THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

DE MONTPELLIER SUPAGRO

En Biologie Intégrative, Diversité et Amélioration des Plantes

École doctorale GAIA – Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau

Unité de recherche B&PMP

Laboratoire de Biochimi et Physilogie Moléculaire des Plantes

Étude des facteurs de transcription

impliqués dans la signalisation de
l’azote/nitrate

Présentée par Alaeddine SAFI

Le 27 mars 2018

Sous la direction de Benoit LACOMBE & Gabriel KROUK

Devant le jury composé de

Mme Gwyneth INGRAM , DR CNRS, RDP Lyon Rapportrice

M. Andreas NIEBEL , DR , CNRS, LIPM Toulouse Rapporteur
Mme Anne KRAPP , DR , INRA, IJPB Versailles Examinatrice
M. Loïc LEPINIEC , DR , INRA, IJPB Versailles Examinateur
M. Benoit LACOMBE , CR , CNRS, B&PMP Montpellier Directeur de thèse
M. Gabriel KROUK , CR , CNRS, B&PMP Montpellier Codirecteur de thèse
Liste des abréviations 6
Chapitre 1 : Introduction bibliographique 1
1. La nutrition azotée des plantes 2
1.1. Importance de l’azote : enjeux agronomiques et écologiques 2
1.2. Prélèvement de l’azote par les plantes, considérations physiologiques 4
1.3. Les transporteurs de nitrate 5
1.4. Assimilation et métabolisme de l’azote 8
1.5. Adaptation des plantes à la variation en N 9
1.6. Les acteurs moléculaires dans les voies de signalisation 11
1.6.1. Les acteurs moléculaires de la réponse primaire au nitrate (PNR) 11
1.6.2. Les acteurs de la réponse à la carence en N (NSR) 14
2. Interaction des signaux N et P 16
2.1. La nutrition phosphatée des plantes 16
2.2. L’interaction N/P 17
3. Les espèces réactives de l’oxygène 19
3.1. Généralités 19
3.2. Les sièges de production des ROS 19
3.3. Systèmes antioxydants et stress oxydatif 20
3.4. Le rôle signalétique des ROS 21
4. Les facteurs de transcription 23
4.1. Généralités 23
4.2. La famille GARP 24
4.3. Études des facteurs de transcription: détails sur le TARGET 44
5. Objectifs du travail 45
5.1. Objectifs de l’étude du rôle des NLPs dans la transduction du signal nitrate 45
5.2. Objectifs de l’étude des facteurs de transcription de la sous-famille HRS1/HHO 46
5.2.1. Étude de l'interaction SPX/HRS1, un carrefour entre la voie de transduction du
phosphate et celle du nitrate? 46
5.2.2. Rôle des facteurs de transcription de la famille HHO dans la réponse des plantes
au N 46
5.2.3. Quel rôle pour la forme non nucléaire d’HRS1? 47
Chapitre 2 : Matériels et Méthodes 48
1. Lignées et souches utilisés 49
2. Constructions moléculaires pour l’obtention des plantes transgéniques 49
2.1. Clonage 49
2.2. Oméga PCR 50
2.3. Transformation des bactéries 50
2.4. Extraction des plasmides et séquençage 50
2.5. Transformation des plantes 51
2.6. Croisement des plantes 51
2.7. Extraction de l’ADN génomique 51
2.8. PCR 52
3. Conditions de culture et traitements 52
3.1. Culture en serre 52
3.2. Cultures hydroponiques 52
3.3. Cultures in vitro 53
3.3.1 Culture en Phytatrays™ (hydroponie stérile) 53
3.3.2. Culture en boîtes de Pétri 53
4. Mesure de l’influx racinaire de NO3- 54
4.1. Marquage au 15NO3 54
4.2. Mesure du 15N par spectrométrie de masse 54
5. Analyse de l’expression des gènes 55
5.1. Extraction des ARN totaux 55
5.2. Rétro-transcription des ARN messagers 55
5.3. Quantification de l’accumulation des transcrits par q-PCR 56
6. Extraction des protéines racinaires et analyse par western blot 56
7. Dosage enzymatique des ROS 57
8. TARGET 57
8.1. Construction et purification du vecteur pBeaconRFP_GR-FT sur gradient de CsCl 57
8.2. Isolement des protoplastes 58
8.3. Transformation des protoplastes 59
8.4. Traitements des protoplastes et tri cellulaire 59
8.5. Marquage des ARNs et hybridation des puces 59
 8.6. Analyse bioinformatique et statistique 60
8.6.1. Analyse du transcriptome 60
8.6.2. GeneCloud 60
9. Production et purification des protéines recombinantes 60
9.1. Cultures bactériennes 60
9.2. Lyse des bactéries et extraction des protéines 61
9.3. Purification de la protéine recombinante 61
9.4. Analyse des protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant SDS-PAGE 62
10. Retard sur gel ou EMSA 62
10.1. Choix et hybridation des oligonucléotides 62
10.2. Analyses de retard sur gel 62
11. Observation microscopique d’HRS1-GFP et ses lignées dérivées 63
11.1. Criblage 63
11.2. Co-localisation 63
12. Outils bioinformatiques 64
Chapitre 3: Étude de l’interaction SPX/HRS1, un carrefour entre la voie
de transduction du phosphate et celle du nitrate? 65
1. Introduction 66
2. Résultats et discussion 67
3. Conclusion et perspectives 69
Chapitre 4: Rôle des facteurs de transcription de la famille HHO et des
ROS dans la réponse des plantes à la carence en azote 71
1. Introduction et contexte 72
2. Résultats et discussion 73
Article 73
3. Conclusion et perspectives 109
Chapitre 5: HRS1 est-il un FT qui régule à la fois des gènes nucléaires
et des gènes plastidiaux? 110
1. Introduction et contexte 111
2. Résultats et discussion 113
3. Conclusion et perspectives 118
Chapitre 6: Conclusion générale 119
1. Vers un contrôle “à la carte” des transporteurs via l'édition de genes? 120
2. Un rôle fondamental des ROS dans le contrôle de la nutrition? 123
Annexe 126
1. Liste des cibles directes d’HRS1 liées aux ROS (Medici et al., 2015). 126
2. Liste des cibles directes d’HRS1 liées aux ROS (Safi, submitted). 128
Bibliographie 131
Résumé 152
Abstract 153
 Liste des abréviations

1
O2 : oxygène singulet
3’-UTR : 3’ -Untranslated Transcribed Region
β-ME : β-mercaptoéthanol
λ : longueur d’onde
A : Adénine
ABA : acide abscissique
ABI : Abscisic Acid-Insensitive
ACT : actine
ADN : acide désoxyribonucléique
ADNc : ADN complémentaire
AGI : Arabidopsis Genome Initiative
ALMT : Aluminum-activated Malate Transporters
AMT : ammonium transporter
Amplex Red : 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxasine
ANR1 : Arabidopsis Nitrate Regulated 1
APL : Altered Phloem Development
APRR2 : Arabidopsis Pseudo-Response Regulator 2
APX : Ascorbate Peroxydase
ARN : acide ribonucléique
ARNm : ARN messager
Asn : Asparagine
ASN1 : Asparagine Synthase 1
ATXR5 : Arabidopsis Trithorax-Related Protein 5
NSR : Nitrate Starvation Response
ASPGA1 : Asparaginase A1
ASPGB1 : Asparaginase B1
ATP : adénosine triphosphate
BET : Bromure d'éthidium
BSA : Bovine Serum Albumin
BTB : Born To Bind
BT : BTB and TAZ domain protein
bZIP1 : basic leucine-ZIPPER 1
C : Carbone / Cytosine
CaMV : Cauliflower Mosaic Virus
CAT : catalase
CBL : calcineurin B-like protein
CCD : coupled charged device
CDT1 : Cdc10-Dependent Transcript 1
cHATS : constitutive HATS
ChIP- seq : Chromatin immunoprecipitation- sequencing
CHL1 : Chlorate Resistant 1
CHX : Cycloheximide
CIPK : CBL- Interacting Protein Kinase
Cl- : chlorure
CLA : clathrine
cLATS : constitutive LATS
CLC : Chloride Channel Family
Col : Ecotype Colombia
Cp : crossing point
CPK : calcium-dependent protein kinase
CPSF30-L : Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor 30
CRE : Cis-Regulatory Element
CT: Chloroplast Targeting
Cyt : cytochrome
DAP-seq : DNA Affinity Purification-sequencing
DCFDA : 2, 7 –Dichlorofluorescin Diacetate
DEX : Dexaméthasone
DHAR : Déhydroascorbate réductase
DHE : Dihydroethidium
DNAse : Désoxyribonucléase
dNTP : désoxyribonucléotide Triphosphate
DMF : Diméthylformamide
DMSO : Diméthylsulfoxyde
DO : Densité Optique
DTT : Dithiothreitol
DPI : DiPhenylene Iodonium
E. coli : Escherichia coli
EDTA : Éthylène Diamine Tétra-Acétique
EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay
F : Forward strand
FACS : Fluorescent Activated Cell Sorter
FAD : Flavine adénine dinucléotide
FITC : Fluorescein Isothiocyanate
FT : Facteur de Transcription
G : Guanine
G6PD : glucose-6-phosphate-déshydrogénase
GARP : GOLDEN2, ARR-B, Psr1
GDH : glutamate déshydrogénase
GDPD1 : Glycerophosphodiester phosphodiesterase 1
GFP : Green Fluorescent Protein
GLK : Golden2-Like
Gln : glutamine
Glu : glutamate
Gme : Guanine méthylée
GOGAT : Glutamine oxoglutarate aminotransferase
GPT2 : Glucose-6-Phosphate/Phosphate Translocator 2
GPX : Glutathion Peroxydase
GS : glutamine synthase
GSNO : S-nitrosoglutathion
GST : Gluthation-S-Transférase
GTP : guanosine triphosphate
H2O2 : Peroxyde d'hydrogène
HATS : High Affinity Transport System
HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
HHO : HRS1 HOmologous
HOCl : Acide hypochloreux
HPF : Hydroxyphenyl Fluorescein
HRP : Horseradish Peroxidase
HRS1 : Hypersensitive to low Pi-elicited primary Root Shortening 1
HSF : Heat Shock Factor
HSP : Heat Shock Protein
IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
iHATS : inducible HATS
iLATS : inducible LATS
IPS1 : Induced by Phosphate Starvation 1
IPT3 : Isopentenyl Transferase 3
KI : Iodure de Potassium
KO : Knock-Out
LATS : Low Affinity Transport System
LB : Lisogeny Broth
LBD : LoB Domain-containing protein
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinases
MDHAR/ MDAR : monodéhydroascorbate réductase
MES : acide 2-(N-morpholino)-propane sulfonide
MEP : methylammonium permease
MFP1 : Mar Binding Filament-Like Protein 1
miR : micro RNA
MS : Murashige et Skoog
mut-ATG : mutation du codon ATG
MYR : Myb-Related Protein
N : azote
N2 : diazote
Na+ : sodium
NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide
NADP+ : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NAXT1 : Nitrate Excretion Transporter1
NAR2 : Nitrate Assimilation Related 2
NBT : Nitro Blue-Tetrazolium
NFYA : Nuclear Transcription Factor Y Subunit Alpha
NH3 : ammoniac
NH4+ : ammonium
NIGT1 : Nitrate-Inducible, GARP-type Transcriptional Repressor 1
NiR : nitrite réductase
NIM1 : Non-Inducible IMmunity 1
NLA : Nitrogen Limitation Adaptation
NLP : Nin Like Protein
NLS : Nuclear Localization Signal
NO2- : nitrite
NO3- : nitrate
NOS : oxyde nitrique synthase
NPF : NRT1/PTR Family
NPR1 : Nonexpresser of PR genes 1
NR : nitrate réductase
NRE : Nitrate-Responsive cis-Element
NRG2 : Nitrate Regulatory Gene 2
NRT : Nitrate transporter
NSR : Nitrogen Starvation Response
NUE : Nitrogen Use Efficiency
OST1 : Open Stomata 1
P : Phosphore
P1BS : PHR1-Binding Site
PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis
PAL : Phénylalanine AmmoniaLyase
pb : paire de bases
PBS : Phosphate Buffered Saline
PCR : Polymerase chain reaction
PEG : Polyéthylène Glycol
pH : potentiel Hydrogène
PHL1 : PHR1-Like 1
PHO2 : PHOSPHATE 2
PHR1 : Phosphate Starvation Response 1
pHRS1 : promoteur d’HRS1
PHT : PHosphate Transporter
Pi : Phosphate
PNR : Primary Nitrate Response
PO43- : Phosphate
PP2A : Protein Phosphatase 2A
PP2CA : Protein Phosphatase 2CA
PR : Pathogenesis-Related
PrxR : Peroxiredoxin
PSI : Photosystème I
PSII : Photosystème II
PSR : Phosphate Starvation Response
Psr1 : Phosphorus starvation response 1
PTM : PHD Type Transcription Factor with Transmembrane Domains
PTR : Peptide Transporter
PTS : Plastid Targeting Sequence
PVDF : PolyVinyliDene Fluoride
q-PCR : PCR quantitative
R : Reverse strand
RBOH : Respiratory Burst Oxidase Homolog Protein
RE : Réticulum Endoplasmique
RFP : Red Fluorescent Protein
Rh : Rhesus
ROH : aliphatic alkoxyl radical
ROOH : d’hydroperoxyde
ROS : Reactive Oxygen Species
RNase : Ribonucléase
RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction
S.meliloti : Sinorhizobium meliloti
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SLAC : Slow Anion Associated Channel
SLAH : Slow Anion Associated Channel Homolog
SNO : S-Nitrosothiol
SO42- : Sulfate
SOC : Super Optimal broth with Catabolite repression
SOD : superoxyde dismutase
SPL9 : Squamosa Promoter-binding-Like protein 9
SPX : SYG1/Pho81/XPR1
SSC : Saline Sodium Citrate
STEP1 : Single-Stranded Telomere-Binding Protein 1
T : Thréonine/Thymine
T101 : Thréonine 101
TAE : Tris, Acétate, EDTA
TARGET : Transient Assay Reporting Genome-wide Effects of Transcription factors
TB : Terrific Broth
TBE : Tris, Borate, EDTA
TCP : Teosinte branched 1, Cycloidea, PCF
TE : Tris-EDTA
TGA : TGACG-BINDING FACTOR
TGS : Tris-Glycine-SDS
TGE : Tris-Glycine-Ethanol
Tm : melting temperature
Tris : tris-(hydroxymethyl)-aminoéthane
UPB1 : UPBEAT1
UV : ultra-violet
Y1H : Yeast one-Hybrid
Chapitre 1 : Introduction
bibliographique

1
1. La nutrition azotée des plantes

1.1. Importance de l’azote : enjeux agronomiques et

écologiques
L’azote (N) est un macronutriment essentiel aux êtres vivants puisqu'il est un élément
majeur de la matière organique. Il entre dans la structure d’importantes molécules telles que :
les acides nucléiques (ADN, ARN, ...), les protéines, les alcaloïdes, les coenzymes
(NADH,H+/NAD+, NADPH,H+/NADP+, FADH2/FAD..), les molécules de transfert d’énergie (ATP,
GTP..), les vitamines, les hormones et neurotransmetteurs (cytokinines, thyroxine, dopamine..),
les polyamines (spermine, spermidine..) ou encore les molécules hémiques (hémoglobine,
chlorophylles..). Les plantes étant la voie principale d’entrée de l’azote dans les chaînes
alimentaires, il est donc crucial d’étudier leur nutrition azotée pour comprendre une étape clé de
notre nutrition et de notre survie.
Le diazote (N2) est la source de N la plus abondante dans la nature. Ce gaz représente
78 % du volume de l’atmosphère terrestre. Malheureusement, le N2 n’est utilisé que par
quelques espèces de procaryotes appelées bactéries diazotrophes. Ces dernières ont la
capacité de transformer le N2 en NH3 (rapidement réduit en NH4+) grâce à un complexe
enzymatique appelé complexe nitrogénase (Rees and Howard, 2000). Seulement les plantes
capables d’entrer en symbiose avec ces bactéries fixatrices d’azote, peuvent bénéficier de cette
source d’azote. Cette relation symbiotique fait intervenir plusieurs couples de symbiotes dont le
plus connu est le couple Rhizobium-Légumineuses (Bauer, 1981).
Chez la grande majorité des plantes, l’azote peut représenter jusqu’à 8-9 % de la
matière sèche. Elles sont capables d’utiliser plusieurs sources d’N organiques (urée, acides
aminés, acides nucléiques, peptides) (Nasholm et al., 2009; Paungfoo-Lonhienne et al., 2008)
et minérales (nitrate, ammonium) (von Wirén et al., 1997). La plupart des espèces végétales
utilisent le nitrate (NO3-) et l’ammonium (NH4+) du sol comme source majeure d’azote (Crawford
and Glass, 1998). Ils représentent ensemble plus de 80 % des ions minéraux prélevés du sol
(Marschner, 2012). Si l’NH4+ constitue la forme d’azote privilégiée pour les plantes ligneuses, il
est cependant toxique (syndrome ammoniacal) pour la majorité des plantes herbacées s’il est
fourni seul (Morot-Gaudry, 1997). Une combinaison de NH4+ et de NO3- constitue alors une
solution alternative pour une croissance optimale des plantes (Salsac et al., 1987) et une
meilleure efficacité d’utilisation d’azote (NUE) (Kronzucker et al., 1999). Contrairement au NH4+

2
A

Figure 1.1. Effet de la disponibilité de l’azote sur la croissance

des plantes.
Plantules d’Arabidopsis cultivées en hydroponie pendant 6 semaines
(A) en absence ou (B) en présence de 0,5 mM NH4NO3.
qui est souvent adsorbé aux colloïdes argileux, le NO3- est généralement beaucoup plus
disponible dans la solution du sol (von Wiren et al., 2000). Ceci fait donc du NO3- la principale
source d’azote pour les plantes herbacées (Crawford and Glass, 1998). Cependant, cette
propriété fait du nitrate un élément très mobile et facilement lessivable par les eaux de pluie.
D’où la fluctuation spatio-temporelle de sa disponibilité dans les sols qui se traduit par de
grandes variabilités de la concentration du sol en NO3-, entre 10 μM et 10 mM (Miller et al.,
2007). Ces variations de la nature et de la disponibilité des différentes sources d’azote,
constituent donc un facteur limitant de la croissance des plantes. En effet une privation d’azote
plus ou moins longue peut conduire à un défaut de croissance, des phénomènes de chloroses,
voire à la sénescence de la plante (Tschoep et al., 2009) (Figure 1.1).
Ainsi, l’homme a compris depuis des siècles la nécessité de fournir de l’azote pour
augmenter la productivité et la rentabilité des produits agricoles. Pour cela, il a eu recours aux
engrais basés essentiellement sur les déchets animaux et végétaux (fumier, compost..). Ce
n’est qu’en 1909 que Fritz Haber et Carl Bosch ont réussi à révolutionner le cycle de l’azote sur
la planète en permettant la fixation industrielle du diazote atmosphérique. Le procédé Haber-
Bosch a permis ainsi une production massive d’engrais azoté. Il est considéré comme une des
plus grandes inventions du XXème siècle (Smil, 1999). Le mécanisme consiste à réduire le N2 en
NH3 par catalyse chimique puis en NH4+ avant d’être oxydé en acide nitrique. Depuis, le
mélange de ces deux dernières formes d’azote (NH4+ et NO3-) constitue l’engrais le plus utilisé
en agriculture (Morot-Gaudry, 1997).
On estime que, grâce à cette nouvelle technologie, la production mondiale en céréales a
doublé entre 1960 et 2000, tandis que l’utilisation des engrais azotés a été multipliée par huit
(Tilman et al., 2002). Un rapport du FNDAE (Fonds National pour le Développement des
Adductions d'Eau potable) affirme que 2 500 000 tonnes/an d’engrais azotés sont répandues
sur les cultures en France (Ratel, 2002). Comme, la teneur en azote des récoltes n'a augmenté
que légèrement, une bonne partie des engrais qui ne sont pas assimilés par les plantes sera
lessivée dans les nappes phréatiques par les eaux de pluie, essentiellement sous forme de
nitrate (Tilman et al., 2002).
L’accumulation du nitrate dans les cours d’eau, les lacs et les bassins versants, où les
eaux sont lentement renouvelées, est la cause majeure des phénomènes d’eutrophisation. En
plus de la pollution aquatique, les engrais azotés représentent aussi une source de pollution
atmosphérique à cause de leurs volatilisation sous forme d’oxydes gazeux (N xOy) et de NH3
(Gruber and Galloway, 2008). Par ailleurs, le coût énergétique du processus de production
industrielle des engrais est très élevé (plus de 1 % de la production mondiale d'énergie) (Kitano

3
et al., 2012). L'optimisation de la fertilisation azotée des agrosystèmes représente alors un défi
majeur sur le plan agricole mais aussi écologique. Celle-ci est basée principalement sur
l’adéquation de l’utilisation des fertilisants (Kramer et al., 2006), et l’amélioration de l’efficacité
d’utilisation d’azote (la NUE, ou Nitrogen Use Efficiency) chez les plantes cultivées (Garnett et
al., 2009; Pathak, 2008). Cette dernière est étroitement liée au prélèvement et au transport
racinaire de l’azote (Pathak, 2008) qui est un des axes de recherche majeurs de la présente
thèse.

1.2. Prélèvement de l’azote par les plantes,

considérations physiologiques
Le prélèvement de l’azote et des nutriments de façon générale se fait principalement par
les racines. Même si l’urée peut-être appliquée sur les parties aériennes des plantes aux
champs, cette molécule est rapidement transformée en NH4+ puis en NO3- par l’activité uréase
et nitrifiante des microorganismes du sol (Marschner, 1995). Les ions NH4+ et NO3- absorbés du
sol sont transportés tout au long des racines par les vaisseaux xylémiens vers le reste des
organes de la plante. La variation de leurs concentrations dans la solution du sol a contraint la
plante à développer des mécanismes de transport adaptés. On distingue deux flux opposés
entre les cellules racinaires et le milieu extérieur; un influx et un efflux (Crawford and Glass,
1998). Il est souvent observé que l'efflux ne représente qu'une faible proportion du transport
(Delhon et al., 1995b) et que l’altération du prélèvement est principalement due à des variations
d'influx (Clarkson and Lüttge, 1991; Lee, 1993).
Il existe deux systèmes d’influx d’azote, un système de transport à haute affinité (HATS,
High Affinity Transport System) et un à faible affinité (LATS, Low Affinity Transport System).
Bien que le premier possède une haute affinité au N (Km 10-100 µM), sa capacité de transport
reste faible et saturable à de faibles concentrations. Le LATS (Km > 0,5 mM) par contre se
caractérise par sa faible affinité et par sa grande capacité de transport. Ça contribution devient
significative pour des concentrations externes de N élevées (mM) (Siddiqi et al., 1989; von
Wiren et al., 2000; Wang et al., 1993). Dans le cas du NO3- chacun de ces deux systèmes de
transport est décomposé en deux types de régulation; le premier est constitutif alors que le
second est inductible par le NO3- lui-même. On distingue alors iHATS, cHATS, iLATS et cLATS
(Crawford and Glass, 1998; von Wiren et al., 2000).
Des mesures des concentrations intracellulaires en NO3- et du potentiel de membrane
indiquent que son influx s’effectue majoritairement contre son gradient de potentiel

4
 AtALMT12 Sil
Cellules de garde
SLAC1 & SLAH3
Fermeture des NPF2.12/NRT1.6
stomates Funi
ClCa & ClCc Gr
Mouvement St
des stomates Charge de la graine
NPF6.12/NRT1.1 Cellule de l’embryon
Ouverture des
stomates Vacuole
Tg
NPF6.2/NRT1.4

NRT2.7
Stockage dans la graine
St

Pet
Cellule du mésophylle

Vacuole
F
Approvisionnement de la ClCa & ClCab
feuille en nitrate
Stockage dans la vacuole

NPF2.13/NRT1.7
NPF2.9/NRT1.9
NPF1.2/NRT1.11
NRT2.4 NPF1.1/NRT2.12
Phl

St

Phl
F

Charge du phloème
F
Remobilisation dans la feuille
Sol
Ep
Cor
End
St

Per

NPF2.3 NRT1.1
NPF7.3/NRT1.5 NRT2.1
SLAH1 & SLAH3
NPF6.3/NRT1.1
charge du LEGENDE
NPF4.6/NRT1.2
SLAH2

xylème NRT2.1 Orientation du flux de nitrate

NRT2.2
NRT2.4
NPF7.2/NRT1.8 NRT1.1 NPF2.7/NAXT1 NRT2.5
Zone d’expression des
transporteurs dans les parties
Décharge Efflux du Prélèvement aériennes
du xylème nitrate par les racines

Prélèvement du nitrate du sol et charge du xylème

Figure 1.2. Les transporteurs de nitrate et leurs rôles chez Arabidopsis.

Les transporteurs de nitrate de la famille NPF/NRT1 (en bleu), NRT2 (en orange), SLAC1/SLAH
(en vert), CIC (en violet) et ALMT (en marron).
Cor : cortex, End : Endoderme, Ep : épiderme, F : feuille, Funi : Funicule, Gr : graine, Per :
péricycle, Pet : pétiole, Phl : phloème, Sil : silique, St : Stèle, Tg : tige.
électrochimique (Miller and Smith, 1996). Ce qui implique que le transport du NO3- se fait grâce
à un mécanisme de transport actif. Ceci est probablement assuré par un cotransport de 2
protons H+ et un ion NO3- (Crawford and Glass, 1998; Glass et al., 1992).
Le mécanisme de transport du NH4+ est quant à lui moins compris. Celui-ci pourrait se
réaliser via une voie symport NH3/H+ (Mayer et al., 2006; Mayer and Ludewig, 2006) parfois
considérée comme une voie uniport de NH4+ (Ludewig et al., 2002), ou une voie symport de
NH4+/H+ (Ortiz-Ramirez et al., 2011). Un mécanisme antiport de NH4+/H+ a même été décrit chez
les mammifères (Westhoff et al., 2002). Le transport de NH4+ se fait généralement grâce à des
transporteurs de type AMT/MEP/Rh (Giehl et al., 2017; Loque and von Wiren, 2004; Ludewig et
al., 2007).
Les transporteurs de NO3- étant des objets d'études essentiels de cette thèse (en particulier
chapitre 4), seront décrits plus en détails dans la partie suivante.

1.3. Les transporteurs de nitrate

Les transporteurs impliqués dans le prélèvement, la distribution ou le stockage du NO 3-
chez Arabidopsis sont répartis en 5 familles (Noguero and Lacombe, 2016) : La famille
anciennement appelée NRT1 ou PTR et renommée récemment NPF par (Leran et al., 2014), la
famille NRT2 (Krapp et al., 2014; Orsel et al., 2002), la famille SLAC1/SLAH (Hedrich, 2012), la
famille CLC (Barbier-Brygoo et al., 2011) et la famille ALMT (ALMT12) (Sasaki et al., 2010).
Leurs rôles et spécificités sont décrits ci-dessous et résumés dans la figure 1.2.
La famille NPF comporte 53 membres chez Arabidopsis impliqués entre autres dans le
transport de nitrate, du nitrite, des peptides et des hormones (Corratge-Faillie and Lacombe,
2017). Un criblage au chlorate (ClO3-) a permis d’identifier des mutants résistants à cet
analogue toxique du NO3-. Certains mutants nommés chl1, sont affectés dans le gène
CHL1/NRT1.1/NPF6.3. C’est par cette approche que le premier transporteur de NO3- chez les
plantes a été identifié (Tsay et al., 1993). Initialement attribué au LATS (Tsay et al., 1993),
NRT1.1 possède en réalité une double affinité pour le NO3- (Liu and Tsay, 2003). Ainsi, à faibles
concentrations de NO3-, il est phosphorylé par la kinase CIPK23 sur le résidu T101 ce qui lui
confère une forte affinité pour le NO3-. Inversement il présente une faible affinité face à de fortes
concentrations de nitrate lorsqu’il est déphosphorylé (Liu et al., 1999). NRT1.2/NPF4.6 identifié
par homologie de séquence avec NRT1.1/NPF6.3, fonctionne au sein du cLATS (Huang et al.,
1999). Ces deux transporteurs sont les seuls membres dans cette famille impliqués dans le
prélèvement racinaire du NO3- dans le sol (Noguero and Lacombe, 2016). Les autres membres

5
sont répartis dans les différents organes de la plante et assurent plusieurs rôles (Figure 1.2).
NRT1.4/NPF6.2 par exemple, exprimé au niveau des pétioles, est impliqué dans le transport du
NO3- dans les feuilles (Chiu et al., 2004); NRT1.5/NPF7.3 et NPF2.3 sont exprimés dans le
péricycle et interviennent notamment dans l’export du NO3- vers le xylème (Li et al., 2017a; Lin
et al., 2008; Taochy et al., 2015). Sa translocation vers les feuilles est par la suite effectuée par
NRT1.8/NPF7.2 (Li et al., 2010); l’expression de NRT1.6/NPF2.12 au niveau des siliques lui
permet de dispenser le NO3- aux graines (Almagro et al., 2008); NRT1.7/NPF2.13,
NRT1.11/NPF1.2 et NRT1.12/NPF1.1 sont des transporteurs phloémiens qui interviennent dans
la remobilisation du NO3- des vieilles feuilles vers les plus jeunes (Fan et al., 2009; Hsu and
Tsay, 2013); NRT1.9/NPF2.9 est également exprimé au niveau du phloème et favorise la
charge du nitrate dans la sève descendante (Wang and Tsay, 2011). NAXT1/NPF2.7 participe,
quant à lui, à l’efflux du nitrate vers le milieu extérieur (Segonzac et al., 2007). À l’exception de
NRT1.1/NPF6.3 qui se caractérise par sa double affinité, tout le reste des protéines NPF semble
travailler à faible affinité (Km > 1mM).
Les transporteurs à haute affinité appartiennent plutôt à la famille NRT2 (7 membres
chez Arabidopsis) (Krapp et al., 2014). NRT2.1, NRT2.2, NRT2.4, et NRT2.5 sont les
transporteurs racinaires impliqués dans le prélèvement du nitrate dans le sol (Kiba et al., 2012;
Kiba and Krapp, 2016; Lezhneva et al., 2014; Orsel et al., 2004; Orsel et al., 2002). Dans ce
contexte, NRT2.1 est l’élément principal puisqu'il semble contribuer à lui seul à 72 % de l’activité
du iHATS (Li et al., 2007). NRT2.2 possède un rôle complémentaire à celui de NRT2.1 (Filleur
et al., 2001). NRT2.4 et NRT2.5 sont localisés au niveau de l’épiderme et du cortex des racines
ainsi que dans les parties aériennes et sont impliqués dans le prélèvement du nitrate à de très
faibles concentrations (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014). Ils sont considérés comme des
marqueurs de la réponse à la carence en azote (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014; Safi,
submitted). Leurs expressions dans les feuilles leur permettent aussi de charger le phloème en
nitrate (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014). NRT2.5 est l’effecteur majeur du cHATS avec
63 % d’influx de nitrate (Kotur and Glass, 2015). NRT2.3 et son plus proche homologue NRT2.6
ont montré une activité de transport de nitrate dans des ovocytes (Kotur et al., 2012). Mais leur
rôle dans la plante reste encore un peu flou, d’autant que leur expression n’est ni régulée par la
fourniture d’azote ni par la carence (Okamoto et al., 2003). Cependant, plusieurs études ont mis
en évidence l’importance de NRT2.6 dans la réponse des plantes aux pathogènes (Dechorgnat
et al., 2012; Kechid et al., 2013; Mantelin et al., 2006). NRT2.7 est un transporteur tonoplastique
qui est responsable du stockage du NO3- dans les graines (Chopin et al., 2007). Hormis ce
dernier, les 6 autres membres de NRT2 interagissent physiquement avec NAR2.1/NRT3.1

6
(Kotur et al., 2012). La formation d’un complexe avec cette protéine semble être nécessaire
pour le fonctionnement du transporteur (Kotur and Glass, 2015; Laugier et al., 2012; Orsel et al.,
2006; Yong et al., 2010).
La famille de canaux ioniques SLAC1/SLAH compte 5 membres chez Arabidopsis,
SLAC1 et ses 4 homologues SLAH1 à SLAH4 (Negi et al., 2008). SLAC1 et SLAH3 sont
exprimés dans les cellules de garde et impliqués dans la fermeture des stomates (Geiger et al.,
2011; Negi et al., 2008; Vahisalu et al., 2008). Récemment il a été démontré SLAH1 et SLAH3
sont exprimés dans le péricycle et qu’ils interviennent probablement dans le chargement du
xylème en NO3- et Cl- (Cubero-Font et al., 2016). La capacité d’efflux de Cl- est favorisée par
l’hétérodimérisation des deux canaux (Cubero-Font et al., 2016). SLAH2 est caractérisé par sa
sélectivité au nitrate puisqu’il est imperméable au Cl- (Maierhofer et al., 2014). Il est exprimé
dans la stèle des racines. L’activité de transport de ces canaux est finement régulée par des
kinases CPK6, CPK21, CPK23, CIPK23 et OST1 (Brandt et al., 2012; Geiger et al., 2011;
Maierhofer et al., 2014; Scherzer et al., 2012) et des phosphatases PP2CA (Lee et al., 2009).
Les CLCs font aussi parti d’une famille de canaux ioniques permettant le transport du
NO3- (et du Cl-) (Barbier-Brygoo et al., 2011). Leur dénomination provient d’ailleurs du fait qu’ils
étaient identifiés chez les vertébrés comme étant perméables que au Cl- (Jentsch et al., 1990).
Les protéines caractérisées parmi les 7 membres de la famille sont généralement localisées sur
les membranes internes comme celles des organites cellulaires (Zifarelli and Pusch, 2010), ou
sur le tonoplaste (CLCa, CLCb, CLCc et CLCg) (Lv et al., 2009). CLCa et CLCb sont
responsables du stockage du nitrate dans la vacuole (De Angeli et al., 2006; von der Fecht-
Bartenbach et al., 2010). Ils possèdent également une activité d’efflux de la vacuole vers le
cytosol (von der Fecht-Bartenbach et al., 2010; Wege et al., 2014). Cette capacité de transport
bidirectionnelle permet à CLCa, exprimé dans les cellules de garde, de réguler l’ouverture et la
fermeture des stomates (Wege et al., 2014). D’une manière semblable, CLCc perméable à la
fois NO3- et au Cl-, régule aussi les mouvements des stomates (Geelen et al., 2000; Harada et
al., 2004; Jossier et al., 2010). Aucune perméabilité au NO3- n’a cependant, été enregistrée pour
CLCg (Nguyen et al., 2016). L’activité de ClCa est régulée à la fois par la kinase OST1 (Wege et
al., 2014) et la phosphatase PP2A (Hu et al., 2017). Sa sous-unité catalytique (PP2A-C5)
interagit physiquement avec les 4 canaux tonoplastiques : CLCa, CLCb, CLCc et CLCg (Hu et
al., 2017). CLCd et CLCf sont localisés sur la membrane de l’appareil de Golgi mais aucune
activité de transport de NO3- n’a été rapportée (Guo et al., 2014a; Guo et al., 2014b; Marmagne
et al., 2007; von der Fecht-Bartenbach et al., 2007). CLCe est localisé sur la membrane
thylakoïdienne des chloroplastes (Marmagne et al., 2007) et son mutant correspondant montre

7
 Paroi pecto-cellulosique
Membrane plasmique
Vacuole
Acides
STOCKAGE aminés

Plaste
GS
NiR GOGAT
NR NO2-
NO3- NO3- NO2- NH4+ Glu
α-cétoglutarate

EXPORTATION

NO3-

Figure 1.3. Devenir du nitrate dans la cellule végétale.

Une fois entré dans la cellule par des transporteurs membranaires, le nitrate peut être
exporté hors de la cellule, stocké dans la vacuole ou réduit en nitrite dans le cytoplasme
par la nitrate réductase (NR). Le nitrite est exporté dans les plastes puis réduit en
ammonium par la nitrite réductase (NiR) et assimilé en acides aminés par la GS-
GOGAT.
un contenu faible de NO3- par rapport au sauvage (Monachello et al., 2009). Sa sélectivité au
NO3- et Cl- reste à élucider (Herdean et al., 2016).
Enfin, ALMT12 (QUAC1) appartenant à la famille ALMT est capable de transporter en
autre du Cl- et du SO42-, mais surtout du NO3- (Sasaki et al., 2010). ALMT12 est exprimé
principalement au niveau de la membrane plasmique des cellules de garde, mais également sur
les membranes du réticulum endoplasmique et la vacuole (Sasaki et al., 2010). Sa capacité à
contrôler la fermeture des stomates est elle aussi régulée par la kinase OST1 (Imes et al.,
2013).

1.4. Assimilation et métabolisme de l’azote

S’ils ne sont pas stockés dans les vacuoles, ni transloqués vers d’autres organes, le
NO3- et le NH4+ prélevés du sol sont alors assimilés en acides aminés (Figure 1.3). En effet, le
NH4+ est transporté dans les plastes (généralement les chloroplastes) où il sera assimilé à une
molécule de Glu sous l’action de la GS pour donner une molécule de Gln. La GOGAT par la
suite, dans une réaction de transamination, utilise un groupement amine de la Gln néoformée
pour l’associer à une molécule d’α-cétoglutarate et générer ainsi deux molécules de Glu. Ce
dernier servira de nouveau pour la fixation de NH4+ sinon, il sera utilisé pour la synthèse de tous
les autres acides aminés par transamination. Le NO3- doit donc être transformé en NH4+ pour
pouvoir être intégré dans un squelette carboné. Il est tout d’abord réduit en NO 2- dans le cytosol
par la nitrate réductase (NR) (2 gènes chez Arabidopsis : NiA1; NiA2). Le NO2- est transporté
dans les plastes où il est réduit en NH4+ par la nitrite réductase (NiR) (Beevers and Hageman,
1980). Seulement ces deux dernières réactions définissent l’assimilation du nitrate au sens
propre (Morot-Gaudry, 1997).
L’assimilation de NH4+ en Glu peut également avoir lieu sous l’action de la glutamate
déshydrogénase (GDH) NADP(H)/NAD(H)-dépendante (Liu and von Wiren, 2017; Tercé-
Laforgue et al., 2004). Celle-ci catalyse la transformation réversible de l’α-cétoglutarate en Glu
en utilisant un NH4+ libre sans qu’il soit associé à une Gln (Lea, 1990; Turano et al., 1997). La
GDH possède plusieurs isoformes. Chez Arabidopsis il existe 3 gènes (GDH1, GDH2, et GDH3)
codant respectivement 3 sous-unités (β, α et γ). Ces 3 sous-unités peuvent s‘associer de façon
aléatoire pour former plusieurs homo- et hétéro-hexamères (Marchi et al., 2013). Avant la
découverte de la voie GS/GOGAT (Lea and Miflin, 1974), il a été généralement admis que la
GDH est l’enzyme clé de l’assimilation de l’ammonium en acides aminés (Kennedy, 1966;
Lewis, 1978), puisqu’elle constitue la voie majeure de synthèse de Glu chez les champignons

8
(Pateman, 1975; Sims and Folkes, 1964). Bien qu’elle puisse aussi avoir une localisation
chloroplastique, son faible niveau d’expression et son affinité très faible au NH4+ favorisent son
rôle secondaire dans cette voie par rapport à celle de la GS/GOGAT (Miflin and Lea, 1976). Ce
rôle complémentaire a été soutenu par plusieurs études surtout en cas d’excès de NH 4+ ou
durant des stages de développement spécifiques (Rhodes et al., 1989; Srivastava and Singh,
1987; Stewart et al., 1980; Yamaya et al., 1986). Plus récemment, c’est plutôt la réaction
inverse qui est considérée comme l’activité principale de GDH. C’est-à-dire la formation de α-
cétoglutarate et la libération de NH4+ à partir de Glu (Aubert et al., 2001; Fagard et al., 2014;
Robinson et al., 1991; Robinson et al., 1992). Ceci a été expliqué par la diminution de l’apport
en carbone. La libération d’un squelette carboné va donc permettre l’alimentation du cycle de
Krebs pour la production d’énergie (Turano et al., 1997). En 2013, Marchi et al (Marchi et al.,
2013) ont montré que l’expression de l’isoenzyme 3 (GDH3) est induite en réponse à la carence
en azote. Ainsi, cette enzyme considérée comme marqueur de réponse à la carence (voir
chapitre 4) (Safi, submitted) pourrait intervenir dans le catabolisme des acides aminés et donc le
recyclage de l’azote et le maintien de l’homéostasie du NH4+ (Masclaux-Daubresse et al., 2006).
Une autre enzyme capable de recycler l’azote est l’asparaginase (2 gènes chez Arabidopsis:
ASPGA1 et ASPGB1) (Gaufichon et al., 2017). Asn est l’acide aminé le mieux adapté pour le
stockage et le transport de l’azote en raison de son ratio N/C élevé (2:4) (Coruzzi, 2003; Lea et
al., 2007). Par conséquence, la régulation de l’activité des deux enzymes clé de cette voie
métabolique (l’asparaginase et de l’asparagine synthétase) permet de contrôler le recyclage et
la remobilisation de l’azote (Nakano et al., 2017). Récemment, un facteur de transcription de la
famille GARP (Safi et al., 2017), s’est révélé participer à la régulation du recyclage de l’azote en
contrôlant l’expression de ASN1 (Nakano et al., 2017).

