realizadas dentro do laboratório são algumas vezes subdivididas em: auditoria, frequentemente chamada de “auditoria interna” (que veriica se os procedimentos da qualidade se fazem presentes e estão sendo inteiramente implementados) e análise crítica (veriicação para assegurar que o sistema da qualidade é eicaz e atinge os objetivos). A análise crítica é realizada pela gerência executiva com responsabilidade pela política de qualidade e trabalho do laboratório. Neste guia, o termo auditoria se refere à auditoria interna; avaliação se refere à auditoria externa. IAL - 951 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 3.7 NORMA (STANDARD): Esta palavra possui uma variedade de signiicados distintos na língua inglesa. No passado, ela foi usada rotineiramente para se referir primeiramente a normas escritas amplamente adotadas, isto é, procedimentos, especiicações, recomendações técnicas, etc., e em segundo lugar, a padrões químicos ou físicos usados para ins de calibração. Neste guia, para minimizar a confusão, norma é usada somente no sentido de normas escritas. O termo padrão de medida é usado para descrever padrões químicos ou físicos, usados para ins de calibração ou validação, tais como: produtos químicos de pureza estabelecida e suas correspondentes soluções de concentração conhecida; iltros UV; pesos, etc. Materiais de referência são uma (importante) categoria de padrões de medida. 3.8 MATERIAL DE REFERÊNCIA (MR): ‘Material ou substância, com um ou mais valores de suas propriedades que são suicientemente homogêneos e bem estabelecidos, para ser usada na calibração de um aparelho, na avaliação de um método de medição ou na atribuição de valores a materiais.’ (ISO Guia 30 – Ref C1). 3.9 MATERIAL DE REFERÊNCIA CERTIFICADO (MRC): ‘Material de referência, acompanhado de um certiicado, com um ou mais valores de suas propriedades certiicadas por um procedimento que estabelece sua rastreabilidade à obtenção exata da unidade na qual os valores da propriedade são expressos, e cada valor certiicado é acompanhado por uma incerteza para um nível de coniança estabelecido.’ (ISO Guia 30:1992 – Ref C1). 3.10 RASTREABILIDADE: ‘Propriedade do resultado de uma medição ou do valor de um padrão estar relacionado a referências estabelecidas, geralmente a padrões nacionais ou internacionais, através de uma cadeia contínua de comparações, todas com incertezas estabelecidas.’ (VIM 1993 – Ref B6). 3.11 INCERTEZA DE MEDIÇÃO: Parâmetro associado ao resultado de uma medida que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser razoavelmente atribuídos ao medidor. (VIM 1993 – Ref B6). 4 ACREDITAÇÃO 4.1 As referências à acreditação nesta e nas seções sucessivas se referem à ISO/IEC 17025:1999 (Ref B1). Seus requisitos serão implementados por laboratórios e acreditados por organismos de acreditação durante um período de transição de três anos, indando em dezembro de 2002. A norma é consideravelmente maior do que a sua predecessora e contém alguns requisitos novos ou ampliados, como abaixo sumarizado, mas grande parte do novo material estava previamente contido em 952 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica documentos suplementares de orientação. Assim, a escala dos novos requisitos não é tão grande como possa parecer em princípio. Uma tabela comparando as cláusulas da ISO/IEC 17025:1999 e de sua predecessora, a ISO/IEC Guia 25: 1990, é encontrada no Apêndice C. 4.2 Em resumo, a norma ISO/IEC 17025 inclui requisitos novos ou ampliados referentes ao seguinte: • Revisão de Contratos — comunicações de pré-contrato para garantir que os requisitos sejam adequadamente especiicados e os serviços atendam inteiramente aos requisitos do cliente; • Aquisição de serviços e suprimentos — uma política e procedimentos são requeridos para assegurar-se de que sejam adequados à inalidade; • Amostragem — um plano e procedimentos de amostragem são necessários quando a amostragem izer parte do trabalho do laboratório; • Ação preventiva — ação pró-ativa que procura melhorar os processos, minimizando assim a necessidade de ações corretivas; • Validação de metodologia, rastreabilidade e incerteza de medição — ênfase signiicativamente acentuada nesses requisitos; • Opiniões e interpretações — isto é agora permitido em relatórios de ensaio. 4.3 Os requisitos das principais normas/protocolos de qualidade possuem muitos elementos em comum ou similares. Por exemplo, a ISO/IEC 17025 incorpora os elementos do sistema da qualidade da ISO 9001 (1994) que são aplicáveis aos laboratórios. Uma comparação das principais normas/protocolos é apresentada abaixo: Título ISO/IEC 17025:1999 ISO 9001: 2000 BPL OECD 1998 Organização para a Cooperação Econômica e o Desenvolvimento Escopo 1 1 Referências normativas 2 2 Termos e deinições 3 3  ISO 9000:2000 Seção I – 2 Requisitos gerenciais 4 Várias Seção II – 1.1 Organização 4.1 Diretor de estudo Seção I – 1 Seção II - 1.2 IAL - 953 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Título Gerente da Qualidade Sistema da Qualidade Política da Qualidade Manual da Qualidade Comprometimento da gerência com a qualidade Controle de documentos Aprovação e emissão de documentos Alterações em documentos Análise crítica dos pedidos, propostas e contratos Subcontratação Aquisição de serviços e suprimentos Veriicação de suprimentos Foco no cliente Atendimento ao cliente Reclamações Controle de trabalho não-conforme Melhoria Análise de causas Ação corretiva Ação preventiva Controle de registros Auditorias internas Análises críticas pela gerência Requisitos técnicos gerais Pessoal Acomodações e condições ambientais Métodos de ensaio e calibração 954 - IAL ISO/IEC 17025:1999 ISO 9001: 2000 4.1.5 4.2 4.2.2 4.2.2 5.5.2 4 5.3 4.2.2 4.2.2 5.1 4.3 4.3.2 4.3.3 4.2.3 4.2.3 4.2.3 4.4 7.2 4.5 4.6 7.4 4.6.2 4.7 4.8 4.9 4.10.2 4.10.3 4.10.4 4.11 4.12 4.13, 4.10.5 4.14 5.1 5.2 5.3 5.4 7.4.3 BPL OECD 1998 Organização para a Cooperação Econômica e o Desenvolvimento Pessoal da GQ ≠ GLP Seção II - 2 Seção II – 7.1 Seção II – 6.2.3 (somente item de ensaio) 5.2, 8.2.1 7.2.3 7.2.3 8.3 8.5 8.5.2 8.5.2 8.5.3 4.2.4 8.2.2 5.6 Seção II – 10 Seção II – 2.2 6.2 6.3, 6.4 7.5.1 Seção II - 1.3 Seção II – 3 Seção II – 7 Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Título Validação de metodologias Incerteza de medição Veriicações de cálculo e de transcrições Validação da TI Equipamentos Qualiicação de equipamentos Rastreabilidade da medição Calibração Padrões de referência e materiais de referência Amostragem Manuseio de itens de ensaio ou calibração (transporte/armazenagem/identiicação/ descarte) Identiicação da amostra BPL OECD 1998 Organização para ISO/IEC ISO 9001: a Cooperação 17025:1999 2000 Econômica e o Desenvolvimento 5.4.5 7.5.2 5.4.6 5.4.7.1 Seção II – 8.3 5.4.7.2 6.3 Seção II - 1.1.2 (q) 5.5 7.5.1 Seção II - 4 7.5.1, 5.5.2 Seção II - 5.1 7.5.2 5.6 7.6 5.6 7.6 Seção II – 4.2 5.6.3 7.6 Seção II – 6 5.7 5.8 7.5.5 5.8.2 7.5.3 7.5.1, 7.6, 8.2.3, 8.2.4 Garantia da qualidade dos resultados de medição 5.9 Apresentação dos resultados Opiniões e interpretações Transmissão eletrônica Emendas aos relatórios 5.10 5.10.5 5.10.7 5.10.9 Seção II – 8.3.1 Seção II – 2 Seção II – 9 8.3 Seção II 9.1.4 Nota: Considerações estão sendo feitas para o alinhamento dos requisitos do sistema de gestão da qualidade da Seção 4 (baseada na ISO 9001: 1994) da ISO/IEC 17025: 1999 com a ISO 9001: 2000. 4.4 A acreditação é concedida a um laboratório para um conjunto especíico de atividades (isto é, ensaios ou calibrações) após a avaliação daquele laboratório. Tais avaliações irão incluir tipicamente um exame dos procedimentos analíticos em uso, o sistema da qualidade e a documentação da qualidade. Os procedimentos analíticos serão examinados para garantir que eles sejam tecnicamente apropriados ao IAL - 955 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital im pretendido e que tenham sido validados. O desempenho dos ensaios pode ser testemunhado para garantir que os procedimentos documentados estejam sendo seguidos e possam ser, de fato, acompanhados. O desempenho do laboratório em esquemas de ensaios de proiciência pode ser também examinado. A avaliação pode, adicionalmente, incluir uma “auditoria de desempenho”, onde é necessário que o laboratório analise amostras fornecidas pela entidade acreditadora e atinja níveis de precisão aceitáveis. Essa auditoria de desempenho é efetivamente uma forma de ensaio de proiciência (ver a seção 21). 4.5 É de responsabilidade do laboratório garantir que todos os procedimentos usados sejam apropriados ao seu im pretendido. O processo de avaliação examina este aspecto de “adequação ao uso”. 4.6 Cada entidade acreditadora possui procedimentos estabelecidos com os quais ela opera, avalia laboratórios e concede a acreditação. Por exemplo, as entidades acreditadoras de laboratórios operam, segundo requisitos baseados na ISO/IEC Guia 58 (Ref C8). Similarmente, entidades oferecendo esquemas de certiicação operam segundo os requisitos da ISO/IEC Guia 62 (Ref 19). 4.7 Da mesma forma, avaliadores são escolhidos por critérios especiicados. Por exemplo, os critérios de seleção para nomeação de avaliadores para avaliar em nome das entidades acreditadoras de laboratórios são especiicados na ISO/IEC Guia 58. Estes incluem o requisito de conhecimento técnico nas áreas especíicas de operação sendo avaliadas. 4.8 O benefício da acreditação é permitir aos clientes em potencial do laboratório terem coniança na qualidade do serviço desempenhado. Vários desenvolvimentos internacionais signiicam que a aprovação conferida por acreditação e outras avaliações possuem reconhecimento mundial. Muitas entidades acreditadoras de laboratórios (que foram avaliadas e conirmadas como satisfazendo requisitos relevantes — ver 4.6 acima) assinaram um acordo multilateral (o Acordo ILAC) para reconhecer a equivalência dos esquemas de acreditação de laboratório. Acordos internacionais similares foram desenvolvidos para entidades associadas a esquemas de certiicação. 4.9 A orientação fornecida abaixo será útil para laboratórios buscando acreditação relativa à ISO/IEC 17025, certiicação relativa à ISO 9001, ou conformidade/registro com os princípios das BPL (GLP). 5. ESCOPO 956 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 5.1 Um laboratório pode aplicar GQ a toda ou parte de suas operações. Quando um laboratório reivindica conformidade, pela certiicação ou por acreditação, a uma norma especíica, é importante que seja claro a que esta conformidade, por certiicação ou acreditação, se aplica. A declaração formal das atividades que foram certiicadas com a ISO 9000, ou acreditadas pela ISO 17025, é conhecida como “escopo”. A ISO 9000 e as BPL necessitam apenas de uma breve descrição das atividades envolvidas, mas, no caso da ISO/IEC 17025, uma descrição detalhada do trabalho especíico abrangido pela acreditação é normalmente requerido. 5.2 A gestão da qualidade é auxiliada por uma clara declaração das atividades, que idealmente devem deinir a amplitude do trabalho envolvido, mas sem restringir a operação do laboratório. Diferentes normas da qualidade possuem regras diferentes, mas, para a ISO/IEC 17025, o escopo pode ser, tipicamente, deinido em termos de: i) gama de produtos, materiais ou tipos de amostras ensaiadas ou analisadas; ii) medições (ou tipos de medições) realizadas; iii) especiicação ou método/equipamento/técnica usados; iv) concentração, faixa e incerteza de medição, conforme apropriado. 5.3 A deinição do escopo em termos especíicos é claramente mais facilmente aplicada a laboratórios realizando ensaios de rotina, segundo procedimentos estabelecidos. Quando ensaios fora-de-rotina são realizados, é desejável uma abordagem mais lexível ao escopo. O escopo deve, todavia, ser tão especíico quanto viável e o sistema de GQ mantido pelo laboratório deve assegurar que a qualidade dos resultados está sob controle. 5.4 Um laboratório que deseje alterar seu escopo, adicionando ensaios complementares ou alterando a metodologia dos ensaios existentes, irá necessitar da aprovação da entidade acreditadora, que deverá ter uma política especíica para tais situações. Tipicamente, é possível se conceder mudanças simples por meio do exame da documentação. Para mudanças mais complexas, particularmente onde novas técnicas estejam envolvidas, pode ser requerida uma avaliação adicional. A TAREFA ANALÍTICA 6. IAL - 957 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 6.1 A análise é uma investigação complexa em múltiplos estágios que podem ser sumarizados nas sub-tarefas relacionadas abaixo. Quando apropriado, a seção correspondente deste guia é também listada. Nem todas as etapas serão necessárias a cada vez que uma medição de rotina for realizada. Também, na realidade, a medição é muitas vezes um processo iterativo, que passa pela série linear de etapas mostradas abaixo: • • • • • • • • • • • • Especiicação dos requisitos — ver Seção 7 Análise das informações * Pensamento criativo * Plano de estudo * — ver Seção 8 Amostragem — ver Seção 22 Preparação da amostra Análise preliminar * Identiicação/conirmação da composição Análise quantitativa Coleta e análise de dados Interpretação de dados/solução de problemas Divulgação/recomendações Os itens marcados com * são de maior signiicância no contexto da análise fora-de-rotina. O processo é descrito sob forma de um luxograma na Figura 1 da Seção 19. 6.2 Embora normas distintas enfatizem diferentes aspectos de GQ, e algumas das etapas acima não sejam especiicamente cobertas, é importante que a GQ de cada estágio seja considerada, e abordada onde relevante. 7 ESPECIFICAÇÃO DO REQUISITO ANALÍTICO 7.1 O laboratório tem o dever de prestar um serviço analítico que seja apropriado para resolver os problemas de seus clientes. 7.2 A chave para uma boa análise é uma especiicação clara e adequada dos requisitos. Isto precisará ser produzido em cooperação com o cliente, que pode necessitar de ajuda considerável para converter seus requisitos funcionais numa tarefa analítica técnica. O requisito analítico pode ser também desenvolvido durante os trabalhos de uma comissão, mas não deve sofrer desvios. Quaisquer mudanças são possíveis de serem orientadas pelo cliente, mas devem ter o acordo de ambos: cliente e laboratório. A especiicação do pedido analítico deve abordar as seguintes questões: 958 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica • • • • • • • • • • • • • Contexto analítico Informações requeridas Relevância (Nível crítico)/risco aceitável Restrições de tempo Restrições de custos Amostragem Requisitos de rastreabilidade Incerteza de medição Requisitos do método, incluindo preparação da amostra Identiicação/conirmação/caracterização Critérios de limites Requisitos de GQ/CQ Requisitos do plano de pesquisa/aprovação 7.3 O nível da documentação deve ser proporcional à escala e nível crítico da tarefa e inclui a produção de qualquer “análise de informações” e “pensamento criativo”. 8. ESTRATÉGIA ANALÍTICA 8.1 Todo trabalho analítico deve ser adequadamente planejado. Um plano destes pode ser, em sua forma mais básica, simplesmente uma entrada em um caderno de anotações. Planos mais detalhados deverão ser apropriados para tarefas maiores e mais complicadas. Para trabalho realizado segundo as BPLs, há um requisito especíico de que o trabalho seja realizado segundo planos de estudo documentados. 8.2 Os planos, tipicamente, deverão indicar o ponto de partida e de término pretendido da tarefa especíica em conjunto com a estratégia para alcançar as metas desejadas. Quando, durante a evolução do trabalho, for apropriado alterar a estratégia, o plano deve ser corrigido de acordo. 9 ANÁLISES FORA-DE-ROTINA 9.1 Análises fora-de-rotina podem ser consideradas também como tarefas, mas que são realizadas ocasionalmente, onde metodologia coniável já se encontra estabelecida, ou como tarefas onde cada amostra requer uma abordagem diferente e a metodologia precisa ser estabelecida na ocasião. Orientações são dadas na Referência A1. Os custos da medição química reletem os custos associados aos vários estágios de desenvolvimento do método, validação, instrumentação, consumíveis, manutenção con- 9.2 IAL - 959 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital tínua, participação de pessoal, calibração, controle de qualidade, etc. Muitos desses custos são independentes do número de amostras que serão subseqüentemente analisadas usando-se esse método. Assim, quando um único método puder ser usado para um grande quantidade de amostras, os custos analíticos unitários serão comparativamente baixos. Quando um método tiver que ser especialmente desenvolvido apenas para poucas amostras, os custos analíticos unitários podem ser muito altos. Para tal análise fora-de-rotina, alguns custos podem ser reduzidos pelo uso de métodos genéricos, isto é, métodos que são amplamente aplicáveis. Em alguns casos, a subcontratação de serviços de um laboratório especializado em um tipo particular de trabalho poderia ser a melhor solução custo/benefício. Contudo, quando o trabalho for subcontratado, procedimentos de GQ apropriados devem ser empregados. 