Electrophorèses

1.Electrophorèse dénaturante SDS-PAGE

1.1 Principe et considérations générales

L’électrophorèse dénaturante « SDS-PAGE » est la méthode la plus utilisée pour :
- L’analyse qualitative d’un mélange de protéines
- La séparation des protéines selon le poids moléculaire
- La détermination du poids moléculaire.
- L’estimation du nombre de sous unité protéiques

Le gel de polyacrylamide fréquemment utilisé se forme par la polymérisation des

monoméres d’acrylamides en présence de N,N'-methylene-bis-acrylamide ( “bis-acrylamide”)
(Fig. 1). Notez que le bis-acrylamide est composé de 2 acrylamides liés par un groupement
methylène il est nommé agent de réticulation.
(Fig. 1). La polymerization de l’acrylamide est une catalyse à radical libre initiée par
l’addition du persulfate d’ammonium et une base le N,N,N',N'-tetramethylenediamine
(TEMED). TEMED catalyse la décomposition de l’ion persulfate en donnant un radical libre :

.
S2O8 2– + e– → SO4 2– + SO4 –

si le radical libre est représenté par R• et M comme monomère d’acrylamide , la

polymérisation serait représenté comme suit:
R• + M → RM• RM• + M → RMM• RMM• + M → RMMM•
On aura de longue chaine de polyacrylamide et le bis-acrylamide assurera la liaison entre ces
chaines sous formes de ponts de réticulation.

En présence de Sodium dodécylsulfate (SDS), détergent anionique qui défait la structure

spatiale et se fixe sur les protéines, toutes les molécules sont chargées de la même façon, et la
séparation est alors uniquement fonction de la masse molaire :

(SDS : CH3 - (CH2)10 - CH2 - O - SO3-, Na+)

1
1.2. Méthodologie : (SDS-PAGE et Zymogramme « technique qui détecte l’activité des
enzymes dans un gel d’électrophorèse »)

Exemple de l’électrophorèse d’une protéine nommée xylanase enzyme qui catalyse

l’hydrolyse du xylane qui est un hémicellulose qui se trouve dans la paroi des cellules
végétales.

1.2.1 Préparation des gels d’électrophorèse

On ajoute du xylane de bouleau à 0,1% (m/v) à un gel de séparation de 15% (annexe), ce
mélange est versé entre deux plaques mini protean II (BIO-RAD) mise dans un dispositif qui
maintient les deux plaques (voir Figure ci dessous ), le gel occupe le tiers de la plaque, après
polymérisation, le gel de concentration à 4% (annexe) est coulé au dessus du gel de
séparation, le peigne de 7,5 mm est inséré immédiatement jusqu’à complète polymérisation
du gel de concentration.

1.2.2 Préparation des échantillons

75µl du surnageant concentré est mélangé avec 25 µl du tampon d’échantillon (contenant du
). Les marqueurs protéique BIO-RAD prêt à l’emploi sont chauffés à 100°C pendant 2mn
alors que l’échantillon est chauffé à 100°C pendant 5 mn.

1.2.3 Réalisation de l’électrophorèse

Tout d’abord le peigne est retiré du gel et les plaques sont mises dans la cuve d’électrophorèse
(voir la Figure ci dessous ), le compartiment intérieur et extérieur sont remplis avec du
tampon de migration (annexe), Le kit de marqueurs Biorad utilisé contient 10 marqueurs
ayant les poids moléculaires suivants : 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 et 250 KDa.
L’échantillon et les marqueurs sont déposés à raison de 20µl dans les puits, La migration se
fait à 150V pendant 1h et 15mn.

1.2.4 Coloration au bleu de Coomassie et réalisation du zymogramme

La migration est arrêtée lorsque le bleu de bromophénol est à 1cm du bord inférieur de la plaque, une
fois la migration est terminée, la visualisation du profil de migration se fait après le traitement
du gel comme suite :

2
 le gel est rincé à l’eau distillée et coupé en deux portions, le premier gel sert pour la
réalisation de la coloration au bleu de Coomassie R250 et le deuxième gel pour la
réalisation du zymogramme, pour la coloration au bleu de Coomassie le gel subi les
traitements suivants :
Immersion pendant une heure dans une solution d’acide trichloroacétique (TCA)
(annexe) ;
Rinçage à l’eau distillée puis coloration dans la solution de bleu de Coomassie R250
(annexe) sous faible agitation pendant 1h 30mn ;
Lavage à l’eau distillée puis trempage dans la solution de décoloration (annexe) avec
un changement de bain (2 à 3 fois).

2.4.1 Détermermination de la masses moléculaire de la xylanase

La masse moléculaire est déterminée en utilisant la courbe d’étalonnage

« Rf = f (logPM) »

Le rapport frontal est calculé selon la formule suivante :

Distance parcourue par la protéine

Rf =

Distance de migration du bleu de bromophénol

Le deuxième gel destiné pour la réalisation du zymogramme, subie les traitements suivants :

Immersion dans une solution de Triton X-100 à 2.5% (m/v) pendant 30mn ;
le gel est débarrassé du Triton X-100 par rinçage à l’eau distillée puis une
incubation dans du tampon phosphate 50mM à pH 7 à 50°C pendant 20mn ;
Coloration au rouge de congo (0,1%) pendant 15 mn ;
Lavage avec une solution de NaCl à 1M ;
immersion dans de l’acide acétique à 0,5% (m/v) pour stopper la réaction et
augmenter le contraste

3
Figure 1 : Cuve et accessoires du dispositif d’électrophorèse (Mini Protean II, Bio Rad).

2. Electrophorèse native et mise en évidence des xylanases par zymogramme

L’électrophorèse est réalisée en conditions non dénaturante, le protocole de Laemmli a été
repris (cité ci-dessus) en préparant un gel et un tampon de migration sans SDS et β-
mercaptoéthanol. L’échantillon n’est pas dénaturé par la température, la coloration des
protéines est réalisée avec du nitrate d’argent ou au bleu de Coomassie R250.
Dans ce type d’électrophorèse on utilise des gels homogènes ou en gradient.