1.5. Adaptation des plantes à la variation en N

Les plantes sont des organismes sessiles. Pour faire face aux différents stress biotiques
et abiotiques auxquels elles sont exposées, elles ont développé des mécanismes d’adaptation
sophistiqués. La fluctuation de la disponibilité du nitrate, par exemple, a présidé à l’évolution
d’une panoplie de réponses adaptatives des plantes que ce soit au niveau physiologique,
développemental ou moléculaire (Gojon et al., 2009; O'Brien et al., 2016; Vidal and Gutierrez,
2008). Ces réponses adaptatives incluent : la mise en place de différents systèmes de
prélèvement de NO3- (Krapp et al., 2014), la régulation du stockage et de la remobilisation du

9
NO3- selon les besoins (De Angeli et al., 2006) et l’adaptation de la croissance en fonction de la
disponibilité du NO3- (Rahayu et al., 2005; Remans et al., 2006).
Un élément essentiel de ces réponses est l’adaptation des systèmes de transport du
NO3-. Pour que la plante optimise son apport en azote, les scientifiques ont longtemps considéré
que la plante absorbait le nitrate en permanence et puis elle en rejetait en fonction de ses
besoins. Dans ce cas, c’est l’efflux de nitrate qui est donc régulé (Scaife, 1989). Cette théorie a
été rejetée puisqu'il a été démontré que c’est l’influx (et non l’efflux) qui est majoritairement
soumis aux mécanismes de régulation (Delhon et al., 1995a; Hole et al., 1990). Bien que l’efflux
de NO3- soit majoritairement peu régulé en réponse aux fluctuations en azote du milieu
extérieur, sa régulation reste un mécanisme non fréquent et son rôle physiologique semble être
plutôt limité aux réponses aux stress en général et au stress salin en particulier (Delhon et al.,
1995a; Taochy et al., 2015).
La régulation de l’influx fait intervenir plusieurs facteurs : le signal NO 3- lui-même, le
statut azoté de la plante entière (satiété vs demande), les autres métabolites azotés (acides
aminés, NH4+), l’apport en carbone et le rythme circadien (Crawford and Glass, 1998; Morot-
Gaudry, 1997).
La régulation des systèmes d'absorption n'est pas la seule réponse adaptative aux
variations de la disponibilité des nutriments. Il est bien établi que les plantes ont développé
également une plasticité de leur croissance leur permettant de s’acclimater à différentes
conditions environnementales. En particulier, elles sont capables de moduler l’architecture
racinaire en fonction de la disponibilité en nutriments (Drew and Saker, 1975; Kellermeier et al.,
2014; Malamy, 2005; Remans et al., 2006; Ristova et al., 2013; Zhang and Forde, 2000). Ainsi,
dans des conditions de distribution hétérogène de NO3- dans le milieu, le système racinaire va
coloniser les zones riches en nitrate (Drew, 1975; Remans et al., 2006).
Ces modifications physiologiques et développementales sont directement ou
indirectement liées à des voies de signalisation dont on distingue principalement : la réponse à
la carence ou NSR (Nitrate Starvation Response) et la réponse à la fourniture ou PNR (Primary
Nitrate Response) et les signalisations systémiques décrites ci-dessous.
La NSR peut être comprise comme la réponse des plantes à la carence prolongée en
azote (Kiba and Krapp, 2016; Krapp et al., 2011; Menz et al., 2016), caractérisée surtout par
l’activation des transporteurs de nitrate à haute affinité NRT2.4 et NRT2.5 permettant d’absorber
le NO3- à très faibles concentrations (de l’ordre du micromolaire) dans le sol (Kiba et al., 2012;
Lezhneva et al., 2014), ainsi que GDH3 qui permet de recycler l’azote en catabolisant les acides
aminés (Aubert et al., 2001; Marchi et al., 2013).

10
 La fourniture de nitrate à des plantes préalablement dépourvues en N ou en NO3- induit
une réponse rapide (en quelques minutes) et spécifique au NO3-. Cette réponse est marquée
notamment par l’expression des gènes impliqués dans l’assimilation du NO3- (NIA1, NIA2, NIR..)
mais aussi d’autres gènes sentinelles codant des facteurs de transcription de la famille GARP
(Safi et al., 2017) (HRS1, HHO1, HHO2, HHO3) (Canales et al., 2014; Krouk et al., 2010b;
Wang et al., 2004). On parle alors de la réponse primaire au nitrate (PNR pour Primary Nitrate
Response) (Hu et al., 2009; Medici and Krouk, 2014).
Les signalisations à longue distance permettent à la plante de contrôler son statut azoté
de manière systémique (communication inter-organes). Des signaux de demande et/ou de
satiété en azote sont envoyés d’une racine à une autre en passant par les feuilles pour
permettre à la plante d’adapter son métabolisme et son développement. Comme ces
signalisations ne sont pas au centre de mon travail, je renvoie le lecteur aux références et
revues suivantes (Gansel et al., 2001; Li et al., 2014; Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2015).

1.6. Les acteurs moléculaires dans les voies de

signalisation

1.6.1. Les acteurs moléculaires de la réponse primaire au nitrate (PNR)

Comme évoqué précédemment, la réponse primaire au nitrate (PNR) est définie comme
étant la réponse rapide (quelques minutes) de la plante à la présence du nitrate dans le milieu
(Medici and Krouk, 2014). Cette réponse est maintenue même chez un double mutant de nitrate
réductase, totalement incapable d’assimiler le nitrate. En d’autres termes, c’est l’ion NO 3- lui-
même (et non les produits de son assimilation) qui induit la réponse. De plus, la PNR ne
nécessite pas la synthèse de novo de protéines (Medici and Krouk, 2014; Wang et al., 2004). La
PNR induit des reprogrammations géniques touchant jusqu’à 10 % du transcriptome (Canales et
al., 2014; Gutierrez et al., 2007; Krouk et al., 2010b; Wang et al., 2003). Les gènes concernés
recouvrent plusieurs fonctions liées à N comme le transport, l’assimilation, le métabolisme des
acides aminés et nucléiques ou encore la transcription et l’épissage des ARNs, la synthèse
d’hormones et la voie des pentoses phosphates (Castaings et al., 2011; Krouk et al., 2010b).
Cette voie de signalisation est probablement la mieux et la plus étudiée à ce jour. De ce fait, un
bon nombre d’acteurs moléculaires ont déjà été identifiés, ils sont détaillés ci-dessous.
Le régulateur central de la PNR est NRT1.1 qui, outre son activité de transport, peut se
comporter comme un senseur de nitrate (Bouguyon et al., 2015; Ho et al., 2009; Krouk et al.,

11
2010a). Ce rôle de senseur a définitivement été mis en évidence grâce à un mutant de
substitution P492L (chl1-9) affecté dans l’activité de transport de NO3-, qui conserve toutefois sa
capacité à induire la réponse des gènes au NO3- (Ho et al., 2009). Ceci a permis pour la
première fois de mettre en évidence que les deux fonctionnalités de NRT1.1 (appelé désormais
transcepteur (Gojon et al., 2011)) peuvent être génétiquement découplées. Par ailleurs, la PNR
est également dépendante de l’état de phosphorylation de NRT1.1. Ainsi, la phosphorylation de
la T101 ne permet pas seulement de moduler le système de transport (en passant de LATS à
HATS) mais aussi d’altérer la PNR, suggérant que c’est probablement la forme non
phosphorylée de NRT1.1 qui permet de percevoir le nitrate (Bouguyon et al., 2015; Ho et al.,
2009). L’état de phosphorylation de ce transcepteur et son fonctionnement sont régulés par
différentes protéines. En effet, c’est la kinase CIPK23 qui phosphoryle directement le résidu
T101 de NRT1.1. CIPK23 est elle-même activée par des senseurs de calcium CBL9 (Ho et al.,
2009) et CBL1 (Leran et al., 2015). D’autre part, la désactivation de CIPK23 et CBL1 par la
phosphatase ABI2 permettrait de garder NRT1.1 dans un état déphosphorylé (Ho et al., 2009;
Leran et al., 2015). Ainsi, CIPK23, CBL9, CBL1 et ABI2 semblent former un complexe
régulateur de l'activité de NRT1.1 (Leran et al., 2015). De manière intéressante, ABI2 interagit
également avec CIPK8, un autre élément nécessaire à la mise en place de la PNR (Hu et al.,
2009; Ohta et al., 2003).
Cependant, il existe un(des) voie(s) indépendante(s) de NRT1.1. En effet, la PNR est
fortement affectée chez un mutant KO d’NRT1.1 (chl1-5) ayant du NH4+ comme source d’azote
avant l’apport en NO3-, mais elle n’est pas affectée chez le même mutant ayant subi une pré-
carence en N. Ceci montre que NRT1.1 n’est probablement pas le seul senseur de nitrate
(Wang et al., 2009b).
Le deuxième acteur central de la PNR est NLP7. Le rôle de ce facteur de transcription
chez Arabidopsis dans la régulation des gènes sentinels de la PNR a été mis en évidence grâce
à deux approches indépendantes (Castaings et al., 2009; Wang et al., 2009b). La première
(Castaings et al., 2009) est par la recherche de protéines homologues au facteur de
transcription NIT2 de Chlamydomonas reinhardtii connu pour réguler l'expression des gènes en
réponse au nitrate chez cette algue (Camargo et al., 2007; Schnell and Lefebvre, 1993). La
seconde méthode correspond à une approche de criblage génétique basée sur l’utilisation d’un
promoteur inductible par le nitrate fusionné à un gène rapporteur. L’induction du gène
rapporteur est très fortement altérée chez les mutants nlp7 (Wang et al., 2009b). Le mutant nlp7
présente un phénotype de carence en N même en présence de NO3- (Castaings et al., 2009).
Malgré son rôle central dans la régulation de la PNR, l'expression de NLP7 n’est pas régulée

12
 NO3-

NRT1.1/
NPF6.3

CBL1/CBL9
ABI2

CIPK23 CIPK8
Cytosol

NO3- PLC/InsP3

NO3-
CPK10/30/32

P Noyau

bZIP1
NLP6/7 NLP6/7
TCP20 TGA1/4
NRG2
SPL9

PNR

Figure 1.4. Les principaux acteurs moléculaires qui contrôlent la PNR

(D’après Krouk, 2017).
transcriptionnellement par le nitrate. Cependant, la présence du NO3- conduit à l'accumulation
de la protéine dans le noyau (Marchive et al., 2013). Dans cette même étude, les auteurs ont
révélé 101 gènes reconnus et régulés par NLP7 dont 91 gènes de réponse au nitrate. Cette
forte cohérence valide son rôle important dans la régulation de la PNR (Marchive et al., 2013).
Par ailleurs, son proche homologue NLP6, est aussi régulé post-traductionnellement par le NO3-
. NLP7 et NLP6 régulent tous les deux des gènes de réponse au nitrate via le motif NRE
(Konishi and Yanagisawa, 2013a; Konishi and Yanagisawa, 2013b). La fusion d’un domaine
répresseur à la protéine NLP6, diminue l’expression de presque tous les gènes inductibles par
le nitrate (Konishi and Yanagisawa, 2014). Toutes ces données font de NLP6, au même titre
que NLP7 un régulateur majeur de la PNR, présentant une certaine redondance fonctionnelle
avec NLP7 (Konishi and Yanagisawa, 2013b) (Figure 1.4).
Le fonctionnement de ces 2 facteurs de transcription (NLP6/NLP7) est régulé, entre
autres, par l’interaction avec les protéines NRG2 (Xu et al., 2016) et TCP20 (Guan et al., 2017)
mais aussi par les kinases CPK10, 30, 32 qui présentent désormais un chaînon essentiel entre
la signalisation prenant naissance à la membrane, liée à NRT1.1, et celles nucléaires (Krouk,
2017; Liu et al., 2017a). En présence de NO3- des vagues calciques NRT1.1 dépendantes sont
induites probablement via une phospholipase C (Riveras et al., 2015). L’activation des CPK10,
30 et 32 par le signal calcique va entraîner la phosphorylation de NLP6 et NLP7 et ainsi de
favoriser leur localisation nucléaire où ils vont activer les gènes de la PNR (Krouk, 2017; Liu et
al., 2017a). La complexité de la régulation de la PNR ne s’arrête pas là, puisque NRT1.1 est
régulé aussi au niveau post-transcriptionnel par une protéine nommée CPSF30-L dont le gène
est régulé à la fois par le statut redox et par des signalisations liées au calcium. De manière
intéressante, le mutant cpsf30 présente un défaut au niveau du transport de nitrate et de
l’expression des gènes sentinels (Li et al., 2017b).
Les NLPs ne sont pas les seuls FT impliqués dans la PNR. SPL9 par exemple a été
identifié comme un FT intervenant dans cette réponse (Krouk et al., 2010b) et qui est lui-même
régulé par un microARN, miR156 (Wang et al., 2009a). Bien que d’autres FT puissent réguler
plusieurs réponses liées au nitrate comme le développement racinaire, leur implication dans le
contrôle de la PNR per se reste à prouver (Medici and Krouk, 2014; O'Brien et al., 2016). C’est
le cas de TGA1 et TGA4 (Alvarez et al., 2014), bZIP1 (Para et al., 2014), ANR1 (Gan et al.,
2005). L’ensemble de ces données est résumé dans la figure 1.4.

13
1.6.2. Les acteurs de la réponse à la carence en N (NSR)
La NSR c’est la réponse des plantes à la carence prolongée en azote, caractérisée
surtout par une modification caractéristique de l’architecture racinaire, l’activation du HATS du
nitrate, la réduction de la croissance et la sénescence des feuilles, la translocation de l’azote
vers les tissus les plus jeunes, la diminution de la photosynthèse et l’accumulation des
anthocyanes (Drew and Saker, 1975; Himelblau and Amasino, 2001; Kiba and Krapp, 2016;
Krapp et al., 2011; Peng et al., 2007a).
Ces formes d’adaptation à la carence en N, sont précédées par des régulations
transcriptomiques marquées par la répression des gènes assignés à la photosynthèse, la
synthèse de la chlorophylle, et la synthèse des protéines plastidiales ou encore l’induction des
gènes de métabolisme secondaire et surtout des gènes impliqués dans le HATS (NRT2.4 et
NRT2.5) et dans le recyclage de l’N (GDH3) (Aubert et al., 2001; Krapp et al., 2011; Marchi et
al., 2013; Peng et al., 2007a; Scheible et al., 2004).
Contrairement à la PNR où plusieurs acteurs moléculaires ont été identifiés, les
régulateurs de la NSR sont beaucoup moins connus. Ce n’est qu’en 2009 qu’une étude a révélé
le rôle de 3 FT de la famille LBD dans la régulation de la réponse à la carence en N (Rubin et
al., 2009). Les auteurs ont montré que LBD37, LBD38 et LBD39 qui sont induits par le nitrate,
inhibent des gènes de la synthèse des anthocyanes. Ainsi, l’expression de ces gènes est
constitutive chez les mutants (lbd37, lbd38 et lbd39) qui accumulent de l’anthocyane même en
présence de NO3-, alors que les sur-expresseurs n’en produisent pas même en conditions de
carence. LBD37/38/39 ont aussi un effet répressif sur l’expression de certains gènes
d’assimilation d’azote et des transporteurs de nitrate y compris des transporteurs à haute et très
haute affinité comme NRT2.1 et NRT2.2 et NRT2.5. Les lignées transgéniques affectées dans
ces 3 FT, ont des teneurs en NO3- et en acides aminé altérées (Rubin et al., 2009).
Le rôle du Ca2+ et des CBL dans la PNR a été bien établi (§ 1.6.1), mais est ce qu’ils
sont aussi impliqués dans la NSR? Récemment, il a été suggéré que la carence en nitrate
pourrait déclencher un changement rapide de la concentration cytosolique en Ca 2+ (Ma et al.,
2015). La même étude a mis en évidence que CBL7, un senseur de Ca2+ induit par la carence
en NO3-, est impliqué dans la régulation de la NSR. Des mutants cbl7 carencés en nitrate
présentent une anomalie de croissance de la racine primaire et une baisse de la teneur en NO 3-
par rapport au sauvage. Le défaut dans la teneur en NO3- est corrélé avec la dérégulation des
gènes NRT2.4 et NRT2.5 (Ma et al., 2015). Le mécanisme par lequel CBL7 régule cette voie de
signalisation reste cependant à élucider.

14
 Outre son rôle majeur dans la régulation de la PNR, NLP7 a été proposé par Castaings
et al., (2009) comme un répresseur des gènes de la réponse à la carence en N (Castaings et
al., 2009).
À part les facteurs de transcription, d’autres protéines régulatrices peuvent aussi
intervenir dans ce genre de réponses adaptatives comme l’ubiquitine E3 ligase NLA qui régule
la remobilisation de l’N via la dégradation du transporteur NRT1.7 (Liu et al., 2017b). Ainsi, le
mutant nla ne parvient pas à mettre en place les mécanismes d’adaptation à la carence en N,
comme par exemple la synthèse des anthocyanes, et présente un phénotype de sénescence
abrupte et précoce en -N. Ces données montrent que NLA est un régulateur essentiel du
développement et de l’adaptation des plantes dans des conditions limitantes en N (Peng et al.,
2007a; Peng et al., 2007b). L’accumulation des transcrits de NLA et ainsi son activité sont
finement régulées par miR827 (Kant et al., 2011).
Ces dernières années, de multiples études ont illustré l’implication des petits ARN dans
différents processus physiologiques (Axtell et al., 2007; Borges and Martienssen, 2015;
Kamthan et al., 2015). Les micro ARN en particulier sont impliqués dans les réponses
adaptatives des plantes face à la carence en nutriments (Fujii et al., 2005; Hsieh et al., 2009;
Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Pant et al., 2009). Une carence en N, induit l’expression de
miR160, miR780, miR842, miR846, miR826 et son transcrit complémentaire miR5090 et inhibe
celle de miR169, miR171, miR395, miR397, miR398, miR399, miR408, miR827, et miR857 (He
et al., 2014; Liang et al., 2012). miR196, découvert d’abord chez Medicago truncatula comme
régulateur du développement des nodules (Combier et al., 2006), semble être un acteur
moléculaire dans la réponse à la carence en azote chez Arabidopsis thaliana (Zhao et al.,
2011). En effet, la surexpression de ce micro ARN, donne des plantes hypersensibles à la
carence en N, qui accumulent moins d’N et de chlorophylle que les plantes sauvages et chez
lesquelles l’expression des transporteurs de nitrate est atténuée. Le rôle de miR196 dans la
régulation de la NSR passe probablement par la régulation de l’accumulation des transcrits des
NFYA. Puisque l’induction de l’expression de ces FT par la carence en N, est totalement abolie
par l’expression constitutive de miR169 (Zhao et al., 2011). De plus, la surexpression des NFYA
donne un phénotype opposé à celui observé chez les sur-expresseurs de miR169 caractérisé
surtout par une sénescence tardive et une augmentation de l’accumulation de chlorophylle
(Leyva-González et al., 2012). Un membre de la famille NFYC (fonctionne en hétérotrimère
avec NFYA et NFYB) module le ratio N/C en augmentant l’accumulation des protéines et en
diminuant celle de l’amidon (Li et al., 2015).

15
Les deux micro ARNs miR826 et miR5090 issus de la duplication inversée de leur gène cible
AOP2 sont induits par la carence en N. Leur sur-expression engendre une meilleure tolérance à
la carence en N, qui se traduit par l’induction des gènes de réponse à la NSR accompagnée
d’une amélioration du prélèvement de l’N, l’augmentation de la biomasse, du nombre des
racines latérales, et du taux de chlorophylle (He et al., 2014).
En conclusion, les informations concernant les acteurs moléculaires impliqués dans le
contrôle de la NSR sont plus disparates et les mécanismes moléculaires de la perception de
l’absence d’N par les plantes ne sont pas encore élucidés. Ceci fait l’objet de l’étude proposée
dans les chapitres 3 (SPX) et 4 (HHOs) de cette thèse.

2. Interaction des signaux N et P

2.1. La nutrition phosphatée des plantes

Après l’azote, le phosphore (P) est le deuxième macronutriment limitant la croissance
des plantes (Abel et al., 2002; Marschner, 1995). C’est un élément essentiel qui entre dans la
structure des acides nucléiques, des phospholipides membranaires, des phosphoprotéines, les
coenzymes (NADPH,H+/NADP+) et des molécules de transfert d’énergie (ATP, GTP..). Sur le
plan fonctionnel, il est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme la
photosynthèse, la respiration. Le phosphate inorganique (Pi) joue surtout un rôle crucial dans
les cascades de transduction de signal et dans la régulation de l’activité enzymatique
(Marschner, 1995; Poirier and Bucher, 2002).
Le transport du Pi est régi par 2 systèmes, un LATS faisant intervenir des symports
Pi/Na+ (PHT2 et PHT3) et un HATS dont les transporteurs sont des symports Pi/H+ (PHT1)
(Casieri et al., 2013; Nussaume et al., 2011; Rausch and Bucher, 2002).
Comme l’azote, la biodisponibilité du phosphore aux plantes est limitée. Ceci est dû
principalement à deux raisons: i) Contrairement à N qui peut être assimilé sous différentes
formes, le phosphate inorganique est quasiment la seule forme de P directement assimilable
par les plantes. ii) Et la tendance du Pi à réagir avec des cations (Al 3+, Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+)
pour former des sels assez insolubles (Marschner, 1995; Poirier and Bucher, 2002;
Raghothama, 1999).
Les plantes ont développé des stratégies adaptatives pour pouvoir faire face aux
variations de la disponibilité en Pi. Par exemple, une carence en Pi engendre chez la plante des

16
changements morphologiques, physiologiques, métaboliques, biochimiques et moléculaires.
Ces modifications groupées sous le nom de PSR (pour Phosphate Starvation Response), visent
à améliorer le prélèvement, l’acquisition, et l’efficacité d’utilisation du Pi globalement
(Raghothama, 1999; Scheible and Rojas-Triana, 2015). Les réponses adaptatives les plus
connues dans ce contexte comprennent; l’adaptation de l’architecture racinaire (augmentation
de la croissance des racines latérales et des poils absorbants et l’inhibition de la croissance de
la racine primaire) (Chevalier et al., 2003), la création de nouvelles racines spécialisées (racines
protéoïdes chez certaines espèces végétales) (Lambers et al., 2006), la mycorrhization (Bucher,
2007), la solubilisation du Pi du sol (sécrétions d’enzymes et d’acides organiques)
(Raghothama, 1999), l’induction du HATS (Raghothama, 1999), le recyclage et la remobilisation
du phosphate interne (Nakamura et al., 2005). Toutes ces réponses sont précédées par des
régulations d'expression de centaines voire de milliers de gènes (Misson et al., 2005; Secco et
al., 2013).
En réalité, les voies de signalisations liées au phosphate dépendent aussi de la
disponibilité des autres nutriments (Zn, Fe, S, N). Nous allons en décrire une dans le
paragraphe suivant car certains objets moléculaires étudiés dans cette thèse (HHOs voir
chapitre 3) sont largement impliqués dans cette interaction.

2.2. L’interaction N/P

Ces dernières années, des mécanismes par lesquels les plantes intègrent la présence
ou l’absence d’une combinaison N/P commencent à être élucidés.
Une observation remarquable de l’interaction entre N et P se manifeste par la réversion
du phénotype du mutant nla (§ 1.6.2) de deux manières, une carence combinée en N/P ou la
mutation de PHT1.1. La diminution du prélèvement du Pi permet au mutant d’échapper à la
sénescence précoce induite par la carence en N (Kant et al., 2011; Peng et al., 2008). Par
ailleurs, NLA participe également à l’établissement de l’homéostasie du Pi vu que le mutant
accumule beaucoup plus de Pi que le sauvage et que le phénotype malade du mutant est dû
entre autres à la toxicité du Pi sur-accumulé. Cette toxicité qui phénocopie le mutant pho2 est
surpassée soit par l’augmentation de la concentration en NO3- soit par la diminution de la
concentration en Pi. Ceci est expliqué par un effet antagoniste exercé par NO 3- et Pi sur leurs
accumulations. Ainsi la fourniture de fortes concentrations de NO3- diminue l’accumulation de Pi
et vice versa (Kant et al., 2011). En outre, l’E2 conjugase PHO2 interagit physiquement avec
NLA pour ubiquitiner le transporteur de phosphate PHT1;4 en conditions suffisantes en Pi. Cette

17
polyubiquitination va permettre la dégradation protéasome-dépendante du transporteur et ainsi
diminuer le prélèvement du Pi. Par contre, pendant la carence en Pi, les transcrits de NLA et
PHO2 sont dégradés respectivement par miR399 et miR827 (induits par la carence en Pi et
réprimés par la carence en N) ce qui permet de surpasser la dégradation de PHT1;4 et ainsi
augmenter le prélèvement du Pi (Park et al., 2014).
Le “crosstalk” entre N et P agit également sur le développement de la plante. Un effet
antagoniste de NO3- et de Pi sur la floraison a été observé. En effet, la plante fleurit de façon
précoce à faible concentration en NO3- mais présente une floraison retardée dans des
conditions limitantes en Pi. De plus, l’interaction entre ces deux anions crée un effet cumulatif.
C’est-à-dire des concentrations élevées en Pi combinées à une faible disponibilité en NO3-
accélèrent davantage le processus de floraison (Kant et al., 2011).
Récemment de nouveaux éléments ont été ajoutés à la liste des gènes impliqués dans
l'intégration des signaux NO3- et Pi. Deux FT de la famille GARP (Safi et al., 2017) ont été
révélés comme des régulateurs de la croissance racinaire en réponse à une combinaison N/P.
En particulier, de facteur de transcription HRS1 induit par la fourniture de NO3- (Canales et al.,
2014; Krouk et al., 2010b) exerce un effet répresseur sur le développement de la racine primaire
en absence de Pi (Liu et al., 2009). Cette observation a été ultérieurement confirmée par notre
équipe par des expériences qui ont démontré le rôle essentiel de ce FT dans le contrôle de
l’élongation de la racine primaire dans des conditions particulières de disponibilité en nitrate et
en phosphate contrastées. Il s'est avéré qu’HRS1 réprime la croissance de la racine primaire en
conditions de carence en phosphore mais seulement en présence de NO3- dans le milieu. Ce
rôle implique un mécanisme moléculaire original par lequel ce FT intègre en même temps la
signalisation de NO3- et de Pi nécessitant des mécanismes de contrôle tant au niveau
transcriptionnel qu'au niveau post-transcriptionnel (Medici et al., 2015).
Chez le riz, l'intégration des signaux NO3- et Pi pour réguler la croissance racinaire est
effectuée par un micro ARN fortement induit par la carence en Pi (miR444). Sa surexpression
améliore l’accumulation à la fois du NO3- et du Pi en stimulant l’expression des gènes codant
des transporteurs. Par contre, l’ajustement de l’architecture racinaire en réponse à la carence
en Pi a été altéré chez les sur-expresseurs d’une manière NO3--dépendante. Ces lignées
transgéniques ont aussi des difficultés à s’adapter à des conditions limitées en N en raison d’un
défaut dans leur capacité à remobiliser l’azote (Yan et al., 2014b).

18
 ONOO•
A Peroxynitrite

•NO NO2−
Monoxyde Nitrite
d'azote HOCl
e− −
1O
2 O2 O2•− e O22− Acide hypochloreux

Oxygène Dioxygène Superoxyde

singulet 2 H+ Cl−
Fe2+
H2O2 •OH Radical
hydroxyle
Peroxyde
d’hydrogène RH Biomolécule

RO• ROO•
Alkoxyle Peroxyle

Figure 1.5. Les espèces réactives de l’oxygène, formation et sites de production

A) Formation des différentes ROS à partir du dioxygène atmosphérique. Le nom de
chaque entité réactive est marqué en bleu.
B) Production des ROS dans les différents compartiments cellulaires chez la plante
(Mhamdi et al., 2010).
3. Les espèces réactives de l’oxygène

3.1. Généralités
Le dioxygène O2, est indispensable à la vie car il permet la respiration mitochondriale qui
produit l’énergie nécessaire au métabolisme. Et bien que inerte, ses formes excitées ou
partiellement réduites sont très réactives. Ces formes considérées comme des sous-produits
inévitables du métabolisme aérobie sont appelées les espèces réactives de l’oxygène (ROS,
Reactive Oxygen Species) (Choudhury et al., 2017). On distingue les radicaux libres (comme le
radical hydroxyl •OH, l’anion superoxyde O2•−, et le monoxyde d'azote •NO) et les espèces non
radicalaires (comme l’oxygène singulet 1O2, le peroxyde d'hydrogène H2O2, et l’ozone O3).
En plus de de l’oxygène, certains ROS contiennent également un atome d’N (comme le •NO) et
sont ainsi appelées RNOS (espèces réactives de l’oxygène et de l’azote). Dans tout le reste de
ce manuscrit, le terme ROS concerne aussi bien les RNOS que les ROS sans N.
L’instabilité des ROS leur permet de réagir entre eux ou avec d’autres molécules pour
créer de nouvelles espèces réactives comme l’acide hypochloreux HOCl, le peroxynitrite
ONOO− et les radicaux alkoxyle RO• et peroxyle ROO• (Gill and Tuteja, 2010; Mhamdi et al.,
2010) (Figure 1.5A). Ces molécules sont très instables et capables de déstabiliser d’autres
molécules entraînant ainsi une réaction en chaîne.

3.2. Les sièges de production des ROS

Les ROS sont produites pratiquement dans tous les compartiments de la cellule surtout
au niveau des éléments les plus en contact avec l’oxygène, comme les chaînes de transport
des électrons dans la mitochondrie et dans le chloroplaste mais aussi dans le peroxysome, le
réticulum endoplasmique (RE), la membrane plasmique, la paroi et l'apoplasme (Mhamdi et al.,
2010; Mignolet-Spruyt et al., 2016) (Figure 1.5B). Dans la mitochondrie, la majeure partie de
l'oxygène subit une réduction tétravalente par la cytochrome c oxydase conduisant à la
production de l'eau. Cependant, en laissant fuir des électrons, l'O2 peut être réduit de façon
monoélectronique conduisant à la formation de O2•− (Cadenas and Davies, 2000). Pour les
chloroplastes, les premières entités réactives qui apparaissent sont 1O2 suite à l’excitation de la
chlorophylle associée au PSII, et l’O2•− produit lors du transfert des électrons photosynthétiques
au niveau du PSI (Asada, 2006). Le RE contribue aussi à la formation de O2•− lors du processus
de repliement des protéines (Ozgur et al., 2014) mais aussi lors des réactions de détoxication

19
Tableau 1. Les différents mécanismes responsables de la
production des ROS, leurs localisations ainsi que les types de
ROS générées.

Mécanisme Localisation Type de ROS

Photosynthèse Chloroplaste O2.-
Respiration Mitochondrie O2.-
Glycolate oxydase Peroxysome H2O2
Chlorophylle excitée Chloroplaste O2.-
NADPH oxydase Membrane plasmique O2.-
β-oxydation des acides gras Peroxysome H2O2
Oxalate oxydase Apoplaste H2O2
Xanthine oxydase Peroxysome O2.-
Peroxydase Paroi cellulaire O2.- H2O2
Amine oxydase Apoplaste H2O2
des drogues liposolubles et la neutralisation des xénobiotiques impliquant le cytochrome P450
(Gill and Tuteja, 2010; Kim et al., 2009). Les peroxysomes sont probablement les sites majeurs
de la production d’H2O2, en raison de leur type de métabolisme oxydatif (comme la β-oxydation
des acides gras et la photorespiration par le biais de la glycolate oxydase). Ils produisent
également du O2•− grâce à la xanthine oxydase (del Rio et al., 2006; Mittler, 2002). La
production du •NO chez les animaux se fait par la NO synthase (NOS). L’existence de cette
enzyme dans le règne végétal reste cependant controversée. Pour l’instant, la production de
•
NO chez les plantes reste associée uniquement à l’activité de la nitrate réductase (Planchet et
al., 2005). Les autres sources des ROS qui ne dérivent pas des organites mais localisées au
niveau de la membrane plasmique, la paroi ou l'apoplasme font intervenir les NADPH oxydases,
l’oxalate oxydase, l’amine oxydase et les peroxydases (Bolwell and Wojtaszek, 1997; Mittler,
2002) (Tableau 1).

3.3. Systèmes antioxydants et stress oxydatif

Les ROS sont produites de façon continue dans la cellule et contribuent par plusieurs
processus au maintien de l’homéostasie cellulaire, néanmoins leur concentration doit être
régulée. Une production non contrôlée de ROS peut avoir des effets délétères voire létaux pour
la cellule. Les principales enzymes responsables de la détoxification des ROS sont les
superoxydes dismutase (SOD), les catalases (CAT), les peroxydases (GPX, APX..) et les
peroxyrédoxines. La première enzyme qui intervient dans la détoxification des ROS est la SOD.
Elle produit l’H2O2 à partir de O2•− qui va être à son tour, transformé en H2O sous l’action des
CAT et des peroxydases (Mittler, 2002; Mittler et al., 2004). Pour réduire l’H2O2 en H2O, GPX et
APX oxydent en contrepartie le glutathion et l’ascorbate respectivement. La régénération de ces
molécules antioxydantes se fait grâce aux enzymes GR, MDAR et DHAR (Miller et al., 2010;
Mittler, 2002; Mittler et al., 2004) (Figure 1.6).
Le glutathion et l’acide ascorbique sont des molécules essentielles lors des réactions de
réduction de l’H2O2 mais il existe également d’autres composés non enzymatiques qui
contribuent à la détoxication des ROS comme les tocophérols, les flavonoïdes et les
caroténoïdes (Gill and Tuteja, 2010), ou encore la proline et les polyols (mannitol, sorbitol, myo-
inositol) (Gill and Tuteja, 2010; Shen et al., 1997; Smirnoff and Cumbes, 1989; Trovato et al.,
2008).
La suraccumulation des ROS suite à un déséquilibre entre leur production et leur
détoxication a des effets nocifs sur la cellule et engendre des dommages oxydatifs comme la

20
 SOD CAT

O2.- H2O2 2H2O2 2H2O

2H+ O2 O2
Cycle ascorbate-

APX MDAR DHAR GR

glutathion

H2O2 H2O 2 MDA NAD(P)+ DHA GSSG GSSG GSH

2 Asc 2 MDA NAD(P)H 2 Asc 2 GSH Asc NAD(P)H NAD(P)+
Cycle glutathion

GPX GR

H2O2 2 H2O GSSG GSH

2 GSH GSSG NAD(P)H NAD(P)+

Figure 1.6. Les mécanismes enzymatiques principaux de détoxication des ROS.

SOD: superoxyde dismutase ; CAT: catalase ; APX: ascorbate peroxydase ; Asc:
ascorbate ; MDA: monodéhydroascorbate ; MDAR, MDA réductase ; DHA:
déhydroascorbate ; DHAR: DHA réductase ; GSH: glutathion réduit ; GSSG: glutathion
oxydé GPX: glutathion peroxydase ; GR: Glutathion réductase.
peroxydation des lipides, l’oxydation des protéines, de l’ADN et de l’ARN aboutissant à des
dommages cellulaires inévitables touchant les gènes, l’intégrité de la membrane et le
fonctionnement des protéines. Ces processus qui peuvent même aboutir à la mort cellulaire
sont groupés sous le nom de stress oxydatif (Choudhury et al., 2017; Mittler, 2002; Mittler,
2017) (Figure 1.7).

3.4. Le rôle signalétique des ROS

En dépit de leurs effets délétères pour les biomolécules, les ROS jouent différents rôles
dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et dans la régulation de plusieurs processus
physiologiques et métaboliques (Apel and Hirt, 2004; Laloi et al., 2004). Ils interviennent dans la
protection des plantes contre les pathogènes (Wojtaszek, 1997), l’établissement des symbioses
chez les légumineuses (Santos et al., 2001), la prolifération, la différenciation et la mort
cellulaire (Mittler, 2017), le gravitropisme racinaire (Joo et al., 2001), et la régulation de la
réponse à la carence en macronutriments. Par exemple, la production d’H2O2 dans les racines
d'Arabidopsis joue un rôle dans la régulation de l'expression génique en réponse à la carence
en potassium (Shin and Schachtman, 2004). La carence en N et en P induit également une
accumulation d’H2O2 (Shin et al., 2005). Par ailleurs, la production des ROS et particulièrement
le radical hydroxyl •OH, affecte le transport membranaire de K+ et de Ca2+ chez les plantes
(Demidchik et al., 2010; Demidchik et al., 2003). L’application de molécules détoxifiantes de •OH
comme le mannitol, réduit considérablement cet effet (Cuin and Shabala, 2007). Les ROS
interviennent aussi dans le développement des poils absorbants et la différenciation des
racines. En effet, chez le mutant rhd2, il a été démontré qu’une NADPH oxydase (AtRBOHC)
contrôle le développement des poils absorbants en régulant la croissance de l’apex via
l'activation des canaux calciques (Foreman et al., 2003). Par ailleurs, les concentrations
différentielles de O2•− et d’H2O2 ont été montrées récemment comme impliquées dans le contrôle
de la différentiation du méristème racinaire. Ce gradient de concentration est maintenu par le
facteur de transcription UPB1 qui inhibe l’expression des peroxydases et maintient ainsi un seuil
élevé d’H2O2 nécessaire à l’élongation des cellules et ultérieurement à leur différenciation
(Tsukagoshi et al., 2010). Les ROS participent aussi au maintien des signalisations à longue
distance. En effet, des travaux ont montré que les plantes peuvent médier une communication
systémique consécutive à la blessure. Cette signalisation nécessite une production de ROS
NADPH-oxydase dépendante le long du trajet du signal (Miller et al., 2009). Un dernier exemple
de l’implication des ROS dans l’acclimatation des plantes à l’environnement, est la fermeture

21
 Espèces réactives de l’oxygène

ADN Protéines
Lipides

Oxydation des acides Peroxydation Oxydation des

nucléiques lipidiques groupements
sulfhydriles

Perturbation de l’intégrité Altération des protéines

Altération membranaire, altération systèmes enzymatiques
des gènes fonctionnelle des récepteurs activés/inactivés

Dommages cellulaires

Figure 1.7. Les dommages cellulaires causés par les ROS.

stomatique. En effet, il a été montré qu’un traitement à l'ABA conduit à une accumulation de
peroxyde d’hydrogène qui active des canaux calciques membranaires permettant la fermeture
stomatique (Pei et al., 2000). L’ensemble de ces exemples démontre le rôle des ROS dans
l’acclimatation des plantes à leur environnement. Mais quels sont les mécanismes moléculaires
par lesquels les ROS déclenchent ces réponses ?
Les ROS peuvent effectuer des modifications dans la structure et la fonction des
protéines aboutissant à des changements dans la régulation du métabolisme et de l’expression
des gènes. Parmi les modifications post-traductionnelles liées aux ROS, on trouve la
sulfonylation, la carbonylation, la glutathionylation et la S-nitrosylation (Choudhury et al., 2017).
La sulfonylation et la S-nitrosylation ciblent notamment les groupements thiols (R-SH) des
cystéines qui, en présence d’H2O2, seront oxydés en acide sulfénique (R-SOH) puis en ponts
disulfures (S-S). De la même manière, le •NO est capable lors d’une réaction de S-nitrosylation
de prendre la place du proton du groupement thiol pour former le SNO. Mais d’autres acides
aminés, comme la méthionine, peuvent subir une sulfonylation pour se transformer en
méthionine sulfoxyde. L’oxydation de tryptophane donne naissance à une molécule instable, le
tryptophane hydroperoxyde qui se décompose rapidement en N'-formylkynurénine et
kynurénine. L’acide sulfénique formé par sulfonylation est hautement réactif et peut former des
liaisons covalentes avec le glutathion lors d’une réaction de S-glutathionylation. La
carbonylation touche un large spectre d’acides aminés comme l’arginine, la thréonine, la lysine,
la proline, et l’histidine. Ce dernier, ainsi que la cystéine peuvent également subir une
carbonylation en réagissant avec des produit issus de lipoperoxydation (Choudhury et al., 2017;
Janssen-Heininger et al., 2008).
Ces modifications régulent directement l’activité des protéines cibles comme les FT, les
protéases, les phosphatases et les kinases. Le statut redox de la cellule intervient par exemple
dans la modulation des MAPK qui constituent un système de transduction de signal conservé
chez les eucaryotes. Les MAPK sont connues pour affecter le sort des cellules vers l'apoptose,
la prolifération ou la différenciation (Cuadrado and Nebreda, 2010). Ces kinases sont, en
particulier, capables de moduler l’expression des gènes de défenses comme les PAL et les
protéines PRs et de réguler l’immunité innée chez les plantes (Asai et al., 2002; Nakagami et
al., 2005).

