The oocyte maturation involves a series of events that lead to female gamete capacitation for fer... more The oocyte maturation involves a series of events that lead to female gamete capacitation for fertilization and embryo development. Around 80% of in vitro matured oocytes reach nuclear maturation, but only 60% complete cytoplasmic maturation. This lack of synchronization between nuclear and cytoplasmic maturation can affect early embryonic development and in vitro embryo production. Works developed by our group have shown that modulation of PI3K/Akt pathway increase bovine in vitro production. The aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations of Triciribine® (Merck, Darmstadt, Germany), a selective Akt inhibitor, on in vitro maturation of bovine oocytes. COCs (grade I and II) were matured in vitro in TCM 199 supplemented with 10% FCS, FSH 10 g/mL, LH 5μg/mL and 1% penicillin/streptomycin. This maturation medium was supplemented with 0nM (control-C), 1 nM (Group I-GI), 5 nM (GII) or 10 nM (GIII) of the inhibitor. IVM was performed in 100 µL drop (20 COCs/drop), submerged in mineral oil and maintained in a humidified atmosphere containing 5% CO2 in air, at 38.5°C, for 22 hours. Nuclear maturation evaluation was made after acetic orcein staining. The oocytes were considered matured when showed metaphase plate observed under optic microscope. The cytoplasmic maturation analysis was performed by active mitochondria distribution stained with MitoTracker® Red CMXRos (Molecular Probes®, Invitrogen, Eugene, OR, USA), observed by fluorescence microscopy and classified into three categories: peripheral (mitochondria located at periphery - immature oocytes), transition (incomplete mitochondrial distribution) or scattered (mitochondria homogeneously distributed in the cytoplasm - matured oocytes). Different concentrations of Akt inhibitor used in this study did not significantly alter nuclear maturation of bovine oocytes matured in vitro (SNK test, P > 0.05) (C: 75.72 ± 4.55; GI: 84.50 ± 13.43; GII: 75.69 ± 2.84; GIII: 69.92 ± 2.12). On the other hand, the use of inhibitor significantly reduced the number of oocytes with peripheral mitochondria distribution (C: 37.82 ± 12.11; GI: 17.34 ± 4.98; GII: 23.69 ± 11.59; GIII: 8.40 ± 6.57) and increased the number of oocytes that exhibits mitochondria transition configuration (C: 31.49 ± 17.22; GI: 54.82 ± 8.19; GII: 39.84 ± 7.47; GIII: 49.29 ± 6.31). The treatment did not significantly change number of oocytes that exhibits mitochondria dispersed configuration (C: 30.68 ± 6.57; GI: 32.0 ± 6.02; GII: 36.47 ± 8.34; GIII: 42.31 ± 3.86). The Triciribine® concentrations used in this study did not affect nuclear maturation, but the results show for the first time the participation of PI3K/Akt pathway in mitochondrial migration and cytoplasmic maturation of in vitro-matured bovine oocytes. The effect of the inhibitor should be further investigated on in vitro production of bovine embryos.
As mudancas climaticas ao longo do ano impoem as doadoras diferentes padroes nutricionais e ambie... more As mudancas climaticas ao longo do ano impoem as doadoras diferentes padroes nutricionais e ambientais que podem influenciar a qualidade dos oocitos e consequentemente os resultados da producao in vitro de embrioes (PIVE). Assim, o objetivo do trabalho sera avaliar a influencia da sazonalidade na maturacao in vitro (MIV) de oocitos selecionados pelo metodo do Azul Cresil Brilhante (ACB), um marcador nao invasivo que permite identificar oocitos de maior potencial de desenvolvimento in vitro. Serao usados ovarios oriundos de matadouro local para a obtencao dos oocitos. Esses serao selecionados por criterios morfologicos (Grau I e II), durante o verao e inverno. Apos a selecao, os oocitos serao incubados em solucao de ACB (26µM em meio 199) por 90 minutos, a 38,5 °C e 5% de CO2. Posteriormente os oocitos serao classificados em ACB+ (citoplasma azul – de maior potencial de desenvolvimento para MIVe PIVE) e ACB- (citoplasma nao corado).Os dados serao avaliados pelo teste de qui-quadrado com 5% de significância, relacionando o numero de oocitos corados ou nao, com as duas estacoes do ano. Perspectivas Futuras O presente projeto sera iniciado no mes de junho de 2011, quando os oocitos obtidos serao distribuidos aleatoriamente entre os diferentes tratamentos e submetidos a maturacao in vitro. Os oocitos serao avaliados quanto a capacidade de alcancar a metafase II atraves da coloracao com orceina acetica a 2%, outro grupo de oocitos sera direcionado a fertilizacao in vitro para avaliacao da taxa de blastocisto expandido em diferentes epocas do ano. Resultados Esperados Espera-se que no verao haja um predominio dos oocitos ACB+ sobre os obtidos no inverno. Quanto ao numero de oocitos que atingirao a metafase II e esperado que oocitos ACB+ supere os ACB-. De forma semelhante e esperado que oocitos ACB+ resultem em maior taxa de blastocistos.
