Chapitre 5

Diagnostic par nature

du prélèvement

échangeuse d’ions diéthylaminoéthyle (DEAE).

Approche L’intégralité des examens parasitologiques du
en parasitologie sang est réalisée sur sang total prélevé sur tube
avec un anticoagulant EDTA, ACD ou citrate de
Examen parasitologique sodium selon le parasite recherché.
du sang
Mise en œuvre
Indications
État frais
Les parasites sanguicoles sont des parasites réali-
sant leur cycle parasitaire en totalité ou en partie L’état frais est une technique d’examen direct sans
dans le sang de l’hôte parasité. Les parasites préparation préalable. Il est réalisé en déposant 10
répondant à cette définition chez l’homme sont à 50 µL de sang total entre lame et lamelle. L’état
principalement les protozoaires ou hématozoaires frais permet de rechercher les formes mobiles
du phylum Apicomplexa des genres Plasmodium exo-érythrocytaires des parasites, notamment les
sp., Babesia sp. et Toxoplasma gondii, les pro- microfilaires et les trypanosomes au faible grossis-
tozoaires ou hématozoaires flagellés du genre sement (objectif ×10 et ×40). L’état frais est une
Leishmania sp., Trypanosoma sp., ainsi que les technique de détection qualitative, mais un dépôt
nématodes sanguicoles représentés par les filaires calibré de sang total permet également d’estimer
(Loa loa, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, la quantité de parasites (par exemple microfilaré-
Brugia timori, Mansonella sp.). Le diagnostic mie). Cette technique simple, rapide, peu coû-
de ces parasitoses repose sur la mise en évidence teuse est peu sensible et requiert une expertise.
des formes parasitaires circulantes. Leur quan- L’absence de programme d’évaluation externe
tification possède surtout une visée thérapeu- de la qualité (EEQ) pour ce type de technique
tique, parfois pronostique (parasitémie). Selon ne facilite pas le maintien des compétences des
la localisation du parasite dans le secteur sanguin opérateurs. Il est donc indispensable de mettre
(intra- ou extracellulaire), la taille et la mobilité en place un programme d’habilitation initiale et
du parasite, différentes techniques diagnostiques de maintien des compétences à l’aide de témoins
sont disponibles (tableau  5.1). On distingue les positifs ou de formation par l’image.
techniques d’examen direct sans préparation (état
frais) ou avec préparation de l’échantillon sanguin Frottis sanguin
(frottis sanguin) et les techniques dites de concen- La recherche de parasites sanguicoles de plus
tration telles que la goutte épaisse, le quantitative petite taille, intra-érythrocytaires (Plasmodium
buffy coat (QBC), la leucoconcentration, la leu- spp., Babesia spp.) ou intracellulaires (Leishma­
cocytoconcentration et la filtration sur colonne nia spp., exceptionnellement Toxoplasma gondii)

Parasitologie et mycologie médicales

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96 Méthodes

Tableau 5.1. Techniques de détection des principaux parasites sanguicoles.

Parasitoses Agents pathogènes Nature Caractéristiques Technique
du prélèvement du pathogène
Babésiose Babesia microti Sang veineux prélevé Intra-érythocytaire Frottis sanguin et goutte épaisse
Babesia divergens, etc. sur EDTA Immobile après coloration au MGG ou Giemsa
(objectif ×100)
Leishmaniose Leishmania donovani Sang veineux sur Intracellulaire Leucoconcentration
viscérale Leishmania infantum EDTA ou citrate Immobile et leucocytoconcentration du sang veineux
Leishmania chagasi, etc. suivi de coloration au MGG (objectif ×100)
Filariose Wuchereria bancrofti Sang veineux prélevé Extra-érythrocytaire – État frais entre lame/lamelle
lymphatique Brugia malayi sur EDTA entre Mobile (objectif ×10)
Brugia timori 23 heures et 3 heures – Frottis mince après coloration au MGG
(objectif ×10, ×100)
Loaose Loa Loa Sang veineux
– Goutte épaisse après coloration
prélevé sur EDTA
au Giemsa (objectif ×10, ×100)
entre 10 heures
– Leucoconcentration (objectif ×10, ×40)
et 16 heures
– Éventuellement QBC
Mansonellose Mansonella spp. Sang veineux prélevé
sur EDTA
Paludisme Plasmodium falciparum Sang veineux prélevé Intra-érythrocytaire – Frottis mince après coloration au MGG
Plasmodium malariae sur EDTA Immobile (objectif ×100)
Plasmodium ovale – Goutte épaisse après coloration
Plasmodium vivax au Giemsa (objectif ×100)
Plasmodium knowlesi – Éventuellement QBC
Trypanosomoses Trypanosoma Sang veineux prélevé Extra-érythrocytaire – État frais entre lame/lamelle (objectif
brucei gambiense ou sur EDTA Mobile ×40)
rhodesiense – Frottis mince après coloration au MGG
Trypanosoma cruzi (objectif ×40, puis ×100)
– Goutte épaisse après coloration
au Giemsa (objectif ×40, ×100)
– Leucoconcentration (objectif ×40)
– Filtration sur colonne échangeuse
d’ions (DEAE)
– Éventuellement QBC
DEAE : diéthylaminoéthyle ; MGG : May-Grünwald Giemsa ; QBC : quantitative buffy coat.

et la nécessité d’objectiver des caractères morpho- existent. Pour les autres techniques citées ci-après,
logiques précis pour l’identification de l’espèce il sera donc indispensable d’utiliser des témoins
parasitaire requièrent le plus souvent de réaliser positifs qui auront un double objectif  : valider
un frottis sanguin en couche mince coloré par la réalisation de la technique et mettre en place
le MGG ou par des colorations similaires (voir un processus d’habilitation et de maintien des
chapitre  1, «  Techniques de coloration  »). compétences du personnel (pour les éléments ci-
L’observation microscopique se réalise à l’objectif dessous, voir au chapitre  1, «  Techniques de
×10, ×40 ou ×100 selon la taille du parasite concentration du sang »).
recherché. De nombreux programmes d’EEQ
existent pour évaluer la qualité de la recherche de Goutte épaisse
parasites par frottis sanguin. Le dépôt de quelques microlitres de sang per-
met, contrairement au frottis sanguin en couche
mince, d’observer un volume de sang important
Techniques de concentration en quelques champs microscopiques (20 à 50
La goutte épaisse est la seule technique de concen- fois plus) [3] et donc un nombre plus important
tration pour laquelle des programmes d’EEQ de parasites, ou de sensibiliser la recherche en
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 97

cas de faibles charges parasitaires. C’est une tech- parasites sanguicoles, mais celui-ci devra toujours
nique largement utilisée pour la détection des être confirmé par la lecture d’un frottis sanguin
parasites sanguicoles qu’ils soient intra- (Plasmo­ pour l’identification de l’espèce parasitaire et sa
dium spp., Babesia spp.) ou extra-érythrocytaires quantification.
(microfilaires, Trypanosoma spp.). Sa sensibilité
est très élevée (limite de détection de 10 à Leucoconcentration
20  parasites/µL pour Plasmodium spp.), mais Fondée sur une hémolyse des échantillons san-
cette technique nécessite une bonne expérience guins, la leucoconcentration repose sur l’obser-
de la lecture microscopique. L’identification de vation à l’objectif ×10 au microscope optique
l’espèce peut également s’avérer difficile par du culot de l’hémolysat entre lame et lamelle ou
l’altération possible de la morphologie parasi- après confection d’un frottis coloré au MGG.
taire liée à l’hémolyse lors de la coloration au Cette technique est exclusivement utilisée pour la
Giemsa sans fixation et au séchage de la goutte recherche des formes parasitaires circulantes exo-
épaisse après coloration. La technique de la érythrocytaires (Leishmania spp., microfilaires,
goutte épaisse doit davantage être considérée formes trypomastigotes de Trypanosoma spp.).
comme une technique qualitative de détection Cette technique simple et peu onéreuse per-
(présence/absence) qu’une technique quantita- met une quantification des formes parasitaires en
tive. Néanmoins, une quantification parasitaire parasites/µL de sang total. La morphologie des
est possible, estimée en nombre de parasites leucocytes et celle des formes parasitaires peuvent
pour 1000 leucocytes suite à l’hémolyse (para- être altérées suite à l’hémolyse. Ainsi, la lecture
sites intra-érythrocytaires) ou en formes parasi- d’une leucoconcentration devra de préférence
taires/µL de sang total (en cas de prise d’essai être associée à une deuxième technique pour le
calibrée de sang). diagnostic formel de l’espèce parasitaire.
La recherche des formes parasitaires circulantes
Quantitative buffy coat (QBC) exo-érythrocytaires (Trypanosoma spp. et micro-
La détection des formes circulantes des para- filaires) et intracellulaires (formes amastigotes de
sites sanguicoles intra- et extra-érythrocytaires Leishmania spp. et tachyzoïtes de Toxoplasma
(excepté Leishmania spp.) est ici fondée sur la gondii) peut également s’effectuer par une leu-
fluorescence des formes parasitaires en vert (ADN cocytoconcentration après cytocentrifugation du
nucléaire) et rouge (ARN cytosolique) après culot de l’hémolysat. Le spot obtenu sur lame est
incorporation d’Acridine Orange, s’intercalant coloré au MGG ou coloration équivalente pour
dans les acides nucléiques. Cette technique rapide être observé à l’objectif ×100 à l’immersion.
à réaliser possède des caractéristiques similaires à
la goutte épaisse avec une sensibilité de détec- Filtration sur colonne échangeuse
tion des hématozoaires de 10  parasites/µL et d’ions DEAE (mini anion exchange
une valeur prédictive positive proche de 100  % centrifugation technique [mAECT])
[1]. Cependant, le QBC est une technique de Cette technique de concentration est fondée sur
concentration onéreuse nécessitant un matériel les différences de propriétés physicochimiques
spécifique pour la préparation (centrifugeuse à entre les globules rouges et les formes parasitaires
capillaire) et la lecture (microscope à fluores- circulantes. Le sang périphérique de patients est
cence) [2,  4]. De plus, comme pour la goutte filtré sur une colonne échangeuse d’ions DEAE
épaisse, l’identification d’espèce est difficile et la équilibrée par du PBS permettant l’élution des
quantification des formes parasitaires impossible. formes parasitaires et la rétention des globules
La reconnaissance des formes parasitaires circu- rouges chargés plus négativement que les para-
lantes et leur distinction avec des artéfacts fluores- sites sanguicoles. La centrifugation de l’éluat et
cents nécessitent une expertise importante [3]. l’observation du culot à l’objectif ×10 en micro-
Cette méthode représente un bon test diagnos- scopie optique entre lame et lamelle permettent
tique de première intention pour la recherche de l’identification des formes parasitaires à l’état
98 Méthodes

frais. Cette technique mAECT est onéreuse et très « Techniques de fixation-conservation »). Le délai
sélective, spécifiquement utilisée pour la recherche de viabilité des formes végétatives de protozoaires
des formes trypomastigotes de Trypanosoma spp. dépend de la nature, du stade du parasite et des
avec une limite de détection inférieure à 100 para- modalités de conservation de la selle. On préco-
sites/mL. Elle est désormais peu utilisée. nisera donc une conservation des selles non fixées :
• à température ambiante si l’examen est pratiqué
dans les 12  heures suivant l’émission (délai
Examen parasitologique optimal d’acheminement  ≤  4  heures). On
des selles pourra ainsi repérer certaines formes mobiles
d’amibes et de flagellés et effectuer, selon
les renseignements cliniques, une recherche
Indications
spécifique d’anguillules. Néanmoins, les tro-
La Nomenclature des actes de biologie médicale phozoïtes d’amibes et de Dientamoeba fragilis
(NABM) encadre de façon précise la conduite de s’immobilisent et se lysent rapidement ;
l’examen parasitologique des selles (EPS). L’exa- • réfrigérée si l’examen est pratiqué au-delà de
men pourra être effectué selon deux modalités 12  heures pour éviter la pullulation micro-
(donc deux cotations différentes) selon que les bienne et fongique. Néanmoins, il est impor-
selles sont émises ou non au laboratoire. Dans tant de noter que cela entraînera une lyse
les deux cas, on effectuera : des formes végétatives de protozoaires et des
• sur le prélèvement, à réception  : un examen larves de strongyloïdes en l’absence de fixation.
macroscopique et microscopique direct pour Lorsqu’une partie des selles a été fixée, per-
rechercher et identifier les helminthes (adultes, mettant un examen direct dans les conditions
larves et œufs) et les protozoaires (formes optimales, la concentration peut être réalisée
végétatives et kystes) ; sur les selles non fixées conservées pendant
• après concentration  : une recherche micro- 4 jours au maximum, de +2 à +8 °C.
scopique des œufs, larves et kystes, selon une Le prélèvement de selles étant aisé à réaliser,
ou deux techniques au choix du directeur de il sera judicieux de refaire le prélèvement si
laboratoire. les conditions de conservation/acheminement
Le laboratoire devra donc élaborer une stratégie optimales ne sont pas garanties pour la bonne
pour combiner les différentes techniques néces- exécution des analyses requises.
saires à la réalisation de l’EPS. La figure  5.1 Les échantillons doivent être accompagnés de
présente un exemple de démarche fonction des renseignements cliniques précisant :
données clinico-épidémiologiques disponibles. • les séjours éventuels en zones chaudes et
humides, la durée du séjour et la date du
retour ;
Mise en œuvre • les signes cliniques et biologiques (éosinophi-
lie) ;
Prélèvement • le statut immunitaire du patient ;
L’examen sera réalisé sur des selles fraîches et • les traitements préalables au prélèvement ;
en quantité suffisante (≥ 40  g). L’ingestion de • les modalités de conservation des échantillons
laxatifs ou de médicaments opaques (charbon) est entre émission et arrivée au laboratoire (impor-
à éviter les jours précédant le recueil des selles. De tance de préciser l’heure du prélèvement).
même, un régime pauvre en fibres végétales dans Le compte-rendu de résultat du laboratoire
les jours précédant l’examen est recommandé. devra rappeler la nécessité d’effectuer au moins 3
Lorsque les selles ne sont pas émises au labora- EPS sur une période d’une dizaine de jours. Cette
toire, il sera préférable d’en fixer une partie dès répétition de l’EPS devrait également être réalisée
l’émission dans un fixateur (voir au chapitre  1, lors du contrôle après traitement antiparasitaire.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 99

Figure 5.1. Exemple de logigramme pour la réalisation d’un examen parasitologique des selles.
100 Méthodes

Les différentes étapes de l’EPS impliquent des La recherche et l’identification éventuelle de

compétences spécifiques (définies dans les critères parasites macroscopiques (anneaux de cestodes,
d’habilitation et de maintien des compétences adultes d’oxyures, etc.) seront réalisées lors de
du laboratoire d’analyses de biologie médicale cette étape.
[LABM]) afin de pouvoir détecter et différencier
les éléments pathogènes des éléments normaux Examen microscopique direct
ou non pathogènes. des selles fraîches
Les modalités techniques de l’examen direct
Examen macroscopique sont décrites dans le chapitre  1 («  Examens
On préférera le recueil des prélèvements dans directs »). On préférera une dilution au tiers de la
des pots transparents qui permettent de voir selle dans du sérum physiologique, l’eau dis-
l’ensemble de la selle. On notera systématique- tillée pouvant altérer les stades trophozoïtes lors
ment l’aspect et la consistance de la selle. Ces de l’examen de selles non fixées. On veillera à
éléments descriptifs peuvent se fonder de façon prélever à différents endroits de la selle ainsi qu’au
objective sur l’échelle de Bristol (figure 5.2) [8]. niveau des glaires lorsqu’elles sont présentes.

Figure 5.2. Échelle de Bristol définissant l’aspect et la consistance des selles.

(Source : Association française de formation médicale continue en hépato-gastro-entérologie.)
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 101

La dilution au 1/3 permet en règle générale même principe que la technique de Bailenger,
d’obtenir des préparations minces permettant une mais utilisant comme phase aqueuse le MIF.
observation de qualité. Idéalement, le laboratoire Cette technique préserve mieux les helminthes
devra disposer d’un microscope à platine chauf- que la technique de Bailenger, mais a l’inconvé-
fante afin de conserver en particulier la mobilité nient de produire des culots plus importants. Elle
des trophozoïtes de Dientamoeba fragilis ou des est en revanche particulièrement recommandée
amibes. pour la recherche des œufs de schistosomes.
Ces techniques sont les plus universelles car elles
Examen microscopique concentrent bien les kystes de protozoaires, les
après fixation-coloration larves et la plupart des œufs. On notera cepen-
dant que les œufs d’oxyure ou d’autres œufs
La préparation et les modalités d’observation
lourds s’enrichissent mal par ces techniques,
sont identiques à celle de l’examen direct sur
d’autant plus que la couche de débris est impor-
selles fraîches. En France, la coloration au MIF
tante (séquestration des œufs à l’interface des
ou équivalent est probablement la plus utilisée
deux phases). Par ailleurs, les culots des concen-
(voir chapitre  1, «  Techniques de coloration  »).
trations diphasiques sont souvent importants
Elle permet de visualiser notamment l’aspect et
avec certaines selles riches en cellulose et fibres
le nombre de noyaux des kystes amibiens. Les
musculaires.
selles fixées se conservent plusieurs mois, voire
plusieurs années entre 2 et 30 °C. L’examen peut Techniques de flottation
alors être différé. Les selles ainsi fixées pourront
Ces techniques consistent à diluer l’échantillon
constituer une parasitothèque destinée à la for-
fécal dans un liquide de densité supérieure à celle
mation du personnel et à la fabrication d’échan-
des éléments parasitaires qui seront récupérés pas-
tillons de CIQ.
sivement ou après centrifugation. Les techniques
utilisant des solutions de sulfate de zinc (type
Techniques de concentration
Faust) enrichissent bien les œufs, les kystes de
de routine
protozoaires et les larves. La technique de Willis
Ces techniques, dites « standard », sont choisies utilisant une solution saturée de NaCl ne peut
par le biologiste pour leur capacité à concen- être utilisée que pour la concentration des œufs.
trer le maximum d’espèces parasitaires. Une ou De plus, la formation de cristaux de NaCl sur la
deux techniques seront réalisées au choix du lamelle peut gêner l’observation si elle ne se fait
laboratoire. Les modalités des techniques de pas rapidement après la flottation.
concentration sont exposées dans le chapitre  1 En pratique, la densité des solutions classi-
(«  Techniques de concentration des selles  ») quement utilisées de 1,18 à 1,20 (techniques
Actuellement, les groupes de techniques suivants de Faust et Willis) entraîne l’impossibilité pour
sont utilisés. ces techniques de concentrer les œufs lourds
(embryophores de taenia, ascaris non fécondés,
Techniques diphasiques douves, bothriocéphale). Ces œufs nécessitent
Ces techniques associent une concentration par des solutions de flottation avec des densités supé-
centrifugation et une action dissolvante de sol- rieures.
vants organiques comme l’éther ou l’acétate
d’éthyle. Ces techniques ont l’avantage de don- Techniques par filtration
ner des culots de faible volume, donc un nombre Ce sont des techniques commerciales utilisant
réduit de lamelles à observer, car on rappellera les phases aqueuses des techniques diphasiques
qu’il est indispensable d’observer la totalité des (liquide de Bailenger, MIF ou iodésine) mais
culots de centrifugation. La technique du MIF n’utilisant pas de solvants. La concentration est
concentration est une technique diphasique de fondée sur le passage de la dilution fécale à travers
102 Méthodes

un filtre pendant la centrifugation. Ces techniques 37 °C pendant 24 à 48 heures. Cette technique
ont l’inconvénient majeur de produire des culots est très peu utilisée.
importants qui devront être observés en totalité.
Après dilution au 1/3 du culot, on obtient en Techniques de coloration permanente
général entre 10 à 30 lamelles à observer. Avec Afin d’améliorer la détection ou l’identification
certaines selles, les débris peuvent colmater les des trophozoïtes, des techniques de coloration sur
pores du filtre et empêcher le passage des gros frottis peuvent être réalisées. Bien que longues et
œufs (schistosomes). En revanche, contrairement parfois de réalisation délicate, ces colorations per-
aux techniques diphasiques, ces kits ont l’avan­ mettent de mieux apprécier les structures internes
tage de préserver les formes végétatives de proto­ des protozoaires.
zoaires.
Recherche de coccidies par microscopie
Techniques de concentration combinées Cette recherche permet la mise en évidence ciblée
Il s’agit par exemple de la méthode de Junod. des cryptosporidies, Cystoisospora belli, Cyclos­
Dans le but de réduire la durée d’observation pour pora cayetanensis et Sarcocystis hominis. Cette
la recherche d’œufs ou de larves peu abondants, recherche est indiquée chez tous les patients
il est possible de réaliser une technique combinée immunodéprimés et peut faire partie du bilan
qui a pour principe d’effectuer une flottation sur étiologique en cas de diarrhées chez des patients
plusieurs culots de techniques diphasiques. Cette immunocompétents du fait de l’incidence de la
technique permet d’obtenir pour les œufs et cryptosporidiose dans nos régions [6, 7] et dans
larves d’helminthes des facteurs de concentration les zones chaudes et humides [9].
de l’ordre de 50 à 100 fois (contre 10 à 20 fois Les deux obstacles à une recherche systéma-
avec les techniques de routine). tique sont :
• la nomenclature qui impose une prescription
Technique de Kato et Miura spécifique ;
• la longueur de réalisation des techniques de
Cette technique est adaptée à la détection des œufs coloration de type Ziehl-Neelsen.
d’helminthes. Elle peut être utilisée pour le suivi La technique en contraste de phase décrite
quantitatif de l’excrétion des œufs d’helminthes dans le chapitre 1 (« Techniques de coloration »)
(ascaris notamment) au cours d’un traitement. est une alternative intéressante car de réalisation
rapide et lue en 1 à 2 minutes. Le couplage à la
Techniques spécifiques technique de Bailenger permet d’augmenter la
sensibilité d’un facteur 10 à 20.
Leur mise en œuvre se fera soit sur prescription
spécifique, soit à l’initiative du biologiste sur Recherche de microsporidies
des arguments cliniques et/ou épidémiologiques.
La recherche des microsporidies devrait être sys-
Les modalités techniques de ces techniques sont
tématique chez tous les patients immunodépri-
rapportées dans le chapitre 1 (« Culture et inocula-
més et peut faire partie du bilan étiologique
tions à l’animal » et « Techniques de coloration»).
des diarrhées de voyageurs immunocompétents.
Leur recherche s’effectue classiquement par la
Recherche et identification
coloration de Weber (de lecture délicate et peu
de protozoaires
adaptée au « coup par coup ») ou par la mise en
Culture évidence de leur chitine par le Calcofluor White
La détection des amibes, flagellés, ciliés, de Dienta­ ou l’Uvitex® 2B [5]. Des approches moléculaires
moeba fragilis ou encore de Blastocystis sp. pourra sont également disponibles et tendent progres-
être améliorée par la réalisation de cultures courtes sivement à supplanter la microscopie.
xéniques de selles fraîches non fixées sur milieux En complément des méthodes précédemment
diphasiques (type Dobell et Laidlaw) incubées à décrites, des approches par tests de diagnostic
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 103

rapide ou par biologie moléculaire sont disponibles des larves d’anguillules par la réalisation du cycle
pour certains parasites et seront évoquées dans les externe. Plusieurs protocoles sont disponibles.
chapitres correspondants.
Test à la cellophane adhésive de Graham
Recherche d’helminthes C’est la technique de choix pour la recherche des
Technique de Baermann œufs d’oxyure. Le point d’appel est la présence
Cette technique (non réalisable sur selles liquides) d’un prurit anal. Cette recherche est particuliè-
permet notamment la recherche des larves rement conseillée chez l’enfant porteur ou non
d’anguillules. Des selles fraîches et non fixées d’une éosinophilie en cas de présence de cristaux
seront nécessaires. La mise en œuvre de cette tech- de Charcot-Leyden dans les selles lorsqu’aucun
nique nécessite une incubation de 3 à 24 heures autre parasite n’a été mis en évidence. À effectuer
d’attente avant lecture. La réalisation technique de préférence au laboratoire sans toilette locale et
impose un nettoyage soigneux du matériel souillé. avant les premières selles du matin.