22
4. Les facteurs de transcription

4.1. Généralités
La plupart des processus biologiques sont finement régulés via la modulation de
l’expression des gènes. Ces régulations transcriptionnelles sont directement liées à l’activité des
facteurs de transcription. Les facteurs de transcription sont généralement des protéines
contenant des “DNA-binding domains” (DBD) qui leur permettent de se fixer sur le promoteur
pour réguler l’expression de leurs gènes cibles. Cependant, il existe des protéines régulatrices
qui ne se fixent pas sur l’ADN mais qui interagissent avec ces derniers pour former des
complexes transcriptionnels. Vu qu’ils participent à la régulation de la transcription, ces
protéines sont également qualifiées de facteurs de transcription (Gonzalez, 2015).
À la différence des facteurs de transcription de base (ou généraux) qui se fixent sur les
éléments du promoteur basal comme la boîte TATA, les facteurs de transcription dits
spécifiques reconnaissent des séquences variées situées en amont du promoteur basal
(Gonzalez, 2015; Lee and Young, 2000). La présence de ce genre de séquences est nécessaire
pour la régulation de la transcription parce que i) l’interaction entre les facteurs de transcription
généraux et le promoteur basal n’est pas suffisante pour former un complexe transcriptionnel
stable ii) les facteurs de transcription généraux ne peuvent pas réprimer l’expression des gènes
(Gonzalez, 2015; Stargell and Struhl, 1996; Struhl et al., 1998). Dans tout le reste du manuscrit,
le terme facteur de transcription (FT) fera référence aux facteurs de transcription spécifiques.
Les organismes supérieurs codent jusqu’à des milliers de facteurs de transcription
(~10% des gènes codants des protéines) et chaque FT pourrait réguler des centaines jusqu’à
des milliers de gènes ce qui illustre la complexité des réseaux de régulation des gènes chez les
eucaryotes (Carre et al., 2017; O'Malley et al., 2016; Shiu et al., 2005; Vaquerizas et al., 2009).
Après le séquençage du génome d’Arabidopsis, 1500 FT ont été identifiés puis classifiés
en 30 familles (Riechmann et al., 2000). Des analyses plus détaillées ont par la suite permis
l’identification de plus de 2000 FT. Mais le nombre exact des FT et des familles sur lesquelles ils
sont répartis varient selon les bases de données. PlantTFDB par exemple en compte 58
familles constituées de 2296 FT codés par 1717 gènes (Jin et al., 2017). Le nombre de gènes
par famille varie énormément entre les familles HRT-like et NF-X1 qui contiennent 2 membres
chacune par exemple, et la famille bHLH codant pour 225 FT (Jin et al., 2017). Le règne végétal
contient aussi bien des FT conservés chez tous les eucaryotes que des FT spécifiques des

23
plantes. La famille GARP est un exemple de FT présents uniquement chez les végétaux
(Gonzalez, 2015; Riechmann et al., 2000).

4.2. La famille GARP

Une large partie de mon travail de thèse s’est focalisé sur l'étude de gènes appartenant
à une famille particulière de facteurs de transcription nommée GARP. J’ai eu l'opportunité de
rédiger avec mes encadrants l’article suivant pour le journal Current Opinion in Plant Biology
(Safi et al., 2017), qui présente les détails de cette famille de FT ayant une grande diversité de
fonctions physiologiques et moléculaires.

24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Sup Figure 1.

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34
35
 Supplemental text:
The world according to GARP transcription factors.
Alaeddine Safi, Anna Medici, Wojciech Szponarski, Sandrine Ruffel, Benoît Lacombe, Gabriel
Krouk*.

GARP protein interactions

The activity of TFs depends on DNA binding but also by the interaction with other
proteins; some interesting evidences for GARPs protein-protein interaction are reported in the
literature. The dimerization capacity of PHR1 [28], PHL1 [31] and their orthologues in rice
OsPHR1, OsPHR2, OsPHR3 and OsPHR4 [114] was explained by the presence of a coiled–coil
domain and the disruption of this CC-domain abolishes the DNA binding capacity of PHR1 [28].
Many other GARP TFs show a CC-domain in their amino acid sequences [108]. Thus, GARP
family could be subdivided into two subgroups: subgroup I including Golden2, most of ARR-B,
KAN1 and KAN2 without a coiled–coil domain and subgroup II named GCC (for GARP coiled
coil) including PHR1, APL and Psr1 with a coiled–coil domain [17,108]. Importantly, alternative
splicing of MYR1 and MYR2 in their coiled-coil and/or GARP domains, can affect their
homodimerization, 3D folding, localization and activities [111].
Based on these data, it has been predicted that GARP proteins belonging to subgroup I bind
non-palindromic DNA as a monomer, whereas those of subgroup II bind palindromic sequence
as a dimer [24]. However, Y2H assays have shown that maize Golden2 as well as all GLK
proteins in Arabidopsis and maize can form dimers. This may be due to the presence of the
Golden2 C-Terminal (GCT) box [115]. It is also the case for ARR18 [105].
These findings prompted us to examine the presence of this domain in all Arabidopsis GARP
family members using several coiled-coil domain prediction softwares (Figure 2).
Many TFs of GARP family contain a potential Ser/Thr-Pro motif at the beginning of the α2 helix
(Figure 1A), a regulatory domain involved in the phosphorylation-dependent prolyl isomerization
[116]. Besides their capacity of dimerization, several GARP TFs have been shown to interact
physically with other transcription regulators (Figure 3).
One important GARP TF interactants is the SPX family whose members’ role is mainly the
regulation of Pi homeostasis [117].
In rice, the activity of the AtPHR1 ortholog (OsPHR2) is regulated by the same mechanism via
the interaction with either OsSPX1 or OsSPX2 proteins [30]. The regulation of PHR2 in rice
seems to be more complicated than that in Arabidopsis, since it is not only negatively regulated
in the nucleus (by SPX1 and SPX2), but also in the cytosol by another SPX protein. Indeed,
SPX4 inhibits the translocation of PHR1 from the cytoplasm to the nucleus [118].
This interaction between GARP and SPX proteins is Pi-dependent, which provides evidence to
support that this mechanism forms a Pi-sensing system regulating Pi homeostasis and allowing
plants to adapt to environmental cues [29,30,118]. In Lotus japonicus, IPN2, a GARP TF, is
crucial for nodule organogenesis by transcriptional activation of NIN gene. IPN2 interacts
physically with a GRAS transcription regulator, NSP2, via his coiled coil domain. It was
suggested that these interacting partners form a TF complex in the nucleus to induce the
expression of genes essential for nodule formation and development [119].

36
Several recent studies showed that TFs could regulate gene expression not only by binding to
its specific CRE but also by recruiting histone modifiers [59,120]. For example, HHO4/EFM, a
very close homologous of HRS1, interacts with an H3K36me2 demethylase JMJ30. This
interaction is essential for the binding to the promoter of the FLOWERING LOCUS T (FT) by
both proteins and so for FT repression during the floral transition [59]. FT is also transcriptionally
regulated by APL/FE, another GARP TF which was known to promote phloem differentiation
[56]. And it was suggested that APL/FE could interact with a Jumonji protein to increase FT
transcription via histone modifications [57]. Another homologous of HRS1 called HHO3/HMYB1
has been also shown to control flowering by repressing FT gene. Even if they repress the same
gene, HHO4 and HHO3 have different partners and different mechanisms to control plant
flowering. It turns out that the latter interacts with a HISTONE DEACETYLASE 6 (HDA6) whose
main function is to promote chromatin condensation [110]. Taken together these observations,
may point the fact that HHO proteins could be pioneer transcription factors opening interesting
avenues to understand their molecular dynamics.
Y2H and in vitro binding assays indicated that GLKs can interact with G-box-binding factors
(GBFs). This interaction probably through the Pro-rich region of GBFs could enhance the
transcriptional level of the corresponding target genes [121].
In order to give a complete overview of the protein-protein interactions for the whole GARP
family, we queried Protein-Protein Interaction (PPI) databases with the 56 Arabidopsis GARPs
and built the PPI network provided in Figure 3. Adding all the interactions described in the
literature (red edges) we obtained a more complex network in which almost 35 over the 56
Arabidopsis GARP interact directly or via other nodes. Further analysis need to be performed to
unravel the specificity of these interactions that could be the basis to explain i) the
multifunctionality and the of the GARPs family and II) their role in the cross-talk between nutrient
sensing, hormonal signaling and developmental processes.

Sup Figure 1. Protein motifs discovered by MEME analysis and displayed in Figure 2.

Sup Figure 2. Protein-protein interaction network of Arabidopsis GARP TFs. A compilation of 3

different interactomes [122-124] was queried with the 56 Arabidopsis GARP members (red
nodes). Interacting proteins are represented as light blue nodes in relationship between each
others and GARP TFs. Known interaction from literature
[11,28,29,31,57,59,60,92,105,110,111,115,121,125-144] were manually inserted in the
network using a different color coding (red edges, white nodes).

37
References and recommended reading
of interest , of outstanding interest 

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interacting with a specific cis-element and regulates auxin biosynthesis, transport,
and signaling in opposition to HD-ZIPIII factors. Plant Cell 2014, 26:246-262.
This work makes the nice demonstration of KAN1 is a regulator of auxin biosynthesis, transport
and signaling.

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MYB transcription factor involved in phosphate starvation signaling both in
vascular plants and in unicellular algae. Genes Dev 2001, 15:2122-2133.
29. Puga MI, Mateos I, Charukesi R, Wang Z, Franco-Zorrilla JM, de Lorenzo L, Irigoyen ML,
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Phosphate Starvation Response 1 in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 2014,
111:14947-14952.
This paper (together with ref 30) provides evidences that the SPX1 PHR1 protein partners may
constitute the basis of a Phosphate sensing system. This work is opening exiting
avenues to insvetigate the role of GARPs in nutrient sensing pathways.

30. Wang Z, Ruan W, Shi J, Zhang L, Xiang D, Yang C, Li C, Wu Z, Liu Y, Yu Y, et al.: Rice
SPX1 and SPX2 inhibit phosphate starvation responses through interacting with
PHR2 in a phosphate-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A 2014, 111:14953-
14958.
This paper (together with ref 29) provides evidences that the rice SPX1/SPX2 PHR2 protein
partners may constitute the basis of a Phosphate sensing system. This work is opening
exiting avenues to insvetigate the role of GARPs in nutrient sensing pathways.

31. Bustos R, Castrillo G, Linhares F, Puga MI, Rubio V, Perez-Perez J, Solano R, Leyva A,
Paz-Ares J: A central regulatory system largely controls transcriptional activation
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and FLOWERING LOCUS T INTERACTING PROTEIN 1. Plant J 2015, 83:1059-1068.
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flowering responses to environmental cues in Arabidopsis. Dev Cell 2014, 30:437-
448.

38
This work shows that EFM/HHO4 interacts with the JMJ30 H3K36me2 demethylase to
specifically demethylate an active mark H3K36me2 at FT. This opens interresting
perspectives for the role of GARPs as potential pioneer TFs.

60. Moreau F, Thevenon E, Blanvillain R, Lopez-Vidriero I, Franco-Zorrilla JM, Dumas R, Parcy

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42
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139:1105-1109

43
 A

Figure 1.8. Principe de la technique TARGET (D’après Bargmann et al., 2013).

A) La technique du TARGET consiste à cloner le FT dans un vecteur permettant la
fusion protéique avec le récepteur de glucocorticoïdes (GR). Ce même vecteur est
par ailleurs porteur d’une cassette (35S::RFP) qui sert à trier par FACS les
protoplastes transformés. Avant le tri cellulaire, les protoplastes sont traités (DEX,
CHX, NO3-…). Les ARNs sont par la suite extraits à partir des protoplastes positifs
pour l’étude d’expression des gènes.
B) La fusion FT-GR interagit avec une HSP qui la séquestre dans le cytoplasme.
Le DEX provoque un changement conformationnel du GR permettant ainsi sa
libération de la HSP et l’entrée du complexe FT-GR dans le noyau. En présence
de CHX (cycloheximide), le traitement par le glucocorticoïde permet de déterminer
quelles sont les cibles directes du facteur de transcription étudié.
4.3. Études des facteurs de transcription: détails sur le
TARGET
Une des approches menées en routine par l’équipe, ainsi que par le laboratoire du Pr
Coruzzi (NYU), s’articule autour de la technique appelée TARGET (Bargmann et al., 2013).
Cette technique permet d'élucider les cibles étant directement régulées par un facteur de
transcription donné, à la difference du Chip-Seq (Johnson et al., 2007), Y1H (Bonaldi et al.,
2017), EMSA (Hellman and Fried, 2007), DAP-seq (O'Malley et al., 2016) qui mesurent la
capacité de fixation d’un facteur de transcription (Para et al., 2014). L’approche TARGET
consiste à cloner le facteur de transcription dans un vecteur permettant la fusion protéique
avec le récepteur de glucocorticoïdes (GR) de rat. Ce même vecteur est par ailleurs porteur
d’une cassette (35S::RFP) qui permet la sélection par FACS (Fluorescent Activated Cell
Sorter) des protoplastes ayant subi un événement de transformation (Figure 1.8A). La fusion
FT-GR interagit dans le cytoplasme des cellules végétales avec une HSP qui la séquestre
dans ce compartiment cellulaire. Ce n’est qu’en présence de glucocorticoïde que le GR
opère un changement conformationnel qui autorise l’entrée de FT-GR dans le noyau. En
présence de cycloheximide (inhibiteur de la traduction), le traitement par le glucocorticoïde
permet de déterminer quelles sont les cibles primaires du facteur de transcription étudié
(Figure 1.8B). La combinaison de cette technique avec une étude de l’expression du génome
rend possible la détermination des cibles du facteur de transcription considéré. Par l'étude
des cibles directes et régulées d’un facteur de transcription donné (comme par exemple
l’enrichissement des fonctions des gènes de ces listes), il a été montré qu’il est possible de
déterminer le(s) rôle(s) in planta du facteur de transcription considéré. Par exemple, les
cibles du facteur de transcription ABI3 (impliqué dans la signalisation de l’acide abscissique
(Koornneef et al., 1989; Monke et al., 2012)) comportent à la fois des gènes essentiels à la
réponse des plantes à cette hormone, mais aussi des gènes responsables de la germination
des graines. Si ABI3 avait été un facteur de transcription dont on ne connaissait pas la
fonction, il aurait été possible de la prédire (Bargmann et al., 2013).
C’est ce principe que l'équipe a appliqué à certains facteurs de transcription dont la
fonction était inconnue et qui avaient pour caractéristique d’être très fortement et très
rapidement régulés par le nitrate (voir dessous).
C’est dans cette logique que mon travail de thèse s’inscrit. Pour la famille NLP, j’ai
été impliqué dans l’étude de TARGET elle-même car des données de ce type n’étaient pas
disponibles au commencement de ce travail. Pour les gènes HHOs appartenant à la famille
des GARPs, les données de TARGET étaient disponibles et mon travail a consisté à élargir

44
les connaissances sur le rôle in planta de ces facteurs de transcription. Les objectifs détaillés
concernant les 2 familles sont exposés ci-dessous.

5. Objectifs du travail
Comme l’introduction bibliographique a pu le mettre en avant, outre son rôle de
source majeure d'azote, il est maintenant clairement établi que le NO3- intervient aussi en
tant que molécule signal régulant entre autres de nombreux processus physiologiques et
développementaux de la plante (Chapitre 1, Parties 1-4). Ces régulations passent en
particulier par la reprogrammation NO3--spécifique du transcriptome qui peut toucher des
milliers de gènes (Canales et al., 2014; Krouk et al., 2010b; Medici and Krouk, 2014; Wang
et al., 2004).
Du fait de ces reprogrammations massives du transcriptome, les facteurs de
transcription sont donc des objets d'étude centraux pour comprendre la réponse des plantes
au nitrate et sont, de fait, l’objet d'étude de ma thèse.
Par ailleurs, les mécanismes de réponses aux différentes voies de signalisation liées
à l’azote/NO3- (décrites précédemment, PNR et NSR entre autres) sont loin d'être
complètement caractérisées (Krouk, 2017; O'Brien et al., 2016; Undurraga et al., 2017).
Mon projet de thèse consistait donc à étudier des facteurs de transcription (FT)
impliqués en amont et/ou en aval de la transduction des signaux associées à l’azote en
général et au NO3- en particulier de manière à i) élucider et préciser leurs rôles dans ces
voies de signalisation (identification de cibles directes par la technique TARGET), ii) révéler
d'éventuels “cross-talks” avec d’autres voies de signalisation.
En effet, il est maintenant évident que les signalisations ne sont pas des voies
indépendantes et que des mécanismes croisés sont à l’œuvre (voir introduction sur les
interactions N/P par exemple).
Les deux familles de FT qui ont été étudiées durant cette thèse sont :
i) la famille NLP (NIN-Like Proteins ; en collaboration avec l’équipe du Dr Anne Krapp,
Versailles France, et le laboratoire du Pr Coruzzi, New York USA) ; en particulier NLP7.
ii) et la sous-famille HRS1/HHOs appartenant à la grande famille des GARPs.

5.1. Objectifs de l’étude du rôle des NLPs dans la

transduction du signal nitrate
Les NIN-Like Proteins (NLPs) se sont révélées être des régulateurs centraux de la
signalisation du nitrate (§ 1.6.1). Des expériences de ChIP-chip ont montré que NLP7 est

45
Figure 1.9. Alignement des séquences protéiques de PHR1 et HRS1.
Les acides aminés identiques sont marqués en bleu et le résidus similaires en
vert. La séquence ΔPHR1 (aa 208–362) responsable de l’interaction de PHR1
avec SPX1 (Puga et al., 2014) est encadrée en rouge. Cette séquence
contient une partie très conservée entre les deux protéines (aa 217-288).
capable de se fixer au promoteur de 851 gènes en réponse au nitrate (Marchive et al., 2013).
De manière intéressante, parmi cet ensemble fixé par NLP7, il existe des gènes impliqués
dans le métabolisme de l’azote et/ou impliqués dans la réponse des plantes au nitrate
comme ANR1 (Zhang and Forde, 1998), LBD37/38 (Rubin et al., 2009), CIPK8 et NRT1.1
(Hu et al., 2009). Cependant, il est connu que la fixation d’un facteur de transcription à un
promoteur ne garantit pas que ce dernier régule directement sa cible (Para et al., 2014).
Dans cette optique, l’objectif de cette partie de mon travail était d’identifier, par
l’approche TARGET, les cibles directes et indirectes de certains FTs de la famille NLP
(NLP7, NLP6 et NLP2), d’étudier leur rôle dans la perception du nitrate et dans la régulation
des réseaux de gènes impliqués dans cette signalisation. Ce travail s’est fait en étroite
collaboration avec le laboratoire de l’IJPB (Versailles) et l'université de New York.

5.2. Objectifs de l’étude des facteurs de transcription de

la sous-famille HRS1/HHO

5.2.1. Étude de l'interaction SPX/HRS1, un carrefour entre la voie de

transduction du phosphate et celle du nitrate?
Récemment, il a été mis en évidence que SPX1 et PHR1 (Facteur de transcription
contrôlant la réponse à la carence en Pi) interagissent physiquement et forment un complexe
vraisemblablement capable de percevoir le Pi (Puga et al., 2014; Qi et al., 2017). Donc, il est
possible que le complexe PHR1/SPX1 forme un système de perception (senseur) de Pi.
Dans ce cadre, il est important de noter que HRS1 et PHR1 appartiennent à la même famille
de FT. De manière remarquable, leur homologie la plus forte est sur le domaine protéique de
PHR1 ayant servi à l’identification de son interaction avec SPX1 (Puga et al., 2014) (Figure
1.9).
Un des objectifs de ma thèse était alors de valider l'hypothèse selon laquelle, HRS1
pourrait interagir avec les protéines SPX pour former un complexe impliqué dans la
perception du NO3-, du PO43- ou de la combinaison des deux signaux.

5.2.2. Rôle des facteurs de transcription de la famille HHO dans la

réponse des plantes au N
Des études transcriptomiques ont montré que HRS1 est induit de manière très
précoce et très fortement par la fourniture de NO3-, ce qui a fait de lui un marqueur de la
réponse des plantes aux NO3- (Krouk et al., 2010b). Dans l'équipe, les analyses de TARGET
d’HRS1 ont permis de dresser une liste des gènes cibles de ce FT (Medici et al., 2015). De

46
Figure 1.10. Reconstruction 3D réalisée au microscope confocale
sur la racine primaire de plantes HRS1-GFP.
Les flèches blanches correspondent au signal nucléaire de la GFP et les
flèches rouges représentent les signaux vert non nucléaires (Medici et
al., 2015).
manière intéressante, les gènes directement induits par HRS1 contiennent un nombre
important de gènes impliqués dans la réponse des plantes au phosphate. Cette observation
fut une clé pour la démonstration du rôle d'HRS1 dans le contrôle de la croissance des
plantes en réponse à une combinaison NO3-/PO43- (Medici et al., 2015). Outre son rôle dans
la régulation de la croissance racinaire, de nombreuses autres fonctions semblent sous le
contrôle direct de cette protéine.
Dans la partie résultat correspondante (Chapitre 4), je montrerai que l'étude des
autres cibles directes d’HRS1 a permis d'identifier un rôle important de ce FT dans la
réponse des plantes à la carence en azote et aux ROS, et leur effets croisés (Safi,
submitted).

5.2.3. Quel rôle pour la forme non nucléaire d’HRS1?

Dans le but d'étudier le rôle d'HRS1 in planta Medici et al. (Medici et al., 2015) ont
mis en place des lignées transgéniques exprimant une protéine de fusion HRS1:GFP sous le
contrôle du promoteur natif pHRS1. Les résultats d'imagerie ont montré que ce FT n'est pas
seulement localisé dans le noyau des poils absorbants, des cellules épidermiques et
corticales de la zone d'élongation des racines mais aussi dans des compartiments cellulaires
intra-cytoplasmiques (Figure 1.10). Par ailleurs, il s'est avéré grâce aux expériences de
TARGET qu'il existe des gènes plastidiaux qui semblent être régulés directement par HRS1.
Par conséquent, j’avais comme premier objectif de démontrer que les compartiments
cellulaires marqués par la GFP pourraient être des plastes et de commencer à caractériser
le rôle d’HRS1 dans ces compartiments cellulaires non-nucléaires.

En conclusion de cette partie, l’ensemble de ces objectifs avait pour but commun de
progresser dans la compréhension de la réponse des plantes aux nutriments et en particulier
au NO3-. Mes résultats ont permis de consolider certains aspects de cette compréhension et
d’en identifier de nouveaux. Ceci ouvre en particulier la voie à l'amélioration de la nutrition
des plantes comme les chapitres résultats suivants vont tenter de l’illustrer.

47
Chapitre 2 : Matériels et Méthodes

48
 Tableau 2.1. Liste des différentes lignées utilisées
(1) Medici et al., 2015; (2) Lignée créée dans l’équipe;
(3) Lignée créée pendant la thèse; (4) Ishida et al., 2008.

Fond Origine et
Lignées Détails
génétique références
(1)
hrs1-1 Col-0 Mutant d’insertion de T-DNA (SALK_067074)
(1)
hho1-1 Col-0 Mutant d’insertion de T-DNA (SAIL_28_D03)
(2)
hho2-1 Col-0 Mutant d’insertion de T-DNA (SALK_070096)
(2)
hho3-1 Col-0 Mutant d’insertion de T-DNA (SALK_146833)
(1)
hrs1;hho1 Col-0 Double mutant issu du croisement hrs1-1 x hho1-1
(2)
hrs1;hho1;hho2 Col-0 Triple mutant issu du croisement hrs1;hho1 x hho2-1
(2)
hrs1;hho1;hho2;hho3 Col-0 Quadruple mutant issu du croisement hrs1;hho1;hho2 x hho3-1
Lignée sur-exprimant le gène HRS1 sous contrôle du promoteur
35S:HRS1 Col-0 (2)
pCaMV35S.
Lignée sur-exprimant le gène HHO1 sous contrôle du promoteur
35S:HHO1 Col-0 (2)
pCaMV35S.
Lignée exprimant HRS1 fusionnée à celui de la GFP sous le contrôle de son
pHRS1:HRS1:GFP Col-0 (3)
propre promoteur.
Lignée exprimant la DsRed fusionnée à un peptide d’adressage aux
CT-DsRed Ws (4)
chloroplastes
pHRS1:HRS1:GFP;
Col-0/Ws Lignée issue du croisement des deux dernières lignées. (3)
CT- DsRed
Lignée exprimant la mCherry fusionnée à un peptide d’adressage aux
PTS:mCherry Col-0 (3)
chloroplastes
pHRS1:HRS1:GFP;
Col-0 Lignée issue du croisement pHRS1:HRS1:GFP x PTS:mCherry. (3)
PTS:mCherry
hrs1;hho1;hho2;hho3; Lignée exprimant HRS1:GFP sous contrôle de son propre promoteur dans
Col-0 (3)
pHRS1:HRS1:GFP le fond génétique du quadruple mutant.
Lignée exprimant HRS1 fusionnée à la GFP sous le contrôle de son propre
NLS:HRS1:GFP Col-0 (3)
promoteur ayant une séquence de localisation au noyau en N-ter.
Lignée exprimant HRS1 fusionnée à la GFP sous le contrôle de son propre
PTS:HRS1:GFP Col-0 (3)
promoteur ayant une séquence de localisation au plastes en N-ter.
Lignée exprimant HRS1 fusionnée à la GFP dont le codon d’initiation a été
mut ATG:HRS1:GFP Col-0 muté en GTG ayant par conséquence une délétion de 7 acides aminés en (3)
N-ter d’HRS1.
hrs1;hho1;hho2;hho3; Lignée exprimant NLS:HRS1:GFP dans le fond génétique du quadruple
Col-0 (3)
NLS:HRS1:GFP mutant.
hrs1;hho1;hho2;hho3; Lignée exprimant PTS:HRS1:GFP dans le fond génétique du quadruple
Col-0 (3)
PTS:HRS1:GFP mutant.
hrs1;hho1;hho2;hho3; Lignée exprimant mut ATG:HRS1:GFP dans le fond génétique du quadruple
Col-0 (3)
mut ATG:HRS1:GFP mutant.
1. Lignées et souches utilisés
La plante modèle Arabidopsis thaliana a été utilisée pour l’ensemble des expériences
réalisées au cours de la thèse. Les détails des différentes lignées utilisées ainsi que leurs
écotypes respectifs sont résumés dans le tableau 2.1. Les lignées homozygotes des
différents génotypes ont été criblées par PCR.
Les bactéries utilisées sont Agrobacterium tumefaciens (GV3101) et différentes
souches d’Escherichia coli: Top 10 (Invitrogen™), DH5α (Invitrogen™), Rosetta™ 2(DE3)
pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany) (Tableau 2.2).

2. Constructions moléculaires pour

l’obtention des plantes transgéniques
Les lignées sur-exprimant HRS1 et HHO1 ont été obtenues en clonant leurs
séquences codantes dans le vecteur pMDC32 contenant un promoteur 35S du CaMV
(Medici et al., 2015). Pour créer les lignées pHRS1:HRS1:GFP, la séquence génomique
d’HRS1 comprenant 3 Kb de région promotrice a été amplifiée par PCR et clonée dans le
vecteur pMDC107 (Curtis and Grossniklaus, 2003; Medici et al., 2015). Cette construction a
été utilisée pour créer les lignées NLS et PTS par Ω-PCR et mut-ATG par mutagenèse
dirigée (Chen et al., 2013), en utilisant les amorces référencées dans le tableau 2.3. La
cassette PTS:mCherry a été construite en clonant, en amont du gène de la mCherry, la
séquence de transit de la petite sous-unité de la Rubisco dans le vecteur pBIN20 (Nelson et
al., 2007). De manière similaire, le peptide de transit de RECA (AT1G79050) a été fusionné
à la DsRed en utilisant le vecteur pBI121 (Ishida et al., 2008).

2.1. Clonage
L’ensemble des clonages a été basé sur l’utilisation du système Gateway® (Life
Technologies). La séquence codante du gène est amplifiée par PCR en utilisant des ADNc
comme matrice et cloné dans un vecteur d’entrée (pENTR ou pDONR). La CDS est ensuite
transférée par recombinaison dans un vecteur de destination. C’est ce dernier qui est utilisé
dans les expériences (transformation des plantes, TARGET, production de protéines). Après
chaque étape de clonage, des vérifications sont réalisées par PCR et séquençage. Les
différentes amorces utilisées dans le clonage sont listées dans le tableau 2.4.

49
 Tableau 2.2. Liste des différents vecteurs et souches bactériennes utilisés

Type de Résistance Résistance

Gène/clone Détails Vecteur Bactérie
ransformation du plasmide de bactérie
NLP7 ATG_STOP pDEST15 Rosetta thermique Amp Chl
NLP7 ATG_STOP pBeacon_RFP_GR Top 10 thermique Amp
SPX4 CACC-ATG_STOP pENTR D-TOPO Top 10 thermique Kan
SPX4 attL1-ATG_STOP-attL2 pDONR 207 Top 10 thermique Gen
SPX4 attB1-ATG_STOP-attB2 pDEST15 Rosetta thermique Amp Chl
CD3-999 plastid-mCherry marker pt-rk Top 10 commandé Kan
CD3-999 plastid-mCherry marker pt-rk Agrobactérie électrique Kan Gen/Rif
HRS1:GFP p3kHRS1:HRS1:GFP pMDC107 TOP10 électrique Kan/Hyg .
HRS1 ATG_STOP pBeacon_RFP_GR DH5 α électrique Amp
mut ATG
p3kHRS1:HRS1:GFP pMDC107 DH5 α électrique Kan/Hyg .
HRS1:GFP
PTS:HRS1:GFP p3kHRS1:PTS:HRS1:GFP pMDC107 DH5 α électrique Kan/Hyg .
NLS:HRS1:GFP p3kHRS1:NLS:HRS1:GFP pMDC107 DH5 α électrique Kan/Hyg .
mut ATG
p3kHRS1:HRS1:GFP pMDC107 Agrobactérie électrique Kan/Hyg Gen/Rif
HRS1:GFP
PTS:HRS1:GFP p3kHRS1:PTS:HRS1:GFP pMDC107 Agrobactérie électrique Kan/Hyg Gen/Rif
NLS:HRS1:GFP p3kHRS1:NLS:HRS1:GFP pMDC107 Agrobactérie électrique Kan/Hyg Gen/Rif
HRS1:GFP p3kHRS1:HRS1:GFP pMDC107 Agrobactérie électrique Kan/Hyg Gen/Rif
2.2. Oméga PCR
L’Oméga PCR est caractérisée par l’utilisation de longues amorces chimériques dites
« mégaprimers » (Chen et al., 2013). Les « mégaprimers » destinés à l’insertion ou à la
substitution sont constituées d’une partie identique à la matrice à amplifier et d’une autre
partie qui contient les modifications souhaitées. Pour la délétion, les mégaprimers sont
formés des 2 séquences flanquantes du fragment à déléter. Contrairement aux mégaprimers
utilisés pour les constructions mut ATG, NLS et délétion qui ont été commandés
(EUROFINS), ceux de PTS ont été amplifiés par PCR classique. La liste des amorces
utilisées est résumée dans le tableau 2.3.
Le vecteur pMDC107 contenant la cassette pHRS1:HRS1:GFP (Medici et al., 2015) a
servi de matrice pour les différentes réactions d’Ω-PCR. Une ADN polymérase à haute-
fidélité (Phusion, Thermo Scientific™) a été utilisée suivant ce programme : 98 °C pendant
30 sec, 5 cycles à 98 °C pendant 30 sec, 52 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 5-10 min, 15
cycles de 98 °C pendant 30 sec, 55 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 5-10 min suivis d’une
dernière incubation à 72 °C pendant 10 min. Le produit PCR subit ensuite un traitement par
DpnI (Promega) à 37 °C pendant 4 h. DpnI est une enzyme de restriction qui reconnaît une
séquence palindromique omniprésente (5’-GmeATC-3’). Ce site de restriction n’est clivé que
s’il porte une méthylation. Etant donné que les plasmides sont naturellement méthylés dans
les bactéries, le vecteur d’origine sera dégradé par l’enzyme et seulement le plasmide néo
synthétisé par PCR sera introduit dans des bactéries compétentes.

2.3. Transformation des bactéries

La transformation des bactéries est réalisée suivant les recommandations du
fournisseur. 10 à 100 ng de plasmide sont ajoutés aux bactéries compétentes qui, après
avoir subi un choc thermique ou électrique sont reprises dans 200 μl de SOC (Sigma
Aldrich). Après 1h d’incubation à 37 °C (30 °C pour les Agrobactéries) sous agitation (200
rpm), la solution bactérienne est étalée sur boîtes de LB supplémentées d’antibiotiques
appropriés. Les boîtes de Pétri sont par la suite incubées une nuit à 37 °C.
La liste des différents vecteurs ainsi que des souches de bactéries utilisés est résumée dans
le tableau 2.2.

2.4. Extraction des plasmides et séquençage

Plusieurs colonies issues du clonage sont séparément mises en culture dans 5 ml de
LB contenant les antibiotiques de sélection afin d’isoler les clones recombinants. Après une
nuit d’incubation à 37 °C, les bactéries sont culottées. L’extraction des plasmides se fait

50
 Tableau 2.3. Liste et détails des méga-primers utilisés en Ω-PCR

Sens Taille
Amorces Séquence (5'-3') Tm (°C)
(pb)

mut ATG F TAAGTCCCTAAAGTATCATCGTGATTAAAAAGTTCAGCAATATGG 45 68,5

R CCATATTGCTGAACTTTTTAATCACGATGATACTTTAGGGACTTA 45 68,5

mut ATG2 F GTGATTAAAAAGTTCAGCAATGTGGATTACAACCAGAAACGAGAG 45 70.3

R CTCTCGTTTCTGGTTGTAATCCACATTGCTGAACTTTTTAATCAC 45 70.3

GGATTAAAATTAAGTCCCTAAAGTATCATCATGCAGCCAAGCCTGAAACGTATGAAGATTCAGCCC
NLS F TCCTCCCAACCGATTAAAAAGTTCAGCAATATGGATTAC 105 > 75

GTAATCCATATTGCTGAACTTTTTAATCGGTTGGGAGGAGGGCTGAATCTTCATACGTTTCAGGCTT
R 105 > 75
GGCTGCATGATGATACTTTAGGGACTTAATTTTAATCC

PTS F GGATTAAAATTAAGTCCCTAAAGTATCATCATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCTGCAGC 59 75

R GTAATCCATATTGCTGAACTTTTTAATGCTCAAATCAGGAAGGTATGAG 49 70,3

Délétion F GATTAAAATTAAGTCCCTAAAGTATCATCCCGGAGATGACGACGGAGAATATGTACGG 58 > 75

R CCGTACATATTCTCCGTCGTCATCTCCGGGATGATACTTTAGGGACTTAATTTTAATC 58 > 75
grâce au kit GenElute HP plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich). L’ADN plasmidique est repris
dans 100 μl d’eau et dosé à 260 nm (NANODROP 1000 spectrometer, Thermo Scientific,
Wilmington, USA) et ensuite envoyé à séquencer (EUROFINS).

2.5. Transformation des plantes

Les vecteurs contenant les différentes constructions ont été introduits dans
Agrobacterium tumefaciens (GV3101). Ces dernières sont utilisées par la suite dans la
transformation des plantes d’Arabidopsis par « floral dip » (Zhang et al., 2006). En bref,
après 20 h d’incubation à 30 °C, les Agrobactéries transformées sont centrifugées 5 min à
5000 rpm et reprises dans une solution de trempage (5 % saccharose, 0.02 % SILWET L-
77). Les hampes florales sont trempées dans ce mélange pendant 90 secondes. Les plantes
sont par la suite couvertes de sacs en plastiques pendant 24 h. Les graines issues de cette
transformation (T0) sont criblées in vitro en présence des antibiotiques appropriés puis par
PCR.

2.6. Croisement des plantes

Des plantes cultivées en serre pendant 5 semaines sont utilisées pour le croisement.
Les sépales, les pétales et les anthères sont enlevés afin de faire apparaître le stigmate sur
lequel le pollen d’une autre plante sera déposé. Les siliques mûres sont récoltées
individuellement et les graines sont criblées par la technique appropriée.

2.7. Extraction de l’ADN génomique

Des feuilles de plantes cultivées en serre sont récoltées dans des tubes de 2 ml
contenant une bille en acier et congelées dans l’azote liquide. Les échantillons sont broyés
au broyeur à bille (Broyeur Retsch® Mixer Mills MM400, 25 agitation.s-1, 1 min). 500 μl de
tampon CTAB (20 g.l-1 Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA
pH 8, 100 mM Tris pH 8) sont ajoutés à la poudre. Les tubes sont mis sous agitation durant 5
min, incubés pendant 30 min à 60 °C et centrifugés 10 min à 14000 g. Le surnageant est
transféré dans un tube de 1,5 ml auquel sont ajoutés 500 μl de chloroforme/alcool
isoamylique (24/1). Après homogénéisation et centrifugation 10 min à 14000 g, le
surnageant est transféré dans un tube de 1,5 ml contenant 500 μl d’isopropanol pour
précipitation des acides nucléiques. Une nouvelle centrifugation (10 min, 14000 g) permet
alors de culotter l’ADN. Le culot est rincé 2 fois à l’éthanol 70 % et séché. Il est à la fin repris
dans 40 μl d’eau stérile.

