Cours PCR C Siatka Complet

Muséum de Nîmes
19, Grand rue
BP 81295
F-30015 Nîmes cedex 1
LA RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR)

Tel / Fax : +33(0)466 67 82 29
PRINCIPE ET APPLICATIONS
E-mail : [email protected]
http://www.ecole-adn.fr
TABLE DES MATIÈRES
LA RÉPLICATION DE L’ADN .......................................................................................................................................... 4

Introduction ........................................................................................................................................................... 4
La réplication ........................................................................................................................................................ 4
1- Enchaînement des nucléotides ............................................................................................................. 5
2- Changement de forme de l’ADN ........................................................................................................... 5
3- Initiation de la réplication ...................................................................................................................... 6
4- Terminaison du brin d’ADN .................................................................................................................... 8
5- Correction immédiate des erreurs.......................................................................................................... 8
6- Chez les procaryotes ............................................................................................................................. 8
7- Chez les eucaryotes .............................................................................................................................. 9
La réplication chez les procaryotes ....................................................................................................................... 9
La réplication chez les eucaryotes ........................................................................................................................ 12
Les ADN polymérases eucaryotes ............................................................................................................. 13
La polymérase alpha .................................................................................................................................. 13
La polymérase bêta .................................................................................................................................... 14
La polymérase gamma ............................................................................................................................... 14
La polymérase delta ................................................................................................................................... 14
La polymérase epsilon ................................................................................................................................ 14
La réplication des extrémités d’ADN linéaire .............................................................................................. 15
Correction lors de la réplication .............................................................................................................................. 15
Problème de la structure de la chromatine .................................................................................................. 16
Système de sauvegarde .............................................................................................................................. 16
Altérations d’origine physique ..................................................................................................................... 16
Altérations d’origine chimique .................................................................................................................... 16
Systèmes multiples de sauvegarde ........................................................................................................... 17
LA RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR) ........................................................................................... 18

But et principe ....................................................................................................................................................... 19
Le mélange réactionnel et les cycles de température ................................................................................ 19
La dénaturation ........................................................................................................................................... 19
L’hybridation ................................................................................................................................................ 19
Les amorces ................................................................................................................................................ 20
L’élongation ................................................................................................................................................. 21
La Taq polymérase ...................................................................................................................................... 22
Les conditions réactionnelles ...................................................................................................................... 22
Détection et analyse des produits PCR ...................................................................................................... 24
Applications ........................................................................................................................................................... 25
Le clonage acellulaire ................................................................................................................................. 25
La RT-PCR (reverse-transcriptase PCR) .................................................................................................... 26
La PCR quantitative en temps réel .............................................................................................................. 27
La PCR semi-quantitative ou compétitive .................................................................................................... 29
La PCR appliquée au diagnostic .................................................................................................................. 30
Maladies génétiques ......................................................................................................................... 31
Maladies infectieuses ........................................................................................................................ 33
La PCR appliquée à l’identification .............................................................................................................. 34
La réplication de l’ADN
Introduction
La molécule d’ADN doit sa pérennité et la transmission de l’information qu ‘elle contient au fil des divisions cellulaires à un mécanisme hautement
complexe et très reproductible qu’est la réplication (ou duplication). Ce phénomène universel est très spécifique à la fois chez les organismes
eucaryotes et procaryotes. Il assure une fidèle duplication du support de l’information génétique qu’est la molécule d’ADN.
Ce mécanisme hautement complexe implique une machinerie enzymatique très spécifique indispensable au processus de la vie des cellules.
Cependant, au cours de la vie de la cellule, l’ADN est soumis à de nombreuses modifications comme des lésions et des mutations (deux phénomènes
distincts) qui modifient la fidélité de réplication.
Pour pallier à ces perturbations, les cellules possèdent en complément des systèmes de réparation qui permettent la plupart du temps de rétablir
l’information génétique originelle lors de la réplication.
Plusieurs chapitres vont distinguer les modes de la transmission de l’information génétique :

- Le mécanisme moléculaire de la réplication ;
- La réplication chez les procaryotes ;
- La réplication chez les eucaryotes ;
- Le système de réparation.
La réplication
Le mécanisme de réplication est effectué selon un principe semi-conservatif qui assure une fidèle duplication de l’information génétique. Cette
duplication semi-conservative repose sur le fait que chaque brin d’ADN sert de matrice pour la synthèse de chaque nouveau fragment et permet
de conserver les séquences d’origine. Ce principe aboutit à deux molécules d’ADN identiques à la molécule initiale.
4
1- Enchaînement des nucléotides
La synthèse d’un brin d’ADN s’effectue par l’enchaînements �� T A
��
de désoxyribonucléotides (dNTP). Les ADN polymérases

G C
G C
n’effectuent jamais de synthèse ex nihilo, c’est-à-dire qu’elles A T
ne peuvent réaliser une synthèse d’ADN en absence d’ADN C G
servant de matrice (ADN parental). Ces enzymes catalysent C G
la formation de liaisons phosphodiesters qui impliquent le T A
phosphate 5’ (alpha) d’un dNTP libre et l’hydroxyle 3’ libre

C G
��
T A
d’un brin d’ADN en formation. Cet enchaînement s’effectue

C
G
en respectant la règle de complémentarité des bases. Cette G C
règle veut que le dNTP additionné soit le complémentaire G C
A T
��
du dNTP en vis-à-vis sur le brin matrice. Cela sous-entend A
��
T
que la polymérase est une enzyme de réplication qui a pour G C
substrat un fragment d’ADN et catalyse la polymérisation

T
A
U
A
�� G C
de l’ADN monocaténaire complémentaire en formant des

G
C
G C
��
C G
liaisons phosphodiester dans le respect de la règle de C

G
C
G
complémentarité des bases (A-T ; G-C). G

G
C
G
C
C G
A T
T A
2 - Changement de forme de l’ADN C

G
C
G
C
G
��
La molécule d’ADN doit être accessible aux enzymes
G
��
C
T
A A
T
chargées de sa réplication. Or l’ADN en son état naturel C

G
C
G
est surenroulé. Par conséquent, cet état doit être modifié C

A
T
A
G G
pour laisser l’accès aux enzymes responsables de la T

A C A
réplication. Les enzymes qui assurent ces modifications

C
G G
G C
de l’état d’enroulement de l’ADN sont les topoisomérases.

C
G C
C
Elles déstructurent et restructurent la forme en isomérisant

5
l’ADN. On distingue les topoisomérases I et II avec, bien entendu, des fonctions spécifiques.
La topoisomérase de type I ne coupe que l’un des deux brins de l’ADN en se liant par une des tyrosines au phosphate en 5’ libre de l’ADN coupé.
La molécule d’ADN peut ensuite librement se dérouler et l’énergie de la liaison phosphodiester libérée est transférée lors de la ligation de l’ADN
qui suit le déroulement, ce qui explique que l’énergie sous forme d’ATP n’est pas toujours nécessaire.
La topoisomérase de type II agit spécifiquement en coupant les deux brins de l’ADN. Contrairement à la précédente, elle est capable, chez les
procaryotes, de créer ou de retirer des supertours en consommant de l’énergie. L’une des premières décrites est la gyrase d’E coli, enzyme très
active car il lui est possible de faire ou défaire environ 100 tours par minute. Sensible à la novobicine, cette enzyme est moins bien connue chez
les eucaryotes que chez les procaryotes. Les topoisomérases ne sont pas capables de produire les supertours observés lors de la formation des
nucléosomes. En réalité elles jouent un rôle de relâchement dans les boucles pour favoriser la transcription.
Il est donc important de dérouler l’ADN et de le maintenir sous forme simple brin. Les deux brins sont séparés au moyen d’enzymes que sont
les hélicases (ou déroulases) qui s’associent sur les brins d’ADN, coupent, déroulent et réassocient. Ces activités sont énergie-dépendantes et
utilisent de l’ATP.
Il existe plusieurs types d’hélicases qui se fixent soit sur le brin 3’-5’ soit sur le brin 5’-3’ (hélicases II et III). Les brins d’ADN séparés sont stabilisés
sous forme simple brin au moyen de protéines, les SSBP (single strand binding protein). Leur structure, sous forme de tétramère de 74 kDa,
favorise la fixation sur la molécule d’ADN. L’association des tétramères sur le fragment d’ADN est régie par un phénomène coopératif où la fixation
du premier tétramère favorise la liaison du deuxième etc…, ce qui finit par constituer un manchon rigide de SSB et empêche la réassociation des
brins d’ADN.
3 - Initiation de la réplication
La réplication démarre à l’intérieur de la molécule d’ADN en un point qui est l’origine de la réplication et s’effectue dans les deux directions de
l’orientation de l’ADN bicaténaire. Chez les virus et les bactéries, on distingue sur l’ADN une seule origine de réplication alors que, chez les
eucaryotes, on distingue plusieurs origines. Cette multiplicité des origines de la réplication fait que la duplication de l’ADN eucaryote est bien plus
rapide que celle de l’ADN procaryote, même si la vitesse de déplacement de la fourche de réplication est plus lente (inférieure à 5 000 pb /min pour
les eucaryotes et de l’ordre de 100 000 pb/min pour les procaryotes).
6
��
Il est capital de noter que l’ADN ��
��
��
polymérase doit l’amorce de son ��
��
activité catalytique à une structure
��
d’ADN obligatoirement double ��
��
brin. L’initiation de la réplication
��
nécessite cette structure double brin ��
qui se manifeste par la synthèse et

la liaison sur l’ADN monocaténaire
��
d’une amorce d’ARN ou primer. La ��
��
��
synthèse n’est effective qu’après
��
l’élongation de cette amorce, ce qui
fut démontré par Okasaki. Ce petit
��
ARN est synthétisé par un complexe,
��
le primosome. C’est cet élément
��
qui détermine l’origine de l’amorce.
Le primosome est constitué de trois
��
types de protéines.
En premier lieu, une ADN ��
��
polymérase dépendante appelée
primase et codée par le gène dnaG.
On distingue ensuite deux protéines
qui s’associent à la primase pour former un complexe capable de synthétiser de l’ARN (les gènes responsables sont les dnaB et dnaC). Enfin, il
existe des protéines spécifiques i, n, n’, n’’ qui assurent la reconnaissance du site où doit être synthétisée l’amorce, par conséquent leur fixation à
l’ADN donne une structure qui permet la fixation des protéines issues de gènes dnaB et dnaC et de la primase. Chez les phages, ce mécanisme
est bien décrit : lors du déroulement de l’ADN par les hélicases, les protéines SSB ne se fixent pas sur une petite portion de l’ADN. Du fait de
7
la présence complémentaire cette portion d’ADN va prendre une structure type hair-pin (épingle à cheveux). C’est cette structure qui favorise la
reconnaissance du primosome et initie la synthèse.
Par conséquent, sur le brin matrice une séquence nucléotidique complémentaire courte (10 à 40 nucléotides) s’hybride et initie le mécanisme de
réplication. Cette courte séquence de nucléotides indispensable est synthétisée par une ARN polymérase appelée primase.
La polymérase peut se détacher de l’ADN puis se réassocier à nouveau pour continuer la réplication. La polymérase est dite processive quand elle
reste longtemps fixée à l’ADN.
4- Terminaison du brin d’ADN

Les amorces d’ARN qui initient la réplication sont dégradées par une enzyme spécifique qui hydrolyse l’ARN sur les hybrides ARN-ADN : la Rnase
H. La lacune engendrée par cette action est comblée par l’action de l’ADN polymérase I. La soudure du brin d’ADN est effectuée par une enzyme
appelée ligase qui génère des liaisons phosphodiester entre le 3’OH et les nucléosides triphosphates.
5- Correction immédiate des erreurs

Le taux d’erreur lors de la polymérisation est d’environ 1/10 000, cependant l’erreur observée sur l’ADN néo-synthétisé est de 1/108. Cette
différence est expliquée par la reconnaissance des erreurs de l’ADN Polymérase et la réparation immédiate. Cette action de « contrôle-correction
» dénommée proofreading est dûe à une activité 3’-exonucléase spécifique de ces polymérases. Le processus supposé est le suivant :
La polymérase en action entoure l’ADN, si la base ajoutée n’est pas adéquate la structure spatiale de l’ADN est modifiée ce qui permet de laisser
agir l’activité exonucléasique 3’. Ce mécanisme extrait la base incorrectement incorporée ce qui permet le redémarrage de la polymérase avec
l’incorporation du bon nucléotide.
6- Chez les procaryotes

Trois polymérases sont décrites : I, II et III, elles sont toutes trois indispensables pour la réplication. Elles possèdent toutes une activité de
polymérisation en 5’>3’ mais également une activité exonucléasique en 3’>5’.
Pour l’ADN polymérase I, on distingue en plus une activité exonucléasique en 5’>3’ ce qui correspond à la dégradation de l’ARN amorce au
moment de la réplication.
8
7- Chez les eucaryotes
��
supérieurs, les
G
��
C
mammifères
G
C
G
A
C
T
G
On distingue 5 ADN polymérases
T
A
T
A
C
��
G
C
nommées alpha, bêta, gamma, ��
G
��
A
G
delta et epsilon. Elles assurent ��
A
G
G
l’activité de polymérisation
T
C
C
G
G
5’>3’, les formes gamma, delta
A
��
T
A
A
T
G
��
C
A
et epsilon assurent aussi une
T
G
C
A
T
G
activité exonucléase 3’>5’.
C
G
��
C
��
C
Toutes les polymérases sont
G
��
G
C
��
C
nucléaires seule la gamma est
A
C
G
T
��
mitochondriale.
A
T
A
C
��
G
C
G
G
C
A
U
��
G
C
��
A
G
T
C
C
G
A
A
G
G
La réplication chez les

T
�� C
procaryotes T
T
C
A
A
G
C
T
C
Ce mécanisme complexe est
G
C
C
C
initié par la synthèse préalable
T
A
G
C
G
C
d’une amorce qui est à l’origine
A
T
��
G
C
A
T
G
de la transcription des séquences
A
T
C
��
C
d’ADN par la primase. Cette
G
��
initiation nécessite de nombreuses

protéines spécifiques qui
constituent un complexe dénommé réplisome.
9
Au moment de l’initiation, la protéine Dna A d’E. coli se fixe sur une séquence nucléotidique quasi constante sur les ADN procaryotes issus de
diverses origines. Elle induit la séparation localisée et spécifique des deux brins d’ADN et définit l’origine de réplication.
Le déroulement très progressif de la molécule d’ADN s’effectue en présence d’énergie, sous forme d’ATP, au moyen de protéines spécifiques
appelées hélicases (DnaB, PriA). La séparation des deux brins s’effectue dans les deux sens, ce qui entraîne des tensions largement suffisantes
pour provoquer le surenroulement de la double hélice parentale non encore répliquée. Le surenroulement est amoindri par les topoisomérases.
Elles opèrent en réalisant des coupures au niveau des liaisons phosphodiester sans pour autant laisser libre les extrémités 3’ et 5’ du brin
coupé. Elles s’attachent ensuite à ces extrémités et effectuent soit des enroulements positifs (topoisomérase I) soit des enroulements négatifs
(topoisomérase II) dans les entrecroisements des brins d’ADN. Les topoisomérases I et II équilibrent leur effet pour assurer un degré convenable
de surenroulement de la molécule d’ADN.
Le démarrage de la réplication nécessite donc la séparation des deux brins parentaux ou matrice et la formation de deux fourches de réplication
qui s’éloignent au gré de la réplication. Ainsi chaque initiation constitue une unité de réplication définie comme un réplicon.
La polymérisation s’opère uniquement dans le sens 5’>3’, dans la mesure où les brins d’ADN sont antiparallèles la progression sera différente en
fonction de l’orientation du brin.
Le brin avancé ou principal s’allongera de façon continue dans le sens 5’>3’ ce qui correspond au déplacement de la fourche de réplication.
L’autre brin, secondaire ou retardé, se forme de façon discontinue par petits fragments d’ADN dont la synthèse est systématiquement amorcée en
5’>3’, donc en orientation inverse du déplacement de la fourche de réplication.
Ces fragments d’ADN intermédiaires, nommés fragments d’Okazaki, ont une taille comprise entre 1000 et 2000 chez les procaryotes (100 et 200
nucléotides chez les mammifères).
Le brin principal n’est amorcé qu’une seule fois et le brin retardé par contre est amorcé au début de chaque fragment d’Okazaki. En fonction de
la procession du complexe de réplication, le primosome se déplace et synthétise dans le sens 3’>5’ de petits oligonucléotides d’ARN qui sont
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allongés par l’ADN polymérase III en petites séquences d’ADN.
L’ADN polymérase III synthétise un brin complémentaire à partir de l’extrémité 3’OH libre de l’amorce RNA en utilisant l’ADN comme matrice dans
le sens 5’>3’, ce qui disperse les protéines SSB fixées sur ce brin. Les deux brins sont par conséquent synthétisés en 5’>3’ ; mais la synthèse ne
peut pas être effectuée de façon continue sur le brin direct orienté 3’>5’.
L’ADN polymérase I fut la première polymérase mise en évidence. Elle à été isolée par Kornberg chez E. Coli en 1960. Elle était alors considérée
comme l’enzyme de la réplication En réalité une étude sur des mutants a montré qu’elle était en fait impliquée dans les mécanismes de réparation.
La véritable réplicase est l’ADN polymérase III.
L’ADN polymérase III est constitué de 7 sous-unités codées par des gènes de structures différentes. Il semble que les polymérases soient
��

