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Problme 2 : complexation des ions calcium

NOTE IMPORTANTE : Les diffrentes parties de ce problme sont totalement indpendantes. Au sein de chacune delles, de nombreuses questions sont indpendantes. Les indications de lnonc peuvent tre utilises sans dmonstration pour avancer dans la rsolution des questions. Limportance des ions calcium Ca2+ est reconnue depuis des annes par les biologistes dans le fonctionnement de nombreux systmes comme la contraction musculaire. Les concentrations cytoplasmiques mises en jeu sont trs faibles, de lordre de la micromole par litre. Pour raliser leurs tudes, les scientifiques doivent disposer de mthodes de dosage des ions calcium dans le milieu cellulaire, ainsi que de systmes chimiques permettant le maintien de concentrations constantes aussi faibles. La mthode doit tre fiable, rapide et ne doit pas trop perturber le fonctionnement des systmes biologiques. Lune des mthodes repose sur lutilisation de complexants slectifs des ions calcium, introduits en quantit telle que la concentration rsiduelle en ions calcium soit celle requise et, en outre, facile mesurer. Le chimiste dispose de tels complexants : lacide nitrilotriactique (NTA) ou lacide thylnediaminettraactique, plus connu sous lacronyme EDTA.
O COOH HO HOOC N COOH C O N C O NTA EDTA OH HO C N O C OH

Malheureusement, lEDTA nest pas slectif des ions calcium (il complexe tous les cations mtalliques, notamment les ions Mg2+, ce qui est trs gnant pour les biochimistes) et les proprits acidebase sont telles quil peut difficilement tre utilis dans les milieux cellulaires, dont le pH est voisin de 7. Par ailleurs, les mesures directes ou indirectes des concentrations sont trs dlicates et ne peuvent tre mises en uvre dans les systmes biologiques. Les biochimistes ont donc mis au point des analogues structuraux de lEDTA comme lEGTA ou le BAPTA, dont les structures sont reprsentes ci-aprs.
COOH HOOC N COOH O O EGTA BAPTA HOOC N COOH HOOC N COOH O O N COOH

Ce problme envisage successivement : ltude de dosages des ions calcium en solution aqueuse, la synthse dun driv du BAPTA,

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ltude spectroscopique du systme calcium/BAPTA ltude cintique de la raction de complexation la dtermination de la valeur dune constante de complexation. Ce problme utilise notamment les publications de R.Y. Tsien (Biochemistry, 1980, 19, 2396-2404) et de H. Harafuji et Y. Ogawa (J. Biochem. 87, 1305-1312 (1980)). Les conditions exprimentales des dosages du calcium sont extraites de louvrage Vogels Textbook of quantitative inorganic analysis .

I. Dosages des ions calcium par lEDTA ou lEGTA

LEDTA est reprsent ci-dessous. Cest un ttraacide not H4Y dont les pK A successifs ont pour valeurs respectives : 2,0 ; 2,7 ; 6,4 ; 10,2. En milieu aqueux trs fortement acide, lEDTA est majoritairement sous la forme (1) reprsente ciaprs. 1. Connaissant les valeurs gnrales des pK A des couples acide-base suivants, justifier cette observation.
+ RNH 3 /RNH 2 : 9-10

RCOOH/RCOO : 4-5
O O O N C OH HO H C O N C O (1) O O C N H O C OH

HO HO C O N C O

OH

2.

Lespce complexante est lion Y4 . Il est observ que les ions mtalliques donnent tous avec ce ligand hexadente (ou en franglais, hexadentate) un complexe de stchiomtrie 1/1, les sites de coordination occupant les sommets dun octadre. Identifier les sites de coordination et reprsenter dans lespace lion complexe MY. Lespce H 4 Y tant pratiquement insoluble dans leau, la solution titrante (S) (de concentration cT = 0,0200 mol L1 ) est obtenue par dissolution dans leau du sel Na 2 H 2 Y , totalement dissoci en ions Na + et H 2 Y 2 . crire la structure de lion H 2 Y 2 et montrer que ce dernier est lespce majoritaire dans la solution ainsi prpare.