9.3 Em termos simples, uma medição pode ser convenientemente descrita em termos de uma etapa de isolamento e um estágio de medição. Raramente um analito pode ser medido sem primeiro separá-lo da matriz da amostra. Assim, a inalidade da etapa de isolamento é simpliicar a matriz na qual o analito é inalmente medido. Freqüentemente o procedimento de isolamento pode variar muito pouco para uma ampla variedade de analitos numa faixa de matrizes de amostra. Um bom exemplo de um procedimento de isolamento genérico é a técnica de digestão para isolar traços de metais em alimentos. 9.4 Da mesma forma, uma vez que os analitos tenham sido isolados da matriz da amostra e estejam presentes em um meio comparativamente limpo, tal como um solvente, pode ser possível ter um único método genérico para cobrir a medição de uma ampla variedade de analitos. Por exemplo, cromatograia gasosa, ou espectrofotometria UV-Visível. 9.5 A documentação de tais métodos genéricos deve ser elaborada de forma que possa acomodar facilmente as pequenas mudanças relacionadas com a extração, depuração ou medição de diferentes analitos, por exemplo pelo uso de tabelas. Os parâmetros que podem ser variados são: tamanho da amostra, quantidade e tipo dos solventes de extração, condições de extração, colunas cromatográicas ou condições de separação, ou ajustes de comprimento de onda no espectrômetro. 9.6 O valor de tais métodos para análises fora-de-rotina é que, quando uma nova combinação de analito/matriz é encontrada, freqüentemente é possível incorporá-la a um método genérico existente, com validação adicional, cálculos de incerteza da medição e documentação apropriados. Assim, os custos adicionais incorridos são minimizados em comparação com o desenvolvimento integral de um novo método. O método 960 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica deve deinir as veriicações que precisarão ser realizadas para os diferentes analitos ou tipos de amostras, a im de veriicar se a análise é válida. Informações suicientes precisarão ser registradas, a im de que o trabalho possa ser repetido, precisamente da mesma maneira, numa data futura. Quando uma análise especíica subseqüentemente se torna rotina, um método especíico pode ser validado e documentado. 9.7 É possível acreditar uma análise fora-de-rotina, e a maior parte das entidades acreditadoras terá uma política para avaliar tais métodos e descrevê-los no programa ou escopo de acreditação do laboratório. O ônus caberá ao laboratório de demonstrar aos avaliadores que ao usar estas técnicas ele está satisfazendo todos os critérios da norma de qualidade relevante. Particularmente, a experiência, a capacitação e o treinamento do pessoal envolvido, serão importantes fatores na determinação se tais análises podem ou não ser acreditadas. 10. PESSOAL 10.1 A gerência do laboratório deve deinir, normalmente, os níveis mínimos de qualiicação e experiência necessários aos principais cargos dentro do laboratório. As análises químicas devem ser realizadas por um analista qualiicado, experiente e competente, ou sob a supervisão deste. Outra equipe de funcionários sênior do laboratório possuirá normalmente competências similares. Menores qualiicações formais podem ser aceitáveis quando o pessoal possuir relevante e extensa experiência e/ou o escopo das atividades for limitado. A equipe qualiicada em nível de graduação deverá ter, normalmente, pelo menos dois anos de experiência em trabalho pertinente antes de ser considera composta por analistas experientes. O pessoal em treinamento, ou sem nenhuma qualiicação relevante, pode realizar análises, desde que tenham comprovadamente recebido um nível adequado de treinamento e sejam adequadamente supervisionados. 10.2 Em determinadas circunstâncias, os requisitos mínimos de qualiicações e experiência para o pessoal que realiza tipos particulares de análises podem ser especiicados em regulamentos. 10.3 O laboratório deve assegurar que todo o pessoal receba treinamento adequado para o desempenho competente dos ensaios e operação dos equipamentos. Quando apropriado, isto deverá incluir treinamento nos princípios e teorias por trás de técnicas particulares. Quando possível, medidas objetivas devem ser tomadas para avaliar o alcance da competência durante o treinamento. Somente analistas que possam demonstrar a competência necessária, ou que sejam adequadamente superIAL - 961 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital visionados, podem realizar ensaios nas amostras. A competência continuada deve ser monitorada, por exemplo, usando-se técnicas de controle de qualidade. A necessidade de reciclar periodicamente o pessoal precisa ser considerada, quando um método ou técnica não estiver em uso regular. Muito embora a administração do laboratório seja responsável por assegurar o fornecimento de treinamento adequado, deve ser enfatizado que a manutenção de um forte elemento de auto-instrução é desejável, particularmente entre os analistas mais experientes. 10.4 O laboratório deve manter um registro atualizado do treinamento que cada membro do pessoal tenha recebido. A inalidade desses registros é fornecer evidências de que cada membro da equipe foi adequadamente treinado, e sua competência para realizar ensaios especíicos foi avaliada. Em alguns casos, pode ser pertinente declarar quaisquer limitações especíicas acerca da evidência sobre a competência. Os registros devem incluir, tipicamente: I) qualiicações acadêmicas; II) cursos internos e externos freqüentados; III) instrução prática relevante (e reciclagem, conforme necessário). Possivelmente, também: IV) participação em esquemas de ensaios de proiciência e/ou de GQ, com os dados associados; V) artigos técnicos publicados e apresentações em conferências. 10.5 Em alguns casos, pode ser mais apropriado registrar a competência em termos de técnicas especíicas, ao invés de métodos. 10.6 O acesso a esses registros de treinamento será necessário no andamento do trabalho diário. O acesso a outros registros de pessoal, normalmente guardados de modo centralizado pelo laboratório e listando detalhes pessoais, pode ser restrito por legislação nacional sobre a proteção de dados. 11. AMOSTRAGEM, MANUSEIO E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 11.1 Ensaios analíticos podem ser requeridos por uma variedade de motivos, incluindo o estabelecimento do teor médio do analito em um material, estabelecimento do peril de concentração do analito em um material, ou determinação da contaminação local em um material. Em alguns casos, por exemplo, na análise forense, pode 962 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica ser apropriado examinar todo o material. Em outros, é apropriado coletar uma determinada quantidade de amostra. Claramente a maneira com que as amostras são obtidas irá depender do objetivo da análise. 11.2 A importância da fase de amostragem não pode deixar de ser exaustivamente enfatizada. Se a porção ensaiada (amostra) não for representativa do material original, não será possível relacionar o resultado analítico medido àquele no material original, não importando a qualidade do método analítico, nem o cuidado na condução da análise. Planos de amostragem podem ser aleatórios, sistemáticos ou seqüenciais, e podem ser empregados para obtenção de informações quantitativas ou qualitativas, ou para determinar a conformidade ou não-conformidade com uma especiicação. 11.3 A amostragem sempre contribui para a incerteza de medição. Conforme a metodologia analítica é aprimorada e os métodos permitam ou requeiram o uso de porções menores de amostra para o ensaio, as incertezas associadas à amostragem se tornam cada vez mais importantes e podem elevar a incerteza total do processo de medição. A incerteza de medição associada à sub-amostragem, etc, deve ser sempre incluída na incerteza de medição do resultado do ensaio, mas a incerteza de medição associada ao processo básico de amostragem é normalmente tratada em separado. 11.4 Em muitas áreas de ensaios químicos os problemas associados à amostragem têm sido abordados e métodos têm sido validados e publicados. Os analistas também devem se referir às normas nacionais ou setoriais, conforme apropriado. Quando métodos especíicos não estiverem disponíveis, o analista deve depender da experiência ou adaptar métodos a partir de aplicações similares. Quando em dúvida, o material de interesse e quaisquer amostras dele obtidas devem sempre ser tratados como heterogêneos. 11.5 A seleção de uma amostra ou amostras apropriadas, a partir de uma grande quantidade de material, é um estágio muito importante na análise química. Raramente ele é direto. Idealmente, se os resultados inais produzidos tiverem que ser de algum valor prático, os estágios da amostragem devem ser realizados por um amostrador capacitado com conhecimento do contexto global da análise, ou sob a direção deste. Possivelmente, tal pessoa poderá ser um analista experiente, ou alguém especiicamente treinado em amostragem. Quando não for prático utilizar tal pessoa capacitada na obtenção das amostras, o laboratório é encorajado a interagir com o cliente para fornecer assessoria e possivelmente assistência prática, a im de assegurar que a amostragem seja a mais apropriada possível. Uma “armadilha” muito IAL - 963 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital comum é subestimar a importância do procedimento de amostragem delegando-o a um empregado inexperiente e sem treinamento. 11.6 A terminologia usada em amostragem é complicada e pode ser desconcertante. Também, os termos usados podem não ser consistentes entre uma aplicação e outra. Ao documentar um procedimento de amostragem é importante assegurar que todos os termos utilizados sejam claramente deinidos, a im de que o procedimento ique claro para outros usuários. Da mesma forma, é importante assegurar, ao se comparar dois procedimentos distintos, que a terminologia usada seja consistente. Por exemplo, deve se tomar cuidado no uso da palavra “bulk” (granel), visto que esta pode se referir à combinação de amostras individuais, ou a uma massa indiferenciada. 11.7 Um dos melhores tratamentos da terminologia de amostragem é apresentado nas recomendações publicadas pela IUPAC (Ref. E7), que descreve os termos usados na amostragem de mercadorias embaladas ou de mercadorias a granel. Neste exemplo, o procedimento de amostragem reduz a partida original, através de lotes ou bateladas, incrementos, amostras primárias ou brutas, amostras compostas ou agregadas, subamostras ou amostras secundárias, para uma amostra de laboratório. A amostra de laboratório, se heterogênea, pode ser mais adiante preparada para produzir a amostra de ensaio. A amostra de laboratório, ou a amostra de ensaio, é considerada como sendo o inal do procedimento de amostragem. É possível que as operações dentro desse procedimento estejam sujeitas a incertezas de amostragem. 11.8 Para o propósito da orientação dada abaixo foram usadas as seguintes deinições, conforme propostas pela IUPAC: Amostra: Uma parcela do material selecionada para representar um corpo maior do material. Manuseio de amostra: Se refere à manipulação a que as amostras são expostas durante o processo de amostragem, desde sua seleção a partir do material original até o descarte de todas as amostras e porções de ensaio. Subamostra: Se refere a uma parcela da amostra obtida por seleção ou divisão; uma unidade individual do lote aceita como parte da amostra ou; a unidade inal da amostragem multifásica. Amostra de laboratório: Material primário entregue ao laboratório. 964 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Amostra de ensaio: A amostra preparada a partir da amostra de laboratório. Preparação da amostra: Isto descreve os procedimentos seguidos para selecionar a porção de ensaio a partir da amostra (ou subamostra) e inclui: processamento no laboratório; mistura (homogeneização); redução; coning & quartering1; riffling2; moagem e trituração. Porção de ensaio: Se refere ao material efetivo, pesado ou medido para a análise. 11.9 Uma vez recebida no laboratório, a(s) amostra(s) de laboratório pode(m) necessitar de posterior tratamento, tal como subdivisão e/ou moagem e trituração, antes da análise. 11.10 A menos que especiicado de outra forma, a porção de ensaio colhida para análise deve ser representativa da amostra de laboratório. Para garantir que a porção de ensaio seja homogênea, pode ser necessário reduzir o tamanho das partículas por trituração ou moagem. Se a amostra de laboratório for grande, pode ser necessário subdividi-la antes da trituração ou moagem. Cuidados devem se tomados para garantir que uma segregação não ocorra durante a subdivisão. Em alguns casos será necessário moer ou triturar grosseiramente a amostra antes da subdivisão em amostras de ensaio. A amostra pode ser subdividida por uma variedade de mecanismos, incluindo coning & quartering, riffling, ou por meio de um divisor rotativo de amostra ou de um divisor centrífugo. A etapa de redução do tamanho das partículas pode ser executada manualmente (almofariz/gral e pistilo) ou mecanicamente usando-se moinhos ou trituradores. Cuidados devem ser tomados para evitar a contaminação cruzada de amostras, assegurando-se de que o equipamento não contamine a amostra (p. ex. metais) e que a composição da amostra não seja alterada (p. ex. perda de umidade) durante a moagem ou trituração. Muitos métodos padronizados de análise contêm uma seção que detalha a preparação da amostra de laboratório, antes da retirada da porção de ensaio para análise. Em outros casos, a legislação lida com este aspecto como uma questão genérica. 11.11 As operações analíticas começam com a medição de uma porção de ensaio a partir da amostra de laboratório ou da amostra de ensaio, e prosseguem por meio de várias operações até a medição inal. 11.12 Existem regras importantes a serem seguidas ao se planejar, adaptar, ou seguir uma estratégia de amostragem: 11.12.1O problema que necessita de tomada de amostras e da análise subseqüente deve ser compreendido, e o procedimento de amostragem elaborado de acordo. A estratégia de amostragem usada irá depender da natureza do problema, p. ex.: a) determinar a concentração média de analito no material; b) conhecer o peril da distribuição do analito no material; IAL - 965 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital c) o material é suspeito de contaminação por um analito particu lar; d) o contaminante está distribuído de modo heterogêneo (ocorre em pontos distintos) no material; e)podem existir outros fatores não-analíticos a serem considerados, incluindo a natureza da área sob exame. 11.12.2 Deve se tomar cuidado ao se presumir que o material seja homogêneo, mesmo quando ele parece ser. Quando o material se encontra claramente em duas ou mais fases físicas, a distribuição do analito pode variar dentro de cada fase. Neste caso, pode ser apropriado separar as fases e tratálas como amostras distintas. Da mesma maneira, pode ser apropriado combinar e homogeneizar as fases para formar uma amostra única. Em sólidos, pode haver uma variação considerável na concentração do analito se a distribuição do tamanho de partícula do material principal variar signiicativamente e, durante um período de tempo, o material puder acomodar-se. Antes da amostragem pode ser apropriado, se praticável, homogeneizar o material para assegurar uma distribuição do tamanho da partícula representativa. Similarmente, a concentração do analito pode variar dentro de um sólido onde diferentes partes do material estiveram sujeitas a diferentes esforços (stresses). Por exemplo, considerar a medição do monômero de cloreto de vinila (VCM) na estrutura de um frasco de PVC. A concentração do VCM varia signiicativamente dependendo de se ela é medida no gargalo do frasco, nas curvaturas (ombro), nos lados ou na base. 11.12.3 As propriedades do(s) analito(s) de interesse devem ser levadas em conta. Volatilidade, sensibilidade à luz, instabilidade térmica e reatividade química podem ser considerações importantes no planejamento da estratégia de amostragem e escolha do equipamento, embalagem e condições de armazenamento. Equipamentos utilizados para amostragem, subamostragem, manuseio de amostra, preparação e/ou extração de amostra devem ser selecionados de modo a evitar alterações indesejadas na natureza da amostra, que possam inluenciar os resultados inais. A signiicância de erros gravimétricos ou volumétricos que possam ocorrer durante a amostragem deve ser considerada, e todos os equipamentos críticos devem estar calibrados. Pode ser apropriada a adição de produtos químicos à amostra, tais como ácidos ou antioxidantes, para estabilizá-la. Isto é de particular importância na análise residual, onde existe o risco da adsorção do analito na superfície do recipiente de armazenagem. 11.12.4 Pode ser necessário considerar o uso e o valor do restante do material original, após uma amostra ter sido retirada para análise. Uma amostragem feita com pouco cuidado, especialmente se destrutiva, pode tornar toda a partida/carregamento do material inoperante ou sem valor. 966 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 11.12.5 Qualquer que seja a estratégia usada para a amostragem, é de vital importância que o amostrador mantenha um registro claro dos procedimentos seguidos, a im de que o processo de amostragem possa ser exatamente repetido. 