��
��
��
��
��
��
��
��
��
11
associées au niveau du point de réplication, chacune répliquant son brin, ce qui implique un repliement des brins sur eux-mêmes. L’enzyme, sur le
brin matrice ou brin direct orienté 3’>5’, synthétise en continue au fur et à mesure du déroulement des brins d’ADN. L’enzyme située sur l’autre brin
(brin retardé) synthétise de l’ADN sous forme discontinue au moyen de petits fragments (1000 à 2000 pb) nommés les fragments d’Okasaki. L’ADN
à répliquer est ensuite ouvert par les hélicases, une amorce est synthétisée sur les fragments 5’>3’, les synthèses reprennent et ce processus se
répète jusqu’à la réplication totale du brin d’ADN.
Lorsque l’ADN polymérase III arrive sur l’extrémité 5’ de l’amorce précédente, elle est remplacée par l’ADN polymérase I qui agit en qualité
d’exonucléase en dégradant l’ARN de 5’ en 3’. Son activité polymérase remplace ensuite l’amorce d’ARN par de l’ADN. L’ensemble de ces
fragments d’ADN sur le brin retardé sont associés par une enzyme qui rétablit la liaison phosphodiester : l’ADN ligase.
La formation de la première fourche de réplication est définie par le brin principal qui se forme à l’origine de la réplication. Sur le brin retardé, un
fragment d’Okazaki peut dépasser l’origine de réplication, il devient par conséquent le brin principal de la deuxième fourche de réplication.
De part et d’autre de la fourche de réplication les deux fourches évoluent en sens inverse avec pour chacune un brin principal et un brin retardé.
Il apparaît donc que le brin d’ADN est dupliqué de façon continue sur le brin 5’>3’ et discontinue sur le brin 3’>5’.
Dès que les simples brins se forment, ils sont très rapidement liés aux protéines spécifiques SSBP (single strand binding protein, protéines sans
activité enzymatique décrite) qui stabilisent les deux brins d’ADN sous forme monocaténaire indispensable à leur fonction de matrice. Les SSBP
possèdent également un rôle protecteur de l’ADN monocaténaire contre les nucléases.
Bilan : La croissance des brins est différente en fonction de l’orientation. Elle est continue sur un brin et discontinue sur l’autre, c’est fonction de
l’orientation des brins.
La réplication chez les eucaryotes
La réplication chez les eucaryotes est sensiblement identique à celle des procaryotes, la majeure distinction se fait essentiellement sur la fréquence,
en effet le temps de régénération chez les eucaryotes est nettement plus long (cycles cellulaires et taille des génomes).
12
De plus l’organisation de l’ADN chez les eucaryotes est nettement plus complexe compte tenu des protéines (histones) qui s’y associent pour
former la chromatine. Cette complexité motive les recherches avancées sur les mécanismes de contrôle de la réplication.
La réplication est bidirectionnelle et s’effectue généralement à partir de plusieurs origines. Le brin principal est synthétisé par un complexe
composé par l’ADN polymérase et la deltaprotéine pCNA (proliferating cell nuclear antigen). Sur le brin secondaire, les amorces d’ARN et les
fragments d’Okazaki sont l’œuvre d’une primase et de l’ADN polymérase alpha ; l’élimination des amorces est assurée par la RNAse H et ce sont
les polymérases alpha et bêta qui assurent le remplacement de l’ADN.
Les variations entre mécanismes de réplication procaryote et eucaryote concernent essentiellement les polymérases.
Les ADN polymérases eucaryotes

L’étude de ces enzymes a été complexe dans la mesure où elles sont peu abondantes, très sensibles à la protéolyse et leur fonctionnement
nécessite des protéines associées.
La connaissance des mécanismes de réplication a été essentiellement permise par la mise au point d’un système de réplication in vitro au moyen
du génome du virus SV 40 et le clonage de l’ADNc de quelques polymérases identifiées. Cependant les études n’ont permis d’éclaircir que le rôle
des polymérases delta et epsilon, rôle qui n’est pas identique chez les levures et chez les mammifères.
La polymérase alpha (la primase)

Elle est constituée de 4 sous-unités dont les masses moléculaires sont respectivement de 165, 70, 58 et 48 kDa. La plus grosse sous-unité possède
l’activité catalytique et a été clonée chez l’homme et la levure ; elle est constituée d’un polypeptide 165 kDa. Son gène est localisé sur le bras
court du chromosome X, en Xp 21.3 – Xp22.1. Dans les cellules, cette sous-unité présente plusieurs masses moléculaires différentes comprises
entre 120 et 180 kDa. Les formes les plus légères correspondent à des formes issues de modifications post-traductionnelles. Les sous-unités de
45 et 58 kDa possèdent une activité de type primase. Le rôle de la sous-unité de 70 kDa est encore mal connu. Cette polymérase a été nommée
polymérase - alpha-primase.
Cette enzyme ne possède pas d’activité exonucléasique 3’>5’ (excepté chez la drosophile), par conséquent elle n’est pas capable d’assurer des
épreuves de correction (proofreading). Elle ne peut donc pas assurer à elle seule la réplication de l’ADN chez les eucaryotes. Son rôle sert à
13
synthétiser les amorces indispensables à la réplication sur le brin retardé par le biais de son activité de type primase.
La polymérase bêta
Elle est constituée de 335 acides aminés (39 kDa). Sa localisation est essentiellement nucléaire et elle est codée par un gène situé sur le bras
court du chromosome 8. Cette polymérase possède un double rôle qui consiste à assurer à la fois la synthèse et la réparation de l’ADN amorcé.
Elle possède aussi une fonction excision qui supprime l’ARN amorce sur le brin retardé. On peut lui attribuer un rôle similaire à celui de l’ADN
polymérase des procaryotes.
La polymerase gamma
C’est une polymérase codée par un gène nucléaire, mais son activité est mitochondriale. Elle présente une structure variable en fonction des
organismes : homotétramère de 4 x 47 kDa observé chez le poulet ; hétérodimère chez la drosophile (125 et 35 kDa) ; monomère chez la levure
(143,5 kDa). La particularité de cette enzyme est de posséder une activité 5’-exonucléasique.
La polymérase delta
Observée initialement dans les cellules de la moelle osseuse de lapin et le thymus de veau, elle a été par la suite purifiée à partir des cellules
HELA; la forme humaine est présente sous forme de dimère (125 kDa et 48 kDa ). Son activité est potentialisée par une protéine de 36 kDa, PCNA
(Prolferating cell Nuclear antigen). Elle possède une activité 3’>5’. Il apparaît que son rôle est différent en fonction des organismes :
- Synthèse du brin direct chez les virus ;
- Synthèse du brin retardé chez les levures ;
- Synthèse de deux brins chez les eucaryotes en jonction avec la polymérase epsilon.
La polymérase epsilon
Elle aussi fut purifiée à partir des cellules HELA, deux formes ont été trouvées ;
- Une première comprenant une sous-unité catalytique de 125-140 kDa et une autre de de 40 kDa ;
- Une deuxième, plus complexe, comprenant une sous-unité catalytique de 215–230 kDa et une série de sous-unités de 30-70 kDa.
Elle est impliquée aussi bien dans le mécanisme de réplication que de réparation de l’ADN.
14
Chez l’homme, l’enzyme est constituée de deux sous-unités liées par un site de protéolyse conduisant après coupure à des formes de 140 à 250
kDa avec chacune une activité catalytique.
Ces deux formes sont retrouvées dans les cellules ; il a été observé in vitro que la protéine n’est active que si les protéines accessoires telles
PCNA ou RFA et RFC sont présentes. Cette enzyme possède une activité 3’>5’ exonucléasique. Elle ne nécessite pas le facteur PCNA pour être
active.
RF-A et RF-C sont des protéines (replication factors) avec des spécificités propres.
RFA-A est une protéine constituée de 3 sous-unités (11, 34 et 70kDa) qui se fixe sur l’ADN simple brin. Ce facteur semble être impliqué dans les
mécanismes de recombinaison.
RF-C Se fixe au niveau des zones de synthèse des amorces. Ce facteur de réplication possède une fonction ATPasique ADN dépendante.
La réplication des extrémités d’ADN linéaire

Lors de la réplication d’ADN circulaire, le remplacement des amorces ARN par de l’ADN est parfaitement maîtrisé par les mécanismes de réparation.
Dans le cas des molécules d’ADN linéaire le retrait de l’ARN aux extrémités des brins directs laisse un espace qui ne peut être comblé dans la
mesure où les polymérases ne fonctionnent que dans le sens 3’>5’. Chez les eucaryotes, ce problème est levé par la présence des séquences
télomériques. Chez les eucaryotes, la synthèse et la réplication du télomère sont généralement catalysés par la télomérase, une transcriptase
inverse spécialisée qui maintient la longueur du télomère en équilibrant son raccourcissement et son élongation nets. La télomérase est une
ribonucléoprotéine pour laquelle une partie de la composante ARN fournit la matrice utile à la synthèse des séquences télomériques. Elle est donc
responsable de la réplication des extrémités d’ADN linéaire.
Correction lors de la réplication
L’activité de réplication, bien qu‘effectuée selon un principe de copiage fidèle qui utilise une matrice, n’est pas infaillible et des erreurs de réplication
surviennent. Ainsi a-t-il été observé un taux d’erreur par nucléotides de l’ordre 1 sur 1 milliard. Une aussi grande fidélité de réplication est due non
seulement à la spécificité d’appariement des bases AT et GC mais aussi à la propriété de correction d’épreuve de l’ADN Pol III. La correction a
15
pour rôle d’éliminer le nucléotide mal apparié donc mal intégré au moment de la réplication. L’ADN pol III assure cette fonction grâce à son activité
d’exonucléase 3’>5’. L’élimination du nucléotide mal apparié libère une extrémité 3’OH qui peut être utilisée par l’ADN polymérase pour insérer le
bon nucléotide. Le taux d’erreur dans l’ADN est ainsi contrôlé par la même enzyme grâce à ses activités de polymérisation dans le sens 5’>3’ et
de dépolymérisation dans le sens 3’>5’.
Se pose le problème de la structure de la chromatine

Les modifications de la topologie de l’ADN après réplication ne posent pas de problèmes compte-tenu des nombreuses topoisomérases qui sont
présentes. Cependant se pose la question de la structuration nucléosomique. Il apparaît que la molécule d’ADN après réplication s’organise très
rapidement en nucléosomes (observations effectuées grâce au marquage à la thymidine tritiée).
Les nouveaux nucléosomes formés contiennent essentiellement des histones nouvellement synthétisées. Aucun mélange n’a été observé entre
les anciennes et les nouvelles histones au sein d’un même nucléosome.
Le système de sauvegarde assure le maintient de l’intégrité de l’ADN

Les agressions physiques et chimiques de l’environnement altèrent les différentes molécules cibles de toutes les cellules. Les altérations de la
molécule d’ADN sont les plus graves puisqu’elles peuvent être pérennisées au cours des réplications. À ce titre, il existe des systèmes qui assurent
le maintient de l’intégrité de l’ADN face à ces agressions.
Les altérations d’origine physique

Les rayons cosmiques et la radioactivité correspondent à des rayonnements très énergétiques qui peuvent directement produire des lésions de
type modification de bases ou rupture de brins. Cependant l’agression par ces rayonnements peut être aussi indirecte car ils génèrent l’apparition
d’ions superoxides (ou radicaux libres), agents très réactifs. Les rayons solaires, moins énergétiques, induisent principalement des dimérisations
de thymines.
Altérations d’origine chimique

Elles sont très variées et peuvent résulter du simple métabolisme de la cellule. Il a été observé que l’agitation thermique et les ions H+ peuvent
supprimer 10000 bases puriques par jour et par cellule chez l’homme.
16
Ces lésions peuvent être directes (dépurination modification de bases, désamination, oxydation, création de liaisons covalentes entre les deux
brins). Elles peuvent être aussi indirectes (substances intercalantes comme le bromure d’éthidium).
Toutes ces altérations se produisent principalement entre les mitoses et entraînent des mutations de type délétion et insertion.
Des systèmes multiples assurent la sauvegarde du contenu informatif de l’ADN

Dans le cadre de prévention, la cellule possède des systèmes de protection contre les agents susceptibles de provoquer des altérations. Si l’on
considère l’exemple des ions superoxydes, ils sont directement détruits par la superoxyde dismutase (SOD). Les protons H+ sont directement pris
en charge par des systèmes de régulation de l’équilibre acido-basique. Les oxydations sont réduites par les différents systèmes de réduction.
La fidélité de la réplication n’est pas absolue, cependant la correction immédiate des erreurs est assuré par un système assez fidèle. L’activité
proofreading des polymérases (correction) laisse passer quelques erreurs. En général, après polymérisation, on observe environ un taux d’erreur
de 10-10 à 10-11. Il se trouve que le produit formé tout de suite après le passage de la polymérase possède encore un taux d’erreur voisin de 10-
8. Il existe un système qui a pour fonction de reconnaître le mauvais appariement, de détecter quel est le nouveau brin, de localiser l’erreur et de
sectionner immédiatement après la mauvaise base.
17
La Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La PCR (Polymerase Chain Reaction) fut inventée par K. Mullis en 1983 et brevetée en 1985. Son principe repose sur l’utilisation de l’ADN
polymérase, il s’agit d’une réplication in vitro de séquences spécifiques d’ADN. Cette méthode permet de générer à des dizaines de milliards
d’exemplaires un fragment d’ADN particulier (la séquence d’intérêt, ADN d’intérêt ou ADN cible) à partir d’un extrait d’ADN (ADN matriciel). En
effet, si la séquence d’intérêt est présente dans l’extrait d’ADN, il est possible de sélectivement la répliquer (on parle d’amplification) en très grande
quantité. La puissance de la PCR repose sur le fait que la quantité d’ADN matriciel n’est pas, en théorie, un facteur limitant. On peut donc amplifier
des séquences nucléotidiques à partir de quantités infinitésimales d’extrait d’ADN.
La PCR est donc une technique de purification ou de clonage. L’ADN extrait à partir d’un organisme ou d’un échantillon contenant des ADN d’origines
diverses n’est pas directement analysable. Il contient une masse trop importante de séquences nucléotidiques. Il convient donc d’isoler, de purifier
la ou les séquences qui présentent un intérêt, qu’il s’agisse de la séquence d’un gène ou de séquences non codantes (introns, transposons, mini
ou microsatellites…). À partir d’une telle masse de séquences que constitue l’ADN matriciel, la PCR peut donc sélectionner une ou plusieurs
séquences déterminées et les amplifier par réplication à des dizaines de milliards de copies. La réaction terminée, la quantité extrêmement faible
d’ADN matriciel contenue dans l’échantillon PCR n’aura pas varié. En revanche, la quantité de la ou des séquences amplifiées (l’ADN d’intérêt)
sera très grande. La PCR permet donc d’amplifier un signal à partir d’un bruit de fond, il s’agit donc bien d’une méthode de clonage moléculaire,
et cloner revient à purifier.
Les applications de la PCR sont multiples. C’est une technique désormais incontournable en biologie cellulaire et moléculaire. Elle permet
notamment en quelques heures le « clonage acellulaire » d’un fragment d’ADN grâce à un système automatisé, alors qu’il faut plusieurs jours avec
les techniques standard de clonage moléculaire. D’autre part, la PCR est largement utilisée à des fins de diagnostic pour détecter la présence d’une
séquence d’ADN spécifique de tel ou tel organisme dans un fluide biologique. Elle est aussi employée pour réaliser des empreintes génétiques,
qu’il s’agisse de l’identification génétique d’une personne dans le cadre d’une enquête judiciaire, ou de l’identification de variétés animales,
végétales ou microbiennes destinée à des tests de qualité alimentaire, de diagnostic ou de sélection variétale. La PCR est encore indispensable
à la réalisation d’un séquençage ou d’une mutagénèse dirigée. Enfin, il existe des variantes de la PCR : real-time PCR, PCR compétitive, PCR in
situ, RT-PCR…
18
But et principe
La PCR permet donc d’obtenir par réplication in vitro de multiples copies d’un fragment d’ADN à partir d’un extrait. L’ADN matriciel peut tout autant
être de l’ADN génomique que de l’ADN complémentaire obtenu par RT-PCR à partir d’un extrait d’ARN messagers (ARN poly-A), ou encore de
l’ADN mitochondrial.
Le mélange réactionnel et les cycles de température

