1

BAB I

PENDAHULUAN

Latar Belakang.
Tanaman adalah tumbuhan yang bermanfaat baik secara langsung maupun tidak
langsung bagi kehidupan manusia. Tumbuhan yang menganggu disebut gulma. Bagi
pemulia tanaman baik tanaman, tumbuhan dan gulma adalah penting sebagai sumber
keragaman genetik. Pemuliaan tanaman sendiri adalah perbaikan sifat genetik tanaman
baik dengan transfer material genetik dari tanaman donor atau donor yang lain (introgresi)
kepada tanaman penerima maupun perubahan material genetik dari tanaman penerima itu
sendiri yang dikenal dengan mutasi. Jadi introgresi dan mutasi merupakan dua proses
utama dalam perbaikan sifat tanaman. Pemuliaan tanaman sendiri adalah suatu proses yang
progresif dan berkelanjutan baik dari segi ilmu dan teknologi. Tanaman itu tumbuh pada
berbagai habitat tumbuh dari iklim kutub sampai iklim tropis dan dari rawa sampai lahan
kering. Berbagai habitat tumbuh ini yang menyebabkan tanaman beradaptasi untuk
bertahan hidup yaitu terjadi semacam "struggle for life". Perubahan fenotipe tanaman untuk
beradaptasi itu didasar pada perubahan genotipe tanaman. Jadi sebelum manusia campur
tangan dalam pemuliaan tanaman, tanaman sendiri sudah memuliakan dirinya secara
mandiri. Pemulia tanaman belajar dari tanaman bagaimana perubahan genetik yang terjadi
pada tanaman, memodifikasi dan mempercepat perubahan genetik yang terjadi.
Bioteknologi adalah terapan biologi yang melibatkan disiplin ilmu mikrobilogi,
biokimia, genetika, dan biologi monokuler. Definisi bioteknologi secara klasik atau
konvensional adalah teknologi yang memanfaatkan agen hayati atau bagian-bagiannya
untuk menghasilkan barang dan jasa dalam skala industri untuk memenuhi kebutuhan
manusia. Sedangkan jika ditinjau secara modern, bioteknologi adalah pemanfaatan agen
hayati atau bagian-bagian yang sudah direkayasa secara in vitro untuk mrenghasilkan
barang dan jasa pada skala industri. Bioteknologi dikembangkan untuk meningkatkan nilai
bahan mentah dengan memanfaatkan kemampuan mikroorganisme atau bagian-bagiannya
misalnya bakteri dan kapang. Selain itu bioteknologi juga memanfaatkan sel tumbuhan
atau sel hewan yang dibiakkan sebagai bahan dasar sebagai proses industri.
Bioteknologi tanaman meliputi Kultur Jaringan dan Rekayasa Genetika. Kultur
jaringan erat kaitannya dengan rekayasa genetika, karena pengerjaan rekayasa genetika
juga kebanyakan dilakukan secara in vitro di laboratorium. Selain itu, sistem regenerasi
 2

tanaman transgenik juga mebutuhkan ilmu kultur jaringan, sehingga orang yang bekerja di
bidang rekayasa genetika wajib mengetahui prinsip-prinsip kerja dalam kultur jaringan.

Teknik rekayasa genetik tanaman (transgenik) merupakan metode baru untuk

menghasilkan tanaman tahan virus yang disebut sebagai CoatProtein-Mediated Resistance
(CP-MR), yaitu ketahanan tanaman yang disebabkan oleh ekspresi gen coat protein
(cpgene) (Beachy, 1991). Dilaporkan oleh Power-Abel et al., (1986) tembakau transgenik
cpTMV yang resisten terhadap TMV ternyata tidak menunjukkan adanya gejala penyakit
meskipun diinokulasi dengan Tomato Mosaic Virus (ToMV) maupun SMV. Demikian juga
tomat yang diinfeksi gen cp-TMV ternyata tahan terhadap ToMV(Nelson , 1988).
Berdasarkan kisaran inang dan hubungan serologi, ada 60-90 % homologi asam amino
pada coat protein TMV, SMV dan ToMV sehingga dapat saling melindungi. Hal ini dapat
dijelaskan oleh Power-Abel et al. (1986) bahwa coat protein dari virus yang menginfeksi
pertama akan menyelubungi RNA dari virus yang menginfeksi berikutnya sehingga dapat
mencegah replikasinya. Pada metode CP-MR terjadi interaksi antara sekuen asam amino
virus dengan coat protein transgen secara spesifik pada aras molekular, sehingga ada
korelasi antara resistensi dengan derajat keserupaan antara sekuen asam amino pada coat
protein transgenik tanaman dengan coat protein virus (Clark et al., 1995). Di Indonesia,
untuk mendapatkan kedelai yang tahan terhadap penyakit Mosaik perlu dikembangkan
tanaman transgenik dengan penyisipan gen coat protein SMV lokal.
Isolasi virus SMV isolat lokal DIY dan amplifikasi gen cp-SMV telah dilakukan dan
berhasil diklon dan digunakan untuk transformasi Agrobacterium sp. (Sumardiyono et al.,
1995; Sismindari dan Sujadi, 1996). Selanjutnya Agrobacterium sp. yang menyandi gen
cp-SMV telah berhasil ditransformasi ke daun tembakau sebagai tanaman model dan
membentuk kalus dan tunas (Agung-Astuti dan Diah, 2000). Agrobacterium sp. dapat
memindahkan dan mengintegrasikan T-DNA ke dalam genom tanaman (Sheng dan
Citovsky, 1996). Keberadaan gen cp-SMV di dalam kalus atau tunas dapat dideteksi
dengan pendekatan PCR menggunakan dua primer yang sesuai dengan urutan basa dari gen
cp-SMV beserta daerah pengapitnya sehingga diperoleh fragmen sekitar 0,8 kb
(Eggenberger et al., 1989). Analisis molekular dengan PCR pada kalus dan tunas tembakau
hasil transformasi cp-SMV isolat lokal DIY, menunjukkan bahwa gen penyandi cp-SMV
isolat lokal DIY berekombinasi dengan DNA tanaman (sekitar 0,8 kb), sehingga
 3

diharapkan dapat mengekspresikan coat protein yang akan menghambat replikasi virus
SMV di dalam sel tanaman (Agung-Astuti et al., 2002).
Setelah diketahui bekerjanya sistem ekspresi gen cp-SMV isolat lokal DIY pada
tembakau sebagai tanaman model, maka untuk mendapatkan tanaman kedelai yang tahan
terhadap infeksi virus SMV dengan mekanisme CP-MR, perlu dilakukan transformasi gen
cp-SMV isolat lokal DIY ke tanaman kedelai.
Permasalahan.
Untuk transformasi gen cp-SMV isolat lokal DIY ke tanaman kedelai, dihadapi
beberapa permasalahan antara lain :
(a) Apakah regenerasi kalus atau tunas transforman dapat ditingkatkan dengan
menentukan macam medium dan zat pengatur tumbuh yang sesuai untuk menginduksi
tunas dan planlet,
(b) Bagaimana ekspresi dan stabilitas gen cp-SMV di dalam sel tanaman kedelai,
(c) Bagaimana aklimatisasi transforman : medium penyapihan, komposisi medium
bibit, kondisi rumah kaca,
(d) Bagaimana tingkat ketahanan tanaman kedelai terhadap serangan virus di lapangan
(Bioassay).
Tujuan Penelitian.
1) Regenerasi kalus atau tunas kedelai yang membawa gen cpSMV.
2) Memperoleh konfirmasi ekspresi coat protein SMV pada kalus transforman kedelai.
3) Menginduksi tunas/akar dari kalus transforman kedelai dengan perlakuan ZPT.
4) Mengetahui pengaruh pupuk daun dan air kelapa untuk substitusi sumber hara dan
ZPT pada medium MS pada multiplikasi transforman.

