ADN antiguo: Química y aplicaciones

adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 27 INTRODUCCIÓN. l avance y sofisticación de las técnicas en biología molecular ha permitido uno de los grandes hitos de la ciencia moderna: la posibilidad de recuperar material genético de restos biológicos antiguos. Las posibilidades que esta nueva disciplina -a la que denominamos "paleogenética"- ofrece son múltiples: caracterización genética de nuestros antepasados próximos, análisis del material genético de especies extintas para tratar de esclarecer su relación con otras actuales -por ejemplo, los Neandertales- o el seguimiento de migraciones históricas o prehistóricas. Figura 2. Dóble hélice de ADN. E Fernández Domínguez E. Turbón D. Pérez-Pérez A. Arroyo-Pardo E.1 Unidad de Antropología Departamento de Biología Animal Facultad de Ciencias Biológicas Avda. Diagonal 645 08028-Barcelona. 1 Laboratorio de Biología Forense Toda la tecnología empleada en el Departamento de Toxicología y estudio de biomoléculas antiguas Legislación Sanitaria tiene una base teórica y fisicoquímiFacultad de Medicina ca de gran importancia. Los orígenes Universidad Complutense de Madrid de esta nueva disciplina cabe bus28040-Madrid carlos a mediados de los años 80 E-mail: [email protected] con el trabajo pionero de Higuchi y colaboradores.1 Gracias a este equipo se obtuvo por vez primera ADN de una especie extinta: el cuagga (Equus quagga), un équido de África del Sur que se extinguió hace aproximadamente 140 años. Desde entonces se ha conseguido aislar ADN de restos de una gran variedad de especies vegetales y animales, incluido el hombre (ver figuras 1 y 2).2-4 Desgraciadamente, este entusiasmo inicial se trocó al poco tiempo en escepticismo al ser puesta en duda la Figura 1. Esquema de la situación del ADN dentro del núcleo celular. autenticidad de algunos de los resultados obtenidos. Algunos investigadores creyeron que las secuencias de ADN presuntamente antiguas no eran sino ADN moderno introducido en la muestra por fallos de procedimiento; es decir, lo que los especialistas denominan "contaminaciones".5-7 Con la llegada de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)8,9 -y en parte con la secuenciación automática- la tecnología del ADN antiguo (ADNa) ha sufrido una auténtica revolución (ver figura 3). La PCR ha hecho posible Figura 3. Esquema de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El proceso iterativo (ciclos) aumenta el número de copias de ADN. ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES 27 adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 28 la obtención de información genética a partir de cantidades ínfimas y muy fragmentadas de ADN y el uso de secuenciadores automáticos ha permitido analizar de forma rápida la variabilidad de las secuencias, para comparar muestras antiguas con modernas, e inferir así conclusiones filogenéticas. más satisfactorios (ver figura 4).13 Particularmente los dientes constituyen un depósito natural de ácidos nucleicos notablemente protegido de factores medioambientales.6 En general, hay que abordar tres problemas clave para garantizar el éxito en la recuperación de ADNa: a) La presencia de inhibidores de la Taq polimerasa, derivados del suelo en que se ha conservado el resto o de procesos bioquímicos degradativos acontecidos tras la muerte del individuo. b) El aislamiento de ADN "template" auténticamente antiguo, libre de ADN exógeno moderno. c) El daño molecular ocasionado en el ADN antiguo recuperado. 28 Desde que aparecieron las primeras publicaciones sobre ADNa a mediados de los años 80, estos tres puntos han sido objeto de controversia. Los trabajos iniciales de Höss y Pääbo10 y de Tuross11 no sólo permitieron en su momento profundizar en los fundamentos moleculares de estas dificultades sino que sentaron las bases para un estudio más profundo del ADNa, que excedía con mucho la mera recuperación de fragmentos mediante PCR. De hecho, fueron ellos los que establecieron que la extracción y amplificación del ADN antiguo se complica por todos aquellos mecanismos de descomposición que acompañan a las muestras enterradas o suficientemente antiguas. Como demostraron aquellos trabajos pioneros, el ADN se comporta como otras moléculas que, tras la muerte del individuo, pasan de la biosfera a la geosfera.12 Desgraciadamente, este enfoque sólo se abordó decididamente a mediados de los años 90. Por último, a juicio de algunos autores5, a los resultados obtenidos a partir de restos no humanos, se les debe pedir un cierto "sentido filogenético"; es decir, que su amplificación produzca resultados no humanos y que, además, esté de acuerdo con la información filogenética disponible para la especie en cuestión. Este criterio -en parte discutible- no