51
Tableau 2.4. Liste et détails des amorces utilisées pour le clonage et le séquençage

Taille Tm
Amorce Séquence (5’-3’)
(pb) (°C)

Primer GR GCTGAAATCATCACTAATCAGATACC 26 60.1

Primer GR 2 CATGCATGAGGTGGTTGAGA 20 57.3

Seq pBOB GCGGACTCTAGCATGGCCGCGGG 23 71.3

Plastid TS GCATGGCTTCCTCAGTTCTTTCC 23 62.4

Seq pHRS1 CAAAATACTGATCCTAGAGGCC 22 58.4

GST F seq GGTGATCATGTAACCCATCCTG 22 60.3

M13 rev (-29) CAGGAAACAGCTATGACC 18 53.7

M13 uni (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT 18 53.7

pEntr attL1 F TCGCGTTAACGCTAGCATGGAT 22 60.3

pEntr attL2 R ACATCAGAGATTTTGAGACACGGGC 25 63

T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20 53.2

T7 rev GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG 22 62.1

Primer pD207 F CGCGTTAACGCTAGCATGGATCTCGGGC 28 71

Primer pD207 R CGGGCCAGAGCTGCAGCTGGATGGC 25 72.8

NLP2 F CACCATGGAAGGTGGTCGTGGTGGTGG 27 71
NLP2 R TTATAACGAGGGACCAAGACCGATGC 26 64.8

NLP2 F2 CTCTGTCTGCGACCCTTCAGCAGG 24 67.8

NLP2 R2 CCTGCTGAAGGGTCGCAGACAGAG 24 67.8

NLP6 F CACCATGGAACTTGACGACTTGGATCTCAGC 31 69.5

NLP6 R TCACAAGCACATCATAGTTTCCTCTGAGC 29 65.3

NLP6 F2 CTCTGTCTGCGACCCTTCAGCAGG 24 67.8

NLP6 R2 CCTGCTGAAGGGTCGCAGACAGAG 24 67.8

NLP7 F CGACCAAGAGCAAGATTTGCTGTTGGG 27 66.5

NLP7 R CCCAACAGCAAATCTTGCTCTTGGTCG 27 66.5

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAAGGTGG
attB1 NLP2 F 56 > 75
TCGTGGTGGTGGAG
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATAACGAGGG
attB1 NLP2 R 55 > 75
ACCA AGACCGATG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGAACTTGAC
attB1 NLP6 F 56 > 75
GAC TTGGATCTCA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACAAGCACATC
attB1 NLP6 R 55 > 75
ATA GTTTCCTCT
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAG
attB1 SPX1 F 71 > 75
AACC ATGAAGTTTGGTAAGAGTCTCAGCA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTGGCTTCT
attB1 SPX1 R 55 > 75
TGC TCCAACAAT
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAG
attB1 SPX2 F 71 > 75
AACC ATGAAGTTCGGCAAGAGCCTAAGCA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATTTCGCTACT
attB1 SPX2 R 55 > 75
TGT TCAAGGACA
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAG
attB1 SPX3 F 71 > 75
AACC ATGAAGTTTGGAAAGAGGATTAAAG
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATGGAATAGG
attB1 SPX3 R 55 > 75
AATC GGAGAAGAT
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAG
attB1 SPX4 F 71 > 75
AACC ATGAAATTCGGCAAAGAGTTTCGTA
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTGGGAAGG
attB1 SPX4 R 55 > 75
TCCA GTATCTTCC
2.8. PCR
Les différentes réactions PCR ont été effectuées dans un Thermocycleur 2720
(Applied BiosystemsMC). L’amplification est réalisée grâce à une ADN polymérase (Gotaq®
DNA polymerase, Promega, ou Phusion, Thermo Scientific™ pour les versions à haute
fidélité) suivant les recommandations des fournisseurs. Après une phase initiale de
dénaturation à 95 °C pendant 5 min, l’amplification est réalisée en 35 cycles (1 min à 95 °C,
30 sec à 55°C et 1 min/Kb à 72 °C) suivie d’une phase finale d'extension de 10 min à 72 °C.
Le produit PCR est ensuite analysé par électrophorèse. La migration (30 min à 100 V) se fait
sur gel d’agarose 1 % dans du TAE 1X. La liste des amorces utilisées est illustrée dans les
tableaux 2.4 et 2.5.

3. Conditions de culture et traitements

3.1. Culture en serre

L’amplification des graines est réalisée en serre. Les plantes sont soumises à un
cycle jour/nuit de 16h/8h de 23 °C/21 °C. L’hygrométrie n’est pas contrôlée. Lorsque la
luminosité externe n’est pas suffisante, l’éclairage est maintenu à 150 μmol photon.m -2.s-1
grâce à des lampes à vapeur de sodium. Le substrat utilisé pour la culture est le terreau
Neuhaus huminsubstrat® (Klasmann-Deilmann, Allemagne). Les plantes sont sub-irriguées
à l'eau du robinet une à deux fois par semaine.

3.2. Cultures hydroponiques

Les expériences réalisées en hydroponie ont été basées sur la méthode décrite par
(Conn et al., 2013). Les bouchons des tubes Eppendorf noirs sont percés et remplis d’agar
0.5 % p/v (Figure 2A). Les graines sont ensuite déposées sur l’agar, incubées 2 jours à 4°C
à l'obscurité. Après une semaine d’incubation dans l’eau du robinet, les plantules sont
transférées sur un milieu de culture composé de 1 mM KH 2PO4, 1,5 mM MgSO4, 0,25 mM
K2SO4, 3 mM CaCl2, 0,1 mM Na-Fe-EDTA, 30 μM H3BO3, 5 μM MnSO4, 1 μM ZnSO4, 1 μM
CuSO4, 0,1 μM (NH4)6Mo7O24, 5 μM KI, 0,5 g.l-1 MES et 0,5 mM NH4NO3. Le pH est ajusté à
5,7 avec du KOH 1 M. Les plantes sont cultivées pendant 5-6 semaines (selon l’expérience)
dans les conditions suivantes : cycle jour/nuit 8 h/16 h, 23 °C/21 °C, intensité lumineuse 260

µmol photons.m−2.s−1 et humidité relative 70 %. Elles sont par la suite transférées sur le

52
 Tableau 2.5. Liste des amorces utilisées pour le criblage plantes

Taille Tm
Gène Amorce Séquence (5’-3’)
(pb) (°C)

HRS1 HRS1-ATG ATGATTAAAAAGTTCAGCAATATGGATTACAACC 34 62.2

AT1G13300 HRS1-STOP TTAATTATTCTTGACGTAATGATTACGGGTAGAA 34 62.2

HHO1 HHO1-ATG CACCATGATCAAGAACTTAAGTAATATGAAG 31 61.6

AT3G25790 HHO1-STOP TTATGATATTATTTTTGCATCTTTCGTC 28 56.3

HHO2 HHO2-ATG CACCATGGTGGAGATGGATTACGCTAAGAAAATG 34 68.3

AT1G68670 HHO2-STOP TTATGACACAGGAGTAGAAGTATTTGTATTTG 32 61.8

HHO3 HHO3-ATG CACCATGATGTTCAAGAGCGGTGACATGGATTAC 34 69.5

AT1G25550 HHO3-STOP TTATGAAAGAGGAAGAAGGTGTGGTGTGTG 30 65.4

Clathrine CLA-F AGCATACACTGCGTGCAAAG 20 57.3

AT4G24550 CLA-R TCGCCTGTGTCACATATCTC 20 57.3

Rbohc rbohc_LP ACAGGGCTACGCCTGTATTG 20 55

At5g51060 rbohc_RP GTCCGGAGCTTACTTTGCTG 20 55

rbohc_LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC 19 52.4

rbohc_LP2 TCTAAGACCACGGTACCATCG 21 52.4

rbohc_RP2 CGAGCTTAAGCGTTTGACATC 21 47.6

Rbohb rbohb_LP TCCAAATTTGGACATTGCATAG 22 54.7

AT1G09090 rbohb_RP AGCTTGGACTTGGTCCTTAGC 21 59.8

rbohb_LB3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC 34 64

DsRED DsRED F CTCCTCCGAGAACGTCATCACCGAG 25 67.9

DsRED R CCGTCCTTCAGCTTCAGGGCC 21 65.7
 15
même milieu avec ou sans azote (1 à 3 semaines pour l’influx de NO3- et 6h pour le dosage
des ROS).
Le milieu est renouvelé tous les 4 jours tout au long de l’expérience et puis 24h avant la
récolte des tissus (Figure 2B).

3.3. Cultures in vitro

La culture in vitro des plantes est réalisée en conditions axéniques comme décrit
précédemment (Gifford et al., 2008; Krouk et al., 2010b). Les paramètres des chambres de
culture sont: cycle jour/nuit de 16h/8h, intensité lumineuse de 65 µmol photons.m -2.s-1,
température de 22°C.
Les graines sont stérilisées par agitation pendant 8 min dans une solution de
stérilisation contenant 50 % d’éthanol, 12,5 % de javel et 37,5 % H 2O (v/v). Elles sont
ensuite lavées 5 fois avec l’éthanol absolu et séchées sous hotte à flux laminaire.

3.3.1 Culture en Phytatrays™ (hydroponie stérile)

Les graines stériles, sont semées à la volée sur des mailles de nylon (Nitex 03-
250/47 mesh) soutenues par un support en plastique pour permettre aux racines de pousser
dans des Phytatrays™ stériles contenant 250 ml de milieu de culture liquide autoclavé
(Figure 2C). Ce dernier est composé de : 1 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 0,25 mM K2SO4, 3
mM CaCl2, 0,1 mM Na-Fe-EDTA, 30 µM H3BO3, 5 µM MnSO4, 1 µM ZnSO4, 1 µM CuSO4,
0,1 µM (NH4)6Mo7O24, 5 µM KI, 1 g.l-1 Saccharose, 0,5 g.l-1 MES. Le pH est ajusté à 5,7
avec du KOH 1 M. Ce milieu est complété par 0,5 mM de NH4NO3 comme source d'azote.
Deux semaines après le semis, les plantes sont transférées dans un milieu frais avec ou
sans N (0,5 mM de NH4NO3). Les plantes qui sont dépourvues d’azote ont été préalablement
rincées avec le même milieu pour éliminer l’azote adsorbé sur les racines. Les différents
traitements (DPI, KI...) sont appliqués au moment du transfert.
Les racines sont récoltées à différents moments après le traitement et immédiatement
congelées dans de l'azote liquide.

3.3.2. Culture en boîtes de Pétri

Le milieu utilisé pour la culture en boîtes, est le ½ MS sans azote (Plant Media)
contenant 1 g.l-1 Saccharose et 0,5 g.l-1 MES et complété (le cas échéant) par la source et la
quantité d’azote appropriées à chaque expérience. Le pH est ajusté à 5,7 avec du KOH 1 M.
Le mélange est solidifié avec 1 % p/v d’agar puis autoclavé à 120°C pendant 20 minutes.
Quarante millilitres de milieu sont coulés dans des boîtes de Pétri 12x12 cm. Les graines,
préalablement stérilisées, sont semées à l’aide d’un cure-dent stérile. Les boîtes sont

53
A

Figure 2. Illustrations des systèmes de culture en hydroponie. A) Préparation des

bouchons eppendorfs pour le semis. B) Culture des plantes en bassine noire sur support
flottant. C) Système de culture Phytatray (hydroponie stérile).
fermées par du parafilm et placées verticalement en chambre de culture pendant une
semaine.

4. Mesure de l’influx racinaire de NO3-

4.1. Marquage au 15NO3

Les mesures d’influx de NO3- ont été réalisées comme décrits par (Lejay et al., 1999).
Les racines sont tout d’abord rincées dans une solution de CaSO4 0,1 mM pendant 1 min.
Les plantes sont ensuite incubées 5 min dans un milieu de culture standard contenant une
source d’azote marquée K15NO3 (99 % 15
N) dont la concentration est dépendante de
15
l’expérience. Pour éliminer toute trace de N adsorbée sur les racines, celles-ci sont rincées
encore une fois dans du CaSO4 0,1 mM durant 1 min, avant d’être récoltées, placées dans
des cupules en étain puis séchées 48 h à 70 °C. Après séchage, le poids sec ainsi que la
15
teneur en N total et le pourcentage en N sont déterminés par spectrométrie de masse à
flux continu (Lejay et al., 1999).

4.2. Mesure du 15N par spectrométrie de masse

Le dosage isotopique a été réalisé comme décrit précédemment par (Clarkson et al.,
1996). Les échantillons subissent une combustion à 1000 °C en présence de Cr 2O3 et de
CuO puis une réduction à 550 °C en présence de CuO. La totalité de l’azote transformé en
N2 est véhiculée par un flux d’Hélium ultra pur pour être injectée dans un spectromètre de
masse (IsoPrime) connecté à un analyseur élémentaire (Euro-EA Vector, GV Instruments)
14 15 15
où les pourcentages de N et de N sont quantifiés. L’influx de NO3- est déterminé selon
la formule suivante :
%N*10000*(1/14)*(%E)*(1/%ES)*(1/#hours) et exprimé en : μmol N / g de matière
sèche / heure.
%N : le pourcentage d’N total dans un échantillon. %N = g N / 100 g matière sèche.
15
%E : l’enrichissement isotopique en N dans un échantillon et correspond à la différence
15 15
entre l’abondance isotopique en N mesurée et l’abondance isotopique en N présente
dans les échantillons témoins (n’ayant pas été en contact avec la solution marquée, 0,3663).
%ES : le pourcentage de 15NO3- fourni aux plantes.

54
5. Analyse de l’expression des gènes

5.1. Extraction des ARN totaux

Les tissus congelés (quelques dizaines de mg de racines) sont broyés une ou 2 fois
par agitation en présence d’une bille d’acier de 3 mm de diamètre (Broyeur Retsch® mixer
mills MM400, 25 agitation.s-1, 1 min). La poudre obtenue est reprise dans 1ml de TRIzol
reagent (Invitrogen) pour séparer les protéines et les acides nucléiques et incubée au moins
5 min à température ambiante sous agitation. Deux-cent µl de chloroforme sont ajoutés au
mélange, successivement incubé 5 min sous agitation à température ambiante et centrifugé
(15 min, 4°C, 14 000 g). Le surnageant contenant les acides nucléiques (environ 400 µl) est
récupéré, mélangé à 0,5 ml d’isopropanol et 1 µl de GlycoBlue™ (Ambion®), incubé 5-10
min dans la glace et centrifugé (30 min, 4°C, 14 000 g) pour précipiter les ARNs. Le
surnageant est éliminé, le culot est lavé deux fois dans 0,5 ml d’éthanol 75 % (v/v) et
centrifugé (5 min, 4°C, 14 000 g). L’éthanol est éliminé et le culot est séché (quelques
minutes) avant d’être repris dans 30-40 µl d’eau stérile ultra-pure. Les ARNs totaux ainsi
extraits sont dosés par spectrométrie à 260 nm (NANODROP 1000 spectrometer, Thermo
Scientific, Wilmington, USA) et les résultats sont analysés avec le logiciel ND-1000 V3.7.1.
La pureté des ARNs est vérifiée par le mesure des ratios DO260/DO280 et DO260/DO230 qui
doivent être proche de 2.

5.2. Rétro-transcription des ARN messagers

Avant la rétro-transcription, les ARNs totaux (2 à 4 µg) subissent un traitement à la
DNAse I (SIGMA-ALDRICH, St Louis, USA) (0,1 U) incubés 30 min à 23°C au thermocycleur
2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems). Le mélange est additionné de 1 µl d’EDTA,
incubé 10 min à 70°C et puis maintenu dans la glace pour stopper l’activité de la DNAse afin
d’éviter tout risque de dégrader les ADNc à venir. Les ARNs sont incubés pendant 5 min à
65°C en présence de 50 pmol oligo-dT(20), et de 20 nmol de dNTP puis gardés dans la glace.
La rétro-transcription est réalisée en présence de la ThermoTMscript (Invitrogen) (15 unités),
4 µl de tampon de synthèse d’ADNc 5X, 1 µl de DTT 0.1 M, 40 U de RNase OUT. Le volume
est ajusté à 22 µl avec de l’eau ultra-pure. La réaction est laissée pendant 1h30 à 50°C puis
5 min à 85°C. Les ADNc obtenus sont dilués dans 60 µl d’eau ultra-pure ou TE (10 mM Tris,
1 mM EDTA pH 8 avec HCl).

55
 Tableau 2.6. Liste et détails des amorces utilisées en qPCR

Taille Tm
Gène AGI Amorce Séquence (5’-3’)
(pb) (°C)

Clathrine AT4G24550 Sens AGCATACACTGCGTGCAAAG 20 57.3

Anti-sens TCGCCTGTGTCACATATCTC 20 57.3

Actine AT3G18780 Sens GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG 23 62.4

AT1G49240 Anti-sens AACGACCTTAATCTTCATGCTGC 23 58.9

HRS1 AT1G13300 Sens ATATAGACTGCATACAAGAAGGC 23 57.1

Anti-sens TAGTCCGATTGTGGTACCCATAAA 24 59.3

NRT2.4 AT5G60770 Sens GAACAAGGGCTGACATGGAT 20 57.3

Anti-sens GCTTCTCGGTCTCTGTCCAC 20 61.4

NRT2.5 AT1G12940 Sens ACTGAAGAAGACTATTATCTCGCC 24 59.3

Anti-sens CTCTTTCGCTAATGCTGGTTT 21 55.9

AT1G0809
NRT2.1 Sens AACAAGGGCTAACGTGGATG 20 57,3
0
Anti-sens CTGCTTCTCCTGCTCATTCC 20 59,4

GDH3 AT3G03910 Sens CCATGGGAAGCTAAAGAACAAG 22 58,4

Anti-sens AGAAGGTTAAACTGCAATTAGCAC 24 57,6

HHO1 AT3G25790 Sens GATGATGAAGAACACCAGTC 20 55.3

Anti-sens TATTAGAAACAACTGCGTCG 20 53.2

BT1 AT5G63160 Sens CTCTTTGCAGGCAATATAAGAATAG 25 58.1

Anti-sens GGCTTTAGCAGACGCTACTC 20 59.4

BT2 AT3G48360 Sens CATAGAAAGGAGCAGGATCTTTAC 24 59.3

Anti-sens TTGTTATCTACTACGTTTGATGGAC 25 58.1

5.3. Quantification de l’accumulation des transcrits par
q-PCR
Les amorces utilisées ont été conçues à l’aide du logiciel LightCycler® Probe Design
Software 2.0 et synthétisées par le laboratoire EUROFINS. Les couples d’amorces sont
définis préférentiellement dans la partie 3’-UTR et amplifient des fragments d'ADNc de 80-
150 pb. Elles font 20-23 pb et ont une température d’hybridation d’environ 60 °C et un % CG
d’environ 50. La liste des amorces utilisées est donnée dans le tableau 2.6.
L'amplification est réalisée à l'aide du réactif SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)
(TaKaRa, Clontech, China) en plaque de 384 puits (Hard-Shell® 384-Well Skirted PCR
Plates, Roche, Mannheim, Allemagne) dans un LightCycler® LC480 (Roche Diagnostics,
Basel, Switzerland) selon les instructions du fournisseur avec de 1 μL d’ADNc dans un
volume de 10 μL contenant 1 μM de chacune des amorces. Les conditions d'amplification
sont illustrées dans le tableau 2.7. À la fin des 42 cycles d’amplification, le produit PCR est
dénaturé en augmentant la température de 0,05°C par seconde jusqu’à 95°C afin de
mesurer la spécificité de l'amplification grâce à l’analyse de la « melting curve ». L'analyse
des résultats est effectuée avec le logiciel LightCycler® LC480 SW1.5 (Roche, Mannheim,
Allemagne) en utilisant la méthode des « Fit points » pour calculer les Cp (crossing point).
Des dilutions successives d'un mélange d’une même quantité des différents échantillons
d’ADNc sont utilisées comme gamme étalon. Une bonne amplification possède une efficacité
comprise entre 0.8<E<1. Les résultats sont normalisés par rapport aux valeurs obtenues
pour la clathrine (AT4G24550) et l’actine (AT3G18780, AT1G49240) (Charrier et al., 2002).
Chaque échantillon est testé en duplicata/triplicata; la concentration en produit
d’amplification est calculée comme la moyenne des valeurs obtenues, préalablement
normalisées par rapports aux concentrations des gènes de ménage (CLA, ACT).

6. Extraction des protéines racinaires et

analyse par western blot
Les racines d’Arabidopsis (1 semaine sur ½ MS) ont été broyées. La poudre a été
reprise dans 1 ml de méthanol pré-refroidi à -20 °C. Le mélange est agité (vortex), incubé 10
min à -20 °C et centrifugé 5 min à 14000 g à 4 °C. Les mêmes étapes sont répétées en
utilisant de l’acétone à la place du méthanol. Une fois le culot complètement séché, 100 µl
de réactif d’extraction (Protein Extraction Reagent Type 4, Sigma Aldrich) contenant 1 µl
d’inhibiteur de protéases (Sigma Aldrich) est ajouté. Le mélange est ensuite incubé 30 min à

56
Tableau 2.7. Programme d’amplification de l’ADNc par la PCR quantitative

Température Temps Rampe

Pré-incubation 95 °C 10 min 4.8 °C/sec

95 °C 5 sec 4.8 °C/sec
Amplification (42 cycles) 60 °C 5 sec 2.5 °C/sec
72 °C 10 sec 4.8 °C/sec
95 °C 5 sec 4.8 °C/sec
Courbe de fusion 65 °C 1 min 2.5 °C/sec
97 °C - 0.11 °C/sec
Refroidissement 40 °C 30 sec 2.5 °C/sec
température ambiante sous agitation et centrifugé à 14000 g pendant 30 min. Le surnageant
est récupéré et les protéines solubles sont quantifiées en utilisant le réactif Pierce TM 660 nm
Protein Assay Reagent (Thermo Scientific) (Antharavally et al., 2009). Une courbe
d'étalonnage a été réalisée en utilisant des concentrations croissantes de BSA. Le western
blot a été réalisé avec 40 μg de protéines est révélé grâce à l’anticorps anti GFP couplé à
l’HRP (Miltenyi Biotec, 130-091-833). La révélation a été réalisée à la caméra CCD
(LAS3000, Fujifilm).

7. Dosage enzymatique des ROS

Le dosage d’H2O2 a été basé sur la méthode décrite par (Shin et al., 2005). La poudre
(~30 mg) issue du broyage des racines est additionnée de 200 µl de tampon phosphate (50
mM K2HPO4, pH 7.4), vortexée et centrifugée (14 000 g, 10 min, 4°C). Il est important de
réaliser cette partie du protocole à 4°C (chambre froide). Dans une plaque de microtitration
transparente, 50 µl du surnageant sont déposés avec 50 µl du mélange réactionnel (100 µM
Amplex Red® dilué dans le DMSO, 0.2 U.ml-1 HRP, 50 mM tampon phosphate K2HPO4, pH
7.4). Pour calibrer le dosage : une gamme d’H2O2 (0 ; 1,25 ; 2,5 ; 6,25 ; 12,5 ; 25 et 50 µM) a
été réalisée parallèlement. La plaque est ensuite incubée 30 min à l’obscurité à température
ambiante. L’absorbance est mesurée au VICTOR2 ™ (MULTILABEL COUNTER, Life
Sciences) à 560 nm. Les valeurs du dosage ont été reportées sur la gamme d’étalonnage.
Les résultats ont été exprimés en nmol d’H2O2 produites / mg de matière fraîche.

8. TARGET

8.1. Construction et purification du vecteur

pBeaconRFP_GR-FT sur gradient de CsCl
L’insertion des CDS des facteurs de transcription dans le vecteur pBeaconRFP_GR a
été basée sur l’utilisation du système de recombinaison Gateway® (Life Technologies). Le
clonage a été vérifié par PCR et séquençage (Tableau 2.4).
Une culture bactérienne est réalisée dans 1 litre de milieu TB (12 g.l-1 Tryptone, 24
g.l-1 Extraits de levure, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4, 0,4 % Glycérol, pH 7,3) en partant
d’une préculture fraiche (37 °C à 250 rpm). Le lendemain, les bactéries sont centrifugées à
4000 g pendant 15 min et incubées à -20 °C avant d’être reprises dans 40 ml de solution de
resuspension (10 mM EDTA, pH 8 avec du NaOH) additionnés de 80 ml de solution de lyse

57
(NaOH 0.1 N, 1 % SDS) et mélangées par agitation pendant 5 sec. 30 ml d’une 3ème solution
(acétate de potassium 3 M, acide acétique 15 %) sont ensuite ajoutés suivis d’une
centrifugation à 4000 rpm pendant 5 min. Le surnageant est filtré sur un filtre préalablement
mouillé (Miracloth, Calbiochem®) et mélangé avec 150 ml d’isopropanol dans des pots
Nalgène. Après une nuit d’incubation à 4 °C, les bouteilles sont centrifugées 5 min à 4000
rpm. Le culot est rincé avec de l’éthanol 95 % avant d’être séché puis repris dans de 3.5 ml
d’EDTA 10 mM. Dans un tube de 15 ml, le volume est ajusté à 4,7 ml auquel sont ajoutés
5,5 g CsCl et 300 μl de BET (10 mg/ml). Après dissolution du CsCl homogénéisation de tous
les ingrédients, les tubes sont à nouveau centrifugés 5 min à 3000 rpm. Le surnageant est
alors récupéré dans des tubes OptiSeal de 3,3 ml (Beckman Coulter RefN°: 361627) qui sont
soigneusement équilibrés puis ultracentrifugés toute la nuit à 80000 rpm (Beckman,
TLN100). La bande (0.5-2 cm) sont visualisées sous lumière UV et la bande inférieure qui
correspond à l’ADN plasmidique superenroulé est aspirée à l’aide d’une seringue et
transférée dans un tube de 15 ml. Le volume est ajusté à 3,5 ml avec de l’eau auquel est
ajouté le même volume d’une solution de butanol saturée en sel (83,3 % n-butanol, 16,7 %
NaCl 3 M). Après vortex et centrifugation (1500 rpm, 3 min), le surnageant saturé en BET est
éliminé et l’ADN dissout dans la phase aqueuse est récupéré. Cette étape est répétée au
moins deux fois jusqu’à ce que la phase aqueuse devienne bien claire. Après élimination de
toute trace de BET, 2 volumes d’éthanol 95 °C sont ajoutés à la phase aqueuse afin de
précipiter l’ADN plasmidique. Une incubation 15 min à 4 °C est alors réalisée suivie d’une
centrifugation pendant 1 h à vitesse maximale. Le culot d’ADN est séché puis repris dans de
l’eau pour une concentration 3-5 μg/μl.

8.2. Isolement des protoplastes

Des plantes cultivées pendant 10 jours dans des boîtes de Pétri ont été utilisées pour
la préparation des protoplastes. 10 g/l de saccharose ont été ajoutés au milieu de culture
pour augmenter la densité des cellules et ainsi faciliter leur sédimentation lors de la
centrifugation. Brièvement, les racines sont récoltées et incubées pendant 3 h dans une
solution de digestion de la paroi cellulaire (1,25 % Cellulase [Yakult, Japan], 0,3 %
Macerozyme [Yakult, Japan], 0,4 mM Mannitol, 20 mM MES, 20 mM KCl, 0,1 % BSA, 10 mM
CaCl2, 5 mM β-mercaptoéthanol, le pH est ajusté à 5,7 avec du Tris/HCl 1 M pH 7.5). Les
protoplastes libérés sous l’action des enzymes sont alors filtrés sur des filtres en nylon de 40
µm (VWR® Cell Stainers) et centrifugés 10 min à 300 g. Les cellules culottées sont
récupérées et le surnageant est réutilisé pour le rinçage des racines afin de récupérer le
maximum de protoplastes qui seront à leur tour filtrés et centrifugés. Cette étape est réalisée
2 à 3 fois et les protoplastes sont regroupés puis resuspendus dans 1 ml de solution de

58
transformation (0,4 M Mannitol, 15 mM MgCl2 .6 H2O, 4 mM MES, pH 5.7 avec du KOH). Les
cellules sont ensuite comptées à l’aide d’une lame de Malassez (MARIENFELD) et leur
concentration est ajustée à 4 millions cellules / ml. 1 million de cellules (250 µl) est utilisé
pour chaque transformation au PEG (Figure 1.8).

8.3. Transformation des protoplastes

Pour chaque transformation, 50 µg d’ADN plasmidique sont utilisés auxquels sont
ajoutés 250 µl de protoplastes et 250 µl de solution de transformation (40 % PEG 4000, 0,4
M Mannitol et 0,1 M CaCl2). Le mélange est incubé à température ambiante pendant 15
minutes. Un rinçage est effectué avec 15 ml de solution de lavage (154 mM NaCl, 125 mM
CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES, pH 5,7 avec du KOH) suivi d’une centrifugation de 10 min à
150 g. Le surnageant est éliminé, et les protoplastes sont resuspendus dans 1 ml de solution
de lavage puis transférés dans une plaque 24 puits et incubés toute la nuit à température
ambiante et à l’obscurité (Figure 1.8).

8.4. Traitements des protoplastes et tri cellulaire

Après incubation et expression du plasmide, les protoplastes sont traités
successivement avec 35 μM de CHX (Sigma) durant 30 min et 10 μM de DEX (Sigma) puis
incubés toute la nuit à température ambiante. Des traitements au DMSO et à l’éthanol ont
été réalisés comme témoins négatifs du CHX et du DEX respectivement. Les protoplastes
ayant incorporé le vecteur codant la RFP sont triés à l’aide d’un trieur de cellules (FACSAria
BD Biosciences), en excitant les cellules à 561 nm et en mesurant l’émission à 610-620 nm.
Les protoplastes triés sont directement récupérés dans un tampon d’extraction d’ARN et
congelés dans l’azote liquide (Figure 1.8).

8.5. Marquage des ARNs et hybridation des puces

Les ARNs ont été extraits à l’aide du kit (RNeasy® Micro Kit, QIAGEN) suivant les
recommandations du fournisseur et dosées au Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent
Technologies). Le transcriptome a été réalisé à l’aide de micro-puces GeneChip® ATH1
Affymetrix™. Brièvement, les ARNs sont rétro-transcrits en présence d’oligo (dt) pour donner
naissance à des ADNc simple brin qui, à leur tour, vont servir de matrice pour la synthèse du
brin complémentaire. Les ADNc obtenus sont alors transcrits in vitro en présence d’un
ribonucléotide biotinylé qui va permettre la purification des ARNs néosynthétisés. Les ARNs
purifiés sont quantifiés au Bioanalyzer Agilent 2100 puis fragmentés en utilisant le kit
GeneChip® WT PLUS Reagent (Thermo Scientific). L’hybridation des ARNs fragmentés sur

59
les puces (ATH1 Affymetrix™) est réalisée à 48 °C pendant 16 h. Les puces hybridées sont
rincées, marquées et scannées.

8.6. Analyse bioinformatique et statistique

8.6.1. Analyse du transcriptome

Les données brutes issues de ces puces ont été normalisées par le logiciel
Expression Console Software (Affymetrix™) en ajustant le bruit de fond. Pour l’analyse de
l’expression des gènes, un test ANOVA (seuil p<0,01) suivi d’un test Tukey (seuil p<0,01)
ont été réalisés en utilisant le logiciel statistique R (https://www.r-project.org/). L’analyse des
clusters de gènes et leur représentation en heatmap ont été effectuées à l’aide du logiciel
MeV v4.8 (http://mev.tm4.org/).

8.6.2. GeneCloud
GeneCloud (Krouk et al., 2015) est une plateforme qui permet d’effectuer une analyse
de l'enrichissement sémantique des gènes (https://m2sb.org/). Afin d’identifier les fonctions
surreprésentées dans une liste de gènes donnée, la description et les détails de chaque
gène sont récupérés à partir de TAIR (http://www.arabidopsis.org/index.jsp). Cet algorithme
permet de compter l’occurrence de chaque terme dans une liste de gènes donnée et la
comparer par la suite à l’occurrence du même terme dans tout le génome. Les termes
significativement surreprésentés sont alors organisés sous forme de nuage de mots dont la
taille et la couleur sont corrélées à leur enrichissement relatif au génome entier.

9. Production et purification des

protéines recombinantes

9.1. Cultures bactériennes

La souche utilisée, Rosetta™ 2(DE3)pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany), est un
dérivé lysogène de la souche classique E. coli B. Cette souche possède le gène codant la T7
polymérase sous le contrôle du promoteur lacUV5 inductible par l'IPTG. Les bactéries sont
transformées avec le vecteur d'expression Gateway® pDEST15 (Lifescience) exprimant la
protéine HRS1 fusionnée à la GST sous le contrôle du promoteur fort du bactériophage T7.
Le tag GST (25 KDa environ) permet de purifier la protéine par affinité (voir ci-après).

60
 Les clones recombinants sont mis en pré-préculture dans 10 ml de milieu LB
(Tryptone 10 g.l-1, Extraits de levure 5 g.l-1, NaCl 5 g.l-1, pH 7 avec NaOH) à 37 °C pendant
une nuit sous agitation, en présence des agents sélectifs : chloramphénicol (34 µg/ml) et
carbénicilline, analogue de l’ampicilline, (50µg/ml). Le lendemain, 1 ml de cette préculture est
réensemencé dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TB (12 g.l-1 Tryptone, 24 g.l-1
Extraits de levure, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4, 0.4 % Glycérol, pH 7,3). La DO ayant
atteint 0,7, l’addition de 1 mM d’IPTG (inducteur du promoteur bactérien de la β-
galactosidase (lac)), permet d’activer l’expression du gène et d’induire l’accumulation de la
protéine recombinante. L’état inductif est maintenu 16 h à 22°C sous agitation (200 rpm).

9.2. Lyse des bactéries et extraction des protéines

Le culot bactérien, obtenu par centrifugation à 8000 g pendant 10 minutes à 4°C, est
repris dans 10 ml de PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2HPO4, 1,8 mM KH2PO4,
pH 7,3) en présence de lysozyme et un inhibiteur de protéases. Les bactéries sont lysées
dans la glace par 2 cycles de sonication de 30 sec (80 % d'intensité) séparés par une pause
de 15 sec. Le lysat contenant la totalité des protéines solubles est récupéré par
centrifugation (12000 g, 12 min, 4°C).

9.3. Purification de la protéine recombinante

L’extrait protéique est mélangé à des billes de glutathion-sépharose (GE Healthcare,
Freiburg, Allemagne) et le volume est ajusté à 8 ml avec du tampon PBS. Le mélange est
incubé 2h30 sous légère agitation horizontale à 4°C puis 15 min à température ambiante
pour permettre la fixation du tag GST de la protéine de fusion sur les billes de sépharose (la
GST a une très forte affinité pour son substrat le glutathion immobilisé sur ces billes). Après
centrifugation (650 g, 10 min, 2°C), le surnageant est éliminé et 5 cycles de lavages par le
PBS sont réalisés en prélevant un aliquote de surnageant à chaque fois. L'élution de la
protéine d'intérêt se fait par compétition, en ajoutant 200 µl de tampon d'élution (10 mM
glutathion, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 avec HCl). Ce mélange est incubé 15 min à température
ambiante sous légère agitation horizontale suivi d'une centrifugation (650 g, 10 min, 2°C).
Cette étape est répétée 2 autres fois et les 3 fractions sont récupérées séparément et
conservées à 4°C. Afin de purifier ultérieurement la protéine, cette dernière est dialysée
pendant toute la nuit dans un tampon de dialyse (NaCl 150 mM, HEPES 50 mM, pH 7,4 avec
NaOH) à 4°C.

61
 Tableau 2.8. Liste et détails des oligonucléotides utilisés pour l'EMSA

Motifs utilisés pour l'EMSA

Taille
Description Séquence (5'-3') Tm °C
(pb)
Motif 7 (X4) F GATGTTTCTAGA GATGTTTCTAGA GATGTTTCTAGA GATGTTTCTAGA 48 69.4
R TCTAGAAACATC TCTAGAAACATC TCTAGAAACATC TCTAGAAACATC

Motif7-mut1 (x4) F TATGTTTCTATA TATGTTTCTATA TATGTTTCTATA TATGTTTCTATA 48 62.6

R TATAGAAACATA TATAGAAACATA TATAGAAACATA TATAGAAACATA

Motif7-mut2 (x4) F GATGTTTATAGA GATGTTTATAGA GATGTTTATAGA GATGTTTATAGA 48 66

R TCTATAAACATC TCTATAAACATC TCTATAAACATC TCTATAAACATC

Motif7-mut3 (x4) F TATGTTTATATA TATGTTTATATA TATGTTTATATA TATGTTTATATA 48 59.2

R TATATAAACATA TATATAAACATA TATATAAACATA TATATAAACATA

Motif 1 (X4) F GGAGAAGAAA GGAGAAGAAA GGAGAAGAAA GGAGAAGAAA 40 69.4

R TTTCTTCTCC TTTCTTCTCC TTTCTTCTCC TTTCTTCTCC

Motif 5 (X4) F AAACCAAACCGA AAACCAAACCGA AAACCAAACCGA 36 68.3

R TCGGTTTGGTTT TCGGTTTGGTTT TCGGTTTGGTTT

séquences promotrices utilisées pour l'EMSA

Taille
Description AGI Séquence (5'-3') Tm
(pb)
NRT2.4 AT5G60770 F CTCAAAAAAATTAGAATGTTTAAAGTAGATAATGCAAACA 40 62.3
R TGTTTGCATTATCTACTTTAAACATTCTAATTTTTTTGAG 40 62.3

NRT2.4 AT5G60770 F AAGGTTTTCTGGTTTTTCTTTCTAGATGAAAAATAAAATA 40 62.3

R TATTTTATTTTTCATCTAGAAAGAAAAACCAGAAAACCTT 40 62.3

NRT2.5 AT1G12940 F CACCCAAGTTTAACGATTTTTATCGTTAATTTTCTTTAGG 40 65.3

R CCTAAAGAAAATTAACGATAAAAATCGTTAAACTTGGGTG 40 65.3

NRT2.5 AT1G12940 F TTCGAACCTCGATCGATGTTTTCAGAGATTGTACCATGAG 40 70.5

R CTCATGGTACAATCTCTGAAAACATCGATCGAGGTTCGAA 40 70.5
9.4. Analyse des protéines sur gel de polyacrylamide
dénaturant SDS-PAGE
Après avoir été dosées à 660 nm selon la méthode de (Antharavally et al., 2009) en
utilisant le réactif PierceTM 660 nm Protein Assay Reagent (Thermo Scientific), les protéines
sont dénaturées pendant 5 min à 95°C en présence de 25 % (v/v) du tampon Laemmli 4X
(0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 40 % glycérol, 8 % SDS, 0,04 % Bleu de Bromophénol, 4 % β-
mercaptoéthanol) puis séparées en gel de polyacrylamide 5 et 12,5 % respectivement pour
le gel de concentration (pH 6,8) et le gel de séparation (pH 8,8) en conditions dénaturantes
(SDS). La migration se fait 15 min à 60 V puis 1h30 à 120 V dans le tampon de migration
TGS (Tris base 15,23 g.l-1, Glycine 72,06 g.l-1, 0,5 % SDS). Les protéines sont ensuite
visualisées par coloration du gel au bleu de Coomassie ou transférées sur membrane. La
production de la protéine a été validée par western blot comme décrit précédemment (Feys
et al., 2001) en utilisant des anticorps anti GST couplé à l’HRP.

10. Retard sur gel ou EMSA

10.1. Choix et hybridation des oligonucléotides

Les fragments double-brin d’ADN ont été préparés à partir d'oligonucléotides sens et
antisens complémentaires (Tableau 2.8) Ces derniers (100 µM) ont été mélangés en
concentration équimolaire pour obtenir des concentrations finales de 50 nM pour les sondes
biotinylées et 2 µM pour les non biotinylées. Les oligonucléotides sont chauffés 5 min à 94°C
dans le thermocycleur, refroidis (-1 °C/min) jusqu'à Tm, puis incubés 30 min à Tm et refroidis
(-1 °C/min) jusqu'à 4 °C.

10.2. Analyses de retard sur gel

La liaison de la protéine recombinante (150 ng) sur les sondes biotinylées (20 fmoles)
est réalisée dans un mélange réactionnel contenant 10 mM de Tris, 50 mM de KCl, 1 mM de
DTT, pH 7,5, 2,5 % de glycérol, 5 mM de MgCl2, 1 µg poly (dI-dC) et 0,05 % de NP-40. La
spécificité de liaison a été vérifiée par compétition avec 10, 25, 50 et 200 X de sondes non-
biotinylées, et par des tests avec des sondes contenant des nucléotides mutés (Tableau
2.8). Après incubation à 24 °C pendant 30 min le mélange protéine-sonde est séparé sur gel
natif de polyacrylamide 4 % dans le TBE 0.5 % (TBE 10 % : 5,4 g.l-1 Tris base, 2,75 g.l-1
Acide Borique, 1 mM Na2EDTA pH 8, H2O qsp 1L) et transféré par capillarité dans le tampon

62
SSC 20X (175,3 g.l-1 NaCl, 88,2 g.l-1 Tri-Na-Citrate-2H2O, pH 7) pendant une nuit sur une
membrane de nylon Biodyne B (Thermo Scientific). Après cross-link par UV (254 nm)
pendant 90 sec à 120 mJ.cm-2, la migration des sondes marquées à la biotine est révélée
par incubations séquentielles à température ambiante (en agitation) avec : i) tampon de
blocage (Blocking Buffer Thermo Scientific) (20 ml, 15 min). ii) streptavidine couplée à la
HRP (Thermo Scientific) (dilués au 1/300 dans 20 ml de tampon de blocage, 15 min). iii)
tampon de lavage (Wash Buffer Thermo Scientific) (5 min, 4 fois). iv) tampon d’équilibrage
du substrat (Substrate Equilibration Buffer Thermo Scientific). v) le substrat
chimioluminescent : luminol+peroxyde (Thermo Scientific). La révélation est réalisée par
autoradiographie.