BAB II

PEMBAHASAN

Sejak 8000 tahun yang lalu, bangsa Mesir kuno menggunakan mikroba kapang
Saccharomyces atau ragi untuk pembuatan minuman anggur and roti. Ragi itu mengubah
gula dalam cairan anggur menjadi alkohol. Dalam pembuatan roti, gelembung gas yang
dihasilkan dalam proses fermentasi oleh bantuan ragi roti (yeast), membuat roti bertekstur
empuk sehingga enak dimakan. Nenek moyang bangsa Indonesia telah menggunakan
 4

mikroba lain, yaitu jamur Rhizopus, untuk membuat tempe dari kedelai. Semua ini adalah
penggunaan mikroba pada tingkat sel untuk tujuan pengolahan pangan.

Bioteknologi moderen lahir pada tahun 1970-an setelah dikembangkan teknik

rekayasa terhadap materi genetik (DNA), yang disebut teknologi DNA rekombinan atau
rekayasa genetika. Berkembangnya teknologi ini dimungkinkan oleh kemampuan
mengisolasi, memotong, menyambung dan menggabungkan DNA di laboratorium, serta
memasukkannya ke dalam organisme inang (umumnya bakteri atau virus) untuk
diperbanyak atau dilakukan kloning. Selanjutnya materi genetik yang sudah dimanipulasi
itu dapat dipindahkan ke makhuk hidup yang hendak direkayasa untuk menghasilkan
produk dan jasa yang bermanfaat sesuai kebutuhan manusia. Dengan demikian, melalui
teknologi ini orang mampu menciptakan sifat (karakter) baru pada suatu mikroorganisme,
tanaman ataupun hewan, serta memindahkan karakter dari satu jenis makhluk hidup ke
makhluk hidup lain, bahkan yang berjauhan secara filogenik. Contohnya, kemampuan
memproduksi protein berupa Bt-toxin (racun pembunuh serangga hama) yang secara alami
terdapat pada bakteri Bacillus thuringiensis dapat dipindahkan ke tanaman kedelai, jagung
dan kapas, dengan mentransfer gen penentunya ke dalam tanaman-tanaman tersebut
(Giddings et al, 2000). Contoh lainnya, berbagai jenis vaksin yang umumnya diproduksi
dengan menggunakan hewan, saat ini dapat juga diproduksi pada tanaman pisang, tomat,
kentang dan tembakau (Daniell et al, 2001; Sala et al, 2003), sehingga vaksinasi dapat
dilakukan dengan mengkonsumsi makanan yang berasal dari tanaman yang sudah
direkayasa itu. Contoh-contoh yang telah dikemukakan itu tidak mungkin dapat dilakukan
sebelumnya dengan pemindahan gen dan karakter secara konvensional.

Perkembangan bioteknologi tanaman dan pertanian, bertumpu pada dua bidang

teknologi yang saat ini berkembang dengan pesat, yakni rekayasa genetik dan kultur
jaringan tanaman. Sebagaimana diuraikan sebelumnya, rekayasa genetik atau teknologi
DNA rekombinan berkaitan dengan manipulasi terhadap materi genetik (DNA dan RNA)
didalam sel makhluk hidup, sehingga menimbulkan perubahan karakter yang bersifat
menurun pada makhluk hidup yang direkayasa. Kultur jaringan tanaman berkemampuan
untuk menumbuhkan tanaman utuh dari bagian kecil tanaman itu, misalnya sel,
protoplasma dan jaringan. Karena manipulasi tanaman dengan DNA asing pada umumnya
harus dilakukan pada tingkat sel atau jaringan, maka kemampuan untuk menumbuhkan
 5

kembali tanaman utuh dari sel-selnya mempunyai peranan penting pada rekayasa genetik
tanaman untuk mendapatkan tanaman unggul.

Riset bioteknologi tanaman yang sangat giat dilakukan di negara-negara maju,

terutama oleh perusahaan-perusahaan swasta, telah menghasilkan banyak varietas tanaman
yang direkayasa secara genetik, yang disebut tanaman GM (genetically modified plants).
Secara teknis suatu tanaman GM adalah tanaman yang mengandung gen-gen asing yang
bukan berasal dari jenis tanaman itu. Tanamann hssil rekayasa seperti ini juga disebut
tanaman transgenik. Di antara banyak tanaman transgenik yang telah dikembangkan, ada
beberapa telah ditanam secara luas di seluruh dunia, yaitu kedelai, jagung, kapas dan
canola, dengan ketahanan terhadap herbisida dan ketahanan terhadap hama.
Tanamantanaman transgenik lain yang ditanam cukup luas adalah kentang, tomat, bit gula,
alfalfa, dan papaya. Pada saat ini, sekitar 90% kedelai dan 64% kapas yang ditanam di
seluruh dunia adalah tanaman transgenik hasil rekayasa genetik (James, 2010).

Dengan cara konvensional maupun bioteknologi modern, pemindahan dan

penggabungan sifat-sifat menurun pada tanaman dapat dilakukan dengan memindahkan
gen-gen yang menentukan sifat-sifat menurun itu. Pada bioteknologi moderen,
pemindahan gen dapat dilakukan dengan transformasi genetik. Bioteknologi tanaman
dengan transformasi genetik membutuhkan 3 teknik, yaitu:

1. Teknik rekayasa genetik, untuk merekayasa gen (DNA) yang hendak ditransfer ke dalam
tanaman,

2. Teknik transfer gen, yaitu untuk mentransfer gen yang sudah direkayasa ke dalam
jaringan atau sel tanaman,

3. Teknik kultur jaringan atau kultur sel, untuk menumbuhkan tanaman utuh dari jaringan.

Dengan melibatkan ketiga teknik tersebut pada akhirnya akan diperoleh tanaman hasil
rekayasa genetik atau disebut tanaman transgenik (Chawla, 2000).

Bioteknologi tanaman masuk dalam ilmu Pemuliaan tanaman, namun dilakukan

secara modern. Bioteknologi tanaman meliputi Kultur Jaringan dan Rekayasa Genetika.
Kultur jaringan erat kaitannya dengan rekayasa genetika, karena pengerjaan rekayasa
genetika juga kebanyakan dilakukan secara in vitro di laboratorium. Selain itu, sistem
 6

regenerasi tanaman transgenik juga mebutuhkan ilmu kultur jaringan, sehingga orang yang
bekerja di bidang rekayasa genetika wajib mengetahui prinsip-prinsip kerja dalam kultur
jaringan.

Kultur jaringan adalah metode perbanyakan secara vegetatif yang dilakukan secara
in vitro, sehingga hasil akhirnya adalah klon tanaman atau yang biasa disebut somaklon
(karena berasal dari sel-sel somatik). Metode perbanyakan ini dilakukan secara aseptik di
laboratorium, membutuhkan bahan awal tanaman (biasa disebut eksplan) yang relatif
berukuran kecil untuk menghasilkan somaklon dalam jumlah banyak dan dalam waktu
yang relatif singkat. Somaklon ini memiliki karakter morfologi dan molekuler yang identik
dengan induknya. Kadangkala modifikasi genetis bisa terjadi pada kultur jaringan melalui
variasi somaklonal, akan tetapi hal ini bukan menjadi tujuan, meskipun variasi somaklonal
ini bisa bersifat positif.

