Caroline Perez Camilo

Caroline Perez Camilo
Avaliação da idade epigenética e

padrão de metilação do DNA em
dependentes de crack
Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Programa de Psiquiatria
Orientador: Prof. Dr. Homero Pinto Vallada
Filho
Coorientadora: Profa. Dra. Helena Paula
Brentani
São Paulo
2020
Caroline Perez Camilo
Avaliação da idade epigenética e

padrão de metilação do DNA em
dependentes de crack
Tese apresentada à Faculdade de Medicina

da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutor em Ciências
Programa de Psiquiatria
Orientador: Prof. Dr. Homero Pinto Vallada
Filho
Coorientadora: Profa. Dra. Helena Paula
Brentani
São Paulo
2020
Dedicatória
Dedico essa tese aos meus pais, Ana Maria e Izilmar.
Por todo seu amor, por todo apoio que me deram desde
o início dessa jornada acadêmica e por toda dedicação
empenhada na minha formação pessoal e profissional.
Essa dedicatória é apenas uma singela homenagem,
pois não seria possível expressar em palavras o quanto
sou grata por ser sua filha. Obrigada.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, por permitir que eu trilhasse esse caminho até
esse momento e por nunca me abandonar. Por abençoar à mim e à minha família, por
alimentar a minha fé e por me manter firme diante todas as dificuldade que encontrei ao
longo do caminho.
Aos meus pais, Ana Maria e Izilmar. Imagino o quanto foi difícil educar aquela
adolescente rebelde e ter paciência até que ela se tornasse a mulher que é hoje.
Agradeço pelo amor, suporte e apoio incondicional que me deram no momento mais
difícil que passei nessa trajetória, quando fui diagnosticada com depressão. O
encerramente desse ciclo não seria possível sem vocês ao meu lado.
Ao meu irmão, Ronaldo. Obrigada por ser meu amigo, companheiro e a minha
base. Deus me escolheu para ser sua irmã, para você ser parte de mim. E que sorte eu
tenho por ter você. Que sorte eu tenho por ter sido cuidada e amada desde pequena por
esse homem incrível, que até hoje se preocupada comigo e faz de tudo pra me fazer rir o
tempo todo (mesmo eu sendo esse “potinho de ódio”). Obrigada pelos momentos que
vivemos juntos, pelas risadas que compartilhamos e por cuidar de mim hoje e sempre.
À toda a família Perez. É uma honra ser membro dessa grande família. Agradeço
pela felicidade dos nossos encontros, pelas risadas altas, pela bagunça e pelo amor e
carinho que todos temos uns com os outros. Dona Berenice e Sr. Benedicto devem estar
orgulhosos lá de cima, observando a família linda e unida que suas seis filhas
construíram.
Ao orientador Professor Doutor Homero Vallada. Dentre altos e baixos, sou
muito grata por essa trajetória de dez anos que tivemos como orientador e aluna.
Seguirei agora um novo caminho, levando comigo todos os ensinamentos e toda
experiência que me proporcionou. Agradeço por sempre incentivar minha evolução
acadêmica e pessoal. Obrigada por toda essa história e pelo voto de confiança em me
acolher como orientanda.
À co-orientadora Professora Doutora Helena Brentani. Que honra poder ser sua
aluna, fazer parte da sua equipe, ter sua confiança e aprender com você todos os dias.
Obrigada pelos ensinamentos, pelas cobranças e pelos conselhos.
Aos meus amigos. Que sorte eu tenho de ter vocês na minha vida (ou seria o
contrário?). Brincadeiras à parte, vocês são essenciais em todos os momentos, da
tristeza à felicidade, do drama aos momentos sérios. Obrigada por todos os momentos
que vivemos, e por todos que estão por vir.
Aos amigos do “Panelinha”. Obrigada pelas conversas, pelas risadas, pelo ombro
amigo e por todos os nossos encontros mensais para tomar um cafézinho. Agradeço o
apoio de todos. Vocês fizeram os meus dias na Psiquiatria mais felizes.
Aos colegas do Departamento e Instituto de Psiquiatria do HCFMUSP. Em
especial à equipe da pós graduação, Eliza e Isabel, por todo o apoio e ajuda durante
esses anos de trabalho. Aos colegas do Laboratório de Patologia e do Grupo de Genética
e Bioinformática. Agradeço pelo apoio, convívio e aprendizado durante o
desenvolvimento e execução desse trabalho.
À CAPES: O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de
financiamento 001.
À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo
nº 2013/00659-2) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa.
À todos aqueles que contribuíram, de alguma forma, para a realização deste
trabalho.
Epígrafe
“Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para
todo o propósito debaixo do céu. Há tempo de nascer, e
tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de
arrancar o que se plantou; Tempo de matar, e tempo de
curar; tempo de derrubar, e tempo de edificar; Tempo
de chorar, e tempo de rir; tempo de prantear, e tempo
de dançar; Tempo de espalhar pedras, e tempo de
ajuntar pedras; tempo de abraçar, e tempo de afastar-
se de abraçar; Tempo de buscar, e tempo de perder;
tempo de guardar, e tempo de lançar fora; Tempo de
rasgar, e tempo de coser; tempo de estar calado, e
tempo de falar; Tempo de amar, e tempo de odiar;
tempo de guerra, e tempo de paz.” Eclesiastes - 3:1-8.
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta
publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado
por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana,
Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo:
Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in
IndexMedicus.
Sumário
Lista de figuras
Lista de tabelas
Lista de abreviaturas, símbolos e siglas
Resumo
Abstract
1. APRESENTAÇÃO ................................................................................................................. 1
2. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 3
2.1. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................ 4

2.1.1. Epigenética .............................................................................................................. 4
2.1.2. Metilação do DNA .................................................................................................. 5
2.1.3. Metilação do DNA e fatores ambientais ................................................................. 6
2.1.4. Relógio epigenético ................................................................................................ 7
2.2. CAPÍTULO 2 .......................................................................................................... 10
2.2.1. Dependência de crack ............................................................................................ 10
2.2.2. Influência de fatores ambientais na dependência de crack .................................... 10
2.2.3. Estudos genéticos e epigenéticos na dependência de crack ................................... 12
2.3. CAPÍTULO 3 .......................................................................................................... 13
2.3.1. Análise de mediação .............................................................................................. 13
2.3.2. Modelagem de equações estruturais ...................................................................... 15
2.3.3. O uso de análises de mediação e SEM na avaliação da metilação do DNA, efeitos
ambientais e uso/abuso de drogas.................................................................................... 17
3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 19
4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 21
4.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 22

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 22
5. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 23
5.1. AMOSTRA ....................................................................................................................... 24

5.1.1. Casos .................................................................................................................... 24
5.1.2. Controles .............................................................................................................. 25
5.2. ENSAIO DE METILAÇÃO DO DNA DO GENOMA ....................................................... 25
5.3. ANÁLISE DA METILAÇÃO DO DNA .......................................................................... 26
5.4. OBJETIVO ESPECÍFICO 1 ......................................................................................... 27
5.4.1. Instrumentos de avaliação .................................................................................... 27
5.4.2. Estatística descritiva............................................................................................. 28
5.4.3. Relógio epigenético .............................................................................................. 28
5.4.4. Mediação e modelagem de equações estruturais .................................................. 29
5.5.1. Análise de metilação diferencial ........................................................................... 29
5.6.1. Instrumentos de avaliação .................................................................................... 30
5.6.2. Estatística descritiva............................................................................................. 31
5.6.3. Relógio epigenético .............................................................................................. 31
5.6.4. Mediação e modelagem de equações estruturais .................................................. 31
5.8. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ................................................ 32
6. RESULTADOS ................................................................................................................ 33

6.1.1. Características clínicas e sociodemográficas ....................................................... 34
6.1.2. Avaliação da idade metilômica e aceleração de idade ......................................... 37
6.1.3. Análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais ................... 38
6.2.1. Sítios e regiões diferencialmente metilados em dependentes de crack .................. 47
6.3.1. Características dos subgrupos de dependentes de crack ...................................... 57
6.3.2. Avaliação da idade metilômica e aceleração de idade ......................................... 58
6.3.3. Análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais ................... 59
6.4.1. Análise de metilação diferencial ........................................................................... 61
7. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 62

7.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3 E 4 ................................................................................ 71
8. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 73
9. ANEXOS .......................................................................................................................... 75
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 90

Listas
Lista de figuras
Pag.
Figura 1 - Avaliação da religiosidade dos dependentes de crack realizada com o
instrumento Duke Religion Index (DUREL)............................................... 35
Figura 2 - Avaliação da religiosidade do grupo controle realizada com o
instrumento Duke Religion Index (DUREL).............................................. 36
Figura 3 - Avaliação de qualidade de vida dos dependentes de crack realizada com
o instrumento World Health Organization Quality of Life-Brief
instrument (WHOQL-BRIEF).................................................................... 36
Figura 4 - Avaliação de qualidade de vida do grupo controle realizada com o
instrumento World Health Organization Quality of Life-Brief instrument
(WHOQL-BRIEF)...................................................................................... 37
Figura 5 – Avaliação da idade epigenética entre dependentes de crack e controles.... 38
Figura 6 – Modelos conceituais propostos para a análise de mediação utilizando
modelagem de equações estruturais............................................................ 40
Figura 7 – Avaliação do modelo conceitual 1 com efeito total do uso de crack na
AADiff........................................................................................................ 41
Figura 8 – Modelo final apresentado para o modelo conceitual 2................................ 42
Figura 9 – Covariâncias entre as variáveis utilizadas na composição do modelo final
apresentado para o modelo conceitual 2..................................................... 43
Figura 10 – Modelo final apresentado para o modelo conceitual 3................................ 45

Figura 11 – Manhattan plot mostrando a distribuição dos sítios de metilação entre
dependentes de crack e controles................................................................ 48
Figura 12 – Volcano plot mostrando a distribuição dos sítios de metilação entre
dependentes de crack e controles em relação ao status de metilação......... 48
Figura 13 – Distribuição genômica dos sítios diferencialmente metilados (DMSs)...... 50

Figura 14 - Distribuição dos sítios diferencialmente metilados (DMSs) em relação à
ilhas CpG..................................................................................................... 50
Figura 15 - Representação gráfica das regiões diferencialmente metiladas (DMRs).... 51

Figura 16 - Vias biológicas identificadas para os genes relacionados aos sítios
diferencialmente metilados (DMSs)........................................................... 54
Figura 17 - Processos biológicos identificados para os genes relacionados aos sítios
diferencialmente metilados (DMSs) .......................................................... 55
Figura 18 - Processos biológicos não redundantes identificados para os genes
relacionados aos sítios diferencialmente metilados (DMSs)...................... 56
Figura 19 - Boxplot mostrando a pontuação final da escala ETISR-SF para os
subgrupos de dependentes de crack com e sem “eventos traumáticos”...... 57
Figura 20 - Avaliação da idade epigenética entre os subgrupos de dependentes de
crack com “eventos traumáticos” e sem “eventos traumáticos”............... 59
Modelos conceituais propostos para a análise de mediação utilizando
Figura 21 -
modelagem de equações estruturais............................................................ 60
Figura 22 - Modelos finais apresentados para os modelos conceituais 4 e 5................ 61
Lista de tabelas
Pag.
Tabela 1 - Características sociodemográficas da amostra............................................ 34

Tabela 2 - Avaliação de Domínios de qualidade de vida (WHOQL-BRIEF).............. 37
Tabela 3 - Ìndices de ajuste da análise de mediação utilizando modelagem de
equações estruturais do modelo final apresentado para o modelo
conceitual 2................................................................................................. 44
Tabela 4 - Ìndices de ajuste da análise de mediação utilizando modelagem de
equações estruturais do modelo final apresentado para o modelo
conceitual 3................................................................................................. 46
Tabela 5 – Sítios diferencialmente metilados (DMSs) com maior diferença de
metilação entre dependentes de crack e controles....................................... 49
Tabela 6 – Regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre dependentes de crack
e controles................................................................................................... 52
Tabela 7 – Características dos subgrupos de dependentes de crack............................. 58
Lista de abreviaturas, símbolos e siglas
Early Trauma Inventory Self

% Porcentagem ETISR-SF
Report-Short Form
</≤ Menor / Menor ou igual FCERI Fc-epsilon receptors
>/≥ Maior / Maior ou igual FDR False discovery rate
Média GO Gene ontology
β / ∆β Beta / Delta Beta IC Intervalo de confiança
°C Grau Celsius IGR Região intergênica
ε Erro padrão M Variável mediadora
χ2 Qui-quadrado MAPK mitogen-activated protein kinase
a Efeito indireto Max / Min Valor máximo / Valor mínimo

Age acceletarion /
AA Md Mediana
Aceleração de idade
Mini International
AADiff Age acceletarion Difference MINI
Neuropsychiatric Interview
AARes Age acceletarion Residuals ML Maximum-likelihood
adjP p-valor ajustado N Distribuição numérica
AIC Akaike information criterion NCAM Neural cell adhesion molecule
AKT serine/threonine kinase 1 NF-κB Nuclear Factor kappa B
b Efeito indireto pb Pares de base
BH Benjamini-Hochberg PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

Root mean square error of
BIC Bayesian Information Criterion RMSEA
approximation
c Efeito total SEM Structural Equation Modelling
c´ Efeito direto SF-36 Short Form Health Survey

Standardised root mean square
CFI Comparative fit index SRMR
residual
Citosina - fosfato de ligação - Termo de Consentimento Livre e
CpG TCLE
Guanina' Esclarecido
df Graus de liberdade TLI Tucker Lewis index
Região diferencialmente
DMR TSS Transcription start site
metilada
DMS Sítio diferencialmente metilado UTR Untranslated region
DNA Ácido desoxirribonucléico v. Versão

WHOQL- World Health Organization Quality
±DP Desvio padrão
BRIEF of Life-Brief instrument
DUREL Duke Religion Index X Variável independente
Epidermal growth factor
EGFR Y Variável dependente
receptor
Resumo
Camilo CP. Avaliação da idade epigenética e padrão de metilação do DNA em
dependentes de crack [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo; 2020.
INTRODUÇÃO: A metilação do DNA têm a capacidade de medir o trabalho

cumulativo feito pelo sistema de manutenção epigenética e determinar o impacto dos
fatores ambientais no envelhecimento biológico. Em transtornos como a dependência de
crack, a metilação do DNA têm sido utilizada como um importante mecanismo para
compreender tanto a participação do substrato genético quanto a sua interação com os
fatores ambientais no desenvolvimento da dependência. OBJETIVOS: Explorar
alterações na metilação do DNA em dependentes de crack e avaliar se fatores
ambientais estão associados com essas alterações através do uso de modelagem de
equações estruturais (SEM). MÉTODOS: A metilação do DNA foi avaliada em 118
dependentes de crack e 98 controles saudáveis com o ensaio Infinium MethylationEPIC
BeadChip arrays (850K). Avaliamos dois modelos causais de mediação: 1) A relação
entre a idade epigenética de dependentes de crack e controles mediada por fatores
ambientais como fatores sociodemográficos, qualidade de vida, religiosidade e uso de
álcool e outras drogas, e 2) A relação entre a idade epigenética de dependentes de crack,
considerando a exposição dos indivíduos a eventos traumáticos e estressores, mediado
por transtornos psiquiátricos. Adicionalmente, buscamos por sítios (DMSs) e regiões
diferencialmente metilados (DMRs) entre dependentes de crack e indivíduos controle, e
entre dependentes de crack expostos e não expostos a eventos traumáticos e estressores.
RESULTADOS: Na avaliação entre casos e controles, observamos um aumento
significativo na idade metilômica de dependentes de crack, assim como uma aceleração
de idade maior para esse grupo (ambas com p-valor: <0,001). No entanto, os fatores
ambientais não apresentaram mediação nessa relação. Foram identificados 597 (DMSs)
(adjP <0,001) e 15 DMRs (FDR <0,05; ∆β ≥ 5%) relacionados à dependência de crack,
com genes diferencialmente metilados relacionados principalmente à vias de sinalização
EGFR, vias de organização de cromatina, regulação de expressão gênica e regulação
transcricional pela proteína TP53. Considerando a exposição de dependentes de crack a
eventos traumáticos e estressores, não foi observada diferença significativa na idade
metilômica e aceleração de idade e, consequentemente, não foi possível observar uma
relação de mediação por transtornos psiquiátricos. Na análise de metilação diferencial,
não foram observados DMSs e DMRs relacionados à exposição de dependentes de
crack a eventos traumáticos e estressores. CONCLUSÕES: Observamos que a
dependência de crack está relacionada à uma aceleração de idade positiva, que reflete
que o uso da droga faz com que esses indivíduos apresentem um envelhecimento
biológico acelerado comparados à indivíduos controle. Além disso, observamos
diferenças significativas no padrão de metilação do DNA de dependentes de crack,
sendo a maioria possivelmente relacionada à um silenciamento gênico. Nossos
resultados contribuem para uma melhor compreensão da neurobiologia da dependência
de crack e trazem a perspectiva da identificação de novos biomarcadores que podem
auxiliar em soluções mais eficazes de prevenção, diagnóstico e tratamento da
dependência.
Descritores: Ambiente; Crack; Dependência química; Envelhecimento celular;

Epigenômica; Metilação do DNA; Modelagem de equações estruturais.
Abstract
Camilo CP. Epigenetic age and DNA methylation analysis in crack cocaine dependents
[Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2020.
BACKGROUND: DNA methylation has the ability to measure the cumulative work
done by the epigenetic maintenance system, and to determine the impact of
environmental factors on biological aging. DNA methylation has been used as an
important mechanism to better understand the interaction between the genetic and
environment factors involved with crack dependent phenotype. OBJECTIVES:
Investigate DNA methylation differences between crack dependents and healthy
controls and evaluate its association with environmental factors through structural
equation modeling (SEM). METHODS: We studied DNA methylation profiles of 128
crack dependents and 109 control subjects using the Infinium MethylationEPIC
BeadChip arrays (850K). Two SEM models were evaluated: 1) The relationship
between epigenetic age in crack dependents and controls mediated by environment
factors such as sociodemographics, quality of life, religiosity and use of alcohol and
other drugs, and 2) The relationship between epigenetic age in crack dependents
exposed and non-exposed to traumatic/stressor events mediated by psychiatric
disorders. We also searched for differentially methylated sites (DMSs) and regions
(DMRs) between crack/controls and crack exposed/non-exposed groups. RESULTS:
Epigenetic age approach showed that both DNA methylation age and age acceleration
were higher for the dependents group (p-value <0,001), although no mediation effect
regarding environment factors has been observed. Comparison between crack
dependents and controls revealed 597 DMSs (adjP <0,001) and 15 DMRs (FDR <0,05;
∆β ≥ 5%), with differentially methylated genes mainly related to signaling by EGFR,
chromatin organization pathways, gene expression regulation and transcriptional
regulation by TP53. Considering crack dependents exposed and non-exposed to
traumatic/stressor events, we did not observe differences in both DNA methylation age
and age acceleration. Thus, we could not observe a mediation effect by psychiatric
disorders. For differential methylation analysis we did not find DMSs and DMRs
related to the exposure of crack dependents to traumatic/stressor events.
CONCLUSIONS: We found that crack cocaine dependence is related with a positive
age acceleration, which reflects that the use/abuse of this drug makes the individuals´
biological age older compared to healthy controls. Moreover, we identified statistically
significant differences in DNA methylation patterns of crack cocaine dependents,
mainly involved with gene silencing. Our results contribute to a better understanding of
crack cocaine dependence neurobiology, bringing new perspectives about DNA
methylation biological markers that could contribute to more effective solutions for
prevention, diagnosis and drug dependence treatment.
Descriptors: Environmental; Crack cocaine; Drug dependence; Biological aging;

Epigenomics; DNA methylation; Latent class analysis.
1. APRESENTAÇÃO
Apresentação 2
O epigenoma representa a capacidade de um organismo de se adaptar e evoluir por

meio da expressão de um conjunto de características ou fenótipos desenvolvidos em
resposta a estímulos ambientais 1. Uma das principais modificações epigenéticas, a
metilação do DNA, tem a capacidade medir o trabalho cumulativo realizado pelo
sistema de manutenção epigenética, em um processo chamado de "idade epigenética".
Esse mecanismo tem sido um marcador promissor para o estudo do desenvolvimento
humano e envelhecimento, avaliando a idade biológica dos indivíduos com base nos
níveis de metilação do DNA. Ademais, é capaz de determinar o impacto de fatores
ambientais no processo de envelhecimento biológico 2.
Drogas de abuso, como o crack, são capazes de alterar o padrão de metilação de
DNA do genoma 3. A dependência de crack, assim como a maquinaria epigenética,
também é afetada por fatores ambientais como condições socioeconômicas,
adversidades sociais, qualidade de vida, exposição à estresse e comorbidades
4,5
psiquiátricas . No entanto, poucos estudos avaliaram em conjunto a influência dos
fatores ambientais em alterações na metilação do DNA e dependência de crack.
Nenhum estudo, até o momento, avaliou como essa relação pode afetar a idade
epigenética dos indivíduos, deixando uma lacuna na literatura sobre essa temática.
Para avaliar o impacto da dependência de crack na idade epigenética e inferir como
os fatores ambientais podem mediar essa relação, deve-se considerar a utilização de
técnicas estatísticas capazes de avaliar essa relação de causa e efeito e a interação entre
as variáveis, como análises de mediação e modelagem de equações estruturais.
O presente estudo foi desenvolvido com esse propósito. Apresentaremos a seguir
uma introdução com a fundamentação teórica dos principais temas abordados no nosso
estudo e, nas seções seguintes, os métodos e resultados obtidos na avaliação do impacto
da dependência de crack e fatores ambientais na metilação do DNA.
2. INTRODUÇÃO
Introdução 4
2.1 . CAPÍTULO 1
2.1.1. Epigenética
O termo „epigenética‟ surgiu na década de 1940, com o biólogo e embriologista