Coproculture d’helminthes
Des selles fraîches et non fixées seront néces- Contrôles de qualité (tableau 5.2)
saires. Cette technique est réalisable sur des selles
Contrôles internes de qualité (CIQ)
liquides (par adjonction de charbon). Elle permet
l’identification des ankylostomidés à partir des Des suspensions de selles sont utilisables pour
larves obtenues en culture et l’enrichissement l’étape d’identification, réalisées à partir des

Tableau 5.2. Récapitulatif qualité pour la parasitologie des selles.

Nature du prélèvement Selles fraîches dans un pot propre ou stérile, transparent. Selles émises au laboratoire, selles fixées
Recommandations Quantité suffisante pour effectuer l’ensemble des techniques : >100 g ou 2 grosses noix de selles
pour la qualité Éviter laxatifs et médicaments ou produits opaques
du prélèvement
Conditions d’acheminement, Milieux de transport commercialisés (fixateurs) à recommander pour préserver différentes formes
milieux de transport parasitaires de protozoaires
Mode de conservation Température ambiante pendant 12 heures (optimal 4 heures) puis +4°C si hors délais prévus
(ne convient alors plus aux formes végétatives)
Température ambiante si recherche de larves d’anguillules
Principe méthodologique Examen macroscopique des selles et microscopique à la recherche de différentes formes parasitaires
après concentration par deux méthodes de principes différents. La concentration par une seule technique
est prévue en cas de surveillance après traitement ou de recherche nommément désignée (NABM).
CIQ Seules une « parasitothèque » de selles fixées (CIQ maison) ou des suspensions de billes
commercialisées permettent de mettre en place un CIQ pour l’étape de concentration.
Les suspensions commercialisées ou maison testent l’étape d’identification, à moins de les disperser
dans une selle négative.
EEQ Oui (suspension de selles pour l’étape d’identification)
Performances du test Le facteur de concentration obtenu est autour de ×10 mais il ne couvre pas tous les parasites ;
d’où l’importance au cours de la prestation de conseil d’ajouter des techniques supplémentaires :
coproculture, recherche des larves d’anguillules par l’extraction de Baerman, la coloration
de Ziehl-Neelsen à la recherche des Cryptosporidies, etc.
Cause d’erreur, limites du test Techniques pour un opérateur expérimenté
Faux négatifs :
– lecture trop rapide des préparations
– les parasites présents peuvent être soit en faible nombre, soit émis de façon aléatoire, il est donc
recommandé de réaliser 3 selles à plusieurs jours d’intervalles espacées dans le temps
– traitement d’épreuve administré récemment
Faux positifs : présence de débris végétaux
104 Méthodes

suspensions d’EEQ ou de selles positives fixées. ankylostomose, anguillulose, schistosomose,

Pour les techniques de concentrations, les CIQ toxocarose, filariose ;
commercialisés sont encore peu mis en place • une localisation erratique ou secondaire de
(microbilles commercialisées pour les techniques parasites à tropisme viscéral : hydatidose, échi-
diphasiques). On peut avoir recours à des échan- nococcose alvéolaire, amoebose, anguillulose,
tillons de CIQ fabriqués par le laboratoire à partir schistosomose ;
de selles positives fixées issues de leur activité. • l’émergence d’un parasite à potentiel infec-
L’enregistrement des résultats sera exploité tieux favorisé le plus souvent par une dimi-
pour délivrer les habilitations et le maintien des nution des défenses de l’hôte (VIH, maladie
compétences du personnel. hématologique, transplantation d’organe,
De façon à maîtriser la nature très hétérogène cancer, pathologie pulmonaire chronique, cir-
des selles et leur comportement différent au rhose, corticothérapie, etc.)  : toxoplasmose,
cours de la concentration diphasique, il est pos- trichomonose pleuropulmonaire, leishma-
sible d’introduire dans chaque selle un « traceur » niose, cryptosporidiose, anguillulose maligne
permettant de valider les phases critiques de la [10, 12, 13].
concentration. Pour les ascaridioses, l’extériorisation d’un
ver par la bouche au cours d’efforts de vomis-
Évaluation externe sements, faisant penser à une expectoration,
de la qualité (EEQ) est fréquente en zone tropicale (notamment
chez l’enfant avec infestation massive) et peut
La participation à des EEQ est une obligation
se rencontrer chez le voyageur. D’autres hel-
normative. L’exploitation des EEQ permet :
minthes (Anisakidés, Dirofilaria) peuvent excep-
• de répondre à la norme et d’évaluer globale-
tionnellement être expulsés spontanément dans
ment le laboratoire pour cet examen ;
les crachats.
• d’évaluer les performances des techniques de
Enfin, certaines infections parasitaires des voies
concentration lorsque les quantités d’échan-
respiratoires de l’animal, telles que la dirofila-
tillon fournies sont suffisantes ;
riose (canidés), la syngamose ou mammonoga-
• d’apporter un élément supplémentaire à la
mose (volailles) ou la capillariose (ruminants),
formation-habilitation et l’évaluation du per-
peuvent être observées occasionnellement chez
sonnel.
l’homme [14].
L’analyse repose sur la mise en évidence du
pathogène par observation macro- et microsco-
Examen parasitologique pique ou par techniques de biologie moléculaire ;
des prélèvements il n’y a pas de culture pour la quasi-totalité des
respiratoires et apparentés parasites recherchés.
La recherche microscopique directe de parasites
Indications dans des prélèvements respiratoires sera orientée
par :
L’atteinte pulmonaire est commune à de nom- • le contexte épidémiologique  : séjour en zone
breuses parasitoses. Elle peut correspondre à : tropicale ou en zone d’endémie, bain en eau
• l’action pathogène de parasites à tropisme pul- douce, etc. ;
monaire : paragonimose ; • la présence éventuelle d’une pathologie sous-
• un passage transitoire obligatoire de larves jacente (déficit immunitaire notamment) ;
d’helminthes lors de la phase de migration • les symptômes respiratoires observés (syndrome
du cycle parasitaire, responsable de troubles de Löffler, toux, dyspnée, hémoptysies), et leur
pulmonaires passagers (syndrome de Löffler, association éventuelle à d’autres symptômes
poumon éosinophile tropical)  : ascaridiose, (digestifs, cutanés, etc.) ;
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 105

• les anomalies radiologiques : infiltrats, nodules, de centrifugation (éventuellement avec Lugol)

opacités, etc. ; et un examen après coloration sont ensuite
• le bilan biologique  : hyperéosinophilie, hyper- effectués [11].
leucocytose, CRP, etc.

Interprétation
Mise en œuvre
La recherche directe de parasites dans les prélè-
La recherche de parasites peut être effectuée dans vements respiratoires est une méthode facile à
le LBA, les expectorations ou le liquide pleu- mettre en œuvre mais qui manque de sensibilité.
ral (tableau  5.3). Le prélèvement sera observé Elle doit être complétée par d’autres recherches
macroscopiquement à la recherche de parasites parasitologiques directes (par exemple dans les
(ver adulte d’Ascaris par exemple). Le LBA ou selles, le sang, ou la peau, en fonction des para-
le liquide pleural est ensuite centrifugé directe- sitoses suspectées) et des méthodes sérologiques
ment sur une lame de verre, sous forme de spot indirectes à la recherche d’anticorps spécifiques, à
(cytocentrifugation, 500  g pendant 5 minutes) adapter selon la phase de la parasitose et le cycle
ou dans un tube stérile conique à 1000 g pendant parasitaire (tableau  5.4). Pour certains parasites,
5 minutes. L’expectoration est déposée directe- des méthodes moléculaires par PCR en temps réel
ment sur une lame, sans prétraitement. Un exa- dont certaines commercialisées sont disponibles
men microscopique direct à l’état frais du culot (par exemple Toxoplasma gondii).

Tableau 5.3. Récapitulatif qualité pour la recherche des parasites dans les prélèvements respiratoires.
Nature du prélèvement LBA, expectorations, liquide pleural dans un récipient propre non obligatoirement stérile
Recommandations Aucune
pour la qualité
du prélèvement
Critères d’acceptabilité LBA, liquide pleural : volume >1mL
Conditions d’acheminement, Acheminement dans les 4 heures à température ambiante, +2 à +8 °C au-delà de 4 heures
milieux de transport
Mode de conservation +4°C après examen extemporané
Principe méthodologique L’analyse microscopique effectuée après centrifugation (LBA, liquide pleural) ou directement
(expectorations) inclura selon le contexte :
1. un examen direct du culot de centrifugation à l’état frais : visualisation des formes végétatives
des protozoaires (trichomonoses, amoebose) ou des crochets d’Echinococcus granulosus
(autofluorescence sous lumière UV), larves rhabditoïdes de Strongyloides stercoralis, œufs
de Paragonimus
2. un examen après coloration du spot de centrifugation :
– une coloration panoptique (Giemsa, MGG ou équivalent : visualisation des protozoaires dont
Toxoplasma gondii)
– une coloration de Ziehl-Neelsen : visualisation des oocystes de Cryptosporidium
3. à compléter par une recherche en PCR selon le contexte (suspicion de toxoplasmose, cryptosporidiose,
etc.)
Performances du test Sensibilité de l’examen direct microscopique variable en fonction des parasites
Cause d’erreur, limites du test Formation de l’opérateur pour l’identification des parasites, passage pulmonaire transitoire, intermittent
de certains parasites lors de leur cycle
Attention à ne pas confondre les cellules bronchiques ciliées avec les formes végétatives de protozoaires
flagellés (dont Trichomonas tenax)
Tableau 5.4. Éléments du diagnostic des principales parasitoses pulmonaires.

106
Parasite Morphologie Mobilité Observation Éléments d’orientation Diagnostic
des formes retrouvées à l’état frais microscopique parasitologique
Répartition Biocliniques,
dans les prélèvements complémentaire
géographique, radiologiques

Méthodes
facteurs de risque
Parasites Ascaris lumbricoides Larves, adultes vers rosés Oui NA Cosmopolite, risque Syndrome de Löffler EPS, sérologie
macroscopiques (mâle : 12-17 cm extrémité plus élevé en zone Hyperéosinophilie
(expectorations en crosse ; femelle : 20-25 cm) tropicale
ou assimilés)
Anisakis spp. Larves L3 de couleur Oui NA Cosmopolite, ingestion Signes Sérologie
blanche à jaunâtre, 1,4-3 cm de poissons crus immuno-allergiques
de longueur sur 0,5 mm ou peu cuits
de diamètre
Dirofilaria spp. Ver filiforme 8-12 × 0,1 cm Oui NA Cosmopolite Radiologie en « pièce NA
de monnaie »
Parasitoses Toxoplasma gondii Tachyzoïtes : piriformes, arqués Non Coloration panoptique Cosmopolite, Radiologie : infiltrats Sérologie, PCR
autochtones (figure 5.3a) 6-8 × 3–4 µm, intracellulaires (Giemsa, MGG, etc.), ×100 recherche bilatéraux
dans les macrophages d’immunodépression
Echinococcus Crochets (19–46 µm), sable Non État frais, ×40 Cosmopolite Aspect radiologique Sérologie, PCR
granulosus hydatique (protoscolex 150– Examen en UV en « boulet de canon »
200 µm), vomique hydatique (autofluorescence)
Trichomonas spp. Forme amœboïde 7–10 µm Oui État frais, coloration Cosmopolite, recherche Co-infection avec PCR
(figure 5.3b) panoptique (Giemsa, d’une pathologie Pneumocystis jirovecii
MGG, etc.), ×100 sous-jacente (cancer,
pathologie respiratoire
chronique, etc.)
Cryptosporidium spp. Oocystes 5–8 µm Non Coloration Ziehl-Neelsen, Cosmopolite, Association fréquente PCR
(figure 5.3c) ×100 recherche avec d’autres
d’immunodépression micro-organismes
(VIH) (CMV, Pneumocystis,
mycobactéries, etc.)
Capillaria aerophila Œufs ovales 20 × 40 µm Non État frais ×40 Cosmopolite Hyperéosinophilie EPS
à paroi striée présentant
2 bouchons polaires,
à différencier de l’œuf
de Trichuris trichiura 


Parasite Morphologie Mobilité Observation Éléments d’orientation Diagnostic
des formes retrouvées à l’état frais microscopique parasitologique
Répartition Biocliniques,
dans les prélèvements complémentaire
géographique, radiologiques
facteurs de risque
Parasitoses Paragonimus spp. Œufs ovoïdes, operculés, bruns, Non État frais ×40 Asie Hyperéosinophilie EPS
tropicales 80–100 µm de long Afrique
Schistosoma spp. Œufs avec éperon 50–160 µm Mobilité du État frais avec Lugol, ×40 Zone intertropicale, Hyperéosinophilie Sérologie, EPS, EPU
×40–80 µm miracidium Baignade en eau
douce
Strongyloides Larves strongyloïdes (migration) Oui État frais, coloration Zones tropicales et Syndrome de Löffler, Sérologie, EPS par
stercoralis 500–600 µm × 15 µm, panoptique (Giemsa, subtropicales, Europe hyperéosinophilie méthode de Baermann
queue discrètement bifide, MGG, etc.), ×40 du sud fluctuante (larves rhabditoïdes)
œsophage rectiligne, ou larves Immunodépression ou coproculture
rhabditoïdes (anguillulose (anguillulose maligne)
maligne)
Ancylostoma Larves strongyloïdes 500 µm Oui État frais, coloration Zones tropicales Hyperéosino- EPS, coproculture
duodenale, Necator panoptique (Giemsa, et subtropicales, zone philie, « catarrhe des

Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 107

americanus MGG, etc.), ×40 méditerranéenne gourmes »
Entamoeba histolytica Vomique amibienne Oui État frais, Lugol ou autre Zone intertropicale Polynucléose neu- Sérologie,
« chocolat », forme colorant, ×40 trophile, hépatalgie éventuellement EPS,
hématophage 20-40 µm fébrile PCR
Leishmania spp. Formes amastigotes 3-4 µm Non Coloration panoptique Zones tropicales Pancytopénie Sérologie, PCR, culture
(Giemsa, MGG, etc.), ×100 et subtropicales, zone
méditérannéenne
Filarioses Microfilaires : 200-300 µm Oui État frais, coloration Zones intertropicales Syndrome de Loeffler Sérologie, PCR
selon l’espèce. Les filarioses panoptique (Giemsa, et subtropicales Hyperéosinophilie
lymphatiques sont les plus MGG, etc.), ×10
fréquentes.
Mammomonogamus Vers en « Y ». Femelle : Non État frais, ×40 (œuf) Antilles, Amérique Hyperéosinophilie EPS
spp. 1,5-2 cm ; mâle : 0,3-0,6 cm. centrale
Œufs non embryonnés, avec
une ouverture polaire
70-100 µm × 40-60 µm
CMV : cytomégalovirus ; EPS : examen parasitologique des selles ; EPU : examen parasitologique des urines ; NA : non applicable.
108 Méthodes

Figure 5.3. Protozooses pulmonaires autochtones.

LBA. a) Tachyzoïtes de Toxoplasma gondii (MGG, objectif ×100). b) Forme amœboïde de Trichomonas tenax (Giemsa,
objectif ×100). c) Oocystes de Cryptosporidium parvum (MGG, objectif ×100).
(Source : eANOFEL (a, c) et collection ANOFEL, université de Lille 2 (b).)

Examen parasitologique Trichomonas vaginalis sera recherché prin-

des prélèvements cipalement dans des prélèvements génitaux
(méat urétral chez l’homme, prélèvement vagi-
génito-urinaires nal chez la femme) ou dans les urines chez
l’homme.
Indications Exceptionnellement, des microfilaires de fi­
laires lymphatiques ont été retrouvées dans les
La recherche de parasites dans les prélèvements
urines.
génito-urinaires concerne essentiellement deux
parasitoses, la schistosomose à Schistosoma haema­
tobium et la trichomonose.
La schistosomose (ou bilharziose) urogéni- Mise en œuvre et interprétation
tale, due au trématode Schistosoma haematobium, Recherche d’œufs de Schistosoma
constitue l’indication principale des prélèvements haematobium dans les urines
d’urine en parasitologie. L’hématurie chez des
patients ayant séjourné dans les régions endé- Prélèvement
miques est un signe révélateur de cette mala- L’excrétion des œufs se fait de manière incons-
die, mais l’examen est souvent prescrit après tante. De ce fait, il est recommandé, d’une
l’observation des signes moins spécifiques, ou en part, de renouveler l’examen et, d’autre part,
présence de critères biologiques comme l’hyper- de fournir les urines totales de 24  heures ou
éosinophilie ou une sérologie de schistosomose la totalité des premières urines du matin après
positive. Des œufs de schistosomes peuvent éga- effort (par exemple, monter des escaliers en mar-
lement être recherchés dans des biopsies vésicales, quant bien les pas pendant quelques minutes).
voire des biopsies du col utérin effectuées lors Cependant, des études n’ont pas trouvé de
d’un bilan de complications de la schistosomose bénéfices à cette dernière recommandation et
(voir au chapitre  5, «  Examen parasitologique préconisent d’utiliser des urines émises entre
d’autres prélèvements »). Depuis les cas de schis- 10  heures et 14  heures, étant donné que la
tosomose dans la rivière Cavu en Corse [21], il concentration d’œufs dans les urines serait
est recommandé pour tous les patients s’étant au maximum autour de midi [16,  17]. Dans
baignés dans cette rivière depuis 2011 de faire le cas de la récupération de la totalité d’une
systématiquement une recherche de schistosomes miction, il est important d’insister sur la néces-
dans les urines accompagnée d’une sérologie, sité d’avoir la fin de la miction ; la contraction
même en l’absence de signes cliniques (voir vésicale finale permettrait de chasser les œufs
chapitre 32). de la muqueuse.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 109

Techniques Cette technique permet une quantification des

Méthodes par centrifugation œufs si l’on a, au préalable, mesuré le volume
urinaire.
Pour les urines de 24  heures, la méthode la plus
Dans les cas avec des culots importants et des
simple est la concentration des œufs par sédi-
faibles quantités d’œufs, cette technique nécessite
mentation des urines sous l’effet de gravité, suivie
un temps de travail considérable au microscope.
d’une centrifugation. La décantation des urines
s’effectue pendant quelques heures, sous une
Méthode par filtration des urines
hotte, sans UV et de préférence à l’abri de la
lumière. Pour éviter l’altération des œufs si le La filtration des urines sur des filtres en polycar-
temps de décantation est prolongé (par exemple bonate permet une observation microscopique
pendant une nuit en cas de prélèvement arrivé sans fixation ni coloration. Le protocole décrit par
tardivement dans la journée) ou si l’urine ne peut Marshall [17] utilise un filtre avec un diamètre des
pas être examinée dans les 4 heures qui suivent la pores de 12 à 20  µm, permettant d’éliminer les
collecte, il est conseillé d’ajouter du formol aux hématies et de retenir les œufs de schistosomes.
urines (1 mL de solution de formaldéhyde à 37 % Cette technique nécessite un peu plus de matériel,
pour 100  mL d’urine), mais cette pratique peut mais a l’avantage de réduire le temps de lecture
gêner l’évaluation de la viabilité des miracidiums. et a été décrite comme plus sensible que la cen-
Le surnageant est éliminé et la centrifugation trifugation [19].
s’effectue sur les 20 à 100 mL de sédiment remis Les urines sont aspirées dans une seringue.
en suspension. La seringue est ensuite munie d’un porte-filtre
Pour les urines provenant de la totalité d’une dans lequel sera installé le filtre en polycarbonate
miction, l’échantillon peut être directement cen- d’environ 20 à 25 mm de diamètre, face brillante
trifugé. Disposer d’une centrifugeuse acceptant sur le dessus. Plusieurs passages sont possibles sur
des tubes à centrifuger d’un volume de 250 mL le même filtre. À la fin de la filtration, la seringue
facilitera le travail en limitant le nombre de culots est dévissée du porte-filtre, remplie d’air, puis
à examiner. Une solution alternative est la décan- refixée au porte-filtre afin d’expulser l’air à travers
tation préalable d’environ 1 heure à température le filtre (cela permet d’éliminer l’excès d’urines et
ambiante qui permettra de ne centrifuger que le de bien plaquer les œufs sur le filtre). Le filtre est
sédiment. récupéré et observé au microscope (figure  5.4).
Dans les deux cas, la vitesse de centrifuga- Cette technique permet également une quanti-
tion sera comprise entre 500 et 600  g pendant fication des œufs. Le porte-filtre peut être dés-
5 minutes environ pour éviter l’éclosion des infecté et réutilisé.
œufs ; elle est suivie d’une décantation immédiate Le choix de la technique peut dépendre de la
et d’une lecture de la totalité du culot entre lame qualité et du volume des urines :
et lamelle à l’objectif ×10 ou ×20. • urines claires : filtration aisée de la totalité d’une
Si le culot est franchement hématique, il peut miction, voire du sédiment ou du culot de cen-
être remis en suspension dans 20 mL d’acide acé- trifugation des urines de 24 heures ;
tique 3 % ou dans quelques gouttes de saponine • urines très hématiques : clarifier au préalable par
à 2 % pour clarifier les urines avant une nouvelle de l’acide acétique 3 % ou de la saponine, puis
centrifugation. S’il contient des sédiments chi- filtrer si le sédiment le permet ;
miques (cristaux divers, phosphates amorphes) • urines de 24  heures, riches en cellules ou
gênant l’observation, de l’acide acétique 5 % peut en sédiment  : centrifugation et examen de la
être rajouté goutte à goutte sur le culot. totalité du culot.
En cas de conglomérats cellulaires (cellules
endothéliales, polynucléaires), il est recommandé Interprétation
d’essayer de dissocier le conglomérat en appuyant Les œufs de S. haematobium mesurent 120 à
sur la lamelle et de reprendre l’observation. 170  µm sur 50  µm, avec un éperon terminal,
110 Méthodes

Figure 5.4. Filtration des urines pour la recherche d’œufs de Schistosoma haematobium.
a) Mise en place du filtre en polycarbonate de porosité 12 à 20µm (face brillante dessus) dans le porte filtre. b) Filtration
des urines. c) Récupération du filtre et dépôt sur une lame porte-objet, avec une goutte d’eau physiologique et lamelle
pour observation microscopique. L’eau physiologique peut être remplacée par une goutte de Lugol dilué pour colorer
les œufs en orangé.
(Source : collection ANOFEL, CHU de Limoges.)

caractéristique de l’espèce (voir chapitre 32). Pour

évaluer la nécessité d’un traitement, il est impor-
tant de distinguer les œufs vivants contenant
un miracidium, signe d’une infection active, des
œufs morts ou calcifiés, souvent indicatifs d’une
infection plus ancienne. En effet, des œufs morts
peuvent être trouvés dans les urines pendant
plusieurs mois après l’élimination d’une infec-
tion active. Les œufs vivants sont jaune pâle et
contiennent un miracidium mature (figure  5.5).
Dans des prélèvements frais, il est souvent pos-
sible d’observer la mobilité du miracidium à
l’intérieur de l’œuf ou la présence d’une cellule
à flammes (tableau 5.5).