Pemuliaan tanaman konvensional dan rekayasa genetika sama-sama bertujuan

mendapatkan individu tanaman dengan karakter unggul yang secara genetis sudah
mengalami modifikasi. Akan tetapi terdapat perbedaan antara pemuliaan tanaman
konvensional dengan rekayasa genetika dalam hal modifikasi yang terjadi pada genom
tanaman. Pemuliaan tanaman secara konvensional menggunakan cara persilangan untuk
mendapatkan individu tanaman unggul, sehingga membutuhkan waktu yang relatif lama.
Sedangkan rekayasa genetika melakukan modifikasi genetis tersebut secara langsung
dengan melakukan insersi gen asing (yang membawa sifat unggul yang kita inginkan)
langsung ke genom tanaman.

Rekayasa genetika tanaman adalah manipulasi genom tanaman dengan

bioteknologi. Atau dengan kata lain, pengetahuan dan metode tentang pembuatan tanaman
transgenik. Tanaman transgenik adalah tanaman yang telah disisipi gen asing yang berasal
dari mahluk hidup lainnya, bisa sesama tanaman, hewan, ataupun bakteri.

PENGERTIAN TANAMAN TRANSGENIK

Tanaman transgenik adalah tanaman yang telah disisipi atau memiliki gen asing
dari spesies tanaman yang berbeda atau makhluk hidup lainnya. Penggabungan gen asing
 7

ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat yang diinginkan, misalnya
pembuatan tanaman yang tahan suhu tinggi, suhu rendah, kekeringan, resisten terhadap
organisme pengganggu tanaman, serta kuantitas dan kualitas yang lebih tinggi dari
tanaman alami. Sebagian besar rekayasa atau modifikasi sifat tanaman dilakukan untuk
mengatasi kebutuhan pangan penduduk dunia yang semakin meningkat dan juga
permasalahan kekurangan gizi manusia sehingga pembuatan tanaman transgenik juga
menjadi bagian dari pemuliaan tanaman.

Tujuan dari pembuatan tanaman transgenik adalah untuk mendapatkan tanaman

unggul yang lebih baik dari tanaman aslinya. Pada awal dibuatnya tanaman transgenik
sebenarnya adalah untuk mengatasi masalah pangan dunia. Meningkatnya jumlah
penduduk menyebabkan produksi pangan tidak mampu memenuhi kebutuhan pangan
mereka. Untuk meningkatkan luas areal pertanian tidak memungkinkan karena semakin
sempitnya luas lahan pertanian. Sementara intensifikasi budidaya pertanian (melalui
penggunaan pupuk kimia dan pestisida) menimbulkan dampak buruk pada lingkungan dan
dampak residu pada produk yang membahayakan konsumen. Diketahui bahwa kehilangan
produksi pertanian sebagian besar disebabkan oleh hama, penyakit dan gulma. Dengan
demikian dilakukanlah upaya pembuatan tanaman transgenik yang tahan terhadap hama,
penyakit dan tahan terhadap herbisida. Jadi tujuan utamanya adalah peningkatan produksi
pangan

SEJARAH TANAMAN TRANSGENIK

Seleksi genetik untuk pemuliaan tanaman (perbaikan kualitas/sifat tanaman) telah

dilakukan sejak tahun 8000 SM ketika praktik pertanian dimulai di Mesopotamia. Secara
konvensional, pemuliaan tanaman dilakukan dengan memanfaatkan proses seleksi dan
persilangan tanaman. Kedua proses tersebut memakan waktu yang cukup lama dan hasil
yang didapat tidak menentu karena bergantung dari mutasi alamiah secara acak. Contoh
hasil pemuliaan tanaman konvensional adalah durian montong yang memiliki perbedaan
sifat dengan tetuanya, yaitu durian liar. Hal ini dikarenakan manusia telah menyilangkan
atau mengawinkan durian liar dengan varietas lain untuk mendapatkan durian dengan sifat
unggul seperti durian montong.

Sejarah penemuan tanaman transgenik dimulai pada tahun 1977 ketika bakteri
Agrobacterium tumefaciens diketahui dapat mentransfer DNA atau gen yang dimilikinya
 8

ke dalam tanaman. Pada tahun 1983, tanaman transgenik pertama, yaitu bunga matahari
yang disisipi gen dari buncis (Phaseolus vulgaris) telah berhasil dikembangkan oleh
manusia. Sejak saat itu, pengembangan tanaman transgenik untuk kebutuhan komersial
dan peningkatan tanaman terus dilakukan manusia. Tanaman transgenik pertama yang
berhasil diproduksi dan dipasarkan adalah jagung dan kedelai. Keduanya diluncurkan
pertama kali di Amerika Serikat pada tahun 1996. Pada tahun 2004, lebih dari 80 juta
hektar tanah pertanian di dunia telah ditanami dengan tanaman transgenik dan 56% kedelai
di dunia merupakan kedelai transgenic

PEMBUATAN TANAMAN TRANSGENIK

Untuk membuat suatu tanaman transgenik, pertama-tama dilakukan identifikasi

atau pencarian gen yang akan menghasilkan sifat tertentu (sifat yang diinginkan). Gen
yang diinginkan dapat diambil dari tanaman lain, hewan, cendawan, atau bakteri. Setelah
gen yang diinginkan didapat maka dilakukan perbanyakan gen yang disebut dengan istilah
kloning gen. Pada tahapan kloning gen, DNA asing akan dimasukkan ke dalam vektor
kloning (agen pembawa DNA), contohnya plasmid (DNA yang digunakan untuk transfer
gen). Kemudian, vektor kloning akan dimasukkan ke dalam bakteri sehingga DNA dapat
diperbanyak seiring dengan perkembangbiakan bakteri tersebut. Apabila gen yang
diinginkan telah diperbanyak dalam jumlah yang cukup maka akan dilakukan transfer gen
asing tersebut ke dalam sel tumbuhan yang berasal dari bagian tertentu, salah satunya
adalah bagian daun. Transfer gen ini dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu
metode senjata gen, metode transformasi DNA yang diperantarai bakteri Agrobacterium
tumefaciens, dan elektroporasi (metode transfer DNA dengan bantuan listrik).

Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil. Metode ini sering

digunakan pada spesies jagung dan padi. Untuk melakukannya, digunakan senjata yang
dapat menembakkan mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-
proyektil tersebut akan mengantarkan DNA untuk masuk ke dalam sel tanaman.
Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada
kemungkinan terjadi kerusakan sel selama penembakan berlangsung.
 9

Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Bakteri

Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki
plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam
plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit
tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di
dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. Tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen
pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu
dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.
Metode elektroporasi. Pada metode elektroporasi ini, sel tanaman yang akan menerima
gen asing harus mengalami pelepasan dinding sel hingga menjadi protoplas (sel yang
kehilangan dinding sel). Selanjutnya sel diberi kejutan listrik dengan voltase tinggi untuk
membuka pori-pori membran sel tanaman sehingga DNA asing dapat masuk ke dalam sel
dan bersatu (terintegrasi) dengan DNA kromosom tanaman. Kemudian, dilakukan proses
pengembalian dinding sel tanaman. Setelah proses transfer DNA selesai, dilakukan seleksi
sel daun untuk mendapatkan sel yang berhasil disisipi gen asing. Hasil seleksi
ditumbuhkan menjadi kalus (sekumpulan sel yang belum terdiferensiasi) hingga nantinya
terbentuk akar dan tunas. Apabila telah terbentuk tanaman muda (plantlet), maka dapat
dilakukan pemindahan ke tanah dan sifat baru tanaman dapat diamati.
APLIKASI TANAMAN TRANSGENIK
Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika telah melahirkan revolusi baru
dalam berbagai bidangkehidupan manusia, yang dikenal sebagai revolusi gen .Produk
teknologi tersebut berupa organisme transgenik atau organisme hasil modifikasi genetik
.Dewasa ini cukup banyak organisme transgenik atapun produknya yang dikenal
dikalangan masyarakat luas.Beberapa diantaranya bahkan telah digunakan untuk
memenuhi kebutuhan hidup sehari-hari .Berikut ini akan dikemukakan contoh pemanfaatan
produk yang dihasilkannya dalam berbagai bidang kehidupan manusia.
1. Pertanian
Melalui cara transgenik telah ditemukan sejumlah transgenik seperti
tomat,tembakau dll.dengan sifat-sifat yang diinginkan ,misalnya perlambatan pematangan
buah dan resistensi terhadap hama dan penyakit tertentu.Pada dasarkan rekayasa genetika
di bidang pertanian bertujuan untuk menciptakan ketahanan pangan suatu negara dengan
cara meningkatkan produksi kualitas ,dan upaya penanganan pasca panen serta prosesing
hasil pertanian .Peningkatan produksi pangan melalui revolusi hijau ,di samping itu
 10