Conrad Waddington, como o “ramo da biologia que estuda as interações causais entre
os genes e seus produtos que dão origem ao fenótipo” 6. Nesse sentido, genes ou
exposições ambientais não seriam suficientes para explicar, por si só, o fenótipo de um
indivíduo. Ao invés disso, seriam componentes de um sistema molecular complexo
maior. Assim, a epigenética é uma importante abordagem para entender a influência e
interação do ambiente sobre o genoma 7,8.
Epigenética é um termo amplamente utilizado para descrever os processos
moleculares que alteram a expressão de genes sem alterar a sequência de bases
6,9
nucleotídicas do DNA (Deoxyribonucleic Acid/ Ácido desoxirribonucléico) .
Modificações epigenéticas podem ser herdadas tanto mitoticamente quanto
meioticamente e desempenham um papel essencial na remodelação da estrutura global
da cromatina, que por sua vez, regula a expressão gênica 6,10. A cromatina é o complexo
de DNA, histonas e proteínas (não histonas) no núcleo da célula. Em seu estado
condensado, conhecido como heterocromatina, a cromatina é transcricionalmente
inativa. Já em seu estado ativo, conhecido como eucromatina, a cromatina está
descondensada, permitindo o acesso da maquinaria transcricional e promovendo a
expressão gênica 8,11.
A estrutura da cromatina é regulada por dois mecanismos principais, modificações
pós-traducionais das histonas e metilação do DNA 6. As histonas são as proteínas em
torno das quais o DNA é envolvido para formar o nucleossomo. Os núcleos das histonas
são embalados por caudas aminoterminais e essas caudas são os locais de várias
modificações pós-transcricionais, como acetilação, metilação, fosforilação,
ubiquitinação, sumoilação e ADP-ribosilação. As modificações das histonas são
mediadas pelas enzimas histona acetiltranferases (HATs) e histona deacetilases
(HDACs) e desempenham um papel importante na regulação da transcrição, reparo e
8,10
replicação do DNA, splicing alternativo e condensação cromossômica . A metilação
do DNA, mecanismo que será abordado no presente estudo, será discutido a seguir.
Introdução 5
2.1.2. Metilação do DNA
A metilação do DNA é a modificação epigenética mais bem compreendida e a

mais estável, quando comparada com as modificações das histonas, pois regula a
plasticidade transcricional do genoma 8. A metilação do DNA consiste na adição de um
grupamento metil (CH3) ao carbono da posição cinco da citosina (C). Essa reação é
mediada pelas enzimas DNMT1 (DNA metiltransferase 1), DNMT3A (DNA
metiltransferase 3 alpha) e DNMT3B (DNA metiltransferase 3 beta), que catalisam a
transferência de um grupo metil da S-adenosil metionina, um cofactor enzimático, para
o DNA 8-10. A enzima DNMT1 é essencial para a manutenção dos padrões de metilação
do DNA em células proliferativas. Essa enzima atua na replicação do DNA,
reconhecendo os locais CpG metilados no DNA recém-replicado e copiando essa
metilação para o local CpG da fita complementar. Além disso, em conjunto com as
enzimas DNMT3A e DNMT3B, DNMT1 está envolvida na criação de novos padrões
de metilação de DNA (metilação „de novo‟) 9,12.
A metilação do DNA ocorre principalmente em dinucleotídeos CpG, que são
regiões em que uma citosina (C) precede uma guanina (G) na sequência de DNA ('C-
6,8,9
fosfato de ligação-G') . Dinucleotídeos CpG podem estar agrupados em regiões
conhecidas como ilhas CpG, que contém pelo menos 200 pares de base (pb) e um
10,12
conteúdo C+G maior que 50% . Esses dinucleotídeos também podem ser
encontrados em regiões localizadas nas margens das ilhas CpG, chamadas de „shore‟
(até 2.000 pb próximos à ilha) e „shelf‟ (de 2.000 a 4.000 pb próximos à ilha), e em
regiões „open sea‟ (a partir de 4.000 pb). Em relação aos genes, dinucleotídeos CpG
podem estar em regiões promotoras dos genes (sítios de início de transcrição -
transcription start site - TSS200 e TSS1500, 5' UTR - untranslated region - e primeiro
éxon), no corpo dos genes e na região 3' UTR 13,14.
A metilação também pode ocorrer em locais „não-CG‟, ou seja, locais onde uma
citosina (C) precede outras bases nitrogenadas, seja uma mesma citosina, adenina ou
timina. A metilação em locais não-CG foi descrita em células-tronco, mas esse
mecanismo permanece pouco compreendido 10.
A metilação é comum em todo o genoma e aproximadamente 3% de todas as
citosinas no DNA humano, e cerca de 70% dos 28 milhões de dinucleotídeos CpG,
estão metilados 10.
Introdução 6
2.1.3. Metilação do DNA e fatores ambientais
Assim como toda a maquinaria epigenética, a metilação do DNA é um processo

dinâmico por natureza e seus padrões podem mudar em resposta a influências
ambientais e fatores de estilo de vida 4. Por influências ambientais consideram-se todos
os fatores físicos, químicos, socioculturais e biológicos na vida de um indivíduo. O
efeito de tais influências pode variar dependendo, por exemplo, do tempo de exposição,
e operar em adição à outros fatores como suscetibilidade genética individual, idade,
sexo e o próprio estilo de vida do indivíduo. A variação na metilação do DNA do
genoma é causada, em grande parte, por fatores ambientais pré-natais e, ao longo da
vida, por fatores ambientais específicos para cada indivíduo 15,16. Já o conceito de „estilo
de vida‟ descreve o “modo de vida típico ou modo de vida característico de um
indivíduo ou grupo” e inclui diversos fatores como alimentação, atividade física,
envelhecimento, hábitos de trabalho, interação social e comportamento, condições de
estresse, exposição à poluentes ambientais, tabagismo e consumo de álcool e outras
drogas 17,18.
Desde o ambiente periconcepcional ao nascimento, tanto influências maternas
(dieta materna, tabagismo, saúde mental e o ambiente social) quanto paternas (consumo
de álcool e exposição a produtos químicos tóxicos) podem alterar o perfil metilômico na
prole. Ainda no período perinatal, por exemplo, cuidados maternos na infância
1,19
influenciam nas alterações epigenéticas da criança em crescimento . As experiências
da infância podem modificar a neurobiologia do desenvolvimento e tais influências
ambientais continuam a afetar os padrões de comportamento e resultados psicológicos
na idade adulta. Com isso, fatores epigenéticos podem modular a biologia de um
indivíduo tanto em um nível físico quanto emocional 1. No período da adolescência, por
exemplo, torna-se mais perceptível a interação entre alterações epigenéticas e
determinantes sociais. Durante a puberdade ocorre a maturação de regiões do córtex
pré-frontal, o que é conhecido por ser um desenvolvimento plástico vulnerável,
sugerindo que algumas influências ambientais como o estresse podem desencadear
doenças neuropsiquiátricas por meio de mecanismos epigenéticos 4. A partir dessa fase,
e aplicando-se à fase adulta, não somente as influências ambientais mas também o estilo
de vida dos indivíduos pode influenciar os mecanismos epigenéticos, como a metilação
1,17
do DNA . Além disso, a adolescência é a principal fase de contato dos indivíduos
Introdução 7
com substâncias como álcool, cigarro e outras drogas, que por sua vez, também podem
causar alterações na metilação do DNA 20.
Diversos estudos têm sido realizados buscando avaliar como o uso/abuso de drogas
como álcool, cigarro e outras drogas podem causar alterações na metilação do DNA 21.
Para o consumo de álcool e cigarro, por exemplo, estudos demonstram que o uso/abuso
22-24
dessas substâncias pode causar alterações no padrão de metilação do DNA .
25,26
Alterações na metilação também foram observadas para o consumo de cannabis ,
27-29 3
cocaína e crack .
Como visto, mudanças na metilação do DNA podem ser diferentes do início da
vida àquelas observadas mais tarde na vida. Alterações dinâmicas ocorrem desde o
desenvolvimento embrionário até a idade adulta, quando a especificação de tecidos e
30
órgãos são completados e o crescimento estabilizado . Essas alterações dinâmicas
durante a vida servem como um mecanismo importante para os organismos se
adaptarem às mudanças ambientais externas e internas. No entanto, conforme o
envelhecimento, tais alterações podem funcionar como mudanças adaptativas para
4,31
responder, por exemplo, à exposição ao estresse ao longo da vida . Uma medida
promissora utilizada nos últimos anos para investigar a dinâmica entre o impacto de
influências ambientais e estilo de vida nas assinaturas epigenéticas, como a metilação
do DNA, é o biomarcador molecular conhecido como “relógio epigenético” 2,4,18.
2.1.4. Relógio epigenético
O relógio epigenético é um „preditor‟ que permite estimar a idade biológica dos

indivíduos com base nos níveis de metilação do DNA 2. Referido especificamente como
„idade de metilação do DNA‟ ou „idade metilômica‟, esse método fornece uma
estimativa precisa da idade em diferentes estágios da vida e permite a identificação de
desvios substanciais da idade cronológica real dos indivíduos 30. O estresse cumulativo
ao longo da vida, por exemplo, tem sido relacionado ao envelhecimento epigenético 2.
Horvath 32 propõe em seu método de relógio epigenético que a metilação do DNA tem a
capacidade medir o trabalho cumulativo realizado pelo sistema de manutenção
epigenética, sendo um marcador promissor para o estudo do desenvolvimento humano e
envelhecimento, capaz de determinar o impacto de fatores ambientais no processo de
envelhecimento biológico. Adicionalmente à idade metilômica, o relógio epigenético
Introdução 8
pode estimar a „aceleração de idade‟, que consiste na diferença entre a idade

cronológica e idade metilômica e contém informações sobre os perfis de idade de
metilação dos indivíduos 32,33. Essa estimativa é de extrema importância, pois é capaz de
investigar como a idade metilômica estimada pode diferir entre indivíduos de mesma
idade cronológica, determinando o impacto de fatores ambientais no envelhecimento
biológico. Uma aceleração de idade positiva, por exemplo, sugere o envelhecimento
biológico mais rápido do que o esperado com base na idade cronológica, enquanto
aceleração de idade negativa sugere um envelhecimento mais lento do que seria de se
esperar 2.
Diversos estudos têm observado a relação entre o relógio epigenético, influências
ambientais e fatores de estilo de vida, principalmente sobre como tais fatores podem
influenciar na aceleração da idade. Estudos em famílias mostraram que variações na
idade metilômica podem ser melhor explicadas por fatores ambientais, em sua maioria
por fatores ambientais pré-natais. No entanto, foi observado que a variância da idade
metilômica aumenta com a idade cronológica, sendo pequena para recém-nascidos,
16
maior para adolescentes e relativamente constante para adultos . A exposição à
adversidades no início da vida, como exposição à violência por exemplo, foi associada a
34-36
um envelhecimento biológico acelerado em crianças e adolescentes . Tang e
37
colaboradores demonstraram que crianças expostas à experiências adversas na
infância (incluindo bullying, abuso e negligência emocional, abuso físico, abuso sexual
e problemas relacionados aos pais) apresentaram aceleração da idade de metilação do
DNA.
Influências ambientais como a situação socioeconômica dos indivíduos também
38-40
está associada a um envelhecimento epigenético acelerado . A aceleração de idade
metilômica em adolescentes de famílias de baixa renda foi associada, inclusive, com o
desenvolvimento alterado de estruturas cerebrais 38. Baixa cognição e estresse ao longo
da vida foram associados com uma idade epigenética acelerada 38,41,42. Quanto ao estilo
de vida, estudos demonstram que fatores como educação, atividade física, dieta
equilibrada e baixo índice de massa corporal estão associados a uma lenta aceleração da
43,44
idade . No sentido oposto, baixa escolaridade, alto índice de massa corporal e/ou
obesidade, diabetes e uso de substâncias estão relacionados com uma aceleração de
idade avançada 21,43,45-47.
Introdução 9
Em relação ao uso de substâncias, o consumo leve à moderado de álcool foi

48,49
associado negativamente com a aceleração de idade , enquanto o uso/abuso dessa
50,51
substância foi associado com idade epigenética acelerada . Para o uso de cigarro os
achados são controversos. Enquanto alguns estudos demonstram não haver associação
43,52
entre o consumo de cigarro e uma aceleração de idade , outros evidenciaram essa
relação 47,53, inclusive em órgãos respiratórios 54. Em relação à cocaína e o crack, apesar
de terem sido observadas diferenças na metilação do DNA, até o momento não foram
realizados estudos avaliando como o uso/abuso dessas drogas pode afetar a idade
epigenética dos indivíduos.
Introdução 10
2.2. CAPÍTULO 2
2.2.1. Dependência de crack
A expansão e disseminação do consumo de crack vem se tornando um grave

problema de saúde pública nos últimos trinta anos. Os primeiros relatos de uso de crack
55
no Brasil são da década de 1980 e, desde então, seu uso se disseminou por todo o
território nacional até os tempos atuais. Os últimos levantamentos epidemiológicos
nacionais apontaram para cerca de 1,8 milhões de pessoas já tendo usado crack na vida
e aproximadamente 250 mil pessoas tendo feito uso recente (últimos 6 meses) em cenas
de uso do crack, conhecidas como „cracolândias‟ 56,57.
O crack é a forma „fumada‟ da cocaína e é produzido a partir da pasta ou do
cloridrato de cocaína 58. Dentre as outras formas de uso da cocaína, como intranasal e
venosa, o uso de crack se destaca pela velocidade e duração dos efeitos 59. Ao fumar a
pedra de crack, o vapor produzido é absorvido rapidamente pela mucosa e epitélio
alveolar, atingindo a corrente sanguínea quase imediatamente 60. Ao atingir a circulação
sanguínea seus efeitos ocorrem instantaneamente (8 a 10 segundos), mas esses efeitos
têm curta duração (5 - 10 minutos) 59.
Ao atingir a circulação pulmonar a droga difunde – se ao ventrículo esquerdo,
61
atingindo a circulação cerebral . O principal efeito do crack no Sistema Nervoso
Central ocorre principalmente sobre o sistema mesolímbico – mesocortical, conhecido
como sistema de recompensa, através do bloqueio de recaptação de dopamina na fenda
59,62
sináptica pela inibição dos transportadores de dopamina . Esse bloqueio faz com
que a dopamina fique acumulada na fenda sináptica, causando uma sensação de euforia
63
e bem estar e, para compensar esse aumento, os receptores pré-sinápticos são
ativados, levando à uma diminuição na sua liberação 59,64.
O conjunto de rápida e imediata duração dos efeitos do crack, associado à
sensação de prazer, euforia e poder que a droga proporciona, faz com que os usuários
sofram um grande potencial de dependência 58.
2.2.2. Influência de fatores ambientais na dependência de crack
Além dos efeitos biológicos do crack, outros componentes contribuem para seu
65
potencial de dependência, como os fatores ambientais . A literatura em torno de
Introdução 11
fatores ambientais considerados como „fatores de risco‟ para a dependência de

substâncias é ampla e envolve diferentes populações em todo o mundo. Alguns estudos
com a população brasileira mostraram, por exemplo, que fatores socioeconômicos,
66
vulnerabilidade social , baixa escolaridade, baixa qualidade de vida, menor
envolvimento religioso 5, problemas familiares e uso de outras substâncias 67,68
são
fatores de risco associados ao uso de crack. Um estudo de base populacional realizado
no município de Pelotas, Rio Grande do Sul, mostrou que usuários de crack apresentam
pior qualidade de vida quando comparados à população em geral, principalmente em
termos de saúde geral e física 5. Em outro estudo, realizado em sete estados brasileiros,
pesquisadores observaram alta prevalência de exposição a eventos estressantes e
condições psiquiátricas em usuários de crack 67.
A exposição ao estresse tem sido cada vez mais reconhecida como um
determinante da vulnerabilidade ao uso/abuso uso de substâncias. Adversidades no
início da vida como abuso físico, emocional e sexual têm se correlacionado cada vez
mais com um risco aumentado de uso de substâncias, principalmente na vida adulta 69,70.
Adversidades na infância, como abuso e negligência, podem influenciar a
susceptibilidade à dependência de cocaína e crack 71,72. Usuários de crack em tratamento
em seis capitais brasileiras apresentaram relatam experiências traumáticas tanto antes
quanto depois do primeiro episódio de uso da droga. Esses mesmos usuários
apresentaram comorbidades psiquiátricas com transtorno da personalidade anti-social e
73
transtorno de estresse pós-traumático . Comorbidades entre esses transtornos e o uso
de crack também foram relatados em outros estudos 74.
Além de serem considerados como preditores de iniciação do uso de crack, os
transtornos psiquiátricos são frequentemente relacionados ao uso do crack. No entanto,
quando o usuário já é portador de transtorno primário, a vulnerabilidade para outros
transtornos se torna maior 75. Transtornos de humor como depressão e ansiedade são as
comorbidades psiquiátricas com maior prevalência no uso/abuso de crack, sendo os
sintomas depressivos secundários ao consumo os mais prevalentes 76. Ademais, o uso de
crack têm sido relatado como um fator preditivo para ideação e tentativa de suicídio 74.
Outros importantes transtornos psiquiátricos também já foram associados ao uso/abuso
de crack, como esquizofrenia, transtorno de conduta, transtorno desafiador de oposição,
transtorno de déficit de atenção e hiperatividade 68,76.
Introdução 12
É importante ressaltar que, apesar dos diversos fatores de risco associados ao uso
de crack, outros fatores ambientais podem reduzir a vulnerabilidade para o consumo da
droga. Fatores como um ambiente familiar saudável, maiores níveis de escolaridade e
religiosidade, por exemplo, são considerados positivos na redução de risco à
65,77
dependência . Estudos têm demonstrado uma relação inversa entre a religiosidade e
o uso/abuso de crack77,78. O envolvimento religioso durante a infância e adolescência foi
correlacionado ao início menos frequente do consumo de drogas antes dos 18 anos 79.
2.2.3. Estudos genéticos e epigenéticos na dependência de crack
Diversos estudos têm relatado, além das influências ambientais, a influência dos
fatores genéticos na relação com a dependência química, como nos estudos em famílias,
8,80,81
gêmeos e adotados . Nos últimos anos, diversos estudos têm sido realizados
buscando genes candidatos que possam estar envolvidos em diferentes etapas
relacionadas com a dependência de crack, sendo os mais estudados aqueles aqueles que
82-84
integram o sistema de recompensa dopaminérgico. Stolf e colaboradores
observaram alterações em variantes dos genes DAT1 (dopamine transporter gene),
DRD2 (dopamine receptor D2) e DRD4 (dopamine receptor D4) relacionadas com a
dependência de crack. Outros autores observaram associação do gene NR3C1 (nuclear
receptor subfamily 3 group C member 1) e gravidade da depressão em mulheres com
85
dependência de crack e do gene NR3C2 (nuclear receptor subfamily 3 group C
member 2) com o risco de dependência de crack relacionado à negligência física na
72
infância . A interação desses genes foi associada à gravidade dos sintomas de
abstinência de crack 72.
Estudos avaliando a expressão gênica também evidenciaram associações
significativas com o uso de crack, como uma expressão reduzida de mRNA do gene
FosB (FosB proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit) em dependentes de
86
crack comparados a controles e um aumento no perfil de expressão gênica no córtex
pré-frontal dorsolateral de dependentes de crack 87.
Finalmente, em relação à metilação do DNA, Camilo e colaboradores 3 observaram
diferenças no padrão de metilação de DNA de dependentes de cocaína e crack
comparados à controles, identificando genes diferencialmente metilados previamente
associados à dependência de cocaína.
Introdução 13
2.3. CAPÍTULO 3
2.3.1. Análise de mediação
A análise de mediação é uma técnica estatística utilizada para avaliar o mecanismo

pelo qual a relação entre uma variável independente (X) e uma variável dependente (Y)
pode ser influenciada por uma terceira variável (o mediador). Assim, para uma variável
ser considerada como „mediadora‟, no momento em que ela é incluída em um modelo
de regressão (X > Y), esta variável deve reduzir ou neutralizar o impacto da variável
88
independente sobre a dependente . Se esse impacto for reduzido considera-se que a
variável mediadora absorve parcialmente o efeito de X sobre Y e, se for nulo, significa
que a variável mediadora absorve todo o efeito de X sobre Y, tornando essa mediação
completa 89.
O modelo de mediação é um modelo direcional, pois presume-se que o mediador
causa o resultado e não vice-versa, e é baseado em duas técnicas principais, equações de
90
regressão e análise de caminhos (“path analysis”) , no qual uma hipótese a priori é
estabelecida considerando os efeitos total, direto e indireto do modelo de mediação. O
efeito total (c) refere-se ao coeficiente de regressão preditor da variável independente na
variável dependente, sem a inclusão da variável mediadora. O efeito indireto refere-se à
dois coeficientes, (a) coeficiente preditor do impacto da variável independente na
variável mediadora e (b) coeficiente preditor do impacto da variável mediadora na
variável dependente. Em conjunto, os dois coeficientes de efeito indireto (a*b), medem
o efeito estimado (ou quantidade) de mediação. Já o efeito direto (c´) refere-se ao
coeficiente preditor do impacto da variável independente sobre a variável dependente
controlado pela variável mediadora (M) 91.
Diversas abordagens têm sido propostas para avaliar modelos de mediação, sendo
as principais: análise dos caminhos, diferença entre os coeficientes, teste de Sobel e
método bootstrapping.
Na análise dos caminhos são definidos quatro passos para avaliar os coeficientes:
1) O primeiro passo analisa o efeito total (c) através da associação entre X e Y,
estabelecendo que existe um efeito que pode ser estimado; 2) O segundo passo analisa o
efeito indireto „a‟ através da associação entre X e M. Nesse passo deve-se considerar a
variável M como variável dependente; 3) No terceiro passo é avaliado como a variável
Introdução 14
M afeta Y (efeito indireto „b‟). Para isso, a variável Y é associada tanto à X quanto a M.
88
Baron e Kenny sugerem que a associação entre M e Y não é suficiente para
estabelecer uma relação de mediação, pois M e Y podem estar correlacionados por
ambos serem causados por X. Assim, X deve ser controlada no estabelecimento do
efeito do mediador em Y; 4) O quarto e último passo é derivado do passo anterior pois,
ao avaliar o efeito de M em Y controlado por X, é possível observar se houve efeito de
mediação. Para estabelecer que M faz a mediação entre X e Y, o efeito direto (c ′) deve
ser zero, para uma mediação completa, ou reduzido para uma mediação parcial. No
entanto, para que os efeitos de mediação sejam válidos por esse método, os caminhos a,
b e c ′ devem ser estatisticamente significativos 88.
A abordagem de diferença entre caminhos avalia a diferença entre os efeitos total e
direto (c – c´). Nessa abordagem uma equação matemática por meio da distribuição t
(com n – 1 grau(s) de liberdade) é utilizada para avaliar se existe mediação,
considerando a correlação de M com Y, os erros padrão das relações c e c´, e a
estimativa de mediação dividida pelo erro padrão da equação 92.
O teste de Sobel é um método para determinar se a redução no efeito de Y, após
incluir M no modelo, é uma redução significativa e, portanto, se o efeito da mediação é
estatisticamente significativo. Assim, como na abordagem de análise dos caminhos,
para esse teste todos os caminhos devem ser calculados e, se ambos os caminhos a e b
forem significativos e c‟ for mais próximo de zero do que c, então o mediador M é
considerado significativo. A tabela do teste z e distribuição bicaudal são utilizados como
padrão neste teste, sendo o ponto de corte para que uma mediação seja aceita de α= 0,05
ou z= ± 1,96. Contudo, essa abordagem possui uma importante limitação, com o
93
pressuposto de que a distribuição do produto entre os caminhos a e b seja normal .
O método bootstrapping gera uma representação empírica da distribuição da
amostra por reamostragem com reposição. Com essa abordagem é possível contornar a
limitação do teste Sobel, com o cálculo do intervalo de confiança do produto de a*b.
Assim, utilizando a estimativa de efeito indireto com as reamostragens, é calculado o
intervalo de confiança de 95%. Se os valores dos efeitos diretos e indiretos estiverem
dentro desses 95% a mediação é considerada presente. O método bootstrapping é
indicado para números amostrais entre 20 e 80 91.
Introdução 15
2.3.2. Modelagem de equações estruturais
A modelagem de equações estruturais (SEM - Structural Equation Modelling) é

uma técnica de análise estatística multivariada baseada também em análise de caminhos,
mas que engloba a combinação de técnicas de análise fatorial e regressão linear múltipla
94
. O objetivo de SEM é analisar a relação causal entre variáveis observadas e construtos
latentes (variáveis que não são diretamente observadas ou medidas, mas inferidas a
95
partir de variáveis observadas e/ou latentes) . Esse método pode ser utilizado tanto
para modelos exploratórios, no qual as relações entre as variáveis não é estabelecido a
priori, quanto confirmatórios, em que é estabelecida uma hipótese a priori da relação
das variáveis observadas e variáveis latentes através de um diagrama de caminhos 96.
No método confirmatório, utilizado no presente estudo, o primeiro passo para
análise SEM é identificar o problema a ser abordado e desenvolver uma hipótese sobre
as relações entre as variáveis, baseado em conceitos teóricos ou resultados empíricos.
Deve-se determinar a condição das relações, se uni ou bidirecionais, e o modelo
94
conceitual através de um diagrama de caminho . Com o modelo conceitual
identificado, o próximo passo é selecionar a estimativa de parâmetro para avaliação do
mesmo. As principais estimativas são por máxima verossimilhança (ML - maximum-
likelihood), utilizado com o pressuposto de normalidade, máxima verossimilhança pela
média ajustada (MLM - maximum-likelihood mean adjusted) e máxima verossimilhança
pela média e variância ajustadas (MLMV - maximum-likelihood mean and variance
adjusted), sendo os dois últimos utilizados quando o pressuposto de normalidade não é
válido 96.
O próximo passo é a determinação da adequação do modelo, para determinar o
quanto o modelo se ajusta aos dados da amostra avaliada, que é realizado através de
índices de ajuste. Diversos índices podem ser utilizados, assim, vamos citar os
principais. Como índices de ajuste absoluto são considerados:
 Teste qui-quadrado (χ2): Testa a hipótese nula de que o modelo proposto é
válido para a população, ou seja, a hipótese nula é aceita quando o p-valor
>0,05 97;
Introdução 16
 Razão entre o teste qui-quadrado e graus de liberdade (χ2/df): Compara a

magnitude de χ2 com o número de graus de liberdade, que é o valor esperado
da distribuição da amostra. Para um ajuste de modelo ser considerado como
"bom" ou "aceitável", a razão deve ser entre 0 e 2 e entre 2 e 3,
respectivamente 97;
 Root mean square error of approximation (RMSEA): Mede o ajuste geral do

modelo proposto. Um bom ajuste de modelo é considerado com valor
RMSEA ≤0,05, enquanto valores entre 0,05 e 0,08 são considerados como
um ajuste adequado e valores entre 0,08 e 0,10 como um ajuste medíocre.
98 99
Valores RMSEA >0,10 não são aceitáveis . Hu e Bentler sugeriram um
RMSEA <0,06 como bom ajuste de modelo. Diferente dos demais índices de
ajuste, RMSEA pode ser calculado com intervalo de confiança (IC). Para um
ajuste exato, o limite inferior do IC deve ser zero, e para um ajuste próximo
o limite inferior deve ser <0,05 97;
 Standardised root mean square residual (SRMR): Medida baseada na

diferença entre a correlação observada e a correlação prevista dos resíduos
padronizados. SRMR deve ser <0,05 para um bom ajuste e <0,10 para um
ajuste aceitável 99;
 Adjusted goodness-of-fit statistic (AGFI): Calcula a proporção da variância

pela covariância da população estimada e mostra o quanto o modelo
consegue replicar a matriz de covariância observada, ajustando essa
proporção é pelos graus de liberdade. AGFI deve ser ≥ 0,90 para o modelo
ser considerado bem ajustado 100.
Índices de ajuste incrementais, ou índices de ajuste comparativos, também devem

ser selecionados, pois comparam o modelo proposto com um modelo nulo ou de
independência 96. Os principais são:
 Comparative fit index (CFI): Mede a melhoria relativa do modelo proposto.

