GUIÓ

N 1
 Bacteriófagos
Los bacteriófago o fagos son virus de ARN o DNA que
infectan solo a bacterias
Por sí mismo, un fago no puede replicarse ya que requiere de
una célula bacteriana, por lo que se puede decir que son
parásitos bacterianos obligados.
Los bacteriófagos utilizan el sistema de síntesis de proteínas,
los aminoácidos y los sistemas generadores de energía de la
célula huésped.
Y estos los podemos encontrar de diferente tamaño,
morfología y composición como veremos más adelante
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Historia Abundancia
 En 1913, el bacteriólogo británico Abundancia
Los bacteriófagos son ubicuos es
Frederick Twort descubrió un agente
decir están en todas partes
bacteriolítico que infectaba y mataba a
las bacterias, pero no fue capaz de saber Como sabemos los fagos
qué era exactamente dicho agente requieren bacterias para su
 En 1917 el microbiólogo canadiense Félix replicación por lo que se puede
d’Herelle anuncio su descubrimiento de inferir que su abundancia y
“un microorganismo invisible que distribución se basen en las de sus
antagonizaba al bacilo de la disentería”, organismos huéspedes y la
al cual llamó bacteriófago. mayoría de las bacterias se
encuentran en el océano abierto,
 En 20’s y 30’s, d’Herelle y otros
investigadores, usaron inicialmente la Clasificación
el suelo y los sedimentos
oceánicos, y las subsuperficies
fago terapia; para el tratamiento de
terrestres
infecciones por Streptococcus y por
coliformes; Por ejemplo, se ha estimado que
existen 10 a10 fagos/ litro de agua
de mar,

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CLASIFICACIÓN:
SEGÚN SU ÁCIDO NUCLEICO
Todo se describe por sí mismo en la diapositiva. Notas clave:

• Myoviridae Es el género de vbacteriófagos más conocido, al contener a la mayoría de virus tipo para
su studio.
• Corticoviridae solo posee una especie, al Virus de Pseudoalteromonas PM2. Virus icosahédrico con
membrana interna.
• Finnlakeviridae: Solo contiene una especie, al virus de Flavobacterium FLiP. También es un virus
icosahédrico de membrana interna.
• phiX174 : Especie tipo de Microviridae. Colifago. Fue el primer genoma de DNA en ser
secuenciado.
• MS2: Miembro de Levivirus. Colifago
• Phi6: Virófago de Pseudomonas syringae Φ6

Bacteriófago
MS2

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CLASIFICACIÓN:
SEGÚN SU ESTRUCTURA
Lo mismo que en la anterior

• QB: Fago de enterobaacterias con Pili F (Principalmente E coli)

Qβ

Campbell, A. (1993). Bacteriophages. En Annual Review of Genetics. ° Ed. Annual Reviews.EUA. 5

CLASIFICACIÓN SEGÚN SU ESTRUCTURA:
BACTERIÓFAGOS CON COLA
Cápside: Estructura que almacena el DNA. Compuesta de proteínas ensambladas alrededor del DNA viral.
Cola: Tubo hueco proteico por donde el DNA es liberado a la célula.
Cuello: Estructura que une a la cola y a la cápside.
Placa basal: Contiene el punto de pasaje para el DNA.
Fibras cortas terminals: Permiten la fijación del fago a la membrana tras la adsorción
Fibras largas terminales: Contienen iones Fe que le permiten mantenerse en la me,brana, y su estructura les porta un cierto
grado de motricidad limitada. Esta motricidad le permite buscar ligandos en la superficie de membrana, a los cuales los
receptores de la fibra terminal se unen.
Fibras cortas terminales: Permiten fijar al bacteriófago a la superficie celular.

Replicación:
Bateriófagos con cola no contráctil: Buscan ligandos en porinas bacterianas. Al interactuar, se inducen cambios conformacionales
que permiten la libre diseminación del DNA al interior bacteriano a través de la porina.