PALAVRAS-CHAVE. Cascata da insulina, fosfatidilinositol 3 quinase, maturação oocitaria. INTRODUÇÃ... more PALAVRAS-CHAVE. Cascata da insulina, fosfatidilinositol 3 quinase, maturação oocitaria. INTRODUÇÃO O objetivo da maturação oocitária, seja ela in vivo ou in vitro, é a obtenção de um oócito competente para continuar com sucesso a fertilização e
A maturação oocitária é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro (PIV) de... more A maturação oocitária é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro (PIV) de embriões. Durante a maturação in vitro (MIV), existe uma falta de sincronia entre a maturação nuclear e a maturação citoplasmática, o que se acredita influenciar diretamente na PIV de embriões. Trabalhos do nosso grupo demonstraram que a modulação da via PI3K/Akt aumentou a taxa de blastocistos bovinos. O objetivo deste foi avaliar o efeito das diferentes concentrações da Triciribina®, um inibidor seletivo da Akt, sobre a maturação citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram maturados in vitro em meio TCM 199, acrescido de 10% de SFB, 10 g/mL de FSH, 5 µg/mL de LH e 1% de penicilina/estreptomicina. A esse meio foram adicionados 0nM (controle), 1nM (GI), 5nM (GII) ou 10nM (GIII) do inibidor. A MIV foi realizada em gotas de 100µL (20 COCs/gota) e mantidas em atmosfera úmida, contendo 5% de CO2, a 38.5 ºC, por 22 h. A análise da maturação citoplasmática se baseou na distribuição de lipídeos e mitocôndrias ativas, marcadas com LipidTOX™ e MitoTracker® Red, respectivamente. Os oócitos foram observados sob microscopia de fluorescência e as gotas lipídicas e mitocôndrias classificadas em: periféricas (oócitos imaturos) e dispersas (oócitos maturados), além das mitocôndrias em transição. Os tratamentos com o inibidor reduziram o número de oócitos com lipídeos periféricos (
A baixa viabilidade do sêmen ovino após o descongelamento torna-se uma limitação para a dissemina... more A baixa viabilidade do sêmen ovino após o descongelamento torna-se uma limitação para a disseminação de técnicas como a inseminação artificial. Embora as taxas de motilidade pós-descongelamento nesta espécie sejam de aproximadamente 40-60%, apenas cerca de 20-30% dos espermatozoides permanecem sem danos nas membranas. Muitas pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de compreender as estruturas e componentes dos espermatozoides que participam da motilidade e da capacitação espermática. A motilidade seminal é um evento controlado pela ativação da enzima adenilato-ciclase para produzir aumento dos níveis de AMPc. Um recente estudo com sêmen humano mostrou que a inibição da enzima Fosfatidilinositol-3 quinase (PI3K) resulta num aumento dos níveis de AMPc intracelular. Foi proposto que a PI3K pode influenciar a motilidade do espermatozoide humano, interferindo com os níveis de AMPc. O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito da inibição da atividade da PI3K sobre a motilidade do sêmen fresco em ovinos. Foram realizadas cinco análises de ejaculados provenientes de dois ovinos instalados na Unidade de Apoio à Pesquisa Animal, do LRMGA/ UENF. Os espermatozoides foram incubados em solução de Tris gema com quatro diferentes concentrações do inibidor da PI3K (0, 50, 100 e 150 nM), em banho-maria a 37°C, durante 100 minutos. Onze avaliações consecutivas foram realizadas com intervalos de 10 minutos. O sêmen foi coletado pelo método da vagina artificial e foi avaliado utilizando o programa Ceros, versão 10.2, da Hamilton Torn Research (HTR), quanto aos parâmetros: motilidade total (0-100%) e motilidade progressiva (0-100%). Os dados obtidos a partir de cinco ejaculados (N= 20) foram submetidos à análise da variância (ANOVA) que avaliou as médias ao longo do período de incubação por meio do teste de Scott-Knott (P ≤ 0,05). No grupo controle foi possível observar uma redução dos parâmetros avaliados a partir dos 20 minutos de incubação, enquanto nas amostras tratadas com 50 nM do inibidor tal redução só começou a ocorrer após os 90 minutos de incubação (P ≤ 0,05). Já as amostras tratadas com 100 e 150 nM do inibidor da PI3K mantiveram uma maior motilidade total que as amostras do controle e do grupo 50 nM (P ≤ 0,05) até o final do período de incubação. Conclui-se que a inibição da enzima PI3K interfere positivamente com espermatozoides de ovino, prolongando sua motilidade.
