MALADIES VIRALES

2 C.I Dr. Dorsaf Ben Ahmed

Dure:10 h
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Plan du cours
1. Rappel sur les virus phytopathognes; 2. Mthodes de lutte;

3. Maladies virales des crales et des lgumineuses; 4. Maladies virales des arbres fruitiers et des cultures marachres.
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INTRODUCTION

Incidences Economiques des virus

Dprciation de la qualit des produits rcolts ainsi que des baisses de rendement; Avortement des bourgeons et des boutons floraux (pollen strile de 30 40 % des plantes ligneuses); En Tunisie, en moyenne 13 15T/ha dagrumes sont perdus cause des virus;

Certaines souches virulentes (Virus Y de la pomme de terre ) anantissent compltement la rcolte.

Dfinition et caractristiques gnrales dun virus

Parasites intra-cellulaires obligatoires qui ne se multiplient que dans les cellules vivantes; Un seul type dacides nucliques (ADN: Acide Dsoxyribonuclique ou ARN: Acide Ribonuclique); Particules ultra-microscopiques (20 300nm); Sa multiplication est assure par la rplication de lacide nuclique au moment de linfection;
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Structure des virus

Une particule virale est compose de: Acide nuclique (ADN ou ARN) base de linformation gntique; Capside: a une structure protique qui assure la protection de lacide nuclique

Capside + gnome = nuclocapside

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 La capside confre une grand stabilit chimique et une forte rsistance mcanique aux particules virales; La structure de la capside entrane la forme du virus, ce qui permet de distinguer 3 organisations symtriques: Hlicodale, filamenteux ou en batonnets Cubique ou icosadrique Complexe
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 Virus en batonnet, 300 nm de longueur exemple: TMV.

Virus sphrique: la mosaque de la tomate

Nomenclature des virus

La nomenclature des virus nobit pas au systme binomial de la classification internationale des micro-organismes. Il faut suivre trois rgles: 1. Inclure le nom de la plante hte sur laquelle il a t dcrits pour la premire fois 2. Inclure le symptme spcifique induit par le virus sur les plantes quil attaque. 3. Ajouter le terme V c..d Virus pour avoir le nom complet compos de 3 mots
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Exemples: Virus de la Mosaque du Tabac: TMV Le nom des virus sont souvent prsents par un script reprsentant les initiaux du nom commun du virus en anglais Tobacco Mosaic Virus Exceptions: PVX; PVY; PVS; PVM; PVA. TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus
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Classification des virus

Rgne Division Sous Division Famille Groupes
Monocatnaire

Virus ADN Vira Virus ARN

Bicatnaire Monocatnaire

Bicatnaire

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 Les familles renfermes plusieurs sous familles et ces sous familles renferment des groupes. Il existe une vingtaine de groupes de virus phytopathognes Un groupe renferme des virus ayant des proprits physico-chimiques, biochimiques, gntiques, morphologiques et biologiques semblables. Chaque groupe renferme un membre type ou chef de groupe qui nest quun virus reprsentatif du groupe. Actuellement seulement 920 phytovirus sont dcrits dont 92 genres et 16 familles.

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Exemples de groupes de virus

Les Poty-virus (PVY): - virus ARN monocatnaire
- filamenteux - transmis par puceron.

Les Tobamo-virus (TMV):-ARN monocatraire

champignons - En batonnet - Transmis par semences,

Les Rabdho-virus (AMV): - virus ARN monocatnaire

- bacilliforme - transmis par puceron.

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TRANSMISSION DES VIRUS

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La transmission verticale: La transmission verticale correspond la transmission du virus la descendance d'une plante infecte; Tous les organes de propagation tel que les boutures, les greffons, les bulbes et les tubercules prlevs sur une plante mre virose seront infects, La transmission horizontale La paroi pecto-cellulosique du vgtal est une barrire infranchissable par le virus cest pourquoi il y a intervention dun troisime facteur appel vecteur (insectes, champignons, nmatodes).
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La transmission mcanique
La multiplication vgtative (greffage, bouturage, marcottage, bulbe, tubercule, clat de souche ). 10% des virus connus sont transmis par les semences (108 virus). Dans le cas ou le virus infecte les tguments de la graine (localisation exogne) la plantule qui en rsulte sera saine. Cas du TMV Tobacco Mosaic Virus. En cas dinfection embryonnaire le virus passe automatiquement la jeune plantule. (Cas du Pea Sead born Mosaic Virus PSbMV).
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La transmission mcanique
Lors des oprations culturales (taille, bourgeonnage, prlvement de bouture, cueillette), lHomme peut contaminer ses mains, ses vtements ou ses outils non dsinfects par des virus et effectuer une transmission involontaire dune plante une autre.

