UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO
MESTRADO SAÚDE DO ADULTO E DA CRIANÇA

ATIVIDADE DA Euterpe oleracea Mart SOBRE OS FATORES DE

VIRULÊNCIA DE Aspergillus fumigatus EM SUPERFÍCIE ABIÓTICA E
CELULAR.

Proponente: Katia Regina Assunção Borges

São Luis – MA

2016
 SUMÁRIO

INDENTIFICAÇÃO DO PROPONENTE E DA SUA Pg

INSITUTUIÇÃO DE VÍNCULO
DADOS DA EQUIPE EXECULTORA DO PROJETO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................. 5
2 JUSTIFICATIVA................................................................................ 7
3 OBJETIVOS...................................................................................... 8
3.1 Geral.................................................................................................. 8
3.2 Específico.......................................................................................... 8
4 METODOLOGIA................................................................................ 9
4.1 Estrutura física................................................................................... 9
4.2 Aderência em biomateriais................................................................ 10
4.3 Ensaio de biofilme............................................................................ 10
4.4 Preparo do extrato hidroalcóolico .................................................... 10
4.4.1 Coleta do fruto.................................................................................. 10
4.4.2 Obtenção do extrato.......................................................................... 11
5. ANALISE ESTATÍSTICA.................................................................. 11
6 ORÇAMENTO................................................................................... 14
7 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DE ATIVIDADES........................ 15
REFERÊNCIAS................................................................................. 16
IDENTIFICAÇÃO DO PROPONENTE E DA SUA INSTITUIÇÃO DE VÍNCULO

Título do projeto: ATIVIDADE DA Euterpe oleracea Mart SOBRE OS FATORES DE

VIRULÊNCIA DE Aspergillus fumigatus EM SUPERFÍCIE ABIÓTICA E CELULAR

Proponente: KATIA REGINA ASSUNÇÃO BORGES

Instituição: UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO – UFMA

DADOS DO PROPONENTE
Aluna: Programa de Mestrado Saúde do Adulto e da Criança.
CPF: 684960603-49
RG: 2096292-4 SSPMA
Endereço: Rua Virgílio Domingues
CEP: 65076- 340
Telefone: (98) 98873-3781
Email: [email protected]

DADOS DA INSTITUIÇÃO
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão - UFMA
CNPJ: 06.279.103/0001-19
Endereço: Avenida dos Portugueses, 1966, Bacanga. São Luís - MA
CEP: 65040-080
Telefone: (98) 3272-8000
Email: [email protected]
Departamento de vínculo: Departamento de Patologia
Setor: Núcleo de Imunologia Básica e Aplicada – NIBA
Telefone: (98) 3272-8535

2
DADOS DA EQUIPE EXECUTORA DO PROJETO
1 - Coordenadora: Geusa Felipa de Barros Bezerra
Titulação: Doutora em Biotecnologia
Área de atuação: Micologia/Imunologia/Biotecnologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

2 – Vice-Coordenadora: Maria do Desterro Soares Brandão Nascimento

Titulação: Doutora em Medicina/Doenças infecciosas e parasitárias
Área de atuação: Micologia/Oncologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

3– Pesquisadora: Ivone Garros Rosa

Titulação: Doutora em Bioquímica de vegetal
Área de atuação: Imunologia/Biotecnologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

4 – Pesquisador: Walbert Edson Muniz Filho

Titulação: Doutorando da Rede Nordeste de Biotecnologia
Área de atuação: Biotecnologia/Oncologia/Micologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

5 – Pesquisador: Andressa Sousa Silva

Titulação: Graduando de Farmácia
Área de atuação: Biotecnologia/Micologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

6– Pesquisador: Juliana Barros Costa

Titulação: Graduando de Ciências Biológicas

3
Área de atuação: Micologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

7 – Pesquisador: Daniella de Jesus Castro Brito

Titulação: Graduando de Ciências Biológicas
Área de atuação: Micologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

8 – Pesquisador: Igor Vinícius Pimentel Rodrigues

Titulação: Graduando de Ciências Biológicas
Área de atuação: Micologia
Instituição de vínculo: Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Email: [email protected]