The expression of alpha-1,4-glucosidase activity was fluorometrically and electrophoretically ass... more The expression of alpha-1,4-glucosidase activity was fluorometrically and electrophoretically assessed in the epididymal fluid and seminal plasma of stallions. alpha-Glucosidase specific activity in the epididymis increased significantly from the proximal caput to the cauda. Stallion epididymal glucosidase maintained activity in a wide range of pH, with two distinct peaks (around pH 4.0 and 6.0, respectively). Enzyme activities at different pH, inhibition assays with sodium dodecyl sulfate (SDS) and maltotriose (MTT, selective inhibitors of alpha-glucosidases…
Effect of seasonality on the quality of bovine oocytes selected by the brilliant cresyl blue meth... more Effect of seasonality on the quality of bovine oocytes selected by the brilliant cresyl blue method ¤ Efecto de la estacionalidad en la calidad de los ovocitos seleccionados por el método de azul cresil brillante Efeito da sazonalidade na qualidade dos ovócitos bovinos selecionados pelo método azul cresil brilhante
In vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer are assisted reproduction technologies c... more In vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer are assisted reproduction technologies commonly used in humans and cattle, respectively. Despite advances in these technologies, molecular failures can occur, increasing the chance of the onset of imprinting disorders in the offspring. Large offspring syndrome/abnormal offspring syndrome (LOS/AOS) has been described in cattle and has features such as hypergrowth, malformation of organs, and skeletal and placental defects. In humans, Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) has phenotypic characteristics similar to those found in LOS/AOS. In both syndromes, disruption of genomic imprinting associated with loss of parental-specific expression and parental-specific epigenetic marks is involved in the molecular etiology. Changes in the imprinting pattern of these genes lead to loss of imprinting (LOI) due to gain or loss of methylation, inducing the emergence of these syndromes. Several studies have reported locus-specific alterations in these syndromes, such as hypomethylation in imprinting control region 2 (KvDMR1) in BWS and LOS/AOS. These LOI events can occur at multiple imprinted loci in the same affected individual, which are called multi-locus methylation defect (MLMD) events. Although the bovine species has been proposed as a developmental model for human imprinting disorders, there is little information on bovine imprinted genes in the literature, even the correlation of epimutation data with clinical characteristics. In this study, we performed a systematic review of all the multi-locus LOI events described in human BWS and LOS/AOS, in order to determine in which imprinted genes the largest changes in the pattern of DNA methylation and expression occur, helping to fill gaps for a better understanding of the etiology of both syndromes.
Introdução: A criopreservação de oócitos é alternativa que possibilitará a preservação do futuro ... more Introdução: A criopreservação de oócitos é alternativa que possibilitará a preservação do futuro reprodutivo em mulheres que tenham que adiar a maternidade por desejo próprio ou tratamento. Poderá ser alternativa para o congelamento de embriões em casais submetidos a técnicas de reprodução assistida. Até o momento, não existem resultados consistentes com congelamento de oócitos, estando indefinido o melhor protocolo de congelamento. Objetivo: Determinar a efetividade da trealose como crioprotetor intracelular na vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro. Metodo: estudo experimental com oócitos bovinos. Grupos: controles (maturados-Tc, penetrados-Tp e microinjetados-Tm) e os grupos da vitrificação (microinjetados com trealose-Tmv, crioprotetores penetrantes-Tvde e eletropermeabilizados com trealose-Tev). Avaliou-se a capacidade de retorno ao volume isotônico, integridade de membrana (marcação com iodeto de propídio) e alterações glicoproteicas da zona pelúcida (marcação com lectinas). Resultados: A taxa de retorno ao volume isotônico após a desvitrificação mostrou resultado superior para o grupo Tev, com trealose (80%); oócitos dos tratamentos Tmv e Tvde apresentaram índices de 55 e 68%, respectivamente. Oócitos do tratamento Tev foram os de menor taxa de extrusão citoplasmática (13%). A avaliação da integridade de membrana, resultou em ausência de marcação em 36 %(Tmv), 64% (Tvde) e 29%(Tev) dos oócitos. A marcação das glicoproteínas de superfície da zona pelúcida dos oócitos vitrificados não apresentou diferença entre os tratamentos. Conclusão: Os resultados demonstram que a trealose intracelular é um importante agente crioprotetor para a vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro, mas estudos em humanos ainda deverão determinar sua aplicação em mulheres.
DOAJ (DOAJ: Directory of Open Access Journals), Apr 1, 2010
Análise da produção de embriões na fertilização in vitro e transferência de embriões para doadora... more Análise da produção de embriões na fertilização in vitro e transferência de embriões para doadoras Nelore
Estratégias têm sido desenvolvidas para contornar a elevada sensibilidade de ovócitos à crioprese... more Estratégias têm sido desenvolvidas para contornar a elevada sensibilidade de ovócitos à criopreservação. Uma delas é a introdução da trealose no citoplasma desses gametas. Como esse açúcar não é permeável à membrana plasmática, torna-se necessário desenvolver ...
