Fermentaciones aerobicas especiales

BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Producción de: ácido acético, ácido cítrico, ácido glucónico. Cepas utilizadas. Substratos técnicos. Condiciones de los procesos. Rendimientos. Controles de los procesos. Recuperación de los productos. Usos. Producción de vinagre. Nociones sobre la tecnología de elaboración. BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES INDICE INTRODUCCION A LAS FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES………………………………….. Producción de ácido cítrico………………………………………………………………………………………………... Introducción. Biosíntesis del ácido cítrico. Cepas utilizadas. Sustratos técnicos. Condiciones y controles de los procesos. Procesos en superficies. Procesos sumergidos. Rendimientos. Recuperación del producto. Usos. Producción de ácido glucónico………………………………………………………………………………………….11 Introducción. Biosíntesis del ácido glucónico. Cepas utilizadas. Condiciones y controles de los procesos. Recuperación del producto. Rendimientos. Usos. Producción de ácido acético……………………………………………………………………………………………...15 Introducción. Biosíntesis del ácido acético. Cepas utilizadas. Sustratos técnicos. Recuperación del producto. Producción de vinagre……………………………………………………………………………………………………...17 Introducción. Nociones sobre la tecnología de elaboración. Procesos en superficies. Método de Orleáns o método lento. Generador de goteo o método alemán. Procesos sumergidos. Diagrama de flujo. Fuentes de Información……………………………………………………………………………………………………24 Página 2 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES INTRODUCCION A LAS FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos crecimiento y formación de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente o no según los casos. Los procesos de fermentación juegan un papel importante en la producción de la mayor parte de los ácidos orgánicos, y se abordarán estos temas en este trabajo porque estos ácidos encuentran amplio uso como aditivos en la industria de alimentos y también como aditivos químicos en piensos. Todos los ácidos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos microbiológicamente con alto rendimiento. Otros ácidos orgánicos derivan directamente de la glucosa (por ejemplo el ácido glucónico) o se forman como productos finales a partir del piruvato o del etanol (por ejemplo los ácidos láctico y acético). Excepto la producción de ácido cítrico, que se produce enteramente por fermentación, para algunos ácidos como el acético y el láctico, se utilizan simultáneamente métodos químicos y microbiológicos para su preparación. Para otros ácidos (cetoglutárico, málico) se han desarrollado procesos de fermentación que no se utilizan comercialmente, bien debido a la insuficiente demanda del ácido o por razones económicas. En este trabajo se expondrán los detalles de la producción de sólo tres ácidos orgánicos obtenidos mediante métodos microbiológicos: Ácido Cítrico, Ácido Glucónico y Ácido Acético. También se tratarán los diferentes procesos de elaboración de vinagre. Página 3 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Producción de ácido cítrico Introducción El ácido cítrico ha sido conocido como una sustancia natural de las plantas desde finales del siglo XIX, y desde entonces se sabe que era producida por hongos filamentosos. En 1923 se inició la primera fermentación práctica para la producción de este ácido orgánico utilizando microorganismos que crecían sobre la superficie de los cultivos. Actualmente más del 99% de la producción mundial de ácido cítrico se produce microbiológicamente. Biosíntesis del ácido cítrico El ácido cítrico (ácido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxílico) es un producto metabólico primario y se forma en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la producción de este ácido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosíntesis se metaboliza por reacciones de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. Durante la fase de crecimiento la relación entre estas dos vías es de 2:1. En los microorganismos productores de ácido cítrico las enzimas de la vía EMP están presentes a lo largo del proceso de fermentación y la actividad de la vía está regulada en forma positiva por la fosfofructoquinasa y en forma negativa por la piruvato quinasa. Cuando el piruvato es descarboxilado con formación de acetil-CoA, el residuo de acetato se canaliza hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Durante la idiofase (fase en el crecimiento de una bacteria en la que se producen metabolitos secundarios, que son productos no fundamentales en el metabolismo bacteriano) se expresan todas las enzimas del ciclo de Krebs excepto la -cetoglutarato deshidrogenasa. La actividad de la citrato sintasa (enzima condensante) aumenta por un factor 10 durante la producción del ácido cítrico, mientras las actividades de las enzimas que catabolizan ácido cítrico, como la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa, se reducen drásticamente en comparación con su actividad durante la trofofase (fase en la vida de las colonias de microorganismos en que crecen de forma exponencial). Una