2.1 Gels homogènes et en gradient

Habituellement on fait des gels ou la concentration d'acrylamide est homogène, c'est-à-dire

constante dans toute la plaque de gel. Les gels homogènes permettent une séparation fine sur
une plage réduite de masses moléculaires. Si on désire séparer deux protéines une de l'autre, il
est donc plus efficace d'utiliser un gel homogène, il est cependant possible de faire des gels ou
la concentration d'acrylamide sera variable. Dans ce cas la concentration à la base du gel sera
plus grande que celle au sommet. Ainsi dans un gradient 3 à 25%, les protéines rentrent
d'abord dans le gel ou la concentration est de 3%, plus les protéines avancent dans le gel plus
elles sont mises graduellement en présence de grandes concentrations d'acrylamide jusqu'à
25%.

4
Ce système permet une meilleure séparation générale des protéines sur une vaste gamme de
masses moléculaires. En effet la taille des mailles du gel sera de plus en plus petite à mesure
que les protéines avanceront dans le gel. Donc, au fur et à mesure de leur progrès dans le gel,
les protéines finiront par être exposées à la concentration d'acrylamide optimale pour leur
séparation.

La principale difficulté des gels en gradients est qu'il faut éviter que la polymérisation ne se
produise durant le coulage du gel qui est un processus un peu lent. Pour cela, on utilise soit un
initiateur de polymérisation activable à volonté, comme la riboflavine, ou de très faibles
concentrations d'un initiateur spontané comme le Persulfate d’ammonium.

3.Électrophorèse de zone sur support

3.1Principe

A partir de 1950, on a proposé différents supports qui permettent d'effectuer une

électrophorèse de zone sur un support « stabilisateur » qui peut être le papier-filtre, l'acétate
de cellulose, ou encore le gel d'agar .

Ces supports ont connu un immense succès, car leur emploi est simple, rapide, peu onéreux.
En outre, il ne nécessite que de très petites quantités de substances. Ainsi, dans le cas d'un
sérum sanguin, quelques microlitres suffisent.

Quel que soit le support, on utilise une « cuve à électrophorèse » essentiellement constituée de
deux bacs contenant le tampon et une électrode. Anode et cathode sont reliées à un générateur
de courant continu. Les extrémités du support solide trempent dans le tampon ou lui sont
reliées par des ponts en papier filtre.

3.2 Électrophorèse sur papier et sur acétate de cellulose

On dépose quelques microlitres de la solution à étudier (mélanges d'enzymes, de protéines

sériques ou d'autres substances chargées) sous forme d'une ligne mince sur le support imbibé
de tampon. On le soumet ensuite à une électrophorèse ; l'intensité du courant est voisine de
2 mA par centimètre de largeur du support.

Au bout de quelques heures, la feuille est séchée. Les différentes fractions sont révélées par
des colorants spécifiques, qui permettent de caractériser, par exemple, les protéines, les

5
glycoprotéines, les lipoprotéines. Quant aux enzymes, on peut les révéler en utilisant leur
activité spécifique sur des substrats convenablement choisis.

2.1 Exemple d’électrophorèse des hémoglobines A et S

sur bande d'acétate de cellulose

Les échantillons utilisés pour mener l'électrophorèse sont des solutions réalisées
artificiellement avec des hémoglobines A et S du commerce dissoutes à raison de 2,5 mg/mL
dans du tampon d'électrophorèse préalablement oxygéné par une agitation vigoureuse. Pour
chaque "membre de la famille", on place dans un tube Eppendorf étiqueté 100 µL de solution.
Les échantillons correspondant aux individus homozygotes pour HbA sont constitués de 100
µL de la solution d'hémoglobine A, les échantillons correspondant aux individus
homozygotes pour HbS sont constitués de 100 µL de la solution d'hémoglobine S et les
échantillons correspondant aux individus hétérozygotes sont constitués d'un mélange de 50
µL de la solution d'hémoglobine A et de 50 µL de la solution d'hémoglobine S. Un tel volume
permet de réaliser une vingtaine de pistes d'électrophorèse.

Protocole expérimentale

1. Mettre à tremper les

bandes d'acétate de
cellulose dans le
tampon
d'électrophorèse
(tampon tris-véronal)
pendant 10 à 20
minutes.

Trempage

6
 2. Essorer l'excès de
tampon en plaçant les
bandes entre deux
feuilles de papier
absorbant (essuie-
tout).

Essorage
3. Placer la bande sur
le portoir en veillant à
disposer la face
absorbante vers le
haut.
La bande doit être
tendue et ses
extrémités doivent
dépasser suffisamment
pour tremper dans le
tampon une fois le
support placé dans la
cuve. Mise en place de la bande sur le support

4. Remplir les deux

compartiments de la
cuve avec un même
volume de tampon
d'électrophorèse.

5. Mettre en place le(s)

support(s) dans la
cuve.