11.12.6 Quando mais de uma amostra for retirada do material original pode ser útil incluir um diagrama como parte integrante da documentação, para indicar o padrão da amostragem. Isto deverá tornar mais fácil a repetição da amostragem numa data futura, podendo também auxiliar na obtenção de conclusões a partir dos resultados do ensaio. Uma aplicação típica, onde um esquema deste será útil, é na amostragem de solos sobre uma ampla área para monitorar sedimentos das emissões de chaminés. 11.12.7 Quando o laboratório não tiver sido responsável pela fase de amostragem, ele deve declarar no relatório que as amostras foram analisadas como recebidas. Se o laboratório tiver conduzido ou dirigido a fase de amostragem, ele deve informar sobre os procedimentos utilizados e comentar acerca de quaisquer limitações decorrentes impostas aos resultados. 11.13 A embalagem da amostra e os instrumentos usados para manipulação da amostra devem ser selecionados de forma que todas as superfícies em contato com a amostra sejam essencialmente inertes. Atenção particular deve ser dedicada à possível contaminação das amostras por metais ou plastiicantes lixiviados (migrados) do recipiente, ou de sua tampa, para a amostra. A embalagem deve também garantir que a amostra possa ser manipulada sem ocasionar um risco químico, microbiológico, ou outro qualquer. 11.14 O fechamento da embalagem deve ser adequado, de forma a garantir que não haja vazamento da amostra, e que a própria amostra não seja contaminada. Em algumas circunstâncias, por exemplo, quando amostras tiverem sido coletadas para ins legais, a amostra deve ser lacrada de forma que o acesso a ela somente seja possível pela ruptura do lacre. A conirmação do estado satisfatório dos lacres irá então, normalmente, fazer parte do relatório analítico. 11.15 O rótulo da amostra é um importante aspecto da documentação e deve identiicála, sem ambigüidade, a planos ou notas relacionadas. A rotulagem é particularmente importante, mais adiante no processo analítico, quando a amostra possa ter sido dividida, subamostrada, ou modiicada de alguma forma. Em tais circunstâncias, informações adicionais podem ser apropriadas, tais como referências à amostra IAL - 967 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital principal, e a quaisquer processos usados para extrair ou subamostrar a amostra. A rotulagem deve ser irmemente aixada na embalagem da amostra e, quando apropriado, ser resistente ao desbotamento, autoclavação, derramamento de reagentes ou da própria amostra, e a variações razoáveis de temperatura e umidade. 11.16 Algumas amostras, por exemplo, aquelas envolvidas em litígio, podem ter requisitos especiais para rotulagem e documentação. Pode ser necessário que os rótulos identiiquem todos aqueles indivíduos que estiveram envolvidos com a amostra, incluindo a pessoa que coletou a amostra e os analistas envolvidos nos ensaios. Isto pode ser suportado por recibos, para atestar que um signatário (conforme identiicado no rótulo) entregou a amostra para o próximo signatário, comprovando assim que a continuidade da amostra foi mantida. Isto é normalmente conhecido como “cadeia de custódia”. 11.17 As amostras devem ser guardadas a uma temperatura apropriada e de tal modo que não haja riscos ao pessoal do laboratório, e a integridade das amostras seja preservada. As áreas de armazenagem devem ser mantidas limpas e organizadas, a im de que não haja risco de contaminação ou de contaminação cruzada, ou de danos à embalagem ou a quaisquer lacres pertinentes. Condições ambientais extremas (p.ex. temperatura, umidade), que possam alterar a composição da amostra devem ser evitadas, já que isto pode levar à perda de analito por degradação ou adsorção, ou a um aumento na concentração do analito (micotoxinas). Se necessário, deve ser empregado monitoramento ambiental. Um nível de segurança apropriado deve ser exercido a im de restringir o acesso não autorizado às amostras. 11.18 Todo o pessoal envolvido na administração do sistema de manuseio da amostra deve ser corretamente treinado. O laboratório deve ter uma política documentada para a retenção e descarte de amostras. O procedimento de descarte deve levar em conta as orientações acima citadas. 11.19 Para avaliar integralmente um resultado analítico para avaliação de conformidade, ou para outros ins, é importante ter conhecimento do plano de amostragem e de sua base estatística. Procedimentos de amostragem para inspeção por variáveis presumem que a característica sendo inspecionada é mensurável e segue a distribuição normal. Visto que a amostragem para inspeção por atributos é um método pelo qual a unidade de produto é classiicada como conforme ou não-conforme, ou o número de não-conformidades na unidade de produto é contado com relação a um determinado conjunto de requisitos. Na inspeção por atributos, o risco associado com a aceitação/rejeição de não-conformidades é pré-determinado pelo nível de 968 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica qualidade aceitável (NQA) ou a qualidade limite (QL). 12. AMBIENTE 12.1 Amostras, reagentes, padrões de medida e materiais de referência devem ser armazenados para garantir sua integridade. Em particular, as amostras devem ser armazenadas de modo que a contaminação cruzada não seja possível. O laboratório deve resguardar as amostras contra a deterioração, contaminação e perda de identidade. 12.2 O ambiente do laboratório deve ser suicientemente desobstruído (não abarrotado), limpo e arrumado, de modo a assegurar que a qualidade do trabalho desenvolvido não seja comprometida. 12.3 Pode ser necessário restringir o acesso em áreas especíicas de um laboratório, devido à natureza do trabalho nelas realizado. As restrições podem ser feitas por motivos de proteção, segurança, ou sensibilidade à contaminação ou interferências. Exemplos típicos pode ser o trabalho envolvendo explosivos, materiais radioativos, carcinogênicos, análise forense, técnicas PCR (Reação de Cadeia de Polimerase) e análise residual. Quando tais restrições estiverem em vigor, o pessoal deve estar ciente: I) do uso pretendido de uma área em particular; II) das restrições impostas ao trabalho dentro dessas áreas; III) dos motivos para a imposição de tais restrições; IV) dos procedimentos a serem seguidos quando tais restrições forem violadas. 12.4 Na seleção de áreas que serão designadas para novos trabalhos, o uso anterior da área deve ser levado em consideração. Antes do uso, devem ser feitas veriicações para garantir que a área esteja livre de contaminação. 12.5 O laboratório deve proporcionar condições ambientais apropriadas e os controles necessários para a realização de ensaios especíicos, ou para a operação de equipamento especíico, incluindo: temperatura, umidade, isenção de vibração, isenção de contaminação microbiológica em suspensão no ar ou em poeira, iluminação especial, proteção contra radiação, e serviços especíicos. Condições ambientais críticas devem ser monitoradas e mantidas dentro de limites predeterminados. 12.6 Um desvio das condições ambientais críticas pode ser indicado por sistemas de monitoramento ou pelo controle de qualidade analítico em ensaios especíicos. O imIAL - 969 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital pacto de tais falhas pode ser avaliado como parte integrante dos ensaios de robustez durante a validação do método e, quando apropriado, estabelecidos procedimentos de emergência. 12.7 Procedimentos de descontaminação podem ser apropriados quando o ambiente ou o equipamento estiver sujeito à mudanças de uso, ou quando ocorrer contaminação acidental. 13. EQUIPAMENTOS (Ver também Apêndice B) 13.1 Categorias de equipamentos 13.1.1 Todo o equipamento usado nos laboratórios deve ser de uma especiicação suiciente para a inalidade pretendida, e mantido num estado de manutenção e calibração consistente com seu uso. Equipamentos normalmente encontrados no laboratório químico podem ser classiicados como: i) equipamento para serviços gerais, não usado para medições ou com mínima inluência sobre medições (p. ex. chapas quentes, agitadores, vidraria não-volumétrica e vidraria usada para medição grosseira de volume, tais como provetas) e sistemas para aquecimento ou ventilação de laboratório; ii) equipamento volumétrico (p. ex. frascos, pipetas, picnômetros, buretas, etc.) e instrumentos de medição (p. ex. hidrômetros, viscosímetros de tubo em “U”, termômetros, cronômetros, espectrômetros, cromatógrafos, medidores eletroquímicos, balanças, etc.); iii) padrões de medida física (pesos, termômetros de referência); iv) computadores e processadores de dados. 13.2 Equipamento para serviços gerais 13.2.1 970 - IAL Equipamento para serviços gerais será conservado, tipicamente, apenas por meio de limpeza e veriicações de segurança, conforme necessário. Calibrações ou veriicações de desempenho serão neces- Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica sárias onde a regulagem puder afetar signiicativamente o ensaio ou o resultado analítico (p. ex. a temperatura de um forno de mula, ou banho com temperatura constante). Tais veriicações precisam ser documentadas. 13.3 Equipamento volumétrico e instrumentos de medição 13.3.1 O uso correto destes equipamentos é crítico para as medições analíticas e, assim, ele deve ser corretamente utilizado, conservado e calibrado, levando-se em conta os aspectos ambientais (seção 12). O desempenho de algumas vidrarias volumétricas (e ains) é dependente de fatores especíicos, que podem ser afetados pelos métodos de limpeza, etc. Além de requererem procedimentos estritos para manutenção, tais aparelhos podem, consequentemente, necessitar mais regularmente de calibração, dependendo do uso. Por exemplo, o desempenho de picnômetros, viscosímetros com tubo em “U”, pipetas e buretas, são dependentes da “molhabilidade” e das características da tensão supericial. Procedimentos de limpeza devem ser escolhidos de modo a não comprometer essas propriedades. 13.3.2 Atenção deve ser dada à possibilidade de contaminação originada pela estrutura do equipamento em si, que pode não ser inerte, ou pela contaminação cruzada originada do uso anterior. No caso de vidrarias volumétricas, procedimentos de limpeza, armazenagem e segregação de equipamentos volumétricos podem ser críticos, particularmente para análises residuais, onde a dissolução e a adsorção podem ser signiicativas. 13.3.3 O uso correto combinado com manutenção, limpeza e calibração periódicas não irá necessariamente garantir que um instrumento funcione adequadamente. Quando apropriado, devem ser realizadas veriicações periódicas de desempenho (p. ex. veriicação da resposta, estabilidade e linearidade das fontes, sensores e detectores, a eiciência da separação em sistemas cromatográicos, a resolução, alinhamento e precisão do comprimento de onda de espectrômetros, etc.), ver Apêndice B. IAL - 971 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 13.3.4 A freqüência de tais veriicações de desempenho pode ser especiicada em manuais ou procedimentos operacionais. Caso contrário, ela deverá ser determinada pela experiência e baseada na necessidade, tipo e desempenho anterior do equipamento. Os intervalos entre as veriicações devem ser mais curtos do que o tempo que o equipamento leva, na prática, para ultrapassar os limites aceitáveis. 13.3.5 Muitas vezes é possível criar veriicações de desempenho — veriicações de adequação do sistema — dentro dos métodos de ensaio (p. ex. baseado nos níveis de resposta esperados dos detectores ou sensores para materiais de referência, a resolução das misturas de componentes por sistemas de separação, as características espectrais de padrões de medida etc.). Essas veriicações devem ser satisfatoriamente concluídas, antes do equipamento ser usado. 13.4 Padrões de medida física 13.4.1 Onde quer que os parâmetros físicos sejam decisivos para o correto desempenho de um ensaio em particular, o laboratório deve possuir, ou ter acesso, ao padrão de medida relevante, como um meio de calibração. 2.2.2 Em alguns casos, um ensaio e seu desempenho são na verdade deinidos em termos de uma peça especíica do equipamento, e veriicações serão necessárias para conirmar que o equipamento está de acordo com a especiicação relevante. Por exemplo, valores do ponto de fulgor para uma amostra inlamável especíica são dependentes das dimensões e geometria dos aparelhos utilizados no ensaio. 13.4.3 Materiais padrões de medição e quaisquer certiicados anexos devem ser armazenados e utilizados de maneira consistente para a preservação do estado de calibração. Deve ser dada consideração particular a qualquer recomendação de armazenagem mencionada na documentação fornecida com o padrão de medida. 13.5 Computadores e processadores de dados. Os requisitos para computadores são apresentados na seção 20. 972 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 14. REAGENTES 14.1 A qualidade dos reagentes e de outros materiais consumíveis deve ser apropriada ao uso pretendido. Devem ser feitas considerações a respeito da seleção, compra, recebimento e armazenamento de reagentes. 14.2 A qualidade de qualquer reagente crítico utilizado (incluindo água) deve ser mencionada no método, juntamente com o guia sobre quaisquer precauções especíicas a serem observadas na sua preparação, armazenamento e uso. Essas precauções incluem toxicidade, inlamabilidade, estabilidade térmica ao ar e a luz; reatividade com outros produtos químicos; reatividade com recipientes especíicos; e outros riscos. Reagentes e materiais de referência preparados no laboratório devem ser rotulados para identiicar a substância, concentração, solvente (quando diferente da água), quaisquer precauções ou riscos especiais, restrições de uso, e data de preparação e/ou validade. A pessoa responsável pela preparação deve ser identiicável a partir do rótulo ou dos registros. 14.3 O correto descarte de reagentes não afeta diretamente a qualidade da análise da amostra, contudo ele faz parte das boas práticas de laboratório e deve obedecer aos regulamentos nacionais sobre saúde e segurança, ou meio ambiente. 14.4 Quando a qualidade de um reagente for crítica para um ensaio, a qualidade de um novo lote deve ser veriicada em comparação com o lote anteriormente em uso (de saída), antes de seu emprego, desde que o lote de saída seja reconhecido como sendo ainda utilizável. 15. RASTREABILIDADE 15.1 A deinição formal de rastreabilidade é apresentada em 3.10 e uma declaração de política da CITAC foi preparada (Ref A6). Um guia sobre a rastreabilidade de medições químicas está sendo desenvolvido (Ref A7). A rastreabilidade diz respeito ao requisito de relacionar os resultados das medições aos valores de padrões ou referências rastreáveis ao Sistema Internacional de Unidades, o SI. Isto é alcançado com o emprego de padrões primários (ou outros padrões de alto nível), que são utilizados para estabelecer padrões secundários que, por sua vez, podem ser usados como padrões em calibrações de trabalho e sistemas de medição relacionados. A rastreabilidade é estabelecida em um nível declarado de incerteza de medição, onde cada etapa na cadeia da rastreabilidade acrescenta mais incerteza. A rastreabilidade IAL - 973 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital é importante porque ela assegura que medições feitas em laboratórios diferentes, ou em diferentes ocasiões, sejam comparáveis. Conforme acima indicado, é uma questão de escolha vincular a rastreabilidade a referências locais ou a referências internacionais. 15.2 Medições químicas são feitas, invariavelmente, pelo cálculo do valor a partir de uma equação de medição que envolve os valores medidos de outras quantidades, tais como: massa, volume, concentração de padrões químicos etc. Para que a medição em questão seja rastreável, todas as medições associadas aos valores usados na equação de medição, usada para calcular o resultado, precisam ser também rastreáveis. Outras quantidades não presentes na equação de medição, tais como pH, temperatura etc, podem também afetar signiicativamente o resultado. Quando for este o caso, a rastreabilidade de medições usadas para controle dessas quantidades também precisa ser rastreável a padrões de medição apropriados. 15.3 O estabelecimento da rastreabilidade de quantidades físicas, tais como massa, volume etc., é prontamente alcançado pelo uso de padrões de transferência, no nível de incerteza necessário para medições químicas. As áreas problemáticas para químicos são normalmente as validações de métodos (químicos) e as calibrações. A validação estabelece que o método mede, de fato, o que ele foi destinado a medir (p. ex. metil-mercúrio em peixes). A validação estabelece que a equação de medição usada para calcular os resultados é válida. A calibração é normalmente baseada no uso de soluções gravimetricamente preparadas de materiais de referência de substâncias puras. As questões importantes aqui são identidade e pureza, a primeira sendo mais problemática em química orgânica, onde níveis muito maiores de detalhamento estrutural são frequentemente requeridos e confusões entre componentes similares podem facilmente ocorrer. A incerteza de uma medição irá, em parte, depender da incerteza da pureza do padrão químico utilizado. Contudo, somente no caso de alguns materiais orgânicos, onde problemas de pureza e estabilidade podem ser acentuados, ou onde uma análise de alta precisão dos componentes principais for requerida, é que a pureza irá constituir um grande problema. 