Nama : Achmad Azhar

Nim : G061211016
Kelas/Prodi : IPT Terapan A/Proteksi Tanaman A

Tugas Terjemahan
INOKULASI JAMUR ENDOFIT YANG BERMANFAAT KE DALAM
THEOBROMA JARINGAN KAKAO
Mejía, L. C.1, Rojas, E. I. 1, Maynard, Z. 1, Arnold, A. E. 1, 2
, Kyllo, D. 1, Robbins, N. 1,
Herre, E. A 1.
1
Institut Penelitian Tropis Smithsonian. Apartado 2072. Balboa, Republik Panama.
2
Departemen Ekologi/Biologi Evolusioner, Universitas Arizona, Tucson, AZ 85721
USA; Alamat saat ini: Departemen Biologi, Duke University, Durham, NC 27708 USA.

RINGKASAN
Jamur endofit tampaknya ada di mana-mana di jaringan tanaman yang sehat dan banyak
bukti menunjukkan bahwa endofit dari setidaknya beberapa tanaman membantu inang
mentolerir faktor abiotik dan biotik yang merugikan termasuk patogen. Ini menunjukkan
penggunaan endofit agenbiokontrol. Namun demikian, beberapa penelitian telah berfokus
pada (1) menentukan hubungan ekologis endofit yang terkait dengan tanaman kayu yang
memiliki signifikansi pertanian atau (2) menggunakan informasi ini untuk memandu
budidaya dan inokulasi jamur endofit yang bermanfaat ke dalam jaringan tanaman. Di
sini, kami menjelaskan studi mengenai endofit yang terkait dengan kakao Theobroma,
dengan tujuan ganda untuk memahami kelimpahan dan keragaman endofit yang terkait
dengan inang ini, dan menilai endofit tersebut untukpenggunaan dalam biokontrol.
Pertama, kami membuat koleksi sistematis jamur endofit T. cacao dari berbagai
agroekosistem di Republik Panama. Kami kemudian melakukan uji coba in vitro untuk
menilai aktivitas antagonis 50 morfotipe endofit memperolehtiga patogen utama kakao
(Phytophthora sp., Moniliophthora roreri dan Crinipellis perniciosa). Empat puluh
persen morfotipe yang diuji menunjukkan aktivitas antagonis terhadap setidaknya satu
dari patogen ini. Subset dari morfotipe aktif ini digunakan untuk mengevaluasi metode
untuk memasukkan endofit ke dalam jaringan kakao. Dalam kondisi rumah kaca, kami
menyemprotkan suspensi spora untuk berhasil memasukkan jamur endofit ke dalam daun
T. cacao. Selanjutnya, kami menilai aktivitas in vivo jamur endofit by mengekspos daun
T. cacao yang diolah (+endofit) dan tidak diobati (- endofit) ke Phytophthora sp. Daun
dengan campuran endofit menunjukkan kerusakan hampir 50% lebih sedikit karena
patogen jika dibandingkan dengan daun tanpa endofit. Akhirnya kami melakukan uji
coba lapangan di Bocas del Toro, Panama untuk mengevaluasi endofit untuk
pengendalian moniliasis dan penyakit polong hitam. Efek dari tiga spesies endofit yang
berbeda dinilai di masing-masing dari empat peternakan. Sebulan sekali selama 7 bulan,
kami menggunakan spr ayers kompresi genggamuntuk menerapkan suspensi spora
endofit pada polong kakao yang sedang berkembang dan matang. Data gabungan untuk
semua peternakan menunjukkan penurunan yang signifikan dalam proporsi polong kakao
yang hilang dari Phytophthora sp. dalam dua perlakuan endofit dibandingkan dengan
kontrol selama empat bulan terakhir penelitian. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan
bahwa endofit dapat digunakan sebagai agen biokontrol untuk menguntungkan tanaman
kakao, dan bahwa mereka layak untuk dieksplorasi lebih lanjut.
 PENDAHULUAN
Setiap tahun potensi produksi global kakao berkurang setengahnya karena efek hama dan