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 1. INTRODUÇÃO

A maior parte das infecções fúngicas oportunistas são registradas em

pacientes imunocomprometidos, nesse grupo de indivíduos a deficiência imunitária é
comprovada principalmente em crianças pelo fato que o seu sistema imunológico
ainda está em desenvolvimento, e nos idosos por apresentarem o sistema
imunológico deficitário. Sabe-se que a imunidade tem papel fundamental na defesa
contra agentes infecciosos e se constitui no principal impedimento para a ocorrência
de infecções disseminadas, habitualmente associadas com alto índice de
mortalidade (ROSSI et al., 2011; GARNACHO-MONTERO et al., 2013).
Atualmente os fungos filamentosos estão cada vez mais inseridos no
avanço das infecções fúngicas oportunistas, sendo o gênero Aspergillus um dos
grupos mais frequentes nas infecções de indivíduos imunocomprometidos. Esse
gênero é composto por fungos filamentosos encontrados em todas as estações do
ano, dispersos no solo, em vegetais ou qualquer matéria em decomposição, o que
garante a dispersão dos conídios que é a sua forma infectante. Existem
aproximadamente 900 espécies de Aspergillus, os quais foram classificados em
dezoito grupos respeitando-se os parâmetros morfológicos. Dos dezoito grupos,
doze são causadores de doença humana, entre os quais se destacam as espécies
A. fumigatus (85%), A. flavus (5-10%) e A. niger (2-3%) e os demais casos por A.
terreus, Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans, Aspergillus glaucus, Aspergillus
clavatus, Aspergillus cervinus,Aspergillus candidus, Aspergillus flavipes e Aspergillus
ustus (AMORIM et al., 2004; SILVEIRA et al., 2013; SILVA et al., 2015).
Com relação às infecções por Aspergillus a forma pulmonar da
Aspergilose é a mais frequente, já as formas extrapulmonares geralmente são
graves, bem como, acometimento cerebral, ocular, cutâneo, ósseo e cardiovascular.
Esse quadro é agravante quando ocorre em pacientes que estão hospitalizados,
fazendo uso da terapia imunossupressora ou são portadores da Síndrome de
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (XAVIER et al., 2008; AGARWAL et al., 2015;
PILANIYA et al., 2015; SILVA, et al 2015). Sendo que Aspergilus funmigatus,
Aspergillus niger e Aspergillus flavus são as principais espécies envolvidas,
principalmente nas Aspergiloses pulmonar invasiva (IPA), Aspergiloma em pacientes
com lesões cavitárias preexistentes em que o fungo tem a capacidade de crescer
preenchendo as cavidades expressando sua forma invasiva pelo desenvolvimento
5
de hifas, e também, Aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA) (MENDONÇA et
al., 2011; AGARWA, et al 2013; VIEIRA et al., 2015).
Estudos sobre os fatores de virulência de fungos filamentosos em
especial, aderência e biofilme são restritos. Para fungo leveduriforme vários estudo
principalmente para o gênero Candida. O processo de adesão, propriedade
primária de virulência, envolve fatores referentes a mecanismos moleculares
específicos como a expressão de adesinas, biomoléculas que promovem a
aderência (SILVA, et al., 2011; STANISZEWSKA et al., 2012; KAUR; SINGH 2014).
A adesão pode ocorrer em diferentes superfícies tais como células, polímeros
inertes, materiais abióticos utilizados em cateter, sonda vesical e stent cardíaco e
muitos fatores do hospedeiro podem alterar a expressão destas adesinas ou sua
ligação às células hospedeiras influenciando na patogênese do fungo (AL-ZAHARAA
et al., 2012; PREGNTZ et al., 2011; SILVA et al., 2011; RACHNA et al., 2011).
Já o biofilme é definido como uma comunidade formada por estruturas de
microorganismos altamente associados ou ligados um ao outro formando uma matriz
extracelular de proteção (ECM) contra a resposta do hospedeiro. Para os fungos a
matriz formada impede a atividade terapêutica dos medicamentos nas superfícies
abióticas dificultando uma boa resposta terapêutica para o hospedeiro. Nos últimos
anos, estudos têm demonstrado o papel do biofilme de fungos como um dos fatores
de virulência associado ao desenvolvimento de doença humana e o aumento da
resistência a agentes antimicrobianos (SINGH, et al 2011; RAJENDRAN et al., 2011;
RAMAGE, et al 2016).
Desde 1987, o então Laboratório de Imunologia, hoje Núcleo de
Imunologia Básica e Aplicada (NIBA), com seu Laboratório de Micologia vem
desenvolvendo pesquisas que resultaram em desenvolvimento de tese de
doutorado; dissertações de mestrado; especialização lato senso; monografia de
conclusão de Curso e, pesquisa envolvendo alunos da iniciação científica e
extensão.
A partir da tese de doutorado em Biotecnologia da coordenadora
proponente deste projeto, intitulada Biodiversidade dos fungos do ar de São Luís,
pela Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO resultaram 21 gêneros de
fungos filamentosos do ar/ambiente e, aproximadamente, 120 espécies ainda não
classificadas taxonomicamente. Essa coleção encontra-se armazenada no