de las tres isoenzimas, la isocitrato deshidrogenasa, una enzima mitocondrial que es específica para NADP, se inhibe por el glicerol que se acumula durante el proceso de germinación de las esporas. Además, la producción de ácido cítrico es inhibida por concentraciones altas de amonio. Página 4 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES La citrato sintasa no puede ser solamente responsable del mantenimiento de la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ya que el ciclo se detendría si el ácido cítrico fuera removido. Por lo tanto deben existir durante la fase de producción distintas secuencias que rellenan los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (secuencias anapleróticas), como se ve en la Figura 1. Figura 1. Reacciones anapleróticas que conectan el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La primera enzima anaplerótica presente en Aspergillus es una piruvato carboxilasa (Reacción 4) que convierte piruvato y CO2 en oxalacetato, fosfato inorgánico y ADP (mientras consume ATP). La reacción depende de iones Mg2+ y K+; no se necesita acetil-CoA para la reacción, en contraste con sus requerimientos en las reacciones metabólicas de otros microorganismos. La piruvato descarboxilasa es la enzima clave para la producción de ácido cítrico. La segunda secuencia anaplerótica implica una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Reacción 2), que convierte PEP y CO2 en oxalacetato y ATP en presencia de ADP. El sistema requiere Mg2+ o Mn2+ y K+ o (NH4)+. Si se utilizan como fuente de carbono acetato o compuestos alifáticos superiores, como nalcanos (C9-C23), se encuentra en Aspergillus niger una tercera secuencia anaplerótica. En Página 5 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES ausencia de glucosa opera el ciclo del glioxilato (Reacción 6); la isocitrato liasa se induce, y está presente la malato sintasa. Si se añade glucosa el ciclo del glioxilato se reprime, aunque la isocitrato liasa es todavía parcialmente activa. Cepas utilizadas Muchas cepas excretan trazas de ácido cítrico como producto del metabolismo primario. Como ejemplos están Aspergillus niger, A. wentii, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum, Mucor piriformis, Paecelomyces divaricatum, Citromyces pfefferianus, Candida guillermondii, Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viridae, Arthrobacter paraffineus y Corynebacterium sp. Sin embargo, para la producción comercial sólo se utilizan mutantes de A. niger (se muestra en la Figura 2). Comparado con las cepas de Penicillium, los aspergillus producen más ácido cítrico por unidad de tiempo. Además la formación de productos laterales no deseados, como ácido oxálico, ácido isocítrico y ácido glucónico puede ser más fácilmente suprimida en estos mutantes. Figura 2. Morfología de A. niger. Sustratos técnicos Fuente de carbohidratos Una solución de 15-25% de azúcar es utilizada durante la fermentación. Como fuente de carbohidratos pueden ser utilizados una serie de materias primas tales como almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de almidón sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caña de azúcar con dos tercios de la sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de caña de azúcar y de remolacha. Si se utiliza almidón, este es hidrolizado a azúcares por las amilasas formadas por el hongo productor, o añadidas al caldo de fermentación. Si se utilizan jarabes o hidrolizados debe ser llevado a cabo un tratamiento preliminar con precipitantes o cambiadores de iones para separar cationes. Las cepas de producción se optimizan en base a la fuente de carbono utilizada. Una cepa que produzca bien con una fuente de carbono no puede generalmente ser utilizada con otro material de partida sin que se produzca una sustancial reducción del rendimiento. Página 6 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Elementos trazas El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y molibdeno son necesarios para el crecimiento óptimo en el rango de las ppm. Sin embargo, un exceso respecto de las concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico. El papel del hierro es particularmente interesante. Mientras el crecimiento óptimo requiere concentraciones más altas de hierro (entre otras cosas como cofactor para la aconitasa), sólo 0,05 – 0,5 ppm son necesarias para la producción máxima de ácido cítrico. La concentración óptima de hierro depende del material de partida que se utilice. La sensibilidad de las cepas a metales pesados como zinc, hierro, manganeso y cobre desciende al descender la temperatura. Además, el cobre revierte el efecto inhibitorio del hierro. Además de la composición de la solución de nutrientes (contenido en azúcares, concentración de metales y sales, contenido de fosfato y nitrógeno), el pH del medio influye en el rendimiento. Durante la idiofase el pH debe estar por debajo de 3 a fin de suprimir la formación del ácido oxálico y del ácido glucónico, pero durante la trofofase, el pH desciende hasta por debajo de 3 como resultado del metabolismo de los iones amonio. Para controlar mejor el rendimiento en