ROTEIRO PRÁTICO DE MICOLOGIA

BMM 0585 - Micologia para Biomedicina

Professores:

PROF. Dr. BENEDITO CORREA

PROF. Dr. CARLOS P. TABORDA
PROFa. Dra. KELLY ISHIDA
PROF. Dr. MÁRIO HENRIQUE DE BARROS

Apoio técnico:
EDSON ALVES GOMES
TATIANA ALVES DOS REIS
ZITA MARIA DE OLIVEIRA GREGÓRIO

Aluna do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino:

Julia Figueiredo

2022

1
PRÁTICA 1 – INTRODUÇÃO À MICOLOGIA MÉDICA - MORFOLOGIA, REPRODUÇÃO E
CLASSIFICAÇÃO DOS FUNGOS

A identificação dos fungos é baseada quase que exclusivamente em sua morfologia tanto macro
como microscopicamente. Macroscopicamente os fungos podem apresentar vários tipos morfológicos
com colônias filamentosas, cotonosas, pulverulentas e outras (bolores) e cremosas (leveduras) e com os
mais diversos tipos de pigmentos.
A unidade estrutural dos fungos filamentosos é representada pela hifa e o conjunto desses
elementos é denominado micélio. O micélio pode ser diferenciado em vegetativo - quando exerce as
funções de assimilação de alimentos e fixação em substratos, e em reprodutivo - que serve à reprodução
dos fungos. O micélio vegetativo também pode se reproduzir.
De acordo com a morfologia, os fungos podem apresenta 3 tipos:
Unicelular: Células arredondadas, ovóides ou alongadas, podendo se reproduzir por brotamento,
cissiparidade ou por outro processo. Caracteriza as leveduras.
Filamentoso: Pode se apresentar com ou sem septos. As hifas podem se diferenciar em estruturas
variadas, recebendo denominações diversas: rizóides, artrósporadas, anastomoses, etc. Caracteriza os
bolores.
Pseudofilamentoso: Algumas leveduras em determinadas condições formam, por brotamentos
sucessivos, uma estrutura filamentosa conhecida com o nome de pseudomicélio. Caracteriza as leveduras
do gênero Candida.

O micélio vegetativo (em fungos filamentosos) se diferencia em estruturas de reprodução caracterizadas

pela formação de conídios/esporos que cumprem as funções de disseminação da espécie. Os
conídios/esporos podem ser hialinos, pigmentados, simples, septados, apresentando várias formas que
muitas vezes definem gêneros ou espécies de fungos. São estruturas extremamente importantes na
identificação dos fungos.
As estruturas reprodutivas, de acordo com sua origem, podem ser assexuados (conídios) ou sexuados
(esporos) e tanto um com outro, podem estar ou não dentro de determinadas estruturas.

Conídios (Reprodução assexuada):

Ectósporos: formam-se na extremidade de hifas especiais denominadas conidióforos. Ex. Aspergillus,
Penicillium.
Endósporos: conídios produzidos no interior de esporângios. Os conídios, nesse caso são chamados de
esporangiósporos e caracterizam a subdivisão Zygomycotina. Ex. Rhizopus, Mucor, Absidia.

Esporos (Reprodução sexuada):

Ectósporos: esporos formados na extremidade de basídios e são denominados basidiósporos.
Caracterizam a subdivisão Basidiomycotina. Ex. cogumelos.
Endósporos:esporos formados no interior de células denominadas ascos. Os esporos são chamados de
ascósporos e caracterizam a subdivisão Ascomycotina. Ex. Piedraia hortai.

MATERIAL
Culturas de Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Candida albicans, Sporothrix sp.(fase de levedura e
bolor) e Cryptococcus sp.
Lâminas prontas e focalizadas de Aspergillus sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Sporothrix sp.(fase
bolor),Candida albicans (vida saprofítica) e Cryptococcus sp.

2
DEMONSTRAÇÃO DE CULTURAS FÚNGICAS E LÂMINAS:
-MORFOLOGIA MACROSCÓPICA
Descreva os principais aspectos macroscópicos característicos de cada fungo: tipo de colônia, verso,
reverso, pigmentação, etc. Observe a diferença entre levedura e bolor.

-MORFOLOGIA MICROSCÓPICA
Desenhe e Descreva, através de lâminas prontas e focalizadas, os principais aspectos microscópicos dos
fungos em questão.

MORFOLOGIA MACROSCÓPICA MORFOLOGIA MICROSCÓPICA

Descrição dos aspectos macroscópicos Descrição e desenho dos aspectos
microscópicos
Aspergillus sp. Aspergillus sp.

Penicillium sp. Penicillium sp.

Rhizopus sp. Rhizopus sp.

Sporothrix sp. - Levedura Sporothrix sp. – Levedura

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 Sporothrix sp. -Bolor Sporothrix sp. -Bolor

Candida albicans – vida saprofítica Candida albicans – vida saprofítica

Cryptococcus sp. Cryptococcus sp.

Conclusão:

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PRÁTICA 2 - ECOLOGIA E FIOSIOLOGIA DE FUNGOS

ECOLOGIA DOS FUNGOS

Os fungos tem como habitat, os mais diferentes substratos. A grande maioria dos fungos vive no
solo fazendo parte da reciclagem dos materiais na natureza. São encontrados também nos vegetais, água,
nos animais, etc. Os fungos formam diversas estruturas de dispersão, sendo a principal, os
conídios/esporos, e através de dispositivos especiais, essas estruturas entram em contato com várias vias
de dispersão.
A principal via de dispersão é o ar atmosférico, através dos ventos. Os fungos que se dispersam
pelo ar atmosférico são denominados de fungos anemófilos e tem importância em alergias no homem e
como agentes deteriorantes de diversos materiais. Os fungos podem se dispersar também pela água,
sementes, insetos, homem, animais, etc. Pelas vias de dispersão, os fungos são espalhados na natureza.
Quando encontram um substrato com nutrientes adequados, crescem e colonizam. Dessa maneira, podem
deteriorar vários materiais e ocasionar em vários hospedeiros, as micoses.
Através de métodos específicos, os fungos podem ser isolados de seu habitat, das vias de
dispersão, dos vários materiais contaminados e de diversos hospedeiros com micoses.

MATERIAL
Placas de Petri com ágar Sabouraud para isolamento de fungos anemófilos;
Tubos com 1 g de milho moído e tubos com 9 mL de água destilada estéril;
Tubos com 1 g de solo e tubos com 9 mL de água destilada estéril;
Tubos com água do lago;
Tubos estéreis para coleta de água do abastecimento público;
Pipetas de 1 ml estéreis;
Alças de Drygalsky estéreis.

PRÁTICA

ISOLAMENTO DE FUNGOS ANEMÓFILOS

Expor placas de Petri, contendo ágar Sabouraud dextrose durante 15 minutos em diferentes locais.
Cultivar à 25 °C. Após 7 dias realizar a contagem de colônias crescidas – diferenciar em fungos
filamentosos e leveduras.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SUBSTRATOS (alimentos e solo).

