Tese TANIA MARIA DE ANDRADE RODRIGUES

TÂNIA MARIA DE ANDRADE RODRIGUES CARACTERIZAÇÃO DAS FUNÇÕES DO GENE RING FINGER 4 NA EMBRIOGÊNESE CARDÍACA Te se a pr e se n t a da à Fa cu lda de de CI ÊN CI AS D A SAÚD E da Un ive r sida de de Br a sília pa r a obt e n çã o do Tít ulo de D ou t or e m Ciências da Saúde Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis da Rocha Neves Brasília 2006 Tr a ba lh o r e a liza do no La bor a t ór io de Ana t om ia da Fa culda de de M e dicina da Un ive r sida de de W isconsin / M a dison / Est a dos Unidos, com o pa r t e do dou t or a do, e m cola bor a çã o com o La bor a t ór io de Fa r m a cologia M ole cu la r da Fa culda de de Ciê ncia s da Sa úde da Un ive r sida de de Br a sília , com a poio fin a nce ir o da Coor de n a çã o de Ape r fe içoa m e n t o de Pe ssoa l de N íve l Supe r ior (CAPES) Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis da Rocha Neves TÂNIA MARIA DE ANDRADE RODRIGUES CARACTERIZAÇÃO DAS FUNÇÕES DO GENE RING FINGER 4 NA EMBRIOGÊNESE CARDÍACA Te se a pr e se n t a da à Fa culda de de Ciê n cia s da Sa úde da Un ive r sida de de Br a sília pa r a obt e n çã o do gr a u de D ou t or e m Ciências da Saúde A Deus, em sua benevolência. Aos m eus pais, Seu Osvaldo Andrade ( in m em orium ) e Dona Luzanira, pelo ensino do valor do t rabalho honest o. Ao m eu m arido e cúm plice Sandro. Aos m eus filhos adorados, Vit or e Enrico, razões de m eu viver. Aos m eus queridos Alice e Chico, Paulo, Mayra e Taynara, Luzanira Maria, Solange, Manuella, Mônica, Livia e Alicinha, Sandra, Ricardo, Cam ile, Tiago e Cecília, Célia e Mat eus, Osvaldo, Vilani, Marcelo e Em ir e Osm ar, Bruno e Bruna. Aos m eus pacient es. Por vocês, fui at rás do conhecim ent o. AGRADECIMENTOS À CAPES, pela concessão da bolsa de dout orado. Ao Curso de Pós- Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Ciências de Saúde da Universidade de Brasília. À Universidade Federal de Sergipe, pelo apoio à m inha liberação. Ao professor Francisco de Assis da Rocha Neves, m eu orient ador, a m inha reverência e grat idão. Ao Dr. Gary Edw ards Lyons e ao Depart am ent o de Anat om ia da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Winconsin/ Madison/ WI / Est ados Unidos, pelo acolhim ent o durant e a condução dest e t rabalho no Laborat ório de Anat om ia Molecular. Aos am igos do Depart am ent o de Morfologia, pelo am igável convívio e pela solidariedade nas horas difíceis. À Secret aria do Program a de Pós- Graduação em Ciências da Saúde, na figura das funcionárias Sílvia, Grace e Lillian, m eu apreço. Aos am igos do Laborat ório de Farm acologia Molecular, Guilherm e, Lara, Angélica, Rut néia, Alice, Mari e Rilva que est iveram com igo em algum m om ent o nessa j ornada, m inha am izade. Às am igas Rosa Am élia Dant as, Virgínia F. B. Passos, Robert a Miranda Fernandes e Maria August a Mundim Vargas, m eu afet o. A Hugo Carvalho Pim ent el, pela aj uda na ret a final. 4 RESUMO Doenças cardíacas t ant o congênit as quant o adquiridas apresent am alt a m orbi- m ort alidade, const it uindo no Brasil a prim eira causa de óbit o ( 29,9% ) . O im pact o sócio- econôm ico dessas pat ologias repercut e no sist em a de saúde e em um a realidade de escassez de recursos e necessidade de priorização em sua alocação, direcionando para a prim acia de invest im ent os em experim ent al m ecanism os é de ciências básicas. Est e est udo de cardiogênese ext rem a envolvidos na im port ância form ação do para a coração, com preensão e o m odelo dos de cam undongos genet icam ent e m odificados const it ui valiosa ferram ent a invest igat iva. Cam undongos com deleção do gene Ringer finger 4 ( rnf4) foram gerados com o obj et ivo de avaliar a repercussão nos em briões recessivos negat ivos das alt erações anát om o- pat ológicas, visando ent ender a função dest e gene na form ação do coração. RNF4 é um fat or de t ranscrição que é expresso no coração durant e a em briogênese. Foram ut ilizados cam undongos das linhagens BALBc e C57Bl6. Foram dissecados 825 em briões, sendo 423 BALBc e 402 C57Bl6, dist ribuídos ent re as seguint es faixas et árias: de 11 a 17 dias de desenvolvim ent o em brionário, anim ais com m enos de um dia de vida e anim ais com 21 dias pós- nat al. Os result ados dem onst raram que 34.6% dos cam undongos com deleção t ot al do rnf4, a part ir do décim o t erceiro dia de desenvolvim ent o em brionário, apresent aram vent riculares finas e defeit o do desorganização sept o das vent ricular, cam adas paredes vent riculares, ocasionando repercussão hem odinâm ica e clínica sugest iva de insuficiência 5 cardíaca congest iva. Além disso, nenhum anim al foi viável. Conclui- se que a deleção do gene rnf4 é let al para os em briões de cam undongos por ser essencial na form ação do coração. Esses result ados cont ribuem para ent enderm os os m ecanism os m oleculares envolvidos na em briogênese. Adem ais, serão út eis no desenvolvim ent o de novas est rat égias t erapêut icas para as doenças cardíacas. Palavras- chave: em briogênese cardíaca; defeit o sept o int ervent ricular; fat ores t ranscricionais; rnf4; cam undongos com deleção de gene. 6 ABSTRACT Cardiac diseases, whet her congenit al or acquired, show a high m ort alit y rat e worldw ide and in Brazil, t hey represent t he m aj or cause in nat ural deat hs wit h 29.9% of t he cases. The social and econom ical im pact of t hose pat hologies on t he Brazilian Public Healt h Syst em is part icularly worsened due t o t he lack of resources and t he need t o opt im ize t he scarce resource allocat ion, leading t o t he priorit izat ion of invest m ent s t owards t he basic sciences. For all t he above reasons, research in experim ent al cardiogenesis is of vit al im port ance t o t he underst anding of t he m echanism s involved in t he heart form at ion, where m odels using genet ically alt ered m ice const it ut e an invaluable t ool in t he invest igat ion for cures. Our st udy w as conduct ed by delet ing t he Ring Finger 4 ( Rnf4) m ouse genes and observing t he effect s t he absence of such gene has in t he form at ion of t heir heart s. RNF4 is a t ranscript ion fact or which is expressed in t he heart during em bryogenesis. I n t hat sense, m ice of lineage BALBc and C57B6 which present ed t he Rnf4 delet ion were select ed for our experim ent s. A t ot al of 825 em bryos were dissect ed, w here 423 were of t he BALBc lineage and 402 of t he C57B16 lineage. I n eit her case, t he em bryos were separat ed int o age groups: 1) 11 t o 17 days of em bryonary developm ent ; 2) less t han 1 day old; and 3) 21- day old specim ens. The result s show t hat 34.6% of t he m ice wit h delet ion of t he Rnf4 gene present ed vent ricular sept al defect ( VSD) , t hin vent ricular walls, and disorder of t he vent ricular layers, leading t o hem odynam ic and clinical pat hologies t hat suggest congest ive heart failure ( CHF) . Moreover, anim als which lack of funct ional Rnf4 gene die due t o cardiac defect . We concluded t hat delet ion of t he rnf4 gene is let hal for m ice em bryos, since such gene is apparent ly essent ial in t he heart form at ion. These result s will cont ribuit e t o underst and t he m olecular m ecanism s involved in t he heart em bryogenesis. I n addit ion, it w ill be helpful t o developm ent new t herapeut ical st rat egies t o heart diseases. Ke y w or ds: cardiac em bryogenesis; t ranscript ion fact ors; rnf4; gene t rap m ice; vent ricle sept al defect 7 SUMÁRIO 1.I NTRODUÇÃO.................................................................... 1.1.Em briogênese cardíaca ................................................ 1.2.Mecanism o m olecular envolvido na cardiogênese.................................................................... 1.3.Caract erização das funções do gene rnf4........................ 12 14 2.OBJETI VOS........................................................................ 2.1.Geral......................................................................... 2.2.Específicos.................................................................. 31 31 31 3.MATERI AL E MÉTODOS........................................................ 3.1.Mat eriais.................................................................... 3.2.Anim ais rnf4 delet ados................................................. 3.3.Genot ipagem .............................................................. 3.4.Dissecação dos em briões.............................................. 32 32 33 38 42 4.RESULTADOS..................................................................... 4.1.Genot ipagem ............................................................... 4.2.Análise dos em briões rnf4 delet ados......................................................................... 4.3.Análise dos corações rnf4 delet ados......................................................................... 46 46 5.DI SCUSSÃO....................................................................... 54 6.CONCLUSÕES.................................................................... 64 REFERÊNCI AS ...................................................................... 65 20 24 48 51 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Represent ação esquem át ica da indução de m iócit os............. Figura 2 Organogênese do coração................................................ Figura 3 Est rut ura e localização do gene rnf4 no crom ossom o hum ano....................................................................................... Figura 4 Esquem a est rut ural do RNF4............................................ Figura 5 Configuração t erciária da est rut ura RI NG finger ................ Figura 6 Esquem a represent ando a região 3 do rnf4 locus................ Figura 7 Heredogram a caract eríst ico de herança aut ossôm ica recessiva.................................................................................... Figura 8 PCR de am plificação do rnf4............................................. Figura 9 Em briões de cam undongos .............................................. Figura 10 Em briões rnf4 delet ados.................................................. Figura 11 Corações rnf4 delet ados.................................................. 16 19 25 26 27 34 37 46 49 51 53 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Genot ipagem de progenes C57Bl6............................. Tabela 2 Genot ipagem de progenes BALBc.............................. 41 41 10 LISTA DE ABREVIATURAS 5 RACE - Rápida am plificação do cDNA do t erm inal 5 ß - gal - ß- galact osidase AR - Recept or de androgênio BMP2 - Prot eína m orfogenét ica óssea DBD - Dom ínio de ligação ao DNA E - Dia de desenvolvim ent o em brionário EDTA - Ácido et ilenodiam inot et racét ico ( 0,5 M) FGF- 1A - Fat or de crescim ent o de fibroblast os GATA4 - Fat or t ranscricional com a seqüência GATA Gsc1 - Gene Goodsecóide K - Quinase LacZ - Gene da enzim a galact osidade MADS - MCM1, Agam ous, Deficent e, fat or responsivo Sérico MEF2 - Fat or am plificador de m iócit os MLC2v - Miosina de cadeia leve NLS - Seqüência nuclear de localização NTPS - Ácidos nucléicos t rifosfat os ORF - Open Read Fram e PAGE - Elet roforese com gel de poliacrilam ida PATZ - Prot eína zinc finger com gancho ( hook ) AT PBS - soro album inoso bovino pH - Pont es de hidrogênio POZ - Poxvirus and zinc finger 11 QCE- 6 - Cult ura de células QCE- 6 RING - Genes novos realm ent e int eressant es RTR - Recept or do Horm ônio Tireoidiano SDS - Dodecil sulfat o de sódio Sp1 - Prot eína especial SPBP - Prot eína expressada pelo gene Stromelin TAE - Tam pão 1 M Tris- HCl pH 8- acet at o- EDTA TAF - Fat or associado TATA TE - Tam pão 1 M Tris- HCl pH 8 + EDTA TaqDNA - Enzim a polim erase Thermus aquaticus DNA TATA - Seqüência repet ida de Tim ina, Adenina Tbx - Fat or de t ranscrição T box TGF- ß - Fat or de crescim ent o t ransform ant e TrisCl - Tris( choroet hyl) phosphit e U3D - Upst rem 3 t erm inal t ype D Fosfat o t ris cloroet il 12 1 INTRODUÇÃO Doenças cardíacas t ant o congênit as quant o adquiridas const it uem um conj unt o de pat ologias com alt a m orbi- m ort alidade, sendo no Brasil a prim eira causa de óbit o, com 29,9% de incidência [ 1, 2] . Tendo com o base dados do Minist ério da Saúde que é responsável por m ais de 75% das int ernações hospit alares feit as no País, pelo Sist em a Único de Saúde, no ano de 2002, foram realizadas 11.714.184 int ernações, sendo as doenças do aparelho cardiovascular a t erceira causa ( 1.216.771) a um cust o hospit alar e dom iciliar de cerca de 5 m ilhões de reais nesse ano. E dent re as causas de int ernações, t am bém nesse m esm o ano, segundo o Código I nt ernacional de Doenças, a I nsuficiência Cardíaca foi t am bém a t erceira colocada, com 372.604 hospit alizações [ 2] . Assim , esses dados epidem iológicos em nosso m eio são sim ilares aos dos países desenvolvidos. A m elhor com preensão dos m ecanism os bioquím icos e m oleculares que levam ao desenvolvim ent o das cardiopat ias poderá perm it ir a int ervenção clínica e/ ou cirúrgica m ais precoce e reduzir os alt os índices de m orbi- m ort alidade associados a essas doenças. Por conseguint e, o ent endim ent o dessas doenças do coração m ost ra a im port ância do est udo experim ent al básico em cardiogênese, pois, com o m elhor conhecim ent o desse processo de form ação do coração pode- se diagnost icar e int ervir precocem ent e em pat ologias t ant o congênit as,a exem plo de Persist ência de Canal Art erial, Com unicação I nt erat rial, Com unicação I nt ervent ricular e Tet ralogia de Fallot , quant o adquiridas, com o Doença Art erial Coronariana, Hipert ensão Art erial, Febre Reum át ica, dent re out ras present es nesse órgão, com repercussão social e econôm ica pela possível redução do im pact o dessas doenças no sist em a de saúde. Além disso, as pesquisas básicas em em briogênese produzem inform ações para o conhecim ent o dos diferent es processos de diferenciação das várias linhagens celular que 13 com põem um órgão e, em especial, o coração com suas peculiaridades e alt o im pact o na população em geral. A síndrom e de falência cardíaca é com plexa devido à incapacidade do coração em oferecer adequada ofert a de oxigênio aos t ecidos, ou sej a, inadequado débit o cardíaco para at ender às necessidades m et abólicas dos t ecidos [ 3] . Essa falência do coração pode est ar associada à disfunção sist ólica ou a um a função sist ólica preservada. A disfunção vent ricular deflagra m ecanism os adapt at ivos associados à at ivação neuro- hum oral, gerando alt erações na form a e na eficiência m ecânica do coração ( rem odelam ent o vent ricular) , além de alt erações periféricas circulat órias. Acrescent a- se t am bém que as propost as de t erapêut icas at uais não est ão m udando esse cenário de redução no núm ero de int ernações por descom pensação ou na efet iva elevação das expect at ivas de sobrevida, especialm ent e dos classificados com o graves [ 4] . Em um a perspect iva biom olecular, a análise da fisiopat ogenia da insuficiência cardíaca dem onst ra níveis baixos de prot eínas m usculares nos com ponent es do disco Z das células m usculares que fazem part e da unidade m orfofuncional dos m úsculos, o sarcôm ero, e na m at riz ext racelular [ 5] . Esse fat o corrobora para a int erpret ação sobre o possível papel da anorm alidade do cit oesquelet o na dilat ação progressiva do coração com insuficiência em bat er nos seres hum anos. De form a genérica, t em cardiom iopat ias, m ut ações surgim ent o fenót ipo do sido observado que, na m aioria das nos genes hipert rófico, sarcom éricos enquant o as provocam m ut ações o do cit oesquelet o est ão m ais relacionadas à cardiom iopat ia dilat ada. Esses achados fornecem alguns indícios de que m ut ações genét icas do cit oesqulet o ou do sarcôm ero podem causar cardiom iopat ia dilat ada ou hipert rófica nos seres hum anos, possivelm ent e devido a duas diferent es séries de event os de rem odelação cardíaca, ou sej a, a dilat ação e a hipert rofia podem com part ilhar sua origem m olecular [ 6] . Bruneau, 2002 [ 7] , ressalt ou que com preender a fisiologia m olecular do coração é 14 relevant e, e um a boa ferram ent a para a pesquisa do desenvolvim ent o desse órgão foi a ut ilização de m odelos experim ent ais. Dent re eles, um excelent e m odelo para est udo em briogênese e que se t em dos m ecanism os que cont rolam a dest acado é a ut ilização de anim ais m odificados t ransgenicam ent e, sej a pela ablação sej a pela inserção de novos genes alvos [ 8] . 