puede aplicarse con el mismo rigor al caso de los restos humanos; pero debe subrayarse en todos los demás aspectos el procedimiento metodológico es, salvo excepciones, el mismo en humanos que en otros organismos vivos. A lo largo del presente trabajo revisaremos las cuestiones más candentes desde los inicios de la bioquímica del ADN antiguo hasta el presente. Figura 4. Imagen de un insecto encerrada en ámbar. La posibilidad de recuperar ADN de este tipo de fósiles ha sido objeto de mucha controversia. Tras la muerte de un organismo su ADN es rápidamente degradado por nucleasas endógenas. Ciertas condiciones pueden ralentizar e incluso detener este proceso, como una rápida deshidratación que impida la actuación de microorganismos, la presencia de elevadas concentraciones de sales o las altas temperaturas (ver figuras 5 y 6). Una vez esta actividad endonucleásica ha cesado, hongos y bacterias colonizadoras continúan el proceso degradativo. Tras la acción de estos microorganismos el ADN todavía queda a merced de procesos de degradación química mediante reacciones de hidrólisis y oxidación. Figura 5. Los individuos momificados pueden ser objeto de toma de muestras para estudios de ADN antiguo. 1.- DAÑO Y DEGRADACIÓN DEL ADN ANTIGUO El material de partida para los estudios de ADN antiguo es variado, normalmente restos de tejidos blandos (por ejemplo, piel y músculo) o huesos y dientes, siendo estos dos últimos materiales los que ofrecen resultados ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES Figura 6. Yacimiento neolítico de Tell Halula (Siria). Las condiciones climáticas favorecen una rápida evaporación del agua, una elevada tasa de racemización y una preservación de ácidos nucleicos. adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 29 Como consecuencia de estos procesos el material genético preservado en restos antiguos presenta un conjunto de características que lo diferencian del ADN de organismos actuales (ADN fresco) y que impone un conjunto de limitaciones a su recuperación (ver figura 7). Figura 8. Posibles sitios moleculares susceptibles de daño molecular. Figura 7. Corte esquemático de un diente. El interior de la cámara pulpar retiene gran cantidad de ADN postmortem. En primer lugar, el ADN antiguo está sumamente fragmentado. Algunos autores mantienen que no es posible la amplificación por PCR de fragmentos de ADN de tamaño superior a 150 pares de bases (bp) en tejidos blandos.3 Este límite es sensiblemente superior en tejidos sólidos como hueso o diente, siendo de 300 pares de bases (bp) para ADN mitocondrial y de poco más de 100 bp para material nuclear.14,15 La longitud del fragmento a amplificar guarda una relación inversamente proporcional con la cantidad de producto obtenido tras la amplificación.16 Sin embargo no parece existir una correlación entre la antigüedad de la muestra y su grado de fragmentación.3 Esto se debe a que la degradación del ADN depende más de las condiciones medioambientales en sí, que del tiempo que éste ha estado expuesto a ellas. Así, aunque la cantidad total de ADN antiguo presente en la muestra sea en principio suficiente para garantizar su recuperación mediante una PCR exitosa, la fragmentación de este material hace que sólo sean recuperables aquellos fragmentos más pequeños. En la estructura del ADN existen dos lugares especialmente sensibles a la hidrólisis: los enlaces fosfodiéster, que unen las diferentes desoxirribosas entre sí, y los enlaces glicosídicos, que conectan éstas a las bases nitrogenadas (ver figura 8). La rotura de los enlaces fosfodiéster rompe la cadena de ADN y la de los enlaces glicosídicos suele provocar la pérdida de la base nitrogenada correspondiente formándose sitios apurínicos (AP sites) o sin base (baseless) en un proceso conocido como depurinización o depirimidinación. Este proceso tiene lugar "in vivo" aproximadamente cada 10 horas, aunque puede verse acelerado por factores como la temperatura, la fuerza iónica del entorno, el pH o la presencia de metales pesados. Tras la producción de un sitio apurínico, puede tener lugar la rotura, conocida como β-eliminación, de la cadena de ADN en ese punto. Además del daño hidrolítico, el ADN está sometido a alteraciones de carácter oxidativo durante el proceso de descomposición. Este daño se da bien por efecto de una radiación ionizante directa sobre el ADN, bien por la acción de radicales libres, generalmente del tipo superóxido (O2+), peróxido de hidrógeno (H2O2) e hidroxilo (OH-), o bien por otras especies reactivas como el electrón hidratado (eaq-) y los protones (H+). Todos estos compuestos, esencialmente subproductos de reacciones celulares endógenas, también pueden ser generados tras la exposición de la célula a radiaciones ionizantes, luz ultravioleta