Os resultados de criopreservacao de ovocitos bovinos sao ainda muito baixos, em parte devido a el... more Os resultados de criopreservacao de ovocitos bovinos sao ainda muito baixos, em parte devido a elevada toxicidade das solucoes crioprotetoras. Uma alternativa tem sido o uso de crioprotetores de baixa toxicidade, como a trealose, um acucar impermeavel a membrana plasmatica. A eletroporacao e uma tecnica que possibilita a introducao desse acucar no ooplasma. O estudo teve como objetivo avaliar diferentes parâmetros de eletroporacao de oocitos e sua acao sobre a viabilidade ovocitaria Ovocitos aspirados de ovarios obtidos em abatedouros locais foram maturados in vitro, desnudados e eletroporados em placa (450, BTX) em 20 l de solucao de eletroporacao ( 0,1 mM de sulfato de magnesio, 150 mM dem trealose e 140 mM de manitol). Foram comparados dois protocolos de eletroporacao: T1 (4 pulsos de 2 mS, 40 V) e T2 (5 pulsos de 60 mS, 130 V). Apos a eletroporacao os ovocitos foram marcados com iodeto de propidio (PI) (10 mg / mL em PBS) e analisados aos 5 min. (verificar abertura de poros) e 30 min (verificar fechamento dos poros). A viabilidade ovocitaria foi avaliada com Calceina AM (1 mg / mL), aos 30 min. apos a eletroporacao. Aos 5 min. apos eletroporacao, foi observada diferenca significativa na porcentagem de ovocitos marcados com PI (T1: 75% e T2: 100%). Porem, apos 30 min. nao houve diferenca significativa entre os tratamentos (T1: 15 % e T2: 35 %). A avaliacao da viabilidade celular com Calceina AM mostrou que oocitos de T1 apresentaram maior viabilidade do que os do T2 (84% e 43,1%, respectivamente) de acordo com o teste de proporcao e intervalo de confianca (P <0,05). Os resultados apresentados indicam maior taxa de permeabilizacao da membrana promovido pelo tratamento 1, aos 5 min. Porem T2 foi capaz de promover a abertura de poros na membrana, com menor impacto sobre a sua viabilidade ovocitaria. Conclui-se que o tratamento 2 , apesar de apresentar menor taxa de permabilizacao de membranas , causou menos danos para os oocitos com consequente maior viabilidade.
Several factors may influence transgenic animal production efficiency, and among them gene constr... more Several factors may influence transgenic animal production efficiency, and among them gene construction and the cell type used are of great importance. For a long time, fetal fibroblasts were largely used in generation of transgenic cattle production by nuclear transfer, however adult cells are very useful for cloning once the genotype of the donor nuclei is known, and derivation of such cells is technically simple, efficient, and reproducible. Thus, this study aimed to evaluate the effect of cell type on the percentage of GFP+ cells and fluorescence intensity, using two plasmids constructs encoding for green fluorescent protein (GFP). Transfections were performed in bovine fetal fibroblasts (FF), adult fibroblasts (AF), and cumulus cells (CC) transfected by use of Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for the internalization of FUGW or pEGFPN2 plasmid. Forty-eight hours after transfection, the number and the fluorescence intensity (arbitrary units) of GFP+ cells was measured by flow cytometry (FACSAria, FACSDiva Software, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Non-transfected cells were used as controls. Means were compared by the Student–Newman–Keuls test (SNK; P &lt; 0.05). The FUGW plasmid promoted a higher rate of transfection and fluorescence intensity than pEGFPN2 in all cell types evaluated. When the FUGW plasmid was used, higher transfection rates were obtained with fetal fibroblasts (FF: 17.8 ± 2.82; AF: 10.66 ± 0.65, CC: 3.9 ± 1.97), while higher fluorescence intensity was observed in adult fibroblasts (FF: 4542 ± 497.09; AF: 9367.5 ± 3490.9, CC: 3496 ± 2638.92). The pEGFPN2 plasmid showed percentage of transfected cells and fluorescence intensity significantly higher than the control only in cumulus cells (pEGFPN2 – FF: 4.9 ± 0.14 and 206.47 ± 755; AF: 760 and 2.4 ± 0.70 ± 330.92; CC: 3.9 ± 1.97, and 1418 ± 36.06, respectively; control – FF: 0.15 ± 0.07 and 249 ± 6 : 36; AF: 0.15 ± 0.07 588 ± 213.54, and CC 0.05 ± 0 214 ± 0.07, respectively). We conclude that the plasmid construction may influence the overall efficiency in transfected cells; however, the transfection percentage and fluorescence intensity is greatly influenced by the cell type. We suggest that transgenesis of a specific cell type may be enhanced by the proper choice of the expression vector.