3.

Le dosage des ions calcium par lEDTA peut se raliser dans diverses conditions plus ou moins acrobatiques, en fonction de la prsence ou de labsence dions magnsium. Lune des mthodes est la suivante : elle consiste doser par la solution (S) une solution dions calcium dont le pH est maintenu une valeur voisine de 12,5. Lquivalence est repre par le changement de coloration de la solution, grce la prsence dun indicateur color (ractif de Patton et Reeder ou Calcon). 4. Considrons une solution dions calcium de concentration molaire c1 0,01 mol L1 . Un volume V1 = 25,0 mL de cette solution est introduit dans un erlenmeyer. Le pH de la solution est amen une valeur voisine de 12,5 par addition de N-thylthanamine. Le volume global de la solution est amen V0 50 mL . Vrifier que lhydroxyde de calcium ne prcipite pas.

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On donne la valeur du produit de solubilit de Ca(OH) 2 : pK s = 5,2 5. Quelle est lespce majoritaire de lEDTA non complexe dans ces conditions de pH ?

En considrant, ce qui est raisonnable au vu des quantits mises en jeu, que le pH de la solution ne varie pas au cours du titrage, on peut alors admettre, pour simplifier le raisonnement, que lquation bilan de raction est simplement : Ca 2+ + Y 4 = CaY 2 6. 7.
10 , 7 La constante de formation du complexe CaY2 est Y . Quest-il possible den dduire ? Ca = 10

la solution contenue dans lerlenmeyer, 50 mg de dispersion solide de lindicateur color sont ajouts. La solution est de couleur rose. La solution dEDTA est lentement ajoute, jusqu virage net du rose au bleu. Le virage est observ pour un volume de titrant VE = 11,2 mL . En dduire la valeur de la concentration c1 .

Lindicateur not J est lui-mme un ligand des ions calcium. Le complexe CaJ + et lion libre J doivent avoir des couleurs suffisamment diffrentes dans la solution titre, elles-mmes diffrentes de celle du complexe CaY2 (ce dernier est heureusement incolore). 8. 9. quelles espces sont dues respectivement les colorations rose et bleue ? La constante de formation de lion CaJ + doit-elle tre suprieure ou infrieure celle de lion CaY2 ? Justifier la rponse en crivant lquation bilan qui traduit le changement de coloration de la solution. Considrons maintenant une solution contenant des ions calcium et des ions magnsium, chacun pour simplifier la concentration c1 . Le protocole suivi la question 4 est reproduit. Montrer que lhydroxyde de magnsium prcipite et calculer la concentration rsiduelle en ions magnsium dans la solution. Le dosage slectif des ions calcium est-il alors possible ? On donne la valeur du produit de solubilit de lhydroxyde de magnsium : pK s = 10,8
8, 6 La constante de formation du complexe MgY2 est Y Mg = 10

10.

11.

Dans les dosages de ce type, il est souvent recommand dajouter quelques mg de cyanure de potassium solide la solution titrer. Quel peut tre le rle de cette opration ?

La mthode prcdente ne peut tre rellement applique si les concentrations en ions calcium et magnsium sont voisines. Ds que la concentration en ions magnsium excde 10 % de celle en ions calcium, il y a en effet co-prcipitation des deux hydroxydes. Il faut donc recourir une autre mthode, utilisant un complexant plus slectif comme lEGTA. En effet, les constantes de formation des complexes Ca-EDTA et Mg-EDTA sont dans un rapport voisin de 10 2 alors que celles des complexes Ca-EGTA et Mg-EGTA sont dans un rapport de 10 5, 7 ! Linconvnient est que lEGTA est trois fois plus coteux que lEDTA Lindicateur de fin de titrage est le zincon ou, si vous prfrez : 1-(2-hydroxy-5-sulfonylphnyl)3-phnyl-(2-carboxyphnyl)formazane dont la formule ne sera pas demande et qui sera not HIn 3 sous sa forme libre dans les conditions de pH utilises ( pH 10 ). La forme complexante des ions mtalliques est In 4 . Une solution de HIn 3 dans ces conditions de pH prsente une couleur orange. Se pose nanmoins une difficult : le complexe CaIn 2 est incolore Il faut donc travailler en prsence dun peu dions Zn 2 + qui donnent un complexe ZnIn 2 de couleur bleue. On donne (avec des notations videntes) : EGTA < EGTA Zn Ca

