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Jornal Internacional de Microbiologia de Alimentos 378 (2022) 109784
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Revista Internacional de Microbiologia de Alimentos

Página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/ijfoodmicro
Formação de biofilme e características genômicas de cepas de Listeria
monocytogenes
isoladas de indústrias de carne e laticínios localizadas em Piedmont (Itália)
Pierluigi Di Ciccio a, Selene Rubiola a, Felice Panebianco a,*, Sara Lomonacob , Marc Allardb ,
Daniela Manila Bianchi , cTiziana Civeraa , Francesco Chiesa a
a Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Turim, Largo Braccini 2, Grugliasco, 10095 Turim, Itália
b Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration, College Park, MD, Estados Unidos
c S.C. Sicurezza e Qualita` degli Alimenti, Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta, Turim, Itália
A R T I C L EI N F O A B S T R A C T
Palavras-chave: A Listeria monocytogenes é considerada um grande desafio para a indústria alimentícia, pois pode persistir por
Listeria monocytogenes longos períodos em plantas de processamento de alimentos por meio da formação de biofilmes. Os objetivos deste
Biofilme
estudo foram: i) avaliar a capacidade de produção de biofilme de 57 isolados de Listeria monocytogenes
Sequenciamento de todo o genoma
(WGS) previamente submetidos ao sequenciamento do genoma completo (WGS); ii) comparar os níveis de formação de
Sobrevivência ao estresse ilhota 1 biofilme com a presença ou ausência de genes associados ao biofilme. Para determinar a presença ou ausência de
Proteína inlA um conjunto conhecido de genes associados ao biofilme, foi realizada uma análise genômica comparativa em cada
gene de estresse arsD cepa. Entre os isolados de Listeria monocytogenes, 58%, 38,5% e 3,5% apresentaram produção de biofilme fraca,
moderada ou forte, respectivamente. Não foi observada nenhuma diferença na produção de biofilme entre os
isolados ambientais e de alimentos. A porcentagem de cepas de Listeria monocytogenes isoladas de produtos
cárneos (57%) classificadas como produtoras de biofilme moderadas ou fortes foi maior do que a porcentagem
obtida para cepas isoladas de produtos lácteos (28%). A presença do Stress Survival Islet 1, do gene de estresse
arsD e da proteína inlA truncada foi significativamente associada a níveis mais altos de biofilme. A combinação do
fenótipo de biofilme com dados moleculares e de genotipagem pode oferecer a oportunidade de entender melhor a
relação entre os genes ligados à formação de biofilme em Listeria monocytogenes.
1. Introdução A capacidade do patógeno onipresente de sobreviver, proliferar e

