ISOLASI BAHAN ALAM

ABSTRAK

Natural Product meliputi: (1)seluruh organisme seperti tanaman,hewan atau mikroorganisme

yang belum mengalami pengolahan selain proses yang sederhana misalnya pengeringan. (2)
bagian dari suatu organisme seperti daun atau bunga dari tanaman,organ hewan yang
terisolasi. (3) ekstrak dari organisme atau bagian dari organisme,eksudat. (4) senyawa murni
seperti alkaloid,kumarin,flavonoid,glikosida,lignan,steroid,gula,terpenoid dan lain-lain yang
diisolasi dari tanaman,hewan atau mikroorganisme. Isolasi bahan alam penting untuk
farmasis mengingat banyak komponen bahan alam yang bermanfaat sebagai obat yang belum
diketahui secara pasti, isolasi dibutuhkan untuk mendapatkan isolat senyawa secara murni.

Tulisan ini bertujuan untuk membahas mengenai proses-proses isolasi yang telah
dikembangkan dari hasil penelitian, menggunakan metode penulisan studi pustaka didapatkan
berbagai penjelasan penting mengenai metode isolasi bahan alam diantaranya : Isolasi
dengan menggunakan Low Pressure Colomn Chromatography, Isolasi dengan metode Ion-
Exchange, Isolasi dengan HPLC preparative, isolasi dari bahan alam laut, isolasi dari bahan
microba dan follow up dari isolasi bahan alam.

Kata kunci : Isolasi, Bahan Alam, Metode Isolasi

Pustaka : Sharker, D., Satyajit., Latif, Z., & Gray, I.A., 2005, Natural Products Isolation,
2nd Ed, New Jersey, Humana Press.

Disusun Oleh : Canthika Anisa Abdullah (201310410311014), Nur Muhammad Aminullah

(201310410311015), Frestia Nur Anggani (201310410311015), Annisa Puspita Dewi
(201310410311016), Anitya Nor Azizah (201310410311017), Winda Hayati
(201310410311018), Dian Marlina Nur Hidayati (201310410311020), Chantika Fecillia S
(201310410311021), Yasintha Fadiah (201310410311022), Andri Apriandi R
(201310410311025)

Pendahuluan

Natural Product meliputi: (1)seluruh organisme seperti tanaman,hewan atau

mikroorganisme yang belum mengalami pengolahan selain proses yang sederhana misalnya
pengeringan. (2) bagian dari suatu organisme seperti daun atau bunga dari tanaman,organ
hewan yang terisolasi. (3) ekstrak dari organisme atau bagian dari organisme,eksudat. (4)
senyawa murni seperti alkaloid,kumarin,flavonoid,glikosida,lignan,steroid,gula,terpenoid dan
lain-lain yang diisolasi dari tanaman,hewan atau mikroorganisme. Dalam banyak kasus
kebanyakan natural produk merujuk ke metabolit sekunder yang dihasilkan organisme yang
tidak diperlukan untuk kelangsungan hidup organisme tersebut.

Penelitian terkait Natural Product telah berkembang selama beberapa dekade

terakhir. Secara luas penelitian tersebut dibagi menjadi dua kategori yaitu:
 1. Strategi lama yaitu yang lebih berfokus pada senyawa kimia dari sumber alami
tetapi tidak pada aktivitasnya dan penelitiannya lebih berfokus terutama pada in
vivo.
2. Strategi modern(bioassay guide) yaitu penelitian yang berfokus pada aktivitas
yang dihasilkan oleh senyawa kimia yang berasal dari natural produk serta
berfokus terutama pada in vitro.

Tujuan Penulisan
Penulisan artikel ini dilakukan untuk itu juga untuk menjelaskan secara terperinci
mengenai kriteria dan berbagai macam isolasi bahan alam yang digunakan dan telah
diterapkan diberbagai penelitian khususnya penelitian mengenai penemuan bahan aktif baru
dalam suatu bahan alam.

Metode Penulisan           
 Metode penulisan yang digunakan adalah metode studi pustaka. Data yang diperoleh
berasal dari Buku dan Jurnal ilmiah tentang isolasi bahan alam.

Pembahasan

Isolasi Pada Natural Product

Faktor penting yang harus dipertimbangkan sebelum merancang sebuah proses isolasi
adalah sifat senyawa target yang ada pada ekstrak kasar atau fraksi. Hal yang perlu
diperhatikan untuk memastikan proses isolasi meliputi kelarutan (hidrofobik atau hidrofilik),
sifat asam basa, biaya, stabilitas dan ukuran molekul. Jika mengisolasi senyawa yang sudah
dikenal sangat mudah mendapatkan informasi terkait dengan profil kromatografi dari
senyawa terkait pada literatur yang telah dibuat. Namun ketika ingin mengisolasi senyawa
yang sama sekali baru dan belum dikenal, disarankan melakukan tes kualitatif untuk
kehadiran beberapa senyawa seperti fenolat, steroid, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain serta
melakukan analisis TLC atau Kromatografi Lapis Tipis atau HPLC profilling.

Beberapa contoh percobaan untuk memastikan proses isolasi yang akan dilakukan
adalah sebagai berikut:

a. Hidrofobisitas atau hidrofilisitas. Sebuah indikasi polaritas dari ekstrak dapat

ditentukan dengan pengeringan sebuah aliquot dari campuran dan mencoba
melarutkan kembali dalam berbagai pelarut yang memiliki kisaran polaritas
misalnya air, metanol, esetonitril, petroleum eter, n-heksana kemudian diikuti oleh
assy untuk menentukan distribusi senyawa dalam fraksi pelarut.
b. Sifat asam-basa: Melaksanakan partisi dalam pelarut berair nilai PH antara 3.7 dan
10. Dapat membantu menemukan sifat asam basa dalam senyawa ekstrak
c. Mengisi informasi terkait muatan senyawa yang dapat diperolah dari kondisi
pengujian dalam batch, pengaruh penambahan berbagai ion penukar ke campuran.
Informasi ini sangat berguna untuk merancang protokol isolasi yang melibatkan
pertukaran ion.
 d. Satabilitas terhadap temperatur panas. Tes ini melibatkan inkubasi sampel ekstrak
pada suhu 90 derajat celcius selama 10 menit dalam bak air. Hal ini penting untuk
isolasi bioassay. Dimana pemecahan senyawa aktif menyebabkan hilangnya
aktivitas.
e. Ukuran. Dengan menggunakan dialisis tubing yang dapat digunakan untuk
menguji apakah ada makromolekul misalnya: protein yang hadir dalam ekstrak.

Isolasi Natural Product diklasifikasikan menjadi dua kategori yaitu teknik kromatografi
klasik dan teknik kromatografi modern. Tekni kromatografi klasik meliputi: Kromatografi
Lapis Tipis (TLC), Preparat Kromatografi Lapis Tipis (PTLC), Kromatografi Open Kolom
(CC), Kromatografi Flash (FC). Sedangkan untuk Kromatografi Modern terdiri dari:
Kinerja Tinggi Kromatografi Lapis Tipis (HPTLC), Multiflash Kromatografi (contohnya
Biotage), Vacuum Liquid Chromatography (VLC), Chromatotron, Solid-phase extraction
(contohnya Sep-Pak), Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC), High-
performance Liquid Chromatography (HPLC), Hyphenated techinuques (HPLC-PDA,LC-
MS,LC-NMR,LC-MS-NMR).

Isolasi Produk Natural dengan Kolom Kromatografy Tekanan Rendah (LPCC)

Proses Pemisahan

Salah satu prinsip dasar pemisahan komponen dalam cairan kromatografi (LC) Pemisahan
mengambil dan menempatkan melalui distribusi selektif komponen antara fase gerak dan fase
diam. Namun ada sejumlah faktor, terkait dengan sifat fisik dan kimia dari fase gerak dan
fase diam, serta zat terlarut yang mengendalikan berbagai interaksi antara zat terlarut dan dua
fase, yang terlibat dalam proses pemisahan. Interaksi antara zat terlarut dan fase diam
(Adsorben) tergantung pada ukuran partikel dari fase diam.Ketika lebih besar luas permukaan
fase diam, semakin banyak jumlah interaksi. Keseimbangan antara zat terlarut dan fase diam
disebut konstanta distribusi.

Perbedaan tipe proses pemisahan pada LPLC (low-pressure liquid column chromatography)

1. Adsorption

Dengan mekanisme molekul analit dipertahankan oleh interaksi mereka dengan permukaan
fase diam pemisahan didasarkan terutama pada perbedaan antara afinitas adsorpsi molekul
analit untuk permukaan fase diam. Luasnya adsorpsi molekul analit dalam fase diam diatur
oleh sejumlah faktor; Ikatan hydrogen, va der waals, interaksi dipole-
dipole,kompleksasi.Pemilihan fase gerak yang tepat dan fase diam sangat penting untuk
pemisahan secara sempurna memaksimalkan pengembalian pelarut dan menghindari adsorpsi
irreversible pada bahan.

2. Size-Exclusion

Sering disebut SEC dan GPC ketika pelarut organic yang digunakan. Ketika air maka disebut
gel filtration chromatography (GPC). Pemisahan molekul menurut volume hidrodinamik
mereka. Fase diam yang digunakan ialah yang berpori kira-kira sama dengan partikel bahan.
Maka ukuran molekul besar tidak serta merta langsung dapat masuk, ukuran sedang dapat
masuk bagian dari pori dan bagian molekul yang kecil bisa leluasa untuk masuk. Akibatnya,
molekul mengelusi dalam rangka penurunan ukuran; yang terbesar dielusi dari kolom
pertama dan yang terakhir terkecil.

3. Tipe Fase diam

Untuk LPLC umumnya antara 10 dan 200 mikrometer yang mana pada HPLC 2 dan 10
mikrometer.