Para um bom modelo, CFI deve ser ≥0,95 99,101;
 Tucker Lewis index (TLI): Medida da discrepância entre o valor χ2 do

modelo hipotético e o valor χ2 do modelo independente. Para ser
considerado um modelo aceitável, TLI deve ser ≥0,90 102.
Introdução 17
Por fim, para a comparação entre diferentes modelos e seleção do mais plausível,
97
quando for o caso, devemos selecionar os índices de ajuste de parcimônia , sendo os
principais os índices Akaike information criterion (AIC) e Bayesian Information
Criterion (BIC). Ambos utilizam a probabilidade dado o ajuste de máxima
verossimilhança do modelo e avaliam o desempenho do modelo considerando sua
complexidade. AIC é baseado na aproximação assintótica que pode não ser válida para
um determinado conjunto de dados, enquanto BIC é baseado na suposição de que os
erros do modelo são independentes e normalmente distribuídos. Para a seleção do
modelo que melhor se ajusta aos dados, deve-se considerar aquele com o menor valor
de AIC e BIC dentre os modelos testados 103.
Por fim, o modelo conceitual proposto é finalmente avaliado. No entanto, em
muitos casos, o modelo proposto inicialmente não se adequa perfeitamente aos dados da
amostra. Quando isso ocorre, etapas de ajuste e modificação do modelo podem ser
realizadas, sempre considerando a fundamentação teórica utilizada na construção do
94
modelo para realizar essas modificações . Adicionalmente, é possível utilizar os
índices de modificação („modification indices‟), que fornecem uma estimativa
aproximada de como o χ2 poderia melhorar no modelo proposto se um determinado
parâmetro fosse alterado. Para cada índice de modificação observa-se uma alteração de
parâmetros esperada correspondente e, avaliando-as em conjunto, é possível melhorar
os índices de ajuste do modelo 104.
2.3.3. O uso de análises de mediação e SEM na avaliação da metilação do
DNA, efeitos ambientais e uso/abuso de drogas
Como visto anteriormente, influências ambientais estão relacionadas tanto com

alterações na metilação do DNA quanto com a dependência de crack, e diversos estudos
utilizando as técnicas de mediação e SEM têm sido realizados para avaliar essas
relações.
Estudos com o uso de SEM foram relatados, por exemplo, para calcular a variância
na metilação do DNA explicada por efeitos genéticos, efeitos ambientais
compartilhados e não compartilhados em gêmeos monozigóticos e dizigóticos 105, para
investigar o efeito de baixa renda no envelhecimento epigenético associado à outros
Introdução 18
106
fatores ambientais como educação, estado civil, dieta e consumo de álcool e tabaco ,
entre muitos outros.
Em relação ao uso/abuso de drogas, SEM já foi utilizado para examinar os
caminhos entre o uso de substâncias como álcool, maconha e cocaína e sofrimento
107
psicológico de longo prazo , para avaliar caminhos de predição ao uso de
108
psicoestimulantes e prever fatores de risco mediadores da relação entre abuso e
109
negligência na infância e uso de drogas ilícitas na idade adulta . Especificamente em
relação ao uso de crack, dois estudos interessantes foram encontrados, sendo o primeiro
observando que o transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) pode
predizer o uso de crack em indivíduos com níveis médios e altos de agressão verbal 110,
e o segundo demonstrando que a troca de sexo por crack em mulheres está associada ao
abuso na infância e mediada, em parte, por sofrimento psicológico 111.
3. JUSTIFICATIVA
Justificativa 20
Evidências crescentes sugerem que mecanismos epigenéticos, como a metilação do

DNA, podem ser influenciados pela exposição a uma variedade de influências
ambientais e fatores de estilo de vida. Em relação à dependência de crack, apesar de
terem sido observadas diferenças na metilação do DNA, até o momento não foram
realizados estudos avaliando como o uso/abuso dessa droga pode afetar a idade
epigenética dos indivíduos, deixando uma lacuna na literatura. Para entender essas
alterações e a complexa interação genético-ambiental na dependência de crack a
modelagem de equações estruturais parece ser o método mais adequado.
Assim, diante o contexto apresentado, o presente estudo propõe avaliar o impacto
da dependência de crack na idade epigenética e inferir como essa relação pode ser
influenciada por fatores ambientais relacionados à dependência. Uma compreensão mais
aprofundada dos mecanismos envolvidos na interação entre os fatores biológicos e os
fatores ambientais poderá contribuir com soluções mais eficazes de prevenção e
tratamento dos dependentes de cocaína/crack.
4. OBJETIVOS
Justificativa 22
4.1. Objetivo geral
Explorar alterações na metilação do DNA em dependentes de crack em um estudo

de associação do epigenoma e avaliar se fatores ambientais estão associados com essas
alterações através do uso de modelagem de equações estruturais.
4.2. Objetivos específicos
 Objetivo específico 1: Avaliar a idade epigenética de dependentes de crack

em uma abordagem caso-controle, e se fatores ambientais podem atuar como
mediador nessa avaliação;
 Objetivo específico 2: Avaliar sítios e regiões diferencialmente metilados

entre dependentes de crack e indivíduos controle, assim como vias biológicas
relacionadas a genes diferencialmente metilados;
 Objetivo específico 3: Avaliar a idade epigenética de dependentes de crack

considerando a exposição dos indivíduos a eventos traumáticos e estressores,
e se comorbidades psiquiátricas podem atuar como mediador nessa
avaliação;
 Objetivo específico 4: Avaliar sítios e regiões diferencialmente metilados em

dependentes de crack a exposição a eventos traumáticos e estressores, assim
como vias biológicas relacionadas a genes diferencialmente metilados.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
Material e Métodos 24
5.1. Amostra
5.1.1. Casos
O presente estudo é parte de um estudo epidemiológico concluído em 2014,

intitulado “Perfil sociodemográfico e história natural do consumo de crack entre
usuários de sete estados brasileiros e do Distrito Federal”, coordenado pelos Professores
Ronaldo Laranjeira e Marcelo Ribeiro e com financiamento do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Edital MCT/CNPq Nº 41/2010) I. O estudo
investigou a história natural do consumo de crack e fatores preditores de permanência e
abandono do tratamento de usuários de crack internados para tratamento em
comunidades terapêuticas de sete estados brasileiros e do Distrito Federal. Foi aplicada
uma entrevista estruturada desenvolvida pela equipe de pesquisadores da Unidade de
Pesquisa em Álcool e Drogas (UNIAD) | Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP). A descrição detalhada do questionário encontra-se no Anexo A.
As entrevistas foram conduzidas nos primeiros dias após a admissão (internação)
dos pacientes para tratamento nas comunidades terapêuticas. Foram entrevistados 653
pacientes que preencheram os critérios da Classificação Internacional de Doenças (CID-
10) para dependência de crack. A partir desses, cerca de 542 pacientes aceitaram
participar da coleta de material biológico (saliva), assinando um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). As amostras de saliva foram coletadas com
o produto comercial Oragene DNA OG-500 self-collection kit (DNA Genotek, Ottawa,
Ontario, Canada) e o DNA genômico foi extraído de acordo com as recomendações do
fabricante.
A partir da amostra total de 542 pacientes, foram excluídos 52 pacientes por terem
dados incompletos. Sendo o perfil do usuário de crack composto, em sua maioria, por
indivíduos do sexo masculino 57, optamos pela seleção desses indivíduos, excluindo da
amostra 54 pacientes do sexo feminino. Das 436 amostras restantes, selecionamos os
indivíduos que completaram os instrumentos de avaliação de interesse para o projeto (a
seleção dos instrumentos será descrita para cada objetivo específico) e que apresentaram
material biológico de boa qualidade. Assim, a amostra de casos selecionados para os
ensaios de metilação foi constituída por 128 usuários de crack.
I
http://www.researchgate.net/publication/283153684
5.1.2. Controles
O grupo controle é proveniente do banco de DNA do Programa de Genética e

Farmacogenética (ProGene) do Instituto de Psiquiatria do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (IPq-HCFMUSP), que conta com
mais de 2.000 indivíduos controle. Todos os indivíduos são voluntários que aceitaram
se submeter à um questionário para investigação clínica, psiquiátrica e de uso
substâncias químicas (fármacos e outras substâncias), e coleta de amostra biológica
(sangue periférico ou saliva) para extração de DNA, assinando um TCLE. Para o
presente projeto selecionamos indivíduos controle do sexo masculino, cuja amostra
biológica coletada para extração de DNA foi a saliva, e que apresentavam as mesmas
informações e instrumentos de avaliação do grupo de casos. Foram excluídos indivíduos
que apresentavam relato de uso abusivo ou contato recente com drogas de potencial
abuso (exceto álcool e cigarro) e alguma condição psiquiátrica atual ou história de
internação psiquiátrica em algum momento da vida. A amostra de controles foi
constituída por 109 indivíduos.
5.2. Ensaio de metilação do DNA do genoma
As amostras de DNA foram tratadas com bissulfito de sódio, que consiste na

conversão de bases citosina não metiladas em uracila, enquanto as bases citosina
metiladas permanecem inalteradas, com o kit EZ DNA methylation (Zymo Research,
Irvine, California, USA), de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA
bissulfito convertido foi desnaturado, neutralizado e amplificado por PCR (Polymerase
Chain Reaction/ Reação em cadeia de polimerase) isotérmica, por aproximadamente 16
horas, com perfil de incubação de 16 ciclos a 95 °C durante 30 segundos, 50 °C durante
60 minutos e um passo final de realização de 4 °C durante 10 minutos. O produto
amplificado foi fragmentado por um processo de hidrólise enzimática, para evitar o
excesso de fragmentação da amostra, precipitado com isopropanol, recolhido por
centrifugação a 4 ºC e ressuspenso em tampão. As amostras foram hibridizadas
utilizando o ensaio Infinium MethylationEPIC BeadChip arrays (850K) (Illumina Inc),
seguindo o protocolo de metilação Illumina Infinium HD.
Este ensaio interroga o status de 853.307 sítios de metilação, dos quais 850.3681
são CpGs, 2.280 não-CpGs e 59 são sondas de controle. Em relação à distribuição
genômica, 25,8% CpGs estão localizados em regiões promotoras, sendo 16% nos sítios
de início da transcrição TSS200 e TSS1500, 9,4% em 5' UTR e 0,4% no primeiro éxon.
Por fim, 40% CpGs estão localizados no corpo dos genes, 0,9% em 3' UTR e 33,3% em
regiões intergênicas. A cobertura relacionada às ilhas CpG está dividida em 5,4% CpGs
em ilhas, 16,4% em shores e shelves e 78,2% em regiões „open sea‟ 14.
5.3. Análise da metilação do DNA
Os sinais de metilação do DNA digitalizadas no scanner iScan Microarray

Scanner (Illumina Inc), chamados de arquivos IDAT, foram obtidos através do software
GenomeStudio (v.2011.1) (Illumina Inc) e as sondas foram anotadas utilizando o pacote
IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b2.hg19 II. Os dados de metilação de DNA
III
foram analisados no software R (R Project for Statistical Computing Core Team )
112 IV
utilizando o pacote minfi , disponível no projeto Bioconductor . Na etapa de
controle de qualidade foram removidas 17.587 sondas por apresentarem baixa detecção
de fluorescência (p-valor >0,01), 27.017 sondas localizadas em SNPs (Single nucleotide
polymorphisms/ Polimorfismo de nucleotídeo único) (de acordo com o banco de dados
dbSNP) e 40.500 sondas „cross-reactive‟, sondas de reatividade cruzada que têm como
alvo sequências repetitivas ou que co-hibridizam com sequências alternativas
113,114
homólogas aos alvos pretendidos . Vinte e uma amostras foram excluídas por
apresentarem baixa qualidade de hibridização, permanecendo assim 781.732 sondas em
216 amostras (118 casos e 98 controles) que foram utilizadas nas análises subsequentes.
As intensidades de sinal das sondas Infinium I e Infinium II foram normalizadas com o
115
método quantil e a correção de background foi realizada com o método „noob‟
116
(Normal-exponential convolution using out-of-band probes) . Os efeitos de lote
117
(array/slide) foram corrigidos usando a função ComBat do pacote ChAMP (Chip
118
Analysis Methylation Pipeline) . A composição celular foi estimada usando a função
112
FlowSorted.Blood.EPIC conforme implementado no pacote minfi . Para identificar a
presença de potenciais fatores de confusão em quaisquer variáveis técnicas e biológicas
não computadas na análise, utilizamos o pacote SVA (Surrogate Variable Analysis) 119.
II
DOI: 10.18129/B9.bioc.IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b2.hg19
III
www.r-project.org
IV
https://www.bioconductor.org/
Os nível de metilação de cada CpG, chamados de valores Beta (β), assumem

valores contínuos entre o intervalo 0 (não metilado) e 1 (completamente metilado), e são
calculados pela razão entre os sinais de fluorescência a intensidade da sonda metilada e
120
a intensidade total (soma das sondas metiladas e não metiladas) . As análises de
metilação do DNA que serão apresentadas a seguir, para cada Objetivo Específico,
foram realizadas a partir dos valores β.
5.4. Objetivo Específico 1
5.4.1. Instrumentos de avaliação
Para compor o banco de dados que seria utilizado para a avaliação deste primeiro
objetivo, selecionamos a partir do questionário estruturado as informações e avaliações
que foram coletadas tanto para o grupo de casos como para o grupo controle, para
garantir que os grupos fossem comparáveis. Assim, selecionamos as variáveis
sociodemográficas idade, etnia, escolaridade, estado civil e uso de outras drogas, e os
seguintes instrumentos de avaliação:
 Duke Religion Index (DUREL): Escala composta por cinco itens que avaliam
a religiosidade por meio de três dimensões. O primeiro item avalia a
religiosidade organizacional, referente à frequência que o indivíduo vai à
igreja, templo ou outro encontro religioso. O segundo item avalia a
religiosidade não organizacional, referente à frequência que o indivíduo
dedica o seu tempo a atividades religiosas individuais. Os três últimos itens
avaliam, em conjunto, a religiosidade intrínseca, que refere-se ao grau de
compromisso ou motivação religiosa do indivíduo quanto à sua religiosidade
121
;
 World Health Organization Quality of Life-Brief instrument (WHOQL-

BRIEF): Instrumento proposto para avaliar a qualidade de vida dos
indivíduos. É composto por duas questões que avaliam a percepção da
qualidade de vida e a satisfação com a saúde e 24 facetas que compõem
quatro domínios: físico – aborda questões sobre dor, fadiga, desconforto,
qualidade do sono e mobilidade; psicológico - aborda aspectos sobre auto-
estima, crenças pessoais, sentimentos e capacidades; relações sociais –
aborda as relações e suporte social; meio ambiente - aborda questões sobre o
ambiente físico, lar e recursos financeiros 122.
5.4.2. Estatística descritiva
Para a análise descritiva dos dados sociodemográficos e instrumentos de avaliação

dos indivíduos, utilizamos média ( )/desvio padrão (±DP). Variáveis categóricas foram
avaliadas por distribuição numérica (n) e percentual (%). Para a comparação entre os
grupos, variáveis contínuas foram analisadas pelos testes t-student e variáveis
categóricas foram analisadas utilizando o teste qui-quadrado. As análises estatísticas
foram realizadas no software R, considerando a significância estatística de p-valor
<0,05 para todas as análises.
A idade epigenética dos indivíduos foi avaliada a partir dos valores β com o
32
método do relógio epigenético descrito por Horvath , que estima a idade molecular
baseado nos níveis de metilação do DNA. Resumidamente, o método utiliza a média
ponderada de 353 sítios CpGs (chamados de „clock CpGs‟) e transforma esse dado no
que o autor denomina como „idade de metilação‟ (ou idade metilômica) através de uma
função de calibração. Além da idade metilômica, esse método fornece a aceleração da
idade (ou „Age acceleration‟ - AA), que é calculada de duas formas: pela diferença
entre a idade epigenética e cronológica dos indivíduos (conhecida como AA
„Difference‟), que vamos chamar pela sigla AADiff neste trabalho, e estimada a partir
dos resíduos de um modelo de regressão linear da idade epigenética regredida pela
idade cronológica (conhecida como AA „Residuals‟), que vamos chamar pela sigla
AARes.
5.4.4. Mediação e modelagem de equações estruturais
Para avaliar a relação dos fatores ambientais como mediador na idade epigenética
de dependentes de crack, fizemos uma análise de mediação utilizando modelagem de
equações estruturais. O modelo conceitual proposto foi definido com a medida de idade
epigenética AADiff como variável dependente e os grupos caso e controle como
variável independente. Para a variável mediadora, incluímos as variáveis
sociodemográficas e os instrumentos de avaliação DUREL e WHOQL-BRIEF como
parte de uma variável latente representando os fatores ambientais (Os modelos
conceituais propostos e os diagramas de caminhos serão descritos detalhadamente na
seção „6. Resultados - 6.1.3. Análise de mediação utilizando modelagem de equações
estruturais‟).
Para avaliação do modelo proposto selecionamos a abordagem descrita por Baron e
88
Kenny de análise dos caminhos. Como estimativa de parâmetro selecionamos a
máxima verossimilhança (ML - maximum-likelihood) por se enquadrar melhor no nosso
123
conjunto de dados . Para os índices de ajuste absoluto, selecionamos o teste qui-
97
quadrado (χ2), razão entre o teste qui-quadrado e graus de liberdade (χ2/df) , Root
98,99
mean square error of approximation (RMSEA) e Standardised root mean square
99
residual (SRMR) . Em relação aos índices de ajuste comparativos, utilizados ambos
99,101 102
Comparative fit index (CFI) e Tucker Lewis index (TLI) . Como índices de
ajuste de parcimônia utilizamos os índices Akaike information criterion (AIC) e
Bayesian Information Criterion (BIC) 103.
A análise de mediação utilizando SEM foi realizada no software R utilizando o
104
pacote lavaan . Os resultados serão apresentados utilizando coeficientes e erros
padronizados.
5.5.1. Análise de metilação diferencial
Para a comparação de metilação do DNA entre os grupos de casos e controles, foi

124
aplicado um modelo linear Bayesiano do pacote limma nos M values (loggit dos
valores β), sendo considerados como sítios diferencialmente metilados (DMSs) aqueles
com p-valor ajustado (adjP) <0,001. Para identificar regiões diferencialmente metiladas
125
(DMRs) utilizamos o pacote DMRcate , considerando significante FDR (False
discovery rate) <0,05, diferença de metilação entre os grupos (delta beta, ∆β) ≥ 5% e
com, no mínimo, quatro CpGs.
Genes diferencialmente metilados, relacionados aos DMSs e DMRs, foram
126
anotados funcionalmente no ClueGO (v.2.5.7) , um plug-in do software de
visualização de redes de interação molecular Cytoscape (v.3.7.2) 127. O ClueGO integra
termos de ontologia genética (GO – gene ontology) e cria uma rede de termos GO e vias
biológicas funcionalmente organizadas. O enriquecimento dos genes foi realizado
128
usando o banco de dados Reactome com especificidade média de rede (p-valor
<0,05). Para correção do p-valor foi utilizado o método BH (Benjamini-Hochberg),
teste hipergeométrico bilateral e pelo menos cinco genes por categoria. Os termos GO
foram repetidamente comparados, combinados em grupos funcionais e visualizados no
Cytoscape 127.
5.6.1. Instrumentos de avaliação
Para investigar a idade epigenética de dependentes de crack em relação à

exposição dos indivíduos a eventos traumáticos e estressores, separamos o grupo de
casos em dois subgrupos: I) Dependentes de crack com “eventos traumáticos” e II)
dependentes de crack sem “eventos traumáticos”, de acordo com o instrumento ETISR-
SF:
 Early Trauma Inventory Self Report-Short Form (ETISR-SF), uma escala

que avalia a quantidade de eventos traumáticos e estressores na infância e
adolescência. A escala é composta por 27 itens divididos em quatro
dimensões: trauma geral, abordando itens como desastres naturais, acidentes,
morte e doenças em pessoas próximos, uso de álcool/drogas e transtornos
psiquiátricos em membros da família; abuso físico, incluindo tapas,
empurrões e outras agressões; abuso emocional, com itens abordando
atitudes de outras pessoas com os indivíduos de modo a afetar seu estado
emocional; e abuso sexual 129.
A caracterização de transtornos psiquiátricos foi realizada com o instrumento

MINI:
 Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI): é uma entrevista
diagnóstica estruturada que explora de modo padronizado os principais
Transtornos Psiquiátricos do Eixo I do DSM-IV (Diagnostic and Statistical
Manual of Mental Disorders - Manual Diagnóstico e Estatístico de
Transtornos Mentais). O MINI é dividido em módulos, cada um
correspondendo a uma categoria diagnóstica 130.
5.6.2. Estatística descritiva
A análise descritiva foi realizada utilizando média/desvio padrão e distribuição

numérica/percentual, como descrito anteriormente. A comparação foi realizada entre os
subgrupos de dependentes de crack, sendo variáveis contínuas analisadas pelos testes t-
student ou U de Mann-Whitney, conforme distribuição de normalidade avaliada pelo
teste Shapiro-Wilk, e variáveis categóricas pelo teste qui-quadrado. As análises
estatísticas foram realizadas no software R, considerando a significância estatística de p-
valor <0,05.
A idade epigenética dos indivíduos foi avaliada a partir dos valores β com o
32
método do relógio epigenético descrito por Horvath , como descrito anteriormente.
Para cumprir o objetivo proposto também foi utilizada a aceleração da idade com as
métricas AADiff e AARes.
5.6.4. Mediação e modelagem de equações estruturais
Para avaliar a relação entre a idade epigenética de dependentes de crack, divididos

nos subgrupos dependentes de crack com “eventos traumáticos” e dependentes de crack
sem “eventos traumáticos”, e se comorbidades psiquiátricas podem atuar como um
mediador nessa relação, fizemos uma análise de mediação utilizando SEM. Para isso,
criamos um do modelo conceitual considerando medidas de idade epigenética como
variável dependente, os subgrupos de dependentes de crack (com “eventos traumáticos”
e sem “eventos traumáticos”) como variável independente e os transtornos psiquiátricos

como variável mediadora dentro de um construto latente.
88
O modelo proposto foi avaliado pela a abordagem de análise dos caminhos ,a
estimativa de parâmetro foi a máxima verossimilhança e os índices de ajuste foram os
mesmos descritos para o Objetivo Específico 1, χ2, razão χ2/df 97, RMSEA 98, SRMR 99,
99,101 102 103
CFI , TLI , AIC e BIC , considerando a significância estatística estabelecida
para cada índice de ajuste selecionado. A análise foi realizada no software R utilizando
o pacote lavaan 104.
Para a comparação de metilação do DNA entre os subgrupos de dependentes de

crack, utilizamos os mesmos métodos descritos no Objetivo Específico 1, buscando por
DMSs (adjP <0,001) e DMRs (FDR <0,05; ∆β ≥ 5%; mínimo quatro CpGs). Genes
diferencialmente metilados relacionados aos DMSs e DMRs foram anotados
funcionalmente no ClueGO (v.2.5.7) 126, plug-in do software Cytoscape (v.3.7.2) 127.
5.8. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo (CEP-FMUSP - CAAE 12539113.3.1001.0065/
Parecer 2.670.911).
6. RESULTADOS
Resultados 34
6.1.1. Características clínicas e sociodemográficas
A amostra final foi composta por 118 dependentes de crack e 98 controles. As

características sociodemográficas são descritas na Tabela 1. Em resumo, casos e
controles são todos do sexo masculino, em sua maioria brancos (casos – 65,3% e
controles – 49,0%) e com média de idade de 31 (±7,0) anos para os casos e 39 (±11,3)
para os controles. Os casos apresentaram nível educacional mais abaixo, com cerca de
63% tendo completado apenas o ensino fundamental, enquanto para o grupo controle,
50% completaram o ensino médio e 21% o ensino superior. Em relação ao estado civil,
a maior parte dos casos se declarou solteiro (67%), enquanto a maior parte dos controles
declarou-se casado legalmente (50%). Casos também declararam fazer uso de outras
drogas e 52% indivíduos do grupo controle declararam fazer uso de álcool.
Tabela 1. Características sociodemográficas da amostra