produzir biofilmes em condições adversas contribui para sua
A Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) é um patógeno de persistência no ambiente (Pasquali et al., 2018). Todas essas
origem alimentar que pode causar listeriose, uma doença infecciosa características específicas da L. monocytogenes forçaram governos e
caracterizada por altas taxas de fatalidade (20 a 30%) em pessoas agências de segurança alimentar em todo o mundo a estabelecer
imunocomprometidas. Em 2018, um total de 2.621 casos humanos critérios para reduzir a presença desse patógeno de origem alimentar
invasivos confirmados de listeriose foi relatado por 28 Estados- na cadeia alimentar. Na UE, os produtores devem demonstrar que a L.
Membros da União Europeia (UE). Nos Estados Unidos, 928 casos de monocytogenes não excederá o limite de 100 UFC/g durante o prazo de
listeriose foram registrados em 2019. A taxa de notificação da UE foi validade se um produto alimentício RTE permitir o crescimento desse
de patógeno ou a ausência em 25 g antes de o alimento deixar o controle
0,46 casos por 100.000 habitantes, enquanto a fatalidade geral de casos do operador da empresa de alimentos. A ausência em 25 g é exigida
na UE foi de 17,6% (CDC, 2021; EFSA e ECDC, 2021). Isso torna a também em RTE destinados a bebês e para fins médicos (European
listeriose uma das doenças de origem alimentar mais graves em todo o Commission (EC), 2005). Por outro lado, os Estados Unidos adotaram
mundo. A L. monocytogenes é uma bactéria ambiental onipresente que uma política de tolerância zero para a presença de L. monocytogenes
pode contaminar produtos alimentícios crus e processados em em alimentos RTE (Archer, 2018; Hingston et al., 2017). Sabe-se que
diferentes estágios de produção (Acciari et al., 2017; Go'mez et al., 2015; o ambiente de processamento é frequentemente uma fonte comum de
Wijnands et al., 2014). O consumo de produtos alimentícios prontos para contaminação de
consumo (RTE) contaminados é uma fonte comum de infecção humana (Di L. monocytogenes em alimentos (McCollum et al., 2013; P'erez-Rodríguez et
Ciccio et al., 2020; Ricci et al., 2018), com vários gêneros al., 2008) e a presença de um biofilme é uma causa potencial de
alimentícios, como carne, queijo e produtos frescos, sendo associados repetidas contaminações bacterianas de alimentos (Colagiorgi et al.,
a casos de listeriose (Bolocan et al., 2016; Zhu et al., 2017). A capacidade 2017; Panebianco et al., 2021). As bactérias organizadas em um
desse biofilme desenvolvem resistência contra
* Autor correspondente em: Department of Veterinary Sciences, University of Turin, Largo Braccini 2, Grugliasco, 10095 Turin, Itália.
Endereço de e-mail: [email protected] (F. Panebianco).
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2022.109784
Recebido em 27 de janeiro de 2022; Recebido em formato revisado em 2 de junho de 2022; Aceito em 6 de junho de 2022
Disponível on-line em 10 de junho de 2022
0168-1605/© 2022 Elsevier B.V. Todos os direitos reservados.
P. Di Ciccio et al. Jornal Internacional de Microbiologia de Alimentos 378 (2022)
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condições ambientais adversas, como dessecação, privação de (Moura et al., 2016; Ragon et al., 2008). As cepas da linhagem II são
nutrientes ou tratamento antimicrobiano (Alavi e Hansen, 2013; comuns em alimentos e ambientes de processamento de alimentos
Esbelin et al., 2018; Ferreira et al., 2014; Zoz et al., 2017). Os (Orsi et al., 2011). Entre as diferentes CCs, CC1, CC2, CC4 e CC6
biofilmes, de fato, são responsáveis pela persistência de bactérias nas estão altamente associadas a uma origem clínica e têm maior
indústrias alimentícias (Di Ciccio et al., 2015). Conforme relatado por probabilidade de causar doenças. Outros CCs, como CC9 e CC121, são
diferentes autores, vários fatores, como temperatura, tempo, tipo de frequentemente isolados de alimentos e ambientes de processamento
superfície, origem e disponibilidade de nutrientes, podem afetar a de alimentos (Maury et al., 2016). Conforme demonstrado por vários
formação de biofilmes microbianos (Cherifi et al., 2017; Govaert et al., autores, a capacidade de formação de biofilme variou amplamente
2018). Em um estudo realizado por Bonsaglia et al. (2014), quase todos entre as cepas, e algumas cepas podem persistir melhor do que outras
os no ambiente de processamento de alimentos (Korenˇov'a et al., 2016;
As cepas de L. monocytogenes isoladas do ambiente de produção de Wang et al., 2015). Embora alguns estudos tenham revelado os fatores
alimentos foram capazes de produzir biofilme em superfícies de aço genéticos necessários para a formação de biofilme de L. monocytogenes em
inoxidável e vidro. A formação de biofilme diferiu de acordo com a superfícies abióticas (Jordan et al., 2008; Kumar et al., 2009; Longhi et
temperatura e a superfície. Os isolados de al., 2008; Riedel et al., 2009; van der Veen e Abee, 2010; Zhu et al.,
A L. monocytogenes pode ser categorizada em linhagens, complexos 2017, 2008), são necessárias mais pesquisas para confirmar a
clonais (CCs) de tipagem de sequência multilocus (MLST) e MLST de importância de certos
genoma central (cgMLST)
Tabela 1
Características das 57 cepas de Listeria monocytogenes usadas no presente estudo.
ID ID NCBIa Data Categoria de origem Fonte de isolamento Linhagem Tipo de sequência Complexo clonal (MLST)
(MLST)
1 CFSAN046012 2011 Meio ambiente Fábrica de carnes (material em contato II 9 9
com alimentos)
2 CFSAN045995 2011 Meio ambiente Fábrica de carnes (superfícies) II 325 31
3 CFSAN045994 2011 Alimentos Carne (carne moída) II 9 9
5 CFSAN045983 2011 Alimentos Laticínios (queijo) II 9 9
6 CFSAN045858 2014 Meio ambiente Planta de carne (espetos) II 9 9
7 CFSAN045850 2014 Meio ambiente Fábrica de laticínios (superfícies) II 325 31
8 CFSAN046037 2011 Alimentos Carne II 9 9
14 CFSAN045970 2011 Alimentos Laticínios (leite cru) II 398 398
15 CFSAN045782 2012 Alimentos Carne (carne fresca bovina) II 8 8
17 CFSAN045778 2012 Alimentos Laticínios (leite de tanque a granel) II 9 9
19 CFSAN045953 2012 Alimentos Carne (salame) II 8 8
22 CFSAN045817 2013 Meio ambiente Fábrica de laticínios (superfícies) I 6 6
38 CFSAN044748 2003 Alimentos Carne (linguiça suína) II 9 9
41 CFSAN044758 2003 Alimentos Carne (carne bovina moída) II 9 9
64 CFSAN044767 2003 Alimentos Carne (carne bovina) II 9 9
76 CFSAN044775 2003 Alimentos Fábrica de laticínios (superfícies) II 9 9
86 CFSAN044734 2003 Alimentos Carne (carne bovina moída) II 9 9
92 CFSAN044730 2003 Alimentos Laticínios (leite) II 9 9
G40 CFSAN044840 2005 Alimentos Laticínios (queijo) II 325 31
G46 CFSAN044805 2004 Meio ambiente Fábrica de laticínios (superfícies) II 325 31
G52 CFSAN044807 2004 Alimentos Laticínios (queijo) II 325 31
2
P. G69
Di Ciccio et CFSAN044813
al. 2004 Meio ambiente Fábrica de laticínios (superfícies) II Jornal325
Internacional de Microbiologia 31
de Alimentos 378 (2022)
G70 CFSAN044814 2004 Alimentos Laticínios (queijo) II 325
109784 31
a ID das cepas no banco de dados do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
3
109784
Milão, Itália) foram adicionados a cada poço. Essa etapa de lavagem foi
elementos genéticos e para identificar novos elementos. Nesse
repetida três vezes. Em seguida, os biofilmes foram fixados pelo calor,
contexto, os recentes avanços nas tecnologias de sequenciamento de
expondo as microplacas ao ar quente a 60◦ C por 60 minutos. Para a
próxima geração (NGS) trouxeram várias oportunidades, permitindo a
coloração da biomassa bacteriana, foram adicionados 150 μl de solução
rápida identificação e caracterização de determinantes genéticos
de violeta cristal (CV; Merck, Alemanha) a 0,2% p/v por poço e as
(Rubiola et al, 2020); entre eles, o sequenciamento do genoma completo
placas foram incubadas estaticamente por 15 minutos. Após a
(WGS) permite o sequenciamento de genomas bacterianos inteiros de
coloração, a solução foi removida batendo-se bruscamente nas placas de
forma eficiente, oportuna e econômica, possibilitando a caracterização
cabeça para baixo, os poços foram lavados três vezes com água
de isolados de L. monocytogenes até a resolução de uma única
destilada e secos completamente ao ar. Para quantificar a formação de
diferença de nucleotídeo, permitindo, assim, virulência, persistência e
biofilme, 150 μl de solução de 95% de biofilme foram adicionados às
rastreamento clonal precisos (Ferreira et al., 2014). Algumas cepas de
placas.
L. monocytogenes podem persistir em instalações de processamento de
alimentos por longos períodos de tempo. Isso pode ser devido a muitos
fatores, incluindo maior formação de biofilme, tolerância a
desinfetantes, presença de profagos, marcadores de resistência em
plasmídeos, códons de parada prematuros em inlA, ilhota de
sobrevivência ao estresse (SSI) 1 ou SSI-2 (Muhterem-Uyar et al.,
2018). Nesse sentido, a análise WGS pode representar uma ferramenta
poderosa para associar o genótipo ao fenótipo de biofilme que levou à
aparente diversidade na capacidade das cepas desse patógeno de
produzir biofilmes.
Os objetivos deste estudo, portanto, foram: i) testar a formação de
biofilme de uma seleção de isolados de L. monocytogenes relacionados
a alimentos, previamente submetidos a WGS; ii) comparar fenótipos e
nomes genéticos de biofilme para identificar características genéticas
associadas à formação de biofilme.
2. Materiais e métodos
2.1. Seleção de isolados de L. monocytogenes relacionados a alimentos
As cepas de L. monocytogenes (n = 57) da Coleção de Cultura

