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FLUORESCNCIA DA CLOROFILA a: CONSIDERAES TERICAS E APLICAES PRTICAS E. Campostrini Professor de Ecofisiologia Vegetal do Setor de Fisiologia Vegetal, Laboratrio de Melhoramento Gentico Vegetal, Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28015 620, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, e-mail: [email protected] Resumo Nesta reviso, procurei relatar as informaes mais avanadas sobre a fluorescncia da clorofila, e tentei mostrar o grande potencial desta ferramenta nos estudos relacionados aos efeitos dos fatores do ambiente sobre o processo fisiolgico em plantas. Inicialmente, fao um resumo sobre o processo fotoqumico, o qual serviu como base para descrever os conceitos bsicos da fluorescncia da clorofila. Posteriormente, na fluorescncia nomodulada, relato a cintica da curva de Kautsky, explicando cada fase desta curva. No item fluorescncia modulada, so descritas as anlises dos dissipadores da fluorescncia (quenchings) e os rendimentos qunticos efetivos e mximo do fotossistema II. No final, relato alguns protocolos de amostragem e descrevo algumas citaes relacionadas ao uso da fluorescncia como ferramenta avaliadora do estresse em plantas.

Smbolos
FFF: Fluxo de ftons fotossintticos; Ph: Fotoqumica; Chl a: Clorofila a; Chl b: Clorofila b; NADP: Nicotinamida adeninina dinucleotdio fosfato; NADPH2: Nicotinamida adeninina dinucleotdio fosfato reduzida; LHCII: Sistema coletor de luz do fotossistema II; PSII:Fotossistema II; PSI: Fotossistema I; P680: Centro de reao do fotossistema II; Qa: quinona a; Qb: quinona b; PQ: Pool de plastoquinona; Cysts: citocromos; ATP: Trifosfato de adenosina; Fd: Ferredoxina; D: dissipao por calor; DCMU: 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetiluria; F: Fluorescncia; Z: resduo de tirosina; FLM: Fluormetro modulado; FLNM: Fluormetro no-modulado; FM: Fluorescncia modulada; FNM: Fluorescncia no-modulada; F0: Fluorescncia inicial; Fm: Fluorescncia mxima; Fv: Fluorescncia varivel; q: dissipao (quenching); qp: dissipao fotoqumica (quenching fotoqumico); qN: dissipao no-fotoqumica (quenching no-fotoqumico); NPQ: dissipao nofotoqumica (quenching no-fotoqumico); Ph: dissipao pelo processo fotoqumico; Fv/Fm: IIm: rendimento quntico mximo do PSII; F/Fm: IIe :rendimento quntico efetivo do PSII; ETR: taxa de transporte de eltrons; Rfd: razo de decrscimo da fluorescncia; pH: gradiente de prtons; e-: eltrons; Fv/Fm: Parmetro de Genty

Introduo Os pigmentos fotossintticos (clorofilas (a+b) e carotenides), localizados nas membranas dos tilacides dos cloroplastos, absorvem a energia luminosa que utilizada no processo fotossinttico. Quando uma luz branca incide sobre cada soluo de clorofila, as clorofilas a (maior quantidade) e b (pigmento acessrio) tm o ponto mximo de absoro dos ftons (max) na regio de 428 e 660 nm (clorofila a) e na regio de 452 e 641,8 nm (clorofila b), em ter dietlico, metanol e acetona 80% (Lichtenthaler, 1987). Estes pontos de max, os quais variam com o tipo de solvente utilizado, correspondem regio do azul e do vermelho, respectivamente (Lichtenthaler, 1987) (Figura 1). Este fato mostra que a luz verde que no absorvida refletida e transmitida, o que evidencia a colorao verde destes pigmentos. Esta luz verde refletida caracteriza a colorao verde das folhas. Ambas as clorofilas so componentes das membranas dos cloroplastos e ocorrem na razo clorofila a/clorofila b de aproximadamente 3 para 1 (Lichtenthaler et al, 1981). Plantas expostas a elevados fluxos de ftons fotossintticos (FFF) apresentam razes clorofila a/b em torno de 3,2 a 4,0 e plantas crescendo em ambientes com reduzidos FFF possuem razes a/b em torno de 2,5 a 2,9 (Seybold e Egle, 1970). As molculas de clorofila absorvem a energia luminosa (ftons) e alteram temporariamente as suas configuraes eletrnicas. Estes pigmentos passam do estado basal (Chl a) para o estado excitado (nvel de energia mais alto), denominado de singlet 1 (Chl a*). Este estado excitado muito instvel e de vida muito curta (10-8 s). Desta maneira, estes pigmentos fotossintticos, aps receberem a energia dos ftons, dissipam esta energia proveniente da luz por meio de trs vias de dissipao (desexcitao) do estado excitado (estado de elevada energia). Estas trs vias so assim denominadas: a) Dissipao Fotoqumica (Ph): a utilizao da energia luminosa para os processos fotoqumicos da fotossntese (doao do eltron proveniente da molcula de gua para um aceptor denominado NADP (Nicotinamida adenina dinucleotdio fosfato)). Este processo a base da fotossntese (Figura 2). Esta energia dissipada usada para a formao do poder redutor e da molcula de ATP (Trifosfato de adenosina), os quais sero utilizados na fase bioqumica do processo fotossinttico. Esta dissipao de energia representada pelo quenching fotoqumico (qP) (dissipador fotoqumico)

b) c)

Fluorescncia (F): emisso de radiao na regio do visvel (vermelho e vermelho distante). Dissipao No-Fotoqumica (D): a produo de calor na forma de radiao infravermelha. Esta dissipao de energia representada pelo quenching no-fotoqumico (qN)(dissipador no-fotoqumico)

Figura 1. Espectro de absoro de uma soluo de clorofila a (linha slida) e de clorofila b (linha tracejada) em ter dietlico (solvente puro). (Lichtenthaler, 1987)

Cy clic Phot op hos phor y lat i on A DP A TP 2 e-

Fd
2 e-

Pheophytin

LI GH T
2e-

QA QB
AD P 2 e-

2e-

NADP + 2H +

NA D PH2

PQ Cyts
Ch l o r o p h y l l P7 0 0

L IGH T

H2O
2 e-

Non -Cy c li c A TP Pho t opho spho ry lat ion

Phot osys t em
Chlor ophyll P6 80

Pho t o sy st em

II

2 H+ + 0 .5 O2
Oxygen ( Light Evolut ion React ions)

CO2 + RuBP + A T P

Sugar-P + ADP

Car bo n Dioxide Fixat ion ( Dark Rea ct ions)

Figura 2. Esquema simplificado do processo fotossinttico. Manual de instrues. Qubit System (Canad).

a) Dissipao fotoqumica: O processo fotossinttico a converso da energia luminosa em energia qumica. Esta converso possvel devido sensibilidade das molculas de clorofila luz. Os sistemas de coleta de luz do fotossistema II (Light-Harvesting Complex II LHCII) so compostos de numerosas molculas de clorofilas aderidas a complexos proticos que capturam a energia luminosa e a transferem para o centro de reao do fotossistema II (PSII). No centro do PSII, est localizada uma molcula de clorofila a especial denominada de P680 (max de 680 nm) e esta molcula torna-se excitada (P680*) quando recebe os ftons de luz (energia luminosa). Em condies ideais para o processo fotossinttico, o eltron doado pela P680* reduz um aceptor primrio denominado de feofitina (molcula de clorofila a desprovida do tomo de Mg), que ento transfere o eltron para uma srie de carreadores incluindo a Qa, a Qb, pool de plastoquinona (PQ) e os citocromos (Cyts). Esta transferncia de eltrons est associada com a produo de um gradiente de prtons (H+) transtilacoidal (pH) entre o lmen e o estroma no cloroplasto. Em relao ao estroma (pH 8,0), as maiores concentraes de H+ esto localizadas no lmen (pH < 4,0) (Prezelin e Nelson, 1990). Este processo de formao do ATP proveniente do pH denominado fotofosforilao no-cclica e requer cerca de 2 eltrons vindos de duas molculas de P680 para a produo de 1 ATP (trifosfato de adenosina). A partir do PSII, os eltrons (e-) so transferidos para uma segunda molcula de clorofila a especial chamada P700 (max de 700 nm) que est localizada no centro de reao do fotossistema I (PSI). Concomitantemente absoro da energia luminosa pelo PSII, o P700 absorve a energia luminosa e torna-se excitado (P700*), ou seja, um eltron desta molcula de clorofila a especial elevado para um nvel mais energtico. Este fato permite que o P700* reduza a molcula de ferredoxina (Fd), a qual est relacionada com a reduo do NADP para NADPH2. O NADPH2 pode ser usado para a reduo do CO2 a triose fosfato no processo bioqumico da fotossntese. Quando o eltron liberado da molcula do P700 usado para a reduo do CO2, a molcula de P700 torna-se com carga lquida positiva. A neutralidade desta molcula restabelecida pela passagem do eltron da molcula de P680 para o P700. Em adio, a perda de um eltron deixa a molcula P680 com carga positiva e a neutralidade desta molcula restabelecida pela molcula de gua. A oxidao da molcula de gua