penyakit (Gro-Cocoa 2002). Baru-baru ini penggunaan jamur alami untuk pengendalian
hayati penyakit kakao telah diakui (lihat Krauss dan Hebbar 1999). Secara khusus strategi
baru biokontrol using jamur endofit telah menunjukkan janji besar (Gro-Cocoa 2002).
Endofit jamur adalah jamur yang menjajah dan tumbuh tanpa gejala di dalam jaringan
tanaman internal tanpa menyebabkan kerusakan pada inangnya. Jamur ini telah diamati
pada setiap spesies tanamanyang diperiksa, tetapi sebagian besar penelitian berfokus pada
asosiasi rumput beriklim sedang dan endofit dari famili Clavicipitaceae. Dalam simbiosis
ini, endofit membantu inang mentolerir faktor abiotik dan biotik yang merugikan. Untuk
alasan ini, asosiasi umumnya dianggap mutualistik, tetapi keumuman manfaat tersebut
tidak jelas untuk tanaman inang lainnya. Studi tentang jamur endofit pada tanaman kayu
menunjukkan bahwa mereka sangat melimpah dan beragam, terutama di daerah tropis
(Arnold, Maynard, Gilbert, Coley dan Kursar 2000). Kami melakukan studi multitahun
untuk menilai kelimpahan, keanekaragaman, dan potensi penggunaan endofit untuk
pengendalian biologis patogen kakao.
Penggunaan endofit dalam biokontrol membutuhkan pengenalan endofit ke dalam
jaringan tanaman dalamtahap kuantitas y, situs dan sejarah kehidupan yang secara efektif
memusuhi patogen. Sepengetahuan kami, deskripsi lengkap tentang metode inokulasi
untuk endofit yang terkait dengan pohon langka. Dalam kasus rumput, inokulasi telah
dicapai dengan menempatkan mycelia dalam jaringan coleoptile (Latch dan Christensen
1985), inokulasi jarum suntik (Leuchtmann dan Clay 1988), dan merendam benih dalam
suspensi spora. Demikian pula, semprotan suspensi spora telah digunakan untuk
memasukkan endofit ke dalam kacang dan jelai (Boyle, Gotz, Dammann-Tugend dan
Schultz 2001). Holmes, Evans dan Pomella (2002) berhasil memperkenalkan endofit
dengan merendam kayu kakao budwood dalam suspensi spora dan menginokulasi benih
menggunakan sistem model yang dikembangkan oleh CABI Bioscience dan Almirante
Cacau. Dalam pekerjaan kami, kami telah berusaha untuk mengoptimalkan dan
memperluas metode tersebut untuk menyediakan protokol untuk menginokulasi bibit dan
pohon dewasa.
Di sini, kami menjelaskan serangkaian penelitian mengenai endofit yang terkait
dengan kakao, dengan fokus pada (1) keanekaragaman, kelimpahan, dan komposisi
spesies endofit kakao; (2) aktivitas endofit secara in vitro terhadap patogen kakao; (3)
metode untuk memasukkan endofit ke dalam tanaman hidup; dan (4) evaluasi manfaat
endofit terhadap kakao dalam hal pengendalian hayati.

BAHAN DAN METODE

Strain endofit yang digunakan di sini merupakan bagian dari pengumpulan sistematis oleh
STRI Sustainable Cacao Group, yang menilai infeksi endofit kakao di empat
agroekosistem di Panama. Endofit diisolasi dari daun yang disterilkan permukaan setelah
Arnold et al (2000), kecuali bahwa 16 segmen (masing-masing 2mm2) diambil
sampelnya dari lamina tengah setiap daun. Endofit dalam kultur murni diklasifikasikan
ke morfotipe (Arnold et al 2000) dan oleh data urutan DNA NR. Sekuens diidentifikasi
ke genus menggunakan pencarian BLAST, dengan kesimpulan berdasarkan skor
pencocokan dan pada komposisi yang konsisten pada tingkat genus dari lima sekuens
pencocokan teratas.