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Le protocole opratoire est alors le suivant : Dans un erlenmeyer de 250 mL, introduire un volume V1 = 25,0 mL de solution dions calcium titrer, contenant ventuellement des ions magnsium. Ajouter un volume V1 = 25 mL de solution tampon pH 10 Ajouter environ 2 mL dune solution de complexe Zn-EGTA de concentration voisine de 1 mmol L1 , puis 2 gouttes de solution de zincon. Titrer lentement par une solution dEGTA jusqu ce que la coloration passe du bleu lorange. 12. 13. 14. 15. En crivant une quation bilan, justifier la coloration bleue de la solution initiale. crire lquation bilan traduisant le changement de coloration de la solution et justifier la mthode de dtection de lquivalence. crire la structure de la forme complexante de lEGTA. Quels sont les sites de coordination ? Le numro atomique du magnsium est Z = 12 , celui du calcium Z = 20 . Comment est-il possible de rendre compte simplement de la diffrence importante entre les constantes de complexation de lEGTA pour les ions magnsium et les ions calcium ?

II. Synthse dun driv du BAPTA

LEGTA not H 4 Z possde donc lavantage sur lEDTA de complexer slectivement les ions calcium. Nanmoins, compte tenu des valeurs des deux pK A les plus leves, lEGTA existe majoritairement, aux pH des milieux physiologiques, sous forme H 2 Z 2 , ce qui rend la complexation cintiquement trop lente pour rpondre aux impratifs des biologistes. Par ailleurs, ni lespce libre ni lespce complexe nabsorbent la lumire et aucune dtection non destructive ne peut tre envisage. Cest pourquoi de nouvelles espces ont t mises au point, possdant la fois des proprits acidebase compatibles avec les exigences des biologistes et des caractristiques spectrophotomtriques intressantes. Nous nous intressons donc dans cette partie la synthse dun driv dibrom du BAPTA, dont les proprits seront envisages dans les parties suivantes. Dans un premier temps, une solution dans 50 mL de N,N-dimthylmthanamide (ou DMF, solvant polaire non protogne) de 0,22 mol de 2-nitrophnolate de sodium et 0,12 mol de 1,2-dibromothane est chauffe reflux du solvant pendant 2 heures. Aprs refroidissement, un compos A prcipite et il est isol par filtration sous pression rduite (rendement 56 %). La formule brute de A est C14H12N2O6. 16. 17. Identifier A et proposer, en le justifiant, un mcanisme pour sa formation. Quel est le rle du DMF ?

Par hydrognation catalytique, A est transform en B de formule C14H16N2O2. Le spectre RMN 1 H de B fait apparatre un multiplet entre 7 et 8 ppm (intgration 8 H), un singulet vers 4,2 ppm (intgration 4 H) et un singulet largi (intgration 4 H), disparaissant lorsque le spectre RMN est enregistr en prsence dune goutte de D 2 O . Le spectre IR fait notamment apparatre deux bandes fines vers 3300 cm1. 18. En dduire la formule semi-dveloppe de B. En prsence dune amine tertiaire R3N (120 mmol), 12,5 mmol de B sont mlangs avec 72 mmol de 2-bromoactate dthyle Br CH 2 COOC 2 H 5 et 3,5 mmol diodure de sodium. Le tout est dissous dans

