Papel del polimorfismo genético del citocromo

P450 2C8 y el desacoplamiento de la

epoxigenasa en la remodelación periodontal
que afecta el tratamiento de ortodoncia

Leidy Vanessa Neira D.

GENÈTICA CRANEOFACIAL
INSTITUCIÓN UNIVERSITARIA COLEGIOS DE COLOMBIA
UNICOC
Yamoune S, Wintz K, Niederau C, Craveiro RB, Wolf M, Stingl J. Role of cytochrome P450 2C8 genetic polymorphism and epoxygenase uncoupling in periodontal remodelling affecting orthodontic treatment. Basic
Clin Pharmacol Toxicol. 2022;130(1):132-140. doi:10.1111/bcpt.13681
Citocromo P450 (CYP)

• Hierro
• Flavoproteica → electrones de NADPH

• CYP son proteínas asociadas a la membrana citoplasmática,

mitocondrial y al retículo endoplasmático.

• Funciona como transportadora de electrones

 Citocromo P450 (CYP)
SUBFAMILIA

CYP2C8
FAMILIA ISOENZIMA 1

• 200 Enzimas.
18
• Se encarga de metabolizar medicamentos. familias

3 2
Actúan mucho → Disminuyen la eficacia del medicamento.
Inhiben → Generan Acumulación del medicamento
INTRODUCCIÒN
Condiciones
orales y
periodontales

PERFILES
DE
RIESGO

Condiciones
Terapia con
medicas
medicamentos
complejas
Gen CYP2C8 ↔ OSTEONECROSIS MANDIBULAR
RELACIONADA CON BIFOSFONATOS
Polimorfismo genético que conduce a un
fenotipo de metabolismo lento de los fármacos
y sustratos endógenos

Fibroblastos
del LP

Oxidativo
Estrés
• Proliferación
BIFOSFONATOS • Migración
Polimorfismos Farmacogenicos → metabolizan Monoxigenasas
de P450

EET: Epoxieicosatrienoico
HETE: Hidroxieicosatetraenoico

CYP2C8 : En el tejido Periodontal, puede

mediar la respuesta antiinflamatoria por
estrés oxidativo.
 Actividad enzimática de CYP2C8
Causadas por

Polimorfismo genético Inhibición Inducción de enzimas

Variabilidad en
función de

Metabolismo del AA Inflamación

Vulnerabilidad a la Vulnerabilidad al daño

Remodelación periodontal
mandibular
 VARIANTES ALELICAS DE CYP2C8

CYP2C8*2 REACCION 2ria DESFAVORABLE CYP2C8*3

Liberación de especies reactivas de Aumento = Mayor

respuesta
oxigeno (ROS)
inflamatoria

Peróxido de
Superóxido
Hidrógeno

Productos
secundarios
tóxicos
OBJETIVO

● Dilucidar el mecanismo patológico putativo que explica la asociación entre el

polimorfismo genético con los alelos CYP2C8*2 y CYP2C8*3 afectando la actividad de
CYP2C8 y el riesgo de desacoplamiento de reacción con la liberación de especies
reactivas de oxigeno sin completar la oxidación del sustrato.

● Evaluación del efecto del tratamiento con bifosfonatos tanto en fibroblastos

periodontales cultivados en pacientes sometidos a tratamientos de ortodoncia, como en
enzimas CYP2C8 aisladas que expresan los alelos de perdida de función CYP2C8*2 y
CYP2C8*3. estudiando los efectos sobre la formación de especies reactivas de oxigeno
(Ros) como marcador de estrés oxidativo.
MÈTODO CYP2C8, CYP2C8*2 Y CYP2C8*3
• Enzima de NADPH-CYP450-Oxidoreductase (POR) Recombinantes en Escherichia coli
= Plásmido que codifica el ADNc fue con un vector
pET-22b(+) desde la posición 2200 a la 150

• CYP2C8 se codifico con un vector pET-28a(+) desde

la posición 1650 a la 150.

• las células DH5α competentes se incubaron por 30

min y luego fueron transformadas por un • Se aplicaron 6 ciclos de sonicación de 30 seg cada
calentamiento constante de 15 seg 45 ºC, luego se uno con intervalos de descanso de 1 min.
transfirieron a glucosa añadida (SOC) y se cultivaron
en placas de agarosa con los respectivos marcadores • Centrifugado de lisado a 4000 gr a 4֯C durante 1
hora como resultado se obtuvo un extracto libre de
• Se cultivaron colonias individuales en medio de células que se uso para otras reacciones de
caldo de lisogenia (LB) biocatàlisis

• la expresión génica fue inducida por IPTG

• Las bacterias de lavaron y suspendieron en 50-mM

K2HPO4/KH2PO4 tapón (pH 7.5) y lisado por ultra
sonido a una amplitud de 60%
 Determinación de concentraciones de CYP450
recombinante mediante espectro de CO

• Se agrego CO a la solución de citocromo junto con unos granos de ditionito de sodio

• Se registra el espectro de absorción en un espectofotometro UV

• Mediante la ecuación se determino la concentración en la solución

EXPERIMENTOS DE CULTIVOS CELULARES IN VITRO.