,kualitas gizi serta daya simpan produk pertanian juga dapat ditingkatkan sehingga secara
ekonomi memberikan keuntungan secara nyata .Adapun dampak positifnya adalah untuk
menciptakan keanekaragaman hayati yang lebih tinggi .
2. Florikultur .
Antara lain telah diperoleh tanaman anggrek transgenik dengan masa kesegaran
bunga yang lama .Demikian juga telah dihasilkan. Beberapa jenis tanaman bunga
transgenik lainnya dengan warna bunga yang diinginkan .
3. Kesehatan
Mampu menghasilakan berbagai jenis obat dengan kualitas yang lebih baik
sehingga memberikan harapan dalam upaya penyembuhan sejumah penyakit dimasa
mendatang .Teknik rekayasa genetika memungkinkan diperolehnya berbagai produk
industri farmasi penting seperti insulin,interferon dan beberapa hormon pertumbuhan
dengan cara yang lebih efisien .Hal ini karena gen yang bertanggung jawabatas produk
tersebut dikloning ke dalam sel inang bakteri tertentu yang sangat cepat pertumbuhannya
dan hanya memerlurkan kultivasi biasa Beberapa tanaman transgenik telah diaplikasikan
untuk menghasilkan tiga macam sifat unggul, yaitu tahan hama, tahan herbisida, dan buah
yang dihasilkan tidak mudah busuk. Tanaman jagung dan kapas transgenik dengan sifat
tahan hama telah diproduksi secara massal dan dipasarkan di dunia. Gen asing yang
banyak digunakan untuk sifat resistensi hama ini adalah gen penyandi toksin Bt dari
bakteri Bacillus thuringiensis. Sejak tahun 1996, Monsanto, salah satu perusahaan
multinasional di bidang bioteknologi, telah menjual benih kapas transgenik dengan merek
dagang “Bollgard”. Selain itu, tanaman kedelai dan kanola tahan herbisida juga telah
dijual ke berbagai negara, termasuk Indonesia, dengan merek “Roundup Ready”.
Tanaman tomat transgenik dengan sifat pematangan buah diperlambat pernah
diproduksi oleh Calgene pada tahun 1994 dan dipasarkan di Amerika Serikat dengan
merek “Flavr Savr”. Biasanya, tanaman tomat alami dipanen dalam keadaan masih hijau
dan belum matang kemudian disemprot dengan gas etilen untuk membuat buah matang dan
berwarna merah. Namun, rasa tomat yang dihasilkan umumnya kurang terasa. Tujuan
pembuatan tomat transgenik tersebut adalah untuk memperpanjang masa simpan dan
menghindari pembusukan buah selama transportasi dari lahan penanaman ke tempat
penjualan. Namun, penjualan Flavr Savr ditarik dalam waktu kurang dari setahun karena
alasan kesehatan dan penjualannya mengalami kerugian. Produk tersebut tidak banyak
terjual karena harganya dua kali lipat dari tomat biasa namun rasa yang dihasilkan sama.
 11

Dalam tahap penelitian, tanaman transgenik sedang diaplikasikan untuk

menghasilkan senyawa yang bermanfaat bagi kesehatan manusia, seperti vitamin A dan
vaksin. Untuk produksi vaksin yang dapat dimakan (edible vaccine), contoh tanaman yang
sedang dikembangkan adalah pisang, kentang, dan tomat. Salah satu tanaman transgenik
yang sudah diteliti sejak tahun 1980 untuk mengurangi jumlah penderita defisiensi
(kekurangan) vitamin A adalah padi emas. Aplikasi lain yang sedang dikembangkan
adalah penggunaan tanaman untuk membersihkan polusi tanah dari senyawa beracun
(seperti arsen) dan logam berat (contohnya merkuri). Gen asing dari bakteri ditransfer ke
dalam tembakau dan Arabidopsis sehingga kedua tanaman tersebut dapat menarik merkuri
dalam tanah dan mengubahnya menjadi senyawa yang mudah menguap serta tidak
berbahaya.
Tanaman Arabidopsis juga dikembangkan untuk memproduksi poli
(3hidroksibutirat) atau PHB, suatu bahan pembentuk plastik yang mudah diurai
(biodegradable). Sebagian besar plastik yang ada dibuat dari sumber daya yang tidak dapat
diperbaharui, salah satunya adalah minyak bumi. Untuk mengurangi penggunaan sumber
daya tersebut, digunakan PHB yang dihasilkan oleh bakteri, seperti Alcaligenes eutrophus.
Empat pen pembentuk PHB dari bakteri tersebut telah ditransfer ke Arabidopsis sehingga
tanaman tersebut dapat menghasilkan PHB. Penelitian tentang PHB dari tumbuhan masih
dalam tahap pengembangan sebelum diproduksi massal.

TEKNIK TANAMAN TRANSGENIK KEDELAI

A. Regenerasi transforman kedelai (subkultur dan multiplikasi)

Kalus atau tunas kedelai hasil transformasi diperbanyak pada medium MS + 0,3 mg/l
NAA + 2 mg/l BAP sesuai prosedur George dan Sherrington (Pierik, 1987). Seluruh
tahapan multiplikasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasi pada pencahayaan
sekitar 1000 lux (dengan transmission light) fase gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta
suhu 25-280 C.
B. Isolasi dan penentuan konsentrasi coat protein SMV

a. Isolasi dan penentuan konsentrasi crude protein kalus transforman kedelai

Kalus seberat 2-5 gram dilumatkan dengan penambahan buffer 5mM

 12

Sodiumphosphat 0,14 N NaCl (pH 7) dingin. Selanjutnya siap disentrifugasi dengan

microcentrifuge (MSE) pada kecepatan 10.000 g selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh disimpan dalam 40 C. Konsentrasi crude protein ditentukan berdasarkan serapan
sinar ultraviolet panjang gelombang 280 nm dan 260 nm (Robyt & White, 1987).
C. Analisis coat protein SMV dengan metode Elektroforesis SDS-PAGE