6
Laboratório de Micologia do NIBA/DEPAT/CCBS/UFMA, enquanto novos fungos
continuam sendo investigados e acrescentados a essa coleção. Também fazem
parte desse acervo fungos isolados de humanos, atendidos pelos projetos em
desenvolvimento no NIBA.
Tendo em vista a relevância do gênero Aspergillus em especial o
Aspergillus fumigatus nas infecções oportunistas de idosos e criança
imunocomprometidos, este projeto justifica-se pela necessidade de novos estudos
que possam conhecer os fatores de virulência das espécies acima citadas no
fenômeno de aderência e biofilme em biomateriais: cateter, sonda vesical e stent
cardíaco. Este trabalho tem caráter bioprospectivo a partir de novas investigações
utilizando as espécies acima citadas da coleção fungos da Universidade Federal do
Maranhão para contribuir com o desenvolvimento de novos conhecimentos técnicos
com abordagem e utilização de recursos naturais regionais, para no caso de
positividade de formação in vitro de aderência e/ou biofilme pelos fungos
investigados na superfície abiótica estudada para verificar a possibilidade de tal
substância ser capaz de funcionar como uma substância antiaderente ou
antibiofilme.
O Estado do Maranhão, de acordo com o ponto de vista econômico,
possui dentre os produtos extrativistas mais explorados o babaçu e a juçara (açaí) -
Euterpe oleracea Mart.
Selecionamos Euterpe oleracea Mart. para integrar esta pesquisa devido
a possibilidade de observar experimentalmente in vitro se este produto funciona
como antiaderente e/ou antibiofilme, em virtude de ser um recurso natural que
possui componentes polifenólicos dentre eles orientina, isoorientina, ácido vanílico,
bem como antocianinas cianidina-3-glucoside e cianidina-3-rutinoside. A
caracterização composicional da Euterpe oleracea Mart. tem se revelado muito rico
no seu potencial antioxidante (YAMAGUCHI et al., 2015).

2. JUSTIFICATIVA
Justifica-se esse projeto pela relevância Aspergillus fumigatus nas
infecções oportunistas em especial crianças e idosos, bem como, a disponibilidade
destas espécies a parti da coleção de fungos da Universidade Federal do Maranhão
(UFMA), da estrutura física e dos materiais já disponíveis pelos recursos adquiridos.

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 3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Estudar a atividade da Euterpe oleracea Mart sobre os fatores de virulência

(aderência, biofilme, hemólise, catalase, fosfolipase e proteinase) de Aspergillus
fumigatus sobre superfícies abióticas utilizadas em ambiente hospitalar e superfície
celulares in vitro.