11. Observation microscopique d’HRS1-

GFP et ses lignées dérivées

11.1. Criblage
Le criblage des lignées exprimant la GFP et/ou la mCherry a été effectué aux
objectifs 20X et 40X sous un microscope apotome inversé (ApoTome.2, Zeiss Axio Observer
7) connecté à une caméra digitale monochrome (HAMAMATSU ORCA-Flash4.0 LT) et piloté
par le logiciel Zen 2. Les filtres d’excitation 450-490 nm et 533-558 nm ont été utilisés
respectivement pour la GFP et la mCherry qui émettent de la fluorescence détectée
respectivement à travers des filtres d’émission 500-550 nm et 570-640 nm. L’intensité du
laser est maintenue à 100 %.

11.2. Co-localisation
La colocalisation des deux protéines de fusion HRS1-GFP avec CT-DsRed et PTS-
mCherry a été réalisée au microscope confocal inversé (Leica TCS SP8) équipé d’un objectif
63X à huile et contrôlé par le logiciel LAS AF du fournisseur. La GFP est excitée à 488 nm
par une source de laser Argon et la fluorescence émise par l’échantillon est filtrée à travers
une bande passante de 500-535 nm. Le laser 561 nm a été utilisé pour l’excitation de la
DsRed et la mCherry à 546 et 587 nm respectivement. L’intensité du laser est réglée en
fonction des lignées observées. L’émission de la fluorescence par la DsRed est récupérée
586 nm, tandis que celle de la mCherry est détectée à 610 nm. La détection du signal

63
 Tableau 2.9. Outils de prédiction de la localisation de la protéine HRS1

Prédicteur Localisation
SUAcon noyau
ngLOC noyau
AdaBoost noyau
ATP
BaCelLo noyau
ChloroP 1.1
EpiLoc
PSORT noyau
Ipsort
MitoPred
MitoProt
MitoLoc2 noyau
Nucleo noyau
PCLR 0.9
Plant-mPLoc noyau
Pprowler 1.2 mitochondrie
Predotar v1.03
PredSL extracellulaire, endoplasmique, réticulum, golgi
PTS1
SLPFA mitochondrie
SLP-Local cytosol, noyau
SubLoc noyau
TargetP 1.1
WoLF PSORT noyau
SLocX
Predotar v1.03
AtSubP noyau
Yloc noyau
PrediSi
Protocompb extracellulaire
LOCALIZER noyau
Protein Prowler noyau
PredictProtein noyau
TargetLoc autre, plastes
fluorescent a été réalisée à l'aide d'un détecteur PMT hybride. L’ouverture du pinhole est
maintenue à 1 Airy. Les images ont été acquises à une résolution de 1024x1024.

12. Outils bioinformatiques

L’alignement des séquences de protéines ou d’ADN afin de vérifier les résultats de
séquençage ou de comparer les séquences protéiques des facteurs de transcription a été
réalisé à l’aide du logiciel Vector NTI (Invitrogen).
La représentation de la structure 3D du motif GARP et le marquage des résidus
impliqués dans l’interaction avec l’ADN ont été faits grâce au logiciel 3D Molecule Viewer
software (Invitrogen).
La construction de l’arbre phylogénétique des GARPs a été effectuée en utilisant
l’algorithme mafft (https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/, parameters: G-INS-1, BLOSUM62)
et le logiciel FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Les motifs conservés ont été
déterminés grâce à l’algorithme MEME suite (http://meme-suite.org/doc/meme.html). La
prédiction du domaine coiled-coil a été effectuée à l’aide des algorithmes suivant : MARCOIL
(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/marcoil), prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_lupas.html), COILS
(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html), COILS/PCOILS
(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils), Paircoil2
(http://cb.csail.mit.edu.insb.bib.cnrs.fr/cb/paircoil2/paircoil2.html), et CCHMM
(http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi).
Le réseau d’interaction protéine-protéine a été construit en utilisant le logiciel
Cytoscape.
La liste des outils utilisés pour la prédiction de la localisation cellulaire d’HRS1 est présentée
dans le tableau 2.9.

64
Chapitre 3: Étude de l’interaction
SPX/HRS1, un carrefour entre la
voie de transduction du phosphate
et celle du nitrate?

65
1. Introduction
Plusieurs FT de la famille GARP sont impliqués dans des voies de signalisations
nutritionnelles (Safi et al., 2017). C’est le cas de Psr1, le premier membre de la famille
identifié comme étant impliqué dans la nutrition en phosphate. Il a été isolé chez une souche
de Chlamydomonas reinhardtii résistante à des très fortes concentrations de Pi radioactif
(Shimogawara et al., 1999). Psr1, dont l’expression augmente drastiquement suite à une
privation de Pi, semble être crucial pour l’acclimatation de l’algue à la carence en Pi (Wykoff
et al., 1999). Son homologue chez Arabidopsis, PHR1, a été isolé grâce à une approche de
criblage génétique. Le mutant phr1 est affecté dans l’induction d’un marqueur de la PSR
(IPS1) (Rubio et al., 2001). PHR1 est un régulateur central dans la perception de Pi selon un
mécanisme qui fait intervenir également une autre protéine nommée SPX1 (Puga et al.,
2014). Les SPX sont des petites protéines qui jouent un rôle important dans la tolérance des
plantes à la carence en P (Duan et al., 2008). Les gènes codant les SPX sont au nombre de
quatre chez Arabidopsis et six chez le riz. Ils sont tous fortement induits par la carence en Pi
à l’exception de AtSPX4 et OsSPX4 (Duan et al., 2008; Secco et al., 2012a; Wang et al.,
2009c). Chez la levure, la protéine Pho87, contenant un domaine SPX, est un senseur de Pi
(Giots et al., 2003; Secco et al., 2012b). Le rôle de sensing de Pi chez Arabidopsis semble
être assuré par le couple SPX1/PHR1. En effet, les deux protéines interagissent
physiquement en présence de Pi. cette interaction empêche PHR1 de se fixer sur le motif
P1BS présent dans le promoteur de ses gènes cibles. Par contre en cas de privation de Pi,
l’interaction de SPX1 avec PHR1 est perdue permettant ainsi à ce dernier d’activer les gènes
de la réponse à la carence en Pi via le CRE P1BS (Puga et al., 2014; Qi et al., 2017). Le
même mécanisme a été rapporté chez le riz où l’activité de OsPHR2 (orthologue de
AtPHR1) est régulée via l’interaction avec OsSPX1 ou OsSPX2 (Wang et al., 2014). Les
mécanismes qui contrôlent l’activité de OsPHR2 semblent être plus élaborés puisqu’elle
n’est pas seulement régulée dans le noyau (par OsSPX1 et OsSPX2) mais aussi dans le
cytoplasme par une autre protéine SPX. En effet, OsSPX4 séquestre OsPHR2 dans le
cytosol et empêche sa translocation vers le noyau (Lv et al., 2014). L’interaction Pi-
dépendante entre les GARP et les SPX définit un mécanisme assez conservé de perception
et de régulation de l’homéostasie de Pi.

En outre, les processus développés par les plantes pour faire face aux variations de
la disponibilité des nutriments sont assez complexes. Cette complexité provient de la
diversité des signaux externes, mais aussi du fait que ces signaux ne sont pas perçus
séparément par la plante mais plutôt sous forme de nombreuses combinaisons de stimuli

66
(Kellermeier et al., 2014; Krouk et al., 2009; Ristova et al., 2016). Afin de réagir à cette
myriade d’informations, les plantes ont développé des réseaux de régulation de gènes
appropriés à chaque voie de signalisation. Il existe cependant, des FT qui fonctionnent dans
différentes voies de signalisation permettant à la plante d’intégrer plusieurs signaux. C’est le
cas de PHR1 qui présente un point d’aiguillage important entre le Pi et d’autres nutriments
comme le sulfate, le zinc et le fer (Briat et al., 2015). Des homologues à PHR1 appartenant à
la sous-famille HRS1/HHO sont aussi impliqués dans l'intégration des signaux P et N (Medici
et al., 2015). En plus d’être très rapidement induits par le NO3-, HHO2 et HRS1 sont
respectivement régulés aux niveaux transcriptionnel et post-traductionnel par le Pi (Medici et
al., 2015; Nagarajan et al., 2016). HHO2 est impliqué dans la réponse à la carence en Pi et
contrôle à la fois la teneur des plantes en Pi et le développement racinaire (Nagarajan et al.,
2016). HRS1 et HHO1 sont aussi impliqués dans le contrôle de la croissance racinaire et
cette régulation dépend largement de la disponibilité en P et en N. En effet, ces deux FT
répriment la croissance de la racine primaire en réponse à la privation de Pi (Liu et al., 2009;
Medici et al., 2015). De manière intéressante, le phénotype marquant du double mutant
hrs1;hho1 n’est détecté qu’en carence exclusive en Pi. Une carence combinée en Pi et en
NO3- abolit complètement le phénotype de hrs1;hho1 (Medici et al., 2015). Toutes ces
données mettent en valeur le rôle potentiel des GARP dans l’intégration des signaux P et N.
Contrairement à PHR1 qui est exprimé dans des conditions suffisantes en Pi (Rubio
et al., 2001), HRS1 est induit à la fois par la fourniture du nitrate (Canales et al., 2014; Krouk
et al., 2010b; Medici et al., 2015) et vraisemblablement par la carence en Pi (Liu et al.,
2009). Par ailleurs, en plus d’être des proches homologues, HRS1 et PHR1 partagent le
même domaine qui permet à PHR1 d’interagir avec SPX1 (Figure 1.9).
Prises dans leur ensemble, toutes ces observations suggèrent que HRS1 pourrait
interagir avec les protéines SPX pour former un complexe impliqué dans la perception du
NO3-, du Pi ou de la combinaison des deux. Ce sont ces hypothèses que j’ai testé dans cette
partie de ma thèse dont les résultats sont présentés ci-dessous.

2. Résultats et discussion
Afin d’évaluer s’il existe un mécanisme selon lequel SPX1 pourrait moduler l’activité de
HRS1, j’ai cloné leurs CDS respectivement dans les vecteurs pDEST17 et pDEST15. Les
protéines recombinantes purifiées, SPX1-MBP et HRS1-GST, ont été alors utilisées dans les
expériences d’EMSA à la manière de Puga et al (Puga et al., 2014). Le but était de
déterminer l’influence de SPX1 sur la capacité d’HRS1 à reconnaître ses éléments cis cibles.
En effet, récemment deux motifs significativement sur-représentés dans les promoteurs des

67
 Motif 1 : GGAGAAGAAA
HRS1 - + - + + + + + + +
SPX1 - - + + + + + + + +
KNO3 (mM) - - - - 45 - 45 - - 40
KH2PO4 (mM) - - - - - 30 30 - 30 -
KCl (mM) - - - - - - - 45 45 40

Figure 3.1. Effet de SPX1 sur la fixation d’HRS1 au motif 1 en

présence de KNO3, KH2PO4, ou KCl.
EMSA sur un gel natif de polyacrylamide (4%) en utilisant 40 pb (4X
motif 1) d’ADN biotinylé (20 fmol), en présence de 150 ng de chaque
protéine. La révélation a été faite grâce à la streptavidine couplée à
l’HRP, par autoradiographie (5 min).
cibles directes induites par HRS1 ont été définis (Medici et al., 2015). Ces deux motifs
nommés motif 1 (GGAGAAGAAA) et motif 5 (AAACCAAACCGA) ont été utilisés pour tester
l’interaction putative du couple SPX1/HRS1. Sachant que l’interaction SPX1/PHR1 est Pi-
dépendante (Puga et al., 2014) et que l’expression et l’activité d’HRS1 dépendent fortement
du NO3- (Canales et al., 2014), des combinaisons différentes de KH2PO4 et de KNO3 ont été
ajoutées au mélange réactionnel. Le KCl a été utilisé comme contrôle.
Les résultats présentés (Figures 3.1 et 3.2) ont permis de montrer que HRS1 retarde
le Motif 1 (Figures 3.1 et 3.2A) ainsi que le Motif 5 (Figure 3.2B) ce qui valide les données
publiées par (Medici et al., 2015).
En absence de nitrate et de phosphate, la présence simultanée de SPX1 et HRS1
semble n’avoir aucun effet négatif ni positif sur le binding de ce dernier au motif 1. Par
contre, l’ajout de KNO3, de KH2PO4 ou d’une combinaison des deux, réduit légèrement le
signal correspondant au complexe HRS1-motif 1. Cependant, l’altération de l’activité d’HRS1
par SPX1 ne semble pas être spécifiquement liée à la présence du KNO3 et/ou du KH2PO4
puisque l’effet du KCl est plus déstabilisant que celui du KNO3 et du KH2PO4 (Figure 3.1).
L’inhibition de la fixation d’HRS1 par 3 sels différents et même en présence de toutes
les combinaisons pourrait être juste associée au cation K+, le seul élément commun entre les
3 sels. Pour cela, une nouvelle expérience a été réalisée en substituant le KNO3, le KH2PO4
et le KCl par du NaNO3, le NaH2PO4 et le NaCl respectivement (Figure 3.2A). Les deux
protéines HRS1 et SPX1 ont été déposées à chaque fois en présence d’un seul sel ou de
combinaisons de plusieurs. Aucun effet, cependant, n’a été observé comme dans les
expériences précédentes (Figure 3.2A).
La même expérience a été effectuée mais cette fois-ci en utilisant le motif 5
(AAACCAAACCGA) comme cible d’HRS1. Le même retard a été observé à chaque fois
quelques soient les ions ajoutés au milieu réactionnel (Figure 3.2B).
De manière troublante, bien que SPX1 ne soit pas un facteur de transcription au sens
strict du terme, un retard est observé pour le motif 1 (GGAGAAGAAA). Le niveau très bas du
signal observé peut être expliqué par une fixation aspécifique de SPX1 ou par la présence
de traces d’autres protéines dans l’extrait de protéine recombinante, lors de la purification de
SPX1.

Pris dans leur ensemble, ces résultats montrent que SPX1 n’influence pas l’activité
de fixation d’HRS1 ni en présence de NaNO3, ni en présence de NaH2PO4. D’autres
investigations doivent être effectuées pour pouvoir trancher sur l’interaction SPX1-HRS1 en
présence KNO3 et du KH2PO4. L’ajout de ces produits en absence de SPX1, pourrait
constituer une bonne piste pour dévoiler si la faible inhibition du binding d’HRS1 (Figure 3.1)

68
 Motif 1 : GGAGAAGAAA
A
NaNO3 (mM) - 30 - - 10 15 - 15 30 30
NaH2PO4 (mM) - - 30 - 10 - 15 15 - 30
NaCl (mM) - - - 30 10 15 15 - 30 -
- 30 - - 10 15
-- 15
- 30 30
- 10 - 15
-
15 -- 30
- 30 10 15 15
- 30 -

Motif 5 : AAACCAAACCGA
B
NaNO3 (mM) - 30 - - 10 15 - 15 30 30
NaH2PO4 (mM) - - 30 - 10 - 15 15 - 30
NaCl (mM) - - - 30 10 15 15 - 30 -

Figure 3.2. Tests de l’interaction HRS1/SPX1.

EMSA sur un gel natif de polyacrylamide (4%) en utilisant 40-48 pb (4X motif )
d’ADN biotinylé (20 fmol), en présence de 150 ng chaque protéine. La
révélation a été faite grâce à la streptavidine couplée à l’HRP, par
autoradiographie (5 min).
A) Effet de SPX1 sur la fixation d’HRS1 au motif 1 en présence de NaNO3,
NaH2PO4, ou NaCl.
B) Effet de SPX1 sur la fixation d’HRS1 au motif 5 en présence de NaNO3,
NaH2PO4, ou NaCl.
(HRS1 et SPX1 sont présents dans tout les puits).
résulte d’un mécanisme faisant intervenir plusieurs acteurs y compris SPX1 ou ce n’est
qu’un simple effet des sels (peut-être K+) sur l’interaction protéine/ADN.

3. Conclusion et perspectives
Bien que j'aie utilisé les deux motifs cibles d’HRS1 et testé plusieurs conditions
ioniques, je n’ai pas réussi à révéler un mécanisme d’interaction HRS1-SPX1. Les autres
parties de la thèse (Chapitre 4 en particulier) ayant donné des résultats plus tôt, nous avons
pris la décision de se focaliser sur d’autres questions plus prometteuses à ce moment de la
thèse. Cependant, l’interaction des HHOs avec les SPX semble toujours être une hypothèse
intéressante malgré les résultats négatifs présentés ci-avant.
En effet, l’utilisation des protéines recombinantes SPX1-MBP et HRS1-GST dont les
conformations tridimensionnelles ont été au moins légèrement modifiées par les étiquettes
protéiques, pourrait influencer l’interaction native de ces protéines. Le clivage des protéines
chimères par une protéase spécifique lors de la purification constitue une alternative
intéressante. La thrombine par exemple, qui coupe au niveau de la partie N-terminale de la
GST, permettrait de libérer HRS1 et de tester cette hypothèse.
Ces expériences réalisées in vitro, ne sont pas suffisantes pour pouvoir rejeter de
manière incontestable toute interaction possible entre ces deux protéines. Des tests in vitro
utilisant d’autres techniques comme le FITC, ou des techniques in vivo ou in planta
pourraient nous donner des réponses plus claires.
Même si ça n'affectera pas le binding de HRS1 in vitro, l’interaction avec les SPX
pourrait avoir lieu au niveau du cytosol (comme OsSPX4 et OsPHR2 (Lv et al., 2014)), des
expériences d’interaction protéine-protéine (co-immunoprécipitation par exemple) sont des
solutions intéressantes pour répondre à cette question.

Outre les motifs 1 et 5 qui se présentent majoritairement dans les gènes induits par
HRS1, un nouveau motif (GATGTTTCTAGA) sur-représenté dans les promoteurs des gènes
réprimés a été identifié. Ce motif est impliqué dans la régulation des gènes de la réponse à
la carence en N (voir chapitre 4). De manière intéressante, contrairement aux autres CRE
reconnus par HRS1 (Medici et al., 2015), ce dernier est le seul identifié par DAP-seq
(O'Malley et al., 2016). Par ailleurs, la répression transcriptionnelle a été identifiée comme
étant l’activité dominante d’HRS1 qui possède une séquence similaire au domaine répressif
du motif EAR (EAR-motif repression domain). En effet, la fusion d’HRS1 au domaine de
binding de GAL4 (35S:GAL4DB-HRS1) permet d’inhiber l’activité luciférase dont l’expression
est sous le contrôle du promoteur GAL4 (35S:5xGAL4DB-HRS1) (Mito et al., 2011).

69
Figure 3.3. Induction de SPX4 spécifiquement par le nitrate.
Niveaux relatifs d’accumulation des transcrits de SPX4. Les
plantes ont été cultivées pendant 14 jours en hydroponie stérile en
présence de 0,5 mM succinate d’ammonium, transférées sur –N
pendant 24h puis transférées sur 1 mM KCl (gris), 1 mM KNO3
(jaune), 1 mM NH4Cl (bleu) ou 0,5 mM NH4NO3 (vert).
(Données de Ristova et al., 2016).
D’ailleurs, une activité d’auto-répression a été attribuée à son orthologue OsNIGT1 chez le
riz (Sawaki et al., 2013). Toutes ces données montrent qu’une grande part de l’activité
d’HRS1 serait basée sur la répression de l’expression des gènes possédant ce nouveau
motif. Ces informations nous incitent donc à évaluer la capacité de SPX1 à réguler le binding
d’HRS1 à cet élément cis régulateur (GATGTTTCTAGA).
Cette régulation pourrait également faire intervenir plusieurs protéines SPX comme
c’est le cas de OsPHR2 chez le riz régulé à la fois par OsSPX1, OsSPX2 et OsSPX4 (Lv et
al., 2014; Wang et al., 2014).
Ainsi, AtSPX4 est un bon candidat vu qu’il est, comme HRS1, induit par le nitrate
(Figure 3.3). De plus, SPX4 interagit physiquement avec HHO2 (Safi et al., 2017). D’autre
part, HHO2 ainsi que HHO3 partagent avec leur homologue HRS1 le même élément cis
régulateur (GATGTTTCTAGA) (O'Malley et al., 2016; Safi, submitted). L’ensemble de ces
données suggère une régulation de la NSR via des interactions entre SPX4 et HRS1 d’une
part et SPX4 et HHO2 d’autre part (Safi et al., 2017).
Finalement, une interaction entre SPX3 (dont la localisation peut être chloroplastique
(Duan et al., 2008)) et HRS1 pourrait éventuellement contrôler le double adressage
(noyau/plastes) de ce dernier (voir chapitre 5).

70
Chapitre 4: Rôle des facteurs de
transcription de la famille HHO et
des ROS dans la réponse des
plantes à la carence en azote

71
1. Introduction et contexte
Les études réalisées sur la sous-famille HRS1/HHO ont montré que ces protéines
jouent un rôle capital dans la régulation de plusieurs processus physiologiques : plasticité de
la croissance racinaire (Liu et al., 2009; Medici et al., 2015; Nagarajan et al., 2016), tolérance
au stress salin (Mito et al., 2011), maintien de l’homéostasie nutritionnel (Nagarajan et al.,
2016)) et durant différents stages de développement de la plante allant de la germination
(Czechowski, 2005; Wu et al., 2012) jusqu’à la floraison (Ke, 2016; Moreau et al., 2016; Yan
et al., 2014a). Pour revue voir (Safi et al., 2017) (Chapitre 1).
Un des axes de recherche majeurs menés dans l’équipe est l’étude de la perception
des nutriments azotés par les plantes et plus particulièrement les voies de transduction liées
au signal NO3-. Afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la signalisation du NO3-,
notre équipe a réalisé des études transcriptomiques pour déterminer des reprogrammations
géniques induites par le NO3-. Ces analyses ont révélé que HRS1, HHO1, HHO2 et HHO3
sont très fortement induits de manière précoce en réponse à la fourniture du NO3- (Krouk et
al., 2010b). D’autres travaux indépendants ont aussi trouvé que HRS1 est parmi les gènes
les plus fortement induits par le NO3- (Canales et al., 2014; Wang et al., 2004). Ces
observations qui ont défini HRS1 comme marqueur de réponse au NO3- constituent des
arguments prometteurs pour placer HRS1 dans la liste des acteurs moléculaires contrôlant
des aspects de la perception du nitrate et sa relation au développement.
Pour tester cette hypothèse, une expérience de TARGET (Bargmann et al., 2013) a
été réalisée afin d’identifier les listes de gènes régulés par HRS1. Les données issues de
cette approche ont indiqué que HRS1 est capable de réguler directement des gènes liés aux
ROS (Medici et al., 2015). De plus, NRT2.4 pourrait être une cible directe réprimée par
HRS1 (Medici et al., 2015). En outre, l’expression de ce gène et celle d’un autre transporteur
de nitrate (NRT1.1) sont différentiellement régulées chez le double mutant hrs1;hho1 et chez
deux lignées surexprimant respectivement HRS1 et HHO1 (Medici et al., 2015).
Étant donné que NRT1.1 peut se comporter comme un transporteur de nitrate à
haute affinité (Liu and Tsay, 2003) et que NRT2.4 fonctionne exclusivement à faible
concentration de NO3-, et qu’il est considéré comme un marqueur de la réponse à la carence
en N (Kiba et al., 2012), cela suggère que HRS1 (voire ses homologues) pourraient être
impliqués dans la régulation de la NSR en contrôlant les transporteurs de NO3- à haute
affinité. C’est en partie ce que j’ai testé dans ce chapitre de ma thèse.
Par ailleurs, les carences nutritionnelles sont connues pour induire une production de ROS
(Shin et al., 2005; Shin and Schachtman, 2004) et leur accumulation régule les systèmes de
transport membranaires de K+ et de Ca2+ au niveau des racines (Demidchik et al., 2010;

72
Demidchik et al., 2003). Ceci suggère que les ROS pourraient être nécessaires pour
l’établissement de la réponse à la carence en nutriments. En associant ces données avec
celles du TARGET (Medici et al., 2015), on peut supposer que HRS1 pourrait réguler la
réponse à la carence en azote en altérant la production et/ou l’accumulation des ROS.

Ce chapitre présente le manuscrit d’un article qui a été soumis à Nature

Communications, puis à The Plant Cell puis déposé à BioRxiv. L’article a été envoyé en
revue dans les 2 journaux. Nature Communications nous a encouragé à soumettre une
révision. Des résultats complémentaires à cet article sont en cours d’obtention pour re-
soumission.

2. Résultats et discussion

Article
HRS1/HHOs GARP transcription factors and reactive
oxygen species are regulators of Arabidopsis nitrogen
starvation response.

73
HRS1/HHOs GARP transcription factors and reactive
oxygen species are regulators of Arabidopsis
nitrogen starvation response.

Authors: Alaeddine Safi1, Anna Medici1, Wojciech Szponarski1, Amy Marshall-

Colon2,3, Sandrine Ruffel1, Frédéric Gaymard1, Gloria Coruzzi2, Benoît Lacombe1,
Gabriel Krouk*1.

Affiliation:
1 Laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes, UMR5004
CNRS/INRA/SupAgro/UM, Institut de Biologie Intégrative des Plantes ‘Claude
Grignon’, Place Pierre Viala, 34060 Montpellier, France.
2 New York University, Department of Biology, Center for Genomics & Systems
Biology, 12 Waverly Place, New York, N.Y. 10003, USA.
3 Present Address:
Department of Plant Biology, University of Illinois at Urbana–Champaign, Urbana, IL,
USA

* Correspondence should be addressed to

Gabriel Krouk
[email protected]

74
Abstract
Plants need to cope with strong variations in the nitrogen content of the soil solution.
Although many molecular actors are being discovered concerning how plants
perceive NO3- provision, it is less clear how plants recognize a lack of Nitrogen.
Indeed, following N removal plants activate their Nitrogen Starvation Response
(NSR) being characterized in particular by the activation of very high affinity nitrate
transport systems (NRT2.4, NRT2.5) and other sentinel genes such as GDH3. Here
we show using a combination of functional genomics (via TF perturbation) and
molecular physiology studies, that the GARP Transcription Factors (TFs) belonging
the HHO sub-family are important regulators of the NSR through two potential
mechanisms. First, HHOs directly repress NRT2.4 and NRT2.5 high-affinity nitrate
transporters. Genotypes affected in HHO genes (mutants and overexpressors)
display modified high-affinity nitrate transport activities opening interesting
perspectives in biotechnology applications. Second, we show that Reactive Oxygen
Species (ROS) are important to control NSR in wild type plants and that HRS1 and
HHO1 overexpressors are affected in their ROS content, defining a potential feed-
forward branch of the signaling pathway. Taken together our results define two new
classes of molecular actors in the control of NSR including ROS and the first
transcription factors to date. This work (i) opens perspectives on a poorly understood
nutrient related signaling pathway, and (ii) defines targets for molecular breeding of
plants with enhanced NO3- uptake.

75
Introduction
The fertilization of crops with nitrogen (N) is a key requirement for global food production
systems, sustaining the world’s population and ensuring food security. As N is the key rate-
limiting nutrient in plant growth, understanding the factors that limit N-use efficiency (NUE) will
have particular relevance (Han et al., 2015). Inefficient NUE by agricultural systems is also
responsible for nitrate run-off into water soil and atmosphere. Increased leaching of N into
drainage water and the release of atmospheric nitrous oxide and reactive N greenhouse gases,
pollutes the troposphere, contributes to global warming, and accelerates the eutrophication of
rivers and acidifies soils (Sutton et al., 2011). Thus, understanding the regulation of N transport
by plants is likely to contribute to tackle these problems.
As sessile organisms, plants need to adapt to fluctuating nitrogen (N) conditions
(Crawford and Glass, 1998; O'Brien et al., 2016). N related adaptations include modification of
germination (Alboresi et al., 2005), root and shoot development (Forde and Walch-Liu, 2009;
Gruber et al., 2013; Krouk et al., 2010a; O'Brien et al., 2016; Rahayu et al., 2005), flowering time
(Castro Marin et al., 2010), transcriptome and metabolome (Krouk et al., 2010a; O'Brien et al.,
2016; Scheible et al., 1997; Stitt, 1999; Wang et al., 2004).
Interestingly, one can distinguish between different N-related signaling pathways being
activated in response to different N-variation scenarios and being reported by different sets of
sentinel genes.
These signaling pathways include the Primary Nitrate Response (PNR) (Hu et al., 2009;
Medici and Krouk, 2014) that can be seen when NO3--depleted or N-depleted plants are treated
with NO3-. PNR sentinel genes are very quickly (within minutes) (Krouk et al., 2010b) regulated
by NO3- and include nitrate reductase gene 1 (NIA1), nitrite reductase gene 1 (NIR1), glucose 6
phosphate dehydrogenase (G6PDH), and several others such as the GARP transcription factors
HRS1 (hypersensitive to low Pi-elicited primary root shortening 1 (Liu et al., 2009)) and HHO1
(HRS1 homologue 1 (Liu et al., 2009)) (Canales et al., 2014; Medici and Krouk, 2014). PNR is
probably the most studied and understood N-related signaling pathway for which several
molecular actors have been identified so far. These include the NO3- transceptor
CHL1/NRT1.1/NPF6.3 (Ho et al., 2009), kinases and phosphatase (CIPK8, CIPK23, ABI2,
CPK10,30,32) (Ho et al., 2009; Hu et al., 2009; Leran et al., 2015; Liu et al., 2017), and several
transcription factors (NLP6/7, TGA1, NRG2, BT2, TCP20, SPL9) (Alvarez et al., 2014; Araus et
al., 2016; Castaings et al., 2009; Guan et al., 2017; Krouk et al., 2010b; Marchive et al., 2013;
Wang et al., 2009; Xu et al., 2016). Recently a NO3--triggered Ca2+ signal have been shown to
be a crucial relay between the NRT1.1 transceptor and the nuclear events controlling PNR
(Krouk, 2017; Liu et al., 2017; Riveras et al., 2015).
Long-distance N-related root-shoot-root signals have also been shown to adapt plant
development and metabolism to the whole nitrogen status of the plant (Gansel et al., 2001; Li et
al., 2014; Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2015). These long-distance signals can be divided into
N-demand signals and N-supply signals, which can be genetically uncoupled (Li et al., 2014;
Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2015). Cytokinin and CEP peptides biosynthesis have been
shown to be important to generate the N-demand root-to-shoot-to-root relay necessary to
regulate genes and modify root development in conditions where N-supply is heterogeneous
(Ohkubo et al., 2017; Ruffel et al., 2011; Ruffel et al., 2015; Tabata et al., 2014).

77
 Finally, another signaling pathway includes N-Starvation Response (NSR). It can be
related to the molecular events triggered by a prolonged N-deprivation (Kiba and Krapp, 2016;
Krapp et al., 2011; Menz et al., 2016). Sentinel genes of NSR include high affinity (Km ~10 µM)
NO3- transporters NRT2.4 and NRT2.5 (activated to retrieve traces of NO3- in the soil), as well as
the glutamate dehydrogenase 3 gene (GDH3; hypothesized to be activated to recycle N) (Kiba
et al., 2012; Kotur and Glass, 2015; Lezhneva et al., 2014; Marchi et al., 2013). To date, the
calcineurin B-like7 displayed an effect on NRT2.4 and NRT2.5 gene expression in the context of
NSR (Ma et al., 2015). A role of miR169 was shown in the control of NFYA transcription factors
in response to NSR with a substantial impact on NRT2.1 and NRT1.1 transcriptional regulation
(Zhao et al., 2011). However, no proof of the actual role of the NFYA genes themselves on NSR
was provided in this work (Zhao et al., 2011). LBD37,38,39 transcription factors over-expression
have been shown to impact anthocyanin production on plants with N-deprived status (Rubin et
al., 2009) with a potential regulation on nitrate transporters including NRT2.5 (Rubin et al.,
2009). However, no direct regulatory target of LBDs were provided in this previous study (Rubin
et al., 2009).
These different N-related signaling pathways are likely to be tightly intertwined but no
molecular actors are known to be to play such a role. Here, we show that one of the most
strongly and rapidly NO3- regulated transcription factor (HRS1) (Canales et al., 2014; Krouk et
al., 2010b) and its close homologous GARP TFs (HHOs) (Safi et al., 2017), are involved in NSR
regulation. This has very important consequences on high-affinity NO3- transport activity, as well
on plant growth. We also demonstrate that NSR is abolished by ROS scavenging molecules in
wild-type plants (WT) and interferes in HHO-manipulated genotypes, thus defining a two-
branched signaling pathway.

Results
During our recent investigations (Medici et al., 2015) on HRS1 direct targets and their
role in the control of root development in response to combination of N and P signals, we
remarked a that NRT2.4 transcript accumulation was repressed upon controlled nuclear
entrance (Bargmann et al., 2013; Medici et al., 2015) of the GR:HRS1 fusion protein (see Sup
Fig. 1a; (Medici et al., 2015)). We also noticed that NRT2.4 was over-expressed in the double
hrs1;hho1 mutant (data shown in Sup Fig. 1b). These preliminary results suggested that HRS1
could be a direct regulator of the NRT2.4 gene.
Moreover, as NRT2.4 was shown to be a very good marker of the N-starvation response
(Kiba et al., 2012), and no regulator was shown to participate in this signaling pathway at the
outset of this study, we decided to investigate the role of HRS1 and its close homologous in the
NSR response. Since the experiments in Medici et al. (2015) (Sup Fig. 1b) were performed on
plants grown in very particular conditions (minus-Phosphate, plus-N), we investigated the
behavior of the hrs1;hho1 mutants and HRS1, HHO1 over-expressors (Sup Fig. 2a) in the
specific context of the NSR (transfer of plants from N containing media to N-free media). To
consolidate our investigations, we also studied two other genes that are sentinels of the NSR,
namely NRT2.5 (another very high affinity NO3- transporter) (Lezhneva et al., 2014), and GDH3
(Marchi et al., 2013).

78
 HHOs repress NSR sentinel genes
In the growth context of NSR treatments, as expected (Kiba et al., 2012), we showed
that in WT plants NSR is manifested by the strong activation of NRT2.4, NRT2.5, and GDH3
genes within the first days of starvation (Fig. 1a). These studies revealed that NSR was
diminished in 35S:HRS1 plants. In this experiment, these genes are also affected in the
hrs1;hho1 double mutants. Indeed, in the hrs1;hho1 genotype, NSR sentinel genes peak earlier
and are also repressed at earlier time-points compared to WT (Fig. 1a). Since HRS1 and HHO1
are homologous genes, and because the double mutant has a NSR phenotype, we set up an
experiment to compare HRS1 and HHO1 over-expressers side-by-side. This result (Fig. 1b)
showed that 35S:HRS1 and 35S:HHO1 display similar molecular phenotypes with a reduction of
the NSR response. Taken together, these results suggest that HRS1 and HHO1 are repressors
of NSR, likely through the direct regulation of NRT2.4 and NRT2.5 loci.
One interesting aspect of the hrs1;hho1 double mutant, which we observed across the
different experiments, was a very erratic response to NSR with the most representative
response shown in Figure 1a. In order to explain this phenomenon and to stabilize the
phenotype we recalled that HRS1, HHO1 and its paralogs HHO2 and HHO3 (Fig. 2a) are all
transcriptionally regulated by PNR (upon plant transfer from a N-depleted media to a NO3-
containing media) (Krouk et al., 2010b; Wang et al., 2004). To understand the interactions of the
HHO paralogs in regulating the NSR, we generated plants with an increasing number of
deletions in this gene sub-family (Fig. 2a). We generated the triple hrs1;hho1;hho2 and
quadruple hrs1;hho1;hho2;hho3 mutants by crossing (characterization in Sup Fig. 2b) and
compared them with WT, single and double mutants. The rationale was that; if these HRS/HHO
transcription factors (TFs) are indeed repressors of the NSR, they could strongly be regulated by
nitrate (in the context of the PNR) in order to quickly stop the NSR response when NO3- or
Nitrogen is available. We thus tested this hypothesis by subjecting the plants (WT, single,
double, triple and quadruple HRS/HHO mutants) to a nitrogen starvation treatment first, then
treated them with NO3-, and then followed the speed of NSR sentinel gene repression (Fig. 2b).
In this context, we showed that in WT, consistent to what was observed by Okamoto et al.
(2003) (Okamoto et al., 2003), NSR sentinels peaks within minutes and are strongly repressed
within 2 to 4 hours following NO3- provision (Fig. 2b). As predicted, the sequential deletion of the
HHO paralogs triggers a de-repression of NSR genes. It is noteworthy that the de-repression of
the NSR sentinel genes follows the sequential deletion of HHOs (quite manifest at the 2 and 3
hour time-points) (Fig. 2c). The HRS/HHO quadruple mutant displayed the strongest phenotype
and seems to be unable to completely repress the locus even after several hours of NO3-
provision (Fig. 2b, 2c).
To validate that it is indeed a combination of HRS/HHO deletion that de-repressed the
NSR sentinels (as opposed, for example, to the simple effect of hho3 mutation), we performed a
complementation experiment of the quadruple hrs/hho mutant with pHRS1:HRS1:GFP. We
showed (Fig. 2c) that two independent lines are able to fully restore the WT phenotype
regarding the NSR sentinel gene expression. This demonstrates that it is indeed a combination
of HRS/HHO deletions that is needed to observe the de-repression of NSR genes (Fig.
2b,2c,2d).
These results show that HHOs have a redundant function and that they collectively are
involved into repressing NSR sentinels when NO3- is provided (Fig. 2).

79
 HHOs control NO3- HATS
Among the three NSR sentinel genes, NRT2.4 and NRT2.5 were shown to be involved in
a very high-affinity nitrate transport system (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014). Since we
observed interesting molecular phenotypes in the context of N-starvation for the 35S:HRS1 and
hrs1;hho1 mutants (Fig. 1), we tested their high-affinity transport system (HATS) activity
following prolonged NO3- starvation (Fig. 3a). We performed 15NO3- labeling experiments, and
indeed found that 35S:HRS1 plants are affected in NO3- HATS (10 µM) activity. We repeated the
experiment to measure the range of affinities at which the HRS1 overexpression had an effect.
We observed (Fig. 3b) that the whole high-affinity range was decreased in the 35S:HRS1 plants
(with a 2-fold decrease for the very high nitrate affinity conditions, concomitant with a decrease
in NRT2.4, NRT2.5, NRT2.1 mRNA accumulation), while low affinity nitrate transport activity
remained unchanged in the 35S:HRS1 background (Fig. 3b). The double mutant hrs1;hho1
displayed little phenotype in this context, as compared to the WT.
Since we showed that the hrs1/hho mutants were unable to totally repress the NRT2.4,
NRT2.5 loci (Fig. 2b), we also wanted to study functional phenotypes in the HHOs mutants.
Thus, we performed 15NO3- labeling experiment on N-containing media (Fig. 4a). Consistent with
our previous findings (Fig. 2a), the sequential deletion of HHOs increases the HATS NO 3-
transport activity with a maximum effect recorded for the hrs;hho,hho2,hho3 quadruple mutant
that displays a 2.5 fold increase of HATS activity (Fig. 4a). Very interestingly, the nitrate
transport activity increase is accompanied with a strong stimulation of the quadruple mutant
growth in these conditions (Fig. 4b). Although this phenotype is less pronounced than in the
quadruple mutant, the double mutant hrs1;hho1 still displays bigger shoots as compared to the
wild type (Sup Fig. 3). The mutant phenotypes were lost in plants grown on –N conditions (data
not shown). This can be easily explained. Indeed, even if NRT2.4 and NRT2.5 are de-repressed
in the mutants in both conditions, only the mutants grown on +N can take up more nitrate than
WT. Furthermore, HHOs expression is known to be very low in –N conditions (Krouk et al.,
2010b; Menz et al., 2016), so mutations of genes, being weakly expressed in -N, are expected
to have low or no effect. These are two possible explanations of why we see mutant phenotypes
only on +N conditions.
In conclusion, the modification of HHOs expression has functional consequences on NO 3- HATS
activities consistent with their role on the transcriptional control on HATS transporters NRT2.4,
NRT2.5.