provocada indiretamente pela energia luminosa produz o oxignio que liberado pelas folhas das plantas. Como qualquer outro processo de troca de energia, a converso da energia luminosa em energia qumica no processo fotossinttico no perfeita. Nem todos os eltrons que esto num nvel energtico elevado (molcula de clorofila excitada) passado para os aceptores. Estes eltrons retornam ao estado inicial (estado antes das molculas receberem a energia dos ftons), sem a produo de ATP e NADPH2. Ao retornar ao estado inicial, a energia dissipada em forma de calor ou luz (fluorescncia): A Figura 3 mostra graficamente a distribuio da energia (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993).

Figura 3. Diagrama do nvel de energia da molcula de clorofila. F: espectro da fluorescncia; A: espectro da absorvncia; b: fton de luz azul; r: fton de luz vermelha; 1: converso interna; 2: fluorescncia; 3: sistema intermedirio; 4: separao de cargas; I-1: aceptor intermedirio do PSII; s1, s2: estados singlets; t: estado triplet; Z+: doador de eltrons do complexo de evoluo do oxignio (oxidao da molcula de gua) (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993)

b) Fluorescncia: Em temperatura ambiente (temperatura fisiolgica, 20 a 250C), a fluorescncia uma luz emitida e exibe um ponto mximo de emisso na faixa de 682 nm e outro ponto menos pronunciado em 740 nm (Figura 4) (Krause e Weis, 1994).

Figura 4. Espectro de emisso da fluorescncia na temperatura ambiente de cloroplastos isolados intactos na presena de DCMU (2 x 10-5 M). A fluorescncia foi induzida com 480nm de luz (Krause e Weis, 1994).

Ao contrrio das temperaturas baixas (77 K ou -1960C), as quais so efetuados estudos tericos da fluorescncia (ser discutido posteriormente), existe um consenso entre os cientistas de que na temperatura ambiente, , a fluorescncia da clorofila a, em sua maioria, emitida pelo PSII e pelo Sistema Coletor de Luz do PSII (Light-Harvesting Complex II - LHCII). Entretanto, alguma contribuio na regio dos comprimentos de onda maiores pode ser emitida pelo PSI. A emisso de fluorescncia proveniente do PSI parece contribuir para a fluorescncia inicial denominada de F0 (Krause e Weis, 1984, Krause e Weiss, 1988). Os trs processos de dissipao da energia luminosa pelas molculas de clorofilas (Ph+F+D) so competitivos, ou seja, alteraes nas taxas fotossintticas e na dissipao de calor causar alteraes complementares na emisso da fluorescncia. Sendo assim,

alteraes

na

fluorescncia

podem

mostrar

ausncia

ou

presena

de

comprometimentos no processo fotossinttico. A relao entre os trs processos expressa matematicamente: Dissipao total da energia = (Ph + F + D)n Em que: n= nmero de molculas de clorofila Na temperatura fisiolgica, praticamente toda a fluorescncia proveniente das molculas de clorofilas associadas ao PSII. As variaes da fluorescncia refletem o estado primrio do PSII, o rendimento (PSII) da fluorescncia do PSII pode ser definido, sob iluminao constante (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993), como: = F/(Ph+F+D) Esta equao matemtica somente aplicada se todos os centros de reao esto na forma ativa, ou seja, abertos (Qa oxidada). Ver esquema a seguir. Nas reaes fotoqumicas primrias, o eltron vindo da molcula de gua transferido, via doador Z (resduo de tirosina) para o pigmento P680 (clorofila a especial) o qual foi excitado pelos ftons (oxidante forte). Este pigmento especial doa o eltron para a feofitina e esta repassa o eltron ao aceptor Qa (molcula de quinona). A sada do eltron do PSII provocada pela forte oxidao do PSI. Estas informaes supracitadas podem ser representadas pelo esquema a seguir (Krause e Weis, 1988):

Z P680 Feofitina - Qa Qb (centro de reao aberto, Qa oxidada) (aps o perodo de adaptao no escuro)
Fton de luz azul e/ou vermelha

Z P680*e-(recebeu 1 fton, molcula foi excitada, recebeu 1 eltron da molcula de gua) Feofitina Qa - Qb

Z P680 Feofitina e- - Qa Qb

Z P680 Feofitina - Qae- Qb (centro de reao fechado, Qa reduzida)

Z P680 Feofitina - Qa Qb e(centro de reao aberto) (Qa oxidada) Sob condio de baixa intensidade luminosa, em elevados rendimentos qunticos (quantidade molar de O2 liberado ou CO2 fixado por cada mol de ftons absorvidos pelo aparelho fotossinttico), cerca de 97% da energia dos ftons absorvidos usada no processo fotoqumico (produzir ATP e NADPH), 2,5% transformada em calor e 0,5% reemitida como fluorescncia (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993). Entretanto, se os centros de reao estiverem fechados (Qa reduzida), 95 a 97% da energia absorvida pode ser dissipada na forma de calor e 2,5 a 5,0% na forma de fluorescncia (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993). Esta fluorescncia emitida pelo PSII pode ser detectada com um fotodetector, ou seja, um fotomultiplicador ou fotodiodo sensvel aos comprimentos de onda na regio de 680 nm. Entretanto, uma vez que o tecido fotossintetizante pode ser iluminado com uma luz branca, torna-se necessrio separar uma considervel quantidade

de luz vermelha que poder ser refletida do tecido que no seja a emitida como fluorescncia. A Figura 5a mostra o esquema do funcionamento dos dois tipos bsicos de fluormetros encontrados no mercado: a) fluormetro no-modulado (FLNM) e b) fluormetro modulado (FLM).

Figura 5. Esquema genrico de construo dos dois tipos de fluormetros. a) sistema nomodulado. b) Sistema modulado. L: fonte luminosa (branca de halognio ou luz provenientes de LEDs vermelhos); aL: luz actnica branca; fL: pulso saturante de luz branca; d: detector; am: amplificador sincronizado com o pulso da fonte luminosa; Kf: filtro Schott, BG38, <680nm); Lf: filtro de banda longa (690, 710 e 730nm); r: luz branca refletida; e: fluorescncia no-modulada emitida; i: fluorescncia modulada (em forma de pulsos) emitida (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993)

b.1) Fluorescncia no-modulada (FNM): Quando um tecido fotossintetizante iluminado, ele ir emitir fluorescncia continuamente. Entretanto, a fluorescncia contnua per si fornece poucas informaes sobre os processos fisiolgicos. A melhor maneira de obter informaes a partir da emisso da fluorescncia, por meio de interpretaes da cintica de emisso da fluorescncia com o tempo. Os estudos com a fluorescncia tm-se relacionados com as respostas da fluorescncia quando um tecido fotossintetizante rapidamente iluminado, aps este tecido ter sido mantido no escuro por horas ou minutos. Na condio de escuro (centros de reao abertos) vrias enzimas do Ciclo de Calvin tornam-se desativadas e devem ser ativadas pela luz. Ainda, os metablitos produzidos no Ciclo de Calvin devem alcanar nveis apropriados para que a fixao do CO2 possa ocorrer em taxas timas. Sendo assim, existe um perodo de induo fotossinttica quando se efetua a rpida