Bacteriófagos de cola contráctil: Dentro del cuello poseen un tubo menor hueco con lisozimas terminales. Al adsorberse, se
inducen cambios en las fibras terminales que impulsan la fijación a la membrana y empujan el tubo al interior como una jeringa.
Las lisozimas rompen la pared y abren el paso al DNA bacteriano.
CICLOS DE REPLICACIÓN:
Adsorción y penetración Salida del profago del
DNA cromosoma bacteriano

Profago

Replicación del profago

Ciclo lítico:
Virus virulentos
Lisis de la bacteria y salida y temperados El DNA se vuelve circular Reproducción bacteriana normal
de fagos
Profag
o

Síntesis de proteínas Integración del cDNA al

fágicas y ensamblaje cromosoma

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Bacteriofago T4
El T4 es un fago complejo, y de acuerdo a lo que acaba de mencionar mi compañero, es un fago con cola, el cual cuenta con un DNA linear y pertenece a la
familia Myoviridae

A grandes rasgos podemos decir que posee una cabeza Icosaedrica de 78 x 111 nm y una cola helicoidal retractil de 113 x 20 nm
Las diversas estructuras anatómicas especificas que componen al macrófago T4 las podemos ver en las imágenes mostradas en la diapositiva donde
colocamos de lo mas simple a lo más complejo

 Teniendo en primer lugar la cabeza o también denominada capside del bacteriofago que tiene forma icosaédrica y está formada de proteínas. Esta cabeza
protege el DNA del fago de nucleasas y sustancias nocivas. Algunas de las proteínas presentes de la cabeza son la P23 de la cual esta envuelta la cápside, P24
que se encarga de los vértices, la proteína Soc junto con P23 forma una malla continua permitiendo su estabilidad

 también consta de un cuello que es la unión entre la cabeza y la cola, la cual es posible por la proteína P20

 Una cola que consiste en un tubo rodeado por una vaina helicoidal, la cual se va a retraer para insertar el DNA en el huesped

 Una placa basal (Hexagonal) que es la terminación de la cola, la cual sufrirá un cambio conformacional para introducir su ADN dentro de la célula huesped

 Esta base tiene fibras cortas de anclaje las cuales se encarga de unirse de manera IRREVERSIBLE al huesped

 Y 6 fibras largas de anclaje que son los “sensores de reconocimiento de la célula huésped”, las cuales reconocen las moléculas receptoras que se encuentran
en el huésped y se unen REVERSIBLEMENTE por medio de su proteína P37

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 Bacteriófago T4 Mapa genético
Recordando que un mapa genético muestra la ubicación relativa de los genes de un genoma de un organismo.
Para el fago T4 su secuencia completa del genoma es de 168.903 pb que codifican para alrededor de 300 genes
Sólo 62 de los genes T4 son "esenciales" Incluyendo genes que codifican proteínas del replisoma, factores reguladores transcripcionales y la
mayoría de las proteínas estructurales y de ensamblaje de la partícula de fagos
Muchos de estos genes sustituyen a los genes del huésped y hace que el fago se multiplique en muchos huéspedes diferentes y en muchas
condiciones diferentes.
Algo destacable de este fago es la producción de hidroximetilcitosina (HCM)
El gen 42 de T4 codifica para la dCMP hidroximetilasa que cataliza la hidroximetilación de la citosina produciendo la hidroximetilcitosina que
se puede unir a glucosa con ayuda de DNA glucosil tranferasas, dando una protección al ADN contra las endonucleasas de restricción.
(son aquellas que pueden reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortarlo)
También es importante mencionar que el genoma de T4 no codifica su propia RNA-polimerasa.
Proteínas del virus modifican la especificidad de la RNA-polimerasa del hospedador para que reconozca solo los promotores
del fago ( regiones delante de un gen estructural por donde la RNA polimerasa se une para iniciar la Transcripción)

Nota de enzimas  dCMP hidroximetilasa: produce la hidroximetilcitocina (HCM) , es codificada por el gen 42
importantes (ya  ADN glucosil transferasas que recubren el ADN que contiene HMC para protegerlo del
descritas previamente) ataque de ciertas nucleasas del huésped)
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Receptores Morfología de placa
LIGANDOS

Los receptores de E coli son los lipopolisacáridos y una proteína

c de la membrana externa denominada OmpC
Y su ligando principal es la proteína P37 presente en las fibras
largas, la cual interactúa con el LPS que tienen uno o dos
residuos de glucosa (extremo glucosil.alfa.1,3-glucosa de los
lipopolisacáridos )
Por otro lado, ante la presencia de OmpC el ligando no es capaz
de unirse al LPS, pero es capaz de usa esta proteína externa
como receptor