HRS1 direct targets point to a role of Reactive Oxygen Species

To broaden our investigations around this phenomenon, we studied HRS1 direct
genome-wide targets in an N-varying context. To this end, we performed HRS1-perturbations
using a TARGET analysis (Transient Assay Reporting Genome-wide Effect of Transcription
factors (Bargmann et al., 2013; Medici et al., 2015; Para et al., 2014)), including 3 biological
repeats, by using root protoplasts not treated with NO3- during the TARGET procedure. We
compared these new results with previously reported TARGET results for HRS1, in which we
maintained NO3- in the media (Medici et al., 2015). Both studies where performed in parallel in
the exact same conditions and in the same lab. Cycloheximide (CHX) was maintained in the

80
media during the procedure to retrieve only potential direct targets of HRS1. This provided
several important insights concerning HRS1 TF activity.
First, we retrieved 1050 potential HRS1 direct targets (non-redundant AGI) (see Material
and Method for statistics, and Sup File 1 for the gene list). This list of HRS1 direct targets was
subjected to GeneCloud (Krouk et al., 2015) analysis that performs semantic term enrichment
analysis on gene lists (Fig. 5a). This revealed that HRS1 controls a highly coherent group of
genes, function-wise. Very strikingly, the terms related to redox function (oxidation, peroxide,
reductase, oxygen) was highly overrepresented in this list of genes controlled by HRS1 (Fig. 5a,
Sup File 1).
A clustering analysis revealed 12 different modes of gene control by HRS1 in
combination with NO3- (Fig. 5b, cluster lists are provided in Sup File 1). Interestingly, the
expressions of the vast majority (86%) of the HRS1 direct genome-wide targets are dependent
on the NO3- context (Fig. 5b). This can be explained by N related transcriptional, post-
transcriptional, post-translational modifications that could affect HRS1 itself or its TF partners.
Among the 12 clusters of HRS1 target genes, the two NO3--insensitive ones are Clusters
#5 and #8. Cluster #8 contains genes whose functions were reminiscent to the germination
control of HRS1 demonstrated in previous work (Wu et al., 2012) (Fig. 5b). Cluster #5 contains
genes with diverse function including a Chaperone Dnaj-domain protein and a Glutaredoxin. It is
noteworthy that most of the HRS1 regulated gene clusters contain genes related to the redox
state of the cells (Figure 5b). However, the most enriched clusters in redox related genes are
cluster #12 and #2. Cluster #2 contains many genes annotated as heat shock protein and heat
shock factors. For this cluster, HRS1 plays a role of repressor only when NO3- is provided to the
protoplasts. On the other hand, cluster #12 contains genes that are repressed by HRS1 only
when NO3- is not present during the TARGET procedure (Fig. 5b). This cluster contains many
redox related genes such as a Catalase1 (CAT1), a Ferredoxin, a Thioredoxin, and a
Cupredoxin.

In conclusion, this HRS1 TF perturbation analysis in the TARGET system prompted us to

investigate below i) the role of ROS in the NSR, ii) the role of ROS in the HRS1 dependent
control of NSR. It also illustrates that as TF can greatly modify its targets according to a
nutritional context (Fig. 5).

ROS scavenging molecules are strong repressors of NSR

To investigate the role of ROS in NSR, we undertook a pharmacological approach. We showed
that NSR is strongly repressed if plants are concomitantly treated with ROS scavenging
molecules. In a first experiment, we used a co-treatment with potassium iodide (KI, 5 mM)
(Tsukagoshi et al., 2010) and mannitol (5 mM) (Cuin and Shabala, 2007; Shen et al., 1997a;
Shen et al., 1997b; Voegele et al., 2005), shown to scavenge H2O2 and HO respectively. This
KI-mannitol co-treatment totally abolished the induction of the NSR sentinel genes (Fig. 6a). In a
second experiment, we investigated the respective role of KI and mannitol alone, or in
combination and also used diphenyleniodonium (DPI, NADPH oxidases inhibitor) (Orozco-
Cardenas et al., 2001; Tsukagoshi et al., 2010) and DMSO as a mock control. This experiment
confirmed that the inhibition of ROS production has a severe effect on NSR response. More
precisely, for NRT2.4 and NRT2.5, we recorded that KI and DPI strongly repressed the gene

81
response to N deprivation. For NRT2.5 and GDH3, the mannitol alone seems to also have an
effect as it dampens down transcriptional responses to N depletion. For NRT2.5 and GDH3, we
also found that DMSO may have an effect on its own. However, when DPI treatment was
compared to its DMSO mock control, it was significantly affecting NSR for the three sentinel
genes. These experiments demonstrate that ROS scavenging molecules are affecting plant
NSR. And that ROS are an essential activating potential second messenger of NSR.
Since i) HRS1 regulates ROS related genes (Fig. 5); and because ii) ROS production
seem to be important molecules for NSR and; and iii) HRS1 and HHOs are important regulators
of NSR themselves (Fig. 1-2); we wanted to know if the NSR control of HRS1 could have some
branch being ROS-dependent or, if it was a pure direct regulation. To do this we set up two
types of experiments:
-First, we demonstrated that the regulation of NRT2.4 and NRT2.5 loci happens through
the potential binding of HRS1 to the promoter of these genes (Fig. 7). To this end, we identified
a new potential HRS1 DNA-binding element by running the MEME algorithm (Bailey et al., 2009)
on the 500 bp upstream sequences of the most repressed HRS1 genes in the TARGET analysis
(List from repressed direct targets in Medici et al. (2015) (Medici et al., 2015)). This new HRS1
cis-element uncovered contains the GANNNTCTNGA consensus that resembles the consensus
motif of HHO2 and HHO3 revealed by DAP-seq in the work by O'Malley et al. (2016) (O'Malley
et al., 2016) (Fig. 7a). We used EMSA and competition assays with cold probes to demonstrate
that HRS1 had a specific affinity for this new motif, and that the conserved cytosine in the
sequence is not critical for the DNA-protein recognition, while the distal guanines play a
significant role (Fig. 7b-d). Interestingly, this HRS1 motif is found two times in each of the
promoters of the 3 sentinel genes as well as in NRT2.1 (Fig. 7e). We thus tested the binding of
HRS1 to probes made from the promoter sequences framing the HRS1 binding sites, and
validated that HRS1 is able to bind NSR sentinel genes in a promoter context (Fig. 7e-g). Our
results are strengthened by DAP-seq data (O'Malley et al., 2016), showing that HHOs sub-family
binding (Safi et al., 2017) is specially present in the promoter of the NRT2.4, NRT2.5, GDH3
genes. Interestingly no specific binding is recorded for KANADI2 or bZIP16 being respectively: a
G2-like as well but not in the same sub-family (Safi et al., 2017), or a bZIP (different TF family).
Taken together, DAP-seq (Sup Fig. 4), EMSA (Fig. 7), TARGET (Sup Fig. 1a), Over-
expression (Fig. 1; Sup Fig. 1b), mutant phenotype (Fig. 1-4; Sup Fig. 1b), suggests that HRS1
and its homologous genes directly repress the NSR sentinel genes.

-Second, we wanted to test if the HHO-related phenotypes could also be explained by a

default in a ROS production and/or accumulation. To this aim, by using Amplex® Red
measurements (Chakraborty et al., 2016; Shin et al., 2005; Shin and Schachtman, 2004), we
demonstrated that NSR early (within 6 hours) triggers ROS accumulation in root tissues of WT
plants consistent with previous observations (Shin et al., 2005; Shin and Schachtman, 2004).
We also found that this accumulation is lost in the 35S:HRS1 plants and reduced in the
35S:HHO1 genotype (Fig. 8a). Unexpectedly, the quadruple hrs/hho mutant did not display any
ROS accumulation changes. This could be explained by the fact that HRS1 and HHO1 over-
expressors may overproduce ROS scavenging proteins (as found for HRS1 in the TARGET
results), when the 4 mutations in the hrs/hho quadruple mutant are not enough to de-repress
them at the same level (due to functional redundancy) leading to a WT phenotype for ROS

82
accumulation in the mutant. This interesting observation will be important for future
investigations to uncouple the ROS dependent and independent branches of NSR controlled by
HRS1 and HHOs.
As we observed that ROS early accumulate in response to N starvation (Fig. 8a), we
decided to treat the double and quadruple hrs/hho mutants with KI-mannitol in this context (Fig.
8b). We found that ROS scavenging treatment indeed represses NSR sentinel genes in the
hhos mutants to the level of WT, totally abolishing the NSR and the mutant phenotype (Fig. 8b).
These results show that ROS scavenging agents are able to overcome the hhos mutant
phenotype.
In conclusion, we show that HHO genes directly control NSR sentinels (Fig. 7). We also
report that upon NSR, ROS are produced and participate to NSR activation. To a certain extent,
ROS accumulation can also explain phenotypes observed in HHO affected genotypes. Thus, we
conclude that HRS1 and HHO1 are able to reduce ROS accumulation and potentially reduce
NSR through a ROS-dependent and parallel branch of the signaling pathway (Fig. 8b and Fig.
9).

Discussion

To date the role of ROS as a potential messenger in NSR was hypothesized by several
groups (Krapp et al., 2011; Shin et al., 2005) but, to our knowledge, never formally
demonstrated. Previously, Shin et al. (2004) (Shin and Schachtman, 2004) demonstrated that
upon +K starvation, ROS accumulation through the action of RHD2 (NADPH-oxidase) was
important to sustain the full transcriptional activation of +K transporters. The same group (Shin
et al., 2005) also demonstrated that –P, and –N treatments trigger the production of ROS.
However, the direct role of ROS in the NSR was so far elusive. In the current work, we present
evidence that, preventing the production of ROS during NSR strongly represses the response of
the NSR sentinel genes (Fig. 6). Taken together, these above-mentioned research (Krapp et al.,
2011; Shin et al., 2005; Shin and Schachtman, 2004) and others (Balzergue et al., 2017;
Hoehenwarter et al., 2016; Mora-Macias et al., 2017; Muller et al., 2015), strongly support that
ROS are potential central hubs of the nutrient starvation responses. Because plant are able to
differentiate between the different nutritional deprivations, the next challenge will be to
understand how is the nutritional specificity of ROS production detected by cells? How is the
plant able to detect the ROS signal coming from N rather than a K deficiency? Some clue
probably lies into the cellular specificity of the ROS production (Shin et al., 2005). One could
also consider that ROS production is an independent and unspecific branch enhancing any kind
of nutrient deficiencies which specificities are encoded by genetic factors (as for Phosphate
starvation response [PSR], (Puga et al., 2014)). Further research will be necessary to sort this
out.
The second factor found in this work, to be a strong regulators of NSR sentinel genes is
HRS1. HRS1 was previously found to control the P response of primary root development (Liu
et al., 2009; Medici et al., 2015) and to control germination via an ABA dependent pathway (Wu
et al., 2012). HRS1 and its close HHO homologous genes are also very well known to be among
the most NO3- regulated gene in the Arabidopsis genome (Canales et al., 2014; Krouk et al.,
2010b; Wang et al., 2004). The very strong control of HHOs by NO3- seems to be important for

83
its functions. Previously, we showed that HRS1 NO3- regulation is necessary to integrate the
NO3- and the PO43- signal and to trigger appropriate primary root response (Medici et al., 2015).
Herein, the show using over-expressors, mutants, TARGET, EMSA, and DAP-seq data, that
HRS1 directly represses NRT2.4, NRT2.5 genes. These genes are activated upon N starvation
to retrieve NO3- traces in the soil solution. Thus, it seems critical for the plant to repress them (by
HRS1 TF activity) when NO3- is provided to N starved plants (Fig. 2). In this work, we generated
a genotype missing 4 HHOs (HRS1, HHO1, HHO2, HHO3). This genotype is unable to fully
repress the NRT2.4 and NRT2.5 loci (Kiba et al., 2012; Lezhneva et al., 2014). These four
mutations lead to an important enhancement of the HATS activity (~2.5 fold at 100 µM of
external NO3-), leading to an enhancement of growth (Fig. 4). To our knowledge this opens
original perspectives to develop genotypes with increased transport capacities in crops, and
improve NUE with potential long-term impact on global warming (see Introduction).

Conclusion
The model that we propose (Fig. 9) defines two new kinds of molecular actors
(HRS1/HHOs and ROS) in the control of plant to NSR (+N-N). We show that ROS are
produced upon NSR and that this response production is necessary for NSR sentinel gene
activation. We also show that HRS1 and HHO1 i) control ROS accumulation in response to
NSR, ii) directly repress NSR sentinel genes (NRT2.4. NRT2.5).

Material and Methods

Plant material. The Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants were in the Columbia-0
background. Mutant hrs1-1 (SALK_067074), hho1-1 (SAIL_28_D03) (Medici et al., 2015) hho2-1
(SALK_070096) and hho3-1 (SALK_146833) were obtained from ABRC seed stock center and
homozygote lines were screened by PCR. The double (hrs1;hho1), triple (hrs1;hho1;hho2) and
quadruple (hrs1;hho1;hho2;hho3) mutants has been obtained by crossings and PCR validation.
The promoter gene GFP lines were obtained by PCR and cloning of HRS1 from genomic
sequences, bringing 3-kb upstream promoter region and the gene, into pMDC107 Gateway-
compatible vector (Curtis and Grossniklaus, 2003).
Overexpressor lines were obtained by cloning HRS1- and HHO1-coding sequences into
pMDC32 Gateway-compatible vector (see Medici et al., 2015). The constructs were transferred
to Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 and used for the Arabidopsis transformation by the
floral dip method to transform Columbia or the quadruple mutant for complementation (Zhang et
al., 2006).

Growth conditions and treatments. Plants were grown in sterile hydroponic conditions for 14
days in day/night cycles (16/8 h; 90 µmol photons m-2 s-1) at 22°C as described in Krouk et al.
(2010) (Krouk et al., 2010b). Hydroponic media consisted of 1 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4,
0.25 mM K2SO4, 3 mM CaCl2, 0.1 mM Na-Fe-EDTA, 30 µM H3BO3, 5 µM MnSO4, 1 µM ZnSO4,
1 µM CuSO4, 0.1 µM (NH4)6Mo7O24, 5 µM KI; supplied with 3 mM sucrose, 0.5 mM ammonium
nitrate (1 mM KNO3 for results in figure 1) and 0.5 g L-1 MES. pH was adjusted to 5.7 by adding
KOH 1M. Plants were grown for 14 days in day/night cycles (16/8 h; 90 µmol photons m −2.s−1) at

84
22 °C. For +N  -N experiments, plants were transferred to an equivalent fresh nitrogen-free
medium or 0.5 mM ammonium nitrate containing medium (1 mM KNO3 for results in figure 1).
For -N  +N experiments, all plants have been nitrogen starved for 3 days, and then transferred
to an equivalent fresh medium containing 0.5 mM ammonium nitrate. Drug treatments for ROS
scavenging were added upon plants transfer to the new media. Roots (corresponding to
approximately 60 plants coming from a single phytatray) were harvested at different time points
and immediately frozen in liquid nitrogen. Each time point and genotype being harvested from a
different phytatray.
Experiments have been performed at least twice and representative data are reported in figures.
For non-sterile hydroponic culture, seeds were sown on Eppendorf taps with 1 mm whole filled
by H2O-agar 0.5% solution and grown during 7 days on H2O. Then, plants were transferred to
the same media as above (without sucrose) and supplied with 0.5 mM ammonium nitrate and
grown in short day light period (8h light 23°C and 16h dark 21°C) at 260 µmol photons m−2.s−1
and 70% humidity. Nutritive solution was renewed every 4 days for 5 weeks. Then plants were
transferred to an equivalent fresh nitrogen-free medium or 0.5 mM ammonium nitrate containing
medium (1 to 3 weeks for 15NO3- uptake experiments and 6h for ROS measurements).
For mutants complementation experiments (Fig. 2c), Columbia and
hrs1;hho1;hho2;hho3;pHRS1:HRS1:GFP sterilized seeds were sown on the surface of sterile
solid media (1% (w/v) agar) consisting of MS/2 basal salt medium containing no nitrogen,
supplemented with 3 mM sucrose, 0.5 mM ammonium nitrate, MES buffered at pH 5.7 (0.5 g L -
1
). Agar plates were incubated vertically in in vitro growth chamber for 12 days in day/night
cycles (16/8 h; 90 µmol photons m−2.s−1) at 22 °C.

Real-time qPCR analysis. Total RNAs were extracted from Arabidopsis roots using Trizol® and
digested with DNAseI (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). RNAs were then reverse transcribed to
one-strand complementary DNA using Thermo script RT (Invitrogen) according to the
manufacturer’s protocol. Gene expression was determined by quantitative PCR (LightCycler
480; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) using gene-specific primers (provided upon
request) and TAKARA mix (Roche, IN, USA). Expression levels of tested genes were
normalized to expression levels of the actin and clathrin genes as previously described in (Krouk
et al., 2010b).

Expression and purification of GST-HRS1 protein. The protocol was fully described in
(Medici et al., 2015). Briefly, HRS1 coding sequence were first cloned in the pDONR207 vector,
and then transferred to pDEST15 vector (Invitrogen) by LR reaction following the manufacturer’s
instructions. The GST-HRS1 fusion protein was expressed in Escherichia coli Rosetta
2(DE3)pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany). Transformed cells were grown in a phosphate-
buffered rich medium (Terrific broth) at 37°C containing appropriate antibiotics until the OD660
reached 0.7-0.8. After induction with 1 mM IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactoside) for 16 h at 22°
C, bacteria were harvested by centrifugation (6000 ×g, 10 min, 4°C) and suspended in 1X PBS
buffer containing lysozyme from chicken egg white (Sigma) and complete protease inhibitor
cocktail (Roche). The resulting cell suspension was sonicated and centrifuged at 15,000 g, for
15 min at 4°C to remove intact cells and debris. The proteins extract was mixed with buffered

85
glutathione sepharose beads (GE Healthcare, Freiburg, Germany), and incubated at 4°C for 3 h.
The resin was centrifuged (500 ×g, 10 min, 4°C) and washed five times with 1X PBS buffer.
GST-HRS1 was then eluted with 10 mM reduced glutathione (Sigma) in 50 mM Tris buffer and
dialyzed overnight in 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, pH 7.4 buffer.
All fractions were subjected to SDS-PAGE, and proteins concentrations were determined. For
proteins quantification, absorbance measurements were recorded on a nanodrop
spectrophotometer (Model No.1000, Thermo Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA) at 280
nm, and in parallel on a VICTOR2™ microplate reader (MULTILABEL COUNTER, life sciences)
at 660 nm using the Pierce 660 nm Protein Assay (Pierce/Thermo Scientific, Rockford)

Electophoretic Mobility Shift Assay. EMSA was performed using GST-HRS1 purified protein
and DNA probes labeled with Biotin-TEG at the 3′ end. Biotin-TEG 3′ end -labeled single-
stranded DNA oligonucleotides were incubated at 95 °C for 10 min and then annealed to
generate double-stranded DNA probes by slow cooling. The sequences of the oligonucleotide
probes were synthesized by Eurofins Genomics and are provided in Figure 7. The binding of the
purified proteins (~ 150 ng) to the Biotin-TEG labeled probes (20 fmol) was carried out using the
LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo Scientific, Waltham, USA) in 20 μL reaction
mixture containing 1X binding buffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, 1 mM DTT, pH 7.5), 2.5%
glycerol, 5 mM MgCl2, 2 µg of poly (dI-dC) and 0.05 % NP-40. After incubation at 24° C for 30
min, the protein–probe mixture was separated in a 4% polyacrylamide native gel at 100 V for 50
min then transferred to a Biodyne B Nylon membrane (Thermo Scientific) by capillary action in
20X SSC buffer overnight. After ultraviolet crosslinking (254 nm) for 90 s at 120 mJ.cm−2, the
migration of Biotin-TEG labeled probes was detected using horseradish peroxidase-conjugated
streptavidin in the LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Thermo Scientific) according to the
manufacturer's protocol, and then exposed to X-ray film.

ROS measurement. An Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit (Molecular

probes, Eugene, OR, USA) was used to measure H2O2 production in 6-week-old plants,
according to the manufacturer’s protocol. Six independent roots for each treatment and
genotype were frozen and ground in liquid N. All extraction protocol was carried out in a cold
room at 4 °C. Two hundred µl of phosphate buffer (50 mM K2HPO4, pH 7.4) was added to 50 mg
of ground frozen tissue. After 2 centrifugations at 14000 g for 10 min, 50 µl of the supernatant
was added to 50 µl of the Amplex® Red mixture (100 µM (10-acethyl-3,7-dihydrophenoxazine)
and 0.2 U/ml horseradish peroxidase) at room temperature (25 °C) for 30 min under dark
conditions. The absorbance was measured using VICTOR2™ microplate reader (MULTILABEL
COUNTER, life sciences) at 560 nm in 96-well transparent plates. A blank (containing 50 μL
phosphate buffer and 50 μL Amplex® Red reagent) was considered as a negative control. H2O2
quantities were reported to the exact powder mass of each sample. The absorbance was
measured twice in each point.

15
NO3- uptake
Influx of 15NO3- into the roots was assayed as described previously (Lejay et al., 1999). The
plants were sequentially transferred to 0.1 mM CaSO4 for 1 min and then, to basal nutrient
medium (pH 5.7) containing appropriate concentrations of K15NO3. In the labeling solution,

86
15
NO3- was used at 10 to 250 µM for HATS and 1 to 5 mM for LATS. After 5 min 15NO3-labeling,
roots were washed for 1 min in 0.1 mM CaSO4, harvested, dried at 70°C for 48 h and analyzed.
The total N content and atomic percentage 15N abundance of the samples were determined by
continuous-flow mass spectrometry, as described previously (Clarkson et al., 1996), using a
Euro-EA Eurovector elemental analyzer coupled with an IsoPrime mass spectrometer (GV
Instruments). Each uptake value is the mean +/- SE of 6 replicates (6 independent roots from
different plants).

Phylogenetic analysis. The phylogeny reconstruction was established as described in (Safi et

al., 2017) on the whole protein sequences. Briefly, the tree was built using the mafft algorithm
(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/, parameters: G-INS-1, BLOSUM62) and drawn with
FigTree. Different parameters including FFT-NS-2, FFT-NS-i, E-INS-i were used that yielded
very similar trees.

TF perturbation assays in the TARGET system. The TARGET procedure has been performed
as previously described in and (Bargmann et al., 2013; Medici et al., 2015). Protoplasts were
treated with 35 μM CHX (Cycloheximide) for 30 min, then 10 μM DEX (Dexamethasone) was
added and cell suspension was incubated in the dark over night at room temperature. Controls
were respectively treated with DMSO (dimethylsulfoxide) and ethanol.
The red fluorescent protein was used as marker selection for fluorescent-activated cell sorting
of successfully transformed protoplasts. Free nitrogen buffer was maintained during the whole
procedure (as compared to Medici et al. (2015) during which NO3- was maintained during the
TARGET procedure). RNA was extracted and amplified for hybridization with ATH1 Affymetrix
chips.
Transcriptomic analysis was performed using ANOVA followed by a Tukey test using R
(https://www.r-project.org/) custom made scripts following previously published procedures
(Obertello et al., 2010; Ristova et al., 2016). Clustering was perfomed using the MeV software
(http://mev.tm4.org/).
Briefly, the ANOVA analysis was carried out using the R aov() function on log2 MAS5-
normalized data. A probe signal has been modeled as follows: Yi = α1.DEX + α2.NO3 +
α3.NO3*DEX + ε; where α1 to α3 represent the coefficient quantifying the effect of each of the
factors (DEX, NO3) and their interaction (DEX*NO3), and ε represents the non-explained
variance. We determined the false discovery rate (FDR) to be <10% for an ANOVA pvalue-cutoff
of 0.01 and a Tuckey pvalue-cutoff of 0.01.

Acknowledgements

This work was supported by Agence Nationale de la Recherche (IMANA ANR-14-CE19-0008

with a doctoral fellowship to AS), by CNRS (LIA-CoopNet, PEPS-SuperRegNet) and by NSF
(IOS 1339362- NutriNet).

87
Figure Legends:

Figure 1. HRS1 and HHO1 are repressors of NSR sentinel genes. (a) Root response of
NRT2.4, NRT2.5 and GDH3 to NSR in Columbia, hrs1;hho1, 35S:HRS1 genotypes. Plants are
grown in sterile hydroponic conditions on N containing media for 14 days. At time 0, the media is
shifted to –N conditions for 0, 2, 4, 6 days or +N as a control. (b) Root response of NRT2.4,
NRT2.5 and GDH3 to NSR in Columbia WT, 35S:HRS1, 35S:HHO1 genotypes. Plants are
grown in sterile hydroponic conditions on N containing media for 14 days. Then the media is
shifted to –N conditions for 0, 1, 2, 4, 6 days or +N as a control (the media background is kept
unchanged). All transcript levels were quantified by qPCR and normalized to two housekeeping
genes (ACT and CLA), values are means ± s.e.m (n= 4). Asterisks indicate significant
differences from WT plants (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; Student’s t-test).

Figure 2. HHO subfamily is involved in repressing NSR sentinels after NO3- provision. (a)
Phylogenetic tree representing the GARP HHO subfamily. The tree was built as described in
Safi et al., (2017) using the mafft algorithm (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/, parameters: G-
INS-1, BLOSUM62) and drawn with FigTree. (b) Root response of NRT2.4, NRT2.5 and GDH3
to PNR following N starvation in Columbia WT, hrs1, hrs1;hho1, hrs1;hho1;hho2,
hrs1;hho1;hho2;hho3 genotypes. Plants are grown in sterile hydroponic conditions on full media
for 14 days, subjected to N starvation for 3 days and then resupplied with 0.5 mM NH 4NO3 for 0
(harvest before treatment), 15 min, 30 min, 1h, 2h, 3h, 4h (the media background is kept
unchanged). (c) pHRS1:HRS1:GFP is sufficient to complement the hrs1;hho1;hho2;hho3
quadruple mutant. Col, hrs1;hho1;hho2;hho3, hrs1;hho1;hho2;hho3;pHRS1:HRS1:GFP line 1
and line 2 (2 independent transformation events) are grown on petri dishes on 0.5 mM of
NH4NO3 for 12 days. Roots are harvested and transcripts are measured by qPCR. All transcript
levels were quantified by qPCR and normalized to two housekeeping genes (ACT and CLA),
values are means ± s.e.m (n= 4). Asterisks indicate significant differences from WT plants
(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; Student’s t-test).

Figure 3. HRS1 and HHO1 negatively control NO3- HATS. (a) NO3- uptake is altered in the
35S:HRS1 and in the double mutant hrs1;hho1. Plants were grown for 5 weeks on a N
containing media. The media is then shifted to –N conditions or +N as a control for 1 or 3 weeks.
Values are means ± s.e.m (n= 6). (b) One week starved plants were used to quantify NO3-
HATS and LATS activities as well as high affinity NO3- transporter transcript levels. qPCR are
normalized to two housekeeping genes (ACT and CLA), values are means ± s.e.m (n= 12). NO 3-
uptake measurements were performed on different 15NO3- concentrations (10, 100, 250 µM, 1
and 5 mM) to evaluate HATS and LATS. Values are means ± s.e.m (n= 6). The experiment was
performed exactly as mentioned for (a). Asterisks indicate significant differences from WT plants
(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; Student’s t-test).

88
Figure 4. The HHO subfamily represses NO3- uptake and growth in +N conditions. (a) NO3-
uptake is altered in the hrs1, hrs1;hho1, hrs1;hho1;hho2, hrs1;hho1;hho2;hho3 mutants. Plants
were grown for 6 weeks on N containing non-sterile hydroponics (0.5 mM NH4NO3). NO3- uptake
measurements were performed at 100 µM 15NO3- to evaluate the HATS. Values are means ±
s.e.m (n= 6). Asterisks indicate significant differences from WT plants (*P<0.05; **P<0.01;
***P<0.001; Student’s t-test). (b) Representative pictures of Col and the hrs1;hho1;hho2;hho3
quadruple mutant +N conditions at the day of the uptake experiment show a growth phenotype.

Figure 5. HRS1 direct genome-wide targets are largely NO3- dependent and contains
many redox related genes. TARGET procedure was performed with NO3- (data from Medici et
al. (2015)) and without NO3- (this work). An ANOVA analysis followed by a Tukey test retrieved
1050 HRS1 regulated genes (ANOVA pval cutoff 0.01, Tukey pval cutoff 0.01, FDR<10%). (a)
GeneCloud analysis (Krouk et al., 2015) of the 1050 direct targets of HRS1. (b) Clustering
analysis (Pearson correlation) was performed using MeV software (number of clusters was
determined by the FOM method). A selection of over-represented semantic terms is displayed in
front of each cluster. Remarkable redox related genes are displayed in the right column. The list
of each cluster, their related gene list, as well as their respective semantic analysis are provided
in Sup File 1.

Figure 6. ROS is necessary for the NSR response. (a) Altered response of NRT2.4, NRT2.5
and GDH3 by KI-mannitol treatment. Plants are grown in sterile hydroponic conditions on N-
containing media for 14 days. Thereafter, the media is shifted to –N conditions containing or not
5 mM of KI and 5 mM of mannitol for 0, 2, 4, 6 days or +N as a control. (b) Altered response of
NRT2.4, NRT2.5 and GDH3 by ROS scavenger treatment. Plants are grown in sterile
hydroponic conditions on N containing media for 14 days. Then plants were transferred to –N or
+N conditions for 0, 2, 4 days. In parallel, some of the N starved plants were treated with 5 mM
KI, 5 mM mannitol, combination of both or with 10 µM DPI. DMSO was used as mock treatment
of DPI. All transcript levels were quantified by qPCR and normalized to two housekeeping genes
(ACT and CLA), values are means ± s.e.m (n= 4). Asterisks indicate significant differences from
WT plants (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; Student’s t-test).

Figure 7. Identification of a new HRS1 cis-regulatory element and binding of HRS1 to the
NRT2.4 and NRT2.5 promoters. (a) HHOs target motifs. Weight matrix representation of the
motifs retrieved by the MEME algorithm analysis from the 500 bp sequences upstream the
transcription start sites of the down-regulated HRS1-target genes. HHO2 and HHO3 cis motifs
retrieved by DAP-seq (O'Malley et al., 2016). (b) Wild-type and mutated forms of the HRS1
target motif used in EMSA in c and d. (c) EMSA analysis on 48bp (4X repetition of HRS1 target
motif); Biotin-TEG labeled DNA probes (20 fmol), GST:HRS1 protein (150 ng). 200X excess of
the cold version of the same DNA probes was added in the third well. (d) EMSA analysis on
48bp (4X repetition of motifs listed in b); different concentrations of the cold version of the motif
or of the 3 mutated forms were added each time. (e) Schematic representation of NRT2.4,
NRT2.5, NRT2.1 and GDH3 genes showing potential HRS1 cis-motif in their promoters. (f)
EMSA analysis on 40-bp promoter fragments of NRT2.4 and NRT2.5. (g) List of the promoter

89
fragments sequences as well as HRS1 target motif used for EMSA analysis. Two promoter
fragments sequences were tested for each gene.

Figure 8. ROS is produced early after nitrogen deprivation, regulated by HRS1 and crucial
for the NSR. (a) H2O2 production after N deprivation. Plants were grown in non-sterile
hydroponics for 6 weeks on N containing media. Thereafter the media is shifted to –N conditions
or +N as a control for 6 hours. H2O2 accumulation was measured using Amplex Red (see
Material and Methods). Values are means ± s.e.m (n= 6). Different letters means significantly
differences (Student’s t-test, P < 0.05). (b) ROS scavenging treatment represses NSR sentinel
genes in the hhos mutants. Plants are grown in sterile hydroponic conditions on N containing
media for 14 days. Plants are then N-deprived for 3 days and treated with 5 mM of KI and 5 mM
of mannitol. Plants kept on the same renewed media were used as control. Values are means ±
s.e.m (n= 4).

Figure 9. Proposed model of the regulation of NSR by HHOs and ROS. On –N conditions,
ROS are produced and are needed for the NSR induction. When Nitrogen is present in the
media, HRS1 and its homologs are rapidly and highly expressed to repress the NSR either
directly by regulating the NRT2 and GDH3 promoter activities or indirectly by reducing ROS
production.

Supplementary Figure 1. NRT2.4 is down-regulated by HRS1 and HHO1. (a) HRS1

TARGET shows a direct repression of NRT2.4 in Arabidopsis root protoplasts data from Medici
et al., (2015) (b) NRT2.4 transcripts level in Wild-type, hrs1;hho1, 35SHRS1 and HHO1
genotypes (data from Medici et al., 2015).

Supplementary Figure 2. Characterization of quadruple mutant and OE lines.

(a) Characterization of HRS1 and HHO1 mRNA relative accumulations in 35S:HRS1 and
35S:HHO1 transgenic plants. (b) Characterization of the hrs1/hho quadruple mutant. The
absence of full length transcripts for HRS1, HHO1, HHO2 and HHO3 was verified by RT-PCR
(PCR ATG-Stop) on mRNA isolated from roots of hrs1;hho1;hho2;hho3 mutant grown for 14
days on MS/2 media (Clathrin was used as control).

Supplementary Figure 3. hrs1;hho1 double mutant displays growth phenotype in +N

conditions. Representative pictures of Col and the hrs1;hho1 double mutant. Plants were
grown for 6 weeks on N containing non-sterile hydroponics (0.5 mM NH4NO3).

Supplementary Figure 4. HHOs binding evidences in NR2.4, NRT2.5 and GDH3 promoters.
Data from DAP-seq (O'Malley et al., 2016) showing binding peaks of HHO family TFs in NR2.4,
NRT2.5 and GDH3 promoters. KAN2 (GARP family) and bZIP16 binding profiles were used as
controls. The second line of each TF correspond to the demethylated DNA version (ampDAP-
seq) used for DAP-seq binding.

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reductase-null mutant of Arabidopsis. Plant Physiol 136:2512-2522.

94
Wang, R., Xing, X., Wang, Y., Tran, A., and Crawford, N.M. (2009). A genetic screen for nitrate
regulatory mutants captures the nitrate transporter gene NRT1.1. Plant Physiol 151:472-
478.
Wu, C., Feng, J., Wang, R., Liu, H., Yang, H., Rodriguez, P.L., Qin, H., Liu, X., and Wang, D.
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transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc 1:641-646.
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nitrogen-starvation responses in Arabidopsis. New Phytol 190:906-915.

95
 a
2.0 NRT2.4

Relative mRNA level

**  
1.5

1.0 2.0
**   Col (+N)
Col-0 (+N)
1.5 Col (-N)
Col-0 (-N)

mRNA level
*
0.5 **   *  
***   hrs1:hho1
hrs1;hho1 (-N)
(-N)
1.0 35S:HRS1 (-N)
0.0 35S:HRS1 (-N)
0 0.5 2 4 6
Days
0.0
0 2 4 6
Days
3 NRT2.5 **   1.5 GDH3

Relative mRNA level

Relative mRNA level

1.0 **  
2

*   **  
1 *   0.5 **  
**   **   *  
**   **   ***  
0 0.0
0 2 4 6 0 2 4 6
Days Days

b 2.5 NRT2.4
Relative mRNA level

2.0 *  

1.5 **   2.5
***   NRT2.4 Col
Col-0
2.0 **  
1.0 ***   35S:HRS1
35S:HRS1
mRNA level

1.5 35S:HHO1
35S:HHO1
0.5
1.0
0.0 0.5
0 1 2 4 6
0.0
Days
4 0 1 2 4 6 3
Relative mRNA level

GDH3
Relative mRNA level

NRT2.5 Days

3
2 ***  
*   ***  
2 *   *  
***   ***   * **  
***   **  
**   1
1 ***   ***  
**   *
*  
0 0
0 1 2 4 6 0 1 2 4 6
Days Days

Figure  1.  HRS1  and  HHO1  are  repressors  of  NSR  sen6nel  genes.  (a)  Root  response  of  
NRT2.4,  NRT2.5  and  GDH3  to  NSR  in  Columbia,  hrs1;hho1,  35S:HRS1  genotypes.  Plants  are  
grown  in  sterile  hydroponic  condiBons  on  N  containing  media  for  14  days.  At  Bme  0,  the  
media  is  shiFed  to  –N  condiBons  for  0,  2,  4,  6  days  or  +N  as  a  control.  (b)  Root  response  of  
NRT2.4,  NRT2.5  and  GDH3  to  NSR  in  Columbia  WT,  35S:HRS1,  35S:HHO1  genotypes.  Plants  
are  grown  in  sterile  hydroponic  condiBons  on  N  containing  media  for  14  days.  Then  the  
media  is  shiFed  to  –N  condiBons  for  0,  1,  2,  4,  6  days  or  +N  as  a  control  (the  media  
background  is  kept  unchanged).  All  transcript  levels  were  quanBfied  by  qPCR  and  
normalized  to  two  housekeeping  genes  (ACT  and  CLA),  values  are  means  ±  s.e.m  (n=  4).  
96
 $7*.$1
$7*.$1
$7*
$7*$76.$1
$7*
a $7*$W1,*7+56
AT1G13300 HRS1 d
AT3G25790 HHO1
$7*++2 NRT2.4
AT1G25550 HHO3
$7*++2
6   Col-0
Col-0
AT1G68670 HHO2
$7*++2
hrs1;hho1;hho2;hho3
hrs1;hho1;hho2;hho3
AT2G03500 HHO4
$7*++2()0
hrs1;hho1;hho2;hho3:pHRS1:HRS1:GFP1
hrs1;hho1;hho2;hho3;pHRS1:HRS1:GFP line 1

mRNA level
AT4G37180
4 HHO5
$7*++2
AT1G49560 HHO6
$7*++2 hrs1;hho1;hho2;hho3:pHRS1:HRS1:GFP2
hrs1;hho1;hho2;hho3;pHRS1:HRS1:GFP line 2
$7* hrs1;hho1;hho2;hho3:pHRS1:HRS1:GFP3
$7*
2
NRT2.4
b 4 6
NRT2.4 **  
Col
Col-0

Relative mRNA level

3 4 NRT2.4 ***   0 hrs1
hrs1
Relative mRNA level

**  
mRNA level

4
**  
**   **  
**  
*  
*  
hrs1:hho1
hrs1;hho1
2 **   hrs1:hho1:hho2
hrs1;hho1;hho2
3 *  
1
hrs1:hho1:hho2:hho3
hrs1;hho1;hho2;hho3 2

2 **   ***  
**   **  
**   **  
0 **   **  
*   0
1 *   **  
h

h
0

in

in

**  
1

4
m

**  
15

30

Time * 1.5
NRT2.5
***  
0

Relative mRNA level

0
in

in

1.0
1

4
m

m
15

30

Time c 1.5
NRT2.4 ***  
0.5
Relative mRNA level

5 NRT2.5
Relative mRNA level

1.0
*
* ***   **  
*  
4 *   *   0.5 0.0
**  
* **   2.0
3 **   **   GDH3
*   0.0

*  
Relative mRNA level

**   1.5 ***  
2 *
**  
**   * 1.0
1 * **  
**   *  
0 0.5
*  
**  
0
in

in

0.0
1

4
m

m
15

30

Time
Figure  2.  HHO  subfamily  is  involved  in  repressing  NSR  sen6nels  a@er  
5 GDH3 NO3-­‐  provision.  (a)  PhylogeneBc  tree  represenBng  the  GARP  HHO  
Relative mRNA level

* subfamily.  The  tree  was  built  as  described  in  Safi  et  al.,  (2017)  using  the  
* maZ  algorithm  (h[p://maZ.cbrc.jp/alignment/server/,  parameters:  G-­‐
4 *  
*
**   INS-­‐1,  BLOSUM62)  and  drawn  with  FigTree.  (b)  Root  response  of  NRT2.4,  
**  
NRT2.5  and  GDH3  to  PNR  following  N  starepresenBng  the  GARP  HHO  
3 **  
**  
* **   subfamily.  The  tree  was  built  as  described  in  SrvaBon  in  Columbia  WT,  
**   * **   **  
*   **   hrs1,  hrs1;hho1,  hrs1;hho1;hho2,  hrs1;hho1;hho2;hho3  genotypes.  
* **   *  
2 Plants  are  grown  in  sterile  hydroponic  condiBons  on  full  media  for  14  
days,  subjected  to  N  starvaBon  for  3  days  and  then  resupplied  with  0.5  
1 mM  NH4NO3  for  0  (harvest  before  treatment),  15  min,  30  min,  1h,  2h,  
3h,  4h  (the  media  background  is  kept  unchanged).  (c)  NRT2.4  expression  
0 2  hours  aFer  N  supply  showing  an  addiBve  de-­‐repression  effect  
following  sequenBal  deleBon  of  HHOs  genes.  (d)  pHRS1:HRS1:GFP  is  
0
in

in

sufficient  to  complement  the  hrs1;hho1;hho2;hho3  quadruple  mutant.  