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transferncia do tecido fotossintetizante da condio de escuro para a presena da luz. Neste perodo, a fixao do CO2 baixa. Durante o perodo de induo fotossinttica, os aceptores localizados nas membranas dos tilacides esto aptos a receberem eltrons das molculas excitadas pelos ftons. Entretanto, a fase bioqumica da fotossntese no est ativa e nem otimizada. Como resultado, aps a iluminao, o nmero de aceptores apto a aceitarem os eltrons, rapidamente reduz a zero, pois todos os stios de reduo esto ocupados em conseqncia da ativao da fase fotoqumica pela luz. Conseqentemente, a energia absorvida pelas molculas de clorofilas deve ser dissipada em fluorescncia e em calor. Desta maneira, esperado que a fluorescncia deva ser elevada durante o perodo de induo fotossinttica e, aps este perodo, a emisso da fluorescncia ser reduzida. Esta reduo na emisso da fluorescncia explicada, pois somente a partir de um determinado tempo de iluminao do tecido, as reaes de fixao do carbono tornam-se ativas. A cintica desta resposta denominada de curva de Kautsky (Kautsky e Hirsch, 1934) (Figura 6). A terminologia das variveis da fluorescncia foi reformulada e proposta por Kooten e Snel (1990).

Figura 6. Cintica de emisso da fluorescncia ou curva Kautsky registrada de uma suspenso de Chlorella adaptada ao escuro. I: cintica rpida; II: cintica lenta; A: rea acima da curva; F0: fluorescncia inicial (centros de reao do PSII abertos); O: origem; I: nvel intermedirio; D: ponto de depresso; P: pico (ponto) mximo da curva; Fv: fluorescncia varivel; t1/2: metade do tempo de F0 at Fm; Fm: fluorescncia mxima (centros de reao do PSII fechados); S: inclinao da curva; M: pico secundrio mximo; T: nvel terminal; DCMU; qNP: dissipao no fotoqumica (quenching no-fotoqumico); qP: dissipao fotoqumica (quenching fotoqumico) (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993)

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A Figura 6 mostra a cintica de emisso da fluorescncia e as fases da curva so convencionalmente denominadas de OIDPSMT (Papageorgiou, 1975). A quantificao da fluorescncia normalmente arbitrria. Aps mantido o tecido fotossintetizante no escuro (em tecidos saudveis, uma adaptao de 15 a 30 minutos normalmente considerado suficiente (Larcher e Cernusca, 1985); posteriormente ser discutido a funo deste perodo escuro), verifica-se que, aps o incio da iluminao (T0/tempo zero), h uma elevao inicial da fluorescncia denominada de F0 (fluorescncia mnima ou inicial). O valor F0 representa a emisso de luz pelas molculas de clorofilas a excitadas, antes da energia ser dissipada para o centro de reao do PSII (Mathis e Paillotin, 1981). Desta maneira, esta fluorescncia independente dos eventos fotoqumicos. O valor F0 um valor referncia para a determinao das outras variveis da fluorescncia (Hipkins e Baker, 1986). Na induo do sinal, o verdadeiro valor de F0 somente observado, quando antes da iluminao, o aceptor Qa estiver completamente oxidado (centro de reao aberto) (Krause e Weis, 1984). Entretanto, Fo nem sempre uma constante, o seu valor pode aumentar caso os centros de reao do PSII estejam comprometidos, ou se a transferncia da energia de excitao da antena para os centros de reao esteja prejudicada (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989). O valor de F0 alterado por estresses do ambiente que causam alteraes estruturais nos pigmentos fotossintticos do PSII. Estresse por temperaturas infratimas decresce significativamente os valores de F0 (Adams e Perkins, 1993) e o estresse por temperaturas supra-timas caracterizado por incrementar drasticamente os valores de F0 (Krause e Santarius, 1975; Schreiber e Berry, 1977; Smillie e Nott, 1979). O valor desta varivel apresentou valores elevados em plantas cultivadas sob deficincia de fsforo (Conroy et al, 1986). Ao se iluminar o tecido fotossintetizante com uma luz forte (luz actnica), a fluorescncia incrementa a partir do nvel F0, atinge um nvel intermedirio I, depois atinge o nvel D e, aps este nvel, atinge o pico mximo P da curva Kautsky. Esta elevao na fluorescncia revela um declnio do processo fotoqumico (Ph) (Figura 1). A razo do declnio de Ph que o aceptor Qa torna-se reduzido. suposto que a fase OI esteja relacionada com o incio da liberao de O2 (Papageorgiou, 1975). No ponto I, os eltrons iniciam a sada de Qa para o pool de plastoquinona via Qb. Aps a depresso D, ocorre um incremento na fluorescncia at atingir o ponto P. Neste ponto P, cerca de 0,5 a 2 segundos aps o tecido fotossintetizante ter sido iluminado com um pulso de luz actnica de elevada intensidade, todos os centros de reao tornam-se fechados (Qa reduzida,

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Fotoqumica (Ph)=0, dissipao fotoqumica (quenching) (qp) igual a zero) e a fluorescncia atinge o nvel mximo denominada Fm. No ponto P a taxa inicial de reduo de Qa superior a taxa de reoxidao pela plastoquinona e pela atividade do PSI. A fluorescncia emitida de F0 at P denominada fluorescncia rpida. Aps o ponto P (Fm), os eltrons iniciam o fluxo de sada de Qa (fase P-S da curva Kautsky. Neste ponto, Qa est parcialmente oxidada e a transferncia de eltrons para o PSI, via complexo citocromo b6/f e plastocianina, ocorre. Nesta fase, como foi discutido anteriormente, o processo fotoqumico est operando com eficincia. A fase S caracterizada pela formao do gradiente de prtons causado pelo transporte de eltrons. Este gradiente de H+ provoca uma energizao na membrana do tilacide e um decrscimo na emisso da fluorescncia (fase P-S) verificada (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989). A cintica da fluorescncia aps o pico P complexa e est relacionada com a fixao do CO2 e a liberao do O2. Um segundo pico (M), usualmente surge aps o pico P e corresponde ao incio da assimilao do CO2 (Ireland et al, 1984). Aps o pico M, a fluorescncia declina para um estado estacionrio denominado (T), que corresponde ao estado estacionrio da assimilao do CO2. O declnio de P at T pode requerer vrios minutos e esta fase denominada fluorescncia lenta (Figura 6II). O decrscimo da fluorescncia do ponto P at o ponto T denominado de dissipao e utilizada a terminologia quenching (q) para referir-se a este decrscimo. Os quenchings podem ser classificados em dois tipos: o quenching fotoqumico (qp) a dissipao (extino) causada pelo processo fotoqumico, ou seja, causado pela utilizao da energia para a reduo do NADP. Este quenching decresce na proporo do fechamento dos centros de reao (reduo de Qa). O quenching no-fotoqumico (qN) representa todas as outras formas de dissipao de energia, principalmente calor. As anlises mais detalhadas dos quenchings sero efetuadas posteriormente no item fluorescncia modulada. Um outro parmetro da cintica rpida da fluorescncia denominado fluorescncia varivel (Fv). Fv o incremento fluorescncia a partir de F0 at Fm. Na prtica, a razo entre a fluorescncia mxima (Fm) (toda Qa reduzida) e a fluorescncia mnima (F0) (toda Qa oxidada) aproximadamente 5 a 6 em tecidos fotossintetizantes saudveis e adaptados no escuro. Entretanto, esta razo pode variar, dependendo da iluminao e dos tratamentos fisiolgicos que afetam principalmente a fluorescncia mxima (Schreiber et al, 1998). Quando um fton de luz excita a molcula de clorofila, um nico eltron elevado a um maior grau de energia. Como foi relatado no item 1, esta energia pode ser dissipada