3.1. Adsorpsi Fase Diam

3.1.1 Silica Gel

Adalah fase diam yang terumum yang digunakan untuk pemisahan produk alami. Juga
tersedia di pasaran dalam bentuk range luas. Ini pilihan pertama dalam penyerap LPLC.
Dianggap polar. SiO2H2O. Permukaan silika gel terdiri dari kelompok silanol terkena, dan
kelompok-kelompok hidroksil membentuk pusat-pusat aktif. senyawa polar yang
mengandung asam karboksilat, amina, atau amida yang kuat diserap pada silika gel. Pelarut
nonpolar digunakan untuk kromatografi dengan silika gel meliputi pentana, heksana, dan
diklorometana (DCM), sedangkan etil asetat (EtOAc), metanol (MeOH), dan asetonitril
(ACN) adalah contoh dari pelarut polar.

3.1.2 Ikatan Fase diam

Silica gel dapat dimodifikasi dengan cara mengubah sifat fisik dan perilaku kromatografi.
Tujuannya sendiri adalah untuk melindungi grup aktif silanol dan dapat bertemu, berikatan
secara maksimal paad adsorbent. Silanol dapat diblock dengan macam dari silychlorida untuk
menghasilkan senyawa yang nonpolar atau semipolar. Contoh alkohol atau hidroksil fenolik,
amina, fenil, karbonil

3.1.3 Alumina

Polimer berpori dari aluminium oksida (Al2O3) dan dapat diproduksi dengan pH asam, basa,
atau netral untuk permukaan adsorbentnya. Alumina asam ph=4 digunakan untuk
memisahkan asam karboksilat, alumina basa ph=10 dapat digunakan untuk pemisahan
alkaloida, sedang alumina netral ph=7,0 cocok digunakan untuk pemisaahn komponen non
polar seperti steroid.

3.1.4 Polystrene

Polimer dari styrene-diviniyl benzene merupakan dasar biasanya digunakan pada ion-
exchange resin. Dengan tidak adanya kelompok pengion, polimer dapat membentuk gel yang
dapat digunakan sebagai adsorben dalam tekanan rendah kromatografi fase terbalik. Contoh
MCI Gel CHP20p dan SEPABEADS SP 20ms, tersedia dalam partikel ukuran cocok untuk
HPLC serta untuk HPLC.

3.2 Size-Exclusion Fase Diam

3.2.1 Polyacrylamide

Kopolimerasi dari akrilamida dan N,N’-methylene-bis-acrylamide memimpin formasi batch

polyacrylamide berpori Bio-Gel, P-Gels. Dapat digunakan sebagai pemurnian produk alami
makromolekul, misalnya, karbohidrat, peptida, dan tanin. Akan mengembang pad air maka
digunakan fase gerak yang polar biasanya air walau kadang dapat 20%alkohol toleransi untuk
meningkatkan kelarutan sampel.

3.2.2 Karbohidrat

Untuk produk alam yang tidak stabil kromatografi yang sering digunakan ialah bahan netral
dari polimer karbohidrat. Sephadex siap dengan ikatan silang larut dalam airdextran dengan
epichlorohydrin. Untuk pemurnian bahan alam yang biasa digunakan G-10 dan G-15.
Adapula yang dapat mengembang pada pelarut organic yaitu dimetilformamida, sulfoksida
dimetil, etilena glikol, dan berair MeOH.

4.Operasi Kolom
Bagian ini terutama berurusan dengan system operasi LPLC, dengan pertimbangan
pilihan fase diam maupun fase gerak. Bungkusan kolom dengan tempat fase dan
tempat aplikasi sampel berada di atas bungkusan kolom. Tempat pelarut berada di
atas fase diam dan akan mengalir kekolom menggunakan gaya gravitasi. Hasilfraksi
akan dikumpulkan oleh alat fraksinator setelah pemisahan terjadi. Akan jauh lebih
mudah ketika kita sudah tau jenis senyawa apa yang akan diteliti alkaloid, flavonoid,
dan atau steroid.
4.1 Penyeleksian fase diam

Untuk sampel misalnya dengan senyawa polaritas yang tidak diketahui TLC pasti dapat
digunakansebagai fase diam karena plat TLCdilapisi sebagian besar fase diam seperti silica
gel,alumina.

4.2 Packing column dan keseimbangan

Kolom biasanya dilapisi dengan chromatographer sebelum digunakan. Namun sekarang

sudah tersedia kolom dengan berbagai fase diam dan ukuran. Bahan bahan yang setelah
digunakan pada kolom biasanya dibuang untuk mencegah kontaminasi pada sampel
selanjutnya.. Sephadex LH-20 dapat digunakan kembali setelah dicuci bersih. Kolom LPLC
umumnya terbuat dari kaca berdinding tebal yang mana kebal dari kebanyakan solven dan
juga berfungsi menahan tekanan rendah dari media pada saat pengembangan kolom.

4.3 Slurry Packing

Metode ini hanya digunakan ketika fase diam mengembang pada Carbohydrat. Untuk
menyiapkan slurry jumlah yang diperlukan fase diam diambil dalam gelas kimia, pelarut
ditambahkan, dan campuran diaduk. Jika perlu sejulah lebih pelarut dapat ditambahkan untuk
menerima konsisten yang bagus pada slurry seperti bubur., yang mana sebaiknya tidak ada
udara yang terjebak dalam kolom.

4.4 Dry Packing

Jika dilakukan dengan tepat maka akan menjadi suatu metode efisien pada kolom dan biasa
digunakan pada ikatan atau silica. Fase diam diletakkan pada kolom lalu yang penting dalam
bagian ini adalah kolom akan digetarkan beberapa saat maka keutuhan kolom harus dijaga
agar tidak terlalu terguncang. Dengan jalan lain dapat kolom dapat disadap dengan cincin
gabus selama proses pengisian, Kemudian fase diam dibasahi menggunakan pelarut yang
sesuai
5.Aplikasi Sampel

Pengembanagn Kolom

Kolom dapat dikembangkan melalui eluasi dengan berbagai macam metode. Fase gerak dapat
turun dengan menggunakan prinsip gravitasi. Gradien pelarut perlu dikontrol meskipun
pelarut isokratik lebih disukai.

5.1. Gradien Formasi

Pemisahan

5.2 Gravisitas

Secara umum hasil yang baik didapat dari eluasi gravitasdimana ukuran partikellebih besar
dari 600 mikrometer. Ukuran yang terlalu kecil dapat memungkinkan adanya tekanan balik.
Yang mana eluen tidak dapat melewati kolom.

5.3 Tekanan

5.4 Vacuum

Menerapkan tekanan di akhir kolom saja.

5.5 Pompa

Sistem pengirim pelarut terkendali. Hal ini memberikan kelancaran arus dan pada keadaan
stabil dan konstan konsentrasi pelarutnya.Pompa harus inertdan dirancang untuk dapat
digunakan pada pelarut yang mudah terbakar. Resolusi pemisahan dicapai dengan teknik-
teknik kromatografi berikut: HPLC> MPLC> LPLC. Run time juga berkurang jauh dengan
urutan sebagai berikut: LPLC> MPLC> HPLC.

6.Pendeteksi
Selama isolasi produk alami dapt dianalisis profiling sebelum pengisian kimia menggunakan
TLC atau HPLC (gunakan autosampler). Dapat pula menggunkan sinar Uv. Panjang
gelombang uv variable mungkin saja satu fraksi detector memerlukan panjang gelombang
yang berbeda.

Isolasi Dengan Metode Ion-Exchange

Di masa lalu, kromatografi pertukaran ion (IEC) teknik telah diterapkan untuk isolasi produk
alami. Metode yang digunakan untuk pemisahan senyawa bermuatan atau terionisasi, properti
yang terdapat pada sejumlah besar produk alami.aplikasinya sebagai teknik untuk pemisahan
produk alami yang digambarkan dalam beberapa tahun untuk isolasi dan pemisahan asam
amino dari hidrolisis protein. Hal ini terus digunakan secara luas bahkan hari ini dalam
konteks analisis dan pemisahan protein dan nukleotida.

Masalah utama yang dihadapi tentang isolasi produk alam adalah tantangan isolasi senyawa
dari campuran heterogen senyawa, ada dalam konsentrasi rendah, biasanya karena kelarutan
mereka yang terbatas dalam matriks lingkungan mereka. Dalam penerapan metode
pertukaran ion akan mencapai keduanya baik ekstraksi berkonsentrasi tinggi dan selektif
molekul target yang diinginkan adanya pengelompokan ionisasi atau muatan dalam struktur
molekul berfungsi sebagai dasar dari proses manipulatif. langkah pemurnian dengan metode
pertukaran ion telah terbukti sangat bermanfaat dalam isolasi senyawa dari ekstrak mentah
dan kaldu fermentasi. Pada prinsipnya, metode ini memungkinkan pengembangan siap skala
hingga produksi manufaktur, proses dicapai secara efisien dan dengan keuntungan ekonomi.
Yang terakhir ini jelas ditunjukkan oleh penggunaan proses berdasarkan pertukaran ion
dalam banyak produksi industri antibiotik.