1

4
m

Col,  hrs1;hho1;hho2;hho3,  hrs1;hho1;hho2;hho3;pHRS1:HRS1:GFP  line  1  

15

30

Time and  line  2  (2  independent  transformaBon  events)  are  grown  on  petri  
dishes  on  0.5  mM  of  NH4NO3  for  12  days.  Roots  are  harvested  and  
transcripts  are  measured  by  qPCR.  All  transcript  levels  were  quanBfied  
by  qPCR  and  normalized  to  two  housekeeping  genes  (ACT  and  CLA),  
values  are  means  ±  s.e.m  (n=  4).  
97
 a
6 hrs1;hho1
Col-0
µmole N.gDW -1 h-1 35S:HRS1
4
*
*
2 ***  

0
-N 1 week -N 3 week

10 µM [K15NO3]

b 60
hrs1;hho1
Col-0 *
µmole N.gDW -1 h-1

35S:HRS1
40

20 *

*
*
* ***  
*  
0 *  
10 uM 100 uM 250 uM 1 mM 5 mM

[K15NO3]

3 NRT2.4 1.5 NRT2.5 2.5 NRT2.1

***  
Relative mRNA level

2.0
*
mRNA level

mRNA level

2 1.0
1.5
***  
1.0 **  
1 0.5
***  
0.5
0 0.0 0.0

Figure  3.  HRS1  and  HHO1  nega6vely  control  NO3-­‐  HATS.  (a)  NO3-­‐  uptake  is  altered  in  the  
35S:HRS1  and  in  the  double  mutant  hrs1;hho1.  Plants  were  grown  for  5  weeks  on  a  N  
containing  media.  The  media  is  then  shiFed  to  –N  condiBons  or  +N  as  a  control  for  1  or  3  
weeks.  Values  are  means  ±  s.e.m  (n=  6).  (b)  One  week  starved  plants  were  used  to  quanBfy  
NO3-­‐  HATS  and  LATS  acBviBes  as  well  as  high  affinity  NO3-­‐  transporter  transcript  levels.  qPCR  
are  normalized  to  two  housekeeping  genes  (ACT  and  CLA),  values  are  means  ±  s.e.m  (n=  12).  
NO3-­‐  uptake  measurements  were  performed  on  different  15NO3-­‐  concentraBons  (10,  100,  
250  µM,  1  and  5  mM)  to  evaluate  HATS  and  LATS.  Values  are  means  ±  s.e.m  (n=  6).  The  
experiment  was  performed  exactly  as  menBoned  for  (a).    
98
 a
30
30 ***  
µmole N.gDW -1 h-1

Col
Col-0
20 ***   Legend
hrs1
20 ***  
*   hrs1:hho1
hrs1;hho1
hrs1:hho1:hho2
hrs1;hho1;hho2
10
hrs1:hho1:hho2:hho3
hrs1;hho1;hho2;hho3
10
0

100 µM [K15NO3]
0 b

Col-0 hrs1;hho1;hho2;hho3

Figure  4.  The  HHO  subfamily  represses  NO3-­‐  uptake  and  growth  in  +N  condi6ons.  (a)  
NO3-­‐  uptake  is  altered  in  the  hrs1,  hrs1;hho1,  hrs1;hho1;hho2,  hrs1;hho1;hho2;hho3  
mutants.  Plants  were  grown  for  6  weeks  on  N  containing  non-­‐sterile  hydroponics  (0.5  mM  
NH4NO3).  NO3-­‐  uptake  measurements  were  performed  at  100  µM  15NO3-­‐  to  evaluate  the  
HATS.  Values  are  means  ±  s.e.m  (n=  6).  (b)  RepresentaBve  pictures  of  Col  and  the  
hrs1;hho1;hho2;hho3  quadruple  mutant  +N  condiBons  at  the  day  of  the  uptake  
experiment  show  a  growth  phenotype.  

99
 Figure  5.  HRS1  direct  genome-­‐wide  
loss−of−function
targets  are  largely  NO3-­‐  dependent  and  
a
phosphopantetheine
interpro−ipr001128
voltage
monooxygenase interpro−ipr001023 contains  many  redox  related  genes.  
chaperone n−terminal heterodimerization TARGET  procedure  was  performed  with  
NO3-­‐  (data  from  Medici  et  al.  (2015)  46)  
reduction interpro−ipr002068
inflorescence

polyubiquitin
expansion beta−xylosidase
stress interpro−ipr006162 and  without  NO3-­‐  (this  work).  An  ANOVA  
abundant reductase
analysis  followed  by  a  Tukey  test  
17−6a interpro−ipr008978
moderate
retrieved  1050  HRS1  regulated  genes  
embryo differentiation oxidation (ANOVA  pval  cutoff  0.01,  Tukey  pval  
chloroplast heat shock
e−class dehydrin
lp−04 hsp90
intensity
cutoff  0.01,  FDR<10%).  (a)  GeneCloud  
oxygen
high atp
membrane cognate analysis  (Krouk  et  al.,  2015)  of  the  1050  
folding hsp20−like
70−1 lea
aaa−2
xerocarrier
interpro−ipr000167
direct  targets  of  HRS1.  (b)  Clustering  
c−terminal hsf petal anthesisp450
aromatic
interpro−ipr013093
analysis  (Pearson  correlaBon)  was  
peroxide hsp20 hsp70 polypeptide performed  using  MeV  soFware  (number  
interpro−ipr018181 substrate
uracil
of  clusters  was  determined  by  the  FOM  
interpro−ipr013126 upregulated method).  A  selecBon  of  over-­‐
interpro−ipr002401
interpro−ipr017972 represented  semanBc  terms  is  displayed  
interpro−ipr003591 in  front  of  each  cluster.  Remarkable  
redox  related  genes  are  displayed  in  the  
right  column.  The  list  of  each  cluster,  
b Over  represented    
semanBc  terms   Remarkable  genes     their  related  gene  list,  as  well  as  their  
(GeneCloud)   (redox  related)   respecBve  semanBc  analysis  are  
(FDR  corrected  pvalues)    
rep3  

provided  in  Sup  File  1.    

rep2  
rep1  
rep1  

rep3  
rep3  
rep2  
rep3  

rep2  
rep1  
rep2  
rep1  

C1
SBmulus  0.039  
Interpro-­‐ipr018247  0.039  
C10 Pyridine  0.039  
Wall  0.039   MDAR3,    RHD2  (RBOHC)  
Ef-­‐hand  0.039  
Oxygen  0.046  

C4 Peroxysome  0.0254  
Redox  0.0186  

Arabinogalactan-­‐protein  0.026   UPM1  

AromaBc  0.027   Catalase1  
C12 Bilateral  0.042   At1g22480  Cupredoxin  
Chloroplast  0.033   At3g07480  2Fe-­‐2S  ferredoxin-­‐like  
Interpro-­‐ipr003591  (LRR)  0.0099   At3g45810  ferric  reductase-­‐like  
Uracil  0.0099   At2g21510  DNAJ  heat  shock  
At4g37200  HCF164  Thioredoxin  

Lea  2.84e-­‐07        
C8 Embryogenesis  7.31e-­‐06  
Water  0.012  

C5 At3g62930  Glutaredoxin-­‐like  
At4g36040  Chaperone  DnaJ-­‐domain  

Heat  3.69e-­‐29   HSP20-­‐like  

C2 Shock  1.02e-­‐27   HSP21,  DNAJ  Heat  Shock,  HSP23.6,  
Peroxyde  1.45e-­‐06   HSP17.6A,  HSFA2,  HSP70…  
Oxygen  0.0109  

C7

C6 At4g21580  Oxydoreductase  
ATHM1  (Thioredoxin)  

C3 Heat  0.00356  
Oxyda6on  0.00814  
C9
Jmjc  0.0017  
C11 Interpro-­‐ipr013129  0.0052  
Jumonji  0.0052  

- + - + DEX
- + NO3-

100
 a
Relative mRNA level 2.0 NRT2.4

1.5

1.0 +N
-N
0.5 **  
-N +KI +Mannitol
**   **  
0.0
0 2 4 6
Days
2.0 NRT2.5 1.5 GDH3

Relative mRNA level

Relative mRNA level

1.5
1.0
1.0
*  
0.5
0.5
**   **   *   **   **  
0.0 0.0
0 2 4 6 0 2 4 6
Days Days

b
3
Relative mRNA level

NRT2.4 -N
-N

32 -N+KI
-N +KI
-N+Mannitol
-N +Mannitol
level

*  
21 -N+KI
-N +KI +Mannitol
+Mannitol
***  
***   ***   -N+DPI
-N +DPI
Relative mRNA level mRNA

***   ***  
***   -N+DMSO
-N +DMSO
10
0 2 4
5 Days 4
Relative mRNA level

04 NRT2.5 GDH3
0 2 4***   3
3 Days ***  
***   2 ***  
***  
***  
2 ***   ***  
***  
***  
1 ***  
1 ***  
***  
***  
***   ***   ***  
***   ***  
0 0
0 2 4 0 2 4
Days Days

Figure  6.  ROS  is  necessary  for  the  NSR  response.  (a)  Altered  response  of  NRT2.4,  NRT2.5  and  GDH3  by  
KI-­‐mannitol  treatment.  Plants  are  grown  in  sterile  hydroponic  condiBons  on  N-­‐containing  media  for  14  
days.  ThereaFer,  the  media  is  shiFed  to  –N  condiBons  containing  or  not  5  mM  of  KI  and  5  mM  of  
mannitol  for  0,  2,  4,  6  days  or  +N  as  a  control.  (b)  Altered  response  of  NRT2.4,  NRT2.5  and  GDH3  by  
ROS  scavenger  treatment.  Plants  are  grown  in  sterile  hydroponic  condiBons  on  N  containing  media  for  
14  days.  Then  plants  were  transferred  to  –N  or  +N  condiBons  for  0,  2,  4  days.  In  parallel,  some  of  the  N  
starved  plants  were  treated  with  5  mM  KI,  5  mM  mannitol,  combinaBon  of  both  or  with  10  µM  DPI.  
DMSO  was  used  as  mock  treatment  of  DPI.  All  transcript  levels  were  quanBfied  by  qPCR  and  
normalized  to  two  housekeeping  genes  (ACT  and  CLA),  values  are  means  ±  s.e.m  (n=  4).  
101
 a d Mo6f  7   M7-­‐mut1  
MEME results of HRS1 direct DAP-seq
             Comp  (X)          -­‐          -­‐          10      25        50      200      10      25      50      200                            
repressed gene promotors              HRS1-­‐GST          -­‐          +          +          +          +          +          +        +          +          +            

HHO2  

HHO3  

b c Mo6f  7   M7-­‐mut2   M7-­‐mut3  

     Comp  (X200)                      -­‐              -­‐                +                                        Comp  (X)              -­‐          -­‐          10      25        50      200      10      25      50      200                            
                 HRS1-­‐GST                  -­‐              +              +                  HRS1-­‐GST              -­‐          +          +          +          +          +          +        +          +          +            
M7  (Mo6f7)          5’-­‐GATGTTTCTAGA-­‐3’  
M7-­‐mut1                    5’-­‐TATGTTTCTATA-­‐3’  
M7-­‐mut2                    5’-­‐GATGTTTATAGA-­‐3’  
M7-­‐mut3                    5’-­‐TATGTTTATATA-­‐3’  

e
-­‐285    -­‐246  
-­‐298    -­‐287  

NRT2.4   NRT2.1  
-­‐816    -­‐777   -­‐515    -­‐505  

-­‐788    -­‐749           -­‐39    -­‐28  

NRT2.5   GDH3  
-­‐899    -­‐860   -­‐244    -­‐233  

f g
Mo6f  7   NRT2.4  F       NRT2.4  R      NRT2.5  F       NRT2.5  R      
HRS1-­‐GST                -­‐            +          -­‐            +          -­‐            +          -­‐            +            -­‐          +            
M7  (Mo6f7)                                                                              5’-­‐GATGTTTCTAGA-­‐3’  
pNRT2.4  F              5’-­‐CTCAAAAAAATTAGAATGTTTAAAGTAGATAATGCAAACA-­‐3’  
pNRT2.4  R                  5’-­‐AAGGTTTTCTGGTTTTTCTTTCTAGATGAAAAATAAAATA-­‐3’    
pNRT2.5  F                5’-­‐CACCCAAGTTTAACGATTTTTATCGTTAATTTTCTTTAGG-­‐3’  
pNRT2.5  R                5’-­‐TTCGAACCTCGATCGATGTTTTCAGAGATTGTACCATGAG-­‐3’  

Figure  7.  Iden6fica6on  of  a  new  HRS1  cis-­‐regulatory  element  and  binding  of  HRS1  to  the  NRT2.4  and  
NRT2.5  promoters.  (a)  HHOs  target  moBfs.  Weight  matrix  representaBon  of  the  moBfs  retrieved  by  
the  MEME  algorithm  analysis  from  the  500  bp  sequences  upstream  the  transcripBon  start  sites  of  the  
down-­‐regulated  HRS1-­‐target  genes.  HHO2  and  HHO3  cis  moBfs  retrieved  by  DAP-­‐seq  (O'Malley  et  al.,  
2016).  (b)  Wild-­‐type  and  mutated  forms  of  the  HRS1  target  moBf  used  in  EMSA  in  c  and  d.  (c)  EMSA  
analysis  on  48bp  (4X  repeBBon  of  HRS1  target  moBf);  BioBn-­‐TEG  labeled  DNA  probes  (20  fmol),  
GST:HRS1  protein  (150  ng).  200X  excess  of  the  cold  version  of  the  same  DNA  probes  was  added  in  the  
third  well.  (d)  EMSA  analysis  on  48bp  (4X  repeBBon  of  moBfs  listed  in  b);  different  concentraBons  of  
the  cold  version  of  the  moBf  or  of  the  3  mutated  forms  were  added  each  Bme.  (e)  SchemaBc  
representaBon  of  NRT2.4,  NRT2.5,  NRT2.1  and  GDH3  genes  showing  potenBal  HRS1  cis-­‐moBf  in  their  
promoters.  (f)  EMSA  analysis  on  40-­‐bp  promoter  fragments  of  NRT2.4  and  NRT2.5.  (g)  List  of  the  
promoter  fragments  sequences  as  well  as  HRS1  target  moBf  used  for  EMSA  analysis.  Two  promoter  
fragments  sequences  were  tested  for  each  gene.  

102
a
0.25
b  
H2O2 (nmol mg-1/FW)

0.20
b  
0.15

a   acd   a  
0.10 a  
d  
c  
0.05

0.00
+   -   +   -   +   -   +   -   N  

b NRT2.4
5 5
NRT2.4 Legend
-N
Relative mRNA level

4 4 Legend
-N +KI +Mannitol
+N
+N
mRNA level

3
3
2
2
Figure  8.  ROS  is  produced  early  a@er  nitrogen  
1
depriva6on,  regulated  by  HRS1  and  crucial  for  
1
0
the  NSR.  (a)  H2O2  producBon  aFer  N  deprivaBon.  
Plants  were  grown  in  non-­‐sterile  hydroponics  for  6  
0 5
weeks  on  N  containing  media.  ThereaFer  the  
media  is  shiFed  to  –N  condiBons  or  +N  as  a  
Relative mRNA level

4 NRT2.5
control  for  6  hours.  H2O2  accumulaBon  were  
3 measures  using  Amplex  Red  (see  Material  and  
Methods).  Values  are  means  ±  s.e.m  (n=  6).  
2 Different  le[ers  means  significantly  differences  (T-­‐
test,  p  value  <  0.05).  (b)  ROS  scavenging  
1 treatment  represses  NSR  senBnel  genes  in  the  
hhos  mutants.  Plants  are  grown  in  sterile  
0
hydroponic  condiBons  on  N  containing  media  for  
4 14  days.  Plants  are  then  N-­‐deprived  for  3  days  and  
GDH3 treated  with  5  mM  of  KI  and  5  mM  of  mannitol.  
Relative mRNA level

3 Plants  kept  on  the  same  renewed  media  were  

used  as  control.  Values  are  means  ±  s.e.m  (n=  4).  
2

Col-0 hrs1;hho1 hrs1;hho1;

hho2;hho3 103
 +N -N

HRS1 ROS
(H2O2)
HHOs

NRT2.4 High Affinity NO3- transport

NRT2.5
GDH3 Nitrogen recycling

Figure  9.  Proposed  model  of  the  regula6on  of  NSR  by  HHOs  and  ROS.  On  –N  condiBons,  
ROS  are  produced  and  are  needed  for  the  NSR  inducBon.  When  Nitrogen  is  present  in  the  
media,  HRS1  and  its  homologs  are  rapidly  and  highly  expressed  to  repress  the  NSR  either  
directly  by  regulaBng  the  NRT2  and  GDH3  promoter  acBviBes  or  indirectly  by  reducing  ROS  
producBon.  

104
 a
15
NRT2.4
Relative mRNA level

10

0
- + - + DEX
- - + + NO3-

b 20 NRT2.4
Col-0
hrs1;hho1
Relative mRNA level

35S:HRS1
15
35S:HHO1

10

Supplementary  Figure  1.  NRT2.4  is  down-­‐regulated  by  HRS1  and  HHO1.  (a)  HRS1  
TARGET  shows  a  direct  repression  of  NRT2.4  in  Arabidopsis  root  protoplasts  data  
from  Medici  et  al.,  (2015)  (b)  NRT2.4  transcripts  level  in  Wild-­‐type,  hrs1;hho1,  
35SHRS1  and  HHO1  genotypes  46  (data  from  Medici  et  al,  (2015)).  

105
 a
6 HRS1 6 HHO1
***   ***  

Relative mRNA level

Relative mRNA level

4 4

2 2

0 0

b
HRS1   HHO1  HHO2  HHO3   CLA   HRS1   HHO1  HHO2  HHO3   CLA  
1  Kb  

250  bp  

Col-0 hrs1;hho1;hho2;hho3

Supplementary  Figure  2.  Characteriza6on  of  quadruple  mutant  and  OE  lines.  
(a)  CharacterizaBon  of  HRS1  and  HHO1  mRNA  relaBve  accumulaBons  in  35S:HRS1  and  
35S:HHO1  transgenic  plants.  (b)  CharacterizaBon  of  the  hrs1/hho  quadruple  mutant.  
The  absence  of  full  length  transcripts  for  HRS1,  HHO1,  HHO2  and  HHO3  was  verified  by  
RT-­‐PCR  (PCR  ATG-­‐Stop)  on  mRNA  isolated  from  roots  of  hrs1;hho1;hho2;hho3  mutant  
grown  for  14  days  on  MS/2  media  (Clathrin  is  used  as  control).  

106
 Col-0

hrs1;hho1

Supplementary  Figure  3.  hrs1;hho1  double  mutant  displays  growth  phenotype  in  
+N  condi6ons.  RepresentaBve  pictures  of  Col  and  the  hrs1;hho1  double  mutant.  
Plants  were  grown  for  6  weeks  on  N  containing  non-­‐sterile  hydroponics  (0.5  mM  
NH4NO3).  

107
 NRT2.4

HRS1
HHO2

HHO3

HHO4  
HHO5

HHO6

KAN2

bZIP16

NRT2.5

HRS1
HHO2

HHO3

HHO4  
HHO5

HHO6

KAN2

bZIP16

GDH3

HRS1
HHO2

HHO3

HHO4  
HHO5

HHO6

KAN2

bZIP16

Supplementary  Figure  4.  HHOs  binding  evidences  in  NR2.4,  NRT2.5  and  GDH3  promoters.  
Data  from  DAP-­‐seq  (O'Malley  et  al.,  2016)  showing  binding  peaks  of  HHO  family  TFs  in  
NR2.4,  NRT2.5  and  GDH3  promoters.  KAN2  (GARP  family)  and  bZIP16  binding  profiles  were  
used  as  controls.  The  second  line  of  each  TF  correspond  to  the  demethylated  DNA  version  
(ampDAP-­‐seq)  used  for  DAP-­‐seq  binding.   108
3. Conclusion et perspectives
L’ensemble des résultats obtenus dans cette partie montre que HRS1 fonctionne de
manière redondante avec ces homologues (HHO1 à HHO3) pour inhiber la réponse à la
carence en azote. Cette inhibition se fait via une répression directe des gènes marqueurs de
cette voie de signalisation par ces FT. Ainsi comparé au sauvage, le quadruple mutant
hrs1;hho1;hho2;hho3 est affecté dans le niveau d’expression des gènes NRT2.1, NRT2.4 et
NRT2.5 conduisant à une meilleure capacité à transporter le nitrate. En utilisant d’autres
approches (crible simple hybride sur le promoteur de NRT2.4, délétions de promoteurs
fusionnés au gène rapporteur GUS), les mêmes résultats ont été obtenus par un laboratoire
japonais (Kiba, Submitted).
Dans nos expériences nous montrons aussi que l’établissement de la NSR dépend
étroitement des ROS et qu’un défaut de production de ROS affecte profondément cette
réponse. Une production de ROS suite à des carences nutritionnelles est un phénomène connu
depuis quelques années (Shin et al., 2005; Shin and Schachtman, 2004), mais leur implication
dans la régulation de la NSR est une nouveauté. Récemment, un mécanisme de fixation de
monoxyde d’azote (•NO) a été rapporté chez Arabidopsis. L’assimilation du •NO atmosphérique
constitue une alternative pour des plantes cultivées dans des conditions limitées en azote
(Kuruthukulangarakoola et al., 2017).
Outre la régulation directe des gènes de la NSR, la famille HRS1/HHO semble aussi
contrôler la réponse à la carence en N indirectement en inhibant l’accumulation des ROS. Des
facteurs de transcription de la famille G2-like, GLK1/2 et PHL1, se sont révélés aussi être
impliqués respectivement dans la tolérance de l’ozone (fait partie des ROS) (Nagatoshi et al.,
2016) et dans l’accumulation de proline suite à la carence en phosphate (Aleksza et al., 2017).
La proline étant un acide aminé impliqué dans la détoxication des ROS (Chen and Dickman,
2005; Gill and Tuteja, 2010; Trovato et al., 2008).
Des expériences complémentaires sont en cours pour confirmer la régulation de la
production des ROS par les HHOs. Des études sur des mutants NADPH oxydases seront
également réalisées dans le but d'identifier le mécanisme génétique qui associerait les ROS à la
NSR.

109
 Chapitre 5: HRS1 est-il un FT qui
régule à la fois des gènes nucléaires
et des gènes plastidiaux?

110
1. Introduction et contexte
Les organismes eucaryotes supérieurs ont besoin de coordonner et d'harmoniser le
fonctionnement de leurs organites via un réseau de signalisations intracellulaires inter-
organelles (Brautigam et al., 2009; Grimm et al., 2014). Les signaux qui partent du noyau pour
réguler le fonctionnement des organites sont groupés sous le nom de signalisation antérograde
et ceux qui vont dans le sens opposé constituent la signalisation rétrograde (Grimm et al.,
2014). Parmi ces organites, les mitochondries et les plastes (issus de l'endosymbiose d’une
cellule eucaryote primitive avec respectivement une α-protéobactérie et une cyanobactérie)
montrent une complexité particulière dans leur structure et les processus de signalisation
associés (Andersson et al., 1998; Douglas and Raven, 2003; Gray, 1992; Ochoa de Alda et al.,
2014 ).
La coévolution entre les plastes primitifs et les premières cellules végétales a donné lieu
à différents types de plastes (Leon et al., 2012). Les proplastes sont les progéniteurs de tous les
autres types de plastes. Ils ne possèdent pas de couleur ni une morphologie distincte. Les
plastes photosynthétiques sont appelés chloroplastes et bien qu'ils soient principalement
associés à la photosynthèse au niveau des feuilles, ils sont également présents dans les fruits
immatures, les cotylédons et les embryons. Dans des conditions de privation de lumière, les
proplastes peuvent se transformer en étioplastes caractérisés par leur couleur jaune en raison
de l’accumulation de protochlorophylle. Les proplastes peuvent également évoluer pour donner
des chromoplastes ou des leucoplastes. Les chromoplastes contiennent des teneurs élevées en
caroténoïdes et se trouvent dans les organes colorés tels que les pétales et les fruits. Les
leucoplastes par contre, sont incolores et peuvent être classés en 3 types selon la substance
stockée: les oléoplastes (lipides), les protéinoplastes (protéines) ou les amyloplastes (amidon)
(Neuhaus and Emes, 2000; Vothknecht and Westhoff, 2001). Ces derniers sont présents dans
les tissus de stockage et dans les racines et peuvent se différencier en organites spécialisés
impliqués dans la perception de la gravité, ils sont alors appelés statolithes (Sack, 1997
#2673;Kordyum, 2001 #2671}.
Bien que les signaux plastidiaux soient communément associés à des régulations de
l'expression des gènes nucléaires codant des protéines plastidiales, il est cependant
vraisemblable que les signaux rétrogrades sont apparus avant même le transfert des gènes
plastidiaux vers le noyau. En effet, suite à son intégration endosymbiotique et contrairement à la
cellule hôte, le chloroplaste primitif aurait nécessité de la lumière pour sa prolifération. Par
conséquent, pour maintenir l'association endosymbiotique, la cellule hôte aurait synchronisé sa

111
A B C

10 µm

Figure 5.1. Observation microscopique de protoplastes de racines

exprimant la protéine de fusion HRS1:GFP.
A) Signal GFP, B) Lumière blanche, C) Superposition des deux premiers.
prolifération avec la division de l’endosymbiote ce qui suggère qu'un signal rétrograde a été
établi depuis les premiers jours de l'évolution des chloroplastes (Tanaka and Hanaoka, 2012).
Les signaux rétrogrades générés par les plastes peuvent être classés en plusieurs catégories:
l’expression des gènes plastidiaux (Ahlert et al., 2003), les ROS et l’état redox des plastes (Kim
et al., 2008; Rochaix, 2001; Triantaphylides and Havaux, 2009), les intermédiaires de la
biosynthèse des tétrapyrroles comme le Mg-Protoporphyrine IX (Beck, 2005; Surpin et al.,
2002), les métabolites dérivés de plastes tels que le 3-phosphoadénosine 5'-phosphate (PAP),
le méthylérythritol cyclodiphosphate (MEcPP), et le β-cyclocitral (Estavillo et al., 2012), l'acide
abscissique (ABA) (Baier et al., 2004) et les protéines (Isemer et al., 2012; Sun et al., 2011). De
manière intéressante, les plastes peuvent développer certains tubules appelés stromules leur
permettant de se connecter physiquement au noyau (Hanson and Sattarzadeh, 2008).
Les protéines sont principalement impliquées dans les signaux antérogrades plutôt que
rétrogrades puisque 95% des protéines plastidiales sont codées dans le noyau et importées
dans les plastes après avoir été traduites dans le cytoplasme (Barbrook et al., 2006). Celles
impliquées dans la signalisation rétrograde sont généralement des FT à double localisation
cellulaire telles que WHIRLY1 (Isemer et al., 2012) et PTM (Sun et al., 2011). Contrairement à
PTM qui nécessite un clivage protéolytique pour pouvoir être transloquée de la membrane
externe du chloroplaste vers le noyau, le mécanisme responsable de la translocation de
WHIRLY1 demeure inconnu puisque ses deux formes plastidiale et nucléaire ont le même poids
moléculaire (Estavillo et al., 2012). À notre connaissance, les protéines connues pour avoir à la
fois une localisation nucléaire et plastidiale ne sont pas nombreuses chez Arabidopsis (Krause
and Krupinska, 2009). En plus de WHIRLY1 et PTM, on en compte seulement 7 : MFP1
(Samaniego et al., 2006), STEP1 (Kwon and Chung, 2004), CDT1 (Raynaud et al., 2005),
ATXR5 (Raynaud et al., 2006) et AT2G44940 (Schwacke et al., 2007), IPT3 (Galichet et al.,
2008) et HMR/pTAC12 (Chen et al., 2010).
À l'exception d’APL détecté à la fois au noyau et à la mitochondrie (Carrie et al., 2009),
aucune double localisation n’a été rapportée au sein de la famille GARP. Cependant, une
localisation plastidiale a été suggérée pour At2g02060 (Melonek et al., 2012) PHL1, OsPHR1 et
Os03g45194 (Schwacke et al., 2007) appartenant toutes au sous-groupe G2-like (Safi et al.,
2017). Par ailleurs, GLK1 et GLK2 sont impliqués dans la biogenèse et le développement des
chloroplastes ainsi que dans la régulation de la machinerie photosynthétique (Fitter et al., 2002;
Waters et al., 2009), ce qui suggère que ces deux FT pourraient réguler des gènes
chloroplastiques. Ainsi, une expression ectopique de leurs gènes respectifs dans les racines

112
 Canal GFP Canal DsRed Lumière blanche

30 µm
Col-0
CT-DsRed

30 µm
HRS1:GFP

30 µm

Figure 5.2. Observation au microscope confocale des lignées

HRS1:GFP et CT:DsRed.
Les plantes ont été cultivées 1 semaine sur MS/2.
Canal vert : excitation à 488 nm et émission à 500-535 nm.
Canal DsRed: excitation à 546 nm et émission à 586 nm.
La lignée CT:DsRed émet un signal détecté dans le spectre d’émission de la
GFP ce qui n’est pas pratique pour des expériences de colocalisation.
 Canal GFP Canal RFP Lumière blanche
Col-0

30 µm
PTS-mCherry

Red Channel 30 µm
HRS1:GFP

30 µm

Figure 5.3. Observation au microscope confocale des lignées

HRS1:GFP et PTS:mCherry.
Les plantes ont été cultivées 1 semaine sur MS/2.
Canal GFP: excitation à 488 nm et émission à 500-535 nm.
Canal RFP: excitation à 587 nm et émission à 610 nm.
La barre blanche correspond à 30 µm.
Aucun problème de spécificité de signal observé chez les deux lignées.
 Canal GFP Canal RFP Lumière blanche Superposition

30 µm

30 µm

30 µm

30 µm

Figure 5.4. Colocalisation des deux protéines HRS1:GFP et PTS:mCherry dans

les plastes.
Des plantes issues du croisement HRS1:GFP X PTS:mCherry ont été cultivées 1
semaine sur MS/2.
Canal GFP: excitation à 488 nm et émission à 500-535 nm.
Canal RFP: excitation à 587 nm et émission à 610 nm.
conduit à l’apparition de chloroplastes dans ces organes habituellements non photosynthétiques
(Kobayashi et al., 2012).
Dans nos observations microscopiques de la protéine de fusion HRS1:GFP, deux types
de signal ont été détectés, un signal nucléaire et un autre signal dans des petits compartiments
cellulaires (Figure 1.10) (Medici et al., 2015). De manière intéressante et grâce à l’approche
TARGET (Bargmann et al., 2013), des gènes plastidiaux se sont révélés être des cibles
potentiellement directes d’HRS1 tels que (AtCg00630, AtCg01090, AtCg01120, AtCg00210
(Medici et al., 2015)) et (AtCg00020, AtCg01120, AtCg01080, AtCg00270 (Safi, submitted)). En
tenant compte de toutes ces données nous avons suggéré que HRS1 pourrait être une protéine
à double localisation nucléaire et plastidiale.
Mon premier objectif était alors de démontrer que les compartiments cellulaires marqués
par la GFP sont effectivement des plastes. Nous voulions par la suite trouver une corrélation
entre les différents adressages de la protéine HRS1 (au noyau et aux plastes) et son rôle dans
la régulation de la NSR (rôle des HHOs décrit dans le chapitre précédent).

2. Résultats et discussion
Dans le but de confirmer que les marquages sub-cellulaires non-nucléaires observés
dans les racines sont des vrais organites et ne sont pas des artéfacts, des protoplastes issus
des racines de la lignée exprimant la fusion HRS1:GFP ont été générés. En parallèle, des
protoplastes de plantes sauvages ont été transformés par le vecteur contenant la cassette
pHRS1:HRS1:GFP. Les constructions stables ainsi que les transitoires ont confirmé que la
protéine chimère HRS1:GFP est exprimée dans des petits organites (Figure 5.1). De manière
intéressante, très peu de localisation nucléaire a été retrouvée dans les protoplastes exprimant
HRS1:GFP. Cette localisation ponctiforme est de loin majoritaire.
J’ai ensuite entrepris une analyse bioinformatique de la protéine. Le tableau 2.9 illustre
les outils de prédiction de la localisation cellulaire utilisés. Mis à part TargetLoc qui arrive à
prédire une localisation plastidiale d’HRS1 avec un score non significatif, aucun autre logiciel ne
prédit HRS1 comme protéine plastidiale. C’est plutôt sa localisation nucléaire qui est prédite.
Ces prédictions ne signifient pas que la protéine ne peut pas aller aux plastes puisqu'il a été
estimé que ~ 35% des protéines plastidiales ne sont pas prédites comme telles (Kleffmann et
al., 2004). Ceci est dû à la diversité des peptides de transit et de l’absence d’une séquence
consensus. De plus, plusieurs protéines sont conduites aux plastes dans des vésicules dérivées

113
Alanine 51

Figure 5.5. HRS1 possède un site potentiel de clivage.

L’Alanine 51 est prédite par l’algorithme PSORT Prediction, comme un site de
clivage possible d’HRS1.
 A Ala 51

3’ UTR Exon Exon 5’ UTR

Exon 2 Exon 3 Exon 5
1 4

F épissage 1 : taille attendue = 500 pb

3’ UTR Exon Exon 5’ UTR

Exon 2 Exon 3 Exon 5 Plastes
1 4

F épissage 2 : taille attendue = 350 pb

3’ UTR Exon 5’ UTR

Exon 2 Exon 3 Exon 5 Noyau
4

500 pb
400 pb
300 pb

Figure 5.6. HRS1 semble ne pas être alternativement épissé.

A) Modèle suggérant l’épissage alternatif d’HRS1 et l’emplacement des
amorces.
B) PCR sur des ADNc de plantules d’Arabidopsis issus de différentes
conditions (feuilles, racines, âge, traitements, source d’azote…).
 pHRS1
WT cDNA HRS1 GFP

pHRS1
Mut ATG (7 aa) cDNA HRS1 GFP

pHRS1
Délétion (56 aa) cDNA HRS1 GFP
GFP

pHRS1
PTS PTS cDNA HRS1 GFP

pHRS1
NLS

NLS cDNA HRS1 GFP

Figure 5.7. Représentation schématique des différentes constructions

utilisées pour perturber la localisation cellulaire d’HRS1:GFP.
WT: version sauvage d’HRS1:GFP; Mut-ATG: délétion de 7 acides aminés;
Délétion: délétion de 51 acides aminés; PTS: insertion d’une séquence de
transit aux plastes; NLS: insertion d’une séquence de localisation nucléaire;
pHRS1: promoteur natif d’HRS1 (3 Kb).
du système endomembranaire, qui implique le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi
(Gagat et al., 2013). Récemment, Wollman (Wollman, 2016) a proposé que les peptides signals
pourraient avoir une origine antimicrobienne. En effet, des similarités entre peptides
antimicrobiens et peptides de transit ont été démontrés à différents niveaux: séquences
(Wollman, 2016), structures (Bruce, 2000; Kustanovich et al., 2002) et fonctions (capacité de
déstabiliser la bicouche lipidique (Dathe and Wieprecht, 1999; Wieprecht et al., 2000) et activité
antimicrobienne (Hugosson et al., 1994)). On peut alors imaginer que la diversité des
séquences de transit provient de la diversité des peptides antimicrobiens.
Puisque nous supposons que ces organelles sont des plastes du fait de leur structure
(Figure 5.1) et par les arguments évoqués précédents, des croisements pHRS1:HRS1:GFP x
CT:DsRed ont été effectués. Les plantes CT:DsRed expriment un peptide d’adressage aux
chloroplastes (CT: Chloroplast Targeting) fusionné à la DsRed permettant des études de
colocalisation. Contre toute attente, et malgré son nom, j’ai observé que la DsRed émettait un
signal très fort détecté même dans le spectre d’émission de la GFP (Figure 5.2), ce qui rend
impossible la confirmation de la colocalisation des deux protéines.
Pour cela, d’autres croisements ont été effectués entre la lignée pHRS1:HRS1:GFP et la
lignée PTS:mCherry que j’ai générée (PTS: Plastid Targeting Sequence). Cette fois, la mCherry
n’est pas détectée dans le canal vert (Figure 5.3). L’étude de colocalisation entre HRS1:GFP et
PTS:mCherry a mis en évidence (Figure 5.4) la présence d’HRS1-GFP dans les plastes.

En règle générale, les peptides d’adressages sont situés dans la partie N-terminale de la
protéine (Gagat et al., 2013; Patron and Waller, 2007). En particulier, HRS1 possède une
Alanine en position 51 qui est un site potentiel de clivage après la translocation aux plastes
(PSORT Prediction) définissant ainsi une séquence de transit putative (Figure 5.5).
Par ailleurs, l’épissage alternatif est un phénomène largement observé chez les GARPs
avec 97 variants d'épissage pour 56 gènes. Chez la sous-famille HHO, 4 homologues d’HRS1
sur 6 sont alternativement épissés (https://www.arabidopsis.org/).
Donc en combinant les deux informations précédentes, nous avons estimé qu’un
épissage alternatif du premier intron d’HRS1 serait un mécanisme élégant d’adressage d’HRS1
au noyau comme observé récemment pour la protéine GLYK dont la version longue est
adressée aux chloroplastes alors que la version épissée se trouve dans le cytosol (Ushijima et
al., 2017). Pour ce faire, des amorces de part et d’autres du premier exon ont été conçues
(Figure 5.6A) pour faire des RT-PCR et éventuellement mettre en évidence ce phénomène. Des
ADNc issus de différentes expériences ont été utilisés dans l’espoir de détecter deux bandes :

114
A
3 NRT2.5
Col-0
2,5
hhhh
2 hhhh:HRS1:GFP2
1,5 hhhh:HRS1:GFP4
hhhh:HRS1:GFP5
1
hhhh:HRS1:GFP6
0,5
0
1
B

50 µm

50 µm

50 µm

Figure 5.8. Corrélation de la localisation cellulaire d’HRS1:GFP à la

régulation de l’expression des gènes marqueurs de la NSR.
Les plantes sont cultivées 2 semaines en boites de Pétri en présence de 0,5 mM
NH4NO3.
A) Accumulation relative des transcrits de NRT2.5 chez des mutants
complémentés par la version sauvage d’HRS1:GFP.
B) Observations microscopiques de plantules exprimant la fusion HRS1:GFP.
Chaque ligne représente 3 endroits différentes de la même racine en partant de
l’apex. Chaque colonne représente une lignée indépendante.
une de ~500 pb correspondant à la forme non-épissée, et une plus courte correspondant à la
forme épissée. Malgré la présence de bandes surnuméraires de grandes tailles dues
certainement à des artefacts de PCR (Figure 5.6B), aucune bande plus courte n’a été détectée.
Donc cette hypothèse bien que probable, n’a pas pu être validée sur ces échantillons et avec
cette technique.