6. Prélever un
échantillon et le
déposer sur la bande,
sur son support, au
tiers de l'extrémité,
côté cathode (borne Bandes en place dans la cuve
noire) en prenant
garde que la bande soit
bien horizontale et que
l'échantillon ne coule
pas.

7
On peut prélever et
déposer les
échantillons soit avec
une micropipette, soit
avec un capillaire, soit
avec un applicateur
comme celui présenté
ci-dessous réalisé avec
un bouchon et deux
trombonnes pour
permettre un dépôt
linéaire.

Dépôts effectués sur une bande

7. Recommencer pour
chaque échantillon en
laissant un espace
suffisant pour ne pas
risquer la fusion des
échantillons qui
diffusent légèrement
lors du dépôt. 8.
Fermer la cuve et
mettre sous tension
(environ 1 h de
migration à 150 V).

Cuve et générateur pendant la migration

9. Après migration,
placer les bandes dans
la solution de rouge
ponceau pendant 10
minutes.

Coloration

8
10. Décolorer le fond
dans des bains
successifs d’acide
acétique à 5 %. Agiter
le cas échéant pour
accélérer la
décoloration.

Bains de décoloration
 Résultats

L'hémoglobine S
moins chargée que
l'hémoglobine A en
raison de la
substitution d'un acide
glutamique par une
valine en position 6 de
la chaîne de la bêta
globine migre moins
loin et peut ainsi être
distinguée sur la bande Electrophorèse des hémoglobines A et S
d'acétate de cellulose.

9
3.2 Électrophorèse sur gel d'agarose

Principe

L'électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie
moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de leur masse
moléculaire. La technique de l'électrophorèse sur gel d'agarose est basée sur la séparation des
acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation
s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se
déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

Facteurs affectant la migration

Le facteur le plus important est la longueur de la molécule d'ADN : la séparation se fait en

fonction de la masse moléculaire et donc de la taille de l'ADN. Toutefois la conformation de
l'ADN est aussi un facteur important. Ainsi pour éviter les problèmes liés à cette
conformation, n'est séparé sur gel d'agarose uniquement que de l'ADN linéaire (fragment
d'ADN issu d'une digestion, ADN amplifié par PCR ou encore de l'ADNc).

L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel réduit la vitesse de migration et

permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important,
plus la vitesse de migration augmente. Toutefois le voltage est limité en intensité,
effectivement un fort voltage induit une augmentation de température ce qui peut faire fondre
le gel.

La conformation d'ADN plasmidique, non digéré par une enzyme de restriction, migre à
différentes vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN linéaire et ADN
superenroulé.

Gel d'agarose

On utilise généralement un gel 1 % m/V (1 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en

électrophorèse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage
d'agarose.

10
L’agarose est un polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles
auprès des fournisseurs. En général, de l'agarose de grande pureté à la solidification lente est
utilisé lorsque l'ADN doit être extrait du gel après migration.

Tampons

Il existe un nombre très varié de tampons. Les plus souvent utilisés sont le
Tris/Acétate/EDTA (TAE), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB). Le TAE
possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les
fragments d'ADN de grande taille. Le SB est relativement nouveau et inefficace pour la
séparation de fragments d'ADN d'une taille supérieure à 5000 paires de bases (5 kb).
Cependant sa faible conductivité permet l'utilisation d'un plus fort voltage (jusqu'à 35V/cm),
ceci réduisant considérablement le temps de migration. Des fragments d'ADN avec seulement
quelques paires de bases de différences sont séparés en utilisant un gel d'agarose à 3 % et avec
un tampon SB de très faible conductivité (1 mM lithium borate).

Préparation

Exemple pour un mini-gel de 50 ml destiné à séparer des fragments de 2 à 6 kb

 Préparer le moule et le peigne appropriés au nombre et au volume des échantillons à

séparer.
 Préparer suffisamment de tampon (TAE, TBE) pour remplir la cuve (par exemple 200
ml) et préparer le gel (50 ml).
 Dans une fiole Erlenmeyer, peser la quantité d'agarose déterminée d'après le tableau
suivant et en fonction de la taille des fragments à séparer:

Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel

11
 Concentration d'agarose (% en m/V) Gamme de tailles idéales (en kb)

0.3 5 – 60

0.6 1 – 20

0.7 0.8 – 10

0.9 0.5 – 7

1.2 0.4 – 6

1.5 0.2 – 3

2.0 0.1 – 2

 Pour l'exemple, il faudra donc fondre 600 mg d'agarose dans 50 ml de tampon:

concentration finale de 1,2 %, idéale pour séparer des fragments de 0.6 à 6 kb.
 Dissoudre complètement l'agarose dans le tampon, en plaçant l'Erlenmeyer soit au four
à micro-ondes, soit encore dans un bain-marie d'eau bouillante, et en agitant de temps
en temps. L'agarose est totalement dissout lorsque les grains, initialement visibles sous
forme de petites lentilles, ont complètement disparu.
 Mettre sous agitation et laisser refroidir, ou placer dans un bain-marie à environ 50 °C
(température supportable au toucher). Éventuellement, refroidir plus rapidement en
laissant couler un filet d'eau froide le long de l'Erlenmeyer, en agitant constamment. Il
est particulièrement important de refroidir l'agarose en dessous de 60 °C lors de
l'utilisation de moules en PMMA, qui risquent sinon de fondre.
 Si désiré, du bromure d'éthidium peut maintenant être ajouté, à une concentration
finale de 0,5 µg/ml. Il est cependant déconseillé d'ajouter à la place du bromure
d'éthidium certains autres révélateurs (par exemple du SYBR Gold, un fluorophore
semblable au (SYBR Green I) directement dans le gel, car ceux-ci peuvent affecter la
mobilité des acides nucléiques lors de l'électrophorèse.
 Couler l'agarose dans le moule avec le peigne et laisser refroidir. Un gel froid et figé
prêt à l'emploi se reconnaît par son apparence opalescente lorsqu'il est observé par la
tranche, par rapport à un gel encore liquide qui est parfaitement translucide. Emballé
dans du film plastique ou dans du tampon (TAE, TBE ou SB), le gel peut alors être
conservé à 4 °C au réfrigérateur pendant plusieurs jours, avant qu'il ne perde trop d'eau
par évaporation. La conservation de gels contenant du bromure d'éthidium dans du