cultivos sumergidos, la trofofase y la idiofase pueden ser separadas reduciendo el pH por debajo de 2, una vez que ha cesado el crecimiento. Otro beneficio del bajo pH es el descenso en el riesgo de contaminación, ya que a estos valores bajos solamente Penicillium y las levaduras pueden producir contaminación. La frecuencia de contaminación es un factor significativo, especialmente en las fermentaciones en superficie. Condiciones y controles de los procesos El ácido cítrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Los procesos en superficie pueden ser subdivididos a su vez de acuerdo con el estado del medio de cultivo que se utilice: sólido o líquido. De procesos sumergidos se utilizan dos tipos: fermentadores agitados o fermentadores de elevación por aire (air-lift). Varios factores afectan la elección del tipo de proceso: la existencia de capital de inversión, la abundancia de energía, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de técnicas para la medida y la regulación. Página 7 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES El material utilizado como inóculo para la producción de ácido cítrico es una suspensión de esporas, las cuales germinan en el medio de cultivo a 32ºC, y se forma micelio en forma de bolillas o pellets (para los sistemas sumergidos). Es necesario tener el cultivo de la cepa bien desarrollado en estría (agar Sabouroud o papa dextrosa), bien esporulado y de 10-20 días de edad. Procesos en superficie Medio sólido Plantas de baja producción, muy limitadas, unas 500 toneladas al año. Se usa sustrato sólido, como migas de pan o pulpa de almidón. El pH del medio se reduce hasta 4 o 5 antes de la esterilización. Después se inocula con esporas, extendiéndolo sobre bandejas en capas de 3 a 5 cm de grosor y se incuba a 28ºC. El proceso dura unas 90 h, al final de las cuales la solución entera se extrae con agua caliente para aislar el ácido cítrico. Medio líquido Es el método más antiguo de producción. Actualmente se produce el 20% del total de ácido cítrico con este método. Permanece en uso todavía debido a la baja inversión que requiere para su funcionamiento, ya que la tecnología es sencilla y el costo en energía para los sistemas de refrigerado es bajo. El mayor costo viene por la mano de obra, más grande que en los reactores sumergidos, pero es mano de obra no especializada. En reactores sumergidos se requiere menos mano de obra, pero capacitada. En los sistemas modernos, el medio se esteriliza en continuo. La solución nutritiva estéril fluye automáticamente por un sistema de distribución sobre las bandejas. La inoculación se hace en cámaras de inoculación a 30–40ºC, diseminando esporas secas o pulverizando una suspensión de esporas. La temperatura se mantiene constante mediante un sistema de corriente de aire. La ventilación es muy importante también, para el flujo de gases. La velocidad de producción de ácido cítrico baja si la concentración de CO2 pasa del 10%. Al cabo de 24 h de la inoculación, las esporas germinan y forman una fina capa de micelio sobre la superficie de la solución. Al cabo de 30 h empieza la idiofase. La fermentación se detiene al cabo de 8 a 14 días. Si hay demasiado hierro se producirá ácido oxálico, produciéndose una sustancia amarillenta que dificulta el proceso de recuperación. Durante la recuperación se separa el micelio de los nutrientes por filtración. En algunos casos se usan prensas para obtener más cítrico a partir de las células. En los procesos en sólidos se hace así. Página 8 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Procesos sumergidos El 80% de la producción mundial de ácido cítrico se hace mediante procesos sumergidos. Aunque dura más días que los otros métodos presenta varias ventajas: menor inversión en la construcción y menor inversión total, es necesaria menos mano de obra. También presenta algunas desventajas respecto de los métodos anteriores: mayor costo de energía, la tecnología de control es más sofisticada, con lo que se requiere un personal más especializado, la formación de espuma también es un problema en la producción de ácido cítrico, pero se soluciona por la adición de antiespumantes. En resumen, el rendimiento es mayor en la producción sumergida. Existen 3 factores especialmente importantes para los procesos sumergidos: La calidad del material para construir el fermentador: El fermentador debe estar protegido de la acción de los ácidos o bien ser de acero inoxidable, porque de no ser así, cuando se alcancen valores de pH de 1 ó 2, se liberarán metales de las paredes del fermentador, que podrán inhibir la formación de ácido cítrico. La estructura del micelio: Si el micelio es largo y filamentoso, la producción de ácido cítrico en la idiofase desciende. Para conseguir una velocidad óptima de producción el micelio debe estar formado por pellets sólidos muy pequeños. La relación Cu/Fe determina la estructura del micelio. Suministro de O2: Aunque A. niger requiere poco oxígeno, es sensible a su ausencia. Por lo tanto, es necesaria la presencia de oxígeno a una concentración solo del 20–25% de su valor de saturación. Rendimientos En la trofofase, parte de