Gel akrilamid terdiri atas resolving gel 15% (10 ml larutan stok akrilamid :
bisakrilamid 30 : 0,8 + 7,4 ml Tris-HCl 1 M pH 8,6 + 0,2 ml SDS 10 % + 1 ml APS 1,5 %
+ 1,36 ml akuades) + 10 µl TEMED, segera dimasukkan ke slab gel vertikal setinggi 5 cm
dan stacking gel (3%). Selanjutnya ditambahkan butanol untuk menutup permukaan larutan
agar permukaan rata dan menghilangkan gelembung udara. Gel dibiarkan mengalami
polimerisasi selama 30 - 60 menit. Setelah padat maka resolving gel dibersihkan dengan
menyemprot akuades ke permukaan gel. Stacking gel (2,8 ml larutan stok akrilamid :
bisakrilamid 30 : 0,8 + 1,66 ml Tris-HCl 1 M pH 6,8 + 0,14 ml SDS 10 % + 0,66 ml APS
1,5 % + 8,2 ml akuades) + 8 µl TEMED. Campuran dituang di atas resolving gel dengan
cepat, kemudian sisir dipasang dan gel dibiarkan berpolimerisasi selama 30-40 menit
sehingga siap digunakan. Sampel protein yang akan dipisahkan ditambah dengan sampel
bufer (2X), dipanaskan selama 2 menit, setelah itu larutan sampel dimasukkan ke dalam
sumuran pada gel yang telah terbentuk. Elektroforesis protein SDSPAGE dijalankan pada
voltase 80 V selama kurang lebih 1 jam (hingga batas bawah gel). Setelah selesai gel
direndam dalam coomase blue untuk pewarnaan dan digoyang selama semalam dan
dilakukan desstaining hingga pita-pitanya dapat dilihat dengan jelas dan dapat diketahui
berat molekulnya.
D. Analisis coat protein SMV dengan metode Immunoblotting- antibodi poliklonal

Pengujian ini terdiri atas tahapan : transfer membran, blocking, pengujian antibodi,
pengujian anti-antibodi (conjugate) dan pewarnaan. Transfer gel ke membran dilakukan
setelah protein dielektroforesis pada SDS-PAGE dan direndam transfer bufer selama 30
menit. Membran nitrosellulosa dipotong sesuai ukuran gel dan diberi tanda untuk
menentukan posisi sumuran, lalu direndam transfer buffer bersama-sama dengan fiber
pads. Setelah 30 menit, gel disusun dalam Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell dengan
urutan dari bawah sebagai berikut : fiber pad (+), membran nitrosellulosa, gel, fiber pad (),
diratakan agar tidak ada gelembung. Trans-blot SD Semi-dry Transfer Cell ditutup.
Blotting dijalankan pada voltase 20 V selama 45 menit. Blocking dilakukan supaya gel
 13

tertutup larutan blocking sehingga pita protein yang sudah diberi antigen dapat terdeteksi.
Sebelum dilakukan blocking dengan larutan BSA 1% dalam TTBS-tween 0,05 %,
membran yang telah diblot dengan protein dari gel direndam dengan transfer bufer salin
(TBS 1X) selama 5 menit. Membran direndam pada larutan blocking selama 60 semalam
pada suhu 40 C tanpa penggoyangan. Selanjutnya larutan blocking dibuang dan membran
dicuci dengan larutan Tween transfer bufer salin (TTBS) selama 10 menit dengan
penggoyangan pada suhu kamar lalu larutan TTBS dibuang. Pengujian antibodi dilakukan
dengan merendam membran pada larutan antibodi pertama dan selanjutnya membran
diinkubasi selama 120 menit dengan penggoyangan pada suhu kamar. Membran dicuci
dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit dan selanjutnya TTBS dibuang. Pengujian
anti-antibodi (conjugate) dilakukan dengan merendam membran pada larutan antibodi ke
dua (anti-Rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate) dan diinkubasi selama 2 jam pada
suhu kamar dengan penggoyangan. Setelah inkubasi, larutan antibodi ke dua dibuang dan
membran dicuci dengan TTBS dua kali, masing-masing 5 menit, kemudian dicuci dengan
larutan TBS satu kali 5 menit. Deteksi hasil reaksi dilakukan dengan merendam membran
di dalam larutan colour developer (BCIP/NBT) sampai terbentuk warna ungu pada
membran. Reaksi pewarnaan kemudian dihentikan dengan merendam membran dalam
akuades selama 10 menit.

E. Optimasi medium regenerasi untuk induksi akar/tunas transforman

Kalus yang telah disubkultur dan dimultiplikasi kemudian diinduksi untuk beregenerasi
membentuk tunas atau akar. Untuk itu dilakukan optimasi medium terbaik yang dapat
menginduksi tunas atau akar dengan Kanamycin 50 mg/l sebagai marker seleksi. Optimasi
medium regenerasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan diinkubasi pada pencahayaan
sekitar 1000 lux ( dengan transmision light) fase gelap 8 jam dan fase terang 16 jam serta
suhu 25-280 C.
Perlakuan medium yang dicobakan adalah :

C. MS + 0,3 mg/l NAA + 2 mg/l BAP

E. MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP

F. MS + 0,1 mg/l NAA + 1 mg/l BAP

G. MS0
 14

H. MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l Kinetin

I. MS + 0,5 mg/l NAA + 5 mg/l BAP

J. MS + 3 mg/l BAP

F. Substitusi medium pemeliharaan dengan pupuk daun dan air kelapa

Kalus kedelai hasil transformasi yang diperoleh dari multiplikasi, selanjutnya

diperbanyak pada medium MS sesuai prosedur George dan Sherrington (Pierik, 1987) yang
disubstitusi dengan pupuk daun Hyponek ditambah NAA dan BAP dan air kelapa dengan
Kanamycin sebagai penanda seleksi. Perlakuan medium :
K. MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa

L. MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 % air kelapa

M. MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP + 20 % air kelapa

N. MS + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa

O. Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa

P. Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 % air kelapa

Q. Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP + 20 % air kelapa

R. Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa

Seluruh tahapan substitusi medium multiplikasi dilakukan dalam kondisi aseptis dan
diinkubasi pada pencahayaan sekitar 1000 lux ( dengan transmision light) fase gelap 8 jam
dan fase terang 16 jam serta suhu 25-280 C.
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Regenerasi Transforman Kedelai cp-SMV

Transformasi dilakukan menggunakan 200 eksplan dan diseleksi dalam medium

medium MS + 2 mg/l BAP + 0,3 mg/l NAA yang ditambah Kanamycin. Hasil seleksi
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Jumlah dan persentase transforman kedelai cp-SMV berkalus
selama regenerasi dari 200 eksplan

Tahap Kegiatan Jumlah isolat Isolat berkalus (%)

Kultur Skrining Kanamycin 151 75,50
 15

Subkultur I 60 39,70
Subkultur II 20 10,00
Subkultur III 8 4,00
Subkultur IV 6 3,00
Subkultur V 6 3,00
Subkultur VI 6 3,00
Subkultur VII 6 3,00

Dari 200 eksplan yang diseleksi, 151 isolat berhasil membentuk kalus dalam medium
berisi Kanamycin (75,5%). Kalus yang telah tersisipi gen cp- SMV kemudian diisolasi
DNAnya untuk mendeteksi keberhasilan transformasi. Dari 151 isolat, yang diisolasi
DNAnya sebanyak 21 isolat (13,9 %). Dari 21 DNA yang dideteksi PCR dan
menunjukkan kalus tersisipi gen cp-SMV sebanyak 11 isolat (5,5 %). Sementara kalus
juga disubkultur untuk menyuplai hara dan dimultiplikasi untuk memperbanyak kalus.
Kalus yang sudah ditransformasi tidak mudah mempertahankan pertumbuhannya, kalus
mengalami browning yang kemudian berlanjut pada kematian kalus. Kalus bisa
dipertahankan kesegarannya antara 3 – 6 minggu dari inokulasi, sehingga kalus harus
disubkultur dan dilakukan sampai 7 kali selama sekitar 7 bulan untuk memperoleh kalus
yang akan diisolasi protein dan diregenerasi lebih lanjut. Keberhasilan kalus beregenerasi
dan membelah cukup rendah, karena dari 21 transforman, hanya 6 isolat (3 %) yang dapat
bertahan hidup dan diperbanyak yaitu transforman S11, S17, 24, 33, 35 dan 40. Sementara
itu menurut Wattimena (1992) keberhasilan transformasi genetik kedelai menggunakan
metode mikroproyektil sebesar 2 % persen .
Isolat yang membentuk kalus dan bertahan hidup sampai subkultur VII kemudian
dikembangkan untuk mendapatkan kalus dalam jumlah banyak. Hasil multiplikasi dapat
dilihat pada Gambar 2.
 16