Y su morfología de placa podemos observar

Placas claras, circulares y con un diámetro de 1 mm

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Bacteriofago λ

Este bacteriófago es muy similar al que acabamos de ver, ademas

de que es característico porque esta compuesto aproximadamente
por un 50% de proteína y un 50% de DNA. La cabeza donde
almacena su cadena doble de DNA esta conformada por dos
proteínas, PE y PD, siendo PF aquella que le da estabilidad a la
capside y también la cola que también ya revisamos que es por
donde se transportara el DNA para infectar la célula, esta
compuesta principalmente por la proteína PV, pertenece a la
familia Siphoviridae, y mide un total de 230x 65 nm aprox,

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Tan, Y., Tian, T., Liu, W., Zhu, Z., & J. Yang, C. (2016b). Advance in phage display technology for bioanalysis. Biotechnology Journal, 11(6), 732–745. https://doi.org/10.1002/biot.201500458
 Bateriofago λ Mapa genético
• Este bacteriófago tiene un genoma de 48,5 kb
• El ADN del fago lamba es lineal de doble cadena cuando se encuentra en la cabeza del fago en la llamada fase infectante
• Este DNA lineal de doble cadena cada extremo 5′ hay una región de 12 nucleótidos de cadena sencilla que son complementarios
entre si después de inyectar el ADN en la célula para iniciar la infección, el ADN se cicla, mediante el emparejamiento entre los
sitios cos en los extremos formando un DNA circular en la llamada fase replicativa. En este estado, el ADN no puede ser destruido
por enzimas de defensa del huésped, las exonucleasas.
Este ADN circular puede luego integrarse en el cromosoma huésped (ciclo lisogénico) o replicarse y empaquetarse en cabezas de fagos
para formar más fagos (ciclo lítico).
• En este caso, la ARN polimerasa utilizada es la que pertenece a la célula huésped.
• En el genoma las letras simbolizan proteínas que son codificadas por genes del fago, asi que podemos ver la
• Proteína N que es un antiterminador de transcripción se une al RNApol que impide su reconocimiento de sitios de terminación, por
lo que se ignoran las señales normales de terminación de la ARN polimerasa y la síntesis de ARN continúa.
• También se pueden ver productos génicos usados para el ensablaje de la cola o la cabeza del bacteriófago

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Receptores Morfología de placa
Al final de la cola, el fago Lambda posee una proteína
denominada J la le permitirá adsorberse a externamente a la
porina para maltosa producto del gen lamB ,ya actividad es
inducida por la presencia de este azúcar en el medio de cultivo

Morfología de placa

Podemos observar dos morfologías

a) Se observan placas claras, con centro turbio, de forma circular,
bordes enteros con un diámetro de 5 mm. (Lisogenicas)
b) Placas claras de forma circular, bordes irregulares con un
diámetro aprox. de 5 mm. (Liticas)

Madigan, M., Aiyer, J., Buckley, D., Sattley, W., & Stahl, D. (2021). Brock Biology of Microorganisms, Global Edition (16.a ed.). Pearson.
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Bacteriofago M13

El fago M13 a comparación de los 2 que acabamos de ver hace

unos momentos, es un poco mas simple es un bacteriófago
filamentoso, perteneciente a la familia Inoviridae, tiene una
cadena de DNA circular, una morfología cilíndrica de de 900nm de
largo por 6.5 nm de diámetro y su cápside está formada por
aproximadamente 2700 copias de la proteína mayor de
recubrimiento P8, y encapuchada en los extremos por copias de
dos diferentes proteínas de recubrimiento menores (P9, P7, P6,
P3).

16
Birge, E. A. (2006). Bacterial and Bacteriophage Genetics (5.a ed.). Springer.
Receptores Morfología de placa
LIGANDO
La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se
una al la proteína To1A del pilus de Escherichia coli. Cuando se
retrae el pilus, el fago es arrastrado hacia la superficie celular y
finalmente entra en el hospedador. Durante el proceso de
entrada, la cápside se desarma y el DNA entra a la celula

Morfología de la placa del bacteriófago M13 (NO LITICO).

