Séminaire des nouveaux formateurs 2RB

Les agents biologiques

Quels dangers ?

C. POCHET F. RIVENET Paris, 29 et 30 juin 2015

Plan de l’exposé

1. Eléments de contexte
2. Différents types d’agents biologiques
3. Lutte contre les agents biologiques
4. Ressources et références
5. Conclusion

2
1 Réglementation

 Art. R. 4421-1 à R. 4427-5 du Code du travail

 définition des agents biologiques
 classement des agents biologiques infectieux

 Arrêté du 18 juillet 1994 modifié en 1997 et 1998

 liste des agents biologiques pathogènes classés
d’après leur risque infectieux

3
1 Définition des agents biologiques
Art. R. 4421-2 du Code du travail
« Au sens du présent titre, on entend par :
1° Agents biologiques,
les micro-organismes, y compris les micro-organismes génétiquement
modifiés,
les cultures cellulaires
et les endoparasites humains
susceptibles de provoquer une infection, une allergie ou une intoxication ;»

Micro-organisme, entité microbiologique, cellulaire ou non,

capable de se reproduire ou de transférer du matériel génétique

 Bactéries
Culture cellulaire, résultat de la croissance
 Virus et associés in vitro de cellules isolées d'organismes
multicellulaires
 Champignons
Endoparasites
 MGM

4
1 Classement des agents biologiques

 Art. R.4421-3 du code du travail : groupes de risques infectieux

Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4

Possibilité de provoquer
non oui grave grave
une maladie chez l’homme

Danger pour les travailleurs oui sérieux sérieux

Propagation dans la
peu probable possible élevée
collectivité

Existence d’une prophylaxie

oui oui non
ou d’un traitement efficace

C. tetani M. tuberculosis virus Ebola

Pas de liste EBV VHC virus de la
Exemples réglementaire
C. albicans C. imitis variole
T. saginata P. falciparum

5
1 Localisation des agents biologiques
-> ex. de réservoirs naturels

© Eric Tosti et David Alaux pour l’INRS

6
1 Expositions professionnelles
aux agents biologiques

voie cutanéo-muqueuse voie respiratoire voie digestive

© E. Tosti et D. Alaux pour l’INRS

© E. Tosti et D. Alaux pour l’INRS

© E. Tosti et D. Alaux pour l’INRS

7
1

8
1 Autres bases de données

ATCC (American Type Culture

Collection)
 norme de référence de micro-
organismes, de lignées cellulaires et
d'autres matériaux pour la recherche
dans les sciences de la vie.

CIP (Collection de l’Institut Pasteur)

 distribution de souches (propriétés, conservation,
identification...)
 recherche sur l’identification, la taxonomie, la
conservation des souches.

9
1 Relation avec les agents biologiques

 Cohabitation bonne, voire bénéfique

• à la base des chaînes alimentaires
• nécessaires à l'homme
• flore digestive
• biotechnologies

 Risque pour l'homme

Exemples :
Sur les dizaines de milliers d’espèces de bactéries connues

Seule une centaine d’espèces de bactéries pathogènes

10
1 Pathologies liées
aux agents biologiques
• Infection
multiplication de l’agent biologique dans le corps

• Allergie
réponse immunitaire excessive (rhinite, asthme, pneumopathie
d'hypersensibilité, allergie cutanée,…)

• Intoxication
Dégât créé par des toxines synthétisées par l’agent biologique

• Cancer
Conséquence de la présence dans l’organisme d’agents biologiques
et toxines classés par le CIRC*

* Centre International de Recherche contre le Cancer

11
Plan de l’exposé

1. Eléments de contexte
2. Différents types d’agents biologiques
3. Lutte contre les agents biologiques
4. Ressources et références
5. Conclusion

12
2
Bactéries - Présentation

 Organismes unicellulaires procaryotes

 Apparition il y a quelques 3,6 milliards d’années
 Taille : quelques µm (< 1 µm à 5 µm)
 Forme : bacillaire, coccoïde, spiralée

Constituants toujours présents Constituants variables

1. paroi,  flagelle,
2. membrane,  pilus,
3. appareil nucléaire,  capsule,
4. cytoplasme,  plasmide,
5. ribosomes.  spore.

