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    Cours N 02

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    La technique d'analyse biologique de la fluorimétrie implique l'utilisation de la lumière ultraviolette pour exciter les molécules et les faire émettre de la lumière, permettant l'analyse des échantillons. Le document décrit les principes, l'appareillage, les applications et les facteurs affectant la fluorescence.

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    La technique d'analyse biologique de la fluorimétrie implique l'utilisation de la lumière ultraviolette pour exciter les molécules et les faire émettre de la lumière, permettant l'analyse des échantillons. Le document décrit les principes, l'appareillage, les applications et les facteurs affectant la fluorescence.

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    Techniques d’analyses biologiques

    I.2. Fluorimétrie (spectroscopie de fluorescence ou spectrofluorimétrie)


    Certains composés organiques ou minéraux, liquides ou solides (cristaux moléculaires
    ou ioniques), qu’ils soient purs ou en solution, émettent de la lumière lorsqu’ils sont excités
    par des photons du domaine du visible ou du proche ultraviolet.

    La spectroscopie de fluorescence, ou encore fluorimétrie ou spectrofluorimétrie, est


    un type de spectroscopie électromagnétique qui analyse la fluorescence d'un échantillon. Elle
    implique l'utilisation d'un rayon de lumière (habituellement dans l'ultraviolet) qui va exciter les
    électrons des molécules de certains composés et les fait émettre de la lumière de plus basse
    énergie. La spectroscopie de fluorescence peut être une spectroscopie atomique ou
    une spectroscopie moléculaire.

    I.2.1. Terminologie
    Il existe deux types d’émission de lumière selon leurs origines :
    Incandescence : c’est une émission de lumière chaude,
    lorsque l’objet est soumis à une température très élevée (cas
    du soleil ou lampe à incandescence).

    Luminescence : c’est une émission de


    rayonnements électromagnétiques visible ou
    proche ultraviolet sans dégagement de chaleur
    (lumière froide), (LED, objets fluorescents,
    phosphorescents).

    Donc la couleur de la lumière émise dépend de la nature (structure) du corps émetteur

    Structure de
    Couleur
    l’émetteur

    Dr. ARABI . A 5
    Techniques d’analyses biologiques

    Selon la source de l’énergie excitatrice, on distingue plusieurs phénomènes de luminescences:


    Mode d’excitation Type de luminescence
    Lumière Photoluminescence (fluorescence & phosphorescence)
    Réaction chimique Chimiluminescence
    Réaction biochimique Bioluminescence
    Rayons X, rayonnements Radioluminescence
    Électrons accélérés Cathodoluminescence
    Champ électrique Électroluminescence
    Élévation de température Thermoluminescence (incandescence)
    Ultrasons Sonoluminescence
    Frottement, rupture, déformation Triboluminescence

    Photoluminescence : C’est un phénomène de luminescence due à l’absorption de photons.


    Selon la durée de la luminescence, on distingue :
    a. La phosphorescence ; de longue durée (plusieurs minutes voir plusieurs heures).
    b. La fluorescence ; de courte durée (quelques nanosecondes).

    La fluorimétrie regroupe deux techniques analytiques distinguées comme suit :

    Analyte Domaine énergitique


    Spectrométrie de fluorescence moléculaire Molécule Visible te proche de l’UV
    Spectrmétrie de fluorescence atomique ou Atome Rayons X
    spectrométrie de fluorescence X

    I.2.2. Appareillage « Fluorimètre »

    C’est l’outil qui serve à la mesure de la fluorescence. Le fluorimètre permet de mesurer


    l'intensité de la fluorescence à 90° par rapport au trajet optique du rayonnement incident (I0)
    afin de différencier la lumière fluorescente de la lumière transmise (It).

    L'instrumentation d'un fluorimètre est classique et comporte 5 parties:

    • Source lumineuse: généralement une lampe à arc xénon,


    • Monochromateur ou filtre
    • Compartiment à échantillon (porte la cuve quartz)
    • Monochromateur ou filtre
    • Détecteur: photomultiplicateur ou photodiode.

    Dr. ARABI . A 6
    Techniques d’analyses biologiques

    I.2.3. Spectres de fluorescence


    Toute molécule fluorescente se caractérise par 2 spectres: le spectre d'excitation (efficacité des
    différentes longueurs d'ondes à exciter pour conduire finalement à une émission luminescente) et le
    spectre d'émission (intensité relative des émissions aux différentes longueurs d'onde).