1.1 Embriogênese cardíaca O processo de form ação do em brião inicia- se com as prim eiras divisões celulares, sendo form ado um disco achat ado que consist e no blast oderm a, com aproxim adam ent e 10.000 células, dividindo- se em duas: um a área opaca, que form ará o em brião e t am bém cont ribuirá para a form ação de m em branas ext raem brionárias, e um a área cent ral t ranslúcida, que form a duas cam adas, o epiblast o ( ext erno) e o hipoblast o ( int erno) . Nest e est ágio, ocorre a im plant ação do saco em brionário. Nos m am íferos, envolve o cont at o ínt im o com o t ecido ut erino, com ext ensiva proliferação do t rofoblast o e invasão dessas células no est rom a ut erino, est abelecendo- se a conexão m at erno- fet al nessa fase designada com o blast ula [ 9] . Na fase seguint e de gast rulação, o em brião em form ação apresent a a definição do eixo rost ro- caudal e do m esoderm a pré- cardíaco, assim com o t êm início os m ovim ent os de diferent es populações celulares, reforçando o conceit o de padrão local- específico que consist e no fat o de um a linhagem celular iniciar seu processo de diferenciação som ent e quando chega ao seu local de dest ino [ 10] . Na gast rulação, são det ect adas as t rês cam adas germ inat ivas ( ect oderm a, m esoderm a, endoderm a) . O est ágio im ediat o à gast rulação é o est abelecim ent o da geração de diversas linhagens de t ecidos, a part ir de um a população de células progenit oras pluripot ent es e da coloração dos diferent es t ipos celulares em seus locais apropriados no em brião. Nessa fase, pode- se acom panhar o 15 processo de regionalização de progenit ores da linhagem de células cardíacas e sua especificação na form ação dest e órgão [ 11] . As células cardíacas são recrut adas do epiblast o superficial para a área pré- cardíaca, ingressam e m igram para dent ro do em brião, form ando um par de t ubos que se fusionam em um único t ubo, na posição vent ral e m édia. Est e coração prim it ivo cont ém m últ iplas cam adas, exibe regionalização rost ro- caudal e rot ação, sendo possível de ser det ect ado com dois dias de cult ura de em briões [ 12] . A cam ada m esodérm ica t am bém cont ribui com linhagens celulares t ant o da região ext ra- em brionária quant o da em brionária, com o font e de células precursoras cardíacas, encont rando- se localizada post erior à placa neural. A análise dos descendent es dest a população cont ribui, predom inant em ent e, com a form ação do m iocárdio [ 13] . A cam ada endodérm ica que irá t am bém com por o coração em erge recrut ada para a form ação do coração. Chega- se, ent ão, ao form at o de coração t ubular que m igra ant erior e lat eralm ent e ao t ubo neural. Há evidências de que o endoderm a age com o um indut or de sinalização, sendo necessário para que a especificação celular ocorra, levando a diferenciação t erm inal cardiogênica [ 14] . Essa at ividade cardíaca indut iva é derivada m ais especificam ent e do endoderm a ant erior, que sinaliza para a diferenciação do coração, sendo prim ordial no est abelecim ent o da diversidade dos cardiom iócit os. Em um a et apa m ais t ardia, t am bém a cam ada ect odérm ica é indut ora cardíaca [ 15] . Resum idam ent e, as t rês cam adas germ inat ivas dem onst ram possuir um sist em a de sinalização indut ora ent re si para a form ação do coração, e essa sinalização só se m ost ra específica quando as células at ingem a área cardiogênica. Quando os m iócit os diferenciam - se nos t ipos celulares principais, m iócit os at riais e vent riculares e no sist em a de condução, dados apont am para um det erm inism o independent e dos progenit ores iniciais. Os fat os seguint es consist em : os m iócit os prim ordias sofrem ação inicial indut iva 16 dos vasos próxim os, para a diferenciação em cardiócit os e células condut oras. Esses dois processos progridem em paralelo at é os est ágios finais pelo fat o de os cardiócit os diferenciarem - se nos dois t ipos t erm inais que são os m úsculos at riais e vent riculares e na out ra via, na form ação da linhagem celular do sist em a condut or, at é o pont o t erm inal de células de Purkinj e. Porém , acredit a- se que, nest a et apa final, a influência do vaso do epicárdio não sej a preponderant e para que há et apa a pouco descrit a ocorra, m as a presença do vaso na fase inical é fundam ent al para dar início ao processo [ 16] . A sum arização do processo indut ivo est á ilust rada na Figura 1. [ 17] . Figura 1 Represent ação esquem át ica da indução de m iócit os. Efeit o com binat ório indut ivo da cit o- diferenciação de m iócit os e dos vasos coronarianos na cam ada epicárdica, na det erm inação do aparecim ent o das células de Purkinj e, com o com ponent e t erm inal do sist em a de condução do coração. Font e: HARVEY; ROSENTAHAL, 1999, p. 51. Nest e est ágio da organogênese, o coração possui duas cam adas. Um a int erna, form ada de endocárdio, e um a ext erna, o m iocárdio. Essas duas cam adas form am o coração t ubular que inicia suas dobraduras sobre si e, m ais t arde, as cont rações sincrônicas. Nessa et apa, não se det ect am 17 células coronarianas, células do t ecido conect ivo ou neurônios aut ônom os. Os const it uint es desse coração t ubular são t rês t ipos celulares: o endot élio e os m iócit os vent riculares e at riais. Com esses const it uint es, o coração com eça a bat er [ 18] . A m orfogênese das dobras do coração acont ece no est ágio t ubular para adquirir o fenót ipo das quat ro câm aras. Ocorre im port ant e efeit o na det erm inação dext ral da curvat ura do órgão, reflet indo um a regulação t em poral durant e o processo de form ação do coração [ 19] . Os passos seguint es são t rabeculação, m odulação da espessura das paredes das câm aras e das cam adas m usculares. O coração é avascular at é que a hiperplasia e a t rabeculação levem à sinalização para a form ação de plexos capilares e sinusóides venosos. No ent ant o, não se sabe de onde vêm as células para form ar essa rede vascular, se da crist a neural, se do m esênquim a ou, ainda, de am bos os t ecidos. O fat o é que a idéia m ais aceit a é a de que ocorre grau variado de het erogênese em respost a a várias cit ocinas que induzem à form ação dos vasos coronarianos e, quando est a rede vascular est iver est abelecida e ancorada na aort a, células progenit oras da cam ada m uscular lisa m igram , de form a int racardíaca, at ravés dos canais endot eliais, e passam a se diferenciar em vasos espiralados [ 20] . Na form ação do sist em a de condução cardíaco, são necessários quat ro subcom ponent es: o nodo sinoat rial, o nodo at riovent ricular, o feixe at riovent ricular e as fibras de Purkinj e. O local inicial de form ação desse sist em a de condução é a área conhecida com o anel prim it ivo, na j unção at riovent ricular que cont ém os precursores celulares, que são oriundos da crist a neural e de m iócit os especializados, os quais exibem diferenças anat ôm icas, t ais com o reduzidas m iofibrilas e grande acúm ulo de glicogênio [ 21] . Além disso, t em - se um a expressão gênica única, com achado de genes só descrit os no sist em a nervoso, ou sej a, com o genes rest rit os a neurônios que expressam prot eínas neurofilam ent osas e 18 glicoprot eínas associadas ao cérebro. Port ant o, ocorre um a co- expressão de genes m usculares e neuronais nest a et apa de form ação do coração [ 22] . As células de condução t êm um sist em a único de canais iônicos para a at ividade de m arcapasso e conexinas únicas nas j unções do t ipo gap que ret ransm it em o pot encial elét rico ent re as células do sist em a de condução [ 23] . Os com ponent es proxim ais desse sist em a de condução são const it uídos de nó sinoat rial, nó e feixe at riovent ricular, provenient es da crist a neural. Mas um a pergunt a ainda fica para ser respondida: o m ecanism o m olecular envolvido na diferenciação de células cont rát eis ( iniciais) para condut oras ( finais) , com o ocorre com as fibras de Purkinj e, que passam de células cont rát eis para condut oras. Esse fat o ainda necessit a de invest igação. Por out ro lado, acredit a- se que um fat or in sit u faria essa ligação ent re a rede cent ral e a periférica, int egrando t odo o sist em a condut or [ 24] . Todas as et apas de form ação do coração dos m am íferos encont ram - se represent adas na ilust ração da Figura 2, a seguir [ 25] . 19 E8 E9 E10 E11- 12 E13 Figura 2 Organogênese do coração, com em brionários ( E) . Font e: HARVEY; ROSENTAHAL, 1999, p. 111. os correspondent es períodos 20 1.2 Mecanismo molecular envolvido na cardiogênese O processo m olecular envolvido na cardiogênese é com plexo e envolve diferent es vias sinalizadoras. Decifrar a com plexidade das relações de seqüência- est rut ura- função na cardiogênese é obj et o de est udo que exigirá avanços na biologia est rut ural, com put acional. Sim ões- Cost a et al. prot eôm ica e na t ecnologia 2005 [ 26] afirm aram que a organização m orfológica do coração é direcionada pela função fisiológica das vias de ent rada e saída, sendo esse processo de cardiogênese det erm inado pela ação de genes que codificam o eixo ânt ero- post erior do coração. Nesse processo m orfogenét ico, exist em genes que expressam fat ores t ranscricionais, t ais com o: Prot eína Morfogét ica Óssea ( BMP) , Fat or Am plificador de Miócit os ( Mef2c) , Recept or de Ácido Ret inóico ( RAR) e os fat ores t ranscricionais GATA- 4, 5, 6 que são im port ant es para o coração, est ando envolvidos na diferenciação e na diversificação celular [ 27] . Tam bém os genes dit os selet ores, com o eHAND [ 28] e Hox [ 29] , cont rolam os genes subordinados a eles, cham ados de realizadores com o por exem plo, Nkx2- 5 [ 30] e Tbx2 [ 31] que possuem o código diret o da função relat iva à diferenciação celular nas várias linhagens que com põem , por exem plo, os órgãos, inclusive o coração que se inicia com o um vaso m uscular e vai se sofist icando com m últ iplas câm aras, válvulas, sept os, endocárdio, t rabeculações, sist em a de condução, circulação coronariana e um a int erface crít ica de lat eralidade, requerendo um a com plexa int eração ent re os t ecidos. O gene BMP 2, 4 est á envolvido diret am ent e na m orfogênese cardíaca, em especial nas fases prim ordiais, agindo com o um sinalizador present e na cam ada m esodérm ica na dist ribuição das diversas linhagens celulares que irão com por o coração [ 32] . Assim , em cam undongos delet ados para o gene bmp, seus em briões não form aram coração [ 33] . 21 Est e fat o coloca em evidência que a ação do BMP ocorre em um a fase prévia à gast rulação e esses dados colocam - no com o um gene fet al m est re que age no início do processo de form ação do coração. Os genes, com o o mef2B e mef2C ( fat or am plificador de m iócit os 2) , são expressos nas células pré- cardíacas [ 34] . Esses genes expressam fat ores de t ranscrição que prom ovem a indução m iogênica, ou sej a, a form ação dos m ioblast os que com preenderá as t rês linhagens celulares: cardíaca, som át ica e visceral. No coração de vert ebrados, o mef2B e o mef2C são det ect ados j á na fase de vaso t ubular. Durant e o processo de form ação do coração a part ir do m esoderm a, diferent es am plificadores agem de form a independent e, int eragindo com o gene D- mef- 2 que é const it uído de 12 kilos bases de DNA. Esses diferent es fat ores são com paráveis ent re si, t êm em com um um a origem m esoderm al e est ão envolvidos em especificação ou diferenciação do coração [ 35, 36] . Quando o gene mef é at ivado, age am plificando clones de quat ro a seis cardioblast os de form a segm ent ar. Em briões delet ados para mef2 apresent am ret ardo vent riculares finas, do crescim ent o, desorganizadas e efusão pericárdica, dilat adas, com paredes ausência de vent rículo direit o e sinais de insuficiência cardíaca [ 37] . Nos vert ebrados, mef2 t am bém produz prot eínas cont rát eis, porém est a não é a única via de produzi- las. Esse gene apresent a- se de m aneira evolut iva conservadora na cit o- diferenciação cardíaca. Est udos com genes que expressam as seguint es prot eínas C- RZF [ 38] , hFOG- 2 [ 39] , recept or de horm ônio t ireóideo [ 40] e FGF- 1 e FGF- 1A [ 41] que ut ilizaram a est rat égia de cult ura de célula- t ronco diferenciada para cardiócit os apresent aram baixa expressão ao longo do processo de desenvolvim ent o em brionário e, em especial, na form ação do coração. Porém , dem onst raram form ação descrevem do coração. serem im port ant es Acrescent a- se genes que se m ost raram que em algum out ros m om ent o est udos im port ant es num [ 42, da 43] det erm inado 22 m om ent o da cit odiferenciação cardíaca com o, por exem plo, no período m édio do desenvolvim ent o em brionário desse órgão, em t orno do E10, que corresponde ao período de diferenciação ent re as câm aras at riais e vent riculares e ao início do processo de sept ação longit udinal, ou sej a, da m ont agem do sept o int erat rial, m ost raram m aior expressão de suas prot eínas, t ais com o m iosina de cadeia leve ( MLC- 2) [ 42] e o fat or t ransform ant e de crescim ent o ( TGF) [ 43] . Esses achados reforçam a idéia de m arcador fet al ao longo do processo de cardiogênese e os candidat am ( MLC- 2 e TGF) com o m arcadores dessa et apa específica da form ação do coração. Na cardiogênese, um fat or de t ranscrição envolvido é o recept or de ácido ret inóico. Foi dem onst rado que a privação do ácido ret inóico no início da em briogênese, levou