Actina, microtubuli e nucleo

Funzioni del nucleo cellulare

• Un nucleo ben definito non è presente nei batteri
• Le cellule ‘eucariotiche’ sono dotate di un nucleo che consente di
separare le funzioni di replicazione del materiale gentico e della sua
trascrizione in RNA dalla traduzione dei messaggeri in proteine,
funzione svolta esclusivamente nel citoplasma

• Nel nucleo si svolgono funzioni connesse al metabolismo del

DNA e degli RNA:

- Replicazione del DNA

- Trascrizione degli mRNA, degli RNA ribosomali e degli RNA transfer,
oltre a una serie di piccoli RNA con varie funzioni
- Processamento degli RNA
- Capping, poliadenilazione e splicing dei messaggeri
- Preparazione al trasporto degli RNA al citoplasma, che avviene
attraverso i pori nucleari
 Dal gene
alla proteina
Controllo dell’espressione genica
Splicing alternativo
 Reticolo
endoplasmatico
e nucleo

Il nucleo è delimitato da una

doppia membrana, definita
nel suo insieme involucro
nucleare

La membrana esterna è in
continuità con la membrana
del reticolo endoplsmatico,
quindi su di essa è possibile
riscontrare la presenza di
ribosomi
 Nucleo di una cellula HeLa in coltura

Struttura del
nucleo

Schema del nucleo con i suoi

principali componenti
Nucleo visto al microscopio elettronico
Involucro
nucleare e
complessi
del poro

Il citoscheletro è connesso
alla lamina nucleare
mediante proteine della
membrana nucleare

Cromatina addensata
è visibile in più punti in
associazione con il
versante interno
dell’involucro nucleare
Involucro nucleare e pori nucleari
 Pori nucleari
visti dal
versante
esterno,
citoplasmatico...

...e dal
versante
interno,
nucleare
 Traffico attraverso i pori nucleari

Particelle d’oro ricoperte con proteine residenti nel nucleo iniettate

in oociti di rana attraversano i pori nucleari
 Pori nucleari
I pori nucleari presentano
una simmetria ottagonale
con filamenti sul versante
citoplasmatico
e una struttura a canestro
sul versante nucleare

Contengono una trentina

di nucleoporine disposte
all’interno del poro che
consentono la variazione
di diametro del poro stesso.
Alcune nucleoporine
formano un anello
transmembrana che
àncora il complesso
all’involucro nucleare

Le nucleoporine FG, dotate di

domini di fenilalanina-glicina,
formano un filtro nel poro
Le sequenze segnale di proteine nucleari
possono essere localizzate in punti
differenti sulle diverse proteine

Una sequenza per l’import nucleare

Pro – Pro – Lys – Lys – Lys – Arg – Lys – Val

Una sequenza per l’export dal nucleo

Leu – Ala – Leu – Lys – Leu – Ala – Gly – Leu – Asp – Ile
Una sequenza di
import nucleare
permette la
traslocazione
(sperimentale)
al nucleo della
piruvato chinasi,
un enzima attivo
nel citosol
(glicolisi)
 Il sistema di
import/export è coadiuvato
dal mantenimento di
concentrazioni diverse di
Ran-GTP nel nucleo e nel
citoplasma, e dalla attività di
un GEF nucleare (RCC1) e
di una GAP citoplasmatica
(RanGAP1)
Import di proteine nucleari 1) La sequenza NLS permette il legame
della proteina al dimero di importine
2) Il complesso si lega ai filamenti citoplasmatici
3) Il complesso penetra attraverso il poro
interagendo con domini FG di nucleoporine
4) Ran-GTP favorisce il rilascio della proteina
nel nucleo
5) L’importina β viene riportata nel citoplasma
dal Ran-GTP (il GTP viene in seguito idrolizzato),
l’importina α da una esportina
6) Ran-GDP torna al nucleo grazie al fattore NTF2,
(nuclear transport factor), ed è riconvertito in
Ran-GTP
Ran: ras-related nuclear protein
GEF: guanine exchange factor
Nucleoplasmina coniugata a oro iniettata in oociti di Xenopus
(FC: filamenti citoplasmatici; PN: poro nucleare) GAP: GTPase activating protein
 Export degli RNA messaggeri

