Tabet Ricardos 2013 Ed414

UNIVERSITÉ DE STRASBOURG
ÉCOLE DOCTORALE 414

CNRS UMR 7104 - Inserm U 964
THÈSE présentée par :
Ricardos TABET
Soutenue le : 21 novembre 2013
Pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg

Discipline / Spécialité : Sciences du Vivant / Aspects Moléculaires et Cellulaires de la
Biologie
Bases moléculaires de la physiopathologie du

syndrome de l’X fragile
THÈSE dirigée par :

Monsieur MOINE Hervé Docteur, Université de Strasbourg
RAPPORTEURS :
Monsieur MANZONI Olivier Docteur, Institut de Neurobiologie de la Méditerranée
Monsieur MULLER Dominique Professeur, Université de Genève
AUTRES MEMBRES DU JURY :

Monsieur MANDEL Jean-Louis Professeur, Université de Strasbourg
Monsieur CHARLET-BERGUERAND Docteur, Université de Strasbourg
Madame BARDONI Barbara Docteur, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire
Remerciements
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier l’ensemble des membres de jury qui m’ont fait l’honneur
d’accepter d’évaluer ce travail : Dr. Barbara Bardoni, Dr. Olivier Manzoni, Pr. Dominique
Muller, Dr. Nicolas Charlet-Berguerand et Pr. Jean-Louis Mandel.
Equipe X-Fragile :
Je voudrais exprimer mes plus profonds remerciements à Jean-Louis M. pour m’avoir
accueilli dans son équipe et pour tous les conseils judicieux qu’il m’a accordé.
Merci Eric F. pour le travail que nous avons réalisé ensemble durant ces 4 ans au laboratoire
et désolé de t’avoir fait courir à la fin de ma thèse. Merci pour ta sympathie, les cours de
photos et tous les chocolats…
Fidéline B., ton passage au laboratoire fut très court mais il m’a porté bonheur pour la suite.
C’est ensemble que nous avons initié le CLIP durant ton stage Master 2. Merci pour ton
travail et ta joie de vivre.
Hervé M., tu es un directeur de thèse exceptionnel ! Tu m’as beaucoup appris et apporté.

Merci pour ta disponibilité et tes conseils, et pour toutes nos discussions scientifiques
particulièrement enrichissantes. Je ne me suis jamais senti perdu au laboratoire, tu as toujours
été prêt à m’aider et en même temps tu m’as permis de proposer mes propres idées et de
m’épanouir scientifiquement. Merci pour toute cette confiance que tu m’as accordé. Merci
pour ton amitié !
Les gardiens de nos souris Fmr1 :

Solange P., merci pour les souris que tu m’as fourni au début de ma thèse. Merci pour ton
sourire et ta sympathie !
Michael G., merci pour ta disponibilité et toutes les souris que tu as pu me fournir cette
dernière année (environ 6 souris gestantes hétérozygotes par semaine, c’est incroyable mais
vrai… Merci!)
2
Remerciements
Nos collaborateurs :
Nicolas V., notre plus récent collaborateur, nous avons eu de la chance de t’avoir à proximité.
Merci pour l’accueil que tu m’as accordé au sein de ton laboratoire pour pouvoir quantifier le
PA. Merci pour tes compétences !
Dimitri H. et Laetitia F., merci pour les quantifications à la spectrométrie de masse du PA et

du DAG. Dimitri, merci pour les cours de métabolomiques.
Christelle T., Violaine A., Doulaye D. et toute l’équipe, merci pour votre sympathie et surtout
la rapidité à laquelle vous avez réalisé les microarrays.
Barbara B. et Laetitia D., merci de m’avoir permis de travailler sur l’ARN P21. Barbara,
merci pour ton accueil et ta sympathie à Nice, le congrès fut très enrichissant !
Nicolas C-B, Michel N., Fernande F. et Chantal S. (première partie de remerciement), merci
de m’avoir permis de travailler sur DROSHA/DGCR8 et les CGG repeats. Merci de vos
soutiens et de vos conseils tout le long de ma thèse. Une équipe qui est toujours prête à aider.
Merci ! (to be continued…)
Equipe Eriani (IBMC):

Franck M. et Gilbert E., 4 ans sont passés mais je ne vous oublie pas. C’est avec vous que j’ai
réalisé mes premiers pas dans la recherche. Merci pour tout l’investissement que vous
m’aviez accordé pour mon stage M2.
Equipe Mandel (la deuxième moitié)

Amélie P., Claire R., Angélique Q. et Nicolas H., merci pour vos conseils et votre sympathie.
Amélie, merci spécialement pour toutes les recherches sur le gène Dgkk. Claire, je me
souviens de notre premier congrès en Allemagne en « last minute » avec la dame bizarre et
son appareil photo, tu te souviens ? -. Angélique, merci pour les rires et ton soutien pour
l’écriture de la thèse. Nicolas, merci de m’avoir libérer l’ordinateur du troisième pour rédiger.
Equipe Laporte :
Karim H., Johann B., Belinda C., Manuela D., Christos G., Ivana P., Catherine K., Christine
K, Jocelyn L., mes voisins directs. Merci pour votre sympathie. Karim, merci beaucoup
d’avoir été disponible et toujours prêt à m’aider. Merci de nous avoir indiqué Nicolas V. pour
la quantification du PA. Ivana, I remember our first step in the lab, thank you for your
3
Remerciements
friendship. Manuela, just in case I am ready to paint your apartment in pink if you need hihi !
;) and I hope that you will not have a mice in your new apartment. Christos you were always
ready to help thanks. Sorry I forget to tell you that “Service de culture” called you last month
hihi! Chrisitine et Catherine, vous avez toujours le sourire et c’est vraiment très agréable
merci !
Equipe Trottier :
Alice K., Chantal W., Hubert A., Fabrice K. et Yvon T., mes voisins un peu plus loin. Merci
de votre sympathie. Alice, merci pour ton soutien, pour ta gentillesse et pour ton bureau à la
bibliothèque. Chantal, tu es quelqu’un de très calme et c’est vraiment agréable de te parler.
Hubert et Fabrice, merci d’avoir partagé l’AKTA, d’ailleurs je l’ai réservé pour la semaine
prochaine hihi ! Merci de votre sympathie.
Equipe Puccio :
Karine M., Brahim B., Leila L., Alain M., Lena B., Aurore H., Floriana L., Morgane P.,
Laurence M., Nadège V., mes voisins de l’autre côté. Merci pour vos sourires et votre
gentillesse. Merci pour les repas passés ensemble et pour votre soutien. C’était vraiment très
agréable de vous croiser tous les jours.
Je tiens à remercier également les équipes Kieffer, Herault et Fabre. De même, je remercie
Evelyne et Maité pour leur sourire et leur disponibilité.
Soraya, merci pour ton soutien et ta disponibilité
David B., merci pour tous les repas et pour ton soutien au moment de l’écriture
Chantal S. (Thérèse), tu es vraiment un ange avec le cœur sur la main, merci pour ton amitié
Fernande F., hey sister! Tu étais mon rayon de soleil tout le long de ma thèse et l’exemple
scientifique que j’ai toujours suivi…ton sourire, ton rire, ta démarche, nos repas et nos
souvenirs Î un vrai bonheur… Merci d’exister et une seule devise à suivre « like a tiger »
Latha S. (ma conscience), trop de souvenirs inoubliables Î simples, authentiques mais

remplis de folies. Merci pour ton soutien de tous les jours, de ta bienveillance et de ta
présence. La vie est trop courte pour ne pas dire les choses en face alors je vais arrêter d’écrire
et j’arrive…
4
Remerciements
Merci à ma petite famille : mama, baba, mon frère et sa femme, ma grande sœur et sa famille,
ma petite sœur et sa famille … Je suis très chanceux de vous avoir, merci de tout l’amour et le
soutien que vous m’apportez tous les jours depuis mon enfance. Mama, je sais que ça fait
longtemps que tu attends ce moment-là, alors je te dédie ma thèse. Je vous aime.
Merci à tous mes amis qui vont se déplacer le jour J, je ne vous cite pas mais vous êtes dans
mes pensées…
5
Remerciements
« La recherche est un processus sans fin dont on ne peut jamais dire comment il évoluera.
L'imprévisible est dans la nature même de la science. »
François Jacob
6
Table des matières
Table des matières

Table des figures..................................................................................................................... 10
Abréviations ............................................................................................................................ 12
Introduction ............................................................................................................................ 15
Chapitre I : Le syndrome de l’X fragile (FXS).................................................................... 16
1- Définitions de la déficience intellectuelle et des troubles du spectre autistique ..... 16
2- Les caractéristiques phénotypiques du syndrome de l’X fragile ............................. 16
Une déficience intellectuelle (ID)...................................................................................................... 16
Des troubles du comportement .......................................................................................................... 17
Des troubles morphologiques et d’autres........................................................................................... 18
3- Les bases neuroanatomiques du FXS ......................................................................... 18
4- Les causes génétiques du FXS ..................................................................................... 19
L’identification du gène responsable du FXS : Le gène FMR1......................................................... 19
Le mosaïcisme et le FXS ................................................................................................................... 20
Les phénotypes associés à la prémutation ......................................................................................... 21
5- Les modèles animaux du FXS ..................................................................................... 23
Les différents modèles murins (Mus Musculus) ................................................................................ 23
Le « poisson zèbre » (Danio rerio)................................................................................................... 27
Le modèle drosophile (Drosophila melanogaster) ........................................................................... 28
Chapitre II : FMRP et ses caractéristiques fonctionnelles majeures ................................ 31
1- Le gène FMR1 : de son ARN messager à sa protéine FMRP................................... 31
2- L’expression et les domaines fonctionnels de FMRP................................................ 32
Le domaine NDF, une plateforme pour les interactions protéine-protéine........................................ 33
Les domaines NLS/NES .................................................................................................................... 33
Les domaines KH .............................................................................................................................. 34
La boîte RGG..................................................................................................................................... 35
3- Les principales protéines associées à FMRP.............................................................. 36
Les paralogues: FXR1P et FXR2P .................................................................................................... 36
Les partenaires de la région N-Terminale.......................................................................................... 39
Les partenaires de la région C-Terminale.......................................................................................... 40
4- Lien entre FMRP et les complexes ribonucléoprotéiques ........................................ 42
7
Table des matières
Les polyribosomes (ou polysomes) ................................................................................................... 43

Les granules de stress (GS)................................................................................................................ 44
Les granules neuronaux (GN)............................................................................................................ 45
5- Les mécanismes de répression de la traduction par FMRP ..................................... 47
Inhibition de l’initiation de la traduction par recrutement de CYFIP1 .............................................. 48
Inhibition de la traduction par blocage du ribosome ......................................................................... 48
Inhibition par la voie des microARN................................................................................................. 49
6- Les modifications post-traductionnelles modulant l’activité de FMRP.................. 51
Phosphorylation de FMRP................................................................................................................. 51
Méthylation de FMRP ....................................................................................................................... 52
7- Le rôle de FMRP dans les voies neurologiques ......................................................... 53
Les récepteurs métabotropiques au glutamate de type I .................................................................... 54
La LTD-mGluR ................................................................................................................................. 55
La théorie mGluR de l’X fragile........................................................................................................ 55
Des voies alternatives ........................................................................................................................ 56
Des essais cliniques ........................................................................................................................... 57
Chapitre III : Les ARN cibles de FMRP.............................................................................. 60
1- Les différents sites de fixation de FMRP identifiés à ce jour ................................... 60
La structure G-quadruplexe ............................................................................................................... 60
Les séquences riches en Uridines ...................................................................................................... 62
Un ARN non codant (BC1) comme intermédiaire entre FMRP et ARNm cibles ............................. 62
Une structure dite « loop-loop pseudoknot » ou « kissing complex »............................................... 63
La structure SoSLIP (Sod1 mRNA Stem Loops Interacting with FMRP) ........................................ 63
Les motifs ACUK et WGGA (où K = G ou U et W = A ou U)......................................................... 64
2- Les différentes listes des ARNm cibles de FMRP (différentes stratégies)............... 65
La technique RIP-Chip à partir de cerveaux de souris ...................................................................... 65
La technique APRA (Antibody Positioned RNA Amplification)...................................................... 66
La technique « HITS-CLIP » à partir de cerveaux de souris............................................................. 67
La technique PAR-CLIP à partir de cellules HEK293 ...................................................................... 68
3- Les ARNm « validés » comme cible de FMRP, cas par cas...................................... 69
L’ARNm Fmr1 (Fragile X mental retardation 1) .............................................................................. 69
L’ARNm Arc / Arg3.1 (Activity-regulated cytoskeleton-associated protein)................................... 70
8
Table des matières
L’ARNm App (Amyloid precursor protein) ...................................................................................... 70

L’ARNm hAsh1 (human Achaete-scute homologue 1)..................................................................... 71
L’ARNm Camk2a (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha) ................................... 71
L’ARNm Dlg4 (Psd95, Postsynaptic density protein 95).................................................................. 72
L’ARNm Sod1 (Superoxide dismutase 1) ......................................................................................... 73
L’ARNm Dgla ou Dagla (Diacylglycerol lipase alpha) .................................................................... 73
L’ARNm Dscam (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule) ......................................................... 74
Objectifs de la thèse................................................................................................................ 76
Résultats .................................................................................................................................. 78
I/ The Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) targets one unique mRNA in
FRUWLFDOQHXURQVWKHGLDF\OJO\FHURONLQDVHțP51$ PDQXVFULW .................................. 79
II/ Etude du rôle de FMRP dans le blocage du ribosome................................................. 101
III/ mRNAs tethered to FMRP are recruited into specific RNA granules distinct from
stress granules and processing bodies (manuscrit 2) ........................................................ 109
Discussion et perspectives .................................................................................................... 122
Chapitre IV : Identification d’une cible unique ................................................................ 123
1- Le choix du matériel biologique................................................................................ 123
2- Notre stratégie utilisée ............................................................................................... 124
3- La méthode de normalisation.................................................................................... 126
Chapitre V : L’importance des DGK et du PA par rapport au FXS .............................. 128
1- /HVGRPDLQHVIRQFWLRQQHOVGHOD'*.ț.................................................................... 128
2- L’implication des DGK dans le cerveau................................................................... 130
3- Les rôles du DAG et du PA dans la régulation des épines...................................... 133
4- L’implication du PA dans la régulation de la traduction dendritique .................. 136
Conclusion et perspectives................................................................................................... 138
Annexe ................................................................................................................................... 143
Publication 1 ......................................................................................................................... 144
Publication 2 ......................................................................................................................... 153
Publication 3 ......................................................................................................................... 166
Revue Biofutur...................................................................................................................... 183
Bibliographie......................................................................................................................... 191
9
Table des figures
Table des figures

Introduction
Figure 1. Les phénotypes du syndrome de l’X fragile ............................................................. 17
Figure 2. Les épines dendritiques : morphologie et anomalie associées au FXS..................... 18
Figure 3. Remodelage de la structure des réseaux synaptiques lors de l’apprentissage .......... 19
Figure 4. Les conséquences moléculaires de l’expansion CGG dans le gène FMR1 .............. 20
Figure 5. Modèles des mécanismes moléculaires responsables du FXTAS ............................ 22
Figure 6. Le gène FMR1, l’ARNm et la protéine FMRP......................................................... 31
Figure 7. Expression de FMRP chez la souris adulte............................................................... 32
Figure 8. Localisation de FMRP dans des cultures de neurones.............................................. 32
Figure 9 . Structure cristallographique des domaines KH de FMRP ....................................... 35
Figure 10. Réseau des principaux interacteurs protéiques de FMRP....................................... 36
Figure 11. Modèle de régulation de la traduction par le complexe FMRP-TOP3ȕ-TDRD3.. . 41
Figure 12. Modèle de régulation de la fonction de FMRP par DSCR1 ................................... 41
Figure 13. Modèle du rôle neuronal de FMRP......................................................................... 42
Figure 14. Association de FMRP aux polyribosomes.............................................................. 43
Figure 15. Modèles d’inhibition de la traduction par FMRP ................................................... 48
Figure 16. Modèle de régulation de la traduction par phosphorylation de FMRP................... 52
Figure 17. La théorie mGluR du FXS ...................................................................................... 55
Figure 18. Structure G-quadruplexe......................................................................................... 60
Figure 19. Structure RMN d’un peptide du domaine RGG de FMRP lié à l’ARN Sc1 .......... 61
Figure 20. Modèle de la structure d’ARN « kissing complex » kc1 ........................................ 63
Figure 21. Modèle de la structure d’ARN SoSLIP .................................................................. 64
Figure 22. Les motifs ACUK et UGGA identifiés par PAR-CLIP .......................................... 65
Figure 23. Séquences uniques identifiées par HITS-CLIP ...................................................... 67
Figure 24. Blocage du ribosome au cours de la traduction sur ARNm cibles de FMRP ......... 67
Tableau 1. Les ARNm cibles « validés » de FMRP................................................................. 69
Discussion et perspectives
Figure 25. La réaction enzymatique des diacylglycérol kinases (DGK)................................ 128
Figure 26. Représentation schématique des isoenzymes DGK des mammifères .................. 128
10
Table des figures
Figure 27. Implication des DGK dans la fonction des synapses neuronales.......................... 132
Figure 28. La génération du DAG et du PA........................................................................... 133
Figure 29. Modèle d’organisation moléculaire des voies de signalisation du DAG et du PA
dans les épines dendritiques. .................................................................................................. 134
Conclusion et perspectives
Figure 30. Un modèle d’action de FMRP dans les neurones ................................................. 141
11
Abréviations
Abréviations
2-AG 2-Arachidonoyl-sn-Glycerol
4E-BP 4E-Binding Protein
82 FIP 82 kDa FMRP Interacting Protein
aa acides-aminés
Ago2 Argonaute 2
AGS Audiogenic Seizures – crises audiogènes
AMPA alpha-Amino-3-hydroxy-5-Méthylisoazol-4-PropionAte
ARNm Acide RiboNucléique messager
ASD Autism Spectrum Disorders - Troubles du Spectre Autistique
CAPRIN-1 Cytoplasmic Activation- and Proliferation-associated protein 1
CDKI-P21 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor
CYFIP1/2 CYtoplasmic FMRP Interacting Protein 1 ou 2
DAG 1,2-DiAcyl-sn-Glycerol
dFxr l’orthologue des gènes FMR1, FXR1 et FXR2 chez la drosophile
dFXRP l’orthologue des protéines FMRP, FXR1P et FXR2P chez la drosophile
dFxr-I307N un mutant dFxr1 avec une mutation équivalente à I304N
DGK DiacylGlycerol Kinase
DHPG (S)-3,5-DiHydroxyPhenylGlycine
eCBR Récepteurs endoCannaBinoides
eIF eucaryotic Initiation Factor
FMR1 le gène Fragile X mental retardation 1
FMR1-I304N un mutant Fmr1 avec une mutation I304N identifiée chez un des patients FXS
FMRP Fragile X Mental Retardation Protein
FSH / FSDH Facio-scapulo-humeral Muscular Dystrophy
FXPOI Fragile X Premature Ovarian Insufficiency
FXR1P Fragile X Related 1 Protein
FXR2P Fragile X Related 2 Protein
FXS Fragile X Syndrome
FXTAS Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome
GABA acide alpha-aminobutyrique
GFP Green Fluorescent Protein
GN Granules Neuronaux
GS Granules de Stress
hnRNP U heterogenous nuclear RiboNucleoProtein U
I304N Isoleucine en position 304 du gène FMR1 est mutée en Asparagine
12
Abréviations
ID Intellectual Disability - déficience intellectuelle

IF ImmunoFluorescence
IRM Imagerie par Résonance Magnétique
Kb Kilobase
kDa kiloDaltons
KH Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
KI Knock In
KIF3C Kinesin Family member 3C
KO Knock-out
LTD Long Term Depression –Dépression à long terme
LTP Long Term Potentiation – Potentialisation à long terme
mAchRs Récepteurs muscariniques de l'Acétylcholine
mGluR-I Récepteurs métabotropiques au Glutamate de type I (1 et 5)
MEK MAPK-ERK-Kinase
min minute
miARN microARN
MMP-9 Matrix Metallo Proteinase 9
MO Morpholino
MPEP 2-Methyl-2-[PhenylEthynyl]-Pyridine
MSP58 MicroSpherule Protein 58
mTOR mammalian Target Of Rapamycin
MW Molecular Weight - Poids Molécculaire
NDF N-terminal Domain of FMRP
NLS Nuclear Export Signal
Nr2a NMDA Receptor 2A
NUFIP1 NUclear FMRP Interacting Protein
ORF Open Reading Frame - cadre de lecture ouvert
PA Phosphatidic Acid
PH domaine d’Homologie à la Pleckstrine
PDZ Postsynaptic density protein-95/Disks large/Zonula occludens-1
PIP2 PhosphatIdylinositol-4,5-diPhosphate
PKC Protein Kinase C
PLC-beta PhosphoLipase C beta
PP2A Protein Phosphatase 2A
PB Processing Bodies
PRMT1 Protein arginine N-methyltransferase 1
PSD Post-Synaptic Density
13
Abréviations
QI Quotient Intellectuel
qRT-PCR quantitative Reverse Transcriptase followed by Polymerase Chain Reaction
RAN Repeat-Associated Non-AUG
RanBPM Ran-Binding Protein Microtubule-organizing center
RISC RNA Induced Silencing Complex
RNAses RiboNucléases
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
RNP RiboNucléProtéiques
S Svedberg, taux de sédimentation
S6K1 ribosomal protein S6 Kinase 1
SMN Survival Motor Neuron
Tap/NXF1 Nuclear Export Factor 1
TDRD3 TuDoR Domain - containing protein 3
TIA1 T-cell intracellular antigen 1
TILLING Targeting Induced Local Lesions in Genomes
TOP3B TOPoisomérase III beta
UTR UnTranslated Region - Région non traduite
Wt Wild type – sauvage
YAC Yeast Artificial Chromosome - Chromosome artificiel de levure
YB1 Y Box binding protein 1
14
Introduction
Introduction
15
Chapitre I : Le syndrome de l’X fragile (FXS)
1- Définitions de la déficience intellectuelle et des troubles du

spectre autistique
La déficience intellectuelle (Intellectual Disability ; ID, anciennement dénommée « retard
mental ») se caractérise par des limitations significatives à la fois du fonctionnement
intellectuel et du comportement adaptatif (langage, motricité et performances sociales). Elle
affecte 1,5 à 2% des occidentaux. La déficience intellectuelle est caractérisée par un quotient
intellectuel (QI) inférieur à 70 (le QI d’un individu sain étant en moyenne aux alentours de
100) ou par des retards de développement des fonctions cognitives, du langage et de la
motricité durant la petite enfance. Les causes identifiées des déficiences intellectuelles sont
diverses et peuvent être environnementales (syndrome d'alcoolisation foetale, hypoxie
périnatale, etc) ou génétiques. Si l'on excepte les anomalies chromosomiques comme le
syndrome de Down (trisomie 21), le syndrome de l'X-fragile représente la cause héréditaire la
plus fréquente de déficience intellectuelle génétique (Mefford et al., 2012)
Les troubles du spectre autistique (Autism Spectrum Disorders; ASD) se caractérisent par une
perte de contact avec la réalité, un rétrécissement des relations avec l’environnement
conduisant ainsi l’individu à s’exclure de toute vie sociale par un mécanisme de repli sur soi ;
d’où le terme « autisme », dérivé du grec « autos » qui signifie « soi-même ». Ces troubles se
caractérisent également par des comportements répétitifs et une gamme étroite d’intérêts, et
ils sont estimés affecter 1 enfant sur 150. Les causes exactes de l’ASD sont complexes et
restent à déterminer mais des causes génétiques sont proposées. Beaucoup d'enfants atteints
de troubles du spectre autistique ont aussi une déficience intellectuelle, et environ 75% ont un
handicap permanent qui nécessite un soutien social et éducatif important. Ainsi, ID et ASD
représentent à eux deux un problème important de santé publique (Mefford et al., 2012).
2- Les caractéristiques phénotypiques du syndrome de l’X fragile

Une déficience intellectuelle (ID)
L’incidence du syndrome de l’X-fragile (FXS) est de 1 sur 5000 garçons et de 1 sur 6000-
8000 filles (Coffee et al., 2009; Wijetunge et al., 2013). Le tableau clinique est présenté dans
16
Les troubles cognitifs Déficience intellectuelle légère (50 <QI< 70)
à sévère (QI <35)
Désordre du spectre autistique (ASD)

Hyperactivité
Troubles du langage
Les troubles Anxiété
comportementaux Troubles de la concentration
Timidité
Tendance dépressive
Dysmorphie faciale (front large, visage allongé, oreilles

proéminentes et strabisme)
Macroorchidie
Les troubles associés Otites et sinusites
Hyperlaxicité ligamentaire
Problèmes orthopédiques : pieds plats et scoliose
Figure 1. Les phénotypes du syndrome de l’X

fragile
Le tableau clinique présente une liste globale des
phénotypes observés chez les patients X fragile,
mais qui ne sont pas forcément tous présents chez
un même individu. Les photos présentent deux
patients à l’âge enfant et adulte, avec un phénotype
facial modéré chez l’enfant.
la Figure 1. La sévérité de la déficience intellectuelle (ID) associée au FXS varie selon les
individus et leur genre. Le quotient intellectuel moyen d’un homme adulte avec FXS est situé
autour de 40, mais des patients hommes peuvent présenter une ID légère (avec un QI entre 50
et 70) ou sévère (avec un QI entre 20 et 34) en fonction du niveau d’expression du gène
FMR1 (mutation complète ou mosaïque avec une fuite d’expression du gène allégeant les
phénotypes FXS, voir partie intitulée : le mosaïcisme et le FXS) (Garber et al., 2008; Santoro
et al., 2012). En général, pour FXS, l’ID inclut des problèmes de la mémoire à court terme,
des fonctions exécutives et des capacités visio-spatiales. Les patients peuvent également
présenter des troubles du langage et de la motricité (retard dans l’apparition du langage, des
difficultés d’articulation et de l’apprentissage de l’écriture…) (Boyle and Kaufmann, 2010).
FXS est une maladie dominante lié au chromosome X, c’est pourquoi, les femmes FXS sont
en général plus légèrement affectées que les hommes (phénomène d’inactivation au hasard
d’un des deux chromosomes X chez la femme, voir §4). En effet, la moitié des femmes FXS
présentent une ID, qui de plus est souvent légère. L’autre moitié ne présente que des troubles
émotionnels.
Des troubles du comportement

Chez les enfants avec FXS âgés de plus de 6 ans, 35 à 46% des garçons et 16% des filles
manifestent également des troubles semblables à l’autisme tels que le retrait social avec des
difficultés de communication et d’adaptation, la déviation du contact des yeux et les
comportements répétitifs, y compris la persévération et les battements des mains. Les garçons
avec FXS mais qui ne présentent pas d’ASD ont généralement une ID légère avec un QI
compris entre 50 et 70, tandis que ceux avec de l’ASD ont une ID modérée avec un QI
compris entre 40 et 54 (Boyle and Kaufmann, 2010; Tranfaglia, 2011; Wijetunge et al., 2013).
Les patients mâles FXS manifestent également des défauts de l’attention, une hyperactivité,
une impulsivité, une timidité excessive, une anxiété, des comportements agressifs et une
hypersensibilité sensorielle (Garber et al., 2008; Boyle and Kaufmann, 2010; Wijetunge et al.,
2013). Chez les femmes FXS, les signes comportementaux de la maladie sont moins marqués
que chez les hommes. Cependant, elles souffrent fréquemment de troubles de l’attention et
une tendance dépressive. Elles peuvent également présenter une timidité et un caractère
changeant.
17
A B
Filopode
A B C D E F G H
Immature Mature
Stubby
C
5 μm
Fine
Tête Control
Cou
Champignon
Tête
Cou FXS
Figure 2. Les épines dendritiques : morphologie et anomalie associées au FXS

A, Les principaux types morphologiques des épines sont indiqués. Les filopodes sont longs et
ne possèdent pas de tête à leur extrémité, et ils sont considérés comme des précurseurs
d’épines dendritiques. Le genre « stubby » est court, large (0,5 μm) et sans cou. Les épines
fines sont longues avec un mince cou se terminant par une petite tête. Les épines de type
champignon se caractérisent par un petit cou avec une large tête (Almena and Mérida, 2011;
Rochefort and Konnerth, 2012). B, Catégories de la morphologie des épines utilisées pour
classifier les épines dendritiques des patients X fragiles d’épines immatures (Irwin et al.,
2001). Pour chaque épine est attribuée une lettre correspondant à la forme la plus proche. C,
comparaison de la morphologie et de la densité des épines dendritiques observées chez un
patient X fragile par rapport à un individu sain. Les dendrites ont été colorées selon la
méthode d’imprégnation de Golgi (Irwin et al., 2001).
Des troubles morphologiques et d’autres

Les troubles morphologiques sont plus présents chez l’homme adulte que chez l’enfant et
peuvent inclure une dysmorphie faciale (un visage long et étroit, de grandes oreilles, une
mâchoire proéminente et un strabisme), une laxité articulaire, un palais ogival, des pieds plats
et une macroorchidie. Après la naissance, les individus FXS présentent fréquemment des
reflux gastro-œsophagiens, et des otites et sinusites à répétition. Les femmes présentent moins
de troubles morphologiques mais peuvent avoir des oreilles proéminentes. 13 à 18% des
patients hommes et 5% des femmes sont touchés par des crises épileptiques (Garber et al.,
2008; Boyle and Kaufmann, 2010).
3- Les bases neuroanatomiques du FXS

L’imagerie par résonance magnétique (IRM) et l’autopsie de patients FXS n’ont montré
aucun défaut majeur de la morphologie globale de leurs cerveaux. Des altérations subtiles
dans différentes régions du cerveau ont cependant été identifiées par IRM notamment au
niveau du gyrus préfrontal, du vermis cérébelleux, de l’hippocampe, des amygdales et du
noyau caudé des ganglions de la base (Garber et al., 2008; Wijetunge et al., 2013). Ces
régions sont impliquées dans les fonctions cognitives et les réponses émotionnelles et
comportementales. Les altérations de ces régions du cerveau suggèrent des défauts de la
structure synaptique. L’utilisation de la méthode de Golgi ou encore de la microscopie
électronique sur des tissus de cerveaux post-mortem de patients FXS ont permis de montrer
que les épines dendritiques des neurones de différentes régions du cortex sont anormales
(telles que les épines des neurones pyramidales dans les couches III et V du néocortex pariéto-
occipital) (Rudelli et al., 1985; Hinton et al., 1991; Irwin et al., 2000; Irwin et al., 2001). En
effet, les épines dendritiques des neurones FXS sont surnuméraires et anormalement fines et
tortueuses (Figure 2B, C). Les épines sont de petites protrusions membranaires émergeant
des dendrites de la plupart des différents types de neurones, et au niveau desquelles
s’établissent les jonctions synaptiques (Caroni et al., 2012; Rochefort and Konnerth, 2012).
Les épines dendritiques sont formées en général d’une tête sphérique (volume variant entre
0,001 et 1 μm3) reliée à la base du dendrite par un cou étroit (diamètre < 0,01 μm) et peuvent
présenter une grande variabilité de leur morphologie (en forme de champignon, fines,
« stubby » ou filopodes) (Figure 2A) (Harris and Kater, 1994; Rochefort and Konnerth,
2012). Une caractéristique particulière des épines est la capacité de moduler leur structure et
18
Activité basale
Activité lié à
l’apprentissage
Figure 3. Remodelage de la structure des réseaux synaptiques lors de l’apprentissage

A-C, représentation schématique du renouvellement des épines dendritiques au cours de
l’activité basale, incluant la perte et le gain de nouvelles épines, affectant seulement une sous-
population d’épines transitoires (colorées en bleu foncé) et conservant une large population
d’épines plus stables et persistantes. D-F, au cours de l’apprentissage, le renouvellement est
plus marqué avec l’apparition de nouvelles épines (colorées en bleu foncé) et la disparition
d’épines pré-existantes (tracées en pointillée). Bien que la connectivité soit modifiée, la
densité des épines peut rester inchangée. Les épines nouvellement formées apparaissent
groupées (régions d’épines encerclées), exhibant plus de probabilité de devenir des épines
stables et persistantes et introduisant ainsi une dernière modification du réseau synaptique
(Caroni et al., 2012).
leur nombre lors du développement du cerveau ou en réponse à une activation neuronale dans
le cerveau adulte, par exemple au moment de l’apprentissage (Figure 3) (Caroni et al., 2012;
Rochefort and Konnerth, 2012). Il existe une corrélation étroite entre la structure des épines et
la force/stabilité des synapses (Caroni et al., 2012). Ce constat semble être directement lié à la
dimension de la densité post-synaptique (PostSynaptic Density ; PSD) présente à la surface de
l’épine et qui s’aligne parfaitement avec la zone active présynaptique (Tada and Sheng, 2006).
En effet, les épines plus larges ont des PSD plus importantes et contiennent une plus grande
diversité d’organelles (Matsuzaki et al., 2004). La présence des épines anormalement longues
et fines dans le cerveau adulte des patients FXS évoquent la structure d’épines dendritiques
immatures, suggérant que ces altérations pourraient refléter des erreurs dans la maturation, la
stabilisation ou l’élimination des synapses responsable de la déficience intellectuelle observée
chez les individus avec FXS (Irwin et al., 2001). Ce syndrome appartient donc au groupe de
maladies neurologiques dont la principale cause serait l’altération de la fonction synaptique,
appelé récemment « synaptopathies » (Brose et al., 2010).
4- Les causes génétiques du FXS

L’identification du gène responsable du FXS : Le gène FMR1
FXS, comme son nom l’indique, est associé à un site fragile chromosomique correspondant à
une constriction au niveau de la région q27.3 du chromosome X visible en métaphase lors
d’une analyse cytogénétique, et évoquant un aspect « cassé » lorsque les cellules des patients
sont cultivées en présence de folate (Lubs, 1969; Sutherland, 1977; Hecht and Sutherland,
1985). Ce site a permis l’identification de la mutation responsable du syndrome et le clonage
positionnel du gène altéré FMR1 qui s’étend sur 40 Kb de séquence génomique (Verkerk et
al., 1991). Dans la plupart des cas, la mutation responsable du syndrome est une expansion de
répétitions du triplet CGG localisée au niveau de la région 5’ non traduite (UnTranslated
Region : UTR) du gène FMR1 (150 nucléotides en aval du site d’initiation de la transcription)
(Fu et al., 1991; Oberle et al., 1991; Verkerk et al., 1991). Notons que les expansions de tri-
nucléotides identifiées pour la première fois dans FMR1 ont depuis été également identifiées
dans différents gènes responsable d’une vingtaine de maladies, telles que la Dystrophie
Myotonie ou encore la maladie de Huntington (McMurray, 2010). Dans le gène FMR1, la
longueur des répétitions CGG est polymorphe chez les individus sains et varient entre 6 et
~50 répétitions, avec une moyenne à ~30. Quand la répétition excède 200 CGG, la mutation
19
Normal < 55 Prémutation Mutation complète
répétitions 55-200 répétitions > 200 répétitions
Gène FMR1
5’UTR Répétitions CGG Méthylation
Phase codante
ARNm FMR1
5’UTR Phase codante
FXS
Répétitions
CGG
Protéine FMRP
FXTAS / FXPOI
Figure 4. Les conséquences moléculaires de l’expansion CGG dans le gène FMR1
La condition à gauche correspond à l’individu sain avec en moyenne ~30 répétitions CGG.
L’ARNm correspondant est transcrit et FMRP est traduite. La condition au milieu représente
l’allèle d’un individu prémuté (entre ~55 et 200 CGG), avec une augmentation de la transcription
de l’ARNm et une légère baisse du niveau protéique. La condition à droite correspond à la
mutation complète (>200 CGG), avec une hyper-méthylation de la région promotrice et des
répétitions CGG provoquant l’absence de la protéine FMRP. UTR : région non traduite.
est appelée « complète », en effet au-delà du seuil de 200 le phénotype FXS apparait. Cette
expansion élevée du nombre de répétitions conduit à la méthylation du promoteur (ilots CpG)
du gène FMR1 et de la répétition elle-même, suivi de modifications épigénétiques et de
l’inhibition de la transcription du gène FMR1 entrainant l’absence du produit protéique : la
protéine FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) (Figure 4) (Fu et al., 1991).
Les allèles du gène FMR1 avec un nombre intermédiaire de répétitions (entre 52 et ~200
CGG) sont appelés des « prémutations » (Figure 4). Ces dernières ne provoquent pas de FXS
(voir ci-dessous la partie intitulée : les phénotypes associés à la prémutation), mais la
longueur de leurs répétitions est susceptible d’augmenter chez les enfants des femmes
porteuses (Fu et al., 1991). Ce phénomène appelé « paradoxe de Sherman » d’après S.
Sherman qui, en 1985 constata que les effets du FXS voyait leur sévérité et fréquence
augmenter à chaque génération suivante (Sherman et al., 1985). De manière intrigante les
prémutations chez les hommes sont transmises d’une manière intacte à la génération suivante,
alors que chez les femmes les prémutations deviennent instables lors de l’ovogenèse
probablement lors de la méiose (Fu et al., 1991).
Bien que l’expansion des répétitions CGG soit retrouvée chez la plupart des patients affectés
par FXS, un seul cas de mutation ponctuelle faux-sens est connu à ce jour (De Boulle et al.,
1993). Alors que la longueur de la répétition CGG est normale chez ce patient (25 répétitions
CGG), une mutation est observée conduisant au replacement d’une isoleucine hydrophobe en
asparagine hydrophile en position 304 de la chaîne d’acides aminés constituant la protéine
FMRP (mutation I304N ; l’impact de cette mutation sur la fonction de FMRP est discuté au
chapitre II). L’identification d’une telle mutation confirme que l’absence ou l’altération de la
fonction de FMRP est la cause du FXS.
Le mosaïcisme et le FXS
Le mode de transmission du FXS lié au chromosome X permet d’expliquer la pénétrance
presque totale de la mutation complète chez les patients males qui ne possèdent qu’un seul
chromosome X maternel. Chez les femmes, un seul chromosome X est exprimé en raison du
phénomène d’inactivation d’un des deux chromosomes X durant l’embryogenèse. C’est ainsi
qu’en moyenne les femmes recevant un seul allèle muté du gène FMR1 vont être
« mosaïques » avec des cellules exprimant un niveau normal de FMRP et d’autres sans
FMRP. C’est pourquoi, les femmes hétérozygotes de la mutation FMR1 montrent des
20
phénotypes plus variables et atténués que les hommes (Wijetunge et al., 2013). Chez les
hommes, l’expression de FMRP peut être également mosaïque en fonction de la longueur des
répétitions CGG et/ou du degrée de méthylation du promoteur FMR1. Notons que le
pourcentage de cellules mosaïques et le niveau d’expression de FMRP semblent être tissu
spécifique (par exemple sang versus cerveau), et voire même région spécifique (différentes
régions du cerveau affectées différemment) (Tranfaglia, 2011).
Les phénotypes associés à la prémutation

Bien que les prémutations (répétitions de 55 à 200 CGG) ne causent pas le FXS, il a été
identifié récemment qu’elles peuvent provoquer deux troubles distincts : une ménopause
précoce chez les femmes (une insuffisance ovarienne prématurée - Fragile X Premature
Ovarian Insufficiency, FXPOI) et une ataxie cérébelleuse liée à l’X-fragile (Fragile X-
associated Tremor/Ataxia Syndrome, FXTAS) (Figure 4). L’incidence de la prémutation est
de 1/250 femmes et de 1/800 hommes (Pirozzi et al., 2011).
Environ 20% des femmes porteuses de la prémutation développeraient un syndrome FXPOI

avant l’âge de la quarantaine (Pirozzi et al., 2011). La corrélation entre le nombre des
répétitions CGG et le risque de développer FXPOI est une relation non-linéaire. Les femmes
porteuses de la prémutation allant de 80 à 100 CGG ont une probabilité plus élevée d’avoir
FXPOI que celles avec un nombre de répétitions proche de 200. Des problèmes hormonaux
sont observés chez les femmes porteuses de la prémutation avec FXPOI, mais les causes
moléculaires de ce syndrome ne sont pas encore déterminées.
Le syndrome FXTAS est une maladie neuro-dégénérative progressive caractérisée par un

tremblement intentionnel et une ataxie cérébelleuse à début tardif (Hagerman et al., 2001).
D’autres troubles peuvent être associés tels que des troubles parkinsoniens, une démence, un
déficit des fonctions exécutives et une altération cognitive. Notons que 30% des hommes avec
la prémutation développent FXTAS après 50 ans et près de 70 % après 75 ans. De plus, les
individus ayant une plus longue répétition (typiquement au dessus de 70) ont plus de risques
de développer un FXTAS (Hall and O'Keefe J, 2012). La prévalence du FXTAS chez les
femmes est moindre que chez les hommes. Elle est aux alentours de 16.5% dans les familles
avec des maladies liées à l’X fragile. Par ailleurs, quelques cas récents avec une mutation
complète sont diagnostiqués avec un FXTAS (ceci est probablement dû au mosaïcisme
observé avec différents nombres de répétition CGG ou différents degrés de méthylation, voir
21
Gène FMR1
5’UTR Phase codante
Prémutation
CGG
55-200 répétitions CGG
5’UTR de l’ARNm FMR1
Ribosomes
Répétitions CGG
5’
… 3’
DGCR8/DROSHA
SAM68
…
Poly-Glycine Poly-Alanine
Séquestration de protéines « RAN-translation »
Agrégats nucléaires Inclusions intracellulaires
Figure 5. Modèles des mécanismes moléculaires responsables du FXTAS

A gauche, l’expansion CGG au niveau de la région 5’UTR de l’ARNm séquestre des protéines
formant ainsi des agrégats nucléaires. A droite, une traduction non-canonique par la RAN-
translation produit des polypeptides (Poly-Glycine ou Poly-Alanine) responsables d’inclusions
intracellulaires cytotoxiques.
partie précedente : le mosaïcisme et le FXS). L’utilisation de l’IRM et les études post-mortem

des tissus de patients FXTAS ont permis de montrer des lésions de la substance blanche dans
certaines régions du cerveau (dans 60% des hommes avec FXTAS) et une présence
d'inclusions intranucléaires dans les neurones et les astrocytes, spécialement au niveau de
l’hippocampe, du thalamus et des ganglions de la base (Greco et al., 2002). D’un point de vue
moléculaire, le niveau de l’ARNm FMR1 chez les porteurs de la prémutation est augmenté en
corrélation avec la longueur des répétitions, et le niveau de la protéine FMRP est légèrement
réduit (une augmentation de 2 à 4 fois du niveau de l’ARN chez les individus avec une
prémutation allant de 55 à 100 CGG et de 4 à 10 fois chez ceux avec 100 à 200 répétitions
dans les lymphocytes). L’expansion de CGG au niveau de l’ARN conduirait ce dernier à
former des agrégats intranucléaires dont la taille augmenterait avec le temps et conduisant aux
inclusions observées chez les patients FXTAS. Ces agrégations sont probablement dues à la
séquestration de différentes protéines de liaison aux ARN telles que SAM68 et
DGCR8/DROSHA ((Sellier et al., 2010; Sellier et al., 2013); voir annexe), empêchant ainsi
ces protéines de réaliser leurs fonctions normales. Cette toxicité à gain de fonction de l’ARN
dérégulerait les neurones et les astrocytes provoquant ainsi leur mort (Figure 5).
Récemment, Todd et al. (2013) ont montré une nouvelle voie moléculaire pathogénique
associée aux répétitions CGG dans le gène FMR1. En combinant plusieurs modèles animaux
et cellulaires (drosophile, modèles souris de la prémutation CGG, lignées de cellules
humaines et tissus de patients FXTAS), les auteurs ont montré qu’une traduction non-
canonique peut se dérouler à partir des répétitions CGG dans deux cadres de lectures
différents : …C GGC GGC GGC… ou …CG GCG GCG… ; aboutissant à deux
polypeptides distincts: polyGlycine ou polyAlanine respectivement. Ce phénomène est appelé
« RAN-translation » pour signifier une traduction des répétitions indépendamment d’un codon
AUG initiateur classique (Repeat-Associated Non-AUG (RAN) translation). Ces entités
traduites (spécialement polyGlycine) s’accumulent dans des inclusions intracellulaires
observées chez les modèles et les patients FXTAS, et les auteurs proposent une contribution
de la RAN translation dans la neurodégénérescence. En effet, chez la drosophile, la toxicité
due aux répétitions CGG est corrigée en éliminant la RAN translation et induite par
l’activation de la production du peptide polyGlycine (Figure 5) (Todd et al., 2013).
22
5- Les modèles animaux du FXS

La grande conservation de la protéine FMRP a permis la réalisation de différents modèles
animaux du FXS, permettant des avancées majeures dans la compréhension de la fonction de
FMRP (Bhogal and Jongens, 2010).
Les différents modèles murins (Mus Musculus)

La protéine FMRP partage 97% d’identité en séquence d’acides-aminés avec son orthologue
murin (The Dutch-Belgian Fragile et al., 1994; Brackett et al., 2013). La stratégie de « knock-
out » (KO) a été utilisée pour créer le modèle murin du FXS. A ce jour, deux modèles Fmr1
KO (KO1 et KO2) et un modèle conditionnel (CKO) existent, et ils ont été réalisés par
l’utilisation de la recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires. Le KO1
a été réalisé en 1994 par l’insertion d’un marqueur de sélection codant pour la néomycine
dans l’exon 5 du gène Fmr1 interrompant ainsi la phase codante du gène (The Dutch-Belgian
Fragile et al., 1994). Le KO2 a été réalisé par l’insertion de sites LoxP de part et d’autres du
Promoteur et de l’exon 1 permettant, après croisement avec des souris exprimant la
recombinase Cre dans l’ovocyte mature, une recombinaison des sites LoxP et donc une
suppression de la séquence encadrée par ces sites dans tous les tissus (Mientjes et al., 2006).
Le CKO est un variant du KO2 avec l’allèle comportant les sites LoxP mais la recombinaison
peut être induite en fonction du tissu ou période étudiés. Ces différents modèles ne
reproduisent pas l’expansion de triplets nucléotidiques existant chez les patients FXS, mais
aboutit au même résultat du point de vue moléculaire avec l’absence du produit FMRP.
Notons que l’ARNm Fmr1 n’est pas totalement absent dans le modèle KO1 mais son niveau
est réduit à 27% par rapport au Wt, tant dis que dans le KO2, il est indétectable (0.09% par
rapport au Wt) (Mientjes et al., 2006)
Les souris Fmr1 récapitulent les caractéristiques majeures des patients FXS avec une
macroorchidie progressive pour les souris mâles (90% des souris Fmr1 présentent un volume
testiculaire supérieur à la normale) et des troubles subtils du comportement et de
l’apprentissage (Slegtenhorst-Eegdeman et al., 1998). En effet, la réalisation de tests
comportementaux et moteurs a permis de montrer que les souris Fmr1 présentent des signes
d’hyperactivité et de faible anxiété (par exemple, l’augmentation de l’exploration d’un endroit
donné et augmentation des mouvements dans un champ ouvert comparativement aux souris
Wt avec une tendance à rester au milieu du champ) (Peier et al., 2000), et qu’elles sont
23
sujettes à des crises épileptiques induites par des stimuli sonores (Audiogenic Seizures AGS)
(Yan et al., 2005). Notons que les souris Fmr1 deviennent résistantes aux AGS à l’âge adulte
(Yan et al., 2005), un phénotype corrélé à celui des patients FXS qui arrêtent les crises
d’épilepsies à la fin de leur adolescence (Wisniewski et al., 1991). Par ailleurs, les souris
Fmr1 présentent des troubles subtils de la mémorisation et de l’apprentissage tels que des
défauts en conditionnement de traces (étude de mémorisation en conditionnement de peur)
(Paradee et al., 1999; Zhao et al., 2005) ou encore des troubles de l’apprentissage spatial
dépendant de l’hippocampe lors de l’utilisation du test de Morris (mesure de la capacité et la
rapidité d’une souris à trouver et grimper sur une plateforme cachée dans un dispositif
aquatique circulaire) (The Dutch-Belgian Fragile et al., 1994; Kooy et al., 1996). Ce
phénotype observé avec le test de Morris qui n’a pas été récapitulé par certains laboratoires
semble dépendre en partie du fond génétique des souris Fmr1 (Paradee et al., 1999; Peier et
al., 2000)).
D’un point de vue neuroanatomique, les souris Fmr1 ne présentent pas de différences globales
de la morphologie de leur cerveau mais présentent des anomalies des épines dendritiques
semblables à celles des patients FXS (Nimchinsky et al., 2001; Irwin et al., 2002) (des épines
longues, fines et tortueuses et une augmentation de leur densité, voir §3). Chez les souris
modèles, ces anomalies des épines dendritiques semblent être dynamiques en fonction de
l’âge : les souris Fmr1 âgées d’une à deux semaines présentent des épines dendritiques plus
longues et anormales que les souris sauvages (Wt), mais ces mêmes différences sont moindres
chez les souris âgées d’un mois (28, 10 et 3% plus longues chez les souris Fmr1 âgées d’une,
deux ou quatre semaines respectivement comparativement aux souris Wt). Le même
phénomène est observé pour la densité des épines. Une différence de 33% de la densité est
observé pour des souris Fmr1 âgées d’une semaine par rapport aux souris Wt, mais cette
différence n’est plus détectée pour les souris âgées de 2 à 4 semaines (Nimchinsky et al.,
2001; Galvez and Greenough, 2005). Cependant, les différences des épines réapparaissent
chez les souris adultes (agées de 73 à 76 jours) (Galvez and Greenough, 2005). Les auteurs
suggèrent que les différences observées à l’âge adulte entre les deux types de souris
proviennent du passage des épines immatures aux épines matures chez les souris Wt au cours
du développement avec une altération de ce phénomène chez les souris Fmr1. Récemment,
Pan et al. (2010) ont utilisé l’imagerie intravitale par microscopie biphotonique afin de
montrer que le remodelage des épines dendritiques chez les souris Fmr1, incluant la formation
24
et l’élimination des nouvelles épines, est augmenté comparativement aux souris Wt

(phénomène visible très tôt au cours du développement et durant l’âge adulte) (Pan et al.,
2010). Cette augmentation du remodelage des épines est due à l’apparition et la disparition
des épines transitoires alors que la majorité des épines préexistantes ont une stabilité à long
terme comparable à celles des souris Wt. Ces épines transitoires ont en moyenne de petites
têtes et des cous longs et fins ressemblant aux formes d’épines immatures identifiées au
préalable chez les patients et les souris Fmr1 (Rudelli et al., 1985; Hinton et al., 1991;
Wisniewski et al., 1991; Irwin et al., 2001; Nimchinsky et al., 2001; Galvez and Greenough,
2005). L’utilisation de différents stimuli sensoriels modulant la formation ou l’élimination des
épines a permis de montrer que les souris Fmr1 sont insensibles à cette modulation
dépendante du stimuli-sensoriel comparativement aux Wt (Pan et al., 2010).
Des analyses électro-physiologiques ont été conduites chez les souris Fmr1 dans plusieurs
régions impliquées dans les processus de mémoire et d’apprentissage, afin de définir les
altérations de la plasticité synaptique associés au FXS. Des analyses sur des coupes
d’hippocampes montrent une augmentation de la dépression à long terme (Long Term
Depression – LTD) en réponse d’une stimulation électrique ou lors de l’activation des
récepteurs aux glutamates de type I (mGluR I (1 ou 5)) ou des récepteurs muscariniques de
l'acétylcholine (mAchRs) par des agonistes spécifiques (Huber et al., 2002; Volk et al., 2007)
(mécanismes détaillés au chapitre suivant). L’activation de ces deux récepteurs et l’induction
de cette forme de LTD nécessitent une traduction locale de protéines. Ces travaux ont permis
de conclure que cette forme de plasticité synaptique requiert donc la traduction. Notons
qu’une autre forme de LTD dépendante de l’activation des récepteurs glutamatergiques
ionotropiques de type N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) et la potentialisation à long terme
(Long Term Potentiation – LTP) dans l’hippocampe ne sont pas affectés (Paradee et al., 1999;
Huber et al., 2002; Li et al., 2002). D’autres études ont également montré des défauts de LTP
au niveau de différentes régions du cortex et de l’amygdale latérale (Li et al., 2002; Zhao et
al., 2005; Desai et al., 2006). L’induction de LTP au niveau de la couche profonde (V) du
cortex visuel a été montrée être dépendante de l’activation mGluR5, et elle est sévèrement
réduite dans les souris Fmr1 (Wilson and Cox, 2007). Le défaut de LTP observé au niveau du
cortex peut être âge-dépendant en fonction de la région concernée, par exemple dans le cortex
piriforme antérieur une altération de LTP apparait uniquement chez les souris âgées de plus
de 6 mois (Larson et al., 2005). Notons que l’absence d’effet sur la LTP au niveau de
25
l’hippocampe est âge-indépendant. Les altérations de LTD et LTP, deux mécanismes

importants pour le remodelage des épines lors de l’activité synaptique, montrent que les souris
Fmr1 ont des défauts de la plasticité cérébrale responsable de la mémoire et de
l’apprentissage. Par ailleurs, les souris Fmr1 ont une espérance de vie, une fécondité et un
poids comparable aux souris Wt.
Des souris transgéniques exprimant un chromosome artificiel de levure (Yeast Artificial

Chromosome ; YAC) comportant le gène FMR1 (avec 20 répétitions CGG et des régions
supplémentaires en amont et en aval du gène) ont été croisées avec des souris Fmr1, afin de
vérifier si l’expression de FMRP peut corriger les phénotypes observés des souris Fmr1 (Peier
et al., 2000). Ces souris transgéniques surexpriment une protéine FMRP humaine (10 à 15 fois
plus d’expression par rapport aux souris Wt). Le croisement avec les souris Fmr1 corrige la
macroorchidie et provoque des troubles du comportement opposés à celui des souris Fmr1.
Elles sont hypoactives et plus anxieuses que les souris Wt. Ces données confirment le rôle de
FMRP au niveau des activités locomotrices et de l’anxiété.
Un modèle murin de la mutation faux sens I304N (souris Fmr1-I304N) identifiée chez un
patient FXS (voir §4), a été également réalisé et récapitule les caractéristiques majeures des
souris Fmr1 (The Dutch-Belgian Fragile et al., 1994) et des patients FXS (Zang et al., 2009).
En effet, les souris Fmr1-I304N présentent une macroorchidie, des troubles cognitifs et
comportementaux, une hyperactivité et une susceptibilité aux crises audiogènes (AGS). Chez
ces souris, l’ARNm Fmr1-I304N est transcrit au même niveau que celui des souris Wt tandis
que le niveau de la protéine correspondante (FMRP-I304N) est réduit à ~30% par rapport à
FMRP Wt. Cet effet est plus marqué durant la synaptogenèse (14 jours après la naissance).
L’utilisation de ce modèle FXS a permis de montrer que FMRP-I304N perd ses
caractéristiques majeures de liaison aux ARN et d’association aux polyribosomes (des
fonctions décrites aux chapitre II et III) (Zang et al., 2009).
Par l’utilisation de la stratégie « knock in » (KI), Brouwer et al. (2007) ont réalisé des souris
transgéniques d’environ 230 répétitions de CGG au niveau de la région 5’UTR du gène Fmr1
afin de « mimer » la mutation complète observée chez l’homme. Contrairement aux patients
FXS, cette longueur de CGG n’induit pas la méthylation du promoteur et l’inhibition de la
transcription du gène Fmr1 chez la souris. Le niveau d’ARNm Fmr1 est augmenté de 5 fois
par rapport aux souris contrôles avec une réduction de l’expression de FMRP. Ces résultats
26
suggèrent la nécessité d’avoir des expansions CGG plus longues ou d’autres manipulations
génétiques afin d’obtenir la mutation complète chez la souris (Brouwer et al., 2007).
Le « poisson zèbre » (Danio rerio)

La protéine FMRP chez le poisson zèbre partage 72% d’identité avec son orthologue humain.
Chez le poisson, comme chez l’homme, FMRP est fortement exprimée au niveau du cerveau,
y compris le télencéphale, le diencéphale, le métencéphale, la moelle épinière et le cervelet
(Ng et al., 2013).
En 2006, Tucker et al. ont utilisé la stratégie d’injection de morpholinos (MO) dans des
embryons de 1 à 2 jours afin d’inhiber l’expression de FMRP (Knock Down). Les MO sont
des oligonucléotides anti-sens dont les désoxyriboses sont substitués par des
phosphorodiamidates MO. Ces oligonucléotides modifiés ciblent l’ARNm Fmr1 et empêche
sa traduction normale pour un maximum de 4 jours. L'inhibition de la traduction est donc
transitoire. Les injections de MO contre l’ARNm Fmr1 ont permis de montrer des défauts de
branchements axonaux, des changements dans le nombre de ganglion de Gasser (ganglion
nerveux situé sur le trajet du nerf trijumeau) et des anomalies crânio-faciales. Des effets
beaucoup plus sévères que ceux observés chez la souris suggèrent un effet « off-target » non-
spécifique.
En 2009, Den Broeder et al. ont généré des mutants Fmr1 KO en utilisant la stratégie appelée
TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) qui permet d’induire des lésions
locales ciblées au niveau du génome et sélectionner par la suite des mutants nuls n’exprimant
pas FMRP (den Broeder et al., 2009). Ces mutants sont viables et ne présentent pas
d’anomalies de développement contredisant les résultats obtenus avec les morpholinos
(Tucker et al., 2006). Récemment, (Ng et al., 2013) ont caractérisé ce modèle KO du poisson
zèbre, et ils ont observé que chez les adultes, les poissons présentent des troubles du
comportement avec une augmentation de l’exploration lors des test de champ ouvert ou
encore le passage de compartiments lumineux vers des compartiments obscurs. Ces mutants
présentent également des troubles de l’apprentissage. De plus, des études d’électrophysiologie
sur des coupes de cerveaux adultes montrent des réductions de LTP et des augmentations de
LTD par rapport aux poissons Wt, mais sans altération de la transmission synaptique
glutamatergique basale.
27
Le modèle drosophile (Drosophila melanogaster)

La protéine FMRP chez les mammifères appartient à une famille de trois protéines incluant
FMRP et ses deux paralogues FXR1P et FXR2P (voir chapitre II, §2). Chez la drosophile,
dFXRP (le nom du gène : dFxr) constitue le seul orthologue des trois protéines de la famille
FXR chez les mammifères. Le taux de similarité entre dFXRP et FMRP en particulier est de
56% avec une forte conservation de la plupart des domaines fonctionnels (Wan et al., 2000;
Zhang et al., 2001). dFXRP est exprimée de manière ubiquitaire au cours des premiers stades
du développement mais par la suite l’expression devient prédominante au niveau du cerveau,
de la chaine nerveuse centrale, des muscles et des testicules. Cette expression correspond à un
profil mixte d’expression des 3 protéines FXR chez les mammifères (FMRP est prédominante
au niveau du cerveau et des testicules, FXR1P au niveau du muscle ; voir chapitre II). dFXRP
est localisée exclusivement au niveau du cytoplasme des cellules, et elle est fortement
exprimée dans les neurones avec une localisation au niveau du perikaryon et des dendrites
(Wan et al., 2000; Zhang et al., 2001; Lee et al., 2003). Notons que le gène dFxr ne présente
pas les répétitions CGG identifiées chez les mammifères au niveau de la région 5’UTR du
gène. Différents isoformes de dFXRP existent, comme pour les mammifères, mais leurs
fonctions restent à être déterminées. Au cours du développement chez la drosophile, deux
transcrits dFxr de tailles différentes ont été identifié (2,8 kb et 4 kb) mais codant pour une
protéine de même poids moléculaire suggérant des différences au niveau des régions non
traduites de l’ARN (Wan et al., 2000).
Chez la drosophile, différents mutants du gène dFxr ont été isolés et caractérisés : des mutants
hypo- ou hyper- morphes (une faible ou une surexpression de dFXRP respectivement), des
mutants nuls (une absence complète de dFXRP) et des mutants dFxr-I307N (présence d’une
mutation équivalente à I304N du patient FXS) (Zhang et al., 2001; Dockendorff et al., 2002;
Inoue et al., 2002; Lee et al., 2003). Ces différents mutants sont viables, mais ils présentent
des altérations de l’activité dépendante du rythme circadien (Dockendorff et al., 2002; Inoue
et al., 2002), des réductions du comportement de parade nuptiale (Dockendorff et al., 2002) et
des défauts de la mémoire à long terme (Bolduc et al., 2008). De plus, ces mutants présentent
des altérations de l’architecture des synapses et de la neurotransmission synaptique (Zhang et
al., 2001; Dockendorff et al., 2002). Les mutants dFxr-nul montrent une prolifération des
synapses avec une augmentation des boutons et des branchements synaptiques, tandis que la
surexpression de dFXRP induit l’effet opposé avec des boutons synaptiques moindres et plus
28
larges. De plus, les mutants dFxr perturbent la neurotransmission synaptique au moins à deux
types différents de synapses : les photorécepteurs histaminergiques (des synapses centraux) et
les jonctions neuromusculaires glutamatergiques (des synapses périphériques) (Zhang et al.,
2001). D’une manière surprenante, la surexpression ou la délétion de dFXRP abouti aux
mêmes altérations de la neurotransmission en réduisant significativement la transmission de
synapses centrales et en exagérant celle des synapses périphériques. Ces observations
permettent de proposer que les fonctions de dFXRP peuvent être différentes en fonction des
synapses concernées (Zhang et al., 2001). Le mutant dFxr-I307N n’est pas un dominant
négatif mais il est plutôt associé à une perte de fonction de la protéine. Par ailleurs, les
drosophiles mâles dFxr présentent une forte réduction de la fertilité (Coffee et al., 2010).
Les mutants dFxr présentent donc de fortes similarités des phénotypes moléculaires,
cellulaires et comportementaux avec les patients FXS, mais dFXRP correspond à l’orthologue
des 3 FXR chez les mammifères. Afin d’étudier la contribution de FMRP au niveau des
phénotypes observés, Coffee et al. (2010) ont exprimé et étudié la capacité des 3 gènes
paralogues humains à corriger les mutants dFxr en réalisant des mutatnts tissus-spécifiques.
Contrairement aux protéines FXR1P et FXR2P, FMRP corrige à la fois les mécanismes
moléculaires et cellulaires des défauts neuronaux. En ce qui concerne les défauts non-
neuronaux, les trois protéines corrigent de la même manière les problèmes de fertilité des
drosophiles mâles associés à des défauts de la spermatogenèse. Ces résultats suggèrent que la
fonction de FMRP est conservée au cours de l’évolution pour les mécanismes neuronaux et ne
peut être compensé par FXR1P ou FXR2P, mais toutes les 3 protéines semblent pouvoir se
substituer pour les fonctions non-neuronales (Coffee et al., 2010). Ces observations indiquent
des fonctions spécifiques et distinctes de FMRP au niveau de la régulation de l’expression
neuronale et la connectivité synaptique, par rapport à ces paralogues.
L’utilisation de la drosophile comme modèle a permis à Chang et al. (2008) de découvrir que
les mutants dFxr-nuls meurent durant le développement s’ils sont élevés en présence de
nourriture avec un excès en glutamate. Cette observation a permis de trouver 9 molécules
chimiques qui peuvent corriger cette létalité. Parmi ces composants, 3 molécules agissent sur
la voie inhibitrice gabaergique (GABA : acide alpha-aminobutyrique) et 2 molécules visent
les récepteurs muscariniques (mAchRs), soulignant un lien important de ces deux voies dans
la fonction de dFXRP. L’utilisation du GABA permet de corriger différents phénotypes des
29
mutants dFxr tels que les réductions observées du comportement de parade nuptiale (Chang et
al., 2008).
Durant ma thèse, j’ai utilisé le modèle murin Fmr1 KO2 qui est bien établi au laboratoire afin
d’étudier la fonction de FMRP au sein des neurones. Nous avons vu que ce modèle animal du
FXS est bien caractérisé et récapitule correctement les phénotypes des patients FXS tels que
les troubles du comportement ou encore les anomalies des épines dendritiques. Un des
avantages des souris modèles est la possibilité de réaliser des cultures primaires de neurones.
30
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Répétitions
CGG
B 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 17
I304N S500
C 71 kDa 1 2 1 2
Agenet/
NLS KH NES RGG
Tudor
Acide aminé
0 100 200 300 400 500 600
Figure 6. Le gène FMR1, l’ARNm et la protéine FMRP

A, le gène FMR1. Les régions codantes (vert foncé), non-codantes (vert clair) et les introns
(lignes continus noirs) sont schématisés. Les lignes bleues indiquent l’épissage alternatif. B,
l’ARNm FMR1. Les exons (bleus clairs) sont schématisés au-dessus de leur séquence en acide
aminé. C, la protéine FMRP. NLS, signal de localisation nucléaire ; KH, domaine d’homologie
avec hnRNP K ; NES, signal d’export nucléaire ; RGG, domaine riche en arginine-glycine-
glycine; S500, serine premièrement phosphorylée ; I304N, mutation ponctuelle identifiée chez
un patient FXS (d’après Santoro et al., 2011)
Chapitre II : FMRP et ses caractéristiques fonctionnelles majeures
Chapitre II : FMRP et ses caractéristiques

fonctionnelles majeures
Comme nous l’avons vu dans le chapitre I, l’absence ou la perte des fonctions de la protéine
FMRP est la cause moléculaire du FXS. Depuis la découverte et le clonage du gène en 1991
(voir chapitre I, §4), l’identification et la compréhension de fonctions de FMRP sont devenues
un enjeu majeur.
1- Le gène FMR1 : de son ARN messager à sa protéine FMRP

Rappelons que le gène FMR1 s’étend sur 40 Kb au niveau du locus Xq27.3. La transcription
de ce gène produit un ARNm d’environ 4 kb (0,2 kb : 5’ UTR ; 1,8 kb : 3’UTR et 1,9 Kb :
séquence codante) comportant 17 exons (Figure 6A, B) (ENST00000370475) (Khandjian et
al., 1995). Ce transcrit primaire, comme beaucoup de transcrits dans le système nerveux
central, est soumis à un épissage alternatif produisant différents isoformes (Iso) de la protéine
avec des propriétés biochimiques éventuellement distinctes (Ashley et al., 1993b; Verkerk et
al., 1993). En moyenne, FMRP est une protéine de 632 acides aminés (Adinolfi et al., 2003).
L’isoforme le plus long (Iso1) contient une variété de domaines et séquences
fonctionnels incluant trois domaines de liaisons aux ARN (RBD, RNA Binding Domain), des
domaines d’export et de localisation nucléaire et des sites de modifications post-
traductionnels (décrits au paragraphe suivant). L’isoforme le plus abondant Iso7 ne contient
pas l’exon 12 et a un poids moléculaire (MW – Molecular Weight) de 71 kDa (kiloDaltons).
Les autres événements d’épissages affectent soit l’inclusion ou l’exclusion des exons 12 et 14,
codants pour une extension d’un des RBD et un signal d’export nucléaire (NES, Nuclear
Export Signal) respectivement, ainsi que l’utilisation de différents sites accepteurs au niveau
des exons 15 et 17, permettant l’exclusion ou l’inclusion des sites de modifications post-
traductionnels (Figure 5A, B) (Sittler et al., 1996; Brackett et al., 2013). L’exclusion de
l’exon 14 induit un décalage du cadre de lecture modifiant la composition de la région C-
terminale de la protéine. Par RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction),
20 isoformes différents sont prédits avec un MW allant de 47 à 71 kDa (Sittler et al., 1996).
Par Western blot, 4 à 5 bandes (de 70 à 80 kDa) sont observées mais différents isoformes
peuvent avoir le même MW (Devys et al., 1993; Khandjian et al., 1995). Des anticorps
spécifiques des différents isoformes ne sont toujours pas disponibles à ce jour, c’est pourquoi,
31
Intestin grêle
Testicule
Péritoine
Estomac
Cervelet
Cerveau
Poumon
Muscle
Ovaire
Vessie
Utérus
Côlon
Cœur
Peau
Rein
Rate
Foie
Figure 7. Expression de FMRP chez la souris adulte
Détection de FMRP par « western blot » sur des extraits protéiques de différents tissus
et organes de la souris adulte à l’aide de l’anticorps monoclonal 1C3 (Khandjian et al.,
1995).
Figure 8. Localisation de FMRP dans des cultures de neurones