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15 mL dactonitrile (solvant polaire non protogne) et chauff reflux du solvant pendant 20 heures. Aprs refroidissement et dilution avec du tolune, les produits insolubles (sels de bromure et diodure) sont limins par filtration sous pression rduite. Aprs traitement de la phase organique rsiduelle, le compos C (formule brute C30H40N2O10) est isol avec un rendement de 71 %. Le spectre RMN de C, enregistr en solution dans CDCl 3 une frquence de 60 MHz, se prsente de la faon suivante : = 6,81 ppm , singulet, 8 H = 4,19 ppm , singulet, 8 H = 1,16 ppm , triplet, 12 H, J = 7 Hz 19. 20. 21. En dduire la structure de C. Attribuer les massifs aux diffrents atomes dhydrogne de la molcule et justifier les multiplicits observes (sauf pour le signal le plus dblind). Proposer un mcanisme dtaill pour la formation de C, ne faisant pas intervenir dans un premier temps les ions iodure. Justifier la rponse. Les ions iodure jouent un rle catalytique. Justifier cette observation en prcisant le mcanisme prcdemment crit. = 4,29 ppm , singulet, 4 H = 4,05 ppm , quadruplet, 8 H, J = 7 Hz

Le compos C (0,52 mmol) est dissous dans 5 mL de trichloromthane, en prsence de 1,44 mmol de pyridine. Aprs refroidissement, 1,0 mmol de dibrome dissous dans du trichloromthane sont ajouts. Aprs retour la temprature ambiante, la phase organique est traite par une solution aqueuse de chlorure dhydrogne (acide chlorhydrique) puis par une solution aqueuse dhydrognocarbonate de sodium. La phase organique est sche sur sulfate de sodium, puis le solvant est vapor. Aprs recristallisation, on isole 180 mg de D. La formule brute de D est C30H38N2O10Br2. Le spectre RMN enregistr en solution dans CD 2 Cl 2 une frquence de 100 MHz, se prsente comme suit : = 7,31 6,90 ppm , multiplet, 4 H = 4,26 ppm , singulet, 4 H = 4,06 ppm , quadruplet, 8 H, J = 7 Hz 22. 23. 24. = 6,68 ppm , doublet, 2 H, J = 9 Hz = 4,08 ppm , singulet, 8 H = 1,21 ppm , triplet, 12 H, J = 7 Hz

Montrer que ces donnes sont compatibles avec la fixation dun atome de brome sur chaque cycle aromatique, en position 4 par rapport latome dazote. Sur lexemple de la N,N-dimthylaniline (ou N,N-dimthylbenznamine), prciser le mcanisme de la raction et justifier la rgioslectivit de la raction. Quel peut-tre le rle de la pyridine dans le protocole opratoire propos ?

III. tude spectroscopique du systme calcium-bapta

Les spectres dabsorption UV-visible, correspondant aux transitions nergtiques entre niveaux lectroniques, sont diffrents pour le BAPTA et pour le complexe Ca-BAPTA. Ainsi la dtection spectroscopique indirecte de la concentration en ions calcium libres devient possible. Par ailleurs, les deux pK A les plus levs du BAPTA (sous forme ttraacide) sont gaux 6,4 et 5,5. Les deux premires valeurs, infrieures 4, nont pu tre mesures par suite de linsolubilit dans leau de la molcule sous forme ttraacide. Le spectre du BAPTA libre, enregistr en milieu tamponn de pH = 7,29 prsente deux maxima dabsorption aux longueurs donde 1 = 254 nm (absorption maximale) et 2 = 287 nm . Le spectre de

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lion complexe Ca-BAPTA prsente un maximum dabsorption pour 3 = 274 nm et 4 = 203 nm (absorption maximale). Le premier spectre ressemble tout fait celui de la 2-mthoxy-N,Ndimthylaniline alors que le second ressemble celui du mthoxybenzne. On rappelle que dans une molcule, plus la dlocalisation lectronique est tendue, plus labsorption des radiations lectromagntiques est dcale vers les grandes longueurs donde (effet bathochrome). De mme, on observe sur le spectre du BAPTA enregistr en milieu acide ( pH < 5 ) les mmes effets que ceux observs en prsence dions calcium. 25. 26. 27. 28. Comment peut-on rendre compte simplement de leffet bathochrome quand on passe du mthoxybenzne la 2-mthoxy-N,N-dimthylaniline ? Expliquer de mme leffet observ sur le spectre du BAPTA en milieu acide (effet hypsochrome, dcalage vers les faibles longueurs donde). Quest-il possible den conclure sur la nature des sites de coordination du BAPTA ? Comment est-il possible de rendre compte de leffet hypsochrome en prsence dions calcium ? On constate sur diffrents spectres dabsorption, enregistrs avec une concentration totale en BAPTA constante, mais des concentrations en ions calcium libres variables, que toutes les courbes passent par un point commun. Comment sappelle ce point ? Quest-il possible de dduire de lexistence de ce point ?