Bacteriana do Departamento de Ciências Veterinárias da Universidade de
Turim, Itália, foram incluídas neste estudo. Todas as cepas foram
sequenciadas no genoma completo, conforme descrito por Lomonaco et al.
(2018), e foram escolhidas para representar os CCs mais prevalentes
nas indústrias locais (Piemonte) de carne e laticínios. O conjunto de
dados (n = 57) foi construído com isolados de L. monocytogenes
relacionados a alimentos, originados de alimentos (n = 38) e de
ambientes de processamento de alimentos (n = 19), coletados em um
período de 12 anos (2003-2014). Um total de 20/57 e 18/57 foram
isolados de produtos cárneos e lácteos, respectivamente, enquanto um
total de 11/57 e 8/57 foram isolados de ambientes cárneos e lácteos,
respectivamente. As características genéticas do conjunto de dados da
cepa estão relatadas na Tabela 1. A cultura de rotina foi realizada em
Brain Heart Infusion (BHI, Oxoid, Milão, Itália) e cada cepa foi
ativada duas vezes em 10 ml de BHI por incubação a 37◦ C por 24 h.
As culturas cultivadas foram usadas para inoculação nos poços de
microplacas de plástico para posterior quantificação da produção de
biofilme (consulte 2.2).
2.2. Ensaio de formação de biofilme
A formação de biofilme de todos os isolados foi avaliada de acordo

com um protocolo descrito anteriormente com pequenas modificações
(Stepanovi'c et al., 2007). Resumidamente, a turbidez das culturas
cultivadas (de um dia para o outro) em BHI (Oxoid) foi ajustada para
obter uma turbidez opticamente comparável à do padrão 0,5
McFarland (108 CFU/ml) por meio da leitura da densidade óptica (DO)
a 550 nm usando um espectrofotômetro (Pharmacia Biotech Ultrospec-
3000, Biochrom Ltd., Cambridge, Reino Unido, Inglaterra). Diluições
subsequentes de 1:100 dessas suspensões bacterianas (inóculo de teste
final de 106 CFU/ml) foram adicionadas a cada poço (200 μl) de uma
microplaca de poliestireno estéril de 96 poços (Sarstedt, Nümbrecht,
Alemanha). Os poços de controle negativo continham apenas caldo
(BHI). ◦As microplacas foram incubadas estaticamente por 24 horas a
37 °C. O conteúdo de cada placa foi descartado e 200 μl de solução
salina tamponada com fosfato estéril (PBS - pH 7,3; Sigma-Aldrich S.r.l.,
4
etanol foram adicionados para remover a coloração dos poços. Por 109784
Os resultados da avaliação da formação de biofilme revelaram que
fim, a absorbância da solução de violeta cristal presente na solução de
todas as cepas de L. monocytogenes testadas são produtoras de
descoloração foi medida a 595 nm (Abs-595 nm) usando um leitor de
biofilme. Os isolados de L. monocytogenes exibiram níveis variados de
microplacas (leitor de placas iMark, Bio-Rad, Sydney, NSW, Austrália).
formação de biofilme, de produção fraca a moderada ou forte
Os resultados foram interpretados com base na fórmula de Stepanovi'c et
(Stepanovi'c et al., 2007). Em
al. (2007). O corte de Abs-595 nm para o controle negativo foi
calculado usando a média de Abs-595 nm de todos os poços de
controle negativo (n. 9 para cada placa de microtitulação) mais três
desvios padrão (Abs NC). As cepas foram então classificadas como
formadoras de biofilme fracas (Abs NC< Abs-595 nm ≤ 2× Abs NC),
moderadas (2 × AbsNC < Abs-595 nm ≤ 4 × AbsNC) ou fortes (4 ×
AbsNC < Abs-595 nm). Todas as cepas foram testadas em triplicata e
a média dos resultados foi calculada.
O teste exato de Fisher foi aplicado para variáveis categóricas
(presença/ausência). Para todos os testes, realizados com o Graph Pad
Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA), p <
0,05 foi considerado significativo.
2.3. Análise genômica comparativa
As sequências foram primeiramente submetidas ao banco de dados