Tes in vitro aktivitas antipatogen

Lima puluh morfotipe (termasuk isolat dari polong dan daun) diuji secara in vitro untuk
aktivitas terhadap tiga patogen penting kakao (Phytophthora sp., Moniliophthora roreri,
Crinipellis perniciosa). Sumbat hifa patogen dan endofit ditempatkan terpisah 2 cm
dalam cawan Petri yang mengandung agar ekstrak malt (2% MEA). Setelah 60 jam,
interaksi antara endofit dan patogen dievaluasi. Endofit yang menunjukkan aktivitas
terhadap patogen kakao dipilih untuk percobaan inokulasi (lihat di bawah).

Inokulasi spesies tunggal dalam kondisi rumah kaca

Kami menghasilkan bibit kakao bebas endofit setelah Arnold dan Herre (2003) dan
menginokulasinya dengan propagul tersuspensi dari masing-masing dari tiga spesies
endofit (Tabel 1). Inokula dihasilkan oleh fermentasi liquid dalam media ragi molase
(MYM) diikuti dengan resuspensi dalam gelatin air (0,5%). Inokulasi dilakukan di bawah
kanopi plastik di rumah teduh yang disaring, di mana kelembaban relatif tinggi
dipertahankan selama 48 jam setelah inokulasi. Dua puluh bibit kakao diinokulasi dengan
mengaburkan daun sehat dengan suspensi propagul 1,5 mL menggunakan penyemprot
taman; 20 bibit tambahan berfungsi sebagai kontrol. Sampel daun dikumpulkan dari
waktu ke waktu untuk menentukan keberadaan spesies yang diinokulasi.

Inokulasi multi-sp ecies dan uji antipatogen

Dalam percobaan berikutnya, kami menghasilkan bibit bebas endofit (N = 70) dan secara
serampangan memilih daun individu pada masing-masing untuk menerima inokulum
endofit multi-spesies (E +) atau untuk tetap tidak diinokulasi (E-). Inokulum terdiri dari
propagul dari enam spesies endofit (Tabel 2). Delapan belas hari setelah inokulasi endofit,
kami menginokulasi subset daun E+ dan E- dengan Phytophthora sp. diisolasi dari kakao
bergejala di Panama. Meskipun tidak diidentifikasi untuk spesies, strain ini menunjukkan
afinitas DNA nr yang tinggi terhadap P. palmivora kakao. Untuk memperkenalkan
patogen, kami menempatkan sumbat agar-agar yang sebelumnya direndam dalam
suspensi zoospore (9,5 X 10 5 zoospora/ml) pada daun yang ditusuk dengan jarum steril.
Dua belas jam kemudian, 10μl suspensi zoospore ditempatkan di lokasi infeksi. Setelah
15 d, kami menilai kematian daun dan mengukur luas lesi pada daun yang masih hidup
menggunakan meteran area daun (Arnold et al dalam ulasan).

Inokulasi dalam kondisi lapangan

Untuk bidang experiments kami memproduksi inokula dengan fermentasi cair dan solid-
state pada beras atau Biodac® (kompleks selulosa) mengikuti Hebbar dan Lumsden
(1999), tetapi dengan MYM setengah kekuatan. Suspensi spora diterapkan pada jaringan
tanaman menggunakan penyemprot kompresi kecil. Dalam uji pendahuluan, suspensi
spora Colletotrichum sp. Morfotipe 1 (umumnya diisolasi dari jaringan kakao yang sehat)
diterapkan dua kali untuk mengembangkan polong di Bocas del Toro (N=9 polong pada
delapan pohon), sementara enam polong dipertahankan sebagai kontrol non-inokulat.
Semua polong diambil sampelnya untuk infeksi oleh Colletotrichum sp. setelah enam
minggu dengan melapisi 64 kubus yang disterilkan permukaan (masing-masing 0,8 cm 2)
dari lapisan terluar setiap buah pada 2% MEA.

