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    Apostila Prática 2 - PCR

    Enviado por

    Jéssica N. Costa
    Este documento descreve o protocolo para realizar a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar genes de plantas. A PCR envolve três etapas cíclicas de desnaturação do DNA, anelamento de primers e extensão da cadeia por uma DNA polimerase, resultando na amplificação seletiva de DNA. O protocolo específico inclui colocar reagentes em microtubos e submetê-los a diferentes temperaturas em um termociclador para completar as etapas da PCR.

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    Apostila Prática 2 - PCR

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    Jéssica N. Costa
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    Este documento descreve o protocolo para realizar a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar genes de plantas. A PCR envolve três etapas cíclicas de desnaturação do DNA, anelamento de primers e extensão da cadeia por uma DNA polimerase, resultando na amplificação seletiva de DNA. O protocolo específico inclui colocar reagentes em microtubos e submetê-los a diferentes temperaturas em um termociclador para completar as etapas da PCR.

    Título original

    Apostila Prática 2 - PCR (1)

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    Este documento descreve o protocolo para realizar a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar genes de plantas. A PCR envolve três etapas cíclicas de desnaturação do DNA, anelamento de primers e extensão da cadeia por uma DNA polimerase, resultando na amplificação seletiva de DNA. O protocolo específico inclui colocar reagentes em microtubos e submetê-los a diferentes temperaturas em um termociclador para completar as etapas da PCR.

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    Jéssica N. Costa
    Este documento descreve o protocolo para realizar a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar genes de plantas. A PCR envolve três etapas cíclicas de desnaturação do DNA, anelamento de primers e extensão da cadeia por uma DNA polimerase, resultando na amplificação seletiva de DNA. O protocolo específico inclui colocar reagentes em microtubos e submetê-los a diferentes temperaturas em um termociclador para completar as etapas da PCR.

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    UENF LBT/CBB

    Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Laboratório de Biotecnologia

    Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)


    (PRÁTICA 3 – Biologia Molecular)

    Coordenador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho


    Colaboradores: Luciano de Souza Vespoli
    Patrícia Louzada Rangel
    Suzane Ariádina de Souza
    INTRODUÇÃO

    A técnica, inicialmente, foi desenvolvida por Karry Mullis, que em 1993 foi ganhador
    do Prêmio Nobel de Química. A Reação em Cadeia Polimerase é amplamente utilizada nos
    laboratórios de biologia molecular, já que permite a amplificação de curtas seqüências de DNA
    in vitro, em um milhão de cópias, em poucas horas, sem a necessidade de um sistema vivo de
    células. A PCR envolve o uso de oligonucleotídeos sintéticos de DNA denominados iniciadores
    ou primers que são complementares as sequências localizadas nas extremidades da região de
    interesse.
    A PCR compreende três etapas. Cada uma corresponde a um evento distinto,
    com uma temperatura ótima de funcionamento.

    1º Etapa: DESNATURAÇÃO
    A primeira etapa corresponde a desnaturação da dupla fita de DNA, nesta a
    temperatura é elevada entre 92 e 96 oC que leva à quebra das pontes de hidrogênio que
    ligam as bases nitrogenadas.

    2º Etapa: ANELAMENTO
    A segunda etapa corresponde ao anelamento dos primers (oligonucleotídeos
    sintéticos) de DNA, que se anelam à seqüências específicas localizados nas
    extremidades do filamento molde. Nesta etapa, a temperatura é reduzida entre 42 e 60
    o
    C (dependendo do conteúdo C e G encontrada no primer) por alguns segundos. Os
    primers são necessários para amplificação da cadeia porque fornecem o grupo 3’-OH
    utilizado pela enzima polimerase, para dar início a amplificação da cadeia.

    3º Etapa: EXTENSÃO
    A terceira etapa corresponde à extensão, isto é, o início da polimerização da
    cadeia. Nesta etapa, a polimerase dá início à síntese da cadeia adicionando, nas
    extremidades dos primers anelados, os dNTPs (desoxirribonucleotídeos fosfatados) que
    constituem os “blocos de construção” do filamento molde de DNA. Nesta etapa do ciclo
    a temperatura é elevada a 72oC.

    Todo o processo é repetido, a partir da desnaturação até a extensão, por várias


    vezes (entre 25 e 40 vezes - denominados ciclos) até que se obtenha uma quantidade
    razoável do DNA a ser amplificado.

    1
    ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 3
    Reação em Cadeia de Polimerase

    OBJETIVO: A PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado


    segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena quantidade de DNA-molde. Nesta
    aula, realizaremos a amplificação dos genes CYP71A12, FRK1, AT5G64890 e
    WRKY30.

    MATERIAL E MÉTODOS:

    MATERIAL

    • Água ultra pura


    • Iniciadores
    • DNA-molde (DNA genômico vegetal)
    • Desoxirribonucleotídeos (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
    • Tampão da Taq DNA-polimerase
    • Cofator enzimático (MgCl2)
    • Taq DNA-polimerase

    METODOLOGIA

    1º Etapa: Em um microtubo para PCR, pipetar as seguintes soluções:


    - Água ultra pura 14,8 µl
    - DNA molde (50 ng/µl) 1,0 µl
    - Iniciador 1 (20 pmol/µl) 0,5 µl
    - Iniciador 2 (20 pmol/µl) 0,5 µl
    - Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)* 2,5 µl
    - MgCl2 (25 mM) 1,5 µl
    - dNTP's (1,25 mM) 4,0 µl
    - Taq DNA-polimerase (5 U/µl)** 0,2 µl
    __________

    Volume total = 25,0 µl


    2
    Nota: Uma unidade enzimática da DNA-polimerase é definida como a quantidade de
    enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmol de dNTP durante 30 min à
    72 °C.

    2º Etapa: Colocar a reação em um termociclador com a seguinte programação de ciclos


    de temperatura:

    95 °C - DESNATURAÇÃO INICIAL 5 minutos


    95 °C - DESNATURAÇÃO 1 minuto
    40 CICLOS 42 °C - ANELAMENTO 45 segundos
    72 °C - EXTENSÃO 2 minutos
    72 °C - EXTENSÃO FINAL 5 minutos
    4 ° C - ARMAZENAMENTO a definir

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