13
2 Bactéries - Multiplication

 Division cellulaire par scissiparité

 Croissance en milieu liquide : apparition
d’un trouble
 Croissance sur support solide : création de
colonies (clones)
 Conditions variables selon les souches :
 Nourriture : matières organique ou  Salinité : isolement d’Halobacterium de
minérale la Mer Morte (22-25% salinité)
 Oxygène : présence (aérobie) ou  Pression : présence jusqu'à 10 500 m
absence d'oxygène (anaérobie) de profondeur
 Température : de -10°C à +110°C  Radioactivité : résistance à 1000 fois la
 Humidité : saturation en eau de 75% à dose radioactive mortelle pour l'homme
100% de Deinococcus radiodurans
 pH : de 0,5 à 11,5
14
2 Bactéries – Classement
Identification

 Phénotypique  Génonotypique
 Caractères apparents  Taille du génome
 Aspects macroscopiques  Contenu en ADN (G+C)
 Séquence des acides nucléiques
une colonie (UFC unité formant colonie)
= des milliards de bactéries identiques
= un clone
=> une souche

 Aspects microscopiques  Caractères biochimiques

bacilles coques

profil enzymatique
Gram - Gram +

15
2 Bactéries – Pathologies

Dépendantes des espèces mais aussi des hôtes

Provoquées par une toxine

 Sécrétion de protéines toxiques ou exotoxines, surtout chez les
bactéries Gram + comme Clostridium botulinum, B cereus
 intoxinations

Provoquées par la multiplication des bactéries pathogènes

 Sécrétion d’enzymes lytiques
 destruction des tissus
 Activation d’une réaction inflammatoire
 Présence d’endotoxines après lyse bactérienne (LPS des
bactéries Gram – comme E coli, Salmonella)
 fièvre, nausée, diarrhée
 Sécrétion de toxines diverses (B pertussis, V cholerae)

16
2 Bactéries – Pathologies

Groupes de
2 3
danger

Voies de Aéro Oro Cutanéo Aéro Oro Cutanéo

transmission portée digestive muqueuse portée digestive muqueuse

L. M.
Bactéries B. pertussis S. aureus B. abortus M. leprae
monocytogenes tuberculosis

Pathologies coqueluche listériose furonculose tuberculose brucellose lèpre

17
2 Virus – Présentation

 Organismes non cellulaires acaryotes

 Parasites cellulaires obligatoires
 Taille : quelques nm
 Symétrie
 icosaédrique (cubique)
 hélicoïdale
 mixte (phages)

 Constituants toujours  Constituants variables

présents enveloppe externe
1. Acide nucléique : ADN ou
ARN simple ou double brin
2. Capside protéique
18
2 Virus – Multiplication

 Particule libre = virion

 Fixation à une cellule cible
 Pénétration

Infection productive Infection avec transformation

 Détournement de la machinerie  Persistance voire intégration du
cellulaire au profit du virus génome viral dans l’ADN cellulaire
 Multiplication des éléments viraux  Modification de l’expression des
enzymatiques et de structure gènes de la cellule hôte (oncogènes)
 Assemblage puis libération par la
cellule de nouveaux virions (avec ou
sans éclatement)
19
2 Virus – Classement
Identification
 Classement selon
 critères structuraux
 nature de l’acide nucléique
 type de symétrie capsidiale
 présence ou non d’une enveloppe
 organismes hôtes
 animaux
 (végétaux)
 (microorganismes)

 Identification
Immunologie

Microscopie électronique Biologie moléculaire

20
2 Virus – Pathologies

Groupes
2 3 4
de danger

Voies de Aéro Oro Cutanéo Aéro Oro Cutanéo Aéro Oro Cutanéo
transmission portée digestive muqueuse portée digestive muqueuse portée digestive muqueuse

Virus
Virus Influenza HHV-1 Junin Lassa Ebola
VHA LCMV VHE fièvre
type A HHV-2
jaune

Pathologies grippe hépatite herpès méningite hépatite fièvre fièvres hémorragiques

ictère

21
2 Agents Transmissibles
Non Conventionnels (ATNC)

 Protéine prion PrPc ou PrP sens présente normalement

dans le SNC, le système immunitaire et d’autres tissus
 Présence et accumulation dans le cerveau d’une forme
anormale PrPSc ou PrPres (structure modifiée) de la protéine
prion PrPc
 Aspect histologique : vacuolisation des structures
nerveuses impactées

WaG © INRS Hélice alpha

c = cellulaire
sens = sensible aux enzymes Prpc ou PrP sens
res = résistante aux enzymes
WaG © INRS Feuillet béta
Sc = scrapie = maladie du mouton PrpSc ou PrP res
22
2 Agents Transmissibles
Non Conventionnels (ATNC)