Casos Controles
p-valor
n = 118 n = 98
Idade, ±DP 31 ±7,0 39 ±11,3 <0,001 ᵃ
Etnia, n (%) Branco 77 (65,.3) 48 (49,0)
0,016 ᵇ
Outros (Negro, Mulato, Pardo ou Asiático) 41 (34,7) 50 (51,0)
Escolaridade, Nunca estudou - 1 (1.0)
n (%) Ensino fundamental incompleto 25 (21.2) 4 (4,1)
Ensino fundamental completo 21 (17,8) 4 (4,1)
Ensino médio incompleto 28 (23,7) 19 (19,4)
Ensino médio completo 16 (13,6) 31 (31,6) <0,001 ᵇ
Nível técnico incompleto 9 (7,6) -
Nível técnico completo 13 (11,0) 7 (7,1)
Nível superior incompleto 5 (4,2) 11 (11,2)
Nível superior completo 1 (0,8) 21 (21,4)
Estado civil, Solteiro 79 (66,9) 30 (30,6)
n (%) Casado legalmente 12 (10,2) 49 (50,0)
<0,001 ᵇ
Amasiado 15 (12,7) 10 (10,2)
Separado/divorciado 12 (10,2) 9 (9,2)
Legenda: – Média; DP – Desvio padrão Continua
ᵃ Teste t-student; ᵇ Teste qui-quadrado.
Resultados 35
Tabela 1 (conclusão). Características sociodemográficas da amostra

Uso de drogas, Cocaína 92 (77,9) - -
n (%) Cannabis 74 (62,7) - -
Cigarro 103 (87,3) 10 (10,2) <0,001 ᵇ
Álcool 98 (83,0) 51 (52,0) <0,001 ᵇ
Outros (Solventes, sedativos) † 32 (27,1) 2 (2,0) <0,001 ᵇ
ᵃ Teste t-student; ᵇ Teste qui-quadrado.
†
Uma descrição detalhada sobre os solventes e sedativos listados no questionário estruturado encontra-
se no Anexo A.
Em relação à religiosidade, a maior parte dos casos declarou frequentar igreja,

templo ou outro encontro religioso „Mais do que uma vez por semana‟ (30%), mas cerca
de 37% declarou dedicar seu tempo à atividades religiosas individuais „Poucas vezes
por mês‟ (Figura 1). Para o grupo controle, 39% dos indivíduos declararam frequentar
igreja, templo ou outro encontro religioso „Algumas vezes por ano‟ e 43% declararam
dedicar seu tempo à atividades religiosas individuais „Mais do que uma vez ao dia‟
(Figura 2). As avaliações religiosidade organizacional e não organizacional
apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos (χ2: 31,55; p-valor:
<0,001 e χ2: 32,30; p-valor: <0,001, respectivamente). O grupo de casos apresentou
média 6 (±2,4) para religiosidade intrínseca, enquanto o grupo controle apresentou
média 13 (±2,8) (p-valor teste U de Mann-Whitney: <0,001).
Figura 1. Avaliação da religiosidade dos dependentes de crack realizada com o instrumento

Duke Religion Index (DUREL) 121. Os dados são apresentados em n (%). A: Religiosidade
organizacional; B: Religiosidade não organizacional.
Resultados 36
Figura 2. Avaliação da religiosidade do grupo controle realizada com o instrumento Duke

Religion Index (DUREL) 121. Os dados são apresentados em n (%). A: Religiosidade
organizacional; B: Religiosidade não organizacional.
A avaliação da qualidade de vida mostrou que enquanto 54% dos casos avaliou a
própria qualidade de vida como „Muito ruim‟ ou „Ruim‟ (29,7% e 24,6%,
respectivamente) (Figura 3), 66% dos controles avaliou sua qualidade de vida como
„Boa‟ (Figura 4) (χ2: 82,53; p-valor: <0,001). Na avaliação de satisfação com a saúde,
ambos os grupos declararam estar „Satisfeitos‟, sendo 34% dos casos e 54% dos
controles (Figuras 3 e 4) (χ2: 50,28; p-valor: <0,001). Em relação à avaliação dos
domínios de qualidade de vida, o domínio „Físico‟ se destacou com maior média para os
casos (16 ± 2,8) e o domínio „Meio ambiente‟ com menor média para o grupo controle
(14 ± 2,3), mas apenas os domínios „Psicológico‟ e „Relações sociais‟ apresentaram
diferença significante entre os grupos (Tabela 2).
Figura 3. Avaliação de qualidade de vida dos dependentes de crack realizada com o

instrumento World Health Organization Quality of Life-Brief instrument (WHOQL-BRIEF) 122.
Os dados são apresentados em n (%). A: Avaliação de qualidade de vida; B: Satisfação com a
saúde.
Resultados 37
Figura 4. Avaliação de qualidade de vida do grupo controle realizada com o instrumento World
Health Organization Quality of Life-Brief instrument (WHOQL-BRIEF) 122. Os dados são
apresentados em n (%). A: Avaliação de qualidade de vida; B: Satisfação com a saúde.
Tabela 2. Avaliação de Domínios de qualidade de vida (WHOQL-BRIEF) ᵃ
Casos Controles
p-valor ᵇ
Domínio ±DP Md Min Max ±DP Md Min Max
Físico 16 ± 2,8 17 6 20 16 ± 2,3 16 9 20 0,445
Psicológico 14 ± 2,8 15 6 19 15 ± 1,8 15 8 20 0,019
Relações Sociais 14 ± 3,3 15 4 20 16 ± 2,8 16 7 20 <0,001
Meio Ambiente 14 ± 2,6 14 6 20 14 ± 2,3 13 4 18 0,122
Legenda: – Média; DP – Desvio padrão; Md – Mediana; Min – Valor mínimo; Max – Valor máximo.
ᵃ WHOQL-BRIEF - World Health Organization Quality of Life-Brief instrument
ᵇ Teste U de Mann-Whitney
6.1.2. Avaliação da idade metilômica e aceleração de idade
A análise do relógio epigenético revelou que dependentes de crack apresentaram

idade metilômica significativamente maior do que o grupo controle (p-valor: <0,001)
(Figura 5B). Casos apresentaram média de idade cronológica de 31 (±7,0) anos e
tiveram um aumento de 6 anos para idade metilômica (37 ±6,7), enquanto o grupo
controle apresentou aumento de apenas 2 anos, com 39 (±11,3) de idade cronológica e
41 (±9,0) de idade metilômica. No mesmo sentido, a proporção de indivíduos que
apresentou idade metilômica mais velha do que a cronológica foi de 92% para o grupo
de casos e 61% para o grupo controle (χ2: 30,5; p-valor: <0,001). Esse resultado é
evidenciado pela aceleração de idade (AA), no qual observamos que os casos
apresentaram AADiff maior do que o grupo controle (p-valor: <0,001) (Figura 5C). O
Resultados 38
grupo de casos também apresentou envelhecimento maior em relação à AARes, embora

nenhuma diferença estatística tenha sido observada (p-valor: 0,180) (Figura 5D).
Figura 5. Avaliação da idade epigenética entre dependentes de crack e controles. A: Idade

cronológica.; B: Idade metilômica; C: Age acceleration Difference; D: Age acceleration
Residuals.
6.1.3. Análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais
O primeiro passo para a avaliação da relação dos fatores ambientais como

mediador na idade epigenética dos dependentes de crack foi a construção dos modelos
conceituais. A construção dos modelos foi baseada tanto em premissas da literatura
quanto nos resultados obtidos na avaliação da idade epigenética. Como citado para o
objetivo proposto, definimos os grupos caso e controle como variável independente e
AADiff como variável dependente. Esse primeiro modelo foi utilizado para avaliarmos
o efeito total (c) entre essas variáveis antes da inclusão da variável mediadora (Figura
6A).
No segundo modelo conceitual, a proposta foi incluir a variável mediadora para
avaliar como esta poderia estar influenciando no efeito da variável independente sobre a
Resultados 39
variável dependente. Para isso, propusemos a variável mediadora como uma variável
latente, englobando os fatores ambientais já relacionados na literatura, e disponíveis na
nossa amostra, com a dependência de crack. Primeiro, criamos variáveis latentes para
cada dimensão de dados da nossa amostra: „Sociodemográfico‟ – incluindo etnia,
escolaridade e estado civil; „Drogas‟ – incluindo o uso de álcool, cigarro e outras drogas
(Solventes e sedativos); „WHOQL-BRIEF‟ – incluindo a avaliação de qualidade de
vida, satisfação com a saúde e os quatro domínios de qualidade de vida (Físico,
psicológico, relações sociais e meio ambiente. Essas três variáveis latentes integraram a
variável latente principal „Fatores ambientais‟. Na escala DUREL é indicado que as
dimensões de religiosidade não sejam avaliadas em conjunto, como um escore total,
121
mas analisadas separadamente . Assim, relacionamos cada dimensão (religiosidade
organizacional, religiosidade não organizacional e religiosidade intrínseca) diretamente
com a variável latente principal „Fatores ambientais‟. A variável latente „Fatores
ambientais‟ foi incluída no modelo conceitual como variável mediadora para avaliarmos
os efeitos indiretos (a - impacto da variável independente na variável mediadora; b -
impacto da variável mediadora na variável dependente) e efeito direto (c´ - efeito causal
direto da variável independente sobre a variável dependente controlado pela variável
mediadora) (Figura 6B).
Um terceiro modelo conceitual foi proposto, também incluindo a variável
mediadora como uma variável latente. Mas, para esse modelo, ao invés de utilizarmos
diferentes variáveis latentes para cada dimensão de dados da nossa amostra,
relacionamos todos os fatores ambientais diretamente com a variável latente principal
„Fatores ambientais‟. Como citado para o segundo modelo, essa variável latente
„Fatores ambientais‟ foi incluída no modelo conceitual como variável mediadora para
avaliarmos seus efeitos direto e indiretos (Figura 6C).
Visto que AADiff é a diferença entre a idade metilômica e a idade cronológica dos
indivíduos, a variável idade não foi incluída no modelo, pois esta estaria sendo medida
duas vezes na análise.
Resultados 40
Figura 6. Modelos conceituais propostos para a análise de mediação utilizando modelagem de

equações estruturais. A: Modelo conceitual 1 - Avaliação do efeito total (c) do uso de crack na
AADiff; B: Modelo conceitual 2 - Construção da variável latente „Fatores ambientais‟ como
mediadora. Avaliação dos efeitos indiretos (a - impacto do uso de crack na variável mediadora; b -
impacto da variável mediadora na AADiff) e efeito direto (c´ - efeito causal do uso de crack na
AADiff controlado pela variável mediadora); C: Modelo conceitual 3 - Construção da variável
latente „Fatores ambientais‟ como mediadora. Avaliação dos efeitos indiretos (a e b) e efeito direto
(c´); ε: Erro padrão.
Resultados 41
Na avaliação do modelo conceitual 1, observamos um coeficiente de associação de

efeito total (c) de 0,31 do uso de crack na AADiff (p-valor: 0,013) (Figura 7).
Figura 7. Avaliação do modelo conceitual 1 com efeito total (c) de 0,31 do uso de crack na
AADiff.
Na avaliação inicial do modelo conceitual 2, o modelo proposto não se adequou ao

nosso conjunto de dados, considerando os índices de ajuste do modelo (dados não
mostrados). Assim, para a composição do modelo final, readequamos o modelo
conceitual 2 fazendo alterações nas relações entre variáveis observadas e variáveis
latentes e definimos as covariâncias entre as variáveis utilizadas na composição do
modelo através dos índices de modificação (Figura 8). As variáveis escolaridade e
estado civil foram retiradas do modelo, enquanto as variáveis uso de álcool, cigarro e
outras drogas foram incorporadas na variável latente „Sociodemográfico‟. E, a variável
avaliação de qualidade de vida foi retirada do construto latente „WHOQL-BRIEF‟.
Para uma melhor visualização do modelo final, as covariâncias são apresentadas
separadamente na figura 9.
O modelo final se ajustou adequadamente aos dados da amostra de acordo com os
índices de ajuste (Tabela 3). Podemos observar que o p-valor do χ2 não atendeu ao valor
de referência, enquanto todos os outros índices de ajuste satisfizeram às suas
referências. Isso pode ser explicado pelo fato que o valor de χ2 é diretamente
influenciado pelo número amostral e complexidade do modelo. Assim, tendo em vista o
modelo complexo proposto, o ajuste do p-valor do χ2 poderia ser melhorado com um
número amostral maior.
Resultados 42
Figura 8. Modelo final apresentado para o modelo conceitual 2. Para cada caminho são apresentados os coeficientes de associação e o p-valor
correspondente (entre parênteses). a: Efeito indireto do uso de crack na variável mediadora latente „Fatores ambientais‟; b: Efeito indireto da variável
mediadora latente „Fatores ambientais‟ na AADiff; c´: Efeito direto do uso de crack na AADiff mediado pela variável latente „Fatores ambientais‟. *:
Baseline na análise de associação.
Resultados 43
Figura 9. Covariâncias entre as variáveis utilizadas na composição do modelo final apresentado para o modelo conceitual 2.
Resultados 44
Tabela 3. Ìndices de ajuste da análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais

do modelo final apresentado para o modelo conceitual 2
Índices χ2 (p-valor) df χ2/df RMSEA (ICᵃ) SRMR CFI TLI AIC BIC
112.14 0,06
Modelo final 2 56 2,0 0,08 0,95 0,92 9541.45 9706.84
(<0,001) (0,5 - 0,9)
Nota. Valores de referência: χ2 - p-valor >0,05; χ2/df - entre 0 e 2: bom; RMSEA - entre 0,05 e 0,08:
adequado; SRMR - <0,10: aceitável; CFI - ≥0,95; TLI - ≥0,90.
Legenda: df - graus de liberdade; RMSEA - Root mean square error of approximation; SRMR -
Standardised root mean square residual; CFI - Comparative fit index; TLI - Tucker Lewis index; AIC -
Akaike information criterion; BIC - Bayesian Information Criterion.
ᵃ IC: Intervalo de confiança de 90%
Quanto à avaliação da mediação, observamos um coeficiente de associação de

efeito indireto do uso de crack na variável mediadora latente „Fatores ambientais‟ (a) de
-0,59 (p-valor: 0,054) e coeficiente de efeito indireto da variável mediadora latente
„Fatores ambientais‟ na AADiff (b) de -0,08 (p-valor: 0,034). O efeito causal direto (c´)
do uso de crack na AADiff mediado pela variável latente „Fatores ambientais‟
apresentou um coeficiente de associação de 0,26 (p-valor: <0,001). No entanto, mesmo
com o efeito direto (c´) tendo apresentado um coeficiente estatisticamente significativo,
sugerindo um efeito de mediação parcial, de acordo com o método utilizado de análise
dos caminhos, quando um dos caminhos de efeito indireto (a ou b) ou efeito direto (c´)
não é significativo (p-valor <0,05), deve-se concluir que não existe um efeito de
mediação 88,131.
Na avaliação do modelo conceitual 3, no qual a variável latente principal „Fatores
ambientais‟ foi composta por todos os fatores ambientais, sem o uso de outras variáveis
latentes, observamos que o modelo proposto também não se adequou ao nosso conjunto
de dados (dados não mostrados). Readequamos o modelo fazendo alterações nas
variáveis observadas e definimos as covariâncias entre as variáveis utilizadas na
composição do modelo através dos índices de modificação (Figura 10).
Resultados 45
Figura 10. Modelo final apresentado para o modelo conceitual 3. Para cada caminho são apresentados os coeficientes de associação e o p-valor
correspondente (entre parênteses). a: Efeito indireto do uso de crack na variável mediadora latente „Fatores ambientais‟; b: Efeito indireto da variável
mediadora latente „Fatores ambientais‟ na AADiff; c´: Efeito direto do uso de crack na AADiff mediado pela variável latente „Fatores ambientais‟. Setas na
cor „azul‟ indicam a covariância entre as variáveis. *: Baseline na análise de associação.
Resultados 46
Para o modelo final 3 foram retiradas as variáveis religiosidade organizacional e

não organizacional, meio ambiente e avaliação da qualidade de vida. O modelo se
ajustou adequadamente aos dados da amostra de acordo com os índices de ajuste
(Tabela 4). Ao contrário do que foi observado no modelo final 2, o p-valor do χ2 para o
modelo final 3 satisfez sua referência. Considerando que ambos os modelos utilizaram o
mesmo número amostral, esse resultado sugere a influência da complexidade do modelo
na avaliação desse índice de ajuste. Outro ponto a ser notado refere-se aos demais
índices de ajuste observados. Enquanto o modelo final 2 apresentou alguns índices de
ajuste considerados como „adequados‟ (exemplo, RMSEA entre 0,05 e 0,08), o modelo
final 3 atingiu os pontos máximos de seus valores de referência. Usando como exemplo
o RMSEA, o modelo final 3 foi considerado como bom (RMSEA ≤0,05) e seu intervalo
de confiança indica um ajuste exato do modelo aos dados da amostra. O índice de ajuste
SRMR também apresentou diferença, sendo considerado como adequado para o modelo
final 2 (<0,10) e bom para o modelo final 3 (<0,05).
Tabela 4. Ìndices de ajuste da análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais

do modelo final apresentado para o modelo conceitual 3
Índices χ2 (p-valor) df χ2/df RMSEA (ICᵃ) SRMR CFI TLI AIC BIC
54.83 0,02
Modelo final 3 51 1,0 0,05 0,99 0,99 7905.72 8037.36
(0,331) (0 - 0,5)
Nota. Valores de referência: χ2 - p-valor >0,05; χ2/df - entre 0 e 2: bom; RMSEA - ≤0,05: bom; SRMR -
<0,05: bom; CFI - ≥0,95; TLI - ≥0,90.
Legenda: df - graus de liberdade; RMSEA - Root mean square error of approximation; SRMR -
Standardised root mean square residual; CFI - Comparative fit index; TLI - Tucker Lewis index; AIC -
Akaike information criterion; BIC - Bayesian Information Criterion.
ᵃ IC: Intervalo de confiança de 90%
Em relação à avaliação de mediação, o efeito indireto do uso de crack na variável

mediadora latente „Fatores ambientais‟ (a) obteve coeficiente de associação de -0, 59 (p-
valor: <0,001). Observamos que desde a avaliação inicial do modelo conceitual
proposto até a definição do modelo final 3, os caminhos indireto „b‟, referente ao efeito
da variável mediadora latente „Fatores ambientais‟ na AADiff, e direto „c´‟, referente ao
efeito do uso de crack na AADiff mediado pela variável latente „Fatores ambientais‟,
não demonstraram significância estatística, mesmo após diversas readequações do
Resultados 47
modelo conceitual. Os coeficientes de associação dos efeitos indireto (b) e direto (c´)
foram de -0,48 (p-valor: 0,165) e -0,14 (p-valor: 0,667), respectivamente. Esse resultado
sugere que o uso de variáveis latentes englobando diferentes dimensões de dados, como
utilizado no modelo final 2, pode dimensionar os efeitos de associação entre as variáveis
observadas. Assim, apesar de o modelo final 3 atender a todos os índices de ajuste
adequadamente, resultando em um ajuste exato do modelo proposto aos dados da
amostra, não foi possível estabelecer uma relação dos fatores ambientais como
mediador da dependência de crack na aceleração da idade metilômica. Finalmente, na
comparação final dos dois modelos apresentados, o modelo mais plausível, de acordo
com os índices de parcimônia AIC e BIC, é o modelo final 3.
6.2.1. Sítios e regiões diferencialmente metilados em dependentes de crack
Na análise de metilação diferencial, para controlar os efeitos dos fatores

ambientais, incluímos as variáveis clínicas e sociodemográficas como co-variáveis no
modelo linear bayesiano de identificação de sítios diferencialmente metilados (DMSs) e
regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre dependentes de crack e controles.
Foram identificados 597 (DMSs) (adjP <0,001) (Figura 11), relacionados à 385 genes.
Desses DMSs, 262 estão hipometilados e 335 hipermetilados (casos em relação a
controles) (Figura 12). A lista completa de DMSs é apresentada no Anexo B. Na tabela
5 apresentamos os DMSs com maior diferença de metilação (∆β ≥ 15%).
Resultados 48
Figura 11. Manhattan plot mostrando a distribuição dos sítios de metilação entre dependentes
de crack e controles. No eixo Y está representado o –log10 do p-valor e no eixo X os
cromossomos. A linha vermelha representa o p-valor ajustado <0,001 para identificação dos
sítios diferencialmente metilados.
Figura 12. Volcano plot mostrando a distribuição dos sítios de metilação entre dependentes de
crack e controles em relação ao status de metilação - azul: Hipometilado; rosa: Hipermetilado.
No eixo Y está representado o –log10 do p-valor e no eixo X os valores ∆β. A linha vermelha
representa o p-valor ajustado <0,001 para identificação dos sítios diferencialmente metilados.
Resultados 49
Tabela 5. Sítios diferencialmente metilados (DMSs) com maior diferença de metilação entre
dependentes de crack e controles
Relação ao gene e
Probe ID adjP Δβ Coord. genômica (hg19) Gene
ilha CpG
cg03382291 5.34E-04 -0.192 chr5:147580954 SPINK6 TSS1500 - open sea
cg25747320 4.70E-04 -0.183 chr14:31043362 G2E3 5'UTR - open sea
cg08267336 7.24E-04 -0.176 chr1:167298149 POU2F1 TSS200 - open sea
cg23577610 3.73E-04 -0.171 chr1:172078666 DNM3 Corpo do gene - open sea
cg00816480 5.03E-04 -0.167 chr12:70711895 CNOT2 Corpo do gene - open sea
cg05601847 9.95E-04 -0.164 chr4:83826691 THAP9 Corpo do gene - open sea
cg04980099 2.23E-04 -0.157 chr15:63836733 USP3 Corpo do gene - open sea
cg22348755 9.33E-04 -0.151 chr2:191991246 STAT4 Corpo do gene - open sea
cg18929316 5.36E-04 0.150 chr17:46176848 CBX1 5'UTR - shore
cg07703331 6.29E-04 0.155 chr13:21521930 LINC00367 Corpo do gene - shore
cg12839200 2.84E-04 0.156 chr11:71789642 NUMA1 Corpo do gene - shore
cg14818176 8.35E-04 0.159 chr17:73148480 HN1 5'UTR - shore
cg24247939 6.64E-04 0.163 chr2:61292081 KIAA1841 TSS1500 - shore
cg04800864 5.14E-04 0.175 chr22:43541019 IGR IGR - shore
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adjP - p-valor ajustado; Δβ - delta beta; chr -
Cromossomo; IGR – Região intergênica.
Em relação à distribuição genômica, os DMSs então distribuídos em regiões

promotoras (TSS200, TSS1500, 5' UTR e primeiro éxon), corpo dos genes, 3' UTR e
regiões intergênicas (Figura 13). E, em relação à distribuição de acordo com ilhas CpG,
em ilhas, shores, shelves e regiões open sea (Figura 14). Podemos observar que cerca de
67% dos DMSs estão distribuídos no corpo de genes e regiões intergênicas (36% e 31%,
respectivamente), com maior proporção em regiões open sea, que por sua vez,
representam 63,5% das DMSs.
A comparação entre casos e controles revelou 15 regiões diferencialmente
metiladas (DMRs) (FDR <0,05; ∆β ≥ 5%) com, no mínimo, quatro CpGs (Figura 15).
Em relação à distribuição das DMRs, observamos que 60% estão distribuídas em
regiões promotoras nas margens das ilhas CpG (shores) (30%) e em regiões open sea
(30%) (Tabela 6).
Resultados 50
Figura 13. Distribuição genômica dos 597 sítios diferencialmente metilados (DMSs) (adjP
<0,001). Os dados são apresentados em proporção (n) em relação ao status de metilação.
Figura 14. Distribuição dos 597 sítios diferencialmente metilados (DMSs) (adjP <0,001) em
relação à ilhas CpG. Os dados são apresentados em proporção (n) em relação ao status de
metilação.
Resultados 51
Figura 15. Representação gráfica das 15 regiões diferencialmente metiladas (DMRs) (FDR
<0,05; ∆β ≥ 5%) entre dependentes de crack (linha vermelha) e controles (linha preta).
Resultados 52
Tabela 6. Regiões diferencialmente metiladas (DMRs) entre dependentes de crack e controles