La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans un mélange réactionnel qui comprend l’extrait d’ADN (ADN matriciel), la Taq polymérase,
les amorces et les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans une solution tampon. Les tubes contenant le mélange
réactionnel sont soumis à des cycles de température réitérés plusieurs dizaines de fois dans le bloc chauffant d’un thermocycleur (appareil qui
comporte une enceinte où l’on dépose les tubes échantillons et dans laquelle la température peut varier, très rapidement et précisément, de 0 à
100°C par effet Peltier). L’appareil permet la programmation de la durée et de la succession des cycles de paliers de température. Chaque cycle
comprend trois périodes de quelques dizaines de secondes.
La dénaturation : 94°C
La première période s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de
matrice au cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80°C et les
ADN double-brin se dénaturent en ADN simple-brin (ADN monocaténaires).
L’hybridation : 40 – 70°C
La deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température d’hybridation des amorces. La
diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces,
courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins
d’ADN matriciel. Plus la température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.
19
Les amorces (primers)
Pour parvenir à amplifier sélectivement des séquences nucléotidiques à partir d’un extrait d’ADN par PCR, il est indispensable de disposer d’au
moins une paire d’oligonucléotides. Ces oligonucléotides, qui vont servir d’amorces pour la réplication, sont synthétisés par voie chimique et doivent
montrer la meilleure complémentarité possible avec les deux extrémités de la séquence d’intérêt que l’on souhaite amplifier. L’une des amorces
est conçue pour reconnaître par complémentarité une
séquence située en amont du brin 5’-3’ du fragment
��
d’ADN d’intérêt ; l’autre pour reconnaître, toujours ��
par complémentarité, une séquence située en amont

du brin complémentaire (3’-5’) du même fragment ��
d’ADN. Les amorces sont des ADN monocaténaires

��
dont l’hybridation sur les séquences flanquant la ��
séquence d’intérêt permettra sa réplication de façon

��
sélective. La taille des amorces est généralement
��
comprise entre 10 et 30 nucléotides afin de garantir ��
��
une hybridation suffisamment spécifique sur les ��
��
séquences d’intérêt de l’ADN matriciel. ��
��
D’autres critères, importants mais secondaires par
��
rapport aux précédents, doivent être pris en compte ��
��
��
pour la conception et l’emploi des amorces. La ��

��
séquence des amorces doit comporter la plus grande
proportion possible de guanines et de cytosines.
En effet, la liaison entre guanines et cytosines est Figure 1: 1er cycle d’amplification par PCR
assurée par trois liaisons hydrogène au lieu de deux

entre les adénines et les thymines, ce qui se traduit
par une meilleure stabilité de la liaison au moment de l’hybridation des amorces. Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus leur
température d’hybridation (Tm) peut être élevée (elle est en général comprise entre 40 et 65°C, mais peut atteindre 70°C) et donc plus la spécificité
20
de l’hybridation est grande. À des températures d’hybridation basses, les amorces s’hybrident de façon beaucoup moins sélective ce qui peut se
traduire par l’amplification de séquences d’ADN non souhaitées (amplification non spécifique).
Les pourcentages en guanines et cytosines de chaque membre du couple d’amorces doivent être aussi proches que possible car la proportion
de guanine et cytosine détermine la température
d’hybridation. Si ces proportions diffèrent ��
significativement d’une amorce à l’autre, il est très ��
��
malaisé de définir une température d’hybridation
��
convenable et qui permette une hybridation ��
équilibrée des amorces. Il ne faut pas non plus que ��

��
les amorces présentent de fortes complémentarités ��
��
de séquence sans quoi elles s’associeraient entre- ��
��
elles et n’effectueraient pas correctement l’amorçage ��
��
��
de la réplication.
��
Il faut encore noter que certaines modifications
��
chimiques du milieu réactionnel permettent ��
��
d’optimiser la spécificité d’hybridation des amorces. ��
��
L’ajout de détergent ou de glycérol, par exemple,
��
inhibe la formation des liaisons hydrogène, rend plus ��
��
��
difficile l’hybridation des amorces et donc favorise sa
spécificité.
Figure 2: 2ème cycle d’amplification par PCR
L’élongation : 72°C
La troisième période s’effectue à une température de
72°C, dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant
les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi
sélectivement synthétisées.
21
Au cycle suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent servent à leur tour de matrice et au bout de quelques cycles, l’espèce prédominante
correspond à la séquence d’ADN comprise entre les régions où les amorces s’hybrident. Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une
quantité analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme). Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d’ADN présente au cours du cycle
précédent.
Il est recommandé de rajouter un cycle final d’élongation à 72°C, notamment lorsque la séquence d’intérêt est de grande taille (supérieure à 1
kilobase), à raison de 2 minutes par kilobase.
La PCR permet d’amplifier des séquences dont la
taille est inférieure à 6 kilobases.
��
��
��
La Taq polymérase ��
��
L’ADN polymérase permet la réplication. On utilise ��
��
une ADN polymérase purifiée ou clonée à partir
��
d’une bactérie extrêmophile, Thermus aquaticus,
��
qui vit dans les sources chaudes et résiste à des ��
��
��
températures supérieures à 100°C. Cette polymérase ��
��
(Taq polymérase) possède la caractéristique ��
��
��
remarquable de résister à des températures de ��
��
��
l’ordre de 100°C, lesquelles sont généralement
��
suffisantes pour dénaturer la plupart des protéines. ��
��
��
Thermus aquaticus trouve sa température de confort ��

��
à 72°C, température optimum pour l’activité de sa
��
polymérase. ��
��
��
��
��
Les conditions réactionnelles ��
��
��
Les volumes de milieu réactionnel varient entre 10 et
100 µl. Il existe une multitude de formules de milieux
Figure 3: 3ème cycle d’amplification par PCR
21
réactionnels. Il est toutefois possible de définir une formule standard qui convient à la plupart des réactions de polymérisation en chaîne. Cette
formule, à peu de chose près, a été choisie par la plupart des fabricants et fournisseurs qui, du reste, délivre une solution tampon prête à l’emploi
avec la Taq polymérase. Concentrée 10 fois, sa formule est à peu près la suivante : 100 mM Tris-HCl, pH 9,0 ; 15 mM MgCl2, 500 mM KCl.
Il est possible de rajouter des détergents (Tween 20, Triton
X-100…) ou du glycérol afin d’augmenter les conditions de
stringence qui rendent plus difficile et donc plus sélective
l’hybridation des amorces. Cette démarche est généralement
employée pour réduire le niveau d’amplifications non spécifiques
dues à l’hybridation des amorces sur des séquences sans
��
rapport avec la séquence d’intérêt. On peut aussi réduire la
��
concentration en KCl jusqu’à l’éliminer ou encore augmenter la
concentration en MgCl2. En effet, certains couples d’amorces
fonctionnent mieux avec des solutions enrichies en magnésium.
��
D’autre part, lorsque sont utilisées de fortes concentrations en ��
��
dNTP, il convient d’augmenter la concentration en magnésium
à cause des interactions stœchiométriques entre magnésium
��
et dNTP qui réduisent la quantité de magnésium libre dans le
milieu réactionnel.
Figure 4: Hétérogénéité des fragments amplifiés par PCR
Les dNTP (desoxyribonucléotides) fournissent à la fois l’énergie
et les nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ADN lors de la
polymérisation en chaîne. Ils sont incorporés au milieu réactionnel en excès, soit environ 200 µM final.
Selon le volume réactionnel choisi, la concentration en amorce peut varier entre 10 et 50 pmol par échantillon.
L’ADN matriciel peut provenir de n’importe quel organisme et même de matériels biologiques complexes qui comprennent des ADN de différents
organismes. Mais pour garantir la réussite d’une PCR encore faut-il que l’ADN matriciel ne soit pas trop dégradé. Ce critère est évidemment d’autant
plus crucial que la taille de la séquence d’intérêt est grande. Il est aussi important que l’extrait d’ADN ne soit pas contaminé par des inhibiteurs de
la réaction de polymérisation en chaîne (détergents, EDTA, phénol, protéines…). La quantité d’ADN matriciel dans le milieu réactionnel pour initier
22
la réaction d’amplification peut se réduire à une copie unique. La quantité maximale ne peut en aucun cas excéder 2 µg. En général, les quantités
utilisées se situent dans une gamme comprise entre 10 et 500 ng d’ADN matriciel.
La quantité de Taq polymérase par échantillon est généralement comprise entre 1 et 3 unités.
Le choix de la durée des cycles de température et du nombre de cycles dépend de la taille de la séquence d’intérêt ainsi que de la taille et de la
complémentarité des amorces. Il convient de réduire les durées au minimum non seulement pour un gain de temps mais aussi pour prévenir le
risque d’amplification non spécifique. Pour la dénaturation et l’hybridation des amorces, 30 secondes suffisent généralement. Pour l’élongation, il
faut compter 1 minute par kilobase d’ADN d’intérêt et 2 minutes par kilobase pour le cycle final d’élongation. Le nombre de cycles, généralement
compris entre 20 et 40, est inversement proportionnel à l’abondance en ADN matriciel.
Détection et analyse des produits PCR
Le produit d’une PCR est constitué d’un ou de plusieurs fragments d’ADN (la ou les séquences d’intérêt). La détection et l’analyse des produits
peuvent être très rapidement réalisées par électrophorèse sur gel d’agarose (ou d’acrylamide). L’ADN est révélé par une coloration au bromure
d’éthidium. Ainsi, les produits sont-ils visibles instantanément par transillumination aux ultraviolets (280 – 320 nm).
Des produits de très petite taille sont souvent visibles très près du front de migration sous forme de bandes plus ou moins diffuses. Ils correspondent
à des dimères d’amorces et parfois aux amorces elles-mêmes. Selon les conditions réactionnelles, il arrive que des fragments non spécifiques
d’ADN soient amplifiés en quantité plus ou moins abondante, formant des bandes nettes ou des « traînées » (smear).
Sur des systèmes automatisés, on utilise aujourd’hui un analyseur de fragment. Cet appareillage utilise le principe de l’électrophorèse capillaire.
La détection des fragments est réalisée par une diode laser. Cela n’est possible que si la PCR est réalisée avec des amorces couplées à des
fluorochromes.
23
Applications
Le clonage acellulaire
C’est l’une des applications les plus remarquables de la PCR. Elle permet d’isoler, c’est-à-dire de purifier un gène sans recourir aux méthodes
traditionnelles de clonage moléculaire qui consistent à insérer une banque d’ADN dans un vecteur plasmidique qui est ensuite employé à transformer
une souche bactérienne dont les clones, après sélection, sont criblés. La réalisation est beaucoup plus rapide et beaucoup moins aléatoire en
utilisant la PCR.
On parle de clonage acellulaire, lorsqu’on utilise la PCR, car il est inutile d’employer un système cellulaire (bactérie, levure, cellule animale ou
végétale) pour amplifier le clone. La réalisation d’un clonage moléculaire par PCR dépend de deux critères majeurs : le choix de l’extrait d’ADN
(l’ADN matriciel) et des amorces. Il est en effet indispensable de disposer de données plus ou moins fiables sur la séquence du gène que l’on
souhaite cloner et/ou des séquences qui le flanquent afin de synthétiser les jeux d’amorces nécessaires à son amplification en tout ou partie.
D’autre part, s’agit-il encore de réaliser la PCR sur l’ADN matriciel adéquat. On peut choisir l’ADN génomique qui comporte la séquence totale du
génome et donc l’ensemble des gènes de l’espèce. Dans ce cas, les gènes comprennent tant les exons que les introns et leur amplification aboutit
au clonage de la séquence complète du gène et même, selon les amorces que l’on a choisies, des régions régulatrices.
Mais on peut aussi choisir d’extraire les ARN messagers (ARNm), c’est-à-dire les seules séquences codantes du gène — les transcrits. Étant
donné que les ARN sont instables, les ARN messagers sont transformés en ADN complémentaires (ADNc) par RT-PCR (voir infra), une variante
de la PCR qui utilise la transcriptase inverse et permet de changer les séquences ARN en ADN. C’est sur cette banque d’ADNc que l’on réalise
alors la PCR pour cloner le gène d’intérêt. Dans ce cas, la donne est plus complexe. La présence du transcrit d’un gène dans l’extrait dépend du
type cellulaire, du tissu ou de l’organe à partir duquel on a réalisé l’extraction d’ARNm. En effet, la transcription est spécifique du type cellulaire.
Pis, l’expression d’un gène est souvent régulée par des facteurs physiologiques, environnementaux… Autant dire donc que le gène d’intérêt n’est
pas forcément transcrit et que la banque d’ADNc peut ne pas le contenir. Enfin faut-il encore signaler que la transcription est elle-même régulée
et se voit souvent accompagnée d’un épissage alternatif. Ce phénomène conduit à l’élimination d’exons au moment de l’excision des introns et
conduit à l’expression de différentes protéines à partir du même gène. Il en découle que selon le type cellulaire et les profils de régulation, on peut
ne pas avoir affaire au même transcrit. Il est néanmoins très intéressant de cloner un transcrit puisque sa séquence nucléotidique correspond à
la séquence aminoacide issue de la traduction. D’autre part, avec un ADNc il est plus facile de réaliser l’expression du gène et donc l’évaluation
24
fonctionnelle de la ou des protéines qui lui correspondent dans un modèle cellulaire d’expression.
Très fréquemment le clonage par PCR est pratiqué parallèlement sur ADN génomique (banque génomique) et différentes banques d’ADNc de
sorte à déterminer la séquence complète du gène, son profil d’expression, les modalités de régulation d’épissage…
Plusieurs cas de figure se présentent :
1/ La séquence du gène est connue ;
2/ La séquence du gène n’est pas connue, mais il appartient à une famille dont plusieurs membres ont déjà été clonés et séquencés, et dont on
peut déduire par comparaison des séquences très conservées au sein de la famille ;
3/ La séquence n’est pas connue, mais le gène a déjà été cloné et séquencé chez d’autres espèces d’où l’on peut déduire des séquences
homologues entre espèces ;
4/ La séquence du gène n’est pas connue, mais la protéine qui lui correspond a été purifiée et séquencée et l’on peut déduire une séquence
nucléotidique dégénérée à partir de la séquence aminoacide (génétique inverse), ce cas peut se combiner avec les deux précédents ;
5/ Le gène et la protéine qui lui correspond sont inconnus.
Le cas (1) ne présente pas de difficulté, la connaissance des séquences permet de synthétiser les jeux d’amorces nécessaires à l’amplification.
Dans les cas (2) et (3), la difficulté augmente à cause des incertitudes en matière de séquence. Toutefois, les homologies sont assez fiables pour
permettre de produire des jeux d’amorces performants à condition bien sûr que les espèces ne soient pas trop éloignées, ou que la famille du gène
d’intérêt ne soit pas trop hétéromorphe. Le cas (4) peut poser des problèmes importants notamment dans la mesure où les séquences protéiques
à partir desquelles les amorces sont déduites contiennent des aminoacides très dégénérés. Le cas (5) est quasiment désespéré.
La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Comme on l’a vu au chapitre précédent, il peut s’avérer pertinent d’extraire les ARNm pour générer ensuite des copies d’ADNc. Cette réaction est
catalysée par la transcriptase inverse des rétrovirus (reverse transcriptase) qui synthétise une chaîne d’ADN à partir d’une matrice d’ARN.
Dans un premier temps, les ARN totaux sont extraits. Les ARNm sont isolés à partir des ARN totaux par chromatographie d’affinité grâce à
des oligodT (oligonucléotide polyT), car les ARN messagers se caractérisent par une séquence polyA en 3’. Puis , les ARNm sont soumis à la
transcriptase inverse qui va générer une copie d’ADN (ADNc) de chaque ARNm. À l’issue de la transcription inverse, les ARNm sont hydrolysés
(traitement alcalin, RNase ou température). Les étapes suivantes sont réalisées dans l’enceinte du thermocycleur. Les ADNc monocaténaires
25
sont alors répliqués par l’ADN polymérase au cours d’un premier cycle de température. D’autres cycles sont réitérés afin d’amplifier les ADNc
bicaténaires en grande quantité.
Dans un phénotype cellulaire donné, on estime que 10 à 15 000 gènes sont exprimés chez l’homme et la plupart des mammifères. Certains
transcrits cellulaires sont exprimés à quelques centaines voire quelques milliers de copies par cellule, mais la majorité des transcrits représente un
faible nombre de copies. Les profils d’expression des transcrits connaissent des variations qualitatives ou quantitatives qui reflètent la dynamique
biologique de la cellule. L’identification des
variations d’expression de gènes dans un
contexte physiologique ou pathologique donné
peut donc apporter des informations précieuses ��
concernant la fonction des gènes et l’influence

��
de facteurs de modulation de leur expression, ��
qu’ils soient physiologiques ou d’origine

��
environnementale. L’analyse des variations ��
��
d’expression de gènes impliqués dans une

��
pathologie peut orienter vers de nouvelles ��
��
cibles thérapeutiques ou de diagnostic. Enfin,
d’un point de vue fondamental, étudier le
��
profil d’expression de gènes permet d’avancer ��
��
dans la compréhension des mécanismes de
physiologie cellulaire. ��
��
La PCR quantitative en temps réel