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Transmission mcanique

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Transmission par vecteur

Un vecteur est un organisme biologique mobile qui est capable dacqurir et dinoculer les particules virales des cellules vivantes. Les principales tapes de la transmission: 1. La priode dacquisition: cest le temps ncessaire au vecteur pour acqurir un virus dune plante infecte. 2. La priode de latence: correspond au laps de temps entre lacquisition du virus et le moment o il pourra le transmettre; 3. La priode dinoculation: cest le temps ncessaire au vecteur de transmettre le virus la plante saine; 4. La priode de rtention: cest la priode pendant laquelle le vecteur demeure capable de transmettre un virus c..d porteur du virus. 19

Transmission par les nmatodes

Les nmatodes sont munis de stylets leur permettant datteindre les tissus conducteurs de la plante pour se nourrir.

Trois genres de nmatodes sont vecteurs de virus: Longidorus, Xiphenema et Trichodorus. Exemple: TRSV (virus de la tache annulaire du tabac).
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Transmission par les champignons

Seuls les champignons parasites obligatoires qui transmettent les virus; Appartiennent aux phylums des Plasmodiophoromycota (Pythium) et au Chytridiomycota (Olpidium, Polymyxa, Spongospora); Lactivit vectrice est assure par le stade zoospore mobile;

Une vingtaine de virus sont transmis par les champignons dont le virus de la ncrose du tabac (TNV) qui est transmis par Olpidium brassicae.
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Transmission par les insectes

Environ 99 % des virus sont transmis par les insectes. Pucerons (Aphidide) Cicadelles (Delphacides) Aleurodes (Bemisia, Trialeurodes) Thrips (Tingides)

Insectes piqueurs suceurs

- Coloptres (Chrysomlides, Coccinelle phytophage)

Insectes broyeurs

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Les pucerons
Plus que 160 espces de puceron sont capables de transmettre les virus. Le primtre de dispersion est de 100 150 km ou plus avec laide du vent. Modalits de transmission: * Les virus non circulants ou non persistants * Les virus semi-persistants * Les virus circulants ou persistants
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Les virus non circulant ou non persistant

Les virus non circulant ou non persistant, les virus sont acquis et transmis rapidement (absence de priode de latence); Le puceron ralise plusieurs piqres dessai avant de sinstaller sur une plante, favorisant ainsi la dissmination du virus dune plante lautre. Les piqres d'essai des pucerons durent quelques secondes 1 minute puis il y a passage une autre plante; Exemple: le virus Y de la pomme de terre (PVY).
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Les virus circulants ou persistant

Les virus circulant ou persistant, passent par une circulation du virus dans le corps de linsecte. La priode dacquisition et dinoculation sont assez longues durent de 10 min quelques heures. Les pucerons restent virulifres plusieurs jours et parfois toute leur vie.

Dans le cas o le virus est capable de se rpliquer au sein de linsecte (on parle de virus circulant propagatif). Exemple: Barley Yellow Dwarf Virus (BYDV) jaunisse nanisante de lorge.
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Transmission persistante

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1. Les Cicadelles: les Rhabdovirus et les Geminivirus Exemple: Virus de lenroulement des feuilles de pomme de terre (PLRV) - Transmission selon le mode circulant propagatif.
-Transmettent

2. Les Aleurodes ou mouches blanches: - Transmettent les Clostrovirus et les Geminivirus (111 espces de virus). Exemple: Virus de la feuille jaune enroule de la tomate (TYLC).
-Trois espces daleurodes sont vectrices de virus dont Bemisia tabaci est la plus efficace sous abri. - Le mode de transmission est persistant semi27 persistant.

3. Les Thrips: Transmettent les Tospovirus selon un mode de transmission persistant. Exemple: Frankinella occidentalis vecteur de Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV). Virus de quarantaine en Tunisie. 4. Les Coloptres: Sont des chrysomlids, coccinelle phytophage et les charanons Ils transmettent des virus appartenant aux genres
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Tymovirus, Comovirus et Sobemovirus.