2. Teori Ion-Exchange

Dasar dari proses pertukaran ion adalah mengikat reversibel molekul bermuatan dengan
matriks insoluble dengan muatan berlawanan.. Sebuah molekul bermuatan (M) berinteraksi
dengan kelompok molekul bermuatan berlawanan (G) yang melekat pada resin matriks
pendukung (R) dan dipertahankan oleh perpindahan dari ion lawan (C). Karena gugus
fungsional pada matriks pendukung dapat membawa baik muatan negatif atau positif,
pertukaran ion lawan memberikan baik resin kationik atau resin anion. Proses ini diwakili
oleh persamaan berikut:

Cationic exchange :

R-G-C+ + M+  R-G-M+ + C+

Anionic exchange :

R-G+C- + M-  R-G+M- + C-

Sebagian besar molekul organik yang dikenakan adalah hasil dari kehadiran asam lemah
terionisasi atau kelompok dasar. Muatan pada molekul dapat disesuaikan dengan perubahan
pH. Persamaan Henderson-Hasselbach memprediksi bahwa asam organik akan sepenuhnya
dipisahkan untuk membentuk anion di dua unit pH di atas nilai pKa asam, sementara amina
sepenuhnya terprotonasi untuk menghasilkan kation hingga dua unit pH di bawah nilai pKa
asam konjugasi mereka. Akibatnya, sebagian besar asam karboksilat akan membawa muatan
negatif pada pH di atas 6,0, menyebabkan retensi pada resin pertukaran anion membawa
sekelompok bermuatan positif. Amina umumnya terprotonasi pada pH di bawah 8,0 dan akan
dipertahankan pada resin pertukaran kation membawa gugus fungsi bermuatan negatif. Agar
molekul bermuatan dapat dipertahankan pada resin, harus menggantikan ion lawan yang
terkait dengan resin. Kesetimbangan yang terlibat dapat dinyatakan dalam konstanta partisi
(Kp), yang merupakan rasio konstanta disosiasi untuk mengikat kelompok bermuatan pada
resin dengan ion lawan (Kc) atau molekul bermuatan (Km).

Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi menggunakan ion exchange :

1. Tarikan Muatan

Efektivitas proses pertukaran ion akan tergantung pada afinitas kelompok resin yang
dikenakan terhadap ion (dinyatakan sebagai Kc dan Km) dan konsentrasi relatif mereka ([C]
dan [M]). lebih tinggi ion terpolarisasi akan lebih kuat ke resin pertukaran. ion polivalen
biasanya memiliki afinitas yang lebih besar untuk resin bermuatan daripada ion monovalen,
sebagai akibat dari beberapa mengikat pada lebih dari satu dibebankan kelompok pada resin.

2. Peran ion lawan

Kehadiran ion lawan mempertahankan netralitas muatan dari resin. Reversibilitas proses
mengikat dapat dimanipulasi oleh Isolasi dengan metode Ion-exchange mengubah
konsentrasi ion lawan atau substitusi dengan ion lawan dengan afinitas yang lebih besar
(peningkatan nilai Kc). Meskipun afinitas ion lawan untuk resin dapat dipengaruhi oleh sifat
dari resin itu sendiri, afinitas anion resin biasanya mengikuti urutan meningkat:

hidroksida <asetat <bikarbonat, format <klorida <fosfat, sitrat.

Urutan ini menggambarkan mengapa ion klorida (afinitas yang lebih besar) yang efektif di
eluting anion karboksilat (diwakili oleh asetat dari afinitas yang lebih rendah) dari resin
penukar anion.

Meningkatnya Afinitas kation menuju penukar kation diberikan oleh urutan berikut:

lithium <hidrogen <natrium <amonium <kalsium.

Dalam hal ini, jelas bahwa ion natrium tidak akan sangat efektif dalam eluting amina (pada
pH di mana mereka ada sebagai bermuatan positif ion amonium) dari resin penukar kation.

3. Interaksi hidrofobik

Meskipun interaksi antara ion dan resin terutama dipengaruhi oleh interaksi muatan, efek
yang signifikan dapat terjadi karena interaksi hidrofobik tambahan antara residu dari struktur
resin matriks dan gugus fungsi tak bermuatan dari molekul teradsorpsi. Efek nonionik
berkontribusi pada proses adsorpsi dan retensi secara keseluruhan, tetapi mungkin sebagian
besar dikurangi dengan memanfaatkan efek memodifikasi pelarut organik untuk
meminimalkan efek partisi tersebut.

4. Kapasitas pertukaran dan Tingkat Proses

Kemampuan resin pertukaran untuk menyerap molekul akan tergantung pada densitas
atau jumlah kelompok bermuatan per unit massa dari resin. Ini mungkin bisa dinyatakan
sebagai jumlah miliekuivalen ion teradsorpsi per gram resin (meq / g). Oleh karena itu, resin
dari kapasitas 2 meq / g memiliki kapasitas teoritis untuk menyerap 2 mmol monovalen atau
1 mmol divalen dibebankan molekul per gram resin. Tingkat proses pertukaran ion akan
tergantung pada '' ketersediaan '' dari kelompok berinteraki

5. Bahan untuk Ion-exchange

resin biasanya dalam bentuk partikel air-larut atau butiran. Bahan matriks yang tidak larut
adalah secara kovalen terikat pada kelompok bermuatan negatif atau positif. pertukaran ion
berlawanan terkait dengan kelompok-kelompok ini dan menjaga netralitas dari fase. Matriks
yang mendukung mungkin didasarkan pada sejumlah bahan polimer, yang meliputi polimer
sintetis, silika, atau polisakarida. Berikut diuraikan jenis bahan yang digunakan untuk matriks
resin dan bahan kimia alami dari pengikatan kelompok ion-exchange.

Matriks Pendukung
 Polystyrene Resins
 Carbohydrate Polymers
 Silica Gel
 Gugus Fungsi
 Anion Exchangers
 Cation exchangers
6. Column Operation
a. Selection of Packing Material
Jika muatan pada zat terlarut diketahui, maka pemilihan pertukaran ion jenis
resin adalah jelas. Misalnya, isolasi senyawa dasar yang mengandung gugus
amina akan mendorong penggunaan awal dari resin pertukaran kation kuat
(SCX). Titik awal dari pemisahan produk alami akan sering membutuhkan
isolasi senyawa struktur yang tidak diketahui. Sebuah strategi untuk mencapai
fase resin cocok untuk pemisahan harus didasarkan pada percobaan awal
menggunakan serangkaian kolom penyelidikan, dielusi dalam kondisi yang
berbeda.
b. Resin Preparation
persiapan yang cermat dari resin pertukaran ion merupakan prasyarat penting
untuk pemisahan yang sukses. Komersial resin tersedia biasanya
membutuhkan tingkat pengkondisian.
1. Washing
 Pencuci awal resin menghilangkan kotoran dan '' butir halus '' yang
dihasilkan dari proses pembuatan atau penyimpanan. literatur produsen
untuk prosedur pencucian dianjurkan untuk mencuci resin mereka.
mencuci resin polimer dengan metanol atau pelarut yang mensimulasikan
proses elusi akan meminimalkan kemungkinan kontaminan yang tidak
diinginkan dalam produk akhir.
2. Swelling
Proses penting kedua dalam persiapan resin adalah pengembangan resin.
Proses pengembangaan masing-masing berbeda untuk gugus-gugus
fungsional dalam interior resin untuk fase gerak, kelompok hydrating, dan
ion yang berlawanan dengan menembus pori-pori. Secara khusus,
mensuspensikan polimer karbohidrat dalam air mungkin tidak
menghasilkan pengembangan sempurna. Gugus fungsional bermuatan
dalam matriks hidrofilik mungkin tetap terikat hidrogen, tidak tersedia
untuk proses pertukaran, dan membatasi kapasitas resin.
3. Resin Cycle
Siklus resin sangat penting. resin dapat secara komersial dipasok dalam
bentuk ion lawan, yang tidak langsung cocok untuk digunakan. Konversi
dari resin dari satu siklus ke yang lain dapat dicapai dengan perlakuan
dengan volume besar larutan ion lawan yang diinginkan, diikuti oleh
volume besar air untuk membuang kelebihan ion. Konversi siklus yang
paling biasa untuk penukar kation berasal dari hidrogen untuk siklus
natrium, dan untuk penukar anion dari klorida untuk siklus asetat.
c. Column-Size Selection
kriteria penting dalam memilih kolom adalah volume dan bentuk. Volume
tempat resin harus dipilih yang beberapa kali kapasitas pertukaran yang
diharapkan. Jika jumlah sampel diketahui, volume ini dapat dihitung dari data
resin produsen '. Untuk situasi di mana ukuran sampel tidak pasti, volume
tempat resin harus 0,1-0,05 volume beban yang diterapkan dari larutan.
Sebuah diameter lebar kolom pendek dengan ketinggian tidur 10-20 cm
biasanya lebih baik.
d. Sample Loading
Pemuatan sampel dalam proses isolasi sering berasal dari kultur seluler.
Sampel harus diklarifikasi sebelum pemuatan, sebagai biomassa akan melapisi
sisa resin dan serius menghambat penetrasi zat terlarut dalam pori-pori resin.
Sentrifugasi adalah metode yang disukai untuk mengklarifikasi, karena filtrasi
dapat mengakibatkan serapan non spesifik pada salah satu kertas saring
(selulosa) atau bantuan filter (silika). Sampel dapat dimuat ke resin oleh salah
satu dari dua metode: '. Kolom' atau 'Batch'. Resin dan sampel diklarifikasi
dicampur bersama-sama untuk waktu yang cukup (15-30 menit) untuk
memungkinkan ion adsorpsi -exchange. resin dapat dipulihkan dengan filtrasi
melalui saringan kasar atau dekantisasi menghabiskan pelarut dan kemudian
bubur dikemas untuk elusi. Atau dalam metode kolom, resin disiapkan adalah
bubur dikemas ke dalam kolom, diperbolehkan untuk menetap di tempat, dan
 kemudian sampel diterapkan. Waktu aliran Isolasi oleh metode Ion-Exchange
dari 10-20 menit (5-10 mL / menit untuk kolom 100 mL) diperlukan untuk
penerapan sampel untuk memastikan bahwa molekul berdifusi ke pori-pori
resin dan terserap
e. Elution
i. Ionic Strength
ii. Elusi zat terlarut terikat dari resin dapat dicapai dengan baik dengan
penyesuaian kekuatan ion atau perubahan pH. Penggunaan konsentrasi
garam yang tinggi menyebabkan perpindahan zat terlarut oleh
pergeseran keseimbangan dalam mendukung counterion terikat.
Natrium klorida dapat digunakan untuk mengelusi zat terlarut dari
kedua kationik dan anionik pertukaran kolom dengan pertukaran ion
yang sesuai dengan zat terlarut dikenakan pelengkap.
iii. pH Adjustment Alternatively
penyesuaian pH dapat mengubah muatan pada zat terlarut atau dalam
kasus resin pertukaran lemah pada resin itu sendiri. Perubahan pH
dapat mencapai elusi lebih selektif zat terlarut dengan menghapus
muatan pada zat terlarut sehingga tidak lagi terikat resin. Sebuah asam
karboksilat mengandung zat terlarut dapat diserap pada resin anion
pada pH 6,0 dan dielusi pada pH 4,0 ketika anion karboksilat menjadi
terprotonasi dan bermuatan. Hal ini mungkin, bagaimanapun, secara
signifikan mengubah kelarutan zat terlarut menyebabkan curah hujan
atau interaksi hidrofobik polimer resin mengakibatkan retensi zat
terlarut dalam resin.
iv. Cosolvents
Penggunaan pelarut air-larut seperti metanol atau asetonitril dengan
baik strategi untuk elusi, kekuatan ion atau penyesuaian pH, berguna
untuk mengganggu interaksi hidrofobik antara resin dan molekul
netral. Sebuah pelarut sangat berguna untuk elusi anion dari resin
penukar anion seperti Dowex-1 adalah larutan 3% amonium klorida
(kira-kira 0,5 M) di 90% metanol dalam air. campuran garam organik
dari piridin dan asam asetat, yang komposisi dapat disesuaikan untuk
memberikan berbagai nilai pH
v. Solvent Gradients
elusi gradien dapat dilakukan '' bertahap '' atau dengan '' halus '' gradien
bertahap. Sedangkan untuk percobaan penyelidikan hasil yang
memadai dapat diperoleh dengan menggunakan teknik bertahap,
gradien halus biasanya lebih efektif dan dapat segera diproduksi.
Sebuah gradasi yang halus sederhana dapat dihasilkan dengan
penambahan konstan komponen pelarut kedua reservoir pencampuran
yang berisi elusi pelarut awal.
Isolasi Dengan Metode HPLC Preparatif