15.4 Para muitas análises, onde extração, digestão, derivatização e saponiicação são normalmente requeridas, o principal problema pode ser adquirir um bom conhecimento da quantidade de analito na amostra original, relativamente ao resultado obtido ao inal do processo de medição. Esta propensão (algumas vezes chamada de “recuperação”) pode ser devido a perdas no processamento, contaminação ou interferentes. Alguns destes efeitos são manifestados dentro das incertezas de reprodutibilidade, mas outros são efeitos sistemáticos e necessitam de uma consideração 974 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica separada. As estratégias disponíveis para determinar as tendências do método incluem: • Uso de métodos primários ou de referência, de tendência conhecida e pequena; • Comparações com matrizes combinadas de MRCs; • Medição de brancos e amostras gravimetricamente fortiicadas; • Estudo de perdas, contaminações, interferentes e efeitos de matrizes. O estabelecimento da rastreabilidade desta parte do processo de medição requer a correlação da tendência da medição com referências apropriadas, tais como os valores contidos em materiais de referência de matrizes combinadas. Deve ser observado que a medição da recuperação de amostras fortiicadas não simula necessariamente a extração do analito nativo das amostras. Na prática, isto não constitui normalmente um problema quando as amostras forem líquidas e/ou totalmente digeridas. Contudo, podem ocorrer problemas com a extração de sólidos. Por exemplo, um analito fortiicado pode estar livremente disponível na superfície das partículas da amostra, enquanto que o analito nativo pode estar fortemente adsorvido dentro das partículas e, portanto, mais difícil de ser extraído. 15.5 A maioria das medições químicas pode, em princípio, se fazer rastreável para o mol. Quando, contudo, o analito for deinido em termos funcionais, tal como gordura ou proteína baseada numa determinação de nitrogênio, então a especiicação da medição em termos de mols não é viável. Nesses casos, a quantidade sendo medida é deinida pelo método. Nestes casos, a rastreabilidade é para padrões de quantidades de componentes usados para calcular o resultado, por exemplo, massa e volume, e os valores produzidos por um método padronizado e/ou os valores determinados por um material de referência. Tais métodos são denominados métodos empíricos. Em outros casos, a limitação em alcançar a rastreabilidade segundo o SI, deriva da diiculdade em avaliar a tendência e sua incerteza, tal como a recuperação dos analitos em matrizes complexas. As opções aqui são deinir o mensurando pelo método e estabelecer a rastreabilidade, conforme referências mencionadas, incluindo um método de referência/material de referência. Tais medidas possuem um `menor nível´ de rastreabilidade, mas também possuem uma menor Incerteza de Medição, relativa às referências estabelecidas. Alternativamente, a tendência pode ser estimada e corrigida para a incerteza, devido à tendência poder ser também estimada e incluída na avaliação da incerteza global. Isto irá permitir que a rastreabilidade ao SI seja reivindicada. 16. INCERTEZA DE MEDIÇÃO IAL - 975 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 16.1 Incerteza de medição é formalmente deinida em 3.11. As boas práticas na avaliação da incerteza de medição são descritas num Guia ISO (Ref B7), e uma interpretação para medição química, incluindo um número de exemplos trabalhados, é fornecida num Guia CITAC/EURACHEN (Ref A2). A incerteza de medição caracteriza a faixa de valores dentro da qual o valor real deve se situar, com um nível de coniança especiicado. Cada medida possui uma incerteza a ela associada, resultante de erros originados dos vários estágios de amostragem e análise, e do conhecimento imperfeito de fatores afetando o resultado. Para que as medidas sejam de valor prático, é necessário ter algum conhecimento de sua coniabilidade ou incerteza. Uma declaração da incerteza associada a um resultado transmite ao cliente a `qualidade´ do resultado. 16.2 A ISO/IEC 17025:1999 requer que os laboratórios avaliem sua incerteza de medição. Existe também um requisito para divulgar a incerteza de medição em circunstâncias especiicas, por exemplo, quando ela for relevante para interpretação do resultado do ensaio (o que é muitas vezes o caso). Assim, a declaração da incerteza de medição em relatórios de ensaios deve se tornar prática comum no futuro (Ref B18). 16.3 Uma declaração de incerteza é uma estimativa quantitativa dos limites, dentro dos quais o valor de um mensurando (tal como uma concentração de analito) é previsto se situar. A incerteza pode ser expressa como um desvio-padrão ou um múltiplo calculado do desvio-padrão. Na obtenção ou estimativa da incerteza relativa a um método e analito especíico, é essencial assegurar que a estimativa considere explicitamente todas as fontes possíveis de incerteza, e avalie componentes signiicativos. A repetitividade ou reprodutibilidade, por exemplo, não são normalmente estimativas completas da incerteza, visto que nenhuma delas leva inteiramente em conta quaisquer incertezas associadas a efeitos sistemáticos inerentes a um método. 16.4 Uma ampla variedade de fatores torna qualquer resultado de medição analítica possível de se desviar do valor verdadeiro. Por exemplo, os efeitos da temperatura nos equipamentos volumétricos, relexão e dispersão da luz em instrumentos espectroscópicos, variações de voltagem na rede elétrica, a interpretação dada por cada analista aos métodos especiicados e recuperações de extrações incompletas, todas elas inluenciam potencialmente o resultado. No que for razoavelmente possível, tais erros precisam ser minimizados por controles externos ou explicitamente corrigidos, por exemplo: pela aplicação de um fator de correção adequado. O desvio exato de um único resultado de medição do valor verdadeiro (desconhecido) é, 976 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica contudo, impossível de ser obtido. Isto ocorre porque os diferentes fatores variam de experimento a experimento, e porque o efeito de cada fator sobre o resultado nunca é exatamente conhecido. A possível faixa de desvios precisa ser, portanto, estimada. 16.5 A principal tarefa na atribuição de um valor para a incerteza de uma medição é a identiicação das fontes relevantes de incerteza e a atribuição de um valor a cada contribuição signiicativa. As contribuições distintas precisam ser então combinadas (conforme mostrado na seção 16.13), aim de fornecer um valor global. É necessário manter registros das fontes individuais de incerteza identiicadas, do valor de cada contribuição e a origem do valor (por exemplo: medições repetidas, referências de literatura, dados de MRCs, etc.). 16.6 Na identiicação das principais fontes de incerteza, a seqüência completa de eventos necessários para atingir a inalidade da análise deve ser considerada. Tipicamente, essa seqüência inclui amostragem e subamostragem, preparação de amostra, extração, depuração, concentração ou diluição, calibração de instrumento (incluindo preparação do material de referência), análise instrumental, processamento de dados brutos e transcrição do resultado produzido. 16.7 Cada um dos estágios terá fontes de incerteza associadas. As incertezas de componentes podem ser avaliadas individualmente ou em grupos apropriados. Por exemplo, a repetitividade de uma medição pode servir como uma estimativa de contribuição total da capacidade de variabilidade aleatória, devido a um número de etapas num processo de medição. Da mesma forma, uma estimativa da tendência global e sua incerteza podem ser derivadas de estudos de materiais de referência certiicados com matrizes combinadas e estudos de fortiicação. 16.8 O tamanho das contribuições de incerteza pode ser estimado de diversas maneiras. O valor de um componente de incerteza, associado a variações aleatórias em fatores de inluência, pode ser estimado pela medida da dispersão dos resultados de um número adequado de determinações sob uma faixa de condições representativas. (Em tais investigações, o número de medições não deve ser normalmente inferior a dez). Os componentes de incerteza originados do conhecimento imperfeito, por exemplo, de uma tendência ou tendência em potencial, podem ser estimados com base em um modelo matemático, julgamento proissional fundamentado, comparações interlaboratoriais internacionais, experimentos sobre sistemas modelo, etc. Estes diferentes métodos para estimativa dos componentes individuais de incerteza podem ser válidos. IAL - 977 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 16.9 Quando as contribuições de incerteza forem estimadas em grupos, é importante, apesar de tudo, registrar as fontes de incerteza que são consideradas como sendo incluídas em cada grupo, e medir e registrar valores dos componentes individuais de incerteza, quando disponíveis, como uma veriicação sobre a contribuição do grupo. 16.10 Se forem usadas informações provenientes de resultados de comparações interlaboratoriais, é essencial considerar incertezas originadas fora do escopo de tais estudos. Por exemplo, valores nominais para materiais de referência são tipicamente informados como uma faixa, e quando diversos laboratórios usam o mesmo material de referência num experimento colaborativo, a incerteza no valor do material de referência não é incluída na variação interlaboratorial. Da mesma forma, experimentos interlaboratoriais utilizam tipicamente uma faixa restrita de materiais de ensaio, normalmente homogeneizados com cuidado, de modo que a possibilidade de falta de homogeneidade e diferenças na matriz, entre amostras reais e materiais de ensaio nos experimentos colaborativos, devem ser também levadas em consideração. 16.11 Tipicamente, as contribuições da incerteza para resultados analíticos podem incidir em quatro grupos principais: i) Contribuições da variabilidade aleatória de curta duração, tipicamente estimada a partir de experimentos de repetitividade. ii) Contribuições, tais como: efeitos do operador, incerteza de calibração, erros de escala graduada, efeitos do equipamento e do laboratório, estimativas a partir dos experimentos de reprodutibilidade entre laboratórios, intercomparações internas, resultados de ensaios de proiciência ou por julgamento proissional. iii) Contribuições fora do escopo dos ensaios interlaboratoriais, tais como incerteza dos materiais de referência. 6.12 iv) Outras fontes de incerteza, tais como: variabilidade da amostragem (falta de homogeneidade), efeitos de matriz e incerteza sobre hipóteses subjacentes (tais como hipóteses sobre integridade da derivatização). As contribuiçõe.s de incerteza para cada fonte devem ser todas expressas da mesma forma, idealmente como desvios padrão ou desvios padrão relativos. Em alguns casos, será necessário efetuar conversões. Por exemplo, os limites dos materiais de referência são frequentemente presumidos como tendo limites absolutos. Uma distribuição retangular de largura W tem um desvio padrão W/(2 ). Intervalos de coniança podem ser convertidos em desvios-padrão, dividindo-se 978 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica pelo valor “t” de Student apropriado para grandes amostras estatísticas (1,96 para limites de coniança de 95%). 16.13 Após uma lista de incertezas ser disponibilizada, os componentes individuais podem ser combinados. Quando fontes individuais de incerteza forem independentes, a expressão geral para a incerteza padrão combinada u é: u= onde ∂R/∂xi é o diferencial parcial do resultado R, com relação a cada valor intermediário (ou outra `quantidade de inluência´, tal como uma correção xi), e u(xi) é o componente de incerteza associado a xi. 16.14 Essa expressão simpliica consideravelmente os dois casos mais comuns. Quando as quantidades de inluência ou resultados intermediários são adicionados ou subtraídos para fornecer o resultado, a incerteza u é igual à raiz quadrada da soma dos contribuintes dos componentes da incerteza ao quadrado, todos expressos como desvio-padrão. Quando os resultados intermediários forem combinados por multiplicação ou divisão, o desvio padrão relativo (DPR) combinado é calculado extraindo-se a raiz quadrada da soma dos DPRs ao quadrado, para cada resultado intermediário, e a incerteza padrão u combinada é calculada a partir do DPR combinado e do resultado. 16.15 A incerteza global deve ser expressa como um múltiplo do desvio-padrão calculado. O multiplicador recomendado é 2, isto é, a incerteza é igual a 2u. Quando as contribuições forem originadas de erros normalmente distribuídos, este valor irá corresponder aproximadamente a um intervalo de coniança de 95%. 16.16 Não é normalmente seguro estender este argumento a maiores níveis de coniança sem o conhecimento das distribuições envolvidas. De modo particular, é normalmente constatado que distribuições de incerteza experimentais são muito mais amplas no nível de coniança de 99%, do que seria previsto por hipóteses de normalidade. 16.17 Freqüentemente não é necessário avaliar as incertezas para cada tipo de ensaio e amostra. Será normalmente suiciente investigar a incerteza somente uma vez para um método especíico, e utilizar as informações para estimar a incerteza de medição para todos os ensaios realizados dentro do escopo daquele método. IAL - 979 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 17. MÉTODOS/PROCEDIMENTOS PARA ENSAIOS E CALIBRAÇÃO 17.1 É responsabilidade do laboratório o uso de métodos apropriados à aplicação requerida. O laboratório pode usar o seu próprio critério ou pode selecionar um método em consulta com o cliente, ou ainda, o método pode ser especiicado em regulamento, ou pelo cliente. 17.2 Os padrões de qualidade freqüentemente favorecem o uso de padrões ou métodos colaborativamente testados, sempre que possível. Embora isto possa ser desejável em situações onde um método tiver que ser amplamente usado, ou deinido em regulamento, algumas vezes um laboratório pode ter um método próprio mais adequado. As considerações mais importantes são de que o método deva ser adequado ao im pretendido, seja adequadamente validado e documentado, e forneça resultados que sejam rastreáveis com relação às referências mencionadas em um nível de incerteza apropriado. 17.3 A validação de um padrão ou método colaborativamente testado não deve ser considerada implícita, a despeito de quão impecável seja a origem do método - o laboratório deve se certiicar de que o grau de validação de um método especíico é adequado ao im proposto, e que o próprio laboratório é capaz de veriicar quaisquer critérios de desempenho declarados. 17.4 Métodos desenvolvidos internamente devem ser adequadamente validados, documentados e autorizados antes do uso. Onde eles estiverem disponíveis, materiais de referência com matrizes combinadas devem ser usados para determinar qualquer tendência, ou quando isto não for possível, os resultados devem ser comparados com outra(s) técnica(s), de preferência baseada(s) em diferentes princípios de medição. A medição da recuperação de analito fortiicado, gravimetricamente adicionado, medição dos brancos e o estudo de interferências e efeitos matriciais podem ser também usados para veriicação da tendência ou recuperação imperfeita. A estimativa da incerteza deve fazer parte deste processo de validação e, além de cobrir os fatores acima, deve abordar questões, tais como a homogeneidade e estabilidade das amostras. Uma recomendação sobre validação de metodologia é apresentada na seção 18. A documentação de métodos deve incluir dados de validação, limitações de aplicabilidade, procedimentos para controle da qualidade, calibração e controle de documentos. Um laboratório documentando métodos pode achar conveniente adotar um formato comum, tal como a ISO 78-2: (Ref C10), que fornece um modelo útil. Além disto, recomendações sobre documentação de métodos estão 17.5 980 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica disponíveis por outras fontes, tais como órgãos de acreditação e órgãos nacionais de normalização. 17.6 Desenvolvimentos em metodologias e técnicas irão requerer que os métodos sejam alterados de tempos em tempos e, assim, a documentação do método deve estar sujeita a um controle adequado de documentos. Cada cópia do método deve apresentar o número/data da edição, autoridade da edição e número da cópia. Deve ser possível determinar a partir dos registros, qual é a versão mais atualizada de cada método autorizado para uso. 17.7 Métodos obsoletos devem ser descontinuados, mas devem ser guardados para ins de arquivo e identiicados claramente como obsoletos. A diferença de desempenho entre métodos revisados e obsoletos deve ser estabelecida, de modo que seja possível comparar dados novos e antigos. 17.8 Quando métodos forem revisados, a validação precisa ser também atualizada. A revisão pode ser de menor natureza, envolvendo diferentes tamanhos de amostra, diferentes reagentes etc. De modo alternativo, ela pode envolver mudanças signiicativas, tais como o uso de tecnologia ou metodologia radicalmente diferente. O nível de revalidação requerido aumenta com a escala das mudanças feitas no método. 