ao aparecim ent o de alt erações do dobram ent o do coração com conseqüent e m á- form ação dos sept os át riovent ricular e int ervent ricular, assim com o da parede dos vent rículos [ 44] . Além disso, em briões expost os ao ácido ret inóico apresent am t am bém anom alias cardíacas envolvendo as vias de saída e ent rada, t endo ação no m om ent o do dobram ent o do coração para a form ação das câm aras cardíacas, das valvas at riovent riculares e do sept o int ervent ricular [ 44] . Evidências acum uladas, apont am para que o ácido ret inóico exerça um papel de sinalizador da cit odiferenciação das diversas linhagens celulares que com põem a arquim orfologia cardíaca [ 46, 47] É int eressant e com ent ar sobre out ra prot eína envolvida na t ranscrição, a da fam ília GATA. Os genes que expressam GATA são det ect ados durant e t odo o processo de m at uração do endoderm a cardíaco, porém não se m ost ram ser específicos com o precursores cardíacos e foram descrit os est ar present es na organogênese de out ros órgãos. Acredit a- se que na form ação do coração ocorre de form a segm ent ar, com populações dist int as de progenit ores para as diferent es câm aras cardíacas, envolvendo especificação para cada câm ara [ 48] . Os fat ores t ranscricionais de ligação à seqüência GATA agem com o m oduladores 23 dessa especificidade, com o elem ent os regulat órios diret os, por exem plo, da m orfologia de vent rículo direit o [ 49] e em associação com out ros fat ores t ranscricionais que agem com o co- reguladores no acabam ent o final do coração, dando a arquit et ura única de cada região. Um específica) out ro grupo de genes, com o os da fam ília Sp ( prot eína [ 50] , est aria envolvido na especificação, sobrevivência e crescim ent o das linhagens celulares no processo de organogênese, o qual segue um padrão inicial segm ent ar para m ais t arde surgir com o est rut ura única. Ut ilizando um a t écnica de seleção de genes que aum ent am sua expressão durant e a diferenciação de células- t ronco em células cardíacas, o grupo do Dr. Gary E. Lyons do Depart am ent o de Anat om ia da Universidade de Wisconcin- Madison- USA ident ificou quat ro genes que poderiam est ar envolvidos na diferenciação do coração, os genes 6AC6, 6BD4, 8AB2 e 17BC4. Desses, som ent e o gene 6BD4 j á havia sido ident ificado, sendo, at é ent ão, conhecido com o Jumonji ( jmj) [ 51] . Para invest igar a im port ância do gene 6BD4, est e grupo est udou cam undongos com deleção do gene jmj [ 52] e observou que esses anim ais apresent avam defeit o na form ação do sept o vent ricular e dupla via de saída. O defeit o de sept o vent ricular const it ui um a com unicação ent re os vent rículos direit o e esquerdo, com repercussão hem odinâm ica sugest iva de ret enção de líquido no t erceiro espaço e alt eração da m orfologia dos vent rículos, por exem plo, paredes finas. Quant o a dupla via de saída é um a anom alia grave, caract erizada pela saída dos dois vasos, aort a e pulm onar, do vent ríulo direit o. Nesse est udo, as alt erações cardíacas descrit as foram dilat ação im port ant e de át rio direit o e edem a present e na caixa t orácica, sugerindo que esses anim ais evoluiam com disfunção hem odinâm ica grave e quadro de insuficiência cardíaca congest iva. Ent ret ant o, essas alt erações não foram suficient es para levar ao óbit o fet al em t odos os exem plares, t endo sido regist rado o nascim ent o 24 de anim ais port adores dessa deleção. Esses result ados confirm aram que o gene jmj t em papel im port ant e na form ação do coração [ 52] . Dois grupos europeus, um it aliano [ 53] e out ro finlandês [ 54] , publicaram post eriorm ent e sobre um novo gene designado com o rnf4, RI NG finger 4 que coincidiu com o gene 6AC6, o qual t inha sido um dos t rês isolados pelo grupo am ericano do Dr. Gary E. Lyons que ainda não t inham , at é aquele m om ent o, sido ident ificados. Esse result ado sugere que o rnf4 poderia ser um gene t am bém im port ant e na em briogênese cardíaca. 1.3 Caracterização das funções do gene rnf4 O gene rnf4, no m apa crom ossôm ico, encont ra- se na posição do gene hum ano no crom ossom o 4 posição 16.3, encont rando- se ent re o locus da doença de Hunt ingt on e o gene do recept or 3 do fat or de crescim ent o de fibroblast os ( fgf3). O gene t em , aproxim adam ent e, 47 Kb e apresent a 8 exons, t endo sido deposit ado no Gene Bank Dat a Library, com núm eros de acesso: U95/ 40 para rat os RNF4cDNA, e U95/ 41 para hum anos RNF4cDNA [ 55] . A Figura 3 apresent a det alhes da est rut ura do gene rnf4 [ 53] . 25 Figura 3 Est rut ura e localização do gene rnf4 no crom ossom o hum ano. Mapa físico do crom ossom o 4, na região 4p16.3 que cont ém o gene rnf4. A posição do loci D4S é indicada e o t am anho em kilobases ( kb) ent re o cent rôm ero ( cen) e o t elôm ero ( t el) . A posição do gene rnf4 é apresent ada. A organização dos exon- int ron é apresent ada na part e baixa da figura, 1, 2 e 8 são exons codificados, 3, 4 e 6 são exons não- codificados, e 5 e 7 são int rons. A set a acim a do exon 1 índica o sent ido da t ranscrição. Não se encont ra em escala. Font e: CHI ARI OTTI et al., GENOMI CS, 47: 258- 265, 1998. O rnf4 j á foi localizado no crom ossom o de cam undongos e em out ras espécies, com o Gallus gallus e Xenopus t ropicalis [ 56] . Port ant o, esse gene dem onst ra ser bem conservado filogenicam ent e. O gene hum ano rnf4 codifica um a prot eína de 190 am inoácidos. Essa prot eína é const it uída por um a seqüência conservada RI NG finger na porção t erm inal carboxila e região que orient a o direcionam ent o da prot eína para o núcleo, que na Figura 4, a seguir, é represent ada pelo box am arelo. É expresso em baixos níveis na m aioria dos t ecidos hum anos, 26 t ais com o cérebro, fígado, pulm ão, rim , m andíbula e no coração [ 51] , t am bém é expresso e exibe m aior expressão nas células germ inat ivas t est iculares [ 57] . Essa prot eína é pert encent e à fam ília significa RI NG- zinc finger que Really I nt erest ing New Gene , cuj a expressão varia durant e a organogênese, sendo reconhecido com o fat or de t ranscrição RI NG finger 4 e t am bém denom inado SNURF que significa sm all nuclear C( 3) H( 4) finger . A Figura 4 m ost ra a conform ação espacial previst a, da região RI NG, para a prot eína RNF4 pelos grupos de Chiariot t i et al. ( 1998) [ 53] e Moilanen et al. ( 1998) [ 54] . Figura 4 Esquem a est rut ural do RNF4. A região NLS ( Seqüência Localizadora Nuclear) em am arelo, a região de int eração com o recept or do hôrm onio androgênio ( AR) em verde e a seqüência C3 HC4 que ident ifica a região RI NG zinc finger , aqui represent ada pela área cor rósea que com preende do resíduo 136 ao 180. Font e: MOI LANEN et al., MOLECULAR AND CELL BI OLOGY, 18: 5128- 5139, 1998. As prot eínas GATA4 t am bém Ring- zinc finger , t ais com o MEF2C, BMP, RAR e est ão envolvidas no desenvolvim ent o cardiovascular em brionário. A fam ília de prot eínas RI NG- finger cont ém um segm ent o com um que é caract erizado pela presença de um a seqüência específica rica em cist eína, cont endo a seqüência de t rês cist eínas, um a hist idina, seguida de m ais quat ro cist eínas ( C3HC4) . Com essas caract eríst icas, est a 27 fam ília de prot eínas liga- se diret am ent e ao DNA e funciona com o fat ores reguladores t ranscricionais, t ant o posit ivo quant o negat ivo [ 58] . A Figura 5 m ost ra a configuração est rut ural t erciária da região RI NG finger que const it ui um a região especializada do t ipo dedo de zinco, com post a por 40 a 60 resíduos que se ligam a dois át om os de zinco. Essa região parece envolvida em m ediar int erações prot eína- prot eína, sendo ident ificada com o sinalizadora de t ransdução e desenvolvim ent o [ 59] . Figura 5 Configuração t erciária da est rut ura RI NG finger . Em verm elho, observa- se o grupo am ino ( - H2 N) e, ligada ao grupo carboxila ( COOH) ident ifica- se a região dedo de zinco ( set as verm elhas) . ( a) Região onde se encont ram as cist eínas nas posições 6 e 3 da cadeia e as hist idinas nas posições 19 e 23 da cadeia, ligadas ao át om o de zinco ( bola laranj a m aior) ; ( b) Dupla fit a do gene ring e sua correspondent e prot eína expressa RI NG. Font e: KLUG; CUMMMI NGS, 2000, p. 440. A presença da prot eína RNF4, t ant o no núcleo quant o no cit oplasm a, foi docum ent ada por crom at ografia por afinidade e im uno- hist oquím ica. Esse achado sugere um envolvim ent o do RNF4 em carrear inform ações ent re o núcleo e o cit oplasm a [ 60] . A int eração RNF4- DNA, in vit ro, dem onst ra que essa ligação é linear à dupla fit a de DNA, sem aparent e especificidade de seqüência, de m aneira cooperat iva, dependent e do t am anho de segm ent o de DNA ut ilizado. RNF4 int erage eficazm ent e t ant o 28 com fragm ent os condensados circulares quant o com j unções DNA do t ipo quat ro vias. A habilidade de ligação RNF4- DNA é associada à sua capacidade de am plificar o processo de t ranscrição a part ir de prom ot ores cont endo elem ent os do t ipo boxe GC [ 61] . Port ant o, RNF4 pode ligar- se t ant o a prot eínas ( fat ores t ranscricionais) quant o diret o com o DNA. Um a das funções do RNF4 é a de agir com o um co- at ivador t ranscricional est eróide, ligando- se ao DNA pela região prom ot ora, at ravés de elem ent os responsivos ou boxes ricos em GC, t ant o do recept or de androgênio quant o de est rogênio [ 62] . Ent ret ant o, RNF4 não possui a função int rínseca de at ivação t ranscricional e seu m ecanism o m olecular com o co- at ivador ainda necessit a ser elucidado. É im port ant e ressalt ar que RNF4 t am bém se liga a out ras prot eínas com o a SP1 ( specific prot ein 1) . As fam ílias SP ( 1,2,3,4 e 5) são fat ores de t ranscrição prot éicos que exibem na região t erm inal carboxila a seqüência dom ínio do t ipo dedo de zinco C( 2) H( 2) e part icipam da ligação ao DNA, at ravés das seqüências de repet ições diret as de GC [ 63] . Esse boxe GC [ 64] é um a seqüência dom ínio de ligação ao DNA present e na região prom ot ora de vários genes, inclusive o rnf4 [ 61] . Est udos com a fam ília SP revelam que eles t êm papel im port ant e em num erosos event os nos m ais diversos t ecidos em brionários, incluindo as fases de gast rulação e de alongam ent o do eixo do em brião; na diferenciação do t ubo neural, da região faríngea e dos som it os; e na form ação dos m úsculos esquelét icos do corpo. Acredit a- se que essas prot eínas exerçam um papel de coordenadoras dessas alt erações na m aquinaria t ranscricional que são requeridas para gerar as diferent es linhagens de t ecidos ao longo do desenvolvim ent o do em brião [ 65] . Com o um regulador de t ranscrição, RNF4 t am bém int erage com out ras prot eínas, ent re elas a Goosecoid- like ( Gsc1) [ 66] . Gsc1 é um fat or de t ranscrição com at ividade supressiva, o qual é expresso durant e a em briogênese do cérebro e das gônadas em em briões de cam undongos, 29 sendo expresso em t ecidos derivados da fenda neural nos est ágios prim ordiais do desenvolvim ent o em brionário. Acredit a- se que o m esm o est ej a envolvido na expressão da síndrom e de DiGeorge e nas síndrom es denom inadas de velocardiofacial, ou sej a, o port ador t em anorm alidades que incluem defeit os cardíacos na via de saída dos vent rículos, hipoplasia ou aplasia de t im o e glândula parat ireóide, hipocalcem ia e fenót ipo facial caract eríst ico. Todas essas desordens em briogênese, sendo derivadas das t êm bolsas origem faríngeas com um [ 67] . na Essas síndrom es velocardiofaciais envolvem o segm ent o ant erior do em brião, e m ut ações nos genes im plicados com o causadores dessas disgenesias t êm sua ação t em poral e espacial no processo de desenvolvim ent o do em brião hum ano. O gene stromelisin 1 expressa o fat or de t ranscrição SPBP que t am bém int erage com a prot eína RI NG finger RNF4 e am bas est ão localizadas no núcleo. A prot eína RNF4 prom ove, inicialm ent e, o acúm ulo específico de SPBP ligado ao DNA, agindo com o um co- fat or posit ivo m ediando a t ransat ivação [ 68] . O gene que causa a Síndrom e t richo- rino- falangeal, a qual se caract eriza por alt erações esquelét icas, escassa dist ribuição de cabelo no couro cabeludo e dism orfism o facial em hum anos expressa a prot eína TRPS1 que é um repressor do fat or de t ranscrição GATA- m ediado. Quando TRPS1 e RNF4 int eragem , ocorre regulação negat iva da ação do TRPS1. Acredit a- se que RNF4 iniba a função repressional de TRPS1, reafirm ando sua vocação de com odulador, ora posit iva ora negat ivam ent e agindo na t ranscrição e na função dos produt os gênicos, não sendo capaz de at ivar diret am ent e o processo de t ranscrição. Est e est udo dem onst rou que RNF4 e GATA at uam sinergicam ent e, podendo est e achado dem onst rar o elo ent re GATA que regula a cardiogênese e RNF4 com o m odulador no processo de em briogênese cardíaca [ 69] . Por out ro lado, RNF4 int erage negat ivam ent e com PATZ, a qual 30 t am bém possui em seu dom ínio de ligação ao DNA o át om o de zinco com o um dos com ponent es, porém com região de DBD denom inada de gancho ( hook ) AT e não do t ipo dedo de zinco [ 70] . Toda essa diversidade de ação reforça que o m ecanism o de ação do RNF4 envolve m ult i- com plexos, podendo agir de form a sinérgica ou ant agônica, a depender de com quem est ej a int eragindo em um det erm inado m om ent o espacial. Assim , foi dem onst rado que o RNF4, apesar de um conhecido at ivador t ranscricional, pode m udar seu com port am ent o quando se int erage com PATZ, que é um repressor t ranscricional. Nest a sit uação, a hiperexpressão de RNF4 com PATZ pot encializa a repressão da t ranscrição induzida por PATZ [ 70] . Com esse achado, inicalm ent e, RNF4 havia sido cogit ado com o repressor t ranscricional [ 70] . Mas, na publicação de Pero et al. 2002 [ 71] foi dem onst rado a ação at enuant e de RNF4 sobre PATZ, quando ocorria a ligação PATZ- RNF4. Os m ecanism os envolvidos na m odulação da diferenciação cardíaca são pouco conhecidos. É possível que o m Rnf4 at ue com o um co- at ivador [ 72] ou regulador at enuant e t ranscricional [ 73] essencial na regulação de genes, provavelm ent e a nível nuclear [ 74] . Considerando a im port ância da int eração da prot eína RNF4 com prot eínas im plicadas na m orfogênese cardíaca, e que o gene que codifica foi isolado, j unt o com o gene j m j , com o genes que est ariam envolvidos na diferenciação das células- t ronco em células cardíacas [ 51] , o Laborat ório de Anat om ia do Prof. Dr. Gary E. Lyons da Universidade de Wisconsin, Madison, USA opt ou por desenvolver cam undongos com deleção do gene rnf4, e o present e t rabalho t eve com o obj et ivo avaliar o efeit o deleção do rnf4 na cardiogênese e na m ort alidade desses anim ais. 31 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Avaliar a função do gene rnf4 no desenvolvim ent o do coração, at ravés do uso de cam undongos com deleção desse gene, obj et ivando descrever as alt erações m orfológicas dos corações, clínicas desses em briões, e a m ort alidade, em diferent es est ágios do desenvolvim ent o em brionário, peri- e pós- nat al. 2.2. Específicos Em embriões com deleção do rnf4 Caract erizar as alt erações m orfológicas de desenvolvim ent o dos em briões hom ozigót icos delet ados para rnf4 e seus fenót ipos; Descrever achados anat ôm icos m acroscópicos dos em briões hom ozigót icos delet ados para rnf4; Descrever os achados hist ológicos dos corações desses em briões hom ozigót icos delet ados para rnf4. 