Des cultures primaires d’hippocampes (9 jours) ont été immuno-marqué contre FMRP
avec l’anticorps 1C3, utilisant une technique indirecte de la phosphatase alcaline (une
réaction positive est illustrée avec un précipité rouge) (Tamanini et al., 1997).
Brackett et al. (2013) ont quantifié l’expression par qRT-PCR des profils de 12 variants
d’ARNm Fmr1 dans les polyribosomes. Ceci a permis d’identifier que tous les transcrits
possibles sont potentiellement traduits (55 à 90% du niveau global de ces ARN sont associés
aux polyribosomes) dans différentes régions du cerveau de souris, essentiellement dans les
neurones. D’une manière générale, l’exclusion de l’exon 12 (Iso 7 à 12) semble être un
phénomène fréquent contrairement à celle de l’exon 14 (Iso 4 à 6 et 10 à 12, aboutissant à une
forme nucléaire de la protéine). Une étude de ces mêmes transcrits durant le développement
embryonnaire (à partir de 9 jours : E9) et post-natale (jusqu’à 40 jours après la naissance) a
permis de montrer que les 12 ARN sont exprimés au même niveau à E9, mais les isoformes
excluant l’exon 12 (Iso 7 à 12) deviennent majoritaires durant le développement par rapport à
ceux incluant cet exon (Iso 1 à 6) (Brackett et al., 2013). La fonction exacte de ces différents
isoformes reste à déterminer.
2- L’expression et les domaines fonctionnels de FMRP

Chez l’homme et la souris, FMRP est exprimée dans la grande majorité des tissus fœtaux et
adultes, mais à l’âge adulte, son niveau d’expression est très élevé au niveau du cerveau, des
ovaires et des testicules et très faible au niveau des muscles (Figure 7) (Devys et al., 1993;
Hinds et al., 1993; Tamanini et al., 1997). L’étude de la dynamique d’expression de FMRP au
cours du développement embryonnaire chez la souris a permis de montrer que FMRP est
exprimée très tôt et augmente progressivement jusqu’à atteindre un pic d’expression au
dixième jour de gestation. Puis, l’expression est réduite progressivement jusqu’à atteindre un
niveau basal dans tous les tissus testés, sauf au niveau du cerveau et des testicules où une forte
expression est maintenue jusqu’à l’âge adulte (Hinds et al., 1993). Au niveau du cerveau,
FMRP est principalement présente au niveau des neurones du cortex, de l’hippocampe et du
cervelet. Elle est observée surtout au niveau du perikaryon des neurones et des dendrites
proximales (Figure 8) (par exemple : les cellules de purkinje localisées à l’interface entre les
couches granulaires et moléculaires du cervelet) (Devys et al., 1993; Tamanini et al., 1997).
Un marquage faible et occasionnel peut être observé au niveau du noyau des neurones et des
cellules non neuronales (cellules gliales). Au niveau des testicules adultes humains, FMRP est
essentiellement dans le cytoplasme des spermatogonies (des cellules adjacentes de la
membrane basale des tubes séminifères) avec un marquage granulaire. Chez le fœtus (20
semaines), FMRP se localise au niveau des cellules germinales primordiales (des cellules qui
32
naissent du mésoderme extra embryonnaire au moment de la gastrulation) (Devys et al., 1993;

Tamanini et al., 1997).
Le domaine NDF, une plateforme pour les interactions protéine-protéine

Le domaine NDF (N-Terminal Domain of FMRP ; 134 acides aminés) est composé de deux
motifs répétés appelés NDF1 (de 3 à 50) et NDF2 (de 63 à 113), suivi d’une petite hélice
alpha (de 122 à 126) (Adinolfi et al., 2003; Ramos et al., 2006). L’interaction de ces trois
motifs structuraux est nécessaire pour la stabilité du domaine, avec l’hélice alpha qui interagit
avec NDF1 formant une cavité hydrophobe. Les motifs NDF1 et NDF2 appartiennent à la
superfamille “royale” (chromodomain, tudor domain, malignant brain tumor (MBT), PWWP
et plant Agenet module) formés chacun de 4 feuillets beta antiparallèles et également appelés
les domaines Agenet/Tudor (Figure 6C). Ces domaines sont connus avoir de nombreuses
fonctions, incluant les interactions protéine-protéine et la fixation des lysines méthylées qui
pourraient faciliter l’adressage de FMRP au noyau (Winograd and Ceman, 2011). Malgré la
ressemblance structurale des deux motifs répétés, NDF2 est moins compacte et mieux définie
que NDF1, présentant ainsi des propriétés fonctionnelles et dynamiques différentes. En effet,
le deuxième domaine interagit spécifiquement avec une lysine méthylée et la protéine 82-FIP
(82 kDa FMRP Interacting Protein ; un des partenaires protéiques de FMRP, voir §3). Notons
que la majorité des partenaires protéiques de FMRP interagit via le domaine NDF. Ce
domaine est hautement conservé chez les paralogues de FMRP et au cours de l’évolution. Le
criblage de mutations chez la drosophile a permis d’identifier plusieurs résidus conservés, au
niveau de la région NDF, qui sont importants pour maintenir une morphologie normale des
synapses (Reeve et al., 2008). Ces observations soulignent l’importance du domaine NDF
dans le phénotype neuronal du FXS. De plus, le domaine NDF renferme un signal de
localisation nucléolaire de la protéine (Ramos et al., 2006). L’exon 7 renferme un domaine
coiled-coil qui permet l’homo-dimérisation de FMRP, aussi bien que l’hétéro-dimérisation
avec les protéines paralogues (FXR1P et FXR2P) (Siomi et al., 1996). Cette même région est
décrite comporter un motif hélice-coude-hélice (Sjekloca et al., 2009).
Les domaines NLS/NES

L’utilisation de différents fragments de FMRP et des mutations dirigées ont permis de révéler
l’existence des signaux de localisation et d’export nucléaires (NLS : Nuclear Localisation
Signal et NES : Nuclear Export Signal) (Figure 6C). L’utilisation d’une forme tronquée de la
33
protéine, avec les 167 aa en N-terminal, est suffisante pour adresser ce fragment au noyau,
indiquant la présence d’un domaine NLS dans cette région (Eberhart et al., 1996). Le NLS de
FMRP est situé entre les résidus 115 et 150 et son activité peut être renforcée par la région
151 à 196 (Bardoni et al., 1997). FMRP renferme également un domaine NES localisé au
niveau de l’exon 14 (de 425 à 489 aa) (Figure 6C). La délétion de cet exon augmente la
localisation nucléaire de la protéine. 19 acides aminés comportant le début de l’exon 14 (de
418 à 437 aa) sont suffisants pour adresser FMRP ou une protéine nucléaire hétérologue au
cytoplasme. Cette séquence LRLERLQI (429 à 437) est similaire au NES présent au niveau
de la protéine REV du virus HIV-1 (LPPLERLTL) et elle peut même le remplacer lors des
tests d’exports nucléaires (Fridell et al., 1996; Bardoni et al., 1997). La présence simultanée
d’un NLS et d’un NES dans la séquence d’acides-aminés de FMRP suggère qu’elle peut faire
la navette entre le noyau et le cytoplasme. Cette hypothèse fut confirmée par des expériences
d’inhibition de l’export nucléaire en traitant les cellules à la leptomycine B (inhibe
l’interaction avec l’exportine-1) induisant une accumulation partielle de FMRP dans le noyau
(Tamanini et al., 1999).
Les domaines de liaisons aux ARN

La caractéristique majeure de FMRP est sa capacité de lier et « potentiellement » de réguler
des ARNm spécifiques ayant des fonctions importantes pour la plasticité synaptique. Elle
comporte trois domaines de liaisons aux ARN, dont deux domaines KH répétés en tandem et
une boite RGG.
Les domaines KH
Les domaines KH ont été identifiés initialement dans la protéine hnRNP K (heterogeneous
nuclear RiboNucleoProtein K). Ces domaines sont retrouvés dans beaucoup de protéines de
liaison aux ARN, et bien souvent répétés en tandem de 2 à 16 fois (Valverde et al., 2007). Le
domaine minimal est composé de 45 acides aminés, et il se caractérise par un repliement de
type « ȕĮĮȕ » avec un consensus GXXG au niveau d’une boucle reliant les deux hélices
ĮĮ2 ensembles. Les domaines KH sont classifiés par un repliement de type I (ȕĮĮȕȕ Į )
ou de type II (Į ȕ ȕĮĮȕ) en fonction des extensions en C ou N-Terminal du domaine. A
ce jour, les domaines KH de type I sont uniquement retrouvés chez les eucaryotes, tandis que
les domaines de type II sont exclusivement procaryotiques.
34
A
Domaine KH de type I :
motif KH minimal
-
H3+N COO
Domaine KH de type II :
motif KH minimal
-
H3+N COO
KH1 Boucle variable
KH2
Boucle variable
Figure 9. Structure cristallographique des domaines KH de FMRP

A, schématisation du repliement des domaines KH eucaryotique (de type I) et
procaryotique (de type II). Les lignes pointillées correspondent aux boucles variables.
B, structure cristallographique des domaines KH1-KH2 de FMRP humaine. KH1 est
présenté en violet et KH2 en bleu (Valverde et al., 2007).
FMRP contient deux domaines KH de type I en tandem (Figure 6) : KH1 codé par les exons
8-10 (acides aminés 212 à 266) et KH2 codé par l’exon 13 (acides aminés 285 à 328).
L’importance fonctionnelle de ces domaines fut soulignée par l’identification d’un patient
FXS avec la mutation I304N localisé au niveau du KH2 (De Boulle et al., 1993) (voir chapitre
I). En 2007, la cristallographie des deux domaines KH a été réalisée montrant que le résidu
I304 est inaccessible au solvant, enfoui dans une poche hydrophobe de la protéine (Figure 9)
(Valverde et al., 2007). Ce résidu est donc peu susceptible d’interagir avec un ligand, sauf si
des réarrangements structuraux ont lieu après fixation d’un ligand par la protéine. La mutation
I304N perturbe la structure du domaine et diminue sa stabilité. De plus, cette mutation dans
la protéine complète semble altérer la liaison de la protéine aux ARN (Siomi et al., 1994;
Darnell et al., 2005) et son association aux polyribosomes (Zang et al., 2009), deux fonctions
majeures de FMRP (décrites au chapitre III).
La boîte RGG
La boite RGG de FMRP est localisée entre les acides aminés 527 et 552 au niveau de l’exon
15 (Figure 6C) (Ramos et al., 2003). Ce domaine a été identifié dans la protéine hnRNP U
(heterogenous nuclear RiboNucleoProtein U), et il est généralement considéré comme un
domaine ayant des propriétés de liaison à l’ARN via des forces électrostatiques non-
spécifiques. Cependant, ce domaine dans FMRP est montré reconnaitre des structures d’ARN
spécifiques par des liaisons hydrogènes et hydrophobes avec de très peu de liaisons
électrostatiques (Zanotti et al., 2006). La composition riche en Arginine (28%) et en Glycine
(44%) suggère une flexibilité du domaine RGG. Des études biophysiques (telle que la RMN)
d’un peptide recombinant de 32 acides-aminés de FMRP comportant la boite RGG a confirmé
que ce domaine est flexible et instructuré (Ramos et al., 2003). A ce jour, toutes les
interactions de FMRP avec ses ARN cibles sont montrées être réalisées via le domaine RGG,
et ce motif est suffisant pour reconnaitre une structure d’ARN répliée en G-quadruplexe in
vitro (Darnell et al., 2001; Schaeffer et al., 2001; Phan et al., 2011). Ces structures G-
quadruplexes ont été identifées initialement dans l’ARNm FMR1 (Schaeffer et al., 2001) et
dans plusieurs ARNm cibles de FMRP (Brown et al., 2001) (discutés au chapitre III). Le
domaine RGG reconnait également un autre motif de trois tiges boucles appelé SoSlip
(Bechara et al., 2009).
35
FMRP 1 2 1 2
Agenet/
NLS KH NES RGG Nucléoline
Tudor
YB1/P50
Acide aminé
0 100 200 300 400 500 600 ? Pur-alpha
mStaufen
Myosine Va
419 - 632
490 - 526 ?
62 - 134 171 - 211 RanBPM
MSP58 DSCR1
NUFIP FMRP
427 - 442
82-FIP FXR1P 470 - 526 KIF3c
CAPRIN-1
FXR2P SMN
CYFIP1 216 – 332

CYFIP2 430 - 486
RAC1
TDRD3
Actine
TOP3b
Figure 10. Réseau des principaux interacteurs protéiques de FMRP

FMRP est schématisée avec ses différents domaines. Une échelle en acide aminé est
positionnée en dessous sur toute la longueur de FMRP. Les flèches pleines à double sens
indiquent les protéines dont une interaction directe avec FMRP a été montrée. La flèche en
pointillée à double sens indique les protéines avec lesquelles FMRP a été trouvée au sein
de complexes. Les chiffres indiquent les portions de FMRP impliquées dans l’interaction
avec ses partenaires et le « ? » indique à ce jour l’absence de motifs.
3- Les principales protéines associées à FMRP

Beaucoup de protéines partenaires ont été identifiées dans des complexes
RiboNucléoProtéiques (RNP) comportant FMRP, mais des interactions directes ne sont pas
toujours clairement montrées (Figure 10). Parmi ces partenaires, la majorité correspond à des
protéines associées au cytosquelette ou ayant des propriétés de liaison aux ARN. L’interaction
de ces protéines à FMRP pourrait moduler ses fonctions, notamment son affinité pour les
ARNm cibles.
Les paralogues: FXR1P et FXR2P

FMRP est un membre d’une petite famille de protéines, incluant deux paralogues
autosomaux : Fragile x related 1 protein (FXR1P) et fragile x related 2 protein (FXR2P).
Leurs gènes sont localisés au niveau des locus 3q28 et 17p13.1 respectivement. FXR1P et
FXR2P possèdent 17 exons, comme FMRP, partageant environ 60% d’identité. Le profil
d’expression des trois protéines au niveau du cerveau des mammifères est d’une manière
globale similaire. Elles sont fortement présentes dans le cytoplasme de plusieurs types de
neurones fœtaux et adultes. Notons que FXR1P montre également une forte localisation
nucléaire dans le fœtus contrairement au cerveau adulte (Tamanini et al., 1997). Dans les
cultures primaires d’hippocampes, leur expression est également cytoplasmique avec une
localisation au niveau des dendrites proximales. Les trois protéines FXR partagent de fortes
homologies de séquences au niveau de leurs domaines fonctionnelles, incluant les domaines
Agenet/Tudor, NLS, NES, KH1 et KH2, suggérant des fonctions communes telles que
l’association aux ARN et la capacité de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme. Les
trois protéines FXR peuvent héterodimeriser via l’exon 7 (de 171 à 211 aa), et peuvent
interagir avec la sous-unité 60S du ribosome, via la région couvrant les exons 13 et 14,
directement et indépendamment les unes des autres (Figure 10) (Siomi et al., 1996). De plus,
elles sont associées aux polyribosomes suggérant des fonctions de régulation de la traduction
ou de la stabilité de l’ARN (Feng et al., 1997a). Ces similarités suggèrent que les protéines
paralogues pourraient compenser partiellement l’absence de FMRP chez les patients FXS
(Feng et al., 1997a). Toutefois, ces protéines semblent avoir acquis des fonctions distinctes.
En effet, bien qu’ayant une localisation similaire à celle de FMRP dans le cerveau, elles ont
une localisation différente dans les cellules musculaires et testiculaires (Tamanini et al.,
1997). De plus, dans le noyau, FMRP et FXR1P ont une localisation au niveau du
36
nucléoplasme, tandis que FXR2P est plutôt au niveau du nucléole (Tamanini et al., 2000). En
effet, FXR2P comporte un fragment de résidus basiques au niveau de la région C-terminale
ressemblant au signal nucléolaire de la protéine viral Rev du HIV1. Ce domaine (16 aa) est
absent dans tous les isoformes de FMRP et il n’est présent que dans quelques isoformes de
FXR1P (Iso e et f), étant donné que la région comportant ce motif peut être alternativement
épissé (Tamanini et al., 2000).
A ce jour, aucune pathologie humaine n’a été trouvée associée à des mutations dans les gènes
FXR1 ou FXR2. Afin d’étudier les fonctions des paralogues in vivo, des souris modèles ont été
réalisées. Les souris homozygotes Fxr1 (-/-) meurent rapidement après la naissance, à cause
de défauts cardiaques ou respiratoires (Mientjes et al., 2004). Des études d’histochimie à l’âge
embryonnaire E19 montrent des défauts de l’architecture et de la structure des cellules
cardiaques et squelettiques. Des souris modèles exprimant faiblement FXR1P ne montrent pas
de létalité après la naissance, mais présentent une forte réduction de la musculature des
membres inférieurs avec une réduction de l’espérance de vie à environ 18 semaines. Le gène
Fxr1 est fortement exprimé dans le muscle et son pré-ARNm est sujet à de multiples
épissages alternatifs générant différents variants avec des régions C-terminales divergentes.
Quatre isoformes de 70 à 80 kDa (Iso a, b, c, d) sont exprimés de manière ubiquitaire, mais
deux isoformes de 82 et 84 kDa (Iso e et f) sont fortement exprimés au niveau des myoblastes
après différentiation musculaire. Ces deux variants sont les seuls exprimés au niveau du
muscle adulte. Davidovic et al., (2008) ont montré une réduction de l’expression des
isoformes musculaires due à une diminution de la stabilité des ARNm correspondants, dans
les myotubes et les myoblastes dérivés des patients atteints de la dystrophie musculaire facio-
scapulo-humérale (FSH ou FSDH ; une dystrophie musculaire progressive autosomique
dominante fréquente) (Davidovic et al., 2008). Ceci peut donc contribuer à la
physiopathologie du FSDH, étant donné que FXR1P est proposée réguler le métabolisme des
ARNm durant la myogenèse. Très peu d’ARNm cibles de FXR1P sont identifiés à ce jour,
mais récemment Davidovic et al., (2013) (voir annexe) ont réalisé une analyse d’expression
de gènes sur des cellules de myoblastes « déplétés » de FXR1P, révélant des altérations du
niveau des transcrits impliqués dans le cycle cellulaire et des voies du développement
musculaire. Ces résultats sont confirmés par des altérations du cycle cellulaire des myoblastes
en absence de FXR1P. Parmi ces ARNm, FXR1P est proposé diminuer la stabilité de
l’ARNm P21 (CDKI-P21 ; Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor) en se fixant sur une structure
37
G-quadruplexe (discuté au chapitre suivant) au niveau de la région 3’UTR ((Davidovic et al.,

2013) ; voir annexe). Ceci est corrélé avec une augmentation du niveau de la protéine P21 en
absence de FXR1P et dans les cellules des patients FSDH. La protéine P21 est impliquée dans
les processus de différenciation en tant que promoteur de l'arrêt du cycle cellulaire.
En ce qui concerne FXR2P, l’ARNm correspondant n’est pas sujet à l’épissage alternatif et à
ce jour, une seule forme de la protéine est identifiée (Winograd and Ceman, 2011). Des souris
KO Fxr2 ont été également réalisées et caractérisées (Bontekoe et al., 2002). Ces souris ne
montrent pas de défauts majeurs au niveau du cerveau et des testicules. Concernant les
troubles du comportement, seuls quelques-uns ont été identifiés ressemblant à ceux des souris
Fmr1. Les souris Fxr2 présentent une hyperactivité lors des tests à champ ouvert et des
défauts de la motricité avec le test du « Rotarod » comme les souris Fmr1. Toutefois, les
souris Fxr2 ne présentent pas de troubles de l’anxiété, mais présentent des défauts du stimulus
thermique. Deng and Dunaevsky (2009) ont reporté que, contrairement aux souris Fmr1, les
épines des neurones du cortex et d’hippocampes des souris Fxr2 sont moins denses que les
souris Wt (souris âgées de deux semaines). Cependant, les épines dendritiques sont plus
longues que les souris Wt, similaire aux souris Fmr1 (Deng and Dunaevsky, 2009). Ces
résultats suggèrent que FXR2P a des fonctions dans le remodelage des épines. Afin de
préciser la relation fonctionnelle entre FXR2P et FMRP, des souris doubles KO Fxr2/Fmr1
ont été générées (Spencer et al., 2006). Ces souris ont des troubles du comportement plus
sévères que ceux observés dans chacun des modèles KO simples. Par exemple, des
exagérations de l’activité dans un champ ouvert ou lors de l’inhibition du réflexe de sursaut
(PPI). Ces résultats suggèrent que FXR2P et FMRP peuvent être impliqués dans les mêmes
voies régulant les activités locomotrices et sensorimotrices, suggérant une compensation
partielle de certains phénotypes en absence de FMRP. En ce qui concerne la fonction de
liaison aux ARN de FXR2P, une comparaison de l’expression des gènes a été réalisé à partir
d’extrait de cerveaux Fxr2 comparativement aux cerveaux Wt (Cavallaro et al., 2008). 52
gènes ont été montrés dérégulés en absence de FXR2P, dont certains sont reliés à des troubles
de la mémoire et de l’apprentissage. Ces ARN ne sont pas retrouvés parmi ceux co-
immunoprécipités avec FMRP ((Brown et al., 2001) ;voir chapitre suivant), suggérant une
régulation spécifique d’un ensemble d’ARN par FXR2P.
38
Les partenaires de la région N-Terminale

La protéine NUFIP (NUclear FMRP Interacting Protein ; 495 aa, 56 kDa) est une protéine
nucléaire ayant un profil d’expression similaire à celui de FMRP (fortement exprimée au
niveau des neurones d’hippocampes, du cortex et du cervelet) (Bardoni et al., 1999; Bardoni
et al., 2003a). NUFIP a la capacité de lier les ARN in vitro et elle se localise à proximité des
sites de transcription dans le noyau. Cette protéine interagit avec la région comportant les
exons 4 et 5 de FMRP (résidus 66 à 134) (Figure 10), mais elle ne se fixe pas aux protéines
FXR1P et FXR2P (Bardoni et al., 2003b). De plus, NUFIP colocalise avec les isoformes
nucléaires de FMRP. Elle possède un domaine de doigt de zinc (C2H2), un NLS et un NES, et
elle fait la navette entre le noyau et le cytoplasme. Dans les neurones, elle est détectée au
niveau du réticulum endoplasmique et des synaptoneurosomes en association aux ribosomes.
Boulon et al., (2008) ont montré que NUFIP est un composant d’un complexe d’assemblage
des particules ribonucléprotéiques (RNP), composés de différentes protéines, impliquant une
chaperone HSP90 et des protéines de la famille L7Ae (retrouvées dans les snoRNP (biogenèse
des ribosomes) et les snRNP (épissage)) (Boulon et al., 2008). NUFIP est également
nécessaire à l’activité de l’ARN polymérase II responsable de la transcription des ARNm
(Cloutier and Coulombe, 2010).
La protéine 82-FIP (82 kDa FMRP Interacting Protein ;766 aa) interagit également avec les
exons 4 et 5 de FMRP (résidus 66 à 134) (Figure 10), et ne se fixe pas aux protéines FXR1P
et FXR2P (Bardoni et al., 2003b). La distribution de 82-FIP au niveau du cerveau est similaire
à celle de FMRP, et elle peut également faire la navette entre le noyau et le cytoplasme.
Cependant, la distribution cellulaire de 82-FIP dépend du cycle cellulaire (cytoplasmique
durant les phases G2/M et s’accumule au niveau du noyau durant la phase G1). Notons que
des distributions subcellulaires différentes au niveau des neurones sont également observées
en fonction des régions du cerveau. La fonction exacte de 82-FIP reste à être déterminée. Elle
peut lier les séquences ARN polyG in vitro, tout comme FMRP, ainsi que les polysomes
suggérant qu’elle pourrait avoir une certaine affinité pour les ARNm. Cependant, aucun motif
connu de liaison aux ARN n’a été identifié dans cette protéine.
Les protéines CYFIP1 et CYFIP2 (CYtoplasmic FMRP Interacting Protein 1/2) sont des
homologues avec 88% d’identité, et elles sont fortement conservées durant l’évolution. Ces
deux protéines ne lient pas les ARN mais interagissent avec FMRP via l’exon 7 (le même
domaine impliqué dans la dimérisation de FMRP) (Figure 10) (Schenck et al., 2001).
39
CYFIP1 interagit uniquement avec FMRP alors que CYFIP2 est capable d’interagir
également avec FXR1P et FXR2P. CYFIP1/2 sont des protéines cytoplasmiques et sont
retrouvées dans les extraits de synaptoneurosomes de cerveau de souris. CYFIP1 interagit
également avec la Rho GTPase Rac1, une molécule clé dans la réorganisation des filaments
d’actine impliquée dans le développement et la stabilité neuronale. L’orthologue chez la
drosophile de CYFIP1/2, appelé CYFIP, est montré interagir biochimiquement et
génétiquement avec dFXRP et dRac1 jouant un rôle d’intermédiaire entre ces deux protéines
et un rôle dans l’établissement de la connectivité neuronale (Billuart and Chelly, 2003;
Schenck et al., 2003).
Les partenaires de la région C-Terminale

La protéine RanBPM (Ran-Binding Protein Microtubule-organizing center) a été montrée
interagir avec la région de 419 à 632 aa de FMRP in vivo et in vitro (Figure 10) (Menon et
al., 2004). Elle est, comme FMRP, fortement exprimée dans les neurones du cortex cérébral et
des cellules de Purkinje du cervelet. RanBPM n’est pas une protéine de liaison aux ARN mais
peut moduler la fixation de FMRP à ses ARNm cibles (un excès de RanBPM in vitro
empêche la fixation de FMRP aux homopolymères).
La protéine MSP58 (MicroSpherule Protein 58 ; 58kDa, 462 aa) est une protéine
essentiellement nucléaire avec une présence marquée au niveau du nucléole dans des cellules
non-neuronales interagissant avec les isoformes nucléaires de FMRP (site de reconnaissance
entre les aa 490 et 526 de FMRP, couvrant un site de phosphorylation) (Figure 10)
(Davidovic et al., 2006). Elle est proposée jouer un rôle dans la régulation de la transcription.
Cependant, MSP58 est fortement présente au niveau du perikaryon des neurones et au niveau
des synapses où elle colocalise avec FMRP. MSP58 est une protéine de liaisons aux ARN
interagissant, comme FMRP, aux polyribosomes des synaptoneurosomes.
La protéine motrice KIF3C (Kinesin Family member 3C), un membre de la famille II des
kinésines, colocalise avec FMRP dans le soma des neurones et au niveau des branchements
dendritiques (Davidovic et al., 2007). FXR1P et FXR2P lient également KIF3C au même
domaine que FMRP. KIF3C est exprimée essentiellement au niveau du cerveau et de la rétine.
L’utilisation d’un dominant négatif de KIF3C, ne comportant pas la région motrice, réduit
significativement le transport des granules FMRP au niveau des neurites. FMRP est donc
proposée être un élément adaptateur entre les granules d’ARN et les protéines motrices.
40
Ribosomes en cours Stress topologique de l’ARN
TDRD3 Traduction active
de traduction Blocage du ribosome TOP3b FMRP
Figure 11. Modèle de régulation de la traduction par le complexe FMRP-TOP3ȕ-

TDRD3.
Une fraction de FMRP co-immunoprécipite avec le complexe Top3ȕ-TDRD3, permettant
de proposer que FMRP recrute ce complexe sur des ARNm spécifiques, réduisant ainsi le
stress topologique des ARNm et stimulant la traduction (Xu et al., 2013).
Synthèse
protéique
Synthèse
protéique
Figure 12. Modèle de régulation de la fonction de FMRP par DSCR1

A, à un niveau basal, le complexe phospho-FMRP-DSCR1 réprime la traduction des
ARNm au niveau des synapses. La Calcineurin déphosphoryle FMRP, mais son activité
est inhibée par DSCR1. La cascade de signalisation via mTOR (mammalian Target Of
Rapamycin) contribue à la régulation de la phosphorylation de FMRP. B, après
stimulation par le BDNF, DSCR1 devient phosphorylé aboutissant à l’activation de la
Calcineurin. Ainsi, cette dernière, déphosphoryle FMRP permettant à l’inhibition de la
traduction d’être levée (Roselli, 2012)
La protéine SMN (Survival Motor Neuron) fait partie d’un complexe ubiquitaire qui participe
à l’assemblage des RNP du spliceosome (snRNP U). Le complexe SMN est localisé dans le
cytoplasme et le noyau, où il se concentre dans des domaines sub-nucléaires appelés les Cajal
Bodies (CBs). SMN est retrouvée dans les dendrites et les axones et elle est présente dans des
granules de transport des ARN et dans la régulation de la traduction au niveau des neurones.
FMRP a été montrée interagir physiquement avec le complexe SMN via la région 470 à 526
aa du C-terminal (Figure 10), et elle peut être présente dans les mêmes granules que ce
complexe au niveau des neurones (Piazzon et al., 2008).
La protéine CAPRIN-1 (Cytoplasmic Activation- and Proliferation-associated protein 1)
interagit avec la région de 427 à 442 aa de FMRP dans les neurones de souris (Figure 10),
avec une co-localisation le long des branchements dendritiques (El Fatimy et al., 2012).
CAPRIN-1 est une protéine de liaison aux ARN, fortement exprimée au niveau du cerveau, et
elle est proposée, comme FMRP, réguler la traduction des ARNm neuronaux. CAPRIN-1 est
montré reconnaitre aux moins deux ARNm cibles de FMRP, Camk2a et Map1b, suggérant
que FMRP peut lier des ARNm directement ou via des protéines de liaisons aux ARN
partenaires.
La protéine TDRD3 (TuDoR Domain-containing protein 3, 83 kDa), exprimée dans une
variété de tissus avec une prédominance cytoplasmique, interagit potentiellement avec FMRP
via deux régions différentes (de 216 à 332 aa au niveau des domaines KH et de 430 à 486 aa)
(Figure 10) (Linder et al., 2008). Elle lie également FXR1P et FXR2P. La surexpression de
TDRD3 dans les cellules HeLa (Henrietta Lacks) induit la formation des granules de stress
(décrites au chapitre suivant) où elle colocalise avec FMRP. Le mutant I304N-FMRP n’est
plus capable de s’associer à TDRD3 suggérant l’importance du domaine KH2 dans cette
association. TDRD3 est impliquée dans le recyclage des protéines via le système d’ubiquitine-
protéasome.
Récemment, Stoll et al., (2013) ont proposé que TDRD3 permet d’intégrer à la fois FMRP et
la topoisomérase TOP3B dans des mRNP cytoplasmiques (la délétion du gène Topoisomérase
III beta a été trouvée associé à la schizophrénie et à la déficience intellectuelle). En absence
de TDRD3, FMRP n’est plus présente dans les mRNP comportant TOP3B. Cette dernière est
une enzyme qui normalement contrôle la topologie de l’ADN durant la transcription, mais elle
est montrée dans cette étude agir sur l’ARN, suggérant son implication dans le métabolisme
des ARNm cibles de FMRP (Figure 11) (Stoll et al., 2013).
41
présynapse
corps cellulaire
postsynapse
5
4
1
3
dendrite
noyau épine
dendritique
Polyribosomes Microtubules
Interacteurs nucléaires Peptides naissants
Interacteurs cytoplasmiques mGluR de type I
Interacteurs nucléaires / cytoplasmiques D’autres récepteurs
ADN Actif en traduction
ARN messager Inhibé en traduction
Figure 13. Modèle du rôle neuronal de FMRP

1, FMRP s’associe aux ARNm dans un complexe mRNP au niveau du noyau. 2, une fois
transportée vers le cytoplasme, FMRP s’associe aux polyribosomes actifs en traduction. 3,
durant un stress cellulaire, FMRP est basculée vers les granules de stress inhibés en
traduction. 4, FMRP est également présente dans des granules neuronaux où elle est
proposée reconnaître un ensemble d’ARNm spécifiques, d’inhiber leur traduction et d’agir
sur le transport de ces particules vers les compartiments post-synaptiques. 5, au niveau des
synapses, FMRP régulerait la traduction locale de ses ARNm en réponse à l’activation des
mGluR-I.
Un modèle récent propose que la protéine « down critical region 1 » (DSCR1, également
connue sous le nom RCAN1), impliquée dans le syndrome de Down (trisomie 21), interagit
avec FMRP afin de réguler la traduction locale et la morphologie des épines dendritiques
(Figure 12) (Wang et al., 2012). Ce modèle repose sur des interactions génétiques et
fonctionnelles des deux protéines. La région de FMRP impliquée dans cette interaction n’est
pas déterminée, mais DSCR1 co-immunoprécipite avec FMRP lorsque cette dernière est
phosphorylée. Les altérations des épines dendritiques observées lors de la surexpression de
DSCR1 (augmentation de la taille des épines) sont corrigées par une réduction de l’expression
de FMRP dans les neurones d’hippocampes, dans des souris transgéniques ou lors de
l’utilisation d’ARN interférent. Ces observations suggèrent que DSCR1 régulerait la fonction
de FMRP et permettent ainsi d’établir un lien entre les syndromes de Down et de l’X fragile.
Les protéines Nucléoline, YB1/P50 (Y Box binding protein 1), Pur-alpha, mStaufen et
myosine Va ont également été immunoprécipitées dans des complexes contenant FMRP, mais
la preuve d’une association directe avec FMRP n’a pas été apportée (Ceman et al., 1999;
Ceman et al., 2000; Ohashi et al., 2002). Toutes ces protéines sont aussi impliquées dans
différentes voies du métabolisme de l’ARNm.
4- Lien entre FMRP et les complexes ribonucléoprotéiques

FMRP est une protéine de liaison aux ARNm (sujet principal du chapitre III), interagissant
avec de nombreux partenaires protéiques au sein de complexes RNP dont la nature reste à
définir et retrouvée à différents endroits de la cellule (Figure 13).
Rappelons que FMRP est une protéine essentiellement cytoplasmique, mais ayant des
capacités de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme (Eberhart et al., 1996; Bardoni et
al., 1997). Un modèle suggère que FMRP entre dans le noyau pour se fixer sur ses ARNm
cibles, puis ressort pour les accompagner dans le cytoplasme (Figure 13) (Eberhart et al.,
1996). Le transport de FMRP pourrait dépendre de sa fixation aux ARNm. Ce modèle repose
sur l’observation d’une accumulation de GFP-FMRP au niveau du noyau, après l’utilisation
d’ARN interférent contre le facteur d’export des ARNm, Tap/NXF1 (Nuclear eXport Factor
1) (Kim et al., 2009b). Ce phénomène est d’autant plus marqué en retirant le signal d’export
nucléaire de FMRP. De plus, Tap/NXF1 est montré co-immunoprécipité avec FMRP d’une
manière dépendante de l’ARN. Par ailleurs, FMRP est montrée associée aux ARN naissants
au niveau des sites actifs de transcription des « lampbrush chromosomes » dans les ovocytes
42
80S
Densité Optique 254 nm

polyribosomes
FMRP
40S 60S 80S

Densité Optique 254 nm
FMRP
Figure 14. Association de FMRP aux polyribosomes

FMRP s’associe aux polyribosomes dans les cellules non-neuronales et neuronales.
Séparation des extraits de cellules ou tissus sur gradient de sucrose par ultracentrifugation
en présence de MgCl2 (en haut) et de l’EDTA qui induit la dissociation du ribosome (en
bas). 40S : petite sous-unité ribosomique, 60S : grande sous-unité ribosomique et 80S : un
ribosome fonctionnel (Khandjian et al., 1996).
d’amphibiens (ces chromosomes comportent beaucoup de boucles d’ADN correspondant aux

sites de transcription) (Kim et al., 2009b). Récemment, Durry et al. (2013) ont montré que les
Iso 6 et 12 de FMRP (des espèces mineures) sont présents au niveau des Cajal Bodies, lieux
d’assemblage et de maturation des complexes RNP. Ces observations suggèrent des fonctions
spécifiques pour les isoformes nucléaires mineurs dans le contrôle post-transcriptionnel des
ARN (Durry et al., 2013).
Au niveau du cytoplasme, FMRP est présente au niveau de différentes particules

RNP (Figure 13):
Les polyribosomes (ou polysomes)

FMRP est présente dans un complexe de poids moléculaire >600 kDa dans des cellules
lymphoblastoïdes humaines, dont elle se dissocie à forte concentration ionique ou par un
traitement aux ribonucléases (RNases) (Tamanini et al., 1996). Ce complexe correspond aux
polyribosomes avec lesquels FMRP co-sédimente, après ultracentrifugation sur gradient de
sucrose (Figure 14) (Khandjian et al., 1996). FMRP est présente essentiellement dans les
fractions comportant la grande sous-unité du ribosome 60S, et une interaction directe avec
cette sous-unité est suggérée via les exons 13 et 14 de FMRP (Khandjian et al., 1996; Siomi et
al., 1996). L’immunofluorescence a permis de montrer une parfaite co-localisation entre
FMRP et les polyribosomes cytoplasmiques (Khandjian et al., 1996), et la microscopie
immuno-électronique a montré que FMRP est associée aux polysomes libres et à ceux
attachés à la membrane du réticulum endoplasmique (Willemsen et al., 1996). De plus, par la
même technique, FMRP est suggérée s’associer aux précurseurs des ribosomes matures au
niveau des granules nucléolaires (Willemsen et al., 1996). Au niveau des neurones, FMRP est
également montrée s’associer aux polysomes dans le perikaryon et dans les préparations de
synaptoneurosomes (Feng et al., 1997b; Khandjian et al., 2004; Stefani et al., 2004; Davidovic
et al., 2005). Cette association est sensible au traitement à la puromycine qui induit un arrêt
prématuré de la traduction (Stefani et al., 2004). Ces observations indiquent que FMRP est
associée aux polysomes fonctionnels dans les neurones. Dans les cellules dérivées du patient
avec la mutation FMRP-I304N, l’interaction avec les polysomes actifs en traduction est abolie
indiquant que cette association est importante pour la fonction normale de FMRP (Feng et al.,
1997a).
43
Les granules de stress (GS)

Immédiatement après un choc thermique, une des premières réponses observables de la
cellule est une diminution de 90 % du taux de la synthèse protéique (Duncan and Hershey,
1989). Cette baisse est provoquée par une diminution du nombre de polyribosomes suite à un
arrêt de la traduction et une réorganisation des mRNP. La majorité des ARNm cellulaires, à
l’exception des ARNm codants pour les protéines de choc thermique, quitte les polysomes
pour intégrer les GS (Anderson and Kedersha, 2002). Dans ces granules, la traduction est
inhibée au stade de pré-initiation (43S). Les GS sont des structures dynamiques avec un
échange rapide des entrées et sorties des différents facteurs (Kedersha et al., 2005). La
stabilisation des polyribosomes par l’émétine ou la cycloheximide inhibe l’assemblage des
GS, alors que leur déstabilisation par la puromycine stimule leur assemblage indiquant un
équilibre dynamique entre ces structures (Kedersha et al., 2000).
Mazroui et al., (2002) ont montré dans des cultures de fibroblastes, après un choc thermique
ou après surexpression de FMRP , que cette dernière est présente dans les GS (Mazroui et al.,
2002). Par la suite, FMRP a été montrée présente dans les SG isolés avec un anticorps dirigé
contre la protéine TIA1 (T-cell Intracellular Antigen 1 ; un composant essentiel des GS) à
partir d’hippocampes de souris traités avec de l’arsenite (induisant un stress oxydatif) (Kim et
al., 2006). Lors des études in vivo dans la souris, FMRP a été montrée quitter les
polyribosomes pour intégrer les SG après l’induction mécanique de lésions neuronales,
obtenus par placement d’électrodes dans le gyrus denté et dans l’hippocampe (Kim et al.,
2006). L’induction d’un stress oxydatif sur les cellules PC12 (cellules de type neuronal)
provoque la formation de GS comportant FMRP à la fois dans le soma et les neurites
(Dolzhanskaya et al., 2006b). Bien que la totalité de FMRP co-localise avec TIA1 au niveau
du soma, seulement 60% de co-localisation est observée dans les neurites suggérant une
hétérogénéité de composition de granules au niveau des neurites (Dolzhanskaya et al., 2006b).
Afin de tester la contribution exacte de FMRP dans la formation des GS, Didiot et al., (2009)
ont testé la capacité des fibroblastes immortalisés à partir de souris Fmr1 (STEK) à former
des GS après un traitement à l’arsenite. Contrairement aux mêmes cellules transfectées avec
l’Iso7-FMRP, les fibroblastes ne comportant pas FMRP montrent une réduction significative
de la formation des GS. Une réduction est également observée pour les cellules
lymphocytaires de patient exprimant FMRP-I304N (Didiot et al., 2009). Ces résultats
suggèrent un rôle direct de FMRP dans l’assemblage de ces granules.
44
Les granules neuronaux (GN)

L’adressage des ARNm vers différents compartiments cellulaires est un phénomène important
et fondamental dans différents types cellulaires, et tout particulièrement dans les neurones. La
majorité des ARNm neuronaux est retrouvée dans le corps cellulaire, mais un certain nombre
de ces ARNm est transporté vers les neurites. Une étude récente de séquençage d’ARN à
haut-débit, du neuropile de l’hippocampe (constitué par l'ensemble des connexions
neuritiques), a permis d’identifier plus de 2550 ARN neuritiques (Cajigas et al., 2012). La
traduction locale de ces ARN dans les dendrites peut intervenir dans la plasticité synaptique et
participer aux changements à long terme de la force synaptique. Le transport des ARN débute
par la formation de particules RNP (cargos) dont les granules neuronaux (GN), où la
traduction est inhibée (Krichevsky and Kosik, 2001). Ce transport nécessite l’intervention de
protéines motrices telles que les kinésines (plus de 40 kinésines ont été identifiées chez les
mammifères) associées aux microtubules (Kanai et al., 2004). Aux niveaux des synapses, les
ARN sont relâchés et traduits en réponse à une activation synaptique (Krichevsky and Kosik,
2001). La dépolarisation induit une réorganisation des GN avec un passage des ARN vers les
polysomes actifs en traduction (Krichevsky and Kosik, 2001). Kanai et al., (2004) ont isolé et
caractérisé une particule GN, sensible aux RNases (~1000S), associée à la kinesine KIF5.
Dans cette particule, 42 protéines ont été identifiées dont certaines sont impliquées dans le
transport des ARNm (Staufen, Pur alpha et beta), des protéines de la traduction (eIF2alpha et
la protéine ribosomique L3) et des ARNm dendritiques (Camk2a et Arc). Parmi ces protéines,
toute la famille FXR a été identifiée, notamment FMRP. De même, la purification de GN par
un fractionnement subcellulaire à partir de cerveaux de souris (E18) a confirmé la présence de
FMRP dans ces granules avec d’autres protéines de liaison aux ARN et des protéines
ribosomiques (Elvira et al., 2006). Ces résultats suggèrent la présence de ribosome dans les
GN, mais inactif en traduction. Par ailleurs, notons qu’il a été proposé l’existence de
particules d’ARN de transport distinctes des GN. Ces particules de transport ne contiendraient
pas un ribosome complet mais seulement la petite sous-unité, indiquant une inhibition de la
traduction à l’étape de l’initiation (Sossin and DesGroseillers, 2006). FMRP semble être
présente dans les deux types de granules. Cependant, les types et les différences entre ces
différents granules d’ARN de transport, dans les neurones, restent mal compris.
Le rôle exact de FMRP dans les GN n’est pas bien déterminé, mais elle est proposée
sélectionner des ARN dendritiques au niveau du corps cellulaire des neurones pour former ces
45
granules, réprimer la traduction de ces ARN et réguler leur transport vers les synapses
(Figure 13). Ce modèle d’action de FMRP sur le transport et la régulation de la traduction des
ARNm neuronaux est basé sur différentes observations. Contrairement à la majorité de FMRP
qui est associée aux polysomes au niveau du corps cellulaire, 10% de la protéine totale est
retrouvée associée aux microtubules, dans des particules mRNP ne comportant pas de
ribosomes fonctionnels (Wang et al., 2008). Les kinésines KIF3C et KIF5 ont été identifiées
comme partenaires de FMRP, faisant de cette dernière un intermédiaire éventuel entre un
cargo d’ARN et les protéines motrices associées aux microtubules (Davidovic et al., 2007;
Dictenberg et al., 2008). De plus, FMRP est montrée présente par immunofluorescence (IF)
au niveau des dendrites et des épines des neurones d’hippocampes (Antar et al., 2004).
L’intensité du signal est augmentée au niveau des dendrites après activation des récepteurs
mGluR-I, par un agoniste spécifique (DHPG ; (S)-3,5-DiHydroxyPhenylGlycine), suggérant
une activation du transport de FMRP (Antar et al., 2004; Antar et al., 2005). Le transport des
particules associées à FMRP dans les dendrites est montrée être bidirectionnel et dynamique
avec une cinétique de l’ordre de 1.8 μm/s, mesuré par microscopie en temps réel avec des
constructions GFP-FMRP (Dictenberg et al., 2008; Wang et al., 2008). Concernant un rôle
direct de FMRP sur le transport des ARNm, différentes données ne montrent aucune
altération de la localisation de différents transcrits cibles en présence et en absence de FMRP
dans un état non-stimulé des neurones (Steward et al., 1998; Muddashetty et al., 2007;
Dictenberg et al., 2008; Subramanian et al., 2011). Toutefois, FMRP semble jouer un rôle
après activation des mGluR-I car la stimulation du transport des ARNm cibles de FMRP
(Map1b, Camk2a, Sapap4, Rgs-5 et d’autres) est en partie perdue dans les neurones Fmr1 KO
(Dictenberg et al., 2008). Récemment, au laboratoire, nous avons montré que deux ARNm,
connus comme cibles de FMRP (Psd95 et Camk2a), sont transportés via une structure G-
quadruplexe correspondant au site de fixation de la protéine (discuté au chapitre III)
((Subramanian et al., 2011) ; voir annexe). Dans cette étude, la structure G-quadruplexe a été
identifiée comme un élément agissant en CIS sur le transport de l’ARN vers les neurites. A
nouveau, le rôle de FMRP dans ce transport a été montré être subtil. Bien que des ARNm
comportant une structure G-quadruplexe sont transportés de la même manière en présence et
en absence de FMRP dans des neurones non-stimulés, la stimulation de leur transport par
l’activation mGluR-I est diminuée en absence de FMRP. Ces différentes données suggèrent
que le transport des ARNm, à un niveau non stimulé des neurones, ne dépend pas de FMRP
46
mais il nécessiterait l’intervention d’autres protéines de liaison aux ARN non-identifiées à ce

jour.
Au niveau des synapses, FMRP est présente à la fois dans les compartiments pré- et post-
synaptiques (Feng et al., 1997b; Antar et al., 2004; Christie et al., 2009; Akins et al., 2012).
Son ARNm est également localisé au niveau des synapses, et FMRP est traduite localement
après activation des récepteurs mGluR-I (Weiler et al., 1997; Antar et al., 2004). FMRP est
proposée réguler la traduction locale des ARNm importants pour la plasticité synaptique
(Figure 13). En absence de FMRP, dans les préparations de synaptoneurosomes à partir de
cerveau de souris KO, la traduction locale activée par les récepteurs mGluR-I n’est pas induite
(Weiler et al., 2004).
5- Les mécanismes de répression de la traduction par FMRP

Différentes fonctions de FMRP sont proposées à ce jour, mais la fonction la plus répandue
dans la littérature est la répression de la traduction des ARNm spécifiques au niveau des
synapses (voir chapitre III, §3).
La traduction est un processus complexe par lequel la cellule parvient à convertir

l’information génétique portée par l’ARNm en protéines. L’ARNm est au centre des
processus conduisant à la traduction des protéines. Il sert d’abord de plateforme d’assemblage
pour le ribosome durant l’étape d’initiation. Ensuite, durant la phase d’élongation, il sert de
matrice pour la biosynthèse des protéines. Enfin durant la phase de terminaison, il provoquera
l’arrêt de la synthèse au niveau d’un signal d’arrêt de la traduction. L’étape d’initiation est de
loin la plus complexe et la plus sujette à régulation. Chez les eucaryotes, l’initiation implique
une cascade d’événements moléculaires avec de nombreux partenaires protéiques et
nucléiques. Le processus démarre sur l’extrémité 5’ de l’ARNm, via la reconnaissance de la
coiffe (5’m7Gppp-) par le complexe d’initiation eIF4F (composé de 3 facteurs d’initiation :
eIF4E, eIF4G et eIF4A). Cette reconnaissance de la coiffe permet de recruter la petite sous-
unité ribosomique activée, appelée particule 43S, au niveau de l’extrémité 5’. Une fois fixée,
la particule 43S glisse sur l’ARNm, jusqu’au premier codon AUG, sur lequel la sous unité
60S est ensuite recrutée pour former un ribosome 80S fonctionnel (Hernandez, 2009;
Sonenberg and Hinnebusch, 2009).
47
A
Figure 15. Modèles d’inhibition de la traduction par FMRP

A, FMRP recrute CYFIP1 au niveau de la région 5’UTR pour bloquer la formation du
complexe eIF4A-eIF4G-eIF4E (eIF4F) et inhiber l’initiation de la traduction. B, FMRP
provoque l’arrêt du ribosome durant l’étape de l’élongation de la traduction. C, FMRP
recrute le complexe d’ARN interférence RISC pour inhiber l’initiation ou l’élongation de
la traduction (d’après Santoro et al., 2011).
Inhibition de l’initiation de la traduction par recrutement de CYFIP1

L’initiation de la traduction peut être inhibée par l’interaction du facteur 4E-BP (4E-Binding
Protein) avec eIF4E en empêchant la formation du complexe eIF4F et le recrutement de la
particule ribosomique 43S (Richter and Sonenberg, 2005). Récemment, la protéine CYFIP1,
un des partenaires protéiques de FMRP (voir §3), a été montrée être un facteur 4E-BP-like
(Napoli et al., 2008). CYFIP1 comporte un domaine central (la région de 733 à 751 aa),
caractéristique des protéines 4E-BP, pouvant former une structure « en forme de L inversé ».
La co-immunoprécipitation a permis de montrer l’association de CYFIP1 et d’eIF4E avec
FMRP in cellulo. La formation du complexe CYFIP1/eIF4E/FMRP est augmentée en
présence de l’ARNm Arc avec une coiffe en 5’, cible « validée » de FMRP (voir chapitre III),
contrairement à un ARN rapporteur non-cible. L’interaction de CYFIP1 avec eIF4E est
modulée en fonction de l’activation des mGluR-I (Napoli et al., 2008). Rapidement après
traitement au DHPG des préparations de synaptoneurosomes (5 min), le complexe se dissocie
pour libérer la traduction. Un traitement plus long (15 min) stabiliserait ce complexe
CYFIP1/eIF4E. Ces données ont permis de proposer un modèle dans lequel FMRP recruterait
CYFIP1 sur des ARNm spécifiques, lui permettant d’interagir avec eIF4E afin d’inhiber
l’initiation de la traduction (Figure 15A). En accord avec ce modèle, le niveau en protéine de
de différents ARNm cibles (Map1b, Camk2a et App) est trouvé augmenté dans les souris
n’exprimant que la moitié du niveau normale de CYFIP1 (Napoli et al., 2008). De plus,
l’activation de la traduction locale par un traitement pharmacologique utilisant le DHPG est
montrée réduire le niveau d’eIF4E associé au complexe CYFIP1/FMRP. L’association
eIF4E/CYFIP1 serait inversement corrélé à la traduction (Napoli et al., 2008).
Inhibition de la traduction par blocage du ribosome

Dans un autre modèle d’inhibition de la traduction FMRP est proposée bloquer le ribosome au
cours de la synthèse peptidique (Figure 15B). Ce modèle repose sur des données montrant
que FMRP co-sédimente avec les polyribosomes bloqués sur l’ARNm après traitement à la
puromycine. Cette molécule provoque le relarguage des ribosomes en cours de traduction
(déplacement des pics d’absorbance à 260nm des fractions lourdes vers les fractions légères
d’un gradient de sucrose) mais elle n’agit pas sur les ribosomes bloqués sur l’ARNm (qui
conservent ainsi leurs positions au niveau des fractions plus lourdes du gradient, « stalled
ribosomes ») (Stefani et al., 2004). L’utilisation de l’azide de sodium, un inhibiteur de
l’initiation de la traduction, a permis de révéler également la présence de FMRP dans les
48
fractions comportant des polyribosomes bloqués au cours de l’élongation (Ceman et al.,

2003). Récemment, Darnell et al. (2011) ont utilisé un système in vitro (traitement à la
puromycine d’un mélange d’extraits de cerveau et de réticulocytes de lapins) afin de montrer
que des ARNm cibles de FMRP sont associés à des polyribosomes bloqués au cours de la
traduction. A ce jour, le mécanisme de blocage des ribosomes sur les ARNm n’est pas bien
caractérisé, mais il est admis qu’il peut être influencé par un manque des composants de la
traduction, par la dynamique de repliement des protéines naissantes et/ou par la présence de
structure secondaire sur les ARNm (Buchan and Stansfield, 2007). Darnell et al. (2011) n’ont
pas pu identifier de sites spécifiques reconnus par FMRP sur les ARNm cibles testés (discutés
au chapitre III), pour expliquer leurs résultats ils ont proposé que FMRP reconnaîtrait
aléatoirement la phase codante pour bloquer les ribosomes. Ces suggestions sont en complète
contradiction avec la reconnaissance d’ARNm spécifiques par FMRP et ne permettent pas
d’expliquer le processus de blocage du ribosome (discuté au chapitre III, §2)
Inhibition par la voie des microARN

Les microARN (ou miARN) sont des régulateurs négatifs de l’expression génique et
fonctionnent au sein du complexe RNP RISC (RNA Induced Silencing Complex), constitué
de plusieurs protéines dont la protéine Argonaute 2 (Ago2) (Sontheimer, 2005). Ago2 est une
endonucléase séquence-spécifique pouvant induire une coupure dans le squelette
phosphodiester de l’ARNm cible afin de provoquer sa dégradation (Rand et al., 2005).
Un troisième modèle de répression de la traduction par FMRP repose sur la voie miARN
(Figure 15C). dFXRP chez la drosophile et FMRP chez les mammifères ont été montrées
s’associer aux protéines Ago2 et Dicer, deux composants importants du complexe RISC
(Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002; Plante et al., 2006). FMRP a été également trouvées
associées à des miARN spécifiques in cellulo (Jin et al., 2004). Dans des expériences in vitro
avec des protéines recombinantes, FMRP peut aider l’assemblage d’un miARN sur un ARNm
cible, une activité dépendante des domaines KH (Plante et al., 2006). Au contraire, au
laboratoire, Didiot el al. (2009) ont montré que le complexe RISC et FMRP ne colocalisent
pas dans les cellules. En effet, FMRP n’est pas présente dans les « Processing Bodies » (PB),
sites cellulaires majeurs de localisation du complexe RISC et des ARNm soumis à son action
(Didiot et al., 2009). De plus, des cellules ne comportant pas FMRP ont une activité RISC
normale sur des ARNm rapporteurs comportant des sites de miRNA. Cependant, une étude
récente a montré que différents miARN (12/18 testés) sont co-immunoprécipités
49
spécifiquement avec FMRP dans le cerveau Wt comparativement au Fmr1 KO (Edbauer et

al., 2010). La surexpression ou la réduction de miR125b et miR132 aboutit à des altérations
de la morphologie des épines qui sont corrigées en supprimant FMRP dans des cultures
d’hippocampes. De plus, la région 3’UTR de l’ARNm Nr2a (NMDA Receptor 2A) est cible
de miR125b et de FMRP. La fixation de FMRP sur cette région favoriserait l’assemblage du
complexe RISC et la répression de la traduction (Edbauer et al., 2010). De même, FMRP a été
montrée avoir un effet sur l’action de miR-125a au niveau de la région 3’UTR de Psd95 afin
de promouvoir la répression de la traduction. En effet, cette région est montrée être une cible
commune de FMRP et du miR-125a (voir chapitre III), avec le site du miARN chevauchant
une structure G-quadruplexe correspondant au site de fixation de FMRP (Muddashetty et al.,
2011; Subramanian et al., 2011). De plus, une proportion de l’ARNm Psd95, présente au
niveau des fractions légères dont la traduction est inhibée dans un gradient de sucrose, est
déplacée vers les polyribosomes actifs en traduction après stimulation des neurones avec du
DHPG. Une réduction du niveau de miR-125a au niveau des fractions légères après activation
mGluR-I indique une libération de l’ARN réprimé au niveau de l’initiation de la traduction.
Ces données suggèrent la présence de FMRP dans un complexe miRNA-RISC inhibé au
niveau de l’initiation de la traduction. On remarquera ici que ce modèle est en désaccord avec
le modèle de répression au niveau de l’élongation où l’ARNm réprimé par FMRP est présent
dans les polysomes.
Les trois modèles d’inhibition de la répression de la traduction par FMRP ne seraient pas
nécessairement mutuellement exclusifs si différents mécanismes peuvent agir à différents
moments au cours du métabolisme des ARNm. FMRP pourrait être localisée à différents
endroits de la cellule et dans des mRNP ayant des fonctions différentes. Elle pourrait ainsi
accompagner et réguler différemment un ARNm cible. Par exemple, au niveau des granules
de stress, FMRP est associée à des ARNm inhibés au niveau de l’initiation de la traduction.
Elle pourrait également réprimer l’initiation de ses ARNm cibles au cours du transport au
niveau des dendrites via CYFIP1 ou la voie des miRNA. Au niveau des synapses, elle serait
associée à des ARNm engagés dans des ribosomes bloqués au niveau de l’élongation de la
traduction. Un mode d’action qui permettrait une réponse rapide d’une traduction locale après
stimulation synaptique. De plus, FMRP est proposée pouvoir reconnaitre ses ARNm cibles à
différents endroits, au niveau de la région 5’UTR, phase codante et 3’UTR. L’association de
FMRP à la région 3’UTR pourrait moduler le mécanisme de miARN. La reconnaissance
50
d’une structure stable au niveau de la région 5’UTR ou la phase codante pourrait causer un
encombrement stérique, et bloquer le ribosome au cours de l’initiation ou l’élongation de la
traduction, respectivement. Par ailleurs, FMRP est également proposée reconnaitre différents
éléments sur les ARN, avec des contradictions évidentes à ce sujet dans la littérature (voir le
chapitre III). En conclusion, FMRP pourrait réguler différents pools d’ARNm en fonction de
la structure/séquence reconnue et/ou de sa position sur l’ARNm, mais le ou les mécanismes
de son action restent à préciser.
6- Les modifications post-traductionnelles modulant l’activité de

FMRP
Phosphorylation de FMRP
Dans les neurones, FMRP existe sous forme phosphorylée et non-phosphorylée, mais la forme
phosphorylée a été montrée être prédominante dans les granules au niveau des dendrites
(Narayanan et al., 2007). L’analyse de l’état de phosphorylation de FMRP a révélé que la
région entre les aa 483-521 peut être phosphorylée sur un, deux ou trois résidus. Cette région
de 38 aa constitue le domaine de phosphorylation localisé entre les domaines NES et RGG.
Au niveau de cette région, le premier résidu phosphorylé est une serine, conservée de la
drosophile à l’homme (ser406 Drosophile, ser499 souris et ser500 homme) (Ceman et al.,
2003). La phosphorylation de cet aa est acceptée dans la littérature comme un élément
régulant la fonction de FMRP. Bien que la phosphorylation de FMRP n’aie pas été clairement
montrée affecter sa capacité de liaison aux ARN, elle altérerait son association aux
polyribosomes (Ceman et al., 2003). Chez la drosophile, la phosphorylation de la ser406
semble moduler son efficacité d’interaction avec les ARN et d’homo-dimérisation in vitro
(Siomi et al., 2002). L’utilisation de mutants de FMRP de souris mimant l’état
constitutivement phosphorylé de la protéine (S499D) ou non-phosphorylé (S499A) a permis
de montrer que seul le mime S499D reste associé aux polyribosomes après l’induction de
l’arrêt de la traduction par l’azide de sodium (Ceman et al., 2003). Ces observations suggèrent
que FMRP-phosphorylée est associée à des polysomes bloqués sur les ARNm, alors que
FMRP-non phosphorylée est associé à des polysomes actifs en traduction. Ces suggestions
concordent avec les observations de Muddashetty et al., (2011) montrant que la surexpression
de FMRP-S499D, mais non celle de FMRP-S499A, inhibe la traduction d’un ARNm
rapporteur comportant la région 3’UTR de Psd-95 dans des lignées neuronales. De plus,
51
Traduction Traduction
Figure 16. Modèle de régulation de la traduction par phosphorylation de FMRP

FMRP est déphosphorylée rapidement après l’activation des mGluR-I (<1 min) par la
PP2A (Protein Phosphatase 2A), induisant une libération de la répression de la traduction.
Puis, 5 min après stimulation, FMRP est phosphorylée par S6K1 (ribosomal protein S6
Kinase 1) permettant à nouveau de réprimer la traduction des ARNm cibles (d’après
Santoro et al., 2011).
FMRP-S499D déplace cet ARN rapporteur vers les fractions légères dans un gradient de
sucrose, suggérant une inhibition de l’initiation de la traduction de Psd-95 (Muddashetty et
al., 2011). Ces différentes données suggèrent un modèle où FMRP phosphorylée inhiberait la
traduction de ces ARNm cibles, alors que la forme non-phosphorylée permettrait à la
traduction de continuer.
Après stimulation des neurones (mGluR-I), FMRP est déphosphorylée rapidement (<1min),
probablement via l’augmentation de l’activité de la phosphatase 2A (PP2A) (Figure 16)
(Narayanan et al., 2007). En revanche, une activation plus longue des mGluR-I (1-5 min)
induit la diminution de l’activité de PP2A, médiée par mTOR (mammalian Target Of
Rapamycin), aboutissant à la phosphorylation de FMRP. Ces résultats suggèrent que PP2A
serait la principale phosphatase de FMRP, dont l’activité est induite par mTOR. D’autre part,
l’absence de phosphorylation de FMRP, dans les neurones hippocampaux de souris KO pour
la kinase de la protéine ribosomale S6 (S6K1), suggère que S6K1 soit la principale kinase de
FMRP (Figure 16) (Narayanan et al., 2008). L’inhibition pharmacologique de mTOR et
d’ERK1/2 (Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase) inhibe la phosphorylation de
S6K1 et de FMRP. Au contraire, l’inhibition de PP2A conduit à des formes S6K1 et FMRP
phosphorylées. Donc, l’activité de S6K1 sur la phosphorylation de FMRP dépend des
activités des protéines mTOR, ERK1/2 et PP2A (Narayanan et al., 2008). L’ensemble de ces
résultats suggère un modèle selon lequel S6K1 et PP2A seraient en compétition pour contrôler
la phosphorylation de FMRP sous le contrôle de l’activité de mTOR, elle-même régulée par
mGluR-I. A ce jour, il n’est pas déterminé si la phosphorylation de FMRP est due à une re-
phophorylation du même pool de FMRP ou une phosphorylation de protéines FMRP
nouvellement synthétisées.
Méthylation de FMRP
FMRP est méthylée in vitro dans des extraits de réticulocytes de lapin au niveau du domaine
de liaison aux ARN riche en Arginine/Glycine (la boite RGG) codé par l’exon 15 (Denman,
2002; Denman et al., 2004; Dolzhanskaya et al., 2006a; Stetler et al., 2006). Elle est
également méthylée in cellulo (HeLa, COS-7) et ceci sans affecter sa localisation cellulaire
(Dolzhanskaya et al., 2006c; Stetler et al., 2006). FMRP est principalement méthylée au
niveau de 4 arginines de la boite RGG (533, 538, 543 et 545 de la séquence de FMRP murin).
La substitution de ces Arg conduit à 90% de FMRP non-méthylée (Blackwell et al., 2010).
52
Notons que les produits alternatifs de FMRP ne comportant pas le site majeur de
phosphorylation (Ser499) sont méthylés ce qui indique que la phosphorylation n’influe pas
sur la méthylation de la protéine. L’utilisation de différentes méthyltransférases
recombinantes a permis de montrer que le domaine RGG peut être méthylé in vitro par les
protéines PRMT1, PRMT3 et PRMT4 (Protein aRginine n-MethylTransferase 1, 3 et 4)
(Dolzhanskaya et al., 2006a). Différentes évidences suggèrent que la méthyltransférase
principale de FMRP est PRMT1. En effet, cette dernière est co-immunoprécipitée avec FMRP
à partir des cellules COS-7, et l’utilisation de siRNA contre PRMT1 induit une réduction
significative de FMRP méthylée (Blackwell et al., 2010). PRMT1 mono-méthyle et di-
méthyle asymétriquement FMRP de la même manière in vitro et in cellulo. Notons que
dFXRP et FXR1P peuvent être également méthylées au niveau de la boite RGG
(Dolzhanskaya et al., 2006c). La méthylation semble altérer les interactions protéines-
protéines de FMRP, notamment l’hétérodimerisation avec FXR1P et l’efficacité de liaison
aux ARNm cibles (ARNm Fmr1, Ef1a), particulièrement un ARN comportant une structure
G-quadruplexe Sc1 (discuté au chapitre III) (Denman et al., 2004; Dolzhanskaya et al., 2006c;
Stetler et al., 2006). Récemment, Blackwell et al. (2010) ont montré que les Arg 533 et 538
sont nécessaires pour le recrutement normal de FMRP aux polyribosomes, et que les 4 Arg
interviennent dans la fixation aux ARN en fonction de la cible ARNm concernée. La
méthylation in vitro de FMRP affecte sa fixation à l’ARN Sc1 contrairement à un autre ARN
cible de FMRP, l’ARNm Aatyk (Apoptosis-Associated TYrosine Kinase, identifé par co-
immunoprécipitation de FMRP (Brown et al., 2001)). Contrairement aux phosphorylations,
qui sont des modifications labiles équilibrées par les activités kinases et phosphatases, les
méthylations apparaissent irréversibles.
7- Le rôle de FMRP dans les voies neurologiques

Un des axes majeurs de la recherche des bases moléculaires de la physiopathologie de l’X
fragile s’est focalisé sur l’identification des voies neurologiques dans lesquelles FMRP est
impliquée directement. La dépression à long terme associée aux récepteurs métabotropiques
du glutamate de type I (mGluR 1 et 5 ; LTD-mGluR) est la voie la plus étudiée dans le cas de
l’X fragile au niveau de l’hippocampe, décrite ci-dessous. Il est accepté que la majorité des
symptômes neurologiques observés chez les patients FXS serait dus en grande partie à la
dérégulation de cette forme de LTD. Le rôle de FMRP dans cette dernière peut être expliqué
par la théorie « mGluR de l’X fragile » (discuté ci-dessous), où FMRP est considérée comme
53
un répresseur de la traduction locale. Notons que FMRP est aussi importante pour d’autres
voies et dans d’autres régions du cerveau, avec très peu de données disponibles concernant
son rôle exact dans ces voies neurologiques, même s’il est également admis qu’elle agirait
comme un répresseur de la traduction.
Les récepteurs métabotropiques au glutamate de type I