Fazer uma suspensão do substrato (1 g) em 9 mL água destilada estéril. Semear 0,1 ml do líquido na
superfície do ágar Sabouraud dextrose. Espalhar com alça de Drygalsky e cultivar à 25 °C. Após 7 dias
realizar a contagem de colônias crescidas e iniciar a identificação das mesmas. Em alguns casos é
necessário proceder à diluição da água e semear pela técnica de “pourplate”.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SUPERFÍCIE

Com auxílio de “swab”, umedecer o algodão em água destilada estéril e retirar o excesso na parede do
tubo. Passar o “swab” na área de interesse e semear na superfície do ágar Sabouraud dextrose. Após 7
dias realizar a contagem de colônias crescidas – diferenciar em fungos filamentosos e leveduras.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE LÍQUIDOS (água do lago e de abastecimento público).

Para o isolamento de fungos que utilizam a água como via de dispersão, utiliza-se técnicas de diluição
comuns e semeadura na superfície em ágar Sabouraud.
Coletar água do bebedouro, da torneira ou de outro local. Semear 0,1 ml do líquido na superfície
do ágar Sabouraud dextrose. Espalhar com alça de Drygalsky e cultivar à 25 °C. Após 7 dias realizar a
contagem de colônias crescidas e iniciar a identificação das mesmas. Em alguns casos é necessário
proceder à diluição da água e semear pela técnica de “pourplate”.

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LEITURA
Após a incubação por 7 dias, dos meios de cultura, observar e distinguir o tipo de crescimento fúngico
(levedura ou bolor) e contar o número de colônia para cada tipo fúngico.

Inserir os resultados de contagem de colônias e os aspectos macroscópicos (após 7 dias).

Leveduras Bolor
Fungos Anemófilos

Solo

Alimento (milho)

Água do Lago

Água do Abastecimento Público

Superfície de Material

Conclusão:

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FISIOLOGIA DE FUNGOS

Os fungos são seres heterotróficos retirando os nutrientes do meio ambiente circundante. Através
de digestão enzimática externa transformam as substâncias de maneira que possam ser absorvidas. De
maneira geral necessitam de 4 elementos básicos: H, O, C e N, além de outros elementos em menor
quantidade: P, S, K, Mg, Fe, Zn, Mn, Cu, Mb, sendo que alguns fungos necessitam ainda de determinados
fatores de crescimento, como por exemplo a tiamina. De maneira geral, para seu crescimento, necessitam
de uma fonte orgânica de C e de uma orgânica ou inorgânica de N. O meio artificial básico para trabalho
com fungos é ágar Sabouraud que tem como fonte de C, a glicose e como fonte de N, a peptona.
Um esporo/conídio de fungo, tendo os nutrientes adequados, germina, filamento, cresce e origina
novos esporos/conídios. Nesse processo de crescimento, vários fatores interferem como temperatura,
umidade, pH , etc. De maneira geral, o ótimo de temperatura é entre 20 oC e 30 oC, mas os fungos podem
se manter em temperaturas baixas ou altas. Há fungos termofílicos, termotolerantes, mesofílicos,
psicrófilos. A umidade ótima para seu crescimento é entre 75 e 95 %, mas também suportam uma ampla
variação. Da mesma maneira acontece com o pH. As leveduras crescem em variações de pH entre 2,5 e
8,5 e os bolores entre 1,5 e 11. De maneira geral o ótimo é neutro.
Alguns fungos apresentam-se em determinadas condições, na forma filamentosa e em outras
condições, na forma de levedura. Como exemplo desse dimorfismo, temos o Paracoccidioides
brasiliensis, o Histoplasma capsulatum e o Sporothrix schenckii, importantes agentes de micoses, que
na natureza ou em laboratório à temperatura de 25 oC, apresentam-se em forma de bolor e quando
infectando um hospedeiro ou a 37 oC em laboratório, apresentam-se em forma de levedura.
As células fúngicas, para sobreviverem e reproduzirem, se nutrem por meio de absorção de
diversos nutrientes, desde estruturas moleculares simples (metano) até as mais complexas (celulose,
lignina). Para tais, os fungos disponibilizam de processos metabólitos, muitas vezes específicos do
gênero/espécie. Essas reações químicas celulares podem ser utilizadas para a identificação de fungos,
assim como as características macro e micromorfológicas (Método clássico de identificação de fungos).
As principais provas bioquímicas são:
Auxanograma: Avalia a capacidade de assimilação de carboidratos (fontes de carbono) pelos
fungos (Respiração aeróbica) e assimilação de fontes de nitrogênio (orgânico ou inorgânico)
Zimograma: Avalia a capacidade de fermentação de carboidratos pelos fungos (Respiração
anaeróbica), caracterizadas pela formação de gás no tubo de Durham.
Urease: Avalia a capacidade do fungo em converter a uréia em amônia e anidro carbônico. A
amônia deixa o meio de cultura com pH básico. Como o indicador de pH é a vermelho de fenol, o meio
ficará na coloração róseo-avermelhada.

MATERIAL:
Auxanograma para demonstração
Zimograma para demonstração
Urease para demonstração

PRÁTICA

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Faça as observações de cada teste realizado/observado e anote os resultados obtidos.
I) - Culturas de fungos com pigmentos diferentes - Demonstração

Rhodotorula rubra_______________________________________________________
Microsporum canis_______________________________________________________
Fusarium sp. ____________________________________________________________
Trichophyton rubrum______________________________________________________

II) - ZIMOGRAMA – Demonstração

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III) - AUXANOGRAMA – Demonstração

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IV) – UREASE – Candida sp. e Cryptococcus sp. crescidos em meio urease - Demonstração
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Roteiro para Relatório Prática Ecologia e Fisiologia

1. Introdução
2. Materiais e Métodos
3. Resultados e Discussão
Além de descrever os resultados obtidos nos experimentos e nas demonstrações. Abordar os seguintes
aspectos:
a. Qual a importância do controle de qualidade dos fungos do ar?
b. Porque é importante conhecer os processos bioquímicos e fisiológicos dos fungos?
c. Qual a relação da morfologia com o ambiente nutricional?
4.Referências