32 3 MATERIAL E MÉTODOS Est e t rabalho foi conduzido no Laborat ório de Anat om ia da Escola de Medicina em Madison, Wisconsin, Est ados Unidos da Am érica, sob a orient ação do Dr. Gary E. Lyons. O prot ocolo de m anuseio dos anim ais ut ilizado foi analisado e aprovado pelo com it ê de ét ica da referida I nst it uição. 3.1 Materiais Os prim ers foram feit os pela I nt egrat ed DNA Technologies, I nc., Coralville, I A, USA, com ponent es ut ilizados no t erm o- ciclador: t am pão, dNTPs, Taq DNA polym erase em t am pão de est oque t ipo B, m arcador m olecular de 100 pares de bases, t odos esses produt os fornecidos por Promega, Madison, WI , USA. Prot einase k, agarose, TAE, t am pão de correr, brom et o de et ídio, m arcador m olecular de DNA, t odos adquiridos da Sigma- Aldrich Coorporation, St Louis, MO, USA. Solução de precipit ação de prot eína adquirida da Gent ra Syst em , Research Triangle Park, NC, USA. Solução de lise genôm ica foi adquirida da BD Biosciences Clontech, Palo Alt o, CA, USA. EDTA, eosina, form aldeído, isopropanol, adquiridos de Ricca Chem ical Com pany, Arlingt on, TX, USA. Suport es, t ubos cônicos, ult ra t ubos, pont eiras foram ut ilizados da Nalgene, Rochest er, NY, USA. Parafina, et anol e TE adquiridos da BioLabs, Bervely, MA, USA. Det ergent e de laborat ório DRI - CLEAN adquiridos de Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA. Sulfat o de pot ásio crôm io e gelat ina G7500, adquiridos da Fischer Scient ific Co, Pit t sburgh, PA, USA. Ração st andart fornecido por Charles River Laboratories, Wilm ingt on, MA, USA. 33 3.2 Animais rnf4 deletados A deleção do gene rnf4 foi realizada a part ir da inserção de seqüência denom inada de ROSA - geo, expressando a enzim a galact osidade, pela t écnica de ret rovírus. Essa inserção foi no segm ent o aj uzant e do sít io de iniciação que result ou na reposição de t oda a seqüência rnf4, excet o pelos 23 prim eiros am inoácidos. A t écnica foi baseada no descrit o por Baker et al., 1997 [ 51] , e realizada no Serviço de Anim ais Transgênicos da Faculdade de Vet erinária da UW- Madison onde foram gerados os anim ais quim éricos a part ir do cult ivo em células prim ordiais, de m ut ant e alelo de rnf4 associado a um gene repórt er da enzim a ß- galact osidase que gerou um a cult ura quim érica, sendo selecionados só os clones que m ant inham a at ividade lacZ. Essas cult uras de células- t ronco m ut ant es alelo do rnf4 foram inseridas na fase de blast ocist os em cam undongas grávidas, t ant o da linhagem BALBc, com pelagem branca, quant o da linhagem C57Bl6, de pelagem pret a. Essas duas linhagens foram t rabalhadas em paralelo. As proles de cam undongos port adores nasceram , cresceram e, quando adult as, foram apt as a cruzar com cam undongos BALBc e C57Bl6 selvagens, a fim de aum ent ar o núm ero de port adores, conform e esquem a sim plificado da const rução das sondas A com o sinalizador ( lacZ) e B com o selecionador ( gene da resist ência ao ant ibiót ico am picilina) na Figura 6. 34 Figura 6 Esquem a represent ando a região 3 do rnf4 lucus. O vet or const ruído ( lacZ + sonda B + Am p) foi inserido ent re o prim eiro e o segundo exon. Am p gene de resist ência ao ant ibiót ico am picilina; lacZ - gene repórt er da enzim a galact osidase. Font e: LEE et al. 2000. Adapt ado. Os anim ais port adores da deleção do rnf4 ao longo da condução do experim ent o, t ant o BALBc quant o C57Bl6, foram m ant idos em separado e conduzidos em pararelo em t odos os procedim ent os a seguir. Eles ficaram em caixas est éreis, com serragem forrando o fundo da caixa, alim ent ados com ração st andart , fornecim ent o de água dest ilada em recipient e est éril, regim e de luz art ificial dia e noit e, sist em a de cont role da t em perat ura am bient e, para que a m esm a fosse m ant ida a 25 C e sist em a de filt ração de ar. As caixas de acondicionam ent o dos anim ais seguiam um prot ocolo do próprio serviço do Cent ro de Anim ais com t rocas sem anais com plet as, vigilância sanit ária por vet erinários do próprio serviço. Colocação em cada est ant e de acondicionam ent o dos anim ais, de um a caixa t est e com anim ais do próprio serviço do Cent ro de Anim ais para rast ream ent o de vírus, bact érias e fungos pat ógenos próprios dos cam undongos. Esses cam undongos t inham ident ificação própria e m anuseio só por pessoas aut orizadas do Cent ro de Anim ais da UW/ Madison. Em cada caixa, foram acondicionados at é quat ro anim ais do m esm o 35 sexo. Quando adult os, os anim ais foram separados em casais para cruzam ent o e ant es do nascim ent o da ninhada, o m acho era ret irado da caixa. A genit ora foi aloj ada com os filhot es at é o vigéssim o prim eiro dia de vida deles, quando foi realizada a colet a da pont a da cauda para a ext ração do DNA, para a classificação do cam undongo com o port ador ( + / da deleção do rnf4 ou cont role ( + / + ) . Os filhot es foram t am bém m arcados com furos na orelha para facilit ar a ident ificação dos m esm os. Na seguint e ordem : um a perfuração na orelha direit a e est e cam undongo foi ident ificado com o o núm ero um da prole. O cam undongo seguint e fazia duas punções à direit a e recebia a designação de segundo at é fazer t rês punções na orelha direit a, correspondendo ao t erceiro cam undongo da prole. Depois, iniciava- se com a m arcação dos filhot es da m esm a prole correspondent e à perfuração da orelha esquerda. Com isso, sabia- se ident ificar naquela prole quais eram os port adores e separá- los. Quando m uit os foram classificados com o selvagens, procedia- se à repet ição das am ost ras para recert ificação, assim com o dos genit ores. Quando ocorriam anim ais em excesso, procedia- se ao processo de eut anásia com exposição em caixa fechada ao m onóxido de carbono. Baseado em genét ica experim ent al anim al, nas prim eiras gerações descendent es F1 foram desenhadas linhas de endocruzam ent os ent re os cam undongos das duas linhagens t rabalhadas. No prim eiro cruzam ent o, anim ais port adores ( + / - ) C57Bl6 foram cruzados com os da linhagem 8AB2/ m RNF4, pert encent es ao Laborat ório Universidade de Wisconsin, onde foram de Pesquisa Anim al da gerados port adores ( + / - ) e selvagens ( + / + ) . Esses port adores C57Bl6 foram cruzados com ( + / + ) C57Bl6, por cruzam ent os m ãe- filho da prim eira at é a nona geração, para aum ent o da prole het erozigót ica. Foi feit o o m esm o procedim ent o com os anim ais port adores ( + / - ) BALBc. Foram cruzados t am bém pela prim eira vez com a linhagem 8AB2/ m RNF4, sendo gerados port adores e selvagens. Esses port adores foram cruzados com cont role ( + / + ) da linhagem C57Bl6, 36 por cruzam ent os m ãe- filho da prim eira at é a quart a geração, para aum ent o da prole het erozigót ica. Todos os anim ais port adores foram repicados em caixas com quat ro anim ais cada, obt endo- se um grande núm ero de het erozigot os das duas linhagens. O excesso de hom ogizot os fêm eas e os anim ais não- viáveis foram subm et idos à eut anasia. Nessa fase do proj et o, foram iniciados os acasalam ent os ent re het erozigot os das duas linhagens. Ant es, porém , os dados da genot ipagem foram novam ent e revist os e os cruzam ent os + / - com + / - iniciados da décim a ( C57 x LBB) at é a décim a quart a ( LHH x LGG) geração para os anim ais C57Bl6 e da quint a ( BALBc x BVI I .8) à oit ava ( BXI V.13 x BXI I I .19) geração dos BALBc. Com esses cruzam ent os dos port adores, foram obt idos os hom ozigot os recessivos ( - / - ) . As siglas LBB, LHH, LGG, BVI I .8, BXI V.13 e BXI I I .19 são usadas pelo Dr. Lyons para acom panhar os endocruzam ent os das duas linhagens de cam undongos. Nessa segunda fase, foram gerados os descendent es F2 pelos cruzam ent os das duas linhagens de cam undongos het erozigot os, em paralelo, t endo com o finalidade a obt enção de em briões hom ozigot os delet ados para o gene rnf4. Nesse processo, foi m arcada a dat a do acasalam ent o e as fêm eas foram seguidas, diariam ent e, em busca de sinais de gest ação, desde hipersecreção est rogênica em vagina at é aum ent o do volum e abdom inal. O acom panham ent o da gest ação foi feit o por m onit oram ent o com exam e clínico diário. Com essa est rat égia, foram definidas as dat as dos sacrifícios das gest ant es para a colet a dos em briões com t em po de desenvolvim ent o em brionário pré- est abelecido de E11 a E17 porque dissecações precoces, com o E9, E9.5 e E10, não exibiam alt erações e os em briões m ost ravam - se adequados para a idade gest acional. Durant e a condução do t rabalho, por t er ocorrido nascim ent o de exem plares hom ozigot os delet ados rnf4 ( C57Bl6) , foi decidido que seriam conduzidos ao longo de t oda a gest ação, sendo deixados nascer as proles e genot ipados com m enos de um dia de vida, e at é com plet arem 21 dias de vida, para am bas as linhagens est udadas, visando avaliar a 37 viabilidade. Com essa est rat égia, obj et ivava- se avaliar a viabilidade desse concept o delet ado para o gene rnf4. O heredogram a da Figura 7 ilust ra a produção de hom ozigot os aut ossôm icos recessivos pelo efeit o dos endocruzam ent os para averiguação dos m ut ant es rnf4 e sua repercussão no coração, invest igado nest e est udo [ 75] . Figura 7 Heredogram a caract eríst ico de herança aut ossôm ica recessiva. Fase I cruzam ent o de port ador com selvagem . Fase I I geração de port adores por endocruzam ent o com selvagens. Fase I I I cruzam ent o ent re port adores por endocruzam ent os. Fase I V geração de recessivo negat ivo. Font e: THOMPSON; THOMPSON, 1993. Adapt ado. 38 3.3 Genotipagem No procedim ent o de genot ipagem das ninhadas, foi necessária a obt enção de seqüência int rônica do vet or inserido, a part ir de seqüência previam ent e conhecida do pedaço do gene lac- Z, desde que essa inserção t enha m ais um carát er randôm ico do que de um event o- alvo. Port ant o, o program a de Reação em Cadeia de Polim erase ( PCR) - inversa foi ut ilizado, obt endo- se um a seqüência da região 3` sít io do vet or de inserção, ou sej a, que cont inha o sít io codant e iniciador e o sít io - geo. A part ir de DNA genôm ico provenient e de t ecido de anim al het erozigot o, o qual foi digerido com a enzim a Eco R1, ligação e am plificação com seqüências iniciadoras provenient es de casset e de am picilina e do gene inserido. Com esses com ponent es, foi rodado um program a de PCR. O produt o result ant e foi um fragm ent o único de 367 pares de bases, designado de sonda B. A RACE, com sonda A foi conseguida at ravés do uso da t écnica de 5 obt enção de fragm ent o de 512 pares de bases. Todo o prot ocolo de ext ração de DNA foi conduzido segundo Gent ra Syst em s I solat ion Kit s, m odificado por Lee et al. 2000 [ 52] . I nicialm ent e, am ost ras sej a do t ecido da pont a da cauda para ident ificar port adores sej a da m em brana am niót ica para ident ificar recessivos negat ivos foram colet adas, colocadas em t ubos Eppendorff ( 1.5 m l) em 600 de Lise Genôm ica ( TRI S- HCl pH 8.0 ( 200 l de Solução l) + 4 M NaCl ( 375 l) + 0.5 M EDTA ( 2 m l) + 10% SDS ( 1 m l) + com plet a com m illiQH2 O ( 6.42 m l) ) , m ais 3 l Prot einase K ( 20m g/ m l) , seguido de vort ex por 30 segundos. Est a solução foi incubada por um a noit e em banho- m aria a 55° C. No dia seguint e, procedeu- se à precipit ação do DNA. Para isso, as am ost ras foram ret iradas do banho- m aria, vort exadas por 30 segundos e em seguida, foram adicionados 300 l de Solução de Precipit ação de Prot eína em cada am ost ra, seguido de vort ex por 30 segundos. Logo após, as am ost ras foram cent rifugadas ( 14 g/ 3 m in) para obt enção do pellet 39 de precipit ado de rest os celulares no t ubo. O DNA a ser analisado, present e no sobrenadant e, foi t ransferido para um novo conj unt o de t ubos Eppendorf 1.5. Em seguida, a fase de desidrat ação foi iniciada com o uso do prot ocolo de gradient e álcool. Prim eiro, foi usado isopropanol a 100% ( 600 l) , inversão gent il de cada t ubo por 20 vezes, seguida de cent rifugação ( 14 g/ 5 m in) . O sobrenadant e foi descart ado em um Beaker e no t ubo ficava o DNA condensado. Segundo, et anol a 70% ( 600 l) foi acrescent ado, inversão gent il de cada t ubo por 20 vezes, seguida de cent rifugação ( 14 g/ 5 m in) . Novam ent e, o sobrenadant e foi desprezado no Beaker e as am ost ras foram colocadas para secar na capela de fluxo lam inar por 15 m inut os. A fase de reidrat ação iniciava- se com ressuspensão das am ost ras com o uso de t am pão TE pH 8.0 ( 200 a l) e, por fim , elas foram deixadas à t em perat ura am bient e ( 25° C) por m ais um a noit e na bancada do laborat ório. No t erceiro dia, a am plificação do DNA foi feit a at ravés da t écnica ut ilizando aparelho t erm ociclador. A solução foi preparada em t ubo Eppendorff 0.5 m l adequadam ent e para uso em t erm ociclador e t inha os const it uint es a seguir: Tam pão com MgCl 2 ( 2.5 l) + 2nM dNTPs ( 2.5 l) + Prim er 5 em aliquot as de 20nM { CCAGTCGAAAGTGGTCACTATTC} ( 1 Prim er 3 acrescido l) + em aliquot as de 20nM { AATGGCACCCATAGCTTTAGTAC} ( 1 do gene inserido { TTCGCTTCTCGCTTCTGTTC- 3 } ( 1 ( U3D 5) l) , m ais 13.8 sub- t ot al de 21.8 l. Adicionavam - se 3 l de DNA colet ado + 30 em aliquot as de l) , 20nM l de água m illiQ, em um Seguido de vort ex por 30 segundos de cada t ubo. l de óleo para Reação em Cadeia de Polim erase. Os m ixes foram subm et idos ao seguint e program a de PCR ( reação em cadeia de polym erase) . Fase I : cinco m inut os a 94° C. Nesse int ervalo de t em po, ( 0.2 polym erase est ocada em l) da enzim a ( Termus aquaticus) Taq DNA t am pão B ( Prom ega, Madison,WI ,USA) foi adicionada para dar cont inuidade com à segunda fase do program a no t erm ociclador: 30 ciclos de 45 segundos a 94° C, 90 segundos a 62° C e 90 segundos a 72° C e, finalm ent e, de oit o m inut os a 72° C. Todo esse 40 processo durava cerca de 2 horas e m eia. Nesse m esm o dia, o gel de agarose a 1.5% foi preparado com 1.2 gram a de agarose, diluído em 80 m l de 1 X TAE, levando- se ao m icroondas por 2 m inut os, seguido de im ersão do recipient e em banhom aria a 37 C para resfriam ent o por 2 a 3 m inut os. Essa solução foi derram ada em um aparat o do t ipo subm arino com um pent e na borda. Quando a polim erização do gel foi concluída, o pent e foi ret irado e o aparelho era preenchidocom solução 1 X TAE at é t odo o gel encont rar- se subm erso. A cada am ost ra, foram acrescent ados 2.5 l de m arcador de correr brom ofenol azul e, com pipet a, foram preenchidas as covas com as am ost ras. Assim com o 3 l de m arcador m olecular de DNA de 100 pares de bases foram aplicados e colocados para correr o gel im erso em 1 X TAE, com volt agem const ant e de 109 volt s por um a hora, t em po est e em que as am ost ras corriam 2/ 3 do t am anho do gel e o sist em a foi desligado. O gel de agarose foi ret irado desse aparat o e colocado em recepient e com solução de brom et o de et ídeo na concent ração de 1 g/ m l, em bandej a m óvel com rot ação lent a por cinco m inut os, seguidos de m ais cinco m inut os de rinse do gel em água m illiQ. O gel foi fot ografado em câm era escura, com raio ult raviolet a, para visualização das bandas de DNA, com prot eção pessoal at ravés de art efat os de barreira. Com as fot os, a classificação das am ost ras foi feit a, produzindo as Tabelas 1, para a linhagem C57Bl6, e 2, para a linhagem BALBc de cam undongos com suas respect ivas fases do desenvolvim ent o em brionário de E11 at é 21 dias da dat a de nascim ent o, núm ero t ot al de em briões por fase, genot ipagens de seus respect ivos sacos am niót icos e as anot ações das observações do fenôm eno de reabsorção em cada ninhada. 