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central, libéré
par plus de la moitié des synapses cérébrales excitatrices. Plusieurs sous-types de récepteurs
au glutamate sont définis : des récepteurs canaux ioniques (les récepteurs N-methyl-D-
aspartate (NMDAR), alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate (AMPAR) et
kainate) et des récepteurs métabotropiques (mGluR). Les mGluR sont des récepteurs
comportant sept segments transmembranaires hydrophobes. Ils comportent une région N-
terminale extracellulaire possédant un site de fixation des différents ligands et une région C-
terminale intracellulaire responsable de la transduction du signal. Les mGluR sont classés en
trois groupes en fonction de leur homologie de séquence, de leur pharmacologie et de la voie
de transduction à laquelle ils sont couplés (Niswender and Conn, 2010; Nicoletti et al., 2011).
Le groupe I comprend les récepteurs mGluR1 et mGluR5, et ils sont localisés essentiellement
au niveau de la membrane post-synaptique des neurones glutamatergiques excitateurs. Ces
récepteurs sont couplés positivement à la phospholipase C beta (PLC-beta), via des protéines
G hétérotrimériques de type Gq/G11. L’activation de la PLC-beta induit l’hydrolyse du
phosphatidylinositol-4,5-diphosphate (PIP2) en inositol-triphosphate (IP3) et en 1,2-diAcyl-
sn-glycerol (DAG). Ces deux seconds messagers agissent à leur tour comme des effecteurs :
l’IP3 en se liant sur des canaux calciques du réticulum endoplasmique (RE) permet
d’augmenter la concentration cytoplasmique en calcium et le DAG en agissant sur la protéine
kinase C (PKC) favorise, entre autres, l’ouverture de canaux calciques membranaires.
L’activation de la PKC induit également la voie de signalisation MEK/ERK. Par ailleurs,
différentes protéines peuvent interagir directement avec la région C-terminale des mGluR-I,
permettant de cibler l’activation d’autres voies de signalisation. Par exemple, la protéine
HOMER par sa fixation aux mGluR-I induit la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR. La
stimulation des voies MEK/ERK et PI3K/AKT/mTOR aboutie à la régulation de la traduction
coiffe-dépendante des ARNm localisés au niveau du compartiment post-synaptique. Cette
traduction locale est importante pour l’induction de la LTD-mGluR.
54
A
épine dendritique
Traduction
des ARNm
épine dendritique
Traduction
des ARNm
Figure 17. La théorie mGluR du FXS

A, la protéine FMRP et les récepteurs mGluR-I réguleraient de manières opposées la
traduction locale des ARNm nécessaires pour l’endocytose des récepteurs AMPA et
l’induction de la mGluR-LTD. B, en absence de FMRP, il y aurait un excès de la synthèse
protéique et une exagération de la LTD (Bear et al., 2004).
La LTD-mGluR
Les deux formes majeures de la plasticité synaptique dans le cerveau des mammifères, la LTP
(pontentialisation à long terme) et la LTD, sont caractérisées par une augmentation ou une
diminution à long terme de la force synaptique, respectivement. Les deux mécanismes sont
proposés être impliqués dans le stockage de l’information, et par conséquent dans
l’apprentissage et la mémorisation et dans d’autres processus physiologiques (Collingridge et
al., 2010). Différentes formes d’induction de LTD existent, dont la LTD-mGluR dépendante
de la traduction locale. Cette dernière peut être induite par des stimuli synaptiques à double-
charge de faibles fréquences (paired-pulse low frequency stimuli) ou par un traitement
pharmacologique d’un agoniste des mGluR-I, par exemple le DHPG. La traduction locale
rapide après stimulation résulte dans l’internalisation à long terme des récepteurs ionotropes
de glutamate (AMPAR), à la fois des deux sous-unités GluR1 et GluR2, pour au moins une
heure de temps. L’endocytose des AMPAR est nécessaire pour la LTD-mGluR, sachant que
cette dernière est abolie par l’injection d’un peptide interférant avec l’internalisation de ces
récepteurs (Waung and Huber, 2009). Les protéines nouvellement synthétisées ne sont pas
essentielles pour initier l’endocytose des AMPAR, mais elles sont nécessaires pour la
réduction de la membrane de ces récepteurs à long terme après activation mGluR-I
(phénomène observé après une demi-heure de traitement au DHPG). Par exemple, la présence
et la traduction locale des protéines MAP1B et ARC est nécessaire pour l’internalisation des
AMPAR. La suppression ou la surexpression in vivo de ces protéines aboutit à une réduction
ou augmentation de l’endocytose des AMPAR, respectivement, altérant ainsi la LTD-mGluR.
La théorie mGluR de l’X fragile

La protéine FMRP a été identifiée parmi les protéines synthétisées au niveau des synapses
après stimulation des mGluR-I (Weiler and Greenough, 1993; Weiler et al., 1997; Weiler and
Greenough, 1999; Greenough et al., 2001). En absence de FMRP, le niveau de certaines
protéines avait été trouvé augmenté sans activation synaptique, suggérant une perte
d’inhibition de la traduction des ARNm correspondant (Brown et al., 2001; Zhang et al.,
2001; Chen et al., 2003). En parallèle, la LTD-mGluR dépendante de la traduction a été
montrée augmentée dans l’hippocampe des souris Fmr1 (Huber et al., 2002). L’ensemble de
ces observations a permis de proposer la théorie mGluR du FXS. Sous le contrôle des mGluR-
I, FMRP agirait comme un régulateur de la traduction locale d’une population d’ARNm
spécifiques, nécessaires pour la LTD-mGluR (Figure 17) (Bear et al., 2004). Plus
55
précisément, cette théorie postule que FMRP réprimerait la traduction des ARNm importants
pour l’internalisation des AMPAR, dans un cas non-stimulé des neurones. Après activation
mGluR-I, FMRP est proposée lever cette répression de la traduction. Cependant comme on le
verra plus loin (chapitre III, §3), cette théorie est loin d’expliquer l’ensemble des observations
déjà effectuées notamment la perte de stimulation de la traduction locale en absence de FMRP
(Greenough et al., 2001; Weiler et al., 2004). Mais quoiqu’il en soit cette théorie a permis des
avancées notables : La réduction de l’activité des récepteurs mGluR-I a permis de corriger les
phénotypes observés chez les modèles animaux. En effet, l’utilisation d’un antagoniste
spécifique du mGluR5, MPEP (2-methyl-6-(phenylethynyl)-pyridine) a pu corriger certains
phénotypes de l’X fragile au niveau du comportement et des défauts cognitifs dans différents
modèles animaux (drosophile et souris) (McBride et al., 2005; Yan et al., 2005; de Vrij et al.,
2008). De même, MPEP semble corriger des altérations de la morphologie des épines
dendritiques et de l’endocytose des AMPAR. La réduction génétique de 50% des récepteurs
mGluR5 dans les souris Fmr1 KO a permis de corriger également différents phénotypes du
FXS (Dolen et al., 2007).
Des voies alternatives

Parmi les différentes voies de signalisation activées par les mGluR-I, la voie de la PLC-beta
peut aboutir au clivage du DAG par la diacylglycérol lipase alpha (DGL-alpha) en 2-
arachidonoyl-sn-glycérol (2-AG), l’espèce majeure des endocannabinoïdes du système
nerveux central. Une fois formée, le pool de 2-AG traverse l’espace inter-synaptique afin
d’activer les récepteurs endocannabinoides 1 (eCB1R) localisés au niveau de la membrane
présynaptique, induisant ainsi une autre forme de LTD appelée la LTD-eCBR. En absence de
FMRP, l’activation des mGluR-I induit une meilleure réponse des eCBRs au niveau des
synapses GABAergiques du striatum dorsal et de l’hippocampe (Maccarrone et al., 2010;
Zhang and Alger, 2010). Récemment, Jung et al. ont montré que l’activation des mGluR-I, en
absence de FMRP, montre une perte du relâchement de 2-AG et un défaut de l’induction de la
LTD-eCBR au niveau des synapses excitatrices du cortex frontal et du striatum ventral ((Jung
et al., 2012) ; voir chapitre suivant). Dernièrement, des approches pharmacologiques et
génétiques ont été entreprises afin d’étudier l’impact du blocage des eCBR sur les souris
mâles Fmr1 KO. Ces approches ont permis de montrer que la réduction de l’activité des
eCB1R normalise différents phénotypes de l’X fragile tels que les défauts cognitifs, la
susceptibilité aux crises endogènes et l’altération de la morphologie des épines dendritiques
56
(Busquets-Garcia et al., 2013). Le blocage des eCB2R montre des améliorations du

comportement semblable à l’anxiété. Ces données suggèrent que les récepteurs eCB peuvent
constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le FXS.
La transmission synaptique par les récepteurs GABA de type A (GABA A R) est altérée dans
les modèles animaux FXS (Centonze et al., 2008; Olmos-Serrano et al., 2010). Les GABA A R
sont des récepteurs ionotropes, correspondant aux inhibiteurs majeurs du cerveau. Ces
récepteurs sont impliqués dans les processus de l’anxiété, la dépression, l’insomnie,
l’épilepsie, l’apprentissage et la mémoire, des phénotypes altérés dans le FXS. Le niveau des
ARNm de différentes sous-unités GABA A R a été trouvé réduit dans le cortex des souris Fmr1
KO contrairement au cervelet. En effet, 8 sur 18 ARNm des différentes sous-unités (įĮĮ
ĮȕȕȖHWȖ montrent de 35 à 50 % de réduction par rapport aux souris Wt (D'Hulst et
al., 2006). En parallèle, le niveau protéique des sous-unités Į ȕ HW į a été trouvé réduit
après la naissance au cours du développement (Adusei et al., 2010). De même, les 3 sous-
unités des récepteurs GABA chez la drosophile (Grd, Rdl and Lcch3) sont également sous-
exprimées, suggérant que la réduction des récepteurs GABA en absence de FMRP est
conservée avec l’évolution (D'Hulst et al., 2006). L’utilisation des mutants dFxr-nuls chez la
drosophile a permis de sélectionner 3 molécules agissant sur la voie inhibitrice gabaergique
permettant d’empêcher la létalité de ces mutants nourris en excès de glutamate ((Chang et al.,
2008) ; voir chapitre I). L’utilisation d’agonistes des GABA A R, tel que la benzodiazepine
(Diazepam), a permis de montrer que ces récepteurs répondent à l’activation et que certains
phénotypes du FXS sont corrigés (Heulens et al., 2012). Ces données suggèrent que les
agonistes des GABA A R peuvent être utilisés pour des essais cliniques.
Des essais cliniques

Les travaux au cours des dernières années ont révélé de nombreuses nouvelles cibles
thérapeutiques possibles pour le FXS. L'utilisation des antagonistes des mGluR-I ou des
agonistes des GABAAR ont montré une efficacité dans la correction des phénotypes
cellulaires et comportementaux, et de la connectivité cérébrale dans les souris et drosophiles
modèles du FXS. Ces observations ont permis de cibler ces récepteurs dans différents essais
cliniques avec des patients FXS. Le Fénobam, un inhibiteur des mGluR5, a été testé sur une
cohorte de patients adultes mâles et femelles FXS, avec de faibles effets secondaires et des
améliorations du « réflexe de sursaut » (prepulse inhibition) chez quelques patients (Berry-
57
Kravis et al., 2009). Ces premiers résultats indiquent que l’utilisation des antagonistes de
mGluR5 peut être utilisée sans danger chez les patients FXS avec des effets cliniques positifs.
Récemment, la molécule AFQ056, un autre inhibiteur spécifique des mGluR5, a été testée sur
30 mâles FXS âgés de 18 à 35 ans, avec une amélioration des troubles du comportement
uniquement pour les patients avec une méthylation complète du gène FMR1 sans fuite de
transcription (7 patients sur 30) (Jacquemont et al., 2011). Cette première étude ne permet pas
véritablement de conclure que les mGluR5 sont des cibles thérapeutiques efficaces chez
l’homme. La réponse de certains individus au traitement reste prometteuse et un essai clinique
à plus large échelle en phase 2B est actuellement en cours sur des adolescents et adultes avec
FXS. Concernant les récepteurs GABA, un essai clinique actif est en cours utilisant des
agonistes des GABAAR (Ganaxolone) chez les patients FXS à l’institut UC Davis MIND
(www.clinicaltrials.gouv). De plus, un agoniste GABABR, STX209, a été testé sur 63 patients
avec FXS (âgés de 6 à 39 ans, dont 55 mâles) montrant des améliorations de l’isolement
sociale et des troubles du comportement désignés par les parents (Berry-Kravis et al., 2012).
Les effets secondaires communs identifiés chez ces patients sont des effets sédatifs et « maux
de tête ». Le lien moléculaire des récepteurs GABAB avec le FXS n’est pas encore déterminé.
Une activation des GABABR, localisés au niveau de la membrane présynaptique, résulte en
l’inhibition des canaux calciques et du relâchement du glutamate au niveau de la fente
synaptique. Les GABABR pourraient donc agir sur le relâchement du glutamate et réguler
ainsi la voie de signalisation mGluR. Enfin, d’autres cibles thérapeutiques sont également en
cours d’essai clinique, avec des molécules ciblant des protéines surexprimées ou suractivées
en absence de FMRP. Par exemple, la protéine « matrix metallo proteinase 9 » (MMP-9), une
endopeptidase capable de dégrader des protéines matrices extracellulaires permettant une
plasticité structurale a été trouvée surexprimée au niveau de l’hippocampe de souris KO
Fmr1. Cette surexpression a été proposée être responsable de l’altération des épines
dendritiques observée dans cette région (Dziembowska et al., 2013). L’utilisation de la
minocycline, réduisant l’activité des MMP, a été récemment utilisée dans un essai clinique sur
des patients âgés de 3.5 à 16 ans avec FXS. Ce traitement à la minocycline a permis des
améliorations significatives mais modestes de toutes les fonctions des différents participants,
particulièrement au niveau de l’anxiété et de l’humeur (Leigh et al., 2013). Notons que cette
molécule a bien été tolérée jusqu’à 3 mois de traitements dans cet essai, mais des effets
secondaires peuvent commencer à apparaitre après ce délai (Leigh et al., 2013).
58
En conclusion, différents traitements semblent être prometteurs mais des études à plus large
échelle doivent être réalisées pour être concluantes.
59
RGG
FMRP
A Séquence riche en G B
5’ GGGNGGGNGGGNGGG 3’
Boucle N
G-tract
G-quartet
Figure 18. Structure G-quadruplexe

FMRP reconnaît la structure G-quadruplexe via son domaine RGG. A, Modèle d’une
structure intramoléculaire en quadruplexe de guanines. La structure est constituée par la
superposition de plusieurs tétrades de guanines appelés G-quartet et est stabilisée par des
cations, tels que K+, positionnés dans la cavité centrale. B, Structure plane du G-quartet.
Quatre guanines forment un plan carré via des liaisons hydrogènes de types Hoogsteen
(d’après Millevoi et al., 2012).
Chapitre III : Les ARN cibles de FMRP

1- Les différents sites de fixation de FMRP identifiés à ce jour
La structure G-quadruplexe
Les premières études in vitro ont montrées que FMRP se fixe à son propre messager (Fmr1)
avec une forte affinité, et à environ 4% des ARNm provenant d’une banque d’ADNc de
cerveau de fœtus humain (Ashley et al., 1993a; Ceman et al., 1999).
En 2001, au laboratoire, le site de fixation de FMRP au niveau de son ARN messager a été
identifié dans sa phase codante par des délétions progressives. Il est composé d’environ 100
nucléotides (de 1557 à 1658) et possède une forte affinité, estimée à 1 +/- 0.5 nM (Schaeffer
et al., 2001). Ce site est particulièrement riche en guanine et adénine et a été montré former
une structure en tétrades de guanines appelée « G-quadruplexe » (Figure 18A). Ces structures
sont constituées par la superposition de plans formés chacun par quatre guanines interagissant
entre elles par leur position Hoogsteen (Figure 18B). Leur formation est dépendante de la
présence de cations et leur stabilité dépend de la nature des cations monovalents utilisés. Le
potassium en raison de sa taille et de son énergie de solvatation est préféré au sodium ou au
lithium (Joachimi et al., 2009). La structure G-quadruplexe identifiée dans l’ARNm Fmr1 est
essentielle pour la fixation de FMRP, étant donné que la fixation est très stable en présence de
potassium contrairement au sodium ou lithium.
Par la technique de séléction in vitro appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
EXponential enrichment), Darnell et al. (2001) ont confirmé que FMRP se fixe sur une
structure G-quadruplexe. La technique SELEX permet de sélectionner des ARN qui ont une
grande affinité pour la cible protéique mais qui ne correspondent pas forcément à des
séquences naturelles. Après différents tours de sélection, 5 ARN (appelés SC1, 2, …, 5) ont
été sélectionnés ayant une affinité pour FMRP allant de 10 à 31 nM (possédant un motif
commun : DWGG(0-2)-DWGG-(0-1)-DWGG(0-1)-DWGG ; où D = n’importe quels
nucléotides sauf C et W = A ou U). A nouveau, la fixation de FMRP se fait en présence de
potassium et elle est altérée en présence d’ions lithium indiquant la présence d’une structure
G-quadruplexe formée, dans ce cas précis, de 2 plateformes de guanines. Les auteurs ont noté
que ces deux plateformes ne sont pas suffisantes pour permettre la fixation de FMRP in vitro
et des séquences de part et d’autres semblent être nécessaires (un duplexe de 6 pb). Les
60
A B
Figure 19. Structure RMN d’un peptide du domaine RGG de FMRP lié à l’ARN Sc1
A, le peptide du domaine RGG est coloré en rouge avec deux Arginines en vert en contact
direct avec la jonction (orange) entre le duplexe (violet) et le G-quadruplexe (cyan) de
l’ARN Sc1. Le squelette sucre-phosphate de l’ARN est en couleur métal. Un ion K+
(sphère jaune) serait potentiellement fixé à proximité de la jonction entre le duplexe et le
quadruplexe. B, représentation schématique des 3 tétrades formant le G-quadruplexe avec
une plateforme inversée par rapport aux deux autres (Phan et al., 2011).

1- Les différents sites de fixation de FMRP identifiés à ce jour
La structure G-quadruplexe
Les premières études in vitro ont montrées que FMRP se fixe à son propre messager (Fmr1)
avec une forte affinité, et à environ 4% des ARNm provenant d’une banque d’ADNc de
cerveau de fœtus humain (Ashley et al., 1993a; Ceman et al., 1999).
En 2001, au laboratoire, le site de fixation de FMRP au niveau de son ARN messager a été
identifié dans sa phase codante par des délétions progressives. Il est composé d’environ 100
nucléotides (de 1557 à 1658) et possède une forte affinité, estimée à 1 +/- 0.5 nM (Schaeffer
et al., 2001). Ce site est particulièrement riche en guanine et adénine et a été montré former
une structure en tétrades de guanines appelée « G-quadruplexe » (Figure 18A). Ces structures
sont constituées par la superposition de plans formés chacun par quatre guanines interagissant
entre elles par leur position Hoogsteen (Figure 18B). Leur formation est dépendante de la
présence de cations et leur stabilité dépend de la nature des cations monovalents utilisés. Le
potassium en raison de sa taille et de son énergie de solvatation est préféré au sodium ou au
lithium (Joachimi et al., 2009). La structure G-quadruplexe identifiée dans l’ARNm Fmr1 est
essentielle pour la fixation de FMRP, étant donné que la fixation est très stable en présence de
potassium contrairement au sodium ou lithium.
Par la technique de séléction in vitro appelée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
EXponential enrichment), Darnell et al. (2001) ont confirmé que FMRP se fixe sur une
structure G-quadruplexe. La technique SELEX permet de sélectionner des ARN qui ont une
grande affinité pour la cible protéique mais qui ne correspondent pas forcément à des
séquences naturelles. Après différents tours de sélection, 5 ARN (appelés SC1, 2, …, 5) ont
été sélectionnés ayant une affinité pour FMRP allant de 10 à 31 nM (possédant un motif
commun : DWGG(0-2)-DWGG-(0-1)-DWGG(0-1)-DWGG ; où D = n’importe quels
nucléotides sauf C et W = A ou U). A nouveau, la fixation de FMRP se fait en présence de
potassium et elle est altérée en présence d’ions lithium indiquant la présence d’une structure
G-quadruplexe formée, dans ce cas précis, de 2 plateformes de guanines. Les auteurs ont noté
que ces deux plateformes ne sont pas suffisantes pour permettre la fixation de FMRP in vitro
et des séquences de part et d’autres semblent être nécessaires (un duplexe de 6 pb). Les
60
mutations ponctuelles au niveau du motif G-quadruplexe sont celles qui affectent le plus la
fixation de FMRP (perte d’affinité de l’ordre de 100 fois). Les auteurs ont également montré
que le mutant I304N de FMRP (mutation ponctuelle au niveau du deuxième domaine KH2) se
fixe de la même manière que le sauvage, et que la région C-terminal comportant le domaine
RGG est indispensable et suffisante pour la fixation (Darnell et al., 2001).
Récemment, Phan et al. (2011) ont résolu, par résonance magnétique nucléaire (RMN), la
structure du complexe entre un peptide du domaine RGG de FMRP (28 acides aminés) et
l’ARN SC1 identifié par SELEX (36 nucléotides) (Figure 19A). Ce complexe a permis de
révéler une structure G-quadruplexe formée de 3 tétrades de guanine orientées de manière
imprévisible en orientation anti-sens les unes par rapport aux autres (Figure 19B). De plus, un
duplexe de 6 pb est formé avec une jonction supplémentaire permettant de relier le duplexe au
G-quadruplexe (Figure 19A). D’une manière surprenante, les interactions entre ARN et
protéine se font au niveau de cette jonction avec deux résidus arginines (R10 et R15)
contactant le grand sillon du duplexe, mais sans interaction directe avec la structure G-
quadruplexe. Cependant, les auteurs soulignent l’importance de la structure G-quadruplexe
dans l’ancrage du peptide au niveau de la jonction. Rappelons de plus que l’ARN SC1 est un
ARN non naturel identifié par SELEX (Phan et al., 2011).
Depuis la découverte de la structure G-quadruplexe comme site de fixation de FMRP au

niveau de son propre ARNm et par SELEX, d’autres ARNm cibles de FMRP ont été
identifiés comportant de tels motifs. Par exemple, les ARNm Map1b, Sapap3/4, Nap-22,
Munc13, Pp2a, Sema3f. Pour la plupart, ces motifs ont été découverts par l’utilisation de
programmes bioinformatiques et des banques de données permettant de rechercher un
consensus G-quadruplexe. Ce dernier est basé sur la séquence canonique DDGG-N(0-2)-
DDGG-N(0-2)-DDGG-N(0-2)-DDGG où D peut être n’importe quel nucléotide sauf C. Bien
évidemment, ces consensus doivent être validés expérimentalement, afin de montrer qu’ils
sont effectivement capables de former des structures G-quadruplexes reconnus par FMRP.
Ceci est le cas des ARNm suivants : Fmr1, Map1b, Pp2a, Sema3f qui ont été validés en
utilisant des méthodes biochimiques ou biophysiques (tels que la sensibilité aux nucléases
cations dépendant, les sondes enzymatiques et chimiques, la RMN etc…) (Schaeffer et al.,
2001; Castets et al., 2005; Menon and Mihailescu, 2007; Menon et al., 2008; Phan et al.,
2011). L’impact de la fixation de FMRP sur quelques-uns de ces ARNm est détaillé dans le
§3 de ce chapitre.
61
Indépendamment d’une reconnaissance par FMRP, les structures G-quadruplexes dans les
ARN peuvent avoir des rôles biologiques importants, tels que la stabilité, la dégradation et le
transport des ARN, l’activation et la répression de la traduction (Millevoi et al., 2012).
Les séquences riches en Uridines

L’utilisation de la technique cDNA-SELEX à partir d’un pool d’ARNm de cerveau humain
fœtal et adulte a permis d’identifier des séquences riches en uridine dans différentes cibles de
FMRP (Chen et al., 2003). Cette technique est une variante du SELEX décrit ci-dessus, mais
dans ce cas précis, ce sont les ARNm du pool fixés par FMRP qui ont servi de matrice pour la
sélection. A l’issu de cette étude, 57 séquences d’environ 500 nucléotides ont été identifiées.
35% de ces séquences comportent de multiples pentamères riches en uridines, à la fois au
niveau de la phase codante et la région 3’UTR de ces cibles. Une affinité de 13 nM est
mesurée entre la GST-FMRP et un ARN comportant des pentamères riches en U (450
nucleotides de l’ARN RhoA). En 2009, par des études de pontages covalents aux UV et de
mutagenèses, FMRP est montrée interagir avec des séquences riches en U (un polymère de 10
U) présents au niveau de la région 5’UTR de l’ARNm hAsh1 (human Achaete-scute
homologue-1 ; Mash1 chez le rat) (Fahling et al., 2009). La fixation de FMRP sur le poly-U
module l’interaction d’autres protéines avec la région 5’UTR, suggérant un rôle de chaperon
de FMRP régulant l’expression de l’ARNm hAsh1. A ce jour, le domaine de FMRP
reconnaissant ces poly-U et la caractérisation de la structure de ce motif restent à déterminer.
L’impact de FMRP sur l’ARNm hAsh1 est détaillé au niveau du §3.
Un ARN non codant (BC1) comme intermédiaire entre FMRP et ARNm

cibles
Les ARN BC1 et BC200 (Brain Cytoplasmic RNA 1/200) sont des ARN non codant de 200
nucléotides de longs, spécifiquement exprimés dans les neurones de rongeurs et de primates,
respectivement. L’ARN BC1 a été proposé agir comme un adaptateur permettant, par
appariement de séquence complémentaire avec un ARNm, le recrutement de FMRP sur ce
transcrit cible. Le modèle proposé repose sur la co-immunoprécipitation de BC1 avec FMRP
à partir d’extraits de cerveaux de souris et par de tests de retards sur gel montrant une
interaction directe avec FMRP in vitro (Zalfa et al., 2003). Cependant, ce modèle est
controversé par les travaux de cinq laboratoires différents qui ont montré que l’interaction
entre BC1 et FMRP est aspécifique (Iacoangeli et al., 2008). Ces auteurs ont montré que
62
KH2
FMRP
kc1
Figure 20. Modèle de la structure d’ARN « kissing complex » kc1

FMRP reconnaît la structure kc1 via son domaine KH2. La séquence et structure
secondaire du motif kc1 identifié par SELEX est présentée au milieu de la figure. Les
séquences en jaunes au niveau des deux boucles encerclées sont prédites interagir
ensemble pour former une structure tertiaire (en bas de la figure) (Darnell et al., 2005).
FMRP et BC1 sont tous les deux des répresseurs de la traduction mais qui opèrent
indépendamment (Iacoangeli et al., 2008). Depuis ces travaux solides, le modèle de BC1
comme intermédiaire entre FMRP et ARNm cibles est donc réfuté.
Une structure dite « loop-loop pseudoknot » ou « kissing complex »

Encore une fois, la technique SELEX a été utilisée pour trouver les cibles de FMRP
reconnues par son deuxième domaine KH (Darnell et al., 2005). Contrairement à la stratégie
qui a été utilisée pour identifier la structure G-quadruplexe (Darnell et al., 2001), ici, les
auteurs ont utilisé différents fragments de la protéine FMRP (une protéine de taille complète,
un fragment comportant uniquement les deux domaines KH (KH1/KH2) ou un petit fragment
correspondant à la région C-terminal) pour interroger une librairie de séquences d’environ 90
nucléotides. Après 8 tours de sélections, treize ligands, dont deux prédominants (appelées kc1
et kc2), ont été identifiés reconnus par le fragment KH1/KH2 avec une forte affinité allant de
30 à 100 nM (kc1 : 48.9 + 13.6 nM ; kc2 : 65.9 + 16.6). Le deuxième KH (KH2) est
nécessaire et suffisant pour la fixation étant donné que ce domaine seul est suffisant pour
reconnaître ces ligands et que le mutant I304N (mutation ponctuelle dans ce domaine) n’est
plus capable de se fixer. L’utilisation de programme de prédiction de structure secondaire
d’ARN (mfold 3.1), de mutagenèses dirigées et de sondages enzymatiques et chimiques a
permis d’identifier une structure commune de ces ligands. Cette structure se compose de deux
tiges boucles avec un duplexe de 4pb formé par des interactions entre les deux boucles («
loop-loop pseudoknot » ou « kissing complex ») (Figure 20). Un ion Mg++ est nécessaire
pour stabiliser cette structure et permettre l’interaction avec le domaine KH2. Les interactions
de ce domaine avec l’ARN dépendent du duplexe de 4pb formé entre les deux boucles, mais
un raccourcissement des tiges boucles n’affecte pas la fixation. Rappelons que cette structure
« kissing-complex » a été identifiée par SELEX (méthode de sélection in vitro), et à ce jour,
n’a pas été identifiée dans des ARNm endogènes cibles de FMRP. Ceci pourrait être expliqué
par le fait que cette structure nécessite l’interaction entre deux molécules d’ARN telles qu’un
ARNm cible et un ARN adaptateur ou un microRNA (discuté dans le chapitre II).
La structure SoSLIP (Sod1 mRNA Stem Loops Interacting with FMRP)

Une structure appelée SoSLIP a été identifiée dans l’ARNm Sod1 (Superoxide Dismutase 1)
comme un nouveau site de fixation de FMRP (Bechara et al., 2009). L’ARNm Sod1 a été
identifié par la technique APRA (discutée dans le §2 de ce chapitre) et ne comporte pas de
63
RGG
FMRP
Homo sapiens
Figure 21. Modèle de la structure d’ARN SoSLIP

FMRP reconnaît la structure SoSLIP via son domaine RGG. Par alignement de séquence,
SoSLIP a été identifié conservé chez la souris, le rat et l’homme. La structure secondaire
est composée de trois tiges boucles (Bechara et al., 2009).
structure G-quadruplexe ou « Kissing Complex ». Contrairement à ces deux dernières, la

structure SoSLIP n’est pas sensible aux cations mono ou divalents (Mg++, K+ et Na+) et elle
est composée de trois tiges boucles indépendantes séparées par des petites séquences simples
brins. Cette structure est composée d’un domaine minimal de 64 nucléotides chevauchant le
codon d’initiation AUG de l’ARNm Sod1 (Figure 21). La protéine FMRP reconnait SoSLIP
via la région C-terminale comportant la boite RGG avec une forte affinité, mesurée in vitro,
égale à 3 +/- 1 nM. FMRP reconnaît essentiellement les deux dernières tiges boucles et des
nucléotides non appariés au niveau de la troisième boucle. FMRP, par sa fixation, provoque
également un remodelage de la structure exposant ainsi des nucléotides qui étaient
initialement appariés tels que ceux du codon d’initiation AUG. A ce jour, la structure SoSLIP
a été identifiée dans un seul ARNm endogène correspondant à celui de la Sod1. L’impact de
FMRP sur cet ARNm est détaillé dans le §3.
Les motifs ACUK et WGGA (où K = G ou U et W = A ou U)

Récemment, par l’utilisation de la technique PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-
Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) dans des cellules HEK293, Ascano et al.
(2012) ont proposé que FMRP cible des séquences d’ARN distinctes pour réguler l'expression
des protéines (la méthode est discutée dans le §2 de ce chapitre). L’analyse des résultats du
PAR-CLIP a permis d’identifier des sites de fixation de 33 nucléotides de longs, répartis
essentiellement entre les séquences codantes et les régions 3’UTR des ARNm cibles (Figure
22A). En utilisant la méthode d’analyse cERMIT, les motifs ACUK et WGGA ont été
retrouvés dans plus de 50% des sites de fixation, d’une manière exclusive ou simultanée
(Figure 22B-C). Des mesures d’affinité (retard sur gel : EMSA) d’une protéine recombinante
humaine FMRP sont réalisées avec quelques-uns de ces sites de fixation (identifiés dans ces
différents ARN cibles : Apc, App, Fmr1, Kdm5c, Map1b, Nf1, Ppp2ca, Serbp1, Ube3a et
Zzz3). En moyenne, les sites de fixation comportant les motifs WGGA et/ou ACUK ont une
affinité égale à +/- 100 nM. Cette affinité est améliorée en fonction du nombre de ces motifs
présents dans les sites de reconnaissance. La mesure d’affinité avec le mutant I304N
(mutation ponctuelle dans le deuxième domaine KH2) a permis de montrer que le domaine
KH2 reconnait le motif ACUK, mais aucune altération de l’affinité n’a été observée pour le
motif WGGA. Ceci suggère que ce dernier est reconnu par un autre domaine de la protéine,
non déterminé par cette étude (Ascano et al., 2012).
64
A B
Figure 22. Les motifs ACUK et WGGA identifiés par PAR-CLIP

A, répartition des sites identifiés par PAR-CLIP au niveau des exons/introns (le graphique
gauche) et aux niveaux des régions codantes et non codantes (graphique à droite). B, deux
motifs déduits comme élément de reconnaissance de FMRP (Iso1 et Iso7) selon cERMIT
(en haut ACUK, en bas WGGA ; où K = G ou U et W = A ou U). C, répartition avec un
code couleur des motifs, ACUK et WGGA, présent dans les sites de fixation le long de 6
ARNm dont le nom est indiqué sur la figure. Les rectangles vides correspondent aux CDS
et les traits noirs épais aux UTR. Les chiffres indiquent la taille des ARNm en nombre de
bases (Ascano et al., 2012).
Nous avons vu les nombreux sites de fixation de FMRP proposés dans la littérature depuis
2001, soulignant la complexité de reconnaissance des ARN par FMRP. Malgré cette
contradiction, à ce jour, la structure G-quadruplexe (Darnell et al., 2001; Schaeffer et al.,
2001) reste le site de fixation ayant la plus forte affinité pour FMRP (1 nM) (WGGA et
ACUK, (Ascano et al., 2012), présentent une affinité 100 fois inférieure) . De plus, cette
structure reste le site de fixation le plus fréquent dans les ARNm cibles de FMRP validés
incluant son propre messager (seulement un seul ARNm identifié pour la triple tige boucle et
aucun pour la structure « kissing complexe »).
2- Les différentes listes des ARNm cibles de FMRP (différentes

stratégies)
Depuis la découverte que FMRP est une protéine de liaison à l’ARN régulant la traduction
locale au niveau des synapses, plusieurs équipes à travers le monde ont tenté d’identifier la
liste des ARNm sous contrôle de FMRP pour expliquer la physiopathologie du FXS.
La technique RIP-Chip à partir de cerveaux de souris

La première étude globale d’hybridation sur puces des ARN co-immunoprécipités avec le
complexe FMRP-RNP (RIP-Chip avec un anticorps dirigé spécifiquement contre FMRP), à
partir de cerveaux de souris, a permis de proposer 432 ARN cibles potentiels (Brown et al.,
2001). Ces transcrits représentent 3.9% (432 sur 11067 gènes) des ARN totaux. Cette liste a
été établie en utilisant deux critères de normalisation : d’une part, les ARN immunoprécipités
(ARN IP) à partir d’extraits de cerveaux sauvages (Wt) sont comparés à ceux des cerveaux
KO de FMRP, et d’autre part, les ARN IP Wt sont comparés aux ARN totaux à partir des
mêmes extraits de cerveaux sauvages. Sur les 432 ARN sélectionnés, 80 cibles ont été mis en
avant et seulement trois ont été validées par PCR quantitative (Tumor protein P63 (TP63),
Sec7-related transcript (facteur d’échanges nucléotidiques (GEF) par homologie), KIAA0317
protein (une protéine avec une activité ligase d’ubiquitines)). D’un point de vue fonctionnel,
FMRP est une protéine associée aux polyribosomes (voir chapitre II), suggérant une altération
des ARNm cibles dans les polyribosomes en son absence. C’est pourquoi, en parallèle du
RIP-Chip qui a été réalisé à partir de cerveaux de souris, une analyse sur puces a été réalisée
sur les ARNm associés aux polyribosomes dans des cellules lymphoblastoides humaines
normales et issues de patients FXS. Après une recherche d’orthologie, seulement 24 ARN sur
les 80 cibles identifiées par le RIP-chip ont été trouvées communes avec l’analyse dans les
65
polyribosomes. Sur ces 24 ARN, 12 présentent des altérations en absence de FMRP (6 sont
augmentés et 6 diminués suggérant des fonctions d’activation et de répression de la traduction
par FMRP selon la cible). En ce qui concerne les cibles qui ne sont pas altérées, les auteurs
suggèrent une compensation par les paralogues (FXR1P / FXR2P) en absence de FMRP.
Notons que les auteurs ont identifié un consensus G-quadruplexe dans 8 des 12 transcrits
altérés dans les polyribosomes.
La technique APRA (Antibody Positioned RNA Amplification)

En 2003, la technique APRA a été utilisé afin d’identifier les ARN cibles de FMRP,
directement dans les neurones primaires d’hippocampes de rat (Miyashiro et al., 2003). Cette
technique a été utilisée uniquement sur des neurones sauvages c'est-à-dire en présence de
FMRP. Le principe de cette technique repose sur l’utilisation d’un anticorps anti FMRP
couplé à un oligonucléotide dégénéré sur des cellules fixées et perméabilisées. Seuls les ARN
dans le voisinage de l’anticorps sont amplifiés en ADN complémentaire (ADNc), suivi d’une
hybridation sur des puces comportant ~1100 ADNc humains exprimés spécifiquement dans le
système nerveux central (« Neuroarrays ») ou ~5000 ADNc du rat (les puces « GF300 »).
19% des ADNc présents sur les « neuroarrays » (223/1153) et environ 16% présents sur les
puces « GF300 » (818/5000) ont été trouvés cibles putatives de FMRP. Par des tests de
biochimie, les auteurs ont confirmé une interaction possible de FMRP avec 50 ARN sur 83
testés parmi les cibles putatives obtenues par « neuroarrays ». 23% (18/83) de ces ARN
présentent un consensus G-quadruplexe, suggérant la reconnaissance d’autres motifs. Sur les
80 meilleures cibles identifiées dans l’étude de Brown (voir ci-dessus), seulement 17 sont
présents sur les puces «GF300 » et peuvent être comparés aux résultats obtenus par la
technique APRA. 8/17 ARN sont identifiées dans les deux études comme cibles de FMRP
(GRIN1, IP3 receptor, Rab6 associated GDI, Tesk1, PI 4 Kinase, alpha latroxin receptor,
mRNA similar to tensin, mRNA similar to acetylglucosaminyl transferase). En parallèle, la
technique APRA a été utilisée sur un des paralogues de FMRP (FXR1P) avec 52% de cibles
communes (116/223), suggérant une éventuelle compensation en absence de FMRP. Le
niveau des produits de 9 ARN cibles de FMRP a été quantifié par « western blot » (WB).
Seuls deux (GRK2 et transmembrane 43-kd dystrophin-associated glycoprotein ȕ-DAG) ont
présenté une altération significative dans les extraits totaux de cortex KO comparativement au
Wt et trois (GRK2, RGS5 et CDK4) dans les extraits de synaptoneurosomes.
66
Nombre de transcrits
Figure 23. Séquences uniques identifiées par HITS-CLIP
Les différents sites de fixation obtenus après HITS-CLIP de FMRP se répartissent
essentiellement au niveau de la phase codante (orange) des ARNm avec peu de recouvrement
des régions non traduites. Ces séquences uniques ne comportent pas de motifs communs
(Darnell et al., 2011)
Figure 24. Blocage du ribosome au cours de la traduction sur ARNm cibles de FMRP
Les profils des ARNm cibles à gauche de la figure (Lingo1, Kif1a et Map1b) et les ARNm
non cibles à droite (Glrb, Slc35f1 et Hprt1) dans les polyribosomes sont présentés. Un
décalage entre les profils est observé après induction de l’arrêt de la traduction dans un
système in vitro uniquement pour les ARNm cibles. Les barres d’erreurs correspondent à des
triplicats techniques (trois points de qPCR).
La technique « HITS-CLIP » à partir de cerveaux de souris

Récemment, la technique « HITS-CLIP » (séquençage à haut débit des ARN isolés par
immunoprécipitation après pontage covalent) a été utilisée afin d’identifier les interactions de
FMRP avec les ARNm présents dans les polyribosomes de cerveaux de souris (âgées de 11 à
25 jours, une période de la vie critique pour la plasticité synaptique) (Darnell et al., 2011).
Dans cette étude, différentes stratégies du CLIP sur les polyribosomes ont été réalisées,
mettant en jeu deux anticorps différents dirigés contre FMRP. Notons que dans cette
technique de petits fragments d’ARN protégés par FMRP sont générés avant de réaliser le
séquençage à haut débit, et que le séquençage n’a pas été réalisé sur du CLIP à partir de
cerveaux de souris Fmr1 KO. A l’issu de cette étude, 842 cibles ont été identifiées avec une
probable sous-estimation du nombre de ces cibles (quelques transcrits sont rares, présents
seulement dans des fractions de cellules, ou interagissant avec FMRP après certaines
conditions). Une partie significative de ces transcrits codent pour des protéines impliquées
dans la transmission synaptique, notamment des protéines pré-synaptiques (11.6% des ARN
cibles de FMRP correspondant à 30% des ARN pré-synaptiques) et post-synaptiques (32%
des ARN cibles de FMRP correspondant à 28% des ARN post-synaptiques). Parmi ces cibles,
des transcrits codant pour des sous-unités des récepteurs NMDA et mGluR5 ou des protéines
associées ont été retrouvés (par exemple : Psd95, Psd93, Shank1-3, Homer1, Syngap1 etc…).
Au contraire, des transcrits codant pour des protéines impliquées dans la voie des récepteurs
AMPA ne sont pas retrouvés comme cibles de FMRP. Ces données soulignent la régulation
de voies spécifiques par FMRP. De plus, de nombreux transcrits codant pour des protéines
motrices délivrant les cargos vers les compartiments pré-synaptiques sont identifiés comme
cibles (tels que Kif1a, Kif1b, Kif1c…). Enfin, 28 transcrits codant pour des protéines
impliquées dans l’autisme ont été trouvés, notamment Shank3. En comparaison avec l’étude
de Brown et al. (2001), 24% des cibles identifiées par « HITS-CLIP » (Darnell et al., 2011)
correspondant à 44% des cibles identifiées par « RIP-CHIP » (Brown et al., 2001) sont
communes, avec 661 nouvelles cibles. De manière assez surprenante, les sites d’interaction de
FMRP avec les ARN cibles identifiés dans cette dernière étude ont été trouvés essentiellement
au niveau des phases codantes (66% des ARN cibles) avec aucune position spécifique vis-à-
vis des codons d’initiation et de la terminaison de la traduction, et avec un faible
recouvrement des régions 5’ et 3’UTR (Figure 23). Ainsi, les auteurs ne précisent aucun site
de reconnaissance commun sur les ARN identifiés alors que le but premier de cette étude était
67
d’identifier des sites spécifiques de FMRP sur ses ARNm. Les auteurs justifient ces résultats
en suggérant que FMRP se fixe à différents endroits au niveau de la phase codante de ses
ARNm, provoquant ainsi des arrêts du ribosome durant l’élongation de la traduction. En effet,
alors qu’ils n’ont pas pu observer de différences de profils des ARNm cibles dans les
polyribosomes (9 ARNm cibles et 9 ARNm non cibles) entre cerveaux de souris contrôles et
FXS, une différence est observée après induction de l'arrêt de la traduction avec la
puromycine (en utilisant un système in vitro de l’arrêt de la traduction) (Figure 24). Seul les
ARN bloqués avec quelques ribosomes semblent persister après traitement par la puromycine
en présence de FMRP, suggérant que cette dernière bloquerait la traduction à l’étape de
l’élongation sur les ARNm cibles (le modèle est discuté au chapitre II). En conclusion, dans
cette étude la question de la spécificité de liaison aux ARN de FMRP demeure non résolue et
remet ainsi en cause la liste des cibles proposées.
La technique PAR-CLIP à partir de cellules HEK293

Récemment, Ascano et al. (2012) ont utilisé la technique PAR-CLIP pour identifier les
ARNm cibles de FMRP, et proposer ainsi les motifs ACUK et WGGA comme sites de
fixation de la protéine (décrits dans le §1). Cette méthode est basée sur l'incorporation
d'analogues ribonucléosides photoréactifs (4-thiouridine (4-SU)) dans les transcrits naissants,
permettant d’induire des liaisons covalentes plus nombreuses que pour le CLIP entre les
protéines et les ARN. Différentes lignées (des cellules HEK293, stables et inductibles) ont été
utilisées exprimant différentes protéines de la famille FXR fusionnées à un peptide HA
permettant une immunoprecipitation (HA- : Iso1, Iso7, I304N-Iso1, I304N-Iso7, FXR1 et
FXR2). Après sélection, 80000 à 100000 séquences sont obtenues correspondant aux sites de
fixations de la protéine FMRP (isoformes 1 et 7). Ces séquences se répartissent sur 6000
ARNm cibles. La comparaison des séquences obtenues avec les paralogues (FXR1P et
FXR2P) montre un recouvrement de 95% des cibles, suggérant la reconnaissance des mêmes
ARN pour toute la famille FXR. En parallèle du PAR-CLIP, une co-immunoprecipitation des
ARN associés à la protéine HA-Iso1 suivi d’une hybridation sur puces a été réalisée (RIP-
CHIP). 3593 ARN idéntifiés par PAR-CLIP sont enrichis par RIP-CHIP dont 939 ARN
montrent un enrichissement de plus deux fois. Par ailleurs, les auteurs ont noté que 646 ARN
sont uniquement identifiés par RIP-CHIP. A l’issue de ces deux études, des milliers d’ARNm
cibles sont proposés, mais une liste spécifique n’est pas clairement proposée. En parallèle de
ces études d’interactions, les auteurs ont montré une diminution d’environ 30% de la quantité
68
Tableau 1. Les ARNm cibles « validés » de FMRP
Structure Stimulé Méthode
Localisation
ARNm G-quadruplexe par les de Bibliographie
dendritique
(like) mGluR-I validation
(Westmark and
App + (+) + Co-IP
Malter, 2007)
(Steward and Worley,
2001; Park et al.,
Arc + NR + Co-IP 2008; Waung et al.,
2008)
(Zalfa et al., 2003;
Muddashetty et al.,
Camk2a + + + Co-IP
2007; Subramanian et
al., 2011)
Dgla + (+) + Co-IP (Jung et al., 2012)
(Cvetkovska et al.,
Dscam + NR Co-IP
2013)
Co-IP ; in
eEf1a + NR + (Sung et al., 2003)
vitro
(Weiler et al., 1997;
Co-IP ; in
Fmr1 + + + Schaeffer et al., 2001;
vitro Antar et al., 2004)
(Muddashetty et al.,
GluR1/2 + NR + Co-IP 2007)
(Darnell et al., 2001;
Antar et al., 2005;
Co-IP ; in Hou et al., 2006;
Map1b + + +
vitro Davidkova and
Carroll, 2007; Menon
et al., 2008)
(Todd et al., 2003;
Psd95 + + + Co-IP ; in Muddashetty et al.,
vitro ; CLIP 2007; Zalfa et al.,
2007; Subramanian et
al., 2011)
(Brown et al., 2001;
Kindler et al., 2004;
Sapap3/4 + NR + Co-IP Narayanan et al.,
2007; Dictenberg et
al., 2008)
(Darnell et al., 2001;
Sema3F (+) Co-IP Menon and
Mihailescu, 2007)
APRA; in (Miyashiro et al.,
Rgs5 + NR + vitro 2003; Dictenberg et
al., 2008)
GabaAd + NR + APRA; in (Miyashiro et al.,
vitro 2003; Dictenberg et
al., 2008)
Pp2a + in vitro (Castets et al., 2005)
Sod1 - APRA; in (Miyashiro et al.,
vitro 2003; Bechara et al.,
2009)
+ : confirmé, (+) : proposé, NR : Non renseigné, - : absence de G-quadruplexe.
globale de protéines de quelques cibles (FXR2P, HUWE1, KDM5C, mTOR etc…) par
« western blot » (WB), après expression de FMRP dans les cellules Hek293 (tandis qu’aucune
différence n’a été observée sur le transcriptome). Cette diminution a été corrélée à une légère
augmentation des niveaux de 4 de ces protéines dans des extraits de cerveaux humains FXS.
A ce jour, différentes listes d’ARNm cibles de FMRP ont donc été proposées par différents
laboratoires mais peu de recouvrements ont été observés entre ces listes, et donc une grande
contradiction demeure quant à l’existence d’une liste d’ARNm dont la traduction serait
altérée. Parmi ces centaines, voire milliers, de cibles ARN proposées être régulées par FMRP,
la question subsiste donc des ARN cibles ayant un impact majeur sur la maladie.
3- Les ARNm « validés » comme cible de FMRP, cas par cas

Malgré toutes les cibles déjà proposées dans la littérature, seuls quelques ARNm ont
réellement été « validés » à ce jour par des techniques de biochimie (tableau 1). L’impact de
FMRP sur quelques-uns est discuté ci – dessous.
L’ARNm Fmr1 (Fragile X mental retardation 1)

Au laboratoire, après avoir identifié le site de fixation de FMRP au niveau de la boite RGG de
son propre messager (voir §1, (Schaeffer et al., 2001)), Didiot et al. (2008) ont montré par
l’utilisation d’un système de minigène que ce site est un régulateur de l’épissage alternatif. En
caractérisant plus précisement le site de fixation, deux structures G-quadruplexes ont été
identifiées. Alors que ces structures sont nécessaires pour la régulation de l’épissage du
minigene, aucun impact de ces structures n’a été observé sur la régulation de la traduction de
l’ARNm Fmr1 ou sa présence dans les polyribosomes. L’équilibre entre des isoformes courts
ou longs de l’exon 15 de la protéine est altéré en modulant le niveau de FMRP dans la cellule.
De plus, le profil d’épissage de l’exon 15 est altéré dans des extraits de cortex Fmr1 KO
comparativement au Wt (le modèle de souris Fmr1 utilisé exprime l’ARNm Fmr1 avec une
cassette néomycine au niveau de l’exon 5 et ne produit pas FMRP, voir chapitre I §5 modèle
KO1) (Didiot et al., 2008). Ces résultats suggèrent que par sa fixation sur son site au niveau
de son propre messager, FMRP régulerait le ratio entre les différentes isoformes. A ce jour, la
fonction de ces différentes isoformes reste mal comprise et l’ARN Fmr1 reste la seule cible
sur laquelle FMRP jouerait un rôle dans l’épissage alternatif.
69
L’ARNm Arc / Arg3.1 (Activity-regulated cytoskeleton-associated protein)

La protéine ARC interagit avec les composants de la machinerie d’endocytose (Dynamine et
Endophiline) pour stimuler l’internalisation des récepteurs ionotropiques AMPA provoquant
la dépression à long terme (LTD). La fonction importante d’ARC dans la plasticité synaptique
explique le choix d’étude de son ARNm comme cible de FMRP. L’ARNm Arc est montré co-
immunoprécipité avec FMRP à partir d’extraits de cerveaux sauvages comparativement aux
FXS, mais à ce jour aucun site de fixation de FMRP n’a été identifié. Le niveau de l’ARNm
Arc est augmenté dans les polyribosomes préparés à partir de cerveaux totaux ou de
synaptoneurosomes FXS non activés. En parallèle, le niveau de la protéine Arc est augmenté
dans FXS ((Zalfa et al., 2003), cet effet n’est pas observé par d’autres laboratoires à partir
d’extraits d’hippocampes ou de cortex (Park et al., 2008)). Le niveau de la protéine Arc est
augmenté dans des cultures et coupes d’hippocampes après activation mGluR-I (DHPG
100μM 5 min, mais non après activation des récepteurs ionotropiques NMDA). En absence de
la protéine ARC, l’internalisation des AMPAR et de l’activité synaptique mGluRI-dépendant
sont altérés et la surexpression d’ARC montre l’effet inverse. Notons que les inhibiteurs de la
traduction (et non de la transcription) empêche l’augmentation du niveau d’ARC après
l’activation mGluR-I, suggérant ainsi une régulation traductionnelle de l’ARNm (Waung et
al., 2008). Cette augmentation du niveau d’ARC après mGluR-I est absente dans les neurones
et coupes d’hippocampes FXS. Ceci suggère que la traduction de l’ARNm Arc est dérégulée
en absence de FMRP et surtout les cellules FXS ne sont pas capables de répondre à
l’activation mGluRI en augmentant le niveau de la protéine ARC.
L’ARNm App (Amyloid precursor protein)

APP est une protéine importante pour la formation des synapses. Elle est surtout connue
comme la molécule précurseur dont la protéolyse génère un peptide appelé bêta-amyloïde (37
à 49 acides aminés (Aß)). Aß est le principal composant de plaques amyloïdes observées dans
le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. C’est par la recherche de séquences
qu’un consensus G-quadruplexe a été identifié au niveau de la phase codante de l’ARNm App
(694-846) suggérant que cet ARN puisse être une cible potentielle de FMRP (Westmark and
Malter, 2007). L’ARNm APP co-immunoprécipite avec FMRP à partir de synaptoneurosomes
sauvages, et cette interaction est perdue après activation mGluR-I. Par l’utilisation de la
technique CLIP suivie d’une digestion à la RNase T1, deux sites de fixation de FMRP ont été
identifiés (la région 699-796 au niveau de la phase codante correspondant à une séquence
70
riche en G et une séquence au niveau de la région 3’UTR). La présence d’une structure G-

quadruplexe dans ces deux sites de fixation reste à être déterminée. En parallèle de ces
résultats d’interactions, le niveau de la protéine APP est augmenté après activation des
mGluR-I dans les synaptoneurosomes ou culture de neurones corticaux de souris sauvage
mais pas dans les neurones Fmr1 KO. Dans ce cas, le niveau d’APP est trouvé
constitutivement élevé, suggérant une perte de régulation (Westmark and Malter, 2007). Ces
données indiquent que FMRP réprimerait la traduction de l’ARNm App à un niveau basal et
cette répression est levée après activation mGluR-I.
L’ARNm hAsh1 (human Achaete-scute homologue 1)

C’est en combinant différents critères de recherche (les ARNm avec des motifs G-
quadruplexes ou polymères riches en U, les ARNm avec un rôle dans le développement du
système nerveux central et les ARN codants pour des facteurs de transcription) que l’ARNm
hAsh1 a été sélectionné comme cible potentielle de FMRP (Fahling et al., 2009). Notons que
cet ARN n’est pas proposé dans les différentes listes globales, mais les auteurs ont montré une
interaction de FMRP avec la région 5’UTR dépendant de la séquence riche en U in vitro (voir
§1). La surexpression de FMRP dans les cellules HEK293 a montré une augmentation du
niveau hASH1et le « knock down » de FMRP avec un siRNA une diminution. De plus, le
niveau de l’ARNm hAsh1 dans les polysomes lourds est augmenté après surexpression de
FMRP et une augmentation de la traduction est observée dépendant de la région 5’UTR en
utilisant un gène rapporteur. Ces différentes données suggèrent que FMRP régulerait
positivement l’expression de ce gène.
L’ARNm Camk2a (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alpha)

Les premières études de l’ARNm Camk2a comme cible potentielle de FMRP se sont basées
sur le rôle important de CAMK2a dans la plasticité synaptique et sur la régulation de son
expression au niveau des synapses (Zalfa et al., 2003). L’ARNm Camk2a a été montré co-
immunoprécipiter avec FMRP à partir de synaptoneurosomes de cortex de souris sauvages
(Muddashetty et al., 2007). Une interaction directe in vitro a été montrée dans notre
laboratoire, au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Camk2a via une structure G-
quadruplexe ((Subramanian et al., 2011) ; voir annexe). La localisation de l’ARNm Camk2a
dans les neurites n’est pas affectée par l’absence de FMRP à un niveau basal, mais un effet
positif de FMRP sur le transport a été mis en évidence après activation des mGluR-I (Wang et
71
al., 2008; Subramanian et al., 2011). Le niveau de l’ARNm Camk2a est trouvé augmenté dans
les polysomes d’extraits de cerveaux et des synaptoneurosomes FXS comparativement aux
sauvages, suggèrant qu’une proportion de l’ARNm serait réprimée par FMRP et dérégulée en
son absence (Zalfa et al., 2003; Muddashetty et al., 2007). Alors que le niveau de la protéine
est augmenté dans les synaptoneurosomes FXS non activés ((Zalfa et al., 2003), un effet non
récapitulé par (Muddashetty et al., 2007)), Muddashetty et al. (2007) proposent un défaut
d’activation de la traduction de l’ARNm Camk2A après activation synaptique.
L’ARNm Dlg4 (Psd95, Postsynaptic density protein 95)

PSD95 est une protéine localisée au niveau de la membrane post-synaptique jouant un rôle
important dans la plasticité synaptique. Les souris Psd95 KO montre des défauts de
l’apprentissage et de l’altération de la LTP et de la LTD. De plus, la surexpression de PSD95
dans des neurones d’hippocampes augmente la taille et le nombre des épines dendritiques. Le
fait que ces phénotypes évoquent ceux des souris FXS explique le choix d’étude de l’ARNm
Psd95 comme cible de FMRP. L’ARNm Psd95 a été montré co-immunoprécipité avec FMRP
à partir d’extraits de cerveaux et de synaptoneurosomes de souris Wt comparativement aux
souris FXS (Muddashetty et al., 2007; Zalfa et al., 2007). Au laboratoire, une structure G-
quadruplexe a été identifiée au niveau de la région 3’UTR de l’ARN et qui présente une
interaction directe avec FMRP (Subramanian et al., 2011). L’ARNm Psd95 est localisé au
niveau des dendrites mais FMRP n’a aucune influence directe sur sa localisation
(Subramanian et al., 2011). En ce qui concerne le niveau de la protéine, Psd95 est augmentée
après activation des mGluR-I (100 μM DHPG, 20 min) dans des cultures de cortex et des
préparations de synaptoneurosomes sauvages mais le niveau reste inchangé dans les
synaptoneurosomes FXS (Todd et al., 2003; Zalfa et al., 2003; Muddashetty et al., 2007). Le
niveau de l’ARNm Psd95 a été montré augmenté dans les polyribosomes de
synaptoneurosomes FXS comparativement aux sauvages à un niveau basal et plutôt réduit
après activation mGluR-I. Ces résultats suggérent une dérégulation de l’expression de
l’ARNm Psd95 en absence de FMRP. Alors que dans les extraits de cortex et de
synaptoneurosomes (Zalfa et al., 2003; Muddashetty et al., 2007), FMRP est suggérée réguler
l’expression de l’ARNm Psd95, Zalfa et al. (2007) ont montré que dans l’hippocampe le
profil de l’ARNm n’est pas altéré dans les polyribosomes mais plutôt le niveau global de
l’ARNm qui est réduit dans FXS. Ces auteurs ont montré également que FMRP stabilise
l’ARNm Psd95 dans l’hippocampe corrélé avec une réduction significative du niveau de la
72
protéine dans les cultures d’hippocampes FXS. Ces résultats suggèreraient que les mêmes
cibles peuvent être régulées différemment par FMRP en fonction du tissu concerné.
L’ARNm Sod1 (Superoxide dismutase 1)

Des troubles du sommeil et de l’anxiété sont des phénotypes observés couramment chez les
patients X-fragile qui peuvent être causé par des modifications du stress oxydatif. Ces
modifications peuvent être expliquées par l’altération du niveau de la protéine SOD1, une
protéine avec des propriétés antioxydantes. L’ARNm SOD1 a été identifié parmi plusieurs
centaines par la technique APRA (Miyashiro et al., 2003). Le groupe du Docteur B. Bardoni a
recherché le site de reconnaissance de FMRP sur cet ARNm, ce qui a permis d’identifier la
structure SoSlip (détaillé au §1), à ce jour uniquement identifiée dans l’ARNm Sod1 (Bechara
et al., 2009). L’étude du niveau de l’ARN dans les polyribosomes et l’utilisation d’un gène
rapporteur ont permis de montrer que FMRP régulerait positivement la traduction de cet
ARNm. Ceci a été confirmé en montrant des différences significatives sur le niveau de SOD1
par WB à partir d’extrait de cerveaux globaux, d’hippocampes, et du cervelet de souris
sauvages comparativement aux souris FXS. La structure SoSlip a été montrée agir en elle-
même comme une IRES (Internal Ribosome Entry Site) et les auteurs proposent que le rôle de
FMRP serait plutôt de moduler positivement l’activation de la traduction par cette structure.
L’ARNm Dgla ou Dagla (Diacylglycerol lipase alpha)

Cette cible a été proposée sur la base de l’identification d’un défaut de production du 2-
arachidonylglycérol (2-AG, le produit de DGLa) dans les synaptoneurosomes FXS après
activation des mGlur-I, et d’un défaut d’induction de la LTD dépendant de l’activation des
récepteurs endocannabinoids (eCB) au niveau des synapses excitatrices du striatum ventral et
du cortex préfrontal (discuté au chapitre II ; (Maccarrone et al., 2010; Zhang and Alger, 2010;
Jung et al., 2012)). Le groupe du Docteur O. Manzoni a montré que l’ARNm Dgla est co-
immunoprécipité spécifiquement avec FMRP à partir d’extraits de synaptoneurosomes de
cerveaux de souris (voir chapitre II, (Jung et al., 2012)). Une interaction directe avec FMRP
est suggérée via un consensus G-quadruplexe identifié dans l’ARNm. Le niveau de la protéine
DGLa est montré par western blot être le même entre des extraits de synaptoneurosomes Wt
et FXS à un niveau basal, et également après activation des mGluR-I. Ces résultats suggèrent
que FMRP ne régulerait pas l’expression de cet ARNm. Cependant, par des études de
microscopie électronique, la localisation normale de DGLa avec les mGluR-I au niveau des
73
domaines périsynaptiques des synapses excitatrices est montrée altérée dans les neurones
FXS, suggérant ainsi une traduction ectopique de la protéine et perte de la signalisation des
récepteurs eCB en absence de FMRP. Donc, FMRP semble être nécessaire pour la localisation
correcte de la protéine DGLa au niveau des épines dendritiques. Ceci permettrait à la cellule
de répondre à l’activation des mGluR-I par la production du 2-AG qui est nécessaire à
l’induction de la voie de signalisation des récepteurs eCB.
L’ARNm Dscam (Down Syndrome Cell Adhesion Molecule)

DSCAM est un récepteur de surface de la superfamille des immunoglobulines ayant des
fonctions dans le guidage axonal, la ramification dendritique et le ciblage synaptique. Le gène
humain Dscam (~800 Kb) est situé sur le chromosome 21 dans la région critique du syndrome
de Down (ou encore appelé Trisomie 21). Ce gène a été mis en cause dans plusieurs aspects
de phénotypes observés chez les patients avec le syndrome de Down, tels que les phénotypes
cardiaques et neuronaux. L’ARNm Dscam a été identifié dans différentes listes de cibles
proposées de FMRP (voir partie §2) et il a été montré co-immunoprécipité avec dFXRP dans
les extraits de cerveaux de drosophile (Cvetkovska et al., 2013). Une structure « Kissing
complexe » a été proposée dans cet ARNm mais aucune interaction directe n’a été montrée
avec dFXRP. Les auteurs ont montré que dFXRP se fixe sur tous les ARNm isoformes de
Dscam pour réguler l’expression de ce gène (19,008 isoformes qui diffèrent uniquement par
leurs régions extracellulaires). Le niveau de la protéine DSCAM a été trouvé augmenter du
même niveau en absence de dFXRP (le cas du FXS) et en présence de 3 copies du gène
Dscam (le cas du syndrome de Down) suggérant ainsi que dFXRP réprimerait la traduction de
Dscam. Ces données permettent de proposer une éventuelle cible commune responsable des
phénotypes observés dans les deux syndromes. Les études des neurones mécano-sensoriels de
la drosophile ont permis de montrer des altérations des branchements et du ciblage synaptique
dans les drosophiles n’exprimant pas dFXRP ou exprimant 3 copies du gène Dscam. Une
majorité de ces erreurs est corrigée dans les drosophiles n’exprimant pas dFXRP et exprimant
qu’une seule copie du gène Dscam. Ces erreurs de branchements et du ciblage synaptique sont
corrélés à des altérations des comportements qui sont également corrigés en réduisant le
niveau de Dscam en absence de dFXRP. Ces données suggèrent que la dérégulation de
DSCAM pourrait expliquer quelques phénotypes cellulaires observés dans le FXS.
74
D’après ces différents exemples on peut constater que FMRP aurait donc la capacité de
réguler différemment ses cibles en fonction de l’ARNm, des tissus et de l’âge des souris
concernées avec des contradictions (activation ou répression de la traduction, stabilisation et
transport de l’ARN, etc…). Toutes ces fonctions pour une même protéine semblent pour le
moins étonnant voire suspicieux. La fonction la plus documentée de FMRP parmi les
différentes cibles validées est la répression de la traduction. En effet, par western blot, les
protéines de différentes cibles sont montrées augmentées dans les extraits de neurones, de
tissus spécifiques (cortex, hippocampes …) et de cerveaux totaux. Ces données suggèrent une
exagération de la traduction de ces cibles en absence de FMRP. En contradiction avec ces
données, l’activation des mGluR-I (DHPG, agoniste) montrent bien souvent des défauts de
productions de ces mêmes cibles dans les cellules ou les préparations de synaptoneurosomes
FXS. En parallèle de cette dérégulation cible-spécifique, une augmentation globale des
protéines nouvellement synthétisées a été également observée dans FXS (Dolen et al., 2007).
Il est admis, à ce jour, dans la littérature que cette augmentation globale de la traduction serait
due en partie à la sur-activation des voies de signalisation mGluR-I dépendant (voir chapitre
II). Différents ARNm cibles sont identifiés dans les listes globales codant pour des protéines
impliquées directement dans les mGluR-I ou NMDAR (ARNm des sous-unites de ces
récepteurs), mais également des protéines agissant dans les voies de signalisation de ces
récepteurs (PI3K, mTORc1, ERK), ou encore agissant directement sur la traduction
canonique coiffe-dépendant (eEF2, eEF1 …) (Darnell and Klann, 2013). La dérégulation de
ces cibles pourrait expliquer cette dérégulation secondaire de la traduction globale.
Cependant, la question subsiste si les altérations de la traduction globale, des épines
dendritiques et de la plasticité synaptique observés chez les patients ou modèles FXS sont
dues à des altérations de tout un ensemble de cibles ou seulement quelques ARN clés.
75
Objectifs de la thèse
La perte de fonction de la protéine FMRP constitue la base moléculaire du syndrome de l’X

fragile. Sa fonction majeure identifiée à ce jour est sa capacité de lier spécifiquement des
ARNm neuronaux, et de les accompagner dès leur transcription jusqu’à leur destination
finale. FMRP est donc présente dans différents complexes mRNP avec des fonctions
distinctes, pouvant être actifs ou inhibés en traduction. Dans ces complexes mRNP, FMRP
interagit avec différents partenaires protéiques et nucléiques, à différents endroits de la cellule
neuronale, rendant ainsi difficile d’étudier sa fonction d’une manière globale. Son rôle exact
demeure toujours incompris. Ainsi, comment l'absence de FMRP dans les cellules neuronales
conduit à des altérations de la morphologie des épines dendritiques et de la plasticité
synaptique reste un objectif majeur à atteindre.
FMRP est proposée réguler, sous contrôles des mGluR-I et d’autres récepteurs, l’expression
de protéines importantes pour la plasticité synaptique en se fixant spécifiquement sur leurs
ARNm et en modulant leur traduction. Le syndrome résulterait de l’altération de l’expression
correcte des ARNm cibles de FMRP. Il est important d’identifier parmi ces cibles quelles sont
les protéines susceptibles d’être impliquée dans la physiopathologie du FXS. Le projet
principal de ma thèse visait à identifier l’ensemble des ARNm contrôlés par FMRP et par
extension, les protéines correspondantes. Tout d’abord, nous avons mis au point une
technique nous permettant de récupérer et de mesurer précisément l’affinité de FMRP avec
ses ARNm cibles directement dans les neurones. Notons que cette technique a récemment été
réalisée dans d’autres laboratoires mais dans des cellules non neuronales (Ascano et al., 2012)
ou sur des polysomes d’extrait de cerveau (Darnell et al., 2011) conduisant a des résultats
ambigus (ARNm comportant des motifs WGGA et ACUK à faible affinité ou ARNm sans
site spécifique de liaison, respectivement). Nous avons testés de multiples conditions, telles
que l’utilisation de plusieurs anticorps ou des matériels biologiques différents, pour identifier
enfin une condition optimale nous permettant de récupérer spécifiquement des ARNm
contrôles validés comme cible de FMRP dans la littérature. Une fois la technique validée, une
analyse globale sur puces à ADN a permis l’identification, d’une manière surprenante, d’un
ARNm unique comme cible majoritaire de FMRP. Ce gène n’a pas encore été identifié dans
les précédentes études publiées à ce jour et n’a donc encore jamais été montré jouer un rôle
76
dans la pathologie du FXS. Après avoir confirmé ce résultat par PCR quantitative, il était
évident de consacrer le reste de ma thèse à montrer un impact physiologique de l’absence de
FMRP sur son produit protéique ou sa fonction. (Objectif du résultat I : manuscrit 1)
Par ailleurs, les premières études réalisées sur FMRP ont montré que cette protéine se trouve
associée aux polyribosomes dans les cellules neuronales et non neuronales. Ceci renforce
l'hypothèse que FMRP agit comme un régulateur de la traduction de ses ARNm cibles. Mais
comment FMRP régule l'expression de ses ARNm reste incompris. Un modèle propose que
FMRP provoque l’arrêt du ribosome sur l’ARNm pendant la phase d'élongation de la
traduction. Une deuxième partie de mon projet de thèse visait à tester ce modèle en suivant les
profils des ARNm cibles de FMRP dans les polysomes à partir des extraits de cerveaux de
souris et des cultures de neurones primaires, Wt et KO, par qRT-PCR. Ceci, à un niveau basal
mais également après induction de l'arrêt de la traduction avec la puromycine. (Objectif du
résultat II)
Jusqu’aujourd’hui, aucun laboratoire n’a récapitulé un effet direct de FMRP sur un ARN
rapporteur. C’est pourquoi, une troisième partie de ma thèse visait à utiliser un système
permettant de forcer FMRP à interagir avec un ARN, et ainsi de se débarrasser de l’effet de
cibles multiples. Cette approche est basée sur l'utilisation d'une protéine FMRP fusionnée au
peptide N du phage Lambda qui lie un ARNm rapporteur unique portant des motifs box-B
d'ARN (Objectif du résultat III : manuscrit 2).
Enfin, la thèse m’a permis d’acquérir un réel savoir-faire et une maitrise de techniques
spécifiques, telles que la mise en culture de neurones primaires ou encore des études de
structures d’ARN. Un savoir-faire qui m’a permis de contribuer à trois études différentes
(Annexe : publications 1, 2 et 3 ; revue dans Biofutur).
77
Résultats
Résultats
78
I/ The Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) targets one unique mRNA in cortical
QHXURQVWKHGLDF\OJO\FHURONLQDVHțP51$ PDQXVFULW
I/ The Fragile X Mental Retardation Protein

(FMRP) targets one unique mRNA in cortical
neurons: the diacylglycerol kinase ț mRNA
(manuscrit 1)
79
I/ The Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) targets one unique mRNA in cortical neurons :
the diacylglycerol kinase NmRNA
The Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) targets one unique mRNA
in cortical neurons: the diacylglycerol kinase NmRNA
R. Tabet1, E. Flatter1, N. Vitale2, D. Heintz3, L. Fouillen4, V. Alunni1, D. Dembele1, J.L.