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PRÁTICA 3 - IDENTIFICAÇÃO POLIFÁSICA DE FUNGOS

Introdução

A identificação de fungos se baseia, por muitas vezes, nas observações das características
macroscópicas e microscópicas. No entanto, há uma grande dificuldade na identificação/classificação de
fungos quando, somente, métodos baseados em aspectos morfológicos, os quais são aplicados à chaves
de classificação (Arx, 1974; Barnett & Hunter, 1972; Hanlin & Menezes, 1996). Para isso, é preciso que
o indivíduo que esteja fazendo a identificação tenha um alto conhecimento sobre taxonomia e
sensibilidade para perceber pequenos detalhes morfológicos. Em muitos casos, os taxonomistas têm
dificuldades para determinar quais são as características que realmente definem uma espécie ou gênero.
Além disso, fases sexuadas (teleomórficas) e assexuadas (anamórficas) de um mesmo genótipo são
classificadas com espécies distintas, pois, de fato, apresentam formas bastante distintas.
Além das técnicas morfológicas e bioquímicas, técnicas moleculares de identificação podem
contribuir de forma significativa para o entendimento das relações filogenéticas entre as diferentes
espécies de fungos, bem como contribuir para uma melhor classificação das novas espécies que poderiam
ser catalogadas em projetos de análise da biodiversidade. Além disso, a utilização de métodos
moleculares, como o sequenciamento de genes conservados (exemplos: ITS, IGS1, TEF-1α, β-tubulina,
calmodulina), podem ser usados para a identificação de micro-organismos e possibilitar, ainda, o
desenvolvimento de métodos de diagnóstico, análises filogenéticas, epidemiologia e genética de
populações.
Com avanço dos métodos espectroscópicos na identificação de moléculas, a espectrometria de
massas, como por exemplo, pode ser utilizada para detectar e identificar proteínas de um determinado
micro-organismo, caracterizando uma digital. Atualmente, o método MALDI-TOF, já é empregado em
alguns laboratórios de análises clínicas para diagnóstico laboratorial de infecções microbianas, incluindo
as infecções fúngicas. No entanto, ainda se encontra em fase de teste e ampliação do banco de dados.
Diante o exposto, a abordagem polifásica assume um papel fundamental na identificação da
espécie fúngica.

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PRÁTICA

ESCOLHER DUAS COLÔNIAS DE FUNGOS FILAMENTOSOS DA PLACA DOS FUNGOS

ANEMÓFILOS

Os fungos escolhidos serão utilizados em diferentes técnicas na tentativa de identificar o gênero e/ou
espécie do fungo.

Anotar as características macroscópicas das colônias escolhidas:

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EXAME DIRETO DA COLÔNIA

Pingar uma gota de corante Lactofenol azul de algodão e com auxílio de uma alça em L, retirar uma
pequena porção da colônia de levedura ou bolor e dispensar na gota de corante. Recobrir a gota com
uma lamínula. Visualizar ao microscópio ótico.

Anotar as características microscópicas:

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Desenho Esquemático:

COLÔNIA GIGANTE
Com auxílio de uma alça em L, retirar uma porção da colônia e inocular no centro da superfície do ágar
Sabouraud dextrose. Incubar a 25-28 ºC por 3-10 dias.

Observar as características macroscópicas da colônia:

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MICROCULTIVO EM LÂMINA

Fungo na forma filamentosa: Utilizar placas de Petri contendo lâminas dispostas sobre um bastão de
vidro. Com todo cuidado de assepsia, coloque um pequeno quadrado (1 cm) de ágar Sabouraud, sobre a
lâmina. Com alça de platina em L, retire um pequeno fragmento de uma colônia escolhida (placa de
fungo do ambiente) e semeie nos 4 lados do ágar. Coloque uma lamínula estéril sobre o ágar e água
destilada estéril na placa para evitar dessecamento do meio. Feche a placa e deixe à temperatura ambiente.
Quando houver desenvolvimento satisfatório, retire a lamínula e o fragmento do meio de cultura e
coloque numa lâmina contendo uma gota de lactofenol azul de algodão. Examinar ao microscópico e
tentar identificar o fungo, quando possível.

Observar e desenhar e descrever as características microscópicas:

Fungo Filamentoso (1) Fungo Filamentoso (2)

Roteiro para Relatório:

1. Introdução
2. Materiais e Métodos
3. Resultados e Discussão - Descrever os dados obtidos nos experimentos e na discussão abordas os
seguintes aspectos:
a. Qual a vantagem e desvantagem do método do Exame Direto com relação ao microcultivo
em lâmina?
b. Descreva as características macroscópicas das colônias e microscópicas dos fungos
observados na aula prática.
c. Quais estratégias laboratoriais poderiam ser utilizadas para identificar a espécie dos
fungos trabalhados na aula prática?
4. Referências

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 PRÁTICA 4 - GENÉTICA

1- Análise de Tétrades de Esporos

Saccharomyces cerevisiae possui um ciclo de vida bem definido com a fase haplóide e
diplóide estáveis. Na fase haplóide existem dois tipos sexuais: tipo “a” e tipo “α”. O diplóide
pode sofrer meiose em condições de estresse nutricional , como meio pobre em fonte de
nitrogênio.
Cada grupo receberá microtubos contendo células de levedura e deverá identificar em
quais ocorreu a meiose.

2- Transformação de Saccharomyces cerevisiae com DNA exógeno.

Saccharomyces cerevisiae é o organismo eucarionte mais manipulado geneticamente. Possui

uma gama de vetores e estratégias de manipulação muito parecidas com Escherichia coli.
Embora similar ao procedimento bacteriano, a transformação de leveduras requer tratamentos
adicionais com sais de lítio e polietileno glicol. Tais diferenças são decorrentes da presença da parede
celular de quitina e -glucanos típica dos fungos, que forma uma barreira para a entrada de DNA
exógeno.
A seleção das células transformadas pode ser feita pelo simples critério de crescimento e
formação de colônia em meio mínimo seletivo, pois somente as transformadas terão adquiridos
alguma capacidade nutricional nova

Procedimento prático:
Cada grupo receberá um microtubo, tipo eppendorff, contendo 0.1ml de células W303-1B (MAT 
ade2-1, trp1-1, his3-115, leu2-3,112 ura3-1 de S. cerevisiae estando suspensas em 100mM acetato de
lítio, 10mMTris-Cl pH 7.5 e 0.1mM EDTA. A esse será adicionado o DNA exógeno a ser incorporado
pelas células (no caso o plasmídio recombinante (pMRX9-GPD) e DNA carrier obtido de salmão.

1 -Adicionar 10l da mistura de DNA às células.

2-Adicionar 0,7ml de polietileno glicol a 40% (PEG-40%) em 100mM Acetato de Lítio (misturar por
inversão, duas vezes)
3- Deixar na bancada sem mexer por 20min.
4-Transferir os tubos para 42ºC por 10min.
5-Adicionar 0,5ml de H2O em cada tubo;
6- Centrifugar a 13500rpm por 30 segundos.
7- Descartar o sobrenadante;
8- Adicionar 1ml de H2O, fechar, inverter, descartar o TE e ressuspender com o que sobrar
9- Semear em meio mínimo seletivo apropriado.

3- Perguntas para o relatório?