41 Tabela 1. Genot ipagem de progenes C57Bl6. Estágio E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 P0.5 P21 F2 Total embriões 29 85 39 28 41 54 47 29 50 402 Nº de embriões genotipagem Rnf4 +/+ +/-/ 17 11 0 17 50 15 16 18 2 6 17 3 7 23 6 17 31 2 20 21 3 14 12 3 36 14 0 150 197 34 Nº de embriões reabsorvidos 1 3 3 2 5 4 3 0 0 21 E Dias de desenvolvim ent o em brionário. P indica dias pós- nat al. Necrose FONTE: Dados colet ados pela aut ora. Tabela 2. Genot ipagem de progenes BALBc. Estágio E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 P0.5 P21 F2 Total e mbriões 151 66 38 41 21 29 24 19 34 423 Nº de embriões Genotipagem Rnf4 +/+ +/-/ 39 81 7 15 32 5 13 20 2 12 17 2 6 8 0 9 10 2 5 11 0 8 11 0 21 13 0 128 203 18 E Dias de desenvolvim ent o em brionário. P indica dias pós- nat al. Necrose FONTE: Dados colet ados pela aut ora. Nº de embriões reabsorvidos 24 14 3 10 7 8 8 0 0 74 42 3.4 Dissecação dos embriões Os em briões de cam undongos fêm eas em gest ação F2 foram dissecados e a am ost ra do saco am niót ico do lado cont rário à inserção da placent a no t ecido ut erino m at erno foi colet ada para genot ipagem , com o descrit o ant eriorm ent e. Com essa est rat égia, procurou- se evit ar o cont at o da am ost ra com o t ecido m at erno na det erm inação da genot ipagem . O sacrifício das cam undongas grávidas foi realizado por deslocam ent o cervical, procedim ent o est e aceit ável pelo com it ê de defesa dos anim ais de laborat ório, seguido da abert ura por incissura t ransversal de abdôm en. O út ero foi ret irado sob m icroscópio ópt ico, seguido da cirurgia de abert ura do út ero e ext ração dos em briões. Um a um foi dissecado, descrit os os achados m acroscópicos, m ant idos em recipient es ( placa de pet ri) , com 1X PBS gelado. Cada em brião foi colocado em t ubos cônicos de 10 m l, com paraform aldeído a 4% , preparado no dia, im erso em cont einer com gelo at é o t érm ino de t oda a cirurgia. Nesse m om ent o, foi preenchida um a ficha individual para cada em brião e anot adas observações m orfológicas dos m esm os, baseadas em Rugh, 1990 [ 76] . Finalm ent e, os em briões ficavam por doze a dezesseis horas na câm era a 4 C, nos t ubos cônicos, com paraform aldeído a 4% em bandej as rot at órias. No dia seguint e, os em briões foram lavados por t rês vezes com 1X PBS por cinco m inut os em bandej a rot at ória em ar am bient e e os exem plares foram est ocados em geladeira a 4 C, aguardando os result ados da genot ipagem . Com a respost a da genot ipagem , foram descart ados os em briões het erozigot os. Os hom ozigot os delet ados para rnf4 em um a ninhada foram preservados a 4ºC, assim com o os em briões selvagens daquela m esm a ninhada, sendo designados de cont role para com paração com os em briões hom ozigot os delet ados para rnf4. Anot ações de achados de anat om ia m acroscópica foram feit as e dos núm eros de reabsorvidos por ninhada. 43 Os em briões hom ozigót icos delet ados para rnf4 e seu respect ivo cont role selvagem em cada est ágio do desenvolvim ent o em brionário foram incluídos em parafina e seguiam o seguint e prot ocolo: os em briões nos t ubos cônicos foram lavados com 50 m l por 30 m inut os em bandej a rot at ória, com cada um a das seguint es soluções e nest a seqüência: 1X PBS, 1X solução salina, 1: 1 solução salina: 95% de et anol, 95% de et anol, 70% de et anol por 2 vezes, 85% de et anol, 95% de et anol e, finalm ent e, 100% de et anol por duas vezes. Essa et apa foi conduzida em fluxo lam inar e os resíduos, desprezados na pia. A lavagem dos exem plares foi cont inuada com 50 m l de xileno por duas vezes, em bandej a rot at ória, desprezando em recipient e próprio de descart e de m at erial inflam ável, observando t odas as norm as de precaução que regiam o laborat ório. Nest a fase, um forno a vácuo a 60 C foi ut ilizado para as lavagens do em brião, sendo t ransferidos para form a de plást ico. A prim eira lavagem com 50m l t ot al da solução 1: 1 de xyleno ( 25m l) : parafina ( 25m l) por 45 m inut os, seguida de duas lavagens de 20 m inut os cada, com 30 m l de parafina. Na parafinação, foi ut ilizada a Panplast plus purified paraffin que cont ém parafina purificada e dim et il sulfoside ( DMSO) , sendo est e últ im o um polím ero plást ico de peso m olecular regular que t em com o finalidade facilit ar a rápida infilt ração no t ecido. Nest e m om ent o, o em brião foi posicionado no recipient e com o corpo em posição longit udinal, est ando o crânio t ocando o fundo do recipient e do m olde plást ico, com a finalidade de obt er cort es do t órax em posição t ransversal. Nest e pont o do processo, as am ost ras foram para o cort e e obt enção das lâm inas hist ológicas. Os m oldes de parafina foram cort ados por m icrót om o, com cort e de espessura de 0,7 m icron. Os cort es hist ológicos det erm inados para serem corados e lidos foram os que se encont ravam desde o início da base do coração at é seu ápice e foram aqueles designados com o os obrigat órios, ou sej a, as lâm inas do plano t ransverso das quat ro câm aras cardíacas. Essas lâm inas foram subm et idas a um preparo especial ant es de 44 serem ut ilizadas. O rack de m et al com conj unt o de 50 lâm inas foi m ergulhado em água quent e com det ergent e DRI - CLEAN por 20 m inut os. Em seguida, as lâm inas foram lavadas em água quent e corrent e por um a hora. Depois, por t rês vezes, foram lavadas com água dest ilada e colocadas para secar no forno a 60 C. Nest e et apa do procedim ent o, 200 m l da solução 4% paraform aldeído- PBS foram preparados ( 10 g de paraform aldeído + 25 m l de 10 X PBS + 15 l de 10N de NaOH, e o rest ant e com plet ava- se com água dest ilada) , seguido de elevação da t em perat ura at é 65 C. Depois, com papel What m an ( # 1, 24 cm ) para rem over m at erial não- dissolvido foi a solução filt rada. Novam ent e, o volum e final da solução foi com plet ado com 200 m l de água dest ilada. A est a solução, foram acrescent ados 2 g de gelat ina G7- 500 e 0.1 g de sulfat o de pot ásio crom o. Essa solução foi resfriada para 35 C, e o rack com as lâm inas foram subm ergidas nest a solução por cinco m inut os/ 2X. Depois disso, o rack foi para a est ufa ( 37 C) para secagem por um a noit e. As lâm inas selecionadas no m icroscópio ópt ico pelo crit ério cit ado foram subm et idas ao processo de coloração pelos corant es hem at oxilina e eosina. A coloração const it uía a passagem do rack com o set das lâm inas de t ecido pelas seguint es fases: desparafinação com xilol, hidrat ação com um gradient e de álcool desde absolut o, 90% , 80% , 70% , at é água dest ilada, seguida da coloração pela hem at oxilina, água dest ilada, eosina, água acét ica, passando para a fase de desidrat ação com o gradient e de álcool inverso, e finalizando com a fase de clarificação com xilol. O set de lâm inas perm anecia no fluxo lâm inar para secagem . A análise hist ológica foi conduzida no m icroscópio ópt ico no próprio Depart am ent o de Anat om ia da Escola de Medicina em Madison, Wisconsin, Est ados Unidos. Para isso, foram realizadas fot os e anot ações hist ológicas det alhadas das est rut uras m orfológicas cardiovasculares desses em briões. Durant e a condução desse experim ent o, foi est abelecido o m ínim o de t rês repet ições para cada idade gest acional, em paralelo, nas duas linhagens est udadas. Esses casos foram rot ulados com o genot ipagem 45 indet erm inada, m esm o depois de proceder, no m ínim o, a quat ro t ent at ivas por am ost ra, inclusive com diluições do DNA da am ost ra em quest ão, com várias quant idades ( 1 l, 3 l, 6 l, 9 l) . Procedeu- se t am bém à repet ição das am ost ras que, na fot o do gel de agarose, levant asse dúvida ou que o result ado da genot ipagem não foi o esperado, repet indo- se as am ost ras de DNA dos genit ores das fêm eas port adoras do m em bro da ninhada em quest ão. Todos esses cuidados foram t om ados para que os dados obt idos fossem confiáveis. 46 4 RESULTADOS 4.1 Genotipagem As reações de cadeia de polim erase conduzidas nos segm ent os de DNA, ext raídos para am plificação do gene do rnf4, confirm aram o que se esperava dos anim ais com deleção, het erozigot os e do t ipo selvagem . Com o se observa na Figura 8, nos anim ais selvagens (+ / + ), a am plificação do gene rnf4 gerou um produt o de 512 pares de bases. Já os cam undongos com deleção do rnf4 apresent aram um produt o do PCR m enor, equivalent e a 367 pares de bases, e os anim ais het erozigot os apresent avam os dois produt os, frut os do alelo norm al e do delet ado. PCR de am plificação do rnf4. Os anim ais selvagens ( + / + ) apresent am um a banda de 512 pares de bases. Os anim ais com deleção do rnf4 apresent am um a banda equivalent e de 367 pares de bases e os anim ais het erozigot os apresent am duas bandas correspondent es aos alelos norm al e delet ado. Foi ut ilizado gel de agarose 1.5% . FONTE: 318 SMI , 2002. [ 77] . Figu ra 8 47 Essa análise genot ípica foi ut ilizada para com por os dados das Tabelas 1 ( C57Bl6) e 2 ( BALBc) que foram colet adas a part ir da fase do desenvolvim ent o de onze dias de vida porque nos est ágios precoces desse processo de desenvolvim ent o, cham ado de gast rulação, que corresponde ao período de oit o a dez dias de desenvolvim ent o em brionário, os em briões t ant o C57Bl6 quant o BALBc não exibiam sinais de m ut ação, e os fet os t inham desenvolvim ent o com pat ível com os het erozigot os e os selvagens, sendo essas faixas et árias excluídas da análise. Os prim eiros anim ais com deleção do rnf4 apareceram som ent e a part ir do 11º dia de desenvolvim ent o em brionário. Os dados da Tabela 1 apresent am os cam undongos da linhagem C57Bl6 com núm ero elevado de 39% ( 150/ 381) de em briões selvagens ( + / + ) e m enor valor de 8,35% ( 34/ 381) de em briões com deleção ( - / - ) . Esses núm eros não correspondem às proporções do conceit o de herança m endeliana de 1, 2, 1 para os respect ivos hom ozigot os dom inant es e hom ozigot os recessivos. A dist ribuição que m ais se aproxim ou da m endeliana foi o valor t ot al observado nos anim ais het erozigot os que foi de 52% ( 197/ 381) . Quando se analisa por fases, pode- se afirm ar que não foi observada herança m endeliana no P21. Observou- se t am bém que nos E12, E14 e E15 foram dados que se aproxim aram das proporções da herança m endeliana, e as fases E16, E17 e P0.5 encont ram - se m ais discordant es da probabilidade de ocorrência desse padrão heredit ário. O núm ero de reabsorvidos det ect ados em t odos os est ágios foi de 21. Além disso, na análise da Tabela 1, foi observado que, dos 34 em briões que apresent avam deleção do gene rnf4, 17 deles encont ravam se nas fases E12 e E13, período correspondent e ao fecham ent o do sept o int ervent ricular. Com o obj et ivo de invest igar os efeit os da deleção do rnf4 na viabilidade dos anim ais, um grupo de cam undongos foi acom panhado at é o final da gest ação, logo após o nascim ent o, com m enos de um dia de vida e com 21 dias de vida. Com o foi observado, som ent e 3/ 34 cam undongos C57Bl6 com deleção do gene rnf4 nasceram . No ent ant o, os 48 m esm os foram encont rados m ort os com a genit ora na caixa que cont inha som ent e os rest os dos corpos dos em briões. Mesm o assim , foi feit a a genot ipagem desse m at erial e obt eve- se o result ado ( - / - ) , o qual foi rechecado por t rês vezes para confirm ação, sendo seus genit ores confirm ados com o het erozigot os. Por out ro lado, nenhum anim al com 21 dias de vida foi classificado de ( - / - ) dos 50 analisados. A análise dos em briões BALBc, na Tabela 2, t am bém obedeceu à m esm a regra de est ágios, de onze at é dezesset e dias em brionários, m enos de um dia de vida e com vint e e um dias de vida, t odos de segunda geração ( F2) . Ent ret ant o, no est udo da viabilidade P0.5 e P21, não foi observado nenhum exem plar classificado com o ( - / - ) . Foram colet ados 423 em briões, sendo que 74 deles foram ident ificados com o reabsorvidos, ou sej a, em processo de necrose. Do rest ant e ( 349 em briões) , observou- se que 128 em briões ( 37% ) foram classificados com o selvagens ( + / + ) , 203 ( 58% ) com o het erozigot os ( + / - ) e 18 deles ( 5% ) com deleção t ot al ( - / - ) . Os dados dos est ágios de E15 a E17 foram significat ivam ent e próxim os dos núm eros da herança m endeliana de 1: 2: 1. Porém , com os anim ais deixados nascer ( P0.5) e com os de at é 21 dias de vidas, os result ados de suas genot ipagens foram divergent es, confront ados com a herança m endeliana. 4.2 Análise dos embriões rnf4 deletados Os m Rnf4 het erozigot os apresent aram - se norm ais e reproduziram se, sendo com pat íveis com o desenvolvim ent o das out ras linhagens de cam undongos. Tant o het erozigot os quant o selvagens foram m ant idos no m esm o regim e de prot ocolo descrit o ant eriorm ent e. A Figura 9 m ost ra exem plos da evolução em briológica norm al de cam undongos selvagens ( + / + ) e port adores ( + / - ) BALBc. Com relação aos C57Bl6, t am bém foram encont rados o m esm o alinham ent o do desenvolvim ent o em briológico e seus respect ivos fenót ipos em cada est ágio. 49 Figura 9 Fot os de em briões de cam undongos cont role e port adores. Plano lat eral, vist a longit udinal. BALBc ( + / + ) e ( + / - ) com 11, 14 e 17 dias de desenvolvim ent o em brionário, com desenvolvim ent o adequado linear para cada est ágio e viáveis. Magnit udes 20, 10 e 6,5 respect ivam ent e. Sem escala. Font e: Mat erial fot ografado pela aut ora. Com o foi observado ant eriorm ent e, os em briões com deleção t ot al do rnf4 m orreram durant e a em briogênese e no período neonat al, e a análise anát om o- pat ológica m ost rou que t ant o os anim ais C57Bl6 quant o os BALBc apresent aram um ret ardo acent uado do crescim ent o ( Figura 10) . Os em briões - / - apresent aram sinais de congest ão e ret enção de líquidos no t erceiro espaço, ou sej a, com quadro com pat ível de falência cardíaca. 