18 VALIDAÇÃO DO MÉTODO 18.1 Veriicações precisam ser realizadas para garantir que as características de desempenho de um método sejam entendidas e para demonstrar que o método seja cientiicamente coerente, sob as condições nas quais ele deve ser aplicado. Essas veriicações são coletivamente conhecidas como validação. A validação de um método estabelece, através de estudos sistemáticos de laboratório, que o método é adequado à inalidade, isto é, suas características de desempenho são capazes de produzir resultados correspondentes às necessidades do problema analítico. As principais características de desempenho incluem: • • • • • • Seletividade e especiicidade (descrição do mensurando); Faixa de medição; Calibração e rastreabilidade; Tendência *; Linearidade; Limite de detecção/ Limite de quantiicação; IAL - 981 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital • Robustez; • Precisão * Em alguns campos da medição química, o termo recuperação é usado para descrever a tendência total; em outros campos, recuperação é usada em relação a determinados elementos de tendência. As características acima são inter-relacionadas, muitas delas contribuindo para a incerteza total de medição, e os dados gerados podem ser usados para avaliar a incerteza de medição (ver seção 16 e ref C13) durante a validação. A boa prática na validação do método é descrita em um Guia EURACHEM (Ref A3). Observe que não existe um acordo unânime sobre a interpretação de alguns dos termos acima, nem sobre as convenções usadas na sua determinação. Assim, ao mencionar dados de validação, é recomendável mencionar quaisquer convenções adotadas. 18.2 A extensão da validação deve ser claramente indicada no método documentado, de modo que o usuário possa avaliar a adequação do método às suas necessidades especíicas. 18.3 Métodos padrão deverão ser desenvolvidos e validados colaborativamente por um grupo de especialistas (ref C14-C19). Este desenvolvimento deve incluir a abordagem de todos os aspectos necessários de validação e respectiva incerteza. Contudo, a responsabilidade permanece sendo irmemente do usuário, para garantir que a validação documentada do método esteja suicientemente completa para preencher inteiramente suas necessidades. Mesmo se a validação for concluída, o usuário ainda precisará veriicar se as características de desempenho documentadas (p. ex. idelidade e precisão) podem ser obtidas no seu próprio laboratório. 18.4 Conforme acima indicado, existem diferentes opiniões a respeito da terminologia e do processo de validação do método. As explicações a seguir complementam aquelas em outras partes deste guia e tem a intenção de servir como uma diretriz, ao invés de um ponto de vista deinitivo. Seletividade de um método se refere à extensão até a qual ele pode determinar analito(s) especíico(s) numa mistura complexa, sem interferência dos outros componentes na mistura. Um método, que seja seletivo para um analito ou grupo de analitos, é dito como sendo específico. A aplicabilidade do método deve ser estudada usando-se várias amostras, variando desde padrões de medida pura até 18.5 982 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica misturas com matrizes complexas. Em cada caso a recuperação do(s) analito(s) de interesse deve ser determinada e as inluências de interferência suspeitas devidamente mencionadas. Quaisquer restrições na aplicabilidade da técnica devem ser documentadas no método. Este trabalho irá permitir que seja feita uma clara descrição do mensurando. 18.6 Faixa: Para a análise quantitativa, a faixa de trabalho para um método é determinada pelo exame de amostras com diferentes concentrações de analito e determinação da faixa de concentrações para qual a incerteza admissível possa ser alcançada. A faixa operacional é geralmente mais extensa do que a faixa linear, que é determinada pela análise de um número de amostras de concentrações de analito variáveis e cálculo da regressão a partir dos resultados, normalmente usando o método dos mínimos quadrados. A relação entre a resposta do analito e a concentração não precisa ser perfeitamente linear para que o método seja efetivo. Para métodos apresentando boa linearidade, é normalmente suiciente plotar uma curva de calibração, usando-se padrões de medida em 5 níveis distintos de concentração (mais o branco). Um maior número de padrões de medida será necessário quando a linearidade for baixa. Em análise qualitativa é comum examinar amostras replicadas e padrões de medida ao longo de uma faixa de concentrações, para estabelecer em que concentração um ponto de corte coniável pode ser traçado entre detecção e não-detecção (ver também a seção 18.8). 18.7 Linearidade para métodos quantitativos é determinada pela medição de amostras com concentrações de analito abrangendo a faixa reivindicada do método. Os resultados são usados para obter uma reta por regressão com relação ao cálculo de analito, usando-se o método dos mínimos quadrados. É conveniente que um método seja linear ao longo de uma faixa especíica, mas este não é um requisito absoluto. Quando a linearidade for inatingível para um procedimento especíico, deve ser determinado um algoritmo adequado para cálculos. 18.8 Para métodos qualitativos existe a possibilidade de haver um limite de concentração abaixo do qual uma identiicação positiva se torna não-coniável. A faixa de respostas deve ser examinada pelo ensaio de uma série de amostras e padrões de medida, constituída de brancos e de amostras contendo uma faixa dos níveis do analito. Em cada nível de concentração, será necessário medir aproximadamente 10 replicatas. Uma curva de resposta de resultados de % positiva (ou negativa) versus concentração deve ser traçada. A partir dessa curva será possível determinar a concentração limite, na qual o ensaio se torna não-coniável. No IAL - 983 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital exemplo abaixo mostrado, a identiicação positiva do analito cessa de ser 100 % coniável abaixo de 100 μg.g-1. Exemplo: Concentração (µg.g-1) 200 100 75 50 25 0 Nº de Replicações 10 10 10 10 10 10 Positiva/Negativa 10/0 10/0 5/5 1/9 0/10 0/10 18.9 O limite de detecção de um analito é muitas vezes determinado pela análise repetida de uma porção de amostras de brancos, e é a concentração de analito cuja resposta é equivalente à resposta média de brancos + 3 desvios padrão. É possível que seu valor seja diferente para diferentes tipos de amostra. 18.10 O limite de quantificação é a menor concentração de analito, que pode ser determinada com um nível de incerteza aceitável. Ele deve ser estabelecido usando-se uma amostra ou padrão de medida apropriado, isto é, ele é normalmente o ponto mais baixo na curva de calibração (excluindo o branco). Ele não deve ser determinado por extrapolação. Várias convenções assumem o limite como sendo de 5, 6 ou 10 desvios-padrão da medição do branco. 18.11 Solidez: Algumas vezes também chamada de robustez. Quando diferentes laboratórios usam o mesmo método, eles introduzem inevitavelmente pequenas variações no procedimento, que pode ter ou não uma inluência signiicativa sobre o desempenho do método. A solidez de um método é testada, pela introdução deliberada de pequenas alterações no método e exame das conseqüências. Um grande número de fatores pode precisar ser considerado, mas devido ao fato da maioria destes ter um efeito desprezível, será normalmente possível variar diversos deles de uma só vez. A solidez é normalmente avaliada pelo laboratório de origem, antes que outros laboratórios colaborem. 18.12 A tendência (algumas vezes chamada de recuperação) de um sistema de medição (método) é o erro sistemático desse sistema de medição. As questões associadas à estimativa da tendência e recuperação são comentadas na seção 15.4. Além da avaliação da tendência, é importante estimar a incerteza de medição 984 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica associada à tendência e incluir este componente na estimativa global da incerteza de medição. 18.13 A precisão de um método é a declaração da proximidade da concordância entre resultados de ensaio mutuamente independentes e é normalmente expressa em termos de desvio-padrão. Ela é geralmente dependente da concentração do analito, e esta dependência deve ser determinada e documentada. A precisão pode ser expressa de diferentes maneiras, dependendo das condições em que for calculada. Repetitividade é um tipo de precisão relacionada a medições feitas sob condições que podem ser repetidas, isto é: mesmo método; mesmo material; mesmo operador; mesmo laboratório; curto período de tempo entre as medições. Reprodutibilidade é um conceito de precisão relacionada a medições feitas sob condições que podem ser reproduzidas, isto é: mesmo método; operadores diferentes; laboratórios diferentes; equipamentos diferentes; longo período de tempo entre as medições. Precisão é um componente da Incerteza de Medição (ver seção 16). 18.14 Observe que estas declarações de precisão se aplicam à análise quantitativa. Análises qualitativas podem ser tratadas de uma maneira ligeiramente diferente. A análise qualitativa efetivamente é uma medição de “sim/não” para um determinado valor limite de analito. Para métodos qualitativos a precisão não pode ser expressa como um desvio padrão ou um desvio padrão relativo, mas pode ser expressa como taxas de verdadeiro e falso positivo (e negativo). Essas taxas devem ser determinadas numa variedade de concentrações abaixo do nível limite, no nível limite, e acima deste. Os dados obtidos por um método de comparação conirmatório devem ser usados sempre que um método apropriado para tal im estiver disponível. Se um método destes não estiver disponível, amostras de brancos, fortiicadas ou não, podem ser analisadas. % de falsos positivos = falsos positivos x 100/ total de negativos conhecidos % de falsos negativos = falsos negativos x 100/ total de positivos conhecidos 18.15 Conirmação é algumas vezes confundida com repetitividade. Enquanto que a repetitividade requer que a medição seja realizada diversas vezes por uma mesma técnica (método), a conirmação requer que a medição seja realizada por mais de uma técnica. A conirmação aumenta a coniança na técnica sob exame, e é especialmente útil quando as técnicas adicionais operam por princípios signiicativamente diferentes. Em algumas aplicações, por exemplo, na análise de IAL - 985 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital componentes orgânicos desconhecidos por cromatograia gasosa, o uso de técnicas conirmatórias é essencial. 19. CALIBRAÇÃO 19.1 Calibração é um conjunto de operações que estabelece, sob condições especiicadas, a relação entre valores de quantidades indicados por um instrumento de medição ou sistema de medição, ou valores representados por um material de referência, e os valores correspondentes estabelecidos por padrões (ver VIMB6). A maneira usual para realizar a calibração é submeter porções conhecidas da quantidade (p. ex: usando-se um padrão de medida ou material de referência) ao processo de medição e monitorar a resposta assim obtida. Informações mais detalhadas sobre materiais de referência são apresentadas no próximo capítulo. 19.2 Um programa geral para calibração no laboratório químico deve ser criado para assegurar que todas as medições que possuam um efeito signiicativo sobre os resultados do ensaio ou calibração sejam rastreáveis a um padrão de medida, de preferência um padrão de medida nacional ou internacional, tal como um material de referência. Quando apropriado e possível, devem ser usados materiais de referência certiicados. Quando padrões de medida formalmente deinidos não estiverem disponíveis, um material com propriedades e estabilidade adequadas deve ser selecionado ou preparado pelo laboratório, e usado como um padrão de medida do laboratório. As propriedades requeridas desse material devem ser caracterizadas por ensaios repetidos, preferencialmente por mais de um laboratório e usando-se uma variedade de métodos validados (ver ISO Guia 35: Ref C6). 19.3 Ensaios analíticos podem ser subdivididos em classes gerais, dependendo do tipo de calibração requerida: 19.3.1 Alguns ensaios analíticos dependem criticamente da medição de propriedades físicas, tais como a medição de peso em gravimetria e a medição de volume em titrimetria (volumetria). Visto que essas medições possuem um efeito signiicativo sobre os resultados do ensaio, é essencial um programa de calibração adequado para estas grandezas. Além disto, a calibração de dispositivos de medição usados para estabelecer a pureza ou concentração de padrões químicos, precisa ser considerada. 19.3.2 Quando um ensaio for usado para medir uma propriedade empírica de uma 986 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica amostra, tal como ponto de fulgor, o equipamento é muitas vezes deinido num método padrão nacional ou internacional, e materiais de referência rastreáveis devem ser usados para ins de calibração, quando disponíveis. Equipamentos novos ou recentemente adquiridos devem ser veriicados pelo laboratório antes do uso para garantir a conformidade com as especiicações, desempenho e dimensões requeridos. 19.3.3 Instrumentos, tais como cromatógrafos e espectrômetros, que necessitem de calibração como parte integrante de sua operação normal, devem ser calibrados usando-se materiais de referência de composição conhecida (provavelmente soluções de produtos químicos puros). 19.3.4 Em alguns casos, a calibração de todo o processo analítico pode ser realizada por comparação do resultado de medição de uma amostra com o resultado produzido por um material de referência adequado, que foi submetido ao mesmo processo analítico integral como a amostra. O material de referência pode ser uma mistura sintética preparada no laboratório a partir de materiais de pureza conhecida (e de preferência certiicados) ou uma matriz comercial de material de referência certiicado. Contudo, em tais casos, uma estreita combinação entre a amostra para ensaio e a matriz do material de referência, em termos da natureza da matriz, e a concentração do analito precisa ser assegurada. 19.4 No entanto, em muitos casos, a calibração somente é realizada no estágio inal de medição. Por exemplo, a calibração de um método de cromatograia gasosa pode ser realizada utilizando-se uma série de padrões de medida, que são soluções sintéticas do analito de interesse em várias concentrações. Essa calibração não leva em conta fatores, tais como a contaminação ou perdas que ocorrem durante os estágios de preparação e extração ou derivação da amostra. Portanto, é essencial durante o processo de validação do método explorar os problemas em potencial da contaminação e perdas, pelo manuseio de matrizes de materiais de referência ou amostras fortiicadas, ao longo de todo o processo de medição, e deinir o procedimento de calibração diária e as respectivas veriicações de controle da qualidade (ver também a seção 15.4). 19.5 Programas individuais de calibração devem ser estabelecidos dependendo dos requisitos especíicos da análise. Além disto, pode ser necessário veriicar a calibração do instrumento após qualquer parada, intencional ou não, e após algum serviço ou outra manutenção substancial. O nível e a freqüência de calibração devem estar baseados na experiência anterior (histórico do equipamento) e devem ser ao menos aqueles recomendados pelo fabricante. Um Guia sobre IAL - 987 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital calibração é apresentado no Apêndice B e inclui intervalos típicos de calibração para vários tipos de instrumentos simples e indica os parâmetros que podem requerer calibração em instrumentos analíticos mais complexos. A freqüência de calibração requerida irá depender da estabilidade do sistema de medição, do nível de incerteza requerido e de quão crítico é o trabalho. 19.6 Procedimentos para a realização de calibrações devem ser adequadamente documentados, quer como parte integrante de métodos analíticos especíicos, quer como um documento geral de calibração. A documentação deve indicar como realizar a calibração, a freqüência de calibração necessária, e a ação a ser tomada no caso de falha na calibração. Intervalos de freqüência para recalibração de padrões de medida física devem ser também indicados. Amostra ↓ ↓ ←←←←←←Material p/ CQ ↓ | Porção de Ensaio | ↓ --←← ←← ←|←←←←←←MR da Matriz ↓ | | ↓ | |←←←←←←Branco Digestão | Extração | Derivação |←←←←←←Amostra Fortiicada Separação ↓ ↓ Medição←←←←←←←←←←←←←←←←←MR p/ Calibração ↓ ↓ Cálculo do Resultado←←←←←←←←←←←←Fatores ↓ ↓ Apresentação do Resultado e Incerteza de Medição FIGURA 1 19.7 A calibração de vidrarias volumétricas normalmente se refere a um solvente especíico a uma temperatura especíica. A calibração raramente é válida quando as vidrarias forem usadas com outros solventes, devido às diferenças nas densidades, características de molhabilidade, tensão supericial etc. Isto é particularmente pertinente para vidrarias volumétricas calibradas para fornecer um 988 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica volume determinado. Outros equipamentos volumétricos podem ser afetados quando se usam solventes com altas taxas de expansão térmica. Nessas situações, as vidrarias devem ser recalibradas usando-se o solvente pertinente, na temperatura correta. Alternativamente, para maior precisão, as medições podem ser muitas vezes feitas por massa, ao invés de volume. 