Gambar 2. Multiplikasi kalus transforman kedelai cp-SMV

Kemampuan multiplikasi kalus cenderung rendah, karena dari 1 botol koleksi isolat
transforman rata-rata hanya dapat diperbanyak menjadi 2 botol koleksi, kecuali pada
transforman nomor S11 yang dapat diperbanyak sampai 64 botol koleksi pada subkultur
III, meskipun kemampuan multiplikasinya menurun pada subkultur IV menjadi 16 botol
koleksi dan meningkat lagi pada subkultur V. Keberhasilan subkultur dan multiplikasi
menurun karena komposisi medium dan ZPT yang digunakan sama dengan medium untuk
induksi kalus awal, sehingga kalus mengalami stagnasi pertumbuhan. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Gunawan (1987) bahwa subkultur beruntun pada medium yang sama
menyebabkan pertumbuhan eksplan mengalami stagnasi.

B. Isolasi dan Penentuan Konsentrasi coat protein SMV

Kandungan protein pada berbagai tanaman berbeda-beda. Untuk mendapatkan

konsentrasi protein yang cukup dianalisis SDS-PAGE maka perlu dilakukan optimasi berat
sampel isolat. Hasil isolasi protein dari 2 gram sampel diperoleh protein sejumlah 0,50 ml
dengan konsentrasi 5,005 mg/ml sehingga total protein 2,50 mg. Sedang 5 gram sampel
diperoleh protein sejumlah 0,80 ml dengan konsentrasi 12,03 mg/ml sehingga total protein
9,62 mg. Hasil analisis SDS-PAGE berbagai konsentrasi tersaji pada Gambar 3.
 17

1 2 3 4 5 6 7

Gambar 3. Analisis SDS-PAGE berbagai konsentrasi protein transforman kedelai cp-SMV

Keterangan sumur nomor :

1. 5 uM protein dari 2 g sampel 5. 12 uM protein dari 5 g sampel
2. 10 uM protein dari 2 g sampel 6. 24 uM protein dari 5 g sampel
3. 15 uM protein dari 2 g sampel 7. 36 uM protein dari 5 g sampel
4. 3 uM coat protein SMV

Menurut Tang dan Tian (2003) untuk pengujian western blotting cukup digunakan
sampel 1 gram dari kalus segar transgenik loblolly pine dengan konsentrasi 10 uM. Dari
Gambar 3 tampak bahwa pada transgenik kedelai cp-SMV diperlukan sampel seberat 2
gram kalus untuk mendapatkan pita-pita protein yang cukup untuk dianalisis secara
SDSPAGE dengan jumlah protein 10 uM. Isolasi protein dari 6 transforman dengan berat
sampel masing-masing 2 gram, hasilnya tersaji pada Tabel 2.

Tabel 2. Rerata konsentrasi dan jumlah total protein dari enam

transforman kedelai cp-SMV

Transforman Konsentrasi protein Jumlah Total

 18

(mg/ml) Protein
Non transforman 13,97 4,89
S11 13,04 5,22
S17 15,65 8,61
24 14,71 6,62
33 15,59 8,57
35 15,78 7,10
40 16,34 8,17

Hasil isolasi protein dari berat sampel yang sama ternyata menghasilkan jumlah
protein yang berbeda. Hal tersebut selain dipengaruhi oleh kandungan protein dalam
masing-masing transforman, juga oleh sifat kalus yang mempengaruhi isolasi protein.
Jumlah protein yang diperoleh dari enam transforman berkisar antara 4,89 – 8,61 mg
dengan konsentrasi sebesar 13,04 – 16, 34 mg/ml. Dari 2 gram kalus transforman S17, 33
dan 40 diperoleh protein dalam jumlah banyak dengan konsentrasi tinggi. Sementara dari
2 gram kalus non transforman diperoleh protein dalam jumlah yang cenderung lebih
sedikit. Hasil analisis SDS-PAGE berbagai transforman kedelai cp-SMV tersaji pada
Gambar 4.

1 2 3 4 5 6 7 8

Gambar 4. Analisis SDS-PAGE berbagai konsentrasi protein transforman kedelai cp-SMV

Keterangan sumur nomor :

1. 27,9 uM protein non transforman 5. 29,4 uM protein transforman 24
 19

2. 10,0 uM coat protein SMV 6. 31,2 uM protein transforman 33 3.

26,0 uM protein transforman 11 7. 31,6 uM protein transforman 35
4. 31,3 uM protein transforman S17 8. 32,7 uM protein transforman 40

Pada Gambar 4 tampak ada perbedaan profil pita-pita protein antara kontrol dengan
transforman, namun adanya pita coat protein-SMV pada transforman tidak begitu spesifik
karena coat protein SMV pada marker (sumur 2) tidak tampak tegas sebagai pembanding
dikarenakan konsentrasinya yang rendah (10 uM). Untuk memastikan adanya ekspresi gen
cp-SMV pada transforman maka dilakukan analisis coat protein SMV dengan metode
Immuno-dot-blot dan Immunoblotting-SDS-PAGE dengan antibodi poliklonal dari kelinci.

C. Analisis Coat Protein SMV dengan Metode Immuno-dot-blot dan Immunoblotting-

SDS-PAGE dengan Antibodi Poliklonal

Analisis coat protein SMV dengan metode Immuno-dot-blot dilakukan dengan

konsentrasi 13,04 uM – 16,34 uM pada transforman 11, S17, 24, 33, 35, 40, coat
proteinSMV dan kontrol, hasilnya tersaji pada Gambar 5.

Gambar5. Immuno-dot-blot protein transforman kedelai dg antibodi poliklonal cp-SMV

Keterangan :
1. 1,00 uM coat protein SMV 5. 13,95 uM protein non transforman
2. 13,04 uM protein transforman 11 6. 15,59 uM protein transforman 33
 20

3. 14,70 uM protein transforman 24 7. 15,78 uM protein transforman 35

4. 15,65 uM protein transforman S17 8. 16,34 uM protein transforman 40

Pada Gambar 5 dapat ditunjukkan adanya perbedaan intensitas warna ungu

berbagai transforman dengan coat protein-SMV dan kontrol, yang timbul akibat reaksi
antigen-antibodi coat protein SMV yang ditunjukkan dengan reaksi BCIP/NBT oleh
Alkaline Phosphatase. Transforman 11, 24, 33 dan 40 memberikan intensitas pewarnaan
sama dengan coat protein-SMV sehingga terdeteksi adanya ekspresi coat protein SMV.
Sedang transforman S17 dan 35 memberikan intensitas pewarnaan sama dengan kontrol
sehingga belum terekspresi coat protein SMV, meskipun secara deteksi PCR ada pita DNA
< 0,8 Kb.
Menurut Tang dan Tian (2003) hal tersebut ada hubungannya dengan high copy
numbers dan kemungkinan adanya proses co-suppression sehingga ekspresinya lemah.
Untuk membuktikan spesifik ukuran coat protein SMV pada transforman maka dilakukan
analisis Immunoblotting-SDS-PAGE.