Penggunaan HPLC preparatif telah menjadi andalan dalam mengisolasi produk

alami selama 10 tahun terakhir. HPLC preparatif adalah teknik yang serbaguna dan biasanya
cepat, dimana senyawa dapat dimurnikan dari campuran kompleks. Perbedaan utama antara
HPLC preparatif dan 'sistem' tekanan rendah kolom kromatografi lainnya adalah konsistensi
dan ukuran partikel dalam fase diam. Distribusi ukuran partikel sangat penting ketika
digunakan untuk memisahkan campuran dari dua senyawa, karena semakin kecil ukuran
partikel, semakin baik pula kekuatan yang dibutuhkan untuk memisahkan dua senyawa. Rata-
rata ukuran partikel fase diam HPLC preparatif biasanya antara 3 dan 10 mm, jauh lebih kecil
daripada fase stasioner lain dan distribusi ukuran menjadi sempit. Hal ini meminimalkan
terjadinya void atau saluran, yang akan mengganggu fase gerak bepergian secara serentak
melalui fase diam dan menyebabkan pemisahan tidak efisien. Luas permukaan yang tinggi
tersedia untuk zat terlarut yang berinteraksi dengan fase diam dalam kromatografi dengan
kekuatan resolusi tinggi yang diperlukan untuk memurnikan campuran produk alami yang
kompleks.
Produk alami tunggal maupun campuran kadang-kadang bisa terdiri dari ratusan
senyawa. Diperlukan teknik yang cepat dan efisien untuk memurnikan keluarnya senyawa
tersebut. Namun, persyaratan akhir senyawa murni adalah ukuran dan skala teknik isolasi
yang digunakan. Jika jumlah mikrogram senyawa yang menjadi perhitungan utama, maka
pemurnian kadang-kadang dapat dilakukan dengan menggunakan sistem HPLC skala analitis
dengan diameter kolom sekitar 4,6 mm. Sistem preparatif HPLC skala laboratorium
diperlukan untuk mengisolasi jumlah miligram yang dibutuhkan untuk NMR atau X-ray
kristalografi.
Bahan dan metode yang digunakan untuk mengisolasi produk alami oleh HPLC
preparatif juga tergantung pada jenis senyawa yang ditemui dalam ekstrak dan juga
tergantung pada prosedur ekstraksi. Ekstrak tanaman yang polar bila dilakukan dengan
menggunakan etanol akan berbeda secara substansial dalam senyawa yang ditemui jika
tanaman yang sama diekstraksi dengan n-heksana. Oleh karena itu, polaritas dari campuran
senyawa merupakan faktor penentu utama untuk metode HPLC preparatif yang akan
digunakan.
Artikel ini memfokuskan pada aspek-aspek praktis dalam melaksanakan pemisahan
HPLC preparatif skala laboratorium untuk memurnikan produk alami (fase stasioner,
instrumentasi, dan pelarut yang digunakan). Ini mencakup mode pemisahan dengan HPLC
preparatif dan memilih mode yang tepat untuk mencapai pemisahan, penyiapan instrumentasi
dan metode deteksi, persiapan sampel, metode pengembangan, dan cara kerja sampel.
1.1 Mode Pemisahan dan Fasa Diam
Pemurnian dengan HPLC preparatif biasanya menggunakan salah satu dari empat
model kromatografi: fase normal, fase terbalik, kromatografi permeasi gel (GPC), dan
kromatografi pertukaran ion. Model ditentukan oleh fase diam dan kolom preparatif yang
digunakan, serta pelarut yang digunakan untuk elusi tergantung pada kompatibilitas ekstrak
atau campuran dengan kolom yang berbeda model.
a. Fase normal HPLC preparatif
Senyawa dipisahkan oleh adsorpsi ke permukaan fase diam polar karena mengelusi
bawah kolom dan afinitasnya harus nonpolar. Secara umum, semakin polar senyawa,
semakin besar kemungkinan akan diserap ke fase diam, dan senyawa kurang polar
akan dielusi pertama dari kolom. HPLC fase normal paling cocok untuk senyawa
lipofilik, rantai panjang turunan alkana. HPLC fase normal telah digantikan oleh
HPLC fase terbalik. Eluen yang dgunakan dalam HPLC fase yang normal biasanya
campuran hidrokarbon alifatik (n-heksana, n-heptana), hidrokarbon terhalogenasi
 (kloroform, diklorometana), hidrokarbon teroksigenasi lebih polar (dietil eter, etil
asetat, aseton), atau pelarut hidroksilasi seperti isopropanol dan metanol.
b. Fase Terbalik HPLC preparatif
Teknik ini adalah kebalikan dari HPLC fase normal, dimana fase diam lebih
nonpolar dari pelarut. Eluen yang digunakan dalam HPLC fase terbalik umumnya
terdiri dari campuran air dan pelarut organik, biasanya asetonitril (MeCN), metanol
(MeOH), atau tetrahidrofuran (THF). Selain itu, buffer, asam, atau basa dapat
ditambahkan untuk menekan senyawa ionisasi atau untuk mengontrol tingkat ionisasi
gugus silanol yang tidak bereaksi.
c. Kromatografi permeasi gel
Juga disebut ukuran kromatografi eksklusi, digunakan untuk fraksionasi dan
memurnikan protein dan oligosakarida tetapi pernah juga digunakan untuk
memisahkan senyawa dengan melihat berat molekulnya. Fase stasioner biasanya
terbuat dari partikel berpori yang kaku dari kopolimer polistiren/difinilbenzena. Fase
stasioner secara inheren hidrofobik (mirip dengan bahan fase terbalik). Senyawa
dipisahkan oleh kemampuan mereka untuk memasuki pori-pori, molekul yang lebih
kecil ''terjebak'' sementara di pori-pori, sementara molekul yang lebih besar tidak
melewati kolom yang relatif tanpa hambatan, biasanya digunakan dalam pemurnian
biomolekuler.
d. Kormatografi pertukaran Ion
Menggunakan anionik atau fase diam kationik untuk pemisahan asam dan amina.
Senyawa dengan muatan bersih mengikat secara reversibel dengan kelompok
terionisasi pada fase diam dan dielusi melalui perpindahan dalam eluen.

1.2 Pelarut dan Buffer

Pelarut yang digunakan dalam HPLC biasanya harus:
 Dari kemurnian tinggi untuk menjaga integritas sistem dan sampel
 Kompatibel dengan detektor dan tidak mengganggu pengamatan senyawa sasaran
 Kompatibel dengan sampel (kelarutan dan reaktif)
 viskositas rendah untuk menjaga sistem tetap dalam kondisi tekanan rendah
 Cukup murah (ciri khas dari HPLC preparatif dapat menggunakan 1L atau lebih
pelarut setiap kalinya
Penggunaan buffer berguna ketika senyawa tidak diketahui, dan penggunaan sejumlah kecil
asam atau basa dalam tahap pengembangan metode dapat sangat membantu dalam mencapai
kromatografi yang baik.