Processus dinfection
1. L'infection se fait la suite de la rupture de la paroi vgtale. Facilit par un vecteur (insecte, arthropode, nmatode, champignon). 2. L'ARN ou lADN gnomique est dcapsid dans le cytoplasme de la cellule hte: Dcapsidation. 3. La nucloprotine virale (ARNg) est transcrit en (ARNm) grce lARN polymrase synthtise de nouveaux ARNg est sera traduit au niveau des ribosomes de la cellule hte pour donner la protine de la capside. LARNg est de nouveau encapsids, et les virus no-forms vont infecter d'autres cellules.
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Cintique du virus dans la cellule parasite

Protines de mouvement MP
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Cintique du virus dans la plante hte

Les phytovirus envahissent leur hte par les connexions cytoplasmiques reliant les cellules et traversant les parois vgtales: plasmodesmes une vitesse de 1mm ou 8-10 cellules/jour.

Les phytovirus synthtisent des protines de mouvement (MP) qui sont responsables de la migration du virus vers les cellules voisines. L'infection systmique s'effectue ensuite par l'intermdiaire du systme vasculaire.

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SYMPTOMATOLOGIE

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Introduction
La multiplication des particules virales provoque des perturbations mtaboliques conduisant l'extriorisation de symptmes varis et qui sont caractristiques de lagent infectieux.

Les symptmes varient en fonction du virus, de l'tat physiologique de l'espce atteinte et de l'environnement dans lequel se trouve la plante. Certains cas dinfection virale ne sont pas accompagns de lapparition de symptmes: virus latent on parle de porteur sain.
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Les symptmes foliaires

Les mosaques:
Il sagit dune rpartition anormale des pigments chlorophylliens, associe souvent une altration de la structure des chloroplastes. Les mosaques typiques sont verts clair ou jaunes. Exemple typique: Tobacco mosaic virus Tobamovirus (TMV).

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Autres cas de mosaques

Tches diffuses et discrtes: marbrure (Mottle); Exemple: Virus de la marbrure du fraisier (SMV).

Systemic

on Nicotiana glutinosa, 14 days after inoculation with PVY.

mottle

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Ring Spot
Tches en anneaux simples ou concentriques (Ring Spot). Exemple: Virus de la tche annulaire de la tomate TomRSV.

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 Coloration plus intense le long des nervures: Mosaque des nervures (Vein banding) et si la coloration est plus claire: il sagit de vein clearing.

Vein clearing
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Vein banding
Mosaque des nervures sur melon infect par le SqMV.

 Le nanisme et les malformations:

Le virus entraine une dviation du mtabolisme de la plante baisse de la vigueur et un retard de croissance (petite feuille, entre-nud court, fruits de petite taille) Baisse de rendement.
Nanisme ou rabougrissement. Exemple: Virus de la jaunisse nanisante de lorge (BYDV).

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 Des malformations spectaculaires peuvent tre observes sur feuilles ou fruits. Tel que: Boursouflures, cloques, gaufrage du limbe.
Malformations des aubergines

bushy stunt virus

Certains virus entraine des excroissances au niveau des nervures de la face infrieure des feuilles: Enations.

Exemple: Virus de la mosaque nation du pois Pea enation mosaic virus (PEMV).
Enations on leaf of systemically infected Metilotus indica
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Les symptmes corticaux

Lcorce fendill: Les fentes niveau de lcorce peuvent tre sches pour devenir spongieuses et fragiles ou gommeuses. Lcaillement de lcorce: Cest un caillement pidermique de lcorce. Lpiderme se dtache et tombe; Exemple: la psorose cailleuse des agrumes Citrus psorosis virus (CPV). Ecorce rugueux: Il sagit dune mauvaise lignification des branches do le bois reste souple et parfois un aplatissement des branches.
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Lorsquon ne sait pas ce quon cherche, il est difficile de trouver

Diagnostic

Sa

Lut,,

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 Sachant que les phytovirus sont des parasites obligatoires qui ne peuvent pas tre cultivs sur milieu de culture artificiel (in vitro).