19.8 A Figura 1 é um processo analítico típico e ilustra a função da calibração em relação à validação do método e ao controle de qualidade. 20. MATERIAIS DE REFERÊNCIA (MR) 20.1 Uma série de Guias ISO relativa aos materiais de referência está disponibilizada (Ref C1-C6). 20.2 Materiais de referência e materiais de referência certificados são deinidos na seção 3. Eles são usados para calibração, validação de metodologias, veriicação de medições, avaliação da Incerteza de Medição e para ins de treinamento. 20.3 Materiais de referência podem assumir uma variedade de formas, incluindo MRs de substâncias puras, MRs de matrizes e soluções ou misturas. Os itens abaixo são exemplos de materiais de referência: • cloreto de sódio 95% puro; • uma solução aquosa contendo 1% (m/v) de sulfato de cobre (II) e 2% (m/v) de cloreto de magnésio; • um polímero em pó com uma faixa especíica de distribuição de peso molecular; • um sólido cristalino fundindo na faixa de 150-151º C; • leite em pó contendo uma quantidade conhecida de vitamina C. 20.4 Para muitos tipos de análises, a calibração pode ser realizada utilizando-se materiais de referência preparados no laboratório, a partir de produtos químicos de pureza e composição conhecidas. Alguns produtos químicos podem ser adquiridos com um certiicado do fabricante declarando a pureza do material. Alternativamente, produtos químicos com pureza declarada, mas não certiicada, podem ser adquiridos de fornecedores idôneos. Qualquer que seja a fonte, é responsabilidade do usuário estabelecer que a qualidade de tais materiais seja satisfatória. Algumas vezes, ensaios adicionais precisarão ser realizados pelo laboratório. Normalmente, um novo lote de um produto químico deve ser confronIAL - 989 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital tado com o lote anterior. De maneira ideal, todos os produtos químicos a serem usados para ins de material de referência devem ser adquiridos de fabricantes com sistemas comprovados de GQ. Contudo, um sistema de GQ não garante automaticamente a qualidade dos produtos do fabricante, e os laboratórios devem tomar todas as medidas razoáveis para conirmar a qualidade de materiais críticos. O controle de impurezas é importante, especialmente para a análise de traços (residual), onde eles podem causar interferências. Atenção especial deve ser dada às recomendações dos fabricantes sobre a armazenagem e prazo de validade. Além disso, é necessário cautela, já que os fornecedores nem sempre disponibilizam informações sobre todas as impurezas. 20.5 O uso de materiais de referência apropriados pode propiciar rastreabilidade essencial e permitir que os analistas demonstrem a precisão dos resultados, calibrem equipamentos e métodos, monitorem o desempenho do laboratório e validem métodos, permitindo, ainda, a comparação de métodos através do uso como padrões de transferência (de medida). O seu uso é fortemente encorajado, sempre que apropriado. 20.6 A incerteza da pureza de um material de referência de substância pura precisa ser considerada em relação à incerteza associada a outros aspectos do método. De maneira ideal, a incerteza associada a um material de referência, usado para ins de calibração, não deve contribuir em mais de um terço (1/3) da incerteza de medição global. 20.7 A composição do material de referência certiicado deve ser a mais próxima possível da composição das amostras. Quando existirem interferências de matriz, um método deve ser idealmente validado usando-se um material de referência de matriz combinada, certiicado de uma maneira coniável. Se um material deste tipo não estiver disponível, pode ser aceito o uso de uma amostra fortiicada com o material de referência. 20.8 É importante que qualquer material de referência certiicado usado tenha sido produzido e caracterizado de uma maneira tecnicamente válida. Usuários de MRCs devem estar cientes de que nem todos os materiais são validados com o mesmo nível de rigor. Detalhes de experimentos de homogeneidade, ensaios de estabilidade, os métodos usados na certiicação e as incertezas e variações nos valores declarados de analitos, são normalmente fornecidos pelo produtor e devem ser usados para avaliar a procedência dos MRCs. O material deve vir acompanhado de um certiicado, que inclua uma estimativa da incerteza do 990 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica valor certiicado (ver seção 16). A Guia ISO 34 (Ref C5) e um Guia ILAC (Ref B15) lidam com critérios para a competência dos provedores de materiais de referência. Esses guias podem constituir a base para uma futura avaliação de provedores de materiais de referência. 20.9 Materiais de referência e materiais de referência certiicados devem ser claramente rotulados, de forma que sejam identiicados sem ambigüidades e relacionados com os respectivos certiicados ou outra documentação anexa. Informações devem ser disponibilizadas, indicando o prazo de validade, condições de armazenamento, aplicabilidade e restrições de uso. Materiais de referência preparados dentro do laboratório, p. ex. como soluções, devem ser tratados como reagentes para ins de rotulagem, ver seção 14.2. 20.10 Materiais de referência e padrões de medição devem ser manipulados de forma a protegê-los de contaminação ou degradação. Procedimentos para treinamento do pessoal devem reletir estes requisitos. 21. CONTROLE DE QUALIDADE E ENSAIOS DE PROFICIÊNCIA 21.1 O signiicado dos termos `controle de qualidade´ e `Garantia da Qualidade (GQ)´ varia, muitas vezes, conforme o contexto. Em termos práticos, GQ se refere às medidas globais tomadas pelo laboratório para regulamentar a qualidade, enquanto que controle de qualidade descreve as medidas individuais que dizem respeito à qualidade de amostras individuais ou lotes de amostras. 21.2 Como parte de seus sistemas da qualidade e para monitorar o desempenho analítico diário e lote a lote, os laboratórios devem operar um nível apropriado de veriicações de controle interno da qualidade (CQ) e participar, sempre que possível, de rodadas de ensaios de proiciência apropriados (CQ externo). O nível e tipo de CQ irão depender do estado crítico, natureza da análise, freqüência da análise, tamanho do lote, grau de automação, e da diiculdade e coniabilidade dos ensaios. 21.3 CQ Interno: Este pode assumir uma variedade de formas, incluindo o uso de: brancos; padrões de medida; amostras fortiicadas; amostras cegas; análises de replicatas e amostras de CQ. O uso de gráicos de controle é recomendado, particularmente para o monitoramento das amostras de controle de CQ (Ref C20-22). IAL - 991 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 21.3.1 O nível de CQ adotado deve ser comprovadamente suiciente para assegurar a validade dos resultados. Diferentes tipos de controle de qualidade podem ser usados para monitorar diferentes tipos de variações no processo. Amostras de CQ, analisadas em intervalos no lote de amostras, irão indicar a dispersão do sistema; o uso de vários tipos de branco irá indicar quais são as contribuições do instrumento, além daquelas atribuídas ao analito; análises em duplicata fornecem uma veriicação da repetitividade, conforme ocorre com o uso de amostras cegas. 21.3.2 As amostras de CQ são amostras típicas, suicientemente estáveis e disponíveis em quantidades suicientes para serem disponibilizadas para análise durante um período prolongado de tempo. Ao longo desse período, a variação aleatória no desempenho do processo analítico pode ser acompanhada pelo monitoramento do resultado obtido na análise da amostra de CQ, normalmente através de sua inclusão num gráico de controle. Uma vez que o resultado da amostra de CQ seja aceitável, é provável que os resultados das amostras, do mesmo lote em que foi incluída a amostra de CQ, possam ser considerados coniáveis. A aceitabilidade do resultado obtido com a amostra de CQ deve ser veriicada o mais breve possível no processo analítico, a im de que, no caso de falha do sistema, o menor esforço possível tenha sido gasto na análise de amostras não coniáveis. 21.3.3 É responsabilidade do analista deinir e justiicar um nível apropriado de controle de qualidade, baseado numa avaliação de risco, que leve em conta a coniabilidade do método, e o estado crítico do trabalho. É amplamente aceito que em análises de rotina, um nível de CQ interno de 5% seja deinido como razoável, isto é, 1 em cada 20 amostras analisadas deve ser uma amostra de CQ. Contudo, para métodos de rotina robustos, com alta quantidade de amostras, um menor nível de CQ pode ser razoável. Para procedimentos mais complexos, um nível de 20% não é incomum e, em certas ocasiões, mesmo 50% pode ser requerido. Para análises realizadas com pouca freqüência, uma validação completa do sistema deve ser realizada em cada ocasião. Isto pode envolver tipicamente o uso de um material de referência contendo uma concentração certiicada ou conhecida de analito, seguido por análises de replicatas da amostra e da amostra fortiicada (uma amostra à qual uma quantidade conhecida do analito foi deliberadamente adicionada). Análises realizadas com mais freqüência devem ser submetidas a procedimentos sistemáticos de CQ, incorporando o uso de gráicos de controle e amostras de veriicação. 992 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 21.4 Ensaios de proficiência (CQ Externo): Uma das melhores maneiras para um laboratório analítico monitorar seu desempenho, com relação a seus próprios requisitos e às normas de outros laboratórios, é participar regularmente de rodadas de ensaios de proiciência (Ref C7). Ensaios de proiciência ajudam a destacar não só o desempenho da repetitividade e reprodutibilidade entre laboratórios, mas também a existência de erros sistemáticos, isto é, a tendência. Ensaios de proiciência e outros tipos de intercomparações são aceitos como meios importantes de monitoramento da qualidade em níveis nacional e internacional. 21.5 Os organismos de acreditação também reconhecem o benefício desse tipo de ensaios como evidência objetiva da competência do laboratório e da eiciência do processo de avaliação em si. Quando possível, os laboratórios devem selecionar rodadas de Ensaios de Proiciência, que operem de acordo com as boas práticas internacionais (Ref C7) e tenham transparência evidente da qualidade, p. ex. pela acreditação ou outra inspeção de parceiros (Ref B16). Laboratórios acreditados são normalmente solicitados à participar em ensaios de proiciência, (quando existirem rodadas apropriadas), como parte integrante de seus protocolos de GQ. É importante monitorar os resultados dos ensaios de proiciência, como um meio de veriicação de desempenho e tomada de ações corretivas, quando necessário. 22. COMPUTADORES E SISTEMAS CONTROLADOS POR COMPUTADOR 22.1 Em laboratórios de ensaios químicos, computadores possuem uma ampla variedade de usos, incluindo: • controle de condições ambientais críticas; • monitoramento e controle do inventário; • programação de calibrações e manutenções; • controle de estoque de reagentes e padrões de medida; • projeto e desempenho de experimentos estatísticos; • programação de amostras e monitoração da produção do trabalho; • geração de gráicos de controle; • monitoramento de procedimentos de ensaio; • controle da instrumentação automatizada; • captura, armazenagem, recuperação, processamento de dados, manual ou automaticamente; • correspondência das amostras com os dados em biblioteca; • geração de relatórios de ensaio, IAL - 993 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital • processamento de texto; • comunicação. 22.2 Interfaces e cabos fornecem conexões físicas entre diferentes partes do computador ou entre diferentes computadores. É importante que as interfaces e cabos sejam escolhidos para se adequarem à aplicação especíica, visto que eles podem afetar seriamente a velocidade e a qualidade da transferência dos dados. 22.3 O ambiente onde se processam ensaios químicos cria riscos especíicos para a operação de computadores e armazenagem das mídias de computador. Recomendações normalmente podem ser encontradas nos manuais de operação, porém, cuidados especiais devem ser adotados visando evitar danos provocados por produtos químicos, contaminação microbiológica ou por poeira, aquecimento, umidade, e campos magnéticos. 22.4 A validação inicial deve veriicar o maior número possível de aspectos da operação de um computador. Veriicações similares devem ser realizadas se o uso do computador for alterado, ou após manutenção, ou revisão do software. Quando um computador for utilizado para a coleta e processamento de dados associados a ensaios químicos, para validação desta função, é geralmente suiciente assumir sua correta operação se o computador produzir respostas previstas para a entrada de parâmetros conhecidos. Programas de computador que efetuam cálculos podem ser validados pela comparação com resultados calculados manualmente. Deve ser notado que algumas falhas poderão ocorrer somente quando um grupo particular de parâmetros for inserido. Em ensaios químicos, veriicações adequadas sobre as funções de coleta e manipulação de dados podem ser feitas utilizando-se um Material de Referência Certiicado para a validação inicial, usando-se, então, um padrão secundário de medida como material de controle de qualidade para veriicações repetitivas regulares. Quaisquer recomendações feitas pelo fabricante devem ser levadas em consideração. O procedimento de validação usado para um sistema em particular e quaisquer dados registrados durante a validação devem ser documentados. Pode ser difícil validar esses sistemas de forma isolada do instrumento analítico que produz o sinal original. Normalmente, todo o sistema é validado de uma só vez, através do uso de padrões de medida química ou materiais de referência. Essa validação é normalmente aceitável. É conveniente ilustrar a validação usando-se exemplos de aplicações típicas: 22.4.1 Programas processadores de texto são amplamente usados em laboratórios 994 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica para gerar uma ampla variedade de documentação. O laboratório deve assegurar que o uso de programas processadores de texto seja suicientemente controlado a im de prevenir a produção de relatórios não-autorizados ou outros documentos. Em casos mais simples, onde o computador representa um pouco mais do que uma máquina de escrever eletrônica, a validação é alcançada veriicando-se manualmente as cópias impressas. Sistemas mais soisticados lêem e processam dados para produzir automaticamente relatórios em formatos predeterminados. Esses sistemas necessitarão de veriicações adicionais. 22.4.2 Instrumentos controlados por microprocessador terão normalmente uma rotina de veriicação automática que é ativada quando o instrumento é ligado, e deverá incluir o reconhecimento e veriicação de todos os equipamentos periféricos. Muitas vezes o software não é acessível. Sob muitas circunstâncias, a validação pode ser realizada pelo teste dos vários aspectos de funcionamento do instrumento, usando-se parâmetros conhecidos, p. ex: pelo ensaio de materiais de referência, padrões de medida física ou química, ou amostras de controle de qualidade. 22.4.3 Sistemas de manipulação ou processamento de dados, sistemas de integração. Antes de poder ser processado, o sinal de saída do instrumento analítico precisará, normalmente, ser convertido em um sinal digital, usando-se um conversor analógico/digital. Os dados digitalizados são então convertidos em um sinal reconhecível (números, picos, espectros, de acordo com o sistema) pelo algoritmo do software. O algoritmo toma várias decisões (tal como decidir onde os picos começam e terminam, ou quando um número deve ser arredondado para cima ou para baixo), de acordo com as instruções programadas. O algoritmo é uma fonte comum de desempenho imprevisto, e a validação deve testar a lógica por trás das decisões tomadas pelo algoritmo. 22.4.4 Sistema automatizado controlado por computador. Sistema que pode envolver um ou mais dos exemplos anteriores, operado de forma simultânea ou numa seqüência de tempo controlada. Estes sistemas normalmente serão validados pela veriicação da operação satisfatória (incluindo desempenho em circunstâncias extremas) e estabelecimento da coniabilidade do sistema antes que seja permitido que ele funcione sem acompanhamento. A validação deve consistir de uma validação de componentes individuais, além de uma veriicação global sobre o diálogo entre componentes individuais e o computador de controle. Uma avaliação deve ser feita sobre as possíveis causas de mau funcionamento do sistema. Uma consideração importante é que o computador, interfaces e cabos IAL - 995 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital de conexão tenham suiciente capacidade para as tarefas requeridas. Se qualquer parte do sistema for sobrecarregada, sua operação será retardada, havendo a possibilidade de perda de dados. Isto pode ter sérias conseqüências quando as operações incluírem rotinas sincronizadas. Quando possível, o software de controle deve ser ajustado para reconhecer e destacar qualquer mau funcionamento e identiicar os dados associados. O uso de amostras de controle de qualidade e padrões analisados em intervalos nos lotes de amostras deve ser então suiciente para monitorar o correto desempenho em bases diárias. Rotinas de cálculo podem ser veriicadas por meio de testes com valores de parâmetros conhecidos. A transferência eletrônica de dados deve ser veriicada para assegurar que nenhuma degradação tenha ocorrido durante a transmissão. Isto pode ser realizado no computador com o uso de ‘arquivos de veriicação’, mas, sempre que praticável, a transmissão deve ser resguardada por uma cópia impressa dos dados. 