MLST do Instituto Pasteur (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/) e, em
seguida, ao BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para
verificar a presença, ausência ou truncamento de genes e complexos
(SSI-1, inlA, inlL, arsD, actA, bcrBC) já indicados como associados
ao aumento da formação de biofilme, capacidade de adesão e
habilidades de persistência em L. monocytogenes (Franciosa et al,
2009; Keeney et al., 2018; Maggio et al., 2021; Mahoney et al., 2022;
Mishra et al., 2020; Popowska et al., 2017; Seneviratne et al., 2017;
Travier et al., 2013). A tipagem e a reconstrução das sequências de
plasmídeos foram realizadas usando as ferramentas de software Mob-
suite (Robertson e Nash, 2018). Para a análise comparativa dos
genomas acessórios, as sequências foram anotadas com Prokka
(Seemann, 2014) e os arquivos .gff obtidos foram usados como
entradas para construir o pan-genoma das 57 cepas com Roary (Page et
al., 2015). A associação entre os genes presentes nos genomas
acessórios e a produção de biofilme pelas cepas foi realizada com o
Scoary (Brynildsrud et al., 2016). Para superar o possível viés da
presença de genes associados a linhagens genéticas específicas, o
Scoary infere a estrutura da população a partir dos dados de entrada.
Especificamente, o arquivo gene_presence_absence.csv do Roary e
uma lista de grupos de arquivos de características, produtores de
biofilme fracos, moderados e fortes (WP, MP e SP) foram usados
como entradas. As sequências de genes significativamente associadas
(valor de p ingênuo <0,05) ao grupo de cepas MP/SP por Scoary, mas
anotadas apenas como "proteína hipotética" por Prokka, foram
visualizadas com o Integrative Genomics Viewer (IGV) (Robinson et
al., 2011) e, em seguida, submetidas ao banco de dados MLST do
Pasteur Institute e ao BLASTn para uma identificação preliminar.
Para pesquisar a função das proteínas hipotéticas, as sequências foram
analisadas com a ferramenta da Web de pesquisa do banco de dados
de domínios conservados (CDD) (https://www.ncbi.nlm.nih.
gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) (Lu et al., 2020). Presença de
características genômicas (SSI-1; inlL): os acertos significativos
foram definidos como aqueles com cobertura de pelo menos 80% e
uma porcentagem de identidade maior ou igual a 80% (análise
BLAST). As montagens foram ainda examinadas quanto à presença de
resistência antimicrobiana e genes de estresse pelo AMRFinderPlus 3.10
(Feldgarden et al., 2021). Os truncamentos (inlA; actA; stop codes
prematuros: PMSCs) foram definidos como presentes se uma
sequência estivesse faltando pelo menos dez aminoácidos no final da
sequência em comparação com a sequência de referência EGD-e. As
sequências foram traduzidas para aminoácidos, alinhadas com o
MUSCLE e inspecionadas manualmente quanto a truncamentos
(Pirone-Davies et al., 2018).
3. Resultados
3.1. Ensaio de formação de biofilme

5
109784
Em particular, 58% (33/57), 38,5% (22/57) e 3,5% (2/57) das cepas Fig. 1. Diferenças nas habilidades de produção de biofilme entre isolados de
analisadas eram produtoras de biofilme fracas, moderadas e fortes, alimentos e a m b i e n t a i s e cepas de Listeria monocytogenes relacionadas a
respectivamente. Como apenas dois isolados (uma cepa CC31 de um carne e laticínios.
produto cárneo e uma cepa CC9 do ambiente de processamento de
carne) foram classificados como fortes produtores de biofilme, eles
foram agrupados com os produtores moderados para as análises
subsequentes. A porcentagem de isolados de produtos cárneos
classificados como produtores moderados ou fortes de biofilme (57%;
16/28) foi maior do que a porcentagem obtida para isolados de
produtos lácteos (28%; 8/29) - (teste exato de Fisher, p < 0,05). Além
disso, não foi observada nenhuma diferença na produção de biofilme
entre os isolados de alimentos e do ambiente (Fig. 1).
3.2. Análise do genoma
A ilhota de sobrevivência ao estresse 1 (SSI-1) estava presente em

81% (46/57) das cepas pertencentes à linhagem genética II; por outro
lado, estava ausente em todas as cepas (CC6) pertencentes à linhagem I.
Entre as cepas da linhagem II, a SSI-1 estava ausente em todos os isolados
pertencentes a CC121 e CC398. Após a triagem pelo AMRFinderPlus,
77% (44) das cepas foram consideradas positivas para o gene de estresse
arsD e 17% (10 cepas) para os genes de estresse bcrB e bcrC. A presença
de SSI-1 e do gene arsD foi correlacionada com a formação de biofilme
por L. monocytogenes (p < 0,05) (Fig. 2). A presença de inter-nalina L
(inIL) parecia estar associada ao CC9 e ao CC398, pois se mostrou
presente em todos os isolados pertencentes a esses grupos. Em contraste,
ela estava ausente em todas as cepas pertencentes aos CCs 31, 121, 6 e
8. A presença da inlL não foi significativamente associada ao aumento
dos níveis de biofilme. Mutações que levam a PMSCs em inlA foram
identificadas em 45 (79%) isolados (26/45 CC9, 15/45 CC31, 4/45
CC121) e sete tipos de mutação de PMSCs foram identificados.
Descobriu-se que as PMSCs no gene inlA estavam significativamente
associadas a MPs e SPs de biofilme. O gene actA foi truncado em 13/57
(23%) isolados (8/13 CC9, 4/13 CC6, 1/13 CC8). A presença de uma
proteína actA truncada não foi significativamente associada ao
aumento dos níveis de biofilme (Figs. 2; 3). A presença de plasmídeo
não foi associada de forma significativa a nenhum dos grupos. Um
total de 4778 genes (pangenoma) foi identificado em todos os genomas
de L. monocytogenes analisados. O genoma principal (ou seja, genes
encontrados em pelo menos 99% dos genomas) continha 1969 genes. O
genoma acessório dessa população era composto de 284 genes de
núcleo leve (encontrados
6
P. Di Ciccio et al. genéticos que contribuemJornalpara a formação
Internacional de biofilme
de Microbiologia em cepas
de Alimentos de L.
378 (2022)
em 95-99% dos genomas), 1148 genes de casca (encontrados em 15- 109784
monocytogenes relacionadas a alimentos.
95% dos genomas) e 1377 genes de nuvem (encontrados em <15%
A formação de biofilme é afetada pela ilhota de sobrevivência ao estresse de
dos genomas). Descobrimos que 84 grupos de genes individuais nos cinco genes
genomas dos isolados estudados foram significativamente (p ingênuo (SSI-1), que tem sido implicado no crescimento durante a exposição a
< 0,05) associados de forma positiva (n = 59) ou negativa (n = 25) ao ambientes alimentares estressantes (Ryan et al., 2010). A adesão e a
aumento da formação de biofilme (Tabelas 2 e 3). Desses 84 genes, formação de biofilme em L. monocytogenes de diferentes sorotipos
35 anotações exclusivas estavam disponíveis, com base na saída de estão correlacionadas a
anotações do Prokka, e 49 das anotações eram "proteínas hipotéticas".
Os domínios conservados encontrados para proteínas hipotéticas estão
relatados nas Tabelas 1SM e 2SM. Três grupos de genes foram
anotados como precursores de internalina, precursor de internalina-J
(n = 2), precursor de internalina-A (n = 1), sendo um positivamente e
dois negativamente associados à produção de biofilme. Várias
proteínas semelhantes a fagos foram identificadas pela pesquisa BLAST
manual. O grupo de genes da ilhota de sobrevivência ao estresse (SSI-1)
(lmo0444 - lmo0448) também foi associado positivamente.
4. Discussão
A L. monocytogenes é um dos principais agentes causadores de