Mandel1, H. Moine1*
Affiliations:
1
IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire); CNRS, UMR7104;
Inserm, U596; Collège de France, Strasbourg University, 67404 Illkirch-Graffenstaden, France.
2
Institut des Neurosciences Cellulaires et Intégratives; UPR-3212 CNRS, Strasbourg University,
67084 Strasbourg, France.
3
Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Plateforme Métabolomique, UPR-2357,
Conventioné avec l'Université de Strasbourg, 67084 Strasbourg, France.
4
Laboratoire de Biogènese Membranaire; UMR 5200, Plateforme Métabolome; Université de
Bordeaux; 33883 Villenave D'Ornon, France.
*Correspondence to: [email protected]
Abstract:
The fragile X syndrome (FXS) is a major cause of intellectual disability. FXS is due to the
absence of the RNA binding protein FMRP (Fragile X Mental Retardation protein) the precise
function of which is still poorly understood. In this study we found that in mouse cortical
neurons FMRP principally targets one unique mRNA: the diacylglycerol kinase kappa mRNA.
Consequently, the activation of the type 1 metabotropic glutamate receptors (mGluRI) previously
found to mediate FMRP function does not activate the phosphatidic acid synthesis in the cortical
neurons of the fragile X mouse model. These data reveal that the absence of FMRP in mouse
cortical neurons induces a defect of mGluRI-dependent diacylglycerol conversion into
phosphatidic acid, which is a cause of dendritic spine alteration, the hallmark of Fragile X
syndrome.
One Sentence Summary:

FMRP targets uniquely DGKN mRNA, causing a defect of mGluRI-dependent diacylglycerol
conversion into phosphatidic acid in neurons
80
Main Text:
Fragile X syndrome (FXS) is the major cause of inherited intellectual disability. At the cellular
level the only visible phenotype of FXS is the presence in cortical neurons of abnormal dendritic
spines, membranous protrusions establishing contact with other neurons (1). FXS is caused by
the silencing of the FMR1 gene upon CGG triplet repeat expansion in its 5’-untranslated region
(2). The function of the FMR1 gene product, the FMRP protein (Fragile X Mental Retardation
protein) has been investigated since then but its exact function has remained unclear and/or
controversial. FMRP is an RNA binding protein that possesses two hnRNP K homology domains
and one RGG box. It is associated with mRNAs engaged in translation in polyribosomes. In the
brain FMRP is proposed to interact specifically with a subset of mRNAs on which it could play a
role in translation. As the translation-dependent group 1 metabotropic glutamate receptors
activation of long term depression (mGluR-LTD) was found to be altered in the FXS mouse
model (3), it was proposed that FMRP action is mediated by mGluRI to control the local
translation of synaptic mRNAs (4). Studies seeking to identify the mRNAs controlled by FMRP
already produced several lists of hundreds or thousands of candidate mRNAs but with little
overlap between them (5-8), and with little validation at the protein level, casting doubts about
the specificity of RNA binding of FMRP, if any, and leaving unsolved the question of the genes
mostly affected by the absence of FMRP in the brain of fragile X patients.
To identify the mRNAs associated with FMRP in neurons, we performed a cross-linking

immunoprecipitation approach (CLIP). Pure in vitro cultures of cortical neurons from wild type
(Wt) and Fmr1 knock-out (KO) mice (fig S1A) were UV irradiated. The mRNAs crosslinked to
FMRP were immunoprecipitated in the neuron extracts. The Fmr1 KO mouse recapitulates most
symptoms of FXS patients and is therefore considered to be a valid model of the human disease
(9). We first chose the H120 polyclonal anti-FMRP antibody amongst several available ones,
based on its ability to immunoprecipitate efficiently some mRNAs considered as validated
FMRP targets. These mRNAs (e.g. Dlg4, Map1b, CamK2a, Arc) were compared to mRNAs
considered as non-FMRP targets (PO, Glrb, ActB, 28S) in Wt compared to Fmr1 KO neuron
extracts as quantified by qRT-PCR (fig S1 B-D). To identify the mRNAs most efficiently
associated with FMRP we performed a microarray. The microarray approach was chosen rather
than the deep sequencing approach to avoid the possible biases-prone steps of RNase treatment,
81
ligation, reverse transcription and PCR amplification associated with the later technique. A
comparison of the global mRNA levels present in neuron extracts (as reflected by the microarray
data) revealed that except for Fmr1 mRNA (whose transcription is abolished in KO animals)
only two mRNAs showed a significant reduction (slightly above two-fold) between Wt and KO
neurons: apolipoprotein L7c and thymosin beta 15b like, two genes with no obvious link to the
disease (table S1). This indicates that the absence of FMRP has no major impact on the
transcriptome profile of neurons. The comparison of microarray data of clipped mRNAs in Wt
and KO neurons revealed that among 28,853 interrogated genes, 596 mRNAs were clipped (i.e.
showed an enrichment in Wt extracts compared to KO extracts and relatively to input amounts)
with a P valueDQGP51$VZHUHIRXQGHQULFKHGLQ.2H[WUDFWV:LWKD3YDOXH
0.01, these values went down to 143 and 36 respectively. From these data the false positive rate
of the CLIP can be estimated to be 50 and 25% with 0.05 and 0.01 p-values thresholds,
respectively. Thus, for most of the clipped mRNAs, efficiency was very weak (only 7 mRNAs
were enriched over two-fold) and close to non-specific binding (Fig. 1A). Remarkably, one sole
mRNA was found clipped well above the background and of all other mRNAs: the
Diacylglycerol kinase kappa mRNA (DgkN).
Fig. 1. FMRP is uniquely clipped to a single mRNA in murine cortical neurons.

(A) Volcano plot representation of the FMRP CLIP-microarray results. The mRNAs crosslinked at 254 nm to FMRP
in mouse cortical neurons cultured 8 days in vitro (8 DIV) were immunoprecipitated with H120 anti-FMRP (Santa
Cruz) and reverse transcribed to labeled cDNAs with Ovation Pico WTA system V2 (Nugen) and hybridized on
Mouse Gene 1.0ST (Affymetrix). The X axis means Log2 of fold change of average intensity for each individual
dataset (AI) from Wt clipped samples relative to Wt total RNA input compared to KO clipped samples relative to
KO total RNA input (i.e. Log2([AIWt CLIP/AIWt Input]/[AIKO CLIP/AIKO Input])), and the Y axis means -Log(p-value) with
p-value determined using the Significance Analysis of Microarrays test (10) with n=5 (i.e. one microarray per
independent CLIP experiment per biological replicate). The name of a few mRNAs with high p-value or previously
proposed as targets is given and the arbitrary 0.05, 0.02 and 0.01 p-value thresholds with corresponding number of
genes are shown. (B) qRT-PCR validation of the clipped mRNAs. Data shown are the fold changes of clip
efficiency of 43 RNAs chosen among the best clipped mRNAs (DgkN, Tln2, Ppfia3, Ogdh, Apc,…) or previously
proposed as targets (Dlg4, Camk2a, Agap2, Shank3,…) or non FMRP targets (RplP0, Actb, 18S, 28S) determined
by qRT-PCR (i.e. fold change of clip-efficiency was determined using the¨¨&7 PHWKRG ZLWK >&7 Wt-CLIP - CTWt-
Input
]-[CTKO-CLIP - CTKO-Input]). * statistical significance HVWDEOL shed with Student T-test with n biological
replicates. Lower panel shows the absence of differential expression of the same 43 RNAs between Wt and KO
neuron extracts. Fold change of expression was calculated using the¨¨&7PHWKRGDQGZLWKJHQH5SOSRU$FW%DV
normalizer.
82
Fig. 2. Diacylglycerol kinase activity is altered in Fmr1 KO cortical neurons.
(A) Diacylglycerol kinases (DGK) convert diacylglycerols (DAG) into phosphatidic acids (PA). (B) PAs level
was measured using LC-MS/MS, multiple reaction (MRM) mode on total lipid extracts from Wt and Fmr1 KO
murine cortical neurons (8 DIV). The level of the three major PAs (36:1, 38:1, 38:2) is shown in basal conditions
(untreated) and after mGluRI activation with quisqualic acid treatment, 5 μM 10 min (+Quis). Values are relative
to the Wt untreated samples (arbitrary units). * means statistical significance with Student T-test <0.05 and n=5
biological replicates. (C) PAs level in untreated Wt neurons (Wt), after treatment with Quis, 5μM 10 min
(Wt+Q) and after 15 min DGK inhibitors 3 μM R59022 and 0.2 μM R59949 at 6 μM prior Quis 5μM 10 min
(Wt+Q+R). (D) Total DAGs level was measured using LC-MS/MS on total lipid extracts from Wt and Fmr1 KO
murine cortical neurons (8 DIV). The level of total DAG is shown in basal conditions and after synaptic
activation with quisqualic acid (5 μM 10 min). * means statistical significance with Student T-test <0.05 and n=3
biological replicates.
Consistently all 27 sets of probes covering the DgkN mRNA gave a highly enriched CLIP signal
indicating that the whole transcript of this long mRNA (8.2 kb) was present when clipped to
FMRP (fig. S2). The results of the microarrays were then confirmed and refined by qRT-PCR.
Among 43 RNAs tested, including those appearing as the best clipped RNAs (Tln2, Ppfia3,
Ogdh, Apc,…) or previously proposed as targets (Dlg4, Camk2a, Agap2, Shank3,…), most
mRNAs appeared as statistically significantly clipped by FMRP (Fig. 1B). Their average CLIP
enrichment value in Wt neuron extracts compared to KO extracts was 3.3 fold (7 fold for Apc),
but was far from the 40-fold enrichment level found for the DgkN mRNA. These results revealed
that FMRP can interact weakly with a number of neuronal mRNAs (596 with significant CLIP
enrichment and p-value <0.05) more or less as was previously reported by others (6, 7). Here we
identified that FMRP possesses a unique main mRNA target: the DgkN mRNA.
Diacylglycerol kinase kappa is the last identified enzyme of a 10-member family of isozymes
that converts diacylglycerol (DAG) into phosphatidic acid (PA) at the post-synaptic site where it
is likely anchored with its PDZ-binding domain (Fig. 2A) (11). DAG and PA are two signaling
lipids important for neuronal function. DAG signals traffic, secretion and cytoskeletal
reorganization by binding and activating C1 domain-containing proteins expressed principally in
neuronal and immune tissues, particularly protein kinase C one of the "cognitive kinases" that
plays an essential role in both memory acquisition and maintenance (12-14). PA signals cell
growth by interacting with many effectors (e.g. PAK1, PIP5K, PKCH, sphingosine kinase, Raf1,
mTOR, RasGAP,…) a number of which have been shown to regulate spine maintenance in
neurons (15). DGKs are proposed to play important roles in signal transduction through
modulating the balance between the DAG and PA. Four members of the 10 DGK isozymes have
been already shown to be involved in spine maintenance and synaptic plasticity control, notably
mGluR-LTD (16-19).
To verify whether there is a DGK activity defect in Fmr1 KO neurons, we analyzed PA levels in
cortical neurons by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). The
presence of three major PA species was observed (fig. S3, namely 36:1, 38:1, 38:2) and there
was no significant difference of their level in Wt compared to KO unstimulated neurons (Fig.
2B). PA concentrations are maintained at extremely low levels in the cell by the activity of
potent lipid phosphate phosphohydrolases (20). These levels have been shown to increase rapidly
83
Fig. 3. FMRP binds DgkN mRNA in vitro with an affinity higher than all previously known targets.
(A) Gel shift assay competition to determine the relative binding strength of FMRP for DgkN mRNA. 32P-
labelled Fmr1 N19 mRNA fragment was incubated with His-FMRP Iso7 (0.1 pmol) in the presence of increasing
concentrations of various unlabelled competitor RNAs. Lanes 0, control without protein ; lanes C, control
without competitor RNA ; numbers are the log of competitor RNA concentrations. The graph depicts the fraction
of bound labeled N19 RNA plotted against unlabeled competitor RNA concentration. Each point is the mean
with SD of three independent experiments. (B) Analysis of DgkN mRNA profile in brain polyribosomes of Wt
and Fmr1 KO mice. Brain polysomes were isolated from 10 days old mice brain homogenates on 15%-45% w/w
linear sucrose gradient at 36,000 rpm for 2 hr and material was collected in 24 fractions with A260 recording
(left). Total RNA was phenol/chloroform extracted from each gradient fraction, ethanol precipitated and
analyzed by gene specific qRT-PCR. The distribution of DgkN mRNA throughout the gradient was calculated
using the formula 2^ [40 – Ct] for each fraction and plotted as % of the total amount of the RNA on the gradient
(obtained by summing values of individual fractions) (right). Error bars are SD from 2 biological replicates and 2
technical replicates each. (C) DgkN mRNA translation run off with puromycin in brain polyribosomes of Wt and
Fmr1 KO mice. Brain polysomes were isolated as in C except that puromycin 0.5 mg/ml was added to the brain
homogenates and incubated 15 min at 37°C prior lysis with detergent and gradient sedimentation. A global shift
of A260 towards light density fractions (also confirmed by RNA analysis on agarose gel, fig S6) indicates the
puromycin run off effect on ribosomes. The distribution of Dgkk mRNA throughout fractions was determined as
in B. Error bars are SD as in B.
in neurons upon activation of mGluRI receptors (21). Brief application of the mGluRI agonists
(S)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (10 min, 100 μM; DHPG) (fig. S4A) or L-quisqualic acid (10
min, 5 μM, Quis) (Fig. 2B) had a potent action on these receptors, as indicated by the robust
30%, 20%, 30% increases of 36:1, 38:1, 38:2 PA synthesis in Wt neurons, respectively. They
also induced the phosphorylation of ERK1/2 (fig. S4B). This effect can be attributed to the DGK
activity since the pretreatment of the neurons with specific DGK inhibitors R59022 and R59949
(22, 23) prevented the mGluRI agonist effect (Fig. 2C). Remarkably, the mGluRI-dependent PA
synthesis was totally abolished in the Fmr1 KO neurons (Fig. 2B). These data indicate that
mGluRI-dependent DGK activity is lost in Fmr1 KO neurons. To confirm that the PA synthesis
defect was not due to an alteration upstream of the DGK activity, we analyzed DAG levels in Wt
and KO neurons. DAG level was measured by liquid chromatography coupled to mass
spectrometry (LC-MS/MS) (Fig. 2D). In basal conditions, an increase of 28.9 % of total DAG
(Student-T test p-value = 5E-4) was observed in the KO compared to Wt neurons and affects
mostly some of the major DAG species (fig. S5AB), suggesting an excess of DAG production or
a defect of its conversion into PA. Upon mGluRI stimulation a similar increase of DAG level
both in Wt and KO neurons indicated that there was no impairment of DAG synthesis in absence
of FMRP. No difference was observed in the ratio of different DAG species with or without Quis
treatment and in Wt or KO neurons (fig. S5C). These data strongly support our hypothesis that
the defect of mGluRI-dependent PA synthesis in Fmr1 KO neurons is due to a loss of DGK
activity.
Analysis of the in vitro binding of FMRP to DgkN mRNA confirmed that this association has the
highest affinity identified so far (apparent Kd in the subnanomolar range); Dgkk mRNA
transcript can easily displace Fmr1 mRNA fragment N19 (the highest affinity FMRP binding site
known up to now (7, 24)) contrary to non-specific RNA (antisens DgkN transcript) or RNA with
lower Clip efficiency (PSD95) (Fig. 3A). Analysis of polysome profiles in brain extracts of 10
days old mice revealed that DgkN mRNA was similarly well loaded in the ribosomes engaged in
translation in Wt and Fmr1 KO extracts (Fig. 3C). A short (10 min) treatment of the brain
homogenates with puromycin (a peptidyl-tRNA analog releasing the actively translating
ribosomes from mRNAs) caused the same displacement (runoff) of the ribosomes from heavy
polysomes. This indicates that DgkN mRNA is translated at the same efficiency with and without
84
Fig. 4. Model of the role of FMRP in the lipid composition of the dendritic spines of cortical neurons.
Upon activation of the metabotropic glutamate receptors of group 1 (mGluR1), phospholipase C is activated,
leading to the hydrolysis of PIP2 to DAG. DAG can be further converted to PA by diacylglycerol kinases (DGK)
present at the membrane of the activated spines. In neurons lacking FMRP, DAG synthesis occurs as in wild
type neurons but its subsequent conversion into PA is lost due to a loss of FMRP-dependent activation. An
increase of DAG in basal condition is also present that could result from a defect of DAG consumption resulting
from a low DGK activity. The alteration of spine lipid content could cause the abnormal spine morphology and
functions seen in Fragile X patients.
FMRP (Fig. 3D) in basal conditions. Our attempts to visualize an increase of ribosome initiation
upon mGluRI stimulation have failed. Further detailed analyses will be necessary to determine
the exact mechanism by which FMRP can stimulate the DGK activity. An increase of the local
translation of DgkN mRNA near the sites of synaptic activation and an increase of its transport
towards the dendritic spines are both likely and not mutually exclusive possibilities. The
identification of DgkN mRNA as the main target of FMRP provides a basis to explain the
dendritic spine alterations observed in FXS patients and hallmark of the disease (Fig. 4). This
finding is also addressing the intriguing question why an RNA binding protein like FMRP is
mainly devoted to the post-transcriptional control of a unique gene.
References and Notes:

Acknowledgments:
We thank F. Bellereau for technical assistance; E. Bechara for help with setting up the Clip
approach; C. Thibault for advice with microarray strategy; M. Gendron for mice care; K. Hnia,
N. Charlet, B. Bardoni for helpful suggestions. This work was supported by ANR blanc and
Fondation Jérôme Lejeune funding to H.M. Supplementary figures 1-5, sup tables 1-2, material
and methods are presented in the Supplementary Materials.
Supplementary Materials:
Materials and Methods
Table S1-S2
Figures S1-S6
External Databases S1
References (1-27)
Supplementary Materials:
Materials and Methods:
Ethics statement
Animal work involved in this study was conducted according to relevant national CNREEA
(Comité National de Réflexion Ethique en Expérimentation Animale) and international
guidelines (86/609/CEE).
Primary cortical neuron cultures

Cortices from mice embryos (E17.5) were dissected in PBS 1x, 2.56 mg/mL D-Glucose, 3 mg/ml
BSA, 1.16 mM MgSO4 and incubated for 20 min with 0.25 mg/mL trypsin and 0.08 mg/mL
85
Dnase I and mechanically dissociated after supplementation of medium with 0.52 mg/ml trypsin
soybean inhibitor, 0.08 mg Dnase I and 1.5 mM MgSO4. The cells were plated on poly-L-lysine
hydrobromide-coated six-well culture plates for 8 days in NeurobasalTM Medium (GIBCO)
supplemented with B27, Penicillin/Streptomycin and 0.5 μM L-Glutamine.
Analysis of cortical neuron cultures by immunofluorescence microscopy

Primary cortical neurons grown on poly-L-lysine hydrobromide-coated glass coverslips were
fixed in 4% paraformaldehyde in PBS 1x at room temperature (RT) for 20 min, permeabilized
with 1xPBS, 0.2% Triton X100 for 10 min at RT and blocked for 1 h in PBS1 x, 0.1% Triton
X100 with 5% BSA. Neurons were incubated with rabbit primary antibody anti-MAP2 AB5622
1:1000 (Merck Millipore) overnight at 4°C. After 3 washes in 1xPBS, 0.1% Triton-X100 for 10
min, neurons were incubated with secondary Goat antibody anti-Rabbit (Alexa fluor 488) 1:1000
1 h at RT, and were subsequently washed 3 times in PBS 1x, 0.1% Triton-X100 for 10 min.
Coverslips were mounted with antifading medium (Vectashield, Vector) with DAPI and then
analyzed by fluorescence microscopy.
Cross-Linking Immuno-Precipitation (CLIP) on primary neurons

CLIP strategy was adapted from Ule et al. (25) with modifications for neuron cultures. Neurons
from Wt or Fmr1 KO mice grown in 6-well plates for 8 days in vitro (8DIV) were gently washed
with cold PBS and exposed to UV 254 nm (400 mJ/cm2, in Stratalinker 2400) on ice. Neurons
from 3 littermate embryos with same genotype were pooled (constituting one biological sample)
and lyzed with 1 ml lysis buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.1 mM
CaCl2, 0.1% SDS, 1 % NP-40, 0.5 % sodium deoxycholate, 30U anti-RNase (Ambion), 10U
DNase Turbo™ (Invitrogen) for 5 min at 37°C. Lysates were spun down at 13000 rpm, 4°C and
supernatants were precleared by incubation with 50μl free Dynabeads protein G (Dynal) and
then on 50 μl Dynabeads protein G coupled to Rabbit anti-Mouse IgGs (5μg) for 1 hour each.
The lysates were then incubated overnight with agitation on 50 μl Dynabeads protein G coupled
to 5μg anti-FMRP antibody (H-120 Santa Cruz). After immunoprecipitation, the supernatants
were saved for RNA extraction (Wt and KO “inputs”) and the beads were washed three times
with 1 ml of high salt washing buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M KCl, 1 mM EDTA, 1%
NP40, 0.5 % sodium deoxycholate and 0.1 % SDS, 4°C). RNAs from Wt and KO neurons were
recovered by treatment of the beads with 0.4 mg proteinase K in buffer 100 mM Tris-HCl, pH
7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 20 min at 37°C.
RNA isolation and microarray gene expression analysis

RNA from Wt or KO neurons inputs (InputWT, InputKO) or from CLIP samples (CLIPWT,
CLIPKO) were extracted by phenol/chloroform (V/V) followed by chloroform/isoamyl alcohol
(24:1) extraction and ethanol precipitated in presence of 0.3M Na acetate. CLIP and Input RNAs
were then used to prepare biotinylated double strand cDNA targets with the NuGEN Ovation
Pico WTA System V2 Kit (Cat # 3302) followed by the NuGEN Encore Biotin Module Kit (Cat
86
# 4200) according to manufacturer recommendations. Following fragmentation and end-

labelling, 2.07 ȝg of cDNAs were hybridized for 16 hours at 45oC on GeneChip® Mouse Gene
1.0 ST arrays (Affymetrix) interrogating 28.853 genes (26,166 RefSeq transcripts). The chips
were washed and stained in the GeneChip® Fluidics Station 450 (Affymetrix) and scanned with
the GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix) at a resolution of 0.7 μm. Raw data (.CEL
Intensity files) were extracted from the scanned images using the Affymetrix GeneChip®
Command Console (AGCC) version 3.2. CEL files were further processed with Affymetrix
Expression Console software version 1.1 to calculate probe set signal intensities using Robust
Multi-array Average (RMA) algorithms with default settings. On mouse Gene 1.0 ST arrays, the
majority of genes are represented by one unique probeset, composed of approximately 27 probes
spread across the full length of the gene, giving a single signal intensity value. A minority of
genes on the array are interrogated by several probesets. For those genes, we have used the
median of all probeset signal intensity values as a measure of their expression. Thus, only one
fold change value was calculated for each gene on the array as the ratio of the signal intensity
between Wt and Fmr1 KO conditions (FC_adjusted in table S1). The p-value for probesets signal
intensity change between conditions was determined by using the Significance Analysis of
Microarrays (SAM) test (10), n=5 biological replicates; (i.e. one microarray per independent
CLIP experiment per biological replicate).
cDNA Synthesis and qRT-PCR validation of CLIPped RNAs

The first strand cDNA was performed with Superscript™ II Reverse Transcriptase kit
(Invitrogen™) following manufacturer instructions. 0.5 μg of RNA from inputs or one fourth
from CLIP RNAs were used with gene specific primers mix (2 pmol each; see table S2 for
primer sequences). Primers were validated with standard dilution curve onWt RNA input prior
quantification of mRNA levels with Lightcycler 480 (Roche). qRT-PCR were performed on
cDNA dilutions 1/500 for ribosomal RNA and 1/4 for other genes in presence of 7.5 pmol
primers with QuantiTect™ SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). List of primers is provided
in table S1. For CLIP experiments, two technical replicates were performed for at least three
biological replicates for 43 different genes. Fold change between CLIPWt and CLIPKO were
determined using the following method: mean 2^ ¨&W>&W IP WT - Ct input WT] / mean 2^ ¨&W>&W IP
KO - Ct input KO]. Error rates were calculated with formula: Square root ((Wt standard
deviation/KO standard deviation)^ 2 + (Fold change)^ 2).
Neuron treatments
mGluRI agonists (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycine resuspended in DMSO (DHPG; Tocris) or L-
Quisqualic acid resuspended in water (Tocris) were applied on neurons at 100 μM and 5 μM,
respectively, for 10 min at 37°C at 8DIV. Diacylglycerol kinase inhibitors R59022
(Diacylglycerol Kinase Inhibitor I; Calbiochem) and R59949 (Diacylglycerol Kinase Inhibitor II;
Calbiochem) were applied at 3 μM and 0.2 μM each for 15 min at 37°C prior an eventual
mGluRI treatment.
87
Lipids extraction
Neurons at 8DIV cultures (treated or not) were washed twice with cold PBS 1x and were lysed in
cell extraction buffer (FNN0011, INVITROGEN) supplemented with protease inhibitors
(Complete protease inhibitor cocktail, Roche) and PMSF (1 mM) for 30 minutes, on ice, with
vortexing at 10 min intervals. Afterward, neuron extracts were centrifuged for 13,000 rpm 10
min and proteins were quantified by Bradford method to normalize samples. Total lipids were
extracted by the method of Bligh & Dyer 1959. Typically, extracts were mixed with
chloroform:methanol (4:1), vortexed for 10 sec and left under agitation for 1 h at 4 °C. After 5
min centrifugation at 13,000 rpm, organic phase was recovered and used for mass spectrometry
analyses.
Phosphatidic acid (PA) profiling by LC-MS/MS

The organic phase (150μl) was analysis by UPLC/MS/MS (Acquity UPLC system Waters corp.
(Milford, USA) coupled to a Quattro Premier XE triple Quadrupole MS system Waters
Micromass). Column was a Waters Acquity UPLC BEH Amide column (2.1mm x 100 mm, 1.7
μm particule size) together with an Acquity UPLC BEH Amide precolumn (2.1mm x 5 mm, 1.7
μm particule size). Temperature of column oven was 28°C and injection volume 3μl. Eluents
were acetonitrile, ammonium hydroxide (99.5%: 0.5%) (A) and acetonitrile, water, ammonium
hydroxide (80%:19.5%,0.5%) (B). The flow rate was 0.4 ml.min-1. Elution was as follows: 93%
A during 2 min. The gradient was as follow: 93% A to 60% A in 1 min, 60% A to 50 % A in 0.5
min, 50% A to 40 % A in 1.5 min. Then the composition of the mobile phase was returned to the
initial conditions as follow: 40% A to 50% A in 2 min, 50% A to 80% A in 2.5 min, 80% A to
93% A in 0.5 min. 93% A was maintained during 2 min. UV spectra were recorded from 200 to
500 nm. The system was run by Mass-Lynx software (version 4.0). The ESI source was used in
positive and negative mode with a capillary voltage 3.4 kV; RF lens at 0 V, resolution (LM1,
HM1, LM2, HM2) 15, ion energy 1 and 2 :0.5. Source and desolvation temperatures were 135
and 400°C. Flows rates of nitrogen for nebulizor and desolvation were 50 and 900 L.h-1.
Pressure of the argon collision gas was 3.0 * 10-3 mbar. Full-scan, Selected Ion Recording (SIR)
and Daughter Scan mode were used for qualitative analyses. Quantitative PA analyses were
made based on MS/MS Multiple Reaction Monitoring (MRM) as described by Shui G et al (26).
Briefly MRM transitions for each individual PA were determined based on PA standards
obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). The PAs were identified as
deprotonated parent ions [M-H-], cone energy was optimised for each PA and set to 44 Volt. The
predominant daughter fragment ions were then used for quantitative MRM analysis. After
optimisation the collision energy was set to 44V. MRM transitions and specific retention times
were used to selectively monitor PA. Data acquisition and analysis were performed with the
MassLynx software (ver.4.1) running under Windows XP professional on a Pentium PC.
88
diacylglycerols measures
Neuron lysates from two 24-well pate wells were extracted with 2ml of chloroform/methanol 2/1
v/v and 1ml water, sonicated for 30 s, vortexed, and centrifuged. Lower organic phase was
transferred to new tube, the upper aqueous phase were re extracted with 2ml chloroform. Organic
phases were combined and evaporated to dry.
Lipid extracts were resuspeded in 50ȝORIHOXHQW$2QHSPRORIV\QWKHWLFLQWHUQDOOLSLGVWDQGDUG
(DAG 17:0/17:0) from Nu-Check Prep (Elysian, MN, USA) was added.
LC-MS/MS (MRM mode) analyses were performed with a mass spectrometer model QTRAP®
5500 (ABSciex) coupled to a LC system (Ultimate 3000, Dionex). Analyses were achieved in
positive mode. Nitrogen was used as curtain gas (set to 20), gas1 (set to 25) and gas2 (set to 0).
Needle voltage was at +5500 V without needle heating; the declustering potential was set at +86
V. The collision gas was also nitrogen; collision energy was adjusted to +34 V. Dwell time was
set to 3ms.
Reversed phase separation was carried out at 30°C on a Luna 3u C8 150×1mm column, with
100Å pore size, 3ȝPSDUWLFOHV 3KHQRPHQH[ (OXHQW$ZDV$&10H2++2O (19/19/2, v/v/v)
+0.2% formic acid +0.028% NH4OH and eluent B was isopropanol +0.2% formic acid +0.028%
NH4OH. The gradient elution program was 0-5 min, 15%B; 5-35 min, 15-40%B; 35-40 min,
80%B; 40-55 miQ%7KHIORZUDWHZDVȝOPLQȝOVDPSOHYROXPHVZHUHLQMHFWHG7KH
relative levels of DAG species were determined by measuring the area under the peak,
determined using MultiQuant software (v2.1, ABSciex), and normalizing to the area of the DAG
internal standard.
Cloning of DgkN N mRNA and gel shift assay competition experiments

Mouse DgkN was subcloned from clone IMAGE IRAVp968H03163D. The missing DgkN
3’UTR region was cloned by PCR from mouse genomic DNA with primers
GCAGCTAGCTCCTTGAAAGCTGGAAGGAGA and
AATAGAATGCGGCCGCCAGCTTCAACAGCACTTGTAG and introduced at XbaI and NotI
sites of the pYX-DgkN vector to give pYX-DgkNFL. Full length DgkN mRNA (8880 nt) or its
antisense version was transcribed by T7 RNA polymerase (Promega) and purified on TSK-GEL
HPLC (Tosoh Bioscience). PSD95 3’UTR and FMR1 N19 RNAs were prepared as decribed in
(27) Protein/RNA interactions were analyzed either by electromobility shift assay as previously
described (24).
Mouse brain polyribosome preparation and puromycin ribosome run-off assays

Wt and Fmr1 KO 10 days old mice were sacrificed by decapitation and the brain was removed
and placed in ice cold PBS. The brains were homogenized in 0.7 ml polyribosome lysis buffer
(50 mM Tris/HCl pH=7.4 4°C, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTE, RNasin 40 U/ml, 1%
NP40) and spun at 13,000 rpm 4°C for 15 min. The supernatant was loaded onto a 15%-45%
w/w linear density gradient of sucrose in gradient buffer (50 mM Tris/HCl pH=7.4 4°C, 100 mM
89
KCl, 5 mM MgCl2), prepared in 14 × 89 mm polyallomer ultracentrifuge tubes (Beckman).

Gradients were centrifuged at 36,000 rpm for 2 hr at 4°C in a SW41 rotor and twenty four 0.5 ml
fractions were collected with a peristaltic pump coupled to a A260 nm monitor and a fraction
collector. Fractions were adjusted at 0.3 M Na acetate, precipitated with ethanol at -20°C
overnight and mRNP pellets were washed with 80% ethanol, briefly dried and resuspended in 50
μl of 50 mM Tris/HCl pH=7.4 at 4°C, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2. RNA was extracted from
each fraction by phenol/chloroform (V/V) followed by chloroform/isoamylic alcohol (24:1)
extraction and ethanol precipitated in presence of 0.3M Na acetate. mRNA distribution in each of
24 polyribosome sucrose gradient fractions was analyzed by qRT-PCR as for Clip and quantified
using the following method: 2^ [40 – Ct fraction x (1-24)] and results were expressed for each fraction
as a percentage of the sum of all 24 fractions.
Puromycin ribosome run-off assays were performed by homogenizing the brains in 0.7 ml
polyribosome lysis buffer without NP40 and supplemented with puromycin at 0,5 mg/ml. After
incubating at 37°C for 10 min, NP-40 was added to a final concentration of 1% proceeding to
sample lysis before spunnig at 13,000 rpm 4°C for 15 min and loading on linear density gradient.
In parallel, 2 μg of total extracted RNA from each fraction was loaded on denaturing agarose
gels and stained with ethidium bromide.
Table S1: FMRP CLIP-microarray data set (Table S1.xlsx)
90
Table S2 : Primers used for qRTPCR analysis
Genes 5’-3’ Sequence

(ID Ensembl) (Fw : Forward, Rev : Reverse)
Actb Rev : GCCAGAGCAGTAATCTCCTTC

(ENSMUSG00000029580) Fw : GACGGCCAGGTCATCACTATT
Agap2 (Pike) Rev : ACCAGTGCTGGACACGATCA
(ENSMUSG00000025422) Fw: GGAAGAAACTGTCCACGCCT
Akt1 Rev : TTCCGCAGAATGTCTTCATAG
(ENSMUSG00000001729) Fw: CTGGACTACTTGCACTCCGA
Apc Rev : GGACATAGCTAGCAAAGTTCG
(ENSMUSG00000005871) Fw: CTCTGCTCCTCGAAGGTTGA
App Rev : GCGGGCGTCAACAGGCTC
(ENSMUSG00000022892) Fw : GGGAATTCAGCCTGGATGACC
Arc Rev : GCTGGTAAGAGCAGGTGTGAG
(ENSMUSG00000022602) Fw : GCTGAGGAGGAGGAGATCATT
Bdnf Rev : GGCCTTTGGATACCGGGAC
(ENSMUSG00000048482) Fw : CGCAAACATGTCTATGAGGGT
Calm1 Rev : GTTCTGCTTCTGTGGGGTTC
(ENSMUSG00000001175) Fw : GACTGAAGAGCAGATTGCAGA
Camk2a Rev : TGGCAGCATACTCCTGACCA
(ENSMUSG00000024617) Fw : ACCTGCACCCGATTCACAG
Creb1 Rev : GATTTGTGGCAGTAAAGGTCC
(ENSMUSG00000025958) Fw : GCACTTCCTACACAGCCTGC
Ddn Rev : CGGGCGCAGCCTACACGT
(ENSMUSG00000059213) Fw : CATTATAGTCGTCGCGCTCC
Dgkk Rev : GATGCCTTGAAGGTTTGGC
(ENSMUSG00000062393) Fw : GAAGAACATCCAGAACAATAC
Dlg4 (Psd95) Rev : AACACCATTGACCGACAGGA
(ENSMUSG00000020886) Fw : GGCACCGACTACCCCACAG
Dlgap4 (Sapap4) Rev : CAGCACTGAGAACTTTCCCTA
(ENSMUSG00000061689) Fw : AGGGATGGCTACTGGTTCCT
Dscam Rev : GCATTTCAGCTAAACTCTTTGC
(ENSMUSG00000050272) Fw : GTCAGTTGTCCAAAGCGAAG
Eif2d (Lgtn) Rev : TGGTGTCCTCAGAGGCTTCT
(ENSMUSG00000026427) Fw : ACAGCTCAGATGCTGGCTTC
Fat3 Rev : CTGGCAATCAGGTTGTATAC
(ENSMUSG00000074505) Fw : GCGGATATTGGATCCAATGG
Glra2 Rev : TATGTTGCCTGGAGACAAAG
(ENSMUSG00000018589) Fw : CCCAGCCTGTTGATAGTCAT
Glrb Rev : GGGATGACAGGCTTGGCAG
(ENSMUSG00000028020) Fw : CTGTTCATATCAGCACTTTGC
Grin1 (Nmdar) Rev : ATCACCTTCTTGACAGGGTCA
(ENSMUSG00000026959) Fw : AAGCCTCGAGGATACCAGATG
Hprt Rev : TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
(ENSMUSG00000025630) Fw : AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA
Huwe1 Rev : GTCTGAATGAAAGTCACAGGG
(ENSMUSG00000025261) Fw : ACCCTGGTGTAACTGAAGTG
Igsf10 Rev : CAGACAGAGTGACATGAAGG
(ENSMUSG00000036334) Fw : CCACTGGACCAGAGTCTCAT
Jph3 Rev : GACGACCAAGATGGGAGCT
(ENSMUSG00000025318) Fw : CACGGTGCAGAAACTCGAGA
91
Kif1a Rev : TGTGTCTGCTCCTTCACAGG

(ENSMUSG00000014602) Fw : ACCAGAGTGGGCAGAGAAGA
Mtap1b Rev : GTGGTGCTTAGGAGCTCACC
(ENSMUSG00000052727) Fw : CGGACAGTGCTTTGAGAACA
Nrgn Rev : CACTCTCCGCTCTTTATCTTC
(ENSMUST00000065668) Fw : GGCAATGGACTGCTGCACG
Ntrk2 (Trkb) Rev : AGAGTCTTGAGCCACATGATG
(ENSMUSG00000055254) Fw : GTGGCTTACAAAGCGTTTCTG
Papbc1 Rev : GGACTCCCGCAGCATATTTA
(ENSMUSG00000022283) Fw : GAGACCAGCTTCCTCACAGG
Pkp4 Rev : GATCACATACAACAGCGAGTC
(ENSMUSG00000026991) Fw : TCGGAACACAACAGGTTGCC
Plxnd1 Rev : GCTGTCTAGGAATCGGTCTG
(ENSMUSG00000030123) Fw : GACTAAAGCCACCTTCTTCC
Ppfia3 Rev : GGTTTTGTAGCTGCCGTCAG
(ENSMUSG00000003863) Fw : CCTCGCCATTCAGGAGATG
Rplp0 Rev : CCGATCTGCAGACACACACT
(ENSMUSG00000067274) Fw : AATCTCCAGAGGCACCATTG
Shank1 Rev : CCTGCAGGTGTCTGGTGGA
(ENSMUSG00000038738) Fw : CCTGCAGCGGCAGAGGCT
Shank3 Rev : GAGGCTGCTGAAGAGCCGA
(ENSMUSG00000022623) Fw : ACCAACTGTGATCAGTGAGCT
Sod1 Rev : AGTCACATTGCCCAGGTCTC
(ENSMUSG00000022982) Fw : ACCATCCACTTCGAGCAGAA
Spnb1 Rev : TCTGACACCACTGCCTGGAA
(ENSMUSG00000021061) Fw : CGCCAACAACCTGGTAGAGA
Syne2 Rev : CAGTTGTGATCAAGGCACTC
(ENSMUSG00000063450) Fw : CCAGAGGATCAACAAGAATTG
Syngap1 Rev : TCCGGTTGGACATGTGTAGC
(ENSMUSG00000067629) Fw : TGTCGGCTGACATCGAGAG
Szt2 Rev : GTAGGTCAAATCCTGTAGGTG
(ENSMUSG00000033253) Fw : CGTGTGTTGTCCAGTACATC
Tln2 Rev : TCCTTTGAGCTGGTACATGG
(ENSMUSG00000052698) Fw : CAATGACCCTGAGACCCAG
Trak2 Rev : CTTGGGACTCATGTAACATTC
(ENSMUSG00000026028) Fw : AGATCGTAGACCTTCAGCAC
18S rRNA Rev : CCATCCAATCGGTAGTAGCG
(NR_003278.3) Fw : GTAACCCGTTGAACCCCATT
28S rRNA Rev : ACATTGTTCCAACATGCCA
Fw : TTGAAAATCCGGGGGAGAG
92
Fig. S1: Validation of CLIP strategy on murine cortical neurons. (A) Control of cortical neuron cultures at
DIV8. Immunofluorescence labelling with anti-MAP2 and secondary antibody labeled with Alexa fluor 488 (right)
and phase contrast (left) was used to assess the quality of neuron cultures (200X magnification). anti-H120 antibody
immunoprecipitation efficiency. (B) Western blot on Wt and Fmr1 KO neuron extracts from inputs (15 μg total
protein) and clipped (25 μl Dynabeads-H120 boiled in SDS-Page loading buffer) revealed with 1C3 anti-FMRP
antibody (1:50,000) and secondary anti-mouse antibody coupled to peroxydase (1:50,000). (C) Control of RNA
quality in neuron extracts from Wt and KO inputs on denaturing agarose gel stained with ethidium bromide. L is
1Kb DNA ladder. (D) qRT-PCR validation of the FMRP-CLIP. Upper panel shows the clip efficiencies of mRNAs
previously proposed as FMRP targets (Dlg4, Map1B, Camk2a) and non FMRP targets (P0, Glrb, Actb, 28S)
determined by qRT-PCR and expressed as % of input (2^ [CtCLIP-CtInput]*100 and lower panel shows the absence of
differential expression of the same mRNAs between Wt and KO neuron extracts. Fold change of expression was
calculated using the ¨¨&7PHWKRGDQGZLWKJHQH5SOSRU$FW%DVQRUPDOL]HU(UURUEDULVVWDQGDUGGHYLDWLRQ
statistical significance HVWDEOLVKHGZLWK6WXGHQW7-test with n=4 biological replicates.
93
Fig. S2: All 27 sets of probes covering DgkN mRNA give a highly enriched CLIP signal. (A) Comparison of
microarray fluorescence signals of each DgkN probe sets in CLIP Wt and CLIP KO. (B) Comparison of microarray
fluorescence signals of each DgkN probe sets in Input Wt and Input KO.
94
Fig. S3: Measure of phosphatidic acid species in cortical neurons by LC-MS/MS. The level of PA species is
expressed as % of total PAs. Three major PA species are present in neurons 36:1, 38:1, 38:2, representing
50%±3 of total PA (n=3 biological replicates).
95
Fig. S4: mGluRI agonists effect on phosphatidic acids synthesis and ERK1/2 phosphorylation in cortical
neurons. (A) Level of three major phosphatidic acids (36:1, 38:1, 38:2) obtained by MRM analysis using LC-
MS/MS in basal conditions (untreated or DMSO) and after mGluRI activation with quisqualic acid treatment (Quis,
5 μM 10 min, Tocris) or (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (10 min, 100 μM DHPG, Tocris) was measured using
ESI-MS on total lipid extracts. * means statistical significance with Student T-test <0.05 and n=3 biological
replicates. (B) Western blot analysis of the effect of Quis and DHPG on ERK1/2 phosphorylation in cortical
neurons. Cells were treated as indicated on figure were lysed in buffer (FNN0011, INVITROGEN) supplemented
with protease inhibitors (Complete protease inhibitor cocktail, Roche) and PMSF (1 mM) for 30 minutes, on ice,
and 15 μg total protein was analysed by western blot with anti-ERK1/2 or anti-phospho-ERK1/2 and secondary
antibody coupled to peroxydase.
96
97
Fig. S5: Measure of diacylglycerol species in Wt and Fmr1 KO neurons. (A) The level of DAG species analysed
by LC-MS/MS is expressed in pmol/μg of protein. An increase of some major DAG species (34:1, 36:1, 36:2, 36:3,
38:3) is observed in Fmr1 KO neurons compared to Wt. * indicates p-value from Student T-test <0.05 with n=4
biological replicates). (B) The level of DAG species analyzed as in A is increased similarly in Wt and Fmr1 KO
neurons upon treatment with quisqualic acid (5 μM, 10 min). (C) The overall composition of DAG species is not
significantly affected by the absence of FMRP or treatment with quisqualic acid (values are expressed as % of total
DAG, p = 0.90623 using the non-parametric analysis of variance with Kruskal-Wallis method).
98
Fig. S6: Analysis of RNA profiles in brain polyribosomes of Wt and Fmr1 KO mice on denaturing agarose
gel. Total RNAs (3 μg) from each gradient fraction prepared as in fig. 3C are visualized by ethidium bromide
staining. The position of major RNA species is indicated together with phenotype of mice. The treatment with
puromycin (0.5 mg/ml 15 min at 37°C prior lysis) of the brain homogenates inducing a shift of rRNAs towards light
density fractions is an indication of the ribosome runoff.
99
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100
II/ Etude du rôle de FMRP dans le blocage du ribosome
II/ Etude du rôle de FMRP dans le blocage du

ribosome
101
A
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 23 24
28S ARNr
Wt 18S ARNr
ARNt
KO
B
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
28S ARNr
Wt 18S ARNr
ARNt
KO
Figure 1. La puromycine induit la dissociation des sous-unités ribosomiques vers les

fractions légères
A, après fractionnement des lysats de cerveaux Wt et KO sur un gradient de sucrose, 1/10ème
des ARN totaux extraits des 24 fractions d’un gradient sont déposés sur gel d’agarose 1%.
Les ARN sont visualisés après expositions aux UV grâce à la présence d’un agent
intercalant (Bromure d’Ethidium) dans le gel. Trois ARN sont observés, correspondant aux
ARN majoritaires, les ARNr 18S et 28S et les ARN de transferts (ARNt) et ils sont annotés
directement sur la photo du gel. B, Les lysats de cerveaux Wt et KO sont traités à la
puromycine avant de les fractionner sur un gradient de sucrose. La suite de l’expérience est
identique au point a, mais notons la présence des ARNr 18S et 28S dans les fractions légères
18, 19 et 20.
II/ Etude du rôle de FMRP dans le blocage du

ribosome
Introduction
FMRP est une protéine essentiellement cytoplasmique, trouvée associer aux polyribosomes
dans les cellules neuronales et non-neuronales (Khandjian et al., 2004; Stefani et al., 2004).
Cette association est sensible à l'EDTA et aux RNAses (Stefani et al., 2004), ainsi qu’à l’azide
de sodium, un inhibiteur de l’initiation de la traduction (Feng et al., 1997a; Ceman et al.,
2003) et à la puromycine, un analogue d’aminoacyl-ARNt provoquant la dissociation des
ribosomes en cours de traduction (Stefani et al., 2004). De plus, une mutation faux-sens au
niveau du deuxième domaine KH de FMRP (I304N), abolit l’association aux polyribosomes
(Feng et al., 1997a; Zang et al., 2009) et provoque un phénotype X Fragile chez la souris
l’homme (De Boulle et al., 1993) et la souris (Zang et al., 2009). Des études sur les souris
Fmr1 et les souris I304N ont permis de mettre en évidence un certain nombre de défauts de la
plasticité synaptique. L’ensemble de ces données suggère que l’association de FMRP aux
polyribosomes serait une fonction principale de FMRP, notamment pour réguler la traduction
des protéines synaptiques. Mais, à ce jour, le mode d’action de FMRP sur la traduction reste
sujet à controverse. Différents modèles d’inhibition de la traduction par FMRP ont été
proposés. Parmi ces modèles, l’un propose que FMRP provoque l’arrêt du ribosome sur
l’ARN pendant la phase d'élongation de la traduction. Ce modèle repose sur l’observation
d’une persistance de l’association de FMRP aux polysomes en dépit de l’induction de l’arrêt
de la traduction par des inhibiteurs dont l’effet est de dissocier les ribosomes des ARNm
(Ceman et al., 2003; Stefani et al., 2004; Darnell et al., 2011). Ces observations suggèrent que
les ribosomes restant associés à FMRP sont bloqués en cours d’élongation de la traduction, et
sont ainsi insensibles aux antibiotiques (puromycine : arrêt de l’élongation ; hippuristanole ou
azide de sodium: arrêt de l’initiation). Ces données sont appuyées par l’utilisation d’un
système in vitro (traitement à la puromycine d’un mélange d’extraits de cerveau et de
réticulocytes de lapins) montrant que des ARNm cibles de FMRP sont plus associés à des
polyribosomes bloqués en cours de traduction. Nous avons testé ici ce modèle proposé
d’action de FMRP en déterminant les profils de plusieurs ARNm cibles de FMRP dans les
polysomes d’extraits de cerveaux de souris de 10 jours ou de cultures de neurones primaires,
Wt et KO, par qRT-PCR. L’ensemble de nos données révèle qu’aucun des ARNm testés
102
Dlg4 Apc
Absorbance 260 nm
500 20
400 12
15
300 8
10
200 4
5
100
0 0
0
18S ARNr 20 Arc 15 Dgkk
20 15
10
10
Pourcentage d’ARN
10 5
5
0 0 0
15 28S ARNr 12 Glra1 20 Glrb

10 8 15
10
5 4
5
0 0
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Fractions
Figure 2. La perte de FMRP n’affecte pas le profil des ARNm cibles dans les
polyribosomes de cerveaux de souris
Le graphique présenté en haut à gauche correspond à l’absorbance à 260 nm dans les
différentes fractions récoltées d’un gradient de sucrose 15-45%. La partie gauche du
graphique correspond au bas du gradient, comportant les ARNm associés aux polyribosomes
les plus lourds. La partie droite du graphique correspond au haut du gradient contenant les
mRNP libres de ribosomes. Le trait rouge indique les polyribosomes et la flèche rouge
pointe le pic de monosome (en moyenne, il atteint une valeur de 0,35 μg/μl). Tous les autres
graphiques correspondent aux profils des ARN indiqués dans les polyribosomes, et dans
chaque fraction le pourcentage de l’ARN par rapport à la quantité totale est indiqué (pour le
calcul, voir Matériels et Méthodes). La courbe rouge est le résultat de la moyenne des
duplicats Wt avec la barre d’erreur correspondant à l’écart type et la courbe bleue celui des
duplicats KO. Les duplicats montrent un recouvrement parfait des profils en présence et en
absence de FMRP.
(incluant les ARNm Dlg4, CamK2a et Mtap1b, des cibles validées de FMRP) ne montrent de
différences significatives dans leurs profils de polysomes entre Wt et KO. Ceci, à un niveau
basal et également après une induction de l'arrêt de la traduction par la puromycine. Ainsi, nos
données réfutent à priori le modèle d’un blocage de la traduction au cours de l’élongation par
FMRP.
Résultats et discussion
L’absence de FMRP ne perturbe pas le profil des ARNm cibles au cours de la
traduction
Pour évaluer le rôle de FMRP endogène sur la traduction, nous avons suivi le profil de
différents ARNm considérés comme cibles et non cibles de FMRP dans les polyribosomes à
partir d’extraits de cerveaux de souris Wt et Fmr1 KO. Les différents extraits ont été séparés
sur des gradients de sucrose 15-45% permettant de fractionner les ribosomes libres ou
associés aux ARNm en fonction de leur coefficient de sédimentation. Chaque gradient a été
divisé en 24 fractions à partir desquelles les ARN totaux ont été extraits. 1/10ème des ARN ont
été déposés sur gel d’agarose pour contrôler la qualité des ARN et la présence ou non des
ribosomes dans les différentes fractions (Figure 1a). Les fractions 1 à 17 comportent à la fois
les ARNr 18S et 28S, indicateurs de présence de la petite (40S) et de la grande (60S) sous-
unités du ribosome, respectivement. Ces fractions comportent donc des ribosomes
fonctionnels complets et correspondent aux polyribosomes (plusieurs ribosomes associés aux
ARNm en cours de traduction). Notons que les fractions 16 et 17 coïncident avec le pic de
monosome, mesuré par l’absorbance à 260 nm au cours de la séparation des fractions. Les
fractions 18 à 24 comportent les sous-unités ribosomiques libres et les mRNP, indiquées par
l’absence des ARNr 18S et 28S et la présence d’une forte quantité des ARN de transferts
(ARNt).
Le profil de chaque ARN étudié a été déterminé par RT-PCR quantitative avec des amorces
gènes spécifiques dans chaque fraction d’un gradient donné (Tableau 1, matériel et méthode).
Le pourcentage de l’ARN a été calculé dans les différentes fractions en rapportant la valeur
obtenue pour une fraction donnée à la somme totale des 24 fractions. Les profils des ARNr
18S et 28S et de 6 ARNm sont présentés sur la figure 2. Les ARNm Dlg4 et Arc sont des
cibles « validées » de FMRP. L’ARNm Apc est identifié dans la majorité des listes proposées
comme cibles de FMRP et l’ARNm Dgkk correspond à la cible majeure découverte par notre
103
Absorbance 260 nm
1350 Camk2a 30
Dgkk
20
15
850 10 20
5
350 10
- 150 0 0
20 Dlg4 15 Glra1 20 Glrb

15 15
10
10
5 5 10
Pourcentage d’ARN
0 5
0 0
15 Arc 15
Apc Mtap1b
12
10
10 6
5
0 5 4
0 0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
Fractions
Figure 3. FMRP ne provoque pas l’arrêt du ribosome en cours de traduction dans les
extraits de cerveaux
Les mêmes conditions que la figure 2 ont été réalisées excepté que les lysats de cerveaux de
souris ont été traités à la puromycine. Le pic de monosome atteint en moyenne une
absorbance équivalente à 1,35 μg/μl, confirmant le bon fonctionnement de la puromycine.
Les profils en gris sans barre d’erreur sont identiques aux profils présentés dans la figure 2.
Les courbes rouges (Wt) et bleues (KO) sont décalées de la même manière vers les fractions
légères pour tous les ARNm étudiés.
étude (Résultat I). Enfin, les ARNm Glrb et Glra1 ne sont pas identifiés à ce jour comme
cibles de FMRP et pourraient ainsi constituer de contrôles négatifs. Chaque ARN possède un
profil différent dans les polyribosomes qui peut être expliqué par la taille différente des
phases codantes des ARNm ou d’une vitesse différente des ribosomes au cours de la
traduction. Dans tous les cas, pour les 6 ARNm testés, le profil est similaire entre Wt et KO
suggérant que ces différents ARNm sont présents de la même manière au niveau des
polyribosomes. Ces données sont en accord avec ceux de l’étude de Darnell et al. (2011)
effectuée également sur des cerveaux de souris, et en désaccord avec des études antérieurs
réalisées sur des cellules lymphoblastoides humaines (Darnell et al., 2001) et sur les
préparations de synaptoneurosomes (Zalfa et al., 2003; Muddashetty et al., 2007). Ceci peut
être expliqué par la différence entre les tissus ou cellules utilisées. Quoiqu’il en soit dans
notre étude sur les cerveaux de souris, nous observons que tous les ARNm cibles et non cibles
de FMRP testés semblent être traduits de la même manière en présence et en absence de
FMRP.
FMRP n’altère pas l’élongation de la traduction de ses ARNm cibles

Pour distinguer les ARNm associés aux ribosomes actifs par rapport à ceux associés aux
ribosomes bloqués, on peut réaliser une dissociation des ribosomes actifs par un inhibiteur de
traduction avec la puromycine. Seuls les ARNm associés aux ribosomes bloqués vont
persister dans des les polysomes (fractions lourdes au niveau du gradient de sucrose). Si
FMRP bloque le ribosome au cours de l’élongation, nous devrions observer un décalage du
profil des ARNm cibles en son absence. Nous avons donc testé ce modèle en traitant les lysats
de cerveaux de souris Wt et KO avec la puromycine, suivi d’un fractionnement direct sur
gradient de sucrose 15 – 45 %. Contrairement aux gradients non traités à la puromycine, les
deux ARNr 18S et 28S sont enrichis au niveau des fractions 18, 19 et 20 et appauvris dans les
fractions de 1 à 12. De plus, le niveau de ces ARNr est réduit dans les fractions de 1 à 12
(Figure 1b). Ces données indiquent la dissociation des ribosomes vers les fractions légères,
indiquant que le traitement à la puromycine est fonctionnel. De même, le profil de
l’absorbance à 260 nm montre une augmentation du pic de monosome pour les lysats traités
contrairement aux non-traités (Figure 3 / Figure 2 ; en moyenne 1,2 μg/μl pour les lysats
traités à la puromycine et 0,3μg/μl pour les non-traités). 8 ARNm ont été analysés incluant la
cible majeure de FMRP, l’ARNm Dgkk. Le profil de tous ces ARNm est décalé vers les
fractions légères du gradient (Figure 3, la courbe rouge contre la courbe grise), confirmant la
104
A B
Mtap1b 100
Actb
100 100
Absorbance 260 nm
77,7
80 65,6 80
80
60 60 73
60 58,8 40,6
40 40 21,4
40 20 30,8 3,6 20 9,2
17,9
0 0,6 0 0,8
20 Poly. Mono. Libre Poly. Mono. Libre
0
15 Dlg4 80 Dlg4 Rplp0 58,8
58,8 60
10 60 40,4
57,2 39,4 40 54,7
40
34,9 37,2
Pourcentage d’ARN
5 20
20 7,8 8
1,8 0,7
0 0 0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 Poly. Mono. Libre Poly. Mono. Libre
Poly. Mono. Libre Fractions
100 Dlg4
80 85,9
60
40
20 12,2
1,4
0
Poly. Mono. Libre
Fractions
Figure 4. FMRP ne provoque pas l’arrêt du ribosome en cours de traduction dans les
cultures primaires de neurones corticaux
A, un lysat de neurones Wt est fractionné directement sur gradient de sucrose. Le graphique
en haut correspond à la mesure de la DO en parallèle du fractionnement de ce gradient. Le
profil de l’ARNm Dlg4 dans les 24 fractions est également visualisé validant ainsi la
technique dans les neurones. Différentes fractions sont combinées, Polysomes (1 à 16),
Monosome (17 à 20) et libre (21 à 24). La moyenne de trois gradients Wt pour l’ARNm
Dlg4 est présentée au niveau du graphique en bas. B, Des neurones Wt et KO sont traités à
la puromycine directement dans le milieu de culture, suivi d’un fractionnement sur gradient
de sucrose et d’un regroupement des différentes fractions après extraction de l’ARN. Les
courbes rouge (Wt) et bleue (KO) correspondent à la moyenne de trois gradients et ne
montrent pas de différences significatives.
dissociation des ribosomes actifs de ces ARNm. Cependant, le décalage est exactement
identique en présence et en absence de FMRP (Figure 3, la courbe rouge (Wt) contre la
courbe bleue (KO)), suggérant l’absence de ribosomes bloqués sur les ARNm cibles de
FMRP. On pourrait penser qu’un traitement à la puromycine trop élevé pourrait empêcher de
voir un effet entre Wt et KO. Cependant, l’insensibilité de l’ARNm Arc indique que le
traitement n’est pas trop fort. Alors que nos résultats sans traitement à la puromycine sont en
accord avec Darnell et al. (2011) (absence d’effet), après traitement ils contredisent
clairement leurs observations. Dans leur étude, Darnell et al. ont rajouté un extrait de
réticulocytes de lapin à leur extrait de cerveaux de souris avant de fractionner le tout sur un
gradient de sucrose. D’après ces auteurs, l’action de la puromycine sur un extrait de cerveau
nécessite une production d’énérgie pour poursuivre la traduction et incorporé la puromycine
avant la dissociation des ribosomes. Cependant les réticulocytes de lapin comportent
également des ribosomes et de la protéine FMRP, pouvant altérer le profil des ARNm. De
plus, nos résultats montrent que la puromycine fonctionne parfaitement sans besoin d’énergie
exogène.
En parallèle, nous avons également réalisé des expériences préliminaires de traitement à la
puromycine sur des cultures primaires de neurones Wt et Fmr1 KO. Contrairement aux
cerveaux, nous avons beaucoup moins de matériels fractionnés à partir des neurones. C’est
pourquoi, une première analyse a permis de suivre uniquement l’ARNm Dlg4 et de confirmer
qu’un profil est correctement obtenu (Figure 4). Ce profil est comparable à celui d’extraits de
cerveau. Pour la suite de l’expérience, nous avons combinés les fractions correspondant aux
polyribosomes (1 à 16), monosomes (17 à 20) et libres (21 à 24) afin d’obtenir 3 fractions par
gradient et concentrer ainsi le matériel obtenu. Le choix de combinaisons des fractions a
reposé sur la comparaison des différents profils des ARNm, nous permettant de préciser
exactement les fractions correspondant aux polysomes, monosomes et aux mRNP (libres). 4
ARNm ont été analysés dont Mtap1b et Dlg4, deux cibles « validées » de FMRP. Le
traitement à la puromycine est également fonctionnel dans les neurones. En effet, le pic de
monosome pour l’ARNm Dlg4 passe d’une valeur égale à 15 +/-3,4 % dans les neurones Wt
non traités à 34,9 +/-7,8 % dans les conditions traitées à la puromycine. En parallèle, le
niveau de l’ARN dans les polysomes non traités est de 85,9 +/-3.7 % et de 57,2 +/-14,8%
dans ceux traités à la puromycine (Figure 4a, 4b). Comme pour le cerveau, ce décalage
semble être identique en présence et en absence de FMRP.
105
Figure 5. Préparation de cultures primaires de neurones corticaux.
A, observation sous loupe binoculaire, (1) d’un embryon de 17 jours sorti du sac embryonnaire
(2) de son cerveau avec de haut en bas les bulbes olfactifs, les deux hémisphères de l’encéphale,
le cervelet et la moelle épinière, (3) de l’hémisphère droit de l’encéphale mettant en évidence
l’hippocampe (H) et le cortex (C), (4) la séparation de l’hippocampe et du cortex, (5) le cortex
qui sera mis en culture. B, contrôle de la qualité des cultures de neurones corticaux après 8 jours
(200X). (1) observation des neurones en contraste de phase, (2) visualisation des noyaux par
marquage au DAPI et visualisation de la protéine MAP2, marqueur spécifique des neurones, par
immunomarquage (Alexa fluor 488).
L’ensemble de nos données nous permettent de réfuter l’hypothèse avancée d’un blocage du
ribosome par FMRP au cours de la traduction sur ses ARNm, incluant la cible majeure
identifiée dans l’étude du manuscrit 1. Il est donc difficile d’identifier un impact de FMRP sur
le profil des ARNm dans les polyribosomes d’une manière globale, et ceci même en présence
des inhibiteurs de la traduction. Comme décrit dans le manuscrit 1, l’impact principal de
l’absence de FMRP sur la cible majeure est observé après une activation des mGluR-I,
suggérant que l’effet de FMRP sur la traduction serait essentiellement visible après
stimulation de ces récepteurs. Dans ce manuscrit, nous avons mis au point l’étude du profil
des ARNm dans les polyribosomes directement dans les neurones primaires. Cette même
technique peut être utilisée après stimulation pharmacologique des neurones par des agonistes
des mGluR1/5 (DHPG ou Quisqualic) nous permettant ainsi de visualiser un changement de
localisation des ARNm dans les polyribosomes après activation des mGluR-I, les récepteurs
montrés être impliqués directement dans la fonction de FMRP (Dolen et al., 2007).
Matériels et Méthodes
Préparation de cultures primaires de neurones corticaux
Les cellules neuronales ont été préparées à partir d’embryons issus de souris gestantes
hétérozygotes Fmr1 (+/-) de 17.5 jours. Les souris ont été sacrifiées par décérébration puis,
les cortex cérébraux des embryons ont été disséqués et déposés dans le tampon de dissection
S1 (1x PBS, 200 mg/ml D-Glucose, 100 mg/ml BSA et 150 mM MgSO4) (Figure 5). Après
une centrifugation de 1 min à 1000 rpm, le tampon S1 a été retiré, et le culot des cellules
repris dans 500 μl de tampon de dissociation enzymatique (10 ml S1, 10 mg/ml trypsine, 10
mg/ml DNase I), puis incubé pendant 20 min à 37°C. L’action de la trypsine a été arrêtée par
l’addition de 500 μl de tampon d’inhibition S4 (8,4 volumes de S1, 1,6 volume S3 (10 ml de
tampon S1, 10 mg/ml SBTI, 10 mg/ml DNase I et 150 mM MgSO4)). Après une
centrifugation de 5 min à 1000 rpm, le tampon S2-S4 a été éliminé et les cellules ont été
dissociées mécaniquement dans 500 μl de tampon S3 par une dizaine de pipetages avec un
pipetmann P200. Les cellules ont été ensemencées dans 2 ml de milieu DMEM (Gibco)
complémenté avec 10% de sérum de cheval, 10 mM d’HEPES (Gibco), 1μg/ml d’insuline et
200 μg/ml de gentamycine dans des plaques de 6 puits (1 embryon pour 2 puits d’une plaque
de 6). La surface des puits a été préalablement traitée avec une solution de poly-Lysine (0,1
mg/ml ; Sigma) pendant au moins 2h à 37°C. Les cellules ont été incubées à 37°C sous 5%
106
CO2 pendant la nuit, puis le milieu d’ensemencement a été remplacé par 2 ml de milieu
Neurobasal (Gibco) complémenté avec du B27 1x (Gibco), 200 mM de L-Glutamine et 100
IU/ml de pénicilline/streptomycine filtré à 0.22 μm.
Polyribosomes de cerveaux et de cultures neuronales de souris