Relação à
DMR FDR ∆β Coord. genômica (hg19) Gene Relação ao gene CpGs
ilha CpG
DMR_1 6.29E-09 -0.077 chr5:133703519-133703889 CDKL3 TSS1500; 5'UTR shore cg00946942; cg10592139; cg12960467; cg23304085
TSS200; 5'UTR;
cg03884592; cg05570491; cg11769885; cg14996491;
DMR_2 1.14E-04 -0.074 chr1:42384284-42384647 HIVEP3 1stExon; Corpo shore
cg15644324; cg15937073; cg23762517; cg26038582
do gene
DMR_3 1.47E-09 -0.068 chr13:67802655-67802884 PCDH9 5'UTR; 1stExon shore cg05308107; cg14193434; cg26811832; cg27286120
DMR_4 2.29E-05 -0.052 chr12:1025529-1025772 RAD52 Corpo do gene open sea cg06357748; cg14602222; cg16884061; cg26282236
DMR_5 1.26E-05 -0.050 chr6:15505345-15506085 JARID2 Corpo do gene open sea cg03173502; cg14058851; cg23850913; cg24408769
TMEM85; TSS200; cg05180717; cg12949483; cg14433151; cg14560311;
DMR_6 2.72E-05 0.050 chr15:34516488-34517239 open sea
EMC4 TSS1500 cg14847483; cg22549420; cg25494600
DMR_7 3.19E-03 0.051 chr10:29698368-29698462 LOC387647 TSS200 ilha cg03496709; cg14970695; cg16162391; cg19109608
TSS200; cg08890067; cg10937408; cg14587335; cg16329014;
DMR_8 1.67E-04 0.051 chr17:77478569-77478927 HRNBP3 open sea
TSS1500 cg20214871
cg02962952; cg05501509; cg05609335; cg13214295;
DMR_9 2.49E-03 0.052 chr17:75789279-75789529 IGR - ilha; shore
cg22243109
DMR_10 6.33E-03 0.055 chr18:57566144-57566328 PMAIP1 TSS1500 shore cg11957475; cg14685305; cg22549408; cg23084705
DMR_11 1.74E-03 0.056 chr14:56777451-56777525 IGR - open sea cg04067042; cg08443549; cg20474450; cg21556470
TSS200; cg00485194; cg00687135; cg02920129; cg08023500;

DMR_12 1.29E-08 0.057 chr3:21792195-21793157 ZNF385D TSS1500; 5'UTR; open sea cg14550518; cg15160624; cg17024919; cg18267381;
1stExon cg18503679; cg21436456; cg26077378
TSS200;
DMR_13 3.79E-03 0.058 chr16:81254169-81254407 PKD1L2 open sea cg00674807; cg03406106; cg07091758; cg20109624
TSS1500
C13orf29;
DMR_14 4.98E-05 0.063 chr13:111521981-111522314 Corpo do gene open sea cg03757805; cg04513422; cg14947070; cg16032841
LINC00346
DMR_15 9.40E-04 0.082 chr4:187125958-187126139 CYP4V2 Corpo do gene open sea cg02012338; cg09526685; cg10309005; cg23442198
Legenda: FDR - False discovery rate; Δβ - delta beta; chr - Cromossomo; IGR – Região intergênica.
Resultados 53
Para a identificação de vias biológicas na comparação entre casos e controles, os

genes diferencialmente metilados relacionados aos DMSs e DMRs foram anotados
126 128
funcionalmente no ClueGO com o banco de dados Reactome Para os genes
relacionados ao DMSs identificamos vias biológicas relacionadas às vias de sinalização
EGFR (Epidermal growth factor receptor), NCAM (Neural cell adhesion molecule) e
FCERI (Fc-epsilon receptors), regulação transcricional pela proteína TP53 (tumor
protein p53), sinalização pelo receptor MET (também conhecido por HGFR -
hepatocyte growth factor receptor) e metabolismo de proteínas. Também foram
observadas vias de organização de cromatina, inclusive por processos protéicos como a
„sumoilação‟ (SUMO - Small Ubiquitin-like Modifier) (Figura 16).
Em relação à processos biológicos, identificamos vias relacionadas principalmente
à sinalização por ERBB (ou EGFR), I-κB (Inhibitory kappa B) e NF-κB (Nuclear
Factor kappa B), regulação da atividade de PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase),
organização da heterocromatina, regulação positiva de expressão gênica e silenciamento
gênico por RNA (ácido ribonucleico), via de sinalização de apoptose em resposta à dano
ao DNA e dano ao DNA mediado por sinalização transducional da proteína P53,
reorganização do citoesqueleto de actina e organização pós sináptica (Figuras 17 e 18).
Não foram identificados processos e vias biológicas para os genes diferencialmente
metilados relacionados às DMRs.
Resultados 54
Figura 16. Vias biológicas identificadas para os genes relacionados aos sítios diferencialmente metilados (DMSs). A: Vias
biológicas; B: Vias biológicas não redundantes e porcentagem de genes por via.
Resultados 55
Figura 17. Processos biológicos identificados para os genes relacionados aos sítios diferencialmente metilados (DMSs).
Resultados 56
Figura 18. Processos biológicos não redundantes identificados para os genes relacionados aos sítios diferencialmente metilados (DMSs) e porcentagem de
genes por processo.
Resultados 57
6.3.1. Características dos subgrupos de dependentes de crack
O grupo de 118 dependentes de crack foi dividido em dois subgrupos, de acordo

com o instrumento ETISR-SF. A escala resultante desse instrumento resulta em um
intervalo de 0 (indivíduos não foram submetidos a nenhum evento traumático) à 1
(indivíduos foram submetidos a todos os eventos traumáticos avaliados). Para o
presente estudo, das 436 amostras do estudo principal (seção „5. Material e métodos –
5.5.1. Casos), além dos critérios de seleção já mencionados, consideramos a escala de
eventos traumáticos e estressores. Para selecionar os indivíduos que iam compor os
subgrupos, utilizamos os percentis 25 e 75 com o intuito de selecionar os valores
extremos da escala. Assim, o subgrupo sem “eventos traumáticos” apresentou um
pontuação de eventos traumáticos no intervalo de 1 à 14 (11 ±7,0; md= 12), enquanto o
subgrupo com “eventos traumáticos” apresentou pontuação no intervalo de 20 à 26 (22
±1,6; md=22) (Figura 19).
Figura 19. Boxplot mostrando a pontuação final da escala ETISR-SF para os subgrupos de
dependentes de crack com e sem “eventos traumáticos”. *: Teste U de Mann-Whitney.
Resultados 58
Em relação à avaliação de transtornos psiquiátricos, considerando que depressão e

ansiedade são as comorbidades psiquiátricas com maior prevalência no uso/abuso de
crack, avaliamos separadamente essas variáveis e, se o indivíduo apresentava mais
algum transtorno de com o MINI, consideramos essa comorbidade como „outros
transtornos‟. Podemos observar que indivíduos do subgrupo sem “eventos traumáticos”
apresentou mais comorbidade com transtornos psiquiátricos (Tabela 7).
Tabela 7. Características dos subgrupos de dependentes de crack

Com ‘eventos Sem ‘eventos
traumáticos’ traumáticos’ p-valor
n = 59 n = 59
Idade, ±DP 32 ±7,2 31 ±6,8 0,413 ᵃ
Transtornos Depressão 19 (32,2) 27 (45,8) 0,131 ᵇ

Psiquiátricos, n (%) Ansiedade 11 (18,6) 19 (32,2) 0,091 ᵇ
Outros 32 (54,2) 56 (94,9) <0,001 ᵇ
ᵃ t-student; ᵇ Teste qui-quadrado.
6.3.2. Avaliação da idade metilômica e aceleração de idade
Na análise do relógio epigenético observamos que, assim como na idade

cronológica, o grupo com “eventos traumáticos” é um ano mais velho (32 ±7,2) do que
o grupo sem “eventos traumáticos” (31 ±6,7) na idade metilômica (38 ±6,6 e 36 ±6,7,
respectivamente) (p-valor: 0,180) (Figura 20). Esse resultado está em consonância com
a AA, no qual observamos AADiff maior no grupo com “eventos traumáticos”, embora
nenhuma diferença estatística ter sido observada (p-valor: 0,099) (Figura 20C). Apesar
de também não apresentar diferença estatística (p-valor: 0,051), podemos observar que
o grupo sem “eventos traumáticos” apresentou AARes negativa (Figura 20D).
Resultados 59
Figura 20. Avaliação da idade epigenética entre os subgrupos de dependentes de crack com
“eventos traumáticos” e sem “eventos traumáticos”. A: Idade cronológica.; B: Idade
metilômica; C: Age acceleration Difference; D: Age acceleration Residuals.
6.3.3. Análise de mediação utilizando modelagem de equações estruturais
Na construção do modelo conceitual para a avaliação da relação entre a idade

epigenética dos subgrupos de dependentes de crack, com “eventos traumáticos” e sem
“eventos traumáticos”, definimos inicialmente essas variáveis como dependente e
independente, respectivamente. Como não foi observada diferença estatística em ambos
AADiff e AARes, definimos dois modelos conceituais para avaliar o efeito total (c)
entre essas duas medidas e a variável independente (Figuras 21A e 21B).
Para avaliar comorbidades psiquiátricas como mediador nessa relação, criamos o
modelos conceituais, com as variáveis depressão, ansiedade e outros transtornos como
componentes de uma variável latente, que vamos chamar de „Transtornos psiquiátricos‟.
Com isso foi possível avaliar os efeitos indiretos (a - impacto da variável independente
na variável mediadora; b - impacto da variável mediadora na variável dependente) e
efeito direto (c´ - efeito causal direto da variável independente sobre a variável
dependente controlado pela variável mediadora) (Figuras 21C e 21D).
Resultados 60
Figura 21. Modelos conceituais propostos para a análise de mediação utilizando modelagem de
equações estruturais. A: Modelo conceitual 4 - Avaliação do efeito total (c) de eventos
traumáticos e estressores na AADiff; B: Modelo conceitual 5 - Avaliação do efeito total (c) de
eventos traumáticos e estressores na AARes; C: Modelo conceitual 6 - Construção da variável
latente „Transtornos psiquiátricos‟ como mediadora. Avaliação dos efeitos indiretos (a - eventos
traumáticos e estressores na variável mediadora; b - impacto da variável mediadora na AADiff)
e efeito direto (c´ - efeito causal de eventos traumáticos e estressores na AADiff controlado pela
variável mediadora); D: Modelo conceitual 7 - Construção da variável latente „Transtornos
psiquiátricos‟ como mediadora. Avaliação dos efeitos de eventos traumáticos e estressores na
variável mediadora (a), impacto da variável mediadora na AARes (b) e efeito causal de eventos
traumáticos e estressores na AARes controlado pela variável mediadora (c´). ε: Erro padrão.
Na avaliação do modelo final 4, observamos um coeficiente de associação de efeito

total (c) de 0,13 de eventos traumáticos e estressores de dependentes de crack na
AADiff, mas sem significância estatística (p-valor: 0,170) (Figura 22A). O mesmo foi
observado para o modelo final 5, no qual o coeficiente de efeito total foi de 0,17, mas
não significativo (p-valor: 0,055) (Figura 22B).
Resultados 61
Figura 22. Modelos finais apresentados para os modelos conceituais 4 e 5. A: Modelo final 4
com efeito total (c) de eventos traumáticos e estressores na AADiff; B: Modelo final 5 com
efeito total (c) de eventos traumáticos e estressores na AARes.
O primeiro pressuposto para a análise mediação é que a associação entre as

variáveis dependente e independente (efeito total „c‟) seja significativo, estabelecendo
que existe um efeito que pode ser estimado. Como visto, esse pressuposto não foi
cumprido e, consequentemente, não foi possível dar continuidade à avaliação das
relações entre a variável latente mediadora „Transtornos psiquiátricos‟, as medidas
AADiff e AARes e os subgrupos de dependentes de crack com e sem “eventos
traumáticos”.
6.4.1. Análise de metilação diferencial
Na análise de metilação diferencial, incluímos como co-variáveis no modelo linear

bayesiano, além das variáveis clínicas e sociodemográficas, os transtornos psiquiátricos,
buscando controlar os efeitos dos fatores ambientais para a identificação de sítios
(DMSs) e regiões diferencialmente metiladas (DMRs). No entanto, utilizando os
mesmos parâmetros que foram utilizados na análise entre dependentes de crack e
controles, não identificamos DMSs (adjP <0,001) e DMRs (FDR <0,05; ∆β ≥ 5%) na
comparação entre dependentes de crack com e sem “eventos traumáticos”.
7. DISCUSSÃO
Discussão 63
A epigenética é um mecanismo dinâmico, capaz de modular a expressão gênica ao

132
longo da vida em resposta a exposições ambientais . Diferentes abordagens
epigenéticas têm sido utilizadas buscando elucidar a influência de fatores genéticos e
ambientais em doenças complexas, como a dependência química. Mecanismos como a
metilação do DNA estão associados com a plasticidade sináptica e formação da
memória, bem como com respostas comportamentais à drogas de abuso 133. No presente
estudo, avaliamos não somente a relação entre a dependência de crack e a metilação do
DNA, mas também como essa relação pode afetar a idade epigenética dos indivíduos.
Os resultados observados serão discutidos a seguir.
Estudos descrevendo o perfil do usuário de crack são realizados no Brasil há

muitos anos, englobando diferentes populações, como crianças e adolescentes,
estudantes universitários, pessoas em situação de rua, em ambientes de tratamento, entre
outros, e em todas as regiões do país. Em sua maioria, os estudos descrevem o perfil do
usuário de crack como homens com 30 anos ou menos, solteiros, com baixa
134,135
escolaridade, desempregados e usuários de múltiplas drogas . O último
levantamento epidemiológico nacional, avaliando cenas de uso do crack, conhecidas
como „cracolândias‟, foi de acordo com o mesmo perfil relatado nos estudos anteriores
57
. É importante notar que uma característica divergente entre os estudos está
relacionada à etnia dos usuários de crack. Enquanto alguns estudos relataram um perfil
de usuários de etnia branca, como no nosso caso, outros descreveram os indivíduos em
sua maioria de etnia „não branca‟ (englobando pretos, pardos e mestiços) 57,136,137.
As características da amostra de dependentes de crack utilizada no nosso estudo
são condizentes com o perfil de usuários relatado nesses estudos, podendo ser
considerada como representativa dessa população. Apesar de a nossa amostra ser
proveniente de um estudo com usuários de crack internados para tratamento em
comunidades terapêuticas, as características da amostra também são similares aos perfis
descritos para dependentes de crack em tratamento, como em comunidades terapêuticas
136,138,139
, hospitais psiquiátricos e serviços ambulatoriais 66,137,140-143.
Algumas características relacionadas ao perfil do usuário de crack, como fatores
socioeconômicos, baixa escolaridade e uso de outras substâncias, também têm sido
Discussão 64
65
associadas como um fator de risco associado ao uso do crack . Outras características,
como a religiosidade, espiritualidade e baixa qualidade de vida dos indivíduos, também
têm sido cada vez mais relatadas como tendo uma forte relação com o uso/abuso de
78,79
crack . Em relação à religiosidade, foi demonstrado que usuários que foram mais
144
frequentemente à serviços religiosos apresentavam menos dias de uso de crack e
usuários com maior grau de compromisso quanto à sua religiosidade (religiosidade
intrínseca) apresentavam desejo menos intenso pelo uso da droga 79.
No presente estudo, os dependentes de crack apresentaram religiosidade intrínseca
mais baixa do que o grupo controle. Quanto à dedicação do seu tempo a atividades
religiosas individuais, a maioria dos casos relatou dedicar-se a essas atividades poucas
vezes por mês. Os dependentes de crack relataram ir mais frequentemente à igreja,
templo ou outro encontro religioso comparados ao grupo controle. No entanto, deve-se
ressaltar que o tratamento em comunidades terapêuticas possui um forte componente
religioso e espiritual, sendo os encontros religiosos parte importante do tratamento, o
79
que pode superestimar esse último dado . Um estudo avaliando a relação entre a
espiritualidade de usuários de drogas e as taxas de remissão e recaída no tratamento para
a dependência demonstrou que, para drogas como cocaína, heroína, álcool e maconha,
usuários com baixa espiritualidade têm maiores taxas de recaída enquanto usuários com
alta espiritualidade têm maiores taxas de remissão. No entanto, esses padrões não foram
observados para o uso de crack 145.
A religiosidade de dependentes de crack também foi relacionada com a qualidade
de vida desses indivíduos. Usuários com maior grau de compromisso quanto à sua
religiosidade apresentaram melhor qualidade de vida nos domínios físico, psicológico,
social e ambiente de vida 79. Por outro lado, estudos tem demonstrado que fatores como
sexo, idade, estado civil, escolaridade e nível socioeconômico podem interferir
negativamente na qualidade de vida dos usuários de crack 146. Assim como para o nosso
estudo, no qual observamos que dependentes de crack relataram sua qualidade de vida
como „ruim‟ através do instrumento WHOQOL-BREF, outros estudos utilizando esse
instrumento observaram o mesmo desfecho, com escores menores da qualidade de vida
para os usuários de crack 141,143,146. O instrumento WHOQOL-BREF avalia a qualidade
de vida geral, com a percepção do indivíduo sobre a sua posição na vida no contexto da
cultura e dos sistemas de valores em que vive e em relação aos seus objetivos,
122
expectativas, padrões e preocupações . Outro instrumento utilizado na literatura para
Discussão 65
a avaliação da qualidade de vida de usuários de crack é o „Questionário de Qualidade de

Vida SF-36‟ (Short Form Health Survey 36), que avalia, de forma geral, a qualidade de
vida relacionada à saúde, com a a percepção do indivíduo sobre os efeitos de uma
147
doença nas dimensões física, mental e social de seu bem-estar . Utilizando esse
instrumento, Falck e cols.148 observaram associações negativas entre a frequência de uso
de crack todas as subescalas do SF-36 (capacidade funcional, estado geral de saúde,
vitalidade, aspectos sociais, aspectos emocionais, saúde mental, componente físico,
componente mental), exceto para aspectos físicos. Narvaez e cols.5 observaram que
usuários de crack apresentaram escores de qualidade de vida inferiores aos da população
em geral, correspondendo a piores condições de saúde geral, física, emocional e mental.
É interessante notar que 34% dos dependentes de crack da nossa amostra relataram estar
satisfeitos quanto à sua saúde, o que, quando comparado ao grupo controle, está de
acordo com dados descritos na literatura 146. Mas, esse dado também traz a suposição de
que a satisfação com a saúde desses indivíduos pode ter sido influenciada pelo fato de
estarem em tratamento para a dependência durante o preenchimento do questionário,
com melhores condições de saúde nesse momento.
As características descritas para a nossa amostra de dependentes de crack têm sido
amplamente relacionadas não somente como „fatores de risco‟ associados ao uso de
5,67,68
crack , mas também como contribuintes para um envelhecimento epigenético
21,43,47,50,51,53
acelerado . Buscando avaliar o impacto da dependência de crack na idade
epigenética, dado que ainda não foi relatado na literatura, e inferir como essa relação
pode ser influenciada por fatores ambientais relacionados à dependência, utilizamos
modelagem de equações estruturais como um método confirmatório para avaliar essa
relação.
Assim, após a avaliação das características da amostra e definição das variáveis
que compõem os fatores ambientais no nosso estudo, avaliamos a idade epigenética dos
indivíduos. Nossos resultados revelaram que dependentes de crack apresentaram idade
metilômica maior do que o grupo controle. Estudos têm demonstrado que a idade
metilômica pode predizer a idade biológica dos indivíduos de forma mais eficiente do
132
que a idade cronológica, além de predizer a expectativa de vida e mortalidade .
Adicionalmente, observamos uma aceleração de idade maior para os dependentes de
crack (AADiff), assim como uma aceleração de idade positiva (AARes) comparado ao
grupo controle. Uma idade de metilação do DNA acelerada reflete que a idade estimada
Discussão 66
2,30
do indivíduo é maior do que o esperado (com base na idade cronológica) . A
diferença entre as idades epigenética e cronológica, conhecida como „Age acceleration
Difference‟ (AADiff), é também denominada na literatura como „aceleração da idade
epigenética extrínseca‟ e está relacionada com o envelhecimento do sistema
149
imunológico . Valores positivos de AADiff denotam um envelhecimento epigenético
acelerado 149 e, de acordo com nossos resultados, podemos observar que dependentes de
crack apresentaram esse envelhecimento epigenético acelerado comparados à indivíduos
controle. Já os resíduos de aceleração da idade, definidos como os resíduos de um
modelo multivariado que faz a regressão da idade de metilação do DNA prevista na
149,150
idade cronológica, chamados de „Age acceleration Residuals‟ (AARes) , são
também denominados na literatura como „aceleração da idade epigenética intrínseca‟.
149
Diferente de AADiff, o cálculo da AARes leva em consideração a contagem celular .
Apesar de AARes não apresentar diferença estatisticamente significativa entre
dependentes de crack e controles no presente estudo, em conjunto com os demais
resultados de maior idade metilômica e AADiff, nossos resultados apresentam
evidências de que dependentes de crack são biologicamente mais velhos.
Utilizando uma análise de mediação em um modelo de equações estruturais,
observamos que, nos dois modelos finais apresentados (modelos 2 e 3), os fatores
ambientais não atuaram como um mediador sobre o impacto da dependência de crack na
aceleração de idade dos indivíduos. Em ambos os modelos, os fatores ambientais
apresentaram associação negativa com os grupos de estudo e com a aceleração da idade,
indicando relações inversas entre essas variáveis. Esse resultado é, no mínimo, curioso,
pois as variáveis que englobam a variável latente “Fatores ambientais” foram
previamente associadas ao uso de crack e à aceleração de idade epigenética, como
citado anteriormente. Assim, era esperado uma associação positiva entre essas variáveis
na nossa amostra, mas esse resultado não foi observado.
.
Na análise de metilação diferencial, observamos sítios (DMSs) e regiões

diferencialmente metiladas (DMRs) relacionados à dependência de crack. Os DMSs
estavam, em sua maioria, hipermetilados e localizados no corpo dos genes, em regiões
open sea, considerando a relação com ilhas CpG. O genoma humano apresenta um
Discussão 67
padrão de hipermetilação, e a maioria dos CpG metilados são encontrados em corpos

gênicos e regiões intergênicas 151. Esse padrão é responsável por preservar a integridade
do genoma e diz respeito, principalmente, a regiões não gênicas correspondentes à
heterocromatina que, por sua vez, está relacionada às vias de manutenção da metilação
132
. A maioria dos corpos gênicos têm poucos CpGs, mas são extensivamente
metilados151,152. No entanto, enquanto alguns estudos relacionam a metilação do corpo
dos genes à transcrição ativa 152, outros sugerem que essa relação está presente somente
em células em divisão, e que em células que não possuem essa característica, como no
153
cérebro, a metilação do corpo do gene não está associada com a expressão do gene .
A metilação do DNA é um processo tecido específico, mas diversos estudos têm
observado que a metilação do DNA na saliva é mais semelhante aos padrões de
metilação do cérebro quando comparado às correlações entre sangue-cérebro e
esfregaço bucal-cérebro, inclusive em estudos avaliando transtornos psiquiátricos 154-156.
Com isso, podemos, possivelmente, estar observando um efeito de silenciamento gênico
diante o padrão de metilação de dependentes de crack.
Dentre os DMSs com maior diferença de metilação observados, os DMSs
hipermetilados estão presentes em regiões shore, que são as margens das ilhas CpG. A
153
hipermetilaçao dessas regiões está relacionada com a expressão gênica reduzida .
Dois desses DMSs estão no corpo dos genes, mas a maioria está nas regiões promotoras
5'UTR e TSS1500. Em consonância com os dados anteriores, a metilação em regiões
133
promotoras está associada a uma diminuição na transcrição . Destacamos dois DMSs
relacionados aos genes CBX1 (chromobox 1) e HN1 (ou NOTCH1 - notch receptor 1).
CBX1 está associado à regulação da transcrição e ao controle epigenético da estrutura da
157
cromatina, especificamente enriquecido na heterocromatina , que é
8
transcricionalmente inativa . Em consonância, identificamos vias e processos
biológicos para os genes relacionados aos DMSs enriquecidos para vias de organização
de cromatina, organização da heterocromatina e regulação de expressão e silenciamento
gênico. Já o gene NOTCH1, relacionado com o fator de crescimento epidérmico (EGF),
também está associado ao silenciamento do gene AKT (ou AKT1 – AKT
158
serine/threonine kinase 1), que por sua vez inibe a via de sinalização PI3K / AKT .
Observamos também o enriquecimento de processos biológicos relacionados à via de
sinalização EGFR e regulação da atividade de PI3K. O fator de crescimento epidérmico
está envolvido na regulação do desenvolvimento de diversos neurônios cerebrais,
Discussão 68
incluindo neurônios dopaminérgicos. Ratos tratados com EGF apresentaram um