infecções transmitidas por alimentos na Europa (Ricci et al., 2018). A
capacidade da L. monocytogenes de se adaptar e sobreviver sob
estresses ambientais tem sido associada à capacidade de formar
biofilmes (Peng et al., 2016). A persistência de L. monocytogenes no
ambiente de processamento de alimentos é a principal fonte de
contaminação pós-processamento (Ferreira et al., 2014). No passado,
a maioria das pesquisas sobre a persistência de L. monocytogenes se
concentrou no papel da formação de biofilme (Bonsaglia et al., 2014;
Wang et al., 2015). A identificação de fatores que aumentam a
formação de biofilme de algumas cepas de L. monocytogenes no
ambiente de processamento de alimentos seria benéfica para o
desenvolvimento de estratégias de desinfecção eficazes. No presente
estudo, foi realizada uma análise genômica comparativa com o uso de
WGS, além de um ensaio de biofilme fenotípico para correlacionar
marcadores genotípicos e fenotípicos para a formação de biofilme de
L. monocytogenes iso-ladas coletadas nas indústrias de carne e
laticínios localizadas em Piemonte (Itália). Foi avaliada a relação entre
a presença, a ausência ou o truncamento de alguns marcadores
genéticos (como SSI-1, inlA, inlL e actA) e os fenótipos de biofilme de
diferentes cepas de L. monocytogenes. Embora todos os 57 isolados
tenham produzido biofilmes, alguns isolados formaram
significativamente mais biofilmes do que outros. Esse resultado
sugere que algumas cepas podem ter uma vantagem competitiva sobre
outras no ambiente de processamento de alimentos com base em sua
capacidade de formar biofilmes. Nesse contexto, pesquisas anteriores
geraram resultados contrastantes ao determinar se a formação forte ou
moderada de biofilme é um indicador de persistência em ambientes de
processamento (Magalha˜es et al., 2017; Nowak et al., 2017). Kadam et
al. (2013) constataram que todas as cepas de L. monocytogenes
incluídas em seu estudo foram capazes de formar biofilmes em
diferentes condições experimentais. A relação entre linhagem e/ou
sorotipo e formação de biofilme foi examinada por estudos anteriores,
com resultados conflitantes. Djordjevic et al. (2002) e Takahashi et al.
(2009) observaram que as cepas da linhagem I formavam mais
biofilme do que as da linhagem II, enquanto Borucki et al. (2003) e
Combrouse et al. (2013) encontraram o oposto. Carpentier e Cerf
(2011) concluíram que não há cepas de L. monocytogenes com forte
capacidade de persistência em ambientes de processamento de
alimentos. Em contrapartida, Wang et al. (2015) mostraram que
algumas cepas de L. monocytogenes persistem melhor em ambientes
de produção de alimentos do que outras. Outros estudos
demonstraram que a formação de biofilme por L. monocytogenes
pode ser afetada por vários genes (Chang et al., 2012; Piercey et al.,
2016; Sela et al., 2006). Os estudos anteriores se concentraram em
genes individuais que estão envolvidos na formação de biofilme por
L. monocytogenes. Em contrapartida, poucos estudos foram realizados
para identificar genes relevantes para o biofilme de L. monocytogenes em
uma escala de todo o genoma. Até o momento, houve poucas
tentativas sistemáticas de usar o WGS para identificar fatores
7
109784
Fig. 2. Correlação entre as habilidades de produção de biofilme das cepas de Listeria monocytogenes e a presença/ausência de Stress Survival Islet 1 (SS-1), gene
internalin L (inlL), metalochaperona do transportador de efluxo de arsenito (arsD), transportador SMR de efluxo de composto de amônio quaternário (bcrB-bcrC) e
códons de parada prematuros nos genes internalin A (inlA PMSCs) ou actA (actA PMSCs).
operons ars de diferentes bactérias, inclusive L. monocytogenes e