IV. Dtermination de la constante de formation dun complexe

Pour dterminer la constante de formation (ou de dissociation) dun complexe, les biochimistes utilisent la mthode de Scatchard. Considrons le dosage dune solution dEGTA, tamponne pH = 6,8 , par une solution dions calcium suffisamment concentre pour que la dilution de la solution titre puisse tre nglige au cours du titrage. On dfinit la constante apparente de complexation K app = c(Ca EGTA) c c(Ca ) c( EGTA)

o c(Ca EGTA) reprsente la concentration de lion complexe, c(Ca ) la concentration de lion calcium libre et c( EGTA) la somme des concentrations de toutes les formes non complexes de lEGTA ( cette valeur de pH, lEGTA nest pas majoritairement sous sa forme complexante ttraionise. Des corrections permettent de dterminer par la suite la valeur de la constante relle de formation du complexe tudi). NB : c reprsente la concentration standard, dont la valeur est exactement gale 1 mol L1 . Elle est introduite pour des raisons dhomognit lies lexpression des activits en solution aqueuse. On ne cherchera donc pas prciser sous quelle(s) forme(s) se trouve lEGTA dans le milieu. 29. c(Ca EGTA) = f (c (Ca EGTA)) est une droite dont le coefficient c (Ca ) directeur permet daccder la valeur de la constante K app . Montrer que la courbe Les courbes suivantes sont obtenues lors du titrage de deux solutions dEGTA de concentrations molaires respectives c1 = 0,100 mmol L1 et c 2 = 0,200 mmol L1 . En dduire la valeur de la constante K app de formation du complexe dans les conditions donnes.

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V. Cintique de formation du complexe Ca-EGTA

La vitesse de formation de ces complexes est trs leve et doit tre tudie par des mthodes de cintique rapide, permettant des mlanges quasi instantans (mthode de flux stopp). Ltude est ralise par spectrophotomtrie, en prsence de ttramthylmurexide TM. La formation du complexe CaTM est instantane et ltude de labsorbance du milieu permet daccder la concentration instantane des ions calcium par une mthode que nous ntudions pas ici. Deux solutions sont mlanges dans le dispositif, de faon obtenir en une dure trs courte un mlange homogne, tamponn, dions calcium, dindicateur color TM et dEGTA. Ce dernier est introduit en excs. 31. En supposant que la raction de formation du complexe Ca EGTA est un acte lmentaire de constante de vitesse k1 , exprimer la vitesse de disparition des ions calcium en fonction des concentrations en EGTA et en ions Ca 2+ . La concentration initiale en EGTA note cG dans le mlange est environ 10 fois plus grande que la concentration initiale en ions calcium. En dduire lexpression de la concentration en ions calcium en fonction du temps. La concentration en ions calcium est mesure au bout du temps de demi-raction not . crire la relation liant , la concentration cG et la constante de vitesse de la raction. En ralit, il faut tenir compte du temps mort not t d ncessaire au mlange des ractifs. Le temps de demi-raction est en fait augment de cette valeur et la mesure relle est = t d . La courbe ln 2 / cG = f () est reprsente ci-aprs. En dduire la valeur de la constante k1 , ainsi que la valeur de t d . On a en fait nglig la vitesse de destruction du complexe en ses lments constitutifs. Compte tenu de la valeur de K app dtermine dans la partie prcdente, et en supposant que la dcomplexation est aussi une tape lmentaire, donner une estimation de la constante de vitesse de dcomplexation k 1 . Lapproximation faite tait-elle raisonnable ?

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