(Quantitative real-time PCR)
Mise au point au milieu des années quatre-vingt-
dix, la PCR quantitative permet de déterminer Figure 5 : Le principe de la RT-PCR
le taux d’ADN ou d’ARN spécifiques dans un
26
échantillon biologique. La méthode est basée sur la détection d’un signal fluorescent qui est produit de façon proportionnelle à l’amplification du produit
PCR, cycle après cycle. Elle nécessite un thermocycleur couplé à un système de lecture optique qui mesure une émission de fluorescence.
Une sonde nucléotidique est synthétisée de telle sorte qu’elle puisse s’hybrider sélectivement à l’ADN d’intérêt, entre les séquences où les amorces
s’hybrident. La sonde est marquée sur l’extrémité
5’ par un fluorochrome signal (par exemple, la ��
� ��
6-carboxyfluoresceine), et sur l’extrémité 3’ par ��
��
��
��
un fluorochrome extincteur (quencher) (par
exemple, la 6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine). ��
��
��
Cette sonde doit montrer une température ��
d’hybridation (Tm) supérieure à celle des �

�
amorces afin qu’elle s’hybride à 100 % pendant � ��
�
la phase d’élongation (paramètre critique). ��
��
��
��
Tant que les deux fluorochromes restent
présents au niveau de la sonde, l’extincteur ��
��
��
��
empêche la fluorescence du signal. En fait, la
proximité de l’extincteur et du signal induit une �
�
� ��
� � � ��
absence d’émission de fluorescence Or, pendant ��
��
��
��

la phase d’élongation, la Taq polymérase, qui
possède une activité nucléase 5’-3’ intrinsèque, ��
��
��
dégrade la sonde et donc libère le fluorochrome
��
signal. Le taux de fluorescence alors libéré est

proportionnel à la quantité de produits PCR
générée à chaque cycle. Figure 6 : Le principe de la PCR quantitative en temps réel
Le thermocycleur est conçu de telle sorte

que chaque échantillon (la PCR est réalisée
généralement dans des plaques 96 puits) soit connecté à un système optique. Celui-ci comprend un émetteur laser connecté à une fibre optique.
27
Le laser, par l’intermédiaire de la fibre optique, excite le fluorochrome au sein du mélange réactionnel PCR. La fluorescence émise est retransmise,
toujours par le biais de la fibre optique, à une caméra numérique reliée à un ordinateur. Un logiciel analyse et thésaurise ensuite les données.
La PCR quantitative est une méthode de hautes spécificité et sensibilité. Elle s’avère très opportune pour d’innombrables applications. Une PCR
conventionnelle n’apporte que des données qualitatives (présence ou absence de l’ADN d’intérêt, purification de cet ADN). La PCR quantitative,
comme son nom l’indique, permet de connaître en outre précisément la quantité de l’ADN d’intérêt (ou de l’ARN, puisqu’il est possible de conduire
une RT-PCR quantitative avec le même appareillage). Elle est en effet très souvent utilisée à cette fin, par exemple afin de déterminer la charge
virale, notamment dans les cas d’hépatite C ou de SIDA. L’une des plus remarquables et utiles applications est l’analyse de l’expression d’un gène
grâce à la mesure quantitative des transcrits.
La PCR semi-quantitative ou compétitive

Il s’agit dans la plupart des cas de RT-PCR. Dans le cas de la PCR quantitative, le taux d’ARN ou d’ADN d’intérêt est mesuré en tant que quantité
absolue. Dans les cas de PCR semi-quantitative ou de PCR compétitive, il s’agit de mesurer des quantités relatives grâce à des standards qui
correspondent à des ARN ou plus rarement à des ADN. Ces standards peuvent être internes ou externes. Les standards externes peuvent être
homologues ou hétérologues. Le standard est un ARN (plus rarement un ADN) qui est présent dans l’extrait d’ARN (standard interne) ou qui est
rajouté en quantité connue dans le mélange réactionnel (standard externe). Le standard est amplifié en même temps que l’ARN d’intérêt. Il y a
donc compétition entre l’amplification du standard et celle de l’ADN d’intérêt. Plus la quantité de standard est importante (il s’agit néanmoins que
l’amplification soit toujours en phase exponentielle) moins l’ARN d’intérêt sera amplifié et donc plus sa quantité sera faible in fine. Bien sûr, la
méthode d’analyse de l’échantillon PCR doit permettre de discriminer le standard par rapport à l’ARN d’intérêt d’une part et d’autre part d’évaluer
la quantité relative d’ADN d’intérêt par comparaison avec la quantité de standard qui est connue.
Les standard internes sont des ARN endogènes, correspondant aux ARN de gènes dont l’expression est présumée constante (actine, bêta2-
microglobuline…) et qui sont présents au sein de la population d’ARN matrices lors de la transcription inverse. Ces standards présentent un
désavantage majeur : ils nécessitent l’emploi d’amorces différentes de celles qui sont utilisées pour l’ARN d’intérêt. Les cinétiques d’amplification
sont donc sensiblement différentes et il est très difficile voire impossible de garantir une expression constante entre différents échantillons.
Les standards d’ARN externes homologues sont des ARN synthétiques qui partagent les mêmes sites d’hybridation des amorces que l’ARN
d’intérêt et qui possèdent la même séquence globale, à une légère mutation, délétion ou insertion près qui vont permettre l’identification et la
quantification de celui-ci par rapport au signal rendu par l’ARN d’intérêt. Ces standards permettent d’une part d’apprécier la variabilité introduite
28
au niveau de la RT et, d’autre part, présentent globalement la même efficacité d’amplification que l’ARN d’intérêt que ce soit au niveau de la RT
ou de la PCR.
Les standards d’ARN externes hétérologues sont des ARN exogènes et leur taux peut donc être contrôlé. Ils présentent toutefois, à la différence
des standards externes homologues une efficacité d’amplification différente comparé à celle de l’ARN d’intérêt.
Dans le cas de la RT-PCR quantitative (PCR semi-quantitative), le standard consiste en une solution titrée d’ADN de séquence identique à celle
de l’ADN d’intérêt à quantifier. Une série de dilution est réalisée, chacune étant utilisée pour une amplification. Il s’agit ensuite de définir le nombre
idéal de cycles pour se placer dans la phase exponentielle de la réaction tout en s’assurant d’une amplification efficace. Ensuite, chaque dilution
d’ADN standard ainsi que l’ADN extrait de l’échantillon à quantifier sont soumis en parallèle à la réaction de PCR. Une courbe étalon est établie
avec les dilutions de standards [signal = f (concentration)]. Connaissant la valeur du signal mesuré sur l’échantillon à quantifier, le nombre de
copies correspondant peut être extrapolé à partir de la courbe.
Dans le cas de la PCR compétitive, une série de dilutions d’ARN standard externe homologue synthétique est co-amplifiée avec des quantités
équivalentes d’ARN total (et donc une quantité équivalente du gène natif). Le standard entre en compétition avec l’ARN d’intérêt vis-à-vis de la
polymérase et des amorces. Plus la concentration en standard augmente, plus le signal du gène d’intérêt diminue. Ici, la PCR n’a pas besoin d’être
réalisée en phase exponentielle et les résultats présentent une correcte reproductibilité. Cependant la méthode est lourde et ne permet pas de
gérer beaucoup d’échantillons simultanément.
La PCR appliquée au diagnostic

La PCR représente un fabuleux outil de diagnostic. Elle est déjà très utilisée dans la détection de maladies génétiques. L’amplification de tout
ou partie d’un gène responsable d’une maladie génétique permet de révéler la ou les mutations délétères, leurs positions, leurs tailles et leurs
natures. On peut ainsi détecter des délétions, des inversions, des insertions et même des mutations ponctuelles, soit grâce à une analyse directe
des produits PCR par électrophorèse, soit en combinant la PCR à d’autres techniques.
Mais la PCR peut encore être employée pour détecter des maladies infectieuses (virales, bactériennes, parasitaires…), comme c’est déjà le cas
pour le SIDA, l’hépatite C, ou les infections à chlamydia. Même si d’autres outils de diagnostic sont efficaces pour détecter ces maladies, la PCR
présente l’énorme avantage de produire des résultats très fiables et rapides à partir d’échantillons biologiques infimes dans lesquels la présence
du pathogène n’est pas toujours décelable selon les autres techniques.
29
Maladies génétiques
Dans le cadre des maladies génétiques, il s’agit de détecter une mutation sur la séquence d’un gène. Plusieurs cas de figure se présentent. Les
plus simples concernent les insertions et délétions. Dans ces cas, la mutation se manifeste par la modification de la taille du gène ou d’une partie
du gène. Dans la mesure où la mutation est connue, décrite, il suffit donc d’amplifier tout ou partie du gène. S’agissant d’une insertion, le produit
PCR issu de l’ADN d’un malade est plus long que celui qui est issu d’une personne saine. Une délétion présente un résultat contraire. L’analyse
des produits PCR par électrophorèse, et donc
l’évaluation de leur taille, conduit directement ��
� � �
au diagnostic.
��
La détection d’inversions et de mutations ��
ponctuelles s’avère plus délicate. La différence

��
��
de taille entre ADN sain et malade est nulle dans ��
le cas d’une inversion, quasi-nulle dans le cas

��
��
d’une mutation ponctuelle. On ne peut donc plus
��
��
retenir le critère de taille des produits PCR pour
��
��
��
��
aboutir au résultat. Il faut donc recourir à des
��
techniques complémentaires à la PCR. Trois

��
approches peuvent être retenues, le southern
� � � � �
blot, le RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism) ou la détection de mismatch.
Le southern blot consiste à hybrider sur le
produit PCR une sonde oligonucléotidique
marquée, grâce à un isotope radioactif
ou un fluorochrome, dont la séquence est
complémentaire et donc spécifique de celle qui
correspond à la mutation. Cette stratégie est Figure 7 : Southern blot sur produits d’amplification par PCR
30
bien adaptée aux cas d’inversion.
Le RFLP permet de détecter les inversions comme les mutations ponctuelles. Il met en jeu une enzyme de restriction capable d’hydrolyser le
produit PCR au niveau de la séquence où se
situe la mutation. Cette approche n’est possible
��
� � �
que si un site de restriction est effectivement
��
��
��
��
��
��
présent sur cette séquence, qu’il s’agisse de
��
l’allèle muté ou de l’allèle sauvage. L’enzyme
��
de restriction hydrolyse donc soit le produit

��
PCR issu de l’ADN sain soit celui qui est issu de
��
�
��
�
l’ADN malade. À partir de ces produits PCR, on
� � ��
��
obtient ainsi soit un soit deux fragments d’ADN
qui sont ensuite révélés par électrophorèse.
��
�
� ��
��
La détection de mismatch est, comme le RFLP,
�� adaptée aux inversions et aux mutations
� � � � �
ponctuelles. Le produit PCR issu de l’ADN
du patient (ADN échantillon) est mélangé au
produit PCR issu de l’ADN d’une personne saine
(ADN de référence). Ce mélange est ensuite
dénaturé par la température puis réhybridé. Si
l’ADN échantillon est muté, les appariements
entre ADN échantillon et ADN de référence
seront incomplets au niveau de la mutation. Les
Figure 8 : RFLP sur produits d’amplification par PCR
mésappariements (mismatch) concernent une
seule paire de base dans le cas d’une mutation
ponctuelle, plusieurs paires de bases dans le cas d’une inversion. Ces mésappariements sont ensuite dégradés grâce à la nucléase S1, enzyme
qui ne dégrade que les ADN monocaténaires. Une autre solution consiste à cliver les mésappariements par voie chimique (tetroxyde d’osmium,
31
puis pipéridine), mais elle convient plutôt aux
��
mutations ponctuelles. En résumé, la mutation
induit un mésappariement au niveau duquel
��
un clivage, enzymatique ou chimique, conduit
��
à la génération de deux fragments à partir
d’un produit PCR unique. Ces fragments sont
analysés par électrophorèse.
��
Maladies infectieuses
La contamination par des virus ou des
microorganismes (bactéries, parasites…) se
�� traduit obligatoirement par la présence de
� � � leur matériel génétique dans tout ou partie
�� de l’organisme infecté. La PCR est donc un
outil d’autant plus performant pour détecter la
��
présence d’un pathogène dans un échantillon
biologique que sa sensibilité et sa spécificité
sont très grandes.
La performance du diagnostic par PCR repose
Figure 9 : Détection de mésappariements sur produits d’amplification par PCR
essentiellement sur un critère : le choix des
amorces susceptibles d’amplifier de façon très
sélective une séquence de l’ADN du virus ou du microorganisme. L’ADN matriciel, d’autre part, doit être extrait à partir d’un tissu dans lequel le
microorganisme est présent. Il suffit donc d’amplifier une séquence spécifique du pathogène à partir d’un prélèvement réalisé sur le patient et
d’analyser le produit PCR par électrophorèse. La taille du fragment d’ADN amplifié, qui doit être conforme à la taille attendue, garantit la fiabilité
du résultat et donc du diagnostic.
Dans le cas du dépistage du SIDA (VIH), par exemple, les tests de routine reposent sur la méthode ELISA qui consiste à détecter les anticorps
32
anti-VIH ou encore des antigènes viraux dans le sérum des patients par une technique de type immuno-assay. Cette méthode, assez fiable et
peu coûteuse, présente néanmoins quelques inconvénients. Les faux positifs sont assez fréquents à cause d’immuno-réactivités croisées. Les
échantillons positifs font donc l’objet d’un test de contrôle par une autre technique de routine, le western blot.
Reste le problème des séropositifs qui ne sont pas porteurs du virus, comme les enfants dont la mère est malade du SIDA. Le sang de ces nouveaux-
nés contient généralement des anticorps anti-VIH d’origine maternelle et ils sont donc séropositifs. En revanche, ils ne sont pas forcément porteurs
du virus. Dans ce type de cas, le diagnostic par PCR s’avère pertinent. La méthode consiste à amplifier une séquence spécifique du provirus à partir
d’un extrait de lymphocytes. Le même principe est employé pour la détection du toxoplasme chez les nouveaux-nés dont la mère est porteuse.
Il est bien sûr possible de diagnostiquer le SIDA par RT-PCR en recherchant l’ARN viral dans le sérum des patients. Des méthodes quantitatives
ou semi-quantitatives sont au point qui permettent en outre d’évaluer la charge virale.
La PCR appliquée à l’identification

La PCR est remarquablement efficace pour identifier des espèces, des variétés ou des individus par empreinte génétique. Cette application repose
sur les connaissances acquises en matière de structure des génomes. Il s’agit tout simplement d’amplifier des séquences nucléotidiques qui sont
spécifiques soit d’espèce, soit de variété, soit d’individu. Chez les eucaryotes notamment, ces séquences sont très nombreuses et offrent une
vaste palette qui permet des identifications de manière très précise et très sélective. En effet, les génomes d’organismes eucaryotes comportent,
à la différence des procaryotes, des séquences codantes et des séquences non codantes. Les séquences codantes correspondent aux gènes
et sont donc traduites en protéines. Les séquences non codantes, qui ne sont donc pas traduites, représentent une large proportion de l’ADN
génomique des eucaryotes (jusqu’à 98 %).
Les séquences codantes sont très homologues chez les individus d’une même espèce. En effet, l’espèce est caractérisée par des caractères
communs qui sont garantis par ses gènes. Les différences phénotypiques entre les individus qui la composent reposent sur les variations alléliques
et les différents allèles d’un même gène montrent des différences de séquence qui sont infimes (de l’ordre d’une base sur mille). D’une espèce
à l’autre, en fonction de la distance phylogénétique qui les sépare, les séquences des gènes qui codent pour la même fonction présentent des
homologies très fortes, d’autant plus fortes que la fonction du gène est essentielle à l’embryogénèse ou au métabolisme. En conséquence, les
séquences codantes présentent peu d’intérêt en matière d’identification.
En revanche, les séquences non codantes sont très polymorphes entre espèces comme entre individus d’une même espèce. Elles présentent ainsi
un large choix de marqueurs génétiques qui permettent d’établir des tests d’identification redoutablement discriminants. Parmi ces marqueurs, on
33
trouve notamment les minisatellites (ou VNTR, variable number of tandem repeats – nombre variable de répétitions en tandem) et les microsatellites
(ou STR, short tandem repeats – courtes répétitions en tandem). Les VNTR et STR sont des polymorphismes de répétition composés de séquences
qui se répètent en tandem. Ces séquences répétées mesurent de dix à quarante paires de bases pour les VNTR, de une à cinq paires de bases
pour les STR. D’un individu à l’autre, la
séquence répétée d’un VNTR ou d’un
��
STR est identique mais le nombre de
CA
répétitions, et donc la taille du VNTR GT ��
ou du STR peuvent être très variables
CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA
(on parle d’allèles). D’autre part, il GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT
existe une grande variété de VNTR et 12 < n < 40
de STR sur les génomes eucaryotes.