159
aumento nas respostas à cocaína . Em humanos, foi observado uma diminuição da
expressão de EGFR (ou ERBB) em regiões do cérebro de pacientes com esquizofrenia,
160
transtorno bipolar e depressão maior . A via de sinalização PI3K / AKT foi
relacionada ao aumento da atividade cerebral relacionado à recompensa pela ingestão de
161
cocaína em modelos animais à regiões diferencialmente metiladas em dependentes
de cocaína e crack 3.
Quanto aos DMSs hipometilados, estes estão presentes, em sua maioria, em
regiões intergênicas e open sea. Em regiões intergênicas um dos principais papéis da
metilação do DNA é reprimir a expressão de elementos genéticos potencialmente
nocivos que, se expressos são potencialmente prejudiciais, pois sua replicação e
153
inserção podem levar à interrupção do gene e mutação do DNA . Além disso, a
hipometilação está associada a regiões heterocromáticas do genoma e à perda da
integridade da heterocromatina, uma marca do envelhecimento relacionada à realocação
da maquinaria epigenética em resposta a danos no DNA. No entanto, para que haja o
reparo do DNA, é necessária uma quantidade significativa de remodelação da cromatina
nos locais danificados 132.
Para os DMSs hipometilados com maior diferença de metilação entre dependentes
de crack e controles, a maioria estava localizado no corpo dos genes e em regiões open
sea. Dentre esses DMSs, destacamos alguns genes que serão descritos à seguir.
Primeiro, o gene G2E3 (G2/M-phase specific E3 ubiquitin protein ligase), que tem
162
expressão responsiva a danos no DNA , achado que também foi enriquecido nos
processos biológicos. A expressão de G2E3 relacionada à danos no DNA está associada
163
à regulação de p53 , uma proteína responsável por manter a integridade do genoma
164 132
, mas também relacionada ao relaxamento de heterocromatina . p53 é um
componente celular chave no controle da expressão gênica e sua atividade pode
165
determinar como as células funcionam e respondem aos ambientes celulares . Além
disso, desempenha um papel importante na indução de estresse oxidativo e apoptose e
sua depleção foi associada à diminuição da hepatotoxicidade induzida por cocaína em
166
camundongos e proteção contra comportamentos de kindling (comportamento
167
convulsivo) induzidos por cocaína . O comportamentos de kindling induzido por
cocaína aumenta a expressão de p53 no cérebro de camundongos, mais precisamente no
167
hipocampo . Curiosamente, identificamos em nossos resultados o gene USP3
Discussão 69
(ubiquitin specific peptidase 3), relacionado a um DMS hipometilado com maior

diferença de metilação, que interage com p53 e regula sua estabilidade. USP3 é um
168
modificador de cromatina necessário para a estabilidade do genoma . A depleção de
USP3 leva à degradação acelerada de p53 e sua reconstituição restaura a estabilidade da
164
proteína . Esse gene também está relacionado com a ubiquitinação de proteínas
SUMOiladas para modular suas funções, que por sua vez são enriquecidas em sítios
169
locais de dano ao DNA . Outro gene hipometilado relacionado à DMS, e também
associado à regulação de p53, é o DNM3 (dinamina 3)170. Esse gene está envolvido na
171
endocitose da vesícula sináptica e atinge expressão máxima no sistema nervoso
172
central , tendo sido previamente envolvido em transtornos psiquiátricos como
171
transtorno obsessivo compulsivo e esquizofrenia . Por fim, destacamos o gene
hipometilado STAT4 (signal transducer and activator of transcription 4), que atua como
ativador da transcrição e é essencial na mediação de respostas inflamatórias através da
via de sinalização JAK (Janus quinase) / STAT (signal transducer and activator of
transcription) 173.
Resposta inflamatórias também estão relacionadas com as via de sinalização e
processos biológicos enriquecidos em nossos resultados, como a via de sinalização
174
FCERI, sinalização por NF-κB e atividade de PI3K . A via de sinalização PI3K, em
especial, está envolvida na sobrevivência dos neurônios após estimulação com IL-18
175
(Interleucina 18) . Em relação à dependência de crack, foi observado que TNF-
176
α (Tumor Necrosis Factor –Alpha), uma citocina pró-inflamatória , estava mais
elevada em dependentes de crack com histórico de estresse precoce quando comparados
à dependentes de crack sem esse histórico, além de predizer positivamente a gravidade
177
da abstinência . Em modelos animais, foi observado que NF-κB está associado com
178
alterações no córtex pré-frontal de camundongos expostos repetidamente à cocaína .
179
Além disso, NF-κB foi associado à neurotoxicidade induzida pela cocaína .
Em relação às DMRs identificadas no nosso estudo, a maioria estava hipermetilada
180
em regiões promotoras, relacionada com ativação transcricional , e regiões open sea.
E, apesar de não terem sido identificados processos e vias biológicas para os genes
diferencialmente metilados relacionados às DMRs, esses genes estão relacionados a
processos enriquecidos observados para os genes relacionados às DMSs no nosso
estudo. Os genes PMAIP1 (phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1) e
LINC00346 (ou PRECSIT - p53 regulated carcinoma associated Stat3 activating long
Discussão 70
intergenic non-protein coding transcript), por exemplo, estão relacionados com

apoptose induzida por p53 em células com DNA danificado 181,182, o que corrobora com
o enriquecimento da via de sinalização de apoptose em resposta à dano ao DNA e dano
ao DNA mediado por sinalização transducional da proteína p53. O gene HIVEP3
(HIVEP zinc finger 3), atua como um fator de transcrição e é capaz de regular a
183
transcrição mediada pelo NF-κB , outra via de sinalização enriquecida no nosso
estudo. Finalmente, o gene HRNBP3 – (RBFOX3 RNA binding fox-1 homolog 3),
responsável pela produção do antígeno de núcleos neuronais (NeuN), tem sua maior
expressão no sistema nervoso central e desempenha um papel proeminente no
184
desenvolvimento do tecido neural e na regulação da função cerebral do adulto . Em
nossos resultados, observamos o enriquecimento da via de sinalização NCAM, uma
molécula de adesão de células neurais relacionada a diversos distúrbios
neuropsiquiátricos em humanos. Em modelos animais, NCAM está associada à
alterações comportamentais e ativação do córtex pré-frontal e do núcleo accumbens de
camundongos em resposta aos efeitos da cocaína 185.
Comparando nossos achados com um estudo anterior que avaliou o padrão de
metilação do DNA em dependentes de cocaína e crack 3, observamos similaridades em
genes e processos biológicos. Em relação às DMSs, observamos similaridade para os
genes TGFBR3 (transforming growth factor, beta receptor III) e MAPK1 (mitogen-
activated protein kinase 1), ambos hipometilados nos dois estudos. O gene MAPK1, em
particular, faz parte da via MAPK (mitogen-activated protein kinase), que é ativada pelo
aumento na dopamina extracelular no estriado em resposta ao abuso de cocaína e
desempenha um papel importante na regulação gênica por ativação direta de fatores de
186
transcrição e remodelação da cromatina . O gene relacionado à DMR, PCDH9
(protocadherin 9), também apresentou hipometilação em ambos os estudos. Esse gene
tem um importante papel na adesão e reconhecimento celular e está associado com
187
efeitos protetores contra a citotoxicidade induzida por cocaína em cérebro de ratos .
Esse dado sugere que a hipometilação em genes relacionados à via MAPK e adesão e
reconhecimento celular podem estar diretamente associadas à dependência de crack.
Assim como o envolvimento das vias de sinalização PI3K / AKT e EGFR, como citado
anteriormente.
Discussão 71
7.3. Objetivos Específicos 3 e 4
A exposição ao estresse e a presença de transtornos psiquiátricos são reconhecidos

como fatores relacionados à vulnerabilidade para a dependência química, inclusive para
a dependência de crack. Diversos estudos relatam que experiências traumáticas no início
da vida podem estar correlacionadas com um risco aumentado de uso de substâncias
69,70
. O uso de crack foi relacionado, por exemplo, à situações de negligência e abuso
emocional na infância, negligência e abuso físico, e abuso sexual 66,72. Grande parte dos
estudos busca associar, além da exposição ao estresse, a presença de transtornos
67,72,73
psiquiátricos relacionados ao uso do crack . A presença de um segundo
diagnóstico psiquiátrico é comum entre usuários de cocaína e crack e pode aumentar a
134
gravidade de ambas as doenças . Os transtornos mais prevalentes relacionados à
dependência de crack são os transtornos de humor, como a ansiedade e a depressão
66,74,138,139,142,188,189
, sendo esse último também relacionado como um sintoma secundário
ao consumo da droga 76. Diante desse cenário, consideramos a importância de avaliar os
dependentes de crack da nossa amostra em relação a exposição à eventos traumáticos e
a presença de depressão, ansiedade e outros transtornos psiquiátricos. Para isso,
consideramos a utilização de uma análise de mediação em um modelo de equações
estruturais, que nos proporcionaria inferir o impacto de eventos traumáticos e
estressores na idade epigenética dependentes de crack, dado que ainda não foi relatado
na literatura, e como transtornos psiquiátricos poderiam mediar essa relação.
Na avaliação da idade epigenética da nossa amostra, não foi possível observar
diferença estatisticamente significativa entre os subgrupos para a idade metilômica e
aceleração de idade. Apesar de o subgrupo sem “eventos traumáticos” apresentar
AARes negativa, que pode estar relacionada à um envelhecimento epigenético mais
lento do que o esperado 149,150. Curiosamente, esse grupo apresentou maior comorbidade
com transtornos psiquiátricos em todas as categorias utilizadas. No entanto, esse dado
difere da literatura, pois as maiores associações encontradas com comorbidade
psiquiátricas estão relacionadas com a presença de trauma e/ou estresse na infância
67,73,74
. Deve-se considerar que, diferente de outros estudos que avaliam se os indivíduos
tiveram ou não traumas na infância, o instrumento utilizado no nosso estudo (ETISR-
SF) avalia apenas a quantidade de eventos considerados como traumáticos e estressores
vivenciados pelos indivíduos, não sendo capaz de determinar se os indivíduos são
129
acometidos por traumas ou não . Essa questão também pode ter refletido na relação
Discussão 72
entre os subgrupos de dependentes de crack e as medidas de aceleração de idade

AADiff e AARes, na qual não foi possível observar associação entre essas variáveis.
Sendo essa associação o pressuposto inicial para a realização da análise de mediação,
esta não pôde ser realizada, inviabilizando a observação dos transtornos psiquiátricos
como mediador, como era proposto para esse objetivo.
Contudo, destacamos um estudo realizado por Levandowski e cols 190, que utilizou
outra medida biológica para avaliar o impacto do uso do crack na senescência celular de
mulheres dependentes, bem como a associação do crack ao estresse precoce, o
comprimento telomérico. Os pesquisadores observaram que o grupo de dependentes de
crack com estresse precoce tinha telômeros significativamente mais curtos do que o
grupo de dependentes sem essa condição associada. Além disso, o comprimento
telomérico foi negativamente correlacionado com abuso emocional. Embora seja
amplamente relatado que o envelhecimento epigenético não está associado à
191,192
senescência celular , estudos recentes têm relacionado ambas as medidas. Um
estudo com adolescentes saudáveis mostrou que níveis mais baixos de metilação global
193
do DNA estão associados a comprimentos de telômeros mais curtos na juventude .
Outro estudo, avaliando cerca de 5.700 indivíduos, observou relações altamente
significativas entre os níveis de metilação do DNA de 823 sítios CpG e o comprimento
194 195
telomérico dos indivíduos . Chen e cols. relatam que tanto o comprimento dos
telômeros quanto a idade de metilação do DNA estão fortemente associados à idade
cronológica.
Por fim, dados da literatura mostram que situações como estresse e negligência
podem impactar nos padrões de metilação de metilação do DNA 196,197. Adversidades no
início da vida, que aumentam o risco de distúrbios comportamentais na idade adulta, são
196
governados pela metilação do DNA . Porém, na análise de metilação diferencial do
nosso estudo, não foram observadas diferenças na metilação do DNA entre os
subgrupos de dependentes de crack com e sem “eventos traumáticos”.
8. CONCLUSÃO
Conclusão 74
A metilação do DNA tem sido amplamente estudada no contexto das interações

gene-ambiente. Como um processo altamente dinâmico, a metilação do DNA sofre
alterações associadas a diversos fatores ambientais, como o uso/abuso de substâncias.
No presente estudo observamos que a dependência de crack está relacionada à uma
aceleração de idade positiva, que reflete que o uso da droga faz com que esses
indivíduos apresentem um envelhecimento biológico acelerado comparados à
indivíduos controle. Observamos também diferenças significativas no padrão de
metilação do DNA de dependentes de crack, sendo a maioria possivelmente relacionada
à um silenciamento gênico.
Observamos vias e processos biológicos previamente relacionados à dependência
de cocaína e crack, como à via MAPK, via de sinalização PI3K / AKT e EGFR, e
adesão e reconhecimento celular, o que reforça a importante relação dessas vias com o
mecanismo genético-molecular da dependência de crack. Visto que a metilação do DNA
avaliada em saliva é correlacionada aos padrões de metilação observados no cérebro,
nossos resultados contribuem para um melhor entendimento da neurobiologia da
dependência de crack.
Mudanças epigenéticas são, de forma geral, mecanismos reversíveis e trazem a
perspectiva de que as estimativas de idade de metilação do DNA podem ser úteis para
identificar ou validar intervenções. Adicionalmente, a identificação de biomarcadores
de metilação do DNA na dependência de crack pode contribuir com soluções mais
eficazes de prevenção, diagnóstico e tratamento da dependência.
9. ANEXOS
Anexos 76
9.1. ANEXO A
Perfil sociodemográfico e história natural do consumo de crack entre usuários de sete

estados brasileiros e do Distrito Federal
Coordenação Geral: Prof. Ronaldo Laranjeira

Coordenação Executiva: Prof. Marcelo Ribeiro de Araújo
Trata-se de um estudo observacional e prognóstico interessado na aferição de

desfechos relacionados ao consumo de crack. Os principais objetivos desse estudo
foram: observar a evolução do consumo de crack em coortes de usuários internados para
tratamento em comunidades terapêuticas de sete estados brasileiros e do Distrito Federal
- a maioria delas filiadas à Federação Brasileira de Comunidades Terapêuticas
(FEBRACT), considerando como parâmetro a história natural do uso da substância;
avaliar a relação entre as variáveis demográficas e de padrão consumo de crack e os
desfechos de mau prognóstico, tais como manutenção do consumo de crack; avaliar os
fatores de proteção e risco envolvidos tanto na evolução do consumo de crack, quanto
na busca e adesão ao tratamento.
Uma entrevista estruturada foi desenvolvida pela equipe de pesquisadores da
Unidade de Pesquisa em Álcool e Drogas (UNIAD) | Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP), com o intuito de abordar aspectos relevantes da evolução dos
pacientes estudados. O questionário estruturado foi dividido nas seguintes seções:
A) Estágios da vida e dados pessoais – Incluindo questões sociodemográficas,

situação atual de moradia, convívio e relacionamento com os pais biológicos, adotivos
ou cuidadores durante a infância e adolescência (quando o caso, convívio em um abrigo
para crianças e adolescentes), relacionamento com irmãos e filhos, e antecedentes de
uso de álcool e drogas entre os familiares;
B à D) Histórico dos 8 aos 11, 12 aos 14 e 15 aos 17 anos de idade,
respectivamente – Abordando questões sobre o relacionamento do entrevistado com
seus pais e amigos ao longo desses anos, assim como ambiente social, comportamento
individual e acesso à drogas;
E) Atitude dos pais - Incluindo questões sobre a atitude dos pais do entrevistado
durante a infância e adolescência, como opinião dos pais sobre o uso de álcool e drogas
Anexos 77
e brigas e discussões entre os pais. A seção também abordou questões sobre o

desempenho escolar dos entrevistados e dificuldades durante a fase de crescimento;
F e G) Histórico dos 18 aos 21 e 22 aos 25 anos de idade, respectivamente –
Abordando o relacionamento do entrevistado com seus amigos, acesso à drogas e
questões sobre a personalidade do indivíduo ao longo desses anos;
H) Substâncias psicoativas – Incluindo questões sobre o tempo de uso e padrão de
consumo de crack, cocaína „cheirada‟ (utilizada pela via intranasal) e „injetável‟, tabaco,
álcool, cannabis (maconha e haxixe), calmantes benzodiazepínicos, anfetamínicos,
ecstasy, alucinógenos (LSD e „chá de cogumelo‟), solventes („cola de sapateiro‟, „loló‟,
„lança-perfume‟, tolueno e clorofórmio) e derivados do ópio (heroína, morfina, codeína
e meperidina). A seção ainda incluiu as escalas: Cocaine Craving Questionnaire (CCQ-
B) - Versão Brasileira Adaptada para o Crack, para avaliação da fissura pelo crack
198,199 200
; Teste de Fagerström para avaliação de dependência à nicotina ; Car, Relax,
Alone, Forget, Friends, Trouble (CRAFFT) para rastreio do consumo de álcool de alto
201
risco entre crianças e adolescentes ; e Alcool Use Disorders Identification Test
(AUDIT) para avaliação do padrão de uso de álcool 202;
I) Complicações do uso de drogas – Abordando questões sobre a ocorrência de
danos e/ou acidentes ocasionados durante ou após o uso de drogas, incluindo a
ocorrência de overdose;
J) Envolvimento em atividades ilegais – Abordando questões sobre envolvimento
com a polícia ou com o sistema judiciário, como detenção e condenação, ou com
atividades ilícitas, incluindo envolvimento para sustento próprio ou com intuito de
conseguir dinheiro para comprar drogas;
K) Contato com o narcotráfico no último mês – Abordando quais os meios
utilizados pelo entrevistado para aquisição do crack, incluindo a forma de pagamento
pela droga, e prestação de serviço ao tráfico de drogas;
L) Ganhos e sustento – Abordando a fonte do dinheiro do entrevistado para seu
sustento mensal antes da internação;
M) Seção tratamento – Incluindo questões sobre o tratamento atual na comunidade
terapêutica (internação compulsória ou voluntária e os motivos que levaram o
entrevistado a procurar por esse tratamento) e tratamentos pregressos, seja em
comunidade terapêutica ou outros meios de tratamento;
Anexos 78
N) Investigação clínica – Questões sobre a saúde física do entrevistado e