Les cerveaux de souris Wt et Fmr1 KO âgées de 10 jours et sacrifiées par décérébration ont
été placés dans 1x PBS 4°C, puis lysés dans 0,7 ml de tampon « polyribosomes » (50 mM
Tris/HCl à pH=7,4 4°C, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTE, 40 U/ml RNasin et 1%
NP40). Les extraits de cultures de neurones de 8 jours ont été préparés à partir d’une plaque
de 6 puits lavée 2 fois au PBS 1x, puis lysées directement par le même tampon
« polyribosomes ». Les deux types d’extraits ont été centrifugés à 13000 rpm 4°C pendant 15
min, puis le surnageant a été chargé sur un gradient linéaire de sucrose 15 - 45% poids/poids
réalisé avec un tampon de gradient (50 mM Tris/HCl à pH=7,4 4 ° C, 100 mM KCl, 5 mM
MgCl2) dans des tubes polyallomère 14 × 89 mm (Beckman 331372) et centrifugés à 36000
rpm pendant 2 heures à 4 ° C dans un rotor Beckman SW41. Les gradients ont été récoltés en
24 fractions de 0,5 ml avec un système HPLC AKTA et la Densité Optique a été mesurée en
continu à 260 nm. Les différentes fractions ont été précipités en présence de 2 volumes
d'éthanol à -20°C et 0,3 μM NaAcetate pendant la nuit.
Induction de la dissociation des ribosomes au cours de l’élongation

Un arrêt de la traduction est réalisé en homogénéisant les cerveaux de souris avec le tampon
« polyribosome » sans détergent et en présence de 0,5 mg/ml de puromycine. Après
incubation à 37°C pendant 15 min, le NP-40 a été rajouté à une concentration finale de 1%
pour lyser les homogénats. Les échantillons ont été centrifugés à 13000 rpm 4°C pendant 15
min, puis sédimentés sur un gradient de sucrose (comme décrit précédemment).
Un arrêt de la traduction a également été réalisé sur des cultures de neurones en ajoutant
directement la puromycine dans le milieu de culture. Après incubation 15 min à 37°C, les
neurones ont été lavés avec 1x PBS, puis lysés et chargés sur gradient de sucrose comme pour
les neurones non-traités.
Extraction d’ARN
Les ARN totaux ont été extraits à partir de chaque fraction des différents gradients par un
mélange phénol/chloroforme pH=4.5 (volume/volume), suivi par une extraction au
107
Tableau 1. Les amorces utilisées pour la quantification par qRT-PCR
Genes 5’-3’ Sequence

(ID Ensembl) (Fw : Forward, Rev : Reverse)
Actb Rev : GCCAGAGCAGTAATCTCCTTC

(ENSMUSG00000029580) Fw : GACGGCCAGGTCATCACTATT
Apc Rev : GGACATAGCTAGCAAAGTTCG
(ENSMUSG00000005871) Fw: CTCTGCTCCTCGAAGGTTGA
Arc Rev : GCTGGTAAGAGCAGGTGTGAG
(ENSMUSG00000022602) Fw : GCTGAGGAGGAGGAGATCATT
Camk2a Rev : TGGCAGCATACTCCTGACCA
(ENSMUSG00000024617) Fw : ACCTGCACCCGATTCACAG
Dgkk Rev : GATGCCTTGAAGGTTTGGC
(ENSMUSG00000062393) Fw : GAAGAACATCCAGAACAATAC
Dlg4 (Psd95) Rev : AACACCATTGACCGACAGGA
(ENSMUSG00000020886) Fw : GGCACCGACTACCCCACAG
Glra1 Rev : TCCATCGGGAAATTCTTCAG
(ENSMUSG000000000263) Fw : CCGTCTGGCCTACAATGAAT
Glrb Rev : GGGATGACAGGCTTGGCAG
(ENSMUSG00000028020) Fw : CTGTTCATATCAGCACTTTGC
Mtap1b Rev : GTGGTGCTTAGGAGCTCACC
(ENSMUSG00000052727) Fw : CGGACAGTGCTTTGAGAACA
Rplp0 Rev : CCGATCTGCAGACACACACT
(ENSMUSG00000067274) Fw : AATCTCCAGAGGCACCATTG
18S rRNA Rev : CCATCCAATCGGTAGTAGCG
(NR_003278.3) Fw : GTAACCCGTTGAACCCCATT
28S rRNA Rev : ACATTGTTCCAACATGCCA
Fw : TTGAAAATCCGGGGGAGAG
chloroforme/alcool isoamylique (24:1) (volume/volume). Les solutions aqueuses restantes

comportant les ARN ont été précipitées en présence d’acétate de sodium pH=5,2 à une
concentration finale de 0,3M et de 2,5 volumes d’éthanol à 100% à -20°C sur la nuit. Après
une centrifugation à 15000 rpm 4°C pendant 20 min, les culots d’ARN ont été lavés avec 150
μl d’ethanol à 80 % et séchés rapidement avant d’être repris avec 10 μl d’eau milliQ. La
qualité d’ARN a été vérifée en déposant 1 μl de chaque fraction en présence de bleu de
charge sur un gel d’agarose 1%, avant de procéder à l’étape de transcriptase inverse.
Synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) et RT-qPCR

L'ADNc a été produit avec un kit de la transcriptase inverse Superscript™ II (Invitrogen ™)
en suivant les instructions du fournisseur. Un-quart des ARN totaux de chaque fraction a été
utilisé avec un mélange d’amorces inverses spécifiques pour les différents gènes étudiés (2
pmoles de chaque; voir tableau 1 des séquences d'amorces). L'efficacité des couples
d’amorces a été calculée pour chaque gène avec une gamme de dilution à partir des ARN
totaux de cerveaux de souris Wt avec le LightCycler ® 480 (Roche). Les contrôles de
contaminations des amorces ou d’ADN génomique (No RT) ont été réalisés. Les qPCR ont
été effectuées en diluant l’ADNc au 1/500ème pour les gènes d’ARN ribosomique et 1/5ème
pour les gènes d’ARN message en présence de 7.5 pM d’amorces et du « Master Mix
QuantiTect™ SYBR Green PCR » (Quiagen). Des duplicats biologiques ont été réalisés pour
les différents échantillons testés avec des duplicats expérimentaux de qPCR pour chaque
fraction. La distribution (%) des ARNm dans chacune des 24 fractions d’un gradient de
sucrose a été analysée et quantifiée en utilisant la méthode : 2^ [40 – Ct fraction n, où n est une fraction
de 1 à 24], puis ces valeurs ont été divisées par la somme totale des 24 fractions.
108
III/ mRNAs tethered to FMRP are recruited into specific RNA granules distinct from stress
granules and processing bodies (manuscrit 2)
III/ mRNAs tethered to FMRP are recruited

into specific RNA granules distinct from stress
granules and processing bodies (manuscrit 2)
109
stress granules and processing bodies
mRNAs tethered to FMRP are recruited into specific RNA granules distinct from stress
granules and processing bodies
R. Tabet, E. Flatter, J.L. Mandel, H. Moine*
Affiliations:
IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire); CNRS, UMR7104;

Inserm, U596; Collège de France, Strasbourg University, 67404 Illkirch-Graffenstaden,
France.
*Correspondence to: [email protected]
Abstract
FMRP is an RNA binding protein whose absence leads to Fragile X syndrome, a major cause
of intellectual disability. We have addressed the function of FMRP in mRNA metabolism
with a tethering assay. We demonstrate that tethering of FMRP to the 3’ untranslated region
of an mRNA has no impact on its translation efficiency but leads to a segregation of the
mRNA into specific granules distinct from stress granules and processing bodies. The
formation of the “FMRP granules” is not dependent upon the presence of the low complexity
RGG domain or the phosphorylation site of FMRP. These granules are however compromised
by the point mutation I304N in the KH2 domain, even though this mutant is forced to be
loaded on polysomes. Our results support a model where FMRP recruits its target mRNAs in
specific subcellular granules where active translation takes place. We discuss the possible
implications of these results for a role of FMRP in local translation of mRNAs.
110
Introduction
The Fragile X Mental Retardation protein (FMRP) is an RNA binding protein present in most
cell types associated to mRNAs engaged in translation [1]. Mutations silencing the gene
encoding FMRP, FMR1, are the main cause of familial intellectual disability: the Fragile X
syndrome [2]. This has been prompting to identify the precise function of FMRP. Twenty
years of research have led to the conclusion that FMRP is involved in the post-transcriptional
control of a subset of genes important for synaptic plasticity. FMRP binds mRNAs via its two
hnRNPK homology domains (KH) and its carboxy-terminal arginine–glycine-glycine rich
region (RGG) [3]. A number of studies intending to determine whether FMRP binds mRNAs
with specificity have been performed, including by us, leading to lists of hundreds or
thousands of mRNAs and several RNA motives [4,5,6,7,8,9]. The lack of a clear unity
between all the lists and, most important, the lack of clear recapitulation of FMRP function on
a reporter mRNA bearing a minimal binding site in a cell based assay, has been casting
doubts about the true mRNA targets of FMRP and its precise function. At the moment it
remains unclear if FMRP has function(s) on a wide array of mRNAs, as suggested by the
multiple targets identified, or if its true target(s) has(ve) remained concealed because the
techniques used were too noisy. Thus, in absence of certitude regarding its cognate mRNAs
and to better understand the function of FMRP in mRNA metabolism we used a tethering
approach to investigate FMRP function uncoupled from its RNA binding property. Tethered
function assays have been used to show the role of proteins in control of mRNA transport,
localization, translation and stability [10,11]. We chose the bacteriophage lambda N
peptide/boxB RNA interaction system because N peptide and boxB RNA are both very small,
22 amino acids and 19 nucleotides, respectively, and they interact with high affinity (Kd = 1.3
nM). Such system has proven for instance to be essential to demonstrate the translation
inhibition properties of the Ago2 protein [12].
In the present study, we investigate whether FMRP triggers the mRNA control in a tethering
assay. We demonstrate that the tethering of FMRP on the 3’ untranslated region (UTR) of an
mRNA has no impact on its translation efficiency but leads to a segregation of the RNA into
specific granules distinct from previously known stress granules and processing bodies.
111
Figure 1: Validation of FMRP tethering approach.
(A) Western blot analysis of FMRP in Hela cells extracts (20 μg total protein) transfected at 100,000 cells for
24h with pTL 4O-FMRP 0.1 μg, pRLTK 0.2 μg, 0.1 μg pFlashSV40 and visualized with 1C3 anti-FMRP
(1/7000). The O-FMRP protein migrates at expected size of 86 kDa in SDS-PAGE and is not overexpressed
compared to the endogenous FMRP isoforms. (B) 4O-FMRP is normally present in polysomes and 4O-FMRP-
I304N tethered to an mRNA is forced to be loaded in polysomes. The absorbance measurement at 260 nm
throughout the linear sucrose gradient 5-45% indicates the presence of polysomes in the heavier fractions (6-12).
The western blot analysis of the presence of endogenous FMRP throughout the sucrose gradient fractions is
revealed with 1C3 antibody (1C3) and HA-tagged FMRP with anti-HA (HA). Control indicates non-transfected
Hela cells. The combinations of constructs (HA tagged FMRP with or without lambda peptides and renilla
luciferase mRNA with or without B-box) used for transfections is indicated on the left and a scheme showing if a
tethering occurs is shown on the right. (C) The tethering of FMRP to the 3’UTR of a reporter gene (Renilla
luciferase) has no impact on its translation efficiency. Luciferase reporter expression assays were performed on
Hela cells extracts from 24-well plates transfected for 24h at 80% confluency with 0.2 μg pRLTK plasmids
expressing renilla luciferase and bearing 4 boxB (Rluc-4BB) or not (Rluc), 0.1 μg pFlashSV40 expressing firefly
luciferase and 0.1 μg pTL1 plasmid expressing the indicated FMRP proteins (or no protein (c). Results are the
ratio of renilla /firefly luciferase activity. Data are the mean results with standard deviation of three independent
transfection experiments with luciferase assays performed in triplicate for each.
Results
Validation of FMRP tethering to mRNAs
FMRP isoform 7 (Iso7), the most abundant isoform, was fused to four consecutives lambda
N-22 peptides at its N-terminus end (4O-FMRP), between an HA tag and a flexilinker
(GSGSGS) in a eukaryotic expression vector (pTL 4O-FMRP). Four boxB hairpins (GNRA-
fold adopting motives that are bound with nanomolar affinity by the arginine-rich motif of the
lambda N-22 peptide [13]) were inserted in the middle of the 3’ untranslated region (3’-UTR)
of an mRNA encoding the Renilla luciferase in the pRLTK vector (pRLTK-4BB).
Transfection conditions in Hela cells were determined to obtain an expression of 4O-FMRP
under the level of endogenous FMRP isoforms (Fig1A). Indeed it has been shown previously
that an overexpression of FMRP leads to a stress situation where the translation of most
mRNAs is arrested [14]. As a control for its normal behavior we assessed whether the 4O-
FMRP protein was present in polysomes, the place where endogenous FMRP is normally
present [15]. 4O-FMRP was found present in the high density fractions of a 5-45 % (w/w)
linear sucrose gradient, like the endogenous FMRP (Fig 1B, 1C3) and like a protein that does
not bear the four lambda N-22 peptides (Fig 1B, FMRP). This indicates that the presence of
the four lambda N-22 motives in FMRP did not alter its normal interaction with polysomes.
The ability of FMRP to be tethered or not to a specific mRNA did not seem to influence its
polysome profile either. To test whether the tethering of FMRP on a reporter mRNA was
effectively working, we analyzed the behavior of FMRP-I304N, a point mutation identified in
a patient with severe Fragile X that alters the association of the mutant FMRP to polysomes
[16]. When the 4O-FMRP-I304N protein was expressed in cells together with a reporter
mRNA Rluc lacking the boxB motives, the protein was present only in the low density
fractions of the sucrose gradient, indicating that the interaction of the mutant protein with
polysomes was altered, as expected (Fig 1B). In the contrary, when the mutant 4O-FMRP-
Iso7-I304N was co-expressed with a reporter mRNA Rluc bearing 4 boxB, the protein was
present all throughout the gradient (with a lower efficiency than the wild type though)
indicating that its incorporation into polysomes was restored. These data indicate that the
lambda N-22/boxB interaction can force the protein 4O-FMRP-I304N to be present in
polysomes, validating the approach of FMRP tethering to a specific mRNA.
112
Figure 2: FMRP tethered to an mRNA appears into subcellular granular structures.
(A) FMRP proteins expressed from transfected expression vectors are visualized in fixed Hela cells by
immunofluorescence with a primary mouse anti-HA antibody and a secondary goat anti mouse Alexa-488
antibody. In parallel, endogenous Tia1 is visualized with a rabbit anti-TIA-1 and an anti-rabbit secondary
antibody labeled with Alexa-594. The proteins and mRNAs produced by the transfections are given. The
depicted cells are representative of the majority of cells. (B) Histograms represent the percentages of cells (Y
axis) distributed in two categories: no granule (0), granules (G) with the different constructs indicated and using
anti-HA (HA) or anti-FMRP (1C3) for visualization. Error bars indicate the standard deviation and P-value is
calculated with Student t-test on data from at least three independent experiments with counting more than 100
cells in each case.
An mRNA tethered by FMRP assembles into stress granule-like structures without

impact on its translation
We then measured if the tethering of FMRP to an mRNA had an influence on translation.
Plasmid encoding renilla luciferase with 4 boxB in its 3’UTR (Rluc-4BB) or not (Rluc) were
cotransfected with a plasmid expressing FMRP or its 4OFMRP version together with a
plasmid expressing firefly luciferase (Fluc) as normalizer of the transfection. Surprisingly, the
luciferase activity (Rluc/Fluc) in the cell extracts was not found significantly different
whether or not the tethering could take place. Thus, the translation efficiency of the mRNAs
tethered to FMRP was identical to the one of non-tethered mRNAs or to the one of an mRNA
tethered to FMRP I304N (Fig 1C). Furthermore, neither the number of ON motives (4 or 8),
nor the length of expression (12h, 24h or 48h), the isoform type (Iso1 or 7), the cell type
(Hela, Cos, primary murine cortical neurons), and the number of boxB (4 or 8) did have an
influence on the luciferase expression level (data not shown). Altogether these data indicate
that the mere presence of FMRP on the 3’ UTR of an mRNA is not sufficient to exert any
specific effect on its translation.
We then tested whether the tethered mRNP had a specific subcellular localization by
performing immunofluorescent analysis of FMRP. When FMRP was expressed untagged in
the presence of an mRNA bearing the 4boxB (Rluc-4BB, data not shown) or when 4O-FMRP
was expressed with an mRNA bearing no boxB (Rluc, Fig 2A), FMRP was evenly distributed
throughout the cytoplasm as was already reported for endogenous FMRP [17]. Occasionally,
a minority of cells showed a pattern reminiscent of a stress situation, likely induced by the
transfection reagent. Surprisingly, when 4O-FMRP was co-expressed with Rluc-4BB mRNA,
a majority of cells exhibited a pattern evoking stress granules (SGs). Indeed Tia1 colocalized
with FMRP in a number of cells, which suggested this possibility. The detailed analysis of
these cells using anti-FMRP antibody (1C3) revealed that 66%±6 of cells expressing the
tethered version of FMRP had such granular appearance compared to 24%±7 when the
tethering was not taking place (Fig 2B, 1C3). Similar results were obtained with an antibody
specific of the 4O-FMRP (anti-HA) (60%±8 and 25%±9 respectively for Rluc-4BB and Rluc,
Fig 2B, HA). Remarkably, the protein 4O-FMRP-I304N did not give such a granular pattern
(10% ±6 and 15% ±9 with 1C3 and anti-HA antibody, respectively) indicating that the
tethering by itself was not sufficient to induce the granular appearance of FMRP (Fig 2A, 4O-
FMRP I304N+Rluc-4BB) and a functional protein was required.
mRNAs tethered by FMRP are present in specific RNA granules

113
Figure 3: Tethered FMRP granules are distinct from processing bodies.
(A) 4O-FMRP colocalizes with Tia1 in the cells with large granules but not in cells with small granules.
Immunolabeling for FMRP and Tia1 was as described in Figure 2. (B) 4O-FMRP does not colocalize with Dcp1.
Dcp1 was labelled with rabbit anti hDcp1 and secondary anti rabbit Alexa-594. Cyan was artificially exchange
for red for easier visualization of merged colors. (C) Ribosomal protein L7 is present in the FMRP tethering
granules. 4O-FMRP colocalizes with L7 in the cells expressing Rluc-4BB mRNA but not in cells expressing
Rluc. 4O-FMRP is visualized in fixed Hela cells by immunofluorescence with a primary mouse anti-HA
antibody and a secondary goat anti mouse Alexa-594 antibody and endogenous L7 is visualized with a rabbit
anti-L7 antisera and an anti-rabbit antibody labeled with Alexa-488. One can notice that aceton/methanol
permeabilization of the cell necessary to label cytoplasmic ribosomal L7 alters the sharpness of subcellular
structures. The depicted cells are representative of the majority of cells. (D) Tia1 colocalizes with L7 in the cells
expressing Rluc-4BB mRNA but not in cells expressing Rluc. Tia1 is visualized with a primary mouse antibody
anti-Tia1 and a secondary goat anti mouse Alexa-594 antibody and endogenous L7 is visualized as in C.
To have a better idea of the nature of the granules induced by FMRP tethering, we further
analyzed their characteristics. We noticed that for the cells with the most intense FMRP
granules, FMRP colocalized with Tia1 (an RNA binding protein considered as a marker of
SGs), therefore potentially qualifying as SGs (Fig 3A), while for those cells where FMRP was
in more diffused or smaller granules, Tia1 colocalization was absent. Whether those two types
of situation originate from a unique or two separate phenomena is unclear. Because the small
dots appearance of tethered FMRP was evoking processing bodies (PB), we tested whether
there could be an overlap of the granules induced by FMRP tethering with Dcp1, marker of
PBs. In fact, 4O-FMRP localization was clearly distinct from that of PBs, ruling out this
possibility (Fig 3B). eIF4A, an initiation factor protein frequently found in SGs, was also
found to be absent from these granules (data not shown) but the presence of this factor in SGs
seemed to be depending upon the type of stress used [17]. The large ribosomal subunit protein
L7 was present in these granules (Fig 3C,D), suggesting that translation could take place in
them and that probably they were not true SGs since large subunit ribosomal proteins are not
present in SGs [14,18]. To better define whether the FMRP tethered granules were related to
SGs, we analyzed their RNA content with FISH. Using a polydT FISH probe to visualize the
bulk of mRNAs, no RNA granule was visible in any of the tethering combinations we tried
(Fig 4A). This was in clear contradiction with the previous observations that bulk of mRNAs
are segregated in SGs [14] and suggestive that the granules induced by FMRP tethering were
not SGs. To analyze the localization of an mRNA submitted to FMRP tethering, we used
dsRed expressing vector bearing or not the boxB motives in its 3’ UTR and for which we had
an efficient FISH probe. When 4O-FMRP was coexpressed with dsRed-4BB mRNA that
bears 4 boxB motives, the FISH signal was present in granular structures (Fig 4B). In the
contrary, when 4O-FMRP was coexpressed with dsRed mRNA lacking boxB, the FISH signal
was homogenously spread throughout the cytoplasm like the bulk of mRNAs seen with oligo-
dT FISH. The mutant 4O-FMRP-I304N was also not able to induce this granular RNA
appearance (Fig 4B). Thus, the mRNA tethered to FMRP had an appearance similar to that of
the protein itself, suggesting they were part of the same mRNPs in the same subcellular
granular structures. Indeed we could observe that 4O-FMRP colocalized with the dsRed-4BB
mRNA construct but not the dsRed (Fig 4C). Thus the granules we observed in cells upon
tethering of FMRP to a given mRNA were very specific of the interaction with FMRP. We
dubbed them as “FMRP granules” (FGs)
RGG domain deletion does not alter FMRP granule formation
114
Figure 4: Tethered FMRP granules are RNA granules distinct from stress granules. (A) Fish with oligodT-
Alexa 488 in fixed Hela cells indicates that the bulk of mRNAs remains diffuse in the cells where FMRP
tethering is taking place (i.e. in the dsRed positive cells as seen in red chanel presented on right). Cells shown are
representative of all the cells as indicated by the histogram on the right. (B) Fish with anti-dsRedmRNA-Alexa-
488 cDNA probe indicates that the non-tethered mRNA (dsRed) remains diffuse in cytoplasm while the tethered
mRNA (dsRed-4BB) is present in RNA granules. (C) Tethered mRNA (dsRed-4BB) and 4O-FMRP colocalize in
the same granules. Reporter dsRed mRNA is visualized by Fish as in B and 4O-FMRP by a primary mouse anti-
HA antibody and a secondary goat anti-mouse- Alexa-350 antibody.
The RGG domain of FMRP has been proposed to be one of the most important sites for the
specific interaction of FMRP with RNAs. We tested whether this domain was important for
the FG formation. A number of deletion constructs were tested (Fig 5A,B), their correct
expression in Hela was verified by western blot (Fig S1). The deletion of RGG domain in
construct 4O¨RGG (¨ -549) did not perturb FG formation. A deletion of the whole C-
terminus region of FMRP 4O-¨Cter (¨ -632) did not either. Conversely, the RGG alone
(4O-Cter-short 527-632) or a longer fragment of this region, extending further in N-ter
direction (4O-Cter-long 466-632), was not sufficient to promote FG formation. The deletion
of 13 aa residues encompassing the phosphorylation site at ser 499 proposed to control the
regulatory function of FMRP [19] was also tested (4O-¨Phos, ¨491-503) and did not perturb
the FG formation.
Discussion
The present study was initiated following the ascertainment that the exact binding site and
function of FMRP on mRNAs was unknown. Using a tethering approach we demonstrated
that FMRP can be forced to interact with the 3’-UTR a given mRNA within cells with the 4O-
N22/4Bbox interaction. Indeed the natural loss of function mutant FMRP-I304N could be
forced to enter polysomes, where from it is normally poorly present without tethering. The
3’UTR of mRNAs is often a region of binding and action for many regulatory RNA binding
proteins. For FMRP, however, its tethering in the 3’UTR of an mRNA does not seem to have
any influence on translation. Indeed the translation of the reporter mRNA was identical with
and without FMRP tethering. Furthermore, FMRP was similarly present all throughout the
polysome fractions of a sucrose gradient independently of the tethering. Altogether, these data
suggests that FMRP does not have per se the ability to modulate the translation efficiency of
an mRNA when bound to its 3’ UTR. These data suggest that FMRP rather acts in an indirect
manner (e.g. by interfering with another RNA binding protein, by entrapment of a specific
RNA conformation, etc...). Although we took care to introduce a linker between the additional
lambda domain and the N-terminus of FMRP, to prevent steric hindrance effect with N-
terminal NDF domains, we cannot completely exclude that the 4O-N22 altered some essential
functions of FMRP. Also, it is possible that the RNA binding and function of FMRP may not
be readily separable. Thus, unlike Ago2 protein that induces translation inhibition
independently of its guide miRNA when tethered to an mRNA [12], FMRP may have a
nucleic acid-binding site that is also the active site of the protein. For instance FMRP could
exhibit an RNA-induced conformational change required for its function. However, up to
115
Figure 5: Role of FMRP subdomains in FMRP granule formation.
(A) FMRP constructs expressed from transfected expression vectors are visualized in fixed Hela cells by
immunofluorescence as in fig. 2. The name and length (aa size) of constructs is given. Each FMRP construct was
tested with a mRNA bearing 4B-box (Rluc-4BB, right) or not (Rluc, left). Pictures shown are representative of
all cells. An enlargement is presented for the cells expressing Rluc-4BB mRNA to emphasize the presence or
absence of granules. (B) Summary of FMRP granule formation for the different FMRP subdomains as observed
in A.
now, no function of FMRP on translation has been demonstrated to be direct. For instance
FMRP has been proposed to modulate the activity of miR-125a in the 3’ UTR of PSD95 [20],
where the miRNA site overlaps with a FMRP G-quadruplex binding motif [21]. Whether this
is a general mode of action of FMRP or a unique case is unknown. Recent global analyses
seeking to identify all the FMRP mRNA binding sites left the question unanswered. In fact,
no prevalent specific binding site of FMRP could be identified in 3’ UTRs [7,8].
Our main observation in this study is that FMRP can aggregate a species of mRNA within
cells independently of its translation status. Indeed, one could visualize that FMRP assembles
an mRNA into mRNP granules in cells upon their interaction. The RNA granules formed are
distinct from previously characterized stress granules and processing bodies. In particular,
they contain L7 protein of the large ribosomal subunit, in agreement with their translation
status being unaltered. Whether these granules are related to the natural RNA granules such as
neuronal granules or transport granule that have been observed in neurons and proposed to
play a role in mRNA transport and localization is unclear [22,23,24,25]. However it is
tempting to speculate that these properties could be of importance for the local protein
synthesis in the dendritic spine protuberances, the structure altered in Fragile X [26]. Indeed it
is known that FMRP is both synthesized and dephosphorylated upon metabotropic glutamate
receptor activation at the spines [27,28]. According to a conveyor belt model of mRNA
transport within dendrites [29], mRNAs are being continuously conveyed back and forth
throughout the dendritic arbor. Thus, a local increase of FMRP concentration at a given
activated spine or an increase of its RNA binding, would both cause a local aggregation of
mRNA and translation. As a consequence, an amplification of the local concentration of the
newly translated protein(s) would result. Meanwhile, the dephosphorylation of FMRP that
triggers its degradation would rapidly switch off the process [30,31].
It was recently shown that RNA binding proteins with low complexity (LC) domains could be
involved in intracellular RNA aggregations [32]. Since the RGG domain of FMRP could
potentially represent such a LC domain, we tested whether it was involved in the aggregation
process. The deletion of the domain itself (¨ -549) or a longer deletion (¨ -632) did not
affect the granule formation. Conversely, the RGG alone (527-632) or a longer fragment
(466-632) was not able to recapitulate the granule formation. At first glance these data seem
to suggest that the RGG region is not involved in the granule formation. The RGG is involved
in RNA binding though. Indeed, FMRP was shown to bind specifically to G-quadruplex RNA
structures [6] by its RGG domain [5]. The G-quadruplex is also one of the most frequent
binding site identified in the proposed mRNA targets of FMRP [1]. Previously, the RGG was
116
Figure 5: Role of FMRP subdomains in FMRP granule formation.
(B) Summary of FMRP granule formation for the different FMRP subdomains as observed in A.
shown to be necessary for the recruitment of FMRP into stress granules [14,33]. Therefore, in
light of these data our data suggest that in the wild type FMRP the RGG domain probably
needs to be bound to RNA to achieve RNA granule formation. In the case of the tethered
FMRP, the RGG could be swapped by the 4O-N22, compensating for its function.
The effect of FMRP-I304N mutant is more complex. The tethering enabled FMRP-I304N to
enter polysomes, suggesting that this defect of FMRP-I304N is related to its mRNA binding
alteration. However, even if forced to be present on a translated mRNAs, this mutant was not
able to form RNA granules. Structural studies have suggested that the I304N mutation maps
to the RNA binding pocket present in KH2 domain [34]. This residue is thus proposed to
contribute directly to the RNA binding of KH2. However, it is not completely clear whether
this mutant only disrupts RNA binding or if it also destabilizes other domains of the protein,
leading for instance to a loss of FMRP dimerization or other proteins interaction. Altogether
our results underline that both RGG and KH2 RNA binding domains are important for RNA
granule formation, but the KH2 unlike the RGG cannot be swapped. This dual binding of
FMRP may provide the molecular basis for nucleating the condensation of mRNAs that will
eventually assemble into the FMRP mRNA granules.
Acknowledgments
We thank the members of the Human Genetics group for helpful discussions and comments.
This work benefited from grant from Fondation Jérôme Lejeune to HM.
Material and methods

Plasmids
pTL 4O-FMRP and pTL 4O-FMRP-I304N were constructed from pTL1-Iso7 and pTL1-Iso7-
I304N encoding respectively FMRP isoform 7 (lacking exon 12) wild type and mutant I304N
[35,36] by linearizing them with EcoR1 and introducing a 562-nt PCR fragment produced
with :
primer forward (F): ggaattcaccatgtacccatacgatgttccagattacgctggaagcggttccggctctgacgcacaaacacgacgacgt
primer reverse (R) : ggtgaattcggagccgcttccggaaccgcttccaagcttgagctcgagcggt
using plasmid p4LambdaN22-mEGFP3-M9 [37] as template and introducing in phase in front
of FMRP, the HA tag followed by a GSGSGS flexilinker, four N22 peptides and another
GSGSGS flexilinker and cleaved at each end by EcoR1. Insertion of the correct sequence in
proper orientation was confirmed by sequencing with primer ggttattgtgctgtctcatc.
pRLTK-4BB was constructed with pRLTK (Promega) linearized with Not1 and ligated to the
annealed oligonucleotides
ggccagccctgaaaaagggctcgagccctgaaaaagggcaattgccctgaaaaagggcgtcgacgccctgaaaaagggc and
ggccgccctttttcagggcgtcgacgccctttttcagggcaattgccctttttcagggctcgagccctttttcagggct.
Plasmids with deletions were constructed using quickchange protocol with oligonucleotides
117
Figure S1 : Western blot analysis of FMRP subdomains with anti-HA antibody in Hela cells extracts (20 μg
total protein) transfected at 100,000 cells for 24h with pTL 4O-FMRP 0.1 μg. GAPDH is presented as loading
control.
designed as in [38] and using pTL 4O-FMRP as template. The primer sequences used for the
different constructs are given (numbering is with respect to the full length 632 aa protein, that
includes exon 12):
4O¨RGG (¨-549),
F: gagcttcctg/ttcaaaggaaacgacgatcactcccgaaca,
R: ttcctttgaa/caggaagctctccctctcttcctctgttgg
4O-¨Cter (¨-632),
F: gagcttcctgtaaactgcaggagctcggtaccagatctt
R: ctgcagtttacaggaagctctccctctcttcctctgttgg
4O-Cter-short (527-632),
F: cgaattcacc/cgcagaggagacggacggcggcgtgga
R: ctcctctgcg/ggtgaattcggagccgcttccggaaccgct
4O-Cter-long (466-632),
F: cgaattcacc/ggtcaaggaatgggtcgaggtagtagacct
R: ttccttgacc/ggtgaattcggagccgcttccggaaccgct
4O-¨Phos (¨-503),
F: tatacttcag/aatctgaccacagagacgaactcagtgatt
R: tggtcagatt/ctgaagtatatccaggaccgcgtctgccgt
Correct sequence was confirmed by Sanger sequencing.
Cell Culture and Transfections

HeLa cells were grown in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, 1 g/l glucose in
the presence of antibiotics at 37°C in 5% CO2. Four hours before transfection, 4 x104 cells
were plated into 24-well format plates in 500 μl of antibiotic-free medium. Transfections
were performed in triplicate with 1 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) as directed by the
manufacturer with 100 ng of pTL1-Iso7 or pTL1-Iso7-I304N, 200 ng of the reporter gene
(pRLTK, pRLTK-4BB) and 100 ng of the pFlashSV40 plasmid (Synapsys Solutions), coding
for the Firefly luciferase (Fluc) and used as normalizer.
Luciferase Assays
Rluc and Fluc activities were determined using Luciferase Assay System (Promega)
according to the manufacturer’s protocol. Assays were performed 24 h after transfection.
Cells in 24-well dishes were lyzed with 100 μl of reporter lysis buffer. Luciferase activities
were measured using a Lumat LB 9501 luminometer (Berthold). Rluc values were normalized
with Fluc control values.
Polysomes Preparation
HeLa cells washed twice in PBS 1x were lysed directly in 10-cm plates in lysis buffer (50
mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μg/ml cycloheximide, 40 U/ml
RNasin (Sigma), Mini Complete antiprotease EDTA free (Roche) and 1% NP-40). The
samples were centrifuged at 13,000 rpm at 4°C for 10 min and the clarified lysates were
loaded on 15–45% (w/w) sucrose gradients and separated by ultracentrifugation with a SW41
rotor (Beckman) at 36,000 rpm at 4°C for 2 h. Fractions of 500 μl were collected and A260
was measured using a continuous flow cell UV detector (GE Healthcare Life Sciences).
118
Polysomes of each fraction were precipitated with 2.5 vol of 100% ethanol at -20°C overnight
and by centrifugation at 13,000 rpm at 4°C for 20 min. Pellets were washed in 70% ethanol,
briefly dried, and resuspended directly in SDS loading buffer.
Western Blotting
After denaturation in the loading buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% glycerol,
1.4 M ß-mercaptoethanol, and bromophenol blue) for 3 min at 95°C, proteins present in each
polysome fraction were analyzed on a 6% SDS-polyacrylamide gel and immunoblotted onto
PVDF Immobilon P membrane (Millipore) in Tris-glycine-SDS/20% ethanol buffer for 1 h at
200 mA. Membranes were incubated overnight at 4°C with mouse anti-FMRP 1C3 1:10,000
[39]and then incubated 1h at room temperature with peroxidase-conjugated goat anti-rabbit or
goat anti-mouse antibodies (1/5000). Immunoreactive bands were visualized with ECL
reagent (Pierce).
Immunofluorescence and Fluorescent In Situ Hybridization

Cells for immunofluorescence (IF) and fluorescent in situ hybridization (FISH) were grown
on glass coverslips. Cultures were incubated at 37°C in 5% CO2. After two washes with PBS,
cells were fixed with PBS/4% paraformaldehyde (pH 7) at room temperature for 20 min.
Cells were then washed twice with PBS 1X and permeabilized with PBS/0.2% Triton-X for
10 min at room temperature. Cells for IF were washed with PBS and blocked for 1 h at room
temperature in PBS/0.1% Triton-X containing 5% BSA. Cells were incubated with primary
antibodies mouse anti-FMRP 1C3 1:1000, rabbit anti-hDcp1a 1:1000 (J. Lykke-Andersen,
University of Colorado), goat anti-TIA-1 1:1000 (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA), anti-ribosomal protein L7 antisera 1:1000 (Ziemiecki et al., 1990) or rabbit anti-
eIF4E (FL-217, tebu-bio Laboratories, Le Perray-en-Yvelines, France), 1:1000 diluted in
PBS/0,1% Triton-X overnight at 4°C. After three washes in PBS/0.1% Triton-X, cells were
incubated with indicated fluorescent secondary antibodies (1:500) for 1 h at room
temperature. Cells were washed three times at room temperature in PBS/0.1% Triton-X for 10
min and mounted in a Vectashield Mounting Medium with DAPI (1.5 μg/ml; Vector
Laboratories, Burlingame, CA). Oligo-dT probe was prepared with an oligonucleotide bearing
6 aminoallyl nucleotides and coupled with Alexafluor-488 ARES kit (Invitrogen). DsRed
cDNA Alexa-488 probe was prepared by random incorporation of aminoallyl-UTP by reverse
transcription with ARES kit and following manufacturer instructions. Fish probes were heated
1 min at 90°C in hybridization solution (2x SSC, 50% formamide, 30 μg E. coli tRNA, 0.02%
RNAse-free BSA, 2 mM vanadyl-ribonucleoside complexes, and 10% sulfate dextran) and
cooled rapidly on ice. Cells for FISH were rehydrated with 2xSSC/50% formamide during 5
min at room temperature and then hybridized with 20 ng of oligo-dT probe in hybridization
solution 12 h at 37°C in 40 μl. Cells were washed two times at room temperature in 2x
SSC/50% formamide for 20 min and mounted as above. All image acquisitions and
quantification of fluorescent signal intensities were performed using standardized settings on
a microscope (model DM4000 B, Leica) equipped with CCD camera (CoolSnap CF, color)
with 40x objectives. For granule quantification analyses, randomly selected images from each
experiment were analyzed by counting cells with granules among at least 100 cells.
119
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121
122
Chapitre IV : Identification d’une cible unique

Durant ma thèse, l’utilisation du CLIP sur des cultures primaires de neurones corticaux de
souris m’a permis d’identifier l’ARNm Dgkk comme la cible majoritaire de FMRP. Cette
cible n’a pas été identifiée par toutes les autres études réalisées à ce jour (Brown et al., 2001;
Miyashiro et al., 2003; Darnell et al., 2011; Ascano et al., 2012). Dans ce chapitre, je vais
revenir sur la stratégie utilisée et expliquer pourquoi l’ARNm Dgkk n’a pas été identifié
jusqu’à présent.
1- Le choix du matériel biologique

Pour sa validation, le CLIP a été réalisé en parallèle sur des extraits de cerveaux et de cultures
primaires de neurones. Bien que les extraits de cerveaux permettent d’immunoprécipiter plus
de matériel, seuls les extraits de neurones ont permis d’immunoprécipiter des ARN considérés
comme contrôles positifs significativement à partir des neurones Wt comparativement aux
contrôles négatifs et aux neurones Fmr1 KO. Nous avons remarqué qu’en immunoprécipitant
plus de matériels avec FMRP, on récupèrait d’avantages d’ARN aspécifiques et il était donc
très difficile de distinguer le bruit de fond d’un vrai signal. Puisque seuls les neurones
semblaient donner une immunoprécipitation spécifique, nous avons choisi de poursuivre le
reste des expériences sur les neurones, réalisant ainsi la première étude de CLIP de FMRP sur
des cultures de neurones pures. Notons que les autres études ont utilisé des extraits de
cerveaux ou des cellules non-neuronales (Brown et al., 2001; Darnell et al., 2011; Ascano et
al., 2012). Très peu d’études ont été réalisées sur la protéine DGKk, et il est proposé que son
ARNm est essentiellement exprimé au niveau des testicules et du placenta. Dgkk n’est donc
pas exprimée d’une façon ubiquitaire et son ARNm peut être absent dans les lignées non
neuronales utilisées par Ascano et al. (2012). Au niveau du cerveau, on détecte l’ARNm Dgkk
et on montre qu’il est présent dans les polyribosomes. De plus, après l’utilisation de la
puromycine l’ARN n’est plus traduit, indiquant son association aux polyribosomes actifs en
traduction. Les études de Brown et al. (2001), Miyashiro et al. (2003) et Darnell et al. (2011),
réalisées sur des extraits de cerveaux ou des neurones d’hippocampes, auraient pu détecter
l’ARNm Dgkk. Cependant, le gène Dgkk a été découvert en 2005, l’excluant ainsi des études
de Brown et al (2001) et de Miyashiro et al. (2003). De plus Miyashiro et al. ont réalisé la
technique APRA sur des neurones d’hippocampe alors qu’au laboratoire nous avons utilisé
des neurones du cortex. On ne peut pas exclure que la fonction de FMRP puisse être
123
différente en fonction des différentes régions du cerveau. En effet, les altérations de la

plasticité synaptique observées dans les souris modèles sont différentes entre hippocampe
(exagération de la LTD mGluR) et cortex (défaut de la LTP). Concernant l’étude de Darnell et
al. (2011), nous avons réalisé le CLIP sur des neurones au 8ème jour de culture. On pourrait
penser que l’âge des souris est important et que l’ARNm Dgkk n’est présent que durant un
temps précis au cours du développement. D’ailleurs les altérations des épines dendritiques
observées chez les souris modèles semblent apparaitre et disparaitre au cours du
développement (voir introduction). De plus, Darnell et al. ont utilisé les polyribosomes de
cerveaux de souris comme matériel de départ pour l’immunoprécipitation. Ils ont donc pu
perdre des cibles de FMRP, même si cette dernière est majoritairement dans les
polyribosomes. Enfin, Ascano et al. (2012) ont choisi de réaliser leur immunoprécipitation sur
des cellules HEK293 transfectées par FMRP. Les cellules HEK293 sont des cellules
embryonnaires rénales avec de nombreuses anomalies chromosomique et la surexpression de
FMRP induit la formation de granules de stress où elle est retrouvée avec la majorité des
ARNm ((Mazroui et al., 2002; Kim et al., 2006; Didiot et al., 2009) ; manuscrit 2). FMRP n’a
donc pas une localisation normale dans ces cellules et la présence de la quasi-totalité des
ARNm dans les SG rend difficile de distinguer entre signal et bruit de fond. Cette approche et
les résultats qui en découlent sont donc fortement criticables.
2- Notre stratégie utilisée

Au laboratoire, nous avons choisi l’utilisation du CLIP qui repose sur l’induction de liaisons
covalentes entre les protéines et les ARN avant la lyse des cellules et l’immunoprécipitation
de FMRP. Les liaisons covalentes induites en exposant les cellules aux UV ont l’avantage de
lier les ARN et protéines uniquement lorsqu’ils sont en contact direct. Un ARN présent dans
le voisinage d’une protéine mais sans être en contact direct avec elle ne serait pas lié à celle-
ci. La liaison covalente des ARN aux protéines permet de procéder à des lavages avec de
fortes concentrations en sels et détergents éliminant ainsi le maximum d’interaction non
spécifiques. Après la réalisation du CLIP, l’intégralité des ARN est récupérée puis amplifiée
avant d’interroger des puces à ADN. L’absence de l’identification de l’ARNm Dgkk et les
différences dans les cibles identifiées par les autres études dépendent en partie de la méthode
utilisée.
La stratégie de co-immunoprécipitation sans pontage covalent des ARN utilisée par Brown et
al. (2001) ne permet pas d’exclure les ARN associés aux autres protéines partenaires de
124
FMRP. En effet, FMRP est capable d’interagir avec différentes protéines de liaisons aux ARN
telles que ses deux paralogues FXR1P et FXR2P et d’autres protéines. Ces différentes
protéines peuvent réguler d’autres ARN non cibles de FMRP. Une immunoprécipitation sans
forte stringence de lavage ne permet donc pas d’éliminer ces autres protéines de liaisons aux
ARN et augmente les faux positifs. De plus, la lyse des cellules peut provoquer un
remodelage des complexes mRNP. Etant donné que les ARN ne sont pas liés covalemment à
FMRP, une perte ou une association des ARN peuvent donc s’opérer au moment de la lyse
(Mili and Steitz, 2004).
La technique APRA utilisée par Miyashiro et al. (2003) repose sur la détection directe des
ARN à proximité de l’anticorps dirigé contre FMRP. Elle ne permet donc pas la
reconnaissance des ARN non accessibles enfouis à l’intérieur des complexes mRNP. De
même, des ARN non cibles mais localisés à proximité de FMRP dans la cellule peuvent être
reconnus et constituer ainsi des faux positifs. Par ailleurs, à ma connaissance, depuis 2003 la
technique APRA n’a pas été utilisée par d’autres laboratoires ni pour d’autres protéines. De
plus, les puces à ADN utilisées en 2001 ou 2003 ne sont pas aussi complètes que les puces
actuelles.
Conscients des problèmes obtenus en 2001 et 2003, Darnell et al. (2011) et Ascano et al.
(2012) ont utilisé le CLIP. Contrairement au CLIP que j’ai réalisé au laboratoire, ces deux
études ont visé à identifier directement le site de fixation de FMRP sur les ARNm cibles.
Après l’immunoprécipitation de FMRP, un traitement à la RNase a été appliqué afin de
digérer les ARN de part et d’autre de FMRP, conservant ainsi uniquement les petites
séquences d’ARN protégées. Puis, ces fragments ont été copiés en ADN complémentaires
(ADNc) par transcriptase inverse et amplifiés par PCR avant d’être séquencés. Imaginons que
le site de fixation de FMRP soit une structure secondaire ou tertiaire et qu’il ne soit pas
complètement protégé par celle-ci, après digestion à la RNase, les sites récupérés ne seront
donc pas complets et au lieu d’obtenir une séquence linéaire par site qu’on pourrait
positionner à un endroit précis sur l’ARN correspondant, on obtiendra plutôt des petits bouts
de séquences distribués au hasard sur les ARNm. Le choix du traitement à la RNase est donc
crucial dans ce genre d’expérience et une forte perte des ARNm cibles peut être obtenue. De
plus, si les sites de fixations comportent des structures secondaires très stables, elles peuvent
bloquer les transcriptases inverses et empêcher la formation de l’ADNc nécessaire au
séquençage. En effet, il est connu que la structure G-quadruplexe est très stable en présence
125
d’ions K+ et la transcriptase inverse n’est pas capable de traverser cette structure (Schaeffer et
al., 2001). Il serait donc nécessaire de réaliser une transcriptase inverse en présence de Na+
qui déstabilise cette structure. Dans ces conditions, le signal provenant du bruit de fond
pourrait donc dépasser et masquer le vrai signal. L’étude de Darnell et al. (2011) n’a abouti à
aucun site consensus. L’étude d’Ascano et al. (2012) propose deux motifs de quatre
nucléotides communs entre les cibles mais l’affinité de ces sites avec FMRP (environ 100
nM) est 100 fois inférieure que la structure G-quadruplexe identifiée en 2001 (environ 1 nM)
et ces sites sont présents sur quasiment tous les ARNm. Ces résultats contradictoires et
ambigus pourraient donc refléter de nombreux biais liés aux techniques utilisées (digestion
des ARN, choix des cellules, surexpression de FMRP, technique de transcription inverse…).
Le choix de la RNase et les conditions de digestion sont donc des étapes critiques pour
récupérer correctement les sites de fixation d’une protéine de liaison aux ARN. Visiblement,
la reconnaissance des ARN par FMRP semblent être un phénomène délicat, nécessitant des
conditions précises de digestion afin de ne pas perdre les ARNm cibles. C’est pourquoi, au
laboratoire, nous avons choisi après le CLIP de garder les ARNm intacts pour l’étape
d’amplification suivie d’une hybridation directe sur puces à ADN. Par cette méthode, on
n’obtient pas directement les sites de fixation de FMRP sur les ARNm mais on limite
clairement la perte des ARNm cibles. En effet, même si le site de fixation est une structure
secondaire ou tertiaire, il est gardé intact jusqu’à l’hybridation sur puces. De plus, si le site de
fixation est une structure très stable rendant difficile son amplification, d’autres régions de
l’ARNm cible devraient être plus facilement amplifiable et un signal devrait apparaitre. Cette
méthode ne fournit que le nom des ARNm cibles mais elle nous a permit de découvrir que
FMRP reconnait d’une manière unique un ARNm. Il est maintenant plus facile de travailler
sur un seul ARN pour identifier le site de fixation de FMRP.
3- La méthode de normalisation
Il est important de souligner que nous avons réalisé le CLIP en parallèle sur des neurones de
souris Wt et Fmr1 KO. C’est uniquement la différence entre les deux conditions qui a été
prise en considération pour réaliser la normalisation des résultats. Les neurones KO ont donc
servi de contrôles importants pour réduire au maximum le bruit de fond qui a subsité malgré
les lavages à forte concentration d’ions. De plus, nous avons hybridé en parallèle les ARN
totaux afin de pouvoir rapporter chaque ARN immunoprécipité à son niveau global dans
chaque échantillon. L’utilisation de ces deux paramètres, avec toutes les valeurs de puces sans
126
rajout de filtres a été suffisante pour définir une liste d’ARNm spécifique et pour identifier
l’ARNm Dgkk comme cible majeure. Notons que quelque soit la normalisation utilisée, la
comparaison « CLIP Wt/CLIP KO » ou « CLIP/INPUT Wt / CLIP/INPUT KO », les valeurs
obtenues pour Dgkk restaient très fortement supérieures aux autres gènes.
En comparaison des autres études, seul Brown et al. (2001) ont pris en considération les
différences d’ARN obtenus après immunoprécipitation à partir de cerveau Fmr1 KO pour la
normalisation finale. Ils ont également rapporté le niveau de l’ARN immunoprécipité aux
ARN totaux mais uniquement à partir de cerveaux Wt, aboutissant à la normalisation
suivante : « IP/input Wt / IP KO ». Miyashiro et al. (2003), quant à eux, ont amplifié
directement les ARN à proximité de l’anticorps reconnaissant FMRP mais aucune
normalisation n’a été réalisée avec les neurones Fmr1 KO permettant d’éliminer le bruit de
fond. De même, Darnell et al. (2011) ont réalisé les séquences uniquement à partir
d’échantillons Wt et sans normalisation par rapport au KO. De plus, ils ne rapportent pas les
sites obtenus par rapport à la quantité totale. Enfin, Ascano et al. (2012) ont réalisé leur
technique de CLIP sur des cellules transfectées avec les différents membres de la famille FXR
et leur seul control négatif est le mutant I304N. Ce mutant n’est vraisemblablement pas un
bon contrôle négatif car il a encore la capacité de lier les ARN. En effet, la mutation I304N
est au niveau du deuxième domaine KH, mais rappelons que FMRP possède deux autres
domaines de liaisons aux ARN.
Les résultats des puces que nous avons obtenus pour le CLIP ont été validés par qPCR et par
des tests de compétition avec la structure G-quadruplexe in vitro. La structure G-quadruplexe
correspond au site de fixation de FMRP ayant la plus forte affinité. L’affinité de FMRP pour
l’ARNm Dgkk est au moins 10 fois supérieure à celle de la structure G-quadruplexe. Des
expériences sont en cours pour préciser le site de fixation sur l’ARNm Dgkk afin de
comprendre sa particularité et pouvoir ainsi expliquer cette reconnaissance unique par FMRP.
127
Figure 25. La réaction enzymatique des diacylglycérol kinases (DGK)
Les DGK phosphorylent le DAG (schématisé à gauche, avec deux acides gras en position sn1
et sn2) en position sn3 pour obtenir du PA (schématisé à droite). La réaction nécessite une
molécule d’ATP comme source de phosphate
Figure 26. Représentation schématique des isoenzymes DGK des mammifères

A, les 10 isoenzymes des mammifères sont divisés en 5 types différents. B, les isoenzymes de
type II incluant les variants d’épissages des DGK į et Ș. DGKț appartient à la classe II et
comporte un domaine unique riche en Pro/Glu en N-terminale et un domaine PDZ en C-
terminale
Chapitre V : L’importance des DGK et du PA par rapport au FXS
Chapitre V : L’importance des DGK et du PA

par rapport au FXS
Nos travaux permettent de proposer l’hypothèse fascinante que l’évolution aurait sélectionné
une protéine de liaison aux ARN (FMRP) pour réguler essentiellement un seul ARNm : Dgkk
(Diacylglycerol kinase kappa). A ce jour, très peu d’études ont été réalisées sur la fonction du
produit protéique de ce gène, mais il est surtout connu que la kinase DGKț appartient à une
famille de 10 isozymes DGK chez les mammifères (Sakai and Sakane, 2012). Ces enzymes
diffèrent par leur structure, leurs propriétés enzymatiques, leur localisation et leur expression
cellulaire. La fonction de ces enzymes est la phosphorylation du diacylglycérol (DAG) en
acide phosphatidique (PA), jouant un rôle essentiel dans la transduction du signal en modulant
l'équilibre entre ces deux lipides de signalisation (Figure 25) (Sakai and Sakane, 2012). Le
DAG est un diglycéride formé d’un résidu glycérol et deux acides gras liés de façon covalente
par des liaisons esters et un groupement hydroxyle libre. Le glycérol ayant les acides gras liés
aux positions sn1 et sn2 (sn 1,2 isomère) correspond à l’isomère du DAG produit
naturellement dans l’organisme (Dorp et al., 2013). La phosphorylation du groupement
hydroxyle par les DGK aboutit au phosphoglycéride PA. Notons que les DGK ont été
également identifiées dans les organismes unicellulaires comme les bactéries, mais ces DGK
sont différentes structurellement des mammifères et les DGK bactériens peuvent par exemple
phosphoryler d’autres lipides que le DAG (Cai et al., 2009).
1- Les domaines fonctionnels de la '*.ț

10 isoenzymes DGK (nommées Į, ȕ, Ȗ, į, İ, ȗ, Ș, ș, Ț et ț) ont été identifiées chez les
mammifères, classées en cinq groupes différents en fonction de leurs caractéristiques
structurales (Figure 26A) (Sakai and Sakane, 2012). La diversité des DGK peut être étendue
par l’existence d’isoformes de certaines de ces enzymes (ȕ, Ȗ, į, ȗ, Ș et Ț) (Cai et al., 2009).
Les DGK ont essentiellement deux éléments structuraux communs : un domaine catalytique et
au moins deux domaines riches en cystéines homologues du domaine C1 identifié en N-
terminale de la protéine kinase C (PKC). Le domaine C1, une petite entité structurale de 50
acides aminés (aa), permet la fixation du DAG ou son analogue ester de phorbol (Colón-
González and Kazanietz, 2006). Ce domaine joue un rôle important dans la translocation de la
PKC et d’autres protéines vers la membrane plasmique après la génération du DAG par
128
l’activation de récepteurs. Notons que le domaine C1 des DGK le plus proche du domaine
catalytique a une extension de 50 aa qui n’est pas présente dans les autres domaines C1 des
DGK ou dans d’autres protéines (Cai et al., 2009). De plus, les domaines C1 des DGK
semblent être différents des domaines C1 identifiés classiquement dans les effecteurs du DAG
tels que la PKC et la fonction de ces domaines dans la fixation du DAG et/ou protéines reste
indéfinie à ce jour. Le domaine catalytique des DGK fixe une molécule d’ATP nécessaire
pour la phosphorylation du DAG en PA et il est probable que ce domaine nécessite d’autres
motifs pour avoir une activité optimale de l’enzyme. En effet, des mutations en dehors du
domaine catalytique dans différents DGK réduisent d’une manière significative l’activité de
ces enzymes (Los et al., 2004). De plus, le domaine catalytique isolé de la DGKĮ a été montré
récapitulant seulement 1/3 de l’activité maximale de la protéine entière (Klauck et al., 1996).
En 2005, la recherche bioinformatique a permis d’identifier la dernière enzyme de la famille
connue à ce jour DGKț, appartenant à la classe II avec les isoenzymes DGKį et DGKȘ
(Figure 26B) (Imai et al., 2005). La phase codante du gène DGKK code pour une protéine de
1271 acide-aminés avec un poids moléculaire calculé de 142 kDa. En plus des deux domaines
C1, les isoenzymes de classe II ont la caractéristique de comporter un domaine d’homologie à
la pleckstrine (domaine PH) en N-terminal, quatre structures « coiled-coil » (des enroulements
de plusieurs hélices, présents essentiellement dans les protéines formant des fibres) et un
domaine catalytique scindé en deux parties. Le domaine PH (environ 120 aa) dans ces
enzymes a été montré fixer des phosphatidylinositols d’une manière faible et non sélective
(Cai et al., 2009). De plus, le domaine PH de la DGKį1 est nécessaire et suffisant pour une
localisation au niveau de la membrane plasmique de la protéine après stimulation des cellules
au TPA. Cependant, au niveau de la DGKț, ce même domaine n’intervient pas dans sa
localisation au niveau de la membrane (Sakai and Sakane, 2012). D’une manière intriguante,
DGKț comporte 33 répétitions du motif « Glu-Pro-Ala-Pro » (des répétitions EPAP, Glu48-
Pro179) au niveau de la région N-terminale. A proximité des répétitions EPAP, DGKț contient
également des régions riches en prolines (Pro24-Pro44) et cinq répétitions Ser-Pro (Ser196-
Pro205) (Imai et al., 2005; Sakai and Sakane, 2012). Ces différents motifs en N-terminal sont
uniques pour cette protéine et leur fonction reste inconnue à ce jour. A la fin de la région C-
terminale, DGKț comporte un domaine PDZ (Postsynaptic density protein-95/Disks
large/Zonula occludens-1), correspondant au module d’interaction protéine-protéine le plus
retrouvé dans les protéines des mammifères et il est particulièrement présent dans les
129
protéines neuronales (Imai et al., 2005; Chi et al., 2012; Sakai and Sakane, 2012). Les deux
autres DGK de la famille comporte un domaine SAM (Sterile Alpha Motif) en C-terminal qui
serait impliqué dans l’homo ou hétéro-dimérisation de ces deux DGK (į et Ș). Malgré une
forte similitude structurale avec les deux autres DGK du type II, DGKț n’est pas capable de
s’homodimériser et son activité catalytique décroit après un stress oxydatif (traitement au
H2O2), concentration et temps-dépendant. De plus, les différents enzymes n’ont pas la même
localisation cellulaire. En effet, DGKk se localise naturellement au niveau de la membrane
plasmique (observée dans les cellules HEK293 et COS7), grace à un domaine situé entre un
domaine coiled-coil et le PDZ. Des délétions progressives de la DGKț ont montré qu’une
petite séquence de la région C-terminal (1199-1268 aa) est nécessaire et suffisante pour sa
localisation au niveau de la membrane plasmique (Imai et al., 2005). Les deux autres DGK se
localisent au niveau de la membrane uniquement après stimulation des cellules par du TPA.
Concernant les résultats obtenus dans le manuscrit 1, FMRP pourrait jouer un rôle dans la
localisation ou la régulation de la traduction de l’ARNm Dgkk au niveau des épines
dendritiques, permettant de positionner correctement son produit protéique à proximité des
mGluR-I pour une production rapide de PA après stimulation de ces récepteurs.
Par ailleurs, les DGK de classe I (Į, ȕ et Ȗ) ont la particularité de comporter un domaine EF en
N-terminal qui permet de fixer le Ca++ et de les activer. DGKİ appartenant à la classe 3 est le
seul isoenzyme qui ne comporte pas de domaine de régulation, mais qui montre une
préférence pour l’arachidonoyl-DAG en position sn-2 (Figure 26A) (Tang et al., 1996). Les
DGK de la classe VI (ȗ et Ț) comportent 4 répétitions ankyrines, un PDZ et un signal de
localisation nucléaire (NLS) chevauchant avec une région homologue au site de
phosphorylation de la protéine MARCKS (myristoylated alanine-rich C-kinase substrate ;
correspondant à un substrat de la PKC) (Cai et al., 2009). La DGKș de la classe V comporte
un domaine C1 supplémentaire (trois en total) et un motif ressemblant au domaine PH. Les
DGK peuvent donc avoir différentes fonctions selon les domaines de régulation présents dans
ces kinases et selon leur localisation cellulaire et tissulaire.
2- L’implication des DGK dans le cerveau

Le peu de données existant dans la littérature sur la protéine DGKț propose que son ARNm
soit essentiellement détecté par RT-PCR au niveau des testicules et du placenta, faiblement
voire inexistant dans les autres tissus et dans les lignées tumorales (Imai et al., 2005). Comme
décrit dans le manuscrit 1, nous avons détecté et quantifié l’ARNm Dgkk par PCR
130
quantitative dans les neurones primaires de cortex. De plus, l’ARNm Dgkk est associé aux
polyribosomes et il se dissocie après induction de l’arrêt de la traduction par la puromycine,
suggérant la traduction active de cet ARNm dans le cerveau de souris. La comparaison du
profil de l’ARNm Dgkk dans les polyribosomes à partir de cerveaux de souris Wt et Fmr1 KO
ne montrent pas de différence significative. Il est donc difficile d’identifier un impact de
FMRP sur le profil des ARNm dans les polyribosomes d’une manière globale, et ceci même
en présence des inhibiteurs de la traduction. Comme décrit dans le manuscrit 1, l’impact
principal de l’absence de FMRP sur la cible majeure est identifié après activation des mGluR-
I, suggérant que l’effet de FMRP sur la traduction de l’ARNm serait essentiellement visible
après stimulation de ces récepteurs. C’est pourquoi, il serait intéressant de regarder le profil
des ARNm et en particulier celui de la DGKk dans les polyribosomes des neurones en culture
après activation des mGluR-I. La technique que j’ai mise au point durant ma thèse pour
quantifier le niveau d’ARNm dans les polysomes des neurones non stimulé permettra de
réaliser la même expérience après activation mGluR-I.
Etant donné que très peu d’informations sont disponibles concernant la DGKț dans la
littérature, le reste de cette partie sera consacré aux autres DGK étudiées au niveau du
cerveau. La plupart des DGK est exprimée d’une manière abondante au niveau du cerveau,
avec un niveau élevé des ARNm DGK ȕ, Ȗ, ȗ, Ț et ș. la DGKȕ est montrée exprimée au niveau
du noyau caudé, du noyau accumbens et de l’hippocampe (Goto and Kondo, 1993; Adachi et
al., 2005; Shirai et al., 2010). DGKȕ est absente à la naissance, mais elle est rapidement
exprimée entre 14 et 28 jours et localisée au niveau de la membrane plasmique des sites
périsynaptiques (Hozumi et al., 2008), suggérant son importance pour le réseau neuronal. La
DGKȖ est essentiellement localisée dans cellules de Purkinje et de l’hippocampe. Elle est
présente à la naissance, puis augmente progressivement (Goto et al., 1994; Adachi et al.,
2005). La DGKȗ est fortement exprimée au niveau du thymus et du cerveau, mais son niveau
est également abondant dans le muscle squelettique, le cœur et le pancréas (Bunting et al.,
1996; Goto and Kondo, 1996). Au niveau du cerveau, DGKȗ est essentiellement présente au
niveau du cervelet, de l'hippocampe et du bulbe olfactif (Goto and Kondo, 1996). DGKȗ est
détectée au niveau du noyau des neurones d’hippocampe, mais elle peut être déplacée vers le
cytoplasme après une excitotoxicité induite par du kainate (un modèle de la dégénération
neuronale) (Saino-Saito et al., 2011). DGKȚ est essentiellement exprimée dans le cerveau, en
particulier au niveau de l’hippocampe et du gyrus denté (Sommer et al., 2001). L'hybridation
131
Figure 27. Implication des DGK dans la fonction des synapses neuronales
L’activation de différents récepteurs induisent l’accumulation du DAG, notamment les
récepteurs mGlu de type I (mGluR-I). Les DGK phosphorylent le DAG pour terminer la
voie de signalisation de ce lipide et débuter celle du PA. La régulation du niveau de ces
deux messagers lipidiques au niveau des synapses modulerait la structure des épines
dendritiques (Almena and Mérida, 2011)
in situ G $51P '*.ș GDQV OH FHUYHDX GH UDW DGXOWH

évèle
U une forte expression dans le
cervelet et l'hippocampe (Houssa et al., 1997). Enfin, la DGKȘ est également essentiellement
exprimée au niveau du cerveau mais sa localisation précise n’est pas encore déterminée
(Klauck et al., 1996).
A ce jour, au niveau des neurones, quatre DGK (ȕ, ȗ, İ et Ț) ont déjà été montrées impliquées
directement dans la fonction des synapses en modulant la morphologie des neurones et/ou la
transmission synaptique (Figure 27). La souris Dgkȕ KO a été montrée présenter une
réduction de la LTP au niveau de la région CA1 de l’hippocampe, provoquant des altérations
des fonctions cognitives, notamment des défauts de la mémoire spatiale et à long terme lors
des tests de la piscine de Morris et le labyrinthe en Y (Shirai et al., 2010). Les neurones
d’hippocampes en culture des souris Dgkȕ KO ont été montrés présentant moins de
branchements et d’épines comparativement au Wt et cette altération a été corrigée avec une
surexpression de la DGKȕ (Shirai et al., 2010). En parallèle de cette étude, Kakefuda et al.
(2010) ont également montré que les souris Dgkȕ KO présentent quelques anomalies du
comportement, telles qu’une hyperactivité et une faible anxiété et l’administration du lithium
peut corriger ces phénotypes observés. Enfin, l’analyse de section de cerveau avec un
marquage au golgi a permis de révéler que la densité des épines neuronales du cortex est
réduite dans ces souris (Kakefuda et al., 2010). De même, les souris déficientes en DGKȗ
présentent également des défauts du nombre des épines (Kim et al., 2009a). La surexpression
de la DGKȗ aboutit à l’effet inverse avec une augmentation du nombre des épines
dendritiques d’une manière dépendante de l’activité enzymatique. Des études d’imagerie en
temps réel ont montré que la DGKȗ est nécessaire pour la stabilité des épines sans altérer leur
formation (Kim et al., 2009a). La DGKȗ est proposée être adressée vers les synapses
excitatrices via l’interaction à la protéine post-synaptique d’échafaudage PSD95 (Post
Synaptique Densité 95) par son domaine PDZ. En plus des altérations de la morphologie des
épines, les souris Dgkȗ KO présentent une exagération de LTP et une réduction de LTD au
niveau de la région CA1 de l’hippocampe (Lubec et al., 2012). Ces altérations de LTP et LTD
sont corrigées par l’inhibition de la phospholipase C (PLC) produisant le DAG. De même,
l’inhibition de la protéine kinase C (PKC) qui agit en aval du DAG est montrée corriger ces
altérations de la transmission synaptique (Lubec et al., 2012). Le KO d’un autre membre de la
famille DGK dans un modèle murin, DGKİ KO, a été montré présenter des réductions de LTP
au niveau du gyrus denté comparativement aux souris Wt renforçant le rôle de la
132
Migration Signalisation
Chimiotaxie Réorganisation Trafic et sécrétion Croissance
Cytokinèse du cytosquelette Réorganisation du cellulaire
Trafic cytosquelette
Figure 28. La génération du DAG et du PA

Le DAG est généré à partir de l’hydrolyse du PI(4,5)P2 par la phospholipase C (PLC). Il est
ensuite phosphorylé en PA par les DGK avant de subir une série de réactions pour restaurer
le niveau du PI(4,5)P2 suivant le cycle du phosphatidylinositol (PI). Une autre source de
DAG provient de la déphosphorylation du PA par la phosphatase PAP, généré par la
phospholipase D (PLD) à partir de la phosphatidylcholine (PC). Les fonctions cellulaires
attribuées aux différents lipides sont indiquées (Almena and Mérida, 2011).
phosphorylation du DAG en PA dans ces phénomènes (Rodriguez de Turco et al., 2001).