LUGAMENTO PERIODONTAL (Hpcl)

CULTIVO DE CELULAS DEL
Sin caries
A partir de tc periodontal del tercio
medio radicular
Extraídos recientemente

Clinica Universitaria de
Aquisgran

Se incubo en condiciones
Cultivo en glucosa de media alta de estériles a 37ºC y 5 % CO₂
Eagle
(4.5g/ml) suplementada con suero
fetal bovino al 10 % 50 mg/L de
acido ascórbico El medio celular se cambio cada 2
días
GENOTIPADO

● Las PDL fueron separadas y se recolectaron durante 5 min a 300g suspendidas en

n 50-mM K2 HPO4/KH2PO4 buffer (pH 7.5)

● Recuento total de células, el ADN genòmico se aislo con QIAGEN®’s DNeasy®

Blood & Tissue Kit.

● Se determino el contenido el gADN y se aplico una reaccion en cadena de

polimeraza para aislar los genes que portan mutaciones potencialmente
puntuales que codifican para CYP2C8*2 y CYP2C8*3.

● Los cebadores fueron encargados a Alemania.

• rs11572103 (805 A > T) fue 5’ ACAACAAAGTGCTTAAAAA TGTTGC 3’ y 5’ GATCATTAAACATCCTTAGTAAAT TAC
3’

• rs10509681 (1196 A > G) los cebadores eran 5’ TTTT GTTACTTCCAGGGCACA 3’ y 5’GTTCTCTCT

TTCCTTTAAATACAAAT 3’

• rs11572080 (416 G > T) los cebadores fueron 5’ GCTGTGAATTCTCCCAGTTT 3’ y 5’ TCACCCACCCTTGGTTTTT 3’

• La presencia de rs10509681 y rs11572080 indico el alelo CYP2C8*3

• Solo rs11572103 indico CYP2C8*2

• El resultado de la PCR se separo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% a 100 V por 45 min
 BIOCATALISIS

• Se usaron extractos de células libres preparadas a partir de bacterias transformadas

con POR CYP2C8/CYP2C8*2/CYP2C8*3 cDNA o extractos de células libres del
ligamento periodontal en una reacción de 1-mM NADPH and 10-μM amodiaquina.

• Se incluyo acido araquidónico 70µm y acido zeledronico 50µg/ml

• La reacción se incubo a 37 ֯C y se detuvo mediante la adición de acetonitrilo enfriado

con hielo
Determinación de los valores Kₘ de unión de la amodiaquina a
CYP2C8

• Se uso CYP2C8 recombianate a una concentración final de 100 fmol/ml y se añadieron

concentraciones de sustrato entre 0,5 y 60 µM

• Se tomaron tiempos únicos por triplicado después de 0,30 y 60 min de incubación

• La reacción se detuvo con acetonitrilo al 100% y luego de la centrifugación

• El sobrenadante se seco yu se almaceno hasta las mediciones de HPLC-MS/MS

 PROPIEDADES ENZIMATICAS DE LA AMODIAQUINA
CYP2C8
•
N-DESETILACION
Las propiedades se determinaron mediante (HPLC-MS/MS).

• Para el posterior análisis por EM, la ionización se realizó por electrospray, seguida de una monitorización de reacción
seleccionada (SRM) utilizando parámetros específicos para amodiaquina y 'N-desetilamodiaquina determinados
previamente.

• Se determino que los iones precursores de desetilamodiaquina m/z 356 to m/z 283 for amodiaquina y m/z 328 to m/z 283
for N-desetilamodiaquina.

Curvas estándar de amodiaquina y N-

desetilamodiaquina. Curvas estándar de
amodiaquina y N- desetilamodiaquina
evaluada por Graph Pad 8 por PRISM
 Determinación de ROS mediante oxidación amplex roja a
resosufina

Validación del ensayo rojo amplex de la idoneidad de los medios, el fondo celular y la especificidad del ensayo. Los estándares de
peróxido de hidrógeno se diluyeron 1:2, comenzando con 10 μM en tres medios diferentes. (A) tampón de fosfato de potasio (KPB,
50 mM, pH 7,5), (B) DMEM con ácido ascórbico (DMEM + Asc, 0,5 mg/ml), (C) DMEM sin ácido ascórbico (DMEM Asc).