12
 tampon n'en contenant pas peut conduire à la diffusion du révélateur hors du gel. Ceci
peut faire que la distribution du bromure d'éthidium dans le gel soit inhomogène, ce
qui finalement peut affecter l'apparence des bandes (les acides nucléiques, de charge
négative, migreront plus vite là où la concentration du révélateur, de charge positive,
sera plus faible).
 Juste avant d'effectuer l'électrophorèse, placer le gel dans la cuve et s'assurer qu'il est
recouvert de tampon. Retirer ensuite le peigne, charger les échantillons et les
standards, et faire migrer en appliquant une tension ou un courant adaptés. La vitesse
de migration des acides nucléiques dépendant du champ électrique, on fixe
généralement la tension entre 1 et 5 V/cm (distance entre les électrodes) et on laisse
varier le courant (parce que la conductivité du gel varie au cours du temps).

Révélation de l'ADN

Figure 2 : Gel d'électrophorèse sous UV.

Afin de visualiser la migration de l’électrophorèse, il faut préalablement ajouter un colorant

dans le gel à une concentration prescrit par le fabricant de l’agent intercalant ou encore
procéder à une révélation post-migration. La méthode de révélation la plus utilisée est la
révélation au bromure d'éthidium ou BET. Le bromure d'éthidium est un agent d'intercalation
couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie
moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec
une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. Cet effet serait dû à
l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement, plutôt qu'à une rigidification du cycle
benzénique, celui-ci n'étant pas situé entre les paires de bases. Cependant, le bromure
d’éthidium est toxique et hautement mutagène et doit être manipulé avec grande précaution.
D’autres agents intercalants plus sécuritaires comme le GelRed, le SYBR Safe, le violet de
gentiane et le bleu de méthylène peuvent être utilisés.

13
GelRed

Le GelRed est un colorant fluorescent utilisé pour la révélation sur gels d’agarose ou de
polyacrylamide d’ADNdb, d’ADNsb ou d’ARN. Il possède pour caractéristiques d’être
hautement spécifique, très stable et de respecter l’environnement. De plus, sa sensibilité est
supérieure au bromure d’éthidium et il ne requiert pas d’étapes de décoloration4.

1. Ajouter le GelRed à l’agarose fondu pour une concentration finale de 1X.

2. Couler le gel et procéder à la migration.

3. Visualiser la migration avec un appareil UV.

SYBR Safe

Le SYBR Safe est un colorant à gel d’agarose ou de polyacrylamide possédant une haute
sensibilité. Il agit comme agent intercalant pour l’ADN ainsi que l’ARN. Le fabricant vend le
produit à une concentration déjà prête pour l’usage. La visualisation de la migration peut être
faite en excitant l’agent avec des rayons UV ou encore avec de la lumière bleue.

Violet de gentiane

Il est possible d’utiliser le violet de gentiane comme agent de visualisation pour un

électrophorèse sur gel d’agarose. Il est nécessaire d’avoir une grande concentration d’ADN
(100 ng et plus) à faire migrer étant donné la faible sensibilité de cette méthode.
Comparativement au bromure d’éthidium, ce colorant doit être ajouté à une concentration de
10 ug/ml dans le gel ainsi que dans le tampon de migration pour obtenir des résultats
adéquats. Afin d’augmenter la sensibilité de la méthode, il est d’abord possible de décolorer le
gel dans l’eau une fois la migration terminée. Ensuite, il est recommandé d’effectuer une
seconde coloration dans un grand volume de tampon TAE 0,1X contenant 10ug/ml de violet
de gentiane à la fin de la migration.

Bleu de méthylène

Le Bleu de méthylène peut être utilisé comme révélateur à la fin de la migration sur gel
d’agarose ou de polyacrylamide. Cette méthode nécessite un temps de coloration pouvant
aller jusqu’à 15 heures étant donné sa faible sensibilité. Son avantage est simplement qu’il
permet de ne pas utiliser le bromure d’éthidium et que sa décoloration nécessite seulement de

14
l’eau distillé. Toutefois, l’utilisation de ce colorant induit une coloration de fond difficile à
éliminer et cela rend la visualisation des bandes plus difficile.

Alternativement, le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les
acides nucléiques doubles brins) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides
nucléiques simples brins). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une
sensibilité plus élevée permettant de détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques.

Limites de résolution

L'électrophorèse sur gel d'agarose permet théoriquement la séparation de fragments d'ADN

d'une taille allant de 50 paires de bases à plusieurs millions. Cependant, elle est généralement
utilisée pour la séparation de fragment d'une taille allant de 100 pb à 20 kpb. La durée
moyenne de migration est d'une heure.