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Gambar 6b. Analisis SDS-PAGE berbagai konsentrasi protein transforman kedelai cp-SMV

Gambar6b.ImmunoblottingSDS-PAGE protein transforman kedelai dg antibodi poliklonal cpSMV

Keterangan sumur nomor :

1. Marker protein 5. 55,8 uM protein non transforman
 21

2. 5,0 uM coat protein SMV 6. 62,4 uM protein transforman 33

3. 52,0 uM protein transforman 11 7. 65,4 uM protein transforman 40
4. 58,8 uM protein transforman 24

Menurut Eggenberger et al., (1989) ukuran protein lebih rendah dari yang
diperkirakan, diduga karena adanya prosesing. SMV menyandi delapan protein yang pada
awalnya merupakan satu protein besar yang kemudian mengalami pemotongan
(posttranslationally processed) menjadi protein virus. Gen cp-SMV diperkirakan
panjangnya 795 nukleotida yang mengkode 265 asam amino menjadi protein seberat
29.857 dalton. Pada Gambar 6a dari analisis SDS-PAGE tampak bahwa pada transforman
11, 24, 33, 40 maupun kontrol terdapat pita protein yang sejajar dengan coat protein SMV
sebesar <30.200 dalton. Setelah dideteksi secara immunoblotting SDS-PAGE pada Gambar
6b tampak bahwa pada kontrol tidak ada ekspresi coat protein SMV, sedang transforman
33 terekspresi coat protein SMV secara kuat dan pada transforman 11, 24 dan 40
terekspresi coat protein dengan ukuran lebih kecil dari standar cp-SMV.

D. Optimasi medium regenerasi dan induksi akar/tunas transforman

Kemampuan multiplikasi yang rendah menunjukkan sulitnya meregenerasi kalus

transforman. Hal ini dapat disebabkan kegiatan subkultur beruntun pada medium yang
sama. Medium yang digunakan untuk subkultur adalah medium MS + 0,3 mg/l NAA + 2
mg/l BAP yang juga merupakan medium terbaik untuk induksi kalus transforman. Namun
demikian subkultur sulit dilakukan karena banyak kalus yang mengalami browning dan
akhirnya mati, sehingga jumlah isolat dan jumlah koleksi isolat menurun dari subkultur
awal ke subkultur berikutnya.
Untuk meningkatkan keberhasilan subkultur dan multiplikasi isolat kemudian
dilakukan optimasi medium dengan variasi zat pengatur tumbuh dan hasilnya dapat dilihat
pada Tabel 3.
Tabel 3. Optimasi medium regenerasi dan induksi akar/tunas transforman

Perlakuan Medium Persentase Kesegaran Diameter Morfo-

 22

Browning(%) Kalus (%) Kalus (cm) genesis

MS + 0,3 mg/l NAA + 2 81,40 40,00 1,19 Kalus
mg/l BAP
MS + 0,5 mg/l NAA + 3 54,70 70,00 1,44 Kalus
mg/l BAP
MS + 0,1 mg/l NAA + 1 93,60 35,00 1,21 Kalus
mg/l BAP
MS 0 97,30 30,00 1,19 Kalus

MS+0,5 mg/l NAA + 3 99,20 30,00 1,85 Kalus

mg/l Kinetin
MS + 0,5 mg/l NAA + 5 96,70 30,00 1,62 Kalus
mg/l BAP
MS + 3 mg/l BAP 73,70 45,00 1,65 Kalus

Kriteria skoring kesegaran kalus :

> 75 % : Segar
50-75 % : Sedang
< 50 % : Kurang segar

Diantara medium yang dicoba, medium MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP
menghasilkan persentase browning terendah dengan kualitas kesegaran kalus sedang.
Peningkatan konsentrasi NAA dan BAP menyebabkan kalus yang sudah disubkultur
berkali-kali pada medium MS + 0,3 mg/l NAA + 2 mg/l BAP mampu beregenerasi kembali
dalam medium MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP. Gunawan (1987) menyatakan bahwa
subkultur beruntun pada medium yang sama menyebabkan pertumbuhan eksplan stagnan
dan dapat diregenerasi kembali dalam medium yang ditingkatkan konsentrasi ZPTnya dari
medium semula atau medium tanpa ZPT. Namun demikian peningkatan konsentrasi NAA
dan BAP belum mampu menginduksi akar/tunas sehingga morfogenesis kalus transforman
setelah subkultur VII masih terjadi secara tidak langsung yaitu melalui pembentukan kalus.
Untuk itu perlu dicoba ZPT jenis lain yang lebih efektif menginduksi akar/tunas, misalnya
Thidiazuron. Mok et.al (1987) menyatakan bahwa Thidiazuron merupakan turunan
fenilurea yang aktivitasnya lebih tinggi dibanding sitokinin lainnya.
 23

E.Substitusi medium pemeliharaan dengan pupuk daun dan air kelapa

Kalus yang diperoleh dalam kultur in vitro terus-menerus harus dipelihara agar
tidak mengalami kematian dan dapat disimpan sebagai koleksi atau bahan tanam
berikutnya. Pemeliharaan yang utama adalah subkultur yaitu memindahkan kultur dari
medium lama yang telah kehilangan kandungan unsur hara lengkap ke dalam medium baru
yang kandungannya sama dengan medium sebelumnya. Oleh karena komposisi medium
yang digunakan adalah MS maka diperlukan biaya cukup besar disebabkan bahan
penyusun medium MS merupakan senyawa pure analysis yang harganya cukup mahal.
Untuk itu dilakukan upaya mengganti atau mensubstitusi sumber hara dan zat pengatur
tumbuh yang ditambahkan. Sebagai pengganti sumber hara digunakan pupuk daun dan air
kelapa sebagai pengganti sitokinin. Pada Tabel 4 tersaji hasil rerata persentase browning,
diameter kalus dan kesegaran warna transforman kedelai yang diukur dengan teknik
skoring berdasar Munchell Colour Chart. Sedang visualisasi kalus pada substitusi medium
untuk multiplikasi dan induksi tunas/akar tersaji pada Gambar 7.
Tabel 4. Rerata persentase browning, kesegaran warna dan diameter kalus transforman
kedelai pada medium substitusi

Perlakuan Persentase Kesegaran Diameter Morfo

browning(%) warna (%) kalus(cm) genesis
MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 30,00 57,50 2,12 Tunas
% air kelapa
MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 69,00 48,88 1,92 Kalus
% air kelapa
MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP + 20 33,00 54,28 2,28 Kalus
% air kelapa
MS + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa 72,00 71,66 1,76 Kalus

Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP 91,80 49,23 2,26 Kalus
+ 20 % air kelapa
Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP 40,40 78,18 2,74 Kalus
+ 20 % air kelapa
Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP 46,00 61,66 2,70 Kalus
+ 20 % air kelapa
Hyponek +0,5 mg/l NAA + 20 % air 37,00 92,72 2,70 Kalus
kelapa
 24

Keterangan : semakin tinggi persentase warna akan menunjukkan kalus semakin hijau

Dari Tabel 4 dapat dilihat bahwa persentase warna tertinggi diperoleh pada medium
substitusi Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa (Gambar 7 H) diikuti medium
Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 % air kelapa (Gambar 7 F). Pada medium
tersebut diperoleh kalus dalam jumlah cukup tinggi dengan diameter 2,70-2,74 cm dan
semakin hijau kalus yang diperoleh (78,18 -92,72 %) dengan persentase browning yang
cukup rendah (37,:-40,40 %). Hasil ini lebih baik jika dibandingkan persentase warna
kalus yang ditanam dalam medium MS dengan variasi zat pengatur tumbuh buatan dan
alami.