Evaluasi pengendalian hayati dalam kondisi lapangan

Tigaspesies ic endofit yang menunjukkan aktivitas antipatogen secara in vitro (Tabel 1)
diuji kapasitas biokontrolnya dalam uji coba lapangan di Bocas del Toro, Panama. Di
masing-masing dari empat peternakan, 20 pohon per perlakuan dan 20 pohon kontrol
digunakan dalam desain blok acak, dengan spesies endofit e ach mewakili perlakuan yang
berbeda. Selama periode pengujian tujuh bulan, suspensi spora diterapkan pada bunga
dan polong pada interval bulanan, dipasangkan dengan pembersihan phytosanitary.
Sensus bulanan yang dinilai polong untuk gejala monilias adalah, sporulasi
Moniliophthora sp. , atau gejala polong hitam.

HASIL
Survei endofit
Endofit hadir pada 95,6% dan 100% daun T. kakao dewasa dan tua, di mana mereka
menempati hingga 100% segmen daun yang disurvei. Hingga 13 taksa endofit yang
berbeda ditemukan pada daun individu. Kekayaan endofit yang diperoleh dari masing-
masing pohon (kisaran: 38-48 morfotaksia/pohon; N=9 daun/pohon) tidak berbeda secara
spesifik diantara situs. Endofit juga sering ditemukan dari buah tanpa gejala.

Aktivitas in vitro
Isolat dari 20 morfotipe (40%) berinteraksi negatif dengan setidaknya satu dari tiga
patogen secara in vitro, menunjukkan antagonisme biokimia (10%), persaingan (28%)
atau antagonisme langsung (2%).

Eksperimen rumah kaca

Daun yang diinokulasi oleh inokula spesies tunggal dan ganda berbeda dari kontrol dalam
hal kelimpahan endofit dan komposisi spesies. Tidak ada gejala penyakit atau kelainan
yang diamati pada tanaman yang diobati dengan endofit (rentang pengamatan: 3-10
bulan). Namun, tiga puluh tiga hari setelah inokulasi spesies tunggal, 62,5%, 38,54% dan
91% jaringan sampel menunjukkan kolonisasi jamur oleh Botryosphaeria sp. , Nectria
sp. dan Colletotrichum sp. M1, masing-masing, dibandingkan dengan 12,5% infeksi
keseluruhan dalam kontrol. Di antara daun yang diolah, 78,33%, 62,16% dan 87,5% isolat
sesuai dengan inokula masing-masing (Tabel 1).
Keberhasilan kolonisasi daun kakao juga diamati ketika enam spesies endofit
digunakan bersama sebagai sumber inokulum. Setelah 29 d, daun yang diolah
mengandungendophy tes pada 74,6% ruas daun, vs. 4,17% pada daun kontrol. Prevalensi
setiap morfospesies berkorelasi dengan frekuensi isolasi dari infeksi alami di lapangan:
di antara daun yang dirawat, endofit inokulum ditemukan dari 1,2% (Nectria sp. PI20)
menjadi 84,69% (Colletotrichum sp. M1) ruas daun (Tabel 2).
Setelah inokulasi oleh Phytophthora sp., nekrosis diamati pada 97% daun yang
dirawat dalam waktu tiga hari. Namun, kematian daun secara signifikan lebih tinggi pada
daun yang diolah patogen dengan endofit ut daripada daun dengan patogen dan endofit
(P=0,0389). Area daun yang hilang karena nekrosis hampir dua kali lipat lebih tinggi
pada daun tanpa endofit (E-P+) daripada pada daun dengan endofit (E+P+; P=0,0030;
Gambar 1; Arnold dkk dalam ulasan).