La mise en évidence du polymorphisme (n = nombre de motifs)
d’un STR ou d’un VNTR se fait

��
par PCR à l’aide d’amorces qui
TGTGGGGCACAGGTTGTG
s’hybrident aux séquences non ACACCCCGTGTCCAACAC ��
polymorphes flanquantes. Le ou les
TGTGGGGCACAGGTTGTG TGTGGGGCACAGGTTGTG TGTGGGGCACAGGTTGTG
produits d’amplification sont ensuite ACACCCCGTGTCCAACAC ACACCCCGTGTCCAACAC ACACCCCGTGTCCAACAC
soit analysés par électrophorèse, soit quelques unités < n < + de 1000
subissent une analyse de fragments à
l’aide d’un séquenceur capillaire.
Figure 10 : Micro et minisatellites
Il est aujourd’hui possible d’amplifier
simultanément plusieurs STR ou VNTR
en utilisant plusieurs couples d’amorces. La variété des produits d’amplification obtenus permet d’aboutir à des empreintes qui sont spécifiques
des individus. D’autre part, la puissance de la PCR permet d’amplifier les micro et minisatellites à partir de très peu d’ADN.
L’identification par empreinte génétique s’est beaucoup banalisée ces dernières années dans le cadre d’enquêtes judiciaires. Mais ces techniques
sont tout aussi performantes chez d’autres espèces que l’homme et permettent non seulement d’identifier des individus mais aussi des variétés ou des
34
espèces. Le type d’identification dépend simplement du choix des marqueurs. ��
��
De même, à des fins d’identification variétale peut-on communément procéder selon
des protocoles dérivés de la PCR. Deux approches méritent d’être mentionnées, la
RAPD et l’AFLP. La RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) est une PCR
��
��
��
��
��
à fin d’identification variétale qui emploie des couples d’amorces aléatoires de taille
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
réduite (une dizaine de bases). Ces amorces vont s’hybrider de manière aléatoire
��
certes, mais la PCR aboutit généralement à un profil d’amplification par électrophorèse
qui est spécifique de la variété à partir de laquelle l’ADN matriciel est issu. L’AFLP
(Amplification of
Chromosome Chromosome
d’origine d’origine ��
maternelle paternelle
Fragment Lenght
� � ��
��
Polymorphism)
��
est une méthode ��
sens de migration
beaucoup plus � � � � ��
PCR
�
� locus VNTR �
performante. Elle ��
��
� � ��
�
consiste en premier ��
��
��
lieu à hydrolyser
��
��
��
l’ADN génomique ��
��
��
Paire de chromosomes ��
de l'individu testé ��
avec une ou ��
��
mieux, deux ��
��
Figure 11 : Pricipe du test de filiation endonucléases

��
de restriction. ��
��
Ensuite, on procède à la ligation d’adaptateurs (des séquences définies d’ADN ��
��
��
d’une quinzaine de nucléotides) au niveau des extrémités cohésives générées
par les enzymes de restriction. Enfin, le produit de la ligation est amplifié par
Figure12 : Principe de l’identification humaine par empreinte génétique
PCR avec un couple d’amorces qui s’hybride au niveau des adaptateurs. L’AFLP
donne un résultat comparable à la RAPD. Toutefois, l’AFLP montre des résultats
35
plus propres et très reproductibles. Il s’agit de la méthode la plus performante à ce jour appliquée à l’identification variétale.
36
La PCR et RT-PCR quantitative temps-réel
Matthieu Bagory
2006
Résumé 1. La dénaturation (95° C pendant 10 à 15 mi-

nutes) consiste à déshybrider l’ADN2 , casser et
La présente étude s’inscrit dans le cadre d’un tra- dénaturer les structures et enzimes secondaires,
vail personnel en immunotechniques. Il s’agit d’un homogénéiser le milieu réactionnel par agitation
état de l’art des techniques de quantifciation temps- thermique, et activer les ADN polymérases.
2. L’hybridation (56 à 64° C pendant 2 à 60 se-
réel par PCR et RT-PCR. Les principes, la technolo-
gie ainsi que des applications seront étudiés.
condes) : des amorces sens et anti-sens « s’ac-
crochent »aux ADN matrices en raison d’une
1 Introduction température thermodynamiquement favorable.
3. L’élongation (72° C pendant 4 à 120 secondes) :
Depuis la découverte de la Polymerase Chain Reac- l’ADN complémentaire est synthétisé par les po-
tion 1 par Kary Mullis en 1986 et qui lui valu le lymérases à partir des dNTPs3 libres dans le mi-
prix Nobel de chimie en 1993, les techniques de PCR lieu réactionnel.
sont rapidement apparues comme des outils indispen-
sables en biologie molécullaire. La quantification en
2.2 La Reverse Transcriptase, ou trans-
temps réelle, et avec elle un élargissement des aplica-
criptase inverse
tions à de très nombreux domaines tels que le diag-
nostique clinique et l’agroalimentaire, fut certes pro- La RT est une enzyme qui transcrit l’information
posée en 1992 par Higuchi R., a connu un récent génétique de l’ARN en ADN (appelé aussi ADNc).
et spectaculaire dévelopemment ces dernières années Elle est notamment très utilisée par les rétrovirus4 et
[1]. les rétrotransposons5 [1]. Cette propriété est très utile
pour quantifier des ANR, parfoit présents en infime
quantité, en utilisant l’ADNc produit par la RT pour
2 Principes effectuer une PCR.
2.1 La Polymerase Chain Reaction

2.3 Le quenching par FRET
La PCR consiste en la réplication à la chaine
d’une séquence d’ADN par des enzimes, les ADN po- Le Fluorescence resonance energy transfer 6 est un
lymérases. phénomène par lequel l’energie émise par un fluoro-
chrome appelé reporter est absorbée par un quencher
La PCR repose sur deux principes [1] :
qui la reémettra à son tour dans une longueur d’onde
1. Les « ADN polymérases ADN dépendantes ther- différente ou sous forme de chaleur. Pour que cette
mostables »ont des propriétés de synthèse en- absorption fonctionne il faut que reporter et quen-
zymatique et d’initiation « ADN double brins cher soient proches, et que leur spectre respective-
spécifique » ment d’émission et de réception se chevauchent, mais
2. L’hybridation et la deshybridation des brins non l’inverse. Ainsi, en concevant des sondes pour les-
complémentaires d’ADN est fonction de la quels reporter et quencher se trouvent très proches,
température puis éloignés après la réaction que l’on souhaite ob-
server, la fluorescence du reporter sera un marqueur
En contrôlant la température il est ainsi possible
directe de la réaction.
de contrôler l’activité enzimatique des ADN po-
2
lymérases. Séparer les brins de l’ADN en double hélice
3
Bases (adénine, cytosine, guanine, thymine) tri-
La PCR est basée sur un cycle de dénaturation - phosphatées et désoxydées
hybridation - élongation, chacune de ces étapes étant 4
Virus à ARN
5
« pilotée »par une température différente. Séquences d’ADN capables de se déplacer dans le génome
de l’hôte
1 6
Réaction de Polymération en Chaine Aussi appelé Förster Resonance Energy Transfer
1
2.4 Les stratégies de quantifications A partir d’une courbe expérimentale du nombre
de molécules amplifiées N en fonction du nombre de
La quantification des acides nucléiques peut se faire
cycle, il est possible d’en déduire la valeur de N0 .
soit de façon « absolue »après établissement d’un
étalonnage, soit de façon relative par rapport à un
gène de référence [2].
1. Quantification absolue par étalonnage avec un
standard : les cinétiques sont mesurées pour
différentes concentrations du gène ou transcrit
cible. On en déduit une courbe du Ct en fonction
de la quantité d’acides nucléique et une mesure
du coefficient d’efficacité E (qui doit être le plus
proche possible de 2). La courbe d’étalonnage
ainsi constituée permet de déduire la concen-
tration à partir d’une mesure du Ct. La prin-
cipale difficultée réside dans la capacité à ti-
trer7 avec précision et reproductibilité les solu- Fig. 1 – Profil d’une courbe PCR temps réel. Le
tions d’étalonnage. Etant donnée cette limita- nombre de copies est fonction du nombres de cylces.
tion, la quantification absolue est le plus souvent Plusieurs phases sont à distinguer : une phase en
réservée à des applications bien particulières, delà de laquelle aucun signal n’est détecté, une phase
telles que la virologie [2]. linéaire et une phase plateau où la PCR atteint un
maximum[2]
2. Quantification relative : une gène de référence
est quantifié en même temps que le gène étudié, La principale difficultée réside dans la
la concentration de ce dernier étant ensuite nor- détermination du cycle PCR au delà duquel la
malisée par rapport à celle connue du gène de mesure est significative et ne correspond plus à du
référence. bruit. On parle de cycle seuil Ct, et il s’agit en
quelque sorte de la sensibilité de l’instrumentation
2.5 Principes mathématiques de la PCR de détection.
quantitative temps réel La quantification temps-réel est plus fiable que
la PCR conventionnelle, dans la mesure où l’en-
La PCR est une réaction en chaine dans laquelle semble du profil d’amplification est connu, permet-
les produits servent de matrice pour la réaction sui- tant d’identifier rapidement des réactions dont l’effi-
vante suivant une amplification théoriquement qua- cacité d’amplification dévie, par exemple en présence
dratique : d’un inhibiteur de la polymérase [3].
N = N 0 · 2n (1) 3 La fluorométrie temps-réel

Où N0 est le nombre initial de molécules, n le Le principe du temps-réel en PCR repose sur la
nombre de cycle et N le nombre de molécules am- visualisation de la phase exponentielle de la réaction
plifiées. par une fluorochrome spécifique à l’ADN ou par une
Cette amplification théorique dépend dans la sonde oligonucléotique fluorescente spécifique à une
réalité d’une efficacité d’amplication E, ou propor- séquence.
tion moyenne de molécules produites à chaque cycle
(E = 2 idéalement et E = 1 si aucune molécule n’est 3.1 L’instrumentation
produite). Expérimentalement, E varie entre 1,78 et
Les cycles de PCR quantitative temps-réel sont ef-
1,97 [2]
fectués dans des tubes fermés, limitant ainsi le risque
de contamination, et sous un contrôle très précis de
N = N0 · E n (2) la température dans un thermocycleur. Les perfor-
mances de l’instrumentation dépendent fortement :
Soit sous forme logarithmique : 1. du rapport signal-sur-bruit, fonction de la tech-
nologie de détection employé et de la qualité des
optiques
log N = log N0 + n · log E (3)
2. de la répétabilité de la mesure, fonction de l’ho-
7
Par dillution limite puis analyse statistique mogénéité en température des échantillons.
2
Il s’agit d’une sonde fluorogénique spécifique à
la séquence que l’on souhaite quantifier. Lors de
la phase d’hybridation la sonde vient s’accrocher à
la séquence, mais ne génère aucun fluorescence du
fait du phénomène de quenching. Au cours de la
phase d’élongation, l’activité hydrolytique de l’en-
zime Taq polymérase vient cliver reporter et quen-
cher, génèrant un signal détectable dans la longueur
d’onde d’émission du reporter.
3.4 Les sondes FRET en tandem ou

sondes LightCycler
Fig. 2 – Principe de base d’un système PCR temps-

réel [4], composé 1) d’un thermocycleur 2) d’un la-
ser de fluorescence 3) d’un multiplexer pour répartir
l’excitation sur l’ensemble des échantillons 4) d’une
caméra CCD pour mesurer la fluorescence émise
3.2 Les agents intercalants

Les agents intercalants sont des fluorochromes
spécifiques à l’ADN double brin nouvellement
synthétisé, le plus utilisé étant le SYBRGreen I.
Sous une excitation ultra-violet, ce dernier émet
un signal de fluorescence, dont la mesure quanti- Fig. 4 – Principe d’une sonde FRET en tandem [5]
fie l’ADN double brin, qu’il soit d’intérêt ou non.
Il s’agit aussi d’une sonde fluorogénique spécifique
C’est là la principale limitation de cette technique :
à une séquence. Deux sondes sont conçus : une
sa non spécificité, ainsi que sa dépendance à la
première contenant un reporter, une deuxième un
« masse »d’ADN. Pourtant, cette méthode reste très
quencher réémettant dans une autre longueur d’onde,
sensible et reproductible, peu cher, et aide grande-
et dont les deux sites d’accroche sur la séquence sont
ment dans les études de faisabilité et de calibration.
proches. Lors de la phase d’hybridation, en excitant
dans la longueur d’onde du reporter, le signal récueilli
3.3 les sondes d’hydrolyse ou sondes Ta- dans la la longueur d’onde du quencher correspond à
qMan la PCR.
3.5 Les sondes d’hybridation phare ou

sondes beacon
Fig. 3 – Principe d’une sonde d’hydrolyse [5] Fig. 5 – Principe d’une sonde d’hybridation phare [5]
3
Il s’agit d’une sonde fluorogénique spécifique à une de l’identification et de la quantification des acides
séquence, et dont la conformation tridimentionnelle nucléiques.
à l’état non lié fait qu’un reporter et un quencher
non fluorescent8 se trouvent très près l’un de l’autre,
n’émettant ainsi aucun signal. Lorsque la sonde se lie
à la séquence, le changement de conformation spa-
tial induit sépare les deux fluorophores et le repor-
ter peut génèrer un signal mesurable dans sa lon-
gueur d’onde d’émission. La principale difficulté de
ces sondes réside dans le design crucial de la boucle.
3.6 Historique et technologies des ther-

mocycleurs
Le premier thermocycleur disponible, le ABI 7700,
fut commercialisé par Applied Biosystems en 1997 et
reste encore aujourd’hui le best-seller des automates
de PCR. Il s’agit d’un block cylindrique de 96 puits
couplé à un fluromètre. Peu de temps après, Roche
Fig. 6 – Techniques de quantification des acides
Diagnostics arriva sur le marché avec le LightCycler,
nucléiques[6]
a l’origine développé par Idaho Technologies[3].
Il existe aujourd’hui de très nombreux compa-
La détection et la quantification d’ADN par PCR
gnies et automates. Ils peuvent être classés en deux
et d’ARN par RT-PCR trouve de très nombreuses ap-
catégories [2] :
plications. En Microbiologie clinique, ces techniques
1. Les systèmes haut débit, pouvant analyser offrent une détection et une quantification d’agents
au moins 96 PCR simultanément : ABI pathogènes bactériens et fongiques bien plus sensible
Prism7000, 7700 et 7900 (Applied Biosystems), et rapide que les diagnostics traidtionnels, dont la
iCycler(Bio-rad), MX-4000(Stratagene) et le durée pouvait s’exprime en jours voir en semaines.
DNA Engine Opticon(MJ Research). A l’ex- En virologie, pouvoir déterminer par quantification
ception de l’ABI Prism7700 qui comprend une absolue la titration virale du SIDA ou des hépatites
résistance électrique et un groupe froid, ces est d’un grand intérêt dans les phases précoces de
systèmes un thermocycleur 96 puits chauffés par la maladie et dans le suivit des traitements, notam-
des modules à effet Peltier et/ou effet Joule, pour ment antiviraux [2]. Des limitations sont cependant
des vitesses de l’ordre de 1 à 3° C par seconde. à prendre en compte :
2. Les systèmes flexibles : LightCycler(Roche 1. La grande variabilité génétique des virus,
Diagnostics), SmartCycler(Eurogentec) et nécessitant donc de développer des essais
Rotor-Gene(Corbett Research). Le contrôle de spécifiques à chaque sous-classe virale.
la température se fait par de l’air homogéisé
2. Le risque de faux postif par contamination
puis pulsé ou par rotation d’un carroussel
extérieure.
contenant des capillaires où ont lieu les PCR,
pour des vitesse pouvant atteindre jusqu’à 20° 3. Le risque de vrai négatif par inhibition de l’ADN
C par secondes polymérase. L’analyse en parallèle d’un contrôle
interne positif permettrait d’y remédier.
En oncologie clinique, les applications concernes es-
4 Quelles applications pour la
sentiellement [2] :
PCR et la RT-PCR quantitative
1. La recherche de transcrits de fusion, principale-
temps-réel ? ment dans les cas de leucémies, avant ou après
une atogreffe, pour évaluer la réponse à un trai-
Les technologies de PCR et de RT-PCR s’ins-
tement, pour prédire une rechute ou évaluer la
crivent dans le cadre plus large de la problématique
maladie résiduelle minimale.
8
Aussi appelé dark quencher, par exemple les black hole 2. La quantification d’oncogènes, l’amplification
quencher , couvrant un très large spectre d’absorption et res-
tituant l’énergie sous forme de chaleur. Le principal avantage
génique faisant partie des critères d’indication
est une grande efficacité de quenching, limitant ainsi le bruit de thérapies ciblées, comme l’Herceptin®pour
de fond le cancer du sein métastasique.
4
Dans le domaine de l’expression génique, les tech- [9] S. A. Bustin, V. Benes, T. Nolan, and Pfaffl M.
niques de RT-PCR sont largement utilisées pour [2] : W. Quantitative real-time RT-PCR - a pers-
1. Estimer le niveau d’expressio d’un gène. pective. Journal of Molecular Endocrinology,
2. Analyser l’expression des variants d’épissage 34 :597–601, 2005.
génique. [10] Annapaula Guilietti, Lut Overberg, Dirk Valckx,
3. Valider les résultats des puces à ADN Brigitte Decallone, Roger Bouillon, and Chantal
Mathieu. An Overview of real-time quantitative
PCR : Applications to quantify cytokine gene
5 Conclusion expression. Methods, 25 :386–401, 2001.
La PCR et la RT-PCR quantitative peuvent se [11] Stephen A. Bustin and Tania Nolan. Pitfalls
résumer en quatre mots [2] : of quantitative real-time Reverse-Transcription
1. Spécificité Polymerase Chain Reaction. Methods, 25 :386–
401, 2001.
2. Sensibilité
[12] Stephen Bustin and Mueller Reinhold. Real-
3. Bonne reproductibilité
time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and
4. linéarité pour une dynamique de huit ordres de its potential use in clinical diagnosis. Clinical
grandeur Science, 109 :365–379, 2005.
Ajouter à cela le fait d’être rapide, automatisable
[13] Phillip S. Bernard and Wittwer Carl T. Ream-
et en tube fermé, et vous obtenez une technologie
time PCR technology for cancer diagnostics. Cli-
d’un immense intérêt et bénéfice pour la médecine et
nical Chemistry, 48(8) :1178–1185, 2002.
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nique, 61 :635–644, 2003.
5
Reviews in Biology and Biotechnology Vol.2, No 2, December 2002. pp.2-11
By The Moroccan Society of Biology in Canada Printed in Canada
La PCR en temps réel: principes et applications
Elyse Poitras et Alain Houde*
La technologie de PCR en temps réel devient de plus en plus populaire dans différents secteurs d’activité. Cette
technologie est basée sur la détection et la quantification d’un reporter fluorescent dont l’émission est directement
proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. Étant donné qu’elle utilise
généralement des systèmes en tubes fermés et que la quantification ne requiert aucune manipulation post-
amplification, les problèmes de contamination post-PCR par les amplicons sont significativement réduits. Le
processus complet est automatisé du début à la fin rendant cette technologie très performante pour des applications
d’analyses à grande échelle. Cet article présente une description des principes à la base de la PCR en temps réel, des
différentes technologies de détection des amplicons et des exemples d’applications courantes.
Historique de départ et la quantité du produit amplifié à n’importe quel