o ser el resultado de degradación bacteriana y/o fúngica. Algunas de estas especies pueden reaccionar con las bases nitrogenadas del ADN modificándolas, como sucede con los electrones hidratados y los protones producidos por radiación ionizante en solución acuosa.17,18 Otras en cambio, como el radical superóxido (O2- ) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) no producen daño directo en el ADN salvo cuando son convertidos en OH-.19 Como ejemplo de daño molecular fisiológico, se ha comprobado in vivo que los radicales hidroxilo pueden modificar las proteínas asociadas al ADN originando enlaces covalentes ADN-proteína (DPCs: ADNprotein crosslinks). También puede suceder que el radical hidroxilo arranque un protón del grupo metilo de la timina.17 Además, la presencia de iones hierro, cobre y otros compuestos, sobre todo cuando estos iones no están quelados, facilita la formación de radicales hidroxilo a partir de O2- y H2O2 que producen un daño extensivo en el ADN.20 La adición de estas especies reactivas a los dobles enlaces de la molécula de ADN se traduce en la formación de aductos con capacidad de bloquear la PCR, haciendo que aunque se obtenga ADN endógeno, éste sea inservible. Tras analizar diversos extractos de ADN de tejidos de diferentes épocas mediante Cromatografía de Gases / ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES 29 adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 30 Espectrometría de Masas (GC/MS) se comprobó que un gran porcentaje de las bases nitrogenadas estaba modificado.21 La 5-OH-5-Metil Hidantoína es uno de los productos mayoritarios resultantes de la degradación de la timina en ADN expuesto a radiaciones γ, mientras que la 8-OH-Guanina se genera tras el ataque de radicales hidroxilo. La cantidad de los dos primeros tipos de modificaciones en los extractos de ADN guarda una relación inversa con la eficiencia de su amplificación, probablemente causada por el bloqueo que provocan estos productos en la PCR. Tabla 1. Comparación de tres protocolos para la extracción de ADNa. El radical hidroxilo reacciona con la mayoría del ADN por adición a los dobles enlaces de las bases; sin embargo, una pequeña cantidad también reacciona con el esqueleto de azúcar arrancando un protón y originando radicales de azúcares.17 Estos azúcares dañados pueden encontrarse en forma libre o unidos todavía al ADN.22,23 2.- AISLAMIENTO CONTAMINACIÓN DEL ADN ANTIGUO Y Otra de las dificultades del aislamiento del ADN antiguo es la posibilidad de contaminación con ADN moderno, de manera que se amplifique éste en vez de aquél.24 Desde los inicios de la disciplina del ADN antiguo se ha propuesto un conjunto de criterios para tratar de controlar esta contaminación exógena. 30 Primero se propuso una esterilización extensiva de las áreas de trabajo con HCl seguida de su exposición a luz UV. Con el HCl se buscaba producir la hidrolisis ácida del ADN y con la radiación UV, la formación de aductos covalentes no válidos para la reacción de PCR. El siguiente paso, la delimitación de áreas de trabajo -la separación de las áreas de extracción de ADN respecto de las de amplificación del ADN- pretendía anular la posibilidad de carry-over, término mediante el cual se designa el arrastre de moléculas de ADN provenientes de amplificaciones anteriores.25 Además, se impuso el uso de campanas de flujo laminar o de seguridad biológica, instrumentos imprescindibles que impedían la contaminación de las muestras en el área de trabajo. Todas estas medidas de seguridad "clásicas" siguen todavía hoy vigentes, si bien durante los últimos años otras nuevas han venido a sumarse. Con motivo de la polémica suscitada acerca de la amplificación real de ADN antiguo, Béraud-Colomb y colaboradores26 describieron detalladamente en 1995 las precauciones que debían tomarse para minimizar la contaminación potencial de ADN moderno exógeno, añadiendo ocho medidas de seguridad adicionales a las preexistentes (ver tabla 1). La novedad de sus propuestas radicaba en un exhaustivo control de los reactivos así como el empleo sistemático de controles en la reacción de PCR. Tras la secuenciación en 1997 de la región D-loop del ADN mitocondrial de un resto neandertal por el equipo ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES de Svante Pääbo9, Ward y Stringer introdujeron cuatro puntos adicionales para la recuperación fiable de este tipo de material genético en restos antiguos.27 Su propuesta incorporaba parámetros bioquímicos como medida indirecta de la degradación del ADN tales como la racemización de aminoácidos,28 además de la estima del número de moléculas "template" intactas. Según estos autores si la amplificación se inicia a partir de un número demasiado bajo de estas moléculas, se producen