Recherche de Trichomonas vaginalis

Prélèvements
Les prélèvements pour la recherche de T. vagina­
lis chez la femme et chez l’homme sont présentés
dans le chapitre 23.

Mise en œuvre
Examen direct à l’état frais
S’il s’agit d’urine, la totalité du premier jet mic-
tionnel est centrifugée (environ 1000  g pendant Figure 5.5. a) Œuf viable de S. haematobium
5 minutes) afin d’examiner le culot. dans les urines avec un miracidium bien visible
à l’intérieur. Noter l’éperon terminal, caractéristique
En cas d’écouvillonnage vaginal ou urétral, de cette espèce. b) Éclosion du miracidium.
l’écouvillon est immédiatement déchargé dans (Source : eANOFEL.)
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 111

Tableau 5.5. Récapitulatif qualité pour la recherche d’œufs de schistosomes dans les urines.
Nature du prélèvement Urines
Recommandations pour Urines de 24 heures ou totalité d’une miction de milieu de journée (au mieux après effort) recueillies
la qualité du prélèvement dans un récipient stérile
Conditions d’acheminement, Transport < 24 heures, pas de milieu de transport
milieux de transport Température ambiante
Mode de conservation Si analyse différée au lendemain, ajouter éventuellement du formol (1 mL de solution de formaldéhyde
37 % pour 100 mL d’urine)
Principe méthodologique Observation microscopique par examen direct. Recherche et identification morphologique
dans un culot d’urines après centrifugation ou sur un filtrat d’urines
Performances du test Technique de filtration plus rapide et plus sensible que la recherche après centrifugation [19]
Cause d’erreur, limites Perte de sensibilité par altération ou éclosion des œufs (centrifugation >500–560 g ou analyse
du test différée en l’absence de conservateur)
Amas de cellules gênant la lecture
Compétence du personnel pour l’identification morphologique microscopique

une goutte d’eau physiologique ou du milieu de Chez l’homme, la sensibilité de l’examen direct
transport (milieu de Stuart, Amies ou Roiron). est faible.
L’utilisation de milieu de transport permet de
conserver la viabilité du Trichomonas au moins Colorations
24 heures à température ambiante [20]. En cas d’impossibilité d’examen à l’état frais, des
L’observation à l’état frais au microscope colorations de frottis vaginaux ou d’écouvillonnage
(×10 ou ×20) doit être faite le plus rapidement urétral peuvent être réalisées. L’examen de frottis
possible. Elle permet de repérer aisément les colorés est toutefois moins sensible que l’examen à
Trichomonas par leur mobilité (figure  5.6). La l’état frais fait dans de bonnes conditions.
sensibilité est d’environ 60  % dans les prélève- Parmi les colorations, celle de Papanicolau pré-
ments vaginaux, mais diminue rapidement si cédée d’une fixation à l’éthanol préserve mieux
l’observation microscopique est retardée [15]. les structures flagellaires et la membrane ondu-
lante. Cette coloration est plus souvent réalisée
dans les laboratoires effectuant des cytologies de
prélèvements vaginaux. La coloration de Giemsa
avec fixation préalable de 5 minutes au méthanol
permet de repérer aisément le noyau en amande
et l’axostyle de T. vaginalis. La visualisation des
flagelles est plus délicate. La coloration de Gram
est la moins performante [18].

Biologie moléculaire
Les prélèvements urinaires ou génitaux seront
conservés en milieu de transport à +4 °C pour une
éventuelle extraction d’ADN avant analyse molé-
Figure 5.6. Trichomonas vaginalis à l’état frais
dans un prélèvement vaginal.
culaire. Pour T. vaginalis, il existe actuellement
Contraste de phase, objectif ×40. plusieurs kits commercialisés (voir chapitre  23)
(Source : eANOFEL.) (tableau 5.6).
112 Méthodes

Tableau 5.6. Récapitulatif qualité pour la recherche de Trichomonas vaginalis.

Nature du prélèvement Femme : leucorrhées prélevées au niveau du cul-de-sac vaginal postérieur, ou autoprélèvement vaginal
(voir chapitre 23)
Homme : urines, en l’absence de sécrétion urétrale ou goutte de sérosité au méat urétral
Recommandations Prélèvement vaginal : utilisation d’écouvillon en nylon floqué, sécrétions sur les parois du spéculum lors
pour la qualité de son retrait.
du prélèvement Urines : premier jet mictionnel, le matin
Écouvillonnage urétral le matin avant toute toilette, éventuellement après massage prostatique,
avec des écouvillons fins.
Critères d’acceptabilité Prélèvement datant de moins de 2 heures si pas de milieu de transport
Prélèvement datant de 24 à 48 heures si utilisation de milieu de transport [20]
Conditions d’acheminement, Transport immédiat (< 2 heures) en l’absence de milieu de transport, 24 heures si milieu de transport
milieux de transport (type milieu de Stuart ou Amies)
Température ambiante
Mode de conservation Température ambiante
Principe méthodologique Observation microscopique par examen direct ou après coloration. Recherche et identification
morphologique après examen direct à l’état frais (observation des formes mobiles) ou après coloration
(Giemsa, Papanicolau) d’un frottis réalisé à partir des leucorrhées ou prélèvement urétral
Performances du test Examen extemporané à l’état frais : 60-70 % [15]
Cause d’erreur, limites Trichomonas morts difficilement identifiables à l’examen direct en cas de délai
du test Compétence du personnel pour l’identification morphologique microscopique

Examen parasitologique Mise en œuvre

du liquide céphalorachidien Exigences

Indications Les exigences sont indiquées au tableau 5.7.

Cet examen vise à rechercher des parasites (proto- Examen direct

zoaires ou helminthes) dans le LCR (possible
aussi dans le liquide de dérivation ventriculaire). À l’état frais
La recherche est principalement microscopique, Le LCR sera examiné à l’état frais après homo-
effectuée à l’examen direct (état frais) ou après généisation, entre lame et lamelle ou lors de la
méthode(s) de concentration et coloration. Cet détermination de la formule leucocytaire. Cepen-
examen est essentiel pour les trypanosomes afri- dant, il est préférable d’effectuer une technique
cains (Trypanosoma brucei gambiense et T. b. rhode­ de concentration du fait du fréquent paucipa-
siense)  car il constitue un élément important rasitisme. Les techniques de concentration sont
du diagnostic de stade neurologique dans la la simple et la double centrifugation. La simple
trypanosomose humaine africaine (maladie du centrifugation consiste à examiner le culot obtenu
sommeil). Dans d’autres contextes, des trypano- entre lame et lamelle. La double centrifugation,
somes américains (T. cruzi, maladie de Chagas) plus sensible et destinée à la recherche de trypano-
ou des toxoplasmes (Toxoplasma gondii) peuvent somes [23], nécessite de reprendre le culot d’une
être recherchés, surtout chez les patients immu- première centrifugation (850  g, 10 minutes),
nodéprimés. Plus exceptionnellement, des amibes préalablement remis en suspension, au moyen
libres du genre Naegleria (dans ce cas, une culture d’un tube capillaire. Après scellement à la flamme,
spécifique est indiquée) voire des helminthes tels le tube capillaire sera soumis à une deuxième
que des larves de Strongyloides stercoralis (patient centrifugation (13 000-15 000  g, 1 minute)
immunodéprimé) ou des crochets d’Echinococcus dans une centrifugeuse à micro-hématocrite.
granulosus peuvent être observés. Le  tube  capillaire est ensuite cassé et le culot
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 113

Tableau 5.7. Récapitulatif qualité pour la recherche de parasites dans le LCR.

Nature du prélèvement Liquide céphalorachidien (LCR)
Recommandations Prélèvement non hémorragique ; la présence de parasites sanguins pouvant fausser le résultat
pour la qualité Quantité minimale : 1 à 2 mL
du prélèvement
Conditions d’acheminement, Dès que possible (< 4 heures)
milieux de transport
Mode de conservation Maintenir à température ambiante jusqu’à la réalisation de l’examen (boîte isotherme), certaines formes
parasitaires, notamment les formes végétatives de trypanosomes, étant très fragiles
Principe méthodologique 1. Examen microscopique direct (état frais) ou après diverses techniques de concentration
2. Mise en culture (cas d’une suspicion d’amibes libres)
3. PCR
CIQ Non disponible
EEQ Non disponible
Performances du test Non disponible
Cause d’erreur, limites Pauciparasitisme
du test Volume de prélèvement insuffisant
Risque de forte dilution des éléments parasitaires en cas d’examen d’un liquide de dérivation ventriculaire

monté entre lame et lamelle (observation à faible trypanosomes qui donnent des images peu
grossissement ×20 puis ×40 dans les 15 minutes). contrastées). L’utilisation du Calcofluor White
Pour faciliter la lecture et éviter les diffractions, on permet de faciliter la visualisation des amibes libres.
introduit de l’eau dans l’espace libre entre lame
et lamelle, sinon les trypanosomes perdent leur Modalités de lecture
motilité et deviennent difficiles à observer. Il a été À l’état frais, l’œil est attiré par l’éventuelle
récemment décrit une technique de simple centri- motilité des parasites. La lecture des états frais et
fugation qui, en utilisant des tubes à fond conique des lames colorées est réalisée au microscope en
modifié, permet d’obtenir la qualité de la double utilisant un objectif adapté au parasite recherché
centrifugation en une seule opération [22]. (l’utilisation du contraste de phase est une aide
À noter que le surnageant issu d’une cen- appréciable)  : objectif ×10 pour les larves rhab-
trifugation simple peut servir à la recherche de ditoïdes d’anguillules, ×20 à ×50 voire ×100
marqueurs biochimiques, sérologiques ou antigé- à l’immersion pour les lames colorées pour les
niques et une partie du culot à la mise en œuvre protozoaires.
de techniques de biologie moléculaire.
Cultures
Après coloration
Le LCR peut être mis en culture pour la recherche
Une prise d’essai de culot de centrifugation (ou
et l’identification d’amibes libres (exemple de
de LCR natif, en cas de faible quantité de prélève-
milieu  : gélose à 2  % d’Agar enrichie d’une sus-
ment) peut être étalée sur lame pour entreprendre
pension d’Escherichia coli incubée à 35 ±2 °C, voir
diverses colorations (voir chapitre 1, « Techniques
chapitre 24).
de coloration »). Des étalements de bonne qualité
peuvent être réalisés par cytocentrifugation (noter
Biologie moléculaire
que, dans ce cas, il n’est pas possible de récupérer
le surnageant et une partie du culot pour d’autres Les techniques de PCR seront mises en œuvre
analyses). pour la recherche de toxoplasmes ou d’amibes
La coloration unanimement utilisée est le libres. Elles peuvent également participer au diag-
MGG (attention aux colorations rapides pour les nostic de neurocysticercose.
114 Méthodes

Interprétation des techniques d’amplification génique (PCR).

Les prélèvements doivent être réalisés avant la
La recherche de parasites dans le LCR est un mise en route d’un traitement anti-infectieux et
examen peu fréquent en France métropolitaine et se feront en périphérie de la lésion dans l’ordre
peu sensible. Dans ces circonstances, le diagnostic suivant :
moléculaire sera privilégié lorsqu’il est disponible. • pour l’examen microscopique  : gratter la cor-
La validation d’un résultat doit faire appel à un née avec la lame du scalpel/bistouri et étaler
personnel formé à la recherche de ces parasites sur la lame (lame avec zone d’échantillon
rares dans le LCR. Dans tous les cas, la positivité délimitée), à conditionner dans la boîte de
de cette recherche affirmera l’infection. transport ;
• pour le diagnostic moléculaire (PCR) : gratter
la cornée en utilisant une deuxième lame de
Examen parasitologique scalpel/bistouri et insérer la lame dans le micro-
d’un prélèvement cornéen tube de 1,5 mL contenant le tampon (200 µL
de PBS), fermer le tube. Vortexer immédiate-
Indications ment le tube pendant 10 secondes (les cellules
de la cornée sont « déchargées » de la lame de
Le prélèvement cornéen est pratiqué en cas de scalpel/bistouri). Ouvrir le tube et jeter le scal-
suspicion de kératite microbienne et est destiné pel (à défaut, la présence d’inhibiteurs empê-
à la recherche de champignons (par ordre de chera la réaction de PCR). Dans le cas où il
fréquence  : Fusarium, Candida, Paecilomyces, n’est pas possible de décharger le prélèvement
Aspergillus, etc.), d’amibes libres oculaires sur place, il est aussi possible de gratter avec
(Acanthamoeba), voire de microsporidies (Ence­ une éponge stérile et de l’insérer dans un
phalitozoon ou Vittaforma). Toute kératite aiguë microtube de 1,5  mL contenant du tampon
requiert une prise en charge ophtalmologique ou non ;
urgente car le pronostic visuel est en jeu (ulcération • pour la culture d’amibes libres  : gratter la
de la cornée) [24]. Le prélèvement est délicat cornée avec un écouvillon stérile et ensemencer
et les faibles volumes d’échantillon nécessitent immédiatement par la méthode des 3 cadrans
de cibler les techniques de détection selon leur la boîte de Pétri de 5,5 cm contenant de l’eau
sensibilité et le type de lésion pour orienter les gélosée (agar à 2  %) pour la culture d’Acan­
recherches. thamoeba. Jeter l’écouvillon après l’ensemence-
ment. Sceller hermétiquement la boîte de Pétri
avec du film plastique de paraffine sur papier.
Mise en œuvre Dans le cas où il n’est pas possible d’ense-
mencer sur place, gratter avec une éponge
Recommandations stérile et l’insérer dans le microtube de 1,5 mL
pour la qualité du prélèvement contenant 50  µL (2 à 3 gouttes) de sérum
Le port de gants stériles sans talc est obligatoire. physiologique ;
Un blépharostat (instrument ayant pour but • pour la culture fongique  : gratter la cornée
de maintenir les deux paupières écartées) est avec l’écouvillon à embout à nylon floqué et
mis en place et les prélèvements sont réalisés le réinsérer dans son tube d’origine (il sera
après un indispensable rinçage de la surface ensemencé au laboratoire dans une boîte de
oculaire avec 5 mL de sérum physiologique. Ce Pétri contenant un milieu Sabouraud). Il est
lavage élimine la fluorescéine et l’oxybuprocaïne également possible de gratter avec une éponge
administrées pour l’examen à la lampe à fente stérile et de l’insérer dans un microtube de
(biomicroscope) qui peuvent être des inhibiteurs 1,5 mL stérile vide.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 115

Les renseignements cliniques indispensables contrôlée, après l’extraction de l’ADN par

doivent être disponibles : description des lésions, l’amplification d’un gène humain et d’un contrôle
traitement antibiotique, port de lentilles de d’inhibition, afin de limiter le risque de faux
contact, et tout autre élément que l’ophtalmolo- négatifs et d’optimiser le diagnostic.
giste jugera adéquat.

Examen parasitologique
Recommandations au laboratoire
d’autres prélèvements
• La lame sera lue au microscope après coloration
de Gram (réalisée en priorité) ou coloration de Dans ce chapitre seront regroupés des prélève-
Giemsa, MGG ou Trichrome (si les quantités ments cutanés, digestifs, des prélèvements pero-
d’échantillon le permettent). pératoires et biopsies diverses dans lesquels est
• Le tube contenant le tampon où ont été demandée une recherche de parasites. Il s’agit en
déchargées les cellules de la cornée se conserve général de prélèvements précieux. Par ailleurs, la
à +4  °C en attendant l’extraction d’ADN. nature du parasite recherché n’est pas toujours
Si l’échantillon n’a pas été préalablement précisée. Pour optimiser les recherches parasi-
déchargé, l’éponge est déchargée au laboratoire tologiques, il conviendra de respecter certaines
dans 200 µL de PBS par agitation automatique règles :
pendant 5 minutes. • vérifier les informations transmises, complé-
• La boîte de Pétri contenant l’eau gélosée (agar ter si nécessaire en prenant contact avec le
à 2 %) est enrichie au laboratoire en suspension prescripteur  : origine géographique, voyages,
d’E. coli vivants ou tués puis incubée à tempé­ caractère aigu/chronique, statut immunitaire,
rature ambiante ou à 30 ±2 °C. Si le prélèvement données cliniques et biologiques (anomalies
n’a pas été ensemencé auprès du patient, la de la numération formule sanguine [NFS], du
mousse imbibée de sérum physiologique est bilan inflammatoire, du bilan hépatique, etc.) ;
ensemencée au laboratoire. • contacter les anatomopathologistes et les
• L’ensemencement de l’écouvillon ou de microbiologistes (bactériologie, mycologie)
l’éponge sur la boîte de Pétri contenant un afin de vérifier qu’ils disposent de prélèvements
milieu Sabouraud se fait idéalement à l’arrivée à leur intention et d’optimiser la prise en charge
au laboratoire. Il peut être différé en conservant de ces prélèvements précieux ;
l’échantillon à température ambiante. • examen macroscopique : description de l’échan-
tillon adressé (parasite macroscopique, pièce
Conditions d’acheminement, opératoire, etc.)  : forme, consistance. Un exa-
milieux de transport men à la loupe binoculaire peut affiner l’obser-
Tous les échantillons prélevés doivent parvenir vation. Une photographie est recommandée ;
au laboratoire au mieux dans l’heure qui suit les • examen microscopique systématique (fonction
prélèvements et au maximum en 24  heures. Ils du prélèvement adressé) : examen direct, frottis
sont transportés et se conservent à température (liquide) ou apposition sur lame (tissu) et colo-
ambiante. Le microtube de 1,5  mL destiné à la ration par MGG, autres colorations en fonction
PCR est conservé à +4  °C mais peut être trans- du type de parasite recherché ;
porté à température ambiante. • éventuellement, techniques complémentaires,
telles qu’une mise en culture du prélèvement
ou une recherche du parasite par biologie molé-
Contrôle de la qualité du prélèvement culaire (PCR).
La qualité du prélèvement cornéen (quantité La conservation d’un fragment par congéla-
suffisante et absence d’inhibiteurs) peut être tion (pour biologie moléculaire ultérieure) est
116 Méthodes

fortement recommandée (à privilégier en cas de Mise en œuvre

prélèvement en très faible quantité). Le prélèvement est généralement fait en dermato-
logie car une anesthésie locale avec de la xylocaïne
est nécessaire.
Prélèvements cutanés Pour les helminthes à localisation sous-cutanée,
la biopsie-exérèse sera analysée de façon conjointe
Frottis d’exsudat avec le service d’anatomopathologie.
d’une lésion cutanée Pour la recherche de leishmanies, plusieurs
biopsies de 2 à 4 mm de diamètre sont réalisées
Indication à l’aide d’un bistouri cylindrique («  punch  »)
Diagnostic d’une leishmaniose cutanée. au niveau de la bordure inflammatoire de la
lésion, ce qui permet d’obtenir des volumes plus
Mise en œuvre importants.
Un échantillon de biopsie est fixé dans une
Retirer délicatement la croûte ou l’enduit fibrino- solution de formol à 10  % pour l’analyse anato-
leucocytaire de la lésion suspecte, visualisant ainsi mopathologique ; un autre spécimen, non fixé et
une ulcération. En cas de surinfection bacté- acheminé rapidement au laboratoire, est utilisé
rienne, il sera préférable d’éliminer auparavant pour réaliser un frottis par impression  ; et un
cette surinfection par un traitement antibiotique. dernier spécimen sera conservé pour la biologie
On peut recueillir les sérosités en appliquant direc- moléculaire.
tement une lame sur la lésion, mais un grattage Un des morceaux prélevés est placé sur une
appuyé avec un bistouri à lame courbe sur le fond lame de verre et une autre lame de verre recouvre
et au niveau de la bordure inflammatoire de la le fragment ainsi pris en sandwich entre les deux.
lésion (ou bourrelet périphérique) en évitant de Sur une surface ferme, ce fragment de tissus est
faire saigner est préférable. Une variante consiste à écrasé ensuite entre les deux lames de verre. La
prélever à l’aiguille fine par va-et-vient et rotation pression doit être exercée sur le milieu des lames ;
dans la bordure lésionnelle suivis d’aspiration. les cellules des tissus se trouvent alors contraintes
Les produits de raclage ou les sérosités sont de se fixer sur les deux surfaces des lames en
étalés sur des lames porte-objet puis fixées et colo- contact avec l’échantillon. Les lames, débarras-
rées au MGG ou au Giemsa. La lecture à l’objectif sées des fragments de tissus, sont ensuite séchées,
×50 ou ×100 à l’immersion doit être prolongée colorées au MGG ou au Giemsa après fixation
fin de détecter les leishmanies parfois rares dans dans du méthanol pour être examinées au micro-
les lésions anciennes et difficiles à repérer, dans le scope aux objectifs ×50 ou ×100 à immersion.
cytoplasme des macrophages ou extracellulaires. Cette technique serait plus sensible que les tech-
La recherche de l’ADN de leishmanies et niques histologiques [26].
la mise en culture éventuelle du prélèvement
complèteront cette recherche (voir chapitre 28).
Biopsie cutanée exsangue (BCE)
Biopsie cutanée Indication
Indication Cette technique est utilisée principalement pour
rechercher les microfilaires cutanées (Onchocerca
L’indication principale est celle du diagnostic
volvulus et Mansonella streptocerca) [27].
d’une leishmaniose cutanée. Des biopsies-exé-
rèses peuvent être réalisées plus rarement pour le
Mise en œuvre
diagnostic d’autres parasites à localisation sous-
cutanée  : gnathostomes, cysticerques, cœnures, Le prélèvement, retirant un petit copeau de
Dirofilaria, puce chique, etc. peau, se fait à l’aide d’une pince à sclérotomie
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 117

(snip test), des petits ciseaux courbes, ou à l’aide

d’un scalpel et d’une aiguille (pour soulever la
peau) sans anesthésie locale. Il est non dou-
loureux car très superficiel. Si le prélèvement
est hémorragique, il convient de renouveler la
biopsie (pour éviter une éventuelle « contamina-
tion  » avec des microfilaires sanguines, notam-
ment de Loa loa). En raison du tropisme des
filaires, en Afrique, ces biopsies se font plutôt
au niveau des crêtes iliaques, tandis que pour
les patients d’Amérique centrale, elles seront
réalisées au niveau des omoplates. Le prélève- Figure 5.7. Biopsie cutanée exsangue
ment par sclérotome est calibré, permettant de pour la recherche de microfilaires d’Onchocerca volulus,
comparer les charges filariennes dans le suivi à l’aide d’un sclérotome.
(Source : collection ANOFEL, CHU Angers, Tours, Rennes.)
thérapeutique des patients.