3.2 Específicos

 Estimar o número de conídios relacionados com a contagem inicial e final

nos ensaios propostos;
 Determinar padrão de aderência e biofilme da espécie de A. fumigatus,
superfície abiótica (sonda vesical, sonda urinária, ponta de cateter) e
celular;
 Estudar in vitro os efeitos do extrato bruto do caroço, da casca e do fruto
total da Euterpe oleracea Mart em prováveis formações de aderência e/ou
biofilme pelo Aspergillus fumigatus em superfícies abiótica e celular;
 Verificar a expressão das enzimas fosfolipase, hemolisina, catalase e
proteinase produzida pelo Aspergillus fumigatus;
 Realizar o a análise estatística utilizando teste on-way variance
(ANOVA), seguido pelos pós-testes de Dunnt ou Tukey’s, GraphPad Prism
versão 4.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA).
 Comparar o padrão de aderência e de biofilme formados nas
superfícies abióticas e celular;
 Identificar os fatores de virulência envolvidos no mecanismo de
aderência e biofilme Aspergillus fumigatus
 Sugerir um protocolo de assepsia e/ou tempo de troca de sonda e
cateter no ambiente hospitalar.

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 4. METODOLOGIA

4.1 Infraestrutura

O Laboratório de Micologia do NIBA/DEPAT/CCBS/UFMA tem

infraestrutura própria, onde atende à comunidade da área Itaqui-Bacanga através do
projeto: “Farmácia da Cidade Universitária–DEPAT/NIBA/UFMA: Estratégia para a
promoção do uso racional de medicamentos”; “Assistência às Doenças Crônicas na
Cidade Universitária da UFMA: Viva Saúde” e Laboratório de Micologia do
DEPAT/UFMA: Saberes, Práticas e Aplicações na área de Saúde e Biotecnologia,
aprovados pela PROEX/UFMA Edital 16/2015. Estes projetos têm ocasionado o
isolamento de fungos em humanos e do ambiente, aumentando dessa forma o
acervo da coleção de fungos. Além disso, o Laboratório de Micologia do Núcleo de
Imunologia Básica e Aplicada (NIBA) conta com um acervo de fungos que compõe a
Coleção de Fungos da Universidade Federal do Maranhão, 06 microscópios para
realização de identificação de fungos, 03 capelas de fluxo laminar, bancada,
vidrarias, ar condicionado, equipamento de eletroforese, 02 autoclaves, armário
deslizante para armazenamento dos fungos, além de reagentes e meios de cultura,
essenciais para realização de pesquisa na área de micologia. Contamos também
com parceria do Instituto Nacional do Câncer – INCA (Rio de Janeiro).
Esta pesquisa pela Universidade do Maranhão que conta com
infraestrutura e experiência científica a exemplo da aprovação pela coordenadora
proponente, junto ao Edital Fapema nº 29/2012 –CEBIOMA intitulado COLEÇAO DE
FUNGOS DO MARANHAO: Biodiversidade e Sustentabilidade.

3.2. Aderência em superfícies abióticas.

Para a realização deste ensaio será adotado o protocolo utilizado Vale

(2014) com algumas adaptações para os biomateriais citados. Portanto, serão
utilizados fragmentos de sonda vesical, ponta de cateter e stent cardíaco, medindo
0,5 mm de diâmetro, os quais serão lavados e esterilizados.

9
 Os fungos serão cultivados em SDA com Cloranfenicol (Acumedia) e após o
crescimento será realizada a raspagem dos conídios os quais serão adicionados em
tubo contendo solução salina a 0,85% e padronizadas pela contagem de conídios
em câmara de Neubauer de acordo com a Apostila da Embrapa. Após a
padronização, 0,1 mL do inóculo fúngico será adicionado ao tubo contendo o
fragmento de cada biomaterial e incubado a 25ºC em estufa por 2h (esse tempo será
ajustado em projeto piloto) para que ocorra aderência dos propágulos fúngicos aos
fragmentos.
Após o período de incubação, os fragmentos serão retirados e lavados com
solução salina estéril e cuidadosamente colocados em tubos contendo 5 mL com a
mesma solução e, em seguida, agitados em vórtex por 30s. Em seguida serão
adicionadas alíquotas de 0,1mL desta solução em placas contendo SDA e os
inóculos espalhados com auxílio de alça de Drigalski. Após o período de
crescimento incubação será determinado positivo (+) quando ocorrer o crescimento
em duplicata na placa comprovando que houve aderência e negativos (-) quando
não ocorrer crescimento em placa indicando que não houve aderência.