investigação de doenças crônicas (hipertensão, diabetes, asma e reumatismo) e outras
doenças como AIDS, hepatite, sífilis e tuberculose;
O) Religiosidade – Abordando questões sobre as crença religiosas. A seção ainda
incluiu a escala de religiosidade Duke Religious Index (DUREL) 121;
P) Autoestima - Abordando questões sobre os sentimentos e satisfação do
entrevistado com relação à ele mesmo;
Q) Comportamento sexual - Abordando questões sobre orientação sexual, a
importância das relações sexuais para o entrevistado e práticas sexuais em troca de
drogas;
R) Trauma e estresse – Para a avaliação sobre o histórico de traumas foi utilizado o
questionário Early Trauma Inventory Self-Report Short Form (ETISR-SF) 129;
S) Motivação - Abordando questões sobre a opinião do entrevistado acerca do seu
problema com drogas e suas expectativas sobre o tratamento atual;
T) Qualidade de vida - Para a avaliação sobre a qualidade de vida (antes da
internação atual) foi utilizado o questionário World Health Organization Quality of Life
(WHOQOL-BREF) 122;
U) Investigação psiquiátrica – A seção incluiu questões sobre o uso de
medicamentos psiquiátricos e a entrevista psiquiátrica padronizada Mini International
Neuropsychiatric Interview (MINI) 130;
V) Funcionamento global do entrevistado – Os entrevistadores avaliaram os
entrevistados através da escala Avaliação Global de Funcionamento (AGF) 203.
X) Opinião do entrevistador sobre o entrevistado – Os entrevistadores avaliaram os
entrevistados quanto às suas reações e emoções durante a entrevista, colaboração e
compreensão acerca da mesma.
Anexos 79
9.2. ANEXO B
Tabela Anexo B. Sítios diferencialmente metilados (DMSs) entre dependentes de crack e controles
β β Coord. genômica Relação ao gene_ilha
Probe ID adjP Δβ Gene
Controles Casos (hg19) CpG
cg03382291 5.34E-04 0.373 0.181 -0.192 chr5:147580954 SPINK6 TSS1500 - open sea
cg25747320 4.70E-04 0.338 0.155 -0.183 chr14:31043362 G2E3 5'UTR - open sea
cg08267336 7.24E-04 0.381 0.204 -0.176 chr1:167298149 POU2F1 TSS200 - open sea
cg23577610 3.73E-04 0.369 0.199 -0.171 chr1:172078666 DNM3 Corpo do gene - open sea
cg00816480 5.03E-04 0.341 0.174 -0.167 chr12:70711895 CNOT2 Corpo do gene - open sea
cg05601847 9.95E-04 0.365 0.200 -0.164 chr4:83826691 THAP9 Corpo do gene - open sea
cg04980099 2.23E-04 0.306 0.150 -0.157 chr15:63836733 USP3 Corpo do gene - open sea
cg22348755 9.33E-04 0.298 0.147 -0.151 chr2:191991246 STAT4 Corpo do gene - open sea
cg05575921 1.73E-04 0.743 0.594 -0.149 chr5:373378 AHRR Corpo do gene - shore
cg04171753 5.24E-04 0.276 0.128 -0.148 chr18:33045127 IGR IGR - open sea
cg06466659 6.69E-04 0.287 0.141 -0.145 chr2:213990963 IKZF2 Corpo do gene - open sea
cg12689670 9.49E-04 0.290 0.148 -0.142 chr1:183009347 LAMC1 Corpo do gene - open sea
cg14976084 3.95E-04 0.489 0.351 -0.138 chr3:10204012 IGR IGR - shelf
cg12274324 4.53E-04 0.292 0.154 -0.138 chr9:125583959 PDCL Corpo do gene - open sea
cg02316792 5.42E-04 0.261 0.127 -0.134 chr4:10686457 CLNK TSS200 - open sea
cg02575483 6.54E-04 0.274 0.155 -0.119 chr6:117826706 DCBLD1 Corpo do gene - open sea
cg16506300 9.49E-04 0.224 0.107 -0.117 chr16:12444635 SNX29 Corpo do gene - open sea
cg12565636 8.16E-04 0.223 0.111 -0.112 chr8:39797497 IDO2 Corpo do gene - open sea
cg10287032 5.03E-04 0.237 0.125 -0.111 chr2:24552676 ITSN2 5'UTR - open sea
cg10518264 8.70E-04 0.219 0.111 -0.107 chr6:32909440 HLA-DMB TSS1500 - open sea
cg17699374 6.58E-04 0.199 0.097 -0.102 chr22:37403802 C22orf33 5'UTR - open sea
cg18559386 8.16E-04 0.219 0.119 -0.100 chr10:14604648 FAM107B 5'UTR - open sea
cg17405687 9.79E-04 0.193 0.093 -0.100 chr4:124778531 LINC01091 Corpo do gene - open sea
cg26423680 9.49E-04 0.207 0.108 -0.099 chr3:168960390 MECOM 5'UTR - open sea
cg14051805 9.79E-04 0.210 0.112 -0.098 chr15:39917220 FSIP1 Corpo do gene - open sea
cg27200006 8.76E-04 0.269 0.179 -0.090 chr22:25003854 GGT1 5'UTR - open sea
cg24069884 4.53E-04 0.218 0.128 -0.090 chr13:111116765 COL4A2 Corpo do gene - open sea
cg13149979 9.16E-04 0.194 0.107 -0.087 chr16:75139595 ZNRF1 Corpo do gene - open sea
cg23699414 1.73E-04 0.199 0.115 -0.085 chr5:3601762 IGR IGR - island
cg09072199 8.76E-04 0.184 0.101 -0.084 chr1:28507653 PTAFR 5'UTR - open sea
cg24497361 2.12E-04 0.474 0.391 -0.083 chr11:3858493 RHOG 5'UTR - shelf
cg17728974 5.92E-04 0.205 0.124 -0.081 chr6:105403577 LIN28B TSS1500 - shelf
cg12252378 3.55E-04 0.175 0.099 -0.076 chr2:9748413 YWHAQ Corpo do gene - open sea
cg03338962 6.56E-04 0.165 0.091 -0.074 chr14:35673382 KIAA0391 Corpo do gene - open sea
cg03916245 3.73E-04 0.163 0.089 -0.074 chr14:64770272 ESR2 5'UTR - open sea
cg15689991 6.47E-04 0.172 0.098 -0.073 chr12:65019329 RASSF3 Corpo do gene - open sea
cg08810700 8.15E-04 0.889 0.906 0.018 chr14:73453942 ZFYVE1 TSS1500 - open sea
cg01519820 5.72E-04 0.889 0.907 0.018 chr11:107400934 ALKBH8 Corpo do gene - open sea
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adjP - p-valor ajustado; β – valor beta; Δβ - delta beta; continua
chr - Cromossomo; IGR – Região intergênica.
Anexos 80
Tabela Anexo B (continuação). Sítios diferencialmente metilados (DMSs) entre dependentes de crack e controles
cg01103911 5.00E-04 0.163 0.090 -0.073 chr2:29044463 SPDYA Corpo do gene - open sea
cg01303199 8.33E-05 0.187 0.114 -0.072 chr7:129017393 AHCYL2 Corpo do gene - open sea
cg24339570 1.26E-04 0.168 0.097 -0.071 chr17:65685799 PITPNC1 Corpo do gene - open sea
cg21790695 6.83E-04 0.139 0.069 -0.071 chr10:35070092 PARD3 Corpo do gene - open sea
cg17737314 2.55E-06 0.191 0.121 -0.070 chr1:44114355 KDM4A TSS1500 - shore
cg05460226 9.19E-04 0.310 0.240 -0.070 chr17:8804279 PIK3R5 Corpo do gene - open sea
cg08792700 6.56E-04 0.356 0.287 -0.069 chr9:86911279 SLC28A3 Corpo do gene - open sea
cg06134956 8.11E-04 0.160 0.091 -0.069 chr7:91576047 AKAP9 Corpo do gene - open sea
cg16018211 3.73E-04 0.205 0.138 -0.067 chr19:52489829 ZNF350 5'UTR - open sea
cg01991785 6.54E-04 0.192 0.125 -0.067 chr17:78549280 RPTOR Corpo do gene - open sea
cg01373201 9.07E-04 0.138 0.074 -0.065 chr10:81054018 ZMIZ1 Corpo do gene - open sea
cg23497020 1.19E-04 0.175 0.112 -0.063 chr12:50616562 LIMA1 Corpo do gene - open sea
cg02115282 3.95E-04 0.139 0.077 -0.062 chr2:25745241 DTNB Corpo do gene - open sea
cg06037077 6.07E-04 0.748 0.687 -0.061 chr7:75862177 SRRM3 5'UTR - shelf
cg06965839 3.21E-04 0.621 0.561 -0.060 chr17:3303148 OR1E1 TSS1500 - open sea
cg08412188 3.73E-04 0.127 0.071 -0.056 chr7:74074356 GTF2I 5'UTR - shore
cg06422757 8.99E-04 0.190 0.134 -0.055 chr6:36409495 PXT1 5'UTR - shore
cg13713667 5.53E-04 0.140 0.085 -0.055 chr14:78057532 SPTLC2 Corpo do gene - open sea
cg10087036 8.42E-04 0.143 0.089 -0.054 chr16:19130461 ITPRIPL2 1stExon - shelf
cg18886147 9.48E-04 0.883 0.901 0.018 chr12:1609741 LOC100292680 Corpo do gene - open sea
cg06161948 3.55E-04 0.903 0.921 0.018 chr19:33592011 GPATCH1 Corpo do gene - open sea
Anexos 81
cg12075928 7.36E-04 0.707 0.654 -0.053 chr8:141801307 PTK2 Corpo do gene - open sea
cg13529282 8.76E-04 0.155 0.103 -0.053 chrX:23652439 IGR IGR - open sea
cg12793863 6.32E-04 0.773 0.720 -0.053 chr6:109612628 IGR IGR - shore
cg12229388 6.18E-04 0.127 0.075 -0.052 chr10:70088219 PBLD 5'UTR - shelf
cg16637427 9.43E-04 0.180 0.128 -0.052 chr15:89456971 MFGE8 TSS1500 - shore
cg22763040 4.53E-04 0.162 0.110 -0.051 chr12:50615251 LIMA1 Corpo do gene - open sea
cg01245356 5.81E-04 0.129 0.079 -0.050 chr1:28559620 DNAJC8 TSS200 - shore
cg17605068 8.33E-05 0.113 0.063 -0.050 chr10:70088173 PBLD 5'UTR - shelf
cg02061431 9.03E-04 0.109 0.059 -0.050 chr1:92150549 TGFBR3 Corpo do gene - open sea
cg20630456 3.73E-04 0.117 0.068 -0.049 chr18:43542576 EPG5 Corpo do gene - open sea
cg17078326 9.41E-04 0.684 0.636 -0.048 chr4:4509338 STX18 Corpo do gene - open sea
cg08073979 9.68E-04 0.114 0.066 -0.048 chrX:119632157 IGR IGR - open sea
cg04244170 6.45E-04 0.119 0.071 -0.048 chr3:100116021 TOMM70A Corpo do gene - shelf
cg12478874 9.99E-04 0.113 0.065 -0.047 chr15:80263632 BCL2A1 1stExon - open sea
cg19521414 8.49E-04 0.114 0.067 -0.047 chr1:28559596 DNAJC8 TSS200 - island
cg07457402 8.99E-04 0.156 0.109 -0.047 chr2:179279443 MIR548N Corpo do gene - shore
cg18550212 3.73E-04 0.118 0.072 -0.046 chr11:63435428 ATL3 Corpo do gene - shelf
cg01253321 9.49E-04 0.131 0.085 -0.045 chr17:5322267 RPAIN TSS1500 - shore
cg21750785 6.48E-04 0.109 0.064 -0.045 chr6:117819571 DCBLD1 Corpo do gene - open sea
cg17320944 5.03E-04 0.188 0.143 -0.045 chr12:81855113 PPFIA2 5'UTR - open sea
cg24130348 3.53E-04 0.146 0.102 -0.044 chr22:41682824 RANGAP1 TSS1500 - shore
cg26991596 8.35E-04 0.123 0.081 -0.042 chr18:77440820 CTDP1 TSS1500 - shore
cg08152058 7.30E-04 0.095 0.054 -0.041 chr20:33999335 UQCC Corpo do gene - open sea
cg24482496 4.40E-04 0.101 0.060 -0.041 chr17:30228390 UTP6 Corpo do gene - shore
cg27353361 8.02E-04 0.099 0.058 -0.041 chr6:108145420 SCML4 1stExon - open sea
cg12537452 9.79E-04 0.089 0.049 -0.040 chr2:202023279 CFLAR-AS1 TSS1500 - open sea
cg06762477 9.54E-04 0.123 0.083 -0.040 chr2:206951646 INO80D TSS1500 - shore
cg26720491 9.79E-04 0.097 0.057 -0.040 chr1:167517766 CREG1 Corpo do gene - open sea
cg23076476 9.00E-04 0.196 0.157 -0.039 chr11:26353484 ANO3 TSS200 - shore
cg11710314 9.49E-04 0.172 0.134 -0.038 chrX:48980265 GPKOW TSS200 - island
cg15819914 6.75E-04 0.096 0.058 -0.038 chr1:155474162 ASH1L Corpo do gene - open sea
cg21784254 5.43E-04 0.077 0.040 -0.037 chr13:108922428 TNFSF13B 1stExon - open sea
cg02929956 5.03E-04 0.098 0.061 -0.037 chr14:74111258 DNAL1 TSS1500 - shore
cg03519031 5.47E-04 0.908 0.926 0.019 chr2:74980612 IGR IGR - shore
cg06999384 1.98E-04 0.898 0.916 0.019 chr2:62053528 FAM161A 3'UTR - open sea
Anexos 82
cg09366641 6.56E-04 0.098 0.061 -0.036 chr1:153643528 ILF2 TSS200 - island
cg22332884 6.47E-04 0.117 0.081 -0.036 chrX:48980256 GPKOW TSS200 - island
cg04509607 5.09E-04 0.121 0.085 -0.036 chr15:91538344 PRC1 TSS1500 - shore
cg06972810 5.47E-04 0.075 0.039 -0.036 chr8:24272697 LOC101929294 Corpo do gene - open sea
cg05877528 4.65E-04 0.086 0.052 -0.034 chr22:26875552 HPS4 TSS200 - shelf
cg03178820 9.64E-04 0.126 0.092 -0.034 chr2:190627986 OSGEPL1 TSS200 - open sea
cg07488576 6.47E-04 0.072 0.039 -0.033 chr2:192711481 SDPR 1stExon - open sea
cg21010044 9.45E-04 0.093 0.061 -0.033 chr11:46615819 AMBRA1 TSS1500 - shore
cg05134616 8.27E-04 0.094 0.062 -0.032 chr6:30509458 GNL1 3'UTR - open sea
cg08110170 2.07E-04 0.110 0.079 -0.031 chr11:72474129 STARD10 Corpo do gene - open sea
cg18650462 6.70E-04 0.125 0.094 -0.031 chr17:9479287 CFAP52 TSS1500 - shore
cg21691367 3.73E-04 0.089 0.058 -0.031 chr6:151325642 MTHFD1L Corpo do gene - open sea
cg24562746 8.60E-04 0.093 0.062 -0.030 chr19:44598112 ZNF224 TSS1500 - shore
cg21912319 5.04E-04 0.112 0.082 -0.030 chr6:27799567 HIST1H4K TSS1500 - shore
cg07339236 6.07E-04 0.082 0.051 -0.030 chr20:50312490 ATP9A Corpo do gene - open sea
cg14141380 8.37E-04 0.138 0.108 -0.030 chr7:20826721 SP8 TSS1500 - shore
cg12689529 3.73E-04 0.099 0.070 -0.029 chr11:126335883 KIRREL3 Corpo do gene - open sea
cg15200793 5.99E-04 0.121 0.092 -0.029 chr2:42722317 KCNG3 TSS1500 - shore
cg21285431 3.94E-04 0.086 0.058 -0.029 chr10:79789707 POLR3A TSS1500 - shore
cg14530184 3.73E-04 0.876 0.848 -0.028 chr9:117177141 DFNB31 Corpo do gene - open sea
cg00485194 9.07E-04 0.096 0.069 -0.027 chr3:21792684 ZNF385D 1stExon - open sea
cg02018408 8.76E-04 0.103 0.076 -0.026 chr16:25269986 ZKSCAN2 TSS1500 - shore
cg14759064 5.03E-04 0.098 0.073 -0.025 chr5:140026603 NDUFA2 Corpo do gene - shore
cg01593345 2.23E-04 0.067 0.042 -0.025 chr12:12932730 APOLD1 Corpo do gene - open sea
cg01616228 8.87E-04 0.078 0.053 -0.025 chr6:21857295 CASC15 Corpo do gene - open sea
cg24473500 7.13E-04 0.083 0.058 -0.025 chr7:871436 UNC84A 5'UTR - open sea
cg16593229 8.12E-04 0.074 0.049 -0.025 chr22:18122303 BCL2L13 5'UTR - shore
cg15470936 2.23E-04 0.097 0.072 -0.025 chr16:5666398 LINC01570 TSS200 - open sea
cg06777853 3.94E-04 0.078 0.055 -0.024 chr14:61201602 MNAT1 1stExon - open sea
cg10428791 4.48E-04 0.085 0.062 -0.023 chr20:62580620 UCKL1 Corpo do gene - open sea
cg11017057 5.81E-04 0.081 0.058 -0.023 chr3:51706056 TEX264 5'UTR - shore
cg17899718 8.87E-04 0.063 0.040 -0.022 chr22:22171121 MAPK1 Corpo do gene - open sea
cg27294460 9.14E-04 0.866 0.844 -0.022 chr3:29738423 RBMS3 Corpo do gene - open sea
cg23271831 9.79E-04 0.066 0.044 -0.022 chr7:94024254 COL1A2 1stExon - open sea
cg13836518 5.99E-04 0.080 0.058 -0.022 chr9:100883593 CORO2A 3'UTR - shore
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cg07309361 5.99E-04 0.061 0.041 -0.020 chr3:52001477 PCBP4 TSS200 - open sea
cg04856043 4.22E-04 0.078 0.059 -0.020 chr2:20851304 HS1BP3 TSS1500 - shore
cg13179085 3.53E-04 0.063 0.044 -0.019 chr12:93963345 SOCS2 TSS1500 - shore
cg11847459 4.48E-04 0.061 0.042 -0.019 chr14:36789488 MBIP Corpo do gene - open sea
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cg18269801 4.48E-04 0.900 0.919 0.019 chr17:35732756 ACACA 5'UTR - open sea
cg01837631 9.06E-04 0.848 0.867 0.019 chr16:68340409 SLC7A6OS Corpo do gene - shelf
Anexos 83
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cg19329408 1.90E-04 0.068 0.051 -0.017 chr3:132379034 UBA5 TSS200 - shore
cg22189357 9.35E-04 0.049 0.032 -0.017 chr1:24136425 HMGCL Corpo do gene - open sea
cg00359181 2.41E-04 0.067 0.051 -0.017 chr2:38893519 GALM Corpo do gene - open sea
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cg23681213 9.06E-04 0.066 0.049 -0.016 chr14:74180391 PNMA1 1stExon - shore
cg13695535 1.26E-04 0.055 0.040 -0.016 chr5:66124603 MAST4 1stExon - open sea
cg05877694 9.45E-04 0.062 0.047 -0.015 chr11:128775743 KCNJ5 5'UTR - open sea
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cg21161138 9.22E-04 0.637 0.621 -0.015 chr5:399360 AHRR Corpo do gene - open sea
cg21745165 9.49E-04 0.799 0.784 -0.015 chr19:49319447 HSD17B14 Corpo do gene - shelf
cg13826447 5.47E-04 0.062 0.047 -0.015 chr17:46019006 PNPO 5'UTR - open sea
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cg11271605 9.79E-04 0.040 0.026 -0.015 chr7:87936282 STEAP4 TSS200 - open sea
cg10316474 9.41E-04 0.048 0.034 -0.014 chr22:39410068 APOBEC3C TSS200 - open sea
cg12542281 9.87E-04 0.053 0.039 -0.014 chr13:33113069 N4BP2L2 TSS200 - open sea
cg27143082 5.03E-04 0.058 0.044 -0.014 chr6:31744628 C6orf27 5'UTR - open sea
cg18292999 8.12E-04 0.051 0.038 -0.013 chr20:47893669 ZNFX1 5'UTR - shore
cg17498615 8.09E-04 0.050 0.037 -0.013 chr13:97874551 MBNL2 TSS200 - open sea
cg21262854 9.22E-04 0.043 0.030 -0.013 chr7:92861612 CCDC132 TSS200 - open sea
cg06541188 9.79E-04 0.051 0.038 -0.013 chr1:206643735 IKBKE TSS200 - open sea
cg14471560 5.03E-04 0.049 0.036 -0.013 chr2:99225332 C2orf64 TSS1500 - shore
cg26784596 3.95E-04 0.055 0.042 -0.013 chr3:140769814 SPSB4 TSS1500 - shore
cg07316978 8.70E-04 0.893 0.881 -0.012 chr6:157529107 ARID1B 3'UTR - open sea
cg04982748 4.53E-04 0.041 0.029 -0.012 chr12:66696283 HELB TSS200 - open sea
cg27149567 3.73E-04 0.863 0.851 -0.012 chr21:47314725 PCBP3 Corpo do gene - shelf
cg07211155 3.73E-04 0.857 0.845 -0.012 chr2:144359756 ARHGAP15 Corpo do gene - open sea
cg06948947 9.22E-04 0.050 0.038 -0.011 chr7:72993313 TBL2 TSS1500 - island
cg04920574 9.22E-04 0.049 0.039 -0.010 chr6:84569242 CYB5R4 TSS200 - shore
cg12971526 9.01E-04 0.041 0.032 -0.010 chr19:36001401 DMKN 5'UTR - open sea
cg00446722 9.79E-04 0.919 0.910 -0.009 chr8:97620628 SDC2 Corpo do gene - open sea
cg01767202 8.15E-04 0.035 0.026 -0.009 chr14:36789886 MBIP TSS200 - open sea
cg09247880 4.48E-04 0.049 0.041 -0.008 chr6:30028651 ZNRD1 TSS1500 - shore
cg05409276 9.48E-04 0.037 0.029 -0.008 chr17:73400549 GRB2 5'UTR - shore
cg02843856 5.16E-04 0.033 0.025 -0.007 chr4:8581972 GPR78 TSS1500 - shore
cg02044738 7.24E-04 0.035 0.028 -0.007 chr3:119182380 TMEM39A 5'UTR - open sea
cg06746101 4.48E-04 0.037 0.033 -0.004 chr15:79603771 TMED3 Corpo do gene - island
cg07634902 8.36E-04 0.033 0.029 -0.004 chr11:93517282 MED17 TSS200 - shore
cg15980752 6.59E-04 0.029 0.026 -0.004 chr1:155178398 THBS3 TSS1500 - shore
cg27087212 1.73E-04 0.907 0.908 0.000 chr5:56908877 LINCR-0003 Corpo do gene - open sea
cg25499687 8.76E-04 0.027 0.029 0.002 chrX:133507336 PHF6 TSS200 - island
cg23474890 8.44E-04 0.868 0.871 0.002 chr12:122467179 BCL7A Corpo do gene - open sea
cg00334424 8.99E-04 0.810 0.814 0.004 chr2:145559337 TEX41 Corpo do gene - open sea
cg08254771 9.43E-04 0.935 0.940 0.005 chr7:73386116 IGR IGR - open sea
cg13629659 8.12E-04 0.905 0.912 0.007 chr1:23664628 HNRNPR 5'UTR - open sea
cg05418331 6.56E-04 0.931 0.938 0.007 chr5:79927572 DHFR Corpo do gene - open sea
cg26475594 4.48E-04 0.924 0.931 0.008 chr19:35260608 ZNF599 Corpo do gene - shelf
cg02975953 8.07E-04 0.846 0.865 0.018 chr16:88553483 ZFPM1 Corpo do gene - shore
Anexos 84
cg05693313 9.79E-04 0.913 0.922 0.009 chr7:148710922 PDIA4 Corpo do gene - open sea
cg26369315 9.48E-04 0.928 0.936 0.009 chr10:134912228 GPR123 Corpo do gene - island
cg02591563 9.71E-04 0.903 0.912 0.009 chr10:65046179 JMJD1C Corpo do gene - open sea
cg19851413 8.37E-04 0.840 0.849 0.009 chr17:9371130 STX8 Corpo do gene - open sea
cg05646066 5.43E-04 0.934 0.944 0.010 chrX:16840741 TXLNG Corpo do gene - open sea
cg16228039 9.06E-04 0.874 0.884 0.010 chr15:88535619 NTRK3 Corpo do gene - open sea
cg06976209 9.14E-04 0.880 0.891 0.011 chr3:15457528 METTL6 Corpo do gene - open sea
cg06722397 8.85E-04 0.883 0.894 0.011 chr1:7839884 VAMP3 3'UTR - shelf
cg11254527 8.76E-04 0.899 0.911 0.012 chr1:35873695 ZMYM4 Corpo do gene - open sea
cg06142142 6.58E-04 0.895 0.906 0.012 chr10:115938512 TDRD1 TSS1500 - shore
cg21037155 9.49E-04 0.905 0.917 0.012 chr17:37616956 CDK12 TSS1500 - shore
cg11664673 8.17E-04 0.928 0.940 0.012 chr10:28824590 WAC Corpo do gene - shore
cg02711904 5.03E-04 0.915 0.928 0.013 chr9:33364624 NFX1 Corpo do gene - open sea
cg06592137 2.07E-04 0.925 0.938 0.013 chr17:56029300 CUEDC1 5'UTR - shelf
cg02331812 5.47E-04 0.918 0.931 0.013 chr11:118842932 FOXR1 Corpo do gene - island
cg17608456 8.35E-04 0.835 0.849 0.014 chr10:14599023 FAM107B 5'UTR - open sea
cg17943624 8.87E-04 0.911 0.925 0.014 chr8:48424300 SPIDR Corpo do gene - open sea
cg15503706 7.21E-04 0.923 0.937 0.014 chr17:35679212 ACACA Corpo do gene - open sea
cg06452086 5.05E-04 0.913 0.927 0.014 chr3:149686266 PFN2 Corpo do gene - shore
cg12204245 5.03E-04 0.879 0.893 0.014 chr13:114321214 GRK1 TSS1500 - open sea
cg18656644 6.07E-04 0.923 0.937 0.014 chr19:41058885 SPTBN4 Corpo do gene - shore
cg17996603 3.64E-04 0.889 0.903 0.014 chr2:110959266 NPHP1 Corpo do gene - shelf
cg04532381 6.75E-04 0.897 0.911 0.014 chr17:9359598 STX8 Corpo do gene - open sea
cg05814257 5.43E-04 0.904 0.919 0.015 chr2:37032869 VIT Corpo do gene - shelf
cg04933384 5.03E-04 0.920 0.935 0.015 chr15:50840217 USP50 TSS1500 - open sea
cg20152459 9.22E-04 0.905 0.920 0.015 chr8:126009481 SQLE TSS1500 - shore
cg26210451 4.48E-04 0.894 0.909 0.015 chr7:70592898 IGR IGR - shelf
cg13878116 9.22E-04 0.906 0.921 0.015 chr15:55881607 PYGO1 TSS1500 - shore
cg27490029 4.48E-04 0.892 0.907 0.015 chr17:35774430 TADA2A Corpo do gene - open sea
cg18287300 2.41E-04 0.913 0.928 0.015 chr5:112249428 REEP5 Corpo do gene - open sea
cg16957581 9.99E-04 0.898 0.913 0.016 chr7:128441085 CCDC136 Corpo do gene - open sea
cg13108397 8.15E-04 0.894 0.910 0.016 chr15:91263157 BLM 5'UTR - shelf
cg18981227 1.79E-04 0.894 0.911 0.016 chrX:68072547 IGR IGR - open sea
cg00847238 8.70E-04 0.906 0.922 0.016 chr6:108250709 SEC63 ExonBnd - open sea
cg14740901 3.73E-04 0.901 0.918 0.017 chr9:102874024 INVS Corpo do gene - open sea
cg06485000 8.15E-04 0.891 0.908 0.017 chr17:78881721 RPTOR Corpo do gene - shore
cg02530753 5.43E-04 0.889 0.906 0.017 chr17:65955867 BPTF Corpo do gene - open sea
cg22489875 4.70E-04 0.899 0.916 0.017 chr20:33343193 NCOA6 Corpo do gene - open sea
cg06609182 5.70E-04 0.926 0.944 0.018 chr4:3235000 HTT Corpo do gene - open sea
cg02018930 6.65E-04 0.859 0.878 0.018 chr12:53413966 EIF4B Corpo do gene - open sea
cg04719116 9.66E-04 0.893 0.912 0.018 chr22:41360860 RBX1 Corpo do gene - open sea
Anexos 85
cg22925694 6.56E-04 0.864 0.884 0.020 chr2:65340428 RAB1A Corpo do gene - open sea
TVP23C-
cg17557257 8.40E-04 0.867 0.887 0.020 chr17:15425106 Corpo do gene - open sea
CDRT4
cg08247297 7.24E-04 0.876 0.897 0.020 chr21:46917541 COL18A1 Corpo do gene - shore
cg03541903 9.77E-04 0.832 0.852 0.020 chr5:130651434 CDC42SE2 5'UTR - open sea
cg18394881 7.84E-04 0.882 0.902 0.021 chr1:3512777 MEGF6 Corpo do gene - shore
cg12021430 9.22E-04 0.875 0.895 0.021 chr7:156952445 UBE3C Corpo do gene - open sea
cg22664874 9.54E-04 0.897 0.918 0.021 chr4:71599063 RUFY3 TSS1500 - open sea
cg01671333 6.56E-04 0.892 0.913 0.021 chr17:1545307 SCARF1 Corpo do gene - shore
cg12512173 9.61E-04 0.898 0.919 0.021 chr13:111936059 ARHGEF7 Corpo do gene - shore
cg07392941 2.41E-04 0.889 0.910 0.021 chr2:206888934 INO80D Corpo do gene - open sea
cg06840801 2.12E-04 0.871 0.893 0.022 chr8:42552719 CHRNB3 1stExon - open sea
cg15039577 4.28E-04 0.880 0.901 0.022 chr3:194389125 LSG1 Corpo do gene - shelf
cg14192191 9.49E-04 0.876 0.898 0.022 chr9:15502633 PSIP1 Corpo do gene - open sea
cg24034620 9.79E-04 0.847 0.869 0.022 chr19:37936081 ZNF569 5'UTR - open sea
cg21199772 5.01E-04 0.879 0.902 0.022 chr9:99157100 ZNF367 ExonBnd - open sea
cg07520419 8.76E-04 0.877 0.899 0.022 chr11:71943187 INPPL1 Corpo do gene - open sea
cg00379615 5.03E-04 0.840 0.863 0.023 chr8:81895014 PAG1 Corpo do gene - open sea
cg02918879 9.79E-04 0.846 0.869 0.023 chrX:123127175 STAG2 5'UTR - open sea
cg22079827 6.07E-04 0.750 0.773 0.023 chr1:114656043 SYT6 Corpo do gene - open sea
cg09548990 3.73E-04 0.868 0.892 0.023 chr4:39747702 UBE2K Corpo do gene - open sea
cg17843208 5.01E-04 0.892 0.916 0.024 chr17:61933428 TCAM1 TSS1500 - open sea
cg13246941 8.37E-04 0.836 0.860 0.025 chr3:41878377 ULK4 Corpo do gene - open sea
cg09534800 3.73E-04 0.884 0.909 0.025 chr16:4522192 NMRAL1 Corpo do gene - shore
cg05411520 5.03E-04 0.888 0.913 0.025 chr1:200640507 DDX59 TSS1500 - shore
cg06773054 4.22E-04 0.859 0.884 0.025 chr15:59563393 MYO1E Corpo do gene - open sea
cg05324787 2.12E-04 0.879 0.905 0.026 chr11:9455809 IPO7 Corpo do gene - open sea
cg07384147 7.87E-04 0.839 0.866 0.027 chr4:8273940 HTRA3 Corpo do gene - shore
cg06859941 8.15E-04 0.849 0.876 0.027 chr21:43844348 UBASH3A Corpo do gene - open sea
cg27291842 4.22E-04 0.904 0.931 0.027 chr12:123265481 CCDC62 Corpo do gene - open sea
cg08289375 9.14E-04 0.859 0.886 0.027 chr13:114172939 TMCO3 Corpo do gene - open sea
cg15777013 5.43E-04 0.818 0.845 0.027 chr15:65989475 DENND4A Corpo do gene - open sea
cg14655858 8.33E-05 0.859 0.886 0.028 chr8:37978472 ASH2L Corpo do gene - open sea
cg10274696 8.17E-04 0.825 0.853 0.028 chr7:40260671 C7orf10 Corpo do gene - open sea
cg08042092 8.99E-04 0.086 0.114 0.028 chr5:175815846 NOP16 TSS200 - island
cg08917022 5.43E-04 0.857 0.885 0.028 chr5:623259 CEP72 Corpo do gene - island
cg08204093 9.22E-04 0.857 0.885 0.028 chr12:123686537 MPHOSPH9 Corpo do gene - open sea
cg13024564 2.23E-04 0.878 0.906 0.028 chr11:126862306 KIRREL3 Corpo do gene - open sea
PHOSPHO2-
cg26646208 8.83E-04 0.868 0.897 0.029 chr2:170583963 5'UTR - open sea
KLHL23
cg11148957 6.64E-04 0.823 0.852 0.029 chr1:7540638 CAMTA1 Corpo do gene - open sea
cg07343707 8.76E-04 0.843 0.872 0.029 chr2:240110301 HDAC4 Corpo do gene - shore
Anexos 86
cg06310844 3.73E-04 0.248 0.277 0.029 chr19:33072506 PDCD5 Corpo do gene - island
cg18089482 6.87E-04 0.877 0.907 0.030 chr20:35580972 SAMHD1 TSS1500 - shore
cg23942887 4.16E-04 0.834 0.864 0.030 chr3:10079106 FANCD2 Corpo do gene - open sea
cg04497003 8.94E-04 0.846 0.876 0.030 chr7:99144379 FAM200A Corpo do gene - shelf
cg13426829 5.26E-04 0.269 0.299 0.030 chr6:124124875 NKAIN2 TSS200 - island
cg00360866 7.24E-04 0.806 0.836 0.030 chr15:65627661 IGDCC3 Corpo do gene - open sea
cg02747169 6.04E-04 0.871 0.902 0.030 chr17:72982851 CDR2L TSS1500 - shore
cg15891603 5.99E-04 0.863 0.893 0.031 chr9:96394134 PHF2 Corpo do gene - open sea
cg23476801 6.85E-04 0.874 0.906 0.032 chr4:140037891 ELF2 Corpo do gene - shore
cg05317610 9.07E-04 0.877 0.909 0.032 chr1:29015158 GMEB1 Corpo do gene - open sea
cg10612751 2.67E-04 0.867 0.899 0.032 chr4:169751983 PALLD Corpo do gene - shore
cg14779090 8.12E-04 0.716 0.748 0.032 chr19:9083943 MUC16 1stExon - open sea
cg09402329 5.43E-04 0.824 0.857 0.033 chr14:31349788 COCH ExonBnd - open sea
cg26688472 9.14E-04 0.204 0.236 0.033 chr2:203638928 ICA1L 3'UTR - island
cg06070346 6.52E-04 0.845 0.878 0.033 chr6:139180683 ECT2L Corpo do gene - open sea
cg13363124 9.49E-04 0.875 0.908 0.033 chr22:45182017 ARHGAP8 5'UTR - island
cg23587258 7.24E-04 0.871 0.904 0.033 chr12:112506593 NAA25 Corpo do gene - open sea
cg25208258 9.13E-04 0.789 0.822 0.033 chr18:14336385 LOC284233 TSS1500 - open sea
cg05198960 8.94E-04 0.844 0.877 0.033 chr12:133309102 ANKLE2 Corpo do gene - island
cg19144502 9.71E-04 0.853 0.887 0.034 chr14:35777813 PSMA6 5'UTR - open sea
cg13890597 4.12E-04 0.864 0.898 0.034 chr1:161481847 FCGR2A Corpo do gene - open sea
cg01678313 9.98E-04 0.868 0.904 0.036 chr3:13083892 IQSEC1 Corpo do gene - open sea
cg02724203 4.48E-04 0.860 0.897 0.036 chr12:1204071 ERC1 Corpo do gene - open sea
cg14418992 6.56E-04 0.819 0.856 0.037 chr3:169866747 PHC3 Corpo do gene - open sea
cg06667316 8.66E-04 0.851 0.888 0.037 chr19:11550036 PRKCSH Corpo do gene - shelf
cg15031162 6.64E-04 0.826 0.863 0.037 chr16:68349632 PRMT7 5'UTR - open sea
cg09391998 8.95E-04 0.839 0.877 0.038 chr11:113688523 USP28 Corpo do gene - open sea
cg15658543 4.48E-04 0.800 0.837 0.038 chr7:3026309 CARD11 5'UTR - open sea
cg27639283 4.48E-04 0.798 0.837 0.038 chr19:9412868 ZNF699 Corpo do gene - open sea
cg06371374 6.52E-04 0.746 0.785 0.039 chr3:128120212 EEFSEC Corpo do gene - open sea
cg13711144 9.79E-04 0.822 0.862 0.040 chr7:107218933 BCAP29 TSS1500 - shore
cg18016444 6.18E-04 0.828 0.868 0.040 chr4:3093377 HTT Corpo do gene - open sea
cg14460558 9.79E-04 0.868 0.909 0.041 chr9:90795554 IGR IGR - island
cg07945682 5.03E-04 0.803 0.844 0.041 chr17:65467821 PITPNC1 Corpo do gene - open sea
cg16824024 9.87E-04 0.819 0.860 0.041 chr3:73092158 PPP4R2 Corpo do gene - open sea
cg07405570 4.48E-04 0.822 0.864 0.042 chr12:7111582 LPCAT3 Corpo do gene - open sea
cg16671570 9.49E-04 0.835 0.878 0.043 chrX:24080372 EIF2S3 Corpo do gene - open sea
cg08707253 5.99E-04 0.808 0.851 0.043 chr12:53979663 ATF7 Corpo do gene - open sea
Anexos 87
cg01456626 9.79E-04 0.758 0.802 0.044 chr17:38611497 IGFBP4 Corpo do gene - open sea
cg15377630 6.56E-04 0.790 0.835 0.045 chrX:16844007 TXLNG Corpo do gene - open sea
cg07232688 6.64E-04 0.795 0.840 0.045 chr1:100644688 LRRC39 TSS1500 - open sea
cg22935319 6.07E-04 0.737 0.782 0.046 chr17:38545021 TOP2A 3'UTR - open sea
cg23072571 5.26E-04 0.828 0.874 0.046 chr19:54291978 MIR373 Corpo do gene - open sea
cg04673882 3.94E-04 0.842 0.888 0.046 chr12:112506752 NAA25 Corpo do gene - open sea
cg06031041 7.47E-04 0.797 0.845 0.047 chr7:4810741 FOXK1 3'UTR - shelf
cg06076564 3.73E-04 0.785 0.832 0.048 chr4:77977334 CCNI Corpo do gene - open sea
cg18965086 7.68E-04 0.833 0.881 0.048 chr1:109619546 TAF13 TSS1500 - shore
cg00520305 9.79E-04 0.754 0.805 0.051 chr3:149325760 WWTR1 Corpo do gene - open sea
cg14313797 5.99E-04 0.786 0.837 0.051 chr10:12497957 CAMK1D Corpo do gene - open sea
cg06409490 3.73E-04 0.779 0.831 0.052 chr19:36897639 ZFP82 Corpo do gene - open sea
cg23442804 8.76E-04 0.795 0.849 0.054 chr1:220266433 IARS2 TSS1500 - shore
cg17239848 6.95E-05 0.541 0.596 0.055 chr20:58586687 CDH26 Corpo do gene - open sea
cg10878998 3.53E-04 0.170 0.226 0.056 chr18:71959092 CYB5A 1stExon - island
cg00201819 9.49E-04 0.815 0.871 0.056 chr10:134910421 GPR123 Corpo do gene - shore
cg21194785 5.42E-04 0.792 0.849 0.057 chr22:29105478 CHEK2 Corpo do gene - open sea
cg15363973 4.40E-04 0.847 0.905 0.058 chr7:886836 UNC84A Corpo do gene - island
cg00344738 5.81E-04 0.788 0.847 0.059 chr12:101753988 UTP20 Corpo do gene - open sea
cg23470478 8.70E-04 0.789 0.849 0.060 chr19:9433826 ZNF559 TSS1500 - shore
cg06454983 3.53E-04 0.769 0.829 0.060 chr18:12418005 SLMO1 Corpo do gene - shelf
cg07595203 6.39E-04 0.678 0.739 0.061 chr11:2721480 KCNQ1OT1 TSS1500 - island
cg13827444 9.66E-04 0.835 0.895 0.061 chr3:72201951 LINC00870 Corpo do gene - open sea
cg02854791 9.67E-04 0.720 0.782 0.062 chr7:157776477 PTPRN2 Corpo do gene - open sea
cg05383842 3.73E-04 0.750 0.812 0.062 chr12:8072929 SLC2A3 3'UTR - open sea
cg01024878 9.34E-04 0.741 0.805 0.064 chr9:96356546 MIR548AU TSS1500 - open sea
cg10748867 5.03E-04 0.784 0.848 0.064 chr1:19577036 MRTO4 TSS1500 - shore
cg09460500 5.03E-04 0.780 0.845 0.065 chr5:134077921 CAMLG Corpo do gene - shelf
cg06421658 9.55E-04 0.793 0.858 0.066 chr5:68710528 MARVELD2 TSS1500 - shore
cg25219674 9.99E-04 0.721 0.787 0.066 chr3:184972683 EHHADH TSS1500 - shore
cg18459342 7.87E-04 0.275 0.342 0.066 chr8:81084056 TPD52 TSS1500 - island
cg10437787 6.83E-04 0.764 0.831 0.067 chr17:7904871 GUCY2D TSS1500 - shore
cg19271013 6.48E-04 0.762 0.829 0.067 chr16:78131862 WWOX TSS1500 - shore
cg12884247 8.41E-04 0.714 0.782 0.068 chrX:70511422 NONO 5'UTR - open sea
cg20353344 6.75E-04 0.769 0.839 0.070 chr11:65489582 RNASEH2C TSS1500 - shore
cg03818793 2.40E-04 0.233 0.304 0.071 chr18:24129558 KCTD1 TSS1500 - island
cg05150224 3.53E-04 0.702 0.774 0.072 chr16:58587227 CNOT1 Corpo do gene - open sea
cg17375381 5.90E-04 0.707 0.779 0.073 chr3:11685729 VGLL4 TSS1500 - shore
cg12598455 7.84E-04 0.720 0.794 0.073 chr16:19077221 LOC102723385 Corpo do gene - shore
cg05586540 2.86E-04 0.764 0.837 0.073 chr6:43046201 PTK7 Corpo do gene - shore
cg02641277 7.84E-04 0.735 0.810 0.075 chr4:186350279 C4orf47 TSS1500 - shelf
cg10965596 4.13E-04 0.780 0.855 0.075 chr2:27348263 ABHD1 Corpo do gene - shore
Anexos 88
cg19030737 9.87E-04 0.722 0.798 0.076 chr1:226927988 ITPKB TSS1500 - shore
cg07944916 6.75E-04 0.763 0.839 0.077 chr2:9697398 ADAM17 TSS1500 - shore
cg05941652 9.49E-04 0.704 0.781 0.077 chr18:21273909 LAMA3 Corpo do gene - shelf
cg24421839 5.90E-04 0.722 0.800 0.078 chr15:85111313 UBE2QP1 Corpo do gene - shelf
cg02944903 6.65E-04 0.651 0.730 0.078 chr18:2664728 SMCHD1 Corpo do gene - open sea
cg12180316 4.40E-04 0.753 0.833 0.081 chr17:80681317 FN3KRP Corpo do gene - open sea
cg07517688 6.03E-04 0.569 0.650 0.081 chr14:70118078 SUSD6 5'UTR - open sea
cg17587610 5.47E-04 0.738 0.820 0.082 chr11:61195387 CPSF7 Corpo do gene - shore
cg00837060 8.15E-04 0.769 0.851 0.082 chr14:23234275 OXA1L TSS1500 - shore
cg12417176 4.48E-04 0.782 0.865 0.083 chr15:55788778 DYX1C1 Corpo do gene - shore
cg09676484 9.71E-04 0.720 0.803 0.083 chr17:49232155 NME1 5'UTR - shore
cg19214746 5.03E-04 0.736 0.820 0.083 chr12:122879564 CLIP1-AS1 TSS1500 - open sea
cg17784876 4.53E-04 0.653 0.737 0.084 chr1:39464086 AKIRIN1 Corpo do gene - open sea
cg03105206 5.33E-04 0.733 0.818 0.085 chr10:126315291 FAM53B Corpo do gene - open sea
cg15050328 6.35E-04 0.723 0.810 0.087 chr3:124448651 UMPS TSS1500 - shore
cg15482621 4.48E-04 0.580 0.667 0.087 chr6:86259651 SNX14 Corpo do gene - open sea
cg07646209 7.94E-04 0.711 0.799 0.088 chr19:58240321 ZNF671 TSS1500 - shore
cg18555528 5.03E-04 0.675 0.765 0.089 chr10:103125699 BTRC Corpo do gene - open sea
cg08976738 3.94E-04 0.718 0.808 0.090 chr15:80873380 MIR5572 TSS200 - open sea
cg26419869 4.48E-04 0.683 0.773 0.090 chr1:182923215 C1orf14 TSS1500 - shore
cg06521359 6.75E-04 0.608 0.699 0.090 chr1:203767572 ZC3H11A 5'UTR - shelf
cg00375025 2.34E-04 0.761 0.852 0.091 chr3:155860932 KCNAB1 1stExon - open sea
cg01589054 5.03E-04 0.746 0.837 0.091 chr3:11744933 VGLL4 5'UTR - shore
cg05624196 8.15E-04 0.695 0.788 0.094 chr3:195310883 APOD 1stExon - open sea
cg09443855 7.83E-04 0.763 0.858 0.095 chr22:41602903 L3MBTL2 Corpo do gene - shore
cg13520531 8.02E-04 0.620 0.715 0.095 chr19:2268580 OAZ1 TSS1500 - shore
cg21954085 4.48E-04 0.559 0.656 0.097 chr7:156664673 LMBR1 Corpo do gene - open sea
cg19949673 5.03E-04 0.690 0.787 0.097 chr9:128067348 GAPVD1 ExonBnd - open sea
cg25801499 8.11E-04 0.647 0.745 0.097 chr17:60760293 MRC2 Corpo do gene - shelf
cg22779330 6.56E-04 0.619 0.716 0.098 chr11:69061911 MYEOV 5'UTR - open sea
cg22457516 1.73E-04 0.697 0.796 0.099 chr11:83393422 DLG2 1stExon - open sea
cg06875255 1.87E-04 0.676 0.776 0.101 chr2:71787827 DYSF Corpo do gene - island
cg22264420 8.99E-04 0.704 0.808 0.103 chr11:8891370 ST5 5'UTR - shore
cg22954146 1.87E-04 0.705 0.809 0.104 chr1:20835272 MUL1 TSS1500 - shore
cg18761380 4.96E-04 0.657 0.761 0.104 chr1:245186137 EFCAB2 Corpo do gene - open sea
cg06371658 6.75E-04 0.681 0.788 0.107 chr3:10292843 TATDN2 Corpo do gene - shore
cg26443995 9.49E-04 0.518 0.626 0.108 chr2:187560059 FAM171B Corpo do gene - shore
cg08198430 6.56E-04 0.641 0.749 0.108 chr14:24733757 TGM1 TSS1500 - open sea
cg06965610 5.43E-04 0.580 0.692 0.113 chr8:28994608 KIF13B Corpo do gene - open sea
cg08269941 7.24E-04 0.703 0.816 0.113 chr21:38337048 HLCS 5'UTR - shore
cg21125452 6.64E-04 0.647 0.761 0.114 chr8:120846352 TAF2 TSS1500 - shore
cg07649114 9.48E-04 0.666 0.780 0.114 chr7:150494998 TMEM176B 5'UTR - shore
Anexos 89
Tabela Anexo B (conclusão). Sítios diferencialmente metilados (DMSs) entre dependentes de crack e controles
cg22585255 6.47E-04 0.659 0.773 0.114 chr11:57519288 BTBD18 TSS200 - shore
cg10088939 9.66E-04 0.708 0.822 0.114 chr7:99101050 ZKSCAN5 TSS1500 - shore
cg25149391 8.76E-04 0.636 0.754 0.118 chr11:68520448 MTL5 TSS1500 - shore
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cg19226080 3.73E-04 0.605 0.728 0.123 chr4:39480565 LOC401127 TSS1500 - shore
cg17162808 6.56E-04 0.676 0.801 0.125 chr20:33266296 PIGU TSS1500 - shore
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cg24707290 3.73E-04 0.588 0.722 0.134 chr1:109421497 GPSM2 5'UTR - shore
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cg07494499 9.89E-04 0.565 0.703 0.138 chr17:837017 NXN Corpo do gene - open sea
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cg00997655 8.33E-05 0.653 0.795 0.142 chr5:125929132 ALDH7A1 Corpo do gene - shore
cg03273574 1.73E-04 0.616 0.759 0.143 chr17:57286182 SMG8 TSS1500 - shore
cg13434525 8.70E-04 0.606 0.752 0.146 chr13:98627196 IPO5 Corpo do gene - shore
cg18929316 5.36E-04 0.599 0.749 0.150 chr17:46176848 CBX1 5'UTR - shore
cg07703331 6.29E-04 0.602 0.757 0.155 chr13:21521930 LINC00367 Corpo do gene - shore
cg12839200 2.84E-04 0.568 0.725 0.156 chr11:71789642 NUMA1 Corpo do gene - shore
cg14818176 8.35E-04 0.580 0.740 0.159 chr17:73148480 HN1 5'UTR - shore
cg24247939 6.64E-04 0.502 0.665 0.163 chr2:61292081 KIAA1841 TSS1500 - shore
Legenda: Probe ID - Identificação da sonda; adjP - p-valor ajustado; β – valor beta; Δβ - delta beta; chr - Cromossomo; IGR –
Região intergênica.
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Avaliação da idade epigenética e

