Les Observations microscopiques

(Etat frais et mobilit, colorations)

Etudier la morphologie microbienne, au microscope photonique, cest rechercher la forme des bactries et leur mode de groupement.
Ces renseignements peuvent tre fournis par une simple prparation ltat frais entre lame et lamelle, les bactries tant alors observes
vivantes, ou par lobservation dun frottis color.
Les examens microscopiques de prlvements peuvent fournir des informations trs prcieuses pour le diagnostic et le traitement dune
infection. Dans tous les cas, ils orientent le diagnostic, le choix des milieux de culture et les conditions dincubation.
A partir dune souche pure, cest le premier critre didentification.
Les examens microscopiques dun prlvement polymicrobien permettent enfin de connatre les proportions de chaque sous-population dans
le prlvement.
I Observation ltat frais
Une prparation ltat frais permet dexaminer la mobilit des bactries et den dceler la forme, bien que ce renseignement soit plus
accessible sur des frottis colors. Si la bactrie est sporule, ltat frais permet galement de mettre ce phnomne en vidence. Pour observer
la mobilit, on doit prendre garde ne pas dtruire les flagelles bactriens lors du prlvement et de la prparation de la lame.
Technique de la prparation de ltat frais
Dposer une petite goutte deau strile sur la lame.
Prlever une fraction de colonies sur glose, de prfrence aux bords de celle-ci (ou prlever une petite goutte de bouillon). Faire une
suspension homogne dans la goutte deau en incorporant progressivement linoculum et en remuant trs dlicatement (afin de ne pas
casser les flagelles).
Recouvrir dune lamelle en vitant denfermer des bulles dair. Le liquide ne doit pas dborder (sinon jeter la lame dans une solution
dsinfectante et recommencer).
Observer rapidement lobjectif 40 en mettant la lumire au maximum mais en fermant le diaphragme (ou utiliser un systme fond
noir ou contraste de phase ).
Aprs observation, jeter ltat frais dans un bac contenant un dsinfectant large spectre car les bactries sont vivantes
Veiller observer une grande partie de la lame, mais ne pas prolonger lobservation au-del de 3 10 minutes. Ne pas hsiter
recommencer
Des bactries sont considres comme mobiles lorsque des trajets trs diffrents sont observs (dplacement dans toutes les directions).
Une bactrie immobile est anime de mouvements dagitation normaux dits mouvements browniens (agitation molculaire), quil ne faut
pas confondre avec la mobilit. De plus, lors de la pose de la lamelle, des flux liquidiens entranent toutes les bactries dans le mme sens et
la mme vitesse
ATTENTION ! Une bactrie mobile peut apparatre immobile alors quelle est flagelle si les conditions de lobservation ne sont pas
optimales. Les flagelles ne doivent pas tre casss par la prparation ou dtruit par un instrument trop chaud ; la bactrie doit provenir dune
culture jeune. La temprature de lincubation peut aussi avoir de linfluence : certaines bactries immobiles 37C sont mobiles 22C
(Yersinia, Hafnia par exemple). Il est possible de confirmer la mobilit par lensemencement dune glose molle ou par la coloration des cils
II Observation dun frottis color
1- Ralisation dun frottis
Avant toute coloration, il faut raliser un frottis, cest--dire un talement, si possible monocouche, des bactries sur une lame.
La technique du frottis est fort simple :
Dposer sur une lame propre une goutte deau strile si la culture prleve est solide, puis prlever laide de lanse de platine une parcelle
de la culture. Mlanger afin dobtenir une suspension homogne. Il est galement possible de dposer une goutte de milieu liquide incub
ou une goutte de suspension.
Raliser le frottis en partant du centre de la lame, en dcrivant avec lanse des mouvements circulaires de faon obtenir un talement
mince et homogne sur au moins 2/3 de la lame.
Striliser lanse.
Scher et fixer le frottis au-dessus de la flamme du bec Bunsen sans trop le chauffer. La technique la plus sre consiste passer dans la
flamme le frottis 3 ou 4 fois une demi seconde, face sans bactries vers la flamme.
Le frottis tant fix, la lame ne prsente plus de danger de contamination.
On peut alors effectuer la coloration dsire.
Remarque : avant de colorer, attendre que la lame refroidisse sous peine de cristallisation du premier colorant ou de casse de la lame

2- Technique gnrale dune coloration

Toutes les colorations en bactriologie suivent un mme principe qui peut se dfinir en 3 (ventuellement 4) tapes qui sont :
-

Etape de COLORATION (cest le colorant qui donnera un rsultat positif la fin)

Une ventuelle tape de mordanage ou dintensification de la coloration
Une tape de dcoloration ou EPREUVE (cest le caractre que lont cherche mettre en vidence)
Une tape de CONTRE COLORATION qui permet dobserver les germes dcolors prcdemment (donc cest le colorant
donnant un rsultat ngatif)