Nous avons voulu ensuite explorer la fonction d’HRS1 dans les plastes. Pour ce faire ma
stratégie a consisté à forcer l’adressage d’HRS1 en lui ajoutant des séquences de transit
nucléaire et plastidiale forts. Ainsi, j’ai créé des constructions par Ω-PCR (Chen et al., 2013),
pour lesquelles des séquences PTS (Plastid Targeting Sequence) ou NLS (Nuclear Localization
Signal) ont été insérées en amont de la séquence codante d’HRS1 (Figure 5.7). J’ai aussi voulu
créer des lignées dépourvues de la séquence N-terminale native d’HRS1 (Figure 5.7) pour
tester son rôle dans la localisation d’HRS1. Malgré les difficultés techniques qui nous ont
empêchés d’obtenir la construction contenant la plus grande délétion, j’ai obtenu une version
mutée du premier ATG qui entraîne une délétion des 7 premiers acides aminés d’HRS1 (Figure
5.7).
La complémentation du quadruple mutant hrs1;hho1;hho2;hho3 par ces constructions
ainsi que par la version sauvage, a permis l’obtention de 4 types de lignées nommées WT, mut-
ATG, PTS et NLS. Ces lignées ont été utilisées pour caractériser le rôle d’HRS1 dans les
plastes et pour corréler les adressages de ce FT et son rôle dans la régulation de la NSR
(chapitre 4).
Afin de répondre au mieux à ces questionnements, des observations microscopiques et
des mesures d’accumulation des transcrits ont été réalisées en parallèle sur des plantules
cultivées pendant une semaine sur 0,5 mM NH4NO3 (les mêmes conditions de cultures que
celles utilisées dans les expériences de complémentation du quadruple mutant dans l’article).
Les figures 5.8-5.11 illustrent le niveau d’expression des marqueurs de la NSR (représentés par
NRT2.5) chez ces différents génotypes associé à des images qui montrent la localisation de la
protéine HRS1:GFP. Comme prévu, toutes les lignées complémentées par la version sauvage
de la fusion HRS1:GFP ainsi que toutes les lignées NLS (chez lesquelles HRS1 devrait avoir
une localisation purement nucléaire) sont capables de complémenter le phénotype du mutant
(Figure 5.8 et 5.9). En se basant sur nos résultats (Safi, submitted) et sur ceux de (Kiba,
Submitted) qui prouvent que HRS1 régule directement l’expression de NRT2.4 et NRT2.5 en se
fixant sur leurs promoteurs, une localisation nucléaire d’HRS1:GFP était attendue.
Paradoxalement, à l’exception de quelques cellules chez la lignée NLS1 qui ont un signal GFP

115
B
3 NRT2.5
2,5 Col-0
2 hhhh

1,5 hhhh:HRS1:NLS1

1 hhhh:HRS1:NLS2

0,5 hhhh:HRS1:NLS3

0 hhhh:HRS1:NLS4
1

50 µm

50 µm

50 µm

Figure 5.9. Corrélation de la localisation cellulaire d’HRS1:GFP à la

régulation de l’expression des gènes marqueurs de la NSR.
Les plantes sont cultivées 2 semaines en boites de Pétri en présence de 0,5 mM
NH4NO3.
A) Accumulation relative des transcrits de NRT2.5 chez des lignées NLS.
B) Observations microscopiques de plantules exprimant la fusion
NLS:HRS1:GFP. Chaque ligne représente 3 endroits différentes de la même
racine en partant de l’apex. Chaque colonne représente une lignée indépendante.
C
Col-0
6
NRT2.5
hhhh
5
hhhh:HRS1:PTS1
4
hhhh:HRS1:PTS2
3
hhhh:HRS1:PTS4
2
hhhh:HRS1:PTS5
1

0
1

50 µm

50 µm

50 µm

Figure 5.10. Corrélation de la localisation cellulaire d’HRS1:GFP à la

régulation de l’expression des gènes marqueurs de la NSR.
Les plantes sont cultivées 2 semaines en boites de Pétri en présence de 0,5 mM
NH4NO3.
A) Accumulation relative des transcrits de NRT2.5 chez des lignées PTS.
B) Observations microscopiques de plantules exprimant la fusion
PTS:HRS1:GFP. Chaque ligne représente 3 endroits différentes de la même
racine en partant de l’apex. Chaque colonne représente une lignée indépendante.
D
4
NRT2.5 Col-0
3
hhhh

2 hhhh:mut ATG 1
hhhh:mut ATG 2
1
hhhh:mut ATG 4
0 hhhh:mut ATG 6
1

50 µm

50 µm

50 µm

Figure 5.11. Corrélation de la localisation cellulaire d’HRS1:GFP à la

régulation de l’expression des gènes marqueurs de la NSR.
Les plantes sont cultivées 2 semaines en boites de Pétri en présence de 0,5 mM
NH4NO3.
A) Accumulation relative des transcrits de NRT2.5 chez des lignées mut-ATG.
B) Observations microscopiques de plantules exprimant la fusion mut-
ATG:HRS1:GFP. Chaque ligne représente 3 endroits différentes de la même
racine en partant de l’apex. Chaque colonne représente une lignée indépendante.
au niveau du noyau, tout le reste des lignées montrent exclusivement des signaux
probablement plastidiaux (Figure 5.8 et 5.9). Chez les lignées PTS, la localisation d’HRS1:GFP
est le plus souvent plastidiale, ce qui correspond à nos attentes (Figure 5.10). De manière
intéressante, chez PTS2 et PTS5, l’expression d’HRS1 dans les plastes, est associée à des
complémentations du mutant (Figure 5.10). Même si les marqueurs de la NSR sont codés par
des gènes nucléaires, et que HRS1 régule directement leur expression, il n’est pas impossible
que ce dernier pourrait aussi contrôler l’activité de ces gènes indirectement. Comme discuté
dans le chapitre 4, HRS1 permet également de réguler la NSR en contrôlant la balance des
ROS (Safi, submitted). Étant donné que les plastes constituent des sources importantes de
production de ROS (Mittler et al., 2004), la version plastidiale d’HRS1 pourrait ainsi être
impliquée dans la régulation de l’accumulation des ROS d’origine plastidiale. Les données de
TARGET montrent que 3 gènes plastidiaux dont la fonction pourrait être associée à une
production de ROS (AtCg00020, AtCg01080 et AtCg00270), sont des cibles directes d’HRS1
(Annexe).
Cependant, la localisation cellulaire de la protéine et l’expression des gènes ne sont pas
toujours en cohérence. En effet, la présence d’HRS1 dans les plastes de la lignée PTS4 n’a pas
permis de complémenter le phénotype du mutant et inversement, un effet sur l’expression de
NRT2.5 a été observé chez la lignée PTS1 sans qu’il soit associé à un signal plastidial de la
GFP (Figure 5.10). Ceci a été également observé chez les lignées mut-ATG1, 2 et 4 chez
lesquelles NRT2.5 est différentiellement exprimé malgré le signal plastidial d’HRS1:GFP (Figure
5.11). Mut-ATG6 est la seule lignée qui affiche un signal exclusivement nucléaire (Figure 5.11).
Ceci pourrait être dû à l’abolition du peptide signal présumé ce qui empêche la protéine
tronquée d’aller aux plastes. Cependant, l’effet répressif sur l’expression des gènes du HATS
est beaucoup plus visible chez les lignées mut-ATG1 et 2 que chez cette lignée (Figure 5.11).
Plusieurs questions se posent à l’issu de ces résultats troublants. Pourquoi voit-on des
noyaux dans une lignée mut-ATG et on n’en voit dans aucune lignées NLS ni dans les lignées
complémentées par la version sauvage d’HRS1:GFP ? Pourquoi une même localisation
cellulaire aboutit à différentes réponses des gènes de la NSR? Pourquoi malgré le signal
purement nucléaire de mut-ATG6, l’effet sur l’expression de NRT2.5 est beaucoup moins
marqué que chez les lignées mut-ATG1 et 2 (signal plastidial) ? Pourquoi l’insertion de la
cassette pHRS1:HRS1:GFP dans un fond génétique sauvage permet de révéler la double
localisation d’HRS1 alors que seulement la version plastidiale est détectée chez le quadruple
mutant complémenté par la même construction ? La seule différence entre ces deux dernières
lignées est la présence des protéines HHO1, HHO2 et HHO3, ce qui suggérerait que HRS1

116
Figure 5.12. Le peptide signal d’HRS1 semble être en C-terminal.
Alignement de la séquence d’HRS1 avec celle du peptide de transit de MFP1
(Jeong et al., 2003).
nécessite une hétérodimérisation avec au moins un de ses homologues pour pouvoir accéder
au noyau. L’autre hypothèse possible est qu’au moins un de ces 3 facteurs de transcription est
impliqué dans la régulation du transit nucléaire et/ou que l’abolition de ce processus aboutit au
clivage rapide de la protéine de fusion. Ce clivage ferait que la GFP soit dirigée vers les plastes
et HRS1 vers le noyau. Ce clivage présumé pourrait expliquer nos observations (Figures 5.8-
5.11). L’alignement entre la séquence d’HRS1 et celle du peptide signal de MFP1 (Jeong et al.,
2003), montre que contrairement à nos attentes, la séquence de transit d’HRS1 pourrait être en
partie C-terminale (Figure 5.9). Ainsi, si lors de son clivage, la GFP reste liée à la partie C-
terminale d’HRS1, ceci pourrait expliquer mes résultats.
Pour vérifier cette dernière hypothèse, les protéines solubles ont été extraites à partir
des racines de plantes cultivées 1 semaine sur ½ MS. Un western blot a été par la suite réalisé
et la révélation a été faite grâce à un anticorps anti-GFP. Ce dernier manque de spécificité
puisque des bandes ont été détectées chez toutes les lignées testées y compris le sauvage et le
quadruple mutant (Figure 5.10A). De manière troublante, le même profil a été révélé pour la
plupart des lignées à l’exception de mut-ATG6 (Figure 5.10A). Cette dernière est la seule où on
voyait un signal GFP nucléaire. De ce fait, la bande qui la distingue des autres lignées pourrait
correspondre à la protéine de fusion HRS1:GFP même si sa taille devrait théoriquement être
moins importante. L’absence de bande qui correspond à la version plastidiale d’HRS1:GFP,
peut être expliquée par deux hypothèses. La première est que le clivage de la protéine coïncide
avec des bandes aspécifiques qu’on trouve même chez les lignées non transformées, et la
deuxième est qu’une fois dans les plastes, la protéine de fusion n’est plus dans la phase
soluble. Plusieurs données supportent la dernière possibilité. En effet, les chromosomes
plastidiaux sont organisés en complexes ADN-protéine appelés nucléoïdes. Ces structures sont
accrochées à la membrane interne des plastes et à la membrane thylakoïdienne dans les
chloroplastes (Jeong et al., 2003). Étant donné qu’HRS1 est un facteur de transcription qui
apparemment régule directement des gènes plastidiaux, on estime qu’il pourrait être associé
aux nucléoïdes. Ainsi, il ne serait pas impossible de trouver la version plastidiale d’HRS1:GFP
dans la fraction des protéines non solubles. En se basant sur ce raisonnement, j’ai fait un
western blot sur les protéines membranaires (microsome). Encore une fois, on est face à un
problème de spécificité vu que de nombreuses bandes apparaissent dans toutes les pistes
(Figure 5.10B). Et en plus, aucune différence n’est observée entre les lignées transformées par
les différentes versions d’HRS1:GFP et les lignées non transformées.

117
A

100 KDa

70 KDa

35 KDa

25 KDa

B
100 KDa
70 KDa

35 KDa

25 KDa

Figure 5.13. Western blot sur les différentes formes de la protéine

HRS1:GFP.
A) Fraction soluble des protéines.
B) Protéines microsomales.
M: marqueur de taille; Col: plante sauvage; hhhh: quadruple mutant; WT: hhhh
complémenté par la version non modifiée d’HRS1:GFP.
3. Conclusion et perspectives
De manière encourageante, j’ai pu valider la localisation plastidiale d’HRS1 et la plupart
des constructions étudiées (WT, NLS, PTS) permettent une complémentation de la fonction de
régulation d’HRS1. Ce qui, si la protéine n’est pas clivée, pourrait être une démonstration d’un
rôle régulateur de la NSR par HRS1 dans les plastes. Il a été démontré depuis quelques années
qu’un gène codant une protéine plastidiale nommée GDPD1, est impliqué dans le maintien de
l’homéostasie du Pi dans des conditions de carence. Un tel phénomène attribué à la nutrition
azotée en général et à la NSR en particulier serait à notre connaissance une nouveauté (Cheng
et al., 2011).
Cependant, pour tirer cette conclusion il faudra montrer que HRS1 est cependant
toujours liée à la GFP. Les expériences de western blots ne sont pas concluantes pour le
moment et doivent être reproduites pour détecter la protéine dans les phases solubles ou
microsomales. En effet il est connu que la détection des facteurs de transcription par western
blot n’est pas un défi facile. De plus, les lignées WT, NLS, PTS et ATG-mut dans un fond
sauvage sont en cours d’obtention pour éventuellement comprendre le rôle régulateur de
l’adressage d’HRS1 par les autres membres de la famille.

118
Chapitre 6: Conclusion générale

119
 NRT1.1

HRS
HRS1
1 AtCgXXXXX

NLP6
SPX3
ROS
?
HRS1

NLP7
P P
NLP7 NLP6
HRS1 (HHOs)
NLP7
ROS
HRS1
RRG
HRS1
NRT2
ROS SPX
?
HRS1 HRS1
NSR

GDH3
Noyau
L-Glu α-cetoglutarate + NH4+

RRG: ROS Related Genes

NSR: Nitrate Starvation Response Genes
 L’objectif général de mon travail était d’approfondir nos connaissances sur les
mécanismes de signalisation mis en oeuvre lors des changements de la disponibilité en nitrate
du milieu extérieur. J'avais pour but de comprendre les mécanismes et de mettre à jour de
nouveaux acteurs moléculaires étant impliqués dans l’établissement de “crosstalk” entre les
différentes voies de signalisation.
Dans ce sens, je pense que l’objectif général du travail a été atteint, car j’ai pu mettre en
évidence le rôle clé des facteurs de transcription de la famille HHOs ainsi que des ROS dans la
réponse des plantes à la NSR.
Les résultats validés lors de cette thèse concernent le rôle de la sous-famille HRS1/HHO
dans la régulation directe de la réponse des plantes à la carence en azote. En utilisant des
expériences de gel retard, l'étude de caractérisation de mutants KO et de surexpresseurs
affectés dans les gènes HRS1, HHO1, HHO2 et HHO3, j’ai pu démontrer que ces facteurs de
transcription sont des répresseurs de la réponse à la carence en azote. En se liant sur les
promoteurs de leurs gènes cibles, HRS1 (et très probablement ses homologues) inhibent
l’expression des gènes codant des transporteurs de nitrate de haute affinité (NRT2.1, NRT2.4 et
NRT2.5) ainsi que de la glutamate déshydrogénase GDH3. Ce mécanisme moléculaire
représente un phénomène qui impacte fonctionnellement la physiologie de la plante. En effet les
HHOs contrôlent non seulement la capacité des racines à prélever le nitrate mais aussi la
croissance des plantes cultivées en présence de nitrate (Figure 4 et Supplementary figure 3 de
l’article). J’ai également montré que les HHOs peuvent contrôler la NSR grâce à un mécanisme
vraisemblablement parallèle faisant intervenir les ROS. Ces derniers sont indispensables à
l’établissement complet de la NSR. Des expériences supplémentaires sont en cours, sur des
mutants de NADPH oxydase et des mesures de l’accumulation des transcrits chez les différents
génotypes des HHOs sont toutefois nécessaires pour mieux comprendre ce mécanisme.

1. Vers un contrôle “à la carte” des

transporteurs via l'édition de genes?
Ainsi, il semble clair que HRS1 et ses homologues (HHOs) sont des régulateurs majeurs
de la NSR. Les HHOs sont impliqués dans le répression rapide des gènes de la NSR lors de la
fourniture de nitrate aux plantes. Ce mécanisme permet sans doute de stopper les gènes
impliqués dans la réponse des plantes à la carence en azote lorsque le NO3- est à nouveau

120
présent dans la solution du sol. Dans les parties précédentes, nous avons distingué NSR et
PNR. La première (NSR) étant mise en place lors du manque de N; et la seconde (PNR) étant
mise en place lors de la fourniture de NO3- à la plante. Cependant, ceci est une sorte de vue de
l’esprit. En effet, il est tout à fait légitime de se demander si on peut également considérer les
HHOs comme des effecteurs d’une sous-branche de la PNR elle même. De fait, l’induction de
l’expression des HHOs par le nitrate est NRT1.1 et NLP7-dépendante (centraux pour la PNR),
et c’est cette induction qui semble permettre la répression des gènes marqueurs de la NSR. En
d’autres termes, c’est la présence du nitrate (PNR) qui déclenche l’arrêt de la NSR et cet arrêt
se fait en quelques minutes (un des critères de la PNR) par l’intermédiaire de la sous-famille
HRS1/HHO. Dans ce contexte, on pourrait alors considérer les HHOs comme le lien important
appartenant à une sous-branche de la PNR spécialisée dans la répression rapide et spécifique
des marqueurs de la NSR (Figures 2 et 9 de l’article).
Une question générale qui ne trouve pas encore de réponse claire pour le moment est :
pour quelle raison la plante réprime-t-elle ses systèmes de transport à haute (voir très haute)
affinité lorsque le NO3- est à nouveau présent dans le milieu alors que mes résultats montrent
que cette répression induit une diminution de : i) la vitesse de transport de NO3- et ii) la
croissance des plantes (Figure 4 et Supplementary figure 3 de l’article) ? Si l'évolution a
maintenu cette voie de signalisation c’est qu’il est possible que cette répression des gènes de la
NSR soit nécessaire pour les plantes, au moins dans certaines conditions. Quelques
hypothèses peuvent être apportées pour répondre à cette question.
La première est que nous avons montré que GDH3 est un des gènes réprimés par cette
voie. GDH3 est impliqué dans la remobilisation de l’azote des pools d’acide aminés lors de la
carence en azote (Marchi et al., 2013; Masclaux-Daubresse et al., 2006; Robinson et al., 1991).
Si ce gène reste très fortement exprimé quand les conditions de nutrition azotée sont non-
limitantes, ceci pourrait créer un cycle futile de l’azote au sein de la plante en nutrition normale.
L’azote dans le quadruple mutant serait constamment assimilé aux acides aminés puis recyclé
via l'activité GDH, ce qui serait une perte considérable d'énergie pour la plante. Nous n’avons
pas exploré cette hypothèse expérimentalement. Cependant, les quadruples mutants ne
semblent pas être trop affectés dans leur croissance (bien au contraire). Mais nos observations
sont dans des conditions contrôlées de laboratoire, il n’est pas impossible que dans la nature ce
cycle futile impacte la survie des plantes. Si cette hypothèse est validée, et dans une
perspective d'amélioration biotechnologique des plantes (voir introduction de la thèse), il serait
intéressant par exemple de muter spécifiquement les sites de fixation des HHOs dans les
promoteurs des gènes de NRT2.4, NRT2.5, NRT2.1 pour éviter leur répression tandis que la

121
répression de GDH3 serait maintenue. Des approches de mutagenèse utilisant la technique
CRISPR-Cas9 (Wang et al., 2015), pourraient être envisagées.
Deuxièmement, les expériences de TARGET ainsi que les transcriptomes (Medici et al.,
2015) ou les résultats d’autres équipes (Liu et al., 2009; Mito et al., 2011; Nagarajan et al.,
2016; Wu et al., 2012) montrent que les HHOs semblent être un carrefour important pour le
contrôle de nombreuses voies de signalisations de réponse à différentes situations “stressantes”
pour les plantes (réponse au sel, à l’ABA…). Il est donc probable que le quadruple mutant
hrs1;hho1;hho2:hho3 soit intrinsèquement “stressé”, ce qui dans des conditions naturelles (pas
de laboratoire) peut conduire à une diminution du taux de survie dans l'environnement. Encore
une fois, dans ce contexte, travailler sur la derepression spécifique des gènes du transport et de
l’assimilation du nitrate pourrait être une solution alternative, maintenant que nous (et d’autres
(Kiba, Submitted)) avons mis en évidence les éléments cis-régulateurs des HHOs dans les
promoteurs des gènes cibles de cette voie.
En conclusion, malgré sans doute quelques ajustements nécessaires discutés ci-dessus,
les résultats du travail de ma thèse ouvrent des perspectives tant sur le plan fondamental que
appliqué. Des plantes éditées pourraient voir le jour dans lesquelles les systèmes de transports
de nitrate seraient constitutivement déréprimés. Ces plantes pourraient permettre d'améliorer
l’efficience de l’utilisation de l’azote (NUE). Cette perspective est d’autant plus encourageante
lorsque on y regarde de plus près, de fort parallèles existent entre les études sur les gènes BTB
et HRS1/HHOs (Araus et al., 2016). En effet, BT1 et BT2 répriment l’expression des gènes
codant des transporteurs de haute affinité NRT2.4 et NRT2.1 et affectent par la suite le
prélèvement du nitrate (Araus et al., 2016). Outre leur effet commun sur la régulation du HATS,
ces deux groupes de gènes partagent également la manière dont ils sont régulés. Ils sont tous
les deux induits par le NO3- (Canales et al., 2014; Sato et al., 2017; Vidal et al., 2013) et leur
expression est NRT1.1 et NLP6/7-dépendante (Konishi and Yanagisawa, 2013a; Marchive et
al., 2013; Sato et al., 2017).
Par ailleurs, il est possible d’étendre cette perspective biotechnologique à d’autres nutriments
essentiels pour la nutrition des plantes. Il est connu que des voies spécifiques des nutriments
sont activées en réponse à la carence en K+ ou en P. Pour le P, des gènes impliqués dans la
répression de la voie de carence sont connus (notamment les SPX) (Puga et al., 2014; Wang et
al., 2014). Mes résultats peuvent permettre d’imaginer que des éléments cis-régulateurs
présents dans les promoteurs des gènes pourraient réprimer les systèmes de transport de
différents nutriments. La technique d'édition des gènes serait encore une fois une opportunité
pour déréprimer spécifiquement des systèmes de transports d’ions de toutes sortes (K+, Pi, NO3-

122
, NH4+, …) pour créer des plantes aux capacités de transport finement adaptés à des conditions
pédologiques locales.

2. Un rôle fondamental des ROS dans le

contrôle de la nutrition?
Plusieurs résultats de ma thèse ainsi que des données de la littérature permettent de
mettre en évidence un rôle important des ROS dans la nutrition des plantes. Bien souvent les
interventions des ROS pourraient en partie expliquer les résultats négatifs obtenus.
Pour commencer, prenons les expériences de retard sur gel (EMSA) faites pour étudier
l’effet présumé de l’interaction entre SPX1 et HRS1 sur la capacité de ce dernier de se fixer à
ses motifs cibles (Chapitre 3, Figures 3.1 et 3.2). Malgré le résultat négatif, des perspectives
visant à tester d’autres couples de protéines et/ou d’autres motifs reconnus par HRS1 sont
envisagés. Il est important de noter que les ROS peuvent affecter les interactions protéines-
protéines et la fixation des facteurs de transcription aux promoteurs de leurs gènes cibles
(Lindermayr et al., 2010; Viola et al., 2013). C’est le cas du couple NPR1 (NIM1) / TGA1
impliqué dans résistance des plantes aux pathogènes (Despres et al., 2003; Despres et al.,
2000; Pieterse and Van Loon, 2004). Le monoxyde d’azote (•NO) libéré à partir du S-
nitrosoglutathion (GSNO) permet non seulement la S-nitrosylation des deux protéines, mais
également de stimuler la fixation de TGA1 sur son motif as-1 (activation sequence-1) en
présence de NPR1 (NIM1). En plus, la translocation nucléaire de ce dernier est favorisée par le
•
NO (Lindermayr et al., 2010). L’ensemble de ces données souligne l’importance du •NO dans la
régulation de l’activité des facteurs de transcription. Un tel mécanisme pourrait intervenir dans le
contrôle de l’activité de “binding” d’HRS1. L’utilisation du GSNO dans les expériences d’EMSA
pourrait ainsi être envisageable dans le but de vérifier cette hypothèse. Le fait que le GSNO soit
métabolisé entre autres par le système thiorédoxine (Broniowska et al., 2013) et que HRS1
régule directement de nombreux gènes de thiorédoxine ainsi que d’autres rédoxines (Annexe),
pourrait signifier que HRS1 est effectivement impliqué dans une boucle de rétrocontrôle
impliquant les ROS.
Le deuxième exemple est celui des TCP, dont l’activité de fixation à l’ADN est inhibée
après incubation de la protéine avec des agents oxydants ou avec des ROS. La capacité de

123
dimérisation de ces facteurs de transcription est également affectée par ces mêmes conditions
(Viola et al., 2013). En se basant sur l’interactome de la famille GARP où les TCP constituent
une bonne partie des protéines avec qui le groupe des HHOs interagit (Safi et al., 2017), il est
possible que l’interaction HHO/SPX nécessite la participation d’un troisième partenaire, un TCP,
dont l’activité serait ROS-dépendante. Dans ce contexte il est important de noter que les TCP
sont impliqués dans la réponse primaire au nitrate à travers l’interaction de TCP20 avec NLP7
(Guan et al., 2017).
Ces hypothèses sont renforcées par les données qui montrent que l’activité
transcriptionnelle la famille R2R3-MYB est régulée de façon redox-dépendante (Heine et al.,
2004), et que cette famille de facteurs de transcription est reliée à la famille GARP dont HRS1
est un membre (Safi et al., 2017).
Donc, et en conclusion, les ROS n’ont pas été en première intention une variable
importante des modèles que j’ai développés durant ma thèse. Pourtant i) les phénotypes de
répression de la NSR par les scavengers de ROS et ii) les résultats du TARGET d’HRS1,
prouvent que ces derniers sont centraux de la réponse des plantes à la carence en N et plus
largement aux nutriments. Les difficultés que j’ai rencontrées proviennent des approches
expérimentales inefficientes pour mesurer les différentes espèces réactives de l'oxygène et pour
étudier leurs accumulations différentielles (données non montrées). Il sera donc important dans
les prochaines investigations d’inclure cette variable centrale de la réponse et de développer
des protocoles robustes pour l’investigation de l’accumulation des ROS au tissulaire et
éventuellement sub-cellulaire.

En effet, les ROS pourraient être la variable explicative des complications rencontrées
dans le chapitre 5 de ma thèse. De fait, l’objectif de la troisième partie de cette thèse a consisté
étudier la double localisation d’HRS1. J’ai voulu mettre en évidence une corrélation entre la
localisation sub-cellulaire d’HRS1 et sa fonction comme régulateur de la NSR. J’ai réussi grâce
à des expériences de colocalisation à prouver qu’HRS1 peut également être addressé aux
plastes. Malgré la création de versions censées forcer des localisations différentes, j’ai été
confronté à l’obtention de résultats pour le moment non-concluants.
Cependant, et encore, les plastes sont le siège d’une intense synthèse de ROS (et
NOS). Il sera important d’inclure cette variable explicative dans le modèle en particulier en
essayant de déterminer les conditions expérimentales qui favorisent la localisation d’HRS1 aux
plastes (dans les protoplastes par exemples [Figure 5.1]). Cette étude a été abordée faute de

124
temps jusqu'à présent et sans résultats concluants. En conclusion les ROS pourraient encore
une fois être une explication des résultats que nous ne comprenons pas jusqu'alors.

125
Annexe

1. Liste des cibles directes d’HRS1 liées aux ROS (Medici et al., 2015).

Down
At5g25140 CYP71B13, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 13
At5g51440 HSP20-like chaperones superfamily protein
At4g27670 HSP21, heat shock protein 21
At2g19310 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g25230 ATFKBP62, FKBP62, ROF1, rotamase FKBP 1
At1g52560 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g50660 CLM, CYP90B1, DWF4, PSC1, SAV1, SNP2, Cytochrome P450 superfamily protein
ATHSP23.6-MITO, HSP23.6-MITO, mitochondrion-localized small heat shock
At4g25200 protein 23.6
At2g29450 AT103-1A, ATGSTU1, ATGSTU5, GSTU5, glutathione S-transferase tau 5
At5g12030 AT-HSP17.6A, HSP17.6, HSP17.6A, heat shock protein 17.6A
At2g47730 ATGSTF5, ATGSTF8, GST6, GSTF8, glutathione S-transferase phi 8
At1g31670 Copper amine oxidase family protein
At2g29500 HSP20-like chaperones superfamily protein
At1g59860 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g26125 CYP86C2, cytochrome P450, family 86, subfamily C, polypeptide 2
At2g26150 ATHSFA2, HSFA2, heat shock transcription factor A2
At1g32720 Cytochrome C oxidase polypeptide VIB family protein
At1g16030 Hsp70b, heat shock protein 70B
At5g12020 HSP17.6II, 17.6 kDa class II heat shock protein
At5g59720 HSP18.2, heat shock protein 18.2
At3g26300 CYP71B34, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 34
At1g62180 APR2, APSR, ATAPR2, PRH, PRH43, 5'adenylylphosphosulfate reductase 2
At1g54050 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g01900 CYP94B2, cytochrome P450, family 94, subfamily B, polypeptide 2
At5g56030 AtHsp90.2, ERD8, HSP81-2, HSP90.2, heat shock protein 81-2
At1g07400 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g26230 CYP71B24, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 24
At1g74310 ATHSP101, HOT1, HSP101, heat shock protein 101
At1g29700 Metallo-hydrolase/oxidoreductase superfamily protein
At1g29620 Cytochrome C oxidase polypeptide VIB family protein
At1g65670 CYP702A1, cytochrome P450, family 702, subfamily A, polypeptide 1

126
Up
At2g38380 Peroxidase superfamily protein
At4g37520 Peroxidase superfamily protein
At1g56410 ERD2, HSP70T-1, heat shock protein 70 (Hsp 70) family protein
At5g51880 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein
At4g37530 Peroxidase superfamily protein
At5g57220 CYP81F2, cytochrome P450, family 81, subfamily F, polypeptide 2
At4g21105 cytochrome-c oxidases;electron carriers
At1g32330 ATHSFA1D, HSFA1D, heat shock transcription factor A1D
At2g33210 HSP60-2, heat shock protein 60-2
At1g76570 Chlorophyll A-B binding family protein
At1g20870 HSP20-like chaperones superfamily protein
At2g38390 Peroxidase superfamily protein
At5g54270 LHCB3, LHCB3*1, light-harvesting chlorophyll B-binding protein 3
At3g03070 NADH-ubiquinone oxidoreductase-related
At3g24200 FAD/NAD(P)-binding oxidoreductase family protein
At1g06620 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein
At4g27440 PORB, protochlorophyllide oxidoreductase B

127
2. Liste des cibles directes d’HRS1 liées aux ROS (Safi et al., submitted).

>C02
At5g02490 Heat shock protein 70 (Hsp 70) family protein
At5g25140 CYP71B13, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 13
At3g13730 CYP90D1, cytochrose P450, family 90, subfamily D, polypeptide 1
At5g51440 HSP20-like chaperones superfamily protein
At4g27670 HSP21, heat shock protein 21
At2g19310 HSP20-like chaperones superfamily protein
At1g53540 HSP20-like chaperones superfamily protein
At1g52560 HSP20-like chaperones superfamily protein
At3g28740 CYP81D1, Cytochrome P450 superfamily protein
ATHSP23.6-MITO, HSP23.6-MITO, mitochondrion-localized small heat shock
At4g25200 protein 23.6
At2g29450 AT103-1A, ATGSTU1, ATGSTU5, GSTU5, glutathione S-transferase tau 5
At5g12030 AT-HSP17.6A, HSP17.6, HSP17.6A, heat shock protein 17.6A
At5g37670 HSP20-like chaperones superfamily protein
At4g10250 ATHSP22.0, HSP20-like chaperones superfamily protein
At2g29500 HSP20-like chaperones superfamily protein
ATHS83, AtHsp90-1, ATHSP90.1, HSP81-1, HSP81.1, HSP83, HSP90.1, heat shock
At5g52640 protein 90.1
At2g26150 ATHSFA2, HSFA2, heat shock transcription factor A2
At3g12580 ATHSP70, HSP70, heat shock protein 70
At5g02500 AT-HSC70-1, HSC70, HSC70-1, HSP70-1, heat shock cognate protein 70-1
At1g16030 Hsp70b, heat shock protein 70B
At5g12020 HSP17.6II, 17.6 kDa class II heat shock protein
At5g59720 HSP18.2, heat shock protein 18.2
At3g26300 CYP71B34, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 34
At1g62180 APR2, APSR, ATAPR2, PRH, PRH43, 5'adenylylphosphosulfate reductase 2
At1g54050 HSP20-like chaperones superfamily protein
At2g25140 CLPB-M, CLPB4, HSP98.7, casein lytic proteinase B4
At3g09440 Heat shock protein 70 (Hsp 70) family protein
At5g56030 AtHsp90.2, ERD8, HSP81-2, HSP90.2, heat shock protein 81-2
At4g24280 cpHsc70-1, chloroplast heat shock protein 70-1
At1g74310 ATHSP101, HOT1, HSP101, heat shock protein 101
At3g46230 ATHSP17.4, HSP17.4, heat shock protein 17.4
At1g65670 CYP702A1, cytochrome P450, family 702, subfamily A, polypeptide 1

128
>C03
At2g32120 HSP70T-2, heat-shock protein 70T-2
At3g51910 AT-HSFA7A, HSFA7A, heat shock transcription factor A7A
At1g14345 NAD(P)-linked oxidoreductase superfamily protein
At1g49390 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein
At1g76570 Chlorophyll A-B binding family protein
At3g57620 glyoxal oxidase-related protein
AtCg00020 PSBA, photosystem II reaction center protein A

>C05
At3g62930 Thioredoxin superfamily protein
At2g21910 CYP96A5, cytochrome P450, family 96, subfamily A, polypeptide 5
At1g67110 CYP735A2, cytochrome P450, family 735, subfamily A, polypeptide 2

>C06
At2g29480 ATGSTU2, GST20, GSTU2, glutathione S-transferase tau 2
At1g28430 CYP705A24, cytochrome P450, family 705, subfamily A, polypeptide 24
At4g21580 oxidoreductase, zinc-binding dehydrogenase family protein
At1g03680 ATHM1, ATM1, THM1, TRX-M1, thioredoxin M-type 1

>C07
At4g15380 CYP705A4, cytochrome P450, family 705, subfamily A, polypeptide 4

>C08
At1g72230 Cupredoxin superfamily protein
At2g45580 CYP76C3, cytochrome P450, family 76, subfamily C, polypeptide 3
At4g02450 HSP20-like chaperones superfamily protein

>C09
At3g44190 FAD/NAD(P)-binding oxidoreductase family protein
At5g61290 Flavin-binding monooxygenase family protein

>C10
At2g37760 NAD(P)-linked oxidoreductase superfamily protein
At1g63710 CYP86A7, cytochrome P450, family 86, subfamily A, polypeptide 7
At5g51880 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein
At5g25130 CYP71B12, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 12
At5g57220 CYP81F2, cytochrome P450, family 81, subfamily F, polypeptide 2
At3g03070 NADH-ubiquinone oxidoreductase-related
At5g51060 ATRBOHC, RBOHC, RHD2, NADPH/respiratory burst oxidase protein D
At3g24200 FAD/NAD(P)-binding oxidoreductase family protein

129
At3g09940 ATMDAR3, MDAR2, MDAR3, MDHAR, monodehydroascorbate reductase
At4g18880 AT-HSFA4A, HSF A4A, heat shock transcription factor A4A
At1g06620 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein

>C11
At1g67970 AT-HSFA8, HSFA8, heat shock transcription factor A8
At4g00360 ATT1, CYP86A2, cytochrome P450, family 86, subfamily A, polypeptide 2
At1g13150 CYP86C4, cytochrome P450, family 86, subfamily C, polypeptide 4
At3g26230 CYP71B24, cytochrome P450, family 71, subfamily B, polypeptide 24

>C12
At4g39510 CYP96A12, cytochrome P450, family 96, subfamily A, polypeptide 12
At3g50990 Peroxidase superfamily protein
At3g25180 CYP82G1, cytochrome P450, family 82, subfamily G, polypeptide 1
At3g13610 2-oxoglutarate (2OG) and Fe(II)-dependent oxygenase superfamily protein
At1g20630 CAT1, catalase 1
AtMg00160 COX2, cytochrome oxidase 2
At1g22480 Cupredoxin superfamily protein
At1g15140 FAD/NAD(P)-binding oxidoreductase
At1g31170 ATSRX, SRX, sulfiredoxin
At3g20960 CYP705A33, cytochrome P450, family 705, subfamily A, polypeptide 33
AtCg01080 NDHG, NADH:ubiquinone/plastoquinone oxidoreductase, chain 6
At2g33210 HSP60-2, heat shock protein 60-2
At1g20620 ATCAT3, CAT3, SEN2, catalase 3
At4g37200 HCF164, Thioredoxin superfamily protein
At4g37830 cytochrome c oxidase-related
AtCg00270 PSBD, photosystem II reaction center protein D
At3g07480 2Fe-2S ferredoxin-like superfamily protein
At3g45810 RBOHJ, RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG J

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151
Résumé
Les plantes prélèvent l’azote nécessaire à leur croissance essentiellement sous forme
de nitrate. Pour faire face aux fluctuations spatio-temporelles de la disponibilité de cet ion dans
les sols, ces organismes ont développé des mécanismes d’adaptation spécifiques à chaque
situation. La résponse de la plante à l’azote met en jeu plusieurs voies de signalisations qui
dépendent des scénarios de variations en azote du milieu. Deux grandes voies de signalisation
sont étudiées en particulier dans cette thèse. La Primary Nitrate Response (ou PNR) qui
correspond aux réponses rapides (minutes) et nitrate-spécifiques de la plante lors de la
fourniture de Nitrate. La Nitrogen Starvation response (ou NSR) qui correspond à la réponse
plus lente (jours) qui permet de pallier au manque d’azote dans le milieu. Bien que certains
acteurs moléculaires soient connus dans chacune des voies (PNR et NSR); i) la NSR est
largement moins bien documentée que la PNR, ii) rien n’est connu concernant la coordination
des 2 voies de signalisations. Au cours de ma thèse j’ai pu démontrer qu’un sous groupe de la
famille GARP induit lors de la PNR est directement impliqué dans la régulation de la NSR
(répression des gènes de transport à haute affinité de nitrate). Ceci fournit à la fois de nouveaux
régulateurs de la NSR et un mécanisme de coordination entre les 2 voies de signalisation. Les
phénotypes des plantes altérées dans l’expression des gènes de cette famille de facteurs de
transcription ouvrent des perspectives d’ameliorations biotechnologiques des plantes car ces
dernières présentent des capacités de transport du nitrate bien supérieures aux plantes
sauvages.
Des résultats quant à la double localisation sub-cellulaire d’HRS1 et du rôle d’HRS1
dans le contrôle du statut redox des plantes sont présentés et discutés dans le contexte du
modèle d’interaction entre PNR et NSR proposé précédemment.

Mots clés : Facteurs de transcription, Azote, ROS, nitrate, TARGET

152
Abstract
Plants take up the nitrogen necessary for their growth mainly in the form of nitrate. To cope with
spatio-temporal fluctuations in NO3- availability in soils, these organisms have developed
adaptation mechanisms specific to each situation. Plant N response involves several signaling
pathways that depend on the N variation scenarios of the medium. Two major signaling
pathways are studied in this thesis. The Primary Nitrate Response (or PNR) which corresponds
to the rapid (within minutes) and nitrate-specific responses of the plant when provided with
Nitrate. The Nitrogen Starvation response (or NSR) which corresponds to the slower response
(within days) which makes it possible to overcome the lack of N in the medium. Although some
molecular actors are known in each of the pathways (PNR and NSR); i) the NSR is significantly
less well documented than the PNR, ii) nothing is known about the coordination of the 2
signaling pathways. During my thesis I was able to demonstrate that a subgroup of the GARP
transcription factor family induced during PNR is directly involved in the regulation of NSR
(repression of transport genes with a very high nitrate affinity). This provides both new NSR
regulators and a coordination mechanism between the 2 signaling pathways. The phenotypes
recorded for plants altered in this transcription factors family open up perspectives for crop
biotechnological improvements because they have nitrate transport capacities far superior to
wild plants.
Results regarding the subcellular dual localization of HRS1 and the role of HRS1 in controlling
the redox status of plants are presented and discussed in the context of the previously proposed
PNR-NSR interaction model.

Keywords: Transcription factors, Nitrogen, ROS, nitrate, TARGET

153