Tes Lapangan
Setelah mengaplikasikan Endofit Colletotrichum sp. , 51% segmen jaringan polong
menunjukkan infeksi oleh endofit. Dari sini, 41% dan 9% isolat sesuai dengan uji strain
pada polong yang diinokulasi dan dikontrol, secara terpisah. Dalam uji coba lapangan,
perlakuan endofit tidak berpengaruh nyata pada gejala moniliasis atau sporulasi
Moniliophthora sp. Namun, kami mengamati penurunan yang signifikan dalam kejadian
gejala penyakit polong hitam selama empat bulan terakhir penelitian untuk pohon yang
diobati dengan Colletotrichum sp. M1 (P=0,0109) dan Botryosphaeria sp. (P=0,0226).
Pengobatan dengan Nectria sp. juga menunjukkan beberapa pembatasan gejala penyakit
polong hitam, meskipun efeknya tidak signifikan. Dalam kasus apa pun aplikasi endofit
yang terkait denganproporsi g reater polong yang menunjukkan gejala penyakit.
 DISKUSI
Endofit berlimpah dan beragam dalam daun dan buah T. kakao dalam kondisi lahan yang
beragam. Potensi endofit untuk memberikan pengendalian penyakit kakao didukung oleh
pengamatan bahwa banyak endofit yang memusuhi C. perniciosa, M. roreri, dan
Phytophthora sp. secara in vitro. Melalui percobaan rumah kaca, kami menunjukkan
bahwa endofit dapat berhasil dimasukkan ke dalam jaringan sehat baik dalam inokulasi
tunggal maupun multi-spesiess. Jaringan yang dijajah endofit tetap tanpa gejala dan lebih
tahan terhadap kerusakan dan kehilangan daun karena Phytophothora daripada daun
bebas endofit. Percobaan lapangan menunjukkan kolonisasi endofit yang jauh lebih besar
pada polong yang diinokulasi vs. kontrol. Pengamatan bahwa setidaknya satu spesies
endofit menekan insiden gejala Phytophthora dalam kondisi lapangan memberikan
dorongan kuat untuk studi lebih lanjut dari beragam simbion ini, dan menunjukkan bahwa
endofit dapat digunakan sebagai nts usia biokontrolterhadap penyakit yang mengurangi
produksi kakao.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami berterima kasih kepada Drs. P.K. Hebbar, U. Krauss, R. Lumsden dan G. Gilbert
atas pelatihan dan saran teknis, dan Smithsonian Tropical Research Institute untuk
dukungan logistik.
Pekerjaan ini didukung oleh American Cocoa Research Institute dan M&M Mars (STRI
Sustainable Cacao Research Group: EAH, AEA, LCM, ZM, ER, NR), Andrew Mellon
Foundation (EAH) dan STRI (EAH dan AEA).

LITERATUR YANG DIKUTIP

ARNOLD A. E., MAYNARD Z., GILBERT G. S., COLEY P. D., KURSAR T. A.
(2000). Apakah jamur tropis endofit sangat beragam? Lett. 3: 267-274.

ARNOLD A. E. & HERRE E. A. (2003). Tutupan kanopi dan usia daun mempengaruhi
kolonisasi dari jamur endofit tropises: pola dan proses ekologis di Theobroma cacao
(Malvaceae). Mikologia. 95: 388-398.

ARNOLD A. E., MEJÍA L. C., KYLLO D. A., ROJAS E., MAYNARD Z., ROBBINS
N. A. & HERRE E. A. Dalam ulasan. Endofit jamur membatasi kerusakan patogen di
pohon fores t tropis.

BOYLE, C., GOTZ, M., DAMMANN-TUGEND, U. & SCHULTZ, B. (2001).

Interaksi endofit-host III. Kolonisasi lokal vs sistemik. Simbiosis. 31:259-281.

Penelitian Global tentang Buletin Kakao. (2002). Edisi 1. CABI Biosains.

HEBBAR, K. P. & LUMSDEN, R. D. (1999). Formulasi dan fermentasi agen biokontrol

patogen jamur kakao: Contoh spesies Trichoderma. Dalam Metodologi Penelitian
Pengendalian Hayati Penyakit Tanaman, dengan Referensi Khusus Penyakit Jamur
Kakao. Diedit oleh Krauss, U. & Hebbar, K. P. 63-67.