Se observan placas turbias de forma circular, bordes bien definidos
con un diámetro de 3 mm

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Madigan, M., Aiyer, J., Buckley, D., Sattley, W., & Stahl, D. (2021). Brock Biology of Microorganisms, Global Edition (16.a ed.). Pearson.
 Bateriofago M13 Mapa genético
El fago M13 tiene 6.400 pb y consiste en una sola cadena de DNA trenzado en forma de SSDNA (ADN
monocatenario) encerrado en aproximadamente 2700 copias de una proteína de capa mayor (p8) y 5 copias cada
una de las 4 proteínas de capa menor: p3 y p6 en un extremo y p7 y p9 en el otro como se ve en la figura A. Esto
mismo les confiere la propiedad de salir de la célula infectada sin causar su lisis
• El genoma M13 codifica para 11 proteínas con múltiples genes superpuestos, promotores, sitios de unión a
ribosomas y terminadores.
Como podemos ver en la figura B el mapa del genoma del fago M13 identificando los genes, promotores y
terminadores.
Regiones codificadoras para cada proteína M13 están etiquetadas "p #"
Las regiones sombreadas representan porciones del genoma en el que los genes se superponen (por ejemplo, el
gen para p10 es completamente contenido dentro de la región codificante para p2.)
PA, PB, PH son promotores fuertemente activos.
Dos promotores débiles adicionales se etiquetan como PZ y PW.
Dos terminadores (T) son terminadores fuertes e independientes de rho; el tercer terminador más débil (T(débil))
es dependiente de rho.

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METODOLOGÍAS
PARA LA
CARACTERIZACIÓ
N DE
BACTERIÓFAGOS
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Crecimiento en un solo paso
El experimento del crecimiento en un solo paso fue elaborado por Ellis y Delbrück
Tiene como objetivo la diferenciación de las diferentes fases del ciclo de multiplicación

Este experimento depende de una mono infección sincronizada, a que me refiero con esto, a que una bacteria va a ser
infectada por un solo fago y que todas las bacterias que se infecten, empezaran la infección al mismo tiempo

Para esto es necesario emplear una MOI = 0.1 (Proporción de 1 Fago por cada 10 bacterias)

Para realizar este experimento vamos a mezclar nuestra solución de fagos con el cultivo de la cepa indicadora,
incubaremos a 37°C por 30 mins aproximadamente (Esto es para que se lleve a cabo la adsorcion del fago a la membrana
de la bacteria), posteriormente se diluye con el fin de eliminar a los fagos que no se hayan unido a celulas hospedadoras,
hasta el punto donde las colisiones entre celulas y fagos sean muy poco probables, esto es al diluir 1000 o 10000 veces, y
una vez esto realizado, empezaremos a tomar alicuotas a distintos tiempos, siendo la primera el minuto 0, y tomaremos
otras a los 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 minutos, mezclamos nuestra alicuota con la cepa indicadora y agar blando
fundido, vertemos laamezcla en una caja petri, esperamos a que se solidifique e incubamos a 37°C por 24 hrs, por ultimo
contamos el numero de placas y calculamos el titulo fagico

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Resultados y gráfico de crecimiento en un
solo paso
Como resultado obtendremos esta grafica que representa las ufp por mililitro contra el tiempo, donde se puede observar una serie de fases o periodos bien
diferenciados
Inicando con la fase latente, la cual ocurre inmediatamente despues de la adicion de los fagos. Aqui el numero de placas formadas se mantiene constante
debido a que cada placa formada es una celula infectada por un fago que se liso. El agar blando nos asegura que los fagos liberados no se difunden mas que
unos pocos micrometros y solo se forma una placa para cada celula originalmente infectada. Es importante mencionar que este periodo es el mas corto
requerido para la reproduccion y liberacion del virus
Otro punto importante es que esta fase se divide en dos, la eclipse y el periodo de acumulacion intracellular
En el periodo de eclipse, los fagos aun no infectan en su totalidad a la celula y estan ocultos o eclipsados…, aqui se da la expresion genica, sintesis de proteinas
y la sintesis del genoma
Por otro lado, en la acumulacion intracelular las proteinas y genomas del fago se ensamblan en nuevas particulas de fago y la celula huesped ya puede ser
lisada