1.3 Metode
1) Pengaturan instrumentasi
o Sistem pengendali: komputer kecil, yang mengontrol pompa, tingkat, dan komposisi
pelarut dalam biner, terner, dan sistem kuaterner mengalir di kedua mode isokratik dan
gradien. Dalam beberapa kasus, komputer juga dapat merekam detektor dan fraksi
kolektor output.
o Pompa: dirancang untuk memompa pelarut pada tekanan tinggi dengan tekanan
minimal. Laju aliran dapat bervariasi 5 sampai 100 mL/menit tergantung pada ukuran
kepala pompa dan sistem.
o Injeksi lingkaran: biasanya sistem tipe injektor Rheodyne. sampel dilarutkan dan
disuntikkan sebagai solusi dalam (atau dekat dengan) fase gerak.
o Penjaga kolom: dirancang untuk melindungi kolom utama dari materi partikulat yang
mungkin ada dalam sampel.
 o Kolom: biasanya terbuat dari stainless steel. Kolom harus dipastikan berada dalam
tekanan yang benar sebelum sistem mulai memompa pelarut.
o Detektor: tiga jenis detektor utama yang digunakan dalam HPLC preparatif ialah
detektor ultraviolet (UV/Vis), indeks bias (RI), dan evaporative light scattering (ELS)
detectors.
 Detektor UV/Vis: digunakan untuk senyawa yang menyerap ion radiat elektro
magnetik di UV/visible dengan rentang panjang gelombang (200-600 nm). Ini
mencakup senyawa organik yang memiliki tingkat jenuh atau kromofor.
 RI detektor: semua senyawa dalam larutan memiliki kemampuan untuk membiaskan
cahaya ke tingkat yang lebih besar atau lebih kecil. Mendeteksi perbedaan indeks
bias eluat dari kolom untuk menentukan ada atau tidak adanya senyawa.
 ELS detektor: Keuntungan utama dari detektor ELS adalah dapat mendeteksi
senyawa yang tidak memiliki kromofor dan dapat digunakan dalam metode elusi
isokratik dan gradien, seperti superceding detektor RI.

1.4 Pelaksanaan Isolasi HPLC preparatif

Digunakan “first line methode” sebagai reversed-phase (fase terbalik) untuk isolasi
produk alami. Jenis kolom yang akan digunakan dapat dilihat dari penelitian yang sudah ada
sebelumnya pada berbagai jenis senyawa yang digunakan.

1.5 Pengembangan metode

Menemukan sistem pelarut yang benar yang digunakan untuk mencapai pemisahan
adalah kunci untuk memurnikan senyawa alami dari campuran kompleks. Tidak semua
pemisahan dapat dicapai dalam satu langkah persiapan HPLC. Campuran kompleks tertentu
mungkin perlu ''prefractionation'' menggunakan teknik lain seperti kromatografi kilat untuk
mengurangi jumlah komponen untuk membuat pengembangan metode sederhana. Jumlah
cairan yang disuntikkan dan dikumpulkan tergantung pada persyaratan akhir. Jumlah dimuat
ke kolom dibatasi oleh kelarutan sampel dan seberapa baik kolom dapat mencapai pemisahan
sebelum fase diam menjadi kelebihan beban. Fase stasioner digunakan dalam kolom HPLC
analitis harus merek yang sama dan membuat (atau membawa spesifikasi yang mirip) dengan
yang digunakan di kolom persiapan HPLC. Idealnya, panjang kolom analitis dan persiapan
harus sama juga untuk membuat skala-up lebih mudah dan lebih dapat diprediksi.

1.6 Scale-Up untuk Prep HPLC

Scaling up untuk HPLC Preparatif relatif mudah jika variabel yang meningkat
adalah diameter kolom dan atau panjang kolom. Faktor skala memungkinkan perhitungan
laju aliran yang ditingkatkan dan estimasi jumlah yang dapat disuntikkan ke kolom
preparatif. Perbedaan antara sistem analisis dan preparatif berarti bahwa penyesuaian tertentu
mungkin harus dilakukan pada tahap preparatif untuk mencapai pemisahan optimal. Optimasi
harus dilakukan jika laju aliran yang ditunjukkan oleh persamaan skala menghasilkan kolom
tinggi tekanan balik. Ini mungkin memerlukan pengurangan laju aliran dan atau perubahan
komposisi pelarut untuk menjaga tekanan balik ke bawah.

1.7 Cara kerja sampel

Setelah fraksi telah dikumpulkan, pelarut harus dikeluarkan untuk menghasilkan
senyawa produk murni. Untuk pelarut organik, akan bermasalah ketika menggunakan fraksi
kering rotary evaporator di mana fase organik diuapkan. Hanya sebagian kecil yang dapat
melewati fase terbalik SPE cartridge untuk menjebak senyawa sasaran. Senyawa-senyawa
yang terperangkap kemudian dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik, yang dapat
diuapkan.
Kesimpulan: HPLC preparatif adalah teknik yang sangat cocok digunakan dalam pemurnian
produk alami. Kunci untuk mendapatkan hasil yang maksimal dari teknik ini berasal dari
pengembangan metode pada tahap analisis. Campuran sampel adalah komponen penting
dalam pengembangan metode. Rendahnya tingkat kelarutan atau terlalu rumit campuran
dapat meniadakan upaya kromatografer untuk menghasilkan pemisahan yang optimal. Oleh
karena itu, sampel harus dianalisa secara menyeluruh dan sebelum diisolasi agar dapat
memudahkan kromatografer dan meningkatkan penggunaan HPLC dalam mengisolasi suatu
produk alami.

Isolasi dari Bahan Alam yang berasal dari laut

Informasi tentang taksonomi dapat memfasilitasi pencarian literatur tentang senyawa

yang diproduksi oleh spesies yang diselidiki serta metode pemurnian.Identifikasi taksonomi
organisme laut yang tidak ada atau tidak lengkap taksonominya dapat menyebabkan kesulitan
jika asumsi yang dibuat tentang organisme yang memiliki senyawa kimia. sehingga dapat
mempersulit proses identifikasi. Kuantitas yang kecil dari metabolit juga dapat mempersulit
proses ekstraksi dan isolasi. Salah satu contoh adalah isolasi hanya 10.7 mg dari antitumor
macrolide spongistatin 4. dari sekitar 2,5 ton dari spons laut Afrika Selatan Spirastrella
spinispirulifera. Uji coba untuk mengurangi biomassa spons yang sangat
melelahkan. Pada satu titik dalam usaha ini, perlu untuk menggunakan-kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC) kolom yang hampir 3m panjang dan 15 cm di diameter.
Selanjutnya ialah Ketidakstabilan Metabolit. Panas, cahaya, udara, dan pH merupakan faktor-
faktor yang dapat menyebabkan terjadinya degradasi senyawa. Bahan yang digunakan untuk
pemisahan mungkin juga dapat mengaktifkan beberapa reaksi. Alumina dapat
mengkatalisis kondensasi aldol, penataan ulang, hidrasi dan dehidrasi reaksi, sedangkan silika
dapat meningkatkan oksidasi, penataan ulang, dan N- dan O-demethylation. Beberapa pelarut
seperti aseton, metanol (MeOH), etilena glikol, dan dimetilformamida (DMF) dapat
menimbulkan adduct. Sedikit sifat asam dari beberapa pelarut NMR (misalnya, CDCl3) dapat
menyebabkan degradasi senyawa yang sangat pH-sensitif. Pemurnian senyawa air laut dapat
dipengaruhi karena tingginya air dan konten garam sehingga dapat mempersulit proses isolasi
dan pemurnian senyawa yang larut dalam air. Karena senyawa sasaran yang sangat polar,
media air atau pelarut sangat polar seperti MeOH harus digunakan untuk ekstraksi. Dalam
kasus larutan air, masalah yang tak bias dielak adalah pertumbuhan bakteri dan jamur, yang
sering mendegradasi komponen aktif atau memberikan hasil yang palsu dalam bioassay
karena endotoksin yang dihasilkan oleh mikro-organisme. Konsentrasi ekstrak air juga
menciptakan masalah karena suhu penguapan air tinggi. Selain itu, ekstrak air sering
mengandung bahan aktif permukaan. surfaktan ini dapat menyebabkan buih dan menabrak
selama proses konsentrasi. Kelimpahan garam yang dibawa air laut menjadikan proses isolasi
ekstrak air lebih sulit. Untuk Senyawa yang kekurangan kromover uv, ultraviolet (UV) ialah
teknik deteksi yang lebih disukai untuk analisis HPLC produk alami karena kemudahan
penggunaan dan tinggi kepekaan. Namun, salah satu kelemahan dari detektor UV adalah
ketidakmampuan untuk mendeteksi senyawa yang tidak memiliki kromofor UV, sehingga
membuat konsentrasi deteksi metabolit non kromoforik menjadi rendah dan sangat sulit.
Factor yang terakhir ialah Evektifitas Biaya dan Waktu dan proses yang mahal.
Yang selanjutnya dilakukan ialah pemilihan tehnik kromatografi. Tujuan utama dari
bagian ini adalah untuk memfasilitasi proses memilih teknik yang tepat, pelarut, dan tahap
stasioner. Semua teknik kromatografi melibatkan distribusi komponen ekstrak antara dua fase
gerak yang bergerak melewati fase stasioner. Pemisahan tergantung pada perbedaan afinitas
komponen terhadap fase diam dan fase gerak. Menurut sifat dari fase gerak, kromatografi
dapat diklasifikasikan ke dalam kromatografi gas (GC), liquid chromatography (LC), dan
superkritis kromatografi cairan (SFC). GC dan SFC secara luas digunakan teknik analisis
tetapi tidak dapat digunakan untuk isolasi preparatif produk alami. LC dapat
digunakan secara luas dan tersedia dalam berbagai bentuk. LC dapat diklasifikasikan dalam
beberapa cara diantaranya, Klasifikasi menurut modus operasi, dan Klasifikasi menurut
modus pemisahan. Kemudian ada kromatografi adsorpsi yang didasarkan pada
kemampuan molekul zat terlarut yang secara fisik berinteraksi dengan fase stasioner. Sifat
interaksinya dapat berupa ikatan hidrogen, van der Waals, atau dipol-dipol. kromatografi
partisi didasarkan pada kemampuan zat terlarut untuk mendistribusikan antara duafase
cair.