1- Como se apresentam as células de S. cerevisiae após a meiose?
1- Quais as auxotrofias da linhagem utilizada no experimento de transformação? Qual a marca de
seleção do plasmídio transformante?
2- Como o meio mínimo deve ser suplementado a fim de garantir o crescimento somente das
células que receberam o plasmídio transformante?.
3- Qual o papel dos reagentes (acetato de lítio, carrier DNA, PEG 40%) e do choque térmico a 42oC
utilizados no processo de transformação?
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PRÁTICAS 5, 6, 7 e 8 - DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOSES

As doenças provocadas por fungos são classificadas de acordo com a localização no hospedeiro:

Micoses superficiais
Pitiríasis versicolor - Malassezia furfur
Piedra preta - Piedraia hortae
Piedra branca - Trichosporon beigelii

Micoses Cutâneas
Dermatofitoses - Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton
Candidíase - Candida

Micoses Subcutâneas
Esporotricose – Sporothrix
Cromomicose -Phialophora, Cladophialophora e Fonsecaea
Micetomas- Pseudoallescheria, Madurella, Acremonium
Doença de Jorge Lobo - Paracoccidioides loboi

Micoses Sistêmicas endêmicas

Paracoccidioidomicose - Paracoccidioides
Histoplasmose - Histoplasma capsulatum

Outras Micoses Sistêmicas

Candidíase –Candida
Criptococose- Cryptococcus
Aspergilose – Aspergillus

Além das micoses, os fungos podem ainda produzir alergias, micotoxicoses e micetismos.

Diagnóstico laboratorial
Métodos diretos
1- Exame direto
a fresco - clareamento com KOH
após colorações: Gram, Giemsa
2- Histopatológico - HE, Gomory, PAS
3- Cultura:Sabouraud
Sabouraud + antibióticos
Meios específicos: seletivos e indicadores
Exame macroscópico e microscópico
4- Provas bioquímicas p/ identificação
Auxanograma para fontes de C e N.
Zimograma
Urease etc.
5- Provas imunológicas para identificação do agente

Métodos Indiretos
1- Imunológicos
Reação de Fixação do complemento, aglutinação, Precipitação, imunodifusão,
contraimunoeletroforese, imunofluorescência, intradermoreação, etc

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PRÁTICA 5 – MICOSES SUSPERFICIAIS E CUTÂNEAS

MICOSES SUPERFICIAIS

Constituem um grupo de fungos que estão praticamente no limiar do saprofitismo e do parasitimo,

causando no hospedeiro apenas distúrbios estéticos.

PITÍRIASIS VERSICOLOR

Definição: dermatose superficial crônica, cosmopolita, muito freqüente em clima tropical, caracterizada
pelo aparecimento de pequenas manchas bem delimitadas, de coloração variável, localizadas
principalmente no tronco e no abdômen. Atinge indistintamente todas as raças e mais freqüentemente
adultos jovens.

Agente etiológico: Malassezia spp.

Características clínicas: Lesões superficiais, atingindo principalmente o tronco e abdômen, mas

podendo acometer pescoço, face, braços, e raramente mão e região inguino crural. As lesões se
apresentam sob a forma de manchas hipocrômicas descamativas irregulares, de cor variável, dependendo
da cor do indivíduo, e condição do clima. Apresenta fluorescência à luz de Wood.

Diagnóstico micológico: as escamas devem ser clarificadas em hidróxido de potássio a 20% ou 30%.
Ao exame microscópico observam-se células birrefringentes arredondadas, isoladas ou agrupadas com
um cacho de uvas ao lado de hifas curtas, septadas, ramificadas.
A cultura das escamas deve ser feitas em meio da Sabouraud dextrose + cloranfenicol +
cicloheximida, adicionado de óleo de oliva e bile de boi, pois esta levedura é lipofílica, e incubada à
37oC.

PIEDRAS

PIEDRA BRANCA E PIEDRA NEGRA

Definição: infecção micótica dos pelos caracterizada pela presença de nódulos mais ou menos duros,
esbranquiçados (piedra branca) ou negros (piedra negra).
As piedras são infecções benignas, mas muito contagiosas e de fácil propagação. Ambas são distintas,
não só pelos seus agentes etiológicos, mas também por sua distribuição geográfica e epidemiológica.
Clinicamente, estas micoses podem ser confundidas com a tricomicose axilar e com a pediculose
(lêndias). Atacam a região folicular dos pelos.

PIEDRA NEGRA

Agente etiológico: Piedraia hortae

Epidemiologia: é observada em regiões tropicais e subtropicais da América do Sul, endêmica na

Amazônia, na Indochina e em Java. Ocorre, principalmente nas regiões onde há abundante queda
pluviométrica. Ataca somente os pelos do couro cabeludo, apresentando nódulos visíveis ou não a olho
nu. As nodosidades da piedra preta são muito consistentes.

Exame micológico: o cabelo deve ser cortado e examinado após clarificação com potassa a 20%.
Observa-se um nódulo constituído de um micélio largo de 2 a 4 m, de paredes escuras, presença de
ascos ovais contendo ascóporos fusiformes.

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Cultura em ágar-Sabouraud as colônias são verde-escuras, enegrecidas, acuminadas listas ou plissadas,
de crescimento lento.

Aspecto microscópico: filamentos escuros, curtos de paredes espessas, numerosos clamidoconídios.

PIEDRA BRANCA

Agente etiológico: Trichosporon beigelli

Epidemiologia: é de distribuição geográfica cosmopolita. Ataca os pelos da barba e do bigode, mais

raramente os pelos axilares. Recentemente observou-se ser comum em pelos escrotais. Os nódulos são
menos consistentes e aderentes ao pêlo. São frequentemente encontrados na extremidade do pelo e pouco
visíveis a olho nu.

Exame micológico: Após clarificação de pêlo com potassa a 20%, observa-se micélio fragmentado em
elementos mais ou menos retangulares ou arredondados. Não apresentam ascos.

Cultura. Em ágar Sabouraud dextrose, as colônias são de cor creme, moles, membranosas, tornando-se
com o tempo levemente penugentas e aderindo fortemente ao meio de cultura. Crescimento rápido.

Aspecto microscópico: Filamentos e artroconídos.

FUNGOS PRODUTORES DE MICOSES CUTÂNEAS

DERMATOFITOSES

Definição:

É uma infecção cutânea, com uma variedade de aspectos clínicos, cujos agentes etiológicos
atacam com predileção a queratina da pele, pelos e unhas. A infecção é geralmente restrita às camadas
não vivas da superfície corpórea. A maioria destas infecções são causadas por um grupo homogêneo de
fungos queratinofílicos chamados dermatófitos.
Os dermatófitos são divididos nos seguintes gêneros:
Microsporum spp.
Trichophyton spp.
Epidermophyton spp.
Quanto ao habitat os dermatófitos podem ser:
geofílicos - quando têm seu habitat no solo.
zoofílicos -quando têm seu habitais nos animais.
antropofílicos - quando têm seu habitat no homem.

Modo de infecção: A infecção é feita pela forma miceliana. Na pele, os filamentos micelianos crescem
excentricamente na camada córnea da pele e se ramificam. Após espaço de uma semana há uma reação
cutânea e formação de vesículas ao redor da lesão. O pêlo é penetrado secundariamente; o dermatófito
vai utilizando a queratina do pêlo e penetrando em direção ao bulbo. Os cabelos parasitados se tornam
descoloridos, frágeis, e caem aparecendo uma zona de tonsura (tinhas tonsurantes)
O aspecto dos elementos fúngicos dentro e no redor dos pelos e a presença de hifas septadas,
ramificadas, com artroconídios nas escamas de pele e unhas, indicam seguramente uma infecção por
dermatófitos.