Enfin, la DGKȚ appartenant au même groupe que la Dgkȗ est également montré interagir avec
PSD95 lui permettant de se localiser au niveau des synapses. Les souris DGKȚ ne montrent
pas d’effet sur la morphologie des épines dendritiques mais ces souris présentent une petite
augmentation de la probabilité du relâchement de neurotransmetteurs à partir du
compartiment présynaptique. De plus, les souris DGKȚ âgées de deux semaines ont été
montrées présenter une réduction de la mGluR-LTD comparativement aux Wt probablement
via des mécanismes présynaptiques (Yang et al., 2011). Malgré la ressemblance structurale
des deux DGK (Ț et ȗ), la fonction proéminente de la DGKȗ est essentiellement au niveau du
compartiment postsynaptique alors que la fonction de la DGKȚ serait plutôt une régulation
présynaptique de la signalisation du DAG (Yang et al., 2011). L’ensemble de ces données
montrent que plusieurs DGK sont nécessaire au niveau des synapses pour réguler d’une
manière stricte la phosphorylation du DAG en PA et l’altération du niveau de ces messagers
lipidiques aboutirait à des anomalies de la structure des épines et de la transmission
synaptique. L’altération de ces processus correspond aux phénotypes cellulaires et électro-
physiologiques majeurs du FXS et la cause principale pourrait donc être expliquer par le
défaut de la phosphorylation du DAG en PA que nous avons pu observer dans les neurones
Fmr1 KO après activation mGluR-I (manuscrit 1). Nous proposons l’implication de la DGKk
dans ces défauts observés du FXS étant donné que son ARNm correspond à la cible majeure
de FMRP. Des études complémentaires telles que la réalisation d’une souris modèle de la
DGKk permettraient de confirmer le rôle direct de cet enzyme dans la morphologie des épines
et de la transmission synaptique. Notons que les ARNm des autres DGK de la famille ne
présentent pas de valeurs d’enrichissement aussi importantes que la DGKk avec le CLIP de
FMRP, suggérant que ces ARNm ne soient pas cibles de FMRP dans les neurones de cortex.
3- Les rôles du DAG et du PA dans la régulation des épines

La production du DAG dans les neurones peut être déclenchée par l’activation de différents
récepteurs membranaires qui fonctionnent via la voie de signalisation PLC-ȕ/Ȗ (Figure 28)
(Yang et al., 2013). La PLCȕ est généralement activée par les récepteurs couplés à la protéine
Gq/11 et la PLCȖ par les récepteurs à activité tyrosine kinase (Yang et al., 2013). Parmi ces
récepteurs, notons les mGluR-I couplés à la protéine Gq localisés essentiellement au niveau
de la membrane post-synaptique (de Jong and Verhage, 2009; Yang et al., 2013). La PLC
hydrolyse le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en deux seconds messagers, le
133
déstabilisation maintien
des épines des épines
Figure 29. Modèle d’organisation moléculaire des voies de signalisation du DAG et du

PA dans les épines dendritiques.
Les interactions protéines-protéines sont indiquées sur le schéma par un contact direct des
protéines. Les flèches indiquent des signalisations ou un effet direct. Les inhibitions sont
indiquées par des lignes bleues avec un trait perpendiculaire. Le relâchement du Rac1 est
indiqué par une flèche verte. Différents isoenzymes DGK sont impliqués dans la
réorganisation de la structure des épines mais seule la DGKȗ est présentée sur ce schéma
correspondant à l’isoenzyme le plus étudié (Kim et al., 2010).
DAG et l’inositol-1,4,5-triphosphate (IP3). Le DAG active différents effecteurs impliqués

dans plusieurs voies biologiques notamment la régulation de la structure des épines et l’IP3
permet le relâchement du calcium à partir du réticulum endoplasmique. Parmi les effecteurs
du DAG, notons la protéine kinase C (PKC) qui phosphoryle différents substrats et
majoritairement la protéine MARCKS (Myristoylated, Alanine-Rich C-Kinase Substrate)
(Figure 29). Calabrese et Halpain (2005) ont montré qu’un enrichissement de la forme
déphosphorylée de MARCKS favoriserait la stabilisation des épines (Calabrese and Halpain,
2005). La protéine MARCKS est proposée jouer un rôle important dans la régulation de la
plasticité du cytosquelette notamment des filaments d'actine. L’utilisation de l’ester de
phorbol (analogue de DAG) activant la PKC ou un mutant MARCKS phosphorylé
constitutivement (phospho-mimique) ou la réduction de MARCKS par ARNi ont été montrés
réduire la taille et la densité des épines dendritiques (Calabrese and Halpain, 2005). Un autre
effecteur du DAG est la protéine Į1-chimaerin qui via son domaine contrôlant les protéines à
activité GTPasique (GAP ; GTPase Activating Protein) est montrée inhiber la protéine Rac1,
une molécule clé dans le remodelage des filaments d’actine (Buttery et al., 2006). Le niveau
d’Į1-chimaerin au niveau des synapses a été montré contrôlé par l’activation synaptique et
l’augmentation de son expression est montrée associée à une perte des épines dendritiques et
des branchements. Cet effet nécessite le domaine GAP et la fixation au DAG. La suppression
d’expression d’Į1-chimaerin est montré associé à une augmentation de la croissance de
l’arbre dendritique et de la tête des épines (Buttery et al., 2006). Ces différentes données
suggèrent que les effecteurs du DAG seraient plutôt associés à la déstabilisation des épines
dendritiques. Le niveau du DAG au niveau des synapses doit être donc parfaitement contrôlé
d’où sa phosphorylation par les DGK en PA. Ce dernier est également un important messager
lipidique pouvant activer ou inhiber différents effecteurs pour réguler la structure des épines
(Almena and Mérida, 2011). Un nombre élevé d’effecteurs de PA a déjà été identifié incluant
PAK1 (p21-activated kinase 1), PI(4)P5-kinase (phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase),
PKCȗ, PKCİ, sphingosine kinase, Raf1 kinase, mTOR (mammalian Target Of Rapamycin),
PP1 (protein phosphatase 1), Ras GAP, Į1- et ȕ 2-chimaerin (Kim et al., 2010). La fixation du
PA sur ces effecteurs permettrait soit de réguler leur activité soit leur localisation cellulaire.
L’effecteur PAK1 est une kinase qui régule une variété de processus cellulaire incluant la
polymérisation d’actine (Bokoch, 2003). Au niveau des neurones, PAK1 est proposée réguler
positivement les épines dendritiques (Boda et al., 2006), un phénomène qui peut être expliqué
134
par l’activation de Rac1 en phosphorylant et en induisant la dissociation de son inhibiteur

RhoGDI (Rho guanine nucleotide dissociation inhibitor). En effet, le PA a été montré induire
le relâchement du Rac1 de RhoGDI permettant son activation (Chuang et al., 1993). PI(4)P5-
kinase, un autre effecteur activé par le PA, induit la production du PIP2 (appelé aussi
PI(4,5)P2) à partir du PI(4)P permettant de restorer le niveau du PIP2 qui a été hydrolysé par
le PLC pour produire le DAG (Cai et al., 2009). Les phosphoinositides sont montrés réguler
des processus cellulaires différents incluant la structuration du cytosquelette d’actine (Di
Paolo and De Camilli, 2006). En particulier, le PIP2 peut réguler directement différentes
protéines agissant sur l’actine telles que la profiline et l’Į-actinine. Ces protéines ont été
montrées réguler les épines dendritiques (Ackermann and Matus, 2003; Nakagawa et al.,
2004). L’ensemble de ces données montrent que le DAG et le PA sont tous les deux impliqués
dans la structure des épines dendritiques et leur niveau doit être précisément contrôlé au
niveau des synapses afin d’empêcher l’altération de ces structures. Un défaut de production
du PA dans les neurones FXS après mGluR-I pourrait donc expliquer les anomalies d’épines
dendritiques observées chez les patients FXS et les modèles animaux.
Notons qu’un autre lipide peut être produit à partir du DAG après activation mGluR-I, le 2-
arachidonoylglycerol (2-AG). Le 2-AG active les récepteurs endocannabinoides (eCB)
localisés au niveau de la membrane présynaptique. Un défaut du 2-AG a été observé dans les
préparations de synaptoneurosomes de souris FXS après activation mGluR-I (voir
introduction, chapitre II et III). Cet effet a été expliqué par un défaut de l’activité de la
diacylglycérol lipase Į (DGLĮ) due à l’absence de FMRP qui fixe son ARNm. Nous
observons un défaut du PA allant dans le même sens que le 2-AG. Plusieurs scénarios sont
possibles : première hypothèse, les protéines de liaisons aux ARN sont connus agir en opéron
c’est-à-dire réguler des ARN codant pour des protéines impliquées dans les mêmes voies
métaboliques et on peut donc penser que FMRP régulerait les deux ARNm Dgkk et Dgla.
Cependant les valeurs d’enrichissement de l’ARNm Dgla dans notre étude de CLIP sont
largement plus faibles que celles obtenues pour l’ARNm Dgkk, suggérant un impact
beaucoup plus important sur l’ARNm Dgkk en absence de FMRP que sur Dgla. Deuxième
hypothèse, l’altération de la protéine DGKk au niveau des synapses dues à un défaut de
traduction ou de la localisation en absence de FMRP peut altérer indirectement la présence
d’autres protéines telles que la DGLĮ et donc l’impact observé sur le 2AG serait due à un
effet indirect de l’absence de FMRP. Troisième hypothèse, la production du PA peut avoir un
135
effet positif sur l’activité de la DGLĮ et inversement. Des études complémentaires de l’effet
de FMRP sur l’ARNm Dgkk sont nécessaires pour comprendre l’effet observé sur le 2AG en
parallèle du PA.
4- L’implication du PA dans la régulation de la traduction

dendritique
La présence de matières premières est nécessaire pour permettre à la cellule d’augmenter sa
masse lors de la division cellulaire ou pour permettre aux neurones de remodeler la
morphologie des épines dendritiques lors de la plasticité synaptique (Polak and Hall, 2009).
Le complexe mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) contrôle ces phénomènes en
détectant le niveau de matières premières dans la cellule et en régulant la synthèse protéique
(Sharma et al., 2010). Non seulement, mTOR est sensible aux acides aminés, au glucose, à
l’ATP et à l’insuline mais sa stabilité et son activité dépend également du PA présent dans la
cellule (Foster, 2007, 2009, 2013). Classiquement, la voie PI3K/AKT est celle la plus étudiée
régulant l’activité du complexe mTOR, mais ce dernier reconnait également d’une manière
directe le PA via son domaine de fixation à la rapamycine permettant son activation (Fang et
al., 2001; Veverka et al., 2008). Cette reconnaissance permet de détecter si le niveau du
précurseur lipidique est suffisant pour déclencher la biosynthèse membranaire. Le niveau du
PA est donc important pour l’activité de mTOR contrôlant le remodelage de la membrane en
réponse d’un stimulus, par exemple lors de la prolifération cellulaire. Il est connu dans la
littérature que le niveau du PA est anormalement augmenté dans les cellules cancéreuses avec
en parallèle une suractivation du complexe mTOR (Foster, 2007, 2009, 2013). Le niveau du
PA dans la cellule pourrait donc contrôler directement l’activité de mTOR. L’utilisation des
inhibiteurs de la PLD sur des cellules cancéreuses réduit le niveau du PA avec une réduction
de la suractivation de mTOR, suggérant le rôle direct de la PLD dans ce phénomène. Bien que
la DGKș induit également la stimulation de mTOR (Avila-Flores et al., 2005), des données
suggèrent que les DGK en général inhiberaient plutôt son activité (Gorentla et al., 2011;
Takita et al., 2011). Il est proposé que la nature des acides gras (mono- ou poly-insaturés)
présents dans le PA généré à partir du DAG régulerait différemment mTOR (Foster, 2013).
Dans tous les cas, le PA et les DGK semblent jouer un rôle important dans la régulation de ce
complexe. Dans les neurones, mTOR peut être activé par la stimulation des récepteurs
métabotropiques au glutamate (mGluR) aboutissant au contrôle de la traduction coiffe-
136
dépendante et la LTD-mGluR (Sharma et al., 2010). Il est montré dans la littérature que les
souris Fmr1 KO présentent une exagération de la voie de signalisation mTOR avec en
parallèle une augmentation de la traduction générale (Dolen et al., 2007; Sharma et al., 2010).
Nous avons montré dans le manuscrit 1 que les neurones KO présentent un défaut de
production du PA après stimulation mGluR-I. Ce défaut pourrait donc expliquer la
suractivation de la voie mTOR et suggérer ainsi que l’augmentation de la traduction globale
serait secondaire au défaut de synthèse de PA.
137
138
La fonction majeure de FMRP proposée à ce jour est sa capacité de lier des ARNm et de
réguler leur métabolisme au niveau des synapses. Il est admis dans la littérature que la
dérégulation de l’expression des cibles ARN de FMRP est la cause des anomalies des épines
dendritiques et de la transmission synaptique responsable des troubles cognitifs et
comportementaux des patients X fragile. Les efforts de nombreux laboratoires pour identifier
les cibles de FMRP ont identifié des centaines voire des milliers d’ARNm. Parmi ces ARNm,
seuls quelques-uns ont pu être confirmés mais la quasi-totalité n’a pas été validée
biochimiquement ni n’a de réel impact physiologique par rapport au FXS. De plus, la spécifité
de reconnaissance des ARN par FMRP est sujette à contradiction, avec différents sites de
fixations proposés. Ces résultats ambigus probablement dus aux différentes stratégies utilisées
ont conduit à proposer la présence de FMRP dans différents complexes ribonucléoprotéiques.
Un des challenges majeur de mon projet de thèse était d’établir une technique pour récupérer
les ARNm associés à FMRP et identifier sans les perdre ses cibles majeures. Après avoir testé
différents matériels biologiques et plusieurs anticorps, la réalisation du CLIP à partir des
neurones purs en culture m’a permi d’obtenir des résultats spécifiques et surtout d’identifier
l’ARNm Dgkk comme cible unique de FMRP et ignorée à ce jour. Cette découverte
surprenante nous a permi de nous interroger sur la particularité de cet ARNm et surtout de
proposer comment la dérégulation du produit protéique de cet ARNm pourrait participer à la
physiopathologie de l’X fragile. DGKț est une kinase permettant de contrôler le niveau du
DAG en le phosphorylant pour obtenir du PA. Cette enzyme appartient à une grande famille
de DGK chez les mammifères indiquant que le niveau du DAG et du PA dans la cellule doit
être parfaitement régulé. Une perturbation de la concentration de ces lipides peut provoquer
différents troubles des processus biologiques en fonction du type cellulaire. Au niveau des
neurones, le DAG et le PA ont été montrés participer au remodelage de la structure des épines
dendritiques en modulant leur taille et leur densité (Almena and Mérida, 2011). A ce jour 4
DGK ont déjà été montrées impliquer dans la morphologie des épines dendritiques et les
souris KO de ces isoenzymes présentent des troubles cognitifs et comportementaux. Le DAG
et le PA sont deux seconds messagers lipidiques permettant de déclencher différentes voies de
signalisation impliquée dans la production de la membrane et le remodelage du cytosquelette
d’actine. Au niveau des compartiments postsynaptiques, le niveau du DAG est fortement
139
augmenté après stimulation des mGluR-I pour répondre à une activation synaptique. Ces
récepteurs aux glutamates sont directement impliqués dans les phénotypes X fragile, mais le
lien avec la fonction de FMRP est à ce jour incompris. Alors que la plupart des études
proposées dans la littérature se sont concentrées sur les cascades de phosphorylation de
protéines produites après activation mGluR-I pour aboutir à la régulation de la traduction
locale, très peu d’études se sont concentrées sur les voies qui peuvent être déclenchées par la
production du DAG. Pourtant le DAG est un des premiers lipides et seconds messagers
produits après activation mGluR-I. L’identification de l’ARNm Dgkț comme la cible unique
de FMRP nous a incité à quantifier le DAG et le PA dans les neurones Wt et KO. Bien que le
niveau du DAG soit augmenté de la même manière entre les neurones Wt et KO après
activation mGluR-I, un défaut robuste de production du PA est observé en absence de FMRP.
De plus, le niveau du DAG à un niveau basal semble être significativement augmenté dans les
neurones KO compartivement au Wt. Ces résultats montrent que les neurones KO ne sont pas
capables de terminer correctement la voie de signalisation du DAG et d’initier celle du PA au
moment de la stimulation synaptique. Le remodelage des épines dendritiques responsable de
la plasticité synaptique s’opère au moment de l’activation synaptique. Le défaut du PA
observé dans les neurones KO pourrait donc expliquer les anomalies des épines dendritiques
observées chez les patients et modèles animaux FXS. Par ailleurs, ces résultats remettent en
cause la théorie mGluR de l’X fragile proposant que FXS est du à une exaggération du niveau
global des protéines synaptiques. En effet, nous n’observons pas une exagération du PA dans
les neurones FXS mais un défaut de production de ce lipide, indiquant un manque de l’activité
DGK.
En perspective, il sera important de quantifier le PA neuronal à différents stades du

développement et à partir de préparations de synaptoneurosomes où l’effet est peut être
encore plus marqué. En effet, nous observons un défaut du PA au 8ème jour en culture des
neurones et il serait intéressant de le quantifier au 14ème jour quand les neurones sont plus
ramifiés et ont plus d’épines dendritiques. Il serait également intéressant de mesurer le PA sur
des échantillons post-mortem de cerveaux de patients X fragile pour voir une éventuelle
perturbation à long terme. En effet, un individu subit des stimulations synaptiques différentes
au cours de la vie et une accumulation différentielle du PA entre un individu sain et FXS
pourrait donc être observer sur des cerveaux post-mortem. De plus, nous pouvons envisager
d’administrer du PA ou du DAG à des neurones en cultures et regarder si la morphologie des
140
A
présynapse
postsynapse
soma
épine dendrite
dendritique
Polyribosomes
Interacteurs nucléaires
noyau Interacteurs cytoplasmiques
Nucléo-cytoplasmiques
B ADN
mGluR de type I
D’autres récepteurs
Actif en traduction
Figure 30. Modèle d’action de FMRP dans les neurones.

A, à un état non stimulé : FMRP accompagne son ARNm cible sans impacter son
expression ou son transport dans les dendrites.
B, après stimulation synaptique (activation des mGluR-I) : FMRP traduite au niveau des
synapses peut séquestrer son ARNm cible dans des granules permettant ainsi une
traduction locale active. A la fin de la stimulation synaptique, FMRP est dégradée, libérant
ainsi l’ARNm cible des épines dendritiques et réduisant la traduction locale.
épines peut être modifiée. De même, nous pouvons envisager d’administrer ces deux lipides
aux cerveaux de souris Fmr1 KO et de regarder si les défauts de LTD et LTP dans ces souris
peuvent être corrigés. En effet, la LTP a été montré réduite au niveau du cortex des souris
Fmr1 KO, un phénomène qui peut être expliqué par un manque de PA après activation
mGluR-I. Enfin, concernant la DGKț, très peu d’expériences ont été réalisées sur cette
kinase. Il est important de préciser son expression dans les différentes régions du cerveau et
de réaliser un modèle murin KO de ce gène. Nous pouvons ainsi étudier l’impact direct de la
DGKț sur les épines dendritiques et la transmission synaptique. D’un point de vue
moléculaire, l’identification de l’ARNm Dgkț comme celui ayant la plus forte affinité avec
FMRP nous incite à identifier le site de fixation de FMRP sur cet ARN et à analyser ses
caractéristiques particulières. Par ailleurs, le rôle exact de FMRP dans le métabolisme de cet
ARNm reste à étre déterminé. En effet, le profil de l’ARNm DGKț dans les polyribosomes
est identique dans le cerveau de souris Fmr1 comparativement au Wt, suggérant que FMRP
n’a pas d’effet sur l’expression de cet ARNm à un niveau non stimulé. Un effet de FMRP sur
cet ARNm ou sur son produit protéique pourrait être observé après activation mGluR-I
(expériences en cours). L’étude du manuscrit 2 montre que forcée FMRP à interagir avec un
ARN induit sa localisation dans des granules sans impacter sur l’expression de l’ARN cible.
Ces résultats suggèrent que FMRP en soi n’a pas la capacité d’inhiber ou d’activer
l’expression de ces ARNm cibles et qu’elle a besoin d’être dans un contexte bien particulier
pour pouvoir avoir un impact fonctionnel. La fonction principale de FMRP pourrait donc être
une fonction de chaperonne, permettant de localiser l’ARNm cible à un endroit précis de la
cellule pour pouvoir répondre à une activation synaptique. L’identification de l’ARNm DGKț
comme la meilleure cible identifiée à ce jour devrait permettre enfin de comprendre la
fonction moléculaire de FMRP.
Un modèle d’action de FMRP dans les neurones (Figure 30)

L’ensemble des données de la littérature et de nos travaux m’ont permis de proposer un
modèle d’action de FMRP dans les neurones : A un niveau non stimulé, FMRP serait présente
dans différentes particules mRNP incluant les polyribosomes et les granules neuronaux où
elle serait plus particulièrement associée à l’ARNm Dgkk (résultat I). Dans ces granules,
FMRP n’aurait aucun impact sur l’expression ni sur le transport des ARN et elle ne ferait que
suivre son(ses) ARNm cible(s) d’une manière passive (résultats II et III). Un modèle dans la
littérature propose que les ARN au niveau des dendrites seraient transportés en continu
141
suivant le modèle « d’un tapis roulant dans un restaurant de sushi » où les ARN qui ne sont
pas retenus retourne au niveau du corps cellulaire (Doyle and Kiebler, 2011). Dans le modèle
d’action de FMRP, cette dernière suivrait les ARN au cours de leur trajet au niveau des
dendrites sans impacter leur métabolisme (Dictenberg et al., 2008; Subramanian et al., 2011).
Lors d’une stimulation synaptique, un besoin supplémentaire d’ARNm serait nécessaire pour
permettre une traduction locale (Weiler and Greenough, 1993). Nous avons observé lors de
l’utilisation d’un système « tethering » que FMRP a la capacité de s’aggréger dans des petits
granules sans impacter l’expression de l’ARNm cible, et la surexpression de FMRP induirait
la formation de granules de plus grandes tailles (résultat III). L’association de FMRP sur son
ARNm cible permetterait donc de le concentrer dans des granules spécifiques. Par ailleurs,
FMRP a été montrée traduite après activation mGluR-I au niveau des synapses (Weiler et al.,
1997; Weiler and Greenough, 1999; Greenough et al., 2001). L’augmentation locale de la
concentration de FMRP permettrait d’agréger son ARNm cible au niveau des synapses et
l’empêcherait ainsi de quitter l’épine pour repartir vers le corps cellulaire. Cette séquestration
de l’ARNm permettrait ainsi une traduction locale de la cible de FMRP. Après un certain
temps de stimulation synaptique, FMRP a été montrée dégradée aux niveaux des synapses
(Nalavadi et al., 2012). Cette dégradation détruirait les granules formées par FMRP et
permettrait ainsi la libération de l’ARNm cible afin de reprendre le « tapis roulant » réduisant
ainsi la traduction locale. En absence de FMRP, tel est le cas du FXS, il n’y aurait pas de
différence sur l’expression ni sur le transport des ARNm cibles à un niveau non stimulé des
neurones (résultat II, III, (Dictenberg et al., 2008; Subramanian et al., 2011)). Après
stimulation des mGluR-I et/ou d’autres récepteurs, FMRP ne serait plus présente pour
concentrer les ARN au niveau des épines et le niveau du transport et de la traduction
resteraient donc inchangés dans les neurones Fmr1 ((Weiler et al., 2004; Dictenberg et al.,
2008; Subramanian et al., 2011)). Nous pouvons donc souligner que la concentration de
FMRP dans la cellule devrait être régulée finement et la structure confinée des épines
permettrait de concentrer localement FMRP. FMRP n’aurait donc pas un effet à un niveau
non stimulé mais sa présence sur l’ARN serait importante pour permettre une agrégation
rapide des ARNm cibles au niveau des épines après activation mGluR-I (résultat I).
142
Annexe
Annexe
143
Publication 1
Publication 1
144
scientific report
scientificreport
G–quadruplex RNA structure as a signal for neurite

mRNA targeting
Murugan Subramanian1, Florence Rage 2, Ricardos Tabet1, Eric Flatter1, Jean-Louis Mandel1 & Hervé Moine1+
1Institut
de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), CNRS, UMR7104, Inserm, U596, Collège de France,
Strasbourg University, Illkirch-Graffenstaden, and 2Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, UMR5535, Montpellier, France
Targeting of messenger RNAs (mRNAs) in neuron processes relies element, usually located in the 30 -untranslated region (UTR) of the
on cis-acting regulatory elements, the nature of which is poorly mRNAs (Hirokawa et al, 2009; Mili & Macara, 2009). However,
understood. Here, we report that approximately 30% of the best- the mechanism by which this process occurs is poorly understood.
known dendritic mRNAs contain a guanine (G)–quadruplex In a few cases, a small sequence could be defined as the cis-acting
consensus in their 30 -untranslated region. Among these mRNAs, element involved in mRNA localization. Among the best-known
we show by using RNA structure probing that a G–quadruplex is examples are the ‘zipcode’ of b-actin mRNA—a 54-nucleotide-
present in the mRNAs of two key postsynaptic proteins: PSD-95 long AC-rich element bound by zip code binding protein 1
and CaMKIIa. The G–quadruplex structure is necessary and (Huttelmaier et al, 2005)—and the cytoplasmic polyadenylation
sufficient for the potent and fast localization of mRNAs in cortical element (CPE), a UUUUAU sequence or similar, found in CaMKIIa
neurites and this occurs in a metabotropic glutamate receptor- and other mRNAs that is bound by CPEB1 (Huang et al, 2003).
responsive manner. Thus, G–quadruplex seems to be a common However, these elements have been shown to be important for
neurite localization signal. localization in few mRNAs; thus, for most mRNAs localized in
Keywords: mRNA trafficking; Guanine–quadruplex; PSD-95; dendrites, the cis-acting signal involved remains unknown.
CaMKIIa; FMRP Fragile-X mental retardation protein (FMRP) was recently
EMBO reports (2011) 12, 697–704. doi:10.1038/embor.2011.76 proposed to be a trans-acting factor in the activity-dependent
localization of several neuronal mRNAs (Dictenberg et al, 2008).
INTRODUCTION The number of mRNAs affected by this localization is unknown
The transport of messenger RNAs (mRNAs) within cells is and the way in which FMRP interacts with these localized mRNAs
important for the establishment and conservation of cell polarity has also not been investigated. Previously, we and others have
(Hirokawa et al, 2009; Holt & Bullock, 2009). In neurons, the shown that FMRP binds to intramolecular guanine (G)–quadruplex
transport of specific mRNAs away from the soma to the dendrites (or G-quartet) RNA structures (Darnell et al, 2001; Schaeffer et al,
or the axons has been shown to occur for several genes translated 2001). Intramolecular G–quadruplexes are self-assembling, stable
locally at synapses or at axonal growth cones, respectively (Besse nucleic-acid structures that are proposed to occur in a number
& Ephrussi, 2008; Andreassi & Riccio, 2009; Martin & Ephrussi, of genes, both at the DNA and RNA levels, and are involved
2009). Transport and localization of mRNAs to the dendrites is in several regulatory processes including telomere stabilization,
one preliminary step in the control of local protein synthesis, a key promoter control, recombination and translation control (Lipps &
process for the lasting activity-dependent changes that take place Rhodes, 2009). We tested whether the G–quadruplex structure,
at synapses (Sutton & Schuman, 2006; Bramham & Wells, 2007; the canonical binding site of FMRP, could represent a cis-acting
Costa-Mattioli et al, 2009). The targeting of mRNAs in neurites is signal for localization of mRNAs in the processes of mouse cortical
proposed to rely on protein motors (for example, kinesins) neurons. We first report the presence of G–quadruplex consensus
complexed with diverse trans-acting factors and RNA-binding in a high proportion of dendritic mRNAs and provide experimental
proteins that interact with the RNA to be transported through cis- evidence of the presence of G–quadruplex in the 30 -UTR of
two well-known, dendritically localized mRNAs (PSD-95 and
1IGBMC
CaMKIIa) to show that G–quadruplex are neurite localization
(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire), CNRS,
UMR7104, Inserm, U596, Collège de France, Strasbourg University, elements.
Illkirch-Graffenstaden 67404,
2Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, UMR5535, Montpellier 34293,
France RESULTS AND DISCUSSION

+Corresponding author. Tel: þ 33 388653258; Fax: þ 33 388653201;
G–quadruplex structures in PSD-95 and CaMKIIa mRNAs
E-mail: [email protected] We have previously shown that the intramolecular G–quadruplex
Received 2 February 2011; revised 16 March 2011; accepted 31 March 2011; consensus (GX3N06)4 is a potent binding site for the FMRP
published online 13 May 2011 protein (Schaeffer et al, 2001; Didiot et al, 2008). By using
&2011 EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY ORGANIZATION EMBO reports VOL 12 | NO 7 | 2011 6 9 7

scientific report G–quadruplex as neuritic ‘zipcode’
M. Subramanian et al
the bioinformatic tool QGRS-mapper (Kikin et al, 2008) and Table 1 | Presence of G–quadruplex consensus (GX3N06)4 in the
visual inspection, we found that about one-third of the most 30 -UTR of known dendritic RNAs
well-characterized dendritic RNAs (11/34) have a (GX3N06)4 Gene G–quad- G–quadruplex sequence
consensus in their 30 -UTR that is conserved between humans ruplex in
and rodents (Table 1; supplementary Table S1 online). This 30 -UTR*
ratio seems to be significantly higher than that found in the b-Actin
general mRNA population, in which less than 5% of mRNAs APP + GGGGCGGGTGGGGAGGGG
from a 500-member random pool have this consensus in their
Arc (Arg3.1)
30 -UTR (supplementary Table S2 online). From the short
list of dendritic RNAs, two mRNAs—PSD-95 and CaMKIIa—that BDNF + GGGGATGGGGGATGGGGGG
have been proposed to be controlled by FMRP (Todd et al, Calmodulin
2003; Zalfa et al, 2007; Dictenberg et al, 2008) were retained for a-CaMKII + GGGGGGGCGGGTGGGATGGGAAGAAGGGG
further investigation.
CREB
The presence of G–quadruplex structures in PSD-95 and
CaMKIIa 30 -UTRs was indicated by a reverse transcription (RT) Dendrin + GGAGGGCAGGGTAGGGTAGGG
assay (Fig 1A; supplementary Fig S1A online) and confirmed FMRP
by a T1 RNase protection assay (supplementary Fig S1B online). G protein + GGGAGGGCTGGGGCTTCGGG
The presence of G–quadruplex structures also agrees with the gamma 7 sub.
reactivity pattern of the RNAs submitted to enzymatic and GABA-A-R-g
chemical probes that enabled the establishment of secondary
GLRA1 + GGGGGAGGCTGGGAGAGGGGAACGTGGG
structure models of the 30 -UTRs (Fig 1B,C). In both mRNAs,
InsP3R1
the G–quadruplex motif occurred within 100 nucleotides of the
30 end. Apart from the G–quadruplex, a single-stranded U-rich Ligatin
region upstream and a paired U-rich region downstream MAP1b
(forming a hairpin with polyadenylation signal) were the only MAP2
features in common between the secondary structures of the
MRG15
30 ends of the two mRNAs. The most noticeable difference (MORF4L1)
between the mRNAs is that three independent G–quadruplex
Neurogranin
can occur simultaneously in PSD-95 instead of only one in
CaMKIIa. The fact that the G–quadruplex-forming sequences of Neurofilament
protein 68
the two mRNAs are highly conserved among mammals (supple-
mentary Fig S2 online) suggests that they are biologically NEURL + GGGATGGGCCAGGGCCCTGGGTGGG
important. NMDAR1
Pcp2(L7)
G–quadruplex sequences are neurite-targeting elements
PEP19
Both PSD-95 and CaMKIIa mRNAs have been shown to localize to
dendrites (Burgin et al, 1990; Zalfa et al, 2007) and the 30 -UTR of PSD95 (DLG4) + GGGGAAAAGGGAGGGATGGGTCTAGGGAGT
GGGAAATGCGGGAGGGAGGGTGGGGG
CaMKIIa has been shown to be involved in the localization GCAGGGGTCGGG
process (Mayford et al, 1996; Mori et al, 2000; Huang et al, 2003).
RGS5
To assess the potential role of the G–quadruplex motif in dendritic
RNA localization, we used the lN-GFP system (Daigle & SAPAP4 + GGGCGGGGTAGGGGAGGGCAGGGG
(DLGAP4)
Ellenberg, 2007), which allows visualization of the subcellular
localization of a reporter RNA in fixed or live cells by GFP Shank1 + GGGAGGGTCACGGGAGGGGGGAGGGGyGGGG
TTGGGGAGGGTGTAGGGGGTGGGGGTGGGGGT
labelling (Fig 2A). By using this system, we visualized the GGAAGGAGAGGGGAGAGGGAAGGGGGAGGG
localization of a reporter mRNA bearing the 54-nucleotide
Shank3 + GGGGCGGGAGGTGCCGGGGGTGGGGyGGGGG
dendritic targeting element ‘zipcode’ of the b-actin mRNA GAGGGGGGAGACATTGGGyGGGGTGGGGGG
(Kislauskis et al, 1994) in the neurites of living (supplementary CCCTGGG
Fig S3 online) or fixed (data not shown) neurons. DsRed gene TrkB
encoding reporter mRNAs bearing the full-length 30 -UTR of PSD- Vasopressin
95 or CaMKIIa were transfected into primary cortical neuron (AVP)
cultures. Both reporter mRNAs localized in the processes of Oxytocin (OXT)
neurons (Fig 2B, PSD95-812, CaMKIIa-3112) as efficiently as
BC1
the zipcode-bearing mRNA, confirming the role of CaMKIIa
30 -UTR and demonstrating that of PSD-95 30 -UTR. This localiza- Ribosomal RNAs
tion was confirmed in parallel by in situ hybridization of a tRNAs
multilabelled fluorescent DNA probe on the same mRNAs
*G–quadruplex fulfilling consensus (GX3N06)4 predicted with QGRS-mapper
(Fig 2C). (Kikin et al, 2008) and visual inspection are conserved between human and rodents.
To assess their role in neurite RNA localization, the G–quadruplex- References and additional data are provided in supplementary Table S1 online.
forming sequences of PSD-95 and CaMKIIa 30 -UTRs were deleted UTR, untranslated region.
6 9 8 EMBO reports VOL 12 | NO 7 | 2011 &2011 EUROPEAN MOLECULAR BIOLOGY ORGANIZATION

G–quadruplex as neuritic ‘zipcode’
M. Subramanian et al scientific report
A PSD95 CaMKIIa AG
G A
812 812ΔG Gq 3112 3112ΔG Gq A G
G U
K Li K Li K Li K Li K Li K Li U G
Top Top U A
780 U A
717 3,059 U A
C G
U G
A A U
G G A
G A
U A
B G C U G
A U U A
PSD95 730 C G U G
C G AA U A
700 C
U U C C GU A A
U C A A G C U A
U A G 717 A U U G
U A A U A U A CA U C
U G G 750 U A
U G G G G G G G G G G G G G
G C A U
U G G G G G G G G G G G G G G C ARE 812
U A 3′
5′ U G G G G G G G G G G G G G U C G C
C U (A)n
U C C U
U A G A U A A A G G G G U C U UGA
U U
U U A CU A G G G U G U A
UU U C U
U A U G G C A
U PSD95-Gq U GC
U U U G U
760
C C U
G U
C A U U 3,090
A U G U
G U G C
U G U A G
3,010 A C 3,020 U G U
A U C G
G C 3,080 U A
U A U A
CaMKIIa U A A U
CPE2 U U HEX
C A A
A C U A
A U U A
G U G U
U U U A
3,000 G C 3,070 C G
U U U
G G G A G C
C G
G G G G C U
G C 3,059
U A A
G U G G G G
G C
U A G G G G A
A 3,112
G C G G G G G A
U U A
A U A A U
G A U
U U
2,990 U CaMKIIa-Gq (A)n
A 3′
U
U
U U
CPE1 U U
C U U
U C U
5′
27x
Fig 1 | G–quadruplex structures are present in the 30 -UTR of PSD-95 and CaMKIIa mRNAs. (A) K þ -dependent RT arrest in PSD-95 (human)
and CaMKIIa (rat) 30 -UTR full-length transcripts (PSD95-812 and CaMKIIa-3112, respectively). Numbering from the first 30 -UTR nucleotide.
K, 150 mM KCl; Li, 150 mM LiCl. Deletion of Gq-forming sequences eliminates the RT arrests (PSD95-812DG, CaMKIIa-3112DG), whereas Gq-forming
sequences only (PSD95–Gq, CaMKIIa–Gq) are sufficient to arrest RT. Secondary structure models of the 30 end of PSD95 (B) and CaMKIIa (C)
mRNAs deduced from enzymatic (RNase T1 and V1) and chemical probing (CMCT and DMS) as described in the supplementary Methods online.
Triangles and circles connected to the line are RNase V1 and T1 cleavages, respectively. Circles around nucleotides are CMCT (G,U) or DMS (A,C)
modifications. Symbol thickness is proportional to the degree of reactivity (strong, moderate or weak). Nucleotides without symbol are unreactive or
undetermined. Dotted arrows indicate the start position of RT performed to analyse the RNA structure. The thick arrows indicate the strong stops
of RT at the 30 end of Gq structure, as in (A). The regions framed with thick dotted lines are the minimal Gq-forming sequence. Polyadenylation
site (HEX), CPE as defined in Huang et al (2003), AU-rich sites (ARE) as proposed in Zalfa et al (2007), are indicated. ARE, AU-rich element;
CMCT, 1-cyclohexyl-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluene sulphonate; CPE, cytoplasmic polyadenylation element; DMS, dimethyl
sulphate; Gq, guanine–quadruplex; HEX, hexamer motif; mRNA, messenger RNA; RT, reverse transcription; UTR, untranslated region.
(boxed sequences in Fig 1B,C). The absence of G–quadruplex (Fig 1A, PSD95-812DG, CaMKIIa-3112G). The G–quadruplex
structure in the T7 transcripts of 30 -UTRs of both mRNAs was deletions caused a loss of more than 90%D of the signal in neurites
indicated by the disappearance of the K þ -dependent RT arrests (Fig 2), suggesting that the deleted sequences are necessary for the

localization process. The localization defect was apparently not The G–quadruplex structure is essential for NTE function
due to a change in RNA stability, as the levels of RNA with or To demonstrate that the G–quadruplex structure itself (rather than
without G–quadruplex were unchanged (supplementary Fig S5A just its G-rich content) is important for NTE function, structural
online). As the amount of mRNA present in neurites represents variants of G–quadruplexes and G-rich-non-G–quadruplex se-
only a fraction of the total amount of neuronal mRNA, one cannot quences were tested. A positive correlation was established
totally exclude the fact that those mRNAs being transported between the ability of a given sequence to adopt a G–quadruplex
in neurites are also protected by the presence of the G-quadruplex structure, as defined by its efficiency in arresting RT elongation
at their 30 end. In fact, active transport and degradation protection (Fig 3C), and its efficiency as a NTE (Fig 3D). Thus, all G–
mechanisms could be coupled as indicated by the colocalization quadruplex-forming sequences are efficient NTEs (with efficien-
of mRNA decay components, such as Dcp1, with RNA transport cies between 35 and 80%), whereas G-rich sequences that do not
particles (Cougot et al, 2008). In addition, PSD-95 mRNA has promote G–quadruplex formation have no or little NTE activity
been proposed to be protected from degradation by FMRP in (Fig 3D, ‘G-rich’ and ‘no-Gq’). A two-layer Gq motif is not
hippocampal neurons through AU-rich elements (AREs; Zalfa detected in vitro and does not have NTE activity. Among the Gq
et al, 2007). Interestingly, these AREs are located close to the variants, the three-layer G–quadruplex G3A is a better NTE
G–quadruplex motifs, and could explain how FMRP contributes (80%±5%) than the four-layer G–quadruplex G4A (60%±5%),
to RNA stabilization in the hippocampus (Fig 1B); however, this although it is more stable (compare the intensity of RT stops in Fig
stabilization does not take place in cortical neurons (Zalfa et al, 3C, top), suggesting that G–quadruplex stability is not the sole
2007) in which the present study was conducted. Furthermore, determinant of NTE efficiency. Similarly, a G–quadruplex with
neither the length of the poly-A tail, nor the overall translation intervening adenines has relatively higher NTE efficiency than one
level of mRNAs bearing the same 30 -UTRs were affected by the with uridines. In all examples, the G–quadruplexes are present
deletions (supplementary Fig S5B,C online). within a hundred nucleotides of the 30 end. It remains to be
We then aimed to demonstrate their role as neurite-targeting determined whether specific rules apply regarding the position of
elements (NTEs), and to evaluate the contribution of additional the G–quadruplex motif within a given mRNA. Together, these
nearby cis-acting elements such as the CPE element, two copies data allow us to propose that a G–quadruplex structure is a NTE
of which are close to the G–quadruplex structure in CaMKIIa independently of its surrounding sequences, and to add the
mRNA (Fig 1C) and have been proposed to be involved in G–quadruplex structure to the list of RNA structures with NTE
dendritic localization (Huang et al, 2003). The G–quadruplex- function. The finding that about one-third of the best-known
forming sequences alone (Fig 1B,C) were tested out of their dendritic mRNAs contain a putative G–quadruplex in their 30 -UTR
natural 30 -UTR context in the heterologous 30 -UTR sequence of suggests that G–quadruplexes would be among the most prevalent
pDsRed-Mono-4BB in front of the SV40 polyadenylation signal. neuronal NTEs.
The presence of a G–quadruplex structure was confirmed in NTEs are proposed to affect transport by their interaction with
these mRNAs (Fig 1A, PSD95-Gq, CaMKIIa-Gq) and their neurite- trans-acting RNA-binding proteins. Both PSD-95 and CaMKIIa
targeting was comparable to that of the full-length UTRs (Fig 2), mRNAs have been shown to be regulated by, and to interact with,
indicating that the G–quadruplex structures are sufficient for the FMRP (Todd et al, 2003; Muddashetty et al, 2007; Zalfa et al,
neurite localization. For CaMKIIa mRNA, this could suggest a 2007; Dictenberg et al, 2008). Given this, FMRP seemed to be a
small contribution of CPEs to transport in the processes of cortical good candidate for the G–quadruplex-dependent transport. We
neurons (this study) compared with hippocampal ones (Huang verified that FMRP binds directly to the G–quadruplex motif of
et al, 2003). Alternatively, G–quadruplex and CPEs could function both PSD-95 and CaMKIIa mRNAs in vitro, and that binding is
together in CaMKIIa mRNA, as the efficiency of localization is not impaired by deletion of the G–quadruplex and enhanced by K þ ,
fully recovered in CaMKIIa-G–quadruplex (55% compared with compared with Li þ (supplementary Fig S7A,B online). These data
82% in full-length CamKIIa 30 UTR), and the G–quadruplex support a direct role for FMRP in the G–quadruplex-dependent
deletion in CaMKIIa-3112DG might have perturbed the folding of localization of mRNAs. However, whereas the deletion of G-quartet
CPEs, masking their contribution to mRNA localization. motif within an mRNA 30 -UTR had a strong effect on its dendritic
The lN-GFP system allowed the visualization of fast antero- localization, the lack of FMRP had a more subtle effect. Indeed,
grade movement (X1 mm/s) of lN-GFP-labelled PSD-95 30 -UTR- the basal transport of reporter mRNAs bearing CaMKIIa or PSD-95
RNA particles along neurites, similar to what was previously 30 -UTRs was unaffected by the absence of FMRP (data not shown)
described for active mRNA transport (Fig 3A; supplementary and only the mGluR-triggered transport of the RNA bearing
movie S1 online). CaMKIIa was diminished (supplementary Fig S7C online), as
The dendritic localization of CaMKIIa mRNAs had been shown reported previously (Dictenberg et al, 2008; Kao et al, 2010),
to be enhanced by group 1 metabotropic glutamate receptor whereas the RNA bearing PSD-95 30 -UTR was not significantly
agonist 3,5-dihydroxyphenylglycine hydrate (DHPG; Dictenberg changed. Thus, FMRP is not the main trans-acting factor of the
et al, 2008). We reproduced this effect with CaMKIIa 30 -UTR G–quadruplex-dependent transport, but it would contribute to
(CaMKIIa-3112 þ DHPG, supplementary Fig S4 online) and we their activity-dependent transport. Although FMRP has similar
demonstrated it with PSD-95 30 -UTR (Fig 3B). Remarkably, the binding affinities in vitro for CaMKIIa and PSD-95 30 -UTRs, our
deletion of the G–quadruplex in both mRNAs eliminated this data also suggest that it might have distinct roles in the transport
effect. Taken together, these data support the idea that G– of its different target mRNAs. Whether the intrinsic nature of the
quadruplex-forming regions in the 30 -UTR of PSD-95 and CaMKIIa G-quartet (for example, a triple three-tetrad structure in PSD-95 as
are true NTEs that contribute to the activity-dependent transport of opposed to a single four-tetrad one in CaMKIIa) influences this
mRNAs in neurites. efficiency remains to be determined.

p4λN22-3mEGFP-M9
A
PCMV 4λN22 GFP GFP GFP M9 SV40polyA 4λN22-3GFP
Gq
pDsRed-Mono-4BB
XbaI
4BoxB AAAAA
PCMV PT7 DsRed-Monomer 4xBoxB SV40polyA
mRNA reporter
Neurite localization (%) 100

Gq
PSD95-812 (86 ± 4)
PSD95-812ΔG (4 ± 1)
Gq
PSD95-Gq (90 ± 4)
CPE1 Gq CPE2 Hexa
CaMKIIa-3112 (82 ± 4)
CaMKIIa-3112ΔG (2 ± 1)
Gq
CaMKIIa-Gq (55 ± 3)
B λ-EGFP DsRed λ-EGFP DsRed
PSD95 CaMKIIa
812 3112
PSD95 CaMKIIa
812ΔG 3112ΔG
PSD95 CaMKIIa
Gq Gq
C RNA (fish) DsRed RNA (fish) DsRed
PSD95 CaMKIIa
812 3112
PSD95 CaMKIIa
812ΔG 3112ΔG
PSD95 CaMKIIa
Gq Gq
Fig 2 | Involvement of PSD95 and CaMKIIa G–quadruplex in neurite targeting. (A) lN-GFP system principle and RNA-reporter constructs scheme tested with
their neurite localization quantification (percentage of cells showing GFP signal along the neurites among those expressing GFP (n ¼ 100, ±standard error).
(B) Visualization of reporter mRNAs in cortical neurons with the lN-GFP system (green). DsRed protein expressed from pDsRed-Mono-4BB accumulates
in the cytoplasm and acted as a transfection control (red). Scale bar, 20 mm. Images are projections of 10 1.5 mm confocal sections. The deletion of
the Gq sequences eliminates neurite localization (DG constructs), whereas the Gq sequence only (Gq) restores it. (C) Visualization of PSD95 and CaMKIIa
30 -UTRs-containing reporter mRNAs in cortical neurons with fluorescent in situ hybridization using a multilabelled Alexa-488 oligodeoxynucleotide probe (green).
DsRed protein is expressed from pDsRed-Mono-4BB as a transfection control (red). Cells were treated as described in (C), but without using p4lambda-
N22-3mEGFP-M9. Scale bar, 20 mm. DAPI and merged images are presented in supplementary Fig S4 online. CPE, cytoplasmic polyadenylation element;
DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; GFP, green fluorescent protein; Gq, guanine–quadruplex; mRNA, messenger RNA; UTR, untranslated region.

A B PSD95–812 PSD95–812 + DHPG
PSD95-812ΔG PSD95-812ΔG + DHPG
0s
5s
10 s 60 *
fluorescence (AU)
50
15 s Neurite 40 Non-treated
30 DHPG-treated
20
20 s
10
0
PSD95–812 PSD95–812ΔG
C G4-U G4-A G3-A G2-A No-Gq G-rich
K Li Na K Li Na K Li Na K Li Na K Li Na K Li Na
Top
D RT stop
A A
G G G G AA AA
G G G G G G G G
G G G G G G G G
G G G G A AA C
A A C G2-A
G4-A (12 ± 1)
(60 ± 5)
A A
U U A G G G
G G G G
G G G G G A G G
G G G G G G G A
G G A G
G G G G A A C
A U C
G4-U no-Gq
(35 ± 4) (0)
AA AA A C
G G G G G G G
G G G G G G G
G G G G G G G
A AA C G G G
A A
G3-A G-rich
(80 ± 5) (2 ± 1)
Fig 3 | Transport of mRNAs bearing a Gq structure is a fast, dynamic process that is sensitive to group 1 glutamate receptor activation, and a ‘generic’
Gq is sufficient for localization. (A) Time-lapse confocal visualization of the movement of PSD-95 30 -UTRs-containing reporter mRNAs in cortical
neurons with the lN-GFP system. Scale bar, 20 mm. Recording at 1 frame/s is presented in supplementary Movie 1 online. (B) The neurite targeting of
PSD-95 reporter mRNA is stimulated by 50-mM DHPG treatment for 20 min. PSD95-812DG RNA is not sensitive to such treatment. Cells were treated
as described in Fig 2, except that p4lN22-3mEGFP-M9 plasmid was absent and reporter RNA was visualized by in situ hybridization of a fluorescent
DNA probe; DAPI staining is shown. Histogram shows quantification of neurite fluorescence of FISH signal (arbitrary units), n ¼ 15; paired Student’s
t-test (unstimulated compared with stimulated) *P ¼ 0.00014 (PSD95-812), P ¼ 0.35 (PSD95-812DG). (C) Gq detection by RT in the 30 -UTR of pDsRBB-
‘variants’, as described in Fig 1A. The sequence of transcripts is given in supplementary Fig S6 online. (D) Visualization of variant 30 -UTR-containing
reporter mRNAs in cortical neurons with lN-GFP. Neurons were transfected with mRNA reporter (pDsRBB-variants) and fluorescence reporter
(p4lN22-3mEGFP-M9) plasmids and imaged as shown in Fig 2. The secondary structure model of the variant mRNA reporters (variable region) is
shown with quantifications as in Fig 2A. DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole; DHPG, 3,5-dihydroxyphenylglycine hydrate; FISH, fluorescence in situ
hybridization; Gq, guanine–quadruplex; mRNA, messenger RNA; RT, reverse transcription; UTR, untranslated region.

Finally, because of their cation sensitivity, G–quadruplex helpful suggestions; and M. Koch, M. Boeglin and P. Kessler for help with
structures might have a unique role in activity-dependent transport microscopy analyses. M.S. was supported by a grant from Fondation
de la Recherche Médicale to J.L.M. This project benefited from ANR
by ‘sensing’ the cationic intracellular content in relation to
and Fondation Jérôme Lejeune grants to H.M.
neuronal activity status. The modulation of G–quadruplex stability
by cation variations could regulate the binding of trans-acting CONFLICT OF INTEREST
factors, which could then affect the transport level of the mRNAs The authors declare that they have no conflict of interest.
(such as that observed after mGluR activation). FMRP—
the binding of which to G–quadruplexes is modulated by the
REFERENCES
concentration of monovalent cations—could have a role in this Andreassi C, Riccio A (2009) To localize or not to localize: mRNA fate is in
regulatory process. Future work will be required to test this 30 UTR ends. Trends Cell Biol 19: 465–474
hypothesis and to identify the trans-acting factors that, along with Besse F, Ephrussi A (2008) Translational control of localized mRNAs:
FMRP, contribute to the formation of the G–quadruplex-transport restricting protein synthesis in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol 9:
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particles, and to determine the other neuronal mRNAs that are
Bramham CR, Wells DG (2007) Dendritic mRNA: transport, translation and
subjected to this transport. function. Nat Rev Neurosci 8: 776–789
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containing CaMKIIa 30 -UTR (3112-nucleotide rat) was a gift control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron 61: 10–26
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and pmRFP-4-boxB-bactin-zipcode were obtained from Bertrand E, Rage F (2008) Dendrites of mammalian neurons contain
specialized P-body-like structures that respond to neuronal activation.
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and primers can be found in the supplementary Methods online. Daigle N, Ellenberg J (2007) LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-
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day 17 and grown on polylysine-coated 24-well plates or 35-mm mental retardation protein targets G quartet mRNAs important for
neuronal function. Cell 107: 489–499
glass-bottom dishes (Iwaki) in Neurobasal Medium (NBM) supple- Dictenberg JB, Swanger SA, Antar LN, Singer RH, Bassell GJ (2008) A direct
mented with 1 B27, 0.5 mM L-glutamine and 100 IU/ml role for FMRP in activity-dependent dendritic mRNA transport links
penicillin/streptomycin at 37 1C with 5% CO2. Neurons were filopodial-spine morphogenesis to fragile X syndrome. Dev Cell 14:
transfected at day 7 with 0.1 mg p4lN-3mGFP and 0.25 mg pDsRBB, 926–939
Didiot MC, Tian Z, Schaeffer C, Subramanian M, Mandel JL, Moine H (2008)
and 1.2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in 400 ml NBM. The
The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent
medium was replaced after 3 h with a 1:1 (v:v) mixture of exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Res 36: 4902–4912
conditioned and fresh NBM. After 20 h, the neurons were fixed for Hirokawa N, Noda Y, Tanaka Y, Niwa S (2009) Kinesin superfamily motor
20 min in 4% paraformaldehyde 1 PBS (in situ hybridization), proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 682–696
imaged directly live (spinning disk confocal) or lysed (luciferase Holt CE, Bullock SL (2009) Subcellular mRNA localization in animal cells and
why it matters. Science 326: 1212–1216
assays, RNA preparation). Where indicated, treatment with 50 mM Huang YS, Carson JH, Barbarese E, Richter JD (2003) Facilitation of dendritic
(S)-DHPG (Tocris) was carried out for 20 min before fixation. mRNA transport by CPEB. Genes Dev 17: 638–653
RT assays and RNA structure probing. Primer extensions with RT Huttelmaier S, Zenklusen D, Lederer M, Dictenberg J, Lorenz M, Meng X,
were performed as described in Schaeffer et al (2001) with 5 pmol Bassell GJ, Condeelis J, Singer RH (2005) Spatial regulation of b-actin
translation by Src-dependent phosphorylation of ZBP1. Nature 438:
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20 1C in 20 ml of 50 mM Hepes, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 150 mM Kao DI, Aldridge GM, Weiler IJ, Greenough WT (2010) Altered mRNA
KCl, NaCl or LiCl and 2 mg tRNA. RNA structure probing was transport, docking, and protein translation in neurons lacking
performed as described in Moine et al (1998), see details in the fragile X mental retardation protein. Proc Natl Acad Sci USA 107:
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Publication 2
Publication 2
153
Cell Reports
Article
Sequestration of DROSHA and DGCR8 by Expanded

CGG RNA Repeats Alters MicroRNA Processing
in Fragile X-Associated Tremor/Ataxia Syndrome
Chantal Sellier,1,2 Fernande Freyermuth,1 Ricardos Tabet,1 Tuan Tran,3 Fang He,4 Frank Ruffenach,1 Violaine Alunni,1
Herve Moine,1 Christelle Thibault,1 Adeline Page,1 Flora Tassone,5 Rob Willemsen,7 Matthew D. Disney,3
Paul J. Hagerman,5,6 Peter K. Todd,4 and Nicolas Charlet-Berguerand1,*
1Department of Translational Medicine, IGBMC, Illkirch 67400, France
2College de France, Paris 75000, France
3Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, Jupiter, FL 33458, USA
4Department of Neurology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109, USA
5M.I.N.D. Institute
6Department of Biochemistry and Molecular Medicine
University of California, Davis, Sacramento, CA 95817, USA

7Department of Clinical Genetics, Erasmus MC, Rotterdam 3000 DR, The Netherlands
*Correspondence: [email protected]
http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2013.02.004
SUMMARY and white matter lesions with the presence of ubiquitin-positive

nuclear neuronal and astrocytic inclusions (Greco et al., 2002),
Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome which contain the expanded CGG RNA repeats (Tassone et al.,
(FXTAS) is an inherited neurodegenerative disorder 2004). In contrast to fragile X syndrome, where full mutations
caused by the expansion of 55–200 CGG repeats in (>200 CGG repeats) result in hypermethylation and silencing of
the 50 UTR of FMR1. These expanded CGG repeats the FMR1 gene, FXTAS carriers of shorter CGG expansions
are transcribed and accumulate in nuclear RNA (55–200 CGG repeats) present increased expression of FMR1
mRNA levels and normal, or near-normal, FMRP expression
aggregates that sequester one or more RNA-binding
(Tassone et al., 2000). These observations suggest a toxic
proteins, thus impairing their functions. Here, we
RNA gain-of-function model for FXTAS. In support of that model,
have identified that the double-stranded RNA- cellular and transgenic Drosophila and mouse models demon-
binding protein DGCR8 binds to expanded CGG strate that the sole expression of a mutant RNA containing
repeats, resulting in the partial sequestration of expanded CGG repeats is sufficient to induce the formation of
DGCR8 and its partner, DROSHA, within CGG RNA ubiquitin-positive aggregates and to cause a pathology similar
aggregates. Consequently, the processing of micro- to human FXTAS (Willemsen et al., 2003; Jin et al., 2003; Arocena
RNAs (miRNAs) is reduced, resulting in decreased et al., 2005; Entezam et al., 2007; Hashem et al., 2009). A toxic
levels of mature miRNAs in neuronal cells expressing RNA gain-of-function model predicts that expanded CGG
expanded CGG repeats and in brain tissue from repeats are pathogenic by sequestering specific RNA-binding
patients with FXTAS. Finally, overexpression of proteins, resulting in loss of their normal functions and, ulti-
mately, in neuronal cell dysfunction and death. Consistent
DGCR8 rescues the neuronal cell death induced by
with a titration model, various proteins were found to colocalize
expression of expanded CGG repeats. These results with CGG or ubiquitin-positive inclusions (Iwahashi et al., 2006;
support a model in which a human neurodegenera- Jin et al., 2007; Sofola et al., 2007; Sellier et al., 2010); however,
tive disease originates from the alteration, in trans, the pathological consequences of their recruitment are unclear,
of the miRNA-processing machinery. suggesting that the protein(s) sequestered within CGG RNA
aggregates and responsible for the neuronal cell death, remains
INTRODUCTION to be identified.
MicroRNAs (miRNAs) are small, conserved, noncoding RNAs
Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) is a neuro- that are key components of posttranscriptional gene regulation
degenerative disorder that affects older adult males who are and are involved in the control of many fundamental processes,
carriers of an expansion of 55–200 CGG repeats in the 50 UTR including both differentiation and survival of neurons (Schaefer
of the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene (Hagerman et al., 2007; Davis et al., 2008; De Pietri Tonelli et al., 2008;
et al., 2001). The clinical features of FXTAS include progressive Stark et al., 2008; Haramati et al., 2010; Hébert et al., 2010;
intention tremor and gait ataxia, frequently accompanied by Huang et al., 2010; Fénelon et al., 2011; Schofield et al., 2011).
progressive cognitive decline, parkinsonism, peripheral neurop- miRNAs are initially transcribed by the RNA polymerase II as
athy, and autonomic dysfunctions (Jacquemont et al., 2003). primary miRNA (pri-miRNAs) transcripts, which are processed
Principal neuropathology of FXTAS includes mild brain atrophy into precursor miRNAs (pre-miRNAs) by the type III RNase,
Cell Reports 3, 869–880, March 28, 2013 ª2013 The Authors 869
A B CGG CGG C Figure 1. Identification of Proteins Associ-
MW GENE 20x 60x ated with Expanded CGG Repeats
86 DGCR8 - ++ (A) Silver staining of proteins extracted from
79 MPP10 - + mouse brain and captured on streptavidin resin
250 78 ZCHC8 - + DGCR8 coupled to biotinylated in-vitro-transcribed RNA
130
77 PRP3 + ++ DROSHA containing expanded CGG repeats of normal or
76 ESRP1 + ++ pathogenic size. MW, molecular weight.
95
56 GLD2 - + (B) List of the main proteins identified by nanoLS-
72
46 ZC3HA + ++
D
DGCR8 CGG Merged MS/MS that are preferentially associated with 20
55 44 RBMS1 - +
or 60 CGG repeats.
43 DAZP1 + ++
CTL
36 40 LSM11 + ++ (C) Western blotting against DGCR8 or DROSHA
28 37 hnRNP A2 ++ + of mouse brain proteins captured on 20 or 60 CGG
CGG 60x
35 PUR ++ + RNA repeat columns.
(D) RNA FISH against CGG repeats, coupled to
E IF against DGCR8, of COS7 cells transfected with
% Co-localization
100 a plasmid expressing either no repeats (CTL) or

CTL CGG 60x 60 CGG repeats. Magnification, 6303. Scale
50
bars, 10 mm.
0
(E) Percentage of colocalization of the endoge-
nous-tested candidate proteins within CGG RNA
aggregates analyzed by RNA FISH coupled to IF
on COS7 transfected for 24 hr with a plasmid ex-
pressing either no repeats or 60 CGG repeats.
See also Tables S1, S2, and Figure S1.
DROSHA, and the double-stranded RNA-binding protein, (20 CGG repeats) or pathogenic expansions (60 or 100 CGG
DGCR8, which anchors DROSHA to the pri-miRNA transcript repeats), eluted, separated on SDS-PAGE, and identified by
(Lee et al., 2003; Denli et al., 2004; Landthaler et al., 2004; nano-LC-MS/MS analysis (Figure 1A). More than 30 RNA-
Gregory et al., 2004; Han et al., 2004; Wang et al., 2007). Pre- binding proteins were identified (Figure 1B; Tables S1 and S2),
miRNAs are then exported into the cytoplasm, where they are including hnRNP A2/B1, hnRNP G, and PURa, which were also
processed into mature miRNAs by the DICER enzyme. Global identified in previous studies (Iwahashi et al., 2006; Jin et al.,
reduction of miRNA expression, for example through inactivation 2007; Sofola et al., 2007; Sellier et al., 2010). However, these
of DICER or DGCR8 in mice, results in embryonic lethality and if proteins were recruited preferentially onto short CGG repeats
conditionally lost in brain, leads to neuronal dysfunction and compared to long pathogenic CGG stretches (Figure 1B). In
cell death (Schaefer et al., 2007; Davis et al., 2008; De Pietri contrast, ten proteins (ESRP1, PRP3, ZC3HA, LSM11, ZCHC8,
Tonelli et al., 2008; Stark et al., 2008; Haramati et al., 2010; MPP10, DAZP1, RBMS1, GLD2, and DGCR8) were found
Hébert et al., 2010; Huang et al., 2010; Fénelon et al., 2011; preferentially associated with expanded CGG repeats of patho-
Schofield et al., 2011). genic size (Figure 1B). We confirmed the preferential binding of
Here, we find that DGCR8 binds preferentially to expansions of DGCR8 on long CGG stretches by western blotting on the
CGG repeats of pathogenic length. This association results in protein eluted from the RNA affinity columns (Figure 1C). The
titration of DGCR8 pri-miRNA-binding activity and in the partial partner of DGCR8, DROSHA, was also preferentially recruited
sequestration of DGCR8 and its partner, DROSHA, within CGG to long expanded CGG repeats (Figure 1C).
RNA aggregates. Consequently, the processing of pri-miRNAs Next, to discard nonspecific RNA-binding proteins, we tested
is reduced in cells expressing expanded CGG repeats, and in whether these candidate proteins colocalize with the aggre-
brain samples from patients with FXTAS, resulting in decreased gates formed by expanded CGG repeats in transfected COS7
levels of mature miRNAs. Finally, the expression of pathogenic- cells (Figures S1A and S1B). Among the ten candidates tested,
expanded CGG repeats in cultured mouse cortical neurons only three (PRP3, ZC3HA, and DGCR8) colocalized with CGG
results in decreased dendritic complexity and reduced neuronal RNA aggregates (Figures 1D and S1A). However, we noted
cell viability. Importantly, the sole overexpression of DGCR8 that PRP3 and ZC3HA were naturally localized in speckles,
restored to normal both the dendritic morphological abnormali- which are normal nuclear structures enriched in some splic-
ties and the loss of neuronal cells, demonstrating that titration ing factors and that were found previously to be associated
of DGCR8 by expanded CGG repeats is a leading event to with CGG RNA aggregates in transfected cells (Sellier et al.,
CGG-induced neuronal cell death. 2010). Thus, neither PRP3 nor ZC3HA was specifically re-
cruited within CGG RNA aggregates (Figure S1A). In con-
RESULTS trast, DGCR8 presented a diffuse pattern within the nucleo-
plasm, but upon expression of 60 expanded pathogenic
Identification of Proteins Associated with Expanded CGG repeats, DGCR8 changed localization and was recruited
CGG Repeats within CGG RNA inclusions (Figure 1D). As further controls,
To identify proteins involved in FXTAS physiopathology, proteins we also tested the colocalization of proteins, such as hnRNP
extracted from mouse brain nuclei were captured on streptavidin A2/B1 and PURa, which were found mostly associated with
resin coupled to biotinylated RNA composed of nonpathogenic 20 biotinylated CGG RNA repeats in vitro. Consistent with a
870 Cell Reports 3, 869–880, March 28, 2013 ª2013 The Authors
A DGCR8 DGCR8 DGCR8 Figure 2. DGCR8 and DROSHA Bind to
Expanded CGG RNA Repeats
(A) Gel shift assays of purified bacterial recombinant
His-DGCR8D with 100 nM (30,000 cpm) of
Bound uniformly a-[32P]CTP internally labeled in-vitro-
Bound
Bound transcribed RNA containing 20 or 100 CGG repeats
Free or the pri-miR-125.
Free Free (B) Quantification of DGCR8 binding to 20, 40, 60, or
100 CGG RNA repeats.
CGG 20x CGG 100x pri-miR-125 (C) RNA FISH against CGG repeats, coupled to
IF against SAM68, on COS7 cells cotransfected
with a plasmid expressing 60 CGG repeats and
B C a siRNA against the luciferase (siCTL) or against
DGCR8.
120 SAM68 CGG Merged (D and E) RNA FISH of CGG repeats coupled to IF of
CGG 100x DROSHA or DGCR8 on brain sections (hippo-
100
CGG 60x
% DGCR8 Binding
campal area) of age-matched control or patients

siCTL
80 CGG 40x with FXTAS. Magnification, 6303. Nuclei were

counterstained with DAPI.
60
CGG 20x (F and G) Larger fields of CGG RNA FISH coupled to
40 IF of DROSHA or DGCR8 on brain sections
siDGCR8
of patients with FXTAS. White arrows indicate