Pasangan-
ion Reagen
dan Efek pH,
senyawa ion yang
sangat larut dalam
air juga dapat
dipisahkan
menggunakan fasa
diam nonpolar,
misalnya, oktadesil
silika. Hal ini dapat
dicapai dengan
mengubah pH fase
gerak untuk menekan ionisasi senyawa sehingga mereka dapat dipertahankan sebagai spesies
netral. Fasa Diam Umumnya Digunakan di Adsorpsi Kromatografi adsorben Catatan Silica
fase normal (fase diam lebih polar dari fase gerak). Senyawa polar dipertahankan sementara
yang nonpolar tidak. Asam trifluoroasetat (TFA), pentafluoropropionic acid (PFPA), dan
asam heptafluorobutyric (HBA) adalah contoh dari anion reagen pasangan-ion sementara.
Trietilamina (TEA) adalah salah satu contoh dari kationik. keuntungan tambahan dari TFA
dan TEA termasuk volatilitas tinggi (Memungkinkan untuk penghapusan cepat) dan
kompatibilitas dengan masa analisis spektrometri. Kemudian kromatografi pertukaran ion
(IEC) yang berlaku untuk pemisahan spesies ionik atau komponen yang terionisasi pada pH
tertentu. Hal ini umumnya digunakan dalam pemurnian peptida karena hampir semua
makromolekul ini membawa muatan permukaan yang memungkinkan untuk adsorpsi yang
lebih solid. Keuntungan dari teknik ini adalah kenyataan bahwa kegiatan biologi hampir
selalu dilestarikan karena komposisi ponsel-fase biasanya berair.
Dukungan Matriks yang membentuk partikel fase stasioner bisa resin polystyrene, polimer
karbohidrat, atau silika gel. Sifat dukungan matriks memiliki dampak pada karakteristik
aliran kolom ini, porositas dari stasioner fase partikel, dan ketahanan untuk tekanan mekanik.
Kelompok fungsional yang melekat pada dukungan matriks dapat positif atau bermuatan
negatif untuk memberikan anion- atau kation-exchange chromatography. Jumlah kelompok-
kelompok fungsional per unit volume matriks menentukan kapasitas kolom. Nilai pKa dari
fungsional kelompok menentukan kekuatan exchanger. Dalam kromatografi pertukaran
anion, ionisasi penuh terjadi pada nilai pH 2.0 unit di bawah pKa sementara netralisasi penuh
terjadi pada nilai pH 2,0 unit di atas pKa. Counterions dalam matriks dan fase gerak bersaing
dengan Sampel ion untuk situs mengikat dibebankan pada permukaan sorben. berikut:
hidroksida <fluoride <asetat <bikarbonat;format <klorida <Fosfat;garam sitrat
Dengan cara yang sama, kation dapat peringkat dalam hal afinitas mereka untuk
penukar kation sebagai berikut:
lithium <hidrogen <natrium <amonium <kalium <magnesium <kalsium
Dalam kebanyakan penukar ion, kelompok fungsional tetap langsung pada permukaan
matriks. Hanya sejumlah kelompok ionik dapat melekat karena permukaan bagian terbatas
dari matriks. Keuntungan lain adalah bahwa penukar ion tentakel tidak menunjukkan
interaksi backbone sebagai matriks stasioner fase tersembunyi. Oleh karena itu, penukar ion
tentakel jauh lebih cocok untuk pemisahan molekul protein besar di mana risiko denaturasi
dan hilangnya aktivitas biologis yang signifikan. Ukuran-exclusion chromatography (SEC),
juga dikenal sebagai filtrasi gel atau gel kromatografi, memisahkan molekul menurut ukuran
molekul. Fase diam terdiri partikel berpori dimana ukuran pori dikontrol secara ketat. Sebagai
fase gerak mengalir di atas dan melalui partikel-partikel ini, ia terbawa bersama dengan zat
terlarut, tergantung pada ukuran dan bentuknya, dapat mengalir ke dalam dan keluar dari
pori-pori. SEC memiliki kapasitas muat yang rendah dalam hal massa sampel dan volume
sampel. Sampel harus terkonsentrasi ke tapi tidak di luar titik curah hujan untuk kinerja yang
optimal.
Kromatografi afinitas jauh lebih spesifik daripada pemurnian dengan teknik lainnya.
Hal ini bergantung pada persiapan matriks yang kompleks, dan sebaiknya hanya senyawa ini,
akan mengikat reversibel. Matriks itu biasanya manik-manik agarosa (Sepharose atau BioGel
A), poliakrilamida (Mis, BioGel P), silang dekstran (misalnya, Sephacryl), atau silika gel
dengan ligan spesifik (antibodi, enzim, atau protein reseptor). Ligan bergerak berinteraksi
hanya dengan molekul selektif yang dapat mengikat. senyawa lain dalam sampel, tidak
mampu mengikat biospecifi yang hanyut. Meskipun selektivitas tinggi, kromatografi afinitas
tidak sering diterapkan pada isolasi produk alam laut. Hal ini terutama karena
Teknik ini sangat mahal. Banyak kesulitan yang dihadapi dalam pilihan ligan yang cocok dan
persiapan fase diam. ligan harus menunjukkan afinitas pengikatan spesifik dan reversibel
untuk substansi yang akan dimurnikan. Hal ini juga harus memiliki kelompok kimia
dimodifikasi yang memungkinkan untuk melekat pada matriks tanpa merusak aktivitas
ikatannya . Selain itu, hubungan kovalen digunakan untuk melumpuhkan ligan harus stabil di
segala kondisi yang digunakan selama kromatografi.
Untuk fase gerak di LC, dalam adsorpsi dan kromatografi partisi sistem, aturan lama
Seperti memiliki afinitas untuk memegang makna khusus dalam hal Sistem pelarut yang telah
berhasil digunakan untuk sampel elusi. Pelarut polar dibutuhkan untuk mengelusi analit polar
dari kolom yang normal-fase polar, sedangkan pelarut organik hidrofobik diperlukan untuk
elusi hidrofobik analit dari kolom fase terbalik hidrofobik. Di IEC, fase gerak terutama
larutan buffer, Faktor-faktor kritis adalah pH dan kekuatan ion dari fase gerak. buffer
anorganik tradisional seperti fosfat, asetat, dan format biasanya digunakan dalam pemisahan
ion-exchange. Beberapa penulis lebih suka menggunakan buffer stabil untuk menghilangkan
langkah desalting berikutnya. Contoh buffer volatile amonium bikarbonat dan amonium
asetat. buffer volatile terutama mengandung piridin, yang sangat beracun. Namun, penguapan
dari buffer ini bukanlah tugas yang mudah, dan selama penguapan buffer
solusi, perubahan drastis dalam pH dapat terjadi dan dapat mempengaruhi komponen yang
diinginkan. LC sendiri mempunyai 3 bentuk yaitu, Kromatografi berlawanan (CCC), Kedua
fase stasioner dan mobile cair. Pemisahan zat terlarut dicapai dengan partisi. Kromatografi
Lapis Tipis, fase diam padat dan tersebar di lembaran datar, kedua adsorpsi dan partisi
stasioner fase yang tersedia. Yang paling umum digunakan fasa diam adalah silika gel dan
silika oktadesil, dan tehnik ini berguna di fraksinasi. Yang terakhir adalah kromatografi
kolom, adalah bentuk paling umum dari kromatografi. Semua mode pemisahan diwakili. Fase
diam adalah Isolasi Marine Products Natural 369 padat dan dikemas dalam kolom yang
terbuat dari kaca, stainless steel, atau lembam lainnya bahan. Campuran sampel diterapkan
 di atas kolom dan fase gerak melewati kolom baik oleh gravitasi, vakum, atau
tekanan untuk memberikan open-gravitasi LC, LC vakum, atau menengah atau HPLC.
Sedangkan untuk kromatografi kolom biasanya menggunakan fase diam adalah isolasi padat
yang ditempatkan pada penyangga yang cocok biasanya terbuat dari kaca, stainless steel atau
bahan yang cocok lainnya.sampel ditempatkan pada atas kolom dan fase gerak melewati
kolom baik oleh gravitasi, vakum, atautekanan untuk memberikan open-gravitasi LC, LC
vakum, atau HPLC. Selanjutnya ada ekstraksi fase padat cara adalah cara yang paling
sederhana untuk pemurnian analit dan konsentrasi. Metode ini dapat menghindari emulsi
yang merupaaan masalah yang sering dihadapi dengan prosedur ekstraksi . Teknik ini dapat
digunakan dengan semua jenis fase diam, kecuali untuk kromatografi eksklusi. Bentuk yang
sering digunakan terdiri dari jarum suntik (cartridge) yang berisi 50mg sampai 20 g sorbent
dimana sampel dilembutkan dengan pluger atau vakum.
Ada beberapa pendekatan umum untuk pemurnian produk alam diantaranya
pengumpulan dan penyimpanan organisme. Pada tahap ini, masing-masing sampel harus
memiliki colection record sendiri yang berisi koleksi tahun, ekspedisi jumlah, dan spesimen
nomor, misalnya, koleksi nomor 97212 berarti tahun 1997, ekspedisi nomor 2, dan spesimen
nomor 12. Lokasi harus dipetakan. Informasi tentang habitat (Mis, sampel tumbuh di batu
atau di permukaan organisme lain) sebagai serta observasi ekologi (misalnya, mampu
mencegah pertumbuhan organisme tetangga) harus dicatat. Sebuah penjelasan rinci tentang
fitur morfologi organisme, termasuk warna, bentuk, tekstur, harus ditulis. foto closeup
organisme diatas air maupun dibawah air. spesimen ganggang biasanya diawetkan dalam
larutan formalin 5% dalam air laut. Spesimen harus mewakili dari seluruh organisme dan
taksonomi.dan Untuk tunicates dan karang lunak, sering menjadi bagian dari organisme atau
seluruh organisme (jika tidak terlalu besar) harus dikumpulkan, termasuk '' root. '' Setelah
spesimen dibawa ke laboratorium, larutan formalin diganti dengan etanol 70% untuk
penyimpanan jangka panjang. Jumlah organisme yang akan dikumpulkan biasanya ditentukan
berdasarkan kelimpahan. Ukuran sampel yang ideal adalah 1-2 kg berat basah (100-200 g
berat kering). Idealnya, sampel harus lyophilized segera setelah pengumpulan untuk
mencegah degradasi kimia. Jika hal ini tidak mungkin, sampel harus disimpan pada suhu -20
derajat celcius sampai 0 derajat C. Sampel juga bisa direndam dalam campuran etanol-air
(50:50 v / v) untuk kira-kira 24 jam setelah itu, cairan dibuang. organisme kemudian
ditempatkan dalam botol polyethylene high-density (Nalgene 2 L wadah lebar mulut adalah
yang terbaik) Sampel diawetkan dengan cara ini biasanya bertahan hingga 2 minggu dalam
kondisi tropis. Selanjutnya tahap ekstraksi. Terdapat tiga metode ekstraksi yaitu metode yang
melibatkan maserasi sampel dengan pelarut diiikuti penyaringan. Sampel yang ingin
diekstraksi ditumbuk halus laluditambahkan MeOH atau EtOH selanjutnya di filter dan
dirotary dibawah suhu 35 derajat celcius. Metode ekstraksi kedua yang dikembangkan oleh
ilmuan AS. Sampel diekstraksi dengan air pada suhu 4 derajat celcius, selanjutnya air
dihilangkan dengan sentrifugasi dan lyophilized dan diekstraksi dengan MeOH-CH2Cl2 (1:1
v/v) diikuti MeOH 100%. Ekstraksi ketiga melibatkan penggunaan SCFs. Keuntungan dari
metode ini adalah viskositas rendah, sifat perpindahan massa unggul, kekuasaan solvasi baik,
memiliki kemampuan untuk menembus bahan mikro.
Marine exstract adalah ekstrak yang sangat kompleks terdiri dari campuran asam,
netral,lipofilik, dan senyawa amphiphilic. Untuk itu, diperlukan filtrasi. Umumnya filtrasi ada
empat tahap. Pertama investigasi komponen alami pada ekstrak meliputi biological
Screening. Biasanya tahap ini paling menarik dalam proses penelitian obat dari bahan alam.
Namun ada satu masalah yang rumit yaitu seringnya terjadi positif palsu dan negatif palsu.
Selanjutnya TLC Analysis, TLC digunakan untuk mengetahui tingkat kepolaran komponen
ekstrak yang berbeda. TLC juga dapat diterapkan dalam mengidentifikasi senyawa melalui
beberapa pemisahan. Memprediksi pola pemisahan pada kromatografi kolom. NMR
Analysis, NMR digunakan untuk mengetahui sifat kimia senyawa dalam campuran. MS
Analysis, MS digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul senyawa yang tidak diketahui
oleh pengion mereka dan mendeteksi rasio massa terhadap muatan (m / z) dari ion molekul
yang dihasilkan. Tahap kedua dereplication. Proses ini bergantung pada ketersediaan
database yang komprehensif untuk senyawa yang dikenal. data base yang berisi informasi
terkait organisme, identifikasi taksonomi, dan ekstraksi metode, serta kromatografi yang
berbeda dan karakteristik spektroskopi senyawa terisolasi. Tahap ketiga Crude Fractionation.
Tujuan pada tahap ini adalah untuk menyederhanakan komposisi ekstrak dengan pembagian
menjadi kelompok senyawa fisikokimia yang sama karakteristik dan / atau menghapus
sebagian besar bahan yang tidak diinginkan dan dengan demikian memperkaya ekstrak
sehubungan dengan senyawa sasaran. prosedur umum yang dilakukan melibatkan partisi
pelarut, defatting, dan desalting. Tahap ke empat yaitu Final Purification. Sejauh ini, HPLC
adalah alat yang paling berguna untuk pemisahan campuran senyawa kompleks. HPLC
memungkinkan untuk mengidentifikasi senyawa dengan spektrum UV. Pengenalan
menguapkan hamburan cahaya detektor (ELSD) memungkinkan deteksi senyawa yang tidak
memiliki kromofor UV. Dalam beberapa tahun terakhir, tandem atau teknik analisis ditulis
dgn tanda penghubung seperti LC-MS, LC-MS-MS, LC-NMR, dan LC-NMR-MS juga telah
dikembangkan (lihat Bab. 9). Teknik ini menyediakan alat yang ampuh untuk identifikasi
senyawa dengan cepat dan penentuan kelas struktur yang baru.
Terlepas dari keragaman yang tinggi, penelitian produk dari bahan alam telah lama
dihentikan oleh banyak perusahaan farmasi. Hal ini terkait dengan isolasi yang memakan
waktu yang lama, biaya yang mahal, prosedur identifikasi yang rumit dan ketersediaan bahan
di alam yang terbatas. Akibatnya ekstrak mentah dari produk alam ini sangan sulit ditemukan
terutama karena kemungkinan positif palsu yang tinggi dan berulang. Untuk mengatsi hal
tersebut, baru-baru ini diperkenalkan beberapa metode vistas untuk pemisahan diantaranya
pengoptimalan HTS. Metode bergantung pada menghasilkan sebuah perpustakaan besar
fraksi semipurified. Keuntungan dari metode ini termasuk peningkatan keandalan biologi.
identifikasi dan dereplication. Strategi lain tergantung pada persiapan dari data senyawa
alami murni. Baru-baru ini, Sepiatec GmbH (Berlin, Jerman) bekerjasama dengan Aventis
Pharma Deutschland GmbH (Frankfurt, Jerman) telah dirancang sistem untuk meningkatkan
produktivitas persiapan sampel untuk HTS. Sistem tersebut diantaranya 8X HPLC Paralel
Sistem ini dapat berjalan tanpa pengawasan selama 24 jam sehari, mampu secara bersamaan
fraksinasi delapan campuran ekstrak kompleks menggunakan single-tekanan tinggi sistem
pompa gradien, multi-channel (UV, DAD, atau ELSD) detektor, dan perangkat lunak ahli.
Sampel dipisahkan oleh sebuah array kolom HPLC, menyediakan satu kolom untuk setiap
sampel. Dimethyl sulfoxide (DMSO) sangat larut dalam sampel, kelarutan ini dapat
mengganggu pemisahan kromatografi berikutnya. SPE injeksi modul on-line (26)
memecahkan kesulitan ini. Menggunakan autosampler, sampel dilarutkan dalam DMSO yang
disuntikkan di modul, dan air atau buffer secara bersamaan dipompa sebelum inlet dari kolom
SPE (48). Karena peningkatan instan ini di gradien polaritas, komponen ekstrak tetap diserap
ke dalam kolom SPE dan DMSO / air dibuang. Selanjutnya, pelarut organik yang cocok
disuntikan ekstrak untuk pemisahan. Eluting fraksi secara otomatis hasil pemeriksaan
sebelum koleksi. Ektrak teradsorbsi ke kolom SPE menggunakan prinsip yang sama sebagai
modul sampel injeksi dijelaskan sebelumnya. SPE fraksi terserap memerah dengan air dan
kemudian dielusi dengan pelarut organik murni ke piring 96-baik. Sistem ini dapat
memisahkan lebih dari 100 produk alami ekstrak sehari ke beberapa ribu air dan penyangga
bebas fraksi. Kualitas dan kemurnian fraksi yang diperoleh sesuai dengan tuntutan HTS.
Selanjutnya HPLC-SPE-HPLC-SPE Arrangement. Sistem ini didasarkan pada kombinasi
HPLC dan SPE. Dalam pengaturan HPLC-SPE-HPLC-SPE ini, polaritas eluen meningkat
dengan penambahan air sedemikian rupa bahwa fraksi dielusi dari kolom pemisahan yang
teradsorpsi ke kolom perangkap.fraksi terjebak kemudian melewati pemisahan kolom dimana
pemisahan akhir selesai. Komponen individu dielusi adalah teradsorpsi ke perangkap kolom,
dipisahkan dari buffer, dan dibuang ke kolektor fraksi. Sistem ini jauh lebih cocok untuk
menghasilkan senyawa yang hampir murni.