a presença da ilhota de sobrevivência ao estresse SSI-1, conforme
Enterococcus faecalis (Lin et al,
declarado por alguns estudos recentes (Keeney et al., 2018; Maggio et
al., 2021; Mahoney et al., 2022). A análise dos dados de WGS mostrou
que a SSI-1 está presente na maioria das cepas (46/53-87%)
pertencentes à linhagem II, mas ausente nas quatro cepas pertencentes
à linhagem I. Esse achado está de acordo com Painset et al. (2019). Em
seu trabalho, o SSI-1 foi super-representado em iso-lados da linhagem
II, mas ausente na linhagem I. Quando consideramos os CCs, o SSI-1
estava presente nos CCs 9, 31 e 8, enquanto ausente nos CCs 121, 6,
398. Juntos, esses dados sugerem que a presença de SSI-1 está
correlacionada com a capacidade de formação de biofilme de L.
monocytogenes a 37◦ C. Essa descoberta está de acordo com Keeney et al.
(2018) e em contraste com outros estudos em que SSI-1 não foi
encontrado associado à persistência (Holch et al., 2013) ou ao aumento
da formação de biofilme (Ebner et al., 2015). O gene de estresse arsD,
envolvido nas vias de resistência ao arsênico, demonstrou um padrão
de presença e ausência semelhante entre as cepas. A associação
positiva com a formação de biofilme foi confirmada ainda mais pela
análise Roary-Scoary, em que o gene está incluído na lista de genes
associados positivamente (Tabela 2). Esse gene é encontrado em
8
2007). O gene arsD foi associado ao aumento da formação de biofilme 109784
(Mishra et al., 2020; Seneviratne et al., 2017). As proteínas
internalinas podem afetar a formação de biofilme de L.
monocytogenes, bem como sua adesão, virulência, internalização em
células eucarióticas e sobrevivência em diferentes ambientes (Orsi et
al., 2011; Piercey et al., 2016). O gene inlA é reconhecido como um
importante fator de virulência de L. monocytogenes, e as truncagens
devidas às PMSCs são responsáveis pela atenuação da virulência
(Kim et al., 2018). Um trabalho de Franciosa et al. (2009) sugeriu que
o truncamento do gene codificador de inlA aumenta
significativamente a formação de biofilme; no entanto, essa conclusão
não é apoiada pelas observações fornecidas por Wang et al. (2015).
As proteínas inlA truncadas são comuns em cepas de L.
monocytogenes relacionadas a alimentos (Jacquet et al., 2004;
Kovacevic et al., 2013). As cepas da linhagem II carregam mutações
inlA PMSC com mais frequência do que as cepas da linhagem I (Shen
et al., 2013). Muitos estudos mostraram que CC9 e CC121,
frequentemente associadas aos setores de produção de alimentos, são
hipovirulentas em parte devido a truncamentos em inlA, um
importante fator de virulência de L. monocytogenes (Disson et al.,
2008; Jacquet et al., 2004; Lecuit et al., 2001; Maury et al., 2016;
Pasquali et al., 2018). Em nosso estudo, quarenta e cinco cepas, exceto
as cepas pertencentes a CC6, CC8, CC398 (CCs associadas a
9
109784
Fig. 3. Associação entre as habilidades de produção de biofilme dos diferentes Complexos Clonais (CC) de cepas de Listeria monocytogenes e a presença/ausência de
Stress Survival Islet 1 (SS-1), gene internalin L (inlL), transportador de efluxo de arsenito metalochaperona (arsD), transportador de efluxo de composto de amônio
quaternário SMR (bcrB- bcrC) e códons de parada prematuros nos genes internalina A (inlA PMSCs) ou actA (actA PMSCs).
associados a algumas dessas habilidades. Piercey et al. (2016)