Russell Higuchi fut l’un des premiers à faire l’analyse des cycle. En pratique, il n’est pas rare que les réactions de PCR
cinétiques de la PCR (polymerase Chain Reaction) en en replica donnent des taux différents d’amplicons. Le
élaborant un système qui détectait le produit de la PCR au développement de la PCR quantitative en temps réel a
fur et à mesure qu’il s’accumulait. Ce système en « temps éliminé les variabilités traditionnelles associées à la PCR
réel » utilisait le bromure d’éthidium comme agent quantitative et permet la quantification du produit de la PCR
intercalant dans chacune des réactions d’amplification et de façon fiable et routinière.
un thermocycleur modifié pour stimuler l’émission des Au début de la réaction PCR, les réactifs sont en excès mais
échantillons par rayonnements UV. L’émission de la en concentration assez faible afin d’éviter que la
fluorescence était détectée à l’aide d’une caméra CCD renaturation des amplicons n’entre en compétition avec
(charge-coupled device). Une augmentation de l’émission l’hybridation des amorces (primers). L’amplification est
de la fluorescence était observée lorsque le bromure alors réalisée de façon constante à un taux exponentiel à
d’éthidium se fixait à l’ADN double brin produit au cours l’aide d’une ADN polymérase thermostable. Après la phase
de l’amplification. En traçant l’augmentation de l’émission exponentielle, la réaction d’amplification entre dans une
de fluorescence en fonction du nombre de cycles, le phase linéaire où le taux d’amplification devient
système produit des courbes d’amplification exhibant un extrêmement variable, même au niveau de replica d’un
schéma plus complet du processus de la PCR que la simple même échantillon, à cause d’une compétition entre la
détermination d’amplicons (produits d’amplification) renaturation des amplicons et l’hybridation des amorces.
accumulés en fin d’amplification (Higuchi et al, 1992). Suit ensuite une phase plateau où le taux d’amplification
décroît à près de zéro générant très peu d’amplicons.
Principe
Afin de recueillir des données quantitatives avec précision,
Depuis son invention, la PCR est devenue la technique la chacun des échantillons doit être analysé dans sa phase
plus utilisée pour la détection de l’ADN et de l’ARN. À exponentielle d’amplification qui est la phase la plus
partir d’une simple copie d’une séquence particulière reproductible de la réaction de PCR. La PCR en temps réel
d’acides nucléiques, cette séquence peut être fait donc le suivi de la fluorescence émise pendant la
spécifiquement amplifiée et détectée. Sa nature réaction avec un indicateur de la production des amplicons
exponentielle rend cette technique attrayante pour des durant chaque cycle, à l’opposé de la PCR quantitative
analyses quantitatives. Théoriquement, il existe une conventionnelle où les amplicons ne sont détectés qu’à la
relation quantitative entre la quantité de la séquence cible toute fin du processus. .
Correspondance : Dr. Alain Houde, Agriculture et Agroalimentaire Canada, Centre de Recherche et de Développement sur les aliments, 3600 boul.
Casavant ouest, St-Hyacinthe, Québec, Canada, J2S 8E3. Courriel: [email protected]
Rev. Biol. Biotech. 3
La technologie de la PCR en temps réel est basée sur la qu’il est économique, facile à utiliser et possède plus de
détection et la quantification d’un «reporter» fluorescent. sensibilité que le bromure d’éthidium sans inhiber la
L’augmentation du signal fluorescent est directement réaction d’amplification.
proportionnelle à la quantité d’amplicons générés durant la Lors de la réaction d’amplification par PCR, le colorant
réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence libre en solution exhibe peu de fluorescence. Durant l’étape
émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la d’élongation, une augmentation de la fluorescence est
réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double
augmentation significative dans la quantité d’amplicons est brin naissant. Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation
en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice du signal de fluorescence est observée pendant l’étape de
originale cible (template). Plusieurs instruments de PCR en polymérisation et l’émission fluorescente décroît
temps réel sont présentement sur le marché. Ces appareils complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape
utilisent généralement un système en tubes fermés et la suivante. Conséquemment, l’émission de fluorescence est
quantification ne requiert aucune manipulation post- mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun
amplification, ce qui minimise ou élimine les problèmes de des cycles par un système de lecture intégré à l’appareil de
contamination par les amplicons suite à la réaction de PCR PCR en temps réel qui permet de suivre l’augmentation de
et réduit le temps d’analyse (Bustin, 2000). Le processus la quantité d’ADN amplifié durant la réaction (Bustin,
complet est donc automatisé du début à la fin rendant ainsi 2000) (figure 1).
cette technologie intéressante pour des applications La technologie basée sur le SYBR Green I ne nécessite
d’analyses à grande échelle (high-throughput) (Martell et aucune sonde fluorescente mais sa spécificité repose
al, 1999). entièrement sur ses amorces (Bustin, 2000). Elle ne requiert
Technologies de détection donc aucune expertise particulière pour le design des
sondes fluorescentes et n’est pas affectée par des mutations
Tous les systèmes de PCR en temps réel reposent donc sur
dans l’ADN cible qui influencent l’hybridation des sondes
la détection et la quantification d’un émetteur fluorescent
spécifiques (Mackay et al, 2002). Étant donné que le SYBR
pendant le processus d’amplification et l’augmentation du
Green I se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double
signal d’émission fluorescente est directement
brin, cette technologie présente une certaine versatilité
proportionnelle à la quantité d’amplicons produits durant la
puisque le même agent peut être utilisé pour détecter plus
réaction. Il existe deux principes généraux pour la détection
d’un produit d’amplification dans la même séquence
quantitative des amplicons : les agents se liant à l’ADN
réactionnelle.
double brin (ex. SYBR Green I) et les sondes fluorescentes.
Pour cette dernière catégorie, il existe présentement quatre Cette technologie présente aussi certains désavantages: 1)
technologies principales : hydrolyse de sondes (Taqman étant donné que l’ADN double brin total émet des signaux,
assay), hybridation de 2 sondes (HybProbes), balises il devient impossible en cours de réaction de s’assurer de la
moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion spécificité des amplicons ou de discriminer les différents
(Scorpion primers). Selon Wittwer et al. (1997), ces amplicons dans le cas de multiplexage; 2) le mauvais
différentes technologies de détection auraient une appariement (mis-primering), générant souvent des bandes
sensibilité équivalente. Cependant, ces technologies d’ADN superflues observables sur gel d’électrophorèse,
présentent des différences au niveau de la spécificité peut conduire à des faux positifs ou une surestimation de la
(Bustin, 2000). quantification; 3) l’émission de fluorescence peut être
biaisée par la masse moléculaire de l’ADN amplifié par un
1) Agents se liant à l’ADN double brin (Double-stranded
amplicon plus long qui fixera davantage de molécules
DNA binding dyes: Lightcycler assay)
fluorescentes par rapport à un amplicon plus court dans la
Les molécules qui se lient à l’ADN double brin peuvent même réaction (Bustin, 2000).
être divisées en deux classes: les agents intercalants comme
le bromure d’éthidium (Higuchi et al, 1992), le YO-PRO-1 2) Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay)
(Ishiguro et al, 1995; Tseng et al, 1997), le SYBR Green I La technologie Taqman est basée sur l’activité
(Morrison et al, 1998) et les agents se fixant au sillon 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser
mineur (minor groove binders) comme le Hoeschst 33258 une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon
(Searle et Embrey, 1990; Nielsen, 1991). Leur émission durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR. Un
fluorescente augmente lorsque qu’ils sont liés à l’ADN fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxy-
double brin. Pour être utilisés dans une réaction de PCR en fluorocein) est fixé à l’extrémité 5’ de la sonde
temps réel, ces agents doivent rencontrer deux exigences : d’hybridation et son émission est inhibée par un second
augmenter en fluorescence lorsque lié à l’ADN double brin fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité
et ne pas inhiber la réaction de PCR. Le SYBR Green I, 3’ (ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).
dont le mécanisme de liaison n’est pas bien défini, est Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfert son
l’agent le plus fréquemment utilisé. Ses avantages sont énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe
http://www.rbmc.qc.ca/reviews/
a
5’ 3’ 3’
3’ 5’
5’
c
3’ 5’ 3’ 5’
: fluorochrome stimulé : amplicon : amorce