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

Avaliação da idade epigenética e

Tese apresentada à Faculdade de Medicina

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e

2.1. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................ 4

4.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 22

5. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 23

5.1. AMOSTRA ....................................................................................................................... 24

6.1. OBJETIVO ESPECÍFICO 1 ......................................................................................... 34

7.1. OBJETIVO ESPECÍFICO 1 ......................................................................................... 63

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 90

Figura 10 – Modelo final apresentado para o modelo conceitual 3................................ 45

Figura 13 – Distribuição genômica dos sítios diferencialmente metilados (DMSs)...... 50

Figura 15 - Representação gráfica das regiões diferencialmente metiladas (DMRs).... 51

Tabela 1 - Características sociodemográficas da amostra............................................ 34

Early Trauma Inventory Self

>/≥ Maior / Maior ou igual FDR False discovery rate

Média GO Gene ontology

β / ∆β Beta / Delta Beta IC Intervalo de confiança

°C Grau Celsius IGR Região intergênica

ε Erro padrão M Variável mediadora

χ2 Qui-quadrado MAPK mitogen-activated protein kinase

a Efeito indireto Max / Min Valor máximo / Valor mínimo

adjP p-valor ajustado N Distribuição numérica

AIC Akaike information criterion NCAM Neural cell adhesion molecule

AKT serine/threonine kinase 1 NF-κB Nuclear Factor kappa B

b Efeito indireto pb Pares de base

BH Benjamini-Hochberg PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

c´ Efeito direto SF-36 Short Form Health Survey

DNA Ácido desoxirribonucléico v. Versão

INTRODUÇÃO: A metilação do DNA têm a capacidade de medir o trabalho

Descritores: Ambiente; Crack; Dependência química; Envelhecimento celular;

Descriptors: Environmental; Crack cocaine; Drug dependence; Biological aging;

O epigenoma representa a capacidade de um organismo de se adaptar e evoluir por

O termo „epigenética‟ surgiu na década de 1940, com o biólogo e embriologista

2.1.2. Metilação do DNA

A metilação do DNA é a modificação epigenética mais bem compreendida e a

2.1.3. Metilação do DNA e fatores ambientais

Assim como toda a maquinaria epigenética, a metilação do DNA é um processo

2.1.4. Relógio epigenético

O relógio epigenético é um „preditor‟ que permite estimar a idade biológica dos

pode estimar a „aceleração de idade‟, que consiste na diferença entre a idade

Em relação ao uso de substâncias, o consumo leve à moderado de álcool foi

2.2.1. Dependência de crack

A expansão e disseminação do consumo de crack vem se tornando um grave

2.2.2. Influência de fatores ambientais na dependência de crack

fatores ambientais considerados como „fatores de risco‟ para a dependência de

2.2.3. Estudos genéticos e epigenéticos na dependência de crack

2.3.1. Análise de mediação

A análise de mediação é uma técnica estatística utilizada para avaliar o mecanismo

2.3.2. Modelagem de equações estruturais

A modelagem de equações estruturais (SEM - Structural Equation Modelling) é

 Razão entre o teste qui-quadrado e graus de liberdade (χ2/df): Compara a

 Root mean square error of approximation (RMSEA): Mede o ajuste geral do

 Standardised root mean square residual (SRMR): Medida baseada na

 Adjusted goodness-of-fit statistic (AGFI): Calcula a proporção da variância