Aspectos clínicos das dermatofitoses: Dependendo do local onde o dermatófito se instale, podemos
denominar a dermatofitose, por exemplo, na região inguino-crural = tineacruris; no corpo
=tineacorporis; na barba =tineabarbae; na mãos = tineamanum; nos pés = tineapedis, na unha =
tineaunguium; no couro cabeludo =tineacapitis.
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Estudo biológico dos dermatófitos:
Podemos utilizar a lâmpada de Wood, não só para o auxílio diagnóstico, como para controle de
cura. As lesões de tinhas submetidas às radiações ultravioletas, filtradas, apresentam fluorescência verde,
principalmente nas lesões de tinha do couro cabeludo provocadas pelo M. canis.
Para a coleta do material biológico devemos utilizar: Placa de Petri; tesoura; bisturi; pinça e
lâminas de microscopia.
Das lesões do couro cabeludo devemos coletar, com pinça os fios de cabelo que já estão
tonsurados na periferia da lesão.
Nas lesões circinadas devemos raspar, com bisturi ou com a própria lâmina, na bordas das lesões,
pois é o local onde o fungo está em atividade.
Nas oníquiassub-ungueais deve-se raspar por debaixo da unha, em contato com o tecido são. A
unha pode ser cortada.
Todo material deve ser coletado em placa de Petri ou entre duas lâminas. Não se devem misturar
materiais de locais diferentes.

Diagnóstico Laboratorial

Material Biológico: escamas de pele, raspado de unha e pelos

Exame direto: Submeter o material ao amolecimento e a clarificação com potassa (KOH) diluição a 10,
20 ou 30% a quente.

O que procurar nas preparações:

No exame direto de escamas de pele ou unha observam-se filamentos micelianos longos,
ramificados, septados, algumas vezes com artroconídios
Exame direto de cabelo ou pêlo: bainha de esporos redondos ao redor do pêlo (parasitismo
ectothrix) ou filamentos com artroconídeos no interior do pêlo (parasitismo endothrix). Pode
ocorrer parasitismo endo e ectothrix ao mesmo tempo.

Cultura: todos os dermatófitos crescem facilmente no meio de ágar Sabouraud dextrose ou no meio
“Mycosel” (meio de Sabouraud acrescido de cloranfenicol, inibidor bacteriano, e de cicloheximida, que
inibe fungos filamentosos contaminantes).

16
PRÁTICA – micoses superficiais e cutâneas

I - Lâminas focalizadas/Pranchas e Culturas – Desenhar e fazer anotações a respeito das

características macroscópicas e microscópicas.

Microsporia Tricofícia

Microsporum canis Tricophyton rubrum

Microsporum gypseum Tricophyton mentagrophytes

Ptiríase versicolor Malassezia furfur

Exame direto da PELE

17
II – Técnica da Isca
Em uma placa de Petri estéril, dispensar a terra para análise, e em seguida, colocar os fios de cabelo
estéreis sobre a terra. Molhar com água destilada estéril e incubar a 25-28º C e observar se há
crescimento fúngico por até 21 dias.

Resultado:
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

II - Carpetes estéreis
Os alunos levarão para casa para coleta de material do animal de estimação. Com a mão friccionar o
carpete na pelagem do animal. Levar o carpete no dia seguinte para processamento no laboratório de
Micologia (ICBII - sala 247).

Resultado:
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

I – Urease – Demonstração

___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Roteiro para o Relatório: Experimento técnica da Isca e Carpete

1. Introdução
2. Materiais e Métodos
3. Resultados e Discussão
4. Referências

18
PRÁTICA 6 – MICOSES SUBCUTÂNEAS

MICOSES SUBCUTÂNEAS

ESPOROTRICOSE

Definição
Espécies do gênero Sporothrix são fungos dimórficos e agentes da esporotricose, micose
subcutânea sub-aguda ou crônica, podendo ter 3 principais formas clínicas: cutânea, linfocutânea e
disseminada, sendo a linfocutânea a mais freqüente. A infecção é adquirida através da inoculação
traumática do fungo no tecido epitelial atingindo a camada subcutânea. Indivíduos que trabalham na
lavoura, jardinagem e outros podem se contaminar com o fungo presente no ambiente por meio de farpas
de madeiras e espinhos de plantas. Atualmente, a transmissão zoonótica da esporotricose está vinculadas
a arranhaduras e mordidas de felinos infectadas por Sporothrix e está intimamente ligada a epidemia de
esporotricose no estado do Rio de Janeiro desde 1998. As principais espécies causadoras da esporotricose
são: S. schenckii, S. brasiliensis, S. mexicana, S. globosa, S. palida.
O exame direto à fresco não apresenta muito valor no diagnóstico desta micose, pois as estruturas
fúngicas não revela características diferenciais em vida parasitária. Em material de biópsia observam-se
leveduras em forma de “naveta”.
O cultivo deve ser realizado à 25oC e `a 37oC. À 25oC a cultura encontra-se em fase M (bolor) e
observa-se o desenvolvimento de colônia cotonosa, a princípio branca, tornando-se com o tempo
enegrecida e úmida. Ao exame microscópico observam-se hifas delgadas, septadas e conídios piriformes
dispostos em forma de “margarida”, na extremidade dos pedúnculos (conidióforos) ou inseridos
diretamente nas hifas. Culturas envelhecidas revelam conídios arredondados e dispostos paralelamente
às hifas. À 37oC, a cultura está em fase Y (levedura) e observa-se o desenvolvimento de uma colônia
branca e cremosa. Ao exame microscópico observam-se leveduras globosa a elípticas ou em forma de
naveta.

Diagnóstico laboratorial

Material Clínico: pele, punção dos linfonodos, pus, sangue, biópsias de tecidos etc.
Exame direto: à fresco não revela nenhuma forma conclusiva de Sporothrix. Esfregaços de pus corados
pelo Gram, PAS ou Gomori, raramente permitem visualização do fungo. Pela técnica de
imunofluorescência direta, a visualização do agente em pequeno número é mais fácil.
As células fúngicas observadas nas lesões são raras e quando presentes, são vistas como
leveduras com ou sem brotamento, Gram +, PAS +, tamanho de 2-3 x 3, sob forma de corpo asteróide,
células esféricas de parede espessa.
Cortes histopatológicos corados pelo Gram, PAS ou Gomori & Grocott mostram o fungo sob
a forma de naveta ou charuto ou ainda formas asteróides, resultantes de uma relação hospedeiro-parasita.
Cultura: excelente crescimento em ágar Sabouraud dextrose ou Mycosel. Cultura cresce em 3 a 5 dias,
é um processo seguro e de rápido diagnóstico.
Características macroscópicas da cultura: em meio de ágar Sabouraud-dextrose, à temperatura
ambiente, as colônias de S. schenckii são de formas e cores variadas, de esbranquiçadas a negras,
superfície plissada, levemente aveludada e de consistência elástica. À temperatura de 37oC a cultura é
leveduriforme, de consistência cremosa e de cor amarelo creme.
Características microscópicas da cultura: a forma miceliana é obtida em microcultivo em lâmina,
verifica-se a presença de finos filamentos septados, com conídios redondos ou piriformes, dispostos ao
longo das hifas ou na forma característica em “margarida”. À 37oC apresenta-se sob a forma de levedura
com brotamento.