The oocyte maturation involves a series of events that lead to female gamete capacitation for fer... more The oocyte maturation involves a series of events that lead to female gamete capacitation for fertilization and embryo development. Around 80% of in vitro matured oocytes reach nuclear maturation, but only 60% complete cytoplasmic maturation. This lack of synchronization between nuclear and cytoplasmic maturation can affect early embryonic development and in vitro embryo production. Works developed by our group have shown that modulation of PI3K/Akt pathway increase bovine in vitro production. The aim of this study was to evaluate the effect of different concentrations of Triciribine® (Merck, Darmstadt, Germany), a selective Akt inhibitor, on in vitro maturation of bovine oocytes. COCs (grade I and II) were matured in vitro in TCM 199 supplemented with 10% FCS, FSH 10 g/mL, LH 5μg/mL and 1% penicillin/streptomycin. This maturation medium was supplemented with 0nM (control-C), 1 nM (Group I-GI), 5 nM (GII) or 10 nM (GIII) of the inhibitor. IVM was performed in 100 µL drop (20 COCs/drop), submerged in mineral oil and maintained in a humidified atmosphere containing 5% CO2 in air, at 38.5°C, for 22 hours. Nuclear maturation evaluation was made after acetic orcein staining. The oocytes were considered matured when showed metaphase plate observed under optic microscope. The cytoplasmic maturation analysis was performed by active mitochondria distribution stained with MitoTracker® Red CMXRos (Molecular Probes®, Invitrogen, Eugene, OR, USA), observed by fluorescence microscopy and classified into three categories: peripheral (mitochondria located at periphery - immature oocytes), transition (incomplete mitochondrial distribution) or scattered (mitochondria homogeneously distributed in the cytoplasm - matured oocytes). Different concentrations of Akt inhibitor used in this study did not significantly alter nuclear maturation of bovine oocytes matured in vitro (SNK test, P > 0.05) (C: 75.72 ± 4.55; GI: 84.50 ± 13.43; GII: 75.69 ± 2.84; GIII: 69.92 ± 2.12). On the other hand, the use of inhibitor significantly reduced the number of oocytes with peripheral mitochondria distribution (C: 37.82 ± 12.11; GI: 17.34 ± 4.98; GII: 23.69 ± 11.59; GIII: 8.40 ± 6.57) and increased the number of oocytes that exhibits mitochondria transition configuration (C: 31.49 ± 17.22; GI: 54.82 ± 8.19; GII: 39.84 ± 7.47; GIII: 49.29 ± 6.31). The treatment did not significantly change number of oocytes that exhibits mitochondria dispersed configuration (C: 30.68 ± 6.57; GI: 32.0 ± 6.02; GII: 36.47 ± 8.34; GIII: 42.31 ± 3.86). The Triciribine® concentrations used in this study did not affect nuclear maturation, but the results show for the first time the participation of PI3K/Akt pathway in mitochondrial migration and cytoplasmic maturation of in vitro-matured bovine oocytes. The effect of the inhibitor should be further investigated on in vitro production of bovine embryos.
As mudancas climaticas ao longo do ano impoem as doadoras diferentes padroes nutricionais e ambie... more As mudancas climaticas ao longo do ano impoem as doadoras diferentes padroes nutricionais e ambientais que podem influenciar a qualidade dos oocitos e consequentemente os resultados da producao in vitro de embrioes (PIVE). Assim, o objetivo do trabalho sera avaliar a influencia da sazonalidade na maturacao in vitro (MIV) de oocitos selecionados pelo metodo do Azul Cresil Brilhante (ACB), um marcador nao invasivo que permite identificar oocitos de maior potencial de desenvolvimento in vitro. Serao usados ovarios oriundos de matadouro local para a obtencao dos oocitos. Esses serao selecionados por criterios morfologicos (Grau I e II), durante o verao e inverno. Apos a selecao, os oocitos serao incubados em solucao de ACB (26µM em meio 199) por 90 minutos, a 38,5 °C e 5% de CO2. Posteriormente os oocitos serao classificados em ACB+ (citoplasma azul – de maior potencial de desenvolvimento para MIVe PIVE) e ACB- (citoplasma nao corado).Os dados serao avaliados pelo teste de qui-quadrado com 5% de significância, relacionando o numero de oocitos corados ou nao, com as duas estacoes do ano. Perspectivas Futuras O presente projeto sera iniciado no mes de junho de 2011, quando os oocitos obtidos serao distribuidos aleatoriamente entre os diferentes tratamentos e submetidos a maturacao in vitro. Os oocitos serao avaliados quanto a capacidade de alcancar a metafase II atraves da coloracao com orceina acetica a 2%, outro grupo de oocitos sera direcionado a fertilizacao in vitro para avaliacao da taxa de blastocisto expandido em diferentes epocas do ano. Resultados Esperados Espera-se que no verao haja um predominio dos oocitos ACB+ sobre os obtidos no inverno. Quanto ao numero de oocitos que atingirao a metafase II e esperado que oocitos ACB+ supere os ACB-. De forma semelhante e esperado que oocitos ACB+ resultem em maior taxa de blastocistos.