22.4.5 996 - IAL Sistemas de Gerenciamento de Informações do Laboratório (SGIL). Estes sistemas são cada vez mais populares como um meio de gerenciamento das atividades dos laboratórios. Um SGIL é um sistema baseado em computador com software que permite o confronto eletrônico, cálculo e disseminação de dados, frequentemente recebidos diretamente dos instrumentos analíticos. Ele incorpora processamento de texto, banco de dados, planilhas eletrônicas e capacidade de processamento de dados, e pode executar uma variedade de funções, incluindo: registro e rastreamento de amostras; atribuição e alocação de ensaios; geração de folhas de trabalho; processamento dos dados capturados; controle de qualidade; controle inanceiro; e geração de relatórios. A operação do SGIL pode estar limitada ao próprio laboratório, ou pode fazer parte de um amplo sistema de computação corporativo. As informações podem ser inseridas manualmente ou descarregadas diretamente da instrumentação analítica, ou de outros dispositivos eletrônicos, tais como leitores de código de barras. As informações fornecidas pelo sistema podem ser geradas em meio eletrônico ou por cópias impressas. As saídas eletrônicas podem se constituir de dados brutos ou processados, gravados em outros computadores dentro da mesma organização, ou remotos, transmitidos através de um modem ou por correio eletrônico. Da mesma forma, as informações podem ser descarregadas para um disco de armazenamento eletrônico. Quando os dados são transmitidos de um sistema para outro, pode haver o risco da corrupção de dados devido à incompatibilidades dos sistemas ou da necessidade de reformatar as informações. Um sistema bem projetado permite que altos níveis de GQ sejam atingidos, desde o ponto de entrada de amostras até a produção do relatório inal. Requisitos de validação especíicos incluem o gerenciamento do acesso a várias funções, os passos de auditoria Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica para catalogar alterações e o gerenciamento de arquivos. Quando os dados forem transmitidos eletronicamente será necessário incorporar veriicações de segurança para proteção contra corrupção de dados e acesso não-autorizado. 23. AUDITORIA DO LABORATÓRIO E ANÁLISE CRÍTICA 23.1 Ver seção 3.6 acerca da terminologia aplicada. 23.2 Um aspecto importante da gestão da qualidade é o reexame periódico do sistema da qualidade pela própria gerência do laboratório. Em geral, todos os aspectos do sistema da qualidade devem ser examinados pelo menos uma vez por ano. O sistema deve ser examinado de duas maneiras. Em primeiro lugar, ele deve ser examinado para assegurar que esteja suicientemente bem documentado para permitir uma implementação adequada e consistente, e que o pessoal esteja realmente seguindo o sistema descrito. Este exame é normalmente conhecido como auditoria (em oposição à avaliação ou auditoria externa conduzida por órgãos de acreditação ou certiicação). Em segundo lugar, o sistema deve ser examinado a im de veriicar se ele atende aos requisitos do laboratório, de seus clientes e, se apropriado, do padrão de gestão da qualidade. Ao longo do tempo, as necessidades do laboratório e de seus clientes irão se modiicar e o sistema da qualidade deve evoluir para continuar a atender seus objetivos. Este segundo tipo de exame é normalmente conhecido como análise crítica, e deve ser realizado pelo menos anualmente. Esta análise é realizada pelo nível gerencial do laboratório e utiliza informações de várias fontes, incluindo resultados de auditorias internas, avaliações externas, participação em ensaios de proiciência, estudos do controle interno da qualidade, tendências de mercado, reclamações e elogios de clientes, etc. 23.3 O programa de auditoria e análise crítica é normalmente coordenado pelo gerente da qualidade do laboratório, que é responsável por assegurar que os auditores tenham o treinamento correto, orientação e autoridade necessária para condução da auditoria. As auditorias são normalmente realizadas por pessoal do laboratório que trabalha fora da área em exame. Isto, é claro, nem sempre é possível onde o grupo de trabalho é reduzido. 23.4 As auditorias podem ser realizadas de duas maneiras básicas. Na auditoria horizontal, o auditor irá examinar em detalhes aspectos individuais do sistema da qualidade, por exemplo, calibração ou relatórios. Na auditoria vertical, o auditor irá selecionar uma amostra e acompanhar seu andamento no laboratório, desde o recebimento até a disposição inal, examinando todos os aspectos do IAL - 997 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital sistema da qualidade relacionados ao seu processamento. 23.5 Uma lista de veriicação, detalhando os aspectos de um laboratório químico que devem ser examinados durante uma auditoria da qualidade, se encontra listada no Apêndice A deste Guia. 23.6 A análise-crítica pela gerência deve ser realizada em intervalos regulares. Uma vez por ano é normalmente suiciente, muito embora, para laboratórios com um amplo escopo de acreditação, pode ser necessário dividir a análise crítica em módulos distintos, que podem ser examinados durante o curso de um ano. Os assuntos abordados na análise crítica anual devem incluir uma avaliação do sistema da qualidade e questões que afetem a qualidade analítica, auditorias internas, ações corretivas e preventivas, feedback e reclamações de clientes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS A seção a seguir apresenta Referências úteis (Subseções A, B, C — estas são referidas no texto — endereços de Websites (D), e a Bibliograia (E)). A. GUIAS CITAC e EURACHEM (disponíveis em CITAC www.citac.ws e EURACHEM www.eurachem.org) 1. Quality Assurance for Research and Development and Non-Routine Analysis: 1998 (CITAC/EURACHEM) 2. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement: 2000 (CITAC/EURACHEM) (ver também site - Ref D12) 3. he Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics: 1998 (EURACHEM) 4. Harmonised Guidelines for the Use of Recovery Information in Analytical Measurement: 1998 (EURACHEM/IUPAC/ISO/A.O.A.C.I) Selection, Use & Interpretation of Proiciency Testing (PT) Schemes by Laboratories: 2000 (EURACHEM) 5. 6. CITAC Policy Statement on Traceability in Chemical Measurement: 2000 998 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 7. CITAC/EURACHEM Guide on Traceability in Chemical Measurements: 2002 (em preparação) B. REFERÊNCIAS BÁSICAS 1. ISO/IEC 17025:1999 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories 2. ISO 9000:2000 Quality Management Systems - Fundamentals & Vocabulary 3. OECD Principles of Good Laboratory Practice: 1998 (Code: ENV/MC/ CHEM(98)17 download: http://www1.oecd.org/ehs/ehsmono/01E88455.pdf) 4. ISO/IEC Guide 2:1996 Standardization and related activities - General vocabulary (currently under revision as ISO 17000) 5. ISO 9001:2000 Quality Management Systems - Requirements 6. International vocabulary of basic and general terms in metrology (VIM) - 2nd edition 1993 (ISO/BIPM/IEC/IFCC/IUPAC/IUPAP/OIML) 7. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (GUM), ISO Geneva Switzerland, 1995. 8. Meeting the Measurement Uncertainty and Traceability Requirements of ISO/ IEC 17025 in Chemical Analysis” - B King, Fresenius Journal, 2001 9. he selection and use of reference materials - A basic guide for laboratories and accreditation bodies - draft EEEE/RM 2002 - prepared by B King 2000 10. Position of third party quality assessment of reference materials and their production EEEE/RM/069 rev 1: Draft 2001 11. APLAC Policy and Guidance on the Estimation of Uncertainty of Measurement in Testing – Draft April 2002 12. ILAC P10: 2002 ILAC Policy on Traceability of Measurements Results 13. ILAC G8: 1996 Guidelines on Assessment and Reporting of Compliance with IAL - 999 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Speciication 14. ILAC G9: 1996 Guidelines for the Selection and Use of Certiied Reference Materials 15. ILAC G12: 2000 Guidelines for the Requirements for the Competence of Reference Material Producers ILAC G13: 2000 Guidelines for the Requirements for the Competence of Providers of Proiciency Testing Schemes 16. 17. ILAC G15: 2001 Guidance for Accreditation to ISO/IEC 17025 18. ILAC G17: 2002 Guidance for Introducing the Concept of Uncertainty of Measurement in Testing in Association with the Application of the Standard ISO/IEC 17025 Nota: Outras Diretrizes produzidas por Órgãos Regionais de Acreditação são também relevantes aqui (ver endereços de Websites na Seção D, nºs 7, 8 e 9 abaixo). Além disto, a maioria dos órgãos nacionais de acreditação publicam diretrizes fundamentando seus requisitos (normalmente baseados em normas ISO). C. OUTRAS REFERÊNCIAS (Guias e Normas ISO) 1. ISO Guide 30:1992 Terms and deinitions used in connection with reference materials 2. ISO Guide 31:2000 Reference materials -- Contents of certiicates and labels 3. ISO Guide 32:1997 Calibration in analytical chemistry and use of certiied reference materials 4. ISO Guide 33:2000 Uses of certiied reference materials 5. ISO Guide 34:2000 General requirements for the competence of reference material producers ISO Guide 35:1989 (under revision) Certiication of reference materials -- General and statistical principles 6. 7. ISO/IEC Guide 43:1997 Proiciency testing by interlaboratory comparisons - Part 1: Development and operation of proiciency testing schemes and Part 2: Selection 1000 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica and use of proiciency testing schemes by laboratory accreditation bodies 8. ISO/IEC Guide 58: 1993 Calibration and testing laboratory accreditation systems – general requirements for operation and recognition. (To be replaced by ISO/IEC 17011 General requirements for bodies providing assessment and accreditation) 9. ISO/IEC Guide 62:1996 General requirements for bodies operating assessment and certiication/registration of quality systems 10. ISO 78-2:1999 Chemistry -- Layouts for standards -- Part 2: Methods of chemical analysis 11. ISO/DIS 10576-1:2001 Statistical Methods - Guidelines for the evaluation with speciied requirements Pt 1. General principles 12. ISO 3534 Statistics -- Vocabulary and symbols -- Parts 1, 2 and 3 (1999) 13. ISO/DTS 21748-2002 (under preparation) Guide to the use of repeatability and reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation. 14. ISO 5725-1:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 1: General principles and deinitions ISO 5725-1:1994/Cor 1:1998 15. ISO 5725-2:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method 16. ISO 5725-3:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard measurement method 17. ISO 5725-4:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method ISO 5725-5:1998 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results -- Part 5: Alternative methods for the determination of the precision of a standard measurement method 18. 19. ISO 5725-6:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and IAL - 1001 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital results -- Part 6: Use in practice of accuracy values 20. ISO 7870:1993 Control charts - General guide and introduction 21. ISO 7966:1993 Acceptance control charts 22. ISO 8258:1991 Shewhart control charts. D. ENDEREÇOS DE WEBSITES ÚTEIS 1. CITAC - www.citac.ws 2. EURACHEM - www.eurachem.org 3. ISO - www.iso.ch 4. (ISO)REMCO - www.iso.org/remco 5. COMAR (Base de Dados dos Materiais de Referência - www.comar.bam.de 6. A.O.A.C. - www.A.O.A.C..org 7. ILAC - www.ilac.org 8. APLAC - www.ianz.govt.nz/aplac 9. EA - www.european-accreditation.org 10. BIPM - www.bipm.fr 11. OECD - www.oecd.org 12. www.mutraining.com (site baseado no treinamento sobre credenciamento e incerteza de medida) www.measurementuncertainty.org (fórum/máquina de busca MU – vinculada à Ref A2) 13 E. BIBLIOGRAFIA 1002 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 1. A.O.A.C. International – ISO 17025 and the Laboratory – An Introduction to Laboratory Accreditation: 2000 (A.O.A.C. Internacional – ISO 17025 e o Laboratório – Uma Introdução a Acreditação de Laboratórios: 2000) 2. A.O.A.C. International – Quality Assurance Principles for Analytical Laboratories – 3rd Edition 2000 – F M Garield, E Klesten, J Husch ISBN-0-935584-70-6 (A.O.A.C. Internacional – Princípios da Garantia da Qualidade para Laboratórios Analíticos – 3ª Edição 2000 – F M Garield, E Klesten, J Husch ISBN-0-93558470-6) Crosby, Neil T; Patel, Indu, General principles of good sampling practice, Cambridge: Royal Society of Chemistry, 1995 (Crosby, Neil T; Patel, Indu, Princípios gerais de boas práticas de amostragem, Cambridge: Sociedade Real de Química, 1995) 3. 4. Enell, J. W., “Which Sampling Plan Should I Choose?”, Journal of Quality Technology 1984, 16(3), 168-171 (Enell, J. W., “Que Plano de Amostragem Devo Escolher?”, Jornal de Tecnologia da Qualidade 1984, 16(3), 168-171) 5. Garield, F. M., “Sampling in the Analytical Scheme”, J. – Assoc. Of. Anal. Chem. 1989, 72(3), 405-411 (Garield, F. M., “Amostragem no Esquema Analítico”, J. – Assoc. Proissional de Quím. Anal. 1989, 72(3), 405-411) 6. Gy, Pierre, Sampling for analytical purposes, Chichester: Wiley, 1998 (Gy, Pierre, Amostragem para ins analíticos, Chichester: Wiley, 1998) 7. Horwitz, W., “Nomenclature for sampling in Analytical Chemistry”, IUPAC, Pure Appl. Chem. 1990, 62(6), 1193-1208 (Horwitz, W., “Nomenclatura para amostragem em Química Analítica”, IUPAC, Quím. Pura Apl. 1990, 62(6), 1193-1208) 8. Horwitz, W., “Problems of Samplings and Analytical Methods”, J. – Assoc. Of. Anal. Chem. 1976, 59(6), 1197-1203 (Horwitz, W., “Problemas de Amostragens e Métodos Analíticos”, J. – Assoc. Proissional de Quím. Anal. 1976, 59(6), 1197-1203) 9. Horwitz, W., “Design, conduct and interpretation of method performance stuIAL - 1003 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital dies”, IUPAC Protocol, 1994 (Horwitz, W., “Projeto, condução e interpretação dos estudos de desempenho de métodos”, Protocolo IUPAC, 1994) 10. Kateman, G., Buydens, L., Quality Control in Analytical Chemistry, 2nd ed. New York: Wiley, 1993 (Kateman, G., Buydens, L., Controle de Qualidade em Química Analítica, 2ª ed. New York: Wiley, 1993) 11. Keith, L. H., Environmental Sampling and Analysis, A Practical Guide, Lewis Publishers, Chelsea, MI, 1991 (Keith, L. H., Amostragem e Análise Ambiental, Um Guia Prático, Lewis Publishers, Chelsea, MI, 1991) 12. Keith, L. H., Principles of Environmental Sampling, ACS, Washington DC, 1988 (Keith, L. H., Princípios da Amostragem Ambiental, ACS, Washington DC, 1988) 13. Keith, Lawrence H (Ed), Principles of environmental sampling, 2nd ed, Washington DC, American Chemical Society 1996 (Keith, Lawrence H (Ed), Princípios da amostragem ambiental, 2ª ed, Washington DC, Sociedade Americana de Química1996) 14. Kratochvil, B., Wasllace, D., and Taylor, J. K., “Sampling for Chemical Analysis”, Anal. Chem. 1984, 56(5), 113R-129R (Kratochvil, B., Wasllace, D., e Taylor, J. K., “Amostragem para Análise Química”, Quím. Anal. 1984, 56(5), 113R-129R) 15. Miller, J. C.; Miller, J. N. Statistics for Analytical Chemistry, 4th ed Ellis Horwood 1998 (Miller, J. C.; Miller, J. N. Estatística para Química Analítica, 4ª ed. Ellis Horwood 1998) 16. Prichard, E., Analytical Measurement Terminology – (UK´s Valid Analytical Measurement Program, LGC Ltd) ISBN 0-85404-443-4, 2000 (Prichard, E., Terminologia de Medição Analítica – (Programa de Medição Analítica Válido no RU, LGC Ltd) ISBN 0-85404-443-4, 2000) 1004 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 17. Prichard, E., Quality in the Analytical Chemistry Laboratory, ACOL, Wiley 1997 (Prichard, E., Qualidade no Laboratório de Química Analítica, ACOL, Wiley 1997) 18. Stoeppler, Marcus (Ed), Sampling and sample preparation: practical guide for analytical chemists; Berlin: Springer Verlag, 1997 (Stoeppler, Marcus (Ed), Amostragem e preparação de amostras: guia prático para químicos analíticos; Berlim: Springer Verlag, 1997) 19. Taylor, B. N., Kuyatt, C. E., Guidelines for evaluating and expressing uncertainty in NIST measurement results, NIST technical note 1297, 1994, National Institute of Standards and Technology (Taylor, B. N., Kuyatt, C. E., Diretrizes para avaliação e divulgação da incerteza em resultados de medidas NIST, nota técnica NIST 1297, 1994, Instituto Nacional de Normas e Tecnologia) 20. Taylor, J. K., “Quality Assurance of Chemical Measurements”, Lewis Publishers, Michigan, 1987 (Taylor, J. K., “Garantia da Qualidade de Medições Químicas”, Lewis Publishers, Michigan, 1987) 21. UK DTI VAM Programme – General Guidelines for use with a protocol for QA of Trace Analysis 1998 (Programa UK DTI VAM – Diretrizes Gerais para uso com um protocolo para GQ de Análise Residual 1998) Youden, W. J., and Steiner, E. H., Statistical manual of the Association of Oicial Analytical Chemists. Statistical techniques for collaborative tests. Planning and analysis of results of collaborative tests. Washington DC: A.O.A.C., 1975 (Youden, W. J., e Steiner, E. H., Manual estatístico da Associação Proissional de Químicos Analíticos. Técnicas estatísticas para ensaios cooperativos. Planejamento e análise de resultados dos ensaios cooperativos. Washington DC: A.O.A.C., 1975) SIGLAS 22. Seguem alguns acrônimos comuns: IAL - 1005 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital A.O.A.C. – Association of Oicial Analytical Chemists (USA) APLAC – Asia-Paciic Laboratory Accreditation Cooperation BIPM – International Bureau of Weights and Measures CCQM -Consultative Committee for Amount of Substance CITAC – Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry EA – European Cooperation for Accreditation IEC – International Electrotechnical Commission ILAC – International Laboratory Accreditation ISO – International Organization for Standardization ISO/REMCO – International Organization for Standardization, Committee on Reference Materials IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry JCTLM – Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine OECD – Organization for Economic Cooperation and Development OIML - International Organization on Legal Metrology APÊNDICE A Auditoria da Qualidade – Áreas de particular importância em um laboratório químico. 