19
CROMOMICOSE

Definição

É uma infecção crônica de evolução lenta, que acomete a pele e o tecido celular subcutâneo do homem
e dos animais. A maioria das lesões é causada por fungos da família Dematiaceae, que vivem no solo e
vegetais em decomposição. O aspecto clínico das lesões é polimorfo, caracterizando principalmente pela
formação de nódulos, lesões papulosas, eritemato-descamativas e pela forma clássica, verrucosa, que
pode apresentar-se ulcerada ou não. Normalmente, as lesões localizam-se nos membros inferiores,
principalmente nos pés e pernas.
A infecção ocorre geralmente pela inoculação traumática das partículas fúngicas na pele do hospedeiro.
E os principais agentes etiológicos da cromomicose são: Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea compacta,
Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii e Rinocladiella aquaspersa.
É importante ressaltar que no tecido do hospedeiro, as partículas fúngicas inoculadas se convertem em
células globosas, com presença de fissão entre as células e com coloração natural marrom, chamadas de
corpos fumagóides, células muriformes ou células escleróticas. Essas células são consideradas leveduras
e se dividem por meio de fissão binária. A observação dessas estruturas é sugestiva de cromomicose,
eliminando outras doenças como leishmaniose e esporotricose. Tanto as células escleróticas e o micélio
dos fungos causadores da cromomicose (fungos demáceos) possuem coloração natural marrom-castanho.

Diagnóstico laboratorial

Material Biológico: secreções, escamas de pele, biópsias de tecido

Exame Direto: Clarificação com KOH 10%. Observação de células globosas, ovaladas, de parede
espessa, de coloração castanha, apresentando geralmente septação interna chamadas de corpos
fumagóides, células muriformes ou células escleróticas. A presença dessas células é sugestivo de
cromomicose.
Cultura: Cultivar em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol ou Mycosel (ágar peptonado e
glicosado com cicloheximida e cloranfenicol) a 25-30ºC. Um fato peculiar é que os fungos causadores
da cromomicose não crescem na presença de cicloheximida.
Histopatologia: Os cortes histológicos podem ser corados com HE. Observação as células escleróticas
de coloração natural marrom.

20
PRÁTICA

Observe as lâminas focalizadas. Desenhe e descreva as características macroscópicas e

microscópicas:

21
PRÁTICA 7 – MICOSES SISTÊMICAS I - Candidíase e Criptococose

CANDIDÍASE

Definição

Candidíase é uma infecção primária ou secundária envolvendo as espécies do gênero Candida. Pode-se
considerar cerca de 7 espécies mais frequentes em material clínico humano: C. albicans, C. tropicalis,
C. pseudotropicalis, C. parapsilosis. C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. stellatoidea, sendo a
espécie de C. albicans a mais freqüente. Entretanto, espécies resistentes aos antifúngicos são emergindo
como C. auris e C. lusitaniae. As manifestações clínicas das doenças são as mais variadas, podendo ser
subaguda, aguda ou crônica. O envolvimento pode ser localizado na boca, garganta, couro cabeludo,
vagina, dedos, unhas, brônquios, pulmões, trato gastrointestinal ou generalizado, como na septicemia,
endocardite e meningite. No caso de infecções sistêmicas, a mortalidade pode chegar até 70% dos casos
de candidemia.
Os processos patológicos também são variados indo desde irritação e inflamação até uma resposta
granulomatosa e supurativa. Espécies de Candida são leveduras que fazem parte da microbiota, isto é,
encontradas normalmente no homem e sua manifestação representa um processo oportunístico.
Para que C. albicans seja considerada patogênica é necessário que seja isolada de modo constante, em
grande quantidade das lesões e, de modo geral, visualizada ao exame direto na forma filamentosa.
Freqüentemente, o paciente apresenta debilitação em seus mecanismos de defesa ou tem uma doença de
base. Nos pacientes idosos debilitados, recém-nascidos prematuros e nos desnutridos, a ocorrência de
candidíase é alta, em suas variadas formas clínicas. Durante a gravidez, principalmente nos 3 últimos
meses, com o aumento de glicogênio nas células da mucosa vaginal, e uso de anticoncepcionais de alta
dosagem ocorre aumento de candidíase vaginal. Tratamentos prolongados com antibióticos,
principalmente os chamados de largo espectro de ação, corticóides, drogas imunossupressoras favorecem
a instalação de candidíases, principalmente as formas invasivas.

Diagnóstico Laboratorial

Materiais biológicos: raspados das lesões cutâneas e das mucosas, expectoração, raspados das unhas,
urina, sangue e biópsias, entre outros.
Exame direto:
- a fresco com KOH a 20%
- esfregaços corados pelo Gram ou Giemsa (além de poder visualizar os elementos
fúngicos, permite avaliar a quantidade de microrganismos)
- cortes histológicos: PAS ou Gomori & Grocott (elementos leveduriformes com
brotamentos e filamentos abundantes).
-
Cultura: em meio ágar Sabouraud dextrose + cloranfenicol; após 24-48 horas colônias cremosas,
esbranquiçadas, brilhantes. Ao exame microscópico visualizam-se apenas os elementos leveduriformes
comuns a todas as espécies de Candida.

22
Identificação da espécie de Candida

1. Produção de clamidoconídios: em meio de fubá (“cornmeal ágar”+ tween 80), a C. albicans

produz produz clamidioconídios terminais ou intercalares, redondos ou ovais, após 24-48 h.
2. Produção de tubo germinativo: a espécie de C. albicans produz o tubo germinativo em presença
de soro (humano, fetal bovino) após 1-3 horas à 37oC.
3. Auxanograma: Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio.
4. Zimograma: Fermentação de açúcares.