Se midió la emisión de resorufina. Se aplicó la regresión lineal y se comparó el coeficiente de determinación resultante.
DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco; corr: emisión corregida (emisión (x) misión [0 μM])
 RESULTADOS: Expresión extrahepática de CYP2C8 y actividad
funcional en fibroblastos periodontales.

Oxidación de sustrato y formación de ROS en células de fibroblastos PDL humanos.

Amodiaquina N-deetilación (A) y H2O2 concentraciones (B y C) en células PDL tratadas
con ácido araquidónico y ácido zoledrónico. Áreas pico % de N-desetilamodiaquina en
extractos de células del ligamento periodontal primario

(A). Los resultados se muestran con ±DS n =4 evaluados por Graph Pad 8 por PRISM.
Ctrl = control, ZOL = tratamiento con ácido zoledrónico 40 μg/ml, Aa = tratamiento con
ácido araquidónico 70 μM. `p<0.05 medidad de H ₂O₂ concentración después de 1.5 h de
incubación de células PDL con genotipo 416G > T/A en CYP2C8
B) Sin la variante
C) Mediante el ensayo de peroxidasa amplex red/horseradish se tuvo una DS ±3 ligamento periodontal primario (A).
Los resultados se muestran con ±DS n =4 evaluados por Graph Pad 8 por PRISM. Ctrl = control, ZOL = tratamiento
con ácido zoledrónico 40 μg/ml, Aa = tratamiento con ácido araquidónico 70 μM
 Papel de CYP2C8*2 y CYP2C8*3 variantes alélicas en la
producción de ROS en enzimas aisladas

(A) Medidas de H₂O₂ concentración durante un período de 3,5 h para CYP2C8

(B) CYP2C8*2
(C) CYP2C8*3
• La medida de la ±SD con n = 2. (D–F) H2O2 concentración duranre un periodo de 3.5 hr para CYP2C8 (D),
CYP2C8*2 (E) y CYP2C8*3 (F).

• ± SD con n = 3. Sin emparejar la prueba de datos individuales o calores de estos se realizaron con Graph Pad 8 by
PRISM. *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0001–0.0006. Ctrl = control, ZOL = treatment with 40-μg/ml acido
zeledronico, AQ = co.incubación con 10-μM amodiaquina, Aa = co-incubación de 10-μM acido araquidónico.
 A diferencia de la amodiaquina, la adición de ácido araquidónico al
ensayo amplex red no equilibró la eficiencia de desacoplamiento de
CYP2C8 y sus variantes, aunque el ácido araquidónico también es un
sustrato.

Para obtener más información sobre esta diferencia observada, se

realizó la cinética de Michaelis-Menten utilizando amodiaquina. El
experimento Kₘmde amodiaquina se determinó en 3,1 μM, similar al
trabajo publicado sobre amodiaquina y CYP2C8 en microsomas
hepáticos humanos.

Determinación de amodiaquina y araquidónico afinidad de unión. CYP2C8 Michaelis-Menten cinética de amodiaquina o ácido
araquidónico.
Determinación de CYP2C8: afinidad de unión a amodiaquina a través de la cinética de Michaelis-Menten. Las concentraciones de
sustrato oscilaron entre 0,5 y 60 μM.
La reacción se detuvo mediante la adición de acetonitrilo helado después de 0, 30 y 60 minutos de incubación a 37 ֯C. SD media co ne
=3 AQ = coincubación con amodiaquina. Velocidad en función de las concentraciones de sustrato.
Se aplicó un ajuste de regresión no lineal para obtener K ₘ valores de 3,1 μM para amodiaquina. El análisis de datos se realizó en
Graph Pad 8 por PRISM D
 CONCLUSION

• Se identifico un papel funcional potencial de CYP2C8 en los fibroblastos periodontales

con actividad enzimática tanto en el metabolismo del sustrato como en la formación de
ROS.

• En ciertos alelos de riesgo farmacogenético (CYP2C8*3), El tratamiento con

bisfosfonatos puede mejorar la formación local de ROS en los fibroblastos
periodontales y, por lo tanto, afectar el tratamiento de ortodoncia y la remodelación.

• Los riesgos del paciente pueden verse afectados por ambos, elCYP2C8*3 perfil
farmacogenético y por las interacciones farmacológicas de CYP2C8, que deben
explorarse en estudios futuros que evalúen el perfil farmacogenético junto con la
evaluación de medicamentos sobre las interacciones de CYP2C8.

Yamoune S, Wintz K, Niederau C, Craveiro RB, Wolf M, Stingl J. Role of cytochrome P450 2C8 genetic polymorphism and epoxygenase uncoupling in periodontal remodelling affecting orthodontic
treatment. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2022;130(1):132-140. doi:10.1111/bcpt.13681