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e ser usada para produo de ATP e NADPH2, liberado na forma de calor (D) ou reemitida como fluorescncia (F). Desta maneira, os processos podem ser expressos pela equao: Ph + D + F = 1 Em que: Ph= rendimento quntico da fotossntese (representa energia dos ftons que chega no PSII, em relao energia que ser usada na produo de ATP e NADPH2) F= fluorescncia D= dissipao na forma de calor Destes parmetros supracitados, a determinao de Ph o de maior interesse dos cientistas, pois este mede o rendimento quntico da atividade fotoqumica do processo fotossinttico. O valor de F pode ser facilmente determinado com o uso de um fluormetro, e o parmetro D difcil de mensurar. Entretanto, medidas corretas de Ph podem ser derivadas das medidas de F. Segundo Schreiber et at (1998), a derivao de Ph a partir de F segue as equaes que sero descritas posteriormente: Novamente, considere que um tecido fotossintetizante foi mantido no escuro por um perodo longo. Se, aps este perodo, a folha exposta a um curto perodo de luz intensa, as molculas de clorofila presentes nos tilacides dos cloroplastos ficaro excitadas e passaro os eltrons excitados para os aceptores do PSII e PSI (Figura 2). Contudo, as reaes enzimticas do ciclo de Calvin no esto ativas neste incio de iluminao. Desta maneira, o NADPH2 formado no processo fotoqumico no pode ser usado e o pool de NADP disponvel para a reduo est exaurido. Como conseqncia, nos poucos microsegundos de iluminao, aps o tecido ter sido mantido no escuro, os carreadores de eltrons no PSI e PSII no esto capacitados a transferir os eltrons e permanecem na condio de reduzidos. Conseqentemente, durante o perodo de iluminao, os eltrons excitados da clorofila no podem ser usados para as reaes fotoqumicas. Segundo Schreiber et at (1998), durante a aplicao do pulso saturante de luz e aps o tecido ter sido mantido no escuro, o rendimento quntico do processo fotoqumico (Ph) reduz para zero e a emisso da fluorescncia e a dissipao do calor tornam-se mximos (Fm e Dm). Sendo assim, durante a iluminao: (Ph=0, F=Fm e D=Dm)

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Ph + F + D = 1 ou Ph= 1 F - D Fm + Dm = 1 Dm = 1- Fm Tem sido demonstrado experimentalmente que a quantidade relativa da dissipao de calor e da fluorescncia pode ocorrer durante uma curta (0,8 segundos) iluminao saturante. Sob condies normais de irradincia, as reaes so similares ao que ocorre nesse pouco tempo de 0,8 segundos. Ainda, a razo entre a dissipao (D) e a fluorescncia (F) assumida por ser constante durante um breve pulso de saturao. Desta maneira: Dm/Fm = D/F, considerando Dm = 1- Fm

(1 Fm)/Fm = D/F ou D = (F/Fm) - F Ph + D + F = 1 Ph + [(F/Fm) - F] + F = 1 Ph = 1 F - [(F/Fm) - F)] Ph = 1 (F/Fm) Ph = (Fm F)/Fm

Na prtica, Ph representado pelo rendimento quntico do PSII (II) e pode ser avaliado aps uma adaptao no escuro. Na condio de ausncia de luz e antes da aplicao do pulso saturante de luz, a emisso da fluorescncia mnima, e denominada de F0. Durante a aplicao do pulso saturante de luz, a emisso da fluorescncia mxima, e definida como Fm (Rendimento quntico mximo). Ainda, II pode ser determinado durante uma iluminao com emisso de uma fluorescncia F, com mxima emisso durante o pulso com valor Fm. Neste caso, o rendimento quntico denominado rendimento quntico efetivo. Desta maneira, as expresses abaixo, relacionadas com a fluorescncia, podem ser utilizadas para a determinao do rendimento quntico fotoqumico do PSII (Schreiber et al, 1998): Rendimento quntico mximo: IIm = (Fm-Fo)/Fm = Fv/Fm (amostra adaptada no escuro)

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Rendimento quntico efetivo: IIe = (Fm-F)/Fm = F/Fm (amostra recebendo uma determinada quantidade de FFF (Este rendimento quntico ser discutido posteriormente no item fluorescncia modulada) Bjrkman e Demmig (1987) determinaram os valores da razo Fv/Fm em um grande nmero de espcies vasculares. Foi verificado a 77K que folhas sadias de vrias espcies vegetais apresentaram valores de Fv/Fm em torno de 0,832 0,004. Entretanto, segundo Pfndel (1995) o PSI pode contribuir significantemente no valor de F0, em torno de 5 a 11% da fluorescncia mxima em plantas C3 e C4, respectivamente. Desta maneira, se no houver uma correo, o valor de II pode ser subestimado. Como exemplo, valores em torno de 0,82-0,85, determinados num fluormetro PAM, devero ser incrementados para 0,86-0,90. O valor da razo Fv/Fm foi proporcional ao rendimento quntico da fase fotoqumica da fotossntese (Butler e Kitajima, 1975). O declnio da relao Fv/Fm um bom indicador do dano fotoinibitrio quando plantas esto sujeitas a estresses do ambiente incluindo frio (Baker et al, 1983) e seca (gren e quist, 1985). O valor da razo Fv/Fm amplamente usado. Entretanto, duas fontes de erro podero afetar a determinao desta relao (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989). 1) A definio de Fv depende da exata determinao de F0. Na curva Kautsky, o ponto O (F0) identificado pela descontinuidade da variao de F em funo do tempo. A determinao correta de Fo depende da construo do equipamento. O equipamento dever ser capaz de efetuar as leituras do sinal da fluorescncia induzido pela iluminao com extrema rapidez. Atualmente, com os fluormetros modulados, est fonte de erro insignificante. A fluorescncia modulada ser discutida posteriormente. 2) assumido que os aceptores esto completamente reduzidos no ponto Fm. Se a luz de excitao no suficiente, a fluorescncia no alcanar o pico mximo. Desta maneira, o pico mximo obtido no ser o sinal mximo da fluorescncia Fm, e o valor de Fm determinado no ser correto. Sendo assim, este valor incorreto de Fm no dever ser usado para calcular a relao Fv/Fm. A luz de excitao para a obteno de Fm varia de espcie para a espcie, com o perodo de adaptao no escuro e de acordo com as condies do ambiente de cultivo. Existem outras variveis obtidas da curva Kautsky que podem ser usados nas interpretaes do processo fotossinttico. A razo de decrscimo da fluorescncia (Rfd), que determinada pela expresso (Fm Ft)/Ft, denominada de ndice de vitalidade e usada para avaliar a atividade de Ciclo de Calvin e seus processos relacionados

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(Lichtenthaler et al, 1986). Valores de Rfd superiores a 2,5 indicam um bom funcionamento da atividade fotossinttica (Rinderle e Lichtenthaler, 1988) e valores abaixo de 1 sugerem que a fixao do CO2 tem sido severamente comprometida (Haitz e Lichtenthaler, 1988). A rea sobre a curva de fluorescncia entre Fo e Fm proporcional quantidade dos aceptores de eltrons (Murata et al, 1966). Sendo assim, se a transferncia dos centros de reao para o pool de plastoquinona bloqueado, ou seja, como exemplo a aplicao do herbicida DCMU (Diclorofenil-dimetilureia - Diuron) (bloqueia a trasnferncia de Qa para Qb), a rea da curva ser drasticamente reduzida (Figura 6). b.2) Fluorescncia modulada: Recentes progressos relacionados pesquisa da fluorescncia tm sido obtidos aps construo dos fluormetros modulados (FLM) (gren e Baker. 1985; Schreiber 1986; Schreiber et al, 1986). Estes equipamentos se diferenciam dos equipamentos do tipo FLNM, pois utilizam uma fonte luminosa de excitao modulada (1 a 100 kHz), em conjunto com um sistema de deteco de fluorescncia. Nesta condio, permite-se monitorar a fluorescncia na freqncia e fase da luz modulada de excitao. Sendo assim, estes aparelhos permitem monitorar a fluorescncia na presena de uma luz contnua de qualquer comprimento de onda, incluindo a luz solar. O esquema ilustrado do fluormetro modulado mostrado na Figura 5b. Normalmente, a luz modulada inicial aplicada aps o tecido vegetal ter sido mantido no escuro de baixa intensidade (<1mol m-2 s-1), e no induz a curva da fluorescncia. Uma segunda luz com cerca de 30 mol m-2 s-1 induz a cintica da curva. Esta segunda luz freqentemente denominada de luz actnica. Para efetuar as anlises dos quenchings (dissipaes), uma luz com elevada intensidade luminosa (>2000 mol m-2 s-1) utilizada para fechar os centros de reao. Nestes equipamentos, as medies so efetuadas ligando-se inicialmente uma luz modulada inicial (< 1mol m-2 s-1). Esta luz modulada inicial de insuficiente intensidade para fechar todos centros de reao, ou seja, incapaz de gerar qualquer fluorescncia varivel. Entretanto, capaz de induzir apenas o nvel Fo (Figura 7). Desta maneira, um tempo t de luz modulada inicial pode ser permitido para uma clara definio de F0. Os fluormetros modulados tm facilitado as anlises das dissipaes (quenchings). Estes processos de extino da fluorescncia, denominados quenchings, sero descritos a seguir.