20 CGG RNA aggregates. Note some nonspecific
0 perinuclear background inherent to RNA FISH of
0 10 20 30 40 autopsied human brain samples.
nM DGCR8 Scale bars, 10 mm.
See also Figure S2.
D E
DROSHA CGG Merged DGCR8 CGG Merged
CTL
CTL
found specifically associated with ex-

panded CGG repeats of pathogenic
size, DGCR8.
FXTAS
FXTAS
DGCR8 Binds to Mutated RNA

Containing Expanded CGG Repeats
Recruitment of DGCR8 to biotinylated
CGG RNA questions whether DGCR8
binds directly, or through indirect pro-
F DROSHA CGG Merged tein-protein interactions, to expanded
CGG repeats. Gel shift assays showed
that purified recombinant HIS-tagged
DGCR8 protein binds directly to RNAs
containing expanded CGG repeats of
pathogenic size (60 and 100 CGG repeats;
Figures 2A, S2A, and S2B). In contrast,
DGCR8 binds weakly to RNAs containing
CGG stretch of nonpathogenic size, such
G DGCR8 CGG Merged
as 20 or 40 CGG repeats (Figures 2A,
S2A, and S2B). Furthermore, DGCR8
binds to expanded CGG repeats with
an affinity similar to control pri-miRNAs,
such as pri-miR-124, pri-miR-125, or
pri-Let-7 (Figures 2A and S2A). UV-cross-
linking assays confirmed that purified
recombinant DGCR8 binds directly to
control pri-miR-124 and pri-miR-125, as
preferential binding to normal but not to expanded CGG well as to expanded CGG repeats of pathogenic size, but does
repeats, we found no significant colocalization of these not bind to short CGG stretch (Figure S2B).
candidates with CGG RNA aggregates at early time points The in vitro binding of DGCR8 to long expanded CGG repeats
(Figure 1E). Thus, we pursued our study on the one protein prompted us to investigate whether DROSHA and DGCR8 are
recruited within the nuclear aggregates found in cell models of expressing 60 CGG repeats (Figures S2I and S2J). In contrast,
FXTAS. CGG RNA aggregates are dynamic nuclear structures DROSHA and DGCR8 were not recruited within RNA aggregates
that accumulate various proteins in a time-dependent manner of similarly transfected cells expressing either expanded CUG or
(Sellier et al., 2010), which raises the question of the timing of AUUCU repeats, which are involved in DM1 and spinocerebellar
DROSHA and DGCR8 recruitment. Analysis of the formation of ataxia of type 10 (SCA10), respectively (Figures S2I and S2J).
CGG RNA aggregates at various time points after transfection Identical results were obtained in neuronal PC12 or GT17 cells
of COS7 cells with a plasmid expressing 60 CGG repeats re- (data not shown). These results indicate that DGCR8 binds pref-
vealed that DROSHA and DGCR8 colocalized within CGG aggre- erentially expanded CGG repeats compared to CUG repeats,
gates from the time of their formation (6–8 hr posttransfection; which is consistent with the enhanced stability of the double-
data not shown). Furthermore, depletion of either DROSHA or stranded helical structure formed by expanded CGG repeats
DGCR8 by siRNA reduced the recruitment of SAM68, one of compared to CUG repeats (Mooers et al., 2005; Sobczak et al.,
the earliest proteins found to colocalize with CGG aggregates 2003; Zumwalt et al., 2007; Kiliszek et al., 2009, 2011; Kumar
(Figures 2C and S2C). Next, coimmunoprecipitation experiments et al., 2011). Alternatively, the presence of U:U mismatches
demonstrated that DROSHA and DGCR8 interact with SAM68, versus noncanonical G:G base pairing, or other structural differ-
suggesting that the recruitment of SAM68 within CGG RNA ences that are significant, between CUG and CGG hairpins, may
aggregates is mediated through protein-protein interactions impair the binding of DGCR8. Overall, these results suggest that
with DROSHA or DGCR8 (Figure S2D). These results suggest DROSHA and DGCR8 are specific components of the CGG RNA
that in transfected cells, DROSHA and DGCR8 are among the aggregates in FXTAS.
first proteins to be recruited within the CGG RNA aggregates
and are essential for the further aggregation of other proteins, DROSHA Does Not Cleave Expanded CGG Repeats
such as SAM68. These results were obtained in cells expressing The binding of DROSHA and DGCR8 to the expanded CGG RNA
large amounts of expanded CGG RNA repeat. Thus, to rule out repeat raises the possibility that DROSHA may cleave these
any overexpression bias, we tested the localization of endoge- repeats into shorter CGG hairpins, which is an attractive hypoth-
nous DROSHA and DGCR8 in brain sections from patients with esis considering that DICER was reported, in vitro, to partially
FXTAS. RNA FISH coupled to immunofluorescence (IF) experi- process expanded CGG repeats into potentially toxic miRNA-
ments showed that both DROSHA and DGCR8 consistently like CGG RNA repeats (Handa et al., 2003), an observation
colocalized with endogenous CGG nuclear RNA aggregates in also reported for expanded CUG and CAG repeats (Krol et al.,
brain sections of patients with FXTAS (Figures 2D and 2E; larger 2007; Bañez-Coronel et al., 2012). Accordingly, we tested
fields in Figures 2F and 2G), whereas DROSHA and DGCR8 were whether DROSHA and DGCR8 can process an RNA containing
diffusely localized within the nucleoplasm of age-matched non- 60 expanded CGG repeats. However, no cleavage products
FXTAS controls. Finally, we tested the localization of endoge- were observed, although DROSHA correctly processed a control
nous DROSHA, DGCR8, and CGG aggregates in brain sections pri-miR-125 (Figure S3A). Furthermore, we found no trace of
of a knockin mouse model, in which endogenous CGG repeats small miRNA-like CGG RNA after massive parallel sequencing
had been replaced with an expansion of 98 CGG repeats (Wil- of RNA extracted from cells transfected with a plasmid express-
lemsen et al., 2003). RNA FISH coupled to IF labeling showed ing 60 CGG repeats (data not shown). We propose that structural
the presence of rare nuclear CGG RNA aggregates that colocal- differences between pri-miRNAs and CGG expanded repeats,
ized with both endogenous DROSHA and DGCR8 in mice such as noncanonical G:G base pairing, impair the cleavage
expressing expanded CGG repeats (Figures S2E and S2F). By activity of DROSHA. Overall, the recruitment of DROSHA and
contrast, DROSHA and DGCR8 were diffuse throughout the DGCR8, without the processing of CGG repeats and the subse-
nucleoplasm in control mice. We noted that the CGG RNA aggre- quent release of the proteins, suggests that the aggregates of
gates were larger and much more frequent in patients with CGG repeats may act as molecular sink, titrating DROSHA and
FXTAS than in knockin mice, which is consistent with the milder DGCR8 away from their normal functions.
neurological disturbances observed in knockin mice compared
to patients with FXTAS (Willemsen et al., 2003). DROSHA and DGCR8 Are Partially Sequestered by
The direct binding of DGCR8 to expanded CGG trinucleotide Expanded CGG Repeats
repeats raises the question as to how specific this interaction To test a potential sequestration of DROSHA and DGCR8, we
is and, notably, whether DGCR8 can also recognize other trinu- first analyzed the effect of expanded CGG repeats on the
cleotide repeats such as expanded CUG repeats, the mutation RNA-binding activity of DGCR8. Gel shift experiments demon-
responsible of myotonic dystrophy of type 1 (DM1). UV-cross- strated that addition of increasing amounts of unlabeled
linking assays showed that DGCR8 binds weakly to RNAs con- expanded CGG RNA repeat progressively competed with the
taining 20 or 100 CUG repeats, compared to an RNA containing binding of recombinant purified DGCR8 to radioactively labeled
100 CGG repeats (Figure S2G). Similarly, both DROSHA and pri-miR-125 (Figure 3A). As a control, addition of unlabeled
DGCR8 from mouse brain extract were captured by RNA affinity expanded CUG repeats had little or no effect. We confirmed
columns composed of expanded CGG repeats, yet neither was these results by UV-crosslinking assays, which demonstrated
recruited by expanded CUG repeats (Figure S2H). Finally, RNA that addition of increasing amounts of expanded CGG repeats
FISH coupled to IF demonstrated that both endogenous competed with the binding of DGCR8 to radioactively labeled
DROSHA and DGCR8 were recruited within CGG RNA repeat pri-miR-124 and pri-miR-125, whereas expanded CUG repeats
aggregates that formed in COS7 cells transfected with a plasmid had no effects (Figure S3B). Next, we tested the effect of
expanded CGG repeats on the processing activity of DROSHA. DROSHA (Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007). Quantitative
COS7 cells were cotransfected with a plasmid expressing an RT-PCR analysis of mirtron-877, mirtron-1224, mirtron-1225,
ectopic pri-miRNA under the expression of a CMV promoter, and mirtron-1226 levels in neuronal GT17 cells expressing
allowing the detection of the primary, precursor, and mature expanded CGG repeats demonstrated that their expression
miRNAs by northern blotting (Figure 3B). Importantly, coexpres- was not altered (Figure 3G). Similarly, mirtron expression was
sion of increasing amounts of expanded CGG repeats reduced not altered in COS7 cells expressing expanded CGG repeats
the processing of ectopic pri-miR-124 into pre-miR-124. This (Figure S3I). Also, the mRNA and protein expression levels of
inhibition is specific because expression of control expanded DROSHA and DGCR8 were normal in cells expressing expanded
CUG repeats had no effect on the biogenesis of pri-miR-124 CGG repeats, indicating that pathogenic CGG repeats affect the
(Figure 3B). We confirmed these results using ectopically ex- activity, but not the expression, of DROSHA and DGCR8 (Figures
pressed pri-miR-206, pri-miR-146, and pri-miR-26 and found S3J and S3K). Finally, the transfection of a plasmid encoding
that expression of expanded CGG repeats inhibited the DGCR8 in neuronal cells expressing expanded CGG repeats
DROSHA cleavage of pri-miRNA transcripts into pre-miRNAs rescued the decreased expression of miRNAs, whereas expres-
(Figure S3C). As a control, expression of expanded CUG repeats sion of an inactive form of DGCR8, which was deleted for its
had no or little effects on miRNA biogenesis (Figure S3D). These double-stranded RNA-binding domains, presented no rescue
results suggest that expanded CGG repeats compete with the activity (Figure 3H). Overall, these data suggest that expanded
binding of DGCR8 to pri-miRNAs, reducing the quantity of free CGG repeats specifically reduced the activity of DROSHA and
DROSHA and DGCR8 available to process pri-miRNAs, which DGCR8, without affecting other mechanisms such as general
leads to reduced processing of pri-miRNAs into pre-miRNAs. transcription.
Theoretically, the titration of free DROSHA and DGCR8 may
result in reduced formation of mature miRNAs. To test this The Processing of miRNAs Is Altered in Brain Samples of
hypothesis, we quantified the expression of endogenous mature Patients with FXTAS
miRNAs upon expression of expanded CGG repeats in neuronal The altered processing of miRNAs in cells overexpressing
GT17 cells. Microarray profiling demonstrated that most of the expanded CGG repeats raises the question whether a similar
miRNAs, which presented a modified expression, were reduced alteration occurs in patients with FXTAS. Microarray analysis of
upon transfection of a plasmid expressing 60 CGG repeats (Fig- cerebellar samples from patients with FXTAS revealed that
ure 3C). Decreased levels of mature miRNAs were confirmed by mis-regulation of miRNAs involved predominantly decreased
quantitative real-time RT-PCR (Figure 3D). The limited number expression compared to age-matched controls (Figure 4A).
(56) of miRNAs presenting an expression change, as well as Quantitative RT-PCR analysis confirmed reduced quantities of
the limited decrease (20%–50%) of miRNA levels, are consis- various mature miRNAs in patients with FXTAS relative to
tent with a progressive titration of DROSHA and DGCR8 and controls (Figure 4B). Note that the expression of mature miRNAs
with the early time point (24 hr after transfection) chosen for anal- was not fully abolished but decreased by 20%–50%, indicating
ysis. Also, we noted that the expression of a minority of miRNAs a partial titration of DROSHA and DGCR8 by the expanded
was upregulated upon expression of expanded CGG repeats. CGG repeats. In contrast, the quantity of mirtron-877, whose
However, a similar upregulation occurred at early time point biogenesis depends on the splicing machinery and bypasses
(24 hr after transfection) in neuronal GT17 or COS7 cells depleted DROSHA, was normal in FXTAS brain samples (Figure 4B). As
of DGCR8 by siRNA, suggesting the existence of rescue mech- a control, quantification of the primary transcripts hosting the
anisms to transiently increase the expression of some miRNAs in downregulated mature miRNAs demonstrated no changes or
response to DGCR8 reduction (Figures S3E and S3F). increased expression in patients with FXTAS (Figure 4C). We
Importantly, a decrease in miRNA expression could be confirmed these results in frontal cortex samples of patients
triggered by a specific alteration of the miRNA-processing with FXTAS compared to age-matched controls. Quantitative
machinery but may also reflect a global alteration of RNA tran- RT-PCR confirmed that expression of mature miRNAs was
scription due to reduced cell viability. To discriminate between decreased in patients with FXTAS (Figure 4D). Consistent with
these two hypotheses, we quantified the levels of the primary a specific alteration of the activity of DROSHA, the quantities
transcripts hosting the decreased miRNAs. Quantitative RT- of their corresponding pri-miRNAs were normal or increased in
PCR demonstrated that, whereas mature miRNAs presented FXTAS samples compared to age-matched control samples
reduced levels, expression of their corresponding pri-miRNAs (Figure 4E). As further controls, expressions of various mirtrons,
was not altered or, even, increased (Figure 3E). Similarly, the whose biogenesis is independent of DROSHA, were normal in
expression of various mRNAs containing pri-miRNAs within their patients with FXTAS (Figure 4F). Overall, these results suggest
introns was not altered (Figure 3F). Comparable decrease of that transcription and splicing of pri-miRNAs are not globally
mature miRNA levels with no alterations of the expression of altered in patients with FXTAS but that their processing by
their corresponding pri-miRNAs was observed in a second cell DROSHA is reduced.
model: COS7 cells expressing 60 CGG repeats (Figures S3G
and S3H). These results demonstrate that expanded CGG Overexpression of DGCR8 Rescues Neuronal Cell Death
repeats alter specifically the processing of pri-miRNAs, without A model of titration of DGCR8 by expanded CGG repeats
affecting their transcription. As a further control, we tested the in patients with FXTAS predicts that depletion of DGCR8
expression of mirtrons, which are miRNAs processed by the would enhance any phenotype caused by expanded CGG
splicing machinery, thus independent of the processing by repeats. To test that hypothesis, we took advantage of
A B
CGG 60x CUG 200x
CTL
CGG 60x CUG 100x
pri-miR-124
- + + + + + - + + + + + DGCR8 pre-miR-124
miRNA-124
Bound
Free
5.8S RNA
60
% pri/pre/miRNA
100
% pri-miR
% binding
75
50 30 % pre-miR
25 % miRNA
0
0
C
5
4
Fold change
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
D E F
CTL CGG 60x CTL CGG 60x CTL CGG 60x
*** ***
100 300 200
pri-miRNA/ U6
***
mRNA / Rplp0
* ** *** *** ***

miRNA/ U6
*** ***
*** *** *** ***
*** *** ***
*** *** 200
*** ***
50 100
100
0 0 0
G H
CTL CGG 60x + DGCR8 wt
CTL CGG 60x CGG 60x CGG 60x + DGCR8 mut
100 100
mirtron/ U6
miRNA/ U6
***
*** *** *** *** *** *** ***
*** *** ***
50 50 *** ***
*** *** ***
***
*** *** ***
0 0
Figure 3. DROSHA and DGCR8 Activities Are Reduced in CGG-Expressing Cells

(A) Gel shift assays of recombinant His-DGCR8D binding with 100 nM (30,000 cpm) of uniformly a-[32P]CTP internally labeled in-vitro-transcribed pri-miR-125 in
presence of increasing amounts of nonlabeled in-vitro-transcribed RNA containing either 60 CGG repeats or 100 CUG repeats.
(B) A total of 20 mg of total RNA extracted from COS7 cells cotransfected with a pri-miR-124-2 minigene and increasing amounts of a plasmid expressing either
60 CGG or 200 CUG repeats were analyzed by northern blotting using a miR-124 g-[32P]ATP-labeled antisense probe. The mean of at least three independent
transfections is depicted as the percentage of pri-, pre-, and mature miR-124-2. Error bars indicate SD.
(C) Microarray profiling of mature miRNAs expressed in GFP-positive FACS-isolated GT17 neuronal cells cotransfected with a plasmid expressing GFP and either
a plasmid expressing no repeats (n = 3) or 60 CGG repeats (CGG, n = 3). Ordinate is in Log2 scale.
(D–G) Quantitative RT-PCR analysis of the expression of mature (D), pri-miRNAs (E), mRNAs (F), and mirtrons (G) relative to the U6 snRNA or to the RPLPO mRNA
in GFP-positive FACS-isolated GT17 neuronal cells cotransfected with a plasmid expressing GFP and either a plasmid expressing no repeats (n = 3) or a plasmid
(legend continued on next page)
A B C
CTL FXTAS CTL FXTAS
10 150 400
pri-miRNA/ U6
miRNA/ U6
5 300
Fold change
100
0 200
50
100
-5
0 0
-10
hsa-miR-455-5p
hsa-miR-206
hsa-miR-502-3p
hsa-miR-193a-5p
hsa-miR-449a
hsa-miR-378*
hsa-miR-486-3p
hsa-miR-3065-5p
hsa-miR-135b
hsa-miR-30b*
hsa-miR-550a*
hsa-miR-337-3p
hsa-miR-502-5p
hsa-miR-654-5p
hsa-let-7i*
hsa-miR-30d*
hsa-miR-501-3p
hsa-miR-455-3p
hsa-miR-204
hsa-miR-31
hsa-miR-215
hsa-miR-192
hsa-miR-362-5p
hsa-miR-194
hsa-miR-376b
hsa-miR-486-5p
hsa-miR-320e
hsa-miR-320d
hsa-miR-320c
hsa-miR-320b
hsa-miR-195
hsa-miR-320a
hsa-miR-532-3p
hsa-miR-218
hsa-miR-654-3p
hsa-miR-299-3p
hsa-miR-362-3p
hsa-miR-381
hsa-miR-532-5p
hsa-miR-7-1*
hsa-miR-497
hsa-miR-299-5p
hsa-miR-376a
hsa-let-7i
hsa-let-7d*
hsa-miR-376c
hsa-miR-454
hsa-miR-660
hsa-miR-484
hsa-miR-378
hsa-miR-500a*
hsa-miR-101*
hsa-miR-193a-3p
hsa-miR-885-5p
hsa-miR-124
hsa-miR-26a
hsa-miR-342-5p
hsa-miR-557
hsa-miR-874
hsa-miR-26b
hsa-let-7b
hsa-miR-423-3p
hsa-miR-383
hsa-miR-30b
hsa-miR-33a
hsa-let-7a
hsa-miR-185
hsa-miR-346
hsa-miR-335
hsa-miR-769-5p
hsa-miR-193b
hsa-miR-7
hsa-miR-139-3p
hsa-miR-139-5p
hsa-miR-935
hsa-miR-1238
hsa-miR-133a
hsa-miR-582-5p
D E F
CTL FXTAS CTL FXTAS CTL FXTAS
100 400 100
pri-miRNA/ U6
mirtron/ U6
miRNA/ U6
300
50 200 50
100
0 0 0
Figure 4. miRNA Levels Are Reduced in FXTAS Brain Samples

(A) Microarray profiling of mature miRNAs expressed in cerebellum samples of FXTAS and age-matched control patients.
(B and C) Quantitative RT-PCR analysis of the expression of mature (B) and pri-miRNAs (C) relative to the U6 snRNA in cerebellum samples of FXTAS (n = 13) and
age-matched control (n = 4) patients.
(D–F) Quantitative RT-PCR analysis of the expression of mature (D), pri-miRNAs (E), and mirtrons (F) relative to the U6 snRNA in frontal cortex samples of FXTAS
(n = 3) and age-matched control (n = 2) patients. Error bars indicate SD.
the neurodegenerative phenotype observed in transgenic a plasmid expressing the GFP marker for 1 day (8 DIV). As
Drosophila melanogaster expressing 90 CGG repeats (Jin reported previously by Chen et al. (2010), expression of
et al., 2003). As previously described, expression of 90 CGG expanded CGG repeats resulted in shorter dendrites and an
repeats decreases adult Drosophila viability (Figure S4A). 40% decrease in dendritic branchpoints (Figures 5A and 5B).
Interestingly, decreased expression of Pasha (the Drosophila As a control, expression of expanded CUG repeats had no
homolog of DGCR8) by RNAi in CGG transgenic flies resulted or little effect on neuronal dendritic complexity, indicating a
in enhanced early lethality (Figure S4A). A similar aggravated specific deleterious effect of the expanded CGG repeats (Fig-
phenotype was observed with Drosha RNAi lines (Figure S4B). ure 5B). Importantly, the sole expression of a plasmid expressing
In contrast, overexpression of Drosha or Pasha in CGG flies DGCR8 restored normal dendritic growth and branching in neu-
had little or no effect and did not rescue fly lethality (data not rons expressing the expanded CGG repeats (Figures 5A and 5B).
shown). These data suggest that several pathological mecha- In contrast, expression of an inactive form of DGCR8, which was
nisms may coexist in the fly model of FXTAS, a model consistent deleted for its double-stranded RNA-binding domains, pre-
with the observation of cytoplasmic inclusions containing PURa sented no rescue activity (Figure 5B). Similarly, expression of
in Drosophila (Jin et al., 2007), but not in human cells (Sellier a control plasmid expressing MBNL1 had no significant effect
et al., 2010). Accordingly, we tested mammalian neuronal cells, and did not alleviate the dendritic alterations, indicating a specific
in which expression of expanded CGG repeats leads to forma- role for DGCR8 (Figure 5B). We also tried to rescue the neuronal
tion of CGG RNA nuclear aggregates without formation of cell death induced by expression of expanded CGG RNA
PURa-positive cytoplasmic aggregates. Organotypic cultures repeats by transfecting either miR-124, miR-9 or miR-125, which
of E18 mouse cortex neurons were transfected at 7 days are important miRNAs for neuronal cell function, but we failed to
in vitro (DIV) with a plasmid expressing 60 CGG repeats and observe a full rescue, suggesting that more than one miRNA is
expressing 60 CGG repeats (CGG, n = 3). DLEU2 is the host gene of pri-miR-16-1, CTDSPL of pri-miR-26a1, ABLIM2 of pri-miR-95, SKA2 of pri-miR-454, and
TLN2 of pri-miR-190. Error bars indicate SD.
(H) Quantitative RT-PCR analysis of the expression of mature miRNAs relative to U6 snRNAs in GFP-positive FACS-isolated GT17 neuronal cells cotransfected
with a plasmid expressing GFP, a plasmid expressing 60 CGG repeats, and either a vector expressing Flag-tagged wild-type (WT) DGCR8 or mutant (mut)
DGCR8, deleted for its double-stranded RRM. Error bars indicate SD.
***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.1.
See also Figure S3.
GFP CGG FLAG-DGCR8 Merged Magnification Figure 5. DGCR8 Is Sufficient to Rescue
A
Expanded CGG Toxicity
(A) Primary cultures of cortex neurons from
CTL
E18 mouse embryos were cotransfected with

a plasmid expressing GFP, a vector expressing
either no or 60 CGG repeats, and a plasmid ex-
pressing either a Flag-tagged wild-type DGCR8 or
CGG 60x
a mutant Flag-DGCR8 deleted for its double-

stranded RRM. Neurons were analyzed 24 hr
after transfection by RNA FISH using a CCG8x-Cy3
DNA probe coupled to IF using an antibody
directed against the FLAG tag. Magnification,
CGG 60x + CGG 60x +
DGCR8 mut DGCR8 wt
3603. Magnification of the insets, 2,5003. Scale

bars, 20 mm.
(B) Quantification of the number of dendritic
branchpoints of individual neurons transfected as
in (A). Error bars indicate SD.
(C) Cell viability (tetrazolium) assay of neuronal
GT17 cells transfected for 24 hr with a plasmid
expressing either 200 CUG repeats or 20, 40, or
60 CGG repeats alone, or 60 CGG repeats plus
a plasmid expressing either GFP-SAM68, Flag-
DICER, Flag-DROSHA or Flag-DGCR8. Error bars
B C indicate SD.
***p < 0.001; **p < 0.01.
Branchment points
20 100 See also Figure S4.

Cell viability
**
*** *** *** *** ***
10 *** 50
0 0
et al., 2011; Kiliszek et al., 2011), which

mimics the structure of pri-miRNAs
recognized by DGCR8 (Zeng and Cullen,
2005; Han et al., 2006). We propose that
DGCR8 interacts with the expanded
pathogenic CGG repeats located within
the 50 UTR of the FMR1 mRNA, thus
sequestering itself and its partner,
DROSHA (Figure 6). As a consequence,
probably necessary to restore normal neuronal functions. Next, the level of free DROSHA-DGCR8 microprocessor is decreased,
we tested whether DGCR8 can also rescue the neuronal cell reducing the expression of mature miRNAs and ultimately result-
death caused by expressing expanded CGG repeats. Transfec- ing in neuronal cell dysfunction and degeneration. In that aspect,
tion of a plasmid expressing 60 CGG repeats in neuronal GT17 our work is reminiscent of the abnormal miRNA biogenesis
cells resulted in a 50% decrease of the cell viability, whereas and phenotypic abnormalities caused by the genetic haploinsuf-
expression of either expanded CUG repeats or 20–40 control ficiency of Dgcr8 in the 22q11-deletion mouse model (Stark
CGG repeats was not toxic (Figure 5C). Importantly, the overex- et al., 2008; Fénelon et al., 2011; Schofield et al., 2011).
pression of DGCR8 alone or of DGCR8 plus DROSHA alleviated A DROSHA-DGCR8 titration model has several predicted
the cell death due to the expanded CGG repeats (Figure 5C). As consequences for FXTAS pathology. First, a model based on
a control, transfection of control plasmids expressing either DGCR8 titration predicts that the expansion of CGG repeats
DROSHA alone, DICER or SAM68 had no or little effect. Similar must exceed a minimal threshold size to accommodate DGCR8
results were obtained in COS7 cells (Figure S4C). Overall, these binding (Zeng and Cullen, 2005; Han et al., 2006). This is con-
results suggest that a reduced quantity of free DROSHA and sistent with the CGG repeat dependence of clinical involve-
DGCR8 is the principal cause of the decreased dendritic comment and degree of severity observed in patients with FXTAS
plexity and reduced cell viability observed in neuronal cells ex- (Tassone et al., 2007; Hoem et al., 2011), in whom it is estimated
pressing pathogenic-expanded CGG repeats. that ‘‘normal’’ CGG polymorphic repeat lengths are below 40
repeats, ‘‘gray zone’’ alleles contain 40–55 repeats, and patients
DISCUSSION with FXTAS are defined by premutation alleles containing 55–
200 CGG repeats. Second, we observed that miRNA expression
Our results suggest a model for the cellular dysfunction induced was decreased but not fully abolished, which is consistent with
by the expanded CGG repeats present within the 50 UTR of the a partial and progressive sequestration of DROSHA-DGCR8
FMR1 mRNA. Expanded CGG repeats form a double-stranded and, consequently, a progressive worsening of the disease
RNA hairpin (Sobczak et al., 2003; Zumwalt et al., 2007; Kumar symptoms. Third, previous studies have identified various
CTL contrast, expression of DGCR8 alone is sufficient to restore to
FXTAS
normal both the dendritic morphological abnormalities and the
loss of neuronal viability induced by expression of pathogenic-
pri-miRNA pri-miRNA CGG >50x expanded CGG repeats in cultured mouse neurons.
G
CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG
In conclusion, this work raises the possibility that other human
CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG
CGG <30x diseases could operate through a similar sequestration mecha-
G
nism, provided that the mutant RNA forms a secondary structure
CGGCGGCGGCGG
CGGCGGCGGCGG
that is recognized by the double-stranded RNA-binding protein,

DGCR8. An appealing hypothesis in light of the recent finding that
CGGCGG CGGCGG CGGCGG CGGCGG
DGCR8 DGCR8 DGCR8 noncoding RNAs exceed coding transcripts by more than 5-fold
Drosha Drosha Drosha and that an increasing number of potentially structured G-rich
expanded repeats are found associated with pathologies, such
as the expanded CCGGGG repeats in the C9ORF72 gene that
cause ALS-FTD (DeJesus-Hernandez et al., 2011). The current
pre-miRNA observations should also facilitate the development of novel
model systems to better understand the molecular and cellular
Dicer Reduced miRNA expression mechanisms underlying FXTAS. Finally, from the perspective of
FXTAS treatment, identification of a key interaction between
DGCR8 and the expanded CGG repeats represents an attractive
miRNA target for therapeutic intervention. Indeed, if DROSHA and
Neuronal cell degeneration
DGCR8 are sequestered, they are nevertheless present and
potentially functional; hence, a strategy based on CGG-anti-
Figure 6. Model of DROSHA and DGCR8 Titration by Expanded CGG
sense oligonucleotides or pharmacological compounds (Disney
Repeats
Expanded CGG repeats fold into a double-stranded RNA hairpin that recruits
et al., 2012) able to release the trapped DGCR8 would presum-
DGCR8, resulting in the titration and immobilization of DROSHA and DGCR8. ably return to normal the expression of miRNAs altered in FXTAS.
The reduced levels of free DROSHA and DGCR8 available to normally process
pri-miRNAs into pre-miRNAs result in reduced levels of mature miRNAs, and EXPERIMENTAL PROCEDURES
ultimately, in neuronal cell dysfunctions.
Nano-LC-MS/MS Analysis
Nuclear extract was prepared from mouse brain as described by Dignam et al.
proteins (e.g., PURa, hnRNP A2/B1, SAM68, etc.) as candidates (1983). A total of 300 mg of nuclear extract was passed over an in-vitro-tran-
for transduction of the CGG-expanded repeat toxicity (Iwahashi scribed and -biotinylated RNA (Biotin 11 CTP; PerkinElmer) bound to strepta-
et al., 2006; Jin et al., 2007; Sofola et al., 2007; Sellier et al., vidin-coated magnetic beads (Dynabeads M-280 streptavidin; Invitrogen) in
2010). However, the presence of cytoplasmic inclusions recruit- the presence of 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 0.01% NP40,
ing PURa in fly, but not in mammalian neuronal cells expressing 1 mM DTT, and protease inhibitor (PIC; Roche). The magnetic beads with
immobilized RNA and its bound proteins were washed three times with the
expanded CGG repeats, raises the question of the superimposi-
binding buffer, and bound proteins were eluted by boiling 3 min in the
tion of two different pathological mechanisms in Drosophila: one
sample buffer prior to 4%–12% SDS-PAGE (NuPAGE 4%–12% bis-Tris Gel;
involving PURa in cytoplasmic inclusions, and another involv- Invitrogen) separation and silver staining (SilverQuest; Invitrogen). The protein
ing the sequestration of specific RNA-binding protein(s) by bands were excised, digested, and identified using NanoESI_Ion Trap (LTQ
the expanded CGG repeats within nuclear aggregates. Such XL; Thermo Fisher Scientific).
superimposition of pathogenic mechanisms may explain why
overexpression of Pasha has no evident rescue effect in CGG- Cell Cultures and Transfections
Primary cortical neurons were prepared from C57Bl/6 mouse embryos at E18
transgenic Drosophila, whereas expression of DGCR8 rescues
and grown on polylysine-coated 24-well plates in neurobasal medium (NBM)
the toxicity induced by expression of expanded CGG repeats in supplemented with 13B27, 0.5 mM L-glutamine, and 100 IU/ml penicillin/
primary cultures of mouse neurons. Also, this superimposition streptomycin at 37 C with 5% CO2. Neurons were transfected at day 7 with
model would explain the presence of ubiquitin-positive aggre- Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in 400 ml NBM. Medium was replaced after
gates that do not colocalize with CGG RNA aggregates in knockin 3 hr with a 1:1 (v:v) mixture of conditioned and fresh NBM. After 30 hr, the
mouse models expressing expanded CGG repeats, as well as neurons were fixed for FISH/ IF. COS7 cells were cultured in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium (DMEM), 10% fetal bovine serum, and gentamicin
the recent report that only a subset of miRNAs is mis-regulated
at 37 C in 5% CO2. PC12 cells were cultured in DMEM, 10% horse serum,
in Drosophila expressing expanded CGG repeats (Tan et al., 5% fetal calf serum, and penicillin at 37 C, 5% CO2. GT17 cells were grown
2012). Whether such a superimposition of pathological mecha- in 10% fetal bovine serum, gentamicin, and penicillin at 37 C in 5% CO2 and
nisms also exists in patients with FXTAS remains an open ques- transfected 24 hr after plating in DMEM and 0.1% fetal bovine serum to block
tion, yet to be determined. Finally, we found previously that cell divisions, using either FuGENE HD (Roche) for COS7 cells or Lipofect-
SAM68 is sequestered within CGG RNA aggregates and that amine 2000 for PC12 or GT17 cells. For RNA FISH/IF, GT17 cells were plated
in 24-well plates on glass coverslips precoated with a solution of 1% collagen
SAM68 rescues some of the splicing alterations observed in
type I (BD Biosciences).
CGG-expressing cells (Sellier et al., 2010). However, we now
show that the sequestration of SAM68 into CGG RNA aggre- RNA FISH Combined with IF
gates requires DGCR8 and that restoration of SAM68 function Patients with FXTAS have been described previously (case 6, 7, and 9 of
is not sufficient to recover all normal neuronal cell functions. By Greco et al., 2006). Mouse or human brain sections were deparaffinized
two times for 20 min in Histosol Plus (Shandon) and dehydrated as follows: supported by ANR GENOPAT grant P007942 (to N.C.-B.), AFM and
twice in ethanol 100% (5 min), twice in ethanol 95% (5 min), once in ethanol Jérôme Lejeune funding (to N.C.-B.), Collège de France (to C.S.), NIH
80% (5 min), once in ethanol 70% (5 min), and rinsed in PBS before RNA grant K08NS069809 (to P.K.T.), NIH-NINDS grant NS062411 (to R.W.),
FISH. Glass coverslips containing plated cells or brain sections treated as Netherlands Brain Foundation (F2012(1)-101) (to R.W.), NIH grant
described above were fixed in cold acetone during 20 min at 20 C and 1R01GM079235-01A2 (to M.D.D.), and the NIH Roadmap Initiative grants
washed three times with PBS. The coverslips or slides were incubated for DE019583 and AG032119 (to P.J.H.). Experiments were performed by
10 min in PBS plus 0.5% Triton X-100 and washed three times with C.S., F.F., R.T., F.H., T.T., F.R., and V.A. Samples and patient data were ob-
PBS before prehybridization in 40% DMSO, 40% formamide, 10% BSA tained from F.T., P.J.H., and R.W. Data were analyzed by C.S., C.T., A.P.,
(10 mg/ml), 23 SCC for 30 min. The coverslips or slides were hybridized M.D.D., P.K.T., H.M., R.W., N.C.-B., and P.J.H. The study was designed
for 2 hr in 40% formamide, 10% DMSO, 23 SCC, 2 mM vanadyl ribonucle- and coordinated by N.C.-B.
oside, 60 mg/ml tRNA, and 30 mg/ml BSA plus 0.75 mg (CCG)83-Cy3 DNA
oligonucleotide probe (Sigma-Aldrich). The coverslips or slides were washed Received: June 26, 2012
twice in 23 SCC/50% formamide and twice in 23 SCC. Following FISH, the Revised: November 30, 2012
coverslips or slides were washed twice successively in 23 SCC/50% form- Accepted: February 1, 2013
amide, in 23 SCC, and in PBS. The coverslips or slides were incubated 2 hr Published: March 7, 2013
with primary antibody against Drosha (1:100 dilution, AB12286; Abcam) or
DGCR8 (1:100 dilution, HPA019965; Sigma-Aldrich). Slides or coverslips REFERENCES
were washed twice with PBS before incubation with a goat anti-rabbit
secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (1:500 dilution; Thermo Arocena, D.G., Iwahashi, C.K., Won, N., Beilina, A., Ludwig, A.L., Tassone,
Fisher Scientific) for 60 min, incubated for 10 min in 23 SCC/DAPI (1:10,000 F., Schwartz, P.H., and Hagerman, P.J. (2005). Induction of inclusion
dilution), and rinsed twice in 2 3 SSC before mounting in Pro-Long media formation and disruption of lamin A/C structure by premutation CGG-
(Molecular Probes). Slides were examined using a fluorescence microscope repeat RNA in human cultured neural cells. Hum. Mol. Genet. 14, 3661–
(Leica), and identical exposure or microscope setting was used for control or 3671.
FXTAS brain section analyses.
Bañez-Coronel, M., Porta, S., Kagerbauer, B., Mateu-Huertas, E., Pantano, L.,
Ferrer, I., Guzmán, M., Estivill, X., and Martı́, E. (2012). A pathogenic mecha-
Quantitative Real-Time PCR
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Total RNA from cells or patient brains, the latter obtained under approved IRB
toxic activity. PLoS Genet. 8, e1002481.
protocols (University of California, Davis), was isolated by TriReagent (Molec-
ular Research Center). cDNAs were generated using the miScript II RT Kit Chen, Y., Tassone, F., Berman, R.F., Hagerman, P.J., Hagerman, R.J., Willem-
(QIAGEN) for quantification of miRNAs or the Transcriptor High Fidelity sen, R., and Pessah, I.N. (2010). Murine hippocampal neurons expressing
cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics) for quantification of mRNAs. qPCR Fmr1 gene premutations show early developmental deficits and late degener-
of miRNAs was realized using the miScript Primer Assay (QIAGEN) and ation. Hum. Mol. Genet. 19, 196–208.
miScript Sybr Green PCR Kit (QIAGEN) in a LightCycler 480 (Roche) with Davis, T.H., Cuellar, T.L., Koch, S.M., Barker, A.J., Harfe, B.D., McManus,
15 min at 94 C followed by 50 cycles of 15 s at 94 C, 20 s at 55 C, and 20 s M.T., and Ullian, E.M. (2008). Conditional loss of Dicer disrupts cellular
at 72 C. U6 snRNA was used as standard. qPCR of mRNAs was realized using and tissue morphogenesis in the cortex and hippocampus. J. Neurosci. 28,
the LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) in a LightCycler 480 with 4322–4330.
15 min at 94 C followed by 50 cycles of 15 s at 94 C, 20 s at 58 C, and 20 s DeJesus-Hernandez, M., Mackenzie, I.R., Boeve, B.F., Boxer, A.L., Baker, M.,
at 72 C. The primers are listed in Table S1. RPLPO mRNA was used as stan- Rutherford, N.J., Nicholson, A.M., Finch, N.A., Flynn, H., Adamson, J., et al.
dard, and data were analyzed using the LightCycler 480 analysis software (2011). Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region
(2DCt method). of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72,
For additional details, please see the Extended Experimental Procedures. 245–256.
Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F., and Hannon, G.J. (2004).
SUPPLEMENTAL INFORMATION Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature
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Supplemental Information includes Extended Experimental Procedures, four
De Pietri Tonelli, D., Pulvers, J.N., Haffner, C., Murchison, E.P., Hannon, G.J.,
figures, and two tables and can be found with this article online at http://dx.
and Huttner, W.B. (2008). miRNAs are essential for survival and differentiation
doi.org/10.1016/j.celrep.2013.02.004.
of newborn neurons but not for expansion of neural progenitors during early
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LICENSING INFORMATION 3921.
Dignam, J.D., Lebovitz, R.M., and Roeder, R.G. (1983). Accurate transcription
This is an open-access article distributed under the terms of the Creative
initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian
Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works License, which
nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475–1489.
permits non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium,
provided the original author and source are credited. Disney, M.D., Liu, B., Yang, W.Y., Sellier, C., Tran, T., Charlet-Berguerand, N.,
and Childs-Disney, J.L. (2012). A small molecule that targets r(CGG)(exp) and
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ACKNOWLEDGMENTS
Biol. 7, 1711–1718.
We thank Tom Cooper (Baylor College of Medicine, Houston) and Joelle Entezam, A., Biacsi, R., Orrison, B., Saha, T., Hoffman, G.E., Grabczyk, E.,
Marie (CNRS, Gif-sur-Yvette, France) for the gift of the CUG-expressing Nussbaum, R.L., and Usdin, K. (2007). Regional FMRP deficits and large
plasmids, Karen Usdin (NIH, Bethesda, MD, USA) for the gift of the CGG repeat expansions into the full mutation range in a new Fragile X premutation
65x-expressing plasmid, Narry Kim (University of Seoul, Seoul, Korea) for mouse model. Gene 395, 125–134.
the gift of the Flag-DROSHA and Flag-DGCR8 WT or mutant plasmids, Fénelon, K., Mukai, J., Xu, B., Hsu, P.K., Drew, L.J., Karayiorgou, M., Fisch-
Peng Jin (Emory School of Medicine, Atlanta), who provided the FXTAS bach, G.D., Macdermott, A.B., and Gogos, J.A. (2011). Deficiency of Dgcr8,
model flies, Scott Pletcher (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA), a gene disrupted by the 22q11.2 microdeletion, results in altered short-
who provided the Geneswitch flies, and Claudio Sette (University of Tor term plasticity in the prefrontal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108,
Vergata, Roma) for the gift of the GFP-SAM68 construct. This work was 4447–4452.
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Publication 3
Publication 3
166
A Novel Role for the RNA–Binding Protein FXR1P in
Myoblasts Cell-Cycle Progression by Modulating p21/
Cdkn1a/Cip1/Waf1 mRNA Stability
Laetitia Davidovic1,2, Nelly Durand1,2, Olfa Khalfallah1,2, Ricardo Tabet3, Pascal Barbry1,2,
Bernard Mari1,2, Sabrina Sacconi4, Hervé Moine3, Barbara Bardoni1,2*
1 Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 7275, Valbonne, France, 2 Université de Nice-Sophia Antipolis, Nice, France, 3 IGBMC (Institut de
Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire), CNRS, UMR7104, Inserm U596, Collège de France, Strasbourg University, Illkirch-Graffenstaden, France, 4 INSERM U638,
Faculté de Médecine, Université de Nice Sophia-Antipolis, Centre de Référence pour les Maladies Neuromusculaires, CHU de Nice, Nice, France
Abstract
The Fragile X-Related 1 gene (FXR1) is a paralog of the Fragile X Mental Retardation 1 gene (FMR1), whose absence causes
the Fragile X syndrome, the most common form of inherited intellectual disability. FXR1P plays an important role in normal
muscle development, and its absence causes muscular abnormalities in mice, frog, and zebrafish. Seven alternatively spliced
FXR1 transcripts have been identified and two of them are skeletal muscle-specific. A reduction of these isoforms is found in
myoblasts from Facio-Scapulo Humeral Dystrophy (FSHD) patients. FXR1P is an RNA–binding protein involved in
translational control; however, so far, no mRNA target of FXR1P has been linked to the drastic muscular phenotypes caused
by its absence. In this study, gene expression profiling of C2C12 myoblasts reveals that transcripts involved in cell cycle and
muscular development pathways are modulated by Fxr1-depletion. We observed an increase of p21—a regulator of cell-
cycle progression—in Fxr1-knocked-down mouse C2C12 and FSHD human myoblasts. Rescue of this molecular phenotype
is possible by re-expressing human FXR1P in Fxr1-depleted C2C12 cells. FXR1P muscle-specific isoforms bind p21 mRNA via
direct interaction with a conserved G-quadruplex located in its 39 untranslated region. The FXR1P/G-quadruplex complex
reduces the half-life of p21 mRNA. In the absence of FXR1P, the upregulation of p21 mRNA determines the elevated level of
its protein product that affects cell-cycle progression inducing a premature cell-cycle exit and generating a pool of cells
blocked at G0. Our study describes a novel role of FXR1P that has crucial implications for the understanding of its role
during myogenesis and muscle development, since we show here that in its absence a reduced number of myoblasts will be
available for muscle formation/regeneration, shedding new light into the pathophysiology of FSHD.
Citation: Davidovic L, Durand N, Khalfallah O, Tabet R, Barbry P, et al. (2013) A Novel Role for the RNA–Binding Protein FXR1P in Myoblasts Cell-Cycle Progression
by Modulating p21/Cdkn1a/Cip1/Waf1 mRNA Stability. PLoS Genet 9(3): e1003367. doi:10.1371/journal.pgen.1003367
Editor: Gregory A. Cox, The Jackson Laboratory, United States of America
Received August 21, 2012; Accepted January 21, 2013; Published March 21, 2013
Copyright: ß 2013 Davidovic et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: LD was funded by CNRS, the FRAXA Research Foundation 2010-12, and the Marie Curie European Community Program (FP6 MEIF-CT-2006-41096 and
FP7-PEOPLE-ERG-2008-239290). BB was funded by CNRS, LIA ‘‘NEOGENEX,’’ INSERM, Agence Nationale de la Recherche (ANR) grant ANR-09-RARE-02-05, and by
two French charities: Fondation Recherche Médicale call TEAM FRM 2009 and AFM (Association Française contre les Myopathies) Call MNMP2010 grant NR 13536.
BB and LD were supported by Conseil Général Region PACA. OK was supported by a ‘‘Ville de Nice’’ post-doctoral fellowship. The funders had no role in study
design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
Introduction differentiation [7,8,9,10]. Importantly, these muscle-specific

mRNA variants of FXR1 are the only expressed in adult muscle
The Fragile X-Related 1 (FXR1) gene belongs to a small gene [6,7,8,9,11]. Defects in FXR1 gene muscular pattern of expression
family that includes the Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) have been observed in patients affected by Facio-Scapulo Humeral
and Fragile X-Related 2 (FXR2) genes (reviewed in [1]). Human Distrophy (FSHD), the most prevalent muscular dystrophy
FMR1 is located on chromosome Xq27.3 [2] and inactivation of affecting adults and children [9]. Similar defects were observed
FMR1 expression leads to the Fragile X syndrome in human, the in a mouse model of myotonic dystrophy (DM1, [12]). As a result,
first cause of inherited mental retardation [5]. FXR1 and FXR2 are the long isoforms FXR1P Isoe and Isof of 82–84 kDa are depleted
autosomal genes, respectively mapping at 3q28 and 17p13.1 [3,4]. in myopathic muscle. Consistent with these altered expression
The FXR1 gene is highly expressed in muscle and its pre-mRNA is pattern of FXR1 in myopathic patients, Fxr1-knockout mouse die
known to undergo extensive alternative splicing, which generates shortly after birth most likely due to an abnormal development of
distinct FXR1 mRNA variants that produce FXR1P isoforms with cardiac and respiratory muscles [13]. A mouse model with
divergent C-terminal regions [6,7]. Four isoforms ranging from 70 reduced levels of Fxr1 expression has also been generated, and
to 80 KDa (Isoa, Isob, Isoc, Isod) are ubiquitously expressed, displays reduced limb musculature and a shorter life span of about
including in murine [7,8] and human myoblasts [9]. Myoblasts 18 weeks [13]. Moreover, during Xenopus embryogenesis, complete
also express long muscle-specific FXR1 mRNA variants, termed or partial inactivation of xFxr1 disrupts somitic myotomal cell
Isoe and Isof, which are massively induced upon muscular rotation and segmentation, impeding normal myogenesis [14].
PLOS Genetics | www.plosgenetics.org 1 March 2013 | Volume 9 | Issue 3 | e1003367

Muscle-Specific FXR1P Isoforms Regulate p21 Levels
Author Summary premature cell cycle exit of myoblasts. We link this to a robust
increase in the levels of the cyclin-dependant inhibitor p21/
Muscle development is a complex process controlled by Cdkn1a/Cip1/Waf1, that is also observed in FSHD-derived
the timely expression of genes encoding crucial regulators myoblasts. In this study, we further explore the role played by the
of the muscle cell precursors called myoblasts. We know direct interaction of FXR1P with p21 mRNA in the post-
from previous studies that inactivation of the Fragile X transcriptional control of p21 levels.
related 1 (FXR1) gene in various animal models (mouse,
frog, and zebrafish) causes muscular and cardiac abnor- Results
malities. Also, FXR1P is reduced in a human myopathy
called Fascio-Scapulo Humeral Dystrophy (FSHD), suggest- Inactivation of Fxr1 in C2C12 myoblasts selectively affects
ing its critical role in muscle that findings presented in this
the expression of a range of genes associated with cell-
study contribute to elucidating. Cell-cycle arrest is a
prerequisite to differentiation of myoblasts into mature cycle regulation during muscle development
myotubes, which will form the muscle. One key regulator To understand the functional role of FXR1P in myoblasts, we
is the p21/Cdkn1a/Cip1/Waf1 protein, which commands used as a cellular model the C2C12 myoblastic cell line. This
myoblasts to stop proliferating, and this action is partic- murine cell line enables to reproduce myogenesis in vitro [23] and
ularly important during muscle regeneration. In this study, expresses all the myogenic factors as well as FXR1P [7,8]. In this
we have identified FXR1P as a novel regulator of p21 model, we inactivated the expression of all FXR1P isoforms by
expression. We show that FXR1P absence in mouse transient transfection of siRNAs targeting exon 14, a constitutive
myoblasts and FSHD-derived myopathic myoblasts in- exon present in all Fxr1 mRNAs [6]. As shown in Figure 1A,
creases abnormally the levels of p21, causing a premature quantitative RT-PCR performed on C2C12 cells transfected with
cell cycle exit of myoblasts. Our study predicts that FXR1P siFxr1 siRNAs reveals a significant reduction in Fxr1 mRNA as
absence leads to a reduced number of myoblasts available compared to siControl-transfected cells (13.45%63.4% residual
for muscle formation and regeneration. This explains the expression, Figure 1A). Knockdown of all isoforms of FXR1P was
drastic effects of FXR1 inactivation on muscle and brings a obtained by siFxr1 transfection, as shown by western-blot analysis
better understanding of the molecular/cellular bases of using the 3FX antibody (Figure 1B, [8]). Note that the levels of
FSHD. FXR2P, the close homologue of FXR1P, also recognized by 3FX
antibody, remain unaffected, confirming the specificity of the
knockdown strategy (asterisk, Figure 1B). In siFxr1-transfected
Finally, depletion of zFxr1p during early development of the myoblasts, the decrease in epifluorescence signal after FXR1P-
zebrafish leads to cardiomyopathy and muscular distrophy [15]. immunolabeling as compared to siControl-transfected cells con-
All these data point out an evolutionarily conserved role for firms the efficiency of the knockdown (Figure 1C). The knockdown
FXR1P in myogenesis. appears to homogenously affect all the cells since the signal is
FXR1P contains two KH domains and one RGG box that are uniformly decreased. Note that in C2C12 cells, FXR1P immuno-
characteristic motifs in RNA-binding proteins [4,16]. In addition, reactivity is mainly cytoplasmic, however, signal is also detected in
FXR1P harbours nuclear localization and export signals (NLS and the nucleus (Figure 1C). Indeed, we confirmed the partial nuclear
NES) enabling nucleocytoplasmic shuttling [4,17]. In most cell localization of FXR1P in myoblasts by confocal microscopy
types and tissues studied, FXR1P isoforms are associated to (Figure 1D), as described previously for the long isoforms of
messenger ribonucleoparticles (mRNPs) present on polyribosomes, FXR1P in C2C12 myoblasts [7] and in human myoblasts [9].
suggesting a consensus role in translation regulation for FXR1P To determine the impact of the inactivation of Fxr1 on gene
[18]. However, it was reported that, in undifferentiated myoblasts, expression in myoblasts, total RNA was extracted from siControl
FXR1P long isoforms Isoe and Isof are not detected on and siFxr1-transfected C2C12 myoblasts and simultaneously
polyribosomes, suggesting a role other than translation regulation analysed using whole genome mouse microarrays. Among the
for these isoforms at this stage [7,8]. Very few specific target genes showing measurable differential levels of expression, a
mRNAs for FXR1P have been identified so far, and even more significant change was observed for 105 transcripts (32 down- and
scarcely in the context of myogenesis. First, two independent 73 up-regulated) of which 79 were annotated in the RefSeq
studies reported that the shortest isoform of FXR1P, Isoa, binds database (Figure 1E and Table S1). As expected, Fxr1 mRNA
the AU-rich element (ARE) present in the 39UTR of proin- appears among the most significantly down-regulated in siFxr1-
flammatory cytokine tumor necrosis factor (TNFa) mRNA [19,20]. transfected cells (Figure 1E and Table S1). To confirm the
In this context, FXR1P associates with AGO2 on TNFa2ARE to observed dysregulation of a subset of mRNAs in Fxr1-knockdown
modulate its translation [20]. Second, we have previously shown C2C12 myoblasts, we performed quantitative RT-PCR analysis
the ability of FXR1P Isoe, its long muscle-specific isoform, to (Figure 1F). Interestingly, in Fxr1-depleted myoblasts, we were able
interact specifically and with high affinity with the G-quadruplex to confirm by quantitative RT-PCR a significant upregulation of
RNA structure in vitro [21]. However, no mRNA target of FXR1P mRNAs encoding: Semaphorin 7a (Sema7a), the Ca2+-binding
bearing a G-quadruplex has been identified yet in vivo. Finally, one multiple C2 domains transmembrane protein 2 (Mctp2), asialogly-
study reports the presence of Desmoplakin and Talin2 mRNAs in coprotein receptor 1 (Asgr1), the cyclin-dependant kinase inhibitor
FXR1P-mRNP complexes and subsequent disturbance of the p21 (p21/Cdkn1a/Waf1/Cip1), Hepatocyte growth factor (Hgf),
expression of the encoded proteins in Fxr1-KO heart extracts [22]. Dual specific phosphatase (Dusp6) and finally Limb-bud and heart
However, neither the binding motif/sequence recognized by protein (Lbh, Figure 1E). Conversely, we confirmed a significant
FXR1P on these mRNAs nor the exact functional significance of down-regulation of Cdk15 mRNA encoding the cyclin-dependent
these interactions have been explored. kinase 15. Finally, the mRNAs encoding the myoregulatory factors
To gain further insights into the muscular roles of FXR1P and MyoD and Myogenin for which no mRNA variations were
the pathways perturbed in its absence, we performed a large-scale detected by microarray analysis remained unaffected (Figure 1F).
microarray analysis of the C2C12 myoblastic cell line inactivated These analyses were further repeated on C2C12 cells inactivated
for Fxr1. This analysis revealed that Fxr1-depletion lead to for Fxr1 by transfection of a different siRNA (siFxr1#2) targeting

Figure 1. Microarray analysis of Fxr1-depleted C2C12 myoblasts. (A) Quantitative RT-PCR reveals a strong reduction of Fxr1 mRNA in C2C12
cells transfected with siRNA against Fxr1 compared to siControl-transfected cells. (B) Western-blot analysis of untransfected (UT) and siFxr1-
transfected cells (siFxr1) revealed with the antibody #3FX recognizing all isoforms of FXR1P reveals a strong depletion of all isoforms of FXR1P (short,
medium and long) compared to control (siCtl), while the levels of FXR2P protein (asterisk, *) remain unchanged. b-tubulin (b-tub) signal is used to
verify equal loading of lanes. (C) Immunofluorescence analysis of FXR1P (red) subcellular distribution in siControl and siFxr1-transfected cells, using
polyclonal #830 anti-FXR1P antibodies. Nuclei were counterstained with DAPI (blue) and merge images are shown in the right panel. The same
exposure time was used for both image captures and reveal a strong depletion in FXR1P signal in siFxr1-transfected cells compared to control
(siControl). Scale bar: 15 mm. (D) Confocal micrographs of C2C12 cells immunostained for FXR1P reveal a nucleocytoplasmic distribution of FXR1P.
Please note the nuclear dot-like structures containing FXR1P. Slice depth: 1 mm, scale bar: 15 mm. (E) Volcano plot showing the distribution of
differentially expressed transcripts between C2C12 cells transfected with siRNA against Fxr1 versus siControl-transfected cells. Log of the fold of
change (LogFC) is plotted against the B-statistic value for each transcript. A subset of 9 transcripts selected for further validation by Quantitative-RT
PCR (Fxr1, Cdk15, Sema7a, Mctp2, Asgr1, Hgf, p21, Dusp6 and Lbh) are highlighted. Significantly down- and up-regulated genes are shown in green and
red, respectively. (F) Quantitative-RT PCR analysis of a subset of mRNAs confirm that Sema7a, Mctp2, Asgr1, p21, Hgf, Dusp6, Lbh, MyoD and Myog are
significantly upregulated in Fxr1-depleted C2C12 myoblast, while Cdk15 is downregulated, confirming the microarray analysis. Data are presented as
means 6 SEM of n = 4 experiments.
doi:10.1371/journal.pgen.1003367.g001
Fxr1 exon 6, another constitutive exon of Fxr1 present in all its To gain insights into the pathways perturbed by Fxr1 depletion,
variants [6]. This second siRNA leads to a 37% residual we performed an analysis of the biological functions or processes
expression of Fxr1 mRNA (Figure S1A) and reduces all FXR1P selectively enriched among the altered transcripts, using the
isoforms (Figure S1B) as compared to siControl. In addition, Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (Table S2). Interest-
siFxr1#2-mediated knockdown of Fxr1 efficiently modulated the ingly, Fxr1 knockdown in C2C12 myoblasts significantly affected
previously studied subset of mRNAs to induce variations similar to the functional categories ‘cell cycle’ (Table S2), ‘skeletal and
the one observed with the first siRNA against Fxr1 (Figure S1C). muscular system development and function’ and ‘skeletal and
Importantly, this cross-analysis using two siRNAs targeting distinct muscular disorders’ (Table S2). Importantly enough, a subset of
regions of Fxr1 mRNA exclude the fact that the observed mRNAs perturbed in siFxr1-knockdown myoblasts compared to
variations could derive from off-target effects of the siRNAs. control repeatedly appeared determinant for the definition of the
affected functional categories: the cyclin-dependent kinase (Cdk15),

the cyclin-dependent kinase inhibitor (p21/Cdkn1a/Cip1/Waf1) The absence of FXR1P in C2C12 cells and in FSHD
and the Hepatocyte growth factor (Hgf). patients-derived myoblasts affects the levels of
endogenous p21 mRNA and protein
Fxr1-depletion in myoblasts leads to premature exit of The premature cell cycle arrest we observed in Fxr1-depleted
cell cycle myoblasts prompted us to examine the subset of deregulated
One of the most recurrent terms in IPA analysis of dysregulated mRNAs identified by microarray analysis in order to identify
mRNA upon Fxr1 depletion were ‘cell cycle progression’, ‘arrest in candidates for regulation by FXR1P that could contribute to
G0/G1’, ‘proliferation’ and also ‘cell viability’ (Table S2). This explain this phenotype. The most promising mRNA candidate
prompted us to analyse myoblasts’ viability and proliferation appeared to encode the ubiquitous cyclin-dependent kinase
abilities upon Fxr1-depletion. Fluorescence-Activated Cell Sorting inhibitor (CDKI) p21 –also known as Cdkn1a/Cip1/Waf1- that
(FACS) analysis of the DNA intercalant Propidium Iodide (PI) belongs to the Cip/Kip family of CDKI. In myoblasts, p21 is
incorporation on living cells allowed us to detect no changes in the known to block cell cycle progression to trigger cell-cycle exit, a
overall viability of Fxr1-knockdown (92.5% viability) compared to prerequisite to muscular differentiation [27,28,29].
control (90.53% viability) C2C12 cells (Figure 2A). To assess the In Fxr1-depleted myoblasts, we found that p21 mRNA level is
proliferation ability of Fxr1-depleted myoblasts, we conducted significantly increased by microarray analysis (Figure 1E, Table
tetrazole MTT proliferation assays. Interestingly, after 48 hours in S1) and confirmed a 1.76-fold upregulation of the transcript by
culture, siFxr1-transfected C2C12 cells exhibit a significant 15% quantitative-RT PCR in these Fxr1 loss-of-function experiments (cf
decrease in MTT reductase activity as compared to control Figure 1F). This upregulation of p21 mRNA level in Fxr1-depleted
(Figure 2B). This suggests that Fxr1 depletion may induce myobasts was further confirmed using a second siRNA targeting
alterations of myoblasts cell cycle. We therefore further analysed Fxr1 (Figure S1). We had previously shown that the muscle-specific
the distribution in the various cell cycle phases of siFxr1- or long isoforms of FXR1P, notably Isoe, are depleted in myoblasts
siControl transfected myoblasts. The DNA content of the cells was derived from Fascio-ScapuloHumeral Distrophy (FSHD) patients
assessed by FACS-measurement of the amount of PI incorporated and had hypothesized that this could induce deregulation of
in cells. Surprisingly, in a normal asynchronous cell population, we mRNA targets specific to this isoform FXR1P Isoe [9]. To test this
did not observe any significant change in the cell cycle phases hypothesis on this new potential mRNA target of FXR1P, we
distribution of the C2C12 cells transfected with siFxr1 or assessed the status of human P21 in the same samples used in our
siControl, in normal growth conditions (Figure 2C). previous study. Interestingly enough, P21 mRNA levels are
To highlight specific defects in cell cycle, we synchronized significantly increased in FSHD patients by a 1.8 factor
siFxr1- and siControl-transfected myoblasts by treatment with the (Figure 4A).
cell cycle blocker mimosine, that arrests cell cycle progression at We then sought to verify whether this increase in p21 at the
mRNA level was translated at the protein level by western-blotting
the G1/S phase border [24]. Since the effects of this cell cycle
(WB) analysis. Quantification of WB of siFxr1-transfected C2C12
blocker are fully reversible, we then allowed the synchronized cells
using the ImageJ software revealed a 1.92 fold increase in p21
to reenter cell cycle by incubating them in normal growth medium
protein levels (Figure 4B). Concomitantly, we observed by western-
for 16 hrs before FACS analysis. In these conditions, we did
blotting that the levels of P21 protein are increased in FSHD
observe a significant 27.6% increase in the number of cells in the
myoblasts compared to control by a 1.66 factor (Figure 4C). These
G0/G1 phase in Fxr1-knockdown myoblasts, as compared to
data indicate that depletion of FXR1P and particularly of its long
control. This increase in the G0/G1 population is accompanied by
muscle-specific isoforms increases p21 mRNA and correlatively
a 51.9% decrease in the number of cells in the G2/M phase. increase the levels of p21 protein both in murine and human
Importantly, no differences were observed in the proportion of myoblasts.
cells in the Sub-G1 phase - corresponding to cellular debris with a To assess the specificity and the direct nature of the effects we
lower DNA content liberated by apoptotic cells [25]- in observed on p21 mRNA levels by FXR1P loss of function
asynchronous cells (Figure 2A) and after release from cell cycle experiments, we first used a gain-of-function approach. For these
blocker (Figure 2D). These data indicate that FXR1P depletion in experiments, we used FXR1P long isoform Isoe since its depletion
myoblasts does not lead to cell viability defects but rather causes a in FSHD myoblasts recapitulates the effects on p21 mRNA levels
blockade and accumulation of cells in the G0/G1 phase to the of a knockdown of all FXR1P isoforms in C2C12 cells (cf Figure 4).
detriment of mitosis. Interestingly, in contrast to Fxr1 loss-of-function in C2C12
Thus, to determine whether the cells were blocked in G0 or G1, myoblasts, over expression of FXR1P Isoe lead to a 19,1%
we performed immunolabeling of C2C12 cells in normal growth significant decrease in endogenous p21 mRNA levels as compared
conditions and quantified the number of DAPI-positive nuclei and to transfection with empty vector (Figure 5A). This ascertains the
the amount of cells positive for the proliferation marker Ki67 fact that the effects we observe on p21 mRNA levels are directly
(Figure 3). We observed that the number of nuclei in cultures of related to the levels of FXR1P present in the cell. Secondly, we
siFxr1-transfected myoblasts is decreased by 26%, suggesting that performed rescue experiments using a pTL1 plasmid bearing
Fxr1 depletion limits the proliferating abilities of myoblasts FXR1 Isoe cDNA in which we generated by site-directed
(Figure 3B). Quantification of cells expressing Ki67 enabled us mutagenesis 4 mismatches to avoid recognition of the transgene
to detect that siRNA-meditated depletion in Fxr1 leads to a subtle, by siFxr1 (Figure 5B). This strategy enabled to efficiently re-
but significant 10% decrease in the number of Ki67-positive cells express FXR1P Isoe in Fxr1-knocked down myoblasts (Figure 5C).
compared to control (Figure 3C). Since Ki67 is expressed during Rescue of the expression of FXR1P Isoe lead to a significant
all active phases of the cell cycle (G1, S, G2, and mitosis), but reduction in p21 mRNA levels as compared to unrescued
absent from quiescent cells (G0) [26], the unlabeled cells most myoblasts. The rescue with FXR1P Isoe is total since the levels
likely represent resting cells blocked in G0. of p21 mRNA in rescued cells are restored to control levels. Of
notice, similar results were obtained using another mutant plasmid
of pTL1.Isoe (data not shown), confirming the efficiency of the
rescue strategy.