Dépistage ante mortem

 Test sanguin avec amplification de la PRPres (PMCA )
puis mise en évidence par techniques biochimiques

Dépistage post mortem

 Histologie des tissus nerveux
 Mise en évidence de la PRPres dans les tissus à risque
par des techniques immuno-biochimiques (Western Blot)

23
2
ATNC - Pathologie

Infections particulières : les EST (Encéphalopathies

Spongiformes Transmissibles) caractérisées par :
 une incubation longue (généralement)
 une dégénérescence cérébrale (→ mort)
 pas de réaction inflammatoire – ni réponse immunitaire
Groupes de
3
danger

Voies de transmission Aéro-portée Oro-digestive Cutanéo-muqueuse

Agents de la variante de MCJ …

Exemple d’ATNC normalement aucun Agents de l’ESB ou des EST Agent du syndrome de
animales Gerstmann-Sträussler-
Agent du Kuru Scheinker

 Détérioration mentale avec signes neurologiques

(secousses musculaires, troubles visuels ou de la
Pathologies coordination...)
 Évolution irréversible, en plusieurs mois ou années vers la
mort
24
2 Fungi (champignons)
Présentation

1,5 millions d’espèces dont 80 000 décrites

2 types de mycètes

Champignons filamenteux Levures

 Organismes pluricellulaires  Organismes unicellulaires
eucaryotes eucaryotes
 Mycélium, enchevêtrement  Cellules ovalaires
d’hyphes servant de support et
montrant la croissance
 Appareil sporifère portant les
éléments reproducteurs : les spores

25
2 Fungi (champignons)
Multiplication

 Croissance hyphale ou par bourgeonnement

 Utilisation de substances organiques transformées des
supports comme apport de nutriments
 Reproduction asexuée ou sexuée
 Dissémination des champignons filamenteux par :
• Dispersion facile des spores dans l’environnement
• Adhésion au corps des insectes et des animaux

26
2 Fungi (Champignons)
Identification
 Aspects macroscopiques

Couleur, Aspect des colonies

Aspect du mycélium

 Aspects microscopiques  Caractères biochimiques

Hyphes Spores

27
2 Fungi (Champignons)
Pathologies

 Sécrétion de mycotoxines à action

 hépatique,
 rénale,
 nerveuse,
 cutanée….

 Production d’allergènes

 Production d’enzymes lytiques

28
2 Fungi (Champignons)
Pathologies

Groupes de
2 3
danger

Voies de Aéro Oro Cutanéo Aéro Oro Cutanéo

transmission portée digestive muqueuse portée digestive muqueuse

Champignons H. capsulatum
A. fumigatus C. albicans C. immitis
var. duboisii

Pathologies coccidioïdo
aspergillose candidose histoplasmose
mycose

29
2 Endoparasites
Présentation

 Seuls parasites cités dans le Code du travail

 2 types

Protozoaires Métazoaires (vers)

 Organismes unicellulaires  Organismes pluricellulaires
eucaryotes eucaryotes
 Taille : quelques µm à 70 µm  Taille (adulte) : quelques mm à
10 m
 Forme : arrondie, ovalaire, en
arc, …  Forme des vers :
 Éléments de mobilité : flagelles,  ronds (némathelminthes)
cils, pseudopodes  plats (plathelminthes)
 Eléments de fixation : crochets,
ventouses, …
30
2 Endoparasites
Multiplication

Notion de cycle
 Utilisation par le parasite d’hôtes intermédiaires et/ou
définitifs

Protozoaires Métazoaires (vers)

 Reproduction asexuée par  Reproduction sexuée avec
mitose émission d’œufs fécondés voire
 Reproduction sexuée pour d’embryons, agents de
certains comme les dissémination
Apicomplexa (sporozoaires)

31
2 Endoparasites
Identification
Observation à l’œil nu ou au microscope
 Techniques préparatoires à l’observation
 Examen direct ou après concentration,
 À l’état frais ou après coloration.
 Repérage
 Adultes à l’œil nu ou après grossissement,
 Autres stades dans les produits pathologiques après grossissement
 Œufs ou larves des métazoaires,
 Formes végétatives et/ou kystiques des protozoaires.