Technique
Après avoir, le cas échéant, éliminé le sang avec
un papier filtre, chaque biopsie est placée dans
environ 50 à 100  µL de sérum physiologique
dans un verre de montre ou dans le puits d’une
plaque à microtitration. Le couvercle de la plaque
sera scellé avec un film plastique. Des lectures
seront effectuées au microscope à faible gros-
sissement ou à la loupe binoculaire à partir de
30 minutes, puis après 4  heures et régulière-
ment jusqu’à 24,  heures après le prélèvement
afin de détecter la présence de microfilaires
vivantes qui s’agitent dans le sérum physiolo- Figure 5.8. Émergence d’une microfilaire d’Onchocerca
gique (figures 5.7 et 5.8). Longues de 300 µm, volvulus à partir d’une biopsie cutanée exsangue.
(Source : eANOFEL.)
celles-ci sont faiblement mobiles, se pliant et
se dépliant en leur milieu. À 24  heures, le
liquide sera pipeté et placé sur une lame pour
examen direct au microscope à l’objectif ×5 ou sonde par la bouche ou par le nez dans le
×10 ; les microfilaires mortes et donc immobiles tube digestif haut pour prélever les sécrétions
apparaissent comme des parenthèses translucides duodénales à fin d’analyses biologiques. En para-
avec une queue caractéristique effilée et recour- sitologie, cette pratique peut être utilisée pour le
bée. Des colorations au MGG permettront de diagnostic de giardiose.
différencier Onchocerca volvulus de Mansonella L’examen déplaisant mais non douloureux
streptocerca. s’effectue sans anesthésie. Il ne se pratique ni sur
les enfants insuffisamment coopérants, ni sur les
personnes réticentes.
Prélèvements digestifs Le liquide ainsi prélevé est versé dans un tube
stérile. Il doit être acheminé au laboratoire et
Liquide duodénal examiné au microscope dans l’heure qui suit le
prélèvement pour ne pas altérer les résultats.
Ce prélèvement est obtenu lors d’un tubage Les formes végétatives de Giardia intestinalis,
duodénal. Celui-ci nécessite l’introduction d’une mobiles dans le milieu, sont facilement repérables.
118 Méthodes

En cas de positivité, le reste du liquide duodénal est recommandé d’éclaircir le prélèvement en le

peut être conservé dans une solution de fixation mettant directement entre lame et lamelle dans
(voir au chapitre  1, «  Méthodes de fixation- une goutte de chloral lactophénol ou de gomme
conservation »). au chloral (figures  5.9 et  5.10). Ces montages
Il est possible de visualiser des œufs de douves permettent de relire le prélèvement à distance
hépatiques (Fasciola, Opistorchis, Clonorchis), des après éclaircissement (2 à 24 heures selon l’épais-
œufs de Strongyloides stercoralis, mais c’est une seur de la biopsie) et de le conserver.
découverte fortuite qui reste très rare.
Pour la recherche d’Entamoeba histolytica
Le prélèvement effectué au niveau d’une ulcé-
Biopsies rectales et vésicales ration sera mis dans quelques gouttes de sérum
physiologique et examiné au laboratoire dans les
Indication 4 heures qui suivent le prélèvement. Le fragment
Recherche d’œufs de schistosomes (quelle que est mis entre lame et lamelle pour l’observation
soit l’espèce dans les biopsies rectales) ; recherche des formes végétatives. Un fragment sera égale-
d’Entamoeba histolytica dans des biopsies recto-
sigmoïdiennes.

Mise en œuvre
Au cours d’une rectoscopie ou sigmoïdoscopie,
ou d’une cystoscopie (suspicion de schistosomose
urinaire), l’opérateur prélève avec une pince à
biopsie un fragment de tissus de muqueuse et
sous-muqueuse dans des zones suspectes (polypes,
érosions, etc.). Pour la recherche de schisto-
somes, en l’absence de lésions visibles au cours
de la rectoscopie, il est recommandé de réaliser
les biopsies au niveau de la valvule de Houston Figure 5.9. Œufs de S. mansoni et S. haematobium
et à environ 10  cm au-dessus de celle-ci. Plu- dans une biopsie de muqueuse rectale.
sieurs biopsies de fragments tissulaires sont ainsi Les œufs noirs sont calcifiés ou morts. Objectif ×40.
(Source : eANOFEL.)
réalisées sous endoscopie. Pour chaque niveau,
un fragment sera destiné à l’anatomopathologie
(flacon contenant du formol ou du liquide de
Bouin), et un autre pour la parasitologie déposé
dans un flacon sec ou contenant quelques gouttes
de sérum physiologique et acheminé rapidement
au laboratoire, et un dernier sera conservé en vue
de techniques moléculaires éventuelles.

Technique
Pour la recherche d’œufs de schistosomes
Le fragment frais sera déposé entre deux lames de
verre porte-objet puis écrasé et immédiatement
examiné au microscope sans coloration au préa- Figure 5.10. Œufs de S. haematobium
dans une biopsie vésicale.
lable (faible grossissement). Pour faciliter la Objectif ×40.
détection des œufs dans des fragments épais, il (Source : eANOFEL.)
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 119

ment adressé en anatomopathologie et un autre L’examen direct sans coloration du fluide hyda-
pourra être destiné à la détection d’E. histolytica tique contenu dans un kyste permet de visua-
par PCR. liser potentiellement des protoscolex, à défaut
des crochets et/ou des débris cellulaires (sable
hydatique). L’observation des scolex et crochets
Test de Graham ou test peut être facilitée par centrifugation préalable du
à la cellophane adhésive liquide, par coloration de Baxby (modifiée selon
Clavel) [25] ou par observation de l’autofluores-
Indications
cence des crochets au microscope à épifluores-
Recherche d’œufs d’oxyures et d’embryophores cence (excitation à 330 à 365 nm ou 410 nm).
de Taenia saginata. L’ajout d’éosine à 0,1-0,2 % permet d’évaluer la
viabilité des protoscolex (les protoscolex morts se
Mise en œuvre colorent, les vivants rejettent l’éosine).
Le test doit de préférence se réaliser le matin pour
la recherche d’œufs d’oxyure, avant toute toilette
locale ou défécation ; pour la recherche d’œufs ou
Ponction d’abcès amibien
embryophores de Taenia, l’heure du prélèvement Une ponction de l’abcès hépatique à visée diag-
n’a pas d’importance. Le patient est positionné nostique est exceptionnellement réalisée, surtout
penché en avant, fesses écartées pour bien déplier dans les cas d’importation. Elle est réservée aux
les plis anaux et périanaux. cas diagnostiques difficiles (sérologie négative).
La ponction à visée thérapeutique est réservée
Technique aux abcès volumineux, avec risque de rupture,
Appliquer pendant 1 à 2 secondes le fragment de ou d’évolution thérapeutique défavorable sous
ruban adhésif transparent replié en U sur le fond métronidazole.
d’un tube à essais, au niveau des plis radiés de La ponction guidée (sous scanner, à défaut
l’anus, puis le retirer et ensuite apposer la partie échographie) permet de collecter classiquement
collante sur une lame porte-objet sans laisser un pus couleur chocolat. La recherche microsco-
trop de bulles d’air (causes d’erreur diagnos- pique de trophozoïtes d’E. histolytica est possible
tique). L’observation microscopique au faible mais de faible sensibilité (< 20 %), les amibes étant
grossissement (objectif ×10 ou ×20) peut se faire préférentiellement situées au niveau des parois du
directement  ; les œufs transparents, ovalaires et kyste. Le diagnostic de référence est la détection
asymétriques sont de reconnaissance aisée. On d’ADN d’E. histolytica par PCR sur ce pus.
peut aussi déposer sur la lame 1 à 2 gouttes
d’huile à immersion ou de bleu coton pour
faciliter l’observation après avoir décollé le ruban Autres biopsies d’un tissu mou
adhésif.
Des biopsies de divers tissus peuvent être ache-
Ponction de kyste hydatique minées au laboratoire pour recherches parasito-
logiques. La connaissance de la localisation des
La ponction d’un kyste supposé être une lésion parasites dans l’organisme permettra de mettre en
d’échinococcose kystique est contre-indiquée en rai­ œuvre les techniques adaptées à leur recherche.
son du risque de dissémination et/ou de choc ana­ Plus encore que pour tout autre prélèvement bio-
phylactique. En revanche, les kystes peuvent être logique, un dialogue bioclinique est nécessaire pour
retirés par voie chirurgicale ou lors de ponction orienter les recherches. Le tableau 5.8 récapitule les
aspiration injection réaspiration (PAIR) et envoyés principaux parasites à rechercher en fonction de la
au laboratoire pour confirmation du diagnostic. nature des tissus et les méthodes à mettre en œuvre.
120 Méthodes

Tableau 5.8. Indications et techniques d’analyse de diverses biopsies de tissu mou.

Biopsie Indication Mise en œuvre Techniques microscopiques Autres
techniques
Duodénale Giardiose Transfert au laboratoire dans Apposition directe de la tranche de section PCR
un flacon stérile avec quelques biopsique sur la lame ou après écrasement cryptosporidies
Intestin grêle Cryptosporidiose
gouttes de sérum physiologique de la biopsie entre deux lames. Observation
Colique, rectale Amoebose Transfert rapide et analyse à l’état frais (sérum physiologique) : PCR
immédiate en cas de suspicion trophozoïtes de Giardia et d’amibes E. histolytica
d’amoebose Coloration au MGG/Giemsa : trophozoïtes
de Giardia
Coloration à l’hématoxyline ou au
Ziehl-Nielssen modifiée selon Kinyoun :
oocystes de Cryptosporidium
Examen microscopique aux objectifs
×40, × 100
Rectale Schistosomose Prélèvements au niveau de la Écrasement de la biopsie entre deux lames
(toute espèce) lésion ou au niveau de la valvule et observation à l’état frais
de Houston et à environ 8 à 10 cm Éclaircissement à la gomme au chloral
Vésicale Schistosomose
au-dessus ou au chloral lactophénol
à S. haematobium
Biopsie comprenant muqueuse Coloration possible au Ziehl-vert de méthyle
et sous-muqueuse Examen microscopique aux objectifs
Transfert au laboratoire dans ×10, × 40.
un flacon stérile avec quelques Observation en lumière UV (œufs
gouttes de sérum physiologique spontanément fluorescents)
Cutanée Leishmaniose Anesthésie locale, biopsie à Apposition directe de la tranche de section PCR
cutanée l’emporte-pièce au niveau de biopsique successivement à différents leishmanies
la bordure inflammatoire de la endroits d’une lame Culture
lésion suspecte Coloration au MGG/Giemsa
Transfert au laboratoire dans Examen microscopique aux objectifs
un flacon stérile avec quelques ×40, × 100
gouttes de sérum physiologique
Hépatique, Leishmaniose Transfert au laboratoire dans Apposition directe de la tranche de section PCR
splénique, viscérale un flacon stérile avec quelques biopsique successivement à différents leishmanies
ganglionnaire gouttes de sérum physiologique endroits d’une lame Culture
Coloration au MGG/Giemsa
Examen microscopique aux objectifs ×40,
×100
Ganglionnaire Trypanosomose Transfert au laboratoire dans Apposition directe de la tranche de section PCR
africaine (phase un flacon stérile avec quelques biopsique successivement à différents Trypanosoma
lymphatico- gouttes de sérum physiologique endroits d’une lame brucei *
sanguine) Observation à l’état frais (sérum PCR
Trypanosomose physiologique) : recherche des formes Trypanosoma
américaine mobiles caractéristiques cruzi
(maladie de Coloration au MGG/Giemsa PCR
Chagas) Examen microscopique aux objectifs ×40, Toxoplasma
Toxoplasme ×100
Musculaire Trichinellose Transfert au laboratoire dans Observation microscopique directe PCR
Toxoplasmose un flacon stérile avec quelques (trichinellose) Toxoplasma
gouttes de sérum physiologique
Cérébrale Toxoplasmose Transfert au laboratoire dans Apposition directe de la tranche de section PCR
Amibes libres un flacon stérile avec quelques biopsique successivement à différents Toxoplasma
gouttes de sérum physiologique endroits d’une lame PCR amibes
Coloration au MGG/Giemsa libres
Examen microscopique aux objectifs ×40,
×100
Culture (amibes libres) ou inoculation
à la souris (toxoplasme)
* Examen très rarement prescrit réalisé dans des centres experts comme l’Institut de médecine tropicale d’Anvers.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 121

Approche en mycologie diagnostic vers une infection fongique et parfois

même dans certains cas vers l’espèce fongique sus-
Examen mycologique pectée. La localisation des lésions a également son
pour infections superficielles importance, certaines espèces ne se développant
pas sur toutes les surfaces corporelles.
Les traitements antifongiques récents ou en
Indications
cours ont également un impact sur les résul-
Les mycoses superficielles sont les infections fon- tats. En effet, l’examen direct et/ou la culture
giques les plus fréquentes et peuvent toucher la mycologique pouvant se négativer sous traitement
peau, les phanères ou les muqueuses. Différents antifongique. Il est donc conseillé de respecter
types d’agents fongiques peuvent être respon- une fenêtre thérapeutique avant de pratiquer les
sables de mycoses superficielles, principalement prélèvements  : 2 semaines pour tout traitement
les levures et les dermatophytes, et plus rare- antifongique local, et environ 1 mois pour un
ment les pseudodermatophytes et les moisissures. prélèvement d’ongles en cas d’utilisation de solu-
Le prélèvement est une étape charnière du diag- tions filmogènes (vernis), voire 3 mois en cas de
nostic des infections mycologiques superficielles traitement antifongique systémique (tableau 5.9).
conditionnant en grande partie la prise en charge
de ces pathologies. Il est important de privilégier
un bon contact entre biologiste et clinicien. Détail des techniques [31]
Un examen mycologique de qualité repose en
Mise en œuvre premier lieu sur un prélèvement mycologique de
qualité, pratiqué en quantité suffisante, au bon
Les modalités de réalisation des prélèvements endroit et orienté en fonction de la clinique. Il
dépendent de la localisation et de l’aspect des nécessite un minimum de matériel et d’expé-
lésions. Il est tout à fait possible de passer à côté rience pour être bien réalisé  : pinces à ongles
d’un tel diagnostic dans le cas d’un prélèvement coupantes/ciseaux à ongles, pinces à épiler, vac-
mal exécuté, réalisé au mauvais endroit ou encore cinostyles ou curettes tranchantes (par exemple
en quantité insuffisante. Un interrogatoire bien curette de Brocq), grattoirs, cellophane adhésive
orienté du patient (voyages, profession, contact transparente, écouvillons stériles, compresses
avec les animaux, notion de traitement antifon- stériles, boîtes pour recueillir les squames (type
gique, etc.) contribue déjà à l’orientation du Pétri ou, idéalement, en verre, afin de limiter

Tableau 5.9. Récapitulatif qualité pour les prélèvements d’infections fongiques superficielles.
Nature du prélèvement – Peau (squames), phanères (ongle, poils, cheveux ou muqueuse
– Muqueuses : 2 écouvillons secs ou avec milieu de transport
Recommandations Il sera pratiqué par une personne compétente diplômée [28].
pour la qualité Matériel de prélèvement : pinces, curette, écouvillons stériles, etc. ; recueil en boîte stérile fermée
du prélèvement hermétiquement
Conditions d’acheminement, Température ambiante
milieux de transport
Mode de conservation Plusieurs semaines à température ambiante
Principe méthodologique Mise en culture sur milieux spécifiques Sabouraud ± additionné d’antibiotiques (pour la peau et phanères,
le cycloheximide inhibe les bactéries et les moisissures) et identification des colonies fongiques
CIQ Souche de dermatophyte de référence pour tester le milieu avec cycloheximide
Performances du test Préleveur et opérateur-dépendant
Cause d’erreur, limites du test Champignon non viable, durée d’incubation trop courte, traitement antifongique préalable
122 Méthodes

l’électrostaticité), lampe de Wood. Il existe des invasive (voir chapitre  46). Cette stratégie, dont
écouvillons avec milieu de transport, mais dont l’intérêt reste à l’heure actuelle discuté, repose
l’utilisation reste à valider pour les dermatophytes, classiquement sur la réalisation des prélèvements
même si quelques essais ont été très concluants. multisites, notamment pluri-orificiels (bouche,
Il est conseillé de ne pas se limiter à la seule nez, anus, aisselles, etc.). Ces prélèvements seront
localisation pour laquelle le patient consulte, mais pris en charge de la même manière que les autres
de toujours rechercher d’autres localisations éven- prélèvements superficiels, même si l’examen direct
tuelles. Le prélèvement est donc guidé par la est moins intéressant dans ce cas précis.
clinique (figure 5.11).
Dans certaines populations de patients (notam-
Prélèvement de la peau glabre
ment en réanimation), ces prélèvements super-
ficiels seront réalisés en l’absence de signes La peau glabre est représentée par toute surface
locaux de mycoses pour rechercher/apprécier cutanée considérée comme dénuée de poils. On
une éventuelle colonisation fongique permettant peut considérer plusieurs types de lésions sur ce
théoriquement d’évaluer le risque de candidose revêtement cutané.

Figure 5.11. Orientation de la technique de prélèvement d’une infection mycosique superficielle en fonction de
l’aspect clinique.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 123

• Les dermatophytoses «  circinées  » décrivent des Le  prélèvement sera alors réalisé en périphérie
lésions annulaires avec une périphérie nette- de la lésion par grattage. Dans le cas des plis axil-
ment marquée par un bourrelet inflammatoire laires ou inguinaux, une coloration rouge-corail
parfois additionné de vésicules, et un centre des lésions à la lampe de Wood permet de faire
cicatriciel (croissance centrifuge). Dans certains le diagnostic d’érythrasma (corynébactéries).
cas, ces lésions peuvent confluer et la périphérie • En cas de lésions discrètes ou peu squameuses, le
est inflammatoire. Le prélèvement se réalise par prélèvement s’effectue préférentiellement par
grattage au vaccinostyle ou à la curette en péri- grattage. Cependant, devant un faible rende-
phérie des lésions, zone au niveau de laquelle ment des squames, il peut être judicieux de
le champignon est le plus actif (figure  5.12). compléter le prélèvement par l’apposition d’un
Les squames sont recueillies dans un récipient morceau de cellophane adhésive transparente
stérile. sur les lésions afin de réaliser un examen direct.
• Les intertrigos ou lésions des plis (sous-mam- Un écouvillon préalablement humidifié sera
maires, inguinaux, axillaires, interfessier, inter- ensuite utilisé pour réaliser la culture mycolo-
orteils et interdigitaux) sont prélevés de manière gique. Ce dernier doit être rapidement ense-
différente en fonction du type de lésion et donc mencé sur les milieux de culture afin d’éviter
du champignon suspecté. Une lésion bilatérale, tout développement bactérien.
mal délimitée, avec un enduit blanchâtre dans le • En cas de lésions suintantes, deux écouvillons
fond du pli, fera plutôt suspecter une candidose seront appliqués sur les lésions. Le premier
et orientera vers un écouvillonnage dans le permettra la réalisation de l’examen direct, le
fond du pli. A minima, deux écouvillons seront second de la culture.
utilisés afin de réaliser en parallèle l’examen • Pour le cas particulier de la recherche de levures
direct et la culture mycologique. A contrario, du genre Malassezia, l’examen direct suffit habi-
une lésion unilatérale bien délimitée par une tuellement au diagnostic. Dans le cas du pity-
bordure inflammatoire périphérique fera, quant riasis versicolor, le prélèvement sera réalisé au
à elle, plutôt suspecter une dermatophytose. niveau des lésions caractéristiques par grattage

Figure 5.12. Épidermophytie circinée : lésion clinique et représentation schématique.

La zone à prélever pour le prélèvement est en périphérie de la lésion (figurée par les flèches rouges), du fait de la crois-
sance centrifuge des dermatophytes (figurée par les flèches noires).
(Source : collection ANOFEL, CHU de Nancy et eANOFEL.)
124 Méthodes

des squames ou en appliquant un ruban de cel-

lophane adhésive transparente. Pour la dermite
séborrhéique, il faudra privilégier les zones
grasses (plis nasogéniens, sourcils, pourtour du
cuir chevelu). La culture n’est pas indispensable
au diagnostic (habituellement négative avec les
milieux de culture conventionnels).

Prélèvement des muqueuses

Il s’agit des muqueuses buccales (commissures
labiales, face interne des joues, langue, palais, Figure 5.13. Dermatophytose – leuchonychie
etc.), génitales (vulve, grandes lèvres, parois vagi- superficielle.
nales chez la femme, sillon balanopréputial et (Source : eANOFEL.)
méat urétral chez l’homme) et autres orifices
l’aide d’un vaccinostyle ou d’une curette pour
naturels (anus, narines, conduit auditif externe).
récupérer les produits de grattage permettant de
Dans l’idéal, deux écouvillons sont prélevés
réaliser l’examen direct. Dans le cas des lésions
au niveau de l’atteinte, le premier permettant
proximales et des leuconychies profondes, il peut
la réalisation de l’examen direct et le second la
être nécessaire de créer une brèche au niveau
culture mycologique. Si un seul écouvillon est
de la lésion unguéale à l’aide d’un ciseau/pince
réalisé, il convient de le remettre en suspension
coupante/vaccinostyle, puis de gratter l’ongle plus
dans une petite quantité de sérum physiologique
en profondeur afin de récupérer un maximum de
ou eau distillée stérile afin de réaliser à la fois
matériel infectieux. Quant aux leuconychies super-
l’examen direct et la culture. En plus de l’écou-
ficielles (figure 5.13), un grattage de la surface de
villonnage, si les lésions buccales sont discrètes ou
l’ongle suffit. Ces types de lésions étant souvent
si une surveillance de la colonisation fongique est
difficiles à prélever. On peut également apposer sur
demandée, il peut être utile de réaliser un lavage
la brèche créée un morceau de cellophane adhésive
de bouche pendant une dizaine de secondes avec
pour l’examen direct et utiliser un écouvillon préa-
10  mL de sérum physiologique ou eau distillée
lablement humidifié pour la culture mycologique.
stérile. Ce lavage permet de prélever l’ensemble
Important  : dans tous les cas, il est indis-
de la cavité buccale et d’effectuer si nécessaire une
pensable de rechercher d’autres localisations et de
numération des levures [32].
les prélever – autres ongles, plante des pieds (dits
en «  mocassin  »), paume des mains (syndrome
Prélèvement de phanères
«  1 main, 2 pieds  » caractéristique des der-
(ongles, cheveux, poils)
matophytoses), intertrigo interorteils («  pied
Il faut distinguer les atteintes des ongles (ony- d’athlète ») et/ou interdigital.
chomycoses avec ou sans périonyxis) de celles des En cas de périonyxis (plus fréquent dans les ony-
cheveux et des poils. chomycoses candidosiques, ou dans une atteinte
En cas d’onychomycose, l’atteinte distolatérale à Fusarium  ; figure  5.14), il faut appliquer une
est la plus fréquente. Le prélèvement doit être pression au niveau du bourrelet inflammatoire
réalisé au niveau de la jonction zone saine-zone formé à la base de l’ongle afin de permettre
malade (où le champignon est le plus actif). Il est l’écoulement des sérosités qui seront prélevées par
conseillé de désinfecter systématiquement la sur- écouvillonnage.
face de l’ongle avant tout prélèvement, de manière En cas de teignes, si l’on dispose d’une lampe
à éliminer les moisissures environnementales et de Wood (lumière ultraviolette), il est important
les levures, puis de couper et jeter le bord libre d’examiner dans un premier temps les lésions,
de l’ongle. Il faut ensuite prélever plusieurs petits ce qui permet d’emblée d’orienter le diagnos-
fragments d’ongle, puis gratter sous l’ongle à tic vers une teigne microsporique ou favique
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 125

Figure 5.14. Candidose unguéale avec périonyxis.