Este periodo es seguido por el estallido o Tambien conocido como multiplicación en un paso, en el que las celulas huesped se lisan, liberan fagos infectivos y
hacen que aumente el recuento de placas rapidamente

Por ultimo, temenos al periodo llamado meseta, el cual representa el final de toda la lisis de la celula huesped infectada, aqui los fagos liberados no pueden
adherirse sobre las celulas huesped no infectadas, debido a la dilución realizada en el procedimiento. Por lo tanto, el recuento de placa permanece constante

Con este experimento es posible determinar el tamaño del estallido, osea el numero de fagos producidos a partir de la infeccion de una celula, y esto se hace
por medio de la siguiente formula
Donde el tamaño del estallido = a las unidades formadoras de placa en la fase de meseta entre las unidades formadoras de placas en la fase latente

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 Lisis artificial (T4)
Esta metodología es muy parecida a la curva de crecimiento de un solo paso ya
que realizamos los mismos pasos, a excepción de que aquí se adiciona cloroformo
o algún detergente.
OBJETIVO
Determinar la cinética de la producción de fagos dentro de una célula de una cepa
indicadora.
Aquí el aumento del número de placas representa la producción intracelular de
fagos.

Describir diagrama
IMPORTANTE
• MOI de aproximadamente 0,1 (para garantizar que ninguna célula se infecte
con más de un fago)- Habría 1 fago por cada 10 bacterias
• Dilución: evita que cualquier virión (partícula vírica morfológicamente
completa e infecciosa) liberado en lisis no infecten a otra célula
• El cloroformo destruye las membranas celulares, lo que provoca la lisis
prematura de las células infectadas
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 Resultados y gráfico de lisis artificial
Como resultado del experimento anterior vamos a observar un aumento de UFP debido a
producción de fagos liberados de manera artificial

Ya que nosotros forzamos la lisis de las células las UPF formadas serán conforme a la la
producción de fagos dentro de la célula.
La línea verde representa a los fagos que son liberados extracelularmente de maneral natural
Mientras la línea roja son los fagos totales armados en las células

•Observamos el periodo de latencia, este es el desde que inicia la infección y se liberan los
fagos. ( Esto en crecimiento de un solo paso)
•El la lisis artificial podemos observar el período de eclipse, que es la parte inicial del período de
latencia, inicia desde la infección de la bacteria y termina cuando ya se hayan ensamblado fagos
completos, funcionales e infecciosos. Entonces todos los fagos liberados artificialmente aun no
están completamente armados y no producen una UFP
•Una vez terminado el periodo de eclipse los fagos ya están listos, armados y empaquetados para
infectar nuevas células es por eso que observamos una mayor UFP .

• Por ultimo observamos la meseta ya que todos los fagos producidos han sido liberados
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 Estallido simple
Por último, tenemos al experimento del estallido simple, también ideado por Ellis y Delbrück...

Teniendo como objetivo el Determinar el tamaño del estallido a partir de células infectadas individuales

Por lo tanto, lo que debemos tener como principal consideración es tener solamente una célula infectada por
cada tubo, para así cuantificar el estallido provocado por solamente una célula infectada

---(Empezando ya el procedimiento) ---

Para lograr esto, un cultivo de la cepa bacteriana indicadora debe ser “infectado” con un numero pequeño de
bacteriófagos, de manera que se tenga una MOI menor a 1. Si la cantidad de bacteriófagos es adecuada, es muy
poco probable el tener más de una célula infectada por tubo. Posteriormente vamos a diluir para reducir la
densidad celular e incubaremos varias horas (Aquí es importante mencionar que las células que se infecten se
van a lisar durante su incubación, pero debido a la baja densidad, ningún fago va a poder infectar a alguna otra
célula) y vamos a tomar varias alícuotas de la última dilución, pueden llegar a ser cientos o miles de tubos con
alícuotas y en unos momentos veremos por qué…, se incubaran los tubos (donde las bacterias se van a lisar y
liberaran la progenie del bacteriófago) y por ultimo vamos a sembrar en placa, incubaremos de nuevo y
contaremos el número de placas formadas de cada cultivo