la glucosa añadida se utiliza para la producción de micelio y se convierte a través de la respiración en CO2. En la idiofase el resto de la glucosa se convierte en ácidos orgánicos y existe una pérdida mínima por la respiración. El rendimiento teórico es de 123 g de ácido cítrico 1-hidrato (o 112 g de ácido cítrico anhidro) por cada 100 g de sacarosa. Sin embargo, tales rendimientos no se obtienen en la práctica debido a las pérdidas durante la trofofase. Página 9 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Recuperación del producto Si se llega a formar ácido oxálico como producto lateral debido a un bajo control de la fermentación, se precipita como oxalato de calcio a pH bajo, dejando el ácido cítrico en la solución como citrato monocálcico. Se utilizan filtros rotatorios o centrífugas para separar el micelio y el precipitado de oxalato cálcico del líquido. A pH 7,2 y 70-90ºC, precipita el ácido cítrico, lo que permite a su vez que sea separado mediante filtros rotatorios y secado. Para algunos usos especiales, el ácido cítrico es purificado por adición de ácido sulfúrico para disolver el ácido cítrico, formándose un precipitado de sulfato cálcico. Las etapas subsiguientes de recuperación incluyen el tratamiento con carbón activado, cambiadores de iones y la cristalización como ácido cítrico o ácido cítrico monohidratado. Por encima de 40ºC el ácido cítrico cristaliza como ácido anhidro y por debajo de 36,5ºC como monohidrato. La pureza requerida del producto depende del uso para el que se prepare. Cuando se destina a la industria de los alimentos debe ser más puro que el que se necesita para usos industriales. Usos El ácido cítrico se comercializa como ácido cítrico monohidratado o como anhidro. La mayor parte se utiliza en las industrias de alimentos y bebidas. El sabor de los jugos de frutas, caramelos, helados y mermelada se aumenta o se preserva por adición de este ácido. La industria farmacológica utiliza citrato de hierro y ácido cítrico como preservativos de la sangre almacenada, en tabletas, pomadas y en preparaciones cosméticas. En la industria química se utiliza como agente antiespumante, reblanquecedor y para el tratamiento de textiles. También se lo utiliza en los detergentes porque puede reemplazar a los polifosfatos. En la industria metalúrgica los metales puros se producen como citratos metálicos. Página 10 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Producción de ácido glucónico Introducción El ácido glucónico es un producto de gran demanda por su diversidad de aplicaciones a nivel industrial; se emplea en pequeñas cantidades para preparados antianémicos de gluconato ferroso, pero el uso principal de este ácido es como agente de limpieza y moldeado en las industrias de metal, así como para la eliminación de depósitos de calcio en instalaciones de tratamiento y elaboración de cerveza. El gluconato sódico se utiliza como agente secuestrante en muchos detergentes. En la producción de ácido glucónico sólo participa una enzima microbiana, la glucosa oxidasa, que se encuentra en A. niger. Este hongo crece en condiciones óptimas en el líquido de maceración del maíz pero cuando el crecimiento se ve limitado por el nitrógeno, las células en reposo transforman la glucosa restante en ácido glucónico. Biosíntesis del ácido glucónico La biosíntesis de ácido glucónico a partir de glucosa por medio de la glucosa oxidasa es una reacción sencilla que puede ser llevada a cabo por muchos microorganismos (Figura 3). Figura 3. Producción de ácido glucónico a partir de glucosa. Durante la transferencia de hidrógeno desde FADH2 a oxígeno se produce peróxido de hidrógeno (H2O2) que la enzima catalasa convierte inmediatamente en agua. Se ha demostrado para A. niger que tanto la glucosa oxidasa como la catalasa se encuentran en peroxisomas evitándose de esta forma la toxicidad por H2O2. La gluconolactona formada en la primera etapa se hidroliza espontánea o enzimáticamente por intermedio de una lactonasa (que se halla presente en A. niger) a ácido glucónico. La acumulación de la lactona reprime la producción de ácido glucónico. La hidrólisis Página 11 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES de la lactona ocurre espontáneamente a alta velocidad a pH neutro o alcalino. A pH ácidos es importante la actividad de la lactonasa. El pH también es importante para favorecer la ruta metabólica que lleva a la producción de ácido glucónico, ya que a valores de éste neutros o alcalinos A. niger produce este ácido casi exclusivamente. Además, a valores de pH entre 1 y 3, el glucónico es rápidamente metabolizado por A. niger. Cepas utilizadas Se utilizan A. niger, o la bacteria Acetobacter suboxydans, en procesos sumergidos. En estos procesos se generan ácido glucónico, gluconatos sódico y cálcico y glucosa oxidasa. Otros organismos que han sido optimizados para producir este ácido, pero que no se han utilizado comercialmente, son los hongos Penicillium, Scopulariopsis, Gonatobotrys, Endomycopsis y Pullularia, y las bacterias Vibrio y Pseudomonas. Condiciones y controles de los procesos La fermentación, que se lleva a cabo a pH 4,5, requiere un