3- La coloration de Gram
A- Principe
La coloration de Gram est la base de lidentification dune souche bactrienne. Elle doit tre parfaitement matrise car cest le point de
dpart du choix des examens complmentaires effectuer, des milieux ensemencer etc
Au terme du processus de coloration, les bactries dites Gram Ngatives apparaissent roses tandis que les bactries dites Gram
Positives sont colors en bleu fonc/violet (rem : certaines bactries telles que les Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le mme frottis, on les dit
Gram labiles et les diffrences de coloration sont dues des diffrences dge des bactries)

La coloration de Gram est une coloration qui teste lalcoolo rsistance dune souche bactrienne. En effet, les diffrences de coloration des
bactries reposent sur des diffrences de constitution de la paroi :

Les bactries Gram ngatives ont une paroi plus fine que celles Gram positives. De plus, cette paroi est trs riche en lipides (membrane
externe de la paroi) dans laquelle lthanol est fortement soluble
B- Technique
-

Raliser un frottis et le fixer.

Coloration : violet de gentiane phniqu durant une minute. Toutes les bactries prennent ce colorant et sont donc colores en
violet.
rincer leau du robinet
Mordanage : recouvrir la lame de ractif de Lugol 1 minute (ractif iodo-iodur qui accentue la coloration).
Rincer leau
Epreuve (alcoolo rsistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi seconde dans un pot dalcool puis rincer leau du robinet
immdiatement. Pendant cette tape, les lipides de la paroi des Gram moins sont dissous et lalcool peut donc pntrer dans le corps
bactrien et expulser le violet de gentiane. Les bactries Gram moins sont alcoolo-sensibles et sont donc dcolores. La paroi des
Gram plus ne laisse pas passer lalcool et sont dites alcoolo-rsistantes et restent colores en violet.
Contre coloration : Fuschine dilue au 1/20me ou de safranine pendant une minute. Toutes les bactries prennent le colorant mais
le violet masque la fuschine. Les Gram positives apparaissent donc violettes, les Gram ngatives , recolores par la fuschine,
apparaissent roses.
Rincer leau du robinet et scher entre deux feuilles de papier absorbant.
Observer lobjectif 100 immersion, pleine lumire.

Remarque : la coloration de Gram est parfois appele coloration V.L.A.F afin de se rappeler les colorants et dans quel ordre ils doivent tre
utiliss ( Violet, Lugol, Alcool, Fuschine).

4- La coloration de Giemsa
A- Principe
La coloration de Giemsa est une coloration polychromatique douce. En effet, le colorant de Giemsa contient 3 colorants (bleu de mthylne,
azur de mthylne et osine, llment le plus important tant un compos qui se forme spontanment dans le mlange : losinate dazur de
mthyle) qui donnent des colorations diffrentes selon le support o ils se fixent. En bactriologie, cette coloration conservant mieux les
cellules et tant moins agressive que le Gram permet dobserver des bactries fragiles, trop radicalement altres par une autre coloration :
spirochtes, spirilles, mycoplasmes etc. Par ailleurs, elle permet galement de mettre en vidence la capsule bactrienne ou les bactries
intracellulaires.
B-

Technique

La technique dcrite ci-aprs est dite coloration lente de Giemsa . La solution de travail ne se conservant pas, il faut la prparer
extemporanment en diluant au dixime une solution mre (conserve labri de lhumidit et de la lumire) avec de leau tamponne pH=7.
Dans cette coloration, les tape de coloration, preuve et contre coloration sont toute faites simultanment lors de laction du colorant de
Giemsa
-

Raliser un frottis et le fixer de manire douce. Il est prfrable de la laisser scher longtemps ltuve
Recouvrir de solution de Giemsa (dilue) et laisser colorer 30 minutes. On peut galement utiliser une cuve coloration.
Eliminer le colorant et rincer leau tamponne. Rincer ensuite leau du robinet.
Scher entre deux feuilles de papier absorbant et observer lobjectif 100 immersion.

5- La coloration de Ziehl
A- Principe
Limportance en pathologie des bacilles tuberculeux et paratuberculeux ou encore celui de la lpre en mdecine humaine, a conduit la
recherche de colorations particulires. Elles sont bases sur la capacit de ces bactries conserver, aprs coloration chaud la fuschine, la
teinte rose malgr laction dun acide fort concentr et dthanol 95. Cette proprit est en relation avec une constitution particulire de la
paroi : elle est trs riche en lipides (acide mycoliques, acides gras longues chanes et cires) qui ne sont retrouvs que chez ces bactries
dites alcoolo-acido-rsistantes ou BAAR.