NOTE :
1. Sangat dianjurkan untuk menggunakan fase C18 atau C8 terikat untuk pemisahan peptida
hidrofilik dan C4, C5, atau sianopropil terikat fase untuk yang hidrofobik.
2. Konsentrasi ion-pasangan reagen dalam fase gerak harus dipertimbangkan sehingga tidak
mempengaruhi stabilitas baik fase diam atau komponen sampel. TFA (0,02-0,1%) dan TEA
(0,1-1%) yang umumnya Konsentrasi yang digunakan berkisar.
3. Hasil dentifikasi harus dimasukkan dalam foto- foto. Jika memungkinkan, kamera digital
harus digunakan. Gambar direproduksi dengan izin dari Sepiatec Perusahaan Brosur.untuk
memungkinkan foto untuk diproses dengan cepat. Jika ini tidak tersedia, film slide dan
prosesor memberikan alternatif yang baik untuk memungkinkan pengolahan foto-foto di
situs.
4. Jika botol tidak tersedia, wadah kaca dengan tutup logam bisa digunakan sebagai gantinya.
botol plastik atau tutup harus dipisah untuk mencegah kemungkinan kontaminasi dengan
plasticizer.
5. Jika target dari proses isolasi adalah untuk mendapatkan jumlah yang cukup dari senyawa
diketahui untuk diproduksi oleh organisme, maka proses ekstraksi harus dilebihkan dan setiap
skema ekstraksi dilaporkan. Setiap fitur kimia dari senyawa target yang dapat membuat
proses ekstraksi lebih selektif. Paling umum, isolasi bertujuan untuk mendapatkan senyawa
baru sebanyak mungkin untuk digunakan sebagai tes.
6. Maserasi untuk waktu yang lama dengan pelarut organik pada suhu kamar mungkin
memiliki efek merusak zat yang diekstraksi. Dianjurkan untuk menghapus pelarut secepat
mungkin. Ekstraksi lebih baik dilakukan dalam batch. Di setiap batch, sampel dimaserasi
untuk maksimal 24 jam, setelah itu pelarut dihapus dan diganti dengan pelarut segar lain.
Semua prosedur ekstraksi harus dilakukan pada suhu terdingin mungkin dan jauh dari cahaya
matahari langsung. ekstrak terkonsentrasi harus disimpan dalam freezer pada suhu 20 derajat
celcius
7. Jika air atau berair alkohol digunakan untuk ekstraksi, lakukan ekstraksi dibawah vakum.
dianjurkan untuk menggunakan labu besar (setidaknya kapasitas 1000ml) untuk penguapan
rotary. Sejumlah kecil ekstrak ditambahkan ke labu dan berputar dari labu disesuaikan
dengan tingkat tercepat untuk meminimalkan berbusa. Ini mungkin berguna untuk
menambahkan jumlah kecil (10-20mL) isopropanol atau sec-butanol, untuk memfasilitasi
penghilangan air melalui pembentukan azeotrop (14). Setelah penguapan rotary, ekstrak
terkonsentrasi ditransfer ke botol lebar mulut yang cocok kapasitas. Penghapusan pelarut
dapat dicapai dengan menggunakan pompa vakum tinggi atau kemurnian tinggi aparat N2
blowdown. Turbovaps menggunakan udara harus dihindari karena risiko oksidasi.
8. Dialkylphthalate ester merupakan plasticizer yang paling umum ditemukan. Dapat dengan
mudah dideteksi dalam spektrum 1H-NMR, yang menunjukkan sebagai berikut nilai-nilai
pergeseran kimia: (d, CDCl3) 7.70 (2H, dd), 7.52 (2H, dd), 4.2 (4H, dd), dan 1,2-1,8 (m)
(38). artefak umum lainnya dan kotoran telah Ulasan oleh Middleditch (49).
9. Banyak golongan senyawa dapat dideteksi dengan pola NMR khusus. Lipid muncul
sebagai puncak luas tinggi di d 1,2-1,4. Peptida dapat dideteksi dengan nilai pergeseran kimia
karakteristik mereka a-proton (d 4-5), a-karbon (D 40-70), b-proton (d 1,5-4), dan b-karbon
(d 20-40). gula bisa terdeteksi oleh kehadiran anomeric proton (∞ d 5) dan karbon anomerik
386 Houssen dan Jaspars (∞͑ D 100).
Isolasi dari Senyawa pada mikroba