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Figura 7. Definio dos nveis da fluorescncia modulada, dissipaes (quenchings) e expresses para o rendimento quntico do PSII em amostras adaptadas (mximo ou timo) e no-adaptadas ao escuro (efetivo). Os nveis de fluorescncia mxima aps a amostra ser adaptada ao escuro (Fm) e no-adaptada ao escuro (Fm) foram induzidas pela completa reduo de Qa com um pulso saturante de luz de 0,5-1s. A seta () indica o incio da aplicao da luz, a seta ( ) indica a aplicao do pulso de saturao e a seta () indica o desligamento da luz actnica. O rendimento quntico mximo do PSII (Fv/Fm: IIm) foi obtido com a adaptao da amostra no escuro (centros de reao abertos (qp=1 e qNP=0)). O rendimento quntico efetivo foi medido aps a iluminao. No modelo PAM 2000 (Walz, Alemanha), para as determinaes dos quenchings fotoqumico e no-fotoqumico, torna-se necessrio o conhecimento de F0. Na determinao de NPQ no se utiliza F0 (Bolhr-Nordenkampf et al. 1989). Para os clculos de qN e qP, o fluormetro modelo MiniPAM (Walz, Alemanha) utiliza o valor de F0 e no F0 na determinao dos quenchings.

Anlise das dissipaes (quenchings) Aps a elevao da fluorescncia, ponto P na curva Kautsky, observado um decrscimo na emisso da fluorescncia. Esta queda pode ocorrer em 1 ou em vrios minutos, at atingir o nvel de equilbrio T. A transferncia de eltrons de Qa para Qb e para o pool de plastoquinona reabre os centros de reao, reduzindo a fluorescncia. Entretanto, segundo Duysens e Sweers (1963) o declnio da fluorescncia a partir de P

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no pode ser explicado exclusivamente pela reoxidao de Qa (quenching fotoqumico: converso da energia fotoqumica no PSII). Atualmente, alm do quenching fotoqumico, outros no relacionados reoxidao de Qa so conhecidos. A extenso do abaixamento da fluorescncia a partir de P pode ser expressa pelos coeficientes dos quenchings (0 q 1) e indica a proporo de reduo de Fv. Apesar do termo quenching ter um exato significado fsico, na literatura relacionada fisiologia vegetal, a palavra quenching tem sido definida como qualquer decrcimo (dissipao) da fluorescncia (Krause e Weis, 1984). Como foi citado anteriormente, existem dois tipos de quenchings: quenching fotoqumico (qp) e quenching no-fotoqumico (qN). A fase rpida de induo da fluorescncia (fases OIDP da curva Kautsky) reflete as mudanas de qp, enquanto que as mudanas em qN so mais lentas. As mudanas em qp so rpidas (fraes de segundo) e as mudanas em qN requerem um perodo maior (10 segundos ou vrios minutos). Esta diferena na resposta dos quenchings a base da separao entre qp e qN (Bradbury e Baker, 1981). Em qualquer ponto no tempo, a aplicao de uma luz de alta intensidade contnua aps o pico P causar uma completa reduo dos centros de reao do PSII e, conseqentemente, uma rpida reduo de qp (rpida supresso de qp, isto , qp tende a zero). Segundo Krause e Weis (1988), qp est relacionado com a quantificao da energia de excitao capturada pelos centros de reao abertos (devido a transferncia de energia entre as unidades do PSII, qp no proporcional a Qa oxidada). O quenching fotoqumico determinado pela fotoqumica e decresce na proporo em que os centros de reao so fechados, ou seja, reduo de Qa (Bolhr-Nordenkampf e quist, 1993). Segundo Pospisil (1997), o decrscimo do rendimento quntico da fluorescncia, associado s reaes fotoqumicas, denominado de quenching fotoqumico. Krause e Weis (1991) relatam que qp representa a frao aberta do PSII em relao frao total deste fotossistema. Usando um fluormetro modulado mostrado a separao dos quenchings pela aplicao de apenas 1 pulso de luz saturante (Figura 7 (iluminated)). O sinal reflete a emisso da fluorescncia. Este sinal varia de em torno de 5, entre o valor de F0 (centros de reao abertos) e o valor de Fm (centros de reao fechados). Aps um tecido fotossintetizante ter sido mantido no escuro, foi efetuada a medio da fluorescncia em funo do tempo em um fluormetro modulado. Inicialmente, quando foi incidida sobre a folha, uma luz modulada de baixssima intensidade, a fluorescncia (F) atingiu o valor de F0. Aps alguns segundos, quando a mesma folha foi exposta a um breve e intenso pulso de luz saturante (1 segundo de durao), a fluorescncia incrementou at o nvel mximo

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Fm. Neste ponto, se a luz actnica intensa, todos os centros de reao tornam-se fechados e a fotoqumica torna-se zero (neste ponto, qp e qn atingem valores iguais a zero). Segundo Schreiber et al (1998), no possvel induzir Fm em menos de 100 ms. Aps este pulso, a emisso da fluorescncia diminui de Fm para o nvel F0 como resultado da reoxidao dos centros de reao fechados pelo pulso de luz actnica. Aps o pico de emisso da fluorescncia, uma seqncia de pulsos de luz saturantes aplicada ao tecido fotossintetizante para analisar os quenchings. O pico da fluorescncia em cada pulso aplicado (Fm) reduzido medida que os valores dos quenching so demonstrados (Figura 7). Na Figura 7, mostrado apenas um pulso de luz para induzir Fm. Se os quenchings esto relacionados com a fotoqumica, cada aplicao do pulso saturante elevar a fluorescncia at o nvel Fm, pois cada pulso luminoso suficiente para fechar os centros de reao (qp igual a zero). Entretanto, observado que a cada pulso, Fm no retorna ao valor inicial Fm. Este fato indica que o quenching nofotoqumico est atuando para diminuir a emisso da fluorescncia (Bradbury e Baker, 1981). Esta a base para a diferena de qN e qp. Segundo Pospisil, (1997) o quenching no-fotoqumico o decrscimo do rendimento quntico da fluorescncia associado dissipao termal da energia de excitao. Schreiber et al (1998) relatam que o quenching no-fotoqumico est relacionado ao incremento da energia de de-excitao no-radiativa, envolvendo formao de calor ou transferncia para o PSI no-fluorescente. No modelo PAM 2000 da Empresa Walz, Alemanha, quando a luz actnica desligada, aps um determinado tempo (estabelecido pelo aparelho), ligada uma luz fraca de comprimento de onda na regio do vermelho distante e observado que a fluorescncia atinge o valor F0, inferior a F0. No modelo MINI-PAM, fabricado por essa mesma empresa alem, este equipamento no possui esta luz na regio do vermelho distante. Desta maneira, os cculos de qN e qp so sempre dependentes de F0. Apesar dos conceitos dos quenchings serem motivos de controvrsias entre os autores, segundo Krause e Weis (1988) o quenching no-fotoqumico composto pelos seguintes componentes: a) quenching dependente de energia (qe): relacionado com o gradiente de prtons atravs da membrana do tilacide: o principal componente do quenching no-fotoqumico (dissipao da energia no-radiativa). Briantais et al (1979) tem mostrado que o valor de qe linearmente relacionado concentrao de prtons dentro dos tilacides dos cloroplastos. Em alta intensidade luminosa, quando um alto gradiente de prtons