medio de crecimiento en el que sean limitantes tanto el fosfato como el nitrógeno. Si se va a producir gluconato cálcico no puede ser añadida mas de 13-15% de glucosa como sustrato debido a la baja solubilidad del gluconato cálcico; concentraciones más altas de sustrato permitirían concentraciones más altas de gluconato que cristalizaría espontáneamente dificultando la purificación. En la producción de gluconato sódico, puede ser utilizada una concentración de hasta 28-30% de glucosa, ya que la solubilidad es más alta. En general, se siembra el reactor con esporos. En el inóculo se trata de obtener una elevada masa microbiana y favorecer la síntesis de la glucosa oxidasa, enzima clave en la oxidación de la glucosa. Para ello se trabaja con un medio con elevada concentración de fuentes nitrogenadas y factores de crecimiento, siendo en general utilizados urea o sulfato de amonio y agua de hidrolizado de maíz o su forma deshidratada. Se utiliza glucosa o el monohidrato de ésta como fuente de carbono para inducir la glucosa oxidasa. Las fermentaciones se llevan a cabo durante 20 h a 28-30ºC con una alta velocidad de aireación. Elevando la presión en el sistema puede ser aumentada la solubilidad del oxigeno y por tanto los rendimientos de ácido glucónico. Los rendimientos comerciales actualmente son del 90-95%. Página 12 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Recuperación de los productos Gluconato de calcio El efluente del medio de cultivo se decolora con carbón activado, se concentra evaporando el 15-20% del agua y se deja cristalizar a temperaturas cercanas a 0ºC. La sal se filtra y se lavan los cristales con agua fría. Se puede obtener de esta manera un producto con un adecuado grado de pureza. Si se requiere una sal de alto grado de pureza se recristaliza en agua o agua-alcohol. Gluconato de sodio La forma comercial de esta sal se puede preparar concentrando el efluente del cultivo a 40-45% de sólidos, ajustando el pH a 7,5 con NaOH y luego secando en tambor rotatorio. Un producto de mejor calidad se puede obtener decolorando con carbón activado el concentrado caliente luego de la evaporación y luego recristalizando el producto resultante del secado por tambor rotatorio. Acido glucónico La solución al 50% de ácido glucónico que se encuentra en el mercado se obtiene concentrando por evaporación la solución del ácido (que puede haber sido obtenido tratando con H2S04 una solución concentrada de gluconato de calcio previamente purificado). Las lactonas se obtienen por precipitación de soluciones saturadas a diferentes temperaturas, como ya se indicó. Rendimientos El rendimiento teórico en la producción de ácido glucónico a partir de glucosa, asumiendo que no hay formación de C02, es de 109 g de ácido/100 g de azúcar. En la práctica se obtienen rendimientos superiores al 90% de este máximo. Usos El ácido glucónico no se comercializa en forma cristalina sino que se ofrece en soluciones al 50%. La lactona es comercializada en forma cristalina. Tanto el ácido, como sus lactonas, se utilizan fundamentalmente como acidulantes para alimentos. La lactona es usada universalmente como un ácido latente en polvos para hornear, sustancias leudantes para panificación y mezclas para preparar tortas. Página 13 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES La sal sódica del ácido glucónico es el derivado con mayor importancia comercial. Debido a sus excelentes propiedades como agente complejante se lo utiliza en soluciones lavadoras de material de vidrio, soluciones alcalinas de NaOH, particularmente en el caso de botellas retornables. Los carbonatos de metales di y trivalentes son fácilmente removidos por estas soluciones. También se utiliza el gluconato de sodio en cementos mezclas donde modifican las propiedades de fraguado e incrementan la dureza y resistencia al agua del cemento. El gluconato de calcio es ampliamente usado para el tratamiento de enfermedades que producen déficit de calcio o para suplir este metal durante el embarazo. El gluconato ferroso es utilizado para suministrar este metal en casos de anemia. Página 14 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Producción de ácido acético Introducción La producción de ácido acético a partir de líquidos alcohólicos ha sido conocida desde hace tanto tiempo como la producción de vino (unos 10.000 años). Los romanos y los griegos, que utilizaban el vinagre diluido como bebida refrescante, producían vinagre dejando el vino abierto al aire. Los primeros vinagres fabricados industrialmente eran producidos en vasijas planas abiertas. Eran procesos lentos en los que flotaba una película de bacterias sobre la superficie del vino. En el siglo XIX se modificaron los procesos en superficie hacia métodos más rápidos. Uno de éstos, el proceso del generador de goteo se utiliza todavía en la actualidad debido al mejor sabor en los productos que se obtienen. Biosíntesis del ácido acético La producción de ácido acético es una oxidación incompleta más que una auténtica fermentación, debido a que el poder reductor que se produce se transfiere al oxígeno. La primera etapa de oxidación a partir del etanol conduce