Techniques immunologiques Techniques de

 Immunohémagglutination biologie moléculaire
 Immunoprécipitation
 Immunofluorescence
 Immunoenzymologie
33
2 Endoparasites
Pathologies
Parasitoses intestinales (Giardia, Entamoeba,
Taenia, Ascaris, Enterobius, Echinococcus…)
atteintes intestinales et/ou hépatiques

Parasitoses sanguines (Plasmodium)

Autres parasitoses sanguines et tissulaires :
 protozoaires (Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma)
 nématodes tropicaux (microfilaires (embryons de filaires) et
filaires)
signes variables selon les parasitoses : asthénie, nausées,
vomissements, diarrhées, pâleur ou ictère, troubles
neurologiques…

Parasitoses pulmonaires
localisation systématique (Paragonimus)
localisation accessoire (Echinococcus,
Entamoeba),
transit (Ascaris, filaires…)
nodules, infiltrats transitoires ou
chroniques, œdème ou atteinte pleurale…
34
2 Endoparasites
Pathologies

Groupes
2 3
de danger

Voies de Cutanéo Cutanéo

Aéroportée Orodigestive Aéroportée Orodigestive
transmission muqueuse muqueuse

Acanthamoeba Taenia Plasmodium Naegleria Taenia Plasmodium

Parasites
castellanii saginata spp fowleri solium falciparum

encéphalite méningo-
Pathologies (immuno teniasis paludisme cysticercose paludisme
encéphalite
déprimés)

35
2 Cultures cellulaires
Présentation
Origine : Sang, tissus ou organes humains ou animaux

Différents types de cultures cellulaires :

 cultures primaires : (durée de vie restreinte : 10 passages)
=> cardiomyocytes et fibroblastes de cœur d’embryon de poulet
 souches de cellules diploïdes : extraits de tissus embryonnaires (plus de 100
passages) => MRC5
 lignées cellulaires continues : (théoriquement passages infinis)
 variants « immortels » spontanés de cellules tumorales => cellules KB, Hela
 cellules « immortalisées » expérimentalement à l’aide de virus ou d’un produit
chimique => cellules Vero

Pourquoi un danger ?
Présence potentielle d’agents biologiques
 dans les cellules étudiées
 dans les cellules, support de culture virale
 dans les suppléments de culture (SVF)
36
 Cultures cellulaires
Technique
 Préparation de la culture mère
 élimination du milieu,
 rinçage,
 trypsination,
 neutralisation de la trypsine,
 dénombrement.
 Ensemencement d’un milieu neuf

37
2 Cultures cellulaires

Utilisation très fréquente :

 En laboratoire de recherche
 En laboratoire de diagnostic
 En industrie pharmaceutique (production)

Choix des cellules

 Garanti par traçabilité
 Appuyé sur la consultation de bases (ATCC, Pasteur)
 Adapté à l’utilisation
 Le plus éloigné possible de l’espèce humaine

38
2 Microorganismes
Génétiquement Modifiés (MGM)
Présentation

Eléments nécessaires à la production

insert : fragment de d’ADN d’intérêt d’une cellule donneuse

vecteur servant à introduire l’insert dans la cellule hôte
cellule hôte recevant le fragment d’ADN
 Construction d’un microorganisme
génétiquement modifié (MGM)

cellule donneuse insert vecteur MGMhôte

cellule

Obtention de l’ADN d’intérêt

Insertion de l’ADN d’intérêt dans un
insert = manipulation génétique
Introduction du vecteur dans la
cellule cible devenant ainsi un MGM
40
 Microorganismes
2 Génétiquement Modifiés (MGM)
Présentation

«Tout organisme dont le matériel génétique a été modifié

autrement que par la multiplication ou recombinaison
naturelles»

Références
 Directive européenne actualisée 2001/18/CE
 Loi du 25 juin 2008
 Haut Conseil des Biotechnologies (HCB)

41
 Microorganismes
2 Génétiquement Modifiés (MGM)
Classement
 Art. D532-2 du code de l'environnement
Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV

Organisme récepteur ou parental,

vecteur, insert, OGM non susceptibles
d'entraîner une maladie chez l'homme, oui
l'animal, les végétaux, ni de causer des
effets négatifs sur l'environnement

Agent biologique pouvant provoquer une

maladie chez l'homme, causer des effets oui grave grave
négatifs sur l'environnement

Agent biologique constituant un danger oui sérieux sérieux

pour les travailleurs

peu
Propagation dans la collectivité possible élevée
probable

Existence d’une prophylaxie ou d’un

oui oui non
traitement efficace

43
 Microorganismes
2 Génétiquement Modifiés (MGM)
Utilisation confinée
 Déclaration d'utilisation ou demande d'agrément
d'utilisation d'OGM par l’unité de recherche