com surtos de listeriose; Chen et al., 2016) e três cepas CC9, continham
descobriram que as PMSCs em genes que codificam a biossíntese da
uma mutação de códon de parada prematura (PMSC) em inlA.
parede celular, a motilidade, o metabolismo, a resposta ao estresse e a
Especificamente, esses genomas carregavam sete PMSCs diferentes em
superfície celular
inlA. Até o momento, foram encontrados 21 tipos de mutação da inlA
(Gelbíˇcova' et al., 2016, 2015). Recentemente, Popowska et al. (2017)
e Maggio et al. (2021) demonstraram que a inlL contribui para a
fixação de L. monocytogenes em superfícies abióticas, desempenhando
assim um papel na formação de biofilme. No entanto, em nosso estudo,
a presença do gene inlL não foi significativamente associada ao
aumento dos níveis de biofilme. Além disso, 22% das cepas testadas
(13/57) apresentavam uma versão truncada do gene actA, enquanto
77% (44/57) apresentavam uma versão completa do mesmo gene. O
gene actA está envolvido na polimerização da actina, que é essencial
nas primeiras etapas da formação do biofilme (Travier et al., 2013).
Neste estudo, não observamos uma maior capacidade de formação de
biofilme das cepas que abrigam uma versão truncada do gene actA, em
comparação com as cepas que abrigam uma versão completa do
mesmo gene. Alguns isolados de L. monocytogenes podem persistir em
instalações de processamento de alimentos melhor do que outros
isolados (Carpentier e Cerf, 2011). Diferentes cepas de L.
monocytogenes podem ser capazes de sobreviver e prosperar em
instalações de processamento de alimentos devido a características
fenotípicas relevantes, como fixação em superfícies, capacidade de
formação de biofilme e maior resistência a estresses ambientais
(Korenˇova' et al., 2016). Estudos anteriores identificaram genes
10
proteínas associadas resultaram em maior formação de biofilme. Em 109784
particular, as interrupções de 9 genes não associados anteriormente à
formação de biofilme em L. monocytogenes (lmo2572, lmo2488,
lmo1224, lmo0434 [inlB], lmo0263 [inlH], lmo0543, lmo0057,
lmo2563 e lmo0453) podem afetar as interações eletrostáticas da
superfície celular e resultar em maior formação de biofilme (Piercey
et al., 2016). Em nosso estudo, verificou-se que as PMSCs no gene
inlA estavam associadas ao aumento da produção de biofilme,
enquanto inlA e inlJ estavam entre os genes associados
negativamente. Verificou-se que diferentes alelos de dois genes,
lmo2003 e lmo2015, um repressor do sistema de
transporte/metabolismo de manosil-D-glicerato e uma hidrolase de
manosil-glicerato, respectivamente, estavam positiva e negativamente
associados ao aumento da formação de biofilme (Tabelas 2 e 3).
Verificou-se que os alelos associados negativamente apresentavam
uma mutação na sequência aminoacídica (local 133, de asparagina
para histidina), na lmo2003, e um truncamento dos primeiros 13
nucleotídeos na lmo2015. Vale observar que uma mutação de
histidina para asparagina na sequência em um gene de superóxido
dismutase de manganês demonstrou alterar as propriedades biofísicas
do produto do gene (Bonetta et al., 2021). Em nosso estudo, a análise
do domínio conservado de genes hipotéticos com função
desconhecida destacou a presença de dois genes, positivamente
associados, mostrando funções relatadas na literatura como
associadas ao aumento da formação de biofilme (Tabela 1SM). O
domínio COG0745, encontrado em proteínas semelhantes a OmpR,
está envolvido na regulação da expressão de proteínas de adesão de
superfície em bactérias Gram-negativas.
11
109784
Tabela 2
biofilme (Zhao et al., 2015). Nowak et al. (2017) avaliaram cepas
Genes encontrados positivamente associados a uma maior formação de persistentes de L. monocytogenes isoladas de instalações de produção de
biofilme. mexilhões da Nova Zelândia
Anotaçãoa Nome Função
do
localb
accB lmo1356 Proteína transportadora de biotina carboxila de acetil-
CoA
carboxilase
acpB lmo0445 Regulador positivo da síntese de cápsulas AcpB
acr3 - Proteína de resistência ao arsênico Acr3
aroK_1 lmo1212 Shikimate quinase
arsA - ATPase acionada por bomba arsenical
arsC_2 - Glutaredoxina arsenato redutase
arsD - Repressor de ação trans do operon de resistência ao
arsênico
ArsD
epsJ_1 lmo0496 Glicosiltransferase putativa EpsJ
gadB_1 lmo0447 Glutamato descarboxilase
gadC_2 lmo0448 Antitransportador de glutamato/gama-aminobutirato
grupo_1049 - Proteína hipotética
grupo_1051 A118p40 Proteína hipotética
grupo_1073 lmo0900 Proteína hipotética
grupo_1191 lmo2015 Hidrolase de manosilglicerato
grupo_1857 - tRNA-Val(gac)
grupo_1877 - DNA polimerase IV
grupo_1883 - Tirosina recombinase XerC
grupo_2 lmo0327 Internalin-J
grupo_2578 A118p36 Regulador transcricional do tipo HTH ImmR
grupo_511 lmo1636 Transportador ABC putativo Proteína de ligação a ATP
YxlF
grupo_63 lmo2278 L-alanil-D-glutamato endopeptidase de peptidoglicano
CwlK
mngR lmo2003 Sistema de transporte/metabolismo de manosil-D-
glicerato
repressor MngR
sdpR - Repressor transcricional SdpR
ssbA_2 A118ssb Proteína A de ligação a DNA de fita simples
truB lmo1328 tRNA pseudouridina sintase B
xerC_2 - Tirosina recombinase XerC
yddE - Isomerase putativa YddE
yjjG_1 lmo0635 Pirimidina 5′ -nucleotidase YjjG
yueB_1 lmo0444 Proteína YueB do sistema de secreção ESX
yxeI lmo0446 Penicilina acilase
a Anotação de Prokka.
b Com base na lista de genes EGDe de L. monocytogenes.
bactérias (Prüß, 2017; Stanley e Lazazzera, 2004; Tomaras et al., 2008;

Vidal et al., 1998). A família da L-fucose isomerase (FucIase) e da L-
arabinose isomerase (L-AI), composta pela FucIase, L-AI e proteínas de
superfície celular semelhantes, foi considerada implicada na formação de
12
P. Di Ciccio et al.
Tabela 3
locais (Piemonte, Itália) queInternacional
Jornal foram previamente caracterizadas
de Microbiologia usando
de Alimentos 378 (2022)
Genes associados negativamente a uma maior formação de biofilme. WGS. A maioria dos109784 genes potencialmente ligados à formação de
biofilme foi detectada nos dados de WGS, destacando ainda mais essa
Anotaçãoa Nome do Função
localb
tecnologia como uma alternativa mais rápida e barata às técnicas de
tipagem convencionais. Nossa hipótese é que a fonte de isolamento e a
esaA_2 lmo2360 Fator acessório de secreção ESAT-6 EsaA
presença de alguns marcadores genéticos podem desempenhar um
grupo_10 lmo0264 Internalin-A
grupo_1445 - Ribonuclease papel importante na formação do biofilme.
grupo_1447 Proteína hipotética
grupo_1516 lmo1328 tRNA pseudouridina sintase B
grupo_204 - Internalin-J
grupo_2682 lmo1356 Proteína transportadora de biotina carboxila de acetil-
CoA
carboxilase
grupo_297 lmo2003 Sistema de transporte/metabolismo de manosil-D-
glicerato
repressor MngR
mngB_3 lmo2015 Hidrolase de manosilglicerato
a Anotação de Prokka.
b Com base na lista de genes EGDe de L. monocytogenes.
a fim de encontrar genes específicos ou marcadores genéticos que

possam estar ligados à persistência ou não persistência. Eles não
conseguiram encontrar nenhum marcador nos grupos de isolados
persistentes ou não persistentes. Além disso, eles descobriram que
não havia agrupamento geral de isolados persistentes ou esporádicos e
que não havia associação entre as diferenças nos plastídios e a
persistência. Isso é consistente com nossas descobertas. Além disso,
suas descobertas indicam que os fenótipos de persistência, incluindo a
capacidade de produção de biofilme, podem não ser causados por
mutações únicas, plasmídeos ou outras diferenças genéticas, mas podem
ser exclusivos de linhagens distintas de L. monocytogenes e/ou devido a
elementos genéticos mais complexos, estímulos fenotípicos ou
sistemas de regulação de genes.
De qualquer forma, a principal limitação deste estudo está ligada
ao número restrito de cepas, que não é representativo da diversidade
de
L. monocytogenes encontrada na indústria de alimentos. De fato,
sabe-se que as habilidades de formação de biofilme, a dinâmica de
colonização e a sobrevivência de L. monocytogenes são específicas da
cepa e estão relacionadas a vários mecanismos além da presença de
genes específicos (Gray et al., 2021a; Gray et al., 2021b; Lianou et
al., 2020). Os estudos de associação de todo o genoma devem incluir
um amplo conjunto de cepas, pois elas podem variar
significativamente de pesquisa para pesquisa, mesmo que muitas
pertençam aos principais complexos clonais. São necessários mais
estudos que incluam um número maior de cepas com diferentes
características genômicas para minimizar as variáveis e melhorar a
robustez dos dados derivados desse tipo de pesquisa. Por fim, a
variabilidade que pode ocorrer para o mesmo isolado na capacidade
de formação de biofilme quando são usados métodos e condições
experimentais diferentes deve ser levada em conta no planejamento
desses estudos.
5. Conclusões
Investigamos a capacidade de formação de biofilme de 57 alimentos