Les petits fragments d'acides nucléiques sont mieux séparés par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus difficiles à séparer. En général,
l'utilisation de gel d'agarose à forte concentration (3 à 4 %) est alors nécessaire pour des
fragments inférieurs à 150 pb, car elle permet une meilleure séparation et résolution des
différentes bandes en fonction de leur différence de taille. Le principal désavantage est le
temps de migration, qui peut aller jusqu'à plusieurs jours. Pour pallier ces problèmes, il est
avantageux d'effectuer une électrophorèse en champ pulsé ou bien une électrophorèse en
champ inversé.

Analyse du gel

Après la migration d'électrophorèse, le gel est éclairé sous ultraviolet afin d'observer les
bandes d'ADN fluorescente. Les bandes peuvent être alors découpées et séparées du gel, puis
dissoutes afin de récupérer l'ADN purifié. L'estimation de la taille des fragments est faite
grâce à la comparaison avec l'échelle de marqueur de taille moléculaire utilisée simultanément
dans un autre puits lors de la migration.

15
 1 2 3 4

Figure 3 : Profil électrophorétique sur gel d’agarose

1. Échelle de marqueur de poids moléculaire (1kbplus),

2. vide

3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases, Puits

4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction

Applications

 Estimation de la masse moléculaire de fragment d'ADN après une digestion par des
enzymes de restriction
 Analyse d'ADN après une amplification par PCR
 Séparation de fragments ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de
Northern Blot.

Les avantages de l'électrophorèse sur gel d'agarose sont les suivants :

 Préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose ;

 Pas de dénaturation des échantillons ;
 L'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide ;
 Les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses supplémentaires.

16
3.Immunoélectrophorèse

3.1Principe

On peut disposer des protéines (antigènes ou anticorps) dans un gel d'agarose de diverses
façons: par dépôt direct, par migration électrophorétique, etc.
Les antigènes ou les anticorps contenus sous forme ponctuelle dans le gel pourront alors
diffuser de façon radiale, autour de leur point d'application. En effet les pores d'un gel
d'agarose sont suffisamment grands. Au cours de cette migration, des antigènes et des
anticorps finiront par entrer en contact les uns avec les autres et formeront des complexes
antigènes-anticorps stables. Ces complexes, s'ils ne sont pas trop gros, continueront à diffuser.
Ils continueront aussi de grossir en entrant en contact avec d'autres antigènes ou d'autres
anticorps. Au point d'équivalence, des complexes massifs (contenant des milliers d'antigènes
et d'anticorps reliés ensemble) se formeront et seront emprisonnés dans le gel à cause de leur
taille et ne pourront plus diffuser. Après avoir éliminé toutes les protéines n'ayant pas réagi,
par trempage dans un solvant aqueux (e.g. salin), on pourra colorer les complexes antigènes-
anticorps. Le point d'équivalence est le rapport optimal du nombre d'antigènes et d'anticorps
polyclonaux où se forment de très longues chaînes d'antigènes liés à des anticorps. Lorsqu'il y
a beaucoup trop d'antigènes par rapport aux anticorps, il ne se forme que des complexes
antigène:anticorps 2:1 (s'il s'agit d'une IgG) avec un résidu d'excès d'antigènes non liés.
Inversement s'il y a beaucoup trop d'anticorps par rapport aux antigènes, il se formera des
complexes antigènes:anticorps ou un antigène sera attaché à quelques anticorps avec un
excédent d'anticorps libres. Les complexes antigènes:anticorps 1:1 ou 2:1 sont relativement
petits et peuvent diffuser dans les pores d'un gel d'agarose, tout comme les anticorps et les
antigènes libres. Au fur et à mesure que les anticorps et les antigènes migrent un vers l'autre,
le rapport antigène:anticorps devient optimal, des complexes de plus en plus gros se forment
jusqu'à contenir des milliers de molécules associées en de gigantesques complexes insolubles
et immobilisés dans le gel. Ces complexes sont appelés précipitines.

17
Il existe en fait tout un ensemble de techniques qui utilisent des anticorps associés à des
séparations électrophorétiques. On peut distinguer les techniques suivantes :

3.2 Immuno-électrophorèse de Grabar et Williams

Les protéines migrent dans un gel d'agarose, puis on les révèle par une technique de double
diffusion des antigènes et des anticorps, donnant des arcs de précipitation. Avec un antisérum
total, on peut par exemple distinguer 30-40 protéines dans le sérum humain. On peut bien sûr
l'utiliser également avec un antisérum spécifique.

18
3.3 Electro-immunodiffusion double (= électrosynérèse)

Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle

consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques
sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est
possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines).

3.4 Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)

Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se place à pH où les Ig
migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les anticorps qui forment alors des
précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est proportionnelle à la
concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire un étalonnage.

19
3.5 Electro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell)

On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un
gel contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la seconde dimension.

20
4.Isoélectrofocalisation

4.1 Principe

On sait que les protéines ont une charge qui leur permet de migrer dans un champ électrique. La
vitesse de cette migration est proportionnelle à la charge qui elle-même est proportionnelle à la
différence entre le pH du milieu et le pI de la protéine. Au pI, la protéine ne possède aucune charge
nette, le nombre de charges positives étant égal à celui de charges négatives. Donc à un pH égal au pI,
les protéines ne peuvent pas se déplacer dans le champ électrique. Le principe de base de la
focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de pH dans lequel pourront se déplacer les
protéines soumises à un champ électrique. Les protéines migreront dans ce champ électrique. Arrivées
au pH correspondant à leur pI, elles s'immobiliseront puisque leur charge nette sera nulle. De cette
façon, il est possible de séparer les protéines d'une préparation selon leur pI.