(Source : eANOFEL.)

(fluorescence positive de couleur verte) ou vers

une teigne trichophytique (absence de fluores-
cence). De fausses fluorescences peuvent per-
turber l’observation, telles que les fluorescences
résiduelles des squames, du sébum, des exsudats
ou de certains topiques. Le prélèvement sera
réalisé en grattant la plaque d’alopécie et en
prélevant des squames et croûtes contenant les
cheveux cassé courts (et donc atteints) au sein de
la plaque ou en périphérie, en privilégiant les che- Figure 5.15. Évolution du parasitisme pilaire du cuir
chevelu.
veux qui s’arrachent facilement et qui sont le plus Les structures kératinisées de l’épiderme du cuir chevelu
suspect d’être contaminés (figure 5.15). Dans les et des cheveux sont figurées en jaune.
formes suintantes ou peu squameuses, le grattage (Source : collection ANOFEL.)
des lésions doit être suivi par un écouvillonnage.
Les porteurs sains, tels que les animaux, peuvent En cas de folliculites, le prélèvement des poils
également être prélevés afin de déterminer leur sera réalisé au sein de la zone inflammatoire. Les
implication lors des enquêtes épidémiologiques. pustules seront ensuite ouvertes et grattées à
Des compresses ou des écouvillons stériles seront l’aide d’un vaccinostyle ou d’une curette. Enfin,
alors frottés pendant une trentaine de secondes un écouvillonnage des sérosités finalisera le pré-
en privilégiant les zones telles que le museau, les lèvement.
yeux ou encore les plis des oreilles.
Le sycosis de la barbe et de la moustache est une Interprétation [30]
infection souvent suintante et purulente (surin- En fonction des localisations, différents agents
fection bactérienne associée) dont le prélèvement fongiques vont être retrouvés à des fréquences
peut s’avérer douloureux pour le patient. Cepen- variables (tableau  5.10). La confrontation des
dant, il est nécessaire de prélever des squames données cliniques et des facteurs favorisants aux
par grattage ainsi qu’une dizaine de poils au sein résultats de l’examen direct et des cultures est
de la zone infectée. Ces derniers se détachent donc essentielle.
facilement à l’aide d’une pince à épiler du fait
de l’infection. Le prélèvement se termine par Devant un prélèvement cutané
un écouvillonnage prolongé en récupérant les superficiel de la peau glabre
sérosités au sein des lésions. Il est important de Les agents fongiques à rechercher sont les levures
différencier une infection à staphylocoque et une et les dermatophytes, plus rarement les pseudo-
dermatophytose avec surinfection bactérienne. dermatophytes, Neoscytalidium spp. et Onychocola
126 Méthodes

Tableau 5.10. Les mycoses superficielles et leurs principaux agents étiologiques.

Formes cliniques Dermatophytes les plus souvent impliqués Levures les plus souvent Autres
impliqués (pseudodermatophytes
et moisissures)
Mycoses cutanées
Épidermophyties circinées Microsporum canis, M. audouinii,
Trichophyton rubrum,
T. soudanense, T. tonsurans, Epidermophyton
floccosum
Épidermophyties inflammatoires Trichophyton mentagrophytes (++),
T. verrucosum (++), Microsporum persicolor,
M. gypseum, Trichophyton erinacei
Intertrigos des grands plis Trichophyton rubrum (++), T. mentagrophytes Candida albicans (++),
(+), Epidermophyton floccosum C. glabrata, C. parapsilosis
Intertrigos interdigito-plantaires Trichophyton rubrum (++), T. mentagrophytes Candida albicans (++), Neoscytalidium spp.,
(dermatophytes >levures) var. Interdigitale (+), Epidermophyton floccosum C. glabrata, C. parapsilosis Onychocola canadensis
Intertrigos interdigito-palmaires Trichophyton rubrum (+), T. mentagrophytes Candida albicans (++), Neoscytalidium spp.
(levures >dermatophytes) (+), Epidermophyton floccosum C. glabrata, C. parapsilosis
Kératodermie plantaire Trichophyton rubrum (++), T. mentagrophytes Neoscytalidium spp.
var. Interdigitale (+), Epidermophyton floccosum
Kératodermie palmaire Trichophyton rubrum (++) Neoscytalidium spp.
Dermite séborrhéique Malassezia spp.
Pityriasis versicolor Malassezia spp.
Pityriasis capitis Malassezia spp.
Mycoses des phanères
Teignes tondantes à grandes M. audouinii (++), Microsporum canis (+)
plaques
Teignes tondantes à petites Trichophyton soudanense, T. tonsurans,
plaques T. violaceum
Teignes inflammatoires ou T. verrucosum (++), Trichophyton
suppurées (ou kérions), sycosis mentagrophytes (+), Microsporum gypseum,
Trichophyton erinacei
Teignes faviques Trichophyton schoenleinii
Folliculites Trichophyton rubrum (+), Microsporum canis, Malassezia spp.
Trichophyton mentagrophytes, T. verrucosum
Piedra blanche (cheveux, barbe, Trichosporon spp.
poils pubiens)
Onychomycoses des pieds Trichophyton rubrum (++), T. mentagro- Candida albicans (++), Neoscytalidium spp.,
(dermatophytes >moisissures phytes var. Interdigitale (+), Epidermophyton C. parapsilosis Onychocola canadensis,
>levures) floccosum Scopulariopsis
brevicaulis, Fusarium
spp., Aspergillus spp.
Onychomycoses des mains Trichophyton rubrum (+), T. soudanense, Candida albicans (++), Neoscytalidium spp.
(levures >dermatophytes T. tonsurans, T. violaceum C. parapsilosis (+),
>moisissures) Trichosporon spp. 
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 127

 Formes cliniques Dermatophytes les plus souvent impliqués Levures les plus souvent Autres
impliqués (pseudodermatophytes
et moisissures)
Mycoses des muqueuses
Mycoses génitales Candida albicans (++),
C. glabrata (+), C.
parapsilosis, C. tropicalis
Mycoses de la cavité buccale Candida albicans (++),
C. glabrata, C. parapsilosis,
C. tropicalis, Geotrichum
spp.
Candidose cutanéomuqueuse Candida albicans
chronique
Otite externe Aspergillus spp.
(Aspergillus niger +)
++ : très fréquent, + : fréquent.

canadensis. Les levures du genre Candida sont pathogènes, saprophytes du sol, qui colonisent
uniquement responsables d’infections cutanées au temporairement la peau, n’est pas rare et ceux-ci
niveau des plis. Les intertrigos à Candida spp., ne font habituellement pas l’objet d’un traite-
favorisés par la macération et l’humidité, sont ment (Trichophyton terrestre, Trichophyton ajelloi,
mal limités, touchent les grands plis et les petits Microsporum cookei). Par ailleurs, les pseudoder-
plis (interdigito-palmaires plus souvent qu’inter- matophytes (espèces kératinophiles donnant des
digito-plantaires, contrairement aux dermato- lésions simulant une dermatophytose) apparte-
phytes). Ils sont dus essentiellement à Candida nant au genre Neoscytalidium (N. dimidiatum
albicans, qui n’est jamais isolé sur la peau saine et N. dimidiatum var. hyalinum) et Onychocola
contrairement aux autres espèces de Candida canadensis peuvent être responsables, en plus des
dont C. parapsilosis, levure commensale de la onyxis, d’intertrigos interdigito-plantaires. Neos­
peau. Les levures du genre Malassezia, petites cytalidium spp. peut également donner des inter-
levures lipophiles commensales de la peau, sont trigos interdigito-palmaires et une kératodermie
responsables de mycoses cutanées spécifiques  : farineuse des plantes des pieds et des paumes,
le pityriasis versicolor sur la peau glabre, le pity- notamment en milieu tropical (Antilles, etc.).
riasis capitis sur le cuir chevelu et la dermite Onychocola canadensis se rencontre plutôt en zone
séborrhéique, essentiellement sur le visage. Les tempérée, préférentiellement chez les femmes
dermatophytes sont responsables sur la peau très âgées présentant des troubles trophiques des
glabre d’épidermophyties (ou dermatophytoses) membres inférieurs.
circinées, d’intertrigos bien limités des grands plis
et des petits plis, et d’atteintes érythémato-squa- Devant un prélèvement de cheveux ou de poils
meuses des plantes des pieds. Les dermatophytes Les champignons à rechercher sont les dermato-
sont également responsables de kératodermie phytes, et les levures du genre Malassezia pour les
plantaire et/ou palmaire, affectant souvent une folliculites. Les pseudodermatophytes n’attaquent
seule main et les deux pieds (le one hand, two feet ni les cheveux ni les poils. Il existe différentes
des Anglo-Saxons). Il est donc toujours néces- formes cliniques d’atteintes fongiques du cuir che-
saire de préciser l’espèce dermatophytique en velu ou des poils : les teignes tondantes à grandes
cause car l’isolement des dermatophytes non ou à petites plaques, les teignes inflammatoires
128 Méthodes

et les dermatophytes. Les onychomycoses des

mains sont dues le plus souvent aux levures du
genre Candida (C. albicans surtout) et plus
rarement aux dermatophytes et pseudodermato-
phytes, alors que les onychomycoses des pieds
(beaucoup plus fréquentes) sont majoritairement
dues aux dermatophytes (T. rubrum dans 80  %
des cas) et pseudodermatophytes ; puis aux moi-
sissures (Aspergillus versicolor, S. brevicaulis, etc.)
et enfin aux levures du genre Candida. Cepen-
dant, en milieu tropical, notamment aux Antilles,
Figure 5.16. Piedra blanche due à Trichosporon ovoides. les onychopathies à Neoscytalidium spp. peuvent
(Source : eANOFEL.) être plus fréquentes que celles à dermatophytes.
Les onychomycoses à Candida se distinguent
(encore appelées teignes suppurées ou kérions), cliniquement des onychomycoses à dermato-
les teignes faviques, les sycosis de la barbe et de la phytes et à moisissures par la présence fréquente
moustache et les folliculites. Les teignes tondantes d’un périonyxis associé, les Candida pénétrant
à grandes plaques ou teignes microsporiques l’ongle par son extrémité proximale au niveau du
sont dues à des dermatophytes anthropophiles bourrelet périunguéal alors que les dermatophytes
ou zoophiles appartenant au genre Microsporum. pénètrent l’ongle par son extrémité distale.
A contrario, les teignes tondantes à petites plaques
Devant un prélèvement de muqueuse
ou teignes trichophytiques sont dues à des derma-
tophytes du genre Trichophyton et sont toutes Les agents fongiques à rechercher sont les levures
anthropophiles. Les teignes faviques, devenues commensales du tube digestif et du tractus uro-
exceptionnelles et responsables d’une alopécie génital, avec en premier lieu C. albicans puis
définitive, sont dues à Trichophyton schoenleinii. C. glabrata, et plus rarement Geotrichum spp.
Les teignes inflammatoires du cuir chevelu et les Les atteintes les plus fréquentes sont génitales
sycosis de la barbe et de la moustache sont dus (vulvovaginite aiguë ou récidivante, et balanite
à des espèces zoophiles ou plus rarement à des peu spécifique) et oropharyngées (candidose
espèces telluriques, moins adaptées à l’homme pseudomembraneuse ou muguet, candidose atro-
que les espèces anthropophiles. Les folliculites à phique, ou candidose hyperplasique pseudotumo-
dermatophytes sont généralement observées au rale, souvent associées à une perlèche ou chéilite).
niveau des jambes (favorisées par le rasage répété), Exceptionnellement, la candidose cutanéomu-
alors que les folliculites à Malassezia spp. siègent queuse chronique peut s’observer chez les jeunes
préférentiellement sur le thorax, le dos et les enfants avec atteinte à C. albicans persistante,
épaules. Enfin, la piedra blanche est une infection invalidante ou récidivante de la peau, des ongles
à Trichosporon spp. des cheveux, de la barbe et et des muqueuses.
des poils pubiens, due à une hygiène corporelle Enfin, on observe des otites externes à Aspergil­
insuffisante (figure 5.16). lus spp. (A. niger le plus souvent) avec un risque
potentiel d’évolution vers une otite maligne chez
Devant un prélèvement d’ongle le diabétique.
Les agents fongiques recherchés sont les der-
matophytes et les pseudodermatophytes (Neos­ Avantages, inconvénients, limites
cytalidium spp., O. canadensis), les levures et plus La réalisation de l’examen direct est obligatoire
rarement les moisissures (Fusarium spp., Scopula­ car celui-ci signe la présence du champignon à
riopsis brevicaulis, Aspergillus spp., etc.). Environ l’état parasitaire dans le produit pathologique et il
50 % des onychopathies sont dues à des champi- revêt une importance toute particulière puisqu’il
gnons, parmi lesquels prédominent Candida spp. est parfois le seul examen biologique permettant
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 129

de faire le diagnostic (patients déjà traités, pauci- dermatophyte ou pseudodermatophyte associé  ;

parasitisme, etc.). Il permet par ailleurs de rendre par ailleurs, un second prélèvement doit être
rapidement un résultat positif et ainsi de débuter réalisé afin de mettre en évidence la même moisis-
un traitement adéquat sans attendre les résultats sure (avec toujours les mêmes critères de patho-
de la culture. L’examen direct est donc une étape génicité) pour affirmer sa responsabilité dans
fondamentale du diagnostic des mycoses, qui doit l’onychomycose.
être réalisée par un personnel entraîné [28]. Si sa
réalisation n’est pas possible (quantité insuffisante
par exemple), cela doit être précisé sur le compte- Examen mycologique
rendu. Cependant, pour les lésions de la peau de prélèvements
glabre, l’apposition de cellophane adhésive trans- respiratoires 
parente en fin de prélèvement permet toujours de
réaliser un examen direct. L’analyse mycologique de prélèvements respira-
En revanche, la négativité d’un examen direct toires peut être requise dans différentes situations
(qui, si l’on considère que le prélèvement a cliniques qui auront un impact sur la prise en
été correctement réalisé, peut être liée à un charge du prélèvement, notamment :
faible parasitisme, ou à un produit pathologique • patient immunodéprimé chez lequel seront
examiné dénué de structure fongique) ne doit recherchés Pneumocystis jirovecii (particulière-
pas exclure une mycose  ; de même, il est tou- ment en cas de pneumopathie interstitielle)
jours prudent de s’assurer que le patient n’a pas et les champignons filamenteux responsables
pris récemment de thérapeutique antifongique, d’infections fongiques invasives ;
qu’elle soit locale ou générale. • patient atteint de mucoviscidose ou d’autres
Dans tous les cas, l’interprétation des résultats pathologies bronchopulmonaires chroniques
devra tenir compte du caractère saprophyte/ pour lequel la recherche sera centrée sur les
commensal de certaines levures naturellement champignons filamenteux.
présentes au niveau de la peau (C. parapsilosis) et
des muqueuses (C. albicans, C. glabrata). Ainsi,
la présence de levures dès l’examen direct peut Détection de Pneumocystis
constituer un argument supplémentaire en plus jirovecii
de la positivité des cultures mycologiques, pour
affirmer le caractère pathogène, comme illustré Indications
dans le cadre des prélèvements vaginaux ou oro-
La détection de P. jirovecii est réalisée par un
pharyngés.
examen direct microscopique dans le lavage
Enfin, l’interprétation de la présence d’une moi-
bronchiolo-alvéolaire (LBA) ou dans les expec-
sissure environnementale au niveau d’un ongle
torations induites (EI) de patients à risque de
doit susciter une grande prudence concernant son
développer une pneumonie à Pneumocystis (PPC)
implication éventuelle dans l’étiologie d’une ony-
(voir chapitre 58) [36].
chomycose [29]. Les moisissures les plus souvent
incriminées sont Fusarium spp. et Scopulariopsis
brevicaulis, mais il est important de noter que Mise en œuvre
toute moisissure (Aspergillus spp., Acremonium Deux types de colorations peuvent être utilisés :
spp., les dématiés, etc.) peut potentiellement une coloration panoptique au MGG permettant
être pathogène si des critères de pathogénicité de visualiser les formes trophiques et les ascos-
stricts sont respectés. Ces critères de pathogé- pores, et une coloration ne mettant en évidence
nicité pour l’interprétation de la présence d’une que les asques. En cas d’infestation massive,
moisissure sur un ongle doivent être rigoureux : la détection du champignon est relativement
examen direct positif, pousse de la moisissure à aisée à l’aide de la microscopie. En revanche,
tous les points d’ensemencement, absence d’un l’examen direct est classiquement négatif
130 Méthodes

Tableau 5.11. Récapitulatif du processus qualité pour la recherche de P. jirovecii dans les LBA et expectorations
(d’après [36]).
Nature du prélèvement Lavage bronchiolo-alvéolaire (LBA), expectoration induite (EI), expectoration spontanée (ES)
Recommandations LBA : instillation de sérum physiologique stérile à température ambiante dans un territoire alvéolaire, puis
pour la qualité recueil entre chaque lavage et analyse des fractions du lavage
du prélèvement EI : expectoration de sécrétions bronchiques à l’aide d’un kinésithérapeute, après stimulation de la toux,
induite par nébulisation d’un aérosol hypertonique de NaCl à 3 % pendant 20 minutes
ES : après rinçage buccodentaire à l’eau stérile
Conditions d’acheminement, Flacons stériles
milieux de transport Acheminement dans les 4 heures à température ambiante, sinon conservation entre +2° et +8°C
<48 heures
Mode de conservation +5°C (± 3°C) pour les prélèvements primaires jusqu’à prise en charge
Idéalement, –20°C (± 5°C) pour l’aliquote destinée à la PCR jusqu’à l’extraction
–20°C à –80°C pour les extraits d’ADN
Principe méthodologique Examen microscopique
Détection du génome
Prétraitement de l’échantillon : centrifugation vitesse et temps
Type de méthode Colorations
Biologie moléculaire
Type de mesure Microscopique
PCR
CIQ Microscopie
– Commerciaux : lames de contrôle positives pour l’immunofluorescence ou colorations spécifiques
– Maison : lames préparées à partir d’un échantillon de LBA positif en microscopie
PCR
– Commerciaux : témoins positifs et négatifs inclus dans les coffrets, contrôles d’extraction et d’inhibition
– Maison : témoins positifs obtenus à partir d’un échantillon de LBA positif
EEQ Microscopie : College of American Pathologists, contrôles interlaboratoires
PCR : fournisseurs d’EEQ, contrôles interlaboratoires
Performances du test Microscopie : sensibilité variable selon la nature de l’échantillon, la technique et le terrain du patient
PCR : excellentes sensibilité et valeur prédictive négative (VPN) sur un échantillon de bonne qualité
cellulaire
Cause d’erreur, limites du test Patient sous traitement anti-Pneumocystis
Microscopie
– LBA : prélèvement non représentatif en cas de mauvaise cellularité, c’est-à-dire absence de cellules
macrophagiques, présence de cellules bronchiques, voire de cellules de l’épithélium oropharyngé
– EI : excès de mucus dans les échantillons pouvant perturber la coloration (mais recommandé d’ajouter
un agent mucolytique dans les expectorations)
– LBA et EI : présence de C. albicans dans les échantillons pouvant réagir avec l’anticorps anti-souris
conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine, conduisant à un résultat faussement positif en
immunofluorescence
– ES : microscopie non contributive
– PCR : absence de standardisation de l’échantillon primaire ; échantillon de mauvaise qualité cellulaire

au cours des pauci-infestations. Des réactifs Analyse en microscopie

d’immunofluorescence dirigés contre les ascos- L’examen microscopique peut être réalisé sur
pores ± les formes trophiques sont une alternative les échantillons de LBA et sur les EI après flui-
aux colorations. Le recours aux techniques de dification par un agent mucolytique. Les échan-
PCR, plus sensibles que la microscopie, est désor­ tillons doivent être cytocentrifugés (2 minutes,
mais incontournable [37] (tableau 5.11). environ 500  g) sur lame avant réalisation de la
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 131

Tableau 5.12. Description des techniques de détection microscopique en mycologie.

Technique Modalité de lecture Avantages Inconvénients
Coloration Amas constitués de formes Rapidité de mise en œuvre Manque de sensibilité en cas
au May-Grünwald-Giemsa trophiques et d’asques Visualisation d’autres agents de faible charge fongique
agglomérés détectables à faible pathogènes tels que levures, Expertise nécessaire
grossissement microscopique filaments mycéliens, tachyzoïtes
(objectif ×20) de Toxoplasma
Formes trophiques isolées et Appréciation de la qualité cellulaire
ascospores visualisés à plus fort de l’échantillon
grossissement (objectif ×100)
Coloration de Musto Asques détectables aux objectifs Visualisation d’autres agents Potentielle toxicité
ou de Gomori-Grocott dérivées ×20 ou ×40, colorés en brun fongiques Ne colore pas les formes
de celle de Gomori noir sur fond vert trophiques
Coloration de Chalvardjian Asques détectables aux objectifs Visualisation d’autres agents Ne colore pas les formes
(bleu de toluidine) ×20 ou ×40, colorés en violet fongiques trophiques
sur fond bleu
Calcofluor * Lecture au microscope à Visualisation d’autres agents Ne colore pas les formes
fluorescence fongiques trophiques
Fluorescence ultraviolette des Rapidité de mise en œuvre
asques détectables aux objectifs
×20 ou ×40
Immunofluorescence indirecte Lecture au microscope à Augmente la sensibilité de détection
utilisant des anticorps fluorescence, filtre d’excitation en cas de faible charge fongique
monoclonaux spécifiques 490-500 nm Lecture aisée
des asques* Fluorescence verte des asques
détectables aux objectifs ×20
ou ×40
Immunofluorescence directe Lecture au microscope à Augmente la sensibilité de détection Lecture difficile car les
utilisant des anticorps fluorescence, filtre d’excitation en cas de faible charge fongique formes trophiques isolées
monoclonaux spécifiques de 490-500 nm très polymorphes doivent
l’ensemble des stades* Fluorescence jaune vert des être rapidement distinguées
asques et de l’ensemble des du bruit de fond avant que
stades détectables aux objectifs l’extinction de fluorescence
×20 ou ×40 n’en limite l’observation
* Coffrets commercialisés disponibles.

coloration au MGG. Les techniques de détection invasifs que les LBA (tels que les expectorations
microscopique sont détaillées dans le tableau 5.12 spontanées ou induites, les rinçages oropharyngés
[35, 37]. Il est nécessaire de lire la totalité du spot ou les aspirations bronchiques), même si l’inter-
et de disposer de contrôles. prétation d’un résultat positif sur ces prélèvements
peut parfois s’avérer difficile.
PCR en temps réel
Des coffrets commerciaux ou des PCR dites Interprétation et validation
« maison » sont utilisables. Ces PCR permettent
de rendre des résultats qualitatifs ou quantitatifs. Microscopie
L’utilisation d’une technique amplifiant un gène Au total, un résultat est rendu positif dès lors que
multicopies tels que le MSG (major surface glyco­ des formes trophiques et/ou des asques sont visualisés
protein) ou le mtLSU rRNA (mitochondrial large à l’examen direct, quelle que soit la technique uti­
subunit ribosomal RNA) permet d’augmenter la lisée. Compte tenu de la relative faible sensibilité
sensibilité de la détection. Les techniques de de l’examen microscopique (en particulier chez le
PCR en temps réel ont l’avantage de pouvoir être sujet non infecté par le VIH), toute positivité doit
réalisées à partir d’échantillons respiratoires moins être interprétée comme le témoin d’une infection
132 Méthodes

active. Les figures 5.17 à 5.24 illustrent les diffé-

rents aspects microscopiques selon la coloration
utilisée (voir au chapitre 3, « Examens directs »).