    λmax ex < λmax em


    Décalage de STOKES

    Dr. ARABI . A 7
    Techniques d’analyses biologiques

    I.2.4. Rendement quantique de fluorescence


    On définit le rendement quantique de fluorescence comme étant le rapport de l'intensité
    de fluorescence émise sur l'intensité absorbée.
    !"#$%& (& )*"+"!, &#-, 01
    Soit: ff = = 02
    !"#$%& (& )*"+"!, .$,"%$é,

    Φf: le rendement quantique de fluorescence


    If: l'intensité de fluorescence
    Ia: intensité absorbée
    Φf = 0 Þ absence de fluorescence
    0< Φf <1
    Φf = 1 Þ fluorescence maximale

    Φf dépend :
    - Des propriétés physiques de la molécule
    - De l’environnement: Concentration, polarité, pH, température ...
    Φf ne dépend pas :
    - De l’intensité de la source lumineuse I0
    - De la longueur d’onde d’excitation.

    I.2.5. Intensité́ de fluorescence « If »


    𝐼𝑓 = Φf . Ia = Φf . (I0 – It)
    If = Intensité de fluorescence
    Ia = Intensité du rayonnement absorbé
    I0 = Intensité du rayonnement incident
    It = Intensité du rayonnement transmis

    I.2.6. Temps de vie de fluorescence « τ »


    Le temps de vie radiatif est caractéristique de chaque espèce moléculaire fluorescente,
    il est de 1 à 100 nm.
    Pour t = τ : [MS] = [MS]0/e = [MS]0/2,718
    MS : Nombre de molécules excitées au temps t
    MS0: Nombre de molécules initialement excitées
    τ: temps de vie radiatif
    e = 2,718 (base des logarithmes népériens)
    - Plus τ est court, sera la fluorescence.
    - La sensibilité de la spectrofluorimétrie est inversement proportionnelle à τ
    - τ varie en fonction de l’environnement : Solvant, pH ...

    Dr. ARABI . A 8
    Techniques d’analyses biologiques

    I.2.7. Emission parasite en fluorimétrie


    Il est d'usage d'appeler "Quenching", toute influence qui diminue l'intensité d'émission
    de fluorescence. Ainsi de nombreuses natures de solvant peuvent participer au "Quenching".
    Des émissions radiatives parasites dues au solvant peuvent gêner la lecture de la fluorescence
    si les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission sont proches:
    La diffusion Rayleigh : le solvant réémet
    une partie de l'intensité incidente à la même
    longueur d'onde.
    La diffusion Raman: il y a excitation des
    molécules du solvant (énergie de vibration).
    Le retour à l'état fondamental s'effectue avec émission de photons à de plus grande longueur
    d'onde. Elle est beaucoup plus faible que la diffusion Rayleigh.

    I.2.8. Facteurs du milieu modifiant la fluorescence d'une molécule donnée


    - nature du solvant (polarité),
    - pH du milieu,
    - température et viscosité (en diminuant la
    température et en augmentant la viscosité, on
    augmente le rendement quantique),
    - effets d'autres molécules environnantes : par exemple, le dioxygène est connu pour abaisser
    le rendement quantique de fluorescence de nombreux fluorochromes (Désaération des
    solutions à analyser).

    I.2.9. Les espèces fluorescentes (fluorophores)


    Ceux sont généralement des composés organiques aromatiques qui répondent aux critères
    suivants:
    - Absorption dans le visible ou le proche ultraviolet
    - Coefficient d’extinction molaire εmax important
    - Fort rendement quantique (0.8 - 0.9)
    - Très courte durée de vie de fluorescence (≈ ns)
    - Grand décalage de STOKES
    Fluorescéine

    Dr. ARABI . A 9
    Techniques d’analyses biologiques

    I.2.10. Applications de la fluorimétrie


    La fluorimétrie est utilisée dans plusieurs domaines tels que la médecine, biologie,
    environnement et en toxicologie.
    Exemples : - LSD corporel (psychotrope)
    - Plomb dans l’eau
    - Criminologie (empreinte, trace de sang)
    - En médecine pour la détection des cancers

    Dr. ARABI . A 10

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