HOLMES, K. A., EVANS, H. C. & POMELLA, A. (2002). Pengetahuan Orang Dalam:

Endofit untuk biokontrol penyakit kakao. Berita dan Informasi Biokontrol. 23 (4): 8688.
KRAUSS, U. & HEBBAR, K. P. (1999). Metodologi Penelitian Pengendalian Bio
Penyakit Tanaman dengan Referensi Khusus Penyakit Jamur Kakao. CABI Biosains,
CATIE & USDA, Turrialba, Kosta Rika.
LATCH G. C. M. & CHRISTENSEN M. J. (1985). Infeksi buatan rumput dengan endofit.
Sejarah Biologi Terapan 107: 17-24.
LEUCHTMANN, A., TANAH LIAT, K. (1988). Infeksi eksperimental rumput inang dan
sedges dengan Atkinsonella hypoxylon dan Balansia cyperi (Balansiae, Clavicipitaceae).
Mikolagia. 80(3): 291-297.
Tabel 1. Kolonisasi daun oleh jamur endofit dalam kondisi rumah kaca. Untuk semua
perlakuan dan tanggal, N=3 dan n=96, kecuali untuk tanggal 0, di mana N=5, n=160*.

Beberapa hari setelah inokulasi

10 25 33

% % % % % %
potongan Diinokulasi potongan Diinokulasi potongan Diinokulasi
daun oleh SP % oleh daun oleh SP % oleh sp daun oleh SP % oleh sp
Perawatan dijajah fokus. sp lain . dijajah fokus. lain . dijajah fokus. lain .
Menguasai - 100 11.46 - 100 - 100
4.17 12.50

Botryosphaeria sp. 13.54 76.92 23.08 37.50 77.78 22.22 62.50 78.33 21.67

Nektria sp. 14.58 78.57 21.43 35.41 75.61 24.39 38.54 62.16 37.84

Colletotrichum sp. 20.04 80 20 57.29 94.54 5.45 91.67 87.50 12.50

Pada tanggal 0 daun kendali menunjukkan kolonisasi 2,50% oleh jamur endofit (N=5,
n=160) *N: jumlah daun, n: jumlah potongan daun **Colletotrichum sp. Morfotipe 1.
 Tabel 2. Kolonisasi oleh jamur endofit dari waktu ke waktu untuk daun setelah inokulasi
multi-spesies (E+) vs. tidak ada inokulasi (kontrol).

Beberapa hari setelah inokulasi dan % potongan daun dijajah

0 8 14 29

E+ Menguasai E+ Menguasai E+ Menguasai E+ Menguasai

(N=7, (N=4, (N=7, (N=6, (N=9, (N=6,

Jamur yang Diinokulasi n=224)* n=128) n=224) n=192) n=560) n=384)
Colletotrichum sp. M1 - 0 - 0 69.77 0 84.69 0

Nektria sp. PI 04 - 0 - 0 4.65 0 2.63 0

Nektria sp. PI 16 - 0 - 0 5.81 0 2.87 0

Fusarium sp. PI 18 - 0 - 0 4.65 0 2.39 0

Nektria sp. PI 20 - 0 - 0 5.81 0 1.2 0

Fusarium sp. PI 23 - 0 - 0 6.98 7.14 4.31 25

Sp non inokulasi . - 100 - 100 2.32 92.86 2.15 75

Total % dijajah - 0.45 - 2.34 38.04 7.29 74.64% 4.17

*N: jumlah daun, n: jumlah potongan daun

Gambar 1. Pengaruh infeksi endofit dengan adanya Phytophthora sp. (P+) terhadap
persen luas daun yang hilang akibat nekrosis untuk daun T. cacao yang diinokulasi endofit
(E+) dan endofitbebas (E-). Batang menunjukkan SE; P = 0,0030 menggunakan
roportion p yang ditransformasikan logitdari kerusakan area daun.

15

10

0
E+P+ E-P+

Pengobatan