PCR en temps réel

Comme pour toute technique de PCR, en préa-
lable à l’interprétation des résultats, il conviendra
de valider les témoins positifs et négatifs de chaque
série de PCR ainsi que les contrôles d’extraction
et/ou d’inhibition de chaque échantillon. Le
diagnostic moléculaire de la pneumocystose a été
pris comme exemple pour expliquer le principe de Figure 5.19. Amas de formes trophiques et d’asques
validation de la PCR dans le cadre du diagnostic de Pneumocystis jirovecii.
Asque contenant 8 corps intrakystiques. (Coloration
(voir chapitre 14, « Techniques de PCR en point au MGG, objectif ×100.)
final et en temps réel »). (Source : eANOFEL.)

Figure 5.20. Asques de Pneumocystis jirovecii

Figure 5.17. Échantillon de lavage broncho-alvéolaire
colorés en brun-noir sur fond vert (coloration
de bonne qualité cellulaire coloré au MGG.
de Gomori-Grocott).
Présence de macrophages alvéolaires. (Source : eANOFEL.)
(Source : collection ANOFEL, CHU de Brest et Amiens.)

Figure 5.18. Échantillon de LBA de mauvaise qualité Figure 5.21. Asques de Pneumocystis jirovecii colorés
cellulaire coloré au MGG. en violet sur fond bleu (coloration de Chalvardjian
Présence de cellules de l’épithélium oropharyngé (flèches). ou au bleu de toluidine).
(Source : collection ANOFEL, CHU de Brest et Amiens.) (Source : eANOFEL.)
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 133

Figure 5.22. Asques de Pneumocystis jirovecii colorés Figure 5.23. Amas d’asques de Pneumocystis jirovecii
en bleu-violet, avec un aspect en « grain de café » colorés en vert (immunofluorescence indirecte, anticorps
(Calcofluor White). anti-asques).
(Source : eANOFEL.) (Source : eANOFEL.)

Figure 5.24. Prise en charge du LBA au laboratoire chez un patient immunodéprimé.

Le diagnostic de PPC doit reposer sur un fais- PCR négative sur un LBA de bonne qualité
ceau d’arguments cliniques, radiologiques et bio- (défini sur la présence de cellules macrophagiques
logiques. En effet, en raison de la sensibilité élevée et de pneumocytes) permet a priori d’éliminer le
de la PCR, un résultat de PCR positif ne suffit pas diagnostic d’infection par P. jirovecii.
à affirmer le diagnostic de PPC, de faibles charges
fongiques pouvant être détectées par PCR chez Recherche d’agents fongiques
des patients ne présentant pas de pneumocystose autres que P. jirovecii
(colonisation plus ou moins transitoire). Les PCR
quantitatives permettent d’établir des seuils afin
et pathogénicité
d’aider les cliniciens pour le diagnostic différentiel des champignons isolés
de la PPC et de la colonisation [37]. Ces seuils Recherche de champignons
doivent être validés dans chaque centre et selon la filamenteux
technique utilisée. Il n’y a pas à ce jour de seuil ni
de conduite à tenir qui fasse l’objet d’un consensus. Indications
A contrario, compte tenu de l’excellente sensibilité La recherche de champignons filamenteux dans
de la PCR pour la détection de P.  jirovecii, une le tractus respiratoire, chez les patients non
134 Méthodes

immunodéprimés et non atteints de mucovis- respiratoires. En revanche, il existe des recomman-

cidose, est indiquée lors de suspicion de bron- dations microbiologiques nationales (REMIC ou
chopneumopathies fongiques (aspergilloses référentiel en microbiologie médicale) ou inter-
chroniques, subaiguës ou allergiques, primo- nationales (American Society for Microbiology
infection à champignons dimorphiques, etc.). [ASM]) et des recommandations internationales
Chez les patients avec une pathologie pulmonaire spécifiques pour la mycologie (European Society
sous-jacente, comme une bronchopneumopathie of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
chronique obstructive (BPCO) ou un asthme, la [ESCMID]). Les modalités de prélèvement des
colonisation par des champignons filamenteux, échantillons respiratoires sont décrites dans les
en particulier des genres Aspergillus, Fusarium et manuels de prélèvement institutionnels. Celles de
Scedosporium, peut être associée à la détérioration conservation et de transport sont précisées dans
des fonctions respiratoires avec exacerbation de les répertoires institutionnels d’analyses de bio-
l’insuffisance respiratoire [38]. Les aspergilloses logie médicales. Une synthèse de ces modalités à
chroniques, autres que l’aspergillome simple, et partir de référentiels nationaux et/ou internatio-
les formes subaiguës surviennent chez des patients naux (REMIC, NHS UK, ESCMID, ASM, Cen-
non neutropéniques qui présentent des comorbi- ters for Disease Control and Prevention [CDC])
dités comme le diabète, l’éthylisme, la malnu- est présentée dans le tableau 5.13 [39].
trition, la BPCO, des pathologies nécessitant des
traitements prolongés par corticoïdes et une prise Examen direct
en charge dans des unités de soins intensifs. La L’examen direct est un temps essentiel puisqu’il
recherche de champignons filamenteux dans les sera pris en compte pour l’interprétation des
prélèvements respiratoires est également indiquée résultats. Il peut être réalisé sur le culot de cen-
pour le suivi du traitement de ces pneumopathies trifugation ou sur les lames de cytocentrifugation.
fongiques. Les techniques utilisées sont celles rapportées au
chapitre 3, « Examens directs ».
Mise en œuvre
Prélèvement Méthodes de culture et d’isolement
À ce jour, il n’y a pas de référentiel national pour Il est essentiel de respecter les règles de sécurité
la recherche spécifique d’agents fongiques, en microbiologiques et d’ensemencer les prélève-
particulier d’Aspergillus, dans les prélèvements ments sous PSM 2. Les cultures des prélèvements

Tableau 5.13. Prélèvements respiratoires, quantité et modalités préanalytiques à la mise en culture pour recherche
d’agents fongiques.
Conservation et transport après Prétraitement avant culture
prélèvement
Prélèvement Volume minimal
Délai (h) Température (°C) Homogénéisation (pipette stérile et/ou vortex
et/ou agent mucolytique)
Expectoration ≥ 1 mL 1à4 Ambiante Ensemencer les zones muqueuses si présentes
AT, AB 24 à 48 +2 à +8
LBA ≥ 1 mL 4 Ambiante Si le surnageant est nécessaire pour d’autres
24 à 48 +2 à +8 analyses :
– centrifugation à 1200 g 10 minutes
– conserver 200–500 µl de surnageant
pour suspendre le culot
PDP Autant que possible dilué 1à4 Ambiante Aucun
dans 1 mL de sérum 24 à 48 +2 à +8
physiologique stérile
AB : aspiration bronchique ; AT : aspiration trachéale ; PDP : prélèvement distal protégé.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 135

suspects (contexte épidémiologique, données comorbidités. Au cours de la dernière décennie,

cliniques, examen direct) de contenir un agent grâce à l’amélioration des méthodes d’identifica-
de classe 3, tel que Blastomyces dermatitidis syn. tion, des espèces jusqu’alors considérées comme
Ajellomyces dermatitidis, Cladophialophora ban­ des contaminants ont maintenant un pouvoir
tiana, Coccidioides immitis, Histoplasma capsu­ pathogène démontré [34]. En pratique, seul un
latum, Paracoccidioides brasiliensis, devront être prélèvement biopsique permettant la visualisation
manipulées sous hotte PSM de type II, dans un de filaments mycéliens envahissant les tissus des
laboratoire de confinement NSB3. voies respiratoires à l’examen direct ou en anato-
• Quantité/volume d’ensemencement  : 150  mg mopathologie affirme le diagnostic de mycose inva-
(environ 100  µL) de prélèvement [39] ou sive. La détection d’un champignon filamenteux
50  µL si un culot de prélèvement centrifugé dans un prélèvement respiratoire n’est qu’un des
est utilisé au minimum sur chaque milieu de éléments contributifs au diagnostic des différentes
culture, soit 10 fois plus que le volume d’ense- maladies respiratoires causées par les champignons.
mencement habituellement recommandé en Les champignons filamenteux détectés peuvent
microbiologie. être :
• Milieux actuellement recommandés : • soit à l’origine d’une infection respiratoire
– cas du laboratoire de microbiologie : au mini- comme l’aspergillose invasive ou l’aspergillose
mum un milieu Sabouraud Chloramphénicol chronique ;
Gentamicine (SCG) incubé à 35 °C (± 2 °C). • soit un colonisateur des voies aériennes sans ou
En cas de suspicion de mycose exotique, un avec conséquence clinique pour le patient ;
tube SCG sera rajouté à 25 °C (± 2 °C) ; • soit à l’origine de maladies allergiques comme
– cas du laboratoire de mycologie spécialisé  : l’ABPA (aspergillose bronchopulmonaire aller-
deux milieux SCG incubés à 35 °C (± 2 °C) gique) ou l’alvéolite allergique intrinsèque.
et à 30  °C (± 2  °C). L’ajout d’un milieu Distinguer infection, colonisation et  allergie
potato dextrose agar (PDA) ou d’un milieu au nécessite une bonne connaissance des données
malt augmente la sensibilité de la culture clinico-épidémiologiques du patient, des résul-
pour A. fumigatus [39]. L’utilisation de tats  d’imagerie pulmonaire ainsi que des résultats
milieux sélectifs n’est pas dans la pratique d’autres tests biologiques, qu’ils concernent ou
de routine, mais elle pourrait faciliter l’isole- non la mycologie (biomarqueurs fongiques, sérolo-
ment des certaines espèces fongiques (Scedos­ gies diverses, dosages des immunoglobulines, etc.).
porium sp., Exophiala sp.). Compte tenu L’interprétation doit donc tenir compte non
de la durée d’incubation, il est également seulement de l’examen direct et de l’espèce de moi-
recommandé de réaliser au moins un ense- sissure identifiée, mais aussi du contexte du patient
mencement en tube à chaque température. (immunodépression, pathologie pulmonaire sous-
• Durée d’incubation : au minimum 2 semaines jacente) et des résultats d’examens paracliniques.
[33, 36, 38, 39, 41]. À noter que le délai de croissance, l’importance
de la croissance fongique (en termes de nombre de
Interprétation colonies et/ou du nombre de milieux de culture
L’interprétation de la culture d’un champignon positifs), la présence d’autre(s) espèce(s) fon-
filamenteux dans un prélèvement respiratoire est gique(s) isolé(e)s en culture, peuvent être en pris
toujours délicate car son isolement à partir d’un en considération dans l’interprétation des résultats.
prélèvement respiratoire ne fait jamais à elle seule
un diagnostic, à l’exception des prélèvements biop-
siques. Excepté les champignons dimorphiques Recherche de levures
(voir chapitre  57), les champignons filamenteux
Indications
sont considérés comme des pathogènes opportu-
nistes, qui peuvent causer des mycoses graves chez La recherche spécifique des levures au niveau
les patients immunodéprimés ou présentant des du tractus respiratoire est rarement indiquée.
136 Méthodes

Elle  n’est demandée que dans un contexte Les propositions d’interprétation s’appuient sur
d’immunodépression, notamment pour la l’état actuel des connaissances, pour l’essentiel
recherche d’une cryptococcose pulmonaire. Les sur les données d’isolement en culture. Dans
levures du genre Candida retrouvées dans le les années à venir, celui-ci est amené à évoluer,
tractus respiratoire sont un cas fréquent et ne notamment grâce aux nouvelles technologies
témoignent généralement pas d’une infection comme la PCR/Electro Spray Ionisation-Mass
invasive, mais cela peut éventuellement s’intégrer Spectrometry ou le séquençage à haut débit.
dans l’évaluation de la colonisation fongique, ou De façon simplifiée, sont proposées les inter-
témoigner d’une infection de la cavité oropha- prétations suivantes :
ryngée. La pneumonie à Candida est une entité • cavité buccale  : l’isolement de levures ou
rare avec une prévalence inférieure à 1  % chez de pseudomycélium, en présence de signes
des patients à risque de candidose systémique cliniques évocateurs de candidose buccale,
[42] et dont le diagnostic de certitude repose témoigne d’une infection ;
sur l’examen anatomopathologique d’une biopsie • expectoration, aspiration bronchique et LBA  :
tissulaire. l’isolement de Candida sp. est en faveur d’une
contamination probable à partir du carrefour
Mise en œuvre oropharyngé ou d’une colonisation ;
Les méthodes de culture mises en œuvre pour • prélèvement distal protégé  : colonisation pro-
la recherche de champignons filamenteux seront bable.
habituellement complétées par un ensemence- Deux cas particuliers sont à noter :
ment de milieu chromogène en vue de l’isolement • les prélèvements respiratoires du nouveau-né de
et de l’identification des levures. moins de 15 jours où il s’agit de colonisation,
les flores commensales étant en cours d’acquisi-
Interprétation tion ;
L’interprétation de l’isolement d’une levure à • l’isolement de C. neoformans, C. grubii, ou
partir d’un prélèvement respiratoire est complexe C. gattii, qui devra faire conclure à une crypto-
car elle doit prendre en compte : coccose pulmonaire jusqu’à preuve du contraire.
• le site anatomique en distinguant les prélève-
ments : Prise en charge spécifique
– des voies respiratoires supérieures (fosses pour certaines catégories
nasales, pharynx, larynx et trachée), telle de patients
l’expectoration qui reflète l’étage supraglot-
tique, pour l’essentiel la zone oropharyngée ; Patients immunodéprimés
– des voies respiratoires inférieures (bronches,
Indications et contexte
bronchioles, alvéoles) comme l’aspiration
bronchique et le LBA qui peuvent être conta- Certaines catégories de patients (allogreffés de
minés par la flore buccale et le prélèvement cellules souches hématopoïétiques, transplanta-
distal protégé (PDP) qui, par définition, n’est tions d’organes, corticothérapies au long cours,
pas contaminé par la flore des voies aériennes etc.), pour lesquelles il existe un risque élevé de
supérieures. développer une infection fongique pulmonaire
• le contexte clinique  : communautaire ou hos- invasive, nécessitent une prise en charge particu-
pitalisation ; lière des prélèvements respiratoires [33, 39].
• le caractère commensal (constituant durable
Mise en œuvre (figure 5.17)
ou transitoire de la flore) de la levure selon
le site anatomique, s’il est prouvé ou admis Prélèvement
(tableau 5.14) ; Privilégier tout prélèvement du tractus respira-
• le résultat de l’examen direct, notamment la toire bas, en particulier le LBA, réalisé au niveau
présence ou non de pseudomycélium. du territoire atteint.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 137

Tableau 5.14. Principaux genres et espèces de levures isolées du tractus respiratoire, leurs caractère commensal
et sources.
Genres/espèces Commensalisme Source/réservoir
Candida sp.
C. albicans Commensal du tractus digestif Homme, animaux
C. dubliniensis
C. glabrata (complexe d’espèces) : Commensal du tractus digestif et urogénital Homme, bovins
C. glabrata, C. bracarensis, C. nivariensis (mal connue pour C. bracarensis, C. nivariensis)
C. parapsilosis (complexe d’espèce) : Commensal de la peau et des muqueuses Homme
C. parapsilosis, C. metapsilosis,
C. orthopsilosis
C. tropicalis Commensal de la peau et des muqueuses Homme, aliments, eaux marines, sol
C. krusei (syn. Issatchenkia orientalis, Pichia Commensal du tractus digestif et de la peau Homme, mammifères, oiseaux
kudriavzevii) Aliments
C. kefyr (syn. Kluyveromyces marxianus) Commensal du pharynx et des voies Homme, aliments
respiratoires
C. guilliermondii (syn. Meyerozyma Commensal de la peau Homme, animaux, aliments
guilliermondii)*
C. famata (syn. Debaryomyces hansenii)* Commensal de la peau Homme, animaux, aliments, environnement
C. inconspicua/Pichia cactophila§ Commensal du tractus digestif Homme, produits laitiers
C. norvegensis§ Commensal du tractus digestif et des voies Homme, produits laitiers
respiratoires
C. lusitaniae (syn. Clavispora lusitaniae) Commensal de la peau Homme
Cryptococcus sp. Pathogène Homme, animaux, environnement
C. neoformans, C. grubii, C. gattii
Malassezia sp. Commensal de la peau et des muqueuses Environnement
Rhodotorula sp. Commensal de la peau Environnement, aliments
Trichosporon sp. Commensal de la peau et des muqueuses Environnement
Saccharomyces sp. Commensal au moins transitoire du tractus Aliments, probiotiques (préparation
Saccharomyces cerevisiae digestif pharmaceutique contenant S.cerevisiae
var. boulardii)
Les levures des complexes d’espèces et celles identifiées par * ou § sont des espèces de phénotypes très proches ou non différenciables, dont l’identification
formelle peut être obtenue par biologie moléculaire ou par spectrométrie de MALDI-TOF.

Objectif de l’examen mycologique (« Examens directs »). L’examen direct sera tou-

L’analyse du LBA est réalisée en cas de suspicion jours associé à la culture, sauf si le volume est
d’infection pulmonaire profonde, dans le but insuffisant (dans ce cas, la culture sera privilégiée).
de confirmer l’origine fongique de l’infection et La positivité de l’examen direct permet, en fonc-
d’identifier l’agent causal. Seront recherchées en tion de l’aspect des éléments observés (filaments
priorité les moisissures opportunistes (Aspergillus mycéliens septés de type aspergillaire ou cœnocy-
fumigatus et autres espèces aspergillaires, zygo- tiques de type mucorale, ou présence d’asques ou
mycètes, ou Mucorales), Fusarium spp. et autres de formes trophiques de P. jirovecii), de s’orienter
hyalophyphomycètes, Scedosporium apiospermum vers un type de champignon.
et autres espèces du complexe, ainsi que Crypto­ Pour les micromycètes autres que P. jirove­
coccus neoformans et Pneumocystis jirovecii (voir au cii, après centrifugation 10 minutes à 1200  g
chapitre 3, « Techniques d’identification »). (selon les recommandations de l’UK SMIs ou
La prise en charge et l’examen direct du LBA UK Standards for Microbiology Investigations),
sont identiques à ceux décrits dans le chapitre  3 le culot est ensemencé en parallèle sur milieux de
138 Méthodes

Sabouraud additionnés d’antibiotique(s), incubés mycologique de la colonisation mycologique des

à au moins deux températures, 30  ±  2 °C et voies aériennes est relativement systématique dans
35  ±  2 °C, et conservés au moins 2 semaines cette population de patients (en particulier chez
pour permettre l’isolement des espèces à crois- l’adulte et d’autant plus après transplantation)
sance lente [33, 35, 38, 39]. En cas de suspicion et réalisée à chaque consultation. Elle peut aussi
de mycose exotique, le prélèvement pourra être être justifiée en présence d’une détérioration de
conservé jusqu’à 8 semaines à 30 ± 2 °C. D’autres la fonction respiratoire du patient, soit fortement
milieux de culture, tels que le milieu PDA ou évocatrice d’une étiologie fongique, soit non expli-
un milieu chromogène facilitant l’isolement et quée par une modification de la flore bactérienne.
l’identification des levures, peuvent être ajoutés
en fonction du contexte clinique [41]. Compte Mise en œuvre
tenu de la durée d’incubation et du type de patho- Prélèvement
gène recherché, il est également recommandé Du fait du suivi et de la possibilité de répéter les
de réaliser au moins un ensemencement en tube prélèvements, il faut privilégier les expectorations
à chacune des températures (voir au chapitre  3, spontanées ou précédées de kinésithérapie res-
« Mises en culture »). D’autres investigations peu- piratoire. Chez les jeunes enfants ou les patients
vent par ailleurs être entreprises dans cette popu- «  non expectorants  », on pourra avoir recours à
lation à haut risque d’infection fongique invasive l’aspiration pharyngée (après kinésithérapie ou
(IFI) : coloration à l’encre de Chine, recherche de nébulisation de sérum physiologique). Le LBA
l’antigène capsulaire cryptococcique (non validé), est rarement réalisé (sauf en cas de transplantation
recherche de l’antigène (Ag) galactomannane pulmonaire).
(GM) aspergillaire, de l’Ag 1,3 β-D-glucane (non
validé à l’heure actuelle sur le LBA) et recherche Objectif de l’examen mycologique
spécifique de P. jirovecii. Contrairement au diag- Il convient d’identifier les champignons poten-
nostic moléculaire de P. jirovecii, il n’existe à tiellement impliqués dans la dégradation de la
l’heure actuelle pas de kit commercialisé pour la fonction respiratoire et/ou responsables d’infec-
réalisation d’une PCR panfongique. tions post-transplantation. Les difficultés sont
liées au caractère plurimicrobien des cultures, avec
Interprétation notamment des espèces possédant des vitesses
Le LBA n’étant pas un prélèvement stérile, l’iso- de croissance différentes [38]. Par ailleurs, des
lement en culture d’un champignon filamen- difficultés d’identification peuvent être posées par
teux n’est donc pas obligatoirement le reflet des espèces « émergentes » au sein d’un complexe
d’une infection fongique. Néanmoins, en raison d’espèces.
de la nature alvéolaire du LBA, il mérite plus Les conditions d’acheminement sont identiques
d’attention que les aspirations bronchiques et/ou aux prélèvements respiratoires décrits précédem-
expectorations. L’interprétation tiendra compte ment. Après examen direct (voir chapitre  3,
notamment du nombre de colonies et du carac- «  Examens directs  »), la mise en culture sera
tère pathogène de l’espèce isolée dans le contexte précédée d’une homogénéisation des expectora-
clinique spécifique. tions par un agent mucolytique (dithiothréitol ou
N-acétylcystéine). L’ensemencement se fait de pré-
Patients atteints de mucoviscidose férence sur plusieurs milieux (chapitre 3, « Mises
en culture »), incluant éventuellement des milieux
Indications et contexte semi-sélectifs afin de limiter le développement des
Le pronostic de cette maladie est étroitement lié à bactéries ainsi que des champignons filamenteux à
l’atteinte respiratoire. L’épaississement du mucus croissance rapide et extensive, susceptibles de mas-
bronchique est en effet à l’origine d’un piégeage quer la croissance plus lente d’espèces telles que
dans les voies aériennes de nombreuses espèces celles du complexe Scedosporium ou Exophiala
de bactéries et de micromycètes. Une surveillance dermatitidis (tableau  5.15). Une incubation de
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 139

Tableau 5.15. Milieux de culture semi-sélectifs en mycologie proposés dans la mucoviscidose.