: fluorochrome non stimulé libre : ADN double brin cible
Figure 1 : Agents se liant à l’ADN double brin (Double-stranded DNA binding dyes: Lightcycler assay). (a) Durant la dénaturation, le
SYBR Green I libre exhibe peu de fluorescence. (b) À la température d’appariement, quelques molécules se lient au double brin d’ADN
naissant résultant en une émission de fluorescence lors de l’exitation. (c) Durant la phase de polymérisation, de plus en plus de molécules se
lient au brin naissant et l’accroissement de la fluorescence peut-être suivi en temps réel.
FRET (fluorescence resonance energy transfer) qui dissipe polymérisation de l’enzyme sera légèrement réduite à cette
cette énergie sous forme de chaleur plutôt que d’émettre de température suboptimale. Pour de longs amplicons, une
la fluorescence (Mackay et al, 2002). Étant donné que étape d’hybridation/polymérisation plus longue ou encore
l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase est une augmentation de la concentration en Mn2+ ou Mg2+
spécifique à l’ADN double brin, les sondes libres en pourrait s’avérer nécessaire pour stabiliser l’hybridation de
solution demeurent intactes et aucune fluorescence n’est la sonde à sa séquence cible.
émise. Lors de l’étape d’hybridation, la sonde et les Les principes à respecter dans le design des sondes Taqman
amorces se fixent à leurs séquences complémentaires sont aussi applicables aux autres sondes linéaires et
respectives. A l’étape suivante, la Taq polymérase débute comprennent comme règles générales : 1) une longueur de
l’élongation du nouveau brin d’ADN à partir de l’amorce 20-40 nucléotides, 2) un contenu en G-C variant de 40-
jusqu’à ce qu’elle rencontre sur son passage la sonde 60%, 3) aucun patron de séquence répétée, 4) aucune
hybridée qu’elle déplace et hydrolyse avec son activité séquence permettant une hybridation ou un chevauchement
5’-exonucléasique. Le reporter est alors libéré de avec les amorces, 5) un A, un C ou un T à l’extremité 5’
l’environnement du suppresseur permettant ainsi l’émission parce qu’un G supprime la fluorescence de l’émetteur
de fluorescence qui augmente à chaque cycle même après clivage et, 6) un Tm de 5 à 10 oC plus élevé
proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde que les amorces afin de s’assurer qu’elles s’hybrideront
(figure 2A). avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées
Comme la Taq polymérase hydrolysera la sonde seulement pendant l’étape combinée d’hybridation et de
lorsque celle-ci est hybridée à sa séquence complémentaire, polymérisation (Bustin, 2000; Mackay et al, 2002).
les conditions de température de l’étape de polymérisation Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par
doivent être ajustées de façon à permettre à la sonde de rapport aux agents se liant à l’ADN une spécificité accrue
rester hybridée durant cette étape. La majorité des sondes et une meilleure capacité de multiplexage. La spécificité
ont une température de dissociation (Tm) autour de 70ºC ou d’hybridation entre la sonde fluorescente et sa séquence
de 5 à 10 oC plus élevée que les amorces. Par conséquent, la d’ADN cible réduit significativement l’émission de
technologie Taqman utilise une étape combinée fluorescence non spécifique due à des mauvais
d’hybridation et de polymérisation à 60-62ºC assurant appariements ou des dimères d’amorces (primer-dimers).
l’hybridation et la stabilité de la sonde durant l’extension. Des réactions multiplexes peuvent être élaborées en
Ceci permet aussi une activité 5-exonucléasique maximale utilisant des fluorochromes émetteurs distincts liés à des
de la Taq polymérase mais, l’efficacité de l’activité de sondes différentes dans une même réaction de PCR.
A
5’ 3’
a
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
b
c 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
: sonde TaqMan : sonde hydrolysée avec suppresseur : ADN double brin cible
: sonde hydrolysée avec fluorochrome stimulé : amplicon : amorce
B
a
5’ 3’
3’ 5’ 5’
3’ 3’
5’
b
5’ 3’
5’ 3’ c 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
: sonde avec fluorochrome donneur : sondes hybridées avec émission de fluorescence rouge
: sonde avec fluorochrome émetteur
Figure 2 : A: Hydrolyse de sondes (Hydrolysis probes: Taqman assay) (a) Durant l’étape de dénaturation, la sonde est libre en solution.
(b) À la température d’appariement, la sonde et les amorces s’hybrident à leurs séquences cibles respectives et la proximité des
fluorochromes permet l’inhibition de la fluorescence. La polymérisation débute. (c) La polymérase déplace et hydrolyse la sonde. Le
fluorochrome émetteur est libéré de l’environnement du suppresseur permettant ainsi l’émission de la fluorescence. B: Hybridation de 2
sondes (Hybridization probes) (a) Durant l’étape de dénaturation, les deux sondes demeurent séparées et en solution. (b) À la température
d’appariement, les sondes s’hybrident à leurs séquences cibles respectives et la proximité des fluorochromes permet l’émission de
fluorescence rouge par le principe FRET. (c) Les sondes retournent libres en solution.
La technologie Taqman est toutefois moins efficace et HybProbes et repose sur l’utilisation de deux sondes
moins flexible que d’autres technologies en temps réel pour linéaires complémentaires à une séquence cible pour
la détection de mutations spécifiques (Bustin, 2000; maximiser la spécificité du signal (Wittwer et al, 1997).
Mackay et al, 2002). Une première sonde, bloquée à son extrémité 3’ afin de
prévenir son extension durant l’étape d’élongation,
3) Hybridation de 2 sondes (Hybridization probes)
transporte en 3’ un fluorochrome donneur (FITC) qui
Cette technologie est aussi connue sous le nom de produit une lumière fluorescente verte lorsque excité
par une source de lumière. Son spectre d’émission est plus émetteur est éloigné de son suppresseur restaurant ainsi
large que celui du fluorochrome accepteur (Red 640 ou Red l’émission de fluorescence qui peut être détectée alors que
705) attaché à l’extrémité 5’ d’une seconde sonde. En les autres balises moléculaires demeurent en structure
solution, les deux sondes sont libres et séparées. Étant d’épingle à cheveux (position fermée). Si la séquence
donné que le transfert d’énergie par le principe FRET d’ADN cible ne correspond pas parfaitement (mismatch) à
dépend de la distance entre les deux fluorochromes, il en la séquence de la balise moléculaire aucune hybridation et,
résulte alors seulement un bruit de fond de fluorescence par conséquent, aucune émission fluorescente ne survient.
verte émis par le fluorochrome donneur. Pendant l’étape Ceci est principalement dû aux propriétés thermo-
d’hybridation, les deux sondes se fixent à leurs séquences dynamiques de la structure de la balise moléculaire qui
cibles respectives localisées à moins de 10 nucléotides favorisent surtout la formation de l’épingle à cheveux sauf
(Mackay et al, 2002) dans un arrangement en tête-à-queue. en cas d’hybridation parfaite des séquences (Bustin, 2000)
La proximité des deux fluorochromes permet le transfert (figure 3A). La spécificité de cette technologie est telle
énergétique de la fluorescéine verte par le principe FRET qu’elle permet de détecter les différences de séquences au
au fluorochrome accepteur rouge et provoque son émission nucléotide près, ce qui peut être parfois difficile à réaliser
fluorescente. Pendant l’étape de polymérisation, les deux avec les technologies de sondes linéaires (Giesendorf et al,
sondes retournent de façon indépendante en solution ce qui 1998; Marras et al, 1999). Elle constitue donc une
supprime l’émission de fluorescence rouge (figure 2B). technologie efficace pour la détection et le criblage à
L’accroissement de la fluorescence rouge est proportionnel grande échelle des SNPs (single nucleotide
à la quantité d’ADN synthétisé durant la réaction PCR et polymorphisms) (Tyagi et al, 1998; Mhlanga et Malmberg,
commence à diminuer lorsque la quantité d’amplicons 2001). Les sondes sont dessinées pour demeurer intactes
produits devient suffisamment importante pour provoquer durant la réaction d’amplification et doivent se réhybrider à
une compétition de l’ADN amplifié avec l’hybridation la cible à chaque cycle pour mesurer le signal constituant
simultanée des 2 sondes sur l’ADN cible (Mackay et al, ainsi un autre avantage par rapport aux sondes Taqman
2002). hydrolysées à chaque cycle.
Cette technologie possède donc une grande spécificité et Le désavantage le plus important associé à l’utilisation des
permet aussi une grande flexibilité dans le design des balises moléculaires est le design des sondes d’hybridation.
sondes. De plus, comme les sondes ne sont pas Un design optimal du tronc des balises moléculaires est
hydrolysées, elles sont réutilisées à chacun des cycles crucial. Avec un design non adéquat, le tronc pourrait
(Bustin, 2000). En plus du fait que la séquence cible doit adopter une conformation différente qui éloignerait le
être localisée vers l’extremité 3’ de l’amplicon et que le Tm fluorochrome émetteur de l’environnement immédiat du
des deux sondes doit être similaire, les principes généraux suppresseur résultant ainsi en une population de sondes mal
dans le design des sondes Taqman sont applicables pour supprimées et un bruit de fond important. En contrepartie,
cette technologie. si les forces d’hybridation du tronc (dépendantes de la
4) Balises moléculaires (sonde d’hybridation en épingle à longueur et de la composition des séquences
complémentaires des bras) sont trop importantes, elles
cheveux: Molecular Beacons)
peuvent interférer avec l’hybridation de la balise
Une balise moléculaire est une sonde d’hybridation d’ADN moléculaire à sa séquence complémentaire cible et
en forme d’épingle à cheveux. La portion de la sonde qui l’émission de fluorescence. Un profil de dénaturation
compose la boucle est complémentaire à la séquence cible thermique précis de chacune des balises moléculaires doit
d’ADN. Le tronc de la balise moléculaire est formé de deux être établi pour déterminer les caractéristiques de
bras avec des séquences complémentaires (Tyagi et dissociation (melting) des bras.
Kramer, 1996). Un émetteur fluorescent (FAM, TAMRA, Plusieurs variantes de cette technologie comme les Sunrise
TET, ROX) est fixé à l’extrémité d’un des bras et un primers (maintenant sous appellation commerciale
suppresseur (quencher) (4-(4’-dimethylamino-phenylazo)- Amplifluor TM hairpin primers) (Nazarenko et al, 1997;
benzene: DABCYL) est fixé à l’extrémité de l’autre bras. Myakishev et al, 2001), les cyclicons (Kandimalla et
Le suppresseur est un chromophore non-fluorescent qui Agrawal, 2000) et les amorces scorpion (Mhlanga et
dissipe en chaleur l’énergie du fluorochrome émetteur par Malmberg, 2001) ont été proposées pour la détection
le principe FRET. Les sondes libres adoptent en solution d’acides nucléiques spécifiques dans des solutions
une structure en épingle à cheveux et le tronc maintient les homogènes.
bras ensemble pour une suppression efficace de l’émission
de fluorescence. Pendant l’étape d’hybridation, lorsque la 5) Amorces scorpion (Scorpion primer: self-fluorescing
sonde rencontre une séquence qui lui est complémentaire, amplicon)
elle adopte une conformation transitoire qui force le tronc à Les amorces scorpion représentent une variante de la
se séparer libérant ainsi les 2 bras. La sonde s’hybride alors technologie des balises moléculaires. Les fluorochromes et
préférentiellement à sa séquence complémentaire cible sur la sonde (partie balise moléculaire) sont intégrés à même
la matrice. Dans cette conformation, le fluorochrome l’amplicon de façon irréversible durant l’amplification par
A
5’ 3’ 5’
3’ 5’
a
3’
5’ 3’
b
3’
5’ 5’ 3’
3’ c
3’ 5’ 3’ 5’
: balise moléculaire : amorce : amplicon : ADN double brin cible
: suppresseur : fluorochrome émetteur
B
5’ 3’ 5’
3’ 5’ a 3’
5’ 3’
b
3’ c 3’
5’ 5’ 5’
5’
d
5’ e 5’
3’ 3’
: amorce/sonde scorpion : bloqueur (HEG) : amorce
Figure 3 : A: Balises moléculaires (Molecular Beacons). (a) Durant l’étape de dénaturation, la balise moléculaire est sous forme relaxée et
libre en solution mais la proximité des fluorochromes permet l’inhibition de la fluorescence. (b) Lorsque la sonde s’hybride à sa séquence cible,
le fluorochrome émetteur est suffisamment éloigné de son suppresseur pour permettre l’émission de fluorescence. (c) À l’étape de
polymérisation, la balise moléculaire retourne en solution sous forme d’épingle à cheveux. B: Amorces scorpion (Scorpion primer). (a) Durant
l’étape de dénaturation, la balise moléculaire est sous forme relaxée et libre en solution mais la proximité des fluorochromes permet l’inhibition
de la fluorescence. (b) L’amorce scorpion se fixe à sa séquence complémentaire cible. (c) Polymérisation du brin complémentaire. (d)
Dénaturation des brins d’ADN. (e) Hybridation de la séquence complémentaire de la partie balise moléculaire à sa séquence cible permettant
l’émission de fluorescence.
PCR. Le design d’une amorce/sonde scorpion est pendant la réaction de PCR. Le HEG est donc situé après le
pratiquement similaire à celui des balises moléculaires. fluorochrome supresseur et est suivi d’une région amorce.
L’ajout d’une molécule d’hexéthylène glycol (HEG), aussi Le fluorochrome émetteur porté en 5’ de la région balise
appelé bloqueur (stopper), est nécessaire pour empêcher la moléculaire peut être le FAM ou le ROX et le suppresseur
réplication de la balise moléculaire par l’ADN polymérase est normalement le rouge de méthyl. La région amorce du
scorpion permet donc d’intégrer la balise moléculaire dans transcription in vitro (Liu et al, 2002).
le nouvel amplicon pendant la réaction de PCR. La boucle La PCR en temps réel s’avère aussi un outil puissant pour
de l’épingle à cheveux est dessinée dans le but de permettre des analyses de mutations comme les SNPs et des études de
l’hybridation de la sonde à sa séquence complémentaire génotypage à grande échelle comme pour le gène du
cible située sur l’amplicon (figure 3B). Cette hybridation récepteur d’œstrogène (Täpp et al, 2000).
force l’épingle à cheveux à changer de conformation De plus en plus des tests utilisant la technologie des balises
permettant ainsi l’émission de fluorescence (Whitcombe et moléculaires sont dessinés pour la détection et la
al, 1999; Thelwell et al, 2000; Mackay et al, 2002). quantification rapide d’agents pathogènes viraux,
Thelwell et al (2000) rapportent que la technologie bactériens et parasitaires. Vet et al (1999) ont déjà proposé
amorce/sonde scorpion est généralement plus efficace que un système multiplexe qui permet la détection et la
les technologies Taqman et balises moléculaires, quantification simultanées des rétrovirus HIV-1, HIV-2,
particulièrement dans un programme de PCR possédant des des virus lymphotrophiques-T humains de type I et de type
cycles très courts. II avec un seuil de détection de 10 copies de génome et
Cycle seuil (Threshold cycle) Poddar (1999) pour la détection d’adénovirus. Des tests de
Le concept du « cycle seuil » est à la base d’une détection ont aussi été mis au point pour Salmonella avec
quantification précise et reproductible pour les techniques une sensibilité de 2 CFU par réaction de PCR en temps réel
fluorescentes en PCR. Les valeurs de fluorescence sont (Chen et al, 2000) et de 1 CFU/ml après 6 h
enregistrées au cours de chaque cycle et représentent la d’enrichissement pour Escherichia coli O157:H7 à partir
quantité d’amplicons produits en un point précis dans la d’échantillons de lait cru et de jus de pomme (Fortin et al,
réaction (figure 4). Plus il y a de matrices (template) à 2001). Chez les parasites, un test de PCR en temps réel a
amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé sera le été développé pour Toxoplasma gondii (Lin et al, 2000).
nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal Plusieurs laboratoires travaillent présentement à la mise au
d’émission de fluorescence sera statistiquement et point de nombreux autres tests diagnostiques pour
significativement plus élevé que le bruit de fond (Gibson et différents agents pathogènes.
al, 1996). Ce point est défini comme étant le cycle seuil Traditionnellement, l’analyse du nombre de copies d’un
(Ct) et apparaîtra toujours au cours de la phase plasmide pour évaluer la stabilité génétique des collections
exponentielle d’amplification. Par conséquent, la de cellules était effectuée par transfert de Southern
quantification n’est pas affectée par l’épuisement d’un des (Southern blot). La PCR en temps réel permet maintenant
réactifs comme lors de la phase plateau ce qui explique de réaliser ces analyses de façon beaucoup plus rapide et
pourquoi le système en temps réel est si reproductible. La plus précise. Elle peut aussi être utilisée dans l’évaluation
valeur du Ct peut être traduite en un résultat quantitatif en de la quantité d’ADN chromosomique contaminant ou
la comparant avec les valeurs du Ct générées avec des résiduel bactérien ou de mammifères dans la production de
matrices de quantification connues (Bustin, 2000). protéines recombinantes.
Applications L’analyse de la bio-distribution d’un vecteur est un élément
important dans l’évaluation de l’efficacité de protocoles de
La PCR en temps réel, à cause de sa capacité à produire des thérapie génique. La PCR en temps réel simplifie les études
résultats rapides, spécifiques et quantitatifs, trouve de plus d’évaluation de la présence/absence d’ADN ou d’ARNm
en plus d’applications dans différents domaines. Bien que cible dans les différents tissus et permet de déterminer les
cette liste ne soit pas exhaustive, voici les exemples conditions d’équilibre des ARNm exprimés (steady-state
d’application les plus courants. expressed mRNA).
La PCR en temps réel permet maintenant de réaliser des
études plus fines d’expression génétique à partir de tissus Conclusion
ou de lignées cellulaires comme pour l’analyse quantitative Selon la littérature, la technique la plus fréquemment
de l’expression de différents gènes dans des études de utilisée jusqu’à maintenant est la technologie des sondes
modulation du cycle cellulaire avec des tissus exposés à des d’hydrolyse (Taqman assay) bien que sa popularité soit
carcinogènes non génotoxiques (cie TNO BIBRA), les principalement due à sa maturité commerciale. Cette
analyses de promoteurs dans des lignées cellulaires avec le technologie s’est avérée plus efficace que celle des agents
gène reporter de la chloramphénicol acétyl transférase intercalants au niveau de la spécificité et du multiplexage.
(Jeyaseelan et al, 2001), les études de modifications Le développement des technologies de détection à base de
d’expression génétique dans les expériences balises moléculaires amène encore davantage de spécificité
drogues/réponses (drug/response), l’étude des ARNm et de précision entre autre pour la détection des SNPs et des
variants résultant d’épissage alternatif (alternative splicing) analyses de génotypage comparativement aux technologies
(Vandenbroucke et al, 2001), etc. Elle peut aussi permettre basées sur les sondes linaires. La PCR en temps réel s’avère
de standardiser la quantité d’ADN de départ et d’évaluer la très intéressante pour des applications d’analyses à grande
quantité d’ARNm en fin de réaction dans des études de échelle étant donné que le processus complet est
0,9
0,8
0,7
0,6
Fluorescence
Ct : cycle seuil
0,5
0,4 Ligne de base
0,3
0,2
0,1
0
1 6 11 16 21 26 31 36
Nom bre de cycles
Figure 4 : Modèle graphique de la PCR en temps réel où l’intensité de la fluorescence est exprimée en fonction du nombre de
cycles. L’intensité de la fluorescence à chaque cycle est proportionnelle à la concentration d’amplicons, le cycle seuil (Ct)
représente le nombre de cycles requis où le signal d’émission de fluorescence est statistiquement et significativement plus
élevé que la ligne de base.
automatisé du début à la fin. Comme cette technique génique, de quantification du nombre de copies dans une
comprend généralement des systèmes en tubes fermés et collection de cellules et, finalement, d’évaluation d’ADN
que la quantification ne requiert aucune manipulation post- résiduel sont, présentement, quelques exemples
amplification, les problèmes de contamination post-PCR d’applications de plus en plus répandus de la PCR en temps
par les amplicons sont fortement réduits. réel.
Des analyses d’expression de gènes, de réponse cellulaire à La PCR en temps réel est donc un outil puissant et les
différentes drogues (drug/response), de détection de développements récents dans les différentes technologies de
mutations, de génotypage, de détection et quantification détection laissent entrevoir des applications plus
d’agents pathogènes, de quantification d’ADN et d’ARN, innovatrices les unes que les autres.
d’essais d’expression et de distribution pour la thérapie
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Summary:
Real-Time PCR technology is getting more and more proportional to the quantity of amplicons produced
popular for different sectors of activity. This during the PCR reaction. Because it is generally
technology is based on the detection and quantification performed with closed tube systems and that
of a fluorescent reporter whose emission is directly quantification does not require any post-amplification
handling, the risks of post-PCR contamination by throughput analyses. This paper presents a description
amplicons are significantly reduced. The complete of the Real-Time PCR based principles, different
process is automated from the beginning to the end, amplicons detection technologies and examples of
rendering this technology very performing for high- current applications. .
ÉTAT DE L’ART SUR LA PCR
Support Théorique
École de l’ADN 1
État de l’art sur la PCR
PCR
Réaction de Polymérisation en Chaîne
1983 : Invention de la technique PCR par K.Mullis.
Objectif : synthèse d’un grand nombre de fragments d’ADN identiques.
Condition requises :
-Connaître la séquence du fragment d’intérêt ou de ses séquences flanquantes en amont et en aval ;
-Synthétiser les oligonucléotides (ou amorces) complémentaires à ces séquences.
Etapes de la PCR :
1/ Dénaturation de l’ADN ;
2/ Hybridation des amorces ;
3/ Elongation par la Taq pol.
Principe de la PCR : n cycles = 2n-1 molécules d’ADN théoriques.
OPTIMISATIONS
Paramètres importants :
• Choix de l’enzyme et concentration ;

• Concentration en magnésium ;
• Concentration en désoxyribonucléotides = DNTP ;
• Amorces ;
• Températures d’hybridation et cycles d’amplification ;
• Matrice (ADN) ;
• Additifs et co-slavants (éthanol, urée, DMS, SDS,… =
inhibiteurs de Taq polymérase) ;
• Préparation des réactifs.
1. CHOIX de l’ENZYME
Taq polymérase :
- Résistante à de fortes températures ;

- Activité optimale à des températures de l’ordre de 70°C ;
- Enzyme la plus adaptée pour la PCR ;
- Pas d’activité de correction d’erreur.
Concentration d’utilisation : 1 à 5 unités par échantillon

- Si la concentration est TROP FAIBLE on observe une FAIBLE efficacité d’amplification ;
- Si la concentration est TROP ELEVEE l’amplification est NON SPÉCIFIQUE.
2. CONCENTRATION en MAGNESIUM
- La Taq pol nécessite du magnésium libre (Mg2+) et ceci en plus du Mg2+ piégé par l’ADN matrice, les amorces
et surtout les DNTP ;
- Mg2+ est un catalyseur de la fonction enzymatique de polymérisation de la plupart des ADN pol.
Concentration d’utilisation : 1,5 mM mais généralement le Mg2+ est déjà à la concentration voulue dans le
tampon de la Taq pol.
École de l’ADN 2
3. DNTP
- Les DNTP chélatent le Mg2+;
- Augmenter la concentration en DNTP n’entraîne pas toujours une meilleure efficacité de la PCR ;
Concentration d’utilisation : 200µM suffisent pour synthétiser 12,5 µg d’ADN (incorporation de 50 % des
DNTP) ;
- Si la concentration est ÉLEVÉE, on observe une AUGMENTATION DU TAUX D’ERREUR ;
- Si la concentration est TROP ÉLEVÉE, il peut y avoir une INHIBITION de l’enzyme.
4. CHOIX des AMORCES
- Primordial pour l’efficacité de la PCR ;

- Longueur : 15 à 30 nucléotides (pour les PCR classiques) ;
- Site unique d’hybridation.
Séquence :
- Pourcentage de G+C doit être compris idéalement entre 40 et 60% ;

- Extrémité en 3’ (point de départ de la polymérisation) riche en G et C ;
- Même particularité en 5’ (fixation de l’amorce) ;
Notion de Tm :
Temperature of melting (température de fusion)
- Température à laquelle la moitié des hybrides formés sont dissociés ;