relacionados
Cepas de L. monocytogenes coletadas de indústrias de alimentos
13
109784
defumado e outros peixes defumados no varejo na Itália: frequência de contaminação
papel na formação de biofilme por L. monocytogenes. Os dados de WGS e caracterização de cepas em produtos de diferentes fabricantes. J. Food Prot. 80, 271-
gerados representam um recurso valioso para o aprimoramento da 278. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-15-599.
Alavi, H.E.D., Hansen, L.T., 2013. Cinética da formação de biofilme e sobrevivência à
avaliação quantitativa do risco microbiano. A caracterização de CCs e a
dessecação de Listeria monocytogenes em biofilmes de espécies simples e duplas com
detecção de marcadores genéticos relacionados à formação de biofilme Pseudomonas fluorescens, Serratia proteamaculans ou Shewanella baltica em aço
de cepas que circulam nas indústrias locais de carne e laticínios, inoxidável de grau alimentício
conforme descrito neste estudo, oferecem a oportunidade de melhorar as
avaliações de risco para L. monocytogenes. O WGS pode oferecer a
possibilidade de identificar a ligação entre os marcadores do genoma e
as características fenotípicas por meio de estudos de genômica
comparativa ou estudos de associação de todo o genoma. No entanto, o
principal problema com esses tipos de estudos está relacionado ao
conjunto de cepas testadas, uma vez que ele pode variar
significativamente de pesquisa para pesquisa, destacando a
necessidade de encontrar um ponto em comum. Por exemplo, devemos
enfatizar que o número de isolados para cada CC não foi homogêneo
em nosso estudo. São necessários mais trabalhos nesse campo,
inclusive a detecção ou determinação de truncamento em genes em
todo o conjunto de dados para identificar fatores que predispõem
algumas cepas de L. monocytogenes a uma maior formação de
biofilme.
Financiamento
Esta pesquisa não recebeu nenhum subsídio específico de agências

de financiamento dos setores público, comercial ou sem fins
lucrativos.
Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de genomas investigados neste artigo estão

disponíveis no DDBJ/EMBL/GenBank com os números de acesso
listados na Tabela 1.
Declaração de contribuição de autoria do CRediT
Pierluigi Aldo Di Ciccio: conceitualização, supervisão, redação -

rascunho original. Selene Rubiola: investigação, metodologia, redação
- revisão e edição. Felice Panebianco: investigação, metodologia,
redação - revisão e edição. Sara Lomonaco: investigação, metodologia,
redação - revisão e edição. Marc Allard: redação - revisão e edição.
Daniela Manila Bianchi: investigação, metodologia. Tiziana Civera:
redação - revisão e edição. Francesco Chiesa: análise formal,
investigação, redação - revisão e edição.
Declaração de interesses conflitantes
Nenhum.
Agradecimentos
SL foi apoiado em parte por uma indicação para o Joint Institute for
Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN). Esse projeto foi apoiado em
parte por uma indicação para o Programa de Participação em Pesquisa
do Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN), U.S. Food
and Drug Administration, administrado pelo Oak Ridge Institute for
Science and Education por meio de um acordo entre agências entre o
Departamento de Energia dos EUA e a FDA.
Apêndice A. Dados suplementares
Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados on-line

em https://doi. org/10.1016/j.ijfoodmicro.2022.109784.
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10

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Jornal Internacional de Microbiologia de Alimentos 378 (2022) 109784

Listas de conteúdo disponíveis no ScienceDirect

Revista Internacional de Microbiologia de Alimentos

Formação de biofilme e características genômicas de cepas de Listeria

1. Introdução A capacidade do patógeno onipresente de sobreviver, proliferar e

a ID das cepas no banco de dados do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

2.1. Seleção de isolados de L. monocytogenes relacionados a alimentos

As cepas de L. monocytogenes (n = 57) da Coleção de Cultura

2.2. Ensaio de formação de biofilme

A formação de biofilme de todos os isolados foi avaliada de acordo

2.3. Análise genômica comparativa

As sequências foram primeiramente submetidas ao banco de dados

3.1. Ensaio de formação de biofilme

3.2. Análise do genoma

A ilhota de sobrevivência ao estresse 1 (SSI-1) estava presente em

A L. monocytogenes é um dos principais agentes causadores de

operons ars de diferentes bactérias, inclusive L. monocytogenes e

associados a algumas dessas habilidades. Piercey et al. (2016)

bactérias (Prüß, 2017; Stanley e Lazazzera, 2004; Tomaras et al., 2008;

a fim de encontrar genes específicos ou marcadores genéticos que

Investigamos a capacidade de formação de biofilme de 57 alimentos

Esta pesquisa não recebeu nenhum subsídio específico de agências

Declaração de disponibilidade de dados

Os conjuntos de genomas investigados neste artigo estão

Declaração de contribuição de autoria do CRediT

Pierluigi Aldo Di Ciccio: conceitualização, supervisão, redação -

Declaração de interesses conflitantes

Apêndice A. Dados suplementares

Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados on-line

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