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formado dentro dos tilacides, 80% da fluorescncia varivel pode ser reduzida (qe=0,8). Uma maior parte de qe est altamente relacionada com a formao de zeaxantina. Este carotenide tem sido relacionado como uma armadilha dissipativa no sistema antena (Demmig-Adams e Adams, 1992). Horton e Ruban (1992) propuseram que a zeaxantina facilita a agregao do LHCII e, como conseqncia, incrementa a energia no-radiativa. b) quenching relacionado fosforilao LHCII) (qt) A distribuio da energia de excitao entre os dois fotossistemas regulada pela fosforilao e desfosforilao do LHCII (Bullerjahn, 1997). A Fosforilao do LHCII tem sido indicada por funcionar como um balano na distribuio da energia de excitao entre os dois fotossistemas (Briantais et al, 1986). O LHCII fosforilado separado do PSII e migra das regies da grana para as lamelas do estroma dos tilacides. A diminuio da excitao do PSII em relao ao PSI reduz a emisso da fluorescncia. A contribuio deste mecanismo para a reduo do rendimento quntico da fluorescncia relativamente pequeno (qt max. 0,2). A cintica de qt relativamente lenta em comparao qe (Krause e Behrend, 1986; Horton e Hague, 1988). c) quenching relacionado fotoinibio da fotossntese (qI): possivelmente causado pela transformao dos centros de reao do PSII. A fotoinibio da fotossntese, a qual ocorre em excessivos FFF, est relacionada com o quenching da fluorescncia varivel. Este decrscimo na emisso da fluorescncia se desenvolve dentro de minutos ou horas, dependendo da FFF e do estado de aclimatao do aparato fotossinttico. O processo fotoinibitrio promovido por vrios fatores do ambiente que comprometem a utilizao da energia luminosa sobre o metabolismo do carbono. Existe um consenso de que o PSII o centro primrio do processo fotoinibitrio e este distrbio no-somente reduz o rendimento quntico do PSII, como compromete o fluxo de eltrons neste fotossistema (Barenyi e Krause 1985). Segundo Krause e Weis (1988), qI expressado pelo decrscimo na relao Fv/Fm na cintica da fluorescncia. Um incremento da dissipao termal dos sistemas antena do PSII tem sido considerado como uma causa do quenching (Demmig e Bjrkman, 1987) e uma correlao com

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as reaes do ciclo das xantofilas (formao de zeaxantina a partir da violaxantina) foi encontrado (Demmig et al, 1987). Quando as condies so favorveis, o processo fotoinibitrio e as respectivas relaes com a fluorescncia so completamente reversveis dentro de minutos ou horas. Desta maneira, uma parcela reversvel de qI no dever ser visto como um dano, mas sim como um mecanismo de proteo que permite dissipar o excesso de energia termal. d) quenching causado pelo decrscimo da concentrao de Mg++, causando incremento na transferncia de excitao para o PSI. Na literatura, este tipo de quenching pouco discutido. Em condies normais, qp e qe so os maiores componentes no declnio da emisso da fluorescncia. Como foi discutido, os dois tipos de quenchings podem ser facilmente obtidos utilizando a fluorescncia modulada. Por meio do modelo PAM 2000 (Walz, Alemanha) matematicamente, os dois quenchings podem ser assim expressos (Kooten e Snel, 1990): qP = (Fm F)/(Fm F0) qN = 1- [(Fm F0)/(Fm F0)] No modelo MINI-PAM (Walz, Alemanha), estes quenchings so assim expressos: qP = (Fm F)/(Fm F0) Se qN = 1 - qP qN = (Fm Fm)/(Fm F0)

Torna-se importante relatar que os parmetros da fluorescncia que apresentam o sinal () esto relacionados a uma pr-iluminao da amostra (esto relacionados fluorescncia modulada). Quando um tecido fotossintetizante mantido no escuro, aps o incio da induo da curva de fluorescncia, F0 e Fm so determinados (Figuras 6 e 7). Como foi dito, a

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razo (Fm F0)/Fm = Fv/Fm uma medida do potencial mximo do rendimento quntico do PSII de uma dada amostra (Bjrkman 1987). Durante a iluminao, ou seja, aps o(s) pulso(s) de luz actnica a cintica da fluorescncia torna-se mais complexa. Com o(s) pulso(s) de luz, obtem-se variaes nos nveis de Fm, que passa a ser denominada de Fm. Desta maneira, determina-se Fm Fm (quenching no fotoqumico) e Fm F (quenching fotoqumico). Segundo Bilger e Schreiber (1986) o valor de F0 pode ser reduzido por qe. Sendo assim, para um correto clculo de qp e qN torna-se necessrio uma determinao prvia de F0. Aps o desligamento da luz actnica ( na Figura 7). Este parmetro da fluorescncia pode ser determinado mantendo a amostra no escuro (Qa ter sido oxidada em poucos segundos quando o pool estar parcialmente oxidado) e, aps, efetuar a aplicao uma luz fraca (7moles m-2 s-1) de fundo na regio do vermelho distante para que o PSI provoque uma re-oxidao em Qa. O conhecimento de F0 indispensvel para obter informaes sobre a extenso da abertura do PSII via clculo de qp (Schreiber et al, 1998). Uma outra maneira de calcular o quenching no-fotoqumico foi proposta por Bilger e Bjrkman (1990) e, para o clculo, no utiliza o parmetro F0. A expresso mostrada abaixo. NPQ = (Fm Fm)/Fm Esta expresso do quenching no-fotoqumico baseada no modelo matricial da organizao do sistema antena (Butler, 1978), assumindo a existncia de armadilhas de qn, ou seja, zeaxantina (Demmig-Adams, 1990). O atual mecanismo do quenching nofotoqumico ainda motivo de controvrsias entre os autores. Schreiber et al (1998) relataram que a relao entre NPQ e o excesso de FFF so lineares e que esta linearidade observada tambm quando se relaciona NPQ com o contedo de zeaxantina (Bilger et al 1995). Evidenciando a dissipao da energia no-radiativa via NPQ. Um outro parmetro da fluorescncia foi proposto por Genty et al (1989) (Fv/Fm). Estes autores demonstraram que o rendimento quntico efetivo do PSII pode ser determinado usando a seguinte expresso:

II (rendimento quntico efetivo) = qp x (Fv/Fm) = (Fm F)/Fm = F/Fm

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A expresso Fv/Fm (parmetro de Genty) representa a eficincia de captura da excitao pelos centros de reao abertos do PSII (Schreiber et al, 1994) e est relacionada dissipao da energia termal no sistema antena (Demmig-Adams et al. 1985). Essa equao tem uma grande vantagem de no utilizar o parmetro F0. Schreiber et al 1994 relata que a determinao de F0 pode ser problemtica em condies de campo. Note que nas amostras adaptadas ao escuro, a expresso equivalente a (Fm F)/Fm =F/Fm (amostra pr-iluminada) a expresso Fv/Fm (amostra adaptada no escuro), e definida como rendimento quntico timo. Segundo Bjrkman (1987), Fv/Fm a medida do potencial mximo do rendimento quntico do PSII. O rendimento quntico efetivo representa melhor as variaes no rendimento quntico da fotossntese do que a relao Fv/Fm (Genty et al, 1989) e, desta maneira, de melhor utilidade (Mohammed et al, 1995). Ainda, este parmetro da fluorescncia (Fv/Fm (parmetro de Genty)) no necessita que as amostras sejam adaptadas no escuro, e a sua determinao feita em menos de 1 segundo (Mohammed et al, 1995). Na botnica e em ambientes como o laboratrio, a casa-de-vegetao e em condies de campo, do ponto de vista prtico, a mais importante aplicao da fluorescncia da clorofila, a avaliao, durante um estado de equilbrio da iluminao, do rendimento quntico efetivo (IIe). O rendimento quntico efetivo do PSII pode ser usado para estimar a taxa de transporte de eltrons na amostra (tecido fotossintetizante) se o FFF incidente no tecido conhecido. Uma vez que 1 mol de ftons causa a excitao de 1 mol de eltrons da clorofila, verifica-se que o IIe representa a proporo destes eltrons que so usados na fase fotoqumica (reduo do NADP). Sendo assim, a taxa de transporte de eltrons (ETR) pode ser definida como ETR = IIe x FFF. Entretanto, nem toda a luz incidente sobre a folha absorvida pelas molculas de clorofila, alguns ftons podem ser transmitidos e outros podem ser refletidos. Cerca de 84% da luz incidente sobre a folha absorvida pelas molculas de clorofila, com 50% dos ftons ativando as molculas de clorofila associada ao PSII e 50% dos ftons ativando as molculas associadas ao PSI. Desta maneira, a taxa estimada de transporte de eltrons pode ser derivada da seguinte equao: ETR = IIe x FFF x 0,84 x 0,50 ou ETR = IIe x FFF x 0,42