50 Tam bém foram descrit os exem plares com dist úrbios hem at ológicos, t ais com o sufusões hem orrágicas report adas em am bas as linhagens e ret enção de sangue na periferia. O núm ero de reabsorções nos anim ais BALBc foi acim a da m édia para gest ações de cam undongos não- t ransgênicos que é de dois de acordo com a lit erat ura [ 76] . Foram report ados, em m édia, t rês reabsorções por ninhada, t endo ocorrido em 17 das 55 ninhadas analisadas. Para os C57Bl6, a ocorrência foi abaixo do esperado, sendo observada um a reabsorção por ninhada em 14 ninhadas das t am bém 55 ninhadas est udadas, ressalt ando- se que não foi observada nenhum a ninhada com 3 ou m ais reabsorções/ ninhada ent re os C57Bl6. No t ot al, nas duas linhagens ( BALBc e C57Bl6) , foram colet ados 825 em briões, provenient es em briões/ ninhada. A de 110 m édia ninhadas, para com m édia cam undongos de set e não- m odificados genet icam ent e é de oit o concept os por ninhada, acrescidos das duas reabsorções, em um t ot al de dez [ 76] . Alt erações m acroscópicas anat ôm icas, com o palidez, edem a, pequeno para idade gest acional, alt erações hem orrágicas, com o j á descrit as, e m ut ações aberrant es, com o anencefalia, foram regist radas em m et ade das ninhadas, sendo descrit as essas alt erações. Alguns exem plos dessas peças e alt erações pat ológicas, com o as cit adas acim a, est ão ilust rados na Figura 10. 51 Figura 10 - Em briões rnf4 delet ados. A. Em briões C57Bl6 de 12 dias de em briogênese ( E) classificado com o het erozigot o ( + / - ) e hom ozigot o com deleção t ot al para rnf4 ( - / - ) , observa- se um ret ardo acent uado do desenvolvim ent o no em brião hom ozigot o ( / - ) , quando com parado ao em brião het erozigot o da m esm a ninhada. B. Em brião BALBc em processo de reabsorção, com necrose avançada, pert ecent e à ninhada com 14 dias de desenvolvim ent o em brionário. Escala da barra: 1m m . Font e: Mat erial fot ografado pela aut ora. 4.3 Análise dos corações rnf4 deletados A análise hist ológica do coração dos em briões C57Bl6 e BALBc m ost rou que os hom ozigot os com deleção do rnf4 ( - / - ) apresent aram defeit o do sept o vent ricular, pois não ocorreu o fecham ent o do sept o m em branoso, após o est ágio do desenvolvim ent o de E13. Quando foram obt idas evidências dessa persist ência de com unicação esquerda- direit a, com result ant e alt eração m orfológica em respost a a um a hem odinâm ica alt erada, foram descrit os os achados de paredes vent riculares finas, em especial à direit a, associados à desorganização das cam adas celulares e ao conseqüent e aum ent o das câm aras cardíacas, assim com o paredes at riais finas e dilat adas. Depois do est ágio de E13, essas alt erações hist ológicas foram evoluindo e im pedindo o bom funcionam ent o cardíaco. Finalm ent e, nos est ágios de E16 e E17, t odos os em briões ( - / - ) apresent aram necrose em est ágios avançados, o que, inclusive, prej udicou o processo de 52 coloração e a qualidade das lâm inas. O foco dest e est udo foi o coração. Port ant o, não foram anot adas as alt erações ou não foram encont radas nos out ros órgãos do corpo, com o, por exem plo, pulm ão, rim , ent re out ros. Todos esses cort ej os m orfológicos foram descrit os nos cort es hist ológicos analisados de em briões delet ados para rnf4 e m ost rados na série da Figura 11, a seguir. 53 Figura 11: Corações rnf4 delet ados. Seccionados em cort e t ransverso t orácico, visualizando as quat ro câm aras cardíacas, coradas com hem at oxilina e eosina. A. BALBc E12 cont role. B. BALBc E12 delet ado do gene rnf4 exibindo defeit o de sept o vent ricular. C. C57Bl6 E14 cont role. D. C57Bl6 E14 delet ado do gene rnf4 exibindo persist ência de defeit o de sept o vent ricular, efusão pericárdica, desorganização das cam adas vent riculares e paredes cardíacas finas. E. BALBc E16 cont role. F. BALBc E16 delet ado do gene rnf4 exibindo defeit o de sept o vent ricular e necrose avançada, com perda da arquit et ura m orfológica. Escala da barra: 1m m . local da lesão ident ificada. Font e: Mat erial fot ografado pela aut ora. 54 5 DISCUSSÃO A est rat égia da m odificação do pat rim ônio genét ico de um anim al, sej a at ravés da inserção ou por m eio da deleção de um gene de int eresse, t em - se m ost rado um a im port ant e ferram ent a para a com preensão de várias pat ologias, incluindo as relacionadas à em briogênese e, m ais part icularm ent e, à cardiogênese. Genes candidat os a t erem papel im port ant e na cardiom iogênese j á foram isolados usando est e t ipo de experim ent o [ 78] . Com o result ado desses experim ent os vários genes ao longo dos últ im os anos vêm sendo im plicados na cardiogênese. Esses genes est ão envolvidos em processos t ais com o a det erm inação localespecífica de um núm ero considerável de elem ent os, designação dos eixos direit o- esquerda e ant erior- post erior, dobram ent o sobre si e a rot ação sobre o eixo na form ação do coração. Em t odas as et apas da em briogenese, ocorre a expressão de grupos de genes que se acredit a serem com andados por genes- m est res, sinalizadores e organizadores desse processo de m ont agem de um órgão específico, inclusive, o coração [ 79] . Est udos com deleção gênica de cam undongos, com o Jumonji [ 52] , mdm4 ( oncogene da via p53) [ 80] e trap100 [ 81] ( prot eína associada do recept or de horm ônio t ireoidiano) , est e últ im o t am bém conhecido com o um com plexo m ediador, dem ont raram que quando delet ados, os anim ais apresent aram defeit os na form ação do coração, apesar de, com o no caso de Jumonji, o m esm o ser det ect ado ao longo de t odo o processo de em briogênese. Acrescent a- se que os genes rnf4 e Jumonji foram isolados do m esm o ensaio [ 51] e os dados de Jumonji m ost raram que ele t inha um papel na cardiogênese [ 52] . Est e fat o const it uiu um dos m ot ivos de t er sido desenhada est a pesquisa para invest igar se t am bém o rnf4 revelarse- ia im port ant e na form ação do coração. 55 Em briões delet ados do gene rnf4 apresent aram algum as anorm alidade fenot ípicas, quando com parados com os anim ais selvagens ou het erozigot os, com o por exem plo, t am anho m enor e edem a generalizado, que foi sugest ivo de ret enção de líquido no t erceiro espaço ( Figura 10) . Esse result ado confirm ou as expect at ivas de que o gene rnf4 desem penha um papel im port ant e na form ação do coração. Com parado com os em briões jmj ( - / - ) [ 52] , as alt erações dos em briões delet ados do rnf4 foram ainda m ais relevant es, pois alguns anim ais rnf4 ( - / - ) apresent aram além de edem a generalizado, quadros de hem orragia, palidez e grande núm ero de reabsorções, Figura 9. B. O fenôm eno de rebsorção foi observado, em especial, ent re os cam undongos da linhagem BALBc, com 74/ 423 ( 17,49% ) . I t o et al., 2002 [ 81] , em análise de 308 em briões delet ados para trap100, out ro gene t am bém envolvido na cardiom iogenêse, encont raram 62 decíduas vazias ( 20,12% ) , um valor duas vezes m aior que o observado para a gest ação norm al de cam undongos que é em t orno de 10% [ 76] . No ent ant o, o percent ual encont rado para em briões trap100 - / - ficou próxim o do valor encont rado nesse est udo. Na linhagem , C57Bl6, a t axa de reabsorções ficou bem abaixo do esperado, som ent e 5,22% ( 21/ 402) e analisando esse result ado especula- se um a explicação que poderia ser at ribuída ao efeit o da sucet ibilidade int rínseca dessa linhagem para a deleção do gene rnf4. Um a out ra razão seria at ribuir esse efeit o a erro na m anipulação gênica dessa linhagem de anim ais. Ent ret ant o, esse result ado não pode ser at ribuído à não- deleção no locus corret o, pois essa possibilidade foi afast ada pela re- checagem gênica realizada pelo serviço de pesquisa anim al da Universidade de Wisconsin, confirm ando que a deleção realm ent e ocorreu no crom ossom o corret o de am bas as linhagens, conform e o prot ocolo, e est e procedim ent o afast ou t am bém a possibilidade de erro pesquisador- dependent e. No que se refere à m orfologia do coração dos cam undongos, no décim o t erceiro dia de gest ação, as quat ro câm aras j á se apresent am 56 consolidadas [ 76] . Nos anim ais port adores da deleção rnf4 - / - , a part ir desse est ágio, int ervent ricular foram e descrit as repercussão persist ência dessa de sobrecarga com unicação hem odinâm ica, especulando- se que essa deleção foi responsável pelo obit uário. Cham a- se a at enção para o fat o de em briões com E16 em diant e só serem encont rados necrosados ( Figura 16.F) e, em especial, os da linhagem BALBc. A deleção do int ervent ricular, com rnf4 levou à persist ência da com unicação a repercussão hem odinâm ica int rínseca a esse defeit o de sept o vent ricular, caract erizada pela dilat ação das câm aras cardíacas, paredes finas vent riculares e desorganização de suas cam adas, levando à insuficiência cardíaca, t endo com o repercussão o acúm ulo de líquido no t erceiro espaço, por esse funcionam ent o inadequado de propulsão cardíaca, levando a óbit o fet al e a não- sobrevivent es para os cam undongos da linhagem C57Bl6 de 8% ( 34/ 402) . Result ados sem elhant es aos do present e t rabalho foram encont rados em em briões jmj - / - [ 52] , que em bora sej am capazes de sobreviver e nascer t am bém apresent am as m esm as alt eraçoes nos est ágios finais de E16. Acrescent ase que nos est ágios de E13 a E15 foram descrit os t am bém defeit o do sept o int ervent ricular e result ados sem elhant os ao encont rado no present e t rabalho, no ent ant o com out ros genes envolvidos na cardiom iogênese, j á foram report ados na lit erat ura [ 37- 39, 41- 43, 45] . No t rabalho de Migliorini et al. 2002 [ 80] , a m esm a est rat égia de deleção gênica usando o gene mdm4 t am bém result ou em t erat ogenias em diversos órgãos, inclusive o coração. Os dados anat ôm icos e hist ológicos dem onst raram que os corações colet ados de em briões selvagens e os delet ados do gene rnf4 obedeceram à seqüência de m ont agem desde placa pré- cardíaca at é as com plexas quat ro câm aras desenvolvim ent o ( E12) . Os em brionário anim ais linear, + /+ e foram + /- apresent aram saudáveis ao um nascer, cresceram e reproduziram - se ( Figura 9) . Os recessivos ( - / - ) m ost rados na Figura 11 apresent avam a hist o- arquit et ura de quat ro- câm aras cardíacas e concordant es com os achados de Lee et al., 2000 [ 52] , de defeit o de 57 sept o vent ricular, m as descordant es com o achado de dupla via de saída dos corações jmj - / - . Esses fat os ressalt am a im port ância do rnf4 ao longo do processo de form ação do coração e o coloca com o candidat o a gene- m est re fet al prim ordial na form ação do coração. Gene fet al consist e em genes present es desde o início do desenvolvim ent o e que, durant e t odas as fases, age direcionando as linhagens celulares para se diferenciarem em diversos t ecidos que com põem um órgão [ 41] . Acredit a- se que esses genes possam volt ar a ser expressos quando o órgão encont ra- se em um a sit uação de sobrecarga. Port ant o, esses genes poderiam ser im port ant es m arcadores de doença, por exem plo, no quadro de insuficiência cardíaca. Acrescent a- se que o conj unt o dos dados provenient es da genot ipagem de am bos os grupos ( BALBc e C57Bl6) m ost rou que, em várias et apas do desenvolvim ent o em briológico, não ocorreu herança aut ossôm ica recessiva e, no período de E15 a E17, essa condição não foi sat isfeit a para os cam undongos BALBc, assim com o não houve relat o de sobrevivent es nesse grupo, o que corrobora para o fat o da m aior sucept ibilidade dest a linhagem à deleção do rnf4, ou sej a, as duas linhagens t iveram respost as diferent es em relação ao dogm a da lei de ¼ de ( - / - ) . Todavia, não se pode m enosprezar os fat ores genét icos, além dos epigét icos e hem odinâm icos que, cert am ent e, int erferem na condução desse processo de cit odiferenciação, sej am eles locais ou à dist ância. Esse conceit o defendido, ant eriorm ent e, por Sim ões- Cost a et al. 2005 [ 26] e esse present e est udo de m anipulação gênica são concordant es. Nest e est udo, os em briões com deleção do gene rnf4 exibiram m al form ações cardíacas significat ivas, com let alidade fet al ou no período neonat al im ediat o ( P0.5) , com o m ost rado na Tabela 1. Adiciona- se o fat o de que, ao se delet ar o rnf4, obt eve- se m ort e fet al em sua quase t ot alidade e som ent e foi observada a ocorrência de t rês casos de nat ivivos ( P0.5) ent re os 825 anim ais t rabalhados, e t odos esses anim ais 58 pert enciam à linhagem C57Bl6, sendo encont radas apenas part es em decom posição dos corpos na caixa com m enos de um dia de vida, m as que, m esm o assim , foram genot ipados e revelaram - se ( - / - ) . Ressalt a- se que ent re os BALBc não ocorreu nascim ent o de anim ais com deleção t ot al ( - / - ) e nenhum vivo com 21 dias de vida em am bas as linhagens. No ent ant o, Lee et al. 2000 [ 52] , em est udo com deleção do gene jmj, que foi obt ido no m esm o experim ent o de pré- seleção que rnf4, report aram 38 em brões vivos jmj ( - / - ) e, desses, m ais de 12 m orreram no período ( P0.5) , sendo que esses em briões, provavelm ent e, foram nat im ort os, j á que nos pulm ões não foi evidenciado ar. Por out ro lado, os em briões - / rnf4 apresent aram lesões cardíacas im port ant es que im possiblit aram o relat o de sobrevivent es ent re os da linhagem BALBc. Quant o a let alidade em briônica dos cam undongos da linhagem C57Bl6, nesse t rabalho, foi em t orno de 8% ( 17/ 211) at é o décim o segundo dia ( E12) de desenvolvim ent o em brionário podendo especular- se que essa m ort alidade deve- se provavelm ent e a insuficiência de proliferação celular. Sem elhant e m ort alidade, ( 7% - 23/ 308) t am bém foi report ada no est udo de I t o et al. 2002 [ 81] que observaram m al form ações com plexas, inclusive cardíacas, at é o E10.5 de desenvolvim ent o do em brião. Lee et al. 2000 [ 52] obt iveram 8% ( 27/ 326) de jmj ( - / - ) e report aram t am bém anorm alidade int ervent ricular. Por out ro lado, na linhagem BALBc, foi achada a m et ade da incidência ent re os classificados com o rnf4 hom ozigot os recessivos que foi de 4% ( 18/ 423) , englobando as faixas de desenvolvim ent o em brionário at é E16. Na cardiogênese, um a das classes de prot eínas m uit o im port ant e, const it ui os fat ores de t ranscrição da classe RI NG finger que m ost ram evidências de exercerem função ao longo do processo de form ação do coração, t endo alguns represent ant es dessa classe de prot eínas j á bem docum ent ados com o relacionadas no envolvim ent o desse processo, t ais com o: BMP [ 32- 33] , MEF [ 34- 37] , GATA [ 48- 49] . A prot eína RNF4 é t am bém um fat or t ranscricional RI NG finger ( Figura 6) e aparece com o 59 m ais um candidat o a t er função na cardiogênese. Essa classe de prot eína age em