HPLC

CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento)
CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS
CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS (HPLC)
SISTEMA DE SUMINISTRO DE LA FASE MÓVIL
Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas,

de modo que se evite la contaminación y la degradación de la misma.
BOMBA CUATERNARIA
• Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.

• Mantener un flujo libre de pulsos
• Proporcionar caudales constantes y reproducibles
• Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido
• Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión
Antiguamente el análisis era llevado a

cabo por el flujo gravitacional de la fase
móvil, lo que requería varias horas. Los
sistemas se llamaban “cromatografía de
baja presión” .
BOMBA CUATERNARIA
Es una bombas recíprocas, que consisten en una pequeña cámara en la que el disolvente
es impulsado por el movimiento de vaivén de un pistones de zafiro accionados por un motor.
Las entrada y salida del disolvente se regula mediante dos válvulas antiretorno que se
abren y cierran alternativamente, permitendo el paso de fluido en un solo sentido.
Inyector
Columna
Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se
emplean columnas construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de
ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10
mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior del
tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente existen columnas
de mayor eficacia y dimensiones más reducidas, con un consumo mínimo de
disolvente (lo cual abarata considerablemente el proceso).
Relleno de la columna
• Debe ser químicamente inerte, mecánicamente resistente y poseer un tamaño de

partícula bien definido.
• Habitualmente está formado por partículas esféricas microporosas de sílice muy

puro, que son permeables al disolvente y presentan una elevada área superficial
(no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor que 8).
• También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito

poroso o materiales poliméricos (como estireno-divinilbenceno).
El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o,
convenientemente tratado, puede intervenir directamente en el proceso de
separación
Horno de la columna
En algunas ocasiones se obtienen mejores

resultados calentando la columna, ya que:
• la viscosidad del disolvente disminuye

(se consigue un mayor caudal o se
reduce la presión requerida) y se
acortan los tiempos de retención.
Sin embargo, un aumento de la temperatura

también puede degradar la fase estacionaria
y reducir el tiempo de vida de la columna, por
lo que se deben emplear hornos que
controlen la temperatura de una manera muy
precisa (de décimas de grado).
DETECTORES
 Se elige en función de las propiedades del analito
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos
no hay detectores universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD.
Características que debe tener el detector:
• sensibilidad
• estabilidad
• reproducibilidad
• respuesta lineal
• tiempo de respuesta corto
• fácil manejo
• No destructivo
• Ruido despreciable de la línea base
• Respuesta independiente de la composición de la fase móvil
DETECTORES
• Detector de Absorción UV-Visible
• Detector de Absorción Infrarroja
• Detector de Fluorescencia
• Detector de Índice de Refracción
• Detector de Dispersión de luz
• Detector electroquímico
• Detector de Conductividad
Detector Ultravioleta
Fotodetector
Plano focal
Celda de flujo
abertura
Rejilla de difracción
Lámpara de Hg móvil
abertura
Detector Ultravioleta
El espectrofotómetro Ultravioleta utilizado como detector genera un
espectro de Absorción UV para cada compuesto analizado.
Cromatograma
Elución en fase normal y en fase inversa
Fase normal
Fase inversa
Solventes comunes en Cromatografía de líquidos
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS (HPLC)

Elución isocrática y elución con gradiente

Elución isocrática y elución con gradiente
• ISOCRÁTICA:
Como fase móvil se usa un solvente de composición constante.
• GRADIENTE:
Como fase móvil se usan dos o más solventes de polaridad distinta cuya relación
cambia a lo largo de la elución cromatográfica. Esto para mejorar la separación.

La fase móvil debe estar filtrada y degasificada
Métodos para degasificarla

Aplicaciones
• Ambientales
• Alimentos
• Farmaceuticos
• Bioanalíticos
• Proteínas
• Hidrocarburos pesados
• Extractos de plantas
• Contaminantes
• Plaguicidas
• Drogas
• etc

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CROMATOGRAFÍA DE

SISTEMA DE SUMINISTRO DE LA FASE MÓVIL

Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas,

• Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.

Antiguamente el análisis era llevado a

• Debe ser químicamente inerte, mecánicamente resistente y poseer un tamaño de

• Habitualmente está formado por partículas esféricas microporosas de sílice muy

• También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito

En algunas ocasiones se obtienen mejores

• la viscosidad del disolvente disminuye

Sin embargo, un aumento de la temperatura

 Se elige en función de las propiedades del analito

A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos

Características que debe tener el detector:

• Detector de Absorción UV-Visible

• Detector de Absorción Infrarroja

• Detector de Índice de Refracción

• Detector de Dispersión de luz

Elución en fase normal y en fase inversa

Elución isocrática y elución con gradiente

Elución isocrática y elución con gradiente

Elución en fase normal y en fase inversa

La fase móvil debe estar filtrada y degasificada

Métodos para degasificarla

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