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A FFF medida pelo sensor adaptado ao equipamento. Como exemplo, a ETR foi significativamente afetada por elevadas temperaturas (430C por 5 minutos) em plantas de Phaseolus coccineus (Schreiber et al, 1994). Uma informao importante sobre o desempenho do processo fotossinttico de uma tecido fotossintetizante o traado de curvas de luz (taxa aparente de transporte de eltrons versus FFF). Efetuando uma analogia com as curvas obtidas por equipamentos relacionados s trocas gasosas, a inclinao da curva em baixos FFF est relacionada com o rendimento quntico mximo. A estabilizao da curva alcanada na luz de saturao a medida da capacidade mxima de transporte de eltrons em elevados valores de FFF (Schreiber et al, 1998). A fluorescncia modulada pode ser medida concomitantemente com as trocas gasosas, usando um Analisador de gs no infravermelho (Infrared Gas Analyser - IRGA) (Ireland et al. 1984; 1985 e 1988) ou um eletrodo de oxignio (Schreiber e Bilger, 1987; Walker, 1987). A Figura 8 mostra um exemplo da medida da fluorescncia e da liberao de O2 (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989). Observa-se na curva uma forte relao entre a cintica de liberao do oxignio e qp. Exceto em alguns pontos em que qp antecede alguns pontos da curva dO2/dt. Segundo Schreiber e Bilger (1987) estes desvios podem estar relacionados com o fluxo de eltrons para o O2 (reao de Mehler, ou fotorespirao) ou com o fluxo cclico de eltrons no PSII. O quenching fotoqumico (qp), predominantemente, reflete o metabolismo fotossinttico do carbono. Entretanto, ele no pode representar uma alternativa para a medida da assimilao do carbono e vice-versa. Como exemplo, plantas que apresentam o metabolismo do tipo CAM e plantas submetidas a dficits hdricos acentuados, as quais esto com os estmatos fechados, podem apresentar valores significantes de qp devido reciclagem interna de CO2. Nesta condio, a fluorescncia pode fornecer informaes sobre o rendimento quntico, o fluxo de eltrons e sobre o estado de energia dos cloroplastos (Winter e Demmig, 1987), mesmo que nenhuma fixao do CO2 ou liberao do oxignio ocorra. Neste caso qp est relacionado com a estimativa da disponibilidade de dissipao de energia para o metabolismo do carbono (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989).

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Figura 8. Registro simultneo da fluorescncia da clorofila e da liberao de oxignio. Pulsos saturantes de luz (5000 mol m-2 s-1) foram aplicados repetidamente para determinar o quenching fotoqumico. Discos Foliares de espinafre adaptadas ao escuro foram iluminados com luz branca de intensidade de 350 mol m-2 s-1 no eletrodo de Clarck e simultnemente registrada a fluorescncia modulada (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989).

A Figura 9 mostra as curvas de induo da fluorescncia e o parmetro F/Fm, na ausncia e na presena de CO2. Observa-se na Figura 9A que na presena de CO2, um decrscimo inicial de Fm observado, seguido de um incremento no valor desta varivel. Na Figura 9B, observado um incremento do parmetro F/Fm na presena de CO2. O decrscimo inicial de Fm depende da presena de O2 (a atividade da enzima ascorbato peroxidase, que utiliza H2O2, produto da atividade da superxido dismutase cujo substrato o O2, tem uma funo essencial na ativao do fluxo de eltrons (Asada e Takahashi, 1987, Schreiber et al, 1971)) e reflete a formao do gradiente de prtons entre o estroma e o lmen dos tilacides dos cloroplastos. Segundo Schreiber et al (1994), o incremento de Fm acontece paralelamente ao incio do Ciclo de Calvin e da liberao de oxignio. Na ausncia de CO2, quando a atividade do Ciclo de Calvin suprimida, um estado de

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equilbrio alcanado e caracterizado pelo elevado valor de qn e por um reduzido valor na taxa de fluxo de eltrons, evidenciado pelo valor de F/Fm. Como esperado, a adio de CO2 diminui o qN e estimula o fluxo de eltrons (Figura 9B).

Figura 9. Determinao do fluxo de eltrons assimilatrio e no-assimilatrio em folhas de espinafre adaptadas ao escuro na presena e ausncia de CO2. A: Traos originais. B: Valores calculados do rendimento quntico efetivo (F/Fm). (Schreiber et al, 1994)

Possivelmente, o maior potencial da anlise da fluorescncia em condies de campo ser o seu uso em conjunto com as medidas das trocas gasosas. Esta combinao permite determinar in vivo a atividade dos pontos chaves do processo fotossinttico (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989).

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Adaptao no escuro Como foi discutido anteriormente, antes da induo da cintica da fluorescncia, torna-se necessrio uma adaptao do tecido fotossintetizante ao escuro (30 minutos). Nesta condio, qN anular completamente, embora numa taxa reduzida. Se o NADPH2 o produto final do transporte de eltrons no-cclico, ento, o estado de redox deste aceptor final de eltrons afetar a capacidade de transporte de eltrons, a fotoqumica, qp e indiretamente qe. O estado de redox do aceptor final afetado pelo seu consumo no ciclo de Calvin e por outras reaes redutoras do carbono fotossinttico e do metabolismo do nitrognio, as quais ocorrem no estroma. Similarmente, a taxa de consumo de ATP afetar a capacidade de consumo do gradiente transtilacoidal de prtons e, desta maneira, afetar qe. Torna-se evidente que a fluorescncia seja determinada na eficincia qumica mxima do PSII expressa como Fv/Fm. Esta condio somente obtida com a adaptao da folha no escuro. Fluorescncia a baixas temperaturas A influncia na fluorescncia da clorofila pela capacidade de transporte de eltrons (limitada, por exemplo, pela atividade do Ciclo de Calvin e por qualquer outra reao enzimtica) pode ser suprimida pelas medidas das amostras em nitrognio lquido (77K). Nestas condies, somente as reaes fotoqumicas primrias sero medidas. Praticamente, toda a fase bioqumica est suprimida. Antes do congelamento, ao se adaptar um tecido fotossintetizante ao escuro, o rendimento quntico da fluorescncia do PSII ser dependente somente do estado de redox de Qa, ou seja do quenching fotoqumico. Todos os outros processos termais relacionados ao queching no-fotoqumico sero inibidos. A fluorescncia a 77K pode ser usada no estudo da distribuio de energia entre os dois fotossistemas (Baker et al, 1983). Como foi discutido anteriormente, os estudos da cintica da fluorescncia a 77K est mais direcionado s interpretaes tericas do processo.