1. Pessoal i) O pessoal possui a combinação adequada de instrução, qualiicações acadêmicas ou vocacionais, experiência e treinamento prático para o serviço desempenhado. ii) O treinamento prático é realizado segundo critérios estabelecidos, os quais, sempre que possível, são objetivos. São mantidos registros atualizados dos treinamentos. 1006 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica iii) Os ensaios somente são realizados por analistas autorizados. iv) O desempenho do pessoal realizando as análises é observado pelo auditor. 2. Ambiente i) O ambiente do laboratório é adequado para o trabalho realizado. ii) As instalações e utilizades do laboratório são adequados para o trabalho realizado. iii) Existe separação adequada entre trabalhos potencialmente conlitantes. iv) As áreas do laboratório são suicientemente limpas e organizadas, para garantir que a qualidade do trabalho realizado não seja comprometida. v) Existe separação adequada na recepção de amostras, preparação, depuração, e áreas de medição, para garantir que a qualidade do trabalho realizado não seja comprometida. vi) O cumprimento dos regulamentos de segurança é consistente com os requisitos da norma de gerenciamento da qualidade. 3. Equipamento i) O equipamento em uso é adequado a sua inalidade. ii) Os principais instrumentos são corretamente cuidados, sendo mantidos registros de sua manutenção. iii) Instruções adequadas para o uso de equipamentos estão disponibilizadas. iv) Equipamentos críticos, p. ex: balanças, termômetros, vidrarias, cronômetros, pipetas etc. são individualmente identiicados, corretamente calibrados (com rastreabilidade adequada), os certiicados correspondentes ou outros registros demonstrando a rastreabilidade a padrões de medida nacionais de medição estão disponíveis. v) O equipamento calibrado é adequadamente etiquetado, ou de outra forma identiicado, para assegurar que ele não seja confundido com equipamento nãocalibrado, e para garantir que seu estado de calibração ique claro ao usuário. IAL - 1007 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital vi) Veriicações de desempenho e procedimentos de calibração dos instrumentos são documentados e disponibilizados aos usuários. vii) Procedimentos de calibração e veriicações de desempenho de instrumentos são realizados em intervalos apropriados e mostram que a calibração é mantida e o desempenho diário é aceitável. Ações corretivas apropriadas são tomadas, quando necessário. viii) Registros de calibração, veriicações de desempenho e ações corretivas são mantidas. 4. 5. Métodos e Procedimentos i) Métodos desenvolvidos internamente são plenamente documentados, adequadamente validados e autorizados para uso. ii) Alterações de métodos são adequadamente autorizadas. iii) Cópias de métodos publicados e oiciais são disponibilizadas. iv) A versão mais atualizada do método é disponibilizada ao analista. v) As análises (são observadas para veriicar se) seguem os métodos especiicados. vi) Os métodos têm um nível apropriado de orientações sobre a calibração e o controle de qualidade. vii) A incerteza foi estimada. Padrões de Medidas Química e Física, Materiais de Referência Certificados e Reagentes. i) ii) iii) 1008 - IAL Os padrões de medida requeridos para os ensaios são prontamente disponibilizados. Os padrões de medida são certiicados, ou são os “melhores” disponíveis. A preparação dos padrões de trabalho (padrões secundários) e dos reagentes é documentada. Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 6. 7. 8. iv) Padrões de medida, materiais de referência e reagentes são corretamente identiicados e armazenados. Onde apropriado, são aplicadas (anotadas) as datas de “abertura” e de validade. v) Novos lotes de padrões de medida e reagentes críticos ao desempenho do método são confrontados com lotes antigos (anteriores) antes do uso. vi) Materiais com a correta especiicação estão sendo usados nos ensaios. vii) Quando padrões de medida ou materiais de referência forem certiicados, cópias do certiicado são disponibilizadas para inspeção. Controle de Qualidade i) Existe um nível apropriado de controle de qualidade para cada ensaio. ii) Quando gráicos de controle são usados, o desempenho é mantido dentro de critérios aceitáveis. iii) Amostras veriicadoras do CQ são ensaiadas por procedimentos deinidos, na freqüência requerida, e existe o registro atualizado dos resultados e medidas tomadas quando os resultados excedem os limites de ação. iv) Os resultados de reanálises aleatórias de amostras apresentam uma medida de concordância aceitável em relação aos resultados das análises originais. v) Quando apropriado, o desempenho em esquemas de ensaios de proiciência e/ou comparações interlaboratoriais é satisfatório e não destacou quaisquer problemas ou problemas em potencial. vi) Existe um sistema eicaz para vinculação do desempenho nos ensaios de proiciência com o controle de qualidade diário. Controle das Amostras i) Existe um sistema eicaz documentado para o recebimento de amostras, relacionando essas amostras às análises requisitadas, mostrando o andamento da análise, emissão de relatório, e destinação inal da amostra. ii) As amostras são corretamente identiicadas e armazenadas. Registros IAL - 1009 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 9. i) Cadernos de anotações/folhas de trabalho (planilhas) ou outros registros apresentam a data do ensaio, analista, analito(s), detalhes da amostra, observações do ensaio, controle de qualidade, todos os cálculos brutos, quaisquer descrições de instrumentos relevantes, dados brutos, e dados de calibração relevantes. ii) Cadernos de anotações/planilhas são indeléveis, sendo os erros riscados ao invés de apagados ou ocultados, e os registros são assinados pelos analistas. iii) Quando um erro for corrigido a alteração é rastreável à pessoa que fez a correção. iv) O laboratório possui e usa procedimentos para veriicar a transferência de dados e cálculos realizados. Relatórios de Ensaio i) 10. As informações apresentadas em relatórios são consistentes com os requisitos da norma, do cliente, e reletem quaisquer condições estipuladas no método documentado. Diversos i) Procedimentos documentados estão implementados para lidar com reclamações e dúvidas, e falhas do sistema. ii) Existe evidência adequada de ação corretiva (no caso de falhas no sistema) e ação preventiva. A efetividade é avaliada em ambos os casos. iii) O Manual da Qualidade do Laboratório está atualizado e é acessível a todo o pessoal envolvido no trabalho. iv) Existem procedimentos documentados para a subcontratação de trabalhos, incluindo a veriicação de adequação. Auditorias verticais em amostras aleatórias (isto é, veriicações feitas numa amostra, examinando todos os procedimentos associados a sua análise, desde o recebimento até a emissão de um relatório) não ressaltam quaisquer problemas. v) 1010 - IAL Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica APÊNDICE B Intervalos de Calibração e Veriicações de Desempenho. B1. Na Tabela App B-1 são dadas orientações sobre a calibração de equipamentos em uso normal em laboratórios analíticos e dos quais a calibração de outros instrumentos pode ser dependente. Recomendações mais abrangentes são disponiveis na literatura (ver bibliograia nº 32) e também em manuais de equipamentos. Tabela App B-1 Tipo de Instrumento (a) Balanças Freqüência de Verificação Depende do uso (b) Vidrarias Volumétricas Depende do uso (c) Hidrômetros (em operação) Anualmente (d) Hidrômetros (de referência) 5 anos (e) Barômetros * 5 anos Um ponto Exatidão (f ) Cronômetros (ver nota) 2 anos ou menos, dependendo do uso (g) Termômetros (de referência) 5 anos (h) Termômetros Parâmetros a serem Verificados Linearidade, Ponto zero, Exatidão (usando pesos calibrados) Exatidão, Precisão (pipetas/buretas) Calibração de um ponto contra hidrômetro de referência Calibração de um ponto usando-se padrão de medida de densidade especíica conhecida Anualmente, dependendo do uso Pontos críticos na escala, pontos ixos, p. ex. ponto de congelamento Veriicação de pontos especíicos com termômetro de referência Nota: Instrumentos assinalados com “*” normalmente serão calibrados em um laboratório de calibração acreditado, mas devem, pelo menos, apresentar rastreabilidade a padrões de medida nacionais. IAL - 1011 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Sinais de rádio-tempo nacionais, ou sinais de tempo por telefone, proporcionam uma fonte apropriada de calibração rastreável do tempo absoluto e da diferença de tempo. Cronômetros com movimentos eletrônicos/de quartzo são geralmente mais exatos e estáveis do que cronômetros mecânicos convencionais, e necessitarão ser calibrados com menor freqüência. B2. Os seguintes aspectos dos instrumentos abaixo listados podem precisar ser veriicados, dependendo do método: B2.1 Cromatógrafos (em geral): B2.2 B2.3 B2.4 1012 - IAL i) Veriicações do sistema geral, precisão de injeções repetidas de amostras, transporte. ii) Desempenho da coluna (capacidade, resolução, retenção). iii) Desempenho do detector (saída, resposta, ruído, dispersão, seletividade, linearidade). iv) Sistemas de aquecimento/termostatizados (exatidão, precisão, estabilidade, características de rampa). v) Amostrador automático (exatidão e precisão das rotinas sincronizadas). Cromatografia Líquida e Iônica: i) Composição da fase móvel. ii) Sistema de liberação da fase móvel (precisão, exatidão, isenção de oscilações). Sistemas de medição por Eletrodo, incluindo condutivímetro, pHmetro e detertor íon-seletivo: i) Tendência do eletrodo ou resposta reduzida. ii) Veriicações de ponto ixo e inclinação, usando padrões de medida química. Aparelhos de Aquecimento/Resfriamento, incluindo freezers, refrigeradores, fornos, Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica esterilizadores a ar quente, incubadoras, aparelhos para ponto de fusão e ebulição, banhos de óleo, estufas, autoclaves e banhos-maria: B2.5 B2.6 i) Calibração periódica do sistema sensor de temperatura usando-se termômetro ou pirômetro calibrados, apropriados. ii) Estabilidade térmica, reprodutibilidade. iii) Taxas e ciclos de aquecimento/resfriamento. iv) Capacidade de atingir e manter a pressão ou vácuo. Espectrômetros e espectrofotômetros, incluindo absorção atômica, determinação fluorimétrica, plasma induzido acoplado – emissão ótica, infravermelho , luminescência, massa, ressonância magnética nuclear, fluorescência ultra-violeta/visível e de raios X: i) Exatidão do comprimento de onda selecionado, precisão, estabilidade. ii) Estabilidade da fonte. iii) Desempenho do detetor (resolução, seletividade, estabilidade, linearidade, exatidão, precisão). iv) Relação sinal/ruído. v) Calibração do detetor (massa, ppm, comprimento de onda, freqüência, absorbância, transmitância, largura de banda, intensidade etc.). vi) Controladores e indicadores de temperatura interna, onde aplicável. Microscópios: i) Poder de resolução. ii) Desempenho sob várias condições de iluminação (luorescência, polarização etc.). Calibração do retículo (para medição de comprimento). iii) B2.7 Amostradores automáticos: i) Exatidão e precisão dos sistemas síncronos. IAL - 1013 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital ii) Coniabilidade dos programas de sequenciamento. iii) Exatidão e precisão do sistema alimentador de amostra. APÊNDICE C Comparação entre ISO/IEC 17025:1999 e ISO/IEC Guia: 1990 (Esta tabela é reproduzida da ILAC G15:2001, Diretrizes para Acreditação de acordo com a ISO/IEC 17025) ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 1.1 1.1 1.2 - 1.3 - 1.4 1.3 1.5 7.6 Nota 1.6 Introdução Referências normativas 2 2 Termos e definições 3 3 4.1.1 4.1 4.1.2 1.2 4.1.3 4.1 Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 Escopo Requisitos gerenciais Organização Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 1014 - IAL 4.1.4 - 4.1.5 (a) 4.2 a) 4.1.5 (b) 4.2 b) 4.1.5 (c) 4.2 i) 4.1.5 (d) 4.2 c) 4.1.5 (e) 5.2 b), 5.2 c) 4.1.5 (f) 4.2 d) 4.1.5 (g) 4.2 e) 4.1.5 (h) 4.2 f) ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 4.1.5 (i) 4.2 g) 4.1.5 (j) 4.2 h) Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Sistema da qualidade Controle de documentos Análise crítica dos pedidos, propostas e contratos Subcontratação de ensaios e calibrações Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 4.2.1 5.1 4.2.2 5.1, 5.2 a) 4.2.2 (a) 5.1 4.2.2 (b) 5.2 a) 4.2.2 (d) 5.2 a) 4.2.2 (e) 5.1 4.2.3 5.2 4.2.4 5.2 n) 4.3.1 5.2 e) 4.3.2.1 5.2 d) 4.3.2.2 (a) 5.1, 5.2 d) 4.3.2.2 (b) 5.2 d) 4.3.2.2 (c) 5.2 d) 4.3.2.2 (d) 5.2 d) 4.3.2.3 5.2 d) 4.3.3.1 5.2 d) 4.3.3.2 5.2 d) 4.3.3.3 5.2 d) 4.3.3.4 5.2 d) 4.4.1 5.2 i) 4.4.1 (a) 5.2 i) 4.4.1 (b) 5.2 i) 4.4.1 (c) 5.2 i) 4.4.2 5.2 i) 4.4.3 5.2 i) 4.4.4 5.2 i) 4.4.5 5.2 i) 4.5.1 14.1 4.5.2 14.1 ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 4.5.3 - 4.5.4 14.2 IAL - 1015 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 4.6.1 10.8, 15.2 4.6.2 15.1 4.6.3 - 4.6.4 15.3 Atendimento ao cliente 4.7 - Reclamações 4.8 16.1 Aquisição de serviços e suprimentos Controle de trabalho não-conforme Ação corretiva Ação preventiva Controle de registros Auditorias internas Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 Análise crítica pela gerência 1016 - IAL 4.9.1 5.2 o) 4.9.1 (a) 5.2 o) 4.9.1 (b) 5.2 o) 4.9.1 (c) 5.2 o) 4.9.1 (d) 5.2 o) , 13.6 4.9.1 (e) 5.2 o) 4.9.2 16.2 4.10.1 16.2 4.10.2 16.2 4.10.3 16.2 4.10.4 16.2 4.10.5 16.2 4.11.1 - 4.11.2 - 4.12.1.1 12.1 4.12.1.2 12.2 4.12.1.3 12.2 4.12.1.4 10.7 e) 4.12..2.1 12.1 4.12..2.2 - 4.12..2.3 - 4.13.1 5.3 4.13.2 5.3 4.13.3 5.5 ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 4.13.4 - 4.14.1 5.4 Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica 4.14.2 5.5 5.1.1 - 5.1.2 - 5.2.1 6.1 5.2.1 6.2 5.2.3 - 5.2.4 5.2 e) 5.2.5 6.3 5.3.1 7.1, 7.2 5.3.2 7.3 5.3.3 7.4 5.3.4 7.5 5.3.5 7.6 5.4.1 10.2, 10.1, 10.5 5.4.2 10.3 5.4.3 - 5.4.4 10.4 5.4.5.1 - 5.4.5.2 10.4 5.4.5.3 - 5.4.6.1 10.2 5.4.6.2 10.2 5.4.6.3 - 5.4.7.1 10.6 5.4.7.2 10.7 5.4.7.2 (a) 10.7 b) 5.4.7.2 (b) 10.7 c) 5.4.7.2 (c) 10.7 d) Requisitos técnicos Generalidades Pessoal |Acomodação e condições ambientais Métodos de ensaio e calibração, e validação de metodologia Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 Equipamentos ISO/IEC 17025 Cláusula 5.5.1 5.5.2 ISO/IEC Guia 25 8.1 9.1 IAL - 1017 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital Rastreabilidade das medições Rastreabilidade das medições (cont.) Amostragem Manuseio dos itens de ensaio e calibração Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 1018 - IAL 5.5.3 5.5.4 5.5.5 (a) 5.5.5 (b) 5.5.5 (c) 5.5.5 (d) 5.5.5 (e) 5.5.5 (f ) 5.5.5 (g) 5.5.5 (h) 5.5.6 5.5.7 5.5.8 5.5.9 5.5.10 5.5.11 5.5.12 5.6.1 5.6.2.1.1 5.6.2.1.2 5.6.2.2.1 6.5.2.2.2 5.6.3.1 5.6.3.2 5.6.3.3 5.6.3.4 5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.8.1 10.1 8.4 a) 8.4 b) 8.4 d) 8.4 f ) 8.4 g) 8.4 h) 8.4 i) 8.2 8.2 8.3 9.1 9.2 9.3 9.2 9.3 9.4, 9.5 9.7 9.6 10.5 11.4 ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 5.8.2 11.1 5.8.3 11.2 Apêndice II - Guia para Qualidade em Química Analítica Garantia da qualidade de resultados de ensaio e calibração Apresentação dos resultados Item da lista de conteúdo da ISO/IEC 17025 5.8.4 11.3 5.9 5.6, 5.6 a) 5.9 (a) 5.6 c) 5.9 (b) 5.6 b) 5.9 (c) 5.6 d) 5.9 (d) 5.6 e) 5.9 (e) 5.6 f ) 5.10.1 13.1 5.10.2 (a) 13.2 a) 5.10.2 (b) 13.2 b) 5.10.2 (c) 13.2 c) 5.10.2 (d) 13.2 d) 5.10.2 (e) 13.2 h) 5.10.2 (f ) 13.2 e), 13.2 f ) 5.10.2 (g) 13.2 g) 5.10.2 (h) 13.2 i) 5.10.2 (i) 13.2 k) 5.10.2 (j) 13.2 m) 5.10.2 (k) 13.2 n) 5.10.3.1 13.2 j) 5.10.3.1 (a) - 5.10.3.1 (b) 13.2 l) 5.10.3.1 (c) - 5.10.3.1 (d) - 5.10.3.1 (e) - 5.10.3.2 (a) - 5.10.3.2 (b) -- 5.10.3.2 (c) -- 5.10.3.2 (d) - ISO/IEC 17025 Cláusula ISO/IEC Guia 25 5.10.3.2 (e) -- 5.10.3.2 (f) IAL - 1019 Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital 1020 - IAL