Groupe I Groupe II Groupe III Groupe IV

oui
Déclaration oui si installation déjà agréé
pour groupes II, III ou IV

Agrément oui oui oui

 Avis donné par le HCB sur les risques et les niveaux de

classement de l'OGM
 Agréments délivrés aux unités de recherche par le ministère
en charge de la recherche

44
 Les AB dans une autre classification :
2 classement de cancérogénicité du CIRC
Groupes de
cancérogéni 1 2A 2B 3 4
cité
probablement peut-être inclassable probablement
cancérogène cancérogène quant à sa pas
Définition cancérogène
pour l’Homme pour l’Homme cancérogénicité
pour l’Homme cancérogène
pour l’Homme pour l’Homme

Nombre 116 73 287 503 1

VHC, VHB, VIH 2, HTLV 2 VHD

Exemples VIH 1, EBV, HTLV1 HPV type 6 HPV types 5 et 8, HPV 6 et 11
HPV16, 18, 31, 33, 26, 53, 66, 67, 70, HTLV 2
viraux
35, 39, 45, 73, 82, 30, 34, 69, SV 40
51, 52, 56, 58, 5 85, 97

Aflatoxin M Zearalenone,
Fumonisin B1, Deoxynivalenol,
Aflatoxines
Exemples Fumosin B2 Nivalenol et
fongiques
fongiques Fusarin C Fusarenone X
Ochratoxin A (toxines de
Fusarium)

Infection à Infection à Infection à Infection à

Exemples Schistosoma Plasmodium Schistosoma Opisthorchis
parasitaires haematobium falciparum japonicum felineus

Autre exemple Formaldéhyde Acrylamide Trypan blue Naphtyl-1-amine Ciclosporin 45

Plan de l’exposé

1. Eléments de contexte
2. Différents types d’agents biologiques
3. Lutte contre les agents biologiques
4. Ressources et références
5. Conclusion

46
3 Une grande variété d’agents

=> Une grande diversité de traitements

antibactériens antiviraux
 antiseptiques appliqués  perturbation chimique du cycle de
lors de lésions réplication (pénétration, réplication,
 antibiotiques assemblage)
 stimulation du système immunitaire

antifongiques antiparasitaires
 de surface  antipaludiques
 systémiques  antihelminthiques
 antiamibiens
 autres antiparasitaires systémiques

47
3 Cas de la lutte antiprion

Traitement
 Aucun actuellement

Méthodes de désinfection poussées (non conventionnelles)

 Inactivation non totale : stérilisation par autoclave à vapeur
d'eau à 134°C pendant 18 minutes
 Inactivation totale
 Immersion dans l'hypochlorite de sodium à la concentration
de 2 % de chlore actif pendant 60 minutes à température
ambiante
 Immersion dans la soude molaire pendant 60 minutes à
température ambiante
 Disparition complète de l'infectiosité : incinération à une
température supérieure à 800°C

48
3 Une grande variété d’agents

=> Des mêmes mesures prophylactiques

Mesures d’hygiène des personnes

Vaccinations

49
Plan de l’exposé

1. Eléments de contexte
2. Différents types d’agents biologiques
3. Lutte contre les agents biologiques
4. Ressources et références
5. Conclusion

50
 Ressources et références
4

Textes juridiques
 Agents biologiques :
 Articles R. 4421-1 à R. 4427-5 du Code du travail
 Arrêté du 18 juillet 1994 modifié en 1997 et 1998
 Microorganismes génétiquement modifiés :
 Directive européenne actualisée 2001/18/CE
 Loi du 25 juin 2008

Publications Ressources numériques

 Manuel du HCB pour l'utilisation  Site 3RB
confinée d’OGM (publication du HCB  BAOBAB : BAse de d’OBservation
30/11/2014) des Agents Biologiques (INRS)
 ED 117 : fiche pratique de sécurité « les  Film Agent BIO07 (INRS)
agents biologiques » (INRS)
 ED 6131 : les risques biologiques liés
aux techniques de génie génétique en
laboratoire (INRS)
51
Plan de l’exposé

1. Eléments de contexte
2. Différents types d’agents biologiques
3. Lutte contre les agents biologiques
4. Ressources et références
5. Conclusion

52
5 Conclusion

Identifier le danger biologique

 Type d’agent biologique
 Niveau de dangerosité (textes)
 Mode de contamination (chaîne de transmission)
 Pathologies causées

53