Cependant les phytovirus jouissent de proprits particulires de nature biologique, physico-chimiques ou antigniques qui permettent leurs identification au laboratoire.
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Postulat de Koch
1. Le pathogne (virus) souponn doit tre associ aux mme symptmes dans toutes les plantes malades; 2. Le virus doit tre purifi de la plante malade, inocul artificiellement une plante hte sensible et les symptmes sont notes. 3. Le virus purifi doit tre rinocul des plantes saines de la mme espce sur laquelle la maladie est apparue; et doit induire les mme symptmes dcrites au dpart. 4. Le virus doit tre inocul la mme plante hte sensible dans la 2me tape et lensemble des caractristiques doivent tre exactement les mmes observs initialement la 2me tape.
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2.Les techniques de diagnostic

2.1. Diagnostic visuel - Base sur lobservation des symptmes et se pratique deux fois/an; - Au printemps, quand la plante est en pleine vgtation et que la temprature nest pas trop forte pour masquer les symptmes foliaires. - En t, pour les virus qui se manifestent sur les fruits par des dformations, dcolorations, tches annulaires Le diagnostic visuel reste un moyen limit dans le temps et dans lespace et nest justifi quen cas de souche virulente.
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2.Les techniques de diagnostic

2.2. Diagnostic biologique Chaque virus a une gamme dhtes quil est capable dinfecter. Les plantes indicatrices ou htes diffrentiels sont des espces cultives ou sauvages. Dveloppent des ractions particulires (lsions locales, symptmes gnraliss) qui peuvent tre caractristiques dun virus donn. La transmission exprimentale dun virus des plantes indicatrices=Indexage biologique est bas sur les proprits infectieuses du virus. Il y a deux techniques de diagnostic biologique:
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Diagnostic biologique
Diagnostic sur indicateur ligneux - Les plantes indicatrices ligneuses doivent tre jeunes et croissance rapide; - La technique dinoculation artificielle est le greffage dune partie de lcorce, qui peut rvler labsence ou la prsence dinfection chez les plantes infectes. Diagnostic sur indicateur herbac - Cette technique permet de rvler la prsence du virus dans un temps court de 7 15 jours aprs inoculation.

- La russite de cette mthode dpend des facteurs biologiques, physiques et chimiques.

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- Les techniques dinoculation: o Linoculation mcanique est la plus utilise pour les indicateurs herbacs; - Les plantes tests les plus universelles sont des Chnopodes: Chenopodium quinoa et C. clevelandii ou les Nicotiana benthamiana et N. clevelandii au stade 4-6 feuilles.
o Linoculation par vecteur: - Concerne les virus non transmissibles mcaniquement. - Les vecteurs sont des insectes sains (pucerons, cicadelles, aleurodes ) qui sont maintenus en levage sous des conditions contrls au laboratoire.

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le diagnostic Srologique
Repose sur la raction de deux types de protines: 1. Lantigne: cest une molcule trangre lorganisme et qui est susceptible de dclencher une raction immunitaire chez lanimal cas de protines virales. 2. Lanticorps: Protines spcifiques du groupe des Immunoglobulines (Ig) de cet antigne labores dans les srums sanguins dun animal en rponse de linjection de lantigne. Laffinit antigne/anticorps se base sur des liaisons hydrognes et des forces lectrostatiques.
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Principe de la production dantisrum polyclonaux

1. 2. Injection intramusculaire de virus ou de protines virales purifis (0.1 1 mg); Des injections de rappel sont ralises dans un espacement de 1 2 semaines (priode de suivit de 1 mois). Des prises de sang rgulires sont ralises pour valuer le niveau des anticorps spcifiques. Les prises de sang sont raliss par des ponctions cardiaques ou partir des veines de loreille de lanimal. La sparation du srum est effectue la suite de centrifugation pendant 15 min 1500 rpm. Le srum est additionn dun volume de glycrol puis est maintenue en conservation -20C.

3.

4.
5.
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Lantisrum obtenu est dit polyclonal vu la diversit des anticorps dvelopps contre les divers dterminants antigniques prsents sur les particules virales ou les protines virales. Inconvnients: Les anticorps polyclonaux sont produits en faible volume, avec des performances variables dune prise de sang une autre et dun lapin un autre. Principe de la production dantisrum monoclonaux Les antisrum monoclonaux sont produits chez la souris et ne contiennent quun seul type danticorps correspondant une seule protine virale.