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 Resultados del Estallido simple
Aquí observamos los resultados obtenidos por Ellis y Delbrück, quienes emplearon Conociendo la formula, como la aplicamos a nuestro caso?
una cepa de E coli infectada con bacteriófagos, la dejaron reposar por 10 minutos y Tenemos que partir de lo que estamos seguros por así decirlo, que es cuando r= 0,
luego la diluyeron mas de 100 veces. Se tomaron alícuotas de 0.05 mL las cuales se preguntaran ¿Por qué cuando r = 0? Por la simple razón de que cuando hay 0
fueron distribuidas en 40 tubos y se incubaron por 200 minutos (3 hrs y media celulas infectadas, hay 0 placas y es el único valor que podemos afirmar como
aprox). El contenido entero de cada tubo fue cultivado con la cepa de E. coli verdadero, porque en los demás cultivos aunque presenten cierto numero de placas,
indicadora y aquí observamos una tabla con el numero de placas formadas en cada pues nada nos afirma que en realidad es una o dos o tres células infectadas las que
uno de los cultivos. ocasionan esta formación de placas, por lo tanto podemos obtener la probabilidad
En primera instancia, si asumimos que hay una sola célula infectada por cada tubo, de que tengamos 0 celulas infectadas en un tubo, esto dividiendo el numero de
podemos decir que el tamaño del estallido es enorme, llendo desde 1 hasta 190 cultivos sin placas, que fueron 25 entre el total de cultivos, que fueron 40, entonces
placas formadas, y podriamos deducir por mera lógica el numero promedio del 25/40 nos da un total de 0.625 (SOLO SI PREGUNTAN, LA PROBABILIDAD SE DA POR
tamaño de estallido por célula, todo esto por una simple regla de 3 que diría que por EL NUMERO DE CASOS DADOS/NUMERO DE CASOS POSIBLES)
15 tubos tenemos 883 placas formadas emmm, esto de placas formadas es Resolvemos la formula sustituyendo r y P(0) hasta donde lleguemos (Recordamos
importante mencionar que equivale a los fagos liberados, por lo tanto cuantas fagos que un numero elevado a la 0 es 1 y que el factorial de 0 es 1) y vemos que queda la
liberados tendríamos por un tubo, esto nos daría un total de 59 fagos liberados por base de los logaritmos naturales elevado a la -n, la despejamos con ayuda de un
célula infectada. logaritmo natural para poder obtener n, la cual nos daría 0.47
Una vez con este valor ¿Qué hacemos con el?
Pero como mencione en un principio, esto es solo si ASUMIMOS que hay una sola Podemos conocer el numero total de células infectadas en todo el experimento
célula infectada por cada tubo, y bueno, esto de asumir en determinaciones multiplicando el promedio obtenido por 40 que son los tubos utilizados y esto nos
Cuantitativas no es lo mas conveniente, así que ademas de la lógica, podemos hacer da 18.8 celulas infectadas, las cuales deben estar distribuidas en los 15 tubos donde
una determinación mas precisa del promedio del tamaño de estallido si tenemos en hubo producción de placas. El exceso del numero calculado sobre los 15 tubos
cuenta la probabilidad de que hubiera mas de una célula infectada por tubo sugiere la existencia de tubos con dos o más células infectadas.
Para esto empleamos la distribución de Poisson, donde la probabilidad de que un Con este valor podemos obtener el numero promedio de estallido por célula, donde
tubo tenga r células infectadas depende de n que es el promedio de células si tenemos un total de 883 fagos liberados por 18.8 celulas infectadas, lo cual nos
infectadas por tubo y e, que es un numero irracional y es base de los logaritmos daría un aproximado de 47 fagos por célula infectada
naturales, con un valor de 2.71

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PROTOCOLO
EXPERIMENTA
L

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 Prueba de gota “Spot test”

● Describir diagrama

● El objetivo de la prueba es detectar si hay fagos

capaces de infectar a la cepa bacteriana que
estamos probando
● Los resultados los observamos en calvas en el
césped bacteriano
● Una prueba positiva es cuando se observa una
eliminación del crecimiento bacteriano
observando una UFP
● Una prueba negative es cuando observamos el
cesped bacteriano intacto

31
Gracias por su atención

34