resultados inconsistentes y poco fiables. Tradicionalmente esta determinación se ha venido haciendo por "PCR competitiva", pero actualmente este método está siendo desplazado por la PCR en tiempo real o Real Time PCR (RT-PCR), mucho más sensible y específico. Otro punto novedoso del protocolo de Ward y Stringer consiste en la clonación de los productos amplificados. Esta técnica permite separar las diferentes moléculas de cada producto final de amplificación, resultando útil para detectar ADN contaminante y posibles errores de la Taq polimerasa introducidos durante el proceso de amplificación. Por último, los dos autores consideraban necesario repetir las amplificaciones, para confirmar los resultados. El último de estos criterios, introducido a raíz del trabajo de Krings et al 29 implica la replicación del proceso de extracción y amplificación en dos laboratorios independientes. De esta forma puede conseguirse adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 31 monitorizar la contaminación introducida por los investigadores directamente implicados en el análisis de las muestras, así como el ya mencionado carry over inherente a cada laboratorio. 3.- INHIBIDORES DE LA REACCIÓN DE PCR: La co-purificación junto con el ADN procedente de tejidos blandos, huesos y dientes de otras sustancias fue observada ya en los primeros estudios de ADN antiguo.2,3,30,31 Posteriormente, con la generalización del uso de la PCR en el campo del ADNa, se relacionó esta observación inicial con la presencia, en algunos de estos extractos, de sustancias inhibidoras de esta reacción. Los mecanismos de acción de estas moléculas inhibidoras continúan siendo un misterio, pero existe un conjunto de observaciones empíricas que ofrecen interesantes pistas al respecto. Por ejemplo, la inhibición aparece en diferentes extractos de diferente procedencia y el patrón de absorción de luz de ciertos extractos con poder inhibidor difiere de aquellos que no tienen este poder. Muchos extractos con capacidad inhibidora presentan una coloración marrón y, en algunos casos, al visualizar una alícuota de los mismos en un gel de electroforesis se ha observado la emisión de fluorescencia. El protocolo de extracción convencional de ADN (método FenolCloroformo) no consigue eliminar estas moléculas inhibidoras. Además éstas son retenidas por el filtro de 30000 daltons utilizado para concentrar el ADN en el paso final de extracción. En todo caso existen estrategias para eliminar o atenuar la inhibición, bien aumentando la pureza del ADN extraído, bien tratando de contrarrestar el efecto inhibidor durante la propia reacción de amplificación. La mayor parte de estas medidas resultan en un incremento del riesgo de contaminación con ADN exógeno de la muestra, pues aumentan la manipulación por parte del investigador. Sin embargo existen otras que producen mejoras sustanciales en la amplificación y que no presentan este inconveniente, como es el almacenamiento de los extractos en frío durante varios días previamente a su amplificación. Este procedimiento provoca la formación de un precipitado blanquecino que queda adherido a la pared del tubo y cuya eliminación por precipitación consigue revertir la capacidad de amplificación.32,33 La naturaleza del inhibidor está todavía por determinar, aunque se han propuesto un conjunto de moléculas candidatas, básicamente compuestos del suelo o productos de degradación del organismo. A continuación se citan los más importantes. Ácidos húmicos y fúlvicos La posible acción inhibidora de los ácidos húmicos y fúlvicos sobre las enzimas de biología molecular fue señalada por vez primera por Svante Pääbo.3 Los ácidos húmicos y fúlvicos son una familia de moléculas muy abundantes en el suelo, que pueden acompañar al ADN en el proceso de purificación y que son inhibidores muy potentes de la reacción de PCR (ver figuras 9 y 10). Tan solo 100 ngr. de ácido fúlvico son suficientes para la inhibición total de una amplificación control de fago λ.11 Las propiedades fluorescentes de esta familia de compuestos se han relacionado con la fluorescencia observada en agarosa de algunos de los extractos de ADN antiguo. Residuos de porfirinas o productos derivados de su degradación: Los derivados de la porfirina o sus productos de degradación han sido señalados como tales inhibidores por algunos autores durante los años 90.32,33 La acción inhibidora de estas moléculas se debe a su capacidad para secuestrar iones metálicos, necesarios para el funcionamiento de polimerasas, gracias a estructuras similares al grupo hemo. Las porfirinas se encuentran presentes en sangre, tejidos blandos y en hojas vegetales, y constituyen una familia molecular que puede considerarse como derivada de un compuesto tetrapirrólico original: la porfina. Las porfirinas más abundantes son las protoporfirinas y aunque pueden describirse quince protoporfirinas isómeras, solo una Figura 10. Estructura química del ácido húmico. Figuras 9 . Estructura química del ácido fúlvico. ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES 31 adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 32 forma, la protoporfirina IX, está presente en la naturaleza. La protoporfirina IX forma complejos quelatos tetradentados con iones diversos (hierro, zinc, níquel, cobalto, etc) y también con iones magnesio, en los que el metal se une por enlaces coordinados a los 4 nitrógenos de los anillos pirrólicos. La capacidad de la protoporfirina IX para quelar iones magnesio, necesarios para el funcionamiento de la Taq polimerasa, hace que este tipo de compuestos presente un poder inhibidor de la reacción de PCR potencial.1 Además, los derivados porfirínicos tienden a formar agregados que quedan así retenidos junto al ADN en la membrana de muchos procedimientos de filtrado, como el Centriplus 30000, empleados durante la extracción de ADN antiguo. Productos de Maillard 32 La reacción de Maillard es sobradamente conocida en el campo de la tecnología de los alimentos desde mediados de los años 60. Consiste en la reacción de un grupo carbonilo con un grupo amino para dar una serie de intermediarios como compuestos carbonílicos (cadenas carbonílicas) y deoxiosonas, estos últimos cuando hay azúcares implicados en la reacción. Aunque los productos de Maillard son muchos y variados -desde grupos carbonilo unidos a cadenas cortas de carbono hasta heterociclos como furanos y pirroles- el producto final de la reacción son las melanoidinas, cuya estructura es en buena parte desconocida. Su coloración marrón y su elevado peso molecular -hasta 100.000 daltons- ha sido relacionada por muchos autores con la capacidad inhibidora de algunos extractos de ADNa.3,4 Los productos de Maillard pueden tener numerosos grupos reactivos, entre los que se cuentan los grupos hidroxilo, carbonilo y metilo que pueden reaccionar con el ADN. El propio daño molecular en el ADN puede inducir la producción de reacciones de Maillard, puesto que las pentosas liberadas tras la ruptura de sus enlaces fosfodiéster y N-glicosídico constituyen también un sustrato para esta reacción. Productos de degradación del ADN La degradación del material genético, sea por rotura de sus enlaces o por modificaciones químicas tales como la reducción de azúcares, genera ciertos productos capaces de inducir la inhibición directa de su propia amplificación.34-36 No hay que confundir sin embargo el poder inhibidor de un extracto de ADNa con la imposibilidad de su amplificación. El daño extensivo en el ADN (por fragmentación, por modificación de sus bases...) hace inviable su amplificación. Sin embargo a menos que éste genere productos capaces de interferir en la reacción de amplificación no podrá hablarse de inhibición sensu strictu. ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES Algunos autores han estudiado el efecto del daño postmortem en los resultados de secuencias de ADNa y han podido detectar directamente transiciones denominadas de "tipo 1" (A->G ó T->C) y de "tipo 2" (C->T ó G>A) que pueden enmascarar como mutaciones lo que no es más que un daño molecular.37 Por este motivo, dado que una reducción de 20ºC en la temperatura implica una disminución de entre 10 y 25 veces en la tasa de reacciones químicas, la congelación de muestras puede ser un factor determinante a la hora de preservar un ADN durante largo tiempo. Así, para muestras de gran antigüedad, en el período comprendido entre 40000 y 50000 años, la baja temperatura parece ser de gran importancia para la ralentización de los procesos responsables de la degradación de los ácidos nucleicos durante el período postmortem.21 4.- ESTEREOQUÍMICA DE AMINOACIDOS Y ADN ANTIGUO: Todos los aminoácidos a excepción de la Glicina pueden presentarse en dos formas isoméricas -L y Dpero en la biosíntesis proteica únicamente son utilizadas las formas L. Cuando un organismo muere sus aminoácidos sufren un proceso de racemización38 cuya tasa difiere para cada aminoácido y a su vez, depende de factores tales como la presencia de agua, la temperatura, el pH y la quelación de ciertos iones metálicos a las proteínas. Muchos de estos factores afectan también a la principal reacción hidrolítica responsable de la degradación espontánea del ADN, la depurinización. Por esta razón, se ha considerado el estudio de la racemización de los aminoácidos como un método útil a la hora de estimar la probabilidad de recuperar información genética fiable de un resto antiguo. En 1975, Helfman y Bada28 observaron que durante el envejecimiento se va produciendo una racemización