On peut créer un tel gradient de pH avec des polyélectrolytes portant un certains nombre de groupes
ionisables positivement ou négativement (amines. carboxyles ou sulfates) et possédant un certain
pouvoir tampon. Ces molécules sont appelées ampholytes. Si on soumet ces ampholytes à un champ
électrique borné par une solution d'un acide fort à l'anode et par une solution d'une base forte à la
cathode, ils migreront et se distribueront par ordre de pI. Leur capacité tampon aidera à maintenir
autour d'elles une petite zone de pH égal à leur pI. Une série d'ampholytes ayant donc chacun un pI
couvrant une certaine gamme de pH créera donc un gradient continu de pH. Si on fait migrer une
petite quantité de protéines dans ce système, après ou durant sa formation, elles migreront aussi et
s'immobiliseront à leur Pi.

4.2 Méthodologie

Dans un montage de FIE, il faut donc créer un gradient de pH dans lequel pourront ensuite se
déplacer les protéines de l'échantillon. Comme matrice inerte, on peut utiliser de l'agarose, de
l'acrylamide ou, plus rarement du dextran, dans lequel se formera ce gradient de pH. De nos
jours un gel de polyacrylamide est de plus en plus utilisé. Puisque seul le pI doit influencer la
migration, il faut utiliser des concentrations d'acrylamide dont la porosité ne ralentira pas les
grosses protéines par rapport aux petites mais qui est suffisamment solide pour être aisément
manipulable. Un gel de 5-6% fait généralement l'affaire. Pour les protéines particulièrement
volumineuses, on peut avoir à utiliser des concentrations inférieures à 4%, mais ce gel est très
difficile à manipuler et très fragile. Pour le renforcer, on ajoute quelque fois de l'agarose pour
lui conférer un peu plus de rigidité sans affecter la mobilité des grosses protéines.

21
Le tampon de l'anode est un acide fort, généralement de l'acide phosphorique. À la cathode,
on place une base forte, souvent de la triéthanoamine. On met les ampholytes dans le mélange
du gel avant la polymérisation du gel. Pour créer le gradient de pH, on utilise un mélange de
polyélectrolytes de petite masse molaire, les ampholytes. Ces molécules, des polyélectrolytes,
se déplacent dans le champ électrique et se disposent un à la suite de l'autre dans l'ordre de
leur propre pI. Beaucoup de compagnies fabriquent un grand nombre de mélanges
d'ampholytes couvrant des gammes très étroites ou très larges de pH: Ampholine, Pharmalite
de la compagnie Pharmaca, BioLites de Bio-Rad, Immobiline, etc. Lorsqu'on applique une
tension entre les deux électrodes, chaque ampholyte se déplacera jusqu'à son point
isoélectrique et s'y immobilisera. On pourra créer des gradients de diverses amplitudes de pH
en combinant divers ampholytes. Par exemple, on peut obtenir des gradients de très faibles
intervalles (e.g. 0.1 unité de pH) sur de petites gammes de pH (e.g. entre pH 5 à 7 ou 6 à 8),
permettant une séparation très fine pour mesurer précisément le pI. Inversement, on peut aussi
créer un gradient à plus grands intervalles (e.g. 0.4 unité de pH) sur une plus vaste gamme de
pH (e.g. entre pH 2 à 10), si on veut analyser un grand nombre de protéines. Les protéines
peuvent être ajoutées après la polymérisation du gradient ou directement dans le mélange
avant la polymérisation. Elles aussi migreront dans le champ électrique. Comme elles sont
plus grosses que les ampholytes, elles migreront beaucoup plus lentement et ces dernières
pourront se stabiliser à leur pI bien avant que les protéines se soient déplacées
substantiellement La durée de la focalisation est beaucoup moins critique que celle d'une
électrophorèse ordinaire. En effet dans une FIE les protéines ne risquent pas de sortir du gel
puisqu'elles s'immobiliseront au point où elle auront atteint leur pI. Il faut seulement que la
migration dure suffisamment longtemps pour que les ampholytes aient le temps de migrer
correctement et que protéines aient le temps d'atteindre leur pI. À 2 mA, on estime le temps
requis à environ 1 heure.

4.2.1 Gradient mobile ou immobilisés

La FIE a tout d'abord été développée en produisant des gradients mobiles (Vesterberg,1971).
Cette méthode des gradients mobiles, encore très utilisée, est cependant délicate à réussir,
particulièrement parce que le gradient de pH n'est pas immobile mais se déplace dans le
champ électrique. on a mis au point une méthode pour déposer un gradient d'ampholyte qui
restera immobile dans le gel (Bjellqvist, 1982). Cette approche, qui nécessite cependant un
équipement spécialisé et coûteux, permet une beaucoup reproduction plus facile.

22
4.2.2 Coloration

Les procédures de coloration sont similaires à celle d'une électrophorèse en gel de

polysacrylamide. Il faut cependant éliminer les ampholytes du gel car elles peuvent se colorer.
On fait donc précéder la coloration par trempage dans un bain d'acide trichloroacétique 5 ou
10% pour les faire diffuser hors du gel tout en fixant les protéines sur place.

Tel que mentionné précédemment, on peut se servir de la FIE pour déterminer le pI d'une
protéine. La FIE est aussi une méthode très sensible pour vérifier la pureté d'une préparation
de protéines.