B- Technique
La technique de rfrence est la coloration de Ziehl-Neelsen.
-

Raliser un frottis et le fixer. Ce frottis ne doit tre ni trop fin, ni trop pais.
Coloration :ecouvrir compltement la lame de fuschine de Ziehl concentre et chauffer la lame. Ce chauffage peut se faire laide
dun bec Bunsen en faisant bien attention ne pas rester trop longtemps au mme endroit (mouvement de va et vient). Le chauffage
doit se poursuivre jusqu' mission de vapeurs blanches de phnol. Ce dgagement de vapeur doit durer au moins une minute et le
frottis ne doit jamais scher (rajouter de la fuschine si ncessaire)
Eliminer le surplus de colorant, laisser refroidir un peu la lame et rincer leau du robinet.
Epreuve (acido rsistance) : Recouvrir la prparation dune solution dacide sulfurique au 1/4 (ou dacide nitrique au 1/3) pendant
30 secondes.
Rincer leau du robinet
Recouvrir de bleu de mthylne pendant 1 minute.
Rincer leau du robinet et scher entre feuilles de papier absorbant.
Observer lobjectif 100 limmersion.

Les lments (bactriens ou non) acido-resistants apparaissent roses, les autres apparaissent bleus.

ATTENTION, loccasion des TP, nous raliserons une variante,

dgagement de phnol (toxique) et parfois lclatement de la lame.

froid, de cette coloration. En effet, le chauffage de la lame provoque un

Ltape de coloration la fuchsine se fera donc de la faon suivante :

Recouvrir de fuchsine concentr pendant 5

minutes sans chauffer. Rincer leau

Les vritables lments acido-rsistants sont : les Mycobacterium, les spores bactriennes ou vgtales, les anneaux de lignine, les grains de
pollen et les cryptosporidies (parasite). (voir feuille de prsentation des lments visibles au ZN)
A ct de ces lments, dautres bactries sont partiellement acido-rsistantes (Brucella, Rhodococcus, Nocardia, Chlamydia, Actinobacillus,
Bordetella) et ne sont pas colores par le Ziehl, mthode trop agressive. On ralise alors une coloration de Kster :
-

Raliser un frottis et le fixer.

Coloration : Recouvrir dune solution de fuschine (ou safranine) 2% dans de la soude molaire pendant 1 minute.
Laver leau du robinet.
Epreuve : Dcolorer par action dacide sulfurique 0.1% pendant 10 20 secondes.
Rincer leau du robinet.
Contre-colorer par du bleu de mthylne pendant 20 secondes.
Rincer, scher entre deux feuilles de papier absorbant et observer lobjectif 100 immersion.

Les bactries partiellement acido-rsistantes apparaissent roses oranges sur fond bleu.

6- La coloration des spores

Certaines espces bactriennes, et plus particulirement le genre Bacillus (arobie strict ou aro-anarobie) et Clostridium (anarobie strict),
ont la proprit de former des spores, forme de rsistance de ces bactries en particulier vis--vis de la chaleur et de la dshydratation,
capables de redonner des bacilles.
La sporulation survient lorsque les conditions du milieu deviennent dfavorables : milieu pauvre, cultures ges, dshydratation etc
Les spores, trs impermables, sont parfois visibles la coloration de Gram sous la forme de zones incolores bien dlimites dans les
bactries ou lextrieur. Elles apparaissent trs rfringentes ltat frais. On peut toutefois les colorer par les mthodes dcrites ci-dessous :
A- Coloration positive
Il existe diffrentes colorations bases sur la mme technique : Afin de colorer la spore, on utilise en combinaison laction de la chaleur et
une forte concentration de colorant. Nous allons dcrire la coloration au vert malachite
-

Raliser un frottis et le fixer

Coloration :Recouvrir dune solution de vert malachite 5%. Chauffer jusqu' mission de vapeurs. Laisser refroidir et chauffer
nouveau. Lopration doit durer 10 minutes
Epreuve : Laver soigneusement
Contre coloration :Recouvrir la lame de safranine ou de mercurochrome 5 % pendant 1 minute
Laver, scher entre deux feuilles de papier absorbant
Observer lobjectif 100 immersion

Les spores apparaissent en vert foncs, les sporanges en vert ple et les corps bactriens en rose

On peut galement utiliser la coloration de Ziehl chaud en faisant bouillir la fuschine Les spores apparaissent roses dans les corps
bactriens bleus.
B- Coloration ngative
On peut plus simplement mettre en vidence les spores bactriennes dans les corps bactriens en faisant une coloration dite ngative . En
effet, cette fois la spore nest pas colore et reste donc incolore dans un corps bactrien color. La coloration la plus utilise dans ce cas est la
coloration au bleu de mthylne simple :
-

Raliser un frottis et le fixer

Recouvrir la lame de bleu de mthylne phniqu pendant 1 minute
Rincer leau du robinet
Scher entre deux feuilles de papier absorbant
Observer lobjectif 100 immersion.

Les spores apparaissent incolores dans des corps bactriens bleus