gradual del ácido aspártico, en la dentina y en el esmalte dentario, de forma que el incremento de la concentración de D-aspártico es dependiente de la edad con una tasa de transformación del 0,1% al año.39 A partir de estos hallazgos, han sido muchos los equipos de investigación que han utilizado la racemización de este aminoácido para estimar la edad de un resto cadavérico.34,40 Así, se ha medido la racemización en tejidos con una baja tasa de "turn-over" proteico, tales como sustancia blanca del cerebro40, discos intervertebrales41, fibras elásticas del parénquima pulmonar42, cristalino ocular43 y hueso.44 Teniendo en cuenta que la racemización de los aminoácidos sigue una ley de tasa reversible de primer orden, la reacción de la racemización es: donde D/L es la relación de formas D y L y t es el tiempo. El término logarítmico t=0 describe la cantidad de ácido D-aspártico formado mediante el procedimiento de hidrólisis con HCl 6 M a 100ºC durante 6 horas y K adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:22 PÆgina 33 expresa la tasa de racemización. Mediante esta ecuación se ha podido observar que la tasa de racemización es de 5,3 x 10-3 para la fracción peptídica ácido-soluble de la dentina45,46; de 3,1 x 10-3 para el cartílago39, y de solo 1,8 x 10-3 para la correspondiente fracción de hueso. En la fracción de colágeno ácido-insoluble de la dentina es de 1,0 x 10-3 y de 3,3 x 10-3 en cartílago47,48, con un valor para hueso de solo 0,47 x 10-3.49 No parece muy fácil explicar el porqué la tasa de racemización difiere entre las dos fracciones de hueso y no de cartílago. La diferencia entre los dos compartimentos de la dentina es más sencilla de explicar dado que el colágeno en este tejido no está sujeto a ninguna remodelación, mientras que la fracción peptídica ácido-soluble puede tener intercambio nutricional con la circulación a través de los túbulos y peritúbulos de dentina (ver figura 11). Figura 11. Toma de muestra de dentina para su posterior empleo en análisis de aminoácidos. Se trabaja en entorno estéril con un taladro. aquellas muestras antiguas que no contienen ADN antiguo endógeno y amplificable de una forma rápida y sin necesidad de destruirlas totalmente. Sin embargo, al carecer el método de Poinar y colaboradores de una estandarización en cuanto al tipo de tejido estudiado, cabría plantearse si los valores de racemización propuestos son extrapolables a otros estudios de ADN antiguo realizados con un material diferente. 5.- REAL TIME-PCR y ADN ANTIGUO. Los procedimientos de Real Time PCR (RT-PCR) han desplazado hoy en día a otras técnicas para la cuantificación de ADN. Debido a su sensibilidad y especificidad su uso se ha incorporado rápidamente en el campo del ADNa. La variante más famosa de esta técnica necesita de un par de primers o cebadores e incorpora además una sonda marcada (sonda TaqMan) complementaria a la región de ADN que se quiere amplificar. Los pasos del proceso pueden verse en la figura 12. La sonda en cuestión presenta un reporter fluorescente (TAMRA) en un extremo y un quencher no fluorescente en el otro, que absorbe la fluorescencia emitida por el reporter cuando ambos están unidos a la sonda. 33 Una de las explicaciones para justificar que la correlación entre D/L y la edad sea menor en hueso que en dentina o en cartílago, es la elevada remodelación del primero o que pueda existir contaminación con proteínas de otras fuentes como tejido conectivo y sangre que pueden incrementar de forma significativa la cantidad de forma L. También se ha estudiado el grado de racemización de otros aminoácidos como alanina y leucina, pero el ácido aspártico tiene la ventaja de que tiene una alta energía de activación y su tasa de racemización es una de las más rápidas y es constante en un amplio rango de temperatura (a pH neutro). Según parece, los factores que influyen en el proceso de racemización son también responsables de la degradación del ADN.38 Tras estudiar el grado de racemización de muestras de diferentes organismos y épocas, Poinar y colaboradores establecieron que para relaciones D/L Aspártico mayores de 0.08 no era posible obtener una secuencia fiable de ADN. Parecía existir además una relación clara entre la amplitud de este aminoácido y la longitud de secuencia de ADN que podía recuperarse: en muestras con una D/L igual a 0.05 se obtenían secuencias de entre 140 y 340 pares de bases, mientras que en aquellas con una tasa de racemización mayor tan sólo era posible amplificar fragmentos más cortos.49 La ventaja de este método es que permite identificar Figura 12. Esquema de la PCR en tiempo real o “Real Time PCR”. Si la secuencia blanco está presente, la sonda hibrida con ella y se inicia la elongación a partir del extremo 3' del primer forward, como en una reacción normal de PCR. Ahora bien, cuando la cadena en elongación, junto con la polimerasa, alcanza el extremo 5' de la sonda, ésta es degradada por la actividad 5' exonucleasa que presenta la polimerasa. El resultado es que el quencher es separado del reporter de manera que la señal del reporter se ve considerablemente aumentada. El número de moléculas iniciales de ADN es proporcional a la intensidad de fluorescencia emitida. ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 PÆgina 34 Midiendo esta fluorescencia puede estimarse la concentración de un ADN problema comparándola con unos patrones de concentraciones conocidas. Recientemente la casa comercial Applied Biosystems ha comercializado una nueva modalidad de sondas, denominadas TaqMan MGB (Minor Groove Binding), que presentan la particularidad que se unen al surco pequeño de la doble hélice de ADN y aumentan así la temperatura de desnaturalización Tm, permitiendo el uso de sondas con menos pares de bases. La ventaja de este procedimiento es que permite cuantificar una secuencia de ADN específica y no la cantidad total de ADN, tal y como sucede con otras técnicas como la espectrofotometría. Además, marcando diferentes sondas con diferentes fluorocromos pueden cuantificarse distintas secuencias a la vez. La principal desventaja es que este método requiere una sonda diferente para cada secuencia a cuantificar, lo que suele encarecer bastante el proceso. Un ejemplo de RT-PCR puede verse en la figura 13. Figura 14. Estructura genética del ADN mitocondrial. 34 Figura 15. Retrato de la familia imperial Zarista. El misterioso destino de la princesa Anastasia solo pudo resolverse por el estudio del ADN de sus restos. Figura 13. Ejemplo de un resultado de RT-PCR producido por un extracto de ADN procedente del yacimiento neolítico de Tel-Hallula (Siria), con una antigüedad aproximada de unos 10.000 años. Los colores verde y rojo corresponden a dos réplicas de la misma muestra que aparecen casi superpuestas. Como se ve, a partir de los 33 ciclos de PCR -eje de abcisas- la fluorescencia crece exponencialmente (Imagen de los autores). 6.- ALGUNOS EJEMPLOS DE ANÁLISIS DE ADNa: Identificación del Duque de Widukind: El duque de Widukind vivió en el siglo VIII y fue el jefe de los sajones que combatió por la fuerza de las armas, durante 7 años, la cristianización y el imperio franco de Carlomagno, antes de bautizarse finalmente en 785. Tras su muerte, acaecida entre el 900 y el 910 d.C., su cuerpo fue enterrado en la Iglesia de Enger, en Westfalia (Alemania). El estudio realizado en su sepultura encontró, junto al supuesto esqueleto de Widukind, el de otros dos individuos de origen desconocido.50 Las condiciones de enterramiento hicieron posible la recuperación de secuencias de ADN mitocondrial de los tres individuos (ver figura 14). Dos de ellos poseían las mismas mutaciones mitocondriales indicando la posible relación por vía materna, ya que el ADN mitocondrial se hereda solo matrilinealmente, mientras que el tercero difería en una única mutación de los otros dos. A fecha de hoy, el estudio molecular de los restos de la iglesia de Enger continúa realizándose en la Universidad de ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES Göttingen (Alemania) y, de momento, nada ha podido concluirse acerca de la identidad de los tres individuos estudiados. La identificación de los Romanov: Durante el golpe de estado bolchevique en la Rusia de 1917, la familia imperial zarista fue apresada por los insurgentes. El Zar Nicolás II, la Zarina Alejandra y sus cinco hijos, Olga, Tatiana, María, Anastasia, y el Zarevich Nicolás fueron capturados y, el 16 de julio de 1918, asesinados junto a dos sirvientes y al doctor Botkin, médico de la familia, en la casa Ipatiev, en Ekaterimburgo (ver figura 15). Los cadáveres fueron rociados con cal viva y enterrados en una fosa común, si bien por el relato de los propios asesinos, dos cuerpos fueron enterrados en un lugar diferente (supuestamente los de Anastasia y el Zarevich Nicolás). En 1919 el forense Nicolai Sokolov documentó el hecho pero adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 PÆgina 35 hubo que esperar hasta 1991 en que unos historiadores amateur descubrieron una fosa común con 9 cuerpos. En 1992, se inició un estudio genético para tratar de aclarar la procedencia de los restos. Se estudiaron diferentes marcadores genéticos: ADN mitocondrial, secuencias cromosómicas de microsatélites y ADN de cromosomas sexuales (gen de la amelogenina). Este último tipo, utilizado comúnmente para asignar molecularmente el sexo a una muestra, permitió saber que se trataba de 4 restos de varón y 5 de mujer, tal y como establecía el registro histórico. El estudio de los microsatélites de ADN demostró que los esqueletos 4 y 7 eran padres de 3, 5 y 6. Los restos 1, 8 y 9, al no estar relacionados, podrían ser los sirvientes. Para saber si los individuos estudiados eran o no los Romanov se recurrió a comparar su ADN con el de descendientes actuales vivos por línea materna. El príncipe Felipe de Inglaterra, actual duque de Edimburgo, al estar relacionado por vía materna con la Zarina Alejandra, debía compartir con ella su mismo ADN mitocondrial. De la misma manera, el ADN mitocondrial de los descendientes de Louisse de Hessen-Cassel, emparentados debía ser idéntico al del Zar Nicolás II (ver figura 16). 