a acetaldehído mediante una alcohol deshidrogenasa específica de NAD o NADP. Luego existe una hidratación a acetaldehído hidrato y una segunda oxidación con acetaldehído deshidrogenasa a ácido acético, como se ve en la Figura 4. Figura 4. Oxidación de etanol a ácido acético. Durante la oxidación se produce 1 mol de ácido acético por mol de etanol. A partir de 1 litro de alcohol del 12% (v/v) se produce 1 litro de ácido acético del 12,4%. Para la producción óptima se requiere suficiente oxígeno, que se reduce a través de la cadena respiratoria. Se producen 6 ATP por mol de ácido acético. Si no existe suficiente oxígeno, en presencia de altas concentraciones de ácido acético y etanol, las células mueren. Por esto, tanto el ácido acético como el etanol deben estar presentes para el óptimo crecimiento de Acetobacter. Página 15 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Cepas utilizadas Aunque el ácido acético es producido por muchas bacterias fermentativas, sólo miembros de un grupo especial, las bacterias del ácido acético, se utilizan en la producción comercial. Estas bacterias se dividen en dos géneros, Gluconobacter y Acetobacter, el primer grupo oxida etanol solamente a ácido acético, y el segundo, las superoxidantes, son capaces de oxidar el etanol primero a ácido acético y luego adicionalmente a CO2 y H2O. Los miembros del género Acetobacter son bacterias Gram negativas y ácido tolerantes. Las cepas utilizadas comercialmente pertenecen a las especies Acetobacter aceti (como se ve en la Figura 5), A. pasteurianus y A. peroxidans. Los miembros del género Gluconobacter no son superoxidantes. Gluconobacter oxydans y varias subespecies de esta especie son utilizadas comercialmente. Figura 5. Morfología Acetobacter aceti de Podría parecer que Gluconobacter es el ideal para producir el ácido acético, pero en realidad no es así, porque produce cetonas y otros productos que dificultan la purificación del producto final. Se usa Acetobacter, pero vigilando que no se agote el alcohol, porque en ese caso empezaría a degradar el acético. El inóculo puede provenir de cultivos puros o de vinagre de lotes previos. Sustratos técnicos Los materiales de partida con bajo contenido en etanol como vino, suero de leche, malta o sidra, no requieren ningún componente adicional para constituir una solución completa de nutrientes. Sin embargo, si se utilizan alcohol técnico o licores de papa o de grano, deben ser añadidos nutrientes en muchos casos, para obtener el crecimiento y la producción de ácido acético óptimos. En la fermentación sumergida la concentración de los nutrientes debe ser cinco veces superior debido a la mayor biomasa que se saca del biorreactor con el vinagre. Recuperación de los productos El ácido acético que se obtiene en el proceso sumergido es turbio debido a la presencia de bacterias y el producto debe ser clarificado por filtración. Una vez que se obtiene el filtrado, cuando se desea, se utiliza K4[Fe(CN)6] para decolorar el producto final. Página 16 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Producción de vinagre Introducción Se denomina vinagre al producto obtenido por fermentación acética en contacto con el aire de líquidos alcohólicos de todas clases o de diversas disoluciones azucaradas o amiláceas que hayan experimentado la fermentación alcohólica. Claridad, brillo y edad, son atributos de un buen vinagre. Por fermentación acética, es posible elaborar vinagres a partir de alcohol, vino blanco o tinto, manzana, sidra, melaza, malta y frutas. Los mejores vinagres de vino son los obtenidos con vinos de buena calidad. Los varietales se procesan a partir de un sólo tipo de uva. Los vinagres saborizados se elaboran a partir de vinos blancos, con el agregado de hierbas frescas como romero, albahaca, tomillo y estragón y, también, con pimiento Cayena, chiles, ajo, nuez moscada, frambuesa, pieles de limón y miel. Los acetos o vinagres balsámicos se obtienen a partir del mosto de uvas y se añejan en cascos de madera noble como roble, castaño, cerezo, fresno y mora. El añejamiento se realiza como mínimo durante diez años. Los vinagres argentinos están elaborados a partir de alcohol, vino blanco o tinto y manzana. Con 1 L de alcohol (96º) se elaboran 89 L de vinagre; con 1 L de vino, 1,75 L de vinagre y con 1 L de jugo de manzana se obtiene 920 cm3 de vinagre. Los de vino contienen una acidez del 6%, los de alcohol, 5% y los de manzana, 4%. Nociones sobre la tecnología de elaboración En general, existen en el mercado dos tipos de vinagres de calidad. El primero se obtiene como producto de la fermentación o acetificación con cultivo superficial, donde las bacterias acéticas se encuentran en contacto directo con oxígeno gaseoso situadas en la interface líquidogas, o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborándose así la mayoría de los vinagres tradicionales. El segundo tipo se elabora por la acetificación o fermentación con cultivo sumergido, donde las bacterias acéticas están sumergidas libremente en el seno del líquido a fermentar, en el que constantemente se introduce aire, solo o enriquecido con oxígeno, en condiciones que permitan la máxima transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase líquida. Así se obtienen de forma rápida los vinagres comerciales actuales de menor precio. Página 17 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Procesos en superficie Pese al éxito de los procesos sumergidos, los procesos en superficie se utilizan aún de manera amplia en la producción de vinagre, especialmente en la fabricación de vinagre casero. Existen dos métodos básicos de producción en superficie: Método de Orleáns o método lento. Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de aproximadamente 250–300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas horizontales y superpuestas (como se ve en la Figura 6), provistos de dos agujeros de aproximadamente 5 cm en cada extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire. Figura 6. Pilas de toneles para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleans. Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de corcho por donde penetra un tubo de vidrio recto que llega casi hasta el fondo del líquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la superficie (como se muestra en la Figura 7). Figura 7. Acetificación por el método de Orleans. Página 18 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Este método se trata de un procedimiento estático donde el líquido a acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio. Los rendimientos de transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura de 8 a 10 días una vez comenzada la acetificación. Se comienza añadiendo 60 litros de un buen vinagre, y después de 8 días se adiciona una quinta parte de este volumen de vino, que se transformará en vinagre. Inmediatamente se inocula el tonel con un cultivo de un tonel vinagrero en marcha o con una telilla especialmente criada. Esta operación se lleva a cabo con la varilla de vidrio recta, y se tapa el tonel. El género Acetobacter es aerobio, y por lo tanto si pasa más de 2 min sin oxígeno muere. En este método, al principio se usa Acetobacter xylinum, porque produce celulosa que le permite flotar, a diferencia que la mayoría de las bacterias que se hunden. Estos toneles se mantienen en locales a temperaturas de 20-25ºC, y al cabo de 8 días se añaden poco a poco por el tubo recto otros 12 litros de vino; estas adiciones se reiteran cada 8 días hasta que el líquido llegue casi al borde inferior del orificio de entrada de aire, quedando entonces en marcha normal el tonel vinagrero. A partir de este momento, semanalmente se sacan por el tubo de nivel 12 litros de vinagre ya hecho, que se sustituyen por 12 litros de vino, continuándose así indefinidamente la elaboración. El plazo de una semana entre cada adición no es exacto y depende de la temperatura, de la clase y capacidad de las bacterias acetificantes, del grado alcohólico y composición del vino. Pero en general para producir 12 litros de vinagre es necesario esperar 7 semanas. Generador de goteo o método alemán. El fundamento de este método y su diferencia con el método de Orleáns está en emplear virutas de haya que periódicamente quedan sumergidas en el líquido que está acetificándose. Así se consigue aumentar la superficie de acetificación de la bacteria y mejorar la transferencia de oxígeno, por lo que aumenta la velocidad de acetificación. La cuba giratoria más elemental se prepara con un orificio grande en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los costados de esta cuba, en la parte más alejada de la abertura, se practica un orificio estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una canilla de madera o de vidrio para vaciado del envase. El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo, agujereado con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de virutas de haya. En este Página 19 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES compartimento penetra un largo termómetro para controlar la temperatura. Se obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como máximo, cada 48 h, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboración indefinidamente. Se emplean toneles verticales de encina con doble fondo, como se ve en la Figura 8. Sobre el primero, agujereado, se colocan capas de virutas de madera de haya, impregnadas de vinagre de buena calidad. Sobre el borde superior se lleva un diafragma perforado, con los orificios obturados con algodón. Figura 8. Diagrama de un generador de filtro de goteo para vinagre. Al pasar el vino por el diafragma, burbujea el aire que existe entre las virutas. El vinagre se extrae por la parte inferior. Se pueden emplear barriles giratorios de roble, parcialmente llenos de virutas, consiguiéndose así una mejor aireación. Las ventajas que se destacan en este proceso son la regulación de oxígeno y su uso para la producción continua de vinagre. El vinagre obtenido con el método de cultivo superficial tiene el aroma y el gusto propio de la lentitud de la acetificación que se ve favorecido por el simultáneo envejecimiento. Los principales inconvenientes de estos métodos que utilizan virutas como soporte son: la acumulación de bacterias muertas sobre las