Figure 2. Fxr1-depletion does not impair myoblasts viability but specifically induces accumulation in G0/G1 phase to the detriment
of mitosis. (A) PI incorporation in living siFxr1- or siControl-transfected cultures and subsequent FACS analysis was performed to show that viability
of the culture is not affected by Fxr1-depletion. (B) MTT colorimetric assay show that the proliferation abilities of C2C12 cells are significantly impaired
by Fxr1-depletion. (C) FACS analysis of the Propidium Iodure-stained DNA content of C2C12 cells transfected with siControl or siFxr1. Cells were
analysed in asynchronous conditions or following synchronisation treatment for 8 hrs with the cell cycle blocker mimosine (late G1) followed by
16 hrs release in normal growth medium (D). In asynchronous conditions, cell cycle distribution is similar in siControl or siFxr1 transfected cells.
Synchronisation of cells allows detecting significant differences in the distribution of the cells in the various cell cycle absence of FXR1P: increase in
the G0/G1 proportion and decrease in the G2/M. Data are presented as means 6 SEM of n = 4 experiments, with FACS analysis of a minimal cell
population of 15,000 for each condition and each experiment. The asterisk (*) indicates p,0.05 of a Mann & Whitney test.
These data confirm the specificity of our approach and suggests To test the physical interaction between FXR1P and p21
that p21 mRNA may be a target of FXR1P in C2C12 murine mRNA and determine the portion of the mRNA involved in the
myoblasts and in human myoblasts, either directly by RNA- interaction, we performed in vitro filter-binding assays [21] using
protein physical interaction, or indirectly by modulating a recombinant FXR1P and radiolabeled fragments of p21 mRNA
pathway involved in p21 levels controls. 39UTR described in Figure 5A. We chose to use FXR1P Isoe, the
longest muscle-specific isoform of FXR1P for binding experiments
p21 mRNA is a novel mRNA target of FXR1P, both in vitro since i) it was described to have RNA-binding properties [21], ii) its
and in vivo depletion in FSHD myoblasts recapitulates the effect on p21
Murine p21 mRNA is 1910 nts long (GenBank Accession mRNA levels of a complete knockdown of all FXR1P isoforms in
number: GI 161760647), with a very short 59UTR of less than C2C12 cells (cf Figure 4) and iii) Isoe is able to restore p21 mRNA
100 nts, a 480 nts coding sequence and a 1329 nts long 39UTR levels to normal in Fxr1-knockdown myoblasts (cf Figure 5). As
where lie most of the regulatory elements for the stability of this controls for interaction, we used the N19 fragment of FMR1
mRNA (Figure 6A). Notably, the ARE located at position 86– mRNA containing a G-quadruplex RNA structure [31], known to
103 nts on the 39UTR is bound by the RNA-binding protein HuR be specifically bound by FXR1P Isoe, and its truncated version
to regulate the stability of the mRNA during muscle differentiation N19D35 unable to be bound by FXR1P [21]. As expected,
[30]. Given the ability of FXR1P Isoa to bind ARE sequences FXR1P was able to recognize the G-quadruplex containing N19
[19,20], we hypothesized that the ARE present in p21 mRNA fragment (Figure 6B). Surprisingly, the binding activity of FXR1P
could be the binding site of FXR1P. towards p21 39UTR-a fragment (nts 1–345) that contains a well
Figure 3. Knockdown of FXR1P induces premature cell cycle exit of myoblasts. (A) Immunofluorescence analysis of C2C12 cells transfected
with siControl or siFxr1. Nuclei are stained with DAPI (blue) and cells expressing the proliferation marker Ki67 are labelled with FITC antibody (green).
Scale bar: 75 mm. (B) Quantification of the number of DAPI-stained nuclei. (C) Quantification of the number of Ki67-positive cells over total number of
nuclei quantified in (B). Quantification was performed using a macro developed with the ImageJ software. Data presented are mean of n = 4
experiments with analysis of 10 optical fields for each condition and each experiment. The asterisk (*) indicates p,0.05 for the Student T-test.

vivo. To test this hypothesis, we isolated immunocomplexes

containing FXR1P by performing UV-crosslinking and immuno-
precipitation assays (CLIP, [32]). Immunoprecipitation of FXR1P
mRNA complexes was carried out using the polyclonal antibody
#830 against exon 16 of FXR1P present in all isoforms except the
short ones [7,8] on C2C12 cell extracts (Figure 6C). Control CLIP
was performed using non-immune rabbit IgGs. As expected, using
the #3FX monoclonal antibody [7] against the constitutive exon
14 present in all isoforms of FXR1P, all the isoforms of FXR1P
were detected in both inputs (Figure 6C, lane 1 and 2). Medium
and long isoforms of FXR1P were selectively enriched in #830
immunoprecipitates (Figure 6C, Lane 4) and concomitantly
depleted in #830 post-immunoprecipitation supernatant
(Figure 6C, lane 6). The low amount of FXR1P small isoforms
detected in the #830 immunoprecipitates most likely corresponds
to the fraction of small isoforms interacting with FXR1P medium
and long isoforms, since FXR1P is known to homodimerize [4]. In
contrast, FXR1P is not recovered in immunoprecipitates obtained
with control rabbit IgGs (Figure 6C, lane 3) and still present in the
corresponding post-immunoprecipitation supernatant (Figure 6C,
lane 5), confirming the specificity of the CLIP assay performed
with #830 antibodies.
RT-PCR analysis of mRNAs extracted from both inputs and
immunoprecipitates was then carried out (Figure 6D). The mRNA
encoding p21, b-tubulin and the myogenic factors Myogenin and
MyoD are detected in the input fractions (Figure 6D, lanes 1 and
2). Interestingly, only p21 mRNA was found selectively enriched in
#830 immunoprecipitates (Figure 6D, lane 4) as compared to
control immunoprecipitates (Figure 6D, lane 3), while Myogenin,
MyoD and b-tubulin mRNAs were undetectable. This confirms the
specificity of the approach and suggests that, in the C2C12
myoblastic cell line, endogenous p21 mRNA is present in mRNA
complexes containing FXR1P.
The c fragment of p21 39UTR recognized by FXR1P has

Figure 4. FXR1P depletion in C2C12 cells and in myoblasts intrinsic stabilization properties
derived from FSHD myopathic patients biopsies contributes to To elucidate the functional significance of FXR1P interaction
a consistent increase in p21 mRNA that translates into with p21 39UTR-c fragment, we conducted luciferase assays on
enhanced p21 protein levels. (A) Quantitative RT-PCR reveals a C2C12 cells expressing FXR1P normally (siControl-transfected)
significant increase of P21 mRNA in FSHD myoblats relative to control
individuals. Data are presented as means 6 SEM of n = 3 individuals/ and inactivated for Fxr1 (siFxr1-transfected). The various portions
group. (B) Representative western-blot of p21 protein levels in siControl of p21 39UTR used for binding assays were cloned in the 39 of
(siC) or siFxr1 (siFx)-transfected C2C12 cells. Densitometric quantifica- Renilla luciferase cDNA in a reporter system (Figure 7A). The
tion of western-blots reveal that depletion of FXR1P by siRNA influence of the 39 regulatory elements on Renilla mRNA and
transfection (siFxr1) leads to a significant increase of p21 protein levels protein levels was then assessed, in the presence and in the absence
relative to siControl-transfected cells. Data are presented as means 6
SEM of n = 4 experiments. (C) Representative western-blot of P21
of FXR1P, and compared to control vector without regulatory
protein levels in FSHD patients and control individuals. Densitometric elements in the 39UTR (Figure 7B, 7C). In the presence of FXR1P
quantification of western-blots reveals that muscle biopsies of FSHD or when FXR1P is knocked-down, no significant difference to
patients display a significant increase of P21 protein relative to controls. control is observed in the Renilla mRNA levels, when its cDNA is
Data are presented as means 6 SEM of n = 3 individuals/group. The fused either to the proximal a or central b fragments of p21
asterisks * and ** indicate respectively p,0.05 and p,0.01 of the Mann
mRNA 39UTR. However, the distal cfragment bound by FXR1P
& Whitney test.
doi:10.1371/journal.pgen.1003367.g004 significantly increases Renilla mRNA levels in the presence of
FXR1P (1.33-fold, Figure 7B). Intriguingly, removal of FXR1P by
characterized ARE sequence was null, being equal to the binding siRNA-mediated knockdown potentiated the mRNA stabilizing
activity of the negative control N19D35. Also, p21 39UTR-b effect of the p21 39UTR-c fragment (1.76-fold; Figure 7B)
fragment (nts 324–868) was not recognized by FXR1P. Interest- compared to control. To assess whether variations of Renilla
ingly, the most distal portion of p21 39UTR, termed c fragment mRNA correlated to protein variations, we performed classical
(nts 851–1321), was specifically bound by FXR1P. These data luminescence luciferase assays (Figure 7C). Interestingly, Fxr1-
indicate that FXR1P Isoe does not recognize p21 mRNA via the depletion lead to a significant increase in Renilla luciferase activity
ARE motif present in the proximal portion of the 39UTR (a when its cDNA was either fused to the central b or distal c
fragment), but most likely via an uncharacterized motif or fragment of p21 39UTR (Figure 7C). However, the amplitude of
sequence present in the distal portion of its 39UTR-c fragment. variation was, again, higher when considering the c fragment in
Knowing that FXR1P interacted, at least in vitro, with p21 siControl conditions (2.2-fold) or Fxr1 knockdown conditions (3.4-
mRNA, we further sought to validate that this interaction occurs in fold), compared to control empty vector. These data support the

Figure 5. FXR1P overexpression in Fxr1-depleted C2C12 cells restores p21 mRNA levels to normal. (A) Western-blot analysis (upper
panel) of C2C12 cells transfected with empty pTL1 vector or pTL1.FXR1 Isoe (pTL1.Isoe) construct indicate a strong expression of FXR1P long isoform
Isoe in transfected myoblasts. Quantitative RT-PCR (lower panel) reveals a significant decrease of p21 mRNA levels in C2C12 myoblasts overexpressing
FXR1 Isoe, as compared to control. Data are presented as means 6 SEM of n = 3 independent experiments. (B) Western-blot analysis (upper panel) of
C2C12 cells transfected with control siRNA (siC) or siFxr1 (siFx) and empty pTL1 vector or a mutated version of pTL1.FXR1 Isoe (pTL1.Isoe*) bearing 4
mismatches in siFxr1 recognition sequence indicate a reexpression of FXR1P long isoform Isoe in Fxr1-depleted transfected myoblasts. In the western
blot FXR2P is indicated by (*) Quantitative RT-PCR (lower panel) reveals a significant increase of p21 mRNA levels in C2C12 myoblasts transfected with
siFxr1 (siFx) and the empty vector (pTL1), as compared to control. This increase is restored to normal levels when FXR1P Isoe expression is rescued by
transfection of pTL1.FXR1 Isoe. Data are presented as means 6 SEM of n = 3 independent experiments. The asterisks * indicate p,0.05 of the
Wilcoxon paired test, ns indicates non significance.
hypothesis that FXR1P normally destabilizes p21 mRNA via The c fragment of p21 39UTR contains a highly
binding to a motif present in the distal c portion of its 39UTR. evolutionarily conserved G-quadruplex motif regulating
To test in vivo the hypothesis of FXR1P involvement in the control its stability
of endogenous p21 mRNA stability, we treated siControl- or siFxr1-
The previous data support a negative role for FXR1P in the
transfected C2C12 cells with the transcription inhibitor actinomycin
control of p21 mRNA stability via binding to the 561 nts long p21
D (ActD), and measured the decay rate of p21 mRNA by
39UTR-c portion. The next step was to determine the RNA motif
quantitative RT-PCR. Interestingly, p21 mRNA appears to cycle
responsible for FXR1P recognition. So far, two mRNA motifs
rapidly in control myoblasts. Linear regression on semi-log values of
have been described to be recognized by FXR1P: the ARE motif
p21 mRNA decay rate in siControl-transfected cells, provides an
of TNFa mRNA [20] and the G-quadruplex present in FMR1
estimated half-life of 2.5760.14 hrs (Figure 7D), with only 16%
mRNA [21]. Our in vitro data clearly indicate that the ARE
mRNA remaining after 8 hrs. Conversely, upon Fxr1-depletion, p21
present in the 39UTR of p21 mRNA does not mediate the binding
mRNA decay rate is strongly affected and its half-life is significantly
of FXR1P Isoe to p21 mRNA, we therefore looked for the
increased, reaching 5.9860.42 hrs (p-val,0.05). As a consequence,
presence of putative G-quadruplex motifs in the c fragment of p21
even after 8 hrs of ActD treatment, 43% of p21 mRNA is still
39UTR. For this purpose, we used the QGRS webtool [33] that
present (Figure 7D). The slowing down of p21 mRNA decay rate
indicated three putative G-quadruplexes spread along the
following Fxr1-knockdown was further confirmed using 5,6-
sequence of the c fragment (Figure S3), and notably a high-score
Dichlorobenzimidazole riboside (DRB), an adenosine analogue
central G-quadruplex motif (nts 931–955). It is worth noticing that
inhibiting mRNA synthesis (Figure S2). These data suggest that
this high-score putative G-quadruplex is located within a 51 nts G-
Fxr1-depletion increases endogenous p21 mRNA stability.

Figure 6. FXR1P selectively binds in vitro to the distal portion of p21 mRNA 39 UTR and associates in vivo with p21 mRNA. (A) Scheme
of the various portions of p21 mRNA 39 UTR (a, b and c) used for in vitro binding assays. Note that the a fragment contains a characterized ARE motif.
(B) Nitrocellulose filter binding assays to determine the portion of p21 mRNA bound by FXR1P. Radiolabeled mRNA probes were incubated with
increasing concentrations of recombinant FXR1P Isoe protein, the amount of radioactive probes recovered on filters after binding reaction is then
plotted against the concentration of proteins. The portion of FMR1 mRNA called N19 (known to be bound by FXR1P) and its truncated version
(N19D35) were used as controls. This reveals that the distal portion of p21 39UTR (c fragment) and N19 are selectively bound by FXR1P. Both the a
and b fragments from the 39UTR of p21 remain at background levels comparable to N19D35 binding to FXR1P. (C) Western-blot analysis of UV-
crosslinking and immunoprecipitation (CLIP) assay performed on C2C12 lysates using polyclonal antibodies raised against the C-terminus of FXR1P
(#830) and control rabbit IgG (R). Input lysates (lanes 1 & 2, Input, 1/50th), immunoprecipitates (lanes 3 & 4, IP, 1/5th) and post-immunoprecipitation
supernatants (lanes 5 & 6, post, 1/50th) were probed for FXR1P using the 3FX antibody. A selective enrichment in FXR1P medium and long isoforms is
observed in #830 immunoprecipitate (lane 3), concomitant with a depletion in these isoforms in the post-immunoprecipitation supernatant (lane 4)
as compared to corresponding controls (lane 3 & 5). (D) RT-PCR analysis of mRNAs associated with FXR1P complexes. RNA was extracted from input
and immunoprecipitate fractions described in (C), and used as template for RT-PCR. RT-PCR products obtained from inputs and immunoprecipitations
respectively from control with rabbit IgG (Lanes 1, 3) and immunoprecipitation of FXR1P using #830 (Lanes 2, 4) were separated and visualized by
agarose gel electrophoresis. This reveals that p21 mRNA is selectively enriched in the #830 immunoprecipitates, while the mRNAs encoding the
myogenic determination factors Myogenin and MyoD or the unrelated mRNA encoding b-tubulin are not recovered in any immunoprecipitates. The
symbol # indicates aspecific PCR products corresponding to b-tub primers dimers. DNA molecular weight markers presented on the gels are
respectively 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 and 1000 bp.
rich region (position 918–955, 54% of G). To confirm the downstream of Renilla luciferase mRNA. Then, the levels of Renilla
predicted G-quadruplex, we used the property of G-quadruplex mRNA of the resulting constructs were assessed for each mutant in
forming regions to be detected by comparing reverse transcriptase C2C12 cells. As previously shown in Figure 6B, the presence of the
elongation on RNA templates in the presence of either K+, Li+ or c fragment did increase significantly the levels of Renilla mRNA,
Na+ [31]. Indeed, stabilization of G-quadruplex structures by K+, but partial or full deletion of the G-quadruplex potentiated the
but not by Li+ or Na+, results in cation-dependent pauses increase in the cognate mRNA levels (Figure 8D), mimicking the
detectable on a sequence gel. The experiments were performed effect of Fxr1 knockdown in C2C12 cells (cf Figure 7B). These data
on the full-length 39UTR and on the c fragment alone and argue in favour of a role of the G-quadruplex in mRNA
allowed us to identify two strong (position 939 and 940) and two stabilization that is potentiated by deletion of the binding site of
weak G-quadruplex pauses (position 955 and 969) in the 39UTR FXR1P.
of p21 mRNA (Figure 8A). Both the full-length and the c fragment
exhibited the same pauses, indicating that the c fragment retains Discussion
the ability to form the G-quadruplex structure in a comparable
manner to the full-length native 39UTR (Figure 8A). Alignment of Over the last decade, studies in Fxr1-knockout models have
sequences corresponding to G-rich regions of p21 distal 39UTR in inferred that FXR1P plays a critical role in myogenesis [13,14,15].
mouse and human indicate high evolutionary conservation of this However, even though FXR1P muscle-specific isoforms have
portion of non-coding sequences (Figure 8B) and argues in favour unique RNA-binding properties [21], no specific mRNA targets
of its functional importance. and function have been identified so far for FXR1P in muscle. In
To explore the functional role of the G-quadruplex present in this study, we have explored the functional consequences of the
the 39UTR of p21 mRNA, we constructed c fragments mutants depletion of the FXR1P in myoblasts, with the purpose to
with partial (cD9) or full (cD38) deletion of the G-rich region understand its role in the early stage of myogenesis and in the
containing the G-quadruplex (Figure 8C) that were cloned cellular pathophysiology of FSHD, a human myopathy.

2b and 2c fragments on Renilla luciferase (Ren) mRNA levels in C2C12

cells transfected with control siRNAs (siControl) or siRNAs targeting Fxr1
(siFxr1). Quantitative RT-PCR analysis of the levels of Ren mRNA
normalised to Firefly (Luc) mRNA relative to the empty construct are
presented. In siControl cells, only the c fragment significantly increased
Ren mRNA levels, this effect is potentiated by Fxr1 depletion with siFxr1.
In contrast, the a and b fragment have no effect on Ren mRNA levels, in
the presence or absence of FXR1P. The results are presented as the
means 6SEM of 4 experiments. (C) Effect of p21 39UTR and its a, b and c
fragments on Renilla Luciferase activity in C2C12 cells transfected with
control siRNAs (siControl) or siRNAs targeting Fxr1 (siFxr1). Results
presented here represent the mean of the ratio of Luc-FL, Luc-a, Luc-b
and Luc-c to Luc-empty signal. In siControl cells, only the c fragment
significantly increased luciferase activity. In siFxr1 transfected cells
compared to controls, the b and c fragments increased luciferase
activity, while the a fragment has no effect. However, the amplitude of
variation is greater with the c fragment and this effect is potentiated by
Fxr1 depletion. Six independent experiments in triplicate for each
transfection were quantified. For each transfection, Renilla was
normalized to Firefly luciferase activity. RLU, relative luciferase units.
(D) Fxr1-depletion increases the stability of endogenous p21 mRNA.
C2C12 transfected with siControl (empty squares) or siFxr1 (black
squares) were treated with the transcription inhibitor actinomycin D for
8 hrs. p21 mRNA levels were determined by quantitative RT-PCR at
several time points and normalised to levels before treatment (t0).
Percentage of remaining mRNA is plotted using a semi-log scale. Data
presented represent the mean of n = 3 experiments. The asterisks *
indicate p,0.05 of the Mann & Whitney test, while # and ## indicate
respectively p,0.05 and p,0.01 of the Wilcoxon test.
Cellular pathways affected by Fxr1-depletion

Microarray analysis of our myoblastic model inactivated for
Fxr1 enabled to show that FXR1P depletion affects the expression
of a wide range of mRNA species that control several cellular
pathways. One of the most represented functional categories
correspond to ‘skeletal and muscular system development’ and
‘skeletal and muscular disorders’, in line with the evoked role of
FXR1P in myogenesis and its altered pattern of expression in two
human myopathies: FSHD [9] and DM1 [12]. Interestingly, the
functional category ‘cell cycle’ appears also overrepresented in the
affected functions, in particular, terms corresponding to ‘arrested
in G0/G1 phase transition’ (related to the genes p21/Cdkn1a,
HGF, IGF, IL6) actually reflect what we observed at the
physiological level for Fxr1 inactivated myoblasts which remain
blocked in the G0 phase, without undergoing further differenti-
ation. Apart from p21, several mRNAs with altered levels in the
absence of FXR1P seem to influence the functional categories
affected and appear iteratively in our Ingenuity pathway analysis.
These candidates for interaction with FXR1P in the context of
myogenesis now deserve further investigation. Notably, Hepatocyte
growth factor (Hgf) mRNA is significantly upregulated in the absence
of FXR1P (Table S1, Figure 1E and 1F, Figure S1) and is known
to play an essential role in the migration and proliferation of
myogenic cells [34]. Similarly, the Insulin-like growth factor 1 (Igf1)
would be a relevant target of FXR1P in the muscle context, since
Igf1 plays a key regulatory role in skeletal muscle development, as
well as muscle fiber regeneration and hypertrophy [35]. Finally,
Cyclin-dependent kinase 15 (Cdk15) mRNA which, contrary to p21
mRNA, is downregulated in Fxr1-deficient myoblasts (Table S1,
Figure 1E and 1F, Figure S1) would be an interesting candidate for
regulation of cell-cycle progression by FXR1P. In this case,
FXR1P would stabilize Cdk15 mRNA via recognition of a yet
unknown specific motif. Murine and human Cdk15 mRNA are not
Figure 7. The c portion of p21 mRNA 39UTR modulates the
stability of the mRNA that is potentiated by FXR1P depletion. annotated in the AREsite database [36] and therefore do not seem
(A) Scheme of the constructs bearing various portions of p21 mRNA to bear a canonical AU-rich element sequence in their 39UTR.
39UTR (a, b and c) used for luciferase assays. (B) Effect of p21 39UTR2a, However, analysis of the 3672 nts long human Cdk15 mRNA

Figure 8. The c portion of p21 mRNA 39UTR contains an evolutionary conserved G-quadruplex structure with mRNA stabilization
properties. (A) Cation-dependent termination of reverse transcription in the 39-UTR full-length (FL) or c fragment of p21 mRNA. Strong and weak
pauses of reverse transcriptase (RT) are, respectively, indicated by large and thin arrows. Numbers correspond to positions of RT pauses, position +1
being the first nucleotide following the stop codon. (B) Localization and conservation of the G-quadruplex structure detected in (A) on the sequences
of p21 39UTR from Mus musculus (Mmu) and Homo sapiens (Hsa). (C) Scheme of the constructs used for luciferase assays bearing the conserved G-
quadruplex of c p21 mRNA (boxed) and two versions where the G-quadruplex has been deleted partially (D9) and fully (D38). (D) Effect of p21 39UTR
G-quadruplex and its deletions on Renilla luciferase (Ren) mRNA stability in C2C12 cells. Quantitative RT-PCR analysis of the levels of Ren mRNA
normalised to Firefly (Luc) mRNA relative to the levels of the empty construct. The c fragment bearing the G-quadruplex significantly increases Ren
mRNA levels relative to empty vector. Partial or full deletion of the G-quadruplex sequence strongly increases Ren mRNA levels, both relative to
empty vector and to the G-quadruplex bearing fragment. The results are presented as the mean of 4 experiments (6SEM). The asterisks * and #
indicate p,0.05 respectively of the Wilcoxon test or of the Mann & Whitney test.
using QGRS G-quadruplex mapping webtool reveals the presence upregulation playing an important role in this process by blocking
of 8 putative G-quadruplex sequences (Table S3), with 2 putative the formation of proliferation-inducing Cyclin A/Cdk2-E2F
G-quadruplex in the 39UTR that represent binding sites for complexes [37]. In this context, p21 gene undergoes extensive
FXR1P. To ascertain the importance of FXR1P in the regulation regulation, both at the transcriptional and posttranscriptional
of its putative mRNA targets newly identified in this study, it level. Our data do not support a transcriptional mechanism for the
would be worth investigating the presence of ARE sequences, G- maintenance of elevated p21 mRNA levels in Fxr1-depleted muscle
quadruplexes RNA structures in their 39 untranslated region. cells. Indeed, in myoblasts, p21 is under the sole transcriptional
control of the myogenic transcription factor MyoD that activates
Role of FXR1P/G-quadruplex mRNA complex in the its promoter [38]. Our microarray and quantitative RT-PCR
destabilization of p21 mRNA analyses reveal that MyoD levels remain normal in Fxr1-deficient
Adequate regulation of the balance between proliferation and myoblasts (Figure 1E). Finally, in luciferase assays, Ren mRNA
cell cycle arrest of myoblasts is a crucial step during myogenesis. levels are increased when p21 mRNA G-quadruplex region is
The decision to progress through a new division cycle appears fused to its 39UTR, even though this mRNA does not contain the
primarily regulated before the G1 to S phase transition, with p21 endogenous promoter of p21/Cdkn1a gene (Figure 7B, Figure 8D).

These evidences privilege an FXR1P-mediated posttranscriptional [30,52], while its decay is controled by KSRP [53]. Members of the
mechanism of regulation of p21 mRNA levels involving the hnRNPE family of proteins, PCBP1 and 2, control the central part
binding of FXR1P. of p21 39UTR -the b fragment- [54]. Finally, another hnRNPE,
In myoblasts, FXR1P long isoforms Isoe and Isof are most likely PCBP4, binds and stabilizes the c fragment [55], while we show in
not playing a role in translational regulation, since they are this study that binding of FXR1P to the G-quadruplex motif of p21
detected in the nucleus and faintly in the cytoplasm but do not 39UTR-c fragment destabilizes the mRNA. Here, we wish to
associate to polyribosomes [7,8,17,39]. On the other hand, we propose a double system of regulation in which FXR1P and PCBP4
cannot exclude a mechanism involving translational inhibition via cooperate to regulate the levels of p21 using the distal 39UTR while
binding of small or medium isoforms of FXR1P to p21 mRNA to HuR, RNPC1 and KSRP use the ARE in the proximal part. These
another motif, which may be located in the central part of p21 complex regulatory systems enable a fine-tuning of p21 mRNA
mRNA 39UTR (b fragment) that activates translation in the levels, and our data indicate a prominent role for FXR1P as a
absence of FXR1P (Figure 7A, 7B). This would be consistent with modulator of p21 levels.
the previously described role of FXR1P small isoform Isoa in
translational control [20]. However, our data strongly support the FXR1P control of p21 mRNA stability regulates myoblast
fact that the FXR1P-dependant translational control of p21 cell-cycle exit
mRNA is mainly regulated by FXR1P long isoforms, notably Isoe, We report that, when FXR1P is depleted in the C2C12 cell line
via binding to a 39UTR-located G-quadruplex motif (Figure 8). and in FSHD myoblasts, p21 levels increase (Figure 1, Figure 4).
To date, the G-quadruplex has been described to be a negative As a consequence, a subset of myoblasts becomes more permissive
[31,40] or positive [41] regulator of translation, and a zip-code for to cell cycle arrest, resulting in a reduced yield of myoblasts at each
dendritic transport and synaptic localization [42] depending on its cycle of division (Figure 2, Figure 3). We also observed that the
location on the mRNA (e.g. 59UTR or 39UTR) (for review see Cyclin-dependent kinase 15 (Cdk15) mRNA levels are decreased (Table
[43]). We report here an evolutionary conserved G-quadruplex S1; Figure 1E and 1F; Figure S1) it would be worth investigating
motif as a novel RNA-binding motif present in a G-rich region of whether its decreased levels also have an impact in this premature
the distal portion of p21 mRNA 39UTR. This motif, distinct from cell-cycle exit we observe in Fxr1-depleted myoblasts. Our data are
the classical ARE present in the proximal portion of the 39UTR in line with other studies in which overexpression of p21 in
[30], appears nevertheless to control the stability of p21 mRNA. myoblasts is sufficient to trigger cell cycle exit, even in mitogenic
Indeed, when fused to the 39UTR of Renilla luciferase, the G- medium [28,56,57]. In our study, p21 upregulation upon Fxr1-
quadruplex induces an increase in Renilla mRNA levels, (Figure 7B, depletion causes cell cycle exit without onset of differentiation.
Figure 8D) and this effect is potentiated by deletion of the G- Indeed, the levels of the myogenic factors MyoD and Myogenin
quadruplex (Figure 8D). Collectively, these data argue that the G- remain normal, as assessed by microarray (Table S1) and
quadruplex of p21 mRNA 39UTR participates in the control of quantitative RT-PCR (Figure 1F). Moreover, we did not observe
mRNA stability via a mechanism involving FXR1P. A few reports spontaneous myoblasts fusion into myotubes in Fxr1-knockdown
describe the involvement of 39UTR-located G-rich stretches as cultures in normal growth conditions, which would be indicative of
downstream sequence elements (DSE) promoting polyadenylation premature differentiation (Davidovic & Bardoni, unpublished
and leading to increased stability of mRNA when located data). Nevertheless, it would be worth investigating in details the
downstream the polyadenylation site [44,45]. However, in the impact of Fxr1-knockdown on the differentiation of C2C12
context of p21 mRNA, the G-quadruplex (position 918–955 nts) myoblasts. Indeed, our data predict that premature cell cycle exit
located upstream of p21 mRNA polyadenylation site (AAUAAA of myoblasts in the absence of FXR1P decreases the pool of
sequence in position 1309–1314 nts) could act as an upstream myoblasts available for differentiation. This would directly
sequence elements (USE) promoting polyadenylation, as described contribute to explain the reduced musculature detected in Fxr1-
for a U-rich sequence in Prothrombin mRNA 39UTR [46]. An KO mice [13] and in xfxr1-knockdown Xenopus [14] at early stages
alternate mechanism would involve that FXR1P long isoforms of embryogenesis and development.
drive degradation of p21 mRNA via recruitment of microRNAs The fact that p21 mRNA is an mRNA target for FXR1P Isoe
and the RISC complex. RNA interference is well described to has also crucial implications for the understanding of the
occur in the cytoplasm, but it was recently shown that small non- pathophysiology of myopathies. Indeed, splicing defects of the
coding RNAs can associate with complementary pre-mRNA FXR1 gene in FSHD myoblasts leads to reduced expression of the
target both in the nucleus and in the cytoplasm, by binding to long FXR1P Isoe, the one that specifically binds p21 39UTR. We
Ago2 [47]. The lattest is a key component of the RNA-Induced and others have shown that FSHD myoblasts exhibited higher
Silencing Complex (RISC) [47] and a well-known interactor of levels of p21 than controls, under normal growth conditions (this
FXR1P in human cells [20], Xenopus oocytes [48], and in Drosophila study and [58,59]). It is now tempting to speculate that depletion
[49,50]. Interestingly, p21 mRNA 39UTR contains an evolution- in FXR1P Isoe directly participates to the physiopathology of
arily conserved binding site for miR-22 100 nts upstream of the G- FSHD, by causing p21-mediated premature arrest of the cell cycle
quadruplex motif (Figure S3). This microRNA was recently shown in FSHD myoblasts. Ultimately, this may limit the pool of
to regulate p21 mRNA levels [47] and is bound in vivo by Ago2 myoblasts available for regeneration of muscle fibers, inducing
[51]. In this context, Fxr1-depletion or p21 39UTR G-quadruplex progressive muscle wasting in FSHD patients. This hypothesis is
deletion could prevent recruitment of the RISC complex on p21 supported by a study which demonstrates that p21 is essential for
mRNA and contribute to increase its stability, ultimately leading normal myogenic progenitor cell function in regenerating skeletal
to an accumulation of p21 mRNA and of the cognate protein. muscle [60]. A similar scenario may be envisioned in the case of
In myoblasts, FXR1P is not the sole RNA-binding protein the mouse model of DM1 in which reduced expression of FXR1P
playing a key role in the regulation of p21 mRNA. Several reports Isoe was determined [12].
demonstrate the importance of the proximal ARE of p21 mRNA
39UTR- present in the a fragment- to control the stability of this Conclusions
mRNA. In myoblasts, the ARE-mediated stabilization of p21 In conclusion, our study highlights for the first time the direct
mRNA is mediated by cooperative binding of HuR and hnRNPC1 involvement of an RNA-binding protein, FXR1P, in a new

pathway that regulates p21 levels to control myoblasts cell cycle reaction was performed using the Superscript II RT-PCR system
exit. Perturbations of this pathway will have a strong impact in (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) according to the manu-
muscle development and implicates a new signal dependant on a facturers’ protocol. RT products were subjected to polymerase
39-UTR located G-quadruplex-RNA structure. In the future it will chain reaction (PCR). All primers were designed using the Primer
be important to explore the implication of FXR1P in pathophys- 3 software (Table S4). Standard RT-PCR was performed using the
iology of muscle disorders and the pleiotropic functions of FXR1P Promega PCR Master Kit (Promega, Madison, Wisconsin, USA).
during myogenesis. Furthermore, our study opens new perspec- Real-time PCR reactions were carried out using the Syber Green I
tives on the role of the other Fragile X related proteins in the qPCR core Kit (Eurogentec, Liège, Belgium) in a LightCycler
control of cell cycle. Noteworthy, FMRP is known to recognize G- system (Roche, USA). The comparative threshold cycle (Ct) for the
quadruplex mRNA structures and it would be tempting to amplicons of each sample was determined by the LightCycler
speculate that FMRP could control p21-dependant cell cycle exit software and normalised to the corresponding Ct of TATA Box
of neuronal progenitors during neurogenesis. Binding Protein (TBP) mRNA for endogenous p21 mRNA levels,
and to the Ct of Firefly luciferase in the case of Renilla luciferase
Materials and Methods mRNA assessment. Finally, the 2-DDCt method [63] was used to
analyse the relative changes in the various studied mRNAs
Cells between C2C12 myoblasts transfected with control siRNA
The C2C12 cell line, a subclone of the C2C4 murine myoblastic (Invitrogen) or anti-Fxr1 siRNA (Invitrogen), or between FSHD
cell line [61,62], was cultivated under confluence state in the myoblasts and controls (n = 3). Data were expressed as means
conditions described by ATCC. C2C12 cells were transfected with 6SEM. Each assay was performed in triplicate with n = 3–4
siRNA targeting exon 14 or exon 6 of Fxr1 mRNA (see Table S1) independent replicates.
and/or constructs using the Lipofectamine 2000 reagent (Invitro-
gen), according to the manufacturer’s protocole. Control exper- Immunoblot and immunofluorescence
iments were performed using commercially available control Cell extracts were analysed by western blotting as described
random siRNA of matching GC content (Invitrogen). Transfected previously [64,65]. Previously described primary antibodies
cells were always analysed 48 hrs post transfection. mRNA decay against FXR1P were polyclonal rabbit antibody #830 (1:5,000)
experiments were performed by adding actinomycin D (Act D, and monoclonal 3FX (1:500), the latter also cross-reacting with
5 mg/mL) or 5,6-Dichlorobenzimidazole riboside (DRB, 50 mM) FXR2P [7]. Anti-b-actin monoclonal antibody (Sigma) and anti-
to culture medium for 0 to 8 hrs. p21 polyclonal rabbit antibodies (Santa Cruz) were used respec-
Human myoblasts derived from muscle biopsies of n = 3 FSHD tively at 1:10,000 and 1:200. Digital acquisition of chemilumines-
patients and n = 3 controls of matching age and gender were cent signal was performed using the Las-3000 Imager system
described in [9]. The procedures to generate myoblasts derived (Fujifilm). Quantitation of western-blot was performed using the
from human muscle biopsies were agreed by the French Health ImageJ software and normalized to the b-actin signal.
Authorities (AFSSAPS). Myoblasts cultures were established as Immunofluorescence was performed as described [9], using
previously described [9]. anti-FXR1P #830 polyclonal antibodies (1:5,000; [8]) and anti-
Ki67 monoclonal antibody (1:100; Millipore). Secondary Alexa
Gene expression profiling 594-coupled antibodies (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)
Total RNA of C2C12 cells transfected with siFxr1 or siControl were used at 1:250. After counterstaining with DAPI, coverslips
siRNAs was extracted using the RNeasy kit (Qiagen, Hilden, were mounted on slides with anti-fading reagent and observed
Germany). Integrity of RNA was assessed by using an Agilent using a Zeiss Axioplan2 epifluorescence microscope equipped with
BioAnalyser 2100 (Agilent Technologies) (RIN above 8). RNA a CoolSNAP HQ CCD cooled camera (Roper Scientific) or an
samples were then labeled with Cy3 dye using the low RNA input Olympus FV10i confocal digital microscope. Micrographs were
QuickAmp kit (Agilent) as recommended by the supplier. 825 ng then analysed with ImageJ software.
of labeled cRNA probe were hybridized on 8660K high density
SurePrint G3 gene expression mouse Agilent microarrays. Two Cell viability and FACS analysis
biological replicates were performed for each experimental For viability assessment 48 hrs post transfection with anti-Fxr1
condition. The experimental data are deposited in the NCBI and control siRNAs, both attached cells and culture supernatant
Gene Expression Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih. were collected and then incubated in the presence of propidium
gov/geo/) under the series record number GSE40577. Normal- iodide (PI, 50 mg/mL). The incorporation of PI in dead cells was
ization of microarray data was performed using the Limma then analysed with a FACScan instrument (Becton, Dickinson).
package available from Bioconductor (http://www.bioconductor. MTT proliferation assay was used to determine the proliferation
org). Inter slide normalization was performed using the quantile ability of the cells as recommended by the manufacturer (Sigma).
methods. Means of ratios from all comparisons were calculated For cell cycle distribution assessment, cells were fixed in 70%
and B test analysis was performed. Differentially expressed genes ethanol, treated with RNAseA (50 mg/mL), stained with PI
were selected based on a B-value above 0. Data from expression (50 mg/mL) and their DNA content was assessed using FACS
microarrays were analyzed for enrichment in biological themes analysis. For synchronisation experiments, cells were treated with
(Gene Ontology molecular function and canonical pathways) and 500 nM of the cell blocker mimosine for 8 hrs. Release from cell
build biological networks using Ingenuity Pathway Analysis cycle blockade was performed for 16 hrs in growth medium before
software (http://www.ingenuity.com/) and Mediante (http:// FACS analysis.
www.microarray.fr:8080/merge/index), an information system
providing information about probes and data sets. RNA–binding assays
Human FXR1P Isoe recombinant protein His-tagged in the C–
Quantitative RT–PCR terminus was produced in bacteria using the pET21a/FXR1 Isoe
Total RNA was extracted from myoblasts using the RNeasy kit construct [21], as described [64]. The control RNA fragments
(Qiagen, Hilden, Germany) and a reverse transcription (RT) used in this study: N19 (RNA sequence derived from FMR1

mRNA and containing a G-quadruplex forming structure) and human FXR1 cDNA that impede recognition by siFxr1#1 was
N19D35 (N19 sequence in which the G-quadruplex is deleted) produced by site-directed mutagenesis using primers described in
were cloned in pTL1 plasmid [31]. The various fragments from Table S4 and the QuickChange kit (Stratagene).
p21 cDNA were amplified by RT-PCR of C2C12 cDNAs and
cloned in the pGemTEasy system (Promega) using the primers Statistical analysis
described in Table S1, as advised by the manufacturer. For filter To compare numerical data, non-parametric Mann & Whitney
binding assay, N19 or p21 constructs were in vitro transcribed using test was used for small sample size (n,30) and a Student T-test
T7 RNA polymerase (Promega), the RNA products being labeled was used when n.30. Wilcoxon non-parametric tests were used to
by cotranscriptional incorporation of [c232 P]-ATP. Labeled assess significance of Renilla luciferase mRNA or activity levels
RNAs were purified on a 1% low-melting agarose gel (Ambion). variations between each fragment relative to the empty vector
Labeled RNAs (50,000 c.p.m., 4 fmol) were renatured for 10 min (arbitrarily set to 1). All statistical analysis and data graphs were
at 40uC in binding buffer (50 mM Tris–HCl (pH 7.4), 1 mM performed with the Prism 4 software. Only significant differences
MgCl2, 1 mM EDTA, 150 mM KCl, 1 mM DTT). In the are displayed on the graphs.
presence of 2 U/mL of RNase inhibitors (RNasin, Invitrogen),
0,1 mg/mL of Escherichia coli total tRNA and 0.01% BSA, Supporting Information
radiolabeled RNA were incubated to increasing amounts of
FXR1P protein. RNA–protein complexes were allowed to form Figure S1 Confirmation of microarray mRNA candidates using
for 10 min on ice, filtered through MF-membranes (0.45 HA, a second siRNA targeting another constitutive exon of Fxr1
Millipore) and washed with 2 mL binding buffer. Filters were air- mRNA (exon 6). (A) Quantitative RT-PCR reveals a strong
dried and Cerenkov counting was used to assess the levels of reduction of Fxr1 mRNA in C2C12 cells transfected with siRNA
remaining radioactivity on filters. Data were plotted as percentage against Fxr1 (siFxr1#2) compared to siControl-transfected cells.
of total RNA bound versus the protein concentration and one-site (B) Western-blot analysis of untransfected (UT) and siFxr1-
binding curve was drawn using the Prism 4 software. transfected cells (siFxr1#2) revealed with the antibody #3FX
recognizing all isoforms of FXR1P reveals a strong depletion of all
UV-crosslinking and immunoprecipitation (CLIP) isoforms of FXR1P (short, medium and long) compared to control
To isolate mRNAs associated with FXR1P in vivo, UV-cross- (siCtl), while the levels of FXR2P protein (asterisk, *) remain
linking and immunoprecipitations (CLIP) were performed with unchanged. b-tubulin (b-tub) signal is used to verify equal loading
extracts of C2C12 cells using a protocol adapted from [65] and the of lanes. (C) Quantitative-RT PCR analysis of a subset of mRNAs
#830 polyclonal antibody directed against the C-terminus of confirm that Sema7a, Mctp2, Asrg1, Cdkn1a/p21, Hgf, Dusp6 and Lbh
FXR1P [8]. For each assay, 10 mg of polyclonal antiserum was used mRNAs are significantly upregulated while Cdk15 mRNA is
to immunoprecipitate 256106 cells. An equivalent amount of downregulated in Fxr1-depleted C2C12 myoblasts, confirming the
unrelated rabbit IgGs (Sigma) were used as negative control. microarray analysis and quantitative-RT PCR analysis using the
Approximately 1/20th of the homogenate and 1/4th of the first siFxr1 siRNA. Data are presented as means 6 SEM of n = 4
immunoprecipitate were loaded on a 11% SDS–PAGE gel. Proteins experiments.
transferred onto a 0.45 mm nitro-cellulose membrane were revealed (TIF)
using the 3FX antibody recognizing both FXR1P and FXR2P [8]. Figure S2 Confirmation that Fxr1-depletion increases the
mRNAs were extracted from C2C12 input lysate and immunopre- stability of endogenous p21 mRNA using a second transcription
cipitates using Trizol reagent (Invitrogen) according to the inhibitor. C2C12 transfected with siControl (empty squares) or
manufacturer’s protocole and subjected to reverse transcription siFxr1 (black squares) were treated with the transcription inhibitor
(RT) using the SuperscriptScript III RT-PCR system (Invitrogen). 5,6-Dichlorobenzimidazole riboside (DRB) for 8 hrs. Percentages
RT products were subjected to polymerase chain reaction (PCR), of remaining p21 mRNA at the various time points were
using a PCR Master Kit (Promega) and primers detailed in Table determined by quantitative RT-PCR and normalised to levels
S4 specific for p21, Myogenin, MyoD and b-Tubulin mouse cDNAs. before treatment (t0). During the first 5 hrs of treatment, p21
The PCR program consisted in 10 min. of initial denaturation at mRNA stability is clearly increased when FXR1P is knocked-down
95uC followed by 35 cycles 230 s. at 95uC, 30 s. at 58uC, 30 s. at by siFxr1 transfection, as compared to siControl-transfected cells.
72uC- and a final elongation step of 10 min at 72uC. PCR products At the dose used, DRB effect is reversible and transcription
were visualised on a 2% TAE agarose gel and amplicon size was resumes after 5 hrs of treatment resulting in a progressive increase
verified using the 1 Kb+ DNA ladder (Invitrogen). in p21 mRNA levels in both conditions.
(TIF)
Luciferase assays
Luciferase assays were performed using the pSiCheck2 system Figure S3 Sequence analysis of p21 39UTR c fragment bound
(Promega) according to the manufacturer’s protocole. Briefly, the by FXR1P in search for G-quadruplexes and microRNA binding
various fragments from p21-39UTR cDNA (a, b and c) were sites. The position and scores of the three putative G-quadruplexes
excised from the pGemTEasy vectors using the NotI site and structures predicted by the webtool QGRS [33] in the c portion of
inserted downstream of the Renilla luciferase cDNA using the NotI murine p21 mRNA 39UTR are boxed. The putative G-
site of the pSiCheck2 vector. C2C12 cells were co-transfected in quadruplex located between nts 931–955 displays a high score
96-well plates with the siRNA control or against Fxr1 and of 38 and lies within a G-rich region (nts 918–968) in which G are
pSiCheck2 constructs. Luciferase assays were performed 48 hrs highlighted by empty circles (u). A conserved binding site for miR-
post transfection using the DualGlow Luciferase Kit (Promega) 22/22-3p conserved among species is located in position 837–
according to the manufacturer’s protocole. 843 nts, as predicted by TargetScan webtool.
(TIF)
Constructs Table S1 List of the 79 RefSeq annotated transcripts signifi-
pTL1/FXR1Isoe plasmid was cloned as described in [8]. The cantly modulated after Fxr1-depletion in myoblasts. NCBI RefSeq
mutated version of this plasmid bearing 4 silent mutations in IDs give access to transcripts annotations. Logarithm (base 2) of

the average intensity (AveExp) and logarithm (base 2) of the ratio Table S4 List of primers used in study.
siFxr1/siControl are represented. The subset of mRNAs further (XLSX)
validated in quantitative RT-PCR are highlighted in bold.
(XLSX) Acknowledgments
Table S2 Ingenuity Pathway Analysis of microarray data to The authors gratefully acknowledge Ms. Julie Cazareth and Dr. Frederic
highlight selectively affected pathways in Fxr1-depleted myoblasts. Brau (IPMC, CNRS UMR7275, Valbonne, France) for excellent technical
All the affected pathways ordered by p-value are presented in (A), support concerning FACS analysis and quantification of microscopic
while pathways specifically related to ‘skeletal muscle’ or ‘cell images. The authors are also grateful to the GDR G-quadruplex Network.
cycle’ are respectively presented in (B) and (C).
(XLSX) Author Contributions
Table S3 Prediction of G-quadruplexes present in human Cdk15 Conceived and designed the experiments: LD PB BM SS HM BB.
mRNA using QGRS webtool. G-quadruplexes displaying the Performed the experiments: LD ND OK RT BM. Analyzed the data: LD
highest scores are localized in the 59UTR or coding sequence of OK BM HM PB BB. Contributed reagents/materials/analysis tools: SS.
the mRNA. Wrote the paper: LD BB.
(XLSX)
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Revue Biofutur
Revue Biofutur
183
Revue Biofutur
Syndrome de l’X fragile et syndrome de tremblement et d’ataxie liée à l'X

fragile : deux syndromes pour un même gène.
Tabet Ricardos 1, Charlet-Berguerand Nicolas 1, Sellier Chantal 1.2

1 : IGBMC - Département de médecine translationnelle - Illkirch Graffenstaden - France
2 : Collège de France - Paris - France
En 1991, la mutation à l’origine du syndrome de l’X fragile (Fragile X Syndrome ; FXS), qui
représente la première cause de la déficience intellectuelle héréditaire chez l’enfant, a été
identifiée au niveau du gène FMR1. Dix ans plus tard, la même région de ce gène a été mise
en cause dans le syndrome de tremblement et d’ataxie liée à l'X fragile (Fragile X Tremor
Ataxia Syndrome ; FXTAS), une maladie neurodégénérative qui touche essentiellement les
hommes au delà de cinquante ans.
Une expansion de trinucléotide instable…

Le gène FMR1, localisé au niveau du chromosome X, code pour la protéine FMRP (Fragile X
Mental Retardation Protein) qui joue un rôle essentiel pour les neurones. Ce gène présente la
particularité de comporter une séquence répétée de trinucléotides CGG localisée au niveau de
la région 5’ non traduite (5’UTR). La longueur des répétitions CGG est polymorphe et chez
les individus sains, elle varie entre 6 et 50 répétitions. L’allèle le plus répandu dans la
population présente généralement 30 répétitions CGG. Entre 50 et 59 CGG, ces répétitions
sont particulièrement instables et augmentent lors de la transmission à la descendance. Les
personnes présentant entre 60 et 200 répétitions sont dites porteuses de « prémutations ».
Longtemps considérés comme asymptomatiques, il a été démontré par les professeurs
Hagerman Randi et Hagerman Paul (Hagerman et al., 2001) que la plupart des hommes
porteurs de la prémutation développent le syndrome FXTAS, caractérisé par une atteinte
neurologique associant une ataxie cérébelleuse, un tremblement intentionnel et des troubles
cognitifs. Enfin, une équipe de recherche strasbourgeoise dirigée par le professeur Mandel a
mis en évidence qu’au delà de 200 répétitions CGG, la mutation, dite « complète », aboutit au
FXS (Oberlé et al., 1991), la première cause de la déficience intellectuelle héréditaire.
Ces deux syndromes font partie d’une famille de maladies génétiques dite à “expansion de
triplets nucléotidiques”. L’une des caractéristiques de ce type de maladies est que le nombre
de répétitions peut augmenter au cours des générations. Pour beaucoup d’hommes adultes
184
Revue Biofutur
atteints de FXTAS, le diagnostic est donc souvent posé après qu’un de leurs petits enfants ait
reçu un diagnostic de FXS.
Epidémiologie et symptomalogie différentes

Bien que la région du gène FMR1 à l’origine des syndromes FXTAS ou FXS soit la même, la
prévalence et les symptômes présentés par les patients portant une prémutation ou une
mutation complète au niveau du gène FMR1 sont totalement différents (tableau ci-dessous).
Syndrome de FXTAS Syndrome de l’X fragile
Nombre de répétitions CGG - 60 à 200 - > 200
Niveau d’ARNm FMR1 - Augmenté de 7 à 8 par rapport à - Pas de transcription

des personnes non atteintes
Niveau de la protéine FMRP - Légèrement diminué voire - Absente

normale
Mécanisme pathogénique - Gain de fonction toxique de - Perte de fonction de la protéine

l’ARNm FMR1 FMRP
Age d’apparition des symptômes - Après 50 ans - Dès la naissance
Principaux symptômes - Tremblement intentionnel - Déficience intellectuelle

- Ataxie - Troubles du comportement
- Trouble parkinsonien - Dysmorphie faciale
- Instabilité de l’humeur - Atteinte du tissu conjonctif
- Troubles de la mémoire - Problèmes orthopédiques
- Déclin intellectuel - Macroorchidie
Caractéristique - Inclusions nucléaires dans les - Epines dendritiques immatures

histopathologique neurones et les astrocytes
Caractéristique radiologique - Lésions de la substance blanche - Pas d’anomalie grossière

touchant les pédoncules cérébelleux
- Atrophie cérébrale
Le nombre de personnes portant une prémutation est estimé à 1/813 chez les hommes et 1/259
chez les femmes. Cependant, pour des raisons qui ne sont pas clairement comprises, toutes
les personnes ayant une prémutation ne seront pas atteintes par le syndrome FXTAS. Environ
40% des hommes porteurs de la prémutation développeront ce syndrome au delà de 50 ans, et
ce pourcentage augmente avec l’âge pour atteindre 75% à 80 ans. Ce pourcentage varie
également selon le sexe puisque seul 10% des femmes portant une prémutation développeront
le syndrome FXTAS à l’âge de cinquante ans. L’hypothèse la plus problable est que les
femmes soient protégées par une inactivation au hasard d’un des deux chromosomes X. Ce
185
Revue Biofutur
syndrome est progressif et débute généralement par des difficultés pour s’habiller, conduire,
écrire, manger…. FXTAS est caractérisé par un tremblement intentionnel (tremblement
développé lors de mouvements volontaires) et une ataxie cérébelleuse (perte de l’équilibre et
troubles de la coordination des mouvements). Il peut s’accompagner d’autres symptômes
comme des pertes de la mémoire, des troubles de l’anxiété et des symptômes parkinsoniens.
L’IRM (imagerie par résonnance magnétique) cérébrale est un élément essentiel lors du
diagnostic puisque les anomalies présentes chez les patients FXTAS, telles qu’une atrophie du
pont, du mésencéphale, du cervelet, du cortex cérébral, du corps calleux ainsi que des hyper-
signaux T2 symétriques des pédoncules cérébelleux moyens sont très évocatrices de ce
syndrome. La sévérité des symptômes est généralement corrélée à la taille de l’expansion des
triplets comprise entre 60 et 200 CGG.
A l’inverse, les patients portant plus de 200 répétitions CGG au niveau du 5’UTR du gène
FMR1 présentent les symptômes dès le début de la vie. Cependant, le diagnostic du FXS est
rarement porté avant l’âge de 3 ans. Ce syndrome est caractérisé essentiellement par une
déficience intellectuelle et affecte 1 garçon sur 5000 et 1 fille sur 6000-8000. La sévérité de la
déficience intellectuelle associée au FXS varie selon les individus et leur sexe et inclut des
problèmes de la mémoire à court terme, des fonctions exécutives et des capacités visio-
spatiales. Les patients peuvent également présenter des troubles du langage et de la motricité
(retard dans l’apparition du langage, des difficultés d’articulation et de l’apprentissage de
l’écriture…). FXS est une maladie dominante lié au chromosome X, c’est pourquoi les
femmes atteintes de ce syndrome sont en général plus légèrement affectées que les hommes.
En effet, seulement la moitié des femmes atteinte par ce syndrome développe une déficience
intellectuelle, bien souvent légère. Les autres ne présentent que des troubles émotionnels ou
de l’apprentissage. Par ailleurs, les hommes atteints du FXS manifestent souvent d’autres
symptômes comme une hyperactivité, des défauts de l’attention et des troubles du sommeil.
Les hommes FXS présentent également une macroorchidie correspondant à une augmentation
du volume testiculaire, une dysmorphie faciale et une légère dysplasie du tissu conjonctif. Un
enfant sur trois atteint du FXS présente également des troubles autistiques. Enfin, bien que
l’IRM et l’autopsie des patients FXS n’ont montré aucun défaut de la morphologie globale de
leur cerveau, des études cellulaires plus approfondies ont pu montrer des problèmes de
connections neuronales.
186
Revue Biofutur
Deux mécanismes pathogéniques distincts

La conséquence de la présence des expansions des répétitions CGG au niveau du 5’UTR du
gène FMR1 est différente selon qu’il s’agisse d’une prémutation ou d’une mutation complète
(Figure 1).
Figure 1. Les conséquences moléculaires de l’expansion CGG dans le gène FMR1
Chez les patients atteints du syndrome FXTAS, le gène FMR1 est transcrit et le niveau
d’ARNm FMR1 présente une augmentation de 7 à 8 fois alors que la quantité de protéine
FMRP est très légèrement diminuée voire normale. Les ARNm FMR1 portant les expansions
anormalement longues de répétitions CGG s’accumulent dans le noyau des neurones et des
astrocytes où ils forment des inclusions nucléaires. Ce mécanisme suggère un gain de
fonction toxique de l’ARNm (Greco et al., 2003). En effet, l’augmentation du nombre de
répétitions CGG confère une structure particulière à l’ARNm qui conduit à la séquestration de
différentes protéines et à la formation d’inclusions nucléaires qui renferment à la fois l’ARNm
avec les expansions de répétitions CGG et différentes protéines. Ces inclusions sont
retrouvées dans différentes parties du cerveau, notamment au niveau du néocortex, de
l’hippocampe et de la substance noire. Parmi les protéines séquestrées, on retrouve les
facteurs hnRNPA2/B1, CUG-BP, SAM68 qui sont impliqués dans l’épissage alternatif des
ARNm. Ce mécanisme permet d’obtenir des protéines différentes à partir d’un même gène.
Les altérations d’épissage dues à la séquestration de ces facteurs chez les patients FXTAS
pourraient être responsables de certains dysfonctionnements observés dans les neurones. De
187
Revue Biofutur
plus, il a été montré récemment que le complexe DROSHA-DGCR8 est également présent
dans les inclusions nucléaires. Ce complexe participe à la maturation des micro-ARN qui sont
des petits ARN ayant un rôle essentiel dans différents processus cellulaires comme la survie
ou la prolifération. La perte de ce complexe chez les patients FXTAS, entrainant une
diminution globale du niveau des micro-ARN dans les neurones, pourrait jouer un rôle
essentiel dans la neurodégénérescence responsable des symptômes observés chez ces patients.
Chez les patients porteurs d’une mutation complète, la présence de 200 à plus de 1000
répétitions CGG entraîne une méthylation des ilôts CpG, provoquant une inhibition de la
transcription du gène FMR1. Ce phénomène empêche la fabrication du produit de ce gène: la
protéine FMRP. Au niveau du cerveau, l’absence de FMRP entraîne des perturbations de la
morphologie et de la fonction des neurones. En effet, les épines dendritiques des neurones de
patients FXS sont surnuméraires et anormalement fines, rappelant la structure d’épines
dendritiques immatures identifiées lors du développement (Rudelli et al., 1985). Les épines
dendritiques sont de petites protrusions membranaires émergeant des dendrites de la plupart
des différents types de neurones, et au niveau desquelles s’établissent les jonctions
synaptiques. Des altérations dans les épines peuvent refléter des erreurs dans la maturation, la
stabilisation ou l’élimination des synapses responsables de la déficience intellectuelle
observée chez les individus FXS. Pour comprendre la cause moléculaire de ces altérations, il
est important de connaître la fonction normale de FMRP dans les neurones. L’ensemble des
travaux déjà réalisés à ce jour propose que FMRP réprime la fabrication de protéines
importantes pour la communication entre les neurones. Les récepteurs mGluR1/5 sont
importants pour le remodelage des épines. Leur activation conduit à une fabrication de
nouvelles protéines. En absence de FMRP, une exagération de production des protéines
contrôlées par les mGluR1/5 est observée sans l’activation de ces récepteurs. L’utilisation des
inhibiteurs des mGluR1/5 permet de corriger cet excès de traduction globale chez les souris
modèles de la maladie. Cependant, les récepteurs mGluR1/5 peuvent être impliqués dans
différentes voies métaboliques autre que la traduction des protéines régulée par FMRP. C’est
pourquoi, un des axes majeurs actuel de la recherche sur FXS est l’identification des protéines
contrôlées par FMRP, ayant un impact direct sur la maladie.
Traitements
A l’heure actuelle, il n’y a toujours aucun traitement curatif permettant d’agir sur les causes
moléculaires à l’origine du syndrome FXS ou FXTAS.
188
Revue Biofutur
Dans le cas du syndrome FXTAS, il n’existe pas de médicament permettant de traiter dans sa
globalité les symptômes. Toutefois, différentes molécules peuvent être proposées aux patients
pour soigner certains symptômes tels que des ȕ-bloquants pour limiter les tremblements, de la
L-Dopa pour diminuer le syndrome parkinsonien ou encore des benzodiazépines contre les
troubles anxieux.
Concernant FXS, il est important de détecter le plus tôt possible les enfants porteurs de cette
atteinte et de mettre en place rapidement une prise en charge socio-éducative spécifique
faisant intervenir des orthophonistes, psychomotriciens, kinésithérapeutes afin de stimuler
l’enfant. Certains psychotropes peuvent être prescrits pour limiter les troubles du
comportement.
Où en est la recherche ?
En à peine vingt ans, la recherche est passée de la découverte de la mutation de l’X fragile aux
phases de tests cliniques chez l’homme d’une molécule permettant de diminuer l’activité des
récepteurs mGluR1/5. Les premiers résultats obtenus sont plutôt prometteurs et pourrait
modifier l’évolution et le pronostic du syndrome de l’X fragile.
Dans le cas du syndrome FXTAS, la plupart des symptômes sont dus à la séquestration de
différentes protéines par les ARNm contenant l’expansion de répétitions CGG. Un des axes
thérapeutiques concernant ce type de maladie est l’identification de composés chimiques
permettant de libérer les protéines séquestrées. Une équipe américaine (Disney et al., 2012) a
récemment identifié une molécule permettant de limiter l’effet toxique des répétitions CGG
en libérant partiellement les protéines séquestrées dans les inclusions nucléaires. Cependant,
ces résultats ont été obtenus dans des cellules en culture et il reste encore de nombreuses
étapes avant d’envisager de tester ce composé chez les patients.
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204
Résumé
Le syndrome de l’X fragile représente la première cause de déficience intellectuelle

héréditaire. Ce syndrome résulte de l’absence de la protéine FMRP (Fragile X Mental
Retardation Protein) en raison de l’expansion d’une répétition de tri-nucléotides CGG dans la
région 5’ non traduite du gène FMR1. FMRP est proposée réguler, sous contrôles des mGluR-
I et d’autres récepteurs, l’expression de protéines importantes pour la plasticité synaptique en
se fixant spécifiquement sur leurs ARNm et en modulant leur traduction. Le syndrome
résulterait de l’altération de l’expression correcte des ARNm cibles de FMRP. Plusieurs
études ont déjà tenté d’identifier l’ensemble des ARNm contrôlés par FMRP. Des milliers de
cibles ont déjà été proposées, mais très peu ont pu être validées et une grande controverse
subsiste sur l’identité des cibles importantes pour la pathologie et sur le mécanisme d’action
de FMRP.
L’objectif principal de cette thèse était d’identifier l’ensemble des ARNm contrôlés par
FMRP et parmi ces ARNm cibles ceux susceptibles d’être impliqués dans la physiopathologie
de l’X fragile. Par approche de pontage aux UV et immunoprecipitation (CLIP) couplé à une
analyse micro-array dans des cultures de neurones murins corticaux, nous avons identifié
l’ARNm de la Diacylglycerol kinase kappa (DGKN) comme cible principale de FMRP. Ces
résultats sont confirmés par le fait que FMRP lie l’ARNm DGKN in vitro avec la meilleure
affinité identifiée à ce jour. La protéine DGKN est une kinase contrôlant le niveau du
diacylglycerol (DAG) et de l’acide phosphatidique (PA), deux seconds messagers lipidiques
importants pour le remodelage des épines dendritiques. En conséquence, nous avons montré
que la production du PA dans les neurones Fmr1 KO est absente après activation synaptique
et le niveau du DAG est augmenté. Ces défauts peuvent expliquer les altérations
morphologiques et fonctionnelles des épines dendritiques, cause principale proposée du
syndrome de l’X fragile.
Par ailleurs, l’association de FMRP aux polyribosomes suggérait que FMRP agit comme un
régulateur de la traduction de ses ARNm cibles. Nous avons montré que le profil ribosomique
de l’ARNm DGKN, comme celui de plusieurs autres ARNm, n’est pas altéré en absence de
FMRP, suggérant que la traduction générale de ces ARNm est inchangée. L’utilisation d’un
système permettant de forcer FMRP à interagir avec la région 3’ non-traduite d’un ARN
rapporteur confirme que FMRP n’a pas d’impact direct sur la traduction de cet ARNm. En
revanche, FMRP induit l’assemblage des ARNm liés dans des granules spécifiques distinctes
des granules de stress et des processing bodies. Ces résultats ouvrent des perspectives
nouvelles pour la compréhension des bases moléculaires du syndrome de l’X fragile.
Ricardos TABET
Bases moléculaires de la
physiopathologie du syndrome
de l’X fragile
Résumé
Le syndrome de l’X fragile représente la première cause de déficience intellectuelle héréditaire. Ce
syndrome résulte de l’absence de la protéine FMRP. FMRP est proposée réguler, sous contrôles
des mGluR-I et d’autres récepteurs, l’expression de protéines importantes pour la plasticité
synaptique en se fixant spécifiquement sur leur ARNm et en modulant leur traduction. Des milliers
d’ARNm cibles ont déjà été proposées dans la littérature, mais très peu ont pu être validées. Par
approche de pontage covalent aux UV et immunoprecipitation (CLIP) couplé à une analyse micro-
array, nous avons identifié un ARNm comme cible unique de FMRP dans les neurones corticaux.
Cet ARNm code pour une kinase contrôlant le niveau de deux seconds messagers lipidiques
importants pour le remodelage des épines dendritiques. De plus, nous avons montré que l’activation
mGluR-I dépendante de la kinase est absente dans les neurones Fmr1 KO, avec pour conséquence
une altération de plusieurs espèces lipidiques du neurone. Ces défauts peuvent expliquer les
altérations morphologiques et fonctionnelles des épines dendritiques, cause principale proposée du
syndrome de l’X fragile.
Mots-clés : Syndrome de l’X fragile, FMRP, protéine de liaison aux ARN, CLIP, neurone, déficience
intellectuelle
Résumé en anglais
Fragile X syndrome is the leading cause of inherited intellectual disability and is due to the absence
of the RNA binding protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). FMRP is proposed to bind
and regulate synaptic expression of mRNA targets upon mGluR-I activation. Thousands of mRNA
targets have already been proposed in the literature, but only a few have been validated leaving
unsolved the question of the genes mostly affected by the absence of FMRP in the brain of fragile X
patients. The main project of the thesis was to identify the mRNAs associated with FMRP in cortical
neurons by performing cross-linking immunoprecipitation approach (CLIP). We found that FMRP
principally targets one unique mRNA which encodes an important synaptic kinase. This enzyme
controls the level of two second lipid messengers important for remodeling of dendritic spines.
Consequently, the mGluR-I-dependant activation of the enzyme is lost in absence of FMRP, leading
to several lipid species alterations in the neuron. These defects may explain the morphological and
functional alterations of dendritic spines, the hallmark of fragile X syndrome.
Keywords: Fragile X syndrome, FMRP, RNA binding protein, CLIP, neuron, intellectual disability.

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UNIVERSITÉ DE STRASBOURG

ÉCOLE DOCTORALE 414

THÈSE présentée par :

Pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Strasbourg

Bases moléculaires de la physiopathologie du

THÈSE dirigée par :

AUTRES MEMBRES DU JURY :

Hervé M., tu es un directeur de thèse exceptionnel ! Tu m’as beaucoup appris et apporté.

Les gardiens de nos souris Fmr1 :

Dimitri H. et Laetitia F., merci pour les quantifications à la spectrométrie de masse du PA et

Equipe Eriani (IBMC):

Equipe Mandel (la deuxième moitié)

Soraya, merci pour ton soutien et ta disponibilité

Latha S. (ma conscience), trop de souvenirs inoubliables Î simples, authentiques mais

Table des matières

Les polyribosomes (ou polysomes) ................................................................................................... 43

L’ARNm App (Amyloid precursor protein) ...................................................................................... 70

Table des figures

ID Intellectual Disability - déficience intellectuelle

Chapitre I : Le syndrome de l’X fragile (FXS)

1- Définitions de la déficience intellectuelle et des troubles du

2- Les caractéristiques phénotypiques du syndrome de l’X fragile

 Désordre du spectre autistique (ASD)

 Dysmorphie faciale (front large, visage allongé, oreilles

Figure 1. Les phénotypes du syndrome de l’X

Des troubles du comportement

Figure 2. Les épines dendritiques : morphologie et anomalie associées au FXS

Des troubles morphologiques et d’autres

3- Les bases neuroanatomiques du FXS

Figure 3. Remodelage de la structure des réseaux synaptiques lors de l’apprentissage

4- Les causes génétiques du FXS

5’UTR Répétitions CGG Méthylation

5’UTR Phase codante

Les phénotypes associés à la prémutation

Environ 20% des femmes porteuses de la prémutation développeraient un syndrome FXPOI

Le syndrome FXTAS est une maladie neuro-dégénérative progressive caractérisée par un

5’UTR de l’ARNm FMR1

Séquestration de protéines « RAN-translation »

Agrégats nucléaires Inclusions intracellulaires

Figure 5. Modèles des mécanismes moléculaires responsables du FXTAS

partie précedente : le mosaïcisme et le FXS). L’utilisation de l’IRM et les études post-mortem

5- Les modèles animaux du FXS

Les différents modèles murins (Mus Musculus)

et l’élimination des nouvelles épines, est augmenté comparativement aux souris Wt

l’hippocampe est âge-indépendant. Les altérations de LTD et LTP, deux mécanismes

Des souris transgéniques exprimant un chromosome artificiel de levure (Yeast Artificial

Le « poisson zèbre » (Danio rerio)

Le modèle drosophile (Drosophila melanogaster)

Figure 6. Le gène FMR1, l’ARNm et la protéine FMRP

Chapitre II : FMRP et ses caractéristiques

1- Le gène FMR1 : de son ARN messager à sa protéine FMRP

Figure 8. Localisation de FMRP dans des cultures de neurones

2- L’expression et les domaines fonctionnels de FMRP

naissent du mésoderme extra embryonnaire au moment de la gastrulation) (Devys et al., 1993;

Le domaine NDF, une plateforme pour les interactions protéine-protéine

Les domaines NLS/NES

Les domaines de liaisons aux ARN

KH1 Boucle variable

Figure 9. Structure cristallographique des domaines KH de FMRP

Désordre du spectre autistique (ASD)

Dysmorphie faciale (front large, visage allongé, oreilles