CRIPTOCOCOSE

Definição
É uma infecção subaguda ou crônica de comprometimento pulmonar, sistêmico e, principalmente, do
sistema nervoso central (SNC), causada pelo Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A
infecção primária no homem é quase sempre pulmonar, devido à inalação do fungo da natureza. A
infecção pulmonar é quase sempre subclínica e transitória, podendo imergir ao lado de outras doenças
que debilitam o indivíduo, tornando-se rapidamente sistêmica e fatal. Portanto, é conhecida como
infecção oportunista. Este fungo tem tropismo pelo SNC, ocasionado meningite criptocócica. A espécie
de C. gattii, também, pode causar criptococose em pacientes imunocompetentes.
C. neoformans é de distribuição cosmopolita e está associado com habitat de aves. O pombo parece ser
o principal vetor para a distribuição e manutenção do fungo. Não parece que o pombo tenha a infecção,
uma vez que ele tem uma temperatura corporal em torno de 42ºC. O fungo vive nas fezes e pode
permanecer viável por 2 anos se houver umidade suficiente. Já C. gattii é frequentemente isolado de
troncos de eucaliptos e está relacionado com a presença de madeira em decomposição

Diagnóstico Laboratorial

Materiais biológicos: liquor, escarro, pus ganglionar, exsudatos de lesões cutâneas e mucosas, urina e
sangue.

Exame direto: à fresco com tinta nanquim as leveduras de Cryptococcus spp. são visualizadas como
ucélulas redondas, circundadas por uma cápsula mucopolissacarídica não corada

Histopatologia: Coloração com H&E, Gromori-Grocott – presença de leveduras; Coloração de

mucicarmim evidencia a presença de cápsula polissacarídica envolvendo a levedura – se colora em rosa.

Cultura: o material deve ser semeado em ágar Sabouraud dextrose e dará crescimento a uma colônia
viscosa, lisa, brilhante. Com o tempo, a colônia escorre para a base do tubo.

PRÁTICA DEMOSNTRATIVA

-Lâmina de Cryptococcus sp. em tinta nanquim

-Lâmina de Candida albicans – levedura

-Lâmina de Candida albicans – tubo germinativo

-Lâmina de Candida albicans – clamidoconídeo

-Demonstração Auxanograma e Zimograma

-Demonstração Ensaio da urease

23
 Cryptococcus sp. Candida albicans – levedura

Candida albicans – tubo germinativo Candida albicans – clamidoconídeo

PRÁTICA 8 - MICOSES SISTÊMICAS II - Paracoccidioidomicose e Histoplasmose

PARACOCCIDIOIDOMICOSE (PCM)

Definição

P. brasiliensis e P. lutzii são fungos dimórficos e agentes etiológicos da PCM, doença de localização
sistêmica, grave e que se manifesta por diversas formas clínicas.
O exame direto a fresco é de grande valor no diagnóstico dessa micose, pois o fungo apresenta-se sob a
forma de levedura com dupla membrana, sendo a interna enrugada e a externa lisa. Dependendo do
material, apresenta-se com brotamentos múltiplos Em material de biópsia, com coloração de Gomory,
pode-se observar facilmente o aspecto característico de “roda de leme”.
O cultivo pode ser feito em ágar Sabouraud dextrose a 25 oC e em ágar BHI com sangue ou meio de Fava
Netto a 37 oC e incubar de 20 a 30 dias. A 25 oC, a cultura esta em fase M (mould-bolor) e observa-se o
desenvolvimento de uma colônia cotonosa, branca, elevada e de crescimento lento, cujo exame
microscópico revelará apenas micélio septado e alguns clamidósporos. A 37 oC, a cultura está em fase Y
(yeast = levedura) e observa-se o desenvolvimento da colônia leveduriforme. Ao exame microscópico,
observam-se células isoladas com gemulação simples e múltipla.
De grande valor no diagnóstico e prognóstico dessa micose são as reações imunológicas, como por
exemplo, a reação de fixação do complemento, de precipitação e intradermoreação.

Diagnóstico Laboratorial

Material Biológico: escarro, secreções, pus de linfonodos, material de lesões cutâneas, mucosas, sangue
Exame Direto: Clarificação com KOH 10%. Observação de formas de leveduras com múltiplos
brotamentos com forma de roda de Leme. A presença desta estrutura fúngica é sugestiva de
Paracoccidioides spp.
Cultura: Cultivar em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol ou Mycosel (ágar peptonado e
glicosado com cicloheximida e cloranfenicol) em temperaturas inferiores a 29oC para obtenção da forma
filamentosa. A conversão para a forma levedura, faz-se o cultivo em meio ágar cérebro-fígado-coração
(BHI) a 37oC. A confirmação do dimorfismo fúngico é necessária para fechar o diagnóstico.
24
Histopatologia: Os cortes histológicos podem ser corados com H&E ou Gromori-Grocott. A última
coloração evidencia a presença de fungo no tecido apresentando leveduras multibrotantes. O fungo
aparece com coloração marron-negro no fundo claro.
Teste Sorológico: Consiste na pesquisa de anticorpos anti-Paracoccidioides (Anticorpo anti-gp43).
Pode-se utilizar diversas técnicas: Imunodifusão em gel duplo, Fixação do complemento, Western blot,
Aglutinação em látex

HISTOPLASMOSE

Definição

É uma doença fúngica granulomatosa, cujo agente etiológico é o Histoplasma capsulatum. Este fungo
apresenta especial afinidade pelo sistema reticuloendotelial (SER), produzindo diversas manifestações
clínicas, sendo a forma pulmonar a mais freqüente.
H. capsulatum cresce em solos com alto teor de nitrogênio, geralmente associado com excretas de aves
e morcegos. Solos de galinheiros, viveiros de aves, cavernas de morcegos são altamente propícios. As
aves fornecem o substrato ideal para o crescimento do fungo no solo, podendo transportá-lo para outros
locais em suas penas. Os morcegos são infectados, excretando o fungo em suas fezes, podendo
disseminar a doença em suas migrações. O principal agente vetor é o vento, que pode disseminar os
conídios a longas distâncias.
A inalação de uma quantidade suficiente de partículas infectantes do fungo, gera a infecção primária no
pulmão, com o crescimento de leveduras nos alvéolos pulmonares e interstício. A intensidade da
exposição inalatória, além de outros fatores, determinará se a infecção resultante corresponderá a
sintomas clínicos. Se a exposição for leve, a infecção será provavelmente assintomática, e se for maciça,
o resultado será sintomática aguda.

Diagnóstico laboratorial

Material Biológico: Escarro, material de biópsia, sangue

Exame direto: o exame à fresco não representa muito valor no diagnóstico dessa micose, pela
dificuldade de visualização das leveduras no interior das células do SER. Em material de biópsia
corado pelo método da hematoxilina-eosina (HE) ou pelo Giemsa, observam-se células
leveduriformes pequenas, redondas, intra-citoplasmáticas e que apresentam halo claro ao redor,
imitando cápsula.

Cultura: o cultivo deve ser feito em ágar Sabouraud dextrose a 25 oC e em ágar BHI com sangue ou
em meio Fava Netto a 37 oC. A 25 oC, a cultura está em fase M (mould-bolor) e observa-se o
desenvolvimento de colônia esbranquiçada, cotonosa, que revela ao exame microscópico, micélio
septado com conídios ornamentados denominados estalagmósporos. A 37 oC a cultura está na fase
y (yeast = levedura), observa-se colônia cremosa e microscopicamente, apenas células
leveduriformes ovaladas e pequenas.