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Protocolos de amostragem: Apesar do avano na execuo das medidas da fluorescncia devido aos progressos no processo de instrumentao, tem sido pouco documentada a padronizao das amostras para que se possa ter boa preciso e repetibilidade das medidas (Mohammed et al, 1995). As formas das curvas, bem com a amplitude, podem ser afetadas por vrios fatores como o horrio da medio, a estao de crescimento, a posio da folha, as caractersticas de adaptao luz, ao tempo de adaptao ao escuro e temperatura e intensidade de luz durante o ensaio. Desta maneira, torna-se importante minimizar a influncia de fatores externos, os quais podem conduzir a erros experimentais elevados e subseqentes falhas na interpretao dos dados. Hora do dia/estao de crescimento A estao de crescimento influencia a fotossntese e, por sua vez, a emisso da fluorescncia. Deve-se observar o perodo de dormncia de espcies vegetais que se desenvolvem em regies com baixas temperaturas. A hora do dia em que se coleta uma amostra e/ou o horrio de medio pode influenciar nos resultados. Valentini et al (1994) observaram que os valores da relao F690/F730 em Papulus Alba L. foi reduzida a partir de 8:00 at o perodo da tarde, atingindo a estabilidade em torno das 16:00. Em folhas de Carica papaya L., crescidas a 2450 mol m-2 s-1, a relao Fv/Fm apresentou valores de 0,825 s 6:00 e 0,555 s 12:00 (Marler, 1993). Em condio de campo (FFF em torno de 500 e 1800 mol m-2 s-1, 6:00 e 14:00, respectivamente), este mesmo autor encontrou valores de 0,825 s 6:00 e valores de 0,700 s 14:00. Em folhas desta mesma espcie, crescida em FFF de 300 mol m-2 s-1, Campostrini (1997) encontrou pouca variao (0,825 a 0,850), durante o dia (8:00 s 18:00). As medidas da emisso da fluorescncia da clorofila tm sido obtidas, geralmente, nos perodos do dia em que a taxa fotossinttica apresenta maiores valores, ou seja, poucas horas aps o amanhecer (Saarinen e Liski, 1993).

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Seleo das amostras: Os resultados da emisso da fluorescncia da clorofila podem ser afetados pela posio da folha no dossel. A posio das folhas determina se uma folha apresenta caractersticas de sol ou de sombra e, ainda, se est relacionada idade da folha. Como exemplo, uma elevada variao em Rfd foi encontrada em folhas crescidas no pice do dossel (folhas de sol) e folhas crescidas nas partes mais baixas do dossel (folha de sombra). O valor deste parmetro da fluorescncia foi mais elevado em folhas jovens do que em folhas mais velhas cronologicamente. Os efeitos da exposio das folhas ao sol e sombra so importantes quando se analisa a superfcie abaxial e adaxial, principalmente em folhas de maiores reas. Desta maneira, a padronizao das amostras torna-se importante, principalmente quando pequenas reas foliares esto sendo usadas. Estes cuidados proporcionam maior preciso e repetibilidade dos resultados (Mohammed et al, 1995). A estratgia de amostragem depender dos objetivos do estudo. Se o estudo objetiva mostrar diferenas significativas entre duas populaes num determinado ponto no tempo, ou entre folhas de uma mesma populao em diferentes tempos, uma elevada quantidade de amostras (>50) torna-se necessria (Bolhr-Nordenkampf et al, 1989). Intensidade da luz A intensidade da luz antes e durante as medidas da fluorescncia pode ter significativos efeitos nos resultados. Este fator um dos maiores fatores de variao nos estudos relacionados com a fluorescncia. O FFF usado durante as medidas tem variado de 15 a milhares de moles m-2 s-1 na determinao da curva Kautsky. No h um valor tpico de FFF nos relatos, entretanto, valores inferiores a 500 mol m-2 s-1 so usados com mais freqncia (pulso de saturao so necessariamente altos (>3000mol m-2 s-1)) para que ocorra uma completa reduo dos aceptores de eltrons. Nestas condies, podem fornecer informaes significativas sobre as determinaes dos coeficientes dos quenchings. Na determinao da curva Kautsky, a intensidade da luz de excitao tem sido mostrada por influenciar os parmetros da fluorescncia como Rfd e Fv/Fm (Mohammed et al, 1995). Na determinao de Rfd, por exemplo, requerido uma luz de excitao saturante para uma correta determinao de Fm (Lichtenthaler e Rinderle, 1988). Contudo, altas

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intensidades luminosas podem no ser necessrias para a determinao precisa da relao Fv/Fm. O trabalho clssico de Bjrkman e Demmig (1987) que identificou valores de Fv/Fm em torno de 0,830 (77K), para espcies C3, foi utilizado valores baixos de FFF. Subseqentes estudos comprovaram os resultados desses autores. quist e Wass (1988) mostraram que os valores constantes para a obteno de Fv/Fm foram obtidos nas intensidades de luz variando de 70 a 570 mol m-2 s-1 de luz actnica. BolhrNordenkampf et al (1989), relataram que os efeitos da variao na intensidade de luz nos parmetros da fluorescncia, como Fv/Fm, devero ser testados com o material vegetal que se vai trabalhar. As variaes dos fatores do ambiente como cobertura do cu com nuvens, a presena de competio por luz e o autosombreamento do dossel podem afetar significativamente a intensidade luminosa no ambiente em estudo e, desta maneira, afetar o rendimento quntico do PSII determinado in situ (Schreiber et al, 1994). O rendimento quntico apresenta valores elevados em condio de baixa intensidade luminosa em comparao com altas intensidades. Mohammed et al, 1995 citam que relacionar ETR com FFF pode ser mais informativo. A inclinao desta curva representa a eficincia quntica tima e, em altas FFF representa a limitao do fluxo de eltrons fotossintticos passando atravs do PSII. Quando se est utilizando fluormetros em condio de campo, uma observao importante relatada por Marler e Lawton (1994), foi a influncia da elevada temperatura nas minicubetas utilizadas na adaptao da folha ao escuro. Em condio de campo e em condio de cu limpo, estas minicmaras so diretamente expostas a elevadas intensidades de luz solar direta (elevados FFF). Os valores elevados de FFF podem causar elevaes na temperatura das minicmaras e podem influenciar significantemente os valores de Fo, Fm e da relao Fv/Fm. Nestas condies, os autores propem metodologias que reduzem a interpretao direta da FFF (cobertura com papel alumnio, como exemplo) e/ou uma padronizao na orientao das minicmaras, para reduzir o efeito da temperatura sobre as variveis da fluorescncia. Aplicaes Vrios tipos de estresses como temperaturas supra-timas, dficits hdrico e elevados FFF podem afetar direta ou indiretamente o desempenho do PSII (quist, 1987). Desta maneira, a fluorescncia da clorofila tem sido usada como uma ferramenta de

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seleo de gentipos tolerantes a diversos tipos de estresse (Strand e quist, 1985; Belkhodja et al 1994; Araus et al 1998; Flagella et al 1994; Flagella et al 1995, Kitao et al (1998). Em outros estudos relacionados ao estresse, algumas publicaes abaixo so exemplos das aplicaes da fluorescncia da clorofila. 1. Temperaturas infra-timas: Larcher e Neuner (1989); Brggemann et al (1992); Rtten e Santarius (1992) 2. Temperatura supra-timas: Havaux et al (1988); Havaux et al (1991), Bilger et al (1987) 3. Dfice hdrico e salinidade: Cornic e Briantais (1991); Cornic e Ghashghaie (1991); Winter e Gademann (1991); Larcher et al (1990); Havaux e Lannoye (1985); Havaux e Lannoye (1983); Belkhodja et al (1994); Araus et al (1998); Flagella et al (1994); Flagella et al (1995). 4. Poluio do ambiente: Kooten et al (1988); Schmidt et al (1987, 1990), Atal et al (1991); Saarinen e Liski (1993). 5. Deficincia nutricional: Kitao et al (1998), Conroy et al (1986) Agradecimentos O autor gostaria de agradecer imensamente aos professores Dr. Carlos Pimentel, Departamento de Fitotecnia, do Instituto de Agronomia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Dr. Jurandi Golalves de Oliveira do Setor de Fisiologia Vegetal/LMGV, da Universidade Estadual do Norte Fluminense e o Dr. Carlos A. Martinez, da Universidade de So Paulo pelas valiosas sugestes a este trabalho.

Referncias
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