Gambar 7. Pertumbuhan kalus transforman kedelai pada medium substitusi

Keterangan :
A= MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa
B= MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 % air kelapa
C= MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP + 20 % air kelapa
D= MS + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa
 25

E= Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa

F= Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BAP + 20 % air kelapa
G=Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BAP + 20 % air kelapa
H=Hyponek + 0,5 mg/l NAA + 20 % air kelapa

Dengan demikian pupuk daun Hyponek dapat menggantikan medium MS sebagai

sumber hara makro dan mikro serta air kelapa dapat menggantikan zat pengatur tumbuh
buatan. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Agung-Astuti et al., (2004) pada tanaman
kedelai non transforman bahwa penggunaan medium substitusi Hyponek ditambah air
kelapa menghasilkan persentase warna kalus kedelai yang lebih tinggi dari medium MS
ditambah NAA dan BAP. Namun demikian medium substitusi Hyponek ditambah air
kelapa belum mampu menumbuhkan tunas. Tunas hanya terbentuk pada medium MS + 0,5
mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa, meskipun tunas ini hanya bertahan 3 minggu
dan kemudian mati.

KESIMPULAN

1. Regenerasi kalus transforman kedelai cp-SMV mencapai 3 % pada subkultur VII,

yaitu 6 isolat dari 200 eksplan yang ditransformasi.
2. Diperlukan kalus seberat 2 gram untuk dapat dianalisis SDS-PAGE dengan
konsentrasi 10 uM.
3. Diperoleh konfirmasi adanya ekspresi coat protein SMV di dalam sel transforman
kedelai berdasar analisis immuno-dot-blot dan immunoblotting SDS-PAGE .
4. Medium MS + 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BAP + 20 % air kelapa dapat menginduksi
tunas transforman kedelai cp-SMV.
5. Hyponek dan air kelapa mampu mensubstitusi unsur hara dan ZPT pada medium
MS, namun belum mampu menumbuhkan akar dari kalus transforman kedelai
SARAN

1. Perlu dicoba sitokinin lain seperti Thidiazuron untuk menginduksi tunas/akar dari
kalus transforman kedelai
2. Dilakukan aklimatisasi pada planlet transforman cp-SMV
 26

3. Dilakukan uji stabilitas gen pada transforman cp-SMV dan uji ketahanan terhadap
virus SMV

TERIMA KASIH

DIRJEN DIKTI yang telah membiayai penelitian ini melalui HIBAH PEKERTI tahun
2004.

DAFTAR PUSTAKA

Agrios, G. N. 1988. Plant Pathology. 3th edition. Academic Press, Inc.

Agung-Astuti dan Diah R. 2000. Transformasi Daun Tembakau dengan

Agrobacterium Mengandung Gen Coat Protein SMV. Prosiding Seminar Nasional
BPPT.

Agung-Astuti, Etty H. dan Ainun, F. 2001. Pengaruh Konsentrasi NAA dan BAP
Terhadap Multiplikasi Kalus dan TunasTembakau Hasil Transformasi cp-SMV.

Agung-Astuti, E. Handayani, Innaka, A.R. dan Sismindari. 2002. Analisis Gen Coat
Protein SMV Tembakau Hasil Transformasi cp-SMV. AgroUMY XI (2) : 49-59.

Agung-Astuti, E. Handayani dan Herianto. 2002. Pengaruh Sterilisasi Eksplan Kecambah

Terhadap Pertumbuhan Kedelai Varietas Wilis Secara Kultur in vitro.

Agung-Astuti, E. Handayani dan A.S. Alim. 2002. Kajian Berbagai Konsentrasi Sterilan
dan Lama Perendaman Eksplan Kotiledon Kedelai Varietas Wilis Terhadap
Keberhasilan Kultur in vitro. Prosiding Seminar Nasional Kimia UNY.

Agung-Astuti, Innaka, A.R. dan E. Supanti. 2003. Substitusi Hara dan ZPT pada Medium
MS dengan Pupuk daun dan Air Kelapa untuk Multiplikasi Kalus Kedelai Hasil
Transformasi cp-SMV Secara In Vitro
 27

Agung-Astuti, Innaka,A.R., Sismindari dan Y.B. Sumardiyono.2003.Transformasi

Genetik Kedelai Melalui Agrobacterium: Strategi Perakitan Kedelai Transgenik
Tahan Virus SMV Yang Mengekspresikan Coat Protein-SMV. HIBAH PEKERTI
ANGKATAN I, TAHUN KE 1, DIKTI, Jakarta.

Agung-Astuti, Innaka,A.R., Sismindari dan Y.B. Sumardiyono.2004. Pengaruh Macam

Eksplan Terhadap efisiensi Transformasi Gen Coat Protein-SMV Pada Kedelai
Melalui Agrobacterium sp.Prosiding Seminar Nasional Biokimia dan Biologi
Molekuler PBBMI, Yogyakarta

Beachy, RN., M. Bendahmane, J.H. Fitchen, G. Zhang. 1997. Studies of Coat Protein-
Mediumted Resistance to Tobacco Mosaic Tobamovirus : Correlation between
Assembly of Mutant Coat Proteins and Resistance. Virology 71 (10) : 1942 – 7950.

Beachy, RN. 1998. Virus-resistant Transgenic Plants. In: Biotechnology in Plant Disease
Control. Wiley – Liss, New York.

Clark, W.G., J. Fitchen, A. Nejidat, C.M. Deom, R.N. Beachy. 1995. Studies of coat
protein-mediumted resistance to tobacco mosaic virus (TMV). II. Challenge by a
mutant with altered virion surface does not overcome resistance conferred by TMV
coat protein. J.G. virol. 76 ( 10 ) : 2613 –1617.

Eggenberger, A.L., D.M. Stark and R.N. Beachy. 1989. The Nucleotide Sequence of SMV
Coat Protein Region and its Expression in E. coli, Agrobacterium and Tobacco
Callus. J. Gen. Virol. 70 : 1853-1860

Nelson, R.S. 1988. Virus Tolerance, Plant Growth and Field Performance of Transgenic
Tomato Plant Expressing Coat Protein from TMV. Bio/Technology 6: 403-409.

Mantell, S.H., Matthews, J.A., McKee, R.A. 1985. Principle of Plant Biotechnology An
introduction To Genetic Engineering In Plants. Blackwell Scientific Publications.
Oxfords London Edinburgh. Boston Palo Alto Melbourne.
 28

Power-Abel, P., R.S. Nelson, B.D.N. Hoffmann, Roger, Fraky and R.N. Beachy. 1996.
Delay of Disease Development in Transgenic Plant That Express the TMV Coat
Protein Gene. Science 232 : 738-743

Semangun, H., 1991. Penyakit-Penyakit Tanaman Perkebunan di Indonesia. Gadjah Mada

Press. Yogyakarta.

Sheng, J. and V. Citovsky. 1996. Agrobacterium-Plant Cell DNA Transport : Have

Virulence Protein, Will Travel. The Plant Cell. 8 : 1699-1710

Sismindari dan Sujadi. 1996. Kloning Gen Coat Protein SMV dengan pendekatan PCR
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia. 2 : 36-39

Sumardiyono, Y.B., Wuye Ria Andayani, Susamto S. 1995. Karakterisasi dan serologi
Virus SMV. Makalah Kongres Nasional XIII PFI, Mataram.

Somaatmadja, S. 1988. Kedelai. Badan Litbang Pertanian P3TP. Bogor.

Tang, W. 2001. Agrobacterium-mediated transformation and assessment of factors

influencing transgene expression in loblolly pine (Pinus taeda L.). Cell Research 11
(3) : 237 – 243

Tang, W and Tian, Y. 2003. Transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) plants expressing a
modified d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis with enhanced resistance to
Dendrolimus punctatus Walker and Crypyothelea formosicola Staud. J. of
Exoerimental Botany 54 (383): 835 – 844.

Wang, Y., R.L. Nelson, Y. Hu. 1998. Genetic analysis of resistance to soybean mosaic
virus in four soybean cultivar from China. Crop Science 38 (4) : 922-925.
29