Isolasi Spricardins A dan B dari Nocardia sp

Protokol isolasi ini diuraikan oleh Nakajima

et al yang mana peneliti mengisolasi antibiotik
terpen spirocardins A dan B dari fermentasi sebuah
kaldu dari Nocardia s. Senyawa yang hadir dalam
kaldu di infiltrasi, diekstraksi dua kali dengan
EtoAC (setengah volume supernatan). Fraksi
EtOAc yang dikumpulkan terkonsentrasi diabawah
vakum, kemudian dicuci dengan volume yang sama
dengan air jenuh beserta natrim klorida (NaCl) dan
dikurangi untuk mendapatkan minyak. Minyak yang
didapatkan kemudian dilarutkan kembali dengan
volume minimal EtOAc dan di eluasi dengan
menggunakan silika gel CC dengan n-heksana yang
mengandung sejumlah aseton. Selanjutnya akan
terbentuk dua fraksi spirocardian A dan
Spirocardian B sebagai komponen utamanya.
Selanjutnya pemurnian dicapai dengan
menggunakan silica gel CC dan RP-HPLC. Eluen
yang digunakan adalah benzena-EtOAc. Tetapi
sekarang benzena tidak lagi digunakan sebagai pelarut kromatografi karena
karsinogenitasnya.

1. Isolasi Moschatine sebuah steroid glikosida dari Centaurea moschata

Muscatine sebuah glikosida steroid diisolasi dari biji C.moschata. Isolasi dilakukan
berturut-turut dengan menggunakan proses ekstraksi Soxhlet dari benih dasar dengan
menggunakan N-heksana, CHCl kolom preparatif, eluasi isokratik dengan 55% MeOH dalam
air 5 ml/menit. Purifikasi akhir dilakukan oleh RP-HPLC menggunakan semi preparatif
diikuti oleh preparatif RP-HPLC (C18 kolo,dielusi isocratically dengan 45% MeOH dalam
air 2mL/menit untuk menghasilkan moschatine dengan kemurnian >98%
 2. Isolasi Cispentacin Dari Bacillus.
cereus Konishi et al. disajikan protokol isolasi. untuk antibiotik antijamur,
cispentacin, dari kaldu fermentasi B. cereus. Ini adalah contoh yang sangat baik dari
aplikasi kromatografi pertukaran ion dalam isolasi produk alami. Kaldu supernatan
diterapkan langsung ke kolom pertukaran ion tanpa pengobatan sebelumnya. Fi nal
langkah dari proses isolasi yang digunakan CC pada arang aktif untuk menghasilkan
cispentacin dari 96% kemurnian, yang lebih puri fi ed oleh rekristalisasi dari aseton-
etanol-air.

3. Isolasi Phytoecdysteroids Dari Limnanthes douglasii. Sebuah metode yang mudah

untuk isolasi dua glikosida phytoecdysteroid, limnanthes sisi A dan B, dan dua
phytoecdysteroids,

4. Isolasi Moschatine, sebuah steroid

glikosida, Dari Centaurea moschata
Moschatine, glikosida steroid,
diisolasi dari biji C. moschata.
Protokol isolasi yang terlibat ekstraksi
Soxhlet berturut benih dasar dengan
n-heksana, CHCl3, dan MeOH,
diikuti oleh preparatif RP-HPLC (C18
kolom preparatif, elusi isokratik
dengan 55% MeOH dalam air, 5 mL /
min) . Akhir pemurnian dilakukan
dengan RP-HPLC menggunakan
kolom C6 preparatif setengah, dielusi
isocratically dengan 45% MeOH
dalam air, 2 mL / menit, untuk
menghasilkan moschatine dengan
kemurnian> 98%.

5. Isolasi Saponin Dari Serjania salzmanniana Isolasi antijamur dan molluscicidal dari S.
salzmanniana melibatkan penggunaan CC silika gel diikuti dengan kromatografi arus balik.
Sebuah fitur yang tidak konvensional dari nal tahap TLC preparatif fi adalah penggunaan air
sebagai visualisasi tak rusak '' noda. '' The TLC plate berubah gelap (basah) saat disemprot
dengan air, kecuali daerah-daerah yang diwakili oleh sapogenins, yang karena hidrofobik
mereka , tetap putih (kering).

Quantifikasi Natural Product

 Hasil dari senyawa pada akhir dan pemurnian merupakan proses penting dalam
penelitian Natural Product. Dalam prosess bioassay, senyawa dipantau pada setiap tahap dan
biasanya dilakukan penilaian bioaktivasi senyawa biasa dilakukan dengan metode
pengenceran. Penilaian ini bertujuan memberikan keterangan yang jelas tentang aktivitas
hasil dari senyawa kimia yang dihasilkan. Selama proses isolasi, jika aktivitas senyawa
tersebut hilang atau berkurang secara signifikan, mungkin bisa terjadi karena:

a. Senyawa aktif dipertahankan dalam kolom.

b. Senyawa aktif tidak stabil dalam kondisi yang digunakan dalam isolasi.
c. Larutan ekstrak tidak disusun dalam pelarut yang kompatibel dengan fase gerak,
sehingga sebagian besar komponen zat aktif diendapkan kedalam kolom.
d. Sebagian besar komponen zat aktif tersebar di berbagai pecahan yang
menyebabkan tidak terdeteksi .

Aktivitas ekstrak tidak aktif ketika dipisahkan.

Kesimpulan

Metode di atas merupakan beberapa dari metode isolasi bahan alam yang dapat
dipertimbangkan dalam pemilihan metode isolasi senyawa tertentu. Pada Isolasi Produk
Natural dengan Kolom Kromatografy Tekanan Rendah (LPCC), Salah satu prinsip dasar
pemisahan komponen dalam cairan kromatografi (LC) diilustrasikan pada Pemisahan
mengambil dan menempatkan melalui distribusi selektif komponen antara fase gerak dan fase
diam. Namun ada sejumlah faktor, terkait dengan sifat fisik dan kimia dari fase gerak dan
fase diam, serta zat terlarut yang mengendalikan berbagai interaksi antara zat terlarut dan dua
fase, yang terlibat dalam proses pemisahan. Interaksi antara zat terlarut dan fase diam
(Adsorben) tergantung pada ukuran partikel dari fase diam. Isolasi dengan metode ion-
exchange digunakan untuk pemisahan senyawa bermuatan atau terionisasi, properti yang
terdapat pada sejumlah besar produk alami.aplikasinya sebagai teknik untuk pemisahan
produk alami yang digambarkan dalam beberapa tahun untuk isolasi dan pemisahan asam
amino dari hidrolisis protein. Hal ini terus digunakan secara luas bahkan hari ini dalam
konteks analisis dan pemisahan protein dan nukleotida.

Penggunaan HPLC preparatif telah menjadi andalan dalam mengisolasi produk alami selama
10 tahun terakhir. HPLC preparatif adalah teknik yang serbaguna dan biasanya cepat, dimana
senyawa dapat dimurnikan dari campuran kompleks. Perbedaan utama antara HPLC
preparatif dan 'sistem' tekanan rendah kolom kromatografi lainnya adalah konsistensi dan
ukuran partikel dalam fase diam. Distribusi ukuran partikel sangat penting ketika digunakan
untuk memisahkan campuran dari dua senyawa, karena semakin kecil ukuran partikel,
semakin baik pula kekuatan yang dibutuhkan untuk memisahkan dua senyawa. Adapun pada
perkembangan isolasi yang dilakukan bukan hanya pada tumbuhan dan hewan saja namun
juga sudah mencakup isolasi dari bahan alam laut dan juga mikroba.