PALAVRAS-CHAVE. Cascata da insulina, fosfatidilinositol 3 quinase, maturação oocitaria. INTRODUÇÃ... more PALAVRAS-CHAVE. Cascata da insulina, fosfatidilinositol 3 quinase, maturação oocitaria. INTRODUÇÃO O objetivo da maturação oocitária, seja ela in vivo ou in vitro, é a obtenção de um oócito competente para continuar com sucesso a fertilização e
A maturação oocitária é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro (PIV) de... more A maturação oocitária é uma das etapas determinantes para o sucesso da produção in vitro (PIV) de embriões. Durante a maturação in vitro (MIV), existe uma falta de sincronia entre a maturação nuclear e a maturação citoplasmática, o que se acredita influenciar diretamente na PIV de embriões. Trabalhos do nosso grupo demonstraram que a modulação da via PI3K/Akt aumentou a taxa de blastocistos bovinos. O objetivo deste foi avaliar o efeito das diferentes concentrações da Triciribina®, um inibidor seletivo da Akt, sobre a maturação citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram maturados in vitro em meio TCM 199, acrescido de 10% de SFB, 10 g/mL de FSH, 5 µg/mL de LH e 1% de penicilina/estreptomicina. A esse meio foram adicionados 0nM (controle), 1nM (GI), 5nM (GII) ou 10nM (GIII) do inibidor. A MIV foi realizada em gotas de 100µL (20 COCs/gota) e mantidas em atmosfera úmida, contendo 5% de CO2, a 38.5 ºC, por 22 h. A análise da maturação citoplasmática se baseou na distribuição de lipídeos e mitocôndrias ativas, marcadas com LipidTOX™ e MitoTracker® Red, respectivamente. Os oócitos foram observados sob microscopia de fluorescência e as gotas lipídicas e mitocôndrias classificadas em: periféricas (oócitos imaturos) e dispersas (oócitos maturados), além das mitocôndrias em transição. Os tratamentos com o inibidor reduziram o número de oócitos com lipídeos periféricos (
A baixa viabilidade do sêmen ovino após o descongelamento torna-se uma limitação para a dissemina... more A baixa viabilidade do sêmen ovino após o descongelamento torna-se uma limitação para a disseminação de técnicas como a inseminação artificial. Embora as taxas de motilidade pós-descongelamento nesta espécie sejam de aproximadamente 40-60%, apenas cerca de 20-30% dos espermatozoides permanecem sem danos nas membranas. Muitas pesquisas vêm sendo realizadas com o objetivo de compreender as estruturas e componentes dos espermatozoides que participam da motilidade e da capacitação espermática. A motilidade seminal é um evento controlado pela ativação da enzima adenilato-ciclase para produzir aumento dos níveis de AMPc. Um recente estudo com sêmen humano mostrou que a inibição da enzima Fosfatidilinositol-3 quinase (PI3K) resulta num aumento dos níveis de AMPc intracelular. Foi proposto que a PI3K pode influenciar a motilidade do espermatozoide humano, interferindo com os níveis de AMPc. O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito da inibição da atividade da PI3K sobre a motilidade do sêmen fresco em ovinos. Foram realizadas cinco análises de ejaculados provenientes de dois ovinos instalados na Unidade de Apoio à Pesquisa Animal, do LRMGA/ UENF. Os espermatozoides foram incubados em solução de Tris gema com quatro diferentes concentrações do inibidor da PI3K (0, 50, 100 e 150 nM), em banho-maria a 37°C, durante 100 minutos. Onze avaliações consecutivas foram realizadas com intervalos de 10 minutos. O sêmen foi coletado pelo método da vagina artificial e foi avaliado utilizando o programa Ceros, versão 10.2, da Hamilton Torn Research (HTR), quanto aos parâmetros: motilidade total (0-100%) e motilidade progressiva (0-100%). Os dados obtidos a partir de cinco ejaculados (N= 20) foram submetidos à análise da variância (ANOVA) que avaliou as médias ao longo do período de incubação por meio do teste de Scott-Knott (P ≤ 0,05). No grupo controle foi possível observar uma redução dos parâmetros avaliados a partir dos 20 minutos de incubação, enquanto nas amostras tratadas com 50 nM do inibidor tal redução só começou a ocorrer após os 90 minutos de incubação (P ≤ 0,05). Já as amostras tratadas com 100 e 150 nM do inibidor da PI3K mantiveram uma maior motilidade total que as amostras do controle e do grupo 50 nM (P ≤ 0,05) até o final do período de incubação. Conclui-se que a inibição da enzima PI3K interfere positivamente com espermatozoides de ovino, prolongando sua motilidade.