3.3. Ensaio de Biofilme

Para este ensaio será adotado inicialmente o mesmo procedimento

realizado para o teste de aderência e, para avaliar a formação de biofilme será
adotado o método realizado por Tintton et al (2009) com algumas modificações. Os
fragmentos de biomateriais serão introduzidos nos tubos com as suspensões
fúngicas e incubados a 37ºC por 24, 48 e 72 horas (esse tempo será ajustado em
projeto piloto). Após os diferentes tempos de incubação, os fragmentos serão
removidos dos tubos e transferidos para novos tubos contendo solução fisiológica a
0.85% e homogeneizadas em vórtex durante um minuto. Posteriormente serão
adicionadas alíquotas de 0,1mL desta solução em placas contendo SDA e os
inóculos espalhados com auxílio de alça de Drigalski e incubados a 25ºC.

3.4 Preparo do extrato de hidroalcóolico da casca, caroço e fruto total da

Euterpe oleracea Mart.

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3.4.1 Coleta do fruto.

Serão coletadas três amostras do fruto do açaí, de forma aleatória,

oriundas do Parque Ecológico do Maracanã, situado na ilha de São Luís. O
exemplar do açaí a ser utilizado já foi identificado, em estudo anterior do nosso
grupo de pesquisa, sendo que um exemplar está depositado no Herbário Rosa
Mochel do Núcleo de Estudos Biológicos da Universidade Estadual do Maranhão
(UEMA), sob laudo de número 30, sendo conclusivo para Euterpe oleracea Mart.,
conforme as características da taxonomia.

3.4.2 .Obtenção do extrato hidroalcóolico liofilizado do fruto total, casaca e caroço de

Euterpe oleracea Mart.
Primeiramente será feita a higienização do fruto com água corrente e em
seguida com água destilada. Os frutos serão pesados e, em seguida, despolpados
pelas técnicas convencionais, preservando-se polpa e caroço, que serão
armazenados em freezer até o uso.
O extrato hidroalcóolico liofilizado do açaí prepara seguindo o processo
desenvolvido pelo Prof. Dr. Roberto Soares de Moura et al. (2011) e Soares de
Moura et al. (2012), do Departamento de Farmacologia da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro (UERJ) e depositado na World International Property Organization
sob o registro nº PI0418614-1.
Para a presente pesquisa, o açaí será separada em diferentes frações, as
quais consistem em (1) fruto total, compreendendo a casaca e o caroço, (2) casca,
(3) caroço, cujos métodos de processamento estão descritos a seguir.
1- Uma quantidade previamente pesada de açaí oriundo do Estado do
Maranhão e mantida sob refrigeração a – 18ºC, será separada em
duas porções e exposta do descongelamento em temperatura
ambiente. De uma das porções, a casca será separada do caroço,
reservando-se as duas frações em recipiente distinto, a outra porção
constituíra o fruto total;
2- As frações do açaí (fruto total, casca e caroço) serão lavados em água
corrente e fervida destilada por 5 a10 minutos e depois triturados. Em
seguida, serão extraídos com etano (v:y) e macerada em evaporador

11
 rotativo de baixa pressão a aproximadamente 40°C. O material
resultante será mantido em baixa temperatura, até o dia de uso;
3- Com auxilio de balança de precisão, a fração dos caroços de açaí será
pesada e acrescida de determinado volume de água destilada. Em
seguida, será feita a trituração, em misturador, para a
homogeneização das partículas. A solução resultante (água + caroço)
será aquecida até fervura, permanecendo em cocção por 5 minutos,
sendo em seguida resfriada à temperatura ambiente. A ela será
adicionado determinado volume de etano p.a., a solução será
homogeneizada em agitador por 30 minutos, acondicionada em
frascos identificados e datados. Esta agitação repete-se a cada dois
dias durante certo intervalo e coloca para maturar por 10 dias sob
refrigeração a -18ºC.
4- A casca dos caroços será pesada, e ela em seguida será adicionada
água destilada proporcionalmente ao volume inicialmente utilizado,
aplicando-se a seguinte regra de três simples.
(Massa do caroço) ...............................................(volume água caroço) ml
(massa da casca) g .............................................xmL