1, 8 y 9 eran los sirvientes y el 2 era el Dr. Botkin.51 Este mismo estudio permitió aclarar el enigma de la supuesta princesa Anastasia -Ana Anderson- que desde 1921 decía ser hija del Zar y que finalmente presentó una secuencia mitocondrial inconsistente con los restos encontrados.52 A pesar de todo, esta investigación ha recibido también críticas.53 El enigma de los neandertales. Los neandertales (Homo sapiens neanderthalensis) poblaron Europa y Oriente Próximo entre hace 200.000 y 30.000 años aproximadamente (ver figura 17). En torno al 40.000-30.000 B.P. comenzó a proliferar y extenderse una nueva forma humana que los expertos han pasado a denominar hombre anatómicamente moderno (Homo sapiens sapiens), debido a su morfología más grácil, semejante a la actual. Durante algún tiempo ambas subespecies coexistieron hasta que los neandertales fueron absorbidos o desplazados por los hombres anatómicamente modernos. Este hecho ha llevado a los paleontólogos a preguntarse hasta qué punto no hubo hibridación entre ambas formas y si entre ambos taxa no existió relación filogenética. Figura 17. Cráneo de Hombre de Neanderthal. Pese a su antigüedad (30000-150000 años), este tipo de restos presenta cierto número de copias integras de ADN. 35 Figura 16. Arbol genealógico de la Zarina Alejandra (a) y del Zar Nicolás II (b). Los individuos sombreados comparten el mismo ADN mitocondrial (Tomado de Gill et al. 1994, Ref. 51). En 1997, Mathias Krings, del equipo de Svante Pääbo, consiguió secuenciar la región de control I (HVR-I) de un ADN mitocondrial extraído de un húmero derecho del ejemplar tipo del hombre de Neandertal, encontrado en la cueva de Feldhofer, en Alemania, cerca de Düsseldorf, en 1856, y que se conservaba en el "Rheinisches Landesmuseum" de Bonn.29 Los fósiles hallados en Feldhofer fueron datados entre 40.000 y 50.000 años. El procedimiento empleado consistió en amplificar mediante PCR una serie de fragmentos cortos solapantes a partir de 3.5 gr de polvo de hueso. Se realizó un estudio de racemización de aminoácidos y, además, cada fragmento amplificado fue clonado hasta 8 veces, estableciéndose una secuencia consenso. Finalmente, los fragmentos fueron ensamblados hasta completar la secuencia de la región en cuestión. Este análisis fue replicado por Mark Stoneking y Anne Stone en Pennsylvania State University (USA) para monitorizar la posible introducción de ADN exógeno a la muestra. El resultado de los análisis realizados apoya la hipótesis de que los restos se correspondían con los del crimen de Ekaterimburgo: los individuos 4 y 7 eran el Zar y la Zarina respectivamente; 3, 5 y 6 eran sus hijas; El estudio comparado de la secuencia neandertal obtenida y un gran número de secuencias humanas actuales demostró que aquella se situaba totalmente fuera del rango de variación de estos últimos: la secuencia neandertal presentó 27 diferencias con ADN ANTIGUO: QUÍMICA Y APLICACIONES adn antiguo2.qxd 17/04/2008 12:23 PÆgina 36 respecto a una secuencia consenso de referencia54, mientras que los humanos actuales difirieron tan solo en 5-8 posiciones. Posteriormente, fue secuenciada la región de control II (HVR-II) del mismo ejemplar tipo e incluso otros ejemplares de neandertal, que resultaron ser consistentes con la primera secuencia original.55-57 Krings, Pääbo y cola- boradores a partir de estos resultados concluyeron de forma explícita en su artículo que los neandertales no habían contribuido al "pool" genético de los humanos actuales, a pesar de que su trabajo se basaba en una secuencia única. Este trabajo y las conclusiones derivadas del mismo han sido objeto de numerosas controversias.58,59 AGRADECIMIENTOS. Este artículo ha sido parcialmente financiado por el proyecto BMC2002-2741 (DT). BI BLI OGRAFI A 36 1.- R. Higuchi, B. Bowman, M. Freiberger, O. A. Ryder, A. C. Wilson, Nature, 1984, 312, 282. 2.- S. Pääbo, Nature, 1985, 314, 644. 3.- S. Pääbo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 1939.. 4.- S. Pääbo, Sci. Am., 1993, 269 (5), 86. 5.- M. Stoneking, Am. J. Hum. Genet., 1995, 57, 1259. 6.- A. Cooper, Am. J. Hum. 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