The expression of alpha-1,4-glucosidase activity was fluorometrically and electrophoretically ass... more The expression of alpha-1,4-glucosidase activity was fluorometrically and electrophoretically assessed in the epididymal fluid and seminal plasma of stallions. alpha-Glucosidase specific activity in the epididymis increased significantly from the proximal caput to the cauda. Stallion epididymal glucosidase maintained activity in a wide range of pH, with two distinct peaks (around pH 4.0 and 6.0, respectively). Enzyme activities at different pH, inhibition assays with sodium dodecyl sulfate (SDS) and maltotriose (MTT, selective inhibitors of alpha-glucosidases…
Effect of seasonality on the quality of bovine oocytes selected by the brilliant cresyl blue meth... more Effect of seasonality on the quality of bovine oocytes selected by the brilliant cresyl blue method ¤ Efecto de la estacionalidad en la calidad de los ovocitos seleccionados por el método de azul cresil brillante Efeito da sazonalidade na qualidade dos ovócitos bovinos selecionados pelo método azul cresil brilhante
In vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer are assisted reproduction technologies c... more In vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer are assisted reproduction technologies commonly used in humans and cattle, respectively. Despite advances in these technologies, molecular failures can occur, increasing the chance of the onset of imprinting disorders in the offspring. Large offspring syndrome/abnormal offspring syndrome (LOS/AOS) has been described in cattle and has features such as hypergrowth, malformation of organs, and skeletal and placental defects. In humans, Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS) has phenotypic characteristics similar to those found in LOS/AOS. In both syndromes, disruption of genomic imprinting associated with loss of parental-specific expression and parental-specific epigenetic marks is involved in the molecular etiology. Changes in the imprinting pattern of these genes lead to loss of imprinting (LOI) due to gain or loss of methylation, inducing the emergence of these syndromes. Several studies have reported locus-specific alterations in these syndromes, such as hypomethylation in imprinting control region 2 (KvDMR1) in BWS and LOS/AOS. These LOI events can occur at multiple imprinted loci in the same affected individual, which are called multi-locus methylation defect (MLMD) events. Although the bovine species has been proposed as a developmental model for human imprinting disorders, there is little information on bovine imprinted genes in the literature, even the correlation of epimutation data with clinical characteristics. In this study, we performed a systematic review of all the multi-locus LOI events described in human BWS and LOS/AOS, in order to determine in which imprinted genes the largest changes in the pattern of DNA methylation and expression occur, helping to fill gaps for a better understanding of the etiology of both syndromes.
Introdução: A criopreservação de oócitos é alternativa que possibilitará a preservação do futuro ... more Introdução: A criopreservação de oócitos é alternativa que possibilitará a preservação do futuro reprodutivo em mulheres que tenham que adiar a maternidade por desejo próprio ou tratamento. Poderá ser alternativa para o congelamento de embriões em casais submetidos a técnicas de reprodução assistida. Até o momento, não existem resultados consistentes com congelamento de oócitos, estando indefinido o melhor protocolo de congelamento. Objetivo: Determinar a efetividade da trealose como crioprotetor intracelular na vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro. Metodo: estudo experimental com oócitos bovinos. Grupos: controles (maturados-Tc, penetrados-Tp e microinjetados-Tm) e os grupos da vitrificação (microinjetados com trealose-Tmv, crioprotetores penetrantes-Tvde e eletropermeabilizados com trealose-Tev). Avaliou-se a capacidade de retorno ao volume isotônico, integridade de membrana (marcação com iodeto de propídio) e alterações glicoproteicas da zona pelúcida (marcação com lectinas). Resultados: A taxa de retorno ao volume isotônico após a desvitrificação mostrou resultado superior para o grupo Tev, com trealose (80%); oócitos dos tratamentos Tmv e Tvde apresentaram índices de 55 e 68%, respectivamente. Oócitos do tratamento Tev foram os de menor taxa de extrusão citoplasmática (13%). A avaliação da integridade de membrana, resultou em ausência de marcação em 36 %(Tmv), 64% (Tvde) e 29%(Tev) dos oócitos. A marcação das glicoproteínas de superfície da zona pelúcida dos oócitos vitrificados não apresentou diferença entre os tratamentos. Conclusão: Os resultados demonstram que a trealose intracelular é um importante agente crioprotetor para a vitrificação de oócitos bovinos maturados in vitro, mas estudos em humanos ainda deverão determinar sua aplicação em mulheres.
DOAJ (DOAJ: Directory of Open Access Journals), Apr 1, 2010
Análise da produção de embriões na fertilização in vitro e transferência de embriões para doadora... more Análise da produção de embriões na fertilização in vitro e transferência de embriões para doadoras Nelore
Estratégias têm sido desenvolvidas para contornar a elevada sensibilidade de ovócitos à crioprese... more Estratégias têm sido desenvolvidas para contornar a elevada sensibilidade de ovócitos à criopreservação. Uma delas é a introdução da trealose no citoplasma desses gametas. Como esse açúcar não é permeável à membrana plasmática, torna-se necessário desenvolver ...