Il trasporto degli mRNA avviene solo se lo splicing è stato portato a termine

Proteine contenenti segnali di traslocazione appropriati (NES) si legano al

messaggero e ne consentono il trasferimento al citoplasma.
Il trasporto è mediato da proteine denominate esportine, il cui legame
all’NES è stimolato da Ran-GTP
 Lamina nucleare

La lamina nucleare è una rete di filamenti che delimita dall’interno l’involucro

nucleare, costituita da tre proteine principali della famiglia dei filamenti
intermedi, le lamìne A, B, e C
Lamina nucleare Mutazioni dei componenti
della lamina nucleare
provocano gravi alterazioni
alla struttura nucleare:
pazienti affetti da HGPS
(Hutchinson-Gilford
progeria syndrome)
presentano
nuclei disorganizzati e
una forma tronca della
lamìna A
 Cromatina
e
cromosomi

La cromatina forma un ammasso filamentoso, visibile a sinistra mentre

fuoriesce da un nucleo lisato
A destra, un cromosoma metafasico al massimo grado di condensazione,
composto da due cromatidi tenuti insieme nella regione centromerica
 Compattamento del DNA
nel nucleo
Ciascuna molecola di DNA è contenuta in un
cromosoma, complessata con proteine che ne
consentono l’avvolgimento sequenziale in
strutture di ordine superiore

Ogni cellula somatica umana ha 46 cromosomi,

cioè 22 coppie di autosomi e due cromosomi
sessuali (XX per le femmine e XY per i maschi).
Ogni cromosoma contiene una specifica
molecola di DNA

Nelle cellule somatiche la lunghezza del DNA è

di circa 2 metri, ogni nucleotide ha infatti una
lunghezza di 0,34 nm, e i nucleotidi
sono 6,4 x 109 (coppie di basi)

Le cellule germinali hanno invece un corredo

aploide, contengono cioè 22 autosomi e un
solo cromosoma sessuale, X o Y
 Basi azotate

Il composto base + zucchero è detto nucleoside. I nucleosidi sono

adenosina, citidina, guanosina, timidina e uridina.
 Citidinmonofosfato
(CMP), un nucleotide.

I nucleotidi che recano due o

tre gruppi fosfato sono detti
rispettivamente difosfato e
trifosfato p.es. CDP,
citidindifosfato e CTP,
citidintrifosfato.
Gli altri nucleotidi trifosfato che
compongono gli RNA sono
ATP, GTP ed UTP.

I nucleotidi che costituiscono

il DNA hanno lo zucchero
deossiribosio, privo dell’O in
posizione 2, e le abbreviazioni
sono precedute da una d, p.es.
dCTP = deossicitidintrifosfato.
Gli altri sono dATP, dGTP e
dTTP.
 DNA

Il ponte fosfato consente di unire

nucleotidi successivi in un filamento di DNA.
Il legame è tra il 3’ di un
deossiribosio e il 5’ del successivo.

Nella doppia elica i due filamenti corrono in

direzione opposta (antiparallela) e sono
tenuti insieme da legami idrogeno
tra nucleotidi complementari
Fibre di DNA da 30 nanometri e da 10
nanometri (spessore)

1 nanometro (nm) = 10-9 m

 La fibra da 10 nanometri
Il filamento da 10 nm è composto da
nucleosomi, formati da ~200 paia basi
di DNA e da un ottamero di istoni

Il nucleosoma comprende una regione centrale (core) nella

quale circa 146 bp di DNA si avvolgono attorno all’ottamero
istonico e due regioni linker adiacenti
Fibra da 30
nanometri
in modelli
alternativi...

...e istone
H1

Struttura a
zig-zag
al M.E.
 Anse del cromosoma

La fibra da 30 nm si ripiega in domini ad ansa di dimensione variabile

(~ 100 nm di spessore) connessi a una impalcatura del cromosoma
(scaffold), la cui composizione non è stata ancora chiarita
Domini ad ansa

Modello di anse tenute

insieme dalla proteina
coesina

Le anse possono essere

visualizzate trattando i nuclei
con quantità di proteasi che
degradano gli istoni ma
lasciano integra la matrice
 Dalla
doppia elica
al
cromosoma

1 micron di cromosoma
mitotico contiene
1 cm di DNA
(10000:1)
Regioni essenziali del cromosoma
 Un cromosoma al
microscopio a scansione.
Il centromero contiene
sequenze ripetute di DNA
e lega il cinetocore,
insieme di proteine
essenziale per l’attacco
dei microtubuli del
fuso mitotico