virutas, debido a la falta de aireación y aumentos de temperaturas; el desarrollo de bacterias productoras de celulosa (Acetobacter xylinum); la infección por anguílulas (pequeños nematodos) que son imposibles de combatir una vez que se desarrollan; los aumentos de temperatura difícilmente controlables, con perdidas de alcohol por evaporación en la corriente ascendente de aire caliente, y descenso del rendimiento; la necesidad de gran espacio (generadores de relleno). Procesos sumergidos Se entiende por fermentación sumergida aquella en la que no se utiliza material poroso o soporte, sino que se hacen circular pequeñas burbujas de aire a través de la biomasa, con lo que se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o tanques de acero inoxidable Página 20 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES quedando siempre una parte del vinagre de la operación anterior como inóculo para iniciar el ciclo siguiente. Se llena con vino, y se introduce posteriormente una fuerte corriente de aire. La acetificación es muy rápida. Este proceso se utiliza ampliamente en la actualidad. Los rendimientos de la transformación del alcohol en ácido acético resultan ser muy elevados, y la velocidad a la que se desarrolla el proceso es mayor, así como la uniformidad del producto y, sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en mucho menor volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede trabajar con dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la aireación, sino también los ciclos de carga y descarga. El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del líquido a acetificar, que se satura constantemente de pequeñas burbujas de aire. Una mayor población bacteriana así como la disponibilidad de oxígeno por los microorganismos permiten obtener un mayor rendimiento de la transformación de etanol en ácido acético (rendimientos del 94%) y una mayor velocidad del proceso (25-30 h). Este procedimiento requiere el estricto control de tres parámetros: la temperatura, la presión parcial de oxígeno y los ciclos de carga y descarga. La bacteria acética es viable entre 28-33ºC, pero la velocidad de fermentación varía en función de la temperatura. La temperatura de la fermentación debe estar comprendida dentro del intervalo 30-31ºC que es la óptima para un mejor rendimiento. La oxidación de etanol a ácido acético es una reacción exotérmica que eleva la temperatura del depósito. Por lo tanto cuando la temperatura se eleva, aumentan las pérdidas de alcohol y productos volátiles y, en menor cantidad, de ácido acético, aunque lo más importante es que ocurra la parada del proceso por la muerte de las bacterias. Un elevado suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y arrastre de los componentes volátiles, y por otro lado, su carencia puede paralizar la acetificación dado el carácter aerobio de las bacterias. Además de la cantidad de aire, se debe tener en cuenta su calidad y pureza, ya que las bacterias acéticas son sensibles a los contaminantes de este. Todos los parámetros están interrelacionados en la acetificación. El etanol no debe llegar a agotarse totalmente ya que las bacterias mueren rápidamente y se pierde el cultivo. Por ello en este tipo de sistema de producción de vinagre, se suele llevar a cabo la acetificación en forma discontinua realizándose ciclos de descarga-carga. Así se impide que las bacterias acéticas metabolicen el ácido acético formado convirtiéndolo en CO2 y agua. Página 21 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen del líquido, que se repone con nueva materia prima suministrándole sustrato a la bacteria. Por eso, se puede trabajar de forma automatizada con dispositivos que regulen el control de la temperatura y de la aireación, así como los ciclos de carga y descarga. Figura 9. Fermentador sumergido para la producción de ácido acético. En la Figura 9 se muestra un esquema del acetificador, que esta constituido por un depósito de acero inoxidable de entre 10.000 y 30.000 litros. Los conductos están rodeados por un intercambiador de calor de agua para disipar el calor producido en el proceso y mantener la temperatura a 30ºC. Para evitar las pérdidas de compuestos volátiles se ha desarrollado un sistema cerrado, mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El fermentador consta de un sistema de recirculación de aire y un sistema de control automatizado que inyecta oxígeno en dicha corriente a medida que este es consumido por la biomasa. Página 22 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Diagrama de flujo A continuación se representa el diagrama de flujo de la producción de vinagre: Página 23 de 24 BIOTECNOLOGIA FERMENTACIONES AEROBICAS ESPECIALES Fuentes de Información - CRUEGER, W; CRUEGER, A. Biotecnología. Manual de microbiología industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, 1993. (Capítulo 8: Ácidos Orgánicos) - http://www.uco.es/dptos/ing-quimica (Cátedra Enología - Tema 2) - http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema22MI.html - http://es.wikipedia.org/wiki - http://www.alimentosargentinos.gov.ar (Cadenas Alimentarias – Vinagre) Página 24 de 24