Os resultados de criopreservacao de ovocitos bovinos sao ainda muito baixos, em parte devido a el... more Os resultados de criopreservacao de ovocitos bovinos sao ainda muito baixos, em parte devido a elevada toxicidade das solucoes crioprotetoras. Uma alternativa tem sido o uso de crioprotetores de baixa toxicidade, como a trealose, um acucar impermeavel a membrana plasmatica. A eletroporacao e uma tecnica que possibilita a introducao desse acucar no ooplasma. O estudo teve como objetivo avaliar diferentes parâmetros de eletroporacao de oocitos e sua acao sobre a viabilidade ovocitaria Ovocitos aspirados de ovarios obtidos em abatedouros locais foram maturados in vitro, desnudados e eletroporados em placa (450, BTX) em 20 l de solucao de eletroporacao ( 0,1 mM de sulfato de magnesio, 150 mM dem trealose e 140 mM de manitol). Foram comparados dois protocolos de eletroporacao: T1 (4 pulsos de 2 mS, 40 V) e T2 (5 pulsos de 60 mS, 130 V). Apos a eletroporacao os ovocitos foram marcados com iodeto de propidio (PI) (10 mg / mL em PBS) e analisados aos 5 min. (verificar abertura de poros) e 30 min (verificar fechamento dos poros). A viabilidade ovocitaria foi avaliada com Calceina AM (1 mg / mL), aos 30 min. apos a eletroporacao. Aos 5 min. apos eletroporacao, foi observada diferenca significativa na porcentagem de ovocitos marcados com PI (T1: 75% e T2: 100%). Porem, apos 30 min. nao houve diferenca significativa entre os tratamentos (T1: 15 % e T2: 35 %). A avaliacao da viabilidade celular com Calceina AM mostrou que oocitos de T1 apresentaram maior viabilidade do que os do T2 (84% e 43,1%, respectivamente) de acordo com o teste de proporcao e intervalo de confianca (P <0,05). Os resultados apresentados indicam maior taxa de permeabilizacao da membrana promovido pelo tratamento 1, aos 5 min. Porem T2 foi capaz de promover a abertura de poros na membrana, com menor impacto sobre a sua viabilidade ovocitaria. Conclui-se que o tratamento 2 , apesar de apresentar menor taxa de permabilizacao de membranas , causou menos danos para os oocitos com consequente maior viabilidade.
Several factors may influence transgenic animal production efficiency, and among them gene constr... more Several factors may influence transgenic animal production efficiency, and among them gene construction and the cell type used are of great importance. For a long time, fetal fibroblasts were largely used in generation of transgenic cattle production by nuclear transfer, however adult cells are very useful for cloning once the genotype of the donor nuclei is known, and derivation of such cells is technically simple, efficient, and reproducible. Thus, this study aimed to evaluate the effect of cell type on the percentage of GFP+ cells and fluorescence intensity, using two plasmids constructs encoding for green fluorescent protein (GFP). Transfections were performed in bovine fetal fibroblasts (FF), adult fibroblasts (AF), and cumulus cells (CC) transfected by use of Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for the internalization of FUGW or pEGFPN2 plasmid. Forty-eight hours after transfection, the number and the fluorescence intensity (arbitrary units) of GFP+ cells was measured by flow cytometry (FACSAria, FACSDiva Software, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Non-transfected cells were used as controls. Means were compared by the Student–Newman–Keuls test (SNK; P &lt; 0.05). The FUGW plasmid promoted a higher rate of transfection and fluorescence intensity than pEGFPN2 in all cell types evaluated. When the FUGW plasmid was used, higher transfection rates were obtained with fetal fibroblasts (FF: 17.8 ± 2.82; AF: 10.66 ± 0.65, CC: 3.9 ± 1.97), while higher fluorescence intensity was observed in adult fibroblasts (FF: 4542 ± 497.09; AF: 9367.5 ± 3490.9, CC: 3496 ± 2638.92). The pEGFPN2 plasmid showed percentage of transfected cells and fluorescence intensity significantly higher than the control only in cumulus cells (pEGFPN2 – FF: 4.9 ± 0.14 and 206.47 ± 755; AF: 760 and 2.4 ± 0.70 ± 330.92; CC: 3.9 ± 1.97, and 1418 ± 36.06, respectively; control – FF: 0.15 ± 0.07 and 249 ± 6 : 36; AF: 0.15 ± 0.07 588 ± 213.54, and CC 0.05 ± 0 214 ± 0.07, respectively). We conclude that the plasmid construction may influence the overall efficiency in transfected cells; however, the transfection percentage and fluorescence intensity is greatly influenced by the cell type. We suggest that transgenesis of a specific cell type may be enhanced by the proper choice of the expression vector.
Uploads
Papers by Angelo Burla