- Le Tm doit être idéalement compris entre 45°C et 70°C ;
- Si inférieur à 55°C, diminution de la spécificité d’hybridation des amorces d’où risque d’amplification non
spécifique ;
- Tm forward = Tm reverse ;
- Calcul des Tm :
(soit N le nombre de nucléotides)
Pour N inférieur ou égale à 20 : Tm= 4 x (G+C) + 2 x (A+T)
Pour N supérieur à 20 : Tm= 81,5 + 16,6xlogNa+ + 0,41(% G+C) – 600/N (dans les milieux
classiques, concentration en Na+ est de 0,053 moles/l)
- Si homologie de séquences dans le choix des amorces = hybridation des amorces entre elles ;
- S’il existe une région palindromique au sein de l’amorce = repliement ou formation d’une boucle.
Concentration d’utilisation :
- La plus basse possible pour donner une sensibilité et une spécificité maximale : 5 à 25 pmol par amorce ;
- Si la concentration est trop FAIBLE, cela peut entraîner un MAUVAIS rendement de la PCR ;
- Si la concentration est trop ELEVEE, on observe une AUGMENTATION de dimères d’amorces.
5. BILAN :
LA SPECIFICITE dépend de trois facteurs :
- Choix des amorces ;

- Températures d’hybridation ;
- Concentration des réactifs.
AUGMENTATION DE LA SPECIFICITE d’une réaction PCR
-Diminuer le Mg2+ ;
-Jouer sur un équilibre fin entre les concentrations en amorce, enzyme et ADN ;
-Augmenter la taille des amorces ;
-Augmenter la température d’hybridation.
École de l’ADN 3
OPTIMISATION DES ETAPES
1. DENATURATION :
Avant de commencer les cycles, il est préférable d’ajouter une étape de dénaturation initiale de 2 à 5 minutes
qui permet d’améliorer les étapes de dénaturation qui suivent.
Cruciale pour la séparation des deux brins
- Normalement entre 94°C - 96°C ;
- Entre 45s et 1min pour que le tube atteigne la température ;
- Prévoir un temps plus long pour de l’ADN génomique .
Si problème PCR : vérifier que le tube soit à la bonne température.
2. HYBRIDATION
- Etape la plus délicate à optimiser ;
- Détermination de la température ;
- Température optimale plus élevée que celle prédite : choisir une température de quelques degrés
supérieure (ou égale) au Tm calculé ;
- Si perte de sensibilité : baisser la température d’hybridation.
3. ELONGATION
Etape la plus simple à optimiser, les conditions sont fournies par le fabriquant.
- 72°C température optimale pour la plupart des enzymes ;

- Durée variable selon la longueur de l’ADN à amplifier ;
- L’activité de la Taq est d’environ 1000 pb/min (selon la Taq).
PROBLEMES RENCONTRES ET SOLUTIONS EVENTUELLES
1. Produits PCR avec un « smear » important
• Augmenter la température d’hyridation ;

• Diminuer le temps de polymérisation ;
• Faire varier la concentration en MgCl2 sans modifier la concentration en DNTP ;
• Utiliser moins d’ADN ;
• Combiner un paramètre après l’autre.
2. Produits PCR non spécifiques
• Augmenter la température d’hybridation ;

• Augmenter le temps d’hybridation ;
• Utiliser moins d’amorces ;
• Utiliser moins d’ADN ;
• Augmenter la taille des amorces (pour élever la température
d’hybridation) ;
• Ajouter du glycérol ou de la BSA qui joue sur la stringence ;
• Combiner un paramètre après l’autre.
École de l’ADN 4
3. Pas de produits PCR alors que votre protocole PCR donnait les résultats attendus avant ?
• Assurez vous de mettre tous les composants nécessaires à la réaction ;

• Changer la solution de DNTP (sensible aux congélations et décongélation), astuce : aliquoter
en petit volume ;
• Même remarque pour les amorces et la Taq ;
• Si vous venez d’acheter un nouveau lot d’amorces, vérifier leurs séquences et concentrations ;
• Augmenter la quantité d’amorces ;
• Augmenter la quantité d’ADN ;
• Diminuer la température d’hybridation ;
• Combiner un paramètre après l’autre ;
4. Faible amplification PCR. Que faire pour augmenter le rendement ?
• Augmenter la quantité d’ADN ;

• Diminuer la température d’hybridation ;
• Augmenter la quantité d’amorces ;
• Diminuer graduellement le Tm jusqu’à la température la plus faible ;
• Changer la concentration en MgCl2 : plus élevée si les produits
PCR< 1000 pb ou plus faible si produits PCR> 1000 pb ;
• Ajouter des adjuvants : BSA (0,1 à 0,8 µg/µl au final), ou du
glycérol utilisé entre 5 à 10 %.
École de l’ADN 5
Travaux dirigés applications de la PCR
Etudes de cas, responsable C. Siatka
Problématique 1
Détermination d'amorces pour réaliser une amplification spécifique de séquence.
Un fragment Eco RI-Bam HI de 1 kb contenant un gène de souris appelé BM est sous cloné
dans un vecteur appelé pGEM2, aux sites Eco RI et Bam HI de pGEM2. Le plasmide obtenu
lors de ce sous clonage est appelé pGEM-BM. La séquence partielle du plasmide pGEM2 au
niveau des sites de clonage Eco RI et Bam HI est écrite ci-dessous.
5'- ATTTAGGTGACACTATAGAATACACGGAATTCGAGCTCGCCCGG
GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTCCGGTCCCTAT
AGTGAGTCGT - 3'
On souhaite utiliser le fragment Eco RI-Bam HI de 1 kb comme sonde pour faire une analyse
RFLP chez différentes lignées de souris. Pour préparer la sonde, on choisit de procéder par
amplification spécifique de séquence (PCR) en incorporant des nucléotides marqués lors de
l'amplification.
A partir de la séquence du site multiple de clonage de pGEM2 donnée ci-dessus, donnez la
séquence de 2 amorces de 20 nucléotides permettant d'amplifier le fragment Eco RI-Bam HI
(1 kb) de pBM1 cloné aux sites Eco RI et Bam HI de pGEM2.
On rappelle que les enzymes de restriction Eco RI et Bam HI reconnaissent les séquences
suivantes:
Eco RI Bam HI
G*AATTC G*GATCC
formation PCRq
Problématique 2
Détermination de la taille optimale des amorces
On détermine la séquence d'une amorce de n nucléotides.
a- Calculez la probabilité qu'une séquence de n nucléotides pris au hasard soit identique à la

séquence de l'amorce.
b- Etant donné la taille L et la complexité C du génome d'un organisme, calculez le nombre
moyen de fois que l'on peut trouver une séquence identique à la séquence de l'amorce choisie
ci-dessus dans le génome de cet organisme. (on appelle complexité C d'un génome la
longueur totale des séquences uniques (non répétées) composant ce génome; L et C sont
exprimés en nombre de paires de bases).
c- Calculez la taille minimale d'une amorce qui ne s'hybriderait qu'à une position dans les
génomes suivants:
En pratique, il faut ajouter trois bases à la longueur théorique pour avoir une bonne sécurité
car la valeur calculée est une valeur statistique.
formation PCRq
Problématique 3
Amplification spécifique de séquence (PCR)
On souhaite amplifier par PCR une partie de la séquence (donnée ci-dessous) du gène de la ß-
6 tubuline du maïs.
Rappel: la taille du génome haploïde du maïs est de 5 e+9 pb
1 ttttaagtta ctgtgtgctt gttgcaggat ctgtaactaa ttcctatgcg attctcttgt

61 ttgtagggcg aagatgaggg agatcctgca catccaggga gggcaatgtg gcaaccagat
121 tggcgccaag ttctgggagg tggtgtgcga tgaacatggc attgacccta ccgggcggta
181 cactggcaat tccgaccttc agttggagcg tgttaatgtc tactacaatg aagcctcctg
241 cggacgcttt gttccccgcg ctgttctcat ggatcttgag cctgggacaa tggacagtgt
301 ccggaccgga ccctatgggc agatcttccg ccctgacaac tttgtgtttg ggcaatctgg
361 tgctggtaac aattgggcta agggccacta caccgagggt gctgagctca ttgactctgt
421 tctggatgtt gtgaggaagg aagctgagaa ctgtgactgc ttgcaaggat tccaagtatg
481 ccactccctt ggtggtggta ctggatctgg tatgggtacg ctgttgatct caaagatcag
541 ggaagagtac cctgaccgca tgatgcttac attctcagtt ttcccctcac cgaaagtatc
601 tgataccgtg gttgagccat acaatgccac tctttctgtc caccagttgg tcgagaatgc
661 tgatgagtgc atggttctcg ataacgaagc cctctatgac atctgcttca ggactcttaa
721 gctgaccacc cctagctttg gtgatctgaa ccatttgatc tctgcaacca tgagtggagt
781 cacctgctgc ctaaggttcc ctggtcagct gaactccgac ctcaggaagc tggcagtgaa
841 cctgatcccc ttcccccgtc tccacttctt catggtcggc ttcgcgccgc tgacgtcccg
901 tggctcccag cagtaccggg ccctcacagt ccccgagctc acgcagcaga tgtgggatgc
961 caagaacatg atgtgtgccg ctgaccctcg ccatgggcgt tacctcaccg cctcggccat
1021 gttccgcggg aagatgagca ccaaggaggt tgacgagcag atgatcaacg tccagaacaa
1081 gaactcgtcc tacttcgtgg agtggatccc caacaacgtc aagtccagcg tgtgcgacat
1141 cccgcccagg ggcctgtcca tggcgtccac cttcatcggc aactcgacct ccatccagga
1201 gatgttccgg agggtgagcg agcagttcac tgccatgttc aggaggaagg ctttcttgca
1261 ctggtacacg ggcgagggca tggacgagat ggagttcacc gaggccgaga gcaacatgaa
1321 cgacctcgtg tcggagtacc agcagtacca ggacgcgact gccgacgagg aggagtacga
1381 ggacgaggag gaggtgcagg ccgatgacat gtgaggggag ggctgttatc gtgtgaagcc
1441 ttgtggtccc tagggcaagc ggacctcgat gagttcggtg ttccctttcg tgttgttgcc
1501 atctttctac tgctagcgta cccaccctcg tggcccattc cgtcgctgtt gacgtatgta
1561 tttttcttgt gctatggaac cttgcttttg gtacggtact atcctgctag tatgcttggc
1621 gtttgaggtt cctggcgtga atttaagcct tccgtatgca gtgattggag ttggagaccg
1681 gctgcttcgt ccaggcgaag caattgacag cgacgtgcta tacactcaag
a- Déterminez la séquence de deux amorces utilisables pour amplifier de façon spécifique

environ 1 kilobase de la séquence du gène de la tubuline.
b- Calculez la température de fusion (Tm) de chacune de ces deux amorces.
c- Proposez un protocole d'amplification (température et durée des différentes étapes).
d- Calculez le nombre de cycles théoriquement nécessaires pour obtenir 1 µg de ce fragment

en partant soit de 10 ng, soit de 500 ng d'ADN génomique.
formation PCRq
Problématique 4
Quantification de la présence d'OGM par PCR quantitative.
Pour déterminer le pourcentage de soja génétiquement modifié dans un lot de fèves, on utilise
la technique de PCR quantitative en temps réel. L'analyse repose sur une double
amplification. L'amplification d'un gène spécifique de l'espèce soja (gène codant la lectine)
permet d'évaluer la quantité d'ADN total présent dans l'échantillon. L'amplification d'une
partie du transgène (promoteur CaMV 35S) permet d'évaluer la quantité d'ADN
correspondant à la présence d'OGM. La réglementation française impose l'obligation
d'étiquetage des OGM ou des produits dérivés d'OGM dès lors que le pourcentage d'OGM est
supérieur à 1%.
Pour limiter les biais de l'analyse, les deux amplifications sont réalisées au cours d'une même
réaction de PCR (PCR duplex).
En même temps que les échantillons inconnus que l'on cherche à caractériser, on analyse une
série d'échantillons connus qui contiennent 1% d'OGM, ce qui permet d'établir une courbe
d'étalonnage. L'analyse de cette courbe d'étalonnage a donné les résultats suivants :
a. Tracez séparément les deux droites d'étalonnage en exprimant le Ct (affiché en ordonnée)

en fonction du logarithme de la quantité d'ADN (affiché en abscisse). Déterminez les pentes
de chaque droite puis calculez l'efficacité de chaque PCR selon la formule :
Ces efficacités de PCR sont-elles satisfaisantes pour analyser valablement le pourcentage de

soja transgénique contenu dans un lot ?
b. L'analyse de deux échantillons de soja a donné les résultats suivants
valeurs de Ct mesurées pour l'amplification de la lectine : 20,60 (éch. 1) et 23,87 (éch. 2)

valeurs de Ct mesurées pour l'amplification de l'OGM : 26,36 (éch. 1) et 26,33 (éch. 2)
A l'aide des droites d'étalonnage ou de leurs équations, calculez le pourcentage de soja

transgénique contenu dans ces 2 échantillons de soja. Les produits correspondants doivent-ils
être étiquetés ?
formation PCRq
Problématique 5
Amplification spécifique d'un microsatellite.
On rappelle qu'un microsatellite est une séquence très courte fortement répétée dans le
génome. Dans l'exemple ci-dessous, il s'agit de la répétition CA. Le nombre de répétition du
motif CA à une même position dans l'ADN génomique est très variable selon les différents
individus qui composent une population homogène. Il existe en général plusieurs endroits
différents du génome qui contiennent un microsatellite d'un type particulier (le microsatellite
de type CA par exemple). On distingue bien entendu ces différents endroits par la séquence de
l'ADN entourant le microsatellite, séquence que l'on ne retrouve qu'une fois dans le génome.
a- En considérant l'exemple ci-dessous, proposez une méthode fondée sur la PCR pour
différencier différents individus de la population. Expliquez (et schématisez) quel type de
résultat on doit obtenir lorsqu'on applique la méthode que vous proposez.
b- Déterminez la séquence de deux amorces de 20 paires de bases utilisables pour amplifier de

façon spécifique le fragment contenant ce microsatellite.
1 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT

61 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT
121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA
181 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
241 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
301 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT
361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT
421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG
481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG
formation PCRq

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Muséum de Nîmes

19, Grand rue

F-30015 Nîmes cedex 1

LA RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR)

LA RÉPLICATION DE L’ADN .......................................................................................................................................... 4

LA RÉACTION DE POLYMÉRISATION EN CHAÎNE (PCR) ........................................................................................... 18

Plusieurs chapitres vont distinguer les modes de la transmission de l’information génétique :

de désoxyribonucléotides (dNTP). Les ADN polymérases

n’effectuent jamais de synthèse ex nihilo, c’est-à-dire qu’elles A T

ne peuvent réaliser une synthèse d’ADN en absence d’ADN C G

servant de matrice (ADN parental). Ces enzymes catalysent C G

la formation de liaisons phosphodiesters qui impliquent le T A

phosphate 5’ (alpha) d’un dNTP libre et l’hydroxyle 3’ libre

d’un brin d’ADN en formation. Cet enchaînement s’effectue

en respectant la règle de complémentarité des bases. Cette G C

règle veut que le dNTP additionné soit le complémentaire G C

que la polymérase est une enzyme de réplication qui a pour G C

substrat un fragment d’ADN et catalyse la polymérisation

de l’ADN monocaténaire complémentaire en formant des

liaisons phosphodiester dans le respect de la règle de C

complémentarité des bases (A-T ; G-C). G

2 - Changement de forme de l’ADN C

chargées de sa réplication. Or l’ADN en son état naturel C

est surenroulé. Par conséquent, cet état doit être modiﬁé C

pour laisser l’accès aux enzymes responsables de la T

réplication. Les enzymes qui assurent ces modiﬁcations

de l’état d’enroulement de l’ADN sont les topoisomérases.

Elles déstructurent et restructurent la forme en isomérisant

qui se manifeste par la synthèse et

4- Terminaison du brin d’ADN

5- Correction immédiate des erreurs

6- Chez les procaryotes

La réplication chez les

initiation nécessite de nombreuses

��� ��� ��� ���

La réplication chez les eucaryotes

Les ADN polymérases eucaryotes

La polymérase alpha (la primase)

La réplication des extrémités d’ADN linéaire

Correction lors de la réplication

Se pose le problème de la structure de la chromatine

Le système de sauvegarde assure le maintient de l’intégrité de l’ADN

Les altérations d’origine physique

Altérations d’origine chimique

Des systèmes multiples assurent la sauvegarde du contenu informatif de l’ADN

Le mélange réactionnel et les cycles de température

par complémentarité, une séquence située en amont

d’ADN. Les amorces sont des ADN monocaténaires

séquence d’intérêt permettra sa réplication de façon

pour la conception et l’emploi des amorces. La ��� ���������������������

assurée par trois liaisons hydrogène au lieu de deux

équilibrée des amorces. Il ne faut pas non plus que �����������������������������������

Thermus aquaticus trouve sa température de confort ��� ���������������������

Détection et analyse des produits PCR

La RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

concernant la fonction des gènes et l’inﬂuence

qu’ils soient physiologiques ou d’origine

d’expression de gènes impliqués dans une

��

pour la conception et l’emploi des amorces. La ��

équilibrée des amorces. Il ne faut pas non plus que ��

Thermus aquaticus trouve sa température de confort ��

��

La détection d’inversions et de mutations ��

est une méthode ��