Em seguida, a solução será colocada sob cocção por 5 minutos e será

posteriormente resfriada em temperatura ambiente. Será realizada
uma alcoolização obedecendo a um volume igual ao volume “x” de
água utilizados, sendo homogeneizado em agitador por 30 minutos a
cada 2 dias e deixando em maturação a – 18ºC por 10 dias.
5- O fruto total será pesado e triturado, sendo a ele acrescido
determinado volume de água destilada e aquecido até a fervura, por 5
minutos. Após resfriamento á temperatura ambiente, será realizada
alcoolização com determinado volume de etanol (volume igual ao
dispensado para o caroço). Esta solução será acondicionada me
frascos com identificados e data, sendo homogeneizado em agitador
por 30minutos a cada 2 dias e deixado em maturação a – 15°C por 10
dias.

12
 5. Análise estatística

Para análise estatística dos dados, será realizado o teste on-way variance
(ANOVA), seguido pelos pos-testes de Dunnt ou Tukey’s, de acordo com o tipo de
análise. As diferenças serão consideradas significativas quando o p<0.05. O
programa utilizado para a realização da análise estatística será GraphPad Prism
versão 4.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA).

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 6. ORÇAMENTO

Materiais de consumo
Produtos Quantidade Valor unitário Valor total Uso
EDTA sal dissodico 1frasco 52,00 52,00 Confecção tampões
Cloreto de potássio 1frasco 34,00 34,00 Confecção de tampões
Cloreto de Sódio 1frasco 18,00 18,00 Confecção de tampões
Citrato de Fosfato 1frasco 52,00 52,00 Confecção tampões
Acetato de Sódio 1frasco 62,00 62,00 Confecção tampões
Fosfato de sódio dibásico 1frasco 41,00 41,00 Confecção de tampões
Fosfato de sódio monobásico 1frasco
44,00 44,00 Confecção de tampões
anidro
Tubo de ensaio rosqueável
100 unid 1,50 150,00 Ensaio
18x180mm
Lâmina 30cx 5,50 165,00 Ensaio
Lamínula 20cx 4,20 84,00 Ensaio
Placa de Petri 50p 7,50 375,00 Cultivo
Iodo 1frasco 186,00 186,00 Revelador
Glicose 1frasco 45,00 45,00 Confecção tampões
Gelatina 1frasco 84,00 84,00 Teste enzimático
Carboximetilcelose (CMC) 1frasco 104,00 104,00 Teste enzimático
Extrato de Malte 1frasco 247,00 247,00 Cultura de fungos
Ágar Sabouraud Dextrose 500g 1frasco 165,00 165,00 Cultura de fungos
1frasco
Ágar Batata Dextrose 500g 164,00 164,00 Cultura de fungos
Ponteiras Amarela e Azul 2pacotes 40,00 40,00 Ensaio
SUBTOTAL MATERIAIS DE CONSUMO
TOTAL GERAL 2.112,00

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 7. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DE ATIVIDADES

1º SEM/1º 2º SEM/1º 1º SEM/2º 2º SEM/2º

ATIVIDADE
ANO ANO ANO ANO
Levantamento bibliogáfico x x x X
Determinação do padrão de aderência e
biofilme das espécies de A. fumigatus, x x X
superfície abiótica.
Estudo in vitro dos efeitos do extrato
bruto do caroço, da casca e do fruto total
Euterpe oleracea Mart em prováveis
formações de aderência e/ou biofilme x x x
pelo gênero Aspergillus em superfícies
abióticas;

Avaliação da atividade enzimática x x X

Análise da aderência e biofilme em
x x X
célula.
Análise estatística X x x
Construção de banco de dados x X
Elaboração de relatório técnico x X
Publicação de resultados x x X

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 REFERÊNCIAS

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