associação e esse fat o pode ser essencial na det erm inação da alt a com plexidade das est rut uras do coração. As et apas de form ação do coração ocorrem de form a escalonada e regionalizant e para, no final, t erse o órgão único e funcionant e, ou sej a, durant e a form ação do coração, ocorre a regionalização das est rut uras e um a ação det erm iníst ica que direciona det erm inado grupo celular oriundo de um lugar sabidam ent e conhecido, a m igrar para um out ro local específico e, só quando est a colônia de células encont ra- se nesse local pré- det erm inado, o fenót ipo e a função passam , de fat o, a ocorrer. Por isso, essa expressão é det erm iníst ica e específica [ 82] . Esse processo inicia- se a part ir dos prim órdios da placa pré- cardíaca, seguido pela form ação do t ubo, do dobram ent o desse t ubo, da sept ação e rot ação, finalizando com a m ont agem das quat ro câm aras, pelo posicionam ent o das valvas át riovent riculares. Os dois últ im os event os para com plet ar a form ação do coração, em conj unt o m ost ram o grau de sofist icação desse órgão, são a circulação vascular fechada própria e o sist em a condut or, com um a com plexidade int egradora adm irável, chegando ao décim o t erceiro dia de desenvolvim ent o ao m odelo de quat ro câm aras [ 25] . Nest e t rabalho, t ant o os em briões BALBc e C57Bl6 não com plet aram a sept ação vent ricular, assim com o report ado ant eriorm ent e [ 41- 44] . A prot eína RNF4 [ 56] , assim com o, prot eína BMP [ 13, 32, 33] t am bém se m ost ra bem conservada evolut ivam ent e em anfíbios, aves e m am íferos. BMP é um fort e candit ado com o m arcador precoce do desenvolvim ent o, pois se m ost ra com o m arcador genét ico da at ividade t ranscricional dorsal e vent ral do m esoderm a na fase inicial de blast ocist o, ou sej a, na det erm inação do eixo ânt ero- post erior e, quando delet ado, os em briões não form am nem a placa pré- cardíaca [ 33] . Est e carát er t em poral e espacial de BMP pode represent ar um bom m arcador de fase precoce do desenvolvim ent o em brionário. RFN4 poderia ser um m arcador de fase m édia de desenvolvim ent o j á que nesse experim ent o com em briões de cam undongos rnf4 - / - , a anom alia descrit a foi det ect ada na 60 fase m édia do desenvolvim ent o a part ir do décim o t erceiro dia de em briogênese, quando o sept o int ervent ricular deveria t er sido com plet ado, e esse fat o não ocorreu vide Figura 11 B, D e F. É int eressant e observar que out ros fat ores de t ranscrição regulam a form ação do sept o int ervent ricular. Assim , a deleção do gene m ef2 de cam undongos codifica as prot eínas MEF2A, B, C e D. Essas quat ro sublinhagens som ent e MEF2C m ost raram - se ser responsáveis por má form ação do sept o int ervent ricular e das valvas át rio- vent riculares do coração no décim o prim eiro dia de desenvolvim ent o em brionário que, acredit a- se, lideraram a causa do óbit o fet al at é o décim o quint o dia em brionário. No ent ant o, quant o à deleção de MEF2B, não houve relat o de alt eração cardiológica. Acredit a- se que MEF2C seria um a sub- população de células cardiogênicas present es no t ubo cardíaco e relacionadas com o cont role da form ação do vent rículo direit o [ 34- 37] . No at ual t rabalho com RNF4, t am bém foi docum ent ado defeit o do sept o vent ricular ( DSV) e, em especial, do sept o m em branoso que é form ado a part ir do anel fibroso át rio- vent ricular, e não do sept o m uscular, apesar do relat o de alt eração das cam adas das paredes vent riculares t ais com o paredes finas e desorganizadas. Um out ro fat or t ranscricional com função na cardiogênese que t em t am bém sua ação relacionada na diferenciação do vent rículo direit o é o GATA [ 49] e est udos [ 39, 48] de deleção gênica em cam undongos, dessa prot eína, dem onst ram que um fat or rest rit o de um a det erm inada câm ara at ua de de form a cooperat iva com out ros fat ores t ranscricionais, o que leva a supor a exist ência de co- reguladores que, em cooperação com GATA 4, cont rolariam a expressão gênica da form ação do vent rículo direit o, ou sej a, ação pont ual e específica no processo de form ação do coração, pont uando- se, ainda, que essa co- regulação t ant o pode ser posit iva quant o negat iva a depender de quem são os parceiros e do m om ent o espacial ao longo desse processo. RNF4 e GATA4 [ 69] dem onst raram que in vit ro e em cult ura de células int eragiram , e essa 61 int eração result a em am plificação da at ividade t ranscricional por provável ligação diret a ao DNA, at ravés da região prom ot ora rica em GC [ 61, 64] . Essas evidências colocam o RNF4 com o t endo um a ação regulat ória e a deleção do gene que o expressa, ao longo do processo de form ação do coração, com o essencial na m orfo- arquit et ura do sept o int ervent ricular. Além disso, os fat ores de t ranscrição foram report ados com o ligant es de recept ores nucleares ( Figura 4) . Est udos ut ilizando anim ais t ransgênicos dem onst raram que o recept or de ácido ret inóico ( RAR) , um recept or nuclear que é at ivado por fat ores de t ranscrição, é t am bém im port ant e no est abelecim ent o da segm ent ação ânt ero- post erior, assim com o na form ação das câm aras post eriores do coração e vias de saída ( aort a e art éria pulm onar) [ 44] . Em experim ent o com em briões de cam undongos RAR delet ados, foi descrit a a ocorrência de canal át riovent ricular ( canal A- V) , ou sej a, sem a form ação do sept o int ervent ricular m uscular e m em branoso de form a adequada [ 45] . O ácido ret inóico é um m et abólit o at ivo da vit am ina A e um sinalizador m olecular em brionário de vert ebrados, pois excesso de ácido ret inóico leva a efeit o t erat ogênico sobre o coração, em em briões na faixa de 9- 15 dias de desenvolvim ent o em brionário, e a via de ocorrência é at ravés do RAR e não at ravés do RXR ( recept or de ácido ret inóico X) [ 46] . Além disso, os em briões de cam undongos jmj - / - [ 52] apresent aram canal A- V associado a DSV e, no est udo de Habet s et al. 2002 [ 31] , foi descrit o só canal A- V. Nos em briões rnf4 - / - com o dit o ant eriorm ent e, foi descrit o DSV de m aneira isolada. A prot eína RNF4 é um fat or t ranscricional de localização nuclear [ 60] , agindo em com plexos, a depender de com que parceiro est á int eragindo, est im ulando diret am ent e com o com est eróide [ 54, 63] , andrôgeno [ 57, 71, 74] , est rógeno [ 72, 73] , GATA [ 69] ou co- at ivando Sp1 [ 63] , SPBP [ 68] , TRPS [ 69] ) at ravés de m ult i- com plexos, at uando no núcleo. Por out ro lado, co- reprim indo com o quando se liga à PATZ [ 70, 71] , sendo reconhecido com o co- regulador t ranscricional ou, m ais precisam ent e, com o um a pont e de ligação ent re fat ores de t ranscrição, 62 at uando com o um fat or t ranscricional m ult ifuncional envolvido na regulação do crescim ent o celular. Apesar de o est udo at ual ser m orfofuncional, concorda- se com esses dados publicados ant eriorm ent e e especula- se que, em decorrência de ser um regulador t ranscricional, a ausência de RNF4 pode est ar envolvida no achado do núm ero reduzido de cam adas celulares dos vent rículos, configurando um a parada no ciclo celular ( Figura 11. D) . Evidências sobre o rnf4 e sua prot eína expressa RNF4 foram com piladas com o est ando envolvidos na em briogênese. Com o prot eína é reconhecida com o fat or de t ranscrição da fam ília RI NG finger e por t er seqüência de ligação diret a ao DNA, acum ulam - se indícios de agir com o co- at ivadora ou co- repressora, a depender de com quem est ej a se ligando e form ando com plexos [ 54, 61, 62, 64, 66, 68- 71] . Em decorrência de t odos esses dados, at é o m om ent o, sugere- se que a prot eína RNF4 pode t er ação no ciclo celular, por sua localização nuclear [ 60] , t endo os dados prelim inares nort eado o desenho dest e est udo e as inform ações obt idas, reforçando o fat o da ocorrência de alt eração no processo de divisão celular, com desorganização das cam adas celulares em parede de vent rículos, com o vist o nas lâm inas hist ológicas at é o ext rem o quadro de alt eração m orfológica de anarquia t ot al da arquit et ura t ecidual que, no final do desenvolvim ent o fet al, apresent a- se com o necrose difusa e avançada. Com o ressalt aram Kent sis e Borden 2004 [ 83] , m uit o ainda t em a se desvendar a respeit o dessas assem bléias supra- m oleculares de prot eínas, seus m ecanism os e significado biológico. As anorm alidades encont radas nos cam undongos delet ados para o gene rnf4 foram com pat íveis com o quadro clínico pat ológico em hum anos de insuficiência cardíaca, associado a doenças congênit as cardíacas. Com o os genes rnf4 hum ano e de cam undongo apresent am 98% de com pat ibilidade, pode- se ext rapolar os achados dest e t rabalho para m elhor ent ender congênit as, as pat ologias do coração t ant o adquiridas quant o no que diz respeit o ao papel desses genes fet ais na 63 m orfologia e na fisiologia do coração. Por fim , os achados anat ôm icos e hist ológicos do present e est udo são com pat íveis com as alt erações fisiopat ológicas de insuficiência cardíaca congest iva, e evolução com prognóst ico fechado para m ort e. Sabe- se que essa síndrom e clínica em hum anos, os pacient es, expressa genes fet ais, com o j á dem onst rado para o recept or do horm ônio t ireoidiano por Kinugawa et al. 2001 [ 40] . Sendo assim , o rnf4 poderia t am bém candidat ar- se a gene fet al m est re, podendo ser esse fat or t ranscricional ( RNF4) o elo ent re os genes const rut ores do coração e o ret orno de sua expressão, em decorrência do est ado pat ológico da falência cardíaca, t ant o em decorrência de m orbidades congênit as quant o cianót icas ( Tet ralogia ( Persist ência do Canal Art erial) , bem de Fallot ) ou acianót icas com o adquiridas ( Síndrom es Coronárias) . O desafio para os próxim os anos consist e em ent ender com o, at ravés de indução, o m úsculo cardíaco é form ado durant e a em briogênese e qual o im pact o dessas inform ações com o recurso na t erapia de regeneração cardíaca e de subst it uição de células do coração, assim com o essas inform ações sobre cardiogênese podem aj udar na ut ilização de t erapia gênica com células- t ronco t ant o em briônicas quant o adult as na rest auração da função m iocárdica. 64 6 CONCLUSÕES O gene rnf4 é essencial na form ação do coração de cam undongos; Cam undongos hom ozigót icos com deleção do gene rnf4 apresent am persist ência da com unicação ent re vent rículos direit o e esquerdo devido à m á form ação do sept o vent ricular, com hem odinâm ica e m orfologia clínica de repercussão insuficiência cardíaca congest iva; Essa m á form ação cardíaca est á associada à elevada t axa de óbit o fet al nos prim eiros m om ent os de vida int ra- ut erina, sem regist ros de sobrevivent es com deleção do gene rnf4. 65 REFERÊNCIAS 1. BOCCHI , E. A. ( 2005) . I Diret riz Lat ino- Am ericana para avaliação e condut a na insuficiência cardíaca descom pensada. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 85( SI I I ) : 6- 48. 2. BRASI L. Minist ério da Saúde. Saúde/ est at íst ica; vit al/ m ort alidade geral. Disponível em : www.dat asus.gov.br/ inform ações. Acesso em : j an., 2006. 3. ALBANESI FI LHO, F. M. ( 2005) . O que vem ocorrendo com a insuficiência cardíaca no Brasil?. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 85( 3) : 155- 156. 4. BASI SI O, I . B. J.; CAPPELLARI , M. M. ( 1996) . I nsuficiência cardíaca na infância, in: Souza, A. G. M. R., Mansur, A. J. Edit ores. SOCESP Cardiologia. Edit ora At heneu, São Paulo, p. 756- 760. 5. WEI NTRAUB, W. S.; COLE, J.; TOOLEY, J. F. ( 2002) Cost and cost effect iveness st udies in heart failure research. Am erican Heart Journal, 143: 565- 576. 6. HUNTER, J. J.; CHI EN, K. R. ( 1999) . Signaling pat hways for cardiac hypert rhphy and failure. The New England Journal of Medicine, 341( 17) : 1276- 1283. 7. BRUNEAU, B. G. ( 2002) . Transcript ional regulat ion of vert ebrat e cardiac m orphogenesis. Circulation Research, 90: 509- 519. 8. JAMES, J.; ZHANG, Y.; WRI GHT, K.; WI TT, S.; GLASCOCK, E.; OSI NSKA, H.; KLEVI TSKY, R.; MARTI N, L.; YAGER, K.; SANBE, A.; ROBBI NS, J. ( 2002) . Transgenic rabbit s expressing m ut ant essencial light chain do not develop hypert rophic cardiom yopat hy. Journal Molecular and Cell Cardiology, 34( 7) : 873- 882. 9. LAWSON K. A.; MENESES, J. J.; PERDERSEN, R. A. ( 1991) . Clonal analisis of epiblast fat e during germ layer form at ion in t he m ouse em bryo. Development, 113( 3) : 891- 911. 66 10. CHEN, J. N.; FI SHMAN, M. C. ( 1996) . Zebrafish t inm an hom olog dem arcat es t he heart fiels and init iat es m yocardial different iat ion. Development, 122( 12) : 3809- 3816. 11. TRAI NOR, P. A.; ZHOU, S. X.; PARAMESWARAN, M.; QUI NLAN, G. A.; GORDON, M.; STRURM, K.; TAM, P. P. L. ( 1999) . Applicat ion of lacZ t ransgenic m ice t o cell lineage st udies. Molecular Em bryology, 97: 183200. 12. YAMAMOTO, M.; SAI JOH, Y.; PEREA- GOMEZ, A.; SHAWLOT, W.; BEHRI NGER, R. R.; ANG, S. L.; HAMADA, H.; MENO, C. ( 2004) . Nodal ant agonist s regulat e form at ion of t he ant eropost erior axis of t he m ouse em bryo. Nature, 428( 6981) : 387- 392. 13. YUTZEY, K.; GANNON, M.; BADER, D. ( 1995) . Diversificat ion of cardiom yogenic cell lineages in vit ro. Developm ent al Biology, 170( 2) : 531- 541. 14. XAVI ER NETO, J.; ROSENTHAL, N.; SI LVA, F. A.; MATOS, T. G.; HOCHGREB, T.; LI NHARES, V. L. ( 2001) . Ret inoid signaling and cardiac ant eropost erior segm ent at ion. Genesis, 31: 97- 104. 15. SEARCY, R. D.; YUTZEY, K. E. ( 1998) . Analysis of Hox gene expression during early avian heart developm ent . Developm ent al Dynam ics, 213( 1) : 82- 91. 16. SUCOV, H. M. ( 1998) . Molecular insight s int o cardiac developm ent . Annual Review Physiology, 60: 287- 308. 17. SCHULTHEI SS, T. M.; LASSAR, A. B. ( 1999) . Vert ebrat e heart induct ion. I n: HARVEY, R. P., ROSENTHAL, N. Heart Developm ent , Academ ic Press, San Diego, p. 51. 18. DU, A.; SANGER, J. M.; LI NASK, K. K.; SANGER, J. W. ( 2003) . Myofibrillogenesis in t he first cardiom yocyt es form ed from isolat ed quail precardiac m esoderm . Developmental Biology, 257( 2) : 382- 394. 19. LI NASK, K. K.; HAN, M. D.; LI NASK, K. L.; SCHLANGE, T.; BRAND, T. ( 2003) . Effect s of ant isense m isexpression of CFC on dow nst ream flect ion 67 prot ein expression 228( 2) : 217- 230. during heart looping. Developm ent al Dynam ics, 20. LI NASK, K. K. ( 2003) . Regulat ion of heart m orphology: current m olecular and cellular perspect ives on t he coordinat ed em ergence of cardiac form and funct ion. Birt h Defect s Research Part C Em bryo Today, 69( 1) : 14- 24. 21. DELORME, B.; DAHL, E.; JARRY- GUI CHARD, T.; MARI CS, I .; BRI AND, J. P.; WI LLECKE, K.; GROS, D.; THEVENI AU- RUI SSY, M. ( 1995) . Developm ent regulat ion of connexin 40 gene expression in m ouse heart correlat es wit h t he different iat ion of conduct ion syst em . Am erican Journal of Anatomy, 204( 4) : 358- 371. 