Milieu de culture Température d’incubation Spécificité
Chromogène* 35 ±2°C Levures (isolement et identification)
Sabouraud +antibiotiques* 35 ±2°C Moisissures (Aspergillus fumigatus)
Sabouraud +antibiotiques cycloheximide* 35 ±2°C Scedosporium sp.
DRBC – Bénomyl 35 ±2°C Scedosporium sp. + autres moisissures
à croissance lente
Sabouraud +érythritol 25/35 ±2°C E. dermatitidis
DRBC : dichloran rose Bengal chloramphénicol.
* Premières recommandations du groupe Muco-Microbes [REMIC].

2  semaines au minimum est par ailleurs recom- Mise en œuvre

mandée [34]. L’identification repose en grande Les prélèvements seront pris en charge de
partie sur l’analyse morphologique (critères manière adaptée au(x) pathogène(s) recher-
macro- et microscopiques), mais cette dernière ché(s). L’examen direct à la recherche des formes
tend de plus en plus à être supplantée par la spec- levures intracellulaires se fera après cytocen-
trométrie de masse de type MALDI-TOF. Pour trifugation du LBA et coloration par le MGG.
les isolats dont l’identification est délicate, comme En particulier, des cultures en tubes et manipula-
les espèces du complexe Rasamsonia argillacea, le tions en laboratoire de sécurité microbiologique
recours à la biologie moléculaire peut s’imposer. de type NSB 3 (voir au chapitre  5, «  Examen
L’antifongigramme n’est pas réalisé de manière mycologique des agents L3 ») seront privilégiées
systématique, mais au cas par cas, en fonction du dans ce contexte.
contexte clinique (colonisation chronique associée
à une dégradation de la fonction respiratoire, Interprétation des résultats
bilan prétransplantation, etc.). Contrairement à la mise en évidence des champi-
gnons opportunistes précédemment cités, l’iso-
Interprétation des résultats lement de ces agents de mycoses endémiques,
Bien que de plus en plus fréquemment pris non présents en France (Histoplasma capsulatum,
en compte, l’impact clinique des champignons Coccidioides immitis, etc.), dans un prélèvement
isolés dans ce contexte particulier demeure assez respiratoire est suffisant pour poser un diagnostic
variable [40]. L’interprétation tiendra donc de mycose d’importation et instaurer un traite-
compte du micro-organisme isolé, de sa fréquence ment précoce.
d’isolement et de la quantité présente dans les
prélèvements (caractère chronique de l’isolement
et/ou inoculum fongique important), et de la
présentation clinique. Examen mycologique
des selles et des urines
Sujet voyageur
Indications et contexte Selles : modalités
Le LBA apparaît comme le prélèvement le mieux d’ensemencement,
adapté en cas de suspicion de mycose pulmonaire quantification
d’importation (histoplasmose, coccidioïdomy-
Indications
cose, etc.). Il est essentiel que le prescripteur
informe le laboratoire de la nécessité de procéder L’examen mycologique des selles est recommandé :
à cette recherche et qu’il accompagne sa demande • lors de l’évaluation et/ou du suivi de la colo-
de renseignements cliniques, avec notamment la nisation digestive fongique chez des patients
liste des pays visités (voir au chapitre 57). à haut risque d’infection fongique invasive
140 Méthodes

(par exemple patients neutropéniques, patients

en unité de soins intensifs, patients de néonato-
logie) [44, 51, 52] ;
• lors de l’évaluation de l’efficacité des pro-
tocoles de décontamination digestive sélectifs
[43, 50, 52] ;
• en présence de signes cliniques digestifs sans
autre étiologie retrouvée [52].

Mise en œuvre
L’examen mycologique des selles fait appel aux
différentes techniques de base évoquées dans
cet ouvrage  : examen microscopique direct,
mise en culture, quantification, identification
d’espèce  ±  antifongigramme (selon contexte).
L’examen microscopique direct n’est pas indis-
pensable, car souvent peu informatif.

Dilution des selles et ensemencement

(figure 5.25)
• Dans un tube à hémolyse, diluer une öse (10 µL)
de selles dans 2 mL d’eau distillée stérile.
• Bien homogénéiser par vortex.
• Ensemencer une goutte (soit environ 15 à Figure 5.25. Schéma simplifié de l’ensemencement
des selles en mycologie.
20 µL) de selles diluées sur le milieu de culture
(milieu de culture sélectif chromogène ou
milieu Sabouraud + antibiotique[s]). déséquilibre de flore (secondaire à un traitement
• Incuber à l’étuve à 30 ± 2 °C et à 35 ± 2 °C au antibiotique par exemple), associée à d’autres
minimum pendant 72 heures. facteurs de risque locaux ou généraux, peut y
contribuer [43, 44, 50–52]. Moins fréquemment,
Quantification il s’agira d’autres levures. L’identification d’une
Une appréciation semi-quantitative du nombre de moisissure (Aspergillus spp., Mucorales, etc.) dans
colonies est suffisante avec, par exemple : très rares, les selles doit être confrontée à la symptomatologie
rares, peu nombreuses, nombreuses, très nom- clinique afin de ne pas méconnaître une authen-
breuses, etc. tique infection invasive à point de départ digestif.

Processus qualité
Urines : modalités
(Voir tableau 5.16.) d’ensemencement,
quantification
Interprétation
Indications
Les levures du genre Candida spp. sont les plus
fréquemment retrouvées. Elles témoignent d’une L’examen mycologique des urines est recom-
colonisation digestive (flore commensale) et donc mandé :
pas nécessairement d’une infection invasive, même • lors de l’évaluation et du suivi du niveau de
si leur présence, notamment dans le cas d’un colonisation candidosique des patients à risque
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 141

Tableau 5.16. Récapitulatif qualité pour l’examen mycologique des selles.

Nature du prélèvement Selles
Recommandations pour la qualité Recueil en pot stérile
du prélèvement
Conditions d’acheminement, Acheminement rapide au laboratoire :
milieux de transport À température ambiante (15-30°C) : au maximum 4 heures, puis entre +2°C et +8°C au maximum
48 heures
Possibilité d’utilisation de milieu de transport après prélèvement des selles avec écouvillon floqué
Mode de conservation De +2°C à +8°C jusqu’à la clôture de l’examen
Principe méthodologique Mise en culture du prélèvement et identification des colonies isolées
CIQ Non
EEQ Non
Performances du test Mise en évidence d’un déséquilibre de la flore par la prédominance d’espèces fongiques
Cause d’erreur, limites du test Délais d’acheminement inadaptés avant la mise en culture

de candidose invasive (patients d’hématologie, après désinfection du site de ponction. Chez le

immunodéprimés, de réanimation, etc.) ; nourrisson ou l’enfant  <  2-3  ans sans miction
• en cas de suspicion de candidose invasive/ volontaire, les urines sont recueillies après dés-
candidémie ou de cryptococcose disséminée  : infection locale via un collecteur qui ne doit pas
recherche de localisation secondaire (atteinte rester en place plus de 30 minutes ; le contenu du
rénale, prostatite) ; collecteur est ensuite transféré dans un récipient
• en cas de signes cliniques d’infection du tractus stérile. Les urines prélevées sur urétérostomie ou
urinaire (cystite, prostatite, pyélonéphrite) sans néphrostomie doivent être recueillies après dés-
étiologie bactérienne retrouvée. infection locale de la stomie, via un collecteur
stérile. L’examen mycologique des embouts de
Mise en œuvre sondes urinaires n’est pas recommandé. L’urine
L’examen mycologique des urines fait appel aux peut également être prélevée directement dans la
différentes techniques de base déjà évoquées dans vessie par ponction sus-pubienne, cette technique
cet ouvrage  : ensemencement, mise en culture, étant considérée comme le gold standard des
quantification, identification d’espèce  ±  antifon- techniques de recueil. Le mode de recueil des
gigramme (selon contexte). urines doit être précisé sur le bon de prescription.
Dans la mesure du possible, ces prélèvements
Prélèvement doivent être réalisés à distance d’un traitement
Les urines doivent être recueillies en flacon antifongique. Un volume minimal de 1 à 3  mL
stérile (éventuellement contenant du borate de est recommandé pour l’analyse mycologique des
sodium). Différents modes de recueil des urines urines.
sont préconisés en fonction du contexte clinique. Actuellement, les urines pour ECBU sont pré-
Chez le patient non sondé, le prélèvement de levées sur un conservateur : le borate de sodium
choix est l’urine de milieu de jet (urine mi- destiné à inhiber la croissance intempestive des
jet). Celle-ci doit être prélevée après lavage des germes lors du transport (action bactériostatique).
mains et toilette locale soigneuse (eau  ±  savon), La concentration de cet « inhibiteur de la multi-
si possible  >  4  heures suivant la dernière mic- plication des germes  » n’inhibe pas les levures  ;
tion. Chez le patient sondé, les urines doivent on peut donc travailler à partir de prélèvement
être recueillies par ponction directe de la sonde, commun.
142 Méthodes

Détail des techniques Interprétation

L’examen direct des urines n’est pas toujours
contributif [48]. Si celui-ci est réalisé, il doit être L’interprétation de la présence de levure ou
effectué à l’état frais ou après coloration, après cen- champignon filamenteux dans les urines varie tout
trifugation [45, 47]. Afin de permettre la quantifi- d’abord selon l’espèce retrouvée (figure  5.26).
cation des levures, un volume standardisé d’urines Certaines peuvent être isolées dans le cadre de
de 10 à 100  µL doit être ensemencé sur boîte colonisation ou d’infection urinaire (Candida
(öse calibrée ou autre) [46]. Le milieu de culture spp. , plus rarement Trichosporon spp.) ; d’autres,
le plus approprié pour l’examen mycologique des comme Cryptococcus neoformans, doivent être
urines est le milieu Sabouraud (+ chloramphénicol systématiquement prises en considération (exis-
ou gentamicine). Des milieux chromogènes sélec- tence d’un réservoir prostatique). En effet, à
tifs permettant l’identification présomptive rapide l’exception des patients de néonatologie pour
de C. albicans peuvent également être utilisés. Ils lesquels la mise en évidence d’une candidurie,
facilitent aussi la détection des cultures mixtes. en présence de signes cliniques évocateurs, est en
Les boîtes doivent être incubées au minimum faveur d’une infection, les autres cas témoignent
72  heures afin de permettre la croissance de avant tout d’une colonisation de l’arbre urinaire.
la plupart des levures. En cas de suspicion ou Toute candidurie ne doit donc pas faire l’objet d’un
de recherche de cryptocoque, l’urine doit être traitement antifongique.
ensemencée sur 2 tubes Sabouraud + antibiotique Les espèces du genre Candida spp. sont les plus
(sans actidione) à 30 (± 2 °C) et à 35 °C (± 2 °C) fréquemment isolées. La présence de Candida
et incubée pendant 3 semaines. spp. dans les urines peut résulter d’une colonisa-
Si la culture est positive, une numération des tion ou d’une infection du tractus urinaire, soit
levures est conseillée. Le nombre de colonies/ par voie ascendante, à partir de la flore diges-
boîte est déterminé, puis converti en nombre tive ou vaginale par exemple, soit suite à une
d’UFC/mL d’urine en fonction de l’inoculum dissémination des levures par voie hématogène
initial. au cours d’une candidose invasive [46,  48]. Il
n’existe pas de consensus permettant de dis-
tinguer colonisation, infection urinaire basse et
Processus qualité
infection urinaire haute. En particulier, il n’y a
(Voir tableau 5.17.) pas de relation directe entre l’importance de la

Tableau 5.17. Récapitulatif qualité pour l’examen mycologique des urines.

Nature du prélèvement Urines
Recommandations pour la qualité Recueil en flacon stérile après désinfection locale
du prélèvement Urines mi-jet +++, urines sur sonde après désinfection du site de ponction
Volume minimal nécessaire : 1-3 mL, à adapter en fonction du flacon utilisé (borate)
Conditions d’acheminement, Acheminement rapide au laboratoire :
milieux de transport –Température ambiante (+15–30°C) : <2 heures*
– + 2°C à +8°C : maximum 24 heures*
Mode de conservation +2°C à +8°C jusqu’à la clôture de l’examen
Principe méthodologique Mise en culture du prélèvement et identification des colonies isolées
CIQ Non
EEQ Non
Cause d’erreur, limites du test Faux positif en cas de contamination fécale et/ou cutanéomuqueuse (flore vaginale par exemple)
* Si milieu avec conservateur (par exemple acide borique) : conservation possible à température ambiante (15-30°C) pendant 48 heures (attention au niveau
de remplissage des tubes : concentration correcte en conservateur).
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 143
Figure 5.26. Démarche diagnostique d’une candidurie.
144 Méthodes

candidurie (quantification) et les signes cliniques. L’implication des levures du genre Candida
De  ce  fait, l’interprétation d’une candidurie spp. dans une infection urinaire nécessite en
nécessite la prise en compte d’éléments épidémio- général une candidurie élevée (≥ 105 UFC/mL),
logiques, biologiques et cliniques : conditions et la positivité d’au moins deux prélèvements et la
qualité du recueil de l’urine, contexte épidémio- présence de critères cliniques ou d’inflammation
logique (communautaire ou nosocomial), symp- (leucocyturie  ≥  104/mL en l’absence de sonde
tômes, facteurs de risque, leucocyturie, nature et ou cathéter (à noter que la leucocyturie peut
intensité de la candidurie [48]. être absente en cas d’infection, en particulier lors
De nombreux facteurs de risque de candidurie d’un prélèvement précoce ou chez les patients
ont été décrits  : diabète, présence de sonde neutropéniques) [46,  48]. Chez les patients de
ou cathéter urinaire, antibiothérapie, anomalies réanimation, le seuil de 104 UFC/mL apparaît le
fonctionnelles ou anatomiques de l’appareil uri- plus discriminant : toute candidurie supérieure à
naire, stase urinaire, immunosuppression, acte ce seuil peut traduire ou exposer à un risque de
chirurgical urologique ou endoscopique, poly- candidose disséminée [45]. En cas de prostatite,
traumatisme, brûlures étendues, sexe féminin, un seuil de significativité de 103  UFC/mL est
grossesse, irritation locale, etc. [46, 48, 49]. généralement admis. De même, une augmenta-
Les candiduries communautaires sont rares tion du nombre de levures détectées dans l’urine
(0,2-6 % de la population générale) et traduisent avant et après massage prostatique est évocatrice
le plus souvent une colonisation de l’arbre uri- d’une prostatite [46, 47].
naire chez des patients avec facteurs de risque. Un examen mycologique de contrôle est
En revanche, les candiduries sont fréquentes en recommandé en cas de discordance entre la cli-
milieu hospitalier (8-26  %), en particulier chez nique et la biologie et pour affirmer une candidu-
les patients de réanimation. Les espèces les plus rie véritable [48].
fréquemment isolées sont C. albicans (60  %),
C. glabrata (14-22 %) et C. tropicalis (8 %) [47, 48].
La plupart des candiduries sont asymptomatiques
ou non spécifiques, de présentation clinique simi- Examen mycologique
laire aux infections bactériennes (à type de cystite, d’un liquide de
prostatite ou de pyélonéphrite). Une complica- conservation d’organes
tion possible de l’atteinte du parenchyme rénal est
la formation d’agrégats fongiques ou bézoards, Indications
encore appelés fungus balls, au niveau du bassinet,
des uretères ou de la vessie, visibles à l’imagerie La contamination des liquides de conservation
[46–48]. d’organe (LCO) par des micro-organismes peut
La seule quantification des levures dans les être responsable de complications gravissimes
urines ne permet pas de distinguer formellement pouvant entraîner la perte du greffon (avec néces-
colonisation et infection [48]. Toutefois, diffé- sité de l’enlever en urgence), voire le décès du
rents seuils de significativité sont proposés dans receveur [55]. Ces contaminations sont souvent
la littérature, à titre indicatif, en fonction du provoquées par une brèche digestive lors du pré-
mode de recueil et du contexte clinique. Toute lèvement d’organes. L’analyse microbiologique
candidurie supérieure au seuil de détection doit des LCO est donc essentielle afin de prévenir ces
être prise en compte si l’urine a été prélevée par complications. La fréquence de la contamination
une méthode invasive (par exemple ponction par des agents fongiques varie de 0,4 à 4  %
sus-pubienne) [46]. Dans les autres cas, une can- selon les études et la nature de l’organe trans-
didurie < 103 UFC/mL chez un patient asymp- planté. Candida est le principal agent fongique
tomatique évoque plutôt une contamination du en cause avec une répartition des espèces qui suit
prélèvement ou une colonisation. celle de la flore digestive  : Candida albicans en
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 145

première position suivi de Candida glabrata. En

France, l’Agence de la biomédecine coordonne
les mesures de biovigilance des transplantations
d’organe et a émis des recommandations pour
prévenir la transmission de bactéries et d’agents
fongiques aux receveurs d’organes [53, 54].

Mise en œuvre
Recueil de l’échantillon
En salle d’opération, avant la transplantation et
dès l’ouverture du conteneur interne, 50  mL
de LCO sont prélevés à l’aide d’une seringue
stérile et répartis dans deux flacons stériles pour
les analyses bactériologiques et mycologiques.
Ils seront identifiés et transmis avec un bon
d’acheminement mentionnant le numéro Cristal
(numéro anonyme attribué au donneur) et la
nature du prélèvement (LCO rein, foie, cœur,
poumons, etc.), le service clinique, la date et
l’heure du prélèvement, les noms du prescripteur
et du préleveur. Le LCO doit être acheminé
rapidement au laboratoire et conservé à +4  °C Figure 5.27. Logigramme de prise en charge
s’il ne peut pas être traité pendant la période de d’un liquide de conservation d’organe au laboratoire
permanence des soins. de mycologie.

Prise en charge du prélèvement

au laboratoire (figure 5.27)
incuber à 35  ±  2  °C pendant 24 à 72  heures.
La manipulation du LCO doit se faire sous PSM
Tout résultat de culture positive à levure doit être
de type II dans de parfaites conditions d’asepsie.
communiqué rapidement à l’Agence de la bioméde­
Centrifuger de préférence la totalité du prélè-
cine qui contactera les centres des autres receveurs.
vement dans un tube à fond conique à 2000  g
En cas de positivité de la culture à levures
pendant 10 minutes. Enlever le surnageant et
ou champignons filamenteux, une identification
ne garder que 2  mL. Remettre le culot en sus-
d’espèce doit être réalisée ainsi qu’un antifongi-
pension.
gramme (voir chapitre 3, « Étude de la sensibilité
Un examen direct devra impérativement être
aux antifongiques  »). Les souches doivent être
réalisé (voir chapitre 3, « Examens directs »). Tout
conservées à –80 °C au minimum 12 mois.
résultat d’examen direct positif doit être communi­
qué rapidement à l’Agence de la biomédecine.
La culture est réalisée au minimum sur deux Interprétation
tubes de gélose en pente Sabouraud-chloram-
phénicol ± gentamicine. Les tubes sont incubés à La détection d’un agent fongique, principalement
30 ± 2 °C et à 35 ± 2 °C pendant 15 à 21 jours. une levure, dans un LCO conduira à la mise
En cas d’examen direct positif à levures, il est en place d’un traitement antifongique adapté
recommandé d’utiliser en plus un milieu gélosé chez le receveur ainsi qu’à un suivi spécifique.
d’identification rapide de type chromogène, à La contamination du LCO par un champignon
146 Méthodes

filamenteux étant extrêmement rare, ces dossiers (au-delà de 48 heures il sera congelé à –20 °C).
devront être discutés au cas par cas pour distin- Dans cette situation, un broyage du prélèvement
guer la « vraie » contamination du LCO (et donc n’est pas recommandé car il diminue les perfor-
de l’organe), de la contamination accidentelle de mances des cultures mycologiques.
laboratoire, ou lors de l’échantillonnage au bloc
opératoire. Liquide céphalorachidien (LCR)
La ponction lombaire est réalisée par l’intro-
duction d’une aiguille dans l’espace sous-arach-
Examen mycologique noïdien entre les 4e et 5e apophyses épineuses
pour infections profondes lombaires (soit 4e et 5e vertèbres). Elle per-
met de prélever du LCR recueilli dans un tube
Indications stérile. Les 4 à 5 premières gouttes du LCR
(pouvant contenir un peu de sang ou quelques
En cas d’infection invasive disséminée, de nom- cellules cartilagineuses) sont recueillies dans le
breux organes peuvent être atteints et pourront premier tube, le reste (une vingtaine de gouttes)
éventuellement faire l’objet d’un prélèvement dans les tubes suivants, servant respectivement
en vue de documenter le processus infectieux. aux examens biochimique, microbiologique et
Il est important que le prélèvement soit en cytologique. L’acheminement du LCR se fait
quantité suffisante pour pouvoir associer un sans délai (moins de 30 minutes) en raison de
ou plusieurs examens microscopiques avec une la lyse rapide des polynucléaires et à l’abri du
mise en culture, assurant ainsi une sensibilité froid en raison de la fragilité de certains micro-
de détection maximale, et que le laboratoire organismes. L’examen microbiologique standard
soit prévenu de l’arrivée de ces prélèvements du LCR ne comprend pas de mycologie. En cas
précieux. Au cas par cas, l’intérêt du diagnos- de suspicion de cryptococcose neuroméningée, le
tic moléculaire pourra être discuté (approche degré d’immunodépression, les pathologies sous-
panfongique ou approche spécifique d’espèce), jacentes et les signes cliniques doivent accompa-
en plus des approches traditionnelles (examen gner la demande afin de réaliser des examens
direct et cultures). spécifiques (examen direct à l’encre de Chine,
recherche de l’antigène capsulaire glucuronoxy-
lomannane de C. neoformans) et permettre un
Mise en œuvre diagnostic rapide (voir chapitre 47).
Biopsies
Collections purulentes
Il s’agit essentiellement de prélèvements réali-
et liquides d’épanchements
sés lors des actes chirurgicaux, notamment de
biopsies pulmonaires, ganglionnaires, hépatiques, Les liquides purulents provenant des abcès, de
de nodules sous-cutanés, etc. Ces prélèvements même que les liquides d’épanchement au niveau
précieux sont déposés dans des tubes ou des pots des séreuses (péritoine, plèvre, péricarde, syno-
stériles en ajoutant quelques gouttes de sérum vial) sont aspirés à l’aide d’une aiguille montée
physiologique pour éviter la dessiccation, mais sur une seringue. En cas d’effraction cutanée
sans adjonction de conservateur ou de fixateur qui nécessaire, la zone cutanée traversée doit être soi-
empêcheraient la culture et qui peuvent altérer gneusement désinfectée afin d’éviter les contami-
les performances des PCR. Le prélèvement doit nations par la flore commensale. L’acheminement
être acheminé au plus vite et dans les 4 heures au au laboratoire doit se faire rapidement (dans les
laboratoire. S’il ne peut pas être pris en charge 4  heures) directement dans la seringue ou dans
immédiatement, il sera conservé au réfrigérateur un pot stérile.
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 147

Prélèvements oculaires Sang

Le grattage cornéen (voir au chapitre 5, « Examen La recherche d’agents fongiques au niveau du sang
parasitologique d’un prélèvement cornéen ») peut est réalisée grâce aux dispositifs d’hémoculture
permettre la mise en évidence d’un champignon, (voir au chapitre 3, « Hémocultures fongiques »).
souvent filamenteux, voire d’amibes libres respon-
sables d’une infection de cornée. En cas d’endoph-
talmie, un prélèvement d’humeur aqueuse, voire Interprétation
de vitré, permettra d’isoler le micro-organisme et
De nombreux agents fongiques peuvent être isolés
d’affirmer son rôle dans l’infection. Le prélève-
des prélèvements profonds qui sont décrits ci-des-
ment est réalisé par aspiration à la seringue au bloc
sus. Leur présence est généralement associée à des
opératoire. Là encore, ces prélèvements précieux
terrains spécifiques (tableau 5.18). Dans l’immense
doivent être acheminés rapidement au laboratoire
majorité des cas, l’isolement d’un champignon de
(dans les 4 heures).
ces prélèvements profonds témoigne d’un proces-
sus invasif (présence de levures dans une hémocul-
Peau et muqueuses
ture, présence d’Aspergillus sp. ou de Mucorales
Des prélèvements cutanés peuvent être réalisés dans une biopsie pulmonaire, etc.). La prise en
lors d’une suspicion de lésions cutanées secon- charge antifongique pourra donc être initiée
daires à une infection fongique invasive (IFI). précocement, dès l’examen direct si celui-ci est
L’examen recommandé est la biopsie cutanée réa- suffisamment évocateur, l’identification d’espèce
lisée sous anesthésie locale, à l’aide d’un trocart étant obtenue classiquement par les cultures
cylindrique (punch biopsy). mycologiques. Ce caractère invasif sera également
Pour les muqueuses, et notamment la muqueuse confirmé par l’examen anatomopathologique,
digestive en cas de suspicion de localisations diges- permettant d’objectiver la présence  des  champi-
tives des IFI, des prélèvements biopsiques sous gnons au sein des tissus, voire au sein des vais-
endoscopie peuvent être réalisés (enduit œsopha- seaux pour les champignons angio-invasifs. Pour
gique, biopsies coliques, etc.). Ces prélèvements certains prélèvements, comme les liquides péri-
doivent être acheminés dans des pots stériles et tonéaux, l’isolement de levures ne témoigne pas
pris en charge selon les mêmes modalités que les obligatoirement d’une péritonite fongique, sur-
biopsies d’organes profonds. tout si ceux-ci sont prélevés par l’intermédiaire de

Tableau 5.18. Récapitulatif qualité des examens mycologiques de prélèvements profonds.