Testes sorológicos: provas sorológicas como reação de fixação do complemento, imunodifusão e

imunofluorescência podem ser úteis no diagnóstico dessa doença.

PRÁTICA DEMOSNTRATIVA

-Lâmina a fresco de Paracoccidioides sp.

-Histologia de PCM
-Microcultivo de Histoplasma capsulatum
-Histologia de histoplamose

25
Paracoccidioides sp. Histologia de PCM

Histoplasma capsulatum - microcultivo Histologia de histoplamose

26
PRÁTICA 9 - ANTIFUNGIGRAMA

Infecções causadas por fungos têm se tornado um grande problema de saúde pública e vêm
crescendo em número e gravidade nas últimas três décadas. Esse aumento progressivo está relacionado
com a evolução dos procedimentos médico-hospitalares invasivos, aumentando o risco de infecção
fúngica, principalmente, em pacientes internados em unidades de oncologia, hematologia e de terapia
intensiva (UTIs). Atualmente, a terapia antifúngica está restrita aos agentes poliênicos, aos azóis, as
alilaminas, aos derivados morfolínicos, análogos depirimidinas (5-fluorocitosina), a griseofulvina e, mais
recentemente, as equinocandinas. No entanto, para o tratamento das micoses invasivas, este arsenal
terapêutico é limitado por problemas de baixa seletividade, alta toxicidade e aumento de fungos
resistentes aos antifúngicos.
O teste de susceptibilidade “in vitro” tem o objetivo de avaliar se o fungo filamentoso ou levedura
é sensível ou resistente a um antifúngico. Embora este não seja um teste rotineiramente empregado na
clínica médica, o ideal é a realização deste teste para melhor direcionar a escolha do tratamento
antifúngico. Alguns casos refratários ao tratamento justificamo teste de susceptibilidade aos antifúngicos.
As cepas isoladas são testadas utilizando técnicas padronizadas contra os antifúngicos utilizados na
clínica, principalmente no ambiente hospitalar (anfotericina B, fluconazol, itraconazol, voriconazol,
posaconazol, isavuconazol, caspofungina, micafungina e anidulafungina).
A padronização destes testes de susceptibilidade aos antimicrobianos é realizada por órgãos
internacionais como o CLSI (ClinicalandLaboratory Standards Institute, USA) e o EUCAST (The
EuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting, Europa). No Brasil, o Comitê Brasileiro para
Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (BrCAST) tem padronizado os ensaios de acordo com a
realidade brasileira. Para os testes de sensibilidade aos antifúngicos é preconizado o uso dos protocolos
BrCAST - EUCAST que estão disponíveis em português no site: www.brcast.org.br. Esses protocolos
bem como os critérios de interpretação tem sido atualizados de tempos em tempos. Esta padronização é
necessária para que estudos epidemiológicos possam ser realizados em diferentes partes do mundo e os
resultados comparados. Além disso, para a pesquisa de novos agentes antifúngicos, um dos quesitos é
comparar a eficácia da novas moléculas com os antifúngicos padrão. Para uma boa execução do ensaio,
é necessário realizar o controle de qualidade do teste, pois é essencial para assegurar os resultados
obtidos. Para isso é recomendado que se use uma cepa padrão (geneticamente estável) para determinar
valores aceitáveis de concentração inibitória mínima (CIM) para a tal cepa. Em geral, os resultados
obtidos com variação de CIM ± uma diluição podem ser aceitos.

Definições

CIM – Concentração inibitória mínima: é a menor concentração do antifúngico capaz de inibir o

crescimento do fungo

27
PRÁTICA

I - TÉCNICA DE MACRODILUIÇÃO EM CALDO – Testes de Susceptibilidade de fungos aos

antifúngicos padrão

Materiais
Suspensão de leveduras de Candida sp. (5 x 106 leveduras/mL).
Solução estoque de Anfotericina B (160 µg/mL)
Solução estoque de Fluconazol (160 µg/mL)
Tubos com 0,9 mL de caldo Sabouraud
Tubos com 0,5 mL de caldo Sabouraud

Concentrações a seremtestadas:
Anfotericina B: 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 e 0.25 µg/mL
Fluconazol: 16, 8, 4, 2, 1, 0.5e 0.25 µg/mL
Controle positivo: crescimento de fungo
Controle negativo: ausência de crescimento de fungo

Procedimento:

Em série de 8 tubos de meio de cultura (1º tubo: 0,9 mL e os demais 0,5 mL)
Proceder da seguinte maneira:
1. colocar 0,1mL de antifúngico (solução estoque de 160 µg/mL) no primeiro tubo (Tubo 16) com
meio de cultura (diluição 1:10) e homogeneizar.
2. Proceder a diluição seriada de 1:2, transferindo 0,5mL do tubo 16 para o tubo 8 e homogeneizá-
lo.
3. Realizar o procedimento 2 até o tubo 0,25
4. Após homogeneização do tubo 0,25, descartar os 0,5mL no Tubo Descarte

0
0,5 ml solução estoque 0,5 ml

0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

0,5 ml

5. O penúltimo tubo conterá somente o meio de cultura para o controle positivo de crescimento
fúngico(C+),e o último tubo conterá somente o meio de cultura (C-)
6. Após a diluição do antifúngico, transferir 10 µL da suspensão de fungo em todos os tubos,
EXCETO no C-.
7. Incubar a série de tubos a 35ºC por 24 h para Candida spp.
8. Determinar o valor de CIM para cada antifúngico por meio de Leitura Visual

28
RESULTADOS - Macrodiluição em caldo

Para a interpretação dos resultados usar a Tabela 1.

Tabela 1. Diretrizes de interpretação dos testes de susceptibilidade “in vitro” de Candida spp. aos
antifúngicos (Adaptado do BrCAST, 2022).

Ponto de Corte para CIM (mg/L)

C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsilosis C. tropicalis
Antifúngicos
S≤ R> S≤ R> S≤ R> S≤ R> S≤ R>
Anfotericina B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Fluconazol 2 4 0,002 32 - - 2 4 2 4
Micafungina 0,016 0,016 0,032 0,032 IE4 IE4 0,002 2 IE4 IE4
Voriconazol6 0,0645 0,255 IE IE IE IE 0,1255 0,255 0,1255 0,255
C. krusei tem resistência intrínseca ao fluconazol.

Experimento 1:
Fungo: Antifúngico:
Concentração do antifúngico (µg/mL) 16 8 4 2 1 0,5 0,25 C+
Crescimento do fungo
(+: crescimento; -: inibição de crescimento)

Valor de CIM = __________µg/mL

Interpretação:______________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

Experimento 2:
Fungo: Antifúngico:
Concentração do antifúngico (µg/mL) 16 8 4 2 1 0,5 0,25 C+
Crescimento do fungo
(+: crescimento; -: inibição de crescimento)

Valor de CIM = __________µg/mL

Interpretação:______________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________

Roteiro para o Relatório:

1. Introdução
2. Materiais e Métodos
3. Resultados e Discussão
4. Referências
29