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Quelques techniques danalyse srologique

Immuno-prcipitation: Cette technique peut tre conduite en milieu liquide sur lame de verre ou en tube Hmolyse. Elle est base sur laffinit antigne/anticorps qui se traduit par une prcipitation visible lil nu ou au microscope optique. Consiste apporter un certains volume de jus clarifi partir des plantes tester et une quantit dantisrum et laisser incuber dans un bain marie la temprature adquate. Le prcipit se forme au fond du tube ou la partie mdiane en cas de plante malade. Avantages/Inconvnients: Mthode rapide la prcipitation se fait en quelques minutes; Peu sensible vu que lexcs dantigne ou danticorps empche la visibilit de la prcipitation.
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Quelques techniques danalyse srologique

Immuno-prcipitation: Cette technique peut tre conduite en milieu liquide sur lame de verre ou en tube Hmolyse. Elle est base sur laffinit antigne/anticorps qui se traduit par une prcipitation visible lil nu ou au microscope optique. Consiste apporter un certains volume de jus clarifi partir des plantes tester et une quantit dantisrum et laisser incuber dans un bain marie la temprature adquate. Le prcipit se forme au fond du tube ou la partie mdiane en cas de plante malade. Avantages/Inconvnients: Mthode rapide la prcipitation se fait en quelques minutes; Peu sensible vu que lexcs dantigne ou danticorps empche la visibilit de la prcipitation.
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Quelques techniques danalyse srologique

Immuno-diffusion radiale: Cette techniques est ralise dans un milieu glos (boite de ptri contenant 1 2 mm dagar) o les ractifs diffusent partir de puits dans lesquels ils sont dposs. Le srum est dpos dans le puits central et les diffrents antignes dans les puits la priphrie. La rencontre antigne/anticorps aboutit la formation darc de prcipitation de couleur blanche.

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Immuno-diffusion radiale

Eperon

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Diffrents cas se prsentent

La formation dun peron indique une identit partielle entre les antignes 1 et 2 (cas N 1). La formation dun arc continue indique une identit complte entre les antignes 1 et 2 (cas N 2).

La formation dun croisement entre les arcs indique labsence didentit entre les antignes 1 et 2 (cas N 3). 55

Limites de lImmuno-diffusion radiale

Cette technique ne permet pas de dtecter les virus peu concentrs dans les extraits de plantes. La sensibilit peut aller de 1 20 ug/ml Ncessite des quantits importantes de srums brut Assez couteuse.

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Quelques techniques danalyse srologique

Technique ELISA (Enzyme ImmunoSorbent Assay) Linked

Principe: Le couple anticorps/antigne est rvl grce l'action d'une enzyme (la Phosphatase alcaline) couple aux anticorps qui en contact avec son substrat ajout donne une coloration jaune.
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Etapes de la technique ELISA simple

Addition de lanticorps marqu e e e Addition du substrat de lenzyme

e e

Coloration en jaune
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Double Antibody Sandwitch (DAS- ELISA)

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Matriel utilis
Plaque ELISA polystyrne 8/12 puits

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Incubateur de plaque

Spectrophotomtre

Diagnostic au microscope lectronique

Le microscope lectronique a t conu lors des annes 1930 (Ernst Ruska); Le microscope lectronique transmission Transmission Electron Microscope (TEM) gnre un faisceau dlectrons qui est dirig sur un chantillon quil traverse pour en rvler limage sur un cran. Le principe de Dip method: il sagit de dposer une goutte dextrait brut sur une membrane dpose sur la grille du microscope + une goutte de contrastant Actate duranyle. Les particules virales apparaissent en clair sur un fond sombre.
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Diagnostic au microscope lectronique

Morphologie des virus Dtection des virus dans les tissus du vgtal.
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2.5. Diagnostic molculaire

Bas sur la connaissance des squences du gnome viral (ADN ou ARN). Hybridation molculaire (Dot Blot): Dnaturation dextrait de plante la suite dune exposition une temprature de 94C. Dpt de gouttes des chantillons tester (4-50ul) sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon qui sera fix la lumire U.V. Hybridation par une sonde radioactive (marque au 32P) ou bien une sonde froide (marque la biotine ou Actyl-aminofluorne). Lintensit des spots indique la teneur en agent viral rechercher.
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Hybridation molculaire (Dot Blot)

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2.5. Diagnostic molculaire

Amplification molculaire PCR: Polymrase Chain Reaction

La PCR permet de recopier de manire exponentielle une squence nuclotidique ( ADN viral) en un trs grand nombre de fois. La raction a lieu dans un tube PCR, en additionnant lADN viral la Taq Polymrase, un couple damorce spcifique et les dNTP( A,T, C et G).
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Thermocycleur

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Migration du produit PCR sur gel dagarose

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