22. WALDO, K. L.; LO, C. W.; KI RBY, M. L. ( 1999) . Connexin 43 expression reflect s neural crest pat t erns during cardiovascular developm ent . Developmental Biology, 208( 2) : 307- 323. 23. LI , W. E.; WALDO, K.; LI NASK, K. L.; CHEN, T.; WESSELS, A.; PARMACEK, M. S.; KI RBY, M. L.; LO, C. W. ( 2002) . An essencial role for connexin43 gap j unct ions in m ouse coronary art ery. Development, 129( 8) : 2031- 2042. 24. RENTSCHLER, S.; VAI DYA, D. M.; TAMADDON, H.; DEGENHARDT, K.; SASSOON, D.; MAORLEY, G. E. ( 2001) . Visualizat ion and funct ional charact erizat ion of t he developing m urine cardiac conduct ion syst em . Development, 128: 1785- 1792. 25. HARVEY, R. P.; BI BEN, C.; ELLI OTT, D. A. ( 1999) . Transcript ional cont rol and pat t ern form at ion in t he developing vert ebrat e heart : st udies on NK- 2 class hom eodom ain fact ors. I n: HARVEY, R. P.; ROSENTHAL, N. Heart Development, Academ ic Press, San Diego p. 111. 26. SI MÕES- COSTA, M. S.,; VASCONCELOS, M.; SAMPAI O, A. C.; CRAVO, R. M.; LI NHARES, V. L.; HOCHGREB, T.; YAN, C. Y. I .; DAVI DSON, B.; XAVI ER- NETO, J. ( 2005) . The evolucionary origin of cardiac cham bers. Developmental Biology, 277( 1) : 1- 15. 68 27. FI RULLI , A. B.; THATTALI YATH, B. D. ( 2002) . Transcript ion fact ors in cardiogenesis: t he com binat ions t hat unlock t he m yst eries of t he heart . International Review of Cytology, 214: 1- 62. 28. CSERJESI , P.; BROWN, D.; LYONS, G. E.; OLSON, E. N. ( 1995) . Expression of t he novel basic helix- loop- helix gene eHAND in neural crest derivat ives and ext raem bryonic m em branes during m ouse developm ent . Developmental Biology, 170: 664- 678. 29. CHEN, C. Y.; SCHWARTZ, R. J. ( 1995) . I dent ificat ion of novel DNA binding t arget s and regulat ory dom ains of a m urine t inm an hom eodom ain fact or, nkx- 2.5. Journal Biological Chemistry, 270( 26) : 15628- 15633. 30. LO, P. C.; FRASCH, M. ( 2003) . Est ablishing A- P polarit y in t he em bryonic heart t ube: a conserve funct ion of Hox genes in Drosophila and vert ebrat es? Trends Cardiovascular Medicine, 13( 5) : 182- 187. 31. HABETS, P. E.; MOORMAN, A. F.; CLOUT, D. E.; van ROON, M. A.; LI NGBEEK, M.; van LOHUI ZEN, M.; CAMPI ONE, M.; CHRI STOFFELS, V. M. ( 2002) . Cooperat ive act ion of Tbx2 and Nkx2.5 inhibit s ANF expression in t he at riovent ricular canal: im plicat ion for cardiac cham ber form at ion. Genes & Development, 16( 10) : 1234- 1246. 32. CLEMENT, J. H.; FETTES, S.; KNOCHEL, P.; LEF, J.; KNOCHEL, W. ( 1995) . Bone m orphorgenet ic pot ein 2 in t he early developm ent of Xenopus leavis. Mechanics Developmental, 52: 357- 370. 33. KI SHI GAMI , S.; YOSHI KAWA, S.; CASTRANI O, T.; OKAZAKI , K.; FURUTA, Y.; MI SHI NA, Y. ( 2004) . BMP signaling t hrough ACVRI is required for left - right pat t erning in t he early m ouse em bryo. Developmental Biology, 276( 1) : 185- 193. 34. ROSS, R. S.; NAVANKASATTUSAS, S.; HARVEY, R. P.; CHI EN, K. R. ( 1996) . An HF- 1a/ HF- 1b/ MEF- 2 com binat orial elem ent confers cardiac vent ricular specificit y and est ablished an ant erior- post erior gradient of expression. Development, 122( 6) : 1799- 1809. 35. EDMONDSON, D. G.; LYONS, G. E.; MARTI N, J. F.; OLSON, E. N. ( 1994) . Mef2 gene expression m arks t he cardiac and skelet al m uscle lineages during em bryogenesis. Development, 120: 1251- 1263. 69 36. LI N, Q.; LU, J.; YANAGI SAWA, H.; WEBB, R.; LYONS, G. E.; RI CHARDSON, J. A.; OLSON, E. N. ( 1998) . Requirem ent of t he MADS- box t ranscript ion fact or MEF2C for vascular developm ent . Development, 125: 4565- 4574. 37. BUCHBERGER, A.; ARNOLD, H. H. ( 1999) . The MADS dom ain cont aining t ranscript ion fact or cMef2a is expressed in heart and skelet al m uscle during em bryonic chick developm ent . Developm ent Genes and Evolution, 209( 6) : 376- 381. 38. TRANQUE, P.; CROSSI N, K. L.; CI RELLI , C.; EDELMAN, G. M.; MAURO, V. P. ( 1996) . I dent ificat ion and charact erizat ion of a RI NG zinc finger gene ( C- RZF) expresed in chicken em bryos cells. Proceeding Nat ional Academ y of Sciences of the U.S.A., 93( 7) : 3105- 3109. 39. HOLMES, M.; TURNER, J.; FOX, A.; CHI SHOLM, M. C.; CHONG, B. ( 1999) . hFOG- 2, a novel zinc finger prot ein, binds t he Co- repressor m ct BP2 and m odulat es GATA- m ediat ed act ivat ion. Journal of Biological Chemistry, 274( 274) : 23491- 23498. 40. KI NUGAWA, K.; MI NOBE, W.- A.; WOOD, W. M.; RI DWAY, C.; BAXTER, J. D.; RI BEI RO, R. C. J.; TAWADRONS, M. F.; LOWES, B. A.; LOMG, C. S.; BRI STOW, M. R. ( 2001) . Singnaling pat hways for fet al gene induct ion in t he failing hum an heart : evidence for alt ered t hyroid horm one recept or gene expression. Circulation, 103( 8) : 1089- 1094. 41. MADI AI , F.; HACKSHAW, K. ( 2002) . Expression of t he m ouse FGF- 1 and FGF- 1.A m RNAs during em bryonic developm ent and in aging heart . Research Com m unicat ion in Molecular Pat hology and Pharm acology, 112( 1- 4) : 139- 44. 42. KUBALAK, S. W.; MI LLER- HANCER, W. C.; O` BRI EN, T. X.; DYSON, E.; CHI EN, K. R. Cham ber specificat ion of at rial m yosin light chain- 2 expression precedes sept at ion during m urine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry, 269( 24) : 16961- 16970. 43. AKHURST, R. J.; LEHNERT, S. A.; FAI SSNER, A.; DUFFI E, E. ( 1990) . TGF bet a in m urine m orphogenet ic process: t he early em bryo and cardiogenesis. Development, 108( 4) : 645- 656. 70 44. NI EDERREI THER, K.; VERMONT, J.; MESSADDEQ, N.; SCHUHBAUR, B.; CHAMBON, P.; DOLLÉ, P. ( 2001) . Em bryonic ret inoic acid synt hesis is essent ial for heart m orphogenesis in t he m ouse. Development, 128: 1019- 1031. 45. YASUI , H.; MORI SHI MA, M.; NAKAZAWA, M.; AI KAWA, E. ( 1998) . Anom alous looping, at riovent ricular cushion dysplasia, and unilat eral vent ricular hypoplasia in t he m ouse em bryos w it h right isom erism induced by ret inoic acid. Anatomy Records, 250( 2) : 210- 219. 46. MOSS, J. B.; XAVI ER- NETO, J.; SHAPI RO, M. D.; NAYEEM, S. M.; McCAFFERY, P.; DRAGER, U. C.; ROSENTHAL, N. ( 1998) . Dynam ic pat t erns of ret inoic acid synt hesis and response in t he developing m am m alian heart . Development Biology, 199( 1) : 55- 71. 47. BOHNSACK, B. L.; LAI , L.; DOLLE, P.; HI RSCHI , K. K. ( 2004) . Signaling hierarchy downst ream of ret inoic acid t hat independent ly regulat es vascular rem odeling and endot helial cell proliferat ion. Genes & Development, 18( 11) : 1345- 1358. 48. WANG, G. F.; NI KOVI TS Jr., W.; SCHLEI NI TZ, M.; STOCKDALE, F. E. A posit ive GATA elem ent and a negat ive vit am in D recept or- like elem ent cont rol at rial cham ber- specific expression of a slow m yosin heavy- chain gene during cardiac m orphogenesis. ( 1998) . Molecular and Cellular Biology, 18: 6023- 6034. 49. McFADDEN, D. G.; CHARI TE, J.; RI CHARDSON, J. A.; SRI VASTAVA, D.; FI RULLI , A. B.; OLSON, E. N. ( 2000) . A GATA- dependent right vent ricular enhancer cont rols dHAND t ranscript ion in t he developing heart . Development, 127( 24) : 5331- 5341. 50. HARRI SON, S. M.; HOUZELSTEI N, D.; DUNWOODI E, S. L.; BEDDI NGTON, R. S. ( 2000) . Sp5, a new m em ber of t he Sp1 fam ily, is dynam ically expressed during developm ent and genet ically int eract s wit h Brachyury. Developmental Biology, 227( 2) : 358- 372. 51. BAKER, R. K.; HAENDEL, M. A.; SWANSON, B. J.; SHAMBAUGH, J. C.; MI CALES, B. K.; LYONS, G. E. ( 1997) . Developm ent ally in vit ro preselect ion of gene- t rapped em bryoníc st em cell clones for charact erizing novel regulat ed genes in t he m ouse. Developmental Biology, 185( 2) : 201214. 71 52. LEE, Y.; SONG, A. J.; BAKER, R.; MI CALES, B.; CONWAY, S. J.; LYONS, G. E. ( 2000) . Jum onj i, a nuclear prot ein t hat is necessary for norm al heart developm ent . Circulation Research, 86( 9) : 932- 938. 53. CHI ARI OTTI , L.; BENVENUTO, G.; FEDELE, M.; SANTORO, M.; SI MEONE, A.; FUSCO, A.; BRUNI , C. B. ( 1998) . I dent ificat ion and charact erizat ion of a novel RI NG- finger gene ( RNF4) m apping at 4p16.3. Genomics, 47: 258- 265. 54. MOI LANEN, A. M.; POUKKA, H.; KARVONEN, U.; HÄKLI , M.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J. ( 1998) . I dent ificat ion of a novel RI NG finger prot ein as a coregulat or in st eroid recept or- m ediat ed gene t ranscript ion. Molecular Cell Biology, 18( 9) : 5128- 5139. 55. HADANO, S.; I SHI DA, Y.; I KEDA, J. E. ( 1998) . The prim ary st ruct ure and genom ic organizat ion of five novel t ranscript s locat ed close t o t he Hunt ingt on's disease gene on hum an chrom osom e 4p16.3. DNA Research, 5 ( 3) : 177- 186. 56. PROTEI N STRUCTURE. Disponível em : www.ncbi.nln.nih.gov/ ent rez / prot ein/ st ruct ure/ Cn3D/ downloadcn3d- 4.1/ RNF4. Acesso em : 29 j an. 2006. 57. YAN, W.; HI RVONEN- SANTTI , S. J.; PALVI MO, J. J.; TOPPARI , J.; JÄNNE, O. A. ( 2002) . Expression of t he nuclear RI NG finger prot ein SNURF/ RNF4 during rat t est is developm ent suggest s a role in sperm at id m at urat ion. Mechanisms of Development, 118( 1- 2) : 247- 253. 58. KENTSI S, A.; BORDEN, K. L. ( 2000) . Const ruct ion of m acrom olecular assem blages in eukaryot ic processes and t heir role in hum an disease: linking RI NGs t oget her. Current Protein & Peptid Science, 1 ( 1) : 49- 73. 59. KLUG, W. S.; CUMMI NGS, M. R. ( 2000) . Concept s of GENETI CS. 6. ed. Prent ice Hall, I nc., New Jersey, p. 440. 60. HÄKLI N, M.; KARVONEN, U.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J. ( 2005) . SAMU- 1 prom ot es associat ion of SNURF ( RNF4) wit h PML nuclear bodies. Experimental Cell Research, 304( 1) : 224- 233. 72 61. HI RVONEN, S. J.; SANTTI , H.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J. ( 2002) . GC- Rich elem ent s flanking t he t ranscript ion st art sit e govern st rong act ivat ion on t he SNURF gene. Biochem ical and Biophysical Research Communications, 291( 40) : 897- 902. 62. HÄKLI , M.; KARVONEN, U.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J. ( 2001) . The RI NG prot ein SNURF is a bifunct ional prot ein possessing DNA binding act ivit y. Journal Biological Chemistry, 276: 23653- 23660. 63. POUKKA, H.; AARNI SALO, P.; SANTTI , H.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. ( 2000a) . Coregulat or Sm all Nuclear RI NG Finger Prot ein ( SNURF) Enhances Sp1- and St eroid Recept or- m ediat ed Transcript ion by Different Mechanism s. Journal Biological Chem ist ry, Washingt on DC, 275( 1) : 571579. 64. VI NOGRADOV, A. E. ( 2003) . DNA helix: t he im port ance of being GC - rich. Nucleic Acids Research, 31( 7) : 1838- 1844. 65. BONTEMPS, Y.; VUI LLERMOZ, B.; ANTONI CELLI , F.; PERREAU, C.; DANAN, J.- L.; MAQUART, F.- X.; WEGROWSKI , Y. ( 2003) . Specific prot ein1 is a universal regulat or of UDP- glucose dehydrogenase expression: it s posit ive involvem ent int ransform ing growt h fact or- { bet a} signaling and inhibit ion in hypoxia. Journal of Biological Chem ist ry, 278( 24) : 2156621575. 66. GALI LI , N.; NAYAK, S.; EPSTEI N, J. A.; BUCK, C. A. ( 2000) . Rnf4, a RI NG prot ein expressed in t he developing nervous and reproduct ive syst em s, int eract s wit h Gscl, a gene w it hin t he DiGeorge crit ical region. Developmental Dynamics, 218: 102- 111. 67. GOTTLI EB S.; EMANUEL, B. S.; DRI SCOLL, D. A.; SELLI NGER, B.; WANG, B.; ROE, B.; BUDARF, M. L. ( 1997) . The DiGeorge syndrom e m inim al crit ical region cont ains a Goosecoid- like ( GSCL) hom eobox gene t hat is expressed early in hum an developm ent . Am erican Journal Reumatology Genetic, 60: 1194- 1201. 68. LYNGSØ, C.; BOUTEI LLER, G.; DAMGAARD, C. K.; RYOM, D.; SANCHEZ- MUÑOZ, S.; NØRBY, P. L.; BONVEN, B. J.; JØRGENSEN, P. ( 2000) . I nt eract ion bet w een t he t ranscript ion fact or SPBP and t he posit ive cofact or RNF4. Journal Biological Chemistry, 275: 26144- 26149. 73 69. KAI SER, F. J.; MOROY, T.; CHANG, G. T.; HORSTHEMKE, B.; LUDECKE, H. J. ( 2003) . The RI NG finger prot ein RNF4, a co- regulat or of t ranscript ion, int eract s wit h t he TRPS1 t ranscrit ion fact or. Journal of Biological Chemistry, 278( 40) : 38780- 38785. 70. FEDELE, M.; BENVENUTO, G.; PERO, R.; MAJELLO, B.; BATTI STA, S.; LEMBO, F.; VOLLONO, E.; DAY, P. M.; SANTORO, M.; LANI A, L.; BRUNI , C. B.; FUSCO, A.; CHI ARI OTTI , L. ( 2000) . A novel m em ber of t he BTB/ POZ fam ily, PATZ, associat es wit h t he RNF4 RI NG finger prot ein and act s as a t ranscript ional repressor. Journal Biology Chemistry, 275(11) : 78947901. 71. PERO, R.; LEMBO, F.; PALMI ERI , E. A.; VI TI ELLO, C.; FEDELE, M.; FUSCO, A.; BRUNI , C. B.; CHI ARI OTTI , L. ( 2002) . PATZ at enuat es t he RNF4 m ediat ed enhancem ent of androgen recept or- dependent t ranscript ion. Journal Biology Chemistry, 277( 5) : 3280- 3285. 72. SAVI LLE, B.; POUKKA, H.; WORMKE, M.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J.; STONER, M.; SAMUDI O, I .; SAFE, S. ( 2002) . Cooperat ive coact ivat ion of est rogen recept or in ZR- 75 hum an breast cancer cells by SNURF and TATA- binding prot ein. The Journal of Biological Chemistry, 277( 25) : 24852497. 73. HI RVONEN, S. J.; RANNI KKO, A.; SANTTI , H.; SAVOLAI NEN, S.; NYBERG, M.; JÄNNE, O. A.; PALVI MO, J. J. ( 2003) . Down- regulat ion of est rogen recept or ß and t ranscript ional coregulat or SNURF/ RNF4 in t est icular germ cell cancer. European Urology, 44( 6) : 742- 747. 74. POUKKA, H.; KARVONEN, U.; YOSHI KAWA, N.; TANAKA, H.; PALVI MO, J. J.; JÄNNE, O. A. ( 2000b) . The RI NG finger prot ein SNURF m odulat es nuclear t rafficking of t he androgen recept or. Journal Cell Science, 113: 2991- 3001. 75. THOMPSON, J. S.; THOMPSON, M. W. ( 1993) . Genét ica Médica. 5ª Edição. Edit ora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 60p. 76. RUGH, R. ( 1990) . The m ouse it s reproduct ion and developm ent . Oxford Universit y Press, New York, p. 210. 74 77. 318, SMI , ( 2002) . Universit y of Wisconsin, Medical School, Madison, WI , USA. 78. FI SHMAN, M. C.; CHI EN, K. R. ( 1997) . Fashioning t he vert ebrat e heart : earliest em bryonic decisions. Development, 124( 11) : 2099- 2117. 79. BRAND, T. ( 2003) . Heart developm ent : m olecular insight s int o cardiac specificat ion and early m orphogenesis. Developm ent al Biology, 258( 1) : 119. 80. MI GLI ORI NE, D.; DENCHI , E. L.; DANOVI , D.; JOCHEMSEM, A.; CAPI LLO, M.; GOBBI , A.; HELI N, K.; PELI CCI , P. G.; MARI NE, J. C. ( 2002) . Mdm 4 ( Mdm x) regulat es p53- induced growt h arrest and neuronal cell deat h during early em bryonic m ouse develom pm ent . Molecular and Celular Biology, 22( 15) : 5527- 5538. 81. I TO, M.; OKANO, H. J.; DARNELL, R. B.; ROEDER, R. G. ( 2002) . The TRAP100 com ponent of t he TRAP/ Mediat or com plex is essent ial in broad t ranscript ional event s and develom pm ent . EMBO Journal, 1 ( 13) : 34643475. 82. MOORMAN, A. F.; CHRI STOFFELS, V. M. ( 2003) . Cardiac cham ber form at ion: developm ent , genes, and evolut ion. Physiology Review, 83: 1223- 1267. 83. KENTSI S, A.; BORDEN, K. L. ( 2004) . Physical m echanism s and biological significance of supram olecular prot ein self- assem bly. Current Protein Peptid Science, 5 : 125- 134.