Nature du prélèvement Biopsie, aspiration, grattage : localisation profonde ou sous-cutanée
Recommandations pour la qualité Stérilité et quantité suffisamment abondante pour plusieurs techniques (examen direct,
du prélèvement ensemencement de plusieurs milieux de cultures et PCR si besoin)
Conditions d’acheminement, À température ambiante, dans quelques gouttes de sérum physiologique stérile ou si liquide
milieux de transport directement dans un flacon stérile. Acheminé en moins de 4 heures
Mode de conservation +4°C moins de 48 heures
Principe méthodologique Culture et identification des colonies fongiques
EEQ Non, pas encore de prélèvement natif disponible
Performances du test Comparaison avec les résultats de l’histologie et/ou de la PCR, surtout en cas de négativité
Cause d’erreur, limites du test Faux négatif : champignon non viable ou non cultivable, insuffisance de prise d’essai ensemencée,
absence de champignon dans l’échantillon examiné
Faux positif par aérocontamination pendant le prélèvement ou des milieux par des moisissures
contaminantes
148 Méthodes

redons ou de drains. L’interprétation sera plus dif- premières catégories. En revanche, aucun n’appar-
ficile et prendra en compte le contexte (péritonite tient à la catégorie de risque 4.
communautaire ou nosocomiale), l’existence de En France, la liste d’agents biologiques patho-
signes de gravité, les données de l’examen direct gènes classe 3 [57] recense les champignons dimor-
et la présence ou non d’une flore bactérienne phiques Blastomyces dermatitidis, Histoplasma
associée. En pratique, la présence de levures à capsulatum var. capsulatum, Histoplasma capsu­
l’examen direct sera prise en considération en latum var. duboisii, Paracoccidioides brasiliensis,
cas de péritonite secondaire liée aux soins (ou Coccidioides immitis et le phaeohyphomycète
communautaires en présence de signes de gravité Cladophialophora bantiana. Deux autres cham-
ou chez l’immunodéprimé), témoignant d’une pignons filamenteux (non mentionnés dans la
prolifération fongique importante et pouvant législation française) sont également classés par la
témoigner d’un processus infectieux [56]. communauté internationale comme organismes
de type 3. Il s’agit du phaeohyphomycète
Rhino­cladiella mackenziei, responsable d’infec-
Examen mycologique tions sévères du système nerveux central, et
des agents L3 du champignon dimorphique thermodépendant
Talaromyces marneffei, responsable d’infections
respiratoires souvent mortelles en l’absence
Classification de traitement. Concernant les parasites, seule
La classification des agents biologiques patho- l’amibe libre Naegleria fowleri rentre dans cette
gènes (fixée par le décret n° 94-352 du 4 mai catégorie, avec risque de transmission par voie
1994) [60] positionne ces agents en quatre aérienne.
groupes en fonction de l’importance du risque
d’infection qu’ils représentent pour l’homme ou
de leurs effets allergisants et/ou toxiques. Recommandations
• Le groupe 1 inclut les agents non susceptibles pour le laboratoire
de provoquer une maladie chez l’homme.
• Les agents biologiques du groupe 2 provoquent Lors de la manipulation de ces agents pathogènes,
une maladie chez l’homme et sont un danger les laboratoires doivent établir des recomman-
pour les travailleurs  ; leur propagation dans la dations liées à la sécurité et à la sûreté biolo-
collectivité est peu probable et il existe générale- gique, développées dans le but de surveiller et
ment une prophylaxie ou un traitement efficaces. prévenir des maladies. Les mesures de sécurité
• Le groupe 3 englobe les organismes capables de comprennent les bonnes pratiques de maîtrise
provoquer une maladie grave chez l’homme et des risques visant principalement la prévention
constituant un danger sérieux pour les travail- des risques  d’exposition accidentelle aux agents
leurs. De la même manière que les organismes pathogènes ou toxines afin d’éviter la contami-
du groupe 2, leur propagation dans la collecti- nation des personnels et de l’environnement. La
vité est possible, mais il existe généralement une sûreté biologique consiste en la mise en place des
prophylaxie ou un traitement efficace. mesures d’ordre administratif et organisationnel
• Les agents biologiques du groupe 4 provoquent ainsi qu’en la gestion du personnel en vue de
des maladies graves chez l’homme et consti- protéger et contrôler l’utilisation d’agents ou des
tuent un danger sérieux pour les travailleurs  ; toxines. Ces pratiques ont pour but de prévenir
le risque de propagation dans la collectivité est les risques liés à la perte, au vol ou au mésusage
élevé et il n’existe généralement ni prophylaxie, d’agents pathogènes [58, 62].
ni traitement efficaces. Chaque laboratoire manipulant des champi-
Les parasites et les champignons (levures et gnons appartenant aux groupes de risque 3 devra
filamenteux) peuvent être classés dans les trois établir des mesures de confinement qui incluent
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 149

la création de locaux et d’installations internes dans un laboratoire de confinement NSB3 en

adaptés et les bonnes pratiques opératoires de utilisant obligatoirement les équipements de pro-
travail, correspondants aux normes de sécurité tection individuelle tels que  : combinaison (avec
biologiques NSB3 [58]. Il faut noter l’impor- ou sans cagoule) ou casaque longue à usage
tance de tester l’activité fongicide des détergents unique et recouvrant totalement les vêtements
utilisés dans la désinfection des surfaces dans de ville ; double paire de gants à usage unique ;
un local de confinement classe 3. Une étude lunettes ou surlunettes de protection  ; masque
récente (données non publiées) a évalué l’activité antiparticules de type FFP2 ou FFP3. Ces équi-
fongicide et l’influence du temps de contact avec pements devront être portés jusqu’à la sortie de
le détergent «  ANIOS Surfa’Safe Premium  ». la zone de confinement.
Dix-huit champignons pathogènes incluant des
organismes de classe 3, tels que Coccidioides spp., Phase postanalytique
Histoplasma spp., T. marneffei et C. bantiana, Les isolats classe 3 peuvent être stockés à –80 °C
ont été testés dans le but de déterminer les dans des tubes contenant du lait écrémé à 20  %
conditions optimales d’utilisation du détergent. avec ou sans perles de verre et/ou dans l’azote
Les résultats ont montré une croissance résiduelle liquide.
de < 0,5 % pour la plupart des levures et champi- Si les cultures des agents classe 3 sont envoyées
gnons filamenteux après un temps de contact de dans un autre centre (CNR mycoses invasives et
5 ou 30 minutes. Il convient de noter que pour antifongiques [CNRMA] par exemple) dans le
C. bantiana un temps de contact de 24 heures est cadre d’une expertise d’identification, l’expédi-
recommandé. tion se fera sur des milieux de transport adaptés
La sécurité au laboratoire relève de l’inspection en suivant des règles d’emballage et d’étiquetage
du travail et ne fait partie du champ de l’accré- précises [59]. Cette réglementation impose l’uti-
ditation que lorsqu’il existe un risque pour le lisation d’un triple emballage qui consiste en un
prélèvement. récipient primaire étanche contenant le matériel
biologique, un emballage secondaire en métal
Mise en œuvre ou plastique épais et, finalement, un emballage
tertiaire avec fermeture fixée en bois carton,
L’exposition est différente suivant les étapes de métal ou plastique. Les conditions d’emballage,
l’analyse et suivant l’origine du prélèvement. d’étiquetage et de transport pour les matières
infectieuses se feront en fonction de la catégorie
Traitement du prélèvement à laquelle elles appartiennent. Les matières infec-
et ensemencement tieuses sont classées en deux catégories :
• catégorie A  : matière infectieuse transportée
• En mycologie médicale, les formes infectantes sous une forme qui peut, en cas d’exposition à
ne sont pas dans le prélèvement : le traitement celle-ci, provoquer une invalidité permanente,
du prélèvement en laboratoire NSB2 et sous constituer une menace ou provoquer la mort
poste de sécurité microbiologique (PSM) II, est tant chez l’homme ou l’animal, alors que
suffisant. celui-ci était par ailleurs en bonne santé. Seule
• En mycologie environnementale, surtout en C. immitis appartient à cette catégorie ;
zone d’endémie de ces champignons du groupe • catégorie B : matière infectieuse qui ne satisfait
3, les prélèvements doivent être traités dans un pas aux critères de la catégorie A. Les matières
laboratoire NSB3. de la catégorie B doivent être affectées au
numéro ONU 3373.
Manipulation des cultures Le cadre réglementaire en matières infectieuses
Toute manipulation de culture de champignon peut être consulté sur le site de l’Institut Pasteur
filamenteux suspecte de classe 3 doit être faite [61, 63].
150 Méthodes

Surveillance mycologique • les blocs opératoires : les prélèvements sont ici

de l’environnement plutôt à visée bactériologique. Si un prélève-
ment à visée mycologique est effectué, il peut
hospitalier et intradomiciliaire  s’agir selon la situation d’un prélèvement soit
d’air, soit de surfaces.
La surveillance environnementale fongique s’ins-
crit dans la démarche de prévention des infections
fongiques invasives, liées aux soins. Elle a pour but Quand prélever ?
de contrôler l’efficacité des mesures de prévention Les prélèvements doivent faire l’objet d’une pla-
qui visent à supprimer la pollution fongique, de nification réfléchie à l’interface entre l’équipe
vérifier l’efficacité des mesures mises en place à opérationnelle d’hygiène, les services de soins,
l’occasion de travaux, et d’investiguer l’origine le laboratoire de mycologie et éventuellement la
environnementale d’une infection fongique liée direction des travaux.
aux soins ou d’épidémie. Pour le suivi continu des secteurs bénéficiant
d’un traitement de l’air, les propositions clas-
Modalités de prélèvement siques de suivi sont a minima un prélèvement
mensuel par chambre à flux et un prélèvement tri-
Quels échantillons prélever ?
mestriel  pour les zones communes. En période
En établissements de santé, les prélèvements d’air de travaux, un plan d’échantillonnage doit être
et de surface sont généralement privilégiés. Plus envisagé : avant le début des travaux, avant mise
rarement, notamment pour comprendre une en place des mesures de prévention, pendant les
situation épidémique, des prélèvements d’eau, de travaux et en fin de travaux, afin de valider l’effi-
poussière, voire d’aliments peuvent être effectués. cacité des mesures ou de détecter au cours des
travaux toute augmentation anormale de l’aéro-
Où prélever ?
pollution. Les mesures de prévention à mettre en
En établissements de santé, l’objectif est de véri- place lors de travaux en établissement de santé ont
fier l’efficacité des moyens de prévention mis fait l’objet de recommandations publiées dans la
en place, en particulier le traitement de l’air revue Hygiène [68]. En cas d’épidémie, il s’agit
dans les secteurs hébergeant des patients à haut de rechercher un réservoir inhabituel permettant
risque d’infection fongique invasive, tels que les d’identifier la source.
services d’hématologie et de transplantation. Les
prélèvements sont recommandés exclusivement
dans les zones bénéficiant d’un traitement de Quelle technique de prélèvement
l’air pour être interprétables. Quelques mesures et de détection ?
d’appoint peuvent être faites dans des sites sen- Les techniques seront adaptées en fonction du
tinelles tels que les couloirs d’entrée ou de sortie type de prélèvement :
de ces services. Par ailleurs, en situation de tra- • prélèvements d’air : ils sont généralement réa-
vaux, un plan d’échantillonnage peut être mis en lisés à l’aide de biocollecteurs fondés sur la
place, y compris en zone extérieure, pour mesurer technologie de l’impaction sur gélose (volume
l’impact des travaux et l’impact des mesures de à prélever  >  500 litres). Plus récemment, des
prévention. collecteurs en milieu liquide ont également été
En pratique, deux principales situations bénéfi- commercialisés et permettent d’identifier des
ciant d’un système de traitement de l’air peuvent champignons en culture mais aussi par biologie
être distinguées : moléculaire ;
• une chambre à flux laminaire d’un service • prélèvements de surface : ils peuvent être effec-
d’hématologie stérile : classiquement, on associe tués soit à l’aide de boîtes gélosées contact, soit
un prélèvement d’air et 5 à 10 prélèvements de avec des écouvillons humides ensuite exprimés
surface ; sur milieux de culture ;
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 151

• prélèvements de poussière  : deux modalités PCR quantitative, avec des panels de systèmes
principales existent  : soit par aspiration via un d’amorces et sondes visant à amplifier de façon
filtre collecteur mis en bout d’aspirateur, soit spécifique un certain nombre d’espèces d’intérêt.
par l’usage de lingettes électrostatiques.
Quels champignons rechercher
Modalités de détection et quels seuils critiques ?
Outre la numération de la flore fongique totale,
Les conditions de culture recommandées sont
il faut identifier les principales espèces de champi-
d’utiliser un milieu de culture adapté aux cham-
gnons potentiellement pathogènes et responsables
pignons tels que le milieu Malt Agar ou de
d’infections fongiques invasives, notamment celles
Sabouraud, voire le milieu Dichlorane-glycérol
du genre Aspergillus (en particulier A. fumigatus)
(DG18) plus volontiers utilisé dans les analyses
et plus rarement des genres Fusarium, Scedo­
environnementales domiciliaires.
sporium ou les Mucorales.
Les cultures sont incubées à 30 °C ± 2 °C (ou
Il est difficile de donner des valeurs critiques
mieux si les échantillons peuvent être dupliqués,
pour chacun des environnements, sachant que
un échantillon à 25 à 30 °C ± 2 °C et un échan-
la présence de moisissures est habituelle dans
tillon à 35 °C ± 2 °C) pendant au moins 5 jours.
un environnement non traité et que plusieurs
Une première observation des cultures sera effec-
situations doivent être distinguées (tableau 5.19).
tuée à J2 pour pouvoir décompter le nombre de
colonies. À J5, l’identification sera effectuée soit
par méthode classique microscopique, soit en uti- Mesure de la contamination
lisant des méthodes plus précises d’identification microbiologique des logements
telles que la spectrométrie de masse ou la biologie
moléculaire. La mesure de l’exposition environnementale au
La détection sur un prélèvement d’air ou de domicile est proposée pour améliorer la prise
poussière peut également se faire directement par en charge des patients présentant des maladies

Tableau 5.19. Proposition d’interprétation des contrôles environnementaux à visée fongique.

Secteur Local Prélèvement d’air Prélèvement de surface
Protégé Chambre de patient Absence de spores fongiques Sous flux laminaire : absence de spores
(avec traitement fongiques
de l’air) Autres zones : tolérance de très
rares unités formant colonies (UFC)
de spores fongiques/prélèvement avec
absence d’Aspergillus*
Parties communes Tolérance de très rares UFC/prélèvement avec Tolérance de très rares UFC/prélèvement
absence d’Aspergillus** avec absence d’Aspergillus***
Autres secteurs Chambre du patient Résultats attendus difficiles à définir dans Résultats attendus difficiles à définir
et parties communes un environnement non protégé. Seules seront de façon uniforme et univoque. Seules
interprétées d’éventuelles modifications de seront interprétées d’éventuelles
l’aéropollution dans le temps, pendant les modifications de l’aéropollution dans le
travaux, ou en comparaison à des niveaux temps par rapport à un niveau habituel
de base mesurés avant le début des travaux considéré comme associé à la maîtrise
du risque
À titre indicatif, en situation normale hors travaux.
* Une tolérance de 2 UFC/prélèvement est acceptée pour un prélèvement de 25 cm2 de surface.
** Une tolérance de 2 UFC/prélèvement est acceptée pour un prélèvement d’air de 1 m3.
*** Une tolérance de 5 UFC/prélèvement est acceptée pour un prélèvement de 25 cm2 de surface.
152 Méthodes

allergiques (asthme, rhinite, pneumopathie 170 et 560 UFC/m3, entre 560 et 1000 UFC/m3

d’hypersensibilité) [64]. Elle vise à détecter et et  >  1000  UFC/m3, pour des logements avec
quantifier la présence de champignons allergisants des contaminations faibles, modérées, élevées. Les
et/ou produisant des mycotoxines (Penicillium concentrations  >  1000  UFC/m3 sont considé-
chrysogenum, Cladosporium sphaerospermum, rées comme très élevées et pourraient représenter
Alternaria alternata, Aspergillus versicolor, Stachy­ un risque potentiel pour la santé.
botrys chartarum, etc.). La mise en évidence d’un Des techniques d’amplification par PCR quan-
réservoir de moisissures est un des éléments de titative ciblée réalisées directement sur extraits
l’évaluation de l’exposition globale aux allergènes d’ADN préparés à partir des prélèvements de
(acariens, blattes, allergènes d’animaux, etc.) et poussières (capteurs électrostatiques ou de pous-
peut nécessiter une remédiation dans le cadre sière d’aspirateur) permettent de quantifier les
d’un conseil à domicile. principales espèces impliquées dans les allergies
La mesure de la contamination environnemen- (champignons mais aussi bactéries et acariens).
tale des domiciles des patients immunodéprimés Enfin, des techniques nouvelles fondées sur
(notamment les patients présentant une maladie le séquençage massif (next-generation sequencing
hématologique) peut être réalisée dans le cadre [NGS]) permettent d’appréhender le mycobiote
de la prévention des infections fongiques inva- environnemental sans a priori sur les cibles à
sives (IFI  ; même si elle n’est à l’heure actuelle amplifier. Cette technique d’avenir va surement
pas recommandée) [65,  66]. Dans ce cas, les modifier notre connaissance des réservoirs fon-
champignons recherchés sont les champignons giques environnementaux auxquels nous sommes
responsables d’infections opportunistes, comme exposés.
en milieu hospitalier. L’émergence de souches environnementales
Les méthodes utilisées sont similaires mais d’Aspergillus résistantes aux antifongiques azolés,
adaptées à un environnement non protégé : pré- liée à l’utilisation des fongicides azolés en agri-
lèvement d’air par impaction sur gélose (volume culture, a été décrite [67]. L’ensemencement de
de 100 litres), de surface et de poussières par prélèvements (air, surface, sol) réalisés en milieu
aspiration ou capteur électrostatique (piège à hospitalier, dans les domiciles et dans les envi-
poussières), généralement dans la chambre et ronnements professionnels à risque (agriculture,
dans un lieu humide (cuisine et salle de bains). viticulture, industrie du bois) sur des géloses
Des prélèvements supplémentaires ciblés selon contenant des antifongiques permet un screening
les activités particulières du patient (bricolage, des souches résistantes. La mesure de la CMI
jacuzzi, jardin, etc.) peuvent être réalisés. Les est réalisée ensuite par les méthodes habituelles
cultures sont réalisées sur milieux Malt Agar, (voir au chapitre 3, « Étude de la sensibilité aux
Sabouraud, ou DG18, incubés à 25 à 30  °C. antifongiques »). Ces explorations restent encore
Les lectures (dénombrement et identification) à l’heure actuelle du domaine de la recherche.
sont réalisées dès 48  heures et jusqu’à 7  jours.
L’identification peut être réalisée par examen Références
macroscopique et microscopique, spectrométrie
Approche en parasitologie
de masse MALDI-TOF ou biologie moléculaire
1. Levine RA, Wardlaw SC, Patton CL. Detection
(séquençage). of haematoparasites using quantitative buffy coat
L’interprétation est différente par rapport à la analysis tubes. Parasitol Today 1989;5:132–4.
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l’exposition fongique globale et ses variations. coat test. Med Trop 1999;59:276–8.
3. Société de Pathologie Infectieuse de Langue Fran-
Les seuils critiques sont donc nécessairement
çaise ; Collège des Universitaires de Maladies Infec-
différents. Pour les prélèvements d’air réalisés tieuses et Tropicales ; Société Française de Médecine
par impaction, des seuils ont été proposés pour des Armées  ; Société Française de Parasitologie  ;
les moisissures totales  :  <  170  UFC/m3, entre Société Française de Pédiatrie ; Société de Médecine
 Chapitre 5. Diagnostic par nature du prélèvement 153

des Voyages  ; Société de Pathologie Exotique  ; of trichomoniasis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo
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