23
5. Electrophorèse bidimensionnelle

5.1 Principe

L'électrophorèse bidimensionnelle des protéines dénaturées (EBD) est comme son nom
l'indique, une combinaison de deux électrophorèses. La première, une isoélectrofocalisation
(IEF), fait se déplacer tout polypeptide contenu dans l'échantillon jusqu'à une position
fonction de son point isoélectrique (pl). La deuxième, une électrophorèse en présence de
dodecyl sulfate de sodium (SDS), le fait de se déplacer en fonction de sa masse moléculaire
(MM). Ces deux électrophorèses, perpendiculaires l'une par rapport à l'autre, combinent deux
critères indépendants, c'est ce qui rend cette technique particulièrement résolutive : plusieurs
centaines des constituants d'un mélange de polypeptides peuvent être individualisés sous
forme de spots sur un gel. Les applications sont multiples, depuis la vérification de la pureté
d'un échantillon jusqu'à des études de variabilité génétique, en passant par le suivi des
variations d'expression en fonction de différents facteurs : développement, différenciation,
traitements (drogues, stress, hormones, etc).

Le grand nombre de spots par gels, l'intérêt pour les variations quantitatives et la réalisation
d'études portant sur un grand nombre de gels ont conduit plusieurs équipes à développer des
logiciels d'analyse des gels d'EBD. L'analyse automatique représente un réel progrès par
rapport au dépouillement visuel, en particulier pour l'analyse des variations quantitatives qui
peuvent alors être traitées avec des outils statistiques appropriés : l'analyse de variance, par
exemple, permettra de savoir si les variations observées sont significatives ou pas.

Un désavantage à priori de l'EBD est qu'elle ne donne pas la fonction des protéines révélées
(sauf si l'on dispose d'anticorps). Cependant, l'identification est possible. La méthode encore
la plus sûre reste le micro-séquençage, à partir de spots obtenus par des EBD réalisées en
conditions préparatives : les homologies sont recherchées avec les séquences existant en bases
de données. Plus récemment, d'autres techniques d'identification ont été proposées. Elles sont
basées sur la composition (et non la séquence) en acides aminés, ou sur l'estimation très
précise des masses moléculaires des peptides obtenus après digestion par une protéase
(spectromètrie de masse). Les identifications obtenues par ces techniques sont en général
moins certaines que celles obtenues par micro-séquençage, mais elles présentent l'avantage
d'être moins coûteuses, en argent et en quantité de protéine nécessaire. Des laboratoires ont
mis à disposition du public, par l'intermédiaire de WWW sur Internet, des images d'EBD sur
lesquelles sont positionnées des protéines identifiées : on peut consulter par exemple le
24
serveur ExPASy (URL : http://expasy.hcuge.ch/) pour les protéines de levure, de E. Coli, et
de différents tissus et fluides humains. Il faut cependant noter que l'utilisation de ces données
par d'autres laboratoires dépend grandement de la possibilité de réaliser des EBD comparables
entre laboratoires, ce qui n'est pas encore tout à fait le cas... L'EBD est en effet une technique
analytique très puissante, mais sa mise en oeuvre reste délicate. Nous survolerons les

5.2 L'IEF

Le gradient de pH peut être établi soit par l'utilisation d'ampholytes, qui créeront le gradient
lors de l'application du champ électrique, soit par l'utilisation d'immobilines qui co-
polymérisent avec les molécules d'acrylamide dans le gel d'IEF. Dans ce cas le gradient
d'immobilines doit être constitué lors du coulage du gel. Les gels à immobilines ont de
nombreux avantages par rapport aux gradients à ampholytes : en particulier, stabilité au cours
du temps, bonne reproductibilité, grande capacité de chargement en protéines, possibilité
d'obtenir des gradients de pH très étroits. Par contre il est plus difficile d'obtenir des gels
d'EBD de bonne qualité.

Une grande attention doit être apportée au gradient de pH : quand une gamme de pH très large
est utilisée, il arrive souvent que la plupart des polypeptides se concentrent dans une région du
gel seulement : une grande partie reste inemployée et la résolution est mauvaise dans la partie
utile. Il est donc le plus souvent nécessaire d'optimiser la séparation en choisissant une
gamme de pH resserrée.

5.3 L'électrophorese en présence de SDS

Le gel d'IEF peut être équilibré dans une solution appropriée avant d'être couché sur le gel de
2ème dimension. Cette étape est indispensable lorsque le gradient de pH est établi par
immobilines, mais pas s'il est établi par les ampholytes et si le gel de première dimension est
suffisamment fin. Le gel de concentration («stacking gel») est également inutile si les gels de
première dimension sont assez fins. Un gel de séparation en gradient de concentration
d'acrylamide dans des limites bien choisies améliore la résolution, mais la répétabilité du
gradient n'est pas toujours excellente : il est souvent préférable d'utiliser une concentration
uniforme (en général entre 10 et 15%).

25
5.4 La révélation

Toutes les méthodes de révélation non spécifique des protéines sur gel de polyacrylamide
peuvent être employées. Comme les concentrations en protéines dans les extraits sont souvent
faibles, les méthodes de coloration au nitrate d'argent sont souvent utilisées, bien que leur
reproductibilité soit difficile à contrôler.

La réalisation de «bonnes» EBD nécessite donc la plupart du temps une phase de mise au
point, qui doit aussi optimiser la reproductibilité : par exemple, couler les gels en séries,
contrôler la température en cours de migration, voire en cours de révélation. Le dispositif
expérimental doit impérativement comporter des répétitions à partir d'échantillons différents,
surtout pour mettre en évidence des variations quantitatives.