Centromeri e telomeri Ibridazione su cromosomi di cellule

incapaci di produrre una telomerasi
funzionante
I telomeri umani
contengono
la sequenza ripetuta
TTAGGG e legano
proteine specifiche.
La sonda può essere
utilizzata per
identificare i telomeri
di tutti i cromosomi
umani.
I telomeri sono
essenziali per
mantenere integri
i cromosomi
 Eterocromatina
facoltativa

Cromosoma X inattivato identificato

per l’assenza di istone H4 acetilato
Una parte dell’eterocromatina è presente
esclusivamente in alcuni tipi cellulari, in
modo dipendente dalla espressione
genica specifica

In alcuni casi vengono rese inattive vaste

regioni del genoma, come nel caso della
inattivazione del cromosoma X nelle
Cromosomi X inattivati (corpi di Barr) cellule di Mammiferi di sesso femminile
 Cariotipo umano: colorazione con sonde
fluorescenti che legano sequenze specifiche e
identificano i cromosomi per ibridazione ‘in situ’
Territori cromosomici
TFF:
Trefoil
factor
(Crom. 21)

GREB:
Growth
Regulation
by Estrogen In cellule tumorali mammarie in coltura
in Breast trattate con estrogeni i cromosomi
Cancer 2 e 21 assumono posizioni ravvicinate.
(Crom. 2) Le sonde che identificano i locus
specifici di TFF1 e GREB1 sui due
cromosomi mostrano
infatti co-localizzazione

Schema di una
possibile
interazione tra
geni posizionati
Ciascun cromosoma sullo stesso
occupa una regione cromosoma o
su cromosomi
specifica del nucleo diversi
Modello della distribuzione dei cromosomi nel nucleo
Geni e cromosomi
 Nucleolo

I nucleoli sono costituiti da una componente granulare, all’interno della quale

è possibile distinguere centri fibrillari circondati da una regione densa.
L’area granulare è probabilmente costituita da subunità ribosomali,
mentre le componenti fibrillari sarebbero costituite da DNA ribosomale (centri
fibrillari) e da trascritti di RNA ribosomale (componente fibrillare densa)
 Nucleoli ed RNA
ribosomale di oociti di
Xenopus laevis

Dai nucleoli è possibile isolare il

L’oocita di Xenopus contiene
DNA associato all’RNA ribosomale
centinaia di nucleoli in corso di trascrizione
 RNA ribosomali e
ribosoma dei
Mammiferi (80 S)

Gli RNA ribosomali derivano

dal processamento
di un trascritto primario di
45S prodotto dalla
RNA-polimerasi I
da geni presenti nel DNA
ribosomale nucleolare:
fa eccezione l’RNA 5S che è
trascritto in un altro punto del
genoma ad opera
della RNA polimerasi III
Del nucleolo fanno ovviamente parte le
regioni dei cromosomi che contengono
DNA ribosomale, cioè i geni ripetuti dai
quali si trascrive l’RNA ribosomale

Nucleolo e assemblaggio
delle subunità ribosomali
Oltre alla sintesi e al processamento
degli RNA ribosomali, il nucleolo è
sede dell’assemblaggio dei
complessi che costituiscono la
telomerasi
Una proteina molto rappresentata nel
nucleolo è la nucleolina, proteina
coinvolta nella trascrizione e
processamento dell’rRNA, nel
rimodellamento dell’rDNA e
nell’assemblaggio delle subunità
ribosomali

All’interno del nucleolo agiscono i snoRNAs,

piccoli RNA coinvolti in vari aspetti della
maturazione degli RNA ribosomali
Ribosomi, complessi RNA-proteine
Poli(ribo)soma
 La sintesi
proteica
avviene nel
citoplasma
ad opera dei
ribosomi.
Gli RNA
coinvolti sono
gli RNA
ribosomali,
gli RNA
messaggeri,
codificanti, e
gli RNA transfer,
trasportatori di
aminoacidi
Codice genetico
 Regioni del nucleo

Fattori di splicing
Regolazione trascrizionale

Biogenesi e traffico
Processamento del di
snoRNPs
3’ degliand
mRNAsnRNPs
CstF: cleavage stimulatory factor PML: promyelocytic leukemia