Les différentes innovations apparues depuis l'invention de l'EBD (logiciels d'analyse,

colorations au nitrate d'argent, immobilines, identification des protéines) en font une
technique de plus en plus précise. La qualité des informations que l'on peut en tirer justifie
l'effort de mise au point nécessaire à son utilisation optimale.

26
Annexe

A- Coloration au nitrate d’argent

1. Fixation : 1h à 1 nuit à température ambiante, dans une solution contenant :

Tableau II : Composition de la solution de fixation pour 1 à 4 gels

1 gel 2 gels 3 gels 4 gels Concentration

finale
Ethanol 99% 15 ml 30 ml 45 ml 60 ml 30% (V /V)
Acide 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 10% (V/V)
acétique
H20 milliQ 30 ml 60 ml 90 ml 120 ml -
Volume final 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml -

2 . Sensibilisation : 2H30 à température ambiante, dans une solution contenant couvrir

d’un papier d’aluminium et éviter que la solution devienne jaunâtre.

Tableau III : Composition de la solution de sensibilisation pour 1 à 4 gels

1 gel 2 gels 3 gels 4 gels Concentration

finale
Ethanol 99% 15 ml 30 ml 45 ml 60 ml 20% (V /V)
Potassium 5 ml 10 ml 15 ml 20 ml 0,5M
acétate (D 20)
Potassium 30 ml 60 ml 90 ml 120 ml 3g/l
tétrathionate
Glutaraldehyde 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml 0,5%
QSP H20 50ml 100 ml 150 ml 200 ml -
miliQ Q

Lavages : 3x 20min avec H20 milliQ.

Coloration : 30 min à température ambiante dans une solution contenant :

Préparer à l’avance la solution d’arrêt.

Tableau IV : Composition de la solution de coloration pour 1 à 4 gels

1 gel 2 gels 3 gels

Nitrate d’argent 0,1g 0,2g 0,3g
Formaldéhyde 37% 35µl 70µl 105µl
QSP H2O milliQ 50ml 100ml 150ml

27
Lavages : 10 sec avec H2O milliQ.

Développement : 5 à 10 min à température ambiante dans une solution contenant :

Tableau V: Composition de la solution de développement pour 1 à 4 gels

1 gel 2 gels 3 gels 4 gels Concentration

finale
Potassium 1,5g 3g 4,5g 6g 30g/l
carbonate
Formaldéhyde 25µl 50µl 75µl 100µl 500µl/l
37%
Thiosulfate de 250 µl 375µl 500µl 750µl 0,0124g/l
sodium 5H2 0
2,48g/l
QSP H2O 50ml 100ml 150µl 200µl 0,5%
milliQ

Solution d’arrêt : jusqu’à 3 jours dans une solution d’arrêt

Tableau VI : Composition de la solution d’arrêt pour 1 à 4 gels

1 gel 2 gels 3 gels 4 gels Concentration

finale
Tris 2,5g 5g 7,5g 10g 30g/l
Acide 1,25ml 2,5ml 3,75ml 5ml 25ml/l
acétique
QSP H2O 50ml 100ml 150ml 200ml 0,5%
milliQ

B- Préparation des solutions d’électrophorèse dénaturante SDS- PAGE

1. Préparation des gels de séparation et de concentration

Tableau VII : Composants du gel de concentration et de séparation

Composant Gel de concentration à 4% Gel de séparation à 15%

40% acrylamide /Bis 2,5ml 37,5ml

0,5 M Tris-HCl pH 6,8 6,3ml -

1,5 M Tris-HCl pH 8,8 - 25ml

10 % SDS 250µl 1ml

Eau distillée desionisé 15,9ml 36ml

28
 TEMED 25µl 50µl

10% persulfate d’ammonium 125µl 500µl

Volume total 25ml 100ml

2. Préparation des tampons

2.1 Tampon de séparation

Tris……………..18,15g

SDS……………..400mg

Eau distillée…….100ml

Ajuster le pH à 8,8 avec HCl concentré

2.2 Tampon de concentration

Tris……………….6g

SDS (Sigma)………400mg

Eau distillée……….100ml

Ajuster le pH à 6,8

2.3 Tampon de migration (X10)

Tris……………… 30,3g

Glycine…………..144g

SDS (Sigma)……..10g

Eau distillée………qsp 1L

Ajuster le pH à 8,3

Le tampon de migration est réalisé par dilution 10 fois de cette solution.

2.4 Tampon échantillon (X4)

Trizma base……….0,303g

SDS (Sigma)……….0,8g

Eau distillée……….4ml

29
Ajuster le pH à 6,75 avec du HCl concentré

Glycérol…………..4ml

β-mercaptoéthanol à 14,3M : 2ml

Bleu de bromophénol : 0,1 mg

(Aliquote de 1ml à -20°C)

3. Solution de fixation

Acide trichloroacétique (sigma)………….57g

Ethanol absolu (charbonneau)……………150ml

Eau distillée……………………………….qsp 500ml

4. Solution de coloration

Bleu de Coomassie R250 (sigma)……….0,5g

Méthanol (charbonneaux)……………….225ml

Acide acétique……………………………50ml

Eau distillée………………………………qsp 500ml

Le colorant est solubilisé dans le mélange méthanol/eau puis l’acide acétique est ajouté. La
solution obtenue est filtrée sur filtre papier (prolabo).

5. Solution de décoloration

Méthanol……………..125ml